KR20050098837A

KR20050098837A - 구포자충 백신 및 이를 사용하고 제조하는 방법

Info

Publication number: KR20050098837A
Application number: KR1020057010442A
Authority: KR
Inventors: 래리 알 맥도갈드; 앨버타 엘 풀러
Original assignee: 유니버시티 오브 조지아 리서치 파운데이션 인코퍼레이티드
Priority date: 2002-12-09
Filing date: 2003-12-08
Publication date: 2005-10-12
Also published as: EP1569687A1; US6998127B2; EP1569687B1; CA2508757C; ATE483471T1; US6908620B2; BR0317144A; WO2004052393A1; AU2003297719A1; RU2324498C2; RU2005121517A; CN100366290C; JP2006510671A; CN1735429A; EP1569687A4; DE60334489D1; MXPA05006121A; US20050186228A1; UA87815C2; US20040120973A1

Abstract

본 발명은 4 개의 약독화된 아이메리아 (Eimeria) 종: 아이메리아 아세르불리나, 아이메리아 맥시마, 아이메리아 미티스 및 아이메리아 테넬라 으로부터 제조된 닭 구포자충증용 백신에 관한 것이다. 상기 백신은 구포자충증에 대한 보호성 면역을 자극하는 다른 항구포자충 약물과 동등하거나 뛰어나다.

Description

구포자충 백신 및 이를 사용하고 제조하는 방법{COCCIDIAL VACCINE AND METHODS OF MAKING AND USING SAME}

관련 출원

본 출원은 2002 년 12 월 9 일 출원된, "구포자충 백신 및 이를 사용하고 제조하는 방법" 이라는 명칭의 미국 가출원 일련번호 제 60/432,298 호를 우선권으로 주장하며, 거기에 개시된 내용은 그대로 참조문헌으로 편입된다. 상기 출원, 및 거기에서 또는 수행과정에서 인용된 모든 문서 ("출원 인용 문서"), 그리고 상기 출원 인용 문서에서 인용 또는 참조된 모든 문서, 그리고 본원에서 인용 또는 참조된 모든 문서 ("본원 인용 문서"), 본원 인용 문서에서 인용 또는 참조된 모든 문서들은, 본원에서 참조문헌으로 편입된 어떠한 문서 또는 본원에서 언급된 어떠한 제품에 대한 어떠한 제조자의 지침, 설명, 제품 명세서 및 제품 시트와 함께, 본원에서 참조 문헌으로 편입되며, 본 발명의 실시에 있어서 채택될 수도 있다.

기술분야

본 발명은 구포자충 (coccidia)에 의해 야기되는 질병들에 대한 백신 및 면역원성 조성물의 제조에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 구포자충증(coccidiosis)에 대해 약화된 백신을 제공한다.

구포자충증은 원생동물 문 (phylum Protozoa)의 아문, 첨복포자충 아문 (subphylum Apicomplexa) 및 아이메리아 속 (genus Eimeria)의 세포내 원생동물성 기생충인, 하나 이상의 많은 종의 구포자충으로 인한 감염에 의해 야기되는 질병이다. 아이메리아 속은, 닭, 오리, 거위, 기니 닭 (guinea fowl), 공작, 꿩, 비둘기 및 칠면조와 같은 가금류에서 경제적으로 매우 중요한 종들을 포함한다. 구포자충증이 실제로 모든 종류의 조류에서 발생하는 반면에, 상기 기생충은 숙주 특이적이고 각 종들은 단일 또는 제한된 군의 관련 숙주들에서만 발생한다. 한편, 조류 숙주들은 하나 이상의 구포자충의 번식처로 알려져 있다. 닭에서 구포자충증을 일으키는 아이메리아 종들은 아이메리아 아세르불리나 (E. acervulina), 아이메리아 부루네티 (E. brunetti), 아이메리아 하가니 (E. hagani), 아이메리아 맥시마 (E. maxima), 아이메리아 미티스 (E. mitis), 아이메리아 미바티 (E. mivati), 아이메리아 네카트릭스 (E. necatrix), 아이메리아 프래콕스 (E. praecox), 그리고 아이메리아 테넬라 (E. tenella) 를 포함한다. 아이메리아 아세르불리나는 육계사 (broiler house)의 덮개짚에서 발견되는 가장 일반적인 종 중 하나이다. 그것은 놀라운 생식 잠재력을 가지고 있으며, 체중 증가에 있어서 현저한 감소, 높은 사료 전환, 그리고 상부 소장에서 육안적 병변 (gross lesion)을 나타내기 때문에 병원성인 것으로 간주된다.

비록 칠면조, 거위, 오리 및 기니 닭에서도 손해가 발생할 수 있기는 하지만, 가금류 중에서 닭이 구포자충증으로 인한 심각한 경제적 손해에 대하여 가장 민감하다. 또한, 구포자충증은 사육되는 꿩 및 메추라기에서도 심각한 손해를 일으킨다. 구포자충증 감염의 효과는 엄청난 떼죽음이라는 매우 현저한 형태를 취하지만, 또 다른 원치않는 효과는 감염으로부터 야기된 병적 상태 및/또는 체중 감소이다.

생활사 동안, 아이메리아 기생충은 다수의 단계를 거친다 (개관을 위해서는 예를 들면, 미국 특허 제 6,100,241 호 참조). 닭이 노지 사육 동안 또는 먼지의 흡입에 의해 포자형성 난포낭 (sporulated oocyst)으로 알려진 감염 단계를 취할 때, 생활사가 시작된다. 포자형성 난포낭의 벽이 모래주머니 (gizzard) 및 장관 내 기계적 분쇄 작용 및 화학 작용이 조합에 의해 파열되어, 4 개의 포자낭(sporocyst)의 유리가 일어난다. 포자낭은 십이지장을 통과하여, 그곳에서 담즙 및 소화효소에 노출되어, 포자낭 당 2 개의 포자 (sporozite) 유리가 일어난다.

포자는 유동성이며, 숙주 상피 세포 내에 침투하고 생식하기 위해 적절한 숙주 상피 세포를 찾는다. 상피 세포의 감염에 이어, 기생충은 생활사의 분열체 단계 (schizont phase)에 들어가며, 분열체 당 8 에서 16 내지 200 개를 초과하는 분열소체 (merozoite)를 생성한다. 분열체로부터 유리되면, 분열소체는 자유로이 다른 상피 세포를 감염시킨다. 이들 무성 생식사의 2 내지 5 주기 후에, 세포 내 분열소체는 암컷 또는 암생식모세포 (macrogametocyte) 및 수컷 또는 숫생식모세포 (microgametocyte)로서 알려진 생식 형태로 성장한다. 숫생식모세포에서 유리된 숫생식자 (microgamete)에 의한 암생식모세포의 수정에 이어, 접합체 (zygote)가 형성되어 그 자체에 대한 낭 벽 (cyst wall)을 만든다. 새로이 형성된 난포낭은 대변 배설과 함께 감염된 닭으로부터 배출된다.

온도, 습도 및 공기 중 충분한 산소의 적당한 환경 조건에서, 난포낭은 감염 단계로 포자를 형성하며, 새로운 숙주를 감염시킬 준비를 함으로써 질병을 확산시킨다. 따라서, 조류에서 조류로의 기생충의 이동에는 어떠한 중간체 숙주도 요구되지 않는다.

아이메리아 기생충이 닭의 소화관을 감염시키는 결과, 체중 증가의 감소, 증가된 사료 전환, 달걀 생산의 중지, 그리고 일부 경우에 있어서는 죽음에 이를 수도 있다. 가금류의 집약 생산에 있어서의 증가는 이 기생충으로 인한 심각한 손해가 수반되어 왔으며; 실제로, 구포자충증은 경제적으로 중요한 기생충 질병이 되었다.

과거에는, 구포자충증을 조절하기 위한 시도로서 몇 가지 방법이 사용되었다. 화학치료 제제의 도래 이전에, 덮개짚의 기계적인 제거와 함께 살균제를 사용하여 위생을 개선하는 것이 주로 채택된 방법이었으나; 통상적으로 난포낭이 충분히 잔존하여 질병을 전달하였다. 훌륭한 관리 외에, 사료 또는 식수에 구포자충증 제제를 도입함으로써 질병 억제에 있어서 어느 정도 성공을 거두었다. 부분적으로 약물에 내성을 갖는 구포자충 균주의 발생으로 인해, 수 년에 걸쳐 상기 제제는 유효성의 감소를 겪는 것이 발견되었다. 게다가, 몇몇 화학치료 제제들은 육류 중에 잔류물을 남김으로써 소비에 부적합하게 되는 것이 발견되었다.

미국 특허 제 4,438,097 호; 제 4,639,372 호; 제 4,808,404 호; 제 5,055,292 호; 제 5,068,104 호; 제 5,387,414 호; 제 5,602,033 호; 제 5,614,195 호; 제 5,635,181 호; 제 5,637,487 호; 제 5,674,484 호; 제 5,677,438 호; 제 5,709,862 호; 제 5,780,289 호; 제 5,795,741 호; 제 5,814,320 호; 제 5,843,722 호; 제 5,846,527 호; 제 5,885,568 호; 제 5,932,225 호; 제 6,001,363 호 및 제 6,100,241 호는 생 (live) 백신 및 재조합 백신을 포함하는 구포자충 백신에 관한 것이다. 그러나, 현존하는 구포자충증 백신은 효능의 감소, 다른 기생충 (예를 들면, 클로스트리디움균 (Clostridium spp.))으로 인한 교차 감염, 그리고 저조한 조류 성능과 같은 문제가 있다. 따라서, 조류 성능에 불리하게 영향을 끼치지 않는 감소된 또는 교차 감염을 가지지 않는 효과적인 구포자충증 백신에 대한 필요성이 존재한다.

본 출원에서의 어떠한 문서의 인용 또는 특정은 상기 문서가 본 발명에 대한 선행 기술로서 이용가능하다는 것을 용인하는 것은 아니다.

발명의 요약

본 발명은 클로스트리디움균과의 감소된 교차 감염, 병독성 접종 (virulent challenge)의 측면에 유효하고, 다른 구포자충증 백신과 비교할 때 사료 전환율로서 정의되는 더 나은 조류 성능을 가지는, 약독화된 구포자충증 백신에 부분적으로 기초한다.

본 발명은 아이메리아 아세르불리나, 아이메리아 맥시마, 아이메리아 미티스 및 아이메리아 테넬라의 조발성 (precocious) 균주로부터의 포자형성 난포낭의 혼합물에 관한 것이다. 포자형성 난포낭은, 아이메리아 아세르불리나, 아이메리아 맥시마, 아이메리아 미티스 및 아이메리아 테넬라의 조발성 균주의 배양물로 접종된 하나 이상의 닭들로부터 수득된 종자 배양물로부터 단리되며, 즉 하나 이상의 닭들은 아이메리아 아세르불리나, 아이메리아 맥시마, 아이메리아 미티스 및 아이메리아 테넬라의 조발성 균주로 접종되어, 각각 상이한 아이메리아 균주로 접종된 4 개 군의 닭을 야기한다. 분리된 포자형성 난포낭은 결합되어 아이메리아 아세르불리나, 아이메리아 맥시마, 아이메리아 미티스 및 아이메리아 테넬라의 조발성 균주로부터 포자형성 난포낭의 혼합물을 형성한다.

유리한 구현예에서, 닭은 2 내지 8 주 된 SPE 닭이다. 또다른 유리한 구현예에서, 닭 한 마리 당 약 100 내지 약 15,000 의 난포낭을 접종하여 종자 배양물을 생성시킨다. 또다른 유리한 구현예에서, 종자 배양물에서 포자형성 난포낭을 원심분리에 의해 분리한다.

또한, 본 발명은 포자형성 난포낭이 아이메리아 아세르불리나, 아이메리아 맥시마, 아이메리아 미티스 및 아이메리아 테넬라의 조발성 균주의 특징임을 증명하는 것을 제공한다.

본 발명은 아이메리아 아세르불리나, 아이메리아 맥시마, 아이메리아 미티스 및 아이메리아 테넬라의 조발성 균주로부터의 포자형성 난포낭의 혼합물에 관한 것으로서, 상기 혼합물은 약 10 내지 약 1000 난포낭의 아이메리아 아세르불리나, 약 10 내지 100 난포낭의 아이메리아 맥시마, 약 10 내지 약 1000 난포낭의 아이메리아 미티스, 그리고 약 10 내지 약 1000 난포낭의 아이메리아 테넬라이다. 유리하게는, 상기 혼합물은 약 500 난포낭의 아이메리아 아세르불리나, 약 50 내지 약 100 난포낭의 아이메리아 맥시마, 약 500 난포낭의 아이메리아 미티스, 그리고 약 100 내지 약 500 난포낭의 아이메리아 테넬라이다. 더욱 유리하게는, 상기 혼합물은 약 500 난포낭의 아이메리아 아세르불리나, 약 100 난포낭의 아이메리아 맥시마, 약 500 난포낭의 아이메리아 미티스, 그리고 약 100 난포낭의 아이메리아 테넬라가 조합되어 있다.

또한, 본 발명은 아이메리아 아세르불리나, 아이메리아 맥시마, 아이메리아 미티스 및 아이메리아 테넬라의 조발성 균주로부터 분리된 포자형성 난포낭의 특정비에 관한 것으로서, 아이메리아 아세르불리나 : 아이메리아 맥시마 : 아이메리아 미티스 : 아이메리아 테넬라의 비는, 약 10 : 1 - 2 : 10 : 2 - 10 이다 (즉, 아이메리아 아세르불리나의 포자낭 10 개 마다, 아이메리아 맥시마의 포자낭 약 1 내지 2 개, 아이메리아 미티스의 포자낭 약 10 개 및 아이메리아 테넬라의 포자낭 약 2 내지 10 개가 존재함). 유리하게는, 아이메리아 아세르불리나 : 아이메리아 맥시마 : 아이메리아 미티스 : 아이메리아 테넬라의 비는 약 5 : 1 : 5 : 1 (즉, 10 : 2 : 10 : 2) 이다.

또한, 본 발명은 아이메리아 아세르불리나, 아이메리아 맥시마, 아이메리아 미티스 및 아이메리아 테넬라의 조발성 균주로부터의 포자형성 난포낭의 혼합물의 효능 시험에 관한 것이다. 유리하게는, 상기 시험은 약 100,000 내지 약 500,000 난포낭의 아이메리아 아세르불리나, 약 10,000 내지 약 100,000 난포낭의 아이메리아 맥시마, 약 100,000 내지 약 500,000 난포낭의 아이메리아 미티스 또는 약 10,000 내지 약 100,000 난포낭의 아이메리아 테넬라의 접종량 (challenge dose)을 상기 동물에 투여하는 것에 관한 것이다. 더욱 유리한 구현예에서, 상기 접종량은 약 200,000 난포낭의 아이메리아 아세르불리나, 약 20,000 내지 약 50,000 난포낭의 아이메리아 맥시마, 약 200,000 난포낭의 아이메리아 미티스 또는 약 20,000 내지 50,000 난포낭의 아이메리아 테넬라이다.

본 발명은 닭, 유리하게는 육계 (broiler chicken)를 면역화하는 것에 관한 것이다. 그러나, 본원에 기재된 백신을 제조하는 방법은 아이메리아에 의해 감염된 다른 동물, 특히 조류, 예를 들면 이에 제한되지는 않으나 닭, 오리, 거위, 기니 닭, 공작, 꿩, 비둘기, 메추라기 또는 칠면조에 대하여 외삽추정될 수 있다.

본 발명은 아이메리아 아세르불리나, 아이메리아 맥시마, 아이메리아 미티스 및 아이메리아 테넬라의 조발성 균주로부터 단리된 포자형성 난포낭의 혼합물을 포함하는 면역원성 또는 백신 조성물을 포함한다. 유리한 구현예에서, 상기 혼합물은 약 10 내지 약 1000 난포낭의 아이메리아 아세르불리나, 약 10 내지 약 100 난포낭의 아이메리아 맥시마, 약 10 내지 약 1000 난포낭의 아이메리아 미티스, 그리고 약 10 내지 약 1000 난포낭의 아이메리아 테넬라이다. 유리하게는, 상기 혼합물은 약 500 난포낭의 아이메리아 아세르불리나, 약 50 내지 약 100 난포낭의 아이메리아 맥시마, 약 500 난포낭의 아이메리아 미티스, 그리고 약 100 내지 약 500 난포낭의 아이메리아 테넬라이다. 더욱 유리하게는, 상기 혼합물은 약 500 난포낭의 아이메리아 아세르불리나, 약 100 난포낭의 아이메리아 맥시마, 약 500 난포낭의 아이메리아 미티스, 그리고 약 100 난포낭의 아이메리아 테넬라가 조합된다.

또한, 본 발명은 아이메리아 아세르불리나, 아이메리아 맥시마, 아이메리아 미티스 및 아이메리아 테넬라의 조발성 균주로부터 단리된 포자형성 난포낭의 특정비를 포함하는 면역원성 또는 백신 조성물에 관한 것으로서, 아이메리아 아세르불리나 : 아이메리아 맥시마 : 아이메리아 미티스 : 아이메리아 테넬라의 비는, 약 10 : 1 - 2 : 10 : 2 - 10 (즉, 아이메리아 아세르불리나의 포자낭 10 개 마다, 아이메리아 맥시마의 포자낭 약 1 내지 2 개, 아이메리아 미티스의 포자낭 약 10 개 및 아이메리아 테넬라의 포자낭 약 2 내지 10 개가 존재함). 유리하게는, 아이메리아 아세르불리나 : 아이메리아 맥시마 : 아이메리아 미티스 : 아이메리아 테넬라의 비는 약 5 : 1 : 5 : 1 (즉, 10 : 2 : 10 : 2) 이다.

또한, 본 발명은 동물 내에서 상기 반응을 이끌어내거나 유도하기 위하여 아이메리아 아세르불리나, 아이메리아 맥시마, 아이메리아 미티스 및 아이메리아 테넬라의 조발성 균주로부터 단리된 포자형성 난포낭의 혼합물을 포함하는 면역원성 또는 백신 조성물의 유효한 양을 투여하는 것을 포함하는 면역학적 또는 보호 반응을 유도하거나 면역 반응을 이끌어내는 것을 제공한다. 유리하게는, 상기 동물은 조류, 예를 들면 이에 제한되지는 않으나 닭, 오리, 거위, 기니 닭, 공작, 꿩, 비둘기, 메추라기 또는 칠면조이다. 가장 유리한 구현예에서, 상기 조류는 닭, 유리하게는 육계이다. 면역 반응을 이끌어내거나 면역학적 반응을 유도하는 방법은 또한 아쥬번트, 사이토킨 또는 그 둘 모두를 투여하는 것을 포함할 수 있다.

유리하게는, 면역 반응을 이끌어내거나 면역학적 또는 보호 반응을 유도하기 위한 유효량은, 약 10 내지 약 1000 난포낭의 아이메리아 아세르불리나, 약 10 내지 약 100 난포낭의 아이메리아 맥시마, 약 10 내지 약 1000 난포낭의 아이메리아 미티스, 그리고 약 10 내지 약 1000 난포낭의 아이메리아 테넬라이다. 유리하게는, 상기 유효량은 약 500 난포낭의 아이메리아 아세르불리나, 약 50 내지 약 100 난포낭의 아이메리아 맥시마, 약 500 난포낭의 아이메리아 미티스, 그리고 약 100 내지 약 500 난포낭의 아이메리아 테넬라 이다. 더욱 유리하게는, 상기 유효량은 약 500 난포낭의 아이메리아 아세르불리나, 약 100 난포낭의 아이메리아 맥시마, 약 500 난포낭의 아이메리아 미티스, 그리고 약 100 난포낭의 아이메리아 테넬라가 조합된다. 또다른 구현예에서, 유효량은 동물에 대하여 약 100,000 내지 약 500,000 난포낭의 아이메리아 아세르불리나, 약 10,000 내지 약 100,000 난포낭의 아이메리아 맥시마, 약 100,000 내지 약 500,000 난포낭의 아이메리아 미티스 또는 약 10,000 내지 약 100,000 난포낭의 아이메리아 테넬라의 접종량을 견디기에 충분한 양이다. 더욱 유리하게는, 상기 접종량은 약 200,000 난포낭의 아이메리아 아세르불리나, 약 20,000 내지 약 50,000 난포낭의 아이메리아 맥시마, 약 200,000 난포낭의 아이메리아 미티스 또는 약 20,000 내지 약 50,000 난포낭의 아이메리아 테넬라이다.

또한, 면역 반응을 이끌어내거나 면역학적 또는 보호 반응을 유도하기 위한 유효량은 조발성 균주인 아이메리아 아세르불리나, 아이메리아 맥시마, 아이메리아 미티스 및 아이메리아 테넬라로부터 포자형성 난포낭의 비율로 표현될 수 있으며, 상기의 아이메리아 아세르불리나 : 아이메리아 맥시마 : 아이메리아 미티스 : 아이메리아 테넬라의 비율은 약 10 : 1 - 2 : 10 : 2 - 10 (즉, 아이메리아 아세르불리나의 포자낭 10 개 마다, 아이메리아 맥시마의 포자낭 약 1 내지 2 개, 아이메리아 미티스의 포자낭 약 10 개 및 아이메리아 테넬라의 포자낭 약 2 내지 10 개가 존재함). 유리하게는, 아이메리아 아세르불리나 : 아이메리아 맥시마 : 아이메리아 미티스 : 아이메리아 테넬라의 비는 약 5 : 1 : 5 : 1 (즉, 10 : 2 : 10 : 2) 이다.

다양한 아이메리아 종들의 우세성 및 병원성을 고려하여, 성공적인 약독화된 구포자충증 백신은, 백신의 수용자에게 비-병원성인, 면역 반응을 이끌어내거나 면역학적 또는 보호 반응을 유도하기에 충분한 최소 개수의 아이메리아 균주를 포함하여야 한다. 본 관계는 4 종의 특정 조발성 균주인 아이메리아, 즉 아이메리아 아세르불리나, 아이메리아 맥시마, 아이메리아 미티스 및 아이메리아 테넬라 유래의 난포낭들의 조합과 관련되고, 효과적이고 비-병원성인 백신을 생산한다. 아이메리아 부루네티, 아이메리아 네카트릭스 및 아이메리아 프래콕스와 같은 다른 아이메리아 균주의 첨가는 백신의 효능, 교차-감염 또는 병원성의 관점에서 불리할 수 있다. 아이메리아 부루네티, 아이메리아 네카트릭스 및 아이메리아 프래콕스가 본원에서 개시된 구포자충증 백신의 효능을 위해 필수적이지 않기 때문에, 본 발명의 백신으로부터 유래된 이들 균주들을 배제하는 것이 유리하다.

상기 개시 및 특히 청구항 및/또는 단락에서 "함유하다", "함유되는", "함유하는" 이란 용어 등은 미국 특허법에 의한 의미를 가질 수 있다; 예를 들면, 이들은 "포함하다", "포함되는", "포함하는" 등을 의미할 수 있다; 그리고 "필수적으로 이루어진", "필수적으로 이루어지다" 와 같은 용어는 미국 특허법에 의한 의미를 가지며, 예를 들면 이들은 명백하게 인용되지 않은 요소들은 허용하지만, 선행기술에서 발견되거나 본 발명의 기본적 또는 신규한 특성에 영향을 미치는 요소들은 배제한다.

상기 및 다른 구현예들은 하기 발명의 상세한 설명에 의해 개시되거나 명백해지고 이에 포함된다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 클로스트리디움균과의 감소된 교차 감염, 병독성 접종의 측면에 유효하고, 다른 구포자충증 백신과 비교할 때 사료 전환율로서 정의되는 더 나은 조류 성능을 가지는, 약독화된 구포자충증 백신에 부분적으로 기초한다.

본 발명은 아이메리아 아세르불리나, 아이메리아 맥시마, 아이메리아 미티스 및 아이메리아 테넬라의 조발성 균주로부터의 포자형성 난포낭의 혼합물에 관한 것이다. 포자형성 난포낭은, 아이메리아 아세르불리나, 아이메리아 맥시마, 아이메리아 미티스 및 아이메리아 테넬라의 조발성 균주의 배양물로 접종된 하나 이상의 닭들로부터 수득된 종자 배양물로부터 단리되며, 즉 하나 이상의 닭들은 아이메리아 아세르불리나, 아이메리아 맥시마, 아이메리아 미티스 및 아이메리아 테넬라의 조발성 균주로 접종되어, 각각 상이한 아이메리아 균주로 접종된 4 개 군의 닭을 야기한다.

유리하게는, 아이메리아 균주는 조발성 균주이다. 조발성 균주는 바람직한 투여량으로 투여될 때, 병원성이 안되는 종 분야에서 유래된다. 유리한 구현예에서, 아이메리아 균주는 P.L.Long 및 Joyce K.Johnson 이 저술한 "미국 닭의 아이메리아:조발성 발달을 위한 선택에 의해 생산된 6 종의 약독화 균주의 특성들" 이라는 제목의 아비안 병리학, 17:305-314, 1998 (본 개시는 전체로서 참고문헌에 편입되어 있음) 에 기술되어 있는대로 개별적인 미생물들의 조발성 균주이다. 미생물들은 P.L.Long 및 Joyce K.Johnson 이 저술한 "미국 닭의 아이메리아:조발성 발달을 위한 선택에 의해 생산된 6 종의 약독화 균주의 특성들" 이라는 제목의 아비안 병리학, 17:305-314, 1998 (본 개시는 전체로서 참고문헌에 편입되어 있음) 에서 기술된 대로 조발성 발달을 위한 그들의 선택에 의해 약독화될 수 있다. 간단하게, 미생물은 초기의 전-패튼(patent) 기간 동안, 즉 난포낭이 처음으로 분변에서 관찰될 때, 선택됨으로써 약독화된다. 상기 방법들은 당업자에게 잘 공지되어 있고 통상적인 실험으로 구성된다.

종자 배양을 위한 아이메리아의 균주 보관은, 제한되는 것은 아니며, 하기를 포함한다. 1969 년에 Hess 및 Clark Laboratories 에서 T.K.Jeffers 에 의해 수득된 아이메리아 아세르불리나의 모체는 단일 난포낭에서 유래되며, USDA, Beltsville, MD 에서 Dr.M.M.Farr 에 의해 단리되었다고 교시되었다. 아이메리아 맥시마 배양균은 조지아, 델라웨어, 메릴랜드, 버지니아 및 텍사스에서 수득된 10 개의 정제된 단리물들의 잡종화된 혼합물로부터 유래되었다. 아이메리아 미티스 배양균의 모체는 1978 년 7월 게인즈빌 조지아에서 단리되었으며, 단일 난포낭 단리에 의해 정제되었다. 아이메리아 테넬라 배양균의 모체는 1960 년 초기에 펜실베리아 주립 대학의 Dr.Patten 에 의해 유지된 배양균으로부터 수득되었다. 다른 조발성 아이메리아균주는 Merck Research Laboratories 의 Dr.Peter Long 로부터 수득된 LS 100 조발성 아이메리아 아세르불리나 단리물 809-13 및 LS 조발성 아이메리아 미티스를 포함한다. 대안적으로, 특허 기탁 (미국특허 제 5,055,292 호, 본 개시는 전체로서 참고문헌에 편입되어 있음)으로 동물 세포 배양의 유럽 콜렉션("ECACC")에서 포자 모세포로 기탁되어 있는 약독화된 조발성 아이메리아 계열은 본원에서 기술된 아이메리아종자 배양을 생산하기에 유용하게 저장된 균주이다. 특히, 미국특허 제 5,055,292 호에서 기술된 대로 기탁된 아이메리아 아세르불리나 (기탁 번호 ECACC 86072203), 아이메리아 맥시마 (기탁 번호 ECACC 86112011 및 86112012), 아이메리아 미티스 (기탁 번호 ECACC 86072206) 및 아이메리아 테넬라 (기탁 번호 ECACC 86072201) 는 본 발명의 종자 배양을 위한 유용하게 저장된 배양균이다.

유리하게는, 미생물들은 상기에서 언급된 대로 조발성 발달을 위해 그들의 선택에 의해 약독화된다. 또 다른 유리한 구현예서, 상기 배양균이 무균이다. 상기에서 기술된 저장된 배양균은 액체 질소의 액체 또는 수증기 국면에서 유리하게 유지된다. 상기 방법은 당업자에게 공지되어 있다.

유리한 구현예에서, 닭들은 2 내지 8주령이다. 포자형성 난포낭는 난포낭의 수가 생산을 위한 종자로서 이용하기에 충분할 때까지 닭에서, 통과의 제한없이, 연속적으로 통과된다. 유리하게는, 배양균은 생존성/감염성을 유지하기 위하여 12 개월 이상 동안 보관되지 않아야 한다.

유리한 구현예에서, 헌정된 설비는 각 아이메리아 종들을 위해 유지된다. 유리하게는, 충분한 부피의 포자형성 난포낭(종자)는 먹이와 혼합되거나, 대안적으로 경구 투여하여 각 닭에 최소한의 투여량이 공급된다. 유리한 구현예에서, 종자 배양을 하기 위해 닭 한 마리 당 약 5000 내지 약 15,000 개의 난포낭을 뿌렸다.

종자 배양으로부터 포자형성 난포낭는 조류 분변으로부터, 유리하게 원심분리에 의해 단리된다. 유리한 구현예에서, 수확은 하기와 같다. 드롭핑(dropping)은 물의 약 10% (w/v) 의 비율로 균질화시킨다. 큰 입자는 스크린을 통해 균질 현탁액을 통과함으로써 제거된다. 고체 덩어리는 원심분리, 스크리닝에 의하거나, 24 시간까지 5±3 ℃에서 보관함으로써 분리된다. 고체 덩어리가 5±3 ℃에서 보관함으로써 분리된다면, 그것들을 추가적으로 원심분리함으로써 농축시킨다. 상청액을 버리고, 고체 덩어리는 포화된 NaCl (80 % w/v) 수용액에서 재부유된다. 생성된 용액은 원심분리시킨다. 난포낭는 액체의 상층에서 수집되고(제거되고), 물에서 재부유된다. 선택적으로, 잔존 액체는 20-40 % NaCl 수용액으로 희석시키고 원심분리시킨다. 이어서 펠렛은 추가적 난포낭이 회수되지 않을 때까지 포화된 NaCl 용액에서 재부유되고 재원심분리시킨다. 난포낭을 두번 이하로 세척한다. 난포낭는 반복되는, 재부유-원심분리 사이클에 이어 10 내지 15 분 동안 0.5 %의 아염소산 나트륨 용액에서 재부유함으로써 염이 제거되도록 세척된다. 이후 난포낭는 반복되는 (3번) 원심분리 및 재부유 단계에 의해 아염소산 나트륨 용액이 제거되도록 세척된다. 최종적인 재부유는 2.5 % 의 중크롬산 칼륨 수용액에서 만들어진다. 이어서 난포낭는 포자 형성 관으로 이동된다. 포자 형성은 27±3 ℃ 에서 72 시간을 초과하지 않는 기간 동안 대기에서 부유액을 살포함으로써 촉진된다. 이어지는 난포낭 포자 형성은 최종 산물을 생산할 때까지 5±3 ℃ 에서 유지된다.

또 다른 구현예에서, 현재 백신접종 방법에 따라 사용되는 난포낭는 당업자에게 공지된 다수의 방법 중 하나로 생산될 수 있다. 상기 방법들은 J.F.Ryley 등, 기생충학 73:311-326, 1976, P.L.Long 등, Folia Veterinaria Latina VI＃3,201-217, 1976 및 미국 특허 제 6,627,205 호 (본 개시는 전체로 참고문헌에 편입되어 있음) 에서 기술된 것들을 포함한다. 한 가지 방법에 따라, 대략 2 주령의 상업적 육계들을 적당한 투여량의 포자형성 난포낭을 경구 위관 투여법에 의해 관심있는 아이메리아 종들로 감염시킨다. 감염된 조류로부터 난포낭을 수집 및 정제하기 위한 잘 공지된 공정이 이후 이어진다. 대다수 종의 아이메리아에 있어, 분변을 감염후 5-7일째에 감염된 조류로부터 수집하고, 잔해를 제거하기 위해 블렌딩하고 여과한 후 잔존 배변 물질이 펠렛이 되기에 충분한 속도로 원심분리시킨다. 상기 펠렛은 난포낭이 부유하고 대다수의 오염된 잔해가 원심분리에 의해 제거될 수 있는, 포화 염 용액에서 재부유된다. 난포낭는 이후 염 농도를 낮추기 위해 희석된다. 상기 난포낭는 염을 제거하기 위해 반복하여 세척되고 중크롬산 칼륨 용액 (2.5 %w/v) 에서 재부유된다. 난포낭 부유물은 난포낭의 포자 형성을 유도하기 위해 대략 72 시간 동안 쉐이킹하면서 (예컨대, 140 rpm) 29 ℃에서 인큐베이션한다. 대안적으로, 난포낭는 아염소산 나트륨으로 처리되고 이후 포자 형성될 수 있다. 1 ml 당 포자형성 난포낭의 갯수는 혈구계산기 또는 McMaster 슬라이드를 이용하여 직접 계산함으로써 결정되고, 배양균은 필요할 때까지 냉장 상태에서 저장된다.

포자 모세포를 생산하기 위해, 중크롬산 칼륨은, 탈이온화되거나 증류화된 물에서 원심분리 및 재부유함으로써 난포낭을 수집하는 것과 관련하여, 난포낭의 반복되는 세척에 의해 부유물로부터 제거된다. 중크롬산은 노란빛-오렌지색의 착색 부족으로 판단되어 제거될 때, 난포낭 부유물은 동일 부피의 아염소산 나트륨(표백제)과 혼합되고 15 분간 실온에서 인큐베이션된다. 이어서 상기 표백제는 반복되는 세척에 의해 제거되고, 난포낭는 생리학적 식염수 또는 탈이온화된 물에서 재부유된다. 난포낭는 다양한 공지된 기술을 이용하여 포자 모세포를 방출하기 위해 깨질 수 있다. 예를 들면, 난포낭는 1-4 mm 지름의 유리 구슬과 함께 난포낭을 혼합하고, 손이나 보텍스 믹서로 쉐이킹하거나, 인큐베이터를 쉐이킹하거나, 손에 잡힐만한 균질화기를 사용함으로써 포자 모세포를 방출하기 위해 깨트릴 수 있다. 깨진 난포낭 및 난포낭 벽은 Dulski 등, Avian Diseasas, 32:235-239, 1988 에서 기술된 대로 50 % 퍼콜 (PERCOLL), 규소 입자로 코팅된 폴리비닐 피롤리돈 (Pharmacia Biotech 에서 판매) 콜로이드성 부유물 또는 1 M 수크로오스 내에서 구별되는 원심 분리에 의해 방출된 포자 모세포로부터 분리될 수 있다. 포자 모세포는 깨진 난포낭 및 난모 벽과 혼합되거나 분리되는 것 중 하나인 현 백신접종 방법에서 사용될 수 있다. 유리하게는, 투여된 포자 모세포는 난포낭 및 난포낭 벽으로부터 분리된다.

유리한 구현예에서, 종자 배양의 허용 가능한 산물을 위한 설명은 하기와 같다. 먼저, 포자형성 난포낭 대 전체 난포낭의 비율이 결정되었다. 오직 >40% 포자 형성에 이르거나 초과하는 산물만이 허용 가능하다고 여겨진다. 두번째로, 각 난포낭 산물의 크기, 형태 및 외관이 생상되기로 예정된 종들의 특성이 되어야 한다. 예를 들면, 아이메리아종을 특징짓는데 고려되는 매개변수는, 제한하는 것은 아니나, DNA-기반 기술, DNA 부력성 밀도, 효소 다양성, 숙주 및 위치 특이성, 면역학적 특이성, 병원성, 전-패튼(patent) 기간 및 포자 형성 시간을 포함한다 (Long & Joyner, J Protozool. 1984 Nov; 31(4):535-41 및 Shirley, Acta Vet Hung. 1997; 45(3):331-47, 본 개시는 참고문헌으로 편입되어 있음).

본원에서 기술된 종자 배양으로부터 단리된 포자형성 난포낭는 조발성 균주인 아이메리아 아세르불리나, 아이메리아 맥시마, 아이메리아 미티스 및 아이메리아 테넬라로부터 포자형성 난포낭의 혼합물을 형성하기 위해 결합된다. 일반적으로, 상기 혼합물은 약 10 내지 약 1000 개의 아이메리아 아세르불리나 의 난포낭, 약 10 내지 약 100 개의 아이메리아 맥시마의 난포낭, 약 10 내지 약 1000 개의 아이메리아 미티스의 난포낭 및 약 10 내지 약 1000 개의 아이메리아 테넬라이다. 유리하게는, 혼합물 내 포자형성 난포낭의 범위는 약 125 내지 약 500 개의 아이메리아 아세르불리나의 난포낭, 약 25 내지 약 100 개의 아이메리아 맥시마의 난포낭, 약 125 내지 약 500 개의 아이메리아 미티스의 난포낭 및 약 25 내지 약 500 개의 아이메리아 테넬라의 난포낭이다. 한 구현예에서, 낮은 투여량은 약 125 개의 아이메리아 아세르불리나의 난포낭, 약 25 개의 아이메리아 맥시마의 난포낭, 약 125 개의 아이메리아 미티스의 난포낭 및 약 25 개의 아이메리아 테넬라이다. 또 다른 구현예에서, 배지 투여량은 약 250 개의 아이메리아 아세르불리나 의 난포낭, 약 50 개의 아이메리아 맥시마의 난포낭, 약 250 개의 아이메리아 미티스의 난포낭 및 약 50 개의 아이메리아 테넬라의 난포낭이다. 더욱 다른 구현예에서, 높은 투여량은 약 500 개의 아이메리아 아세르불리나의 난포낭, 약 100 개의 아이메리아 맥시마의 난포낭, 약 500 개의 아이메리아 미티스의 난포낭 및 약 100 개의 아이메리아 테넬라의 난포낭이다.

본 발명은 또한 조발성 균주인 아이메리아 아세르불리나, 아이메리아 맥시마, 아이메리아 미티스 및 아이메리아 테넬라로부터 단리된 포자형성 난포낭의 특정 비율과 관련되는데, 상기에서 아이메리아 아세르불리나 : 아이메리아 맥시마 : 아이메리아 미티스 : 아이메리아 테넬라의 비율은 약 10 : 1 - 2 : 10 : 2 - 10 (즉, 아이메리아 아세르불리나의 포자낭 10 개 마다, 아이메리아 맥시마의 포자낭 약 1 내지 2 개, 아이메리아 미티스의 포자낭 약 10 개 및 아이메리아 테넬라의 포자낭 약 2 내지 10 개가 존재함) 이다. 유리하게는, 아이메리아 아세르불리나 : 아이메리아 맥시마 : 아이메리아 미티스 : 아이메리아 테넬라의 비율은 약 5 : 1 : 5 : 1 (즉 10 : 2 : 10 : 2)이다.

유리하게는, 상기 혼합물은 약 500 개의 아이메리아 아세르불리나 의 난포낭, 약 50 내지 100 개의 아이메리아 맥시마의 난포낭, 약 500 개의 아이메리아 미티스의 난포낭 및 약 100 내지 500 개의 아이메리아 테넬라의 난포낭이다. 더욱 유리한 구현예에서, 약 500 개의 아이메리아 아세르불리나의 난포낭, 약 100 개의 아이메리아 맥시마의 난포낭, 약 500 개의 아이메리아 미티스의 난포낭 및 약 100 개의 아이메리아 테넬라의 난포낭이다.

유리하게는, 난포낭는 젠타마이신을 함유하는 0.01 M 인산염 완충 식염수 용액으로 이루어진 보존액에서 부유된다. 또 다른 구현예에서, 난포낭는 다양한 보존액 또는 제한하는 것은 아니지만, 아세트산, 시트르산, 중크롬산 칼륨 또는 프로피온산 같은 유기 산 중 하나에서 부유된다. 예를 들면, 제한되는 것은 아니지만, 충분한 무균성, 30 mcg/ml 이하로 젠타마이신을 함유하는 0.01 M 인산염 완충 식염수 용액을 사용하여, 2,000 투여량 제공시 한 병 당 2 ml, 5,000 투여량 제공시 한 병 당 5 ml 및 10,000 투여량 제공시 한 병 당 10 ml 를 생산한다. 유리하게는, 난포낭는 무균성 붕규산염 유리 병에 보관된다. 예를 들면, 제한하는 것은 아니며, 난포낭을 반-자동 또는 자동 분배기를 가진 백신 병에 무균적으로 채워넣고, 중단기를 기계적 또는 수동적으로 삽입하고 알루미늄 봉인 (seal)을 배치하고 주름을 잡는다.

또 다른 구현예에서, 난포낭는 부유제, 예를 들면 산탄 검 또는 아카시아 검 같은 검류, 카르복시메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스 또는 마이크로크리스탈린 셀룰로오스 같은 셀룰로오스 유도체, 카라제난, 소듐 알지네이트, 펙틴 또는 녹말 같은 다당류 부유제; 젤라틴 같은 폴리텝티드 부유제; 폴리아크릴산 같은 합성 폴리머 부유제; 또는 마그네슘 알루미늄 실리케이트 같은 실리케이트 부유제를 함유하는 무균성 증류수에서 부유된다 (예컨대, 미국 특허 제 5,055,292 호, 본 개시는 전체로서 참고문헌으로 편입되어 있음).

본 발명은 또한 포자형성 난포낭이 조발성 균주인 아이메리아 아세르불리나, 아이메리아 맥시마, 아이메리아 미티스 및 아이메리아 테넬라의 특징임을 입증하기 위해 제공된다. 유리하게는, 모든 난포낭이 약독화되고, 거기서 그것들은 조발성이다. 또 다른 유리한 구현예에서, 각 난포낭 산물의 크기, 형태 및 외관은 생산되기로 예정된 종들의 특성이 되어야 한다. 더욱 또 다른 유리한 구현예에서, 포자형성 난포낭의 혼합물을 시험 동물, 예컨대 닭의 순도, 체외 병원균, 및/또는 치사 또는 심한 상흔에 관해 테스트한다. 다양한 아이메리아종의 특징들이 완전히 Long P.L. 및 Reid W.M. (1982:A Guide for the Diagnosis of Coccidiosis in Chicken;University of Georgia Research Report 404) 및 Joyner L.P. (1978:Identification and Diagnosis, Avian Coccidiosis, Poultry Science Symposium No.13, British Poultry Science Ltd), 전체로서 참고문헌으로 편입되어 있는 개시에 의해 밝혀졌다.

본 발명은 조발성 균주인 아이메리아 아세르불리나, 아이메리아 맥시마, 아이메리아 미티스 및 아이메리아 테넬라로부터 포자형성 난포낭의 혼합물의 효과를 시험하는 것과 관련된다. 유리하게 상기 테스트는 약 100,000 내지 약 500,000 개의 아이메리아 아세르불리나의 난포낭 및 약 10,000 내지 약 100,000 개의 아이메리아 맥시마의 난포낭, 약 100,000 내지 약 500,000 개의 아이메리아 미티스의 난포낭, 또는 약 10,000 내지 약 100,000 개의 아이메리아 테넬라의 난포낭의 도전적 투여량을 투여하는 것과 관련된다. 더욱 유리한 구현예에서, 도전적 투여량은 약 200,000 개의 아이메리아 아세르불리나의 난포낭 및 약 20,000 내지 약 50,000 개의 아이메리아 맥시마의 난포낭, 약 200,000 개의 아이메리아 미티스의 난포낭, 또는 약 20,000 내지 약 50,000 개의 아이메리아 테넬라의 난포낭이다.

본 발명은 추가적으로 조류에 조발성 균주인 아이메리아 아세르불리나, 아이메리아 맥시마, 아이메리아 미티스 및 아이메리아 테넬라로부터 포자형성 난포낭의 혼합물을 투여한 결과로서 공급원의 전환 비율에 의해 정의되는 조류 능력을 결정하기 위해 제공된다. 공급원 전환 효율은 1 파운드 고기를 생산하기 위해 공급원인 몇 파운드인지로 정의된다. 일반적 결과는 약 1.90 또는 2.0 이다. 일반 전문 용어로 공급원 전환에 있어 원 포인트는 .01인데, 이것은 약 0.5 %(일 퍼센트의 절반)와 동일하다. 미터법 시스템이 사용된다면, 공급원 전환은 고기 1 Kg 당 공급원 Kg 이며, 여전히 상기의 비율이다.

본 발명은 닭, 유리하게 육계를 면역화시키는 것과 관련된다. 그러나, 본원에서 기술된 백신 제조 방법을 아이메리아에 감염된 다른 동물들, 특히 제한하는 것은 아니며, 닭, 오리, 거위, 기니 닭, 공작, 꿩, 비둘기,메추라기 또는 칠면조 같은 특별한 조류에서, 또는 덜 유리한 구현예로, 토끼에서 외삽법으로 적용할 수 있다.

본 발명은 조발성 균주인 아이메리아 아세르불리나, 아이메리아 맥시마, 아이메리아 미티스 및 아이메리아 테넬라로부터 포자형성 난포낭의 혼합물을 함유하는 면역성 또는 백신 조성물을 포함한다. 단리된 포자형성 난포낭는 조발성 균주인 아이메리아 아세르불리나, 아이메리아 맥시마, 아이메리아 미티스 및 아이메리아 테넬라로부터 포자형성 난포낭의 조성물을 형성하기 위해 결합된다. 일반적으로, 상기 혼합물은 약 10 내지 약 1000 개의 아이메리아 아세르불리나 의 난포낭, 약 10 내지 약 100 개의 아이메리아 맥시마의 난포낭, 약 10 내지 약 1000 개의 아이메리아 미티스의 난포낭 및 약 10 내지 약 1000 개의 아이메리아 테넬라의 난포낭이다. 유리하게는, 조성물내 포자형성 난포낭의 범위는 약 125 내지 약 500 개의 아이메리아 아세르불리나의 난포낭, 약 25 내지 약 100 개의 아이메리아 맥시마의 난포낭, 약 125 내지 약 500 개의 아이메리아 미티스의 난포낭, 그리고 약 25 내지 약 250 개의 아이메리아 테넬라의 난포낭이다. 한 구현예에서, 낮은 투여량은 약 125 개의 아이메리아 아세르불리나의 난포낭, 약 25 개의 아이메리아 맥시마의 난포낭, 약 125 개의 아이메리아 미티스의 난포낭, 그리고 약 25 개의 아이메리아 테넬라의 난포낭이다. 또 다른 구현예에서, 배지 투여량은 약 250 개의 아이메리아 아세르불리나의 난포낭, 약 50 개의 아이메리아 맥시마의 난포낭, 약 250 개의 아이메리아 미티스의 난포낭 및 약 50 개의 아이메리아 테넬라의 난포낭이다. 더욱 다른 구현예에서, 높은 투여량은 약 500 개의 아이메리아 아세르불리나의 난포낭, 약 100 개의 아이메리아 맥시마의 난포낭, 약 500 개의 아이메리아 미티스의 난포낭, 그리고 약 100 개의 아이메리아 테넬라의 난포낭이다.

유리하게는, 상기 조성물은 약 500 난포낭의 아이메리아 아세르불리나, 약 50 내지 약 100 난포낭의 아이메리아 맥시마, 약 500 난포낭의 아이메리아 미티스, 그리고 약 100 내지 약 500 난포낭의 아이메리아 테넬라 이다. 더욱 유리한 구현예에서, 상기 조성물은 약 500 난포낭의 아이메리아 아세르불리나, 약 100 난포낭의 아이메리아 맥시마, 약 500 난포낭의 아이메리아 미티스, 그리고 약 100 난포낭의 아이메리아 테넬라 이다.

상기 조성물은 또한 조발성 균주의 아이메리아 아세르불리나, 아이메리아 맥시마, 아이메리아 미티스, 아이메리아 테넬라 로부터 단리된 포자형성 난포낭의 특정 비와 관련하고, 여기에서 아이메리아 아세르불리나 : 아이메리아 맥시마 : 아이메리아 미티스 : 아이메리아 테넬라 는 약 10 : 1 - 2 : 10 : 2 - 10 (즉, 아이메리아 아세르불리나의 포자낭 10 개 마다, 아이메리아 맥시마의 포자낭 약 1 내지 2 개, 아이메리아 미티스의 포자낭 약 10 개 및 아이메리아 테넬라의 포자낭 약 2 내지 10 개가 존재함)이다. 유리하게는, 아이메리아 아세르불리나 : 아이메리아 맥시마 : 아이메리아 미티스 : 아이메리아 테넬라 의 비는 약 5 : 1 : 5 : 1 (즉, 10 : 2 : 10 : 2)이다.

"면역원성 조성물"이라는 용어는, 일단 동물, 예를 들면 조류에 투여하여 기생충, 항원, 면역원 (immunogen) 또는 에피토프에 대하여 보호성 면역 반응을 이끌어내는 것이라면 여기에서 가능한 어떠한 조성물도 포함한다. "백신"이라는 용어는, 일단 동물, 예를 들면 조류에 투여하여 바이러스에 대하여 보호성 면역 반응을 유도하거나 기생충에 대하여 동물을 효과적으로 보호하는 것이라면 여기에서 가능한 어떠한 조성물도 포함한다.

본 발명에 따른 면역원성 조성물 또는 백신은 또한 병원체 또는 상기 병원체의 면역원, 항원 또는 에피토프, 그리고 적어도 하나의 다른 병원체의 면역원, 항원 또는 에피토프, 기생충 또는 바이러스를 포함하고, 즉 구포자충증 백신은 다른 조류 백신과 결합된다. 상기 면역원, 항원 또는 에피토프는, 예를 들면 박테리아, 기생충, 바이러스 기원 또는 불활성화거나 약독화된 형태의 병원체, 기생충 또는 바이러스 기원일 수 있다. 본 발명은 또한 이들 조합 조성물을 제조하는 방법과 이들 조합 조성물을 제조하기 위한 이들 조합 조성물의 성분들의 용도 뿐 아니라, 이들 조합 조성물을 제조하기 위한 키트를 포함한다.

따라서, 본 발명은 본 발명의 조합 면역원성 또는 백신 조성물을 제조하기 위한 키트를 포함하고, 예를 들면 상기 키트는 (a) 유기체, 병원체, 바이러스 또는 그들의 항원 또는 에피토프 (유리하게는 여기에서 언급된 병원체), 그리고 (a)와는 상이한 (b) 유기체, 병원체, 바이러스 또는 이들의 면역원, 항원 또는 에피토프 (유리하게는 바이러스 또는 이들의 면역원, 항원 또는 에피토프, 그러나 여기에서 언급된 다른 병원체들도 또한 고려된다)를 별개의 용기, 임의로 동일한 패키지에, 그리고 임의로 혼합 및/또는 투여 설명서와 함께 포함한다.

본 발명에 따른 면역원성 조성물 및/또는 백신은 아이메리아 배양물 또는 제제 (예를 들면, 불활성화 또는 약독화된 아이메리아, 또는 그들의 면역원, 항원 또는 에피토프), 그리고 (불활성화 또는 약독화된 형태의 병원체를 제한없이 포함하여) 적어도 하나의 다른 조류 병원체의 면역원, 항원 또는 에피토프를 포함할 수 있다. 조류 다가 면역원성 조성물 및 다가 백신의 경우, 추가의 조류 병원체(들)의 추가의 조류 항원(들), 면역원(들) 또는 에피토프(들)이 상기 다가 면역원성 조성물 및 다가 백신에 포함 및/또는 그것들에 의해 발현되는, 추가의 조류 병원체(들)은, 바이러스, 질병 또는 마렉병 바이러스 (Marek's disease virus (MDV)) (예를 들면, 혈청형 1 및 2, 유리하게는 1), 뉴캐슬병 바이러스 (NDV), 뉴캐슬병이 아닌 파라믹소바이러스 (PMV2 내지 PMV7), 전염성 기관지염 바이러스 (infectious bronchitis virus (IBV)), 전염성 빈혈 바이러스 (infectious anaemia virus) 또는 닭 빈혈 바이러스 (CAV), 전염성 후두기관염 바이러스 (infectious laryngotracheitis virus (ILTV)), 전염성 점액낭병 (infectious bursal disease virus (IBDV)), 뇌척수염 바이러스 또는 조류 뇌척수염 바이러스 (AEV 또는 조류 백혈병 바이러스 ALV), 칠면조 출혈성 장염 바이러스 (HEV), 병독성폐렴증 바이러스 (pneumovirosis virus (TRTV)), 가금 페스트 바이러스 (fowl plague virus (조류 인플루엔자)), 닭 물심장막염 바이러스 (chicken hydropericarditis virus), 조류 레오바이러스 (avian reovirus), 구포자충증, 산란 저하 증후군 (egg drop syndrome (EDS76)), 계두 (fowl pox), 봉입체 간염 (inclusion body hepatitis (아데노바이러스)), 칠면조 림프증식성 질병 (lymphoproliferative disease), 닭 그물내피증 (reticuloendotheliosis), 칠면조 그물내피증, 로타바이러스 장염, 그리고 칠면조 비기관염 (rhinotracheitis), 클로스트리디움균, 대장균 (Escherichia coli), 마이코플라즈마 갈리나룸 (Mycoplasma gallinarum), 마이코플라즈마 갈리셉티쿰 (Mycoplasma gallisepticum), 해모필러스 아비움 (Haemophilus avium), 파스퇴렐라 갈리나룸 (Pasteurella gallinarurum), 파스퇴렐라 멀토시다 갈리시다 (Pasteurella multocida gallicida), 그리고 그들의 혼합물이다. 유리하게는, MDV 의 경우 면역원은 유리하게는 gB 및/또는 gD, 예를 들면 gB 및 gD 이고, NDV 의 경우 면역원은 유리하게는 HN 및/또는 F, 예를 들면 HN 및 F 이며; IBDV 의 경우 면역원은 유리하게는 VP2 이고; IBV 의 경우 면역원은 유리하게는 S (보다 유리하게는 Sl) 및/또는 M 및/또는 N, 예를 들면 S (또는 Sl) 및 M 및/또는 N 이며; CAV 의 경우 면역원은 유리하게는 VP1 및/또는 VP2 이고; ILTV 의 경우 면역원은 유리하게는 gB 및/또는 gD 이며; AEV 의 경우 면역원은 유리하게는 env 및/또는 gag/pro, 예를 들면 env 및 gag/pro 또는 gag/pro 이고; HEV 의 경우 면역원은 유리하게는 100K 단백질 및/또는 헥손 (hexon) 이며; TRTV 의 경우 면역원은 유리하게는 F 및/또는 G 이고, 가금 페스트의 경우 면역원은 유리하게는 HA 및/또는 N 및/또는 NP, 예를 들면 HA 및 N 및/또는 NP 이다. 따라서, 본 발명은 또한 키트 뿐 아니라 이들 조성물을 제조하는 방법도 포함한다.

또한 상기와 같은 추가의 면역원성 성분 (추가의 면역원, 항원 또는 에피토프)를 포함하는 본 발명에 따른 면역원성 조성물 또는 백신은, 몇몇 감염 또는 질병 또는 그것들의 원인 인자들에 대한 면역 반응 또는 보호를 동시에 유도하는 이점을 갖는다. 이 추가의 면역원성 성분은 약독화 또는 불활성화된 미생물, 재조합 건조체 또는 서브유니트 (예를 들면, 단백질, 당단백질, 폴리펩티드 또는 에피토프)일 수 있다. 에피토프 결정 과정, 예를 들면 오버랩핑 펩티드 라이브러리를 생성하는 과정 (Hemmer et al., Immunology Today, 1998, 19 (4), 163-168), 펩티드 스캔 (Pepscan) (Geysen H. M. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1984,81 (13), 3998-4002; Geysen H. M. et al. , Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1985, 82 (1), 178-182; Van der Zee R. et al. , Eur. J. Immunol., 1989,19 (1), 43-47; Geysen H. M., Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health, 1990,21 (4), 523-533; Multipin Peptide Synthesis Kits de Chiron), 그리고 알고리즘 (De Groot A. et al. , Nature Biotechnology, 1999, 17,533-561)이 본 발명의 실시에 사용되어, 면역원, 항원, 폴리펩티드, 당단백질, 그리고 그 유사체의 에피토프를 과도한 반복 실험 없이 결정할 수 있다. 그 정보로부터, 상기 에피토프를 암호화하는 핵산 분자를 건조할 수 있고, 그 지식 및 선행기술 지식으로부터 벡터 또는 건조체, 예를 들면 면역원, 에피토프 또는 항원들을 발현하는 재조합 바이러스 또는 벡터 또는 플라스미드를 모두 과도한 반복 실험 없이 건조할 수 있다.

약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 운반체 (vehicle) 또는 부형제는 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들면, 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 운반체 또는 부형제는 0.9% NaCl (예를 들면, 식염수) 용액 또는 인산 완충용액일 수 있다. 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 운반체 또는 부형제는 벡터 (또는 인비트로에서 본 발명의 벡터로부터 발현된 단백질)의 투여를 용이하게 하는 화합물 또는 그 조합 어느 것일 수 있으며; 유리하게는 상기 담체, 운반체 또는 부형제는 형질전환 (transfection)을 용이하게 하거나 및/또는 상기 벡터 (또는 단백질)의 보존을 개선할 수 있다. 여기에서의 투여량 및 투여 부피는 면역 및 백신접종 방법의 일반적인 설명서에 논의되고, 또한 어느 과도한 반복 실험 없이 선행기술 지식과 관련된 이 개시로부터 당업자에 의해 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 면역원성 조성물 및 백신은 필수적으로 하나 이상의 아쥬번트로 구성되거나 포함할 수 있다. 본 발명의 실시 용도에 적합한 아쥬번트는 (1) 아크릴 또는 메타크릴산의 중합체, 말레산 무수물 및 알케닐 유도체 중합체, (2) 면역증강 서열 (immunostimulating sequence (ISS)), 예를 들면 하나 이상의 비-메틸화 CpG 유니트 (Klinman et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 1996,93, 2879-2883; W098/16247)를 갖는 올리고디옥시리보뉴클레오티드 서열, (3) 수중유 (oil in water) 에멀젼, 예를 들면 1995년 플레넘 출판, M. Powell 의 "백신 디자인, 서브유니트 및 아쥬반트 연구" 147 페이지에 기술된 SPT 에멀젼, 및 동 논문의 183 페이지에 기술된 에멀젼 MF59, (4) 4차 암모늄염을 함유하는 양이온 지질, (5) 사이토킨, (6) 알루미늄 히드록사이드 또는 알루미늄 포스페이트, 또는 (7) 본 출원에 참고문헌으로 편입되고 인용된 어느 문서에서라도 논의된 다른 아쥬번트, 또는 (8) 그들의 어느 조합 또는 혼합물이다.

병독성 벡터에 특히 적합한 상기 수중유 에멀젼 (3)은 경 액체 파라핀 오일 (light liquid paraffin oil) (유럽 약물 유형), 이소프레노이드 오일, 예를 들면 수쿠알란, 스쿠알렌, 이소부텐 또는 데센과 같은 알켄의 올리고머화에 의해 생성된 오일, 직쇄 알킬 기를 갖는 산 또는 알콜의 에스테르, 예를 들면 식물유, 에틸 올레이트, 프로필렌 글리콜, 디(카프릴레이트/카프레이트), 글리세롤 트리(카프릴레이트/카프레이트), 그리고 프로필렌 글리콜 디올레이트, 또는 분지상 지방 알콜 또는 산의 에스테르, 특히 이소스테아린산 에스테르를 기초로 할 수 있다.

상기 오일은 유화제와 조합하여 사용되어 에멀젼을 형성한다. 상기 유화제는 비이온성 계면활성제, 예를 들면 한 말단이 소르비탄, 만니드 (mannide) (예를 들면, 안히드로만니톨 올레이트), 글리세롤, 폴리글리세롤 또는프로필렌 글리콜, 그리고 다른 말단은 올레산, 이소스테아린산, 리시놀레인산 또는 히드록시스테아린산의 에스테르이고, 상기 에스테르는 임의로 에톡시화 또는 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 공중합체 블록, 예를 들면 플루로닉 (Pluronic), 예를 들면, L121 이다.

유형 (1) 아쥬번트 중합체 중에서, 가교된 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체, 특히 당 또는 폴리알콜의 폴리알케닐 에스테르에 의해 가교된 중합체가 바람직하다. 이들 화합물은 카보머 (carbomer) (Pharmcuropa, vol. 8, no. 2, June 1996) 라는 이름으로 알려져 있다. 당업자는 또한 적어도 3 개의 히드록실기, 바람직하게는 8 개 이하의 상기 기를 갖고, 상기 적어도 3 개의 히드록실기의 수소 원자는 적어도 2 개의 탄소 원자를 갖는 불포화, 지방족 라디칼에 의해 대체되는 폴리히드록시 화합물에 의해 가교된 상기 아크릴 중합체, 여기에서 를 제공하는 미국특허 제 2,909, 462 호를 참조할 수 있다. 상기 바람직한 라디칼은 2 내지 4 개의 탄소 원자를 함유하는 것들, 예를 들면 비닐, 알릴, 그리고 다른 에틸렌계 불포화 기이다. 상기 불포화 라디칼은 또한 다른 치환체, 예를 들면 메틸을 함유할 수 있다. 카보폴 (Carbopol) (BF Goodrich, Ohio, USA) 이름 하에 팔린 제품이 특히 적합하다. 그것들은 알릴 사카로오스 또는 알릴 펜타에리스리톨에 의해 가교된다. 그것들 중에서, 카보폴 974P, 934P 및 971P 가 참고로 된다.

말레인산 무수물-알케닐 유도체 공중합체에 대하여, 직쇄 또는 가교된 에틸렌-말레인산 무수물 공중합체인 EMA (Monsanto)가 바람직하고, 그것들은 예를 들면 디비닐 에테르에 의해 가교된다. J. Fields 등, Nature 186: 778-780, June 4, 1960 가 또한 참고로 된다.

구조와 관련하여, 아크릴산 또는 메타크릴산 중합체 및 EMA 는 바람직하게는 하기 식을 갖는 기초 유니트에 의해 형성된다:

여기에서 :

- 동일하거나 상이할 수 있는 R_l 및 R₂ 는 H 또는 CH₃ 를 나타내고,

- x = 0 또는 1, 바람직하게는 x = 1 이며,

- y = 1 또는 2 이고, x + y = 2 이다.

EMA 의 경우, x = 0, y = 2, 그리고 카보머의 경우 x = y = 1 이다.

이들 중합체는 물 또는 생리학적 염 용액 (20 g/l NaCl)에 용해되고, pH 는 예를 들면 소다 (NaOH)에 의해 7.3 내지 7.4 로 조절되어 발현 벡터(들)이 삽입될 수 있는 아쥬번트 용액을 제공한다. 상기 최종 백신 조성물 내 중합체 농도는 0.01 내지 1.5% w/v, 유리하게는 0.05 내지 1% w/v, 그리고 바람직하게는 0.1 내지 0.4% w/v 의 범위일 수 있다.

유리하게는 그러나 배타적이지는 않게 플라스미드에 적합한 4 차 암모늄 염을 함유하는 양이온성 지질 (4)은 바람직하게는 하기 식을 갖는 것들이다:

여기에서, R₁ 은 12 내지 18 개의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화 직쇄 지방족 라디칼이고, R₂ 는 2 또는 3 개의 탄소 원자를 함유하는 다른 지방족 라디칼이며, X 는 아민 또는 히드록실기이다.

이들 양이온성 지질 중에서, DMRIE (N-(2-히드록시에틸)-N,N-디메틸-2,3-비스(테트라데실옥시)-1-프로판 암모늄; 국제공개공보 W0 96/34109)가 바람직하고, 바람직하게는 중성 지질, 바람직하게는 DOPE (디올레오일-포스파티딜-에탄올 아민; Behr J. P. , 1994, Bioconjugate Chemistry, 5, 382-389)와 결합하여 DMRIE-DOPE 를 형성한다.

유리하게는 아쥬번트를 갖는 혼합물은 일시적으로 그리고 바람직하게는 제제의 투여와 동시에 또는 제제의 투여 바로 전에 형성되며; 예를 들면, 유리하게는 투여 전에 혼합물이 복합체를 형성하기에 충분한 시간, 예를 들면 투여 대략 30 분 전과 같이 투여 약 10 내지 약 60 분 전을 주기 위해, 투여 바로 전 또는 그 이전에 플라스미드-아쥬번트 혼합물이 형성된다.

DOPE 가 존재할 때, DMRIE : DOPE 몰비는 바람직하게는 약 95 : 약 5, 내지 약 5 : 약 95, 더욱 유리하게는 약 1 : 약 1, 예를 들면, 1 : 1 이다.

DMRIE 또는 DMRIE-DOPE 아쥬번트 : 플라스미드 중량비 약 50 : 약 1, 그리고 약 1 : 약 10, 예를 들면 약 10 : 약 1, 그리고 약 l : 약 5, 그리고 바람직하게는 약 1 : 약 1, 그리고 약 1 : 약 2, 예를 들면 1 : 1 및 1 : 2 이다.

사이토킨 또는 사이토킨들 (5)는 면역원성 또는 백신 조성물 내 단백질 형태일 수 있고, 또는 그것들의 면역원, 면역원들 또는 에피토프(들)과 함께 숙주 내에서 공-발현 (co-expression) 될 수 있다. 그것들의 면역원, 면역원들 또는 에피토프(들)을 발현하는 것으로서 동일한 벡터에 의해, 또는 그것들에 대한 별개의 벡터에 의해 사이토킨 또는 사이토킨들의 공-발현이 바람직하다.

본 발명은 예를 들면 유리하게는 아쥬번트, 담체, 사이토킨 및/또는 희석제와 함께 활성 성분을 혼합함으로써 상기 조합 조성물들을 제조하는 것을 포함한다.

본 발명에 사용될 수 있는 사이토킨들은, 이에 제한되지는 않으며, 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구/대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 인터페론 α (IFN α), 인터페론 β (IFN β), 인터페론 γ, (IFN γ), 인터루킨-lα (IL-1 α), 인터루킨-lβ (IL-1β), 인터루킨-2 (IL-2), 인터루킨-3 (IL-3), 인터루킨-4 (IL-4), 인터루킨-5 (IL-5), 인터루킨-6 (IL-6), 인터루킨-7 (IL-7), 인터루킨-8 (IL-8), 인터루킨-9 (IL-9), 인터루킨-10 (IL-10), 인터루킨-11 (IL-11), 인터루킨-12 (IL-12), 종양 괴사 인자 α (TNF α), 종양 괴사 인자 β(TNF β), 그리고 전환 성장 인자 (transforming growth factor) β (TGF β)를 포함한다. 사이토킨들이 공-투여 및/또는 본 발명의 면역원성 또는 백신 조성물로 연속적으로 투여될 수 있다고 이해된다. 따라서, 예를 들면 본 발명의 백신은 또한 생체내에서 적합한 사이토킨, 예를 들면 백신접종 받는 숙주에 적합하거나 그 안에서 면역학적 반응을 이끌어내는 사이토킨 (예를 들면, 새들에 투여되기 위해 제조되는 조류 사이토킨)을 발현하는 외인성 (exogenous) 핵산 분자를 함유할 수 있다.

본 발명은 또한 동물 내에서 반응을 이끌어내거나 유도하기 위해 아이메리아 아세르불리나, 아이메리아 맥시마, 아이메리아 미티스 및 아이메리아 테넬라의 조발성 균주로부터 단리된 포자형성 난포낭의 혼합물을 포함하는 면역원성 또는 백신 조성물의 효과적인 양을 투여하는 것을 포함하는 면역학적 또는 보호 반응을 유도하거나 면역 반응을 이끌어내는 것을 제공한다.

유리하게는, 상기 동물은 조류, 예를 들면 이에 제한되지는 않으나, 닭, 오리, 거위, 기니 닭, 공작, 꿩, 비둘기, 메추라기 또는 칠면조이다. 가장 유리한 구현예에서, 상기 조류는 닭, 유리하게는 육계이다. 면역 반응을 이끌어내거나 면역학적 반응을 유도하는 방법은 또한 아쥬번트, 사이토킨 또는 그 둘 모두를 투여하는 것을 포함할 수 있다.

면역 반응을 이끌어내거나 면역학적 또는 보호 반응을 유도하기 위한 유효량은 아이메리아 아세르불리나의 난포낭 약 10 내지 약 1000 개, 아이메리아 맥시마의 난포낭 약 10 내지 약 100 개, 아이메리아 미티스의 난포낭 약 10 내지 약 1000 개, 그리고 아이메리아 테넬라의 난포낭 약 10 내지 약 1000 개이다. 유리하게는, 면역 반응을 이끌어내거나 면역학적 또는 보호 반응을 유도하기 위한 유효량은, 아이메리아 아세르불리나의 난포낭 약 500 개, 아이메리아 맥시마의 난포낭 약 50 내지 약 100 개, 아이메리아 미티스의 난포낭 약 500 개 및 아이메리아 테넬라의 난포낭 약 100 개 내지 500 개이다. 보다 유리하게는, 유효량은 아이메리아 아세르불리나의 난포낭 약 500 개, 아이메리아 맥시마의 난포낭 약 100 개, 아이메리아 미티스의 난포낭 약 500 개, 그리고 아이메리아 테넬라의 난포낭 약 100 개이다. 다른 구현예에서, 상기 유효량은, 동물에 대해 아이메리아 아세르불리나의 난포낭 약 100,000 내지 약 500,000 개 및 아이메리아 맥시마의 난포낭 약 10,000 내지 약 100,000 개, 아이메리아 미티스의 난포낭 약 100,000 내지 약 500,000 개, 또는 아이메리아 테넬라의 난포낭 약 10,000 내지 약 100,000 개의 접종량을 견뎌내기에 충분하다. 보다 유리하게는, 접종량은 아이메리아 아세르불리나의 난포낭 약 200,000 개 및 아이메리아 맥시마의 난포낭 약 20,000 내지 약 50,000 개, 아이메리아 미티스의 난포낭 약 200,000 개, 또는 아이메리아 테넬라의 난포낭 약 20,000 내지 약 50,000 개이다.

면역 반응을 이끌어내거나 면역학적 또는 보호 반응을 유도하기 위한 유효량은 또한 아이메리아 아세르불리나, 아이메리아 맥시마, 아이메리아 미티스 및 아이메리아 테넬라의 조발성 균주로부터 단리된, 포자형성 난포낭의 특정 비에 관한 것으로서, 여기서 아이메리아 아세르불리나 : 아이메리아 맥시마 : 아이메리아 미티스 : 아이메리아 테넬라의 비는 약 10 : 1 - 2 : 10 : 2 - 10 (즉, 아이메리아 아세르불리나의 포자낭 10 개 마다, 아이메리아 맥시마의 포자낭 약 1 내지 2 개, 아이메리아 미티스의 포자낭 약 10 개 및 아이메리아 테넬라의 포자낭 약 2 내지 10 개가 존재함) 이다. 유리하게는, 아이메리아 아세르불리나 : 아이메리아 맥시마 : 아이메리아 미티스 : 아이메리아 테넬라의 비는 약 5 : 1 : 5 : 1 (즉, 10 : 2 : 10 : 2) 이다.

본 발명의 다른 측면은, 각각 본 발명에 따른 면역원성 조성물 또는 백신 조성물을 사용한, 면역화법 또는 예방접종법이다.

본 방법은, 본 발명에 따른 면역원성 조성물 또는 백신 조성물의 유효량을 동물에 1 회 이상 투여하는 것을 포함한다. 동물은 수컷 또는 암컷일 수 있다. 상기 투여는 특히 근육내 (IM), 피내 (ID) 또는 피하 (SC) 주사에 의해 또는 비강내 또는 경구 투여를 통해 이루어질 수 있으며, 여기서, 경구 투여에는 먹이 또는 음용수, 겔, 또는 스프레이를 통한 투여가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에 따른 면역원성 조성물 또는 백신은 주사기 또는 바늘이 없는 기기 (예를 들면, Pigjet 또는 Biojector (Bioject, Oregon, USA) 등) 에 의해 투여될 수 있다. 유리한 구현예에서는, 경구 투여된다.

본 발명에 따른 조성물은 또한 다른 포유류, 예컨대 마우스 또는 실험실 동물에 투여되어, 예를 들면, 폴리클로날 항체를 생성하거나, 또는 모노클로날 항체용 하이브리도마를 제조할 수 있다.

본 발명은 동물, 유리하게는 조류의 면역화를 제공한다. 구포자충증 백신의 투여법은, 전체 개시내용이 본원에 편입되는, 미국 특허 제 4,438,097 호; 제 4,639,372 호; 제 4,808,404 호; 제 5,055,292 호; 제 5,068,104 호; 제 5,387,414 호; 제 5,602,033 호; 제 5,614,195 호; 제 5,635,181 호; 제 5,637,487 호; 제 5,674,484 호; 제 5,677,438 호; 제 5,709,862 호; 제 5,780,289 호; 제 5,795,741 호; 제 5,814,320 호; 제 5,843,722 호; 5,846,527 호; 제 5,885,568 호; 제 5,932,225 호; 제 6,001,363 호 및 제 6,100,241 호에 기재되어 있다. 상기 방법은 유효 면역화 투여량의 본 발명의 백신을 동물에 투여하는 것을 포함한다. 백신은 당업자에게 잘 알려진 방법 중 어느 하나, 예를 들면, 근육내, 피하, 복강내, 정맥내, 비강내, 경구, 피내, 포낭내 (intrabursal) (단지, 닭 항문 위로), 난소 내 (in ovo), 또는 안구 내 (ocularly) 에 의해 투여될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제 5,693,622 호; 제 5,589,466 호; 제 5,580,859 호; 및 제 5,566,064 호는, 그 전체 개시 내용이 본원에 편입된다. 새에는, 전체 개시 내용이 본원에 편입되는 미국 특허 제 4,458,630 호 및 제 6,627,205 호 에 기재된 바와 같이, 백신을 난소 내 투여할 수 있다.

유리하게는, 스프레이 캐비넷 (cabinet), 즉, 새를 증기 함유 백신에 놓아 노출시킨 캐비넷 내에서 또는 코오스 스프레이 (course spray) 에 의해 백신을 새에 투여할 수 있다. 다른 유리한 구현예에서, 면역원성 또는 백신 조성물은 경구 투여된다. 이와 달리, 면역원성 또는 백신 조성물은 음용수 또는 먹이로 투여될 수 있다.

본 발명은, 아이메리아 아세르불리나, 아이메리아 맥시마, 아이메리아 미티스 및 아이메리아 테넬라의 조발성 균주로부터의 포자형성 난포낭의 혼합물을 포함하는 면역원성 또는 백신 조성물을 포함한다. 아이메리아 아세르불리나, 아이메리아 맥시마, 아이메리아 미티스 및 아이메리아 테넬라의 조발성 균주로부터의 포자형성 난포낭는 본원에 기재된 종자 배양액으로부터 분리된다. 일반적으로, 조성물 내의 포자형성 난포낭의 투여량 범위는 아이메리아 아세르불리나의 난포낭 약 10 내지 약 1000 개, 아이메리아 맥시마의 난포낭 약 10 내지 약 100 개, 아이메리아 미티스의 난포낭 약 10 내지 약 1000 개, 및 아이메리아 테넬라의 난포낭 약 10 내지 약 1000 개이다. 유리하게는, 조성물 내의 포자 형성 난포낭의 투여량 범위는 아이메리아 아세르불리나의 난포낭 약 125 내지 약 500 개, 아이메리아 맥시마의 난포낭 약 25 내지 100 개, 아이메리아 미티스의 난포낭 약 125 내지 약 500 개 및 아이메리아 테넬라의 난포낭 약 25 내지 약 500 개이다. 한 구현예에서, 저투여량은 아이메리아 아세르불리나의 난포낭 약 125 개, 아이메리아 맥시마의 난포낭 약 25 개, 아이메리아 미티스의 난포낭 약 125 개 및 아이메리아 테넬라의 난포낭 약 25 개이다. 다른 구현예에서, 중간 투여량은 아이메리아 아세르불리나의 난포낭 약 250 개, 아이메리아 맥시마의 난포낭 약 50 개, 아이메리아 미티스의 난포낭 약 250 개 및 아이메리아 테넬라의 난포낭 약 50 개이다. 또다른 구현예에서, 고투여량은 아이메리아 아세르불리나의 난포낭 약 500 개, 아이메리아 맥시마의 난포낭 약 100 개, 아이메리아 미티스의 난포낭 약 500 개 및 아이메리아 테넬라의 난포낭 약 100 개이다.

유리하게는, 면역원성 또는 백신 조성물의 투여량은 아이메리아 아세르불리나의 난포낭 약 500 개, 아이메리아 맥시마의 난포낭 약 50 내지 100 개, 아이메리아 미티스의 난포낭 약 500 개 및 아이메리아 테넬라의 난포낭 약 100 내지 500 개이다. 보다 유리한 구현예에서, 투여량은 아이메리아 아세르불리나의 난포낭 약 500 개, 아이메리아 맥시마의 난포낭 약 100 개, 아이메리아 미티스의 난포낭 약 500 개 및 아이메리아 테넬라의 난포낭 약 100 개이다.

본 발명은 또한 아이메리아 아세르불리나, 아이메리아 맥시마, 아이메리아 미티스 및 아이메리아 테넬라의 조발성 균주로부터 단리된 포자형성된 난포낭에 관한 것으로서, 여기에서, 아이메리아 아세르불리나 : 아이메리아 맥시마 : 아이메리아 미티스 : 아이메리아 테넬라의 비는 약 10 : 1 - 2 : 10 : 2 - 10 (즉, 아이메리아 아세르불리나의 포자낭 10 개 마다, 아이메리아 맥시마의 포자낭 약 1 내지 2 개, 아이메리아 미티스의 포자낭 약 10 개 및 아이메리아 테넬라의 포자낭 약 2 내지 10 개가 존재함). 유리하게는, 아이메리아 아세르불리나 : 아이메리아 맥시마 : 아이메리아 미티스 : 아이메리아 테넬라의 비는 약 5 : 1 : 5 : 1 (즉, 10 : 2 : 10 : 2) 이다.

유리하게는, 젠타미신을 함유하는 0.01 M 인산염 완충염 식염수 용액으로 이루어진 방부제 내에 난포낭을 현탁시킨다. 다른 구현예에서는, 난포낭을 다양한 방부제, 또는 아세트산, 시트르산, 칼륨 디크로메이트 또는 프로피온산 (이에 제한되지는 않음) 과 같은 유기산 중 어느 하나에 현탁시킨다. 예를 들면, 이에 제한되지는 않지만, 30 mcg/ml 이하의 젠타미신을 함유하는 충분한 멸균 0.01 M 인산염 완충 식염수 용액을 사용하여 2,000 투여량 제시용 병 당 2 ml, 5,000 투여량 제시용 병 당 5 ml, 10,000 투여량 제시용 병 당 10 ml 를 생성한다. 유리하게는, 난포낭는 멸균 붕규산염 유리 바이알 내에 저장된다. 예를 들면, 이에 제한되지는 않지만, 난포낭는 반자동 또는 자동 디스펜서를 사용하여 백신 바이알 내로 무균 충전되고, 스톱퍼 (stopper) 가 기계적으로 또는 수동으로 삽입되고 알루미늄 밀봉이 놓여져 폐쇄된다.

백신은 2000 투여량 바이알, 5000 투여량 바이알, 10,000 투여량 바이알 또는 20,000 투여량 바이알을 함유하는 다중 투여량으로 시판중이다. 생성물의 만료일은 효능 시험 개시일로부터 13 개월을 초과하지 않을 것이다.

동물, 유리하게는 조류는 임의의 적합한 연령에 예방접종될 수 있으며, 통상은 최초 예방접종 전 약 1 일 내지 3 일이다. 유리하게는, 상기 동물은 1 회 예방접종된다. 임의로, 2 회의 투여량의 백신이 사용되는 경우, 첫번째는 일반적으로 동물이 3 일 내지 1 주령일 때 투여되고, 연이어 동물의 유형에 따라 추가로 1 내지 10 주 후에 예방접종된다.

유리한 구현예에서의 각 동물 종에 대한 용도, 용법 및 투여 경로는 다음과 같다. 본 발명의 면역원성 또는 백신 조성물을, 구포자충증으로 인한 질병의 예방 있어서의 보조제로서, 생후 1 일 이상된 건강한 닭의 예방접종에 사용한다. 유리하게는, 용법은 닭 100 마리 당 20 ml 의 조수 (coarse water) 스프레이에 의한 닭에 대한 1 회 투여량이었다.

본 발명은 이제 하기의 비제한적 실시예로써 기술될 것이다.

실시예 1: 구균 (Coccus) 제조

생성물의 조성

사용되는 미생물은 아이메리아 아세르블리나, 아이메리아 맥시마, 아이메리아 미티스 및 아이메리아 테넬라이다. 상기 미생물의 보존 균주 (stock culture)의 기원은 다음과 같다. 아이메리아 아세르블리나의 모체는 1969 년 Hess and Clark Laboratories 에서 T. K. Jeffers 로부터 얻어졌으며, USDA, Beltsville, MD, 에서 M. Farr 박사에 의해 분리되었으며, 이는 단일 난포낭로부터 유래된 것으로 생각되었다. 아이메리아 맥시마 배양액은 Georgia, Delaware, Maryland, Virginia 및 Texas 로부터 얻어진 10 개의 정제된 분리물의 잡종 (interbred) 혼합물로부터 유래되었다. 아이메리아 미티스 배양액의 모체는 1978 년 7 월 Gainesville, Georgia 로부터 분리되었으며 단일 난포낭 분리에 의해 정제되었다. 아이메리아 테넬라 배양액의 모체는 Patten 박사에 의해 1960 년대 초반 이후로 펜실바니아 주립 대학에서 유지된 배양액으로부터 얻어졌으며, 1982 년 조지아 대학에 의해 얻어졌다.

사용된 각각의 아이메리아 균주는, 전체 개시내용이 본원에 편입되는 문헌 [Avian Pathology, 17: 305-314,1988 entitled "Eimeria of American Chickens: Characteristics of Six Attenuated Strains Produced by Selection for Precocious Development, P. L. Long and Joyce K. Johnson] 에 기재된 바와 같은 각각의 미생물의 조발성 균주였다. 미생물은 본 방법에 따른 조발성 발생을 위한 선택에 의해 약독화되었다.

배양액

생성물에 사용된 각각의 아이메리아 종은, 전체 개시 내용이 본원에 편입되는 문헌 [Long, P. L. and W. M. Reid, A guide for the diagnosis of cocciodiosis in chickens. Re. Report 404 (Report 355 revised), Athens, GA: College of Agriculture Experiment Station, Univ. of Georgia; 1982] 에 기재된 바와 같이, 이들의 독특한 현미경적 외관, 크기 및 형상, 감염된 닭 창자 또는 맹장 부위에 의해 확인되었다.

미생물은 상술한 바와 같이 조숙한 발생을 위한 선택에 의해 약독화되었다. 9 CFR 113.37 에 기재된 절차를 사용하여 시험한 결과, 각 배양액은 병원균이 없었다. 상술한 보존균주는 액체 질소의 액체 또는 증기상 내에서 유지되었다.

종자 배양액의 제조를 위해 2 내지 8 주령의 닭을 사용하였다. 투여 경로는, 경구였다. 모든 종자는 포자형성 난포낭였으며, 2 내지 8 주령의 SPF 닭에서 생산되었다. 각 아이메리아 종에 대해 제공된 설비를 유지하였다. 충분한 부피의 포자형성된 난포낭 (종자) 을 항구포자충이 없는 먹이와 혼합하거나, 경구 위영양법 (gavage) 에 의해 투여하여, 각 닭에 표 1 에 열거된 최소 투여량을 제공하였다. 난포낭의 수가 생산용 종자로서 사용되기에 충분할 때까지, 2 내지 8 주령의 SPF 닭에 포자형성된 난포낭을 연속적으로 계대접종시켰다 (계대접종 (passage) 은 제한되지 않음). 배양액은 생활력/감염력을 유지하기 위해 12 개월 초과의 기간 동안 유지될 수 없다.

포자형성 난포낭 (종자)의 최소 투여량
종	닭 한 마리당 난포낭
아이메리아 아세르불리나	100 내지 15,000
아이메리아 맥시마	100 내지 15,000
아이메리아 미티스	100 내지 15,000
아이메리아 테넬라	100 내지 15,000

접종 후 3 일째부터 8 일째까지 매일 점적 (dropping) 을 수거하였다. 닭을 무작위로 희생시키고, 미티스를 제외한 각 종에 대해 특징적 감염을 관찰하였다. 임의의 외래 질환의 증거가 있는 경우 수확이 없었다.

참조용 보존균주를 액체 질소 내에서 유지하였다. 생산 배양액을 5±3℃ 에서 유지하고, 2 내지 8 주령 SPF 닭에 계대접종하였다.

살포 (seeding) 또는 접종을 위한 현탁액의 제조는, 충분한 난포낭이 생산되어 제조될 때까지 2 내지 8 주령 SPF 닭에서의 종자 배양액의 일련의 계대접종을 수반하였다.

충분한 부피의 포자형성된 난포낭 (종자) 를 항구포자충이 없는 먹이와 혼합하고, 투여하여 각 닭에 표 1 에 열거된 최소 투여량을 제공하였다. 접종 후 3 일째부터 8 일째까지 매일 하나의 배스 (bath) 로서 점적을 수거하였다. 닭을 무작위로 희생시키고, 미티스를 제외한 각 종에 대해 특징적 감염을 관찰하였다. 임의의 외래 질환의 증거가 있는 경우 수확이 없었다. 상술한 바와 같이, 미생물은 조숙한 발생을 위한 선택에 의해 약독화되었다.

수확

미생물을 제거하기 전, 생산 목적으로, 닭을 개별 종의 생산에 대해 지정된 우리에서 사육하였다. 닭이 항구포자충이 없는 식이법을 유지하도록 하고, 물은 무제한으로 먹였다. 접종 후 3 일째부터 8 일째까지 매일 점적을 수거하였고, 가공될 때까지 5±3℃ 에서 유지하였다.

생산 목적을 위한 미생물 수확 기술은 다음과 같이 수확되었다. 점적을 수중에서 약 10% (w/v) 의 비로 균질화하였다. 호모제나이트 (homogenate) 를 스크린에 통과시켜 대형 입자를 제거하였다. 원심분리, 스크리닝 또는 5±3℃ 에서 24 시간 이하로 유지함으로써 고체를 분리했다. 5±3℃ 에서 유지시켜 고체를 분리한 경우, 이를 원심분리로 추가로 농축시켰다. 상등액을 따라 버리고, 고체를 포화 NaCl (80% w/v) 수용액에 재현탁시켰다. 생성된 용액을 원심분리하였다. 액체의 상부로부터 난포낭을 수거하고 (제거하고), 물에 재현탁시켰다. 최적으로, 남아있는 액체를 물로 20-40% NaCl 까지 희석시키고 원심분리하였다. 이어서, 추가의 난포낭이 회수될 때까지, 펠렛을 포화 NaCl 용액 내에 재현탁시키고 재원심분리하였다. 난포낭을 2 회 이하로 세척하였다. 난포낭을 염을 사용하지 않은 반복적인 재현탁 원심분리 주기에 의해 세척한 후, 10 내지 15 분간 나트륨 하이포클로라이트의 0.5% 용액 내에 재현탁시켰다. 이어서, 난포낭을 반복된 (3X) 원심분리 및 재현탁 단꼐에 의해 나트륨 하이포클로라이트를 사용하지 않고 세척하였다. 2.5% 칼륨 디크로메이트 (K₂CrO₇) 수용액 내에서 최종 재현탁을 수행하였다. 이어서, 난포낭을 포자형성관으로 옮겼다. 27±3℃ 에서 72 시간 이하의 기간 동안 공기와 함께 현탁액을 살포하여 포자형성을 촉진하였다. 포자형성 후, 최종 생성물이 제조될 때까지 난포낭을 5±3℃ 에서 유지하였다.

유리한 구현예에서, 허용가능한 수확물에 대한 상술은 다음과 같다. 첫째로, 총 난포낭에 대한 포자형성된 난포낭의 비를 결정한다. >40% 의 포자형성을 충족시키거나 초과하는 수확물만이 허용가능한 것으로 생각되었다. 둘째로, 각 난포낭 수확물의 크기, 형상 및 외관은 생산하고자 하는 종의 특징이어야 한다.

생산에 사용되지 않는 폐기된 재료는 9 CFR 114.15 와 일치하는 방식으로 처리된다.

생성물의 제조

최종 생성물의 일련 또는 비일련을 벌크 하비스트 (bulk harvest) 용액을 사용하여 모았다. 모든 난포낭은 상기 묘사한 대로, 그들이 성숙한 것에서 약독화되었다. 난포낭을 젠타마이신 30.0 mcg 이하를 함유하는 0.01 M PBS 용액으로 이루어진 방부제에 현탁시켰다. 생성물은 표 2에 지시된 대로 각 종의 포자화된 난포낭의 최종 수 이상 수율로 표준화되었다.

포자형성 난포낭의 표준 투여량
종	투여량 당 난포낭
아이메리아 아세르불리나	500
아이메리아 맥시마	50
아이메리아 미티스	500
아이메리아 테넬라	500

일련을 다음과 같이 모았다. 4 개의 아이메리아 종의 각 벌크 현탁 로트 (lot)는 5±3℃ 저장으로부터 제거하고 교반하면서 주위 실온으로 가온하였다. 각 로트의 충분한 부피는, 벌크 부유의 각각의 숫자에 기초한 계산에 의해서 측정된대로, 상기 표 2에서 기록된 용량당 난포낭 이상의 수율을 산출하기 위해 방부처리하여 제거되고 결합된다. 필요하다면, 포자화된 난포낭의 요구되는 수를 제공하기 위해 각 아이메리아 종의 다수의 로트가 결합된다. 30 mcg/ml 젠타마이신 이하를 함유하는 충분한 무균의 0.01 M PBS를, 2,000 용량 제시를 위해 병당 2 ml, 5,000 용량 제시를 위해 병당 5 ml 이고, 10,000 용량 제시를 위해 병당 10 ml을 수득하기 위해 사용했다. 벌크 일련을 일정한 교반하에서 지속했다.

일련 부피의 예 (10,000 용량 생성물의 10,000,000 용량 배치에 기초함)
	부피
아이메리아 아세르불리나	500 ml @ 1.0 x 10⁷ 난포낭/ml
아이메리아 맥시마	300 ml @ 1.67 x 10⁶ 난포낭/ml
아이메리아 미티스	750 ml @ 6.7 x 10⁶ 난포낭/ml
아이메리아 테넬라	1050 ml @ 2.4 x 10⁶ 난포낭/ml
0.01 M PBS/젠타마이신	17,400 ml
총 부피	20,000 ml

평균 10,000-용량 일련은 20 L 내지 40 L의 범위이다. 가득 찬 부피는 1000 용량당 1.0 ml이다. 백신 병은 무균이고, 붕규산염 유리 바이알이다.

최종 용기를 채우고 밀봉하는 방법 및 기술은 다음과 같다. 백신은 반-자동 또는 자동 디스펜서를 가지고 백신 바이알에 무균으로 채운다. 정지 장치는 기계적으로 또는 수동으로 끼워넣는다. 알루미늄 밀봉을 놓고 수축시킨다.

각 용량은 벌크 총계로부터 계산된 대로, 포자화된 난포낭의 표 2에서 목록된 용량 만큼을 함유한다. 일련 수를 각 분량 1회분으로 할당하고, 단일 수행으로 정리한다.

시험

각 일련은 9 CFR 113.27(e)에서 기술된 시험 방법을 사용해서 순도를 시험했다. 어느 배양 조건에서든 평균 총계는 용량 당 하나의 콜로니를 초과해서는 안된다. 만약 어느 배양 조건에서든 초기 시험에서, 평균 총계가 용량 당 하나의 콜로니를 초과하면, 20 개의 미개봉된 최종 용기를 사용하여 임의로 한번의 재시험을 수행한다. 만약 최종 시험의 어느 배양 조건에서든 평균 총계가, 용량 당 하나의 콜로니를 초과한다면, 일련은 불만족스럽다.

살모넬라는 나트륨 히포클로라이트 및 칼륨 디크로메이트 둘 다에 의해서 효과적으로 죽는 것이 보였으므로, 부가적인 시험을 수행하지 않았다. 미코플라즈마는 나트륨 히포클로라이트에 의해서 효과적으로 죽는 것이 보였으므로, 부가적인 시험을 수행하지 않았다.

각 일련을 9 CFR 113.37에 따라 외부 병원체로 시험했다.

백신의 안정성을 시험하기 위해, 1일생 25 마리 이상의 각각을, 특이 병원체가 없는 닭에게 스프레이 백신에 의해서, 백신의 10 용량으로 백신접종을 한다. 닭을 21일 동안 매일 관찰한다. 기간동안 죽은 닭은 검사하여 사인을 결정한다. 만약 20 마리 이상의 닭이 관찰 기간동안 살아남지 못한다면, 시험은 결론에 이르지 못한다. 만약 임의의 질병이나 죽음을 직접적으로 백신 탓으로 돌릴 수 있다면, 일련은 불만족스럽다. 백신의 경미한 장의 병변 특징은 정상이라고 간주하고, 안정성 평가에서 고려되지 않는다. 만약 20 마리 미만의 닭이 관찰 기간에 살아남고 백신의 탓으로 돌릴만한 죽음이나 심각한 병변이 없다면, 시험을 임의로 한번 반복한다. 시험이 반복되지 않으면, 일련은 공표하기에 불만족스럽다.

생성 종자의 각 새로운 1회분으로부터 생성된 최종 생성물의 첫번째 일련으로 가능성을 시험할 것이다. 1 내지 14일 된 SPF 또는 육계 유형의 닭에서 생성물을 시험할 것이다. 생성 종자로부터 생성된 그 다음의 일련은 상기 구체화된 예비-제형 총계와, 접종된 새들로부터 난포낭의 회수를 이용해 가능성을 평가할 것이다. 닭은 70 마리 이하를 사용했다. 단 35 마리에 백신을 하나의 필드 용량으로 경구 백신을 접종했다. 최초 백신 접종 26 내지 30일후에 모든 닭을 개별적으로 확인하고, 체중을 기록했다. 하기에 목록된 각 군으로부터, 10 백신접종한 것 및 10 대조군에, 표 4에서 보여지는 대로 접종량을 각 1.0 ml로 경구 접종했다.

접종량
	종	접종량
1 군 접종	아이메리아 아세르불리나	100,000 내지 500,000 난포낭
	아이메리아 맥시마	10,000 내지 100,000 난포낭
2 군 접종	아이메리아 미티스	100,000 내지 500,000 난포낭
3 군 접종	아이메리아 테넬라	10,000 내지 100,000 난포낭

접종량은 또한 병원체에 기초해서 선택되며, 선택된 수준에서 2 이상의 최소 수치를 줄 것이다.

접종 6일후에, 표 4에서 각 군으로부터 백신접종한 것과 대조군을 죽이고, 무게를 재고, 창자와 맹장을 검사하고, 병변에 대해 수치를 매겼다. [Experimental Parisitology, Vol. 28, p30-36,1970] 에서 이것의 전부가 참조로써 혼입된 발표에 기술된 대로, 존슨 및 레이드 코시오디알 (Johnson and Reid cocciodial)수치 시스템에 따라 수치를 매기고, 표 5에서 보여진다.

병변의 수치
수치	병변
0	없음
1	경미한 병변
2	중간
3	심각함
4	극히 심각한 병변 또는 사망

제조 후 단계

백신은 다양한 용량을 함유하는, 2000 용량 바이알, 5000 용량 바이알, 10,000 용량 바이알 또는 20,000 용량 바이알로 판매된다. 대표 샘플의 수집, 저장 및 기탁은 9 CFR 113.3에 따른다. 생성물의 유효기간은 가능성 실험 개시 날로부터 13 개월을 초과하지 않았고, 9 CFR 114.13에 따라 재확인하였다.

각 동물 종에 대한 사용, 용량 및 투여 경로는 다음과 같다. 본 생성물을 구포자충증의 예방을 돕기 위해, 건강한 1일생 이상의 닭에 백신접종하는데 사용했다. 용량은 용량 굵은 수분 스프레이에 의해 닭 1 마리당 1 용량이다; 닭 100 마리당 20 ml.

실시예 2: 시판되는 생 구포자충 백신 및 살리노마이신, 통상적인 새에서 항구포자충 약물과 비교한 조류 구포자충의 약독화된 품종을 함유하는 실험 백신의 효능.

본 실시예의 목적은 병독성 아이메리아 종으로 접종된 육계 유형의 닭을 보호하기 위해 USDA 승인된 생 난포낭 백신 (Coccivac-B)과 비교해서, 약독화된 아이메리아 난포낭 백신의 효능을 측정하고, 통상적인 항구포자충 약물, 살리노마이신을 가진 약독화된 백신의 사용과 비교하는 것이다.

표적 변수는 다음과 같다. 일차 변수는 장의 병변 수치이다. 용인 범주는 비백신접종된, 접종된 새와 비교했을 때, 낮은 후-접종 장 구포자충 병변이다. 두번째 변수는 (1) 7-주 성숙 상동안 체중 증가 및 사료 요구 및 (2) 사망률이다. 용인 범주는 백신 접종한 새 대. 생 난포낭 백신 (Coccivac-B) 또는 항구포자충 약물로 치료된 백신접종한 새에서 동등 또는 우세한 체중 증가 및 사료 요구 및 백신접종된 새 대. 비백신접종된 대조군 새, 생 난포낭 백신 (Coccivac-B) 백신접종된 새, 및 항구포자충-처리된 새에서 낮은 사망률을 포함한다.

물질

백신은 표 6에서 기술된다.

백신
	실험 백신	쉐링-플라우 (Schering-Plough) 백신
학명	아이메리아 아세르불리나, 아이메리아 테넬라, 아이메리아 맥시마, 아이메리아 미티스	아이메리아 아세르불리나, 아이메리아 테넬라, 아이메리아 맥시마, 아이메리아 미티스
제조자	롱(Long)의 약독화된 균주로부터 개발됨	쉐링-플라우
제형	냉장된 현탁물
제조	난포낭은 감염되기 쉬운 닭에 경구 접종, 배설물로부터 난포낭의 회수, 포자형성, 총계, 및 적절한 접종량으로 희석함으로써 제조된다.	소유 정보
유통 기한	약 1 년	약 1 년
저장 조건	4℃-10℃─1.5% 포타슘 디크로메이트에 저장되어 약 9 개월동안	4℃-10℃─1.5% 포타슘 디크로메이트에 저장되어 약 9 개월동안
투여량	1x 백신으로 다가 접종, 여기서 1x 는 아이메리아 테넬라, 100 난포낭/ 새 + 아이메리아 아세르불리나, 500 난포낭/새 + 아이메리아 미티스, 500 난포낭/새 + 아이메리아 맥시마, 100 난포낭/새	소유 정보
투여 경로	경구-투여를 위한 스프라-박 (Spra-Vac)	경구 투여

병독성/접종 유기체
특정 이름	아이메리아 아세르불리나, 아이메리아 테넬라, 아이메리아 맥시마, 아이메리아 미티스
원천	필드 단리 또는 병독성 균주
제조	표 6 참조
저장 조건	표 6 참조
투여량	아이메리아 테넬라 및 아이메리아 맥시마의 20,000 내지 50,000 난포낭 및 아이메리아 미티스 및 아이메리아 아세르불리나의 200,000 난포낭을 가지고 감염되기 쉬운 닭에 다가 경구 접종
경로	경구

동물
종	갈루스 도메스티쿠스 (Gallus domesticus)(닭)
품종/계통	통상의 새
성	F/M
나이	1일
수	대략 4000
조절/새 환경 순응	병아리는 백신 접종후 바로 동물집에 둔다.

동물은 그들의 안녕을 고려해 유사하고 마땅하게 다룬다. 동물은 모든 적절한 조절에 순응하여 대우한다.

실험 설계

실험 설계는 다음과 같다.

실험 처리 군
군	나이	새/Rep	Rep/Grp	총 새	투여 경로	접종	처리
1	1일	650	2	1300	스프레이*	실험 백신	한번
2	1일	650	2	1300	스프레이*	생 난포낭 백신 (Coccivac-B)	한번
3	1일	650	2	1300	N/A	살리노마이신	42일째(접종을 위해 제거한 새에는 28일째에 중지)까지 매일 사료에 60g/톤
4	1일	TBD	1	TBD	N/A	비백신접종

* 병아리 100 마리 당 20 mls 전달.

시간스케줄 (timeline) 은 다음과 같다. 0일에, 새는 축사에 의해 무게를 쟀다. 1군 및 2군 안의 새에 표 9에서 기술한 대로, 백신 투여 계획 마다 1300 마리의 새로 백신접종을 하고, 집의 각 반에서 하나로, 2 축사 사이에 나눴다. 3군에 있는 새를 1 및 2 군에서 기술한 대로 나누어, 살리노마이신, 60g/톤으로 시작했다. 축사는 보관했다. 여분의 부화짝은 비백신접종된 병아리와 같이 철제 새장에 유지하였다.

21일에, 모든 새에게 사료를 어린동물용에서 성장용으로 바꿨다. 살리노마이신은 3군에서 계속했다.

28일에, 접종된 새를 철사 새장으로 옮겼다. 3군 새에서 살리노마이신 을 중단했다. 모든 새 및 사료를 무게를 쟀다. 큰 축사에서 각 군의 한배로부터 신선한 배설물 샘플을, 각 축사마다 20 샘플을 수집했다. 종에 의해 난포낭을 정량했다.

29일에, 새장안의 새를 표 7에서 기술된 난포낭의 수를 사용하여 접종했다.

35일에, 접종 새를 중단하고, 병변 수치를 매기고, 체중 증가를 조사했다.

42일에, 모든 군을 치료되지 않은 마무리용 사료로 바꾸고 남은 사료의 무게를 잰다.

49일에, 모든 새와 사료의 무게를 재고, 실험을 중단했다.

실험 절차

백신접종/약물치료. 표 9에서 1-3 군으로 확인된 새의 3번의 처리가, 집의 반에서, 1 집당 3 축사, 1 축사당 650 마리의 새, 실험당 총 1300 마리의 새로 반복하였다. 1 에서 3군의 새를 표 9에서 기술된 대로 백신접종했다.

부가적인 처리군 (4)는 단지 접종 시험에서 사용하기 위해 깨끗한 새장에서 비백신접종, 비처리 대조군으로 개별적으로 유지한다.

처리군 1,2, 및 4에는 비-치료 사료를 제공한다. 처리군 3 에는 살리노마이신 (60g/ton)을 시작 1 일부터 42일까지 제공한다. 3군에서 접종되는 새에는 접종 새장으로 이동한 후 비-치료 사료를 제공한다.

어린동물용 사료를 21일 까지, 성장용은 42일 까지, 마무리용은 49일까지 제공했다. 배출된 사료를 기록하고, 임의의 소비되지 않고 남은 사료는, 사료 교환 및 종료시에 무게를 잰다.

관찰. 새는 0 및 28 일에 축사에 의해, 49일에 축사와 성별에 의해 무게를 쟀다. 죽은 새를 하루에 두번 모으고, 사인을 결정하기 위해 검시했다. 28일에 수집된 배설물 샘플을 생존 가능한 난포낭로 관찰하고, 종에 의해 정량했다.

접종. 28일에, 각 축사로부터 10 마리의 새의 3 reps (처리 당 총 60마리)를 무게를 재고, 아이메리아의 필드 품종 (백신에서 사용된 종에 상응하는)으로 접종하기 위해 배터리 새장으로 이동시켰다. 모든 새에게 새장에서 비-치료 사료를 제공했다. 29일에, 1-4 군의 새를 접종하고, 그리고 35일에 종료했다. 장애 수치와 무게를 기록했다.

상기 동물들을 백신 접종 전에 새끼 상자로부터 랜덤하게 선택하여 각 치료 그룹으로 랜덤하게 할당하였다. 치료 그룹 사이에 교차 오염을 막기 위해 엄격한 보안이 유지되었으므로 과학자들은 치료 그룹을 볼 수 있었다.

협력 투약 및 부작용 관리. 콕시박 (Coccivac)이 접종된 조류는 시험 시작후 제 14 일에 병에 걸렸다. 진단 결과 괴사성 장염이었다. 원인균은 클로스트리디움 소르델리 (Clostridium sordelli)로 확인되었다. 모든 시험 대상 조류에 페니실린 G 를 투여하여, 우리 안 동물 사이의 오염 및 그 영향을 감소시키고, 구포자충증 결과를 왜곡할 수 있는 그룹 간의 치료상 차이를 제거하였다.

자료 분석

측정 기준. 플로어펜 단계 (floor pen phase)에 대한 1 차 변수는 제 28 및 49 일의 생존 체중 (live weight) 및 제 49 일의 사료전환율이었다. 접종 단계에 있어서, 1 차 변수는 접종 후 제 6 일의 체중증가량, 및 마찬가지로 접종 후 제 6 일의 상부, 중앙 및 말단 창자 단면의 병변 수치였다.

통계적 분석. 모든 통계적 분석은 SAS, Cary, NC(Version 8.2)를 이용하여 수행하였다. 통계적 유의성은 본 연구에서 조사한 귀무가설의 양측검정을 기초로 하였으며, 그 결과 p 값은 0.05 이하였다.

창자 병변 수치. 접종후 장 구포자충의 병변 발생빈도 및 경중도 (카테고리별 병변 수치)를, 치료 그룹 및 블록 (block)을 인자로 하는 로짓 모형 (logit model) 및/또는 치료 그룹 및 블록을 인자로 하는 생존분석 모형 (자료의 성질에 따라 다름)을 이용하여 분석하였다.

사망률. 병독성 아이메리아종 접종과 관련된 사망이 발생한 경우, 치료 그룹 및 블록을 인자로 하는 ANOVA (즉, 분산분석)을 수행하여 각 치료 그룹에 대한 총사망률 평균 (발생일에 관계없이)사이에 유의미한 차이가 존재하는지 여부를 결정하였다.

체중증가량 및 사료전환율

플로어펜 단계. 치료 그룹내에서, 쌍체t-검정 (paired t-tests) (블록 효과를 고려함이 없이, 블록 단위 및 전체 그룹으로서)을 실시하여 각 치료 그룹내에 평균 생존 체중의 유의미한 차이가 존재하는지 여부를 결정하였다. 쌍체 비교분석 (paired comparison)에는 제 0 일 대 제 28 일 체중(접종전) 및 제 28 일 대 제 49 일 체중(접종후)이 포함되었다.

쌍체t검정 (블록 효과를 고려함이 없이, 블록 단위 및 전체 그룹으로서)을 실시하여 각 치료 그룹내에 평균 사료전환율의 유의미한 차이가 존재하는지 여부를 결정하였다. 쌍체 비교분석에는 제 28 일 대 제 49 일의 사료전환중량 (접종후) 및 제 42 일 대 제 49 일의 사료전환중량 (비투약 피니셔 사료 효과(unmedicated finisher feed effect))이 포함되었다.

치료 그룹 사이에, 치료 그룹, 일(日), 블록 및 그룹-일 상호관계를 인자로 하는 반복 측정 ANOVA 를 이용하여, 모든 시험일의 체중에 대하여 그룹 간의 평균 생존 체중에 존재하는 유의미한 차이의 기록 여부를 결정하였다.

접종 단계. 치료 그룹내에서, 쌍체t-검정 (블록 효과를 고려함이 없이, 블록 단위 및 전체 그룹으로서)을 실시하여 각 치료 그룹내에 평균 생존 체중의 유의미한 차이가 존재하는지 여부를 결정하였다. 쌍체 비교분석에는 제 28 일 대 제 35 일의 체중 (접종후 6일)이 포함되었다.

치료 그룹 사이에, 접종후 치료 그룹간 평균 생존 체중 분석을, 플로어펜 단계에 대한 치료 그룹간 분석 결과를 이용하여 제 28 일 및 제 35 일 비교에 중점을 두고 수행하였다.

결과

제 28 일 요약
치료	평균 생존 체중	%사망률(NE)*	%총 사망률	사료전환율
실험용 백신	1.41	0.23	2.69	1.429
콕시박	1.39	11.77	15.69	1.453
살리노마이신	1.45	0.46	3.76	1.383
*그룹화에 의한 통계적 차이를 나타냄

제 49 일 요약
치료	평균 생존 수컷 체중	평균 생존 암컷 체중	평균 총생존 체중	사료전환율	%NE사망률	%총사망률
실험용 백신	3.21	2.62	2.90	1.84	0.23	4.69
콕시박	3.11	2.55	2.82	1.92	11.76	17
살리노마이신	3.17	2.63	2.90	1.86	0.53	5.38

접종 결과
치쵸	초기 체중	최종 체중	제6일 체중 증가량	상부 병변 수치	중앙 병변 수치	말단(Ceca) 병변 수치	TLS¹	ATLS²	구포자충증으로 인한 %사망률
음성 대조군	1425.55ab*	1849.72a	424.17a	0.00c	0.00d	0.00d	0.00d	0.00d	0
접종 대조군	1396.95b	1538.75b	141.80c	2.48a	3.43a	2.38b	8.30a	2.77a	6.67
실험용 백신	1459.60ab	1777.53a	317.93b	0.78b	1.30c	2.17b	5.25b	1.42b	0
콕시박	1469.68a	1851.53a	381.85a	0.85b	0.93c	0.55c	2.33c	0.78c	0
살리노마이신	1435.47ab	1488.97b	53.50d	2.50a	2.90b	3.25a	8.65a	2.88a	0
치료제 당 60 마리 조류를 접종함.*은 그룹화에 의한 통계적 차이를 나타냄.a, b, c 및 d 는 던컨의 평균 분리(Duncan's separation of means)이다(던컨 검정은 평균을 분리하기 위한 통계학적 hoc 검정이다).1 은 총병변 수치임.2 는 평균 총병변 수치임.

검토

아이메리아 맥시마, 아이메리아 아세르불리나 및 아이메리아 미티스 접종에 대한 실험용 백신 및 콕시박에 있어서의 병변 수치에는 유의미한 차이가 없었다. 콕시박의 경우 실험용 균주에 비해 아이메리아 테넬라에 대한 병변 수치가 더 낮았다.

콕시박을 접종한 조류는 클로스트리듐 소르델리에 감염되었다는 사실을 주목해야 한다. 클로스트리듐병은 야외에서의 구포자충증 감염과 연관되어 있었다. 상기 감염이 다른 치료제로 전파되지는 않았으나, 콕시박을 접종한 조류는 11.77%의 사망률을 보여 가장 영향을 많이 받았다.

결론

실험용 아이메리아 균주는 병독성 공격에 대하여 효능이 있는 것으로 나타났다. 실험용 균주를 접종한 조류는 콕시박 및 살리노마이신 처리된 조류에 비하여 제 49 일째 사료전환율에 의해 나타나듯이 더 나은 성과를 보였는 바, 이는 양계업자에게 경제적 이익을 가져다 준다.

이제까지 본 발명의 유리한 구현예를 상세히 기술하였는 바, 본 발명은 상기 내용에 기재된 특정 상세한 설명에 제한되지 않으며, 본 발명의 요지 또는 범위를 벗어남이 없이 이의 명백한 변형이 다수 가능하다.

Claims

아이메리아 아세르불리나 (E. acervulina), 아이메리아 맥시마 (E. maxima), 아이메리아 미티스 (E. mitis) 및 아이메리아 테넬라 (E. tenella)의 조발성 (precocious) 균주로부터 단리한 포자형성 난포낭 혼합물로 필수적으로 이루어진 면역원성 또는 백신 조성물.
제 1 항에 있어서, 혼합물이, 아이메리아 아세르불리나 난포낭 약 500 개, 아이메리아 맥시마 난포낭 약 50 내지 약 100 개, 아이메리아 미티스 난포낭 약 500 개, 및 아이메리아 테넬라 난포낭 약 100 내지 약 250 개가 혼합된 조성물.
제 1 항에 있어서, 혼합물이, 아이메리아 아세르불리나 난포낭 약 500 개, 아이메리아 맥시마 난포낭 약 100 개, 아이메리아 미티스 난포낭 약 500 개, 및 아이메리아 테넬라 난포낭 약 100 개가 혼합된 조성물.
아이메리아 아세르불리나, 아이메리아 맥시마, 아이메리아 미티스 및 아이메리아 테넬라의 조발성 균주로부터 단리한 포장형성 난포낭 혼합물을 함유하는 면역원성 또는 백신 조성물로서, 아이메리아 아세르불리나 : 아이메리아 맥시마 : 아이메리아 미티스 : 아이메리아 테넬라의 비가 약 10 : 1 - 2 : 10 : 2 - 5 인 조성물.
제 4 항에 있어서, 아이메리아 아세르불리나 : 아이메리아 맥시마 : 아이메리아 미티스 : 아이메리아 테넬라의 비가 약 5 : 1 : 5 : 1 인 조성물.
제 1 항의 면역원성 또는 백신 조성물의 유효량을 투여하여 닭에게서 면역 반응을 유도하는 것을 포함하는 면역 반응의 유도 방법.
제 1 항의 면역원성 또는 백신 조성물의 유효량을 투여하여 닭에게서 면역학적 반응 또는 보호 반응을 유도하는 것을 포함하는 면역학적 또는 보호 반응의 유도 방법.
제 4 항의 면역원성 또는 백신 조성물의 유효량을 투여하여 닭에게서 면역 반응을 유도하는 것을 포함하는 면역 반응의 유도 방법.
제 4 항의 면역원성 또는 백신 조성물의 유효량을 투여하여 닭에게서 면역학적 반응 또는 보호 반응을 유도하는 것을 포함하는 면역학적 또는 보호 반응의 유도 방법.
제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 유효량이 아이메리아 아세르불리나 난포낭 약 500 개, 아이메리아 맥시마 난포낭 약 50 내지 약 100 개, 아이메리아 미티스 난포낭 약 500 개, 및 아이메리아 테넬라 난포낭 약 100 내지 약 250 개인 방법.
제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 유효량이 아이메리아 아세르불리나 난포낭 약 500 개, 아이메리아 맥시마 난포낭 약 100 개, 아이메리아 미티스 난포낭 약 500 개, 및 아이메리아 테넬라 난포낭 약 100 개인 방법.
제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 유효량이, 아이메리아 아세르불리나 : 아이메리아 맥시마 : 아이메리아 미티스 : 아이메리아 테넬라의 비가 약 5 : 1 : 5 : 1 인 방법.
제 6 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량이, 동물에 대한 아이메리아 아세르불리나 난포낭 약 100,000 내지 약 500,000 개 및 아이메리아 맥시마 난포낭 약 10,000 내지 약 100,000 개, 아이메리아 미티스 난포낭 약 100,000 내지 약 500,000 개, 또는 아이메리아 테넬라 난포낭 약 10,000 내지 약 100,000 개의 접종량을 견디기에 충분한 방법.
제 13 항에 있어서, 접종량이 아이메리아 아세르불리나 난포낭 약 200,000 개 및 아이메리아 맥시마 난포낭 약 20,000 내지 약 50,000 개, 아이메리아 미티스 난포낭 약 200,000 개, 또는 아이메리아 테넬라 난포낭 약 20,000 내지 약 50,000 개인 방법.