ES2224273T3 - Metodo para producir inmunidad activa por medio de un conjugado de vacuna. - Google Patents
Metodo para producir inmunidad activa por medio de un conjugado de vacuna.Info
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Abstract
PROCEDIMIENTO QUE SIRVE PARA PRODUCIR UNA INMUNIDAD ACTIVA CONTRA UNA ENFERMEDAD PROVOCADA POR UNA BACTERIA O POR UN PROTOZOO Y QUE CONSISTE EN ADMINISTRAR A UN SUJETO UN CONJUGADO DE VACUNA QUE CONTIENE UNA BACTERIA O UN PROTOZOO VIVIENTE, Y UN FACTOR NEUTRALIZANTE FIJADO A ESTA BACTERIA O A ESTE PROTOZOO VIVIENTE. ESTE FACTOR NEUTRALIZANTE SE SELECCIONA EN EL GRUPO CONSTITUIDO POR ANTICUERPOS Y FRAGMENTOS DE ANTICUERPOS. LA BACTERIA O EL PROTOZOO VIVIENTE CONSTITUYEN UNA ESPECIE CAPAZ DE PROVOCAR UNA ENFERMEDAD EN EL SUJETO, Y EL ANTICUERPO O LOS FRAGMENTOS DE ANTICUERPO SON DE UN TIPO CAPAZ DE NEUTRALIZAR LA BACTERIA O EL PROTOZOO VIVIENTE.
Description
Método para producir inmunidad activa por medio
de un conjugado de vacuna.
La presente invención se refiere a métodos para
producir inmunidad activa contra una enfermedad bacteriana o
protozoárica mediante la administración de un conjugado de vacuna,
que comprende una bacteria o protozoo vivos y un anticuerpo
neutralizante o un fragmento del mismo.
Los métodos para producir inmunidad activa contra
una enfermedad vírica mediante la administración de un conjugado de
vacuna que comprende un virus vivo y un anticuerpo neutralizante
viral se describen en las patentes U.S. nº 5.397.568 y nº 5.397.569
de Whitfill et al. Dichas referencias se refieren solamente a
enfermedades víricas.
Los métodos de tratamiento de la coccidiosis, una
enfermedad protozoárica de aves y mamíferos causada por diversas
especies de Eimieria, se describen en la patente U.S. nº
4.935.007 de Baffundo et al. y en la patente U.S. nº
5.055.292 de McDonald et al. La inoculación en el huevo
contra la coccidiosis se describe en las publicaciones de
solicitudes PCT WO 96/40233 y WO 96/40234.
La presente invención se refiere a un método para
producir inmunidad activa contra una enfermedad bacteriana o
protozoárica en un ave, comprendiendo el método la administración a
un huevo de un conjugado de vacuna que comprende una bacteria o
protozoo vivos y un factor neutralizante unido a la bacteria o
protozoo vivos. El factor neutralizante se selecciona de entre el
grupo que consiste en anticuerpos y fragmentos de anticuerpo. El
anticuerpo o fragmento del mismo es capaz de neutralizar la
bacteria o protozoo vivos. El conjugado de vacuna se administra en
una cantidad efectiva para producir una respuesta inmunológica
contra la bacteria o protozoo vivos en el ave.
Otro aspecto de la presente invención es una
preparación de vacuna útil para producir inmunidad activa contra
una enfermedad bacteriana o protozoárica en un sujeto. La
preparación de vacuna es una formulación farmacéuticamente aceptable
que comprende un conjugado de vacuna. El conjugado de vacuna
comprende una bacteria o protozoo vivos y un factor neutralizante
unido a la bacteria o protozoo vivos. El factor neutralizante se
selecciona de entre el grupo que consiste en anticuerpos y
fragmentos de anticuerpo. El anticuerpo o fragmento del mismo es
capaz de neutralizar la bacteria o protozoo vivos. El conjugado de
vacuna se incluye en la formulación farmacéuticamente aceptable en
una cantidad efectiva para producir una respuesta inmunológica
frente a la bacteria o protozoo vivos en el sujeto.
La figura 1 muestra la producción de oocistos en
aves vacunadas con un conjugado de vacuna que comprende 500
oocistos de E. acervulina acomplejados con 2,5, 25 ó 150
\mul de anticuerpo policlonal, en comparación con un control no
vacunado (cntrl) y un control vacunado con oocistos pero sin
anticuerpo. Se utilizó el número de oocistos como medida de
infectividad.
La figura 2 muestra el número de oocistos en aves
vacunadas con un conjugado de vacuna que comprende 500 oocistos de
E. acervulina acomplejados con 25 ó 150 \mul de anticuerpo
policlonal, en comparación con un control no vacunado (cntrl) y un
control vacunado con oocistos pero sin anticuerpo. Se utilizó el
número de oocistos como medida de infectividad.
La figura 3 muestra la producción de oocistos
después de la vacunación y desafío con dosis bajas de E.
acervulina. Para la vacunación se utilizó un conjugado de
vacuna que comprendía 500 oocistos de E. acervulina
acomplejados con 2,5, 25 ó 150 \mul de anticuerpo policlonal; los
controles eran un control no vacunado (cntrl) y un control vacunado
con oocistos pero sin anticuerpo (0).
La figura 4 muestra la ganancia de peso (en
gramos) en aves después de la vacunación y desafío con dosis
elevadas de E. acervulina. Para la vacunación se utilizó un
conjugado de vacuna que comprendía 500 oocistos de E.
acervulina acomplejados con 25 ó 150 \mul de anticuerpo
policlonal; los controles eran un control no vacunado (cntrl) y un
control vacunado con oocistos pero sin anticuerpo (0).
La figura 5 muestra el número de lesiones en aves
después de la vacunación y desafío con dosis elevadas de E.
acervulina. Para la vacunación se utilizó un conjugado de
vacuna que comprendía 500 oocistos de E. acervulina con 25 ó
150 \mul de anticuerpo policlonal; los controles eran un control
no vacunado (cntrl) y un control vacunado con oocistos pero sin
anticuerpo (0).
La presente invención proporciona una preparación
de vacuna que comprende un organismo vivo (bacteria o protozoo)
acomplejado con anticuerpos neutralizantes específicos de dicho
organismo. La cantidad de complejos de anticuerpos neutralizantes
es tal que el organismo sigue siendo capaz de inducir una respuesta
inmunológica activa, proporcionando simultáneamente algún grado de
protección contra los efectos perjudiciales del patógeno. Sin que
los presentes solicitantes deseen restringirse a ninguna teoría en
particular, en la actualidad se cree que la presente vacuna
complejo resulta en alguna forma de liberación retardada del
organismo patogénico.
La presente vacuna complejo se cree que retarda o
protege inicialmente al sujeto vacunado de los efectos patogénicos
del organismo de la vacuna. Sin embargo, dicho retardo o protección
inicial es sólo temporal (en contraste con lo que sería de esperar
al utilizar un organismo de vacuna muerto o inactivado). El
organismo de vacuna en el complejo en última instancia infecta al
sujeto, induciendo una inmunidad activa. El grado de retardo será
dependiente de la cantidad de anticuerpo utilizado, del organismo
de vacuna particular y del sujeto a vacunar. Tal retardo en la
infección es importante al vacunar sujetos jóvenes, en particular
cuando deben vacunarse grandes números de sujetos. Por ejemplo, es
más fácil y eficiente económicamente vacunar polluelos in ovo
en comparación con la vacunación de polluelos recién
eclosionados.
En una realización preferida de la presente
invención, el factor neutralizante se proporciona en una cantidad
que retarda la aparición de cambios patológicos asociados con la
infección del sujeto por el organismo de vacuna vivo. El
"retardo" es comparativo; los cambios patológicos se retrasan
en comparación con los que ocurrirían si se administrase el
organismo de vacuna vivo sin factor neutralizante acomplejado.
La utilización de los presentes conjugados de
vacuna es más segura que la utilización del organismo sin conjugar
aunque es capaz de inducir una respuesta inmunológica activa
protectora. El término "segura" se utiliza en la presente
memoria para indicar que los beneficios de la vacunación superan
cualquier daño en la mayoría de los individuos vacunados.
Los anticuerpos utilizados en la puesta en
práctica de la presente invención son anticuerpos neutralizantes
bacterianos o protozoáricos. Los anticuerpos neutralizantes
bacterianos o protozoáricos son aquellos que combaten la
infectividad de una bacteria o protozoo in vivo si se deja
que la bacteria o protozoo y los anticuerpos reaccionen entre sí
durante un tiempo suficiente. El origen del anticuerpo
neutralizante bacteriano o protozoárico no es crítico. Pueden
originarse de cualquier animal, incluyendo aves (por ejemplo,
pollos, pavos) y mamíferos (por ejemplo, ratas, conejos, cabras,
caballos). Los anticuerpos neutralizantes bacterianos o
protozoáricos pueden ser de origen policlonal o monoclonal. Ver,
por ejemplo, D. Yelton y M. Scharff, American Scientist
68:510 (1980). Los anticuerpos pueden ser quiméricos. Ver, por
ejemplo, M. Walker et al., Molecular Immunology 26:403
(1989).
Los anticuerpos neutralizantes bacterianos o
protozoáricos utilizados en la puesta en práctica de la presente
invención pueden ser inmunoglobulinas de cualquier isotipo,
incluyendo las inmunoglobulinas IgM, IgG, IgA, IgD e IgE. Las IgG y
IgM son de mayor preferencia, y las inmunoglobulinas IgG (por
ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) son las de mayor preferencia.
Los fragmentos de anticuerpo utilizados en la
puesta en práctica de la presente invención son fragmentos de
anticuerpos neutralizantes bacterianos o protozoáricos que
conservan la región variable sitio de unión de los mismos. Son
ejemplos los fragmentos F(ab')_{2}, los fragmentos
F(ab') y los fragmentos Fab. Ver, en general, Immunology:
Basic Processes, 95-97 (editor: J. Bellanti, 2ª
edición, 1985).
Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos
utilizados en la puesta en práctica de la presente invención pueden
tener elementos adicionales unidos a los mismos. Por ejemplo, una
microesfera o micropartícula puede estar unida al anticuerpo o
fragmento de anticuerpo, según se describe en la patente U.S. nº
4.493.825 de Platt, cuyo contenido se incorpora en la presente
memoria como referencia.
La presente invención se utiliza con bacterias o
protozoos que serían patogénicos (es decir, capaces de causar
enfermedad) en el sujeto bajo tratamiento si no se conjugasen con
el factor neutralizante. La patogenicidad de las bacterias o
protozoos puede ser inherente a las bacterias o protozoos mismos o
deberse a la susceptibilidad del sujeto a tratar (por ejemplo, las
aves en el huevo). En general, muchas bacterias o protozoos
patogénicos presentan el efecto positivo de inducir inmunidad
activa en sujetos infectados por ellos, y muchas cepas atenuadas de
bacterias o protozoos para vacunas tienen la capacidad de causar
por lo menos alguna manifestación de enfermedad en los sujetos. Por
lo tanto, el término "patogénico", según se utiliza en el
presente documento para describir bacterias o protozoos, significa
que el daño causado a sujetos por la administración de las
bacterias o protozoos supera cualquier beneficio que pueda resultar
de los mismos. Un organismo "activo" o "vivo" se refiere a
uno que no está muerto. Un "organismo de vacuna" se refiere a
un organismo que se utiliza para la inducción de respuestas
inmunológicas protectoras, aunque pueden darse efectos secundarios
negativos (en tales casos, el beneficio de la inmunidad activa
supera cualquier posible efecto secundario negativo). Es preferente
que las bacterias o protozoos sean organismos vivos capaces de
producir una respuesta inmunológica activa contra ellos en el
sujeto bajo tratamiento.
El conjugado de vacuna se incluye en las
formulaciones de vacuna en una cantidad por dosis unitaria
suficiente para provocar una respuesta inmunológica activa contra
las bacterias o protozoos en el sujeto a tratar. El término
"respuesta inmunológica", en su utilización en el presente
documento, significa cualquier nivel de protección frente a
exposiciones posteriores a bacterias o protozoos que resulta de
algún beneficio en una población de sujetos, sea en la forma de
mortalidad reducida, menor número de lesiones, mejores tasas de
conversión alimentaria o la reducción de cualquier otro efecto
perjudicial de la enfermedad, con independencia de que la
protección sea parcial o completa.
Con respecto al grado de protección que
proporciona el factor neutralizante, la cantidad de éste
administrada en combinación con las bacterias o protozoos en la
vacuna no necesita ser suficiente para proporcionar una protección
completa frente a las bacterias o protozoos, con la condición de
que la respuesta perjudicial producida por éstas se reduzca a un
nivel al que los beneficios de la respuesta inmunológica generada
superen cualquier daño resultante de la infección.
El término "sujetos", tal como se utiliza en
el presente documento, se pretende que incluya, entre otros,
mamíferos y aves. Los ejemplos de mamíferos incluyen ratones,
ratas, cerdos, conejos, ovejas, hurones, perros, gatos, vacas,
caballos y primates, incluyendo el hombre. El término "ave" se
pretende que incluya los machos o hembras de cualquier especie
aviar, pero se pretende principalmente que abarque a las aves de
corral que se crían comercialmente para huevos o carne. De acuerdo
con lo anterior, el término "ave" se pretende particularmente
que abarque a gallinas, gallos y pollos macho, pavos, patos,
gansos, codornices y faisanes.
Las bacterias que pueden utilizarse al llevar a
cabo la presente invención incluyen, pero sin limitación,
Actinobacillosis lignieresi, Actinomyces bovis, Aerobacter
aerogenes, Anaplasma marginale, Bacillus anthracis, Borrelia
anserina, Brucella canis, Clostridium chauvoei, C. hemolyticium, C.
novyi, C. perfringens, C. septicum, C. tetani, Corynebacterium
equi, C. pyogenes, C. renale, Cowdria ruminantium, Dermatophilus
congolensis, Erysipelothrix insidiosa, Escherichia coli, Fusiformis
necrophorus, Haemobartonella canis, Hemophilus spp., H. suis,
Leptospira spp., Moraxella bovis, Mycoplasma spp., M.
hyopneumoniae, Nanophyetus salmincola, Pasteurella anatipestifer, P.
hemolytica, P. multocida, Salmonella abortus-ovis,
Shigella equirulis, Staphylococcus aureus, S. hyicus, S. hyos,
Streptococcus agalactiae, S. dysgalactiae, S. equi, S. uberis y
Vibrio fetus (para las enfermedades correspondientes, ver
Veterinary Pharmacology and Therapeutics, 5ª edición, página
746, Tabla 50.2 (Editores: N. Booth y L. McDonald, 1982) (Iowa
State University Press); y Corynebacterium diptheriae,
Mycobacterium bovis, M. leprae, M. tuberculosis, Nocardia
asteroides, Bacillus anthracis, Clostridium botulinum, C. difficile,
C. perfringens, C. tetani, Staphylococcus aureus, Streptococcus
pneumoniae, S. pyogenes, Bordetella pertusiss, Psudomonas
aeruginos, Campylobacter jejuni, Brucella spp., Francisella
tularenssis, Legionella pneumophila, Chlamydia psittaci, C.
trachomatis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella
typhi, S. typhimurium, Yersinia enterocolitica, Y. pestis, Vibrio
cholerae, Haemophilus influenza, Mycoplasma pneumoniae, Neiseseria
gonorrhoeae, N. meninigitidis, Coxiella burneti, Rickettsia
mooseria, R. prowazekii, R. rickettsii, R. tsutsugamushi, Borrelia
spp., Leptospira interrogans, Treponema pallidum y Listeria
monocytogenes (para las enfermedades correspondientes ver R.
Stanier et al., The Microbial World, páginas
637-638, Tabla 32.3 (5ª edición, 1986).
Los protozoos que pueden utilizarse para llevar a
cabo la presente invención incluyen, pero sin limitación, las
especies de Eimeria causantes de coccidiosis (E. tenella,
E. necatrix, E. brunetti, E. acervulina, E. mivati y E.
maxima), Anaplasma marginale, las especies de Giardia
(por ejemplo, Giardia lamblia), las especies de
Babesia (por ejemplo, B. canis, B. gibsoni, B. equi, B.
caballi, B. bigemina, B. argentina, B. divergens y B.
bovis), Trichomonas foetus, Entamoeba histolytica y
Balantidium coli; las especies de Plasmodium (por
ejemplo, P. falciparum, P. malariae, P. vivax y P.
ovale), las especies de Leishmania (por ejemplo, L.
donovani, L. braziliensis, L. tropica y L. mexicana),
las especies de Trypanosoma (por ejemplo, T. brucei y
T. cruzi), Entamoeba histolytica, Trichomonas vaginalis,
Toxoplasmosa gondii y Pneumocystis carinii. Tal como se
utiliza en el presente documento, un "protozoo aviar" es un
protozoo que se conoce que infecta a aves.
Los organismos pueden administrarse de cualquier
forma adecuada, incluyendo esporas o quistes de los mismos. Por
ejemplo, los organismos coccidiales infectivos pueden administrarse
en forma de oocistos esporulados, esporozoitos y esporocistos.
El número exacto de organismos a administrar en
forma de un conjugado no es crítico excepto en que el número debe
ser efectivo para engendrar una respuesta inmunológica del animal.
En general, dependiendo del organismo administrado, el sitio y vía
de administración, la edad y estado del sujeto, etc., el número de
organismos se encontrará comprendido entre 1, 10 ó 100 organismos y
1.000, 10.000, 100.000 o 1 millón de organismos. Cuando los
organismos se administren como un conjugado a aves in ovo
(dentro del huevo), la dosis puede estar comprendida entre 50, 100
ó 500 y hasta 2.000, 10.000, 20.000, 30.000, 50.000 ó 100.000
organismos o más.
Se pueden administrar vacunas de la presente
invención a sujetos mediante cualquier medio adecuado. Por ejemplo,
la administración oral, mediante inyección intramuscular, mediante
inyección subcutánea, mediante inyección intravenosa, mediante
inyección intraperitoneal, mediante gotas oculares o mediante spray
nasal. Cuando el sujeto a tratar es un ave, ésta puede ser un ave
eclosionada, incluyendo un ave recién eclosionada (es decir,
aproximadamente los tres primeros días después de la eclosión), un
ave adolescente y un ave adulta. La vacuna puede administrarse a
aves in ovo, según se describe en la patente U.S. nº
4.458.630 de Sharma (cuyo contenido, así como el de todas las otras
referencias de patente citadas en esta descripción se incorporan en
la presente memoria como referencia).
La administración en el huevo de la vacuna
implica la administración de ésta a los huevos. Los huevos a los
que se administra la vacuna de la presente invención son huevos
fértiles que preferentemente se encuentran en el último cuarto de
la incubación. Los huevos de pollo se tratan en el decimoquinto a
decimonoveno día de incubación y se tratan con la mayor preferencia
en el decimoctavo día de la incubación aproximadamente (el día
dieciocho del desarrollo embriónico). Los huevos de pavo se tratan
preferentemente en el día veintiuno a veintiséis de la incubación
aproximadamente y con la mayor preferencia se tratan en el día
veinticinco de la incubación aproximadamente.
Se puede administrar la vacuna de la invención a
huevos mediante cualquier medio que transporte el compuesto a
través de la cáscara. El método preferido de administración es, sin
embargo, mediante inyección. El sitio de la inyección se encuentra
preferentemente dentro de la región definida por el amnion,
incluyendo el líquido amniótico y el embrión mismo, en la yema o en
la cámara de aire. Con la mayor preferencia, la inyección se
realiza en la región definida por el amnion. Al iniciarse el último
cuarto de la incubación, el amnion ha aumentado de tamaño lo
suficiente para que la penetración del mismo se asegure casi
siempre cuando la inyección se realiza desde el centro del polo más
obtuso a lo largo del eje longitudinal.
El mecanismo de inyección en el huevo no es
crítico, pero es preferible que el método no dañe excesivamente los
tejidos y órganos del embrión o las membranas extraembriónicas que
lo rodean de manera que el tratamiento no reduzca la tasa de
eclosión. Una jeringa hipodérmica dotada de una aguja de calibre
aproximado 18 a 22 es adecuada para dicho propósito. Con el fin de
inyectar en la cámara de aire, la aguja sólo necesita insertarse en
el huevo aproximadamente dos milímetros. Una aguja de una pulgada,
una vez insertada completamente en el centro del polo obtuso del
huevo, atravesará la cáscara, las membranas externa e interna de
ésta que delimitan la cámara de aire, y el amnion. Dependiendo de la
etapa precisa de desarrollo y de la posición del embrión, una aguja
de esta longitud acabará en el líquido por encima del polluelo o en
el polluelo mismo. Puede perforarse o taladrarse un orificio de
prueba a través de la cáscara previamente a la inserción de la
aguja a fin de evitar que la aguja se dañe o pierda su filo. Si se
desea, el huevo puede sellarse con un material de sellado
sustancialmente impermeable a las bacterias, tal como cera o
similar, con el fin de evitar entradas posteriores de bacterias no
deseables.
Se prevé que un sistema automatizado de alta
velocidad de inyección en huevos para embriones aviares será
particularmente adecuado para la puesta en práctica de la presente
invención. Hay disponibles numerosos dispositivos como estos,
siendo ejemplos los descritos en la patente U.S. nº
4.681.063 de Hebrank, y en las patentes U.S. nº 4.040.388, nº
4.469.047 y 4.593.646 de Miller. Todos estos dispositivos, según se
adaptan para la puesta en práctica de la presente invención,
comprenden un inyector que contiene la vacuna descrita en el
presente documento, con el inyector posicionado para inyectar la
vacuna en un huevo sostenido por el aparato. Se han discutido
anteriormente otras características del aparato. Además, si se
desea, puede proporcionarse un aparato de sellado asociado
operativamente con el aparato de inyección que selle el orificio en
el huevo tras la inyección en el mismo.
El aparato preferido para la inyección en huevos
para la puesta en práctica de la presente invención se describe en
las patentes U.S. nº 4.681.063 y nº 4.903.635 de Hebrank, las
descripciones de las cuales se incorporan en el presente documento
por referencia. Dicho dispositivo comprende un aparato de inyección
para administrar sustancias líquidas en una pluralidad de huevos y
un aparato de succión que simultáneamente se acopla y eleva una
pluralidad de huevos individuales desde la parte encarada hacia
arriba de los huevos y coopera con los medios de inyección en los
huevos mientras éstos se encuentran acoplados al aparato de
succión. Las características de dicho aparato pueden combinarse con
las características del aparato descrito anteriormente para la
puesta en práctica de la presente invención. Los sujetos preferidos
para llevar a cabo la presente invención son aves.
La utilización de la presente invención
preferentemente utiliza aves in ovo.
Un conjugado de vacuna de la presente invención
se prepara mediante la mezcla del factor neutralizante con una
bacteria o protozoo vivos en un portador farmacéuticamente
aceptable durante un tiempo suficiente para formar un conjugado de
bacteria o protozoo vivos-factor neutralizante (por
ejemplo, mediante la combinación del factor neutralizante y
bacterias o protozoos en un portador líquido común previamente a la
administración a un sujeto, hasta que se forma un conjugado). Lo
anterior puede llevarse a cabo ventajosamente mediante la simple
adición de sueros hiperinmunológicos que contengan anticuerpos
neutralizantes a una solución acuosa que contengan las bacterias o
protozoos vivos. Las formulaciones de vacuna de la presente
invención comprenden preferentemente el conjugado de vacuna en
forma liofilizada o el conjugado de vacuna en un portador
farmacéuticamente aceptable. Los portadores farmacéuticamente
aceptables son preferentemente líquidos, particularmente portadores
acuosos. Con el fin de preparar tales formualciones de vacuna, el
factor neutralizante y las bacterias o protozoos pueden mezclarse en
solución salina tamponada con fosfato sódico (pH 7,4), medios
convencionales tales como MEM o medio de crecimiento bacteriano. La
formulación de vacuna puede almacenarse en un recipiente estéril de
vidrio sellado con un tapón de goma a través del cual puedan
inyectarse líquidos y retirar la formulación con una jeringa.
El conjugado de vacuna o complejo de vacunas
según la presente invención es un complejo o conjugado de
anticuerpos y organismos de vacuna vivos; la unión entre anticuerpo
y organismo de vacuna es una unión liberable y no es una unión
covalente. La cantidad de anticuerpos neutralizantes adecuada para
su utilización con un organismo de vacuna dado y con un sujeto dado
puede determinarse fácilmente utilizando técnicas disponibles. La
utilización de demasiado poco anticuerpo resultará en efectos
patogénicos tempranos o severos no deseables causados por el
organismo de vacuna; la utilización de demasiado anticuerpo podría
inactivar el organismo de vacuna completamente o hacer que sea
incapaz de inducir una respuesta inmunológica protectora.
Las formulaciones de vacuna de la presente
invención pueden contener opcionalmente uno o más adyuvantes. Puede
utilizarse cualquier adyuvante adecuado, incluyendo
inmunoestimulantes químicos y polipeptídicos que potencien la
respuesta del sistema inmunológico frente a los antígenos.
Preferentemente, se administran adyuvantes tales como hidróxido de
aluminio, fosfato de aluminio, aceites vegetales y animales, y
similares junto con el conjugado de vacuna en una cantidad
suficiente para potenciar la respuesta inmunológica del sujeto al
conjugado de vacuna. La cantidad de adyuvante añadida al conjugado
de vacuna variará dependiendo de la naturaleza del adyuvante,
generalmente comprendida entre aproximadamente 0,1 y
aproximadamente 100 veces el peso de las bacterias o protozoos,
estando preferentemente comprendida entre aproximadamente 1 y
aproximadamente 10 veces el peso de las bacterias o protozoos.
Las formulaciones de vacuna de la presente
invención opcionalmente pueden contener uno o más estabilizantes.
Puede utilizarse cualquier estabilizante adecuado, incluyendo
carbohidratos, tales como sorbitol, manitol, almidón, sacarosa,
dextrina o glucosa; proteínas, tales como albúmina o caseína; y
tampones, tales como fosfato de metal alcalino y similares. La
utilización de un estabilizante es particularmente ventajosa cuando
la formulación de vacuna es una formulación liofilizada.
La presente invención se explica en más detalle
en los siguientes Ejemplos no limitativos.
La bacteria Pasteurella multocida causa
una enfermedad aguda altamente contagiosa en muchas especies de
aves. La enfermedad, el cólera aviar, a menudo se manifiesta como
una enfermedad septicémica, resultando en morbidez y mortalidad
elevadas. Existen varias vacunas vivas para la cólera aviar que
pueden administrarse a pollos y a pavos.
Se formó un complejo in vitro de una cepa
de P. multocida con anticuerpos específicos de P.
multocida para formar complejos
bacteria-anticuerpo. Las diferentes proporciones de
bacteria a anticuerpo se ensayaron con el fin de determinar una
proporción que no inactivase completamente la bacteria y aún de
esta manera permitiese que se produjera una respuesta inmunológica
activa. Estos complejos se utilizan como vacuna en pollos y pavos.
Se siguieron las respuestas de los vacunados y se compararon con las
respuestas de las aves vacunadas con la misma dosis de vacuna de
P. multocida no acomplejada con anticuerpo. Se realizó un
seguimiento de las lesiones después de la vacunación, de la
respuesta temporal de los anticuerpos y de la salud general de las
aves durante todo el ensayo.
También se ensayaron otras bacterias de una
manera similar. Estas bacterias incluían, pero sin limitación,
Mycoplasma gallisepticum en pollos o pavos, Bordetella
avium en pavos, especies de Salmonella en pollos o pavos,
y especies de Salmonella y de Listeria en
roedores.
Los conjugados de vacuna se administraron a aves
sea in ovo, tal como se ha descrito anteriormente, o después
de la eclosión.
Se formaron complejos in vitro del
protozoo Eimeria acervulina (específicamente, los
esporocistos y/o oocistos del mismo) con anticuerpos específicos de
Eimeria acervulina para formar complejos
protozoo-anticuerpo. Estos complejos se utilizaron
como vacunas en pollos. Se realizó un seguimiento de las respuestas
de los complejos de vacuna protozoo-anticuerpo y se
compararon con las respuestas de las aves vacunadas con la misma
dosis de E. acervulina no acomplejadas con anticuerpo. Se
ensayaron diferentes proporciones de protozoo a anticuerpo con el
fin de determinar una proporción que no inactivase completamente el
protozoo y que aún de esta manera permitiese la producción de una
respuesta inmunológica activa. Después de la vacunación se determinó
el número de oocistos en las heces de los vacunados, su capacidad
absortiva intestinal (evaluada mediante la asimilación de
cartenoides) y el peso corporal. Entre los 10 y 12 días después de
la vacunación se sometió a las aves en cada grupo vacunado a un
desafío virulento de E. acervulina. Se determinó el número
de oocistos en las heces de los vacunados, la ganancia de peso
corporal durante el periodo de desafío y la capacidad absortiva
intestinal (evaluada mediante asimilación de cartenoides) en
vacunados y en controles no vacunados.
También se ensayaron otras especies de
Eimeria en pollos, pavos o roedores, así como especies de
Cryptosporidium en pollos o pavos, e Histomonas
meleagridis en pollos o pavos.
Los conjugados de vacuna se administraron a aves
sea in ovo, tal como se ha descrito anteriormente, o antes
de la eclosión.
Se vacunaron pollos y se estudiaron para
determinar los efectos del acomplejamiento de una vacuna de
oocistos de E. acervulina con anticuerpos.
Se estudiaron cuatro estrategias de vacunación.
Se vacunaron grupos de tratamiento (mediante alimentación oral
forzada) con 500 oocistos esporulados de E. acervulina
acomplejados con 0, 2,5, 25 ó 150 unidades de anticuerpo policlonal
específico para E. acervulina. Se proporcionó cada
tratamiento a tres grupos de cinco pollos Leghorn (15 aves en total
en cada grupo de tratamiento; 60 aves de tratamiento en total). Un
grupo de control de quince aves (5 aves en tres repeticiones) no
recibieron oocistos ni anticuerpos pero se trataron con
alimentación oral forzada de 0,1 ml de PBS administrado en el día
de la eclosión y posteriormente se les sometió al desafío
infectivo.
Se definen las unidades de anticuerpo sobre una
base volumétrica, en la que 1\mul = 1 unidad. Se utilizó un
ensayo ELISA para determinar las "unidades de titulación" de
la preparación de anticuerpos utilizada en el presente ejemplo; sin
embargo, este ensayo no ha sido validado. Según el ensayo ELISA, la
preparación de anticuerpos de E. acervulina presentaba un
título de 90.782 unidades/ml. Las dosis utilizadas en la presente
invención proporcionan una comparación relativa; la cantidad
apropiada de anticuerpo a acomplejar con un organismo dado
dependerá de cuál es el organismo, de la preparación de los
anticuerpos y del sujeto a tratar. Un experto en la materia,
utilizando técnicas conocidas en la técnica, sería capaz de
determinar las proporciones apropiadas de organismo:anticuerpo para
una utilización dada.
Los oocistos y anticuerpos se mezclaron en PBS
durante un mínimo de una hora antes de la vacunación a temperatura
ambiente. La vacuna complejo se almacenó después a 4ºC hasta su
administración. Los pollos se vacunaron el día de la eclosión.
El número de oocistos después de la vacunación se
determinó recogiendo heces en los días 4 a 8 después de la
vacunación y contando los oocistos en éstas. Se determinó para cada
grupo la media y desviación estándar del número de oocistos. Tal
como se muestra en la Tabla 1, la utilización de 150 \mul de
anticuerpos acomplejados con 500 oocistos redujo significativamente
el número de oocistos.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\begin{minipage}[t]{130mm} 1. a,b: diferentes al nivel 0,15
según prueba de LSD. Se fijó la significancia al nivel 0,20 debido
al pequeño tamaño de la muestra. No se incluyeron los controles en
el modelo estadístico. \end{minipage} \cr
\begin{minipage}[t]{130mm} 2. N = Tres grupos de cinco aves en
cada grupo.
\end{minipage} \cr}
A continuación, en el día 13 después de la
eclosión, se presentó un desafío de 250 oocistos de E.
acervulina en PBS administrados mediante alimentación oral
forzada, a las aves de los grupos de tratamiento descritos en el
Ejemplo 1. Se recogieron las heces en los días cuatro a ocho
después del desafío, y se determinó el número medio de oocistos
como porcentaje del número de oocistos en el grupo de control (el
modelo estadístico incluía el grupo de control). Se proporcionan
los resultados en la Tabla 2. La mayor salida de oocistos después
del desafío indica menos protección frente al desafío
patogénico.
| 1. A, B, C: diferencia al nivel 0,05 según la prueba de SNK. |
| 2. Control = aves no vacunadas y a las que se sometió a un desafío infectivo. |
Los datos proporcionados en la Tabla 2 se
re-analizaron sin incluir los datos del grupo de
control en el modelo estadístico. Se proporcionan los resultados en
la Tabla 3.
| 1. A, B, C: diferentes al nivel 0,05 según la prueba de SNK. |
| 2. Control = aves no vacunadas a las que se sometió a un desafío infectivo. |
Los resultados que se proporcionan en los
Ejemplos 1 a 3 indican que la utilización de 150 \mul de
anticuerpos conjuntamente con la dosis de vacunación de 500
oocistos de E. acervulina resultaron en una disminución de
los efectos patogénicos de la vacunación (en comparación con la
utilización de la misma vacunación con menores cantidades de
anticuerpo o sin anticuerpo; según indicaba el menor número de
oocistos tras la vacunación), o posiblemente el retraso en los
efectos patogénicos de la dosis de vacunación. Según se muestra en
la Tabla 1, la utilización de 150 \mul de anticuerpos acomplejados
con los oocistos de la vacuna resultó en un nivel menor de
infectividad que la vacuna sin anticuerpos o que la utilización de
menores cantidades de anticuerpos (p \leq 0,15).
Tal como se muestra en la Tabla 2, las aves
vacunadas con vacuna anticuerpo-oocisto presentaban
un número reducido de oocistos tras el desafío con 250 oocistos de
E. acervulina, en comparación con las aves no vacunadas.
Estos resultados indican que la preparación de vacuna
anticuerpo-oocisto es efectiva en la inducción de
una respuesta inmunológica protectora frente al desafío patogénico.
La protección fue más elevada en el grupo de tratamiento vacunado
con oocistos pero sin ningún anticuerpo, con un nivel de
significancia de 0,05. Tal como se muestra en la Tabla 3, entre las
aves tratadas con vacuna de anticuerpo-oocisto, la
protección más elevada se observó nuevamente en el grupo tratado
con oocistos pero sin anticuerpos.
Los resultados anteriores indican que la
utilización de un complejo de vacuna de anticuerpos y oocistos
resulta en una disminución de los efectos patogénicos de los
oocistos de la vacuna, o en un retraso en los efectos patogénicos de
los oocistos de la vacuna, mientras que todavía se produce una
respuesta inmunológica protectora. Cualquiera de los dos efectos se
esperaría que incrementase la seguridad de la vacuna, al permitir
la administración de ésta a sujetos más susceptibles a los efectos
patogénicos del organismo de vacuna, o a sujetos más jóvenes (tales
como aves in ovo).
Lo anterior es ilustrativo de la presente
invención y no debe interpretarse como limitativo de la misma. La
invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas.
Este estudio ensayó una vacuna de 500 oocistos de
Eimeria acervulina acomplejados con cantidades variables de
anticuerpo (2,5 a 150 \mul). Los tratamientos se compararon con
un control no vacunado y con un control vacunado sin anticuerpos.
Todos los tratamientos se administraron en el día de la eclosión.
Se determinó en todos los tratamientos el número de oocistos después
de la vacunación en los días 4 a 8. También se midió el número de
oocistos después del día 13 de un desafío de dosis reducida.
Materiales y métodos: Se utilizaron pollos
Leghorn SPF de Hyvac para descartar efectos de anticuerpos
maternos. Se preparó el anticuerpo policlonal a partir de pollos
inmunizados con oocistos de E. acervulina. Se combinaron dos
preparaciones de anticuerpos con el fin de crear un anticuerpo de
E. acervulina con un título final de 90.782. En la Tabla 4
se muestran los grupos de tratamiento y el diseño experimental.
Se preparó la vacuna complejo mezclando oocistos
(USDA nº 12 Lote 28-131-36) con
anticuerpos en el volumen apropiado. Se incubó el complejo a
temperatura ambiente durante una hora antes de la administración.
Las aves se alimentaron forzadamente el día de la eclosión con una
dosis de 200 \mul del tratamiento respectivo. Se recogió el
material fecal desde el día 4 hasta el día 8. Las muestras de heces
se procesaron y contaron utilizando cámaras de McMaster con el fin
de determinar el número de oocistos por ave.
Las aves se trasladaron a una unidad más amplia y
se les sometió a un desafío de dosis reducida (250 oocistos de
E. acervulina) el día 13 después de la eclosión. Se
recogieron las heces los días 4 a 8 después del desafío y se
enumeraron de la manera descrita anteriormente.
El control vacunado mostró una salida de
\cong12 x 10^{6} oocistos por ave. Los tratamientos de 2,5
\mul y 25 \mul de anticuerpo mostraron resultados similares,
sin embargo, el tratamiento de 150 \mul de anticuerpos podría
haber tenido un efecto inhibitorio sobre el número de oocistos, con
sólo un 46% del número en comparación con el control. Ver figura
1.
Tras un desafío de dosis reducida, se observaron
resultados similares en todos los grupos de tratamientos vacunados
con anticuerpos. Figura 3. Los tres grupos de tratamiento con
anticuerpos presentaron una media de aproximadamente el 40% del
número de oocistos en el control. El control vacunado presentó un
número de oocistos de sólo el 23% del control.
Se ensayaron dos conjugados de vacuna
anticuerpos-oocistos en un modelo de desafío de
dosis elevada. Se midió la infectividad mediante el número de
oocistos y la respuesta al desafío, como ganancia de peso y número
de lesiones. Los conjugados de vacuna consistían en 500 oocistos de
E. acervulina acomplejadas con 25 ó 150 \mul de anticuerpo
(tal como se describe en el Ejemplo 6); ver Tabla 5. Se utilizó la
misma cepa de ave, anticuerpo y lote de oocistos que en el Ejemplo
6, anteriormente.
Las vacunas se prepararon tal como se ha descrito
anteriormente y se administraron en el día 0 después de la eclosión
en un volumen de 200 \mul. Se recogió el material fecal entre los
días 4 y 8 y se enumeró.
Los parámetros posteriores al desafío que se
midieron en el presente experimento fueron diferentes de los del
Ejemplo 6. Se administró un desafío de dosis elevada a todos los
grupos de tratamiento en el día 13 y se registraron los pesos de
cada ave individual. Tras ocho días (día 21) se pesaron las aves y
se contaron las lesiones.
En el presente experimento, el número de oocistos
en el control vacunado, así como en los dos tratamientos con
anticuerpos, fue menor que en el Ejemplo 6; el control vacunado
(sin anticuerpo) mostró una reducción de 20 veces en el número de
oocistos (ver figura 2). La causa de esta reducción no está
clara.
Se administró un desafío de dosis elevada
(desafío de 500 oocistos) a todos los grupos de tratamiento y se
examinaron la ganancia de peso y el número de lesiones. Los
resultados de ganancia de peso (figura 4) no demostraron una
diferencia entre los grupos de tratamiento, incluyendo los controles
vacunados y no vacunados. Los datos de número de lesiones (figura
5) fueron indicativos de protección de todos los grupos vacunados
en comparación con los controles no vacunados.
Se introdujeron diez pollos SPF después de la
eclosión en un cuarto limpio; a las cuatro semanas de edad, cada
ave recibió (inyección subcutánea en el cuello) 0,5 ml de
"Pabac" de Solvay, una vacuna inactivada comercial de P.
multocida en emulsión aceitosa que contiene los serotipos 1, 3
y 4; a las ocho semanas de edad, se inyectaron subcutáneamente 0,5
ml adicionales en el cuello y se inyectaron otros 0,5 ml
intramuscularmente en la parte derecha del tórax. Se extrajeron
aproximadamente 20 ml de sangre de cada ave mediante punción
cardíaca a las diez semanas de edad. Se recogieron los antisueros
de la sangre, se agruparon y se filtraron a través de un filtro de
0,45 \mum. Tras numerosas pruebas de esterilidad, todos dieron
resultados negativos, los antisueros se introdujeron en viales de
diferentes tamaños y se almacenaron en un congelador a -20ºC hasta
su utilización.
Se cultivaron las cepas Cu y M9 de P.
multocida a partir de vacunas vivas, Choleramune Cu y Multimune
M respectivamente, las dos producidas por Biomune. Se determinó que
dichas cepas de P. multocida se congelaban mejor a -70ºC en
una mezcla de 90% de cultivo y 10% de glicerol.
El presente experimento se diseñó para determinar
si diferentes números de unidades formadoras de colonias (CFU) de
las cepas Cu y M9 de P. multocida afectaban a la
eclosionabilidad de los huevos de pollos SPF después de la
inoculación en el huevo en el día 18 de la incubación. Se diluyó
cada cepa de P. multocida en solución salina tamponada con
fosfato (PBS) con el fin de producir tres diluciones: 1.000 CFU por
cada 0,1 ml; 100 CFU por cada 0,1 ml; y 10 CFU por cada 0,1 ml. En
el día 18 de la incubación, se inocularon 0,1 ml de cada dilución
de cada cepa en catorce huevos de pollos SPF. Se inocularon trece
huevos con 0,1 ml de una mezcla de caldo infusión de
cerebro-corazón (BHI), PBS y glicerol (vehículo de
control) y trece huevos no recibieron inoculación.
Los resultados en la Tabla 6 muestran que la
eclosionabilidad de los huevos de pollos SPF se vio severamente
deprimida en los grupos 2 a 7.
Cada huevo inoculado se inoculó con 0,1 ml de una
mezcla de cultivo/PBS que contenía el número apropiado de CFU. Las
diluciones que contenían 1 x 10(2) CFU/ml se titularon para
cada cepa y los títulos difirieron algo de los números deseados. El
grupo 4, de hecho, contenía 10,5 CFU/huevo, el grupo 3 contenía 105
CFU/huevo y el grupo 2 contenía 1.050 CFU/huevo. El grupo 7 contenía
12,5 CFU/huevo. El grupo 6 contenía 125 CFU/huevo y el grupo 5
contenía 1.250 CFU/huevo. Los huevos del grupo 1 se inocularon con
0,1 ml de mezcla de BHI/PBS/glicerol.
Se retiró un ml de antisuero de pollo de P.
multocida (ver Ejemplo 8) de su almacenamiento a -20ºC y se
descongeló a temperatura ambiente. El suero se diluyó en serie 2
veces en PBS. Medio ml de cada dilución de suero se mezcló con 0,5
ml de cultivo de cepa Cu de P. multocida que contenía 100
CFU/0,5 ml. Esta mezcla se reaccionó durante una hora a temperatura
ambiente. Después de una hora, se cultivó en placas TSA, 0,5 ml de
cada mezcla de dilución de suero por duplicado y se cultivaron 200
CFU/ml de solución madre de cepa Cu de P. multocida por
triplicado. Las placas se incubaron durante 48 horas a 37ºC. Las
colonias se contaron tras 24 horas y 48 horas de incubación. Se
muestran los resultados en las Tablas 7 y 8.
\hskip1cm*Este es el número de CFU esperado en 1 ml de mezcla, a partir del título en la Tabla 8.
| CFU/0,5 ml | Media | Por cada 1,0 ml |
| 176 | ||
| 131 | 152 x 2 | =304 |
| 150 |
Se cultivaron en placas las muestras de solución
madre presentadas en la Tabla 8 tras preparar todas las mezclas. No
se dejó reposar la solución durante una hora más. Una mezcla de 0,5
ml de esta solución madre y 0,5 ml de antisuero rinden teóricamente
152 CFU/ml de mezcla.
Los resultados demuestran una reducción en el
número de CFU bacterianas desde el antisuero menos diluidos hasta
el antisuero más diluido (Tabla 7). Esto puede ser debido al tiempo
de reacción. El antisuero más diluido reaccionó durante más tiempo
con el cultivo vivo que el antisuero menos diluido (20 a 30 minutos
más). El mayor tiempo podría haber conducido a un mayor número de
muertes de colonias. La agitación repetida con vórtex de la
solución madre (3 a 4 CFU/ml) también podría haber contribuido a la
reducción observada en el conteo de colonias. El Ejemplo siguiente
investiga esta tendencia adicionalmente.
El presente experimento investigó la reacción
entre colonias de cepa Cu de P. multocida y las mismas
diluciones del antisuero de P. multocida que se muestran en
la Tabla 6. En lugar de agitar con vórtex la solución madre
"2x10(2)" de cepa Cu de P. multocida de manera
continua, al igual que en el experimento anterior, la solución se
mezcló suavemente mediante pipeteado. Para formar cada complejo de
anticuerpo-bacteria, se mezcló un ml de dilución de
antisuero con un ml de dilución de cultivo madre. Esta mezcla se
dejó reaccionar durante cuatro horas. La solución madre se cultivó
en placa sobre placas TSA por triplicado y se encontró que contenía
186 CFU/ml (Tabla 9). El resto de esta solución se dejó reposar a
temperatura ambiente durante cuatro horas.
Después de un tiempo de reacción de cuatro horas,
se mezclaron 0,5 ml de cada mezcla de
anticuerpo-bacteria y se cultivaron sobre TSA por
duplicado. La solución madre de 186 CFU/ml se mezcló y cultivó
sobre TSA por triplicado (0,5 ml/placa). Se contaron las colonias a
las 24 horas después de la incubación a 37ºC y nuevamente después
de 96 horas. Los resultados se proporcionan en las Tablas 9 y
10.
Los datos en la Tabla 10 muestran la misma
relación de reducción en el conteo de colonias con diluciones
crecientes de antisuero que se observó en el experimento anterior,
ligeramente más pronunciada. Parecía haber más CFU/ml de las
esperadas en las mezclas diluidas 1:16 a 1:4.096. Se presentan
resultados similares en la Tabla 7. Los conteos de colonias en la
Tabla 9 sugieren que los CFU mueren en PBS a lo largo del tiempo en
ausencia de suero. Esto podría explicar el conteo de colonias menor
del esperado en las diluciones 1:8.192 a 1:32.768 en ambos
estudios. El antisuero podría estar demostrando alguna capacidad de
inhibición del crecimiento a las mayores diluciones, mientras que
muestra efectos de potenciación del crecimiento en las mezclas
menos diluidas. El experimento siguiente se llevó a cabo con el fin
de investigar posibles causas para estas observaciones.
Se compararon in vitro los efectos del
antisuero de P. multocida y del suero negativo (suero de
pollo que no contiene anticuerpos de P. multocida) sobre el
crecimiento de la cepa M9 de P. multocida. Se prepararon
diluciones del suero y diluciones de un cultivo de P.
multocida de la misma manera que en el Ejemplo 11. Un ml de
cultivo que contenía 139 CFU por ml (Tabla 6) se mezcló con un ml
de suero diluido. Se prepararon tres diluciones (1:16, 1:512 y
1:32.768) de suero negativo y se mezclaron con la cantidad apropiada
de cultivo bacteriano. Las mezclas de dilución de cultivo
bacteriano/suero reaccionaron entre sí durante una hora a
temperatura ambiente.
Las mezclas de anticuerpo
sérico-bacteria se cultivaron en placas TSA (0,5 ml)
por duplicado y las mezclas de suero
negativo-bacteria se cultivaron por triplicado
después de un tiempo de reacción de una hora. La solución madre de
cepa M9 de P. multocida se cultivó en placa por triplicado
tras añadir 1,0 ml a todas las diluciones de antisuero y suero
negativo y nuevamente tras dejarlos reposar a temperatura ambiente
durante una hora. Se contaron las colonias tras incubación de 24
horas a 37ºC y se anotaron los cambios en los conteos tras 48 horas
de incubación. Se proporcionan los resultados de estos conteos en
las Tablas 11 y 12.
No se dieron cambios en los conteos de colonias
tras 48 horas de incubación a 37ºC.
Los datos en los Ejemplos 10 a 12 muestran
incrementos iniciales, que conducen a reducciones graduales en el
número de CFU, con mayores diluciones de los antisueros contra
P. multocida. Los datos combinados sugieren que ambas cepas
de P. multocida podrían utilizar el suero como medio de
crecimiento. A medida que la concentración del suero es menor,
también se reduce el crecimiento de P. multocida. Algunos de
los resultados sugieren que P. multocida muere cuando se
diluye en PBS y se deja reposar a temperatura ambiente durante una
a cuatro horas. Esto podría explicar el número menor del esperado de
CFU en las diluciones 1:8.192 a 1:32.768. A medida que el suero es
menos concentrado, se incrementa la concentración de PBS. Sin
embargo, no se observó una gran diferencia en los conteos de
colonias de la solución madre en el presente ejemplo, antes y
después de un periodo de espera de una hora, aunque los conteos
reducidos en las diluciones más elevadas siguieron dándose.
Los conteos de colonias para las mezclas de suero
que no contenían anticuerpos contra P. multocida en
comparación con sus contrapartidas que contenían anticuerpos contra
P. multocida y los conteos de la solución madre, podrían
estar mostrando alguna capacidad inhibitoria del crecimiento por
parte del antisuero que contiene anticuerpos contra P.
multocida. Los conteos de CFU en las muestras sin antisuero
contra P. multocida eran inicialmente elevados y se
redujeron, aunque no a un nivel menor de lo esperado en comparación
con los conteos de CFU de la solución madre después de una hora.
Los conteos de CFU fueron menores en dos de tres muestras que
contenían anticuerpos contra P. multocida que en las
muestras de suero negativo sin anticuerpos contra P.
multocida. La inhibición del crecimiento provocada por el
antisuero contra P. multocida podría estar enmascarada por
la presencia de otros factores.
El presente estudio se diseñó para ensayar el
efecto de los complejos de anticuerpo
sérico-bacteria cuando se administran in ovo
en huevos de pollos SPF. Se mezcló el mismo número de CFU (el
objetivo era cinco) de cepa M9 de P. multocida con
cantidades variables de antisuero contra P. multocida y
después se inocularon 0,1 ml de cada mezcla en quince huevos de
pollos SPF en cada uno de siete grupos. Se preparó una solución
madre de 100 CFU/ml utilizando cultivo de cepa M9 de P.
multocida. Con el fin de asegurar que cada huevo recibía el
mismo número de CFU, se mezcló la cantidad apropiada de suero con la
cantidad apropiada de la solución madre para cada grupo a
intervalos de cinco minutos. Estas mezclas se dejaron a temperatura
ambiente durante treinta minutos, tras los cuales, se inocularon
0,1 ml en quince huevos en el día dieciocho de la incubación. La
solución madre de 100 CFU/ml se cultivó en placa por triplicado
tras la preparación de la mezcla del grupo final y nuevamente tras
reaccionar ésta durante 30 minutos (Tabla 13). Se incubaron todas
las placas a 37ºC durante 24 horas, tras las cuales, se contaron
las colonias. La Tabla 14 proporciona los datos de eclosionabilidad
para cada grupo.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
El presente estudio se diseñó originalmente para
inocular cada huevo que iba a recibir bacterias con 5,0 CFU en
mezclas con el volumen apropiado de antisuero contra P.
multocida. La información de títulos en la Tabla 13 muestra que
los huevos recibieron un número de CFU más cercano a 3,2 que a 5 y
que se dio una pérdida pequeña de colonias como resultado del
periodo de reacción de 30 minutos. Los resultados en la Tabla 14
muestran que incluso un número pequeño de CFU de cepa M9 de P.
multocida destruye los huevos de pollos SPF cuando se
administran en el día dieciocho de la incubación. Los controles en
el grupo 7 eclosionaron en el 100% de los casos. La eclosión se vio
severamente afectada en los otros grupos. De estos grupos, el 5 y
el 6 contenían los porcentajes más elevados de aves eclosionadas en
total. Los huevos en el grupo 6 se inocularon con la proporción más
elevada de antisuero contra P. multocida (50 \mul + 3,2
CFU) y eclosionaron en el 60% de los casos, con un 27% de eclosiones
normales. Esta tendencia sugiere que el antisuero contra P.
multocida, en combinación con las bacterias vivas, puede
proporcionar algún grado de protección al embrión de pollo al
reducir o retrasar los efectos patogénicos de la bacteria.
Los datos en las Tablas 12 y 14, de comparación
de suero con y sin anticuerpos contra P. multocida y
diferentes cantidades de anticuerpos séricos, respectivamente,
muestran un posible efecto inhibitorio de los anticuerpos séricos
contra P. multocida sobre el crecimiento, y tal vez sobre los
efectos patogénicos, del organismo. En la Tabla 14 se muestra que
las dos cantidades más elevadas de anticuerpo (grupos 5 y 6)
resultaron en mejores eclosiones en comparación con la bacteria
sola (grupo 1).
Se obtuvo un cultivo de la bacteria Mycoplasma
gallisepticum cepa F en la North Carolina State
University,
Mycoplasma Lab., College of Veterinary Medicine. La cepa F de M. gallisepticum se utiliza en la industria avícola como vacuna viva. Se inocularon cuarenta mililitros de medio de Frey suplementado con suero de cerdo al 15% (FMS) con 1,33 ml de cultivo bacteriano. Después, esta mezcla se incubó durante aproximadamente 18 horas a 37ºC y el cultivo maduro se mezcló 80/20 con glicerol estéril para su congelación a -70ºC. Se ensayó la esterilidad de esta mezcla sobre ágar tripticasa soja (TSA) y no creció ningún organismo extráneo. La determinación del título del cultivo madre de cepa F de M. gallisepticum tras 24 horas a -70ºC fue de 5,8 x 10(8) CFU/ml.
Mycoplasma Lab., College of Veterinary Medicine. La cepa F de M. gallisepticum se utiliza en la industria avícola como vacuna viva. Se inocularon cuarenta mililitros de medio de Frey suplementado con suero de cerdo al 15% (FMS) con 1,33 ml de cultivo bacteriano. Después, esta mezcla se incubó durante aproximadamente 18 horas a 37ºC y el cultivo maduro se mezcló 80/20 con glicerol estéril para su congelación a -70ºC. Se ensayó la esterilidad de esta mezcla sobre ágar tripticasa soja (TSA) y no creció ningún organismo extráneo. La determinación del título del cultivo madre de cepa F de M. gallisepticum tras 24 horas a -70ºC fue de 5,8 x 10(8) CFU/ml.
El antisuero contra la cepa R de M.
gallisepticum se adquirió del NCSU Mycoplasma Lab. El antisuero
se produjo mediante la hiperinmunización de conejos New Zealand
White con cepa R de M. gallisepticum inactivada en adyuvante.
Los conejos se inmunizaron mediante inyecciones intramusculares e
intradérmicas tres veces previamente a la recogida de sangre. Este
antisuero se denominó MGA.
El presente experimento investigó el crecimiento
de una cantidad dada de cepa F de M. gallisepticum a lo
largo del tiempo tras mezclar el organismo con cantidades
diferentes de MGA. Una muestra de MGA se diluyó inicialmente 1:10 en
solución salina tamponada con fosfato (PBS). Después, el antisuero
se diluyó adicionalmente realizando 10 diluciones 1:2 en serie
mediante la adición de 0,5 ml de la dilución anterior de 0,5 ml de
PBS (diluciones 1:20 a 1:10.240). Se descongeló un vial de cepa F
de M. gallisepticum a temperatura ambiente y se diluyó
1:100. Esta solución madre 10(-2) contenía 5,8 x 10(6)
CFU/ml. Se prepararon complejos de
bacteria-anticuerpo mediante la adición de 0,4 ml de
solución madre de 5,8 x 10(6) a 0,4 ml de cada una de las 11
diluciones de MGA. Estos complejos se dejaron reaccionar a
temperatura ambiente durante 30 minutos. El tratamiento 12
consistió en 0,4 ml de PBS añadido a 0,4 ml de la misma solución
madre bacteriana.
Una vez completado el tiempo de reacción de 30
minutos, se diluyó en serie cada uno de los 12 tratamientos en FMS,
de 10(-1) a 10(-8). Estos tubos se incubaron durante 14 días y se
determinó el crecimiento a las 41 horas, 47,5 horas y a los 14 días
(el crecimiento de M. gallisepticum se detecta en FMS por un
cambio de color. A medida que el crecimiento bacteriano se
incrementa, se reduce el pH del medio, causando un cambio de color
en el indicador de pH rojo fenol. A medida que se da el crecimiento
el color cambia gradualmente desde rojo profundo a naranja y
finalmente a amarillo. El grado de crecimiento puede clasificarse
basándose en el color del medio). Se proporcionan los resultados en
la Tabla 15.
MgF* = antisuero MgF en 0,4 ml
0,4 ml de MgF** = 0,4 ml de MgF 2,32x10(-6)
Presencia de MgF*** = Presencia de MgF en el tubo
de dilución (tras 14 días de incubación)
- (sin crecimiento; rojo profundo)
+/- (crecimiento inicial; color rojo más claro
que en los tubos de control)
+ (ligero crecimiento; rojo claro)
\text{++} (crecimiento moderado; naranja
profundo)
\text{+++} (crecimiento moderado a intenso;
naranja claro)
\text{++++} (crecimiento intenso; amarillo)
Se detectó crecimiento en todos los 12
tratamientos en el día 14 (Tabla 1). El crecimiento se retrasó en
los grupos 1 a 4, que contenían los niveles más elevados de MGA. El
crecimiento en estos grupos no resultó claro tan pronto como en los
grupos con niveles más bajos de MGA.
Estos resultados sugieren que los niveles más
elevados de MGA presentaban un efecto inhibitorio del crecimiento
sobre la bacteria.
Se descongeló un vial de solución madre de cepa F
de M. gallisepticum y se diluyó 1:100 en FMS. Esta dilución
10(-2) contenía aproximadamente 5x10(6) CFU/ml. Un ml de la
dilución madre 10(-2) se introdujo en cada uno de los ocho tubos de
dilución tras mezclarla cuidadosamente. Se añadió cierta cantidad de
MGA a cada tubo (ver Tabla 16) y se mezclaron los complejos de
bacteria/antisuero. Se incubaron a temperatura ambiente durante 15
minutos y después a 37ºC. SE determinó el crecimiento durante el
transcurso de 13 días utilizando el cambio de color en el medio de
crecimiento FMS como indicador. Los resultados se proporcionan en
la Tabla 16.
+ (crecimiento ligero; rojo claro)
\text{++} (crecimiento moderado; naranja
profundo)
\text{+++} (crecimiento moderado a intenso;
naranja claro)
\text{++++} (crecimiento intenso; amarillo)
Se dio un crecimiento moderado de M.
gallisepticum dentro de las primeras 27 horas de incubación en
el tubo que no contenía antisuero y el crecimiento fue intenso en
este tubo a las 46 horas a 37ºC (Tabla 16). No se detectó
crecimiento bacteriano dentro de las primeras 27 horas de
incubación en los tubos que contenían 1,5 \mul o más de MGA. Tras
46 horas de incubación, todavía no podía detectarse crecimiento en
los tubos que contenían 12, 24 y 48 \mul de MGA. Todos los tubos
mostraron crecimiento intenso de M. gallisepticum tras 13
días a 37ºC. Estos resultados demuestran que la bacteria estaba
presente en todos los tubos, pero que las cantidades más elevadas
de antisuero retrasaron el crecimiento durante periodos de tiempo
más largos que las cantidades menores. El tiempo que tardó en
detectarse el crecimiento parece ser directamente proporcional a la
cantidad de MGA en el complejo
bacteria-antisuero.
Se inocularon nueve grupos de huevos en el día 18
de la incubación. Siete de los grupos se inocularon con uno de
siete complejos diferentes de cepa F de M.
gallisepticum-MGA. Un grupo se inoculó con sólo la bacteria y el
otro grupo se inoculó con una dilución 1:4 de FMS en PBS.
Se descongeló un vial de solución madre de cepa F
de M. gallisepticum y se diluyó 1:5 y 1:10 en 10% de FMS y
90% de diluyente PBS. Se utilizaron cantidades apropiadas de estas
diluciones para crear los complejos de bacteria-MGA.
Cada huevo recibió una inyección de 0,1 ml que contenía el mismo
número de CFU de M. gallisepticum con la cantidad apropiada
de antisuero para un grupo particular, excepto para el grupo 1. Los
huevos del grupo 1 recibieron 0,1 ml de FMS/diluyente PBS. Los
complejos se dejaron reaccionar durante 10 minutos previamente a la
inoculación. Después, los huevos se inocularon hasta la
eclosión.
La dilución 1:10 de la solución bacteriana se
tituló preparando 3 series de dilución hasta 10(-9) y cultivando en
placa las diluciones 10(-6) de las dos series de dilución TSA e
incubando a 37ºC. Todos los tubos en todas las tres series de
dilución seriada mostraron crecimiento de M. gallisepticum.
El título fue de 8 x 10(8) CFU/ml. Los resultados de
eclosionabilidad se proporcionan en la Tabla 17.
Los complejos de MGA-M. gallisepticum
influyeron sobre el porcentaje de eclosión y la salud de los
polluelos. Los grupos que experimentaron eclosiones superiores al
90% fueron los grupos que contenían las proporciones más grandes de
MGA a CFU (con la excepción del grupo 4). El porcentaje de polluelos
sanos fue mucho más elevado en los grupos 2 y 3 que en otros grupos
que recibieron complejos de MGA-bacteria con menos
antisuero en la formulación. Estos resultados indican que
determinadas proporciones de MGA:bacteria tienen la capacidad de
proteger al embrión de pollo en desarrollo al retrasar y/o reducir
los efectos patogénicos de la bacteria.
Se inocularon seis grupos de 16 huevos viables en
el día 18 de la incubación. Los 16 huevos en el grupo de control
negativo (grupo 6) se inocularon el día 18 con 0,1 ml de diluyente
(1 parte de FMS en 9 partes de PBS) y eclosionaron en una unidad
incubadora grande que no contenía ningún otro huevo.
Se descongeló a temperatura ambiente un vial de
solución de cepa F de M. gallisepticum y se diluyó 1:5
(solución 2). La titulación de la solución 2 mostró que contenía
7x10(7) CFU/ml. Después, se diluyó la solución 2 en alícuotas
de 0,9 ml y se combinó con 0,5, 10, 20 y 40 \mul de MGA. Una vez
mezclada, las formulaciones de bacteria-MGA se
dejaron incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Los
complejos bacteria-MGA se administraron a los huevos
de cada grupo en dosis de 0,1 ml. Los huevos del grupo 1 recibieron
inoculaciones que contenían solamente bacterias. Cada grupo de 16
huevos se introdujo después en unidades incubadoras pequeñas
separadas hasta el día de la eclosión. Las CFU ensayadas de las
formulaciones de MGA-M. gallisepticum se muestran en la Tabla
18.
La dilución restante de la solución 2 se tituló
en tres diluciones seriadas separadas de 10 veces hasta 10(-9)
utilizando FMS. Los tubos de dilución 10(-4), 10(-5) y 10(-6) en
cada serie se cultivaron en placas por cuadruplicado en ágar FMS y
se incubaron a 37ºC durante 9 días.
En el día de la eclosión, se procesaron los
grupos 1 a 5. Se muestrearon los polluelos normales y de aspecto
sano para detectar la presencia de M. gallisepticum llevando
a cabo un frotis de la hendidura de la coana con un hisopo estéril
e inoculando tubos que contenían 1,8 ml de FMS. Tras procesar los
polluelos, los muestreados de cada grupo se introdujeron en un
espacio de contención P2. Cada grupo se introdujo en un jaula de
cría separada sin que entrasen en contacto ninguna de las
jaulas.
Los polluelos en el grupo 6 con vehículo de
control experimentaron una eclosión retrasada y se procesaron el
día siguiente de la eclosión de los grupos 1 a 5. Se realizó un
frotis de diez aves de control para detectar la presencia de M.
gallisepticum y se introdujeron en una jaula de cría en un
espacio separado de contención P2. A los 21 días de edad, se
obtuvieron muestras de sangre de todos los polluelos supervivientes
y se recogió suero para determinar los anticuerpos contra M.
gallisepticum mediante aglutinación en placa (SPA) del suero y
ELISA. Se proporcionan los resultados en la Tabla 18.
| \begin{minipage}[t]{145mm} * Debido a un error de cálculo, los huevos en el grupo 1 recibieron 1,4x10(6) CFU. \end{minipage} |
| \begin{minipage}[t]{145mm} ** Todas las reacciones positivas SPA se registraron como 3 o más en una escala de 0 a 4, siendo 4 la reacción más fuerte. \end{minipage} |
Los huevos que recibieron la bacteria sin
antisuero (grupo 1) y las dos cantidades más bajas de MGA más M.
gallisepticum (grupos 2 y 3) presentaron el porcentaje más bajo
de eclosiones y no eclosionaron aves normales. El grupo de vehículo
de control (grupo 6) experimento una eclosión retrasada así como una
eclosión más pobre de lo esperado. Esto probablemente estuvo
causado por el hecho de que los huevos se incubaron en una
incubadora grande preparada para la incubación de 2.000 huevos. A
pesar de este problema de eclosión, 10 polluelos estaban sanos y
sus ensayos de aislamiento de M. gallisepticum y los dos
ensayos de anticuerpos séricos fueron negativos. Los grupos 4 y 5
presentaron porcentajes de eclosión y de eclosiones normales mucho
mejores que las de los grupos 1, 2 y 3. Los huevos en estos dos
últimos grupos recibieron niveles más elevados de MGA y el grupo 5
(3,5x10(6) CFU + 40 \mul de MGA) experimentaron la mejor
eclosión de todos los grupos. Todas las aves en el momento de la
recolección de los sueros estaban vivas y sanas. La respuesta de
anticuerpos contra M. gallisepticum medida con el ensayo SPA
y la ELISA indican que las vacunas complejas de cepa F de M.
gallisepticum fueron eficaces para las aves en los grupos 3, 4
y 5.
Resulta interesante indicar que un ave en el
grupo 5 dio resultados negativos para el
re-aislamiento de M. gallisepticum en el
momento de la eclosión, para el ensayo SPA y la ELISA. Todas las
demás aves que se muestrearon de los grupos 3, 4 y 5 dieron
resultados positivos en los ensayos en cada caso. Parece que un ave
en el grupo 5 no llegó a infectarse.
Los Ejemplos 14 a 18 se diseñaron para probar la
utilidad de un complejo de vacuna
bacteria-anticuerpo. Los datos apoyan el concepto de
que la adición de antisuero específico (para la bacteria de la
vacuna) contra bacterias vivas en la proporción apropiada
proporciona protección al embrión aviar reduciendo o retrasando los
efectos patogénicos de la bacteria a la vez que permite el
desarrollo de una respuesta inmunológica eficaz en los polluelos
recién eclosionados, como evidencia una respuesta inmunológica
humoral activa.
Claims (16)
1. Preparación de vacuna útil para producir
inmunidad activa contra una enfermedad bacteriana o protozoárica,
que comprende un conjugado de vacuna que comprende (i) un
organismo patogénico vivo seleccionado de entre el grupo que
consiste en bacterias patogénicas y protozoos patogénicos y (ii) un
factor neutralizante unido al organismo vivo, siendo capaz el
factor neutralizante de neutralizar el organismo vivo y
seleccionándose de entre el grupo que consiste en anticuerpos y
fragmentos de anticuerpo.
2. Preparación según la reivindicación 1, en la
que el factor neutralizante se selecciona de entre el grupo que
consiste en inmunoglobulinas IgG y fragmentos de inmunoglobulina
IgG.
3. Preparación según la reivindicación 1 ó 2, en
la que el factor neutralizante es de origen policlonal.
4. Preparación según la reivindicación 1 ó 2, en
la que el factor neutralizante es de origen monoclonal.
5. Preparación según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en la que el organismo vivo se encuentra en
forma de esporas o quistes y/o en la que los anticuerpos o
fragmentos de anticuerpo presentan unos elementos adicionales
unidos a los mismos.
6. Preparación según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, que está liofilizada.
7. Preparación según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, que se formula para su:
(i) administración subcutánea;
(ii) administración intraperitoneal; o
(iii) administración intramuscular.
8. Preparación según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en la que el organismo vivo es un micoplasma
y opcionalmente es Mycoplasma gallisepticum.
9. Preparación según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en la que el organismo vivo es capaz de
causar una enfermedad en un mamífero o en un ave, siendo el ave
opcionalmente un ave de corral.
10. Preparación según la reivindicación 9, en la
que el organismo vivo es una especie de Eimeria, y
opcionalmente es E. tenella o E. acervulina, o es
Mycoplasma gallisepticum.
11. Preparación según la reivindicación 9, en la
que el organismo vivo es una bacteria y opcionalmente es
Pasteurella multocida.
12. Utilización de la preparación según la
reivindicación 9 para la preparación de una vacuna destinada al
tratamiento de una enfermedad en un ave o huevo fertilizado causada
por un organismo vivo, según la reivindicación 10 ú 11.
13. Utilización según la reivindicación 12, en la
que la preparación está destinada a ser administrada mediante un
sistema automatizado de alta velocidad de inyección en huevos.
14. Utilización para la preparación de una vacuna
destinada a producir inmunidad activa frente a una enfermedad
bacteriana o protozoárica de un producto, que comprende (i) un
organismo patogénico vivo seleccionado de entre el grupo que
consiste en bacterias patogénicas y protozoos patogénicos y (ii) un
factor neutralizante unido al organismo vivo, siendo el factor
neutralizante capaz de neutralizar el organismo vivo y
seleccionándose de entre el grupo que consiste en anticuerpos y
fragmentos de anticuerpo.
15. Procedimiento para la preparación de una
vacuna destinada a producir inmunidad activa frente a una
enfermedad bacteriana o protozoárica, caracterizado porque
se formula en una preparación de vacuna un conjugado que comprende
(i) un organismo patogénico vivo seleccionado de entre el grupo que
consiste en bacterias patogénicas y protozoos patogénicos y (ii) un
factor neutralizante unido al organismo vivo, siendo capaz el
factor neutralizante de neutralizar el organismo vivo y
seleccionándose de entre el grupo que consiste en anticuerpos y
fragmentos de anticuerpo.
16. Utilización según la reivindicación 14 o
procedimiento según la reivindicación 15, en el que la preparación
de vacuna comprende una cualquiera o más de las características
indicadas en una o varias de las reivindicaciones 2 a 10.
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