ES2401810T3 - Organismos clostridium atenuados y vacuna recombinante - Google Patents

Abstract

Una molecula de acido nucleico que codifica una muteina sustancialmente no toxica de la toxina alfa deClostridium perfringens, en la que la muteina de la toxina alfa comprende la secuencia de aminoacidos de la SEC IDNo: 3 menos 9 restos de aminoacidos consecutivos que van de Tyr62 a Trp70.

Description

Organismos Clostridium atenuados y vacuna recombinante

5 Referencia cruzada a las solicitudes relacionadas

Esta solicitud es una solicitud no provisional que reivindica la prioridad según el Punto 119(e) del Título 35 del Código de los Estados Unidos de la solicitud provisional de los Estados Unidos con Nº de Serie 60/792.553, presentada el 7 de abril de 2006.

Campo de la invención

Esta invención está relacionada con organismos Clostridium atenuados, a los procedimientos para prepararlos y utilizarlos y a las muteínas de las toxinas alfa y los ácidos nucleicos que la codifican.

15 Antecedente de la invención

Los patógenos bacterianos anaerobios constituyen una grave carga económica en la industria agrícola. Las bacterias de la familia Clostridium representan una carga concreta, debido a que estas bacterias producen graves enfermedades en las aves y otros animales domésticos económicamente valiosos. Los diversos esfuerzos para controlar estos organismos se han basado en las medidas sanitarias y en la administración de antibióticos en la alimentación de los animales.

En particular, Clostridium perfringens (“C. perfringens”) es una bacteria anaerobia que se encuentra en el suelo, en

25 materia orgánica podrida, y como parte de la flora del intestino de seres humanos y animales. Las diferentes cepas de C. perfringens se designan como los biotipos A a E, dependiendo del espectro de toxinas producidas [Justin y col., Biochemistry 41, 6253-6262 (2002); McDonel (1986) PHARMACOLOGY OF BACTERIAL TOXINS; F Domer y J Drews (Eds.) Pergamon Press, Oxford]. Las cepas del biotipo A son de particular importancia como los agentes etiológicos de diversos tipos de gangrena y enfermedades entéricas. Una enfermedad entérica particularmente grave producida por C. perfringens es la enteritis necrosante (conocida también en la técnica como “enteritis necrótica”, una gangrena de los intestinos que da como resultado necrosis, sepsia, y hemolisis, en seres humanos y animales domesticados [véanse, Pearson y coI., J. Am. Vet. Med. 188(11):1309-10 (1986); AI-Sheikhy y Truscott, Avian Dis. 21(2): 256-63 (1977)]. En aves, por ejemplo, pollos (Gallus gallus), la enteritis necrosante es un problema significativo. C. perfringens tanto de tipo A como de tipo C puede producir pérdidas importantes, especialmente en la

35 producción de pollos de la variedad Broiler [Ficken y Wages, Necrotic Enteritis, en Diseases of Poultry, 10ª Ed. pps 261-264 (1997)]. Además de las pérdidas asociadas con los brotes producidos por enteritis necrosante, se ha notificado que la productividad se ve afectada en bandadas con enfermedades asociadas a C. perfringens [Lovl y Kaldhusdal, Avian Pathology 30:73-81 (2001)]. Tal como se ha señalado anteriormente, los agentes antibacterianos administrados en la alimentación del animal constituyen el procedimiento de control más común. Sin embargo, los agentes antibacterianos, por ejemplo, los antibióticos, son costosos y están sujetos a riesgos crecientes relacionados con la promoción de la resistencia bacteriana.

De forma más reciente, se han llevado a cabo intentos para proporcionar vacunas contra las especies de Clostridium perjudiciales. Por ejemplo Lovland, y col. [Avian Pathology 33(1): 83-92 (2004)] han ejemplificado vacunas

45 candidatas basadas en los toxoides de tipo A y tipo C de C. perfringens con un adyuvante de hidróxido de aluminio. Se ha notificado la vacunación de gallinas reproductoras para proporcionar anticuerpos específicos para proteger a la progenie frente a las lesiones entéricas inducidas por un estímulo subclínico de C. perfringens. Se conocen otras vacunas basadas en toxoides preparadas a partir de toxinas de C. perfringens detoxificado [véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Nº 4.292.307, que describe toxoides de los tipos A, B y D de C. perfringens, C. oedematiens, y C. septicum].

Se han propuesto también preparaciones de toxoides recombinantes. Por ejemplo, Titball y col., [Patentes de los Estados Unidos Nos 5.851.827, 6.403.094, y 5.817.317] han notificado ácidos nucleicos que codifican péptidos antigénicos de C. perfringens, así como los propios péptidos, y las vacunas preparadas a partir de los péptidos. Se

55 describe que los péptidos tienen, por ejemplo, de 261 a 300 restos de aminoácidos de la toxina alfa de C. perfringens natural, pero carecen de los dominios hidrolizantes de la fosfolipasa C y la esfingomielina de la toxina natural. Se ha notificado además que estos péptidos inducen la inmunoprotección frente a la toxina natural. Además, la Patente de los Estados Unidos Nº 6.610.300 describe una vacuna basada en un fragmento antigénico de una muteína de la toxina beta de C. perfringens.

Sin embargo, no importa si una vacuna de toxoide se deriva del organismo nativo o se obtiene de forma recombinante, se considera que es económicamente laborioso producir y administrar proteínas de toxoides a los animales que necesitan la inmunización, excepto en circunstancias especiales (por ejemplo, para tratar seres humanos que pueden ser alérgicos o sensibles a otros componentes de una vacuna de un organismo completo).

65 Además, las vacunas basadas en proteína/toxoide requieren normalmente repetidas vacunaciones de refuerzo con el fin de mantener una completa efectividad.

Otra solución propuesta ha sido construir mediante ingeniería genética un virus antigénicamente activo que produzca una muteína de la toxina alfa, en lugar de la toxina natural. Por ejemplo, Bennett y col. [Viral lmmunol. 12(2): 97-105 (1999)] han ejemplarizado un vector de virus vaccinia recombinante que expresa un codominio no tóxico de la toxina alfa de C. perfringens. Desafortunadamente, aunque se han propuesto algunas vacunas de

5 vaccinia recombinantes durante los últimos 20 años, sigue existiendo desde hace muchos años una preocupación acerca de la seguridad de la administración de virus de vaccinia vivos e infecciosos en un entorno en el que pueden transmitirse a las personas no son resistentes a este virus.

Se sabe que la toxina alfa (gen plc) de C. perfringens posee algunas actividades biológicas que incluyen la actividad hemolítica, de fosfolipasa C, de esfingomielasa, de fosfodiesterasa, y actividades letales. Existen numerosos informes en la técnica que hacen referencia a mutaciones de esta toxina alfa que reducen la toxicidad. Schoepe, y col. [Infect. and Immun. 69(11): 7194-7196 (2001)] describen una cepa de C. perfringens natural que produce una toxina alfa no tóxica. Sin embargo, sería difícil modificar esta cepa para estimular la inmunoprotección frente a otra variante de la especie C. perfringens natural, pero tóxica.

15 Williamson y Titball [Vaccine 11(12): 1253-1258 (1993)] mostraron que la región de la toxina procedente de los restos de aminoácidos 247 a 370 en solitario fue suficiente para inmunizara ratones contra la gangrena gaseosa inducida experimentalmente por C. perfringens. Alape-Giron y col. [Eur. J. Biochem. 267: 5191-5197 (2000)] han notificado que las sustituciones en Asp269, Asp336, Tyr275, Tyr307, y Tyr331 redujeron la toxicidad de la toxina alfa. Nagahama, y col. [Infect. and Immun. 65: 3489-3492 (1997)] notificaron que la sustitución de Asp-56, Asp-130,

o Glu-152 dio como resultado una reducción en la toxicidad de la toxina alfa. Nagahama y col. [J. Bacteriology 177:1179-1185 (1995)] notificaron que la sustitución de la histidina en la posición 68 por un aminoácido neutro, tal como glicina, en la toxina alfa de C. perfringens, dio como resultado una pérdida completa de la actividad hemolítica, de fosfolipasa C, de esfingomielinasa, y la actividad letal de la muteína de la toxina alfa. Se cree que este único

25 cambio de aminoácidos inactiva uno de los tres dominios de unión al cinc de la proteína. El dominio de unión al cinc inactivado mediante la sustitución de His68 fue posteriormente denotado como Zn2 [Justin y coI., Biochemistry 41: 6253-6262 (2002)].

Schoepe y col, Anaerobe, Londres, GB, vol. 12, nº 1, febrero de 2006, páginas 44-48 se refieren a la protección de ratones contra la toxina alfa de Clostridium perfringens mediante la inmunización con la variante 121A191-R212H de una toxina alfa.

A pesar de lo anterior, sigue existiendo una necesidad en la técnica de un procedimiento seguro, económico y eficaz para proteger animales domésticos criados de forma intensiva, que incluyen aves, tales como pollos, de la infección

35 por especies de Clostridium, incluyendo C. perfringens.

La cita de cualquier referencia en el presente documento no debe considerarse como una admisión de que dicha referencia está disponible como “técnica anterior” con respecto a la presente solicitud.

Resumen

Con el fin de abordar las carencias anteriormente descritas en la técnica, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican una muteína sustancialmente no tóxica de la toxina alfa de Clostridium perfringens.

45 En particular, la presente invención proporciona lo siguiente:

1.

Una molécula de ácido nucleico que codifica una muteína sustancialmente no tóxica de la toxina alfa de Clostridium perfringens en la que la muteína de la toxina alfa comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3 menos 9 restos de aminoácidos consecutivos que van desde Tyr62 a Trp70.

2.

La molécula de ácido nucleico del apartado 1, en la que dicha molécula de ácido nucleico codifica una muteína en la que dichos nueve aminoácidos consecutivos que se han eliminado están sustituidos por un único resto de leucina.

3.

La molécula de ácido nucleico del apartado 1 que comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 2 en la que se han eliminado los nucleótidos 268-294 de la molécula de ácido nucleico.

4.

La molécula de ácido nucleico del apartado 3, en la que los nucleótidos detectados están sustituidos por una secuencia de nucleótidos que codifica un único resto de Leu.

5.

Una muteína sustancialmente no tóxica de la toxina alfa de Clostridium perfringens, en la que la muteína de la toxina alfa comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3 menos nueve restos de aminoácidos consecutivos que van desde Tyr62 a Trp70 que están eliminados.

6. la muteína sustancialmente no tóxica de la toxina alfa de Clostridium perfringens del apartado 5; en la que los

nueve restos de aminoácidos consecutivos están eliminados y sustituidos por un único resto de Leu.

7.

Un organismo Clostridium perfringens atenuado sustancialmente no tóxico desarrollado integrando la molécula de ácido nucleico de uno cualquiera de los apartados 1-4 en un cromosoma de un organismo Clostridium perfringens no atenuado.

8.

El organismo Clostridium perfringens atenuado del apartado 7, en el que la molécula de ácido nucleico está localizada en una posición en el cromosoma que es homóloga a la localización de la molécula de ácido nucleico que codifica una toxina alfa natural presente en el Clostridium perfringens no atenuado.

9.

El organismo Clostridium perfringens atenuado del apartado 7 o del apartado 8 que es un Clostridium perfringens de tipo A.

10.

El organismo Clostridium perfringens de uno cualquiera de los apartados 7-9 en el que el Clostridium perfringens no atenuado a partir del cual se ha desarrollado el anterior ha sido aislado de un animal hospedador que es bien un mamífero o un ave.

11.

El organismo Clostridium perfringens atenuado del apartado 10, en el que dicho mamífero se ha seleccionado entre el grupo que consiste de, bovino, ovino, y porcino.

12.

El organismo Clostridium perfringens atenuado del apartado 10 en el que dicha ave es un pollo, un pavo, un ganso, un pato, un cisne, una paloma, un pichón, un urogallo, o una perdiz.

13.

El organismo Clostridium perfringens atenuado de uno cualquiera de los apartados 7-12 que comprende al menos un gen que codifica un polipéptido no de Clostridium perfringens.

14.

El organismo Clostridium perfringens del apartado 13 en el que dicho polipéptido no de Clostridium perfringens es un polipéptido no bacteriano.

15.

El organismo Clostridium perfringens atenuado del apartado 14 en el que el polipéptido no bacteriano es un polipéptido de ave o mamífero.

16.

El organismo Clostridium perfringens atenuado del apartado 15 en el que el polipéptido no bacteriano es un polipéptido de ave.

17.

El organismo Clostridium perfringens atenuado del apartado 15 en el que el polipéptido no bacteriano es una citoquina.

18.

el organismo Clostridium perfringens atenuado del apartado 17 en el que la citoquina es IL-18 de pollo.

19.

Un Clostridium perfringens atenuado tal como se ha definido en los apartados 7-18 anteriores para uso como una vacuna en un procedimiento para inducir inmunidad frente a las enfermedades producidas por infecciones con Clostridium perfringens en un animal, en el que dicho Clostridium perfringens atenuado se administra en una dosis inmunológicamente eficaz.

20.

El Clostridium perfringens atenuado para uso de acuerdo con el apartado 19, en el que la vacuna es para la administración mediante las rutas oral, intramuscular, intravenosa, intradérmica, subcutánea, o intranasal.

21.

El Clostridium perfringens atenuado para uso de acuerdo con el apartado 19, en el que la vacuna se reparte en el alimento del animal.

22.

El Clostridium perfringens atenuado para uso de acuerdo con el apartado 19, en el que la vacuna es para la administración como una pulverización sobre los animales para proporcionar la administración oral.

23.

Un organismo Clostridium perfringens que es CPERF/ΔαToxin 365-054 que tiene el Nº de Depósito PTA7364 de la ATCC.

24.

Un organismo Clostridium perfringens que es CPERF/ΔαToxin 365-053 que tiene el Nº de Depósito PTA7365 de la ATCC.

25.

Una vacuna que comprende el organismo Clostridium perfringens atenuado de uno cualquiera de los apartados 7-18, 23, o 24.

26.

La vacuna del apartado 25 que comprende además uno o más de los siguientes: un tampón farmacológicamente aceptable, un excipiente, o un adyuvante.

27.

Un pienso animal que comprende del apartado 25 o 26.

Se da a conocer además la molécula de ácido nucleico que codifica una muteína de la toxina alfa que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3, menos al menos 18 restos de aminoácidos consecutivos, en la que uno de los restos de aminoácidos que se han eliminado es His68. Se da a conocer además la molécula de ácido nucleico que codifica una muteína de la toxina alfa que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3,

5 menos al menos 12 restos de aminoácidos consecutivos, en la que uno de los restos de aminoácidos que se han eliminado es His68. Se da a conocer además la molécula de ácido nucleico que codifica una muteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3 menos al menos 9 restos de aminoácidos consecutivos, en la que uno de los restos de aminoácidos que se han eliminado es His68. Se da a conocer además la molécula de ácido nucleico que codifica una muteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3 menos al menos 6 restos de aminoácidos consecutivos, en la que uno de los restos de aminoácidos que se han eliminado es His68. Se da a conocer además la molécula de ácido nucleico que codifica una muteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3 menos al menos 3 restos de aminoácidos consecutivos, en la que uno de los restos de aminoácidos que se han eliminado es His68.

15 Se da a conocer además una molécula de ácido nucleico de la presente invención que codifica una muteína en la que no se han eliminado más de 48 restos de aminoácidos consecutivos procedentes de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3. Se da a conocer además una molécula de ácido nucleico que codifica una muteína en la que no se han eliminado más de 36 restos de aminoácidos consecutivos procedentes de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3. Se da a conocer además una molécula de ácidos nucleicos que codifica una muteína en la que no se han eliminado más de 24 restos de aminoácidos consecutivos procedentes de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3. Se da a conocer además una moléculas de ácidos nucleicos que codifica una muteína en la que no se han eliminado más de 18 restos de aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3.

25 Se da a conocer además una molécula de ácido nucleico que codifica una muteína en la que se han eliminado nueve restos de aminoácidos consecutivos procedentes de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3, uno de los cuales es His68. En una realización concreta de este tipo, la molécula de ácido nucleico codifica una muteína en la que nueve restos de aminoácidos consecutivos van de Tyr62 a Trp70 de la SEC ID Nº: 3. En una realización más concreta, la molécula de ácido nucleico codifica una muteína en la que estos nueve restos de aminoácidos que se han eliminado están sustituidos por un único resto de leucina.

En otra realización, la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 2, en la que se han eliminado los nucleótidos 268-294. En una realización específica de este tipo, los nucleótidos 268-294 de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 2 están sustituidos por tres nucleótidos que codifican un único resto de

35 leucina.

Tal como se ha descrito anteriormente, la presente invención proporciona también muteínas sustancialmente no tóxicas de la toxina alfa de Clostridium perfringens. Se da a conocer además la muteína de la toxina alfa que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3 menos al menos 18 restos de aminoácidos consecutivos, en la que uno de los restos de aminoácidos que se han eliminado es His68. Se da a conocer además la muteínas que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3 menos al menos 12 restos de aminoácidos consecutivos, en la que uno de los restos de aminoácidos que se han eliminado es His68. Se da a conocer además la muteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3 menos al menos 9 restos de aminoácidos consecutivos, en la que uno de los restos de aminoácidos que se han eliminado es His68. Se

45 da a conocer además la muteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3 menos al menos 6 restos de aminoácidos consecutivos, en la que uno de los restos de aminoácidos que se han eliminado es His68. Se da a conocer además la muteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3 menos al menos 3 restos de aminoácidos consecutivos, en la que uno de los restos de aminoácidos que se han eliminado es His68.

Se da a conocer además una muteína que comprende no más de 48 restos de aminoácidos consecutivos que se han eliminado de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3. Se da a conocer además la muteína que comprende no más de 36 restos de aminoácidos consecutivos que se han eliminado de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3. Se da a conocer además la muteína que comprende no más de 24 restos de aminoácidos consecutivos que se han eliminado de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3. Se da a

55 conocer además la muteína que comprende no más de 18 restos de aminoácidos consecutivos que se han eliminado de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3.

Se da a conocer además una muteína sustancialmente no tóxica en la que se han eliminado nueve restos de aminoácidos consecutivos procedentes de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3, uno de los cuales es His68. En una realización más concreta de este tipo, los nueve restos de aminoácidos consecutivos que se han eliminado van de Tyr62 a Trp70 de la SEC ID Nº: 3. En una realización aún más concreta, estos nueve aminoácidos consecutivos que se han eliminado están sustituidos por un único resto de leucina en la secuencia de aminoácidos de la muteína.

65 La presente invención proporciona además organismos Clostridium perfringens atenuados que tienen una molécula de ácido nucleico que codifica una muteína sustancialmente no tóxica de la toxina alfa de Clostridium perfringens integrada en sus cromosomas. Esta molécula de ácido nucleico integrada está preferiblemente localizada en una posición en el cromosoma que es homóloga a la localización de la molécula de ácido nucleico que codifica la toxina alfa natural en el organismo Clostridium perfringens natural. De esta manera, un organismo Clostridium perfringens atenuado de la presente invención puede ser sustancialmente no tóxico debido a la ausencia del gen plc natural

5 funcional. Tal como se ha ejemplificado en el presente documento, el organismo Clostridium perfringens atenuado puede ser un Clostridium perfringens de tipo A.

En una realización particular de la presente invención, el organismo Clostridium perfringens atenuado es Clostridium perfringens CPERF/ΔαToxin 365-054 (N º de Depósito PTA7364 de la ATCC). En otra realización particular de la presente invención, el organismo Clostridium perfringens atenuado es Clostridium perfringens CPERF/ΔαToxin 365053 Nº de Depósito PTA7365 de la ATCC).

Un organismo Clostridium perfringens que se ha atenuado mediante los procedimientos de la presente invención se puede aislar de un animal hospedador que es bien un mamífero o un ave. Dichos mamíferos pueden incluir: bovinos,

15 ovinos, y porcinos, Los ejemplos de aves adecuadas incluyen pollos, pavos, patos, pichones, gansos, palomas, cisnes, perdices, y urogallos.

La presente invención proporciona también vacunas. Dichas vacunas pueden comprender los organismos Clostridium perfringens atenuados de la presente invención. Las vacunas de la presente invención pueden incluir también tampones, excipientes, y/o adyuvantes farmacológicamente aceptables.

Además, la presente invención proporciona procedimientos para inducir la inmunidad frente a Clostridium perfringens en un animal. Una de dichas realizaciones comprende administrar una dosis inmunológicamente eficaz de una vacuna de la presente invención al animal. Las vacunas de la presente invención se pueden administrar

25 mediante numerosas rutas que incluyen: por vía oral, intramuscular, intravenosa, intradérmica, subcutánea e intranasal. Una vacuna de la presente invención se puede repartir en el alimento del animal y/o pulverizarse sobre los animales para proporcionar la administración oral. La presente invención además proporciona un pienso animal que incluye una vacuna de la presente invención.

La presente invención proporciona también un organismo de Clostridium perfringens atenuado de la presente invención que, además, expresa al menos un gen que codifica un polipéptido no de Clostridium perfringens. En una de dichas realizaciones, uno o más de los polipéptidos no de Clostridium perfringens son polipéptidos bacterianos, tales como proteínas antigénicas procedentes de E. coli, salmonella, lawsonia, o campylobacter, etc., y/o sus combinaciones. De forma alternativa, o en combinación con las anteriores, un polipéptido no de Clostridium

35 perfringens puede ser un polipéptido no bacteriano. Los ejemplos de dichos polipéptidos no bacterianos incluyen proteínas de mamíferos o aves, por ejemplo, citoquinas, tales como IL-18 de pollo; virus tales como rotavirus o coronavirus, y parásitos tales como eimeria, isospora, y cryptosporidium.

Se da a conocer además un anticuerpo que se une selectivamente a un epítopo que falta en la muteína sustancialmente no tóxica de la toxina alfa de Clostridium perfringens. Dichos anticuerpos pueden distinguirse de la muteína sustancialmente no tóxica de una toxina alfa de Clostridium perfringens natural.

Se dan a conocer también kits de ensayo que incluyen los anticuerpos dados a conocer para uso en la identificación bien sea de un sujeto animal que se ha vacunado, o alternativamente, que ha resultado infectado naturalmente por

45 un organismo Clostridium perfringens.

De acuerdo con esto, se proporcionan también procedimientos para identificar y/o distinguir un animal que ha sido infectado naturalmente por un organismo Clostridium perfringens de uno vacunado con un organismo Clostridium perfringens atenuado. En una de dichas realizaciones el procedimiento conlleva poner en contacto una muestra de fluido procedente del animal con un anticuerpo que se une selectivamente a un epítope que se encuentra en una toxina alfa de Clostridium perfringens natural que se ha eliminado de la muteína sustancialmente no tóxica de la toxina alfa de Clostridium perfringens de la presente invención. De este modo, el anticuerpo puede distinguir entre los animales que se han vacunado con una muteína sustancialmente no tóxica de la toxina alfa de Clostridium perfringens de la presente invención (y/o un organismo Clostridium perfringens atenuado que expresa la muteína) de

55 aquellos que están infectados o que se han infectado con una toxina alfa de Clostridium perfringens de tipo natural. La siguiente etapa es determinar si el anticuerpo reacciona con la muestra de fluido, por ejemplo, se une a un antígeno contenido por la muestra de fluido. El animal se identifica como uno que se ha/ha sido infectado naturalmente por un organismo Clostridium perfringens cuando el anticuerpo reacciona con la muestra de fluido.

Breve descripción de las figuras

La FIG. 1 ilustra una cartografía genómica de la región que codifica la toxina alfa de C. perfringens. Se muestran las localizaciones de los dos fragmentos grandes (de 1182 pares de bases y 1746 pares de bases), respectivamente, que se usaron para construir CPERF001. Se indica también la localización que resulta de la

65 eliminación de 27 pares de bases. “Ypic” indica el gen ypic (CPE0035), “plc” indica el gen que codifica la toxina alfa (una fosfolipasa C), y “CobW” indica un gen en la dirección 3’.

La FIG. 2A ilustra la secuencia de una porción del gen plc de la cepa CP6 de Clostridium perfringens [SEC ID Nº: 4, esta es una porción de la SEC ID Nº: 22, (es decir, los nucleótidos 262-300) de un fragmento del gen plc de CP6] y la correspondiente secuencia peptídica (SEC ID Nº: 5), en la que el subrayado indica el sitio de restricción de la endonucleasa BamH1 utilizado para crear la eliminación.

5 La FIG. 2B ilustra la secuencia del cebador (SEC ID Nº: 6) utilizado para crear la eliminación en la cepa 1240 de

C. perfringens progenitora, que da lugar al CPERF001 eliminador. El subrayado indica el sitio de restricción BamH1 incluido en el cebador para facilitar la construcción de la eliminación. Se ilustra también el correspondiente péptido (SEC ID Nº: 7). La FIG. 2C ilustra la secuencia de la eliminación resultante en CPERF001 (SEC ID Nº: 8; nucleótidos 103-117) y en el péptido correspondiente (SEC ID Nº: 9). El subrayado indica el sitio de restricción de la endonucleasa BamH1 restaurado. La FIG. 3A ilustra una vez más la secuencia de una porción del gen plc procedente de la cepa CP6 de C. perfringens [SEC ID Nº: 4, nucleótidos 262-300] y la secuencia peptídica correspondiente (SEC ID Nº: 5), en la que el subrayado indica el sitio de la endonucleasa de restricción BamH1 utilizado en la creación de la

15 eliminación. La FIG. 3B ilustra la secuencia del cebador (SEC ID Nº: 10) utilizado para crear la eliminación en la cepa 29 del

C. perfringens, que da lugar al CPER002 eliminador. Se ilustra también el péptido correspondiente (SEC ID Nº: 11). La FIG. 3C ilustra la secuencia de la eliminación resultante en CPERF002 (SEC ID Nº: 12) y el péptido correspondiente (SEC ID Nº: 13).

Descripción detallada

De acuerdo con esto, la presente invención proporciona organismos Clostridia modificados y cultivos que expresan

25 una o más de las toxinas de Clostridia, por ejemplo, las toxinas alfa, como muteínas que no tienen toxicidad detectable, y/o sustancialmente baja toxicidad, con respecto a las toxinas de Clostridia nativas o naturales. De forma ventajosa, los organismos C. perfringens mutantes inventivos se administran fácilmente como vacunas vivas a animales. Se proporcionan también las muteínas de las toxinas alfa de Clostridium perfringens inventivas, junto con las moléculas de ácidos nucleicos que codifican las muteínas, los vectores para expresar las toxinas alfa, y los procedimientos de utilización de las mismas.

Con el fin de proporcionar una descripción clara de la presente invención, algunos términos se definen como sigue. Una vacuna es una composición que incluye un inmunógeno y otros ingredientes farmacéuticamente aceptables opcionales, que incluyen, en algunas realizaciones, adyuvantes adecuados. Tal como se usa en el presente

35 documento, el término “inmunógeno” describe una composición, sustancia o vector que, cuando se introduce en un animal, estimula una respuesta inmune. Para los fines de la presente invención, se contempla que un inmunógeno incluya cualquier vector capaz de expresar o introducir la muteína de la toxina alfa inventiva en un animal que se va a inmunizar. Un vector incluye, por ejemplo, el C. perfringens inventivo u otro microorganismo adecuado, que expresa la muteína de la toxina alfa inventiva cuando el vector se introduce en un animal. Un vector incluye también moléculas de ácido nucleico conocidas en la técnica, por ejemplo, plásmidos y similares, que expresan la muteína de la toxina alfa inventiva cuando se introduce directamente en un animal; por ejemplo, introduciendo una célula del animal y expresando la muteína de la toxina alfa en el animal. Un inmunógeno es también una proteína, tal como la toxina alfa inventiva, empleada por sí misma o como parte de una composición de vacuna adecuada.

45 Tal como se usa en el presente documento, y a no ser que se especifique de otra manera, los términos “inmunizar” y “vacunar” son sinónimos y se usan de forma indistinta para describir la introducción de un inmunógeno en un animal para estimular una respuesta inmune en el animal. La respuesta inmune estimulada proporciona inmunidad protectora al animal tratado que limita o reduce los signos clínicos de la enfermedad, por ejemplo, gangrena gaseosa, y/o la mortalidad, en animales vacunado que se estimulan posteriormente con una dosis virulenta de una especie de Clostridium perfringens para la cual la vacuna inventiva es protectora.

El término “adyuvante” se define como una o más sustancias que dan lugar a la estimulación del sistema inmune. En este contexto, se utiliza un adyuvante para potenciar una respuesta inmune para uno o más antígenos/aislados de vacuna. Se puede administrar un adyuvante al animal diana antes, en combinación con, o después de la

55 administración de la vacuna. Se pueden obtener adyuvantes de la presente invención a partir de cualquiera de numerosas fuentes, incluyendo fuentes naturales, fuentes recombinantes, y/o químicamente sintetizadas, etc. Los ejemplos de compuestos químicos utilizados como adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, compuestos de aluminio; aceites metabolizables y no metabolizables; polímeros en bloque; ISCOM (complejos inmunoestimuladores); vitaminas y minerales (incluyendo, pero sin limitarse a: vitamina E, vitamina A, selenio, y vitamina B12); Quil A (saponinas); polímeros reticulados basados en ácido acrílico (por ejemplo, polímeros de ácido prop-2-anoico), reticulados a diferentes niveles con un polialquenil poliéter, comercializados con la marca comercial CARBOPOL®, y/o gotículas de aceite de tamaño micrométrico uniformemente dispersas en emulsión en agua, por ejemplo, comercializadas con la marca comercial Emulsigen®.

65 Los ejemplos adicionales de adyuvantes, que algunas veces se han denominado específicamente como inmunoestimulantes, incluyen, componentes de la pared celular bacterianos y fúngicos (por ejemplo, lipopolisacáridos; lipoproteínas, glicoproteínas, péptidos de muramilo, beta-1,3/1,6-glucanos, diversos carbohidratos complejos derivados de plantas (por ejemplo, glicanos; acemanano), diversas proteínas y péptidos derivados de animales (por ejemplo, hormonas, citoquinas, factores coestimuladores), y novedosos ácidos nucleicos derivados de virus y otras fuentes (por ejemplo, ARN bicatenario, CpG). Además, cualquier número de combinaciones de las

5 sustancias anteriormente mencionadas puede proporcionar un efecto adyuvante, y por tanto, puede formar un adyuvante de la presente invención.

Se pretende que el término “anticuerpo”, tal como se usa en el presente documento, se abarque anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales y/o sus fragmentos o derivados recombinantes, que incluyen las proteínas de unión diseñadas mediante ingeniería genética que incorporan dominios variables de anticuerpos.

Tal como se usa en el presente documento, la numeración y la posición de los restos de las proteínas de la toxina alfa inventiva se basan en el sistema numérico descrito para la cepa 13 de Clostridium perfringens. La toxina alfa de cepa 13 de Clostridium perfringens está notificada con el Nº de Acceso NC 003366 del GenBank tal como se ilustra

15 mediante las SEC ID Nº: 1. La proteína completa tiene 398 aminoácidos de longitud. La toxina alfa codificada por los vectores de la muteína ejemplificados a continuación en el presente documento corresponde a la proteína de la SEC ID Nº: 1 que tiene una eliminación de los restos de aminoácidos 90-98. Existe una secuencia señal de 28 aminoácidos que se escinde durante la maduración de la proteína. Por tanto, la eliminación ejemplificada corresponde a los restos de aminoácidos 62-70 de la proteína madura, que tiene 370 aminoácidos de longitud (SEC ID Nº: 3).

La numeración del codón del ADN que codifica las proteínas de la toxina alfa inventiva se basa en el gen plc de la cepa 13 de Clostridium perfringens, tal como se ha notificado en el Nº de Acceso NP 560952 del GenBank, y tal como se ilustra mediante la SEC ID Nº: 2. La secuencia de codificación de la toxina alfa se desarrolla desde el

25 nucleótido 48590 al 49786 en la cepa 13 de C. perfringens. La eliminación del codón en las dos construcciones ejemplificadas en el presente documento corresponde a los nucleótidos de 48857 a (e incluyendo) 48883 del gen NP 560952. Esta eliminación se encuentra en el gen de la toxina alfa y corresponde a los nucleótidos 268-294 en la secuencia de codificación de la SEC ID Nº: 2.

Además, el uso de términos en singular por comodidad de la descripción no se pretende que sea en forma alguna limitante. De esta manera, por ejemplo, las referencias a una composición que comprende una célula de Clostridium perfringens incluye referencias a una o más de dichas células.

En un aspecto particular de la presente invención, se proporcionan mutantes sin reversión de C. perfringens que son

35 “sustancialmente no tóxicos”, es decir, organismos que expresan una toxina alfa inmunógena de poca o ninguna toxicidad volviéndolos por tanto adecuados para el uso como vacunas protectoras, Los organismos C. perfringens inventivos conllevan por tanto una toxicidad suficientemente reducida, con respecto a los organismos C. perfringens naturales, para volverlos tolerables como una vacuna o antígeno, cuando se emplean en condiciones eficaces para estimular una respuesta inmune contra la toxina alfa o contra C. perfringens, en un animal que se ha vacunado de esta manera. De esta manera, el C. perfringens inventivo, se ha “atenuado” con respecto al C. perfringens natural.

Se pretende también que la frase, “sustancialmente no tóxica” se aplique a las muteínas de la toxina alfa inmunógenas anteriormente señaladas que tienen una toxicidad suficientemente baja o no tienen toxicidad, haciéndolas también por tanto adecuadas para el uso en una vacuna protectora.

45 La reducción en la toxicidad se mide, por ejemplo, mediante una de las siguientes pruebas conocidas en la técnica: actividad hemolítica, actividad de la fosfolipasa C, actividad de la esfingomielinasa, actividad de la fosfodiesterasa, y actividad letal general en un grupo animal de prueba. Generalmente, no existe toxicidad residual detectable mediante dichas pruebas normalizadas. Sin embargo, la presencia de un nivel mínimo de una o más de estas actividades, por ejemplo, desde aproximadamente 10-4 a aproximadamente 10-2, con respecto a la toxicidad de un número equivalente de unidades infecciosas de la toxina alfa de C. perfringens natural a partir de la cual se ha derivado la muteína, puede demostrar ser aceptable en un escenario veterinario.

En una realización, la presente invención se practica empleando las cepas del biotipo A de C. perfringens, que son

55 de particular importancia como agentes etiológicos de diversos tipos de gangrena y enfermedades entéricas. En particular, la toxina alfa de C. perfringens es la diana para la eliminación-atenuación, debido a que la atenuación de esta toxina es suficiente para volver al C. perfringens suficientemente no letal, con respecto a las cepas naturales.

De forma amplia, el gen plc de C. perfringens expresa una muteína de la toxina alfa.

La muteína de la toxina alfa tiene una eliminación que incluye el resto His del bucle Zn2, junto con los restos que lo flanquean, con el fin de reducir mucho la posibilidad de cualquier mutación que revierta a la forma tóxica. Se ha encontrado ahora que la eliminación del resto His del bucle Zn2, por ejemplo, His68 de la SEC ID Nº: 3 junto con la eliminación de los restos adicionales que flanquean el resto His del bucle Zn2, proporciona una toxina alfa que 65 retiene suficiente inmunogenicidad para inducir inmunidad protectora en animales vacunados con el C. perfringens inventivo, siendo a la vez improbable que se experimente una mutación de reversión que codifique una toxina alfa

natural. Los restos adicionales que se pueden eliminar se eliminan en la dirección del extremo C y/o en la dirección del extremo N, con respecto a His68 y pueden variar en número de aproximadamente 4 a aproximadamente 60 restos en cualquiera de esas direcciones. De forma alternativa, His148 y los restos que la flanquean se pueden eliminar de forma similar.

5 Una muteína de la toxina alfa incluye además, además de la eliminación de His68 una eliminación de al menos 30 restos de aminoácidos de cualquier lado (en la dirección del extremo C o del extremo N) de la posición His68, con respecto a la SEC ID Nº: 3. Una muteína de la toxina alfa descrita incluye, además de la eliminación de His68, una eliminación de al menos 20 restos de aminoácidos de cualquier lado de His68 con respecto a la SEC ID Nº: 3. Una muteína de la toxina alfa descrita incluye, además de la eliminación de His68, una eliminación de al menos 5 restos de aminoácidos de cualquier lado de His68 con respecto a la SEC ID Nº: 3. La muteína de la toxina alfa inventiva incluye una eliminación desde aproximadamente el resto 62 a aproximadamente el resto 70, con respecto a la SEC ID Nº: 3. Opcionalmente, los restos de aminoácidos eliminados se sustituyen por uno o más de otros restos, tal como un único resto de leucina.

15 En otro aspecto más adicional, la muteína de la toxina alfa de C. perfringens se produce y aísla de C. perfringens, o a partir de un organismo recombinante alternativo, que se va a emplear como un reactivo de investigación, y/o en kits diagnósticos o de ensayos, por ejemplo, como una diana para anticuerpos dirigidos contra la toxina alfa. Otra utilidad más de la muteína de la toxina alfa de C. perfringens es en vacunas especializadas para animales, por ejemplo, seres humanos, que pueden no tolerar la vacunación con el organismo C. perfringens atenuado inventivo.

Además, se da a conocer un anticuerpo que se une específicamente a la toxina alfa natural con respecto a las muteínas de la toxina alfa de la presente invención

25 Se da a conocer además un anticuerpo que se une preferiblemente a una proteína de la toxina alfa de C. perfringens natural que presenta a la vez una unión mínima o no tiene unión con la muteína de la toxina alfa inventiva, por ejemplo, evitando la unión a una muteína de la toxina alfa que tiene una eliminación tal como se describe en detalle, más arriba. El anticuerpo proporcionado es por tanto útil para distinguir la eliminación de la muteína de la toxina alfa procedente de la toxina alfa natural, y por tanto, es también útil para distinguir animales vacunados con una vacuna de la presente invención de animales que han sido infectados por C. perfringens natural. Son conocidos en la técnica los procedimientos para estimular y cribar dichos anticuerpos selectivos. De forma similar, se pueden generar también, anticuerpos que reconocen la muteína de la toxina alfa inventiva de la presente invención, pero no la proteína natural. Los anticuerpos pueden ser policlonales, monoclonales (“mAb”) o fragmentos o fragmentos o derivados de dichos anticuerpos diseñados mediante ingeniería genética que retienen las propiedades selectivas de

35 la unión.

Se han descrito ampliamente las técnicas para preparar y cribar anticuerpos monoclonales [véanse, por ejemplo Stites. y col. (eds.) Basic and Clinical lmmunology (4ª ed.), Lange Medical Publications, Los Altos, California (1988); Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988); Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed.), Academic Press, Nueva York (1986); y Kohler y Milstein, Nature 256: 495-497 (1975).

Por ejemplo, y sin limitación, se estimula una respuesta inmune en los animales adecuados, tales como ratones o pollos, mediante vacunación con una proteína alfa de C. perfringens natural purificada, por ejemplo, en combinación con un adyuvante adecuado. Por ejemplo, con el fin de evitar la toxicidad de la proteína alfa natural, el inmunógeno

45 es un péptido que corresponde a los restos eliminados, y, si es necesario, la inmunogenicidad del péptido está potenciada por la combinación con un adyuvante adecuado mediante el acoplamiento con una proteína portadora adecuada. El acoplamiento a una proteína portadora es una técnica conocida, y se puede llevar a cabo, por ejemplo, proporcionando el péptido con una cisteína terminal, y acoplándolo a hemocianina de lapa californiana (KLH) o albúmina de suero bovino (BSA) utilizando tanto la química de acoplamiento de la maleimida como el enlazador (4[N maleimidometil] ciclohexano-1-carboxilato) de sulfosuccinimidilo (de Pierce). Se puede emplear también un enlazador de carbodiimida sin que se requiera una cisteína terminal.

Para la preparación de anticuerpos monoclonales, se pueden obtener linfocitos esplénicos procedentes de un animal inmunizado, se prepararon hibridomas a partir de dichos linfocitos, y se pueden obtener uno o más hibridomas

55 potencialmente adecuados que expresan la proteína anti-alfa. Se cribaron los hibridomas frente a la muteína y la proteína alfa natural, y se identificaron, se clonaron y se emplearon para producir anticuerpos monoclonales que se unían solo a la proteína alfa natural. Opcionalmente, se obtuvo ADNc a partir de la línea clonal del hibridoma identificado, y se pueden producir anticuerpos o fragmentos de anticuerpos en diferentes sistemas de expresión conocidos por la técnica.

Tal como se ha descrito anteriormente, una potencial desventaja de las vacunaciones en general es que los animales vacunados resultantes pueden generar falsos positivos cuando se prueban para la infección cuando se utilizan anticuerpos sensibilizados contra una cepa que se produce naturalmente, impidiendo, por tanto, la identificación de los animales infectados. Se da a conocer, por tanto, un kit de prueba para distinguir un sujeto

65 animal que se ha infectado por un organismo C. perfringens que se produce naturalmente procedente de un animal vacunado con una muteína de toxina alfa de la presente invención.

Uno de dichos kits de prueba incluye una cantidad de anticuerpos selectivos dirigidos contra la toxina alfa natural que presentan mínima o ninguna unión a una muteína de la toxina alfa de la presente invención. El kit puede incluir también otros reactivos adecuados, suficientes para llevar a cabo al menos una prueba diagnóstica. En una realización adicional, el anticuerpo se etiqueta o se marca con un resto marcador fácilmente detectable, por ejemplo,

5 cualquier marcador enzimático conocido en la técnica, por ejemplo, peroxidasa; etiqueta fluorescente, por ejemplo, fluoresceína; perlas, que incluyen perlas magnéticas; y similares. Opcionalmente, el kit puede incluir además un anticuerpo etiquetado que se une selectivamente al anticuerpo selectivo dirigido contra la toxina alfa natural. Se conocen bien en la técnica los inmunoensayos, e incluyen inmunoensayo de tipo sándwich, inmunoensayos competitivos, enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), radioinmunoensayos (RIA) y otros.

Se proporcionan también procedimientos para identificar y distinguir un animal que ha sido infectado por un organismo C. perfringens que se produce naturalmente, es decir, natural, de un animal vacunado con una vacuna que comprende el organismo C. perfringens atenuado de la presente invención, esto se lleva a cabo, por ejemplo, mediante las siguientes etapas:

(a)

poner en contacto una muestra de fluido procedente del animal con el anticuerpo selectivo dirigido contra la toxina alfa natural anteriormente descrito que presenta mínima o ninguna unión a una muteína de la toxina alfa de la presente invención, y

(b)

determinar si el anticuerpo reacciona con la muestra de fluido;

en las que cuando el anticuerpo reacciona con la muestra de fluido, el animal se identifica como uno que se ha infectado por un organismo C. perfringens que se produce naturalmente.

Producción de cepas de C. perfringens atenuadas

25 Un procedimiento para convertir aislados de C. perfringens en una cepa atenuada, o sustancialmente no tóxica, adecuada para administrarse como una vacuna se puede llevar a cabo como sigue. Se puede sustituir el gen (plc) de la toxina alfa en el cromosoma bacteriano por un gen que codifica solo una muteína de toxina alfa, sin dejar capacidad remanente para que el organismo C. perfringens produzca toxina alfa natural. De forma muy amplia, el procedimiento para producir el organismo de la vacuna incluye, pero no se limita a, las siguientes etapas generales, no necesariamente en el orden presentado.

(1) Identificar el tipo de animal que se va a proteger mediante la vacunación y uno o más aislados clínicos

obtenidos a fines de cribado. Esta etapa es normalmente opcional en el caso de la toxina alfa, debido a que es 35 probable que los aislados de una especie animal no proporcionen protección para otras especies animales.

(2)

Amplificar el gen plc procedente del aislado o aislados de C. perfringens, mediante la PCR u otra técnica de amplificación de ácidos nucleicos conocida en la técnica, con cebadores flanqueantes adecuados, y empleando la amplificación con cebadores adecuados para crear la mutación de eliminación deseada. Alternativamente, se puede sondear una biblioteca adecuada.

(3)

Crear un vector suicida que comprende el gen plc de la eliminación, en el que se ha eliminado el origen de la replicación de C. perfringens, y/o en el que no está sencillamente presente un origen de la replicación que puede replicarse en C. perfringens; y en cualquier caso, incluye marcadores seleccionables, por ejemplo, marcadores de antibióticos, adyacentes al gen plc mutado. A continuación se puede insertar dicho vector en organismos C. perfringens, por ejemplo, mediante electroporación, u otros procedimientos conocidos en la

45 técnica.

(4)

Seleccionar organismos C. perfringens en los que el gen plc de la muteína se ha integrado satisfactoriamente en el cromosoma bacteriano. Esto se lleva a cabo cultivando los organismos C. perfringens de la etapa (3) en presencia del agente de selección, por ejemplo, un(os) antibiótico(s) que corresponden a los marcadores seleccionables. Por ejemplo, los únicos organismos C. perfringens que podrían crecer con selección del antibiótico serían aquellos que a través de la recombinación homóloga tienen directamente integrado el vector suicida, con su(s) gen(es) de resistencia al(a los) antibiótico(s), en el cromosoma bacteriano. Estos organismos C. perfringens en crecimiento, podrían tener, por tanto, dos genes plc adyacentes, siendo uno natural, mientras que el otra tendría la mutación de la eliminación.

(5)

Seleccionar los organismos C. perfringens que han experimentado un episodio de recombinación adicional

55 que elimina los marcadores seleccionables, por ejemplo, los marcadores de antibióticos, junto con el gen plc natural. Esto se lleva a cabo cultivando los organismos de (4) en ausencia del agente de selección, por ejemplo, el antibiótico, y seleccionando los clones no hemolíticos en agar sangre.

Debido a que la inserción del ácido nucleico de la muteína se lleva a cabo mediante recombinación homóloga, la molécula de ácido nucleico que codifica la muteína de la toxina alfa se incorpora en una posición cromosómica que es homóloga a la localización de una molécula de ácido nucleico que codifica una toxina alfa natural que está presente en Clostridium perfringens no atenuados.

Con más detalle, se obtuvieron aislados de Clostridium perfringens en el campo procedentes de animales enfermos

65 o de otras fuentes. De forma inicial, el ADN genómico obtenido de los aislados en el campo de interés se insertó en un vector lanzadera de microorganismo duplicado adecuado, por ejemplo, un plásmido lanzadera con marcadores

seleccionables, por ejemplo, marcadores de antibióticos para evaluar su transformabilidad. De forma amplia, un vector lanzadera adecuado incluirá una, dos, tres o más de las siguientes características, un sitio de clonación, un origen de replicación de C. perfringens, un origen de replicación de E. coli, y un gen de resistencia a los antibióticos y/o un marcador seleccionable. Los vectores conocidos en la técnica adecuados para este fin, o fácilmente 5 adaptables para este fin incluyen, por ejemplo, el plásmido pHR106 lanzadera recombinante descrito por Roberts y col., [Appl Env Microbiol 54: 268-270 (1988»); los plásmidos pJIR 750 y pJIR 751 descritos por Bannam, y col., [Plasmid 29: 233-235 (1993»); el promotor menos el vector de selección del promotor pPSV de Matsushita, y col., 1994, Plasmid 31, 317-319; los plásmidos lanzadera pJIR1456 y pJIR1457, descritos por Lyras, y col., 1988, Plasmid 39, 160-164; y el vector lanzadera descrito por Kim y col., 1989, Appl Environ Microbiol 55, 360-365. La eliminación

10 del origen de replicación de C. perfringens convierte el vector lanzadera en un vector suicida.

Por ejemplo, un plásmido lanzadera es pJIR418, descrito por Sloan, y col., 1992, Plasmid 27, 207-219.

Los aislados que dan como resultado ≥ 104 transformantes por microorganismo de ADN plásmido, y que son

15 susceptibles al marcador del antibiótico, por ejemplo, cloranfenicol o eritromicina, son potenciales candidatos para la eliminación. A continuación se usa el ADN genómico de las cepas candidatas como molde para una PCR de intervalo largo del gen plc (toxina alfa) y las secuencias flanqueantes de las cepas candidatas. Por ejemplo, tal como se ejemplifica a continuación en el presente documento, se utilizó el cromosoma de la cepa 13 de C. perfringens para identificar los cebadores de la amplificación del gen que codificaba la toxina alfa. A continuación se usaron

20 estos cebadores para clonar el gen de la toxina alfa de otra cepa, que fue el aislado CP6 de aves.

Tras la subclonación de los productos de la PCR, el gen de la toxina alfa y las regiones flanqueantes se secuenciaron y se cartografió la restricción. Se sintetizaron nuevos cebadores de oligonucleótidos con los sitios de restricción flanqueantes y los productos de las dos amplificaciones separadas se clonaron en un plásmido suicida

25 adecuado (se ha eliminado el origen de la replicación de C. perfringens), por ejemplo, ejemplificado a partir de ahora en el presente documento como plásmido 1192-23.1 para crear la cepa de vacuna deseada con la eliminación.

El(los) vector(es) suicida(s) proporcionado(s) especifico(s) del(de los) aislado(s) se insertó(aron) en la cepa de C. perfringens del animal correspondiente, mediante cualquier procedimiento normalizado conocido en la técnica. Por 30 ejemplo, esto se lleva a cabo mediante electroporación. Cuando el vector suicida se insertó en C. perfringens (sin el origen de replicación de C. perfringens, es incapaz de replicarse en el citoplasma, y no sobrevive a no ser que se integre satisfactoriamente en el cromosoma bacteriano). Los integrantes satisfactorios son los únicos organismos que crecerán en presencia del antibiótico que corresponde al gen marcador antibiótico introducido de forma reciente.

35 Se puede emplear cualquier gen marcador seleccionable conocido en la técnica, aunque se emplean los marcadores de cloranfenicol y/o eritromicina en los vectores ejemplificados a partir de ahora en el presente documento.

Estos episodios recombinantes son el resultado de la homología del gen plc natural con el ADN plásmido del gen plc de la eliminación. La bacteria recombinante resultante se denomina integrante. El integrante contiene una copia del 40 vector de homología introducido que está integrado en el locus del gen plc. De esta manera, el integrante resultante incluye dos copias del gen plc, la copia normal original, y la versión eliminada introducida. Los genes de resistencia a antibióticos introducidos se localizan entre las dos copias del gen plc. Se pueden producir episodios de recombinación aleatoria raros entre las dos copias del gen plc. Este episodio de recombinación puede producir uno de dos resultados. En ambos casos, el ADN que interviene entre las dos copias del gen plc (que incluye los genes

45 de resistencia) ha sido eliminado. En el primer resultado, el gen plc normal o natural está restaurado, dando como resultado la recuperación de la cepa progenitora original sin los marcadores de antibióticos. En el segundo resultado, el gen plc natural está sustituido por la copia eliminada, produciendo la construcción eliminadora de la toxina la deseada, sin los marcadores de antibióticos.

50 Eliminar el antibiótico del medio de cultivo permite sobrevivir y replicarse a aquellas bacterias que han experimentado la recombinación, A continuación se identificaron los clones recombinantes de la eliminación mediante el crecimiento en agar sangre, sin la hemolisis normalmente presentada por C. perfringens que expresa la toxina alfa natural.

55 Animales que se van a vacunar

Los animales para los cuales se puede producir una vacuna de C. perfringens atenuada, y a partir de los cuales se puede aislar una cepa de C. perfringens natural, incluyen, de forma amplia, cualquier animal para el cual la infección por C. perfringens es un problema. Los vertebrados de interés incluyen aves, mamíferos, y peces, y particularmente

60 animales de importancia económica y/o agrícola. La siguiente lista de animales son aquellos que se contemplan para beneficiarse de una vacuna de C. perfringens y/o a partir de los cuales se pueden obtener aislados de C. perfringens natural. Aunque es algunas veces posible que cualquiera de dichas vacunas comprenda un componente (vivo o no vivo) que se haya aislado originalmente del mismo género o especie de animal que se va a vacunar, esto no es necesario.

65 Una lista no limitante de dichos animales incluye aquellos que pertenecen a familias de aves, bovinos, ovinos, etc, así como animales acuáticos, por ejemplo, que pueden emplearse en acuicultura y/o recogerse de la naturaleza y mantenerse vivos en tanques de almacenamiento temporales durante un tiempo antes de la comercialización. Estos incluyen peces tales como trucha o salmón, y otras especies criadas o recolectadas por el beneficio económico. Los

5 animales acuáticos no vertebrados incluyen langostas, cangrejos, moluscos, por ejemplo, calamares, pulpos, almejas, ostras, mejillones, vieiras, y similares. Debe entenderse que las aves incluyen, por ejemplo, pollos, pavos, gansos, patos, etc. Debe entenderse que los bovinos incluyen, por ejemplo, ganado, ganado vacuno, terneras, etc. Debe entenderse que los ovinos incluyen, por ejemplo, corderos, etc.

10 Para los fines de la presente invención, el término “pez” debe entenderse que incluye sin limitación, el grupo de peces Teleosti, es decir, los teleósteos: El orden de los Salmoniformes (que incluye la familia Salmonidae) y el orden de los Perciformes (que incluye la familia Centrarchidae) están contenidos en el grupo de los Teleosti.

Los ejemplos de peces receptores potenciales incluyen la familia Salmonidae, la familia Serranidae, la familia

15 Sparidae, la familia Cichlidae, la familia Centrarchidae, el Roncador de Tres líneas (Parapristipoma trilineatum), y el Pleco de Ojos Azules (Plecostomus spp).

Familia Salmonidae NOMBRE TAXONÓMICO

NOMBRE COMÚN

Coregonus clupeaformis

Arenque de lago

Coregonus hoyi

Arenque

Oncorhynchus keta

Salmón del Pacífico (Salmón keta)

Oncorhynchus gorbuscha

Salmón rosado

Oncorhynchus kisutch

Salmón Coho (Salmón plateado)

Oncorhynchus masou

Salmón japonés (Salmón masu)

Oncorhynchus nerka

Salmón rojo

Oncorhynchus tshawytscha

(Salmon real, boquinegra o chinook)

Prosopium cylindraceum

Arenque del Atlántico

Oncorhynchus clarki

Trucha de agua dulce

Oncorhynchus mykiss

Trucha arcoiris

Salmo salar

Salmón del Atlántico

Salmo trutta

Trucha común

Salmo trutta X S. fontinalis

Trucha tigre híbrida

Salvelinus alpinus

Trucha alpina

Salvelinus confluentus

Trucha toro

Salvelinus fontinalis

Trucha de arroyo

Salvelinus leucomaenis

Trucha japonesa (trucha de montaña)

Salvelinus malma

Salvelino (trucha de Miyabe)

Salvelinus namaycush

Trucha de lago

Thymallus thymallus

Tímalo

Algunos miembros de la Familia Serrranidae NOMBRE TAXONÓMICO NOMBRE COMÚN

Centropristis ocyurus

Lubina de mar

Centropristis philadelphicus

Lubina de roca

Centropristis striata

Lubina de mar negra

Diplectrum bivittatum

Perca enana de arena

Diplectrum formosum

Perca de arena

Epinephelus flavolimbatus

Mero amarillo

Epinephelus morio

Mero rojo

Serranus phoebe

Charlatán

Serranus tortugarum

Lubina gris

Algunos miembros de la familia Sparidae

NOMBRE TAXONÓMICO

NOMBRE COMÚN

Archosaraus probatocephalus

Sargo

Archosaraus rhomboidalis

Besugo

Calamus penna

Pargo legítimo

Laqodon rhomboides

Sargo salema

Pagrus Major

Besugo rojo

12

NOMBRE TAXONÓMICO NOMBRE COMÚN

Sparus aurata Dorada Stenotomus chrysops Pez ratón Algunos miembros de la familia Cichlidae Aequidens latifrons Ácara azul Cichlisoma nigrofasciatum Cíclido del Congo Crenichichla sp. Cíclido lucio alargado Pterophyllum scalare Pez ángel Tilapia mossambica Tilapia de Mozambique Oreochromis spp Tilapia Sarotherodon aurea Tilapia dorada Algunos miembros de la familia Centrarchidae

NOMBRE TAXONÓMICO NOMBRE COMÚN

Ambloplites rupestris Perca de roca Centrarchus macropterus Pez volador Elassoma evergladei Perca sol pigmea de las Everglades Elassoma okefenokee Perca sol pigmea de Okefenokee Elassoma zonatum Perca sol pigmea de bandas Enneacanthus gloriosus Perca sol de puntos azules Enneacanthus obesus Perca sol de bandas Lepomis auritus Perca sol arlequín Lepomis cyanellus Perca sol verde Lepomis cyanellus X L. qibbosus Perca sol x verde Lepomis gibbosus Perca sol Lepomis gulosus Mojarrón Lepomis humilis Mojarra Lepomis macrochirus Mojarra azul (Mojarra de agallas azules) Lepomis megalotis Mojarra gigante Micropterus coosae Lubina de ojo rojo Micropterus dolomieui Lubina negra de boca pequeña Micropterus punctulatus Lubina moteada Micropterus salmoides Lubina de Florida Pomoxis annularis Perca blanca Pomoxis nigromaculatus Perca plateada

En una realización adicional el animal es un animal de compañía o un ser humano. Para los fines de la presente invención, el término animal de “compañía” debe entenderse que incluye todos los animales –caballos (equinos), gatos (felinos), perros (caninos), y roedores, incluyendo ratones, ratas, cobayas, especies de conejos, y aves, tales

5 como pichones, loros, y similares.

Los pájaros que reciben dicha vacunación pueden asociarse tanto con avicultura comercial como no comercial. Estos incluyen, por ejemplo, Anatidae, tales como cisnes, gansos, y patos, Columbidae, por ejemplo, palomas y pichones, tales como pichones domésticos, Phasianidae, por ejemplo, perdices, urogallos y pavos, Thesienidae, por

10 ejemplo, pollos domésticos, Psittacidae, por ejemplo, periquitos, guacamayos, y loros, criados, por ejemplo, para las mascotas o el mercado del coleccionismo. Se ejemplifican los pollos a continuación en el presente documento.

Fuentes de aislados naturales

15 Generalmente, los organismos C. perfringens atenuados de la presente invención pueden producirse comenzando con un C. perfringens que ha sido aislado originalmente a partir de cualquier animal infectado de interés, tal como se ha descrito más arriba y/o a partir del entorno. El entorno incluye cualquier material que contiene organismos C. perfringens viables y/o esporas de C. perfringens incluyendo, por ejemplo, alimento contaminado, suelo, agua, material de las camas animales, heces, y similares.

20 Justin y col., [Biochemistry 41, 6253-6262 (2002)] han caracterizado toxinas alfa de diferentes cepas de C. perfringens que son casi idénticas en secuencia y en las propiedades bioquímicas. Sin embargo, Justin y col., describen también una cepa se aisló de una fuente aviar (un cisne) que tenía una toxina alfa que presentaba un grado grande de variación de la secuencia y una especificidad por el sustrato alterada en comparación con otras

25 cepas. Por este motivo, se cree que la mayor parte de aislados, cuando se conviertan en una forma atenuada, estimularán una inmunidad protectora frente a la toxina alfa de otras muchas cepas de C. perfringens que se producen naturalmente. Sin embargo, dada la posibilidad de variación de la toxina alfa entre aislados, será ventajoso a menudo aislar y atenuar organismos C. perfringens procedentes de especies animales para las cuales se desea una vacuna dirigida contra C. perfringens. El aislado ejemplificado a continuación en el presente documento se aisló

5 de pollo, y se probó en dicha especie.

Vacunas

Los organismos C. perfringens atenuados de la presente invención se formulan generalmente en composiciones de vacuna farmacéuticamente aceptables. Las composiciones de vacuna se formulan de acuerdo con la ruta de administración y son compatibles con el agente antigénico activo. El agente antigénico activo es, por ejemplo, una o más cepas de organismos C. perfringens de tipo A atenuados de acuerdo con la presente invención. Opcionalmente, la composición de vacuna puede incluir también uno o más tipos de proteína alfa no tóxica, en combinación con los organismos C. perfringens de tipo A atenuados.

15 Por ejemplo, sustancialmente todos los organismos C. perfringens de tipo A atenuados incluidos en la composición de vacuna están vivos y son viables, aunque para determinadas situaciones específicas, por ejemplo, para inmunizar determinados seres humanos o animales inmunocomprometidos, la vacuna comprenderá exclusivamente organismos C. perfringens de tipo A atenuados muertos.

La composición de vacuna incluye tampones y/o sales fisiológicamente compatibles, en combinación opcional con adyuvantes y/o inmunopotenciadores o inmunoestimuladores opcionales (administrados simultáneamente o administrados en serie, por ejemplo, antes o después de la vacunación).

25 Los inmunoestimuladores adecuados incluyen, pero no se limitan a, citoquinas, factores de crecimiento, quimioquinas, sobrenadantes procedentes de cultivos celulares de linfocitos, monocitos, células de órganos linfáticos, preparaciones celulares o extractos celulares (por ejemplo, preparaciones de Staphylococcus aureus o lipopolisacáridos), mitógenos, o adyuvantes que incluyen compuestos farmacéuticos de bajo peso molecular. Se puede administrar un inmunoestimulador in ovo en cualquier momento durante la incubación. En un aspecto concreto, el inmunoestimulador se administra en el medio que contiene los organismos C. perfringens de tipo A atenuados.

Procedimientos de administración de vacunas

35 Las vacunas anteriormente descritas se administran, por ejemplo, mediante inyección o inoculación por una o una combinación de las siguientes rutas: administración oral, intranasal, parenteral, subcutánea, escarificación, y/o intramuscular en cualquier formulación adecuada conocida en la técnica, por ejemplo, un tampón compatible y/o una solución salina fisiológicamente aceptable, en combinación opcional con adyuvantes y/o inmunopotenciadores o inmunoestimuladores (administrados simultáneamente o administrados en serie, por ejemplo, antes o después de la vacunación). Para vacunas/procedimientos de vacunación administrados por vía oral, se emplean fácilmente cualquiera de los tampones o agentes suspensores fisiológicamente adecuados que se conocen en la técnica. Además, la composición se puede incorporar, por ejemplo, premezclarse en agua de grifo o pulverizarse sobre concentrados de alimento, espolvorearse o pulverizarse sobre granos de maíz u otros, y similares.

45 El tracto gastrointestinal es un sitio común de infección por C. perfringens, y por tanto, se contempla la administración oral como un procedimiento de inoculación. Se contempla la presencia en el tracto gastrointestinal de organismos C perfringens atenuados vivos de la presente invención para estimular reacciones inmunoprotectoras localizadas en la capa de la mucosa del tracto gastrointestinal, y puede también actuar de forma competitiva para evitar la posterior colonización por C. perfringens natural.

Para aves, tales como aves de corral domésticas, que incluyen pollos, patos, gansos, etc, el procedimiento oral, o la inyección in ovo están entre las rutas útiles para la vacunación. Se ejemplifica a continuación en el presente documento la ruta in ovo, y se produjo una inmunización y protección activas procedentes del estímulo en pollitos empollados

Expresión génica extraña en C. perfringens

Utilizando las técnicas desarrolladas en los ejemplos anteriores, cualquier gen que no se produce naturalmente, es decir, extraño a C. perfringens, se puede insertar opcionalmente en el ADN cromosómico de C. perfringens. Para la expresión de proteínas extrañas, se pueden llevar a cabo fusiones génicas que preservan las secuencias que flanquean el gen de la toxina alfa, el promotor de la toxina alfa y su secuencia señal. En una realización, la mayor parte de la secuencia de codificación del gen plc está sustituida con el gen extraño. Los nucleótidos restantes del gen plc en la dirección 3’ del gen insertado están fuera del marco, y por tanto no se produce toxina alfa funcional. De forma alternativa, se puede insertar el gen extraño en marco con la secuencia de nucleótidos que codifica la toxina

65 alfa formando una proteína de fusión de la toxina alfa – proteína extraña.

Se pueden sintetizar cebadores de oligonucleótidos del gen extraño, por ejemplo, con una secuencia de la etiqueta FLAG del extremo N en los sitios de restricción adecuados. Se pueden clonar los productos de la PCR en el vector suicida; la etiqueta FLAG y el gen extraño se insertan en marco con la secuencia señal de la toxina alfa. La proteína extraña se expresa bajo el control del promotor de la toxina alfa y se dirige para la secreción por la secuencia señal

5 de plc. La proteína extraña secretada se puede detectar en los medios sobrenadantes mediante transferencia Western utilizando una etiqueta anti-FLAG.

Se puede insertar cualquier gen extraño adecuado en el genoma de C. perfringens de esta manera. Esto incluye, por ejemplo, el ADN que codifica antígenos de patógenos del tracto gastrointestinal, incluyendo, por ejemplo, proteínas antigénicas de bacterias tales como E. coli, especies de salmonella, especies de campylobacter, especies de lawsonia, y similares; proteínas antigénicas de parásitos tales como especies de eimeria, especies de isospora, especies de cryptosporidium y similares; y proteínas antigénicas de virus tales como rotavirus, coronavirus, y similares, con el fin de inmunizar el animal tratado con dicho C. perfringens recombinante. Otras proteínas que se pueden expresar por dicho C. perfringens recombinante incluyen proteínas o péptidos terapéuticos. Opcionalmente,

15 estas incluyen péptidos que son endógenos para el tracto gastrointestinal, incluyendo el factor trébol, o cualquier tipo de citoquina conocido en la técnica, por ejemplo IL-18 de pollo, y similares.

Una de dichas construcciones de C. perfringens expresa la proteína IL-18 de pollo. La administración de bacterias vivas que contienen la fusión génica permite administrar dosis terapéuticas de IL-18 en el intestino además de ser relativamente inocuas en el animal hospedador en virtud de la ausencia de producción de toxina alfa. Se pueden expresar también otros agentes terapéuticos utilizando este sistema. Se incluyen los siguientes ejemplos específicos a fines de ilustración, y no se pretende que limiten el alcance de la invención, a no ser que se indique otra cosa.

EJEMPLO 1 VECTOR DE HOMOLOGÍA ELIMINADOR DE LA TOXINA ALFA DE C. PERFRINGENS

Se creó un vector 1162-55-20 plásmido de homología útil en la construcción de los de los eliminadores de la toxina alfa de C. perfringens. El plásmido incorpora varios elementos importantes; la región de replicación procedente del plásmido pUC18 de E. coli, los genes de resistencia al cloranfenicol (catP) y la eritromicina (ermBP) de C. perfringens (ambos de los cuales se expresan también en E. coli) y el gen (plc) de la toxina alfa de C. perfringens inactivado mediante una eliminación específica de 9 aminoácidos. El plásmido 1162-55-20 se creó en varias etapas, como sigue.

35 En primer lugar, se clonó el gen plc a partir de un aislado de ave reciente de C. perfringens (cepa CP6). Se usó la secuencia de la cepa 13 de C. perfringens (Genbank NC 003366; SEC ID Nº: 2) para diseñar los cebadores de oligonucleótidos que se van a usar en la clonación del gen plc. Estos y todos los cebadores posteriores se obtuvieron comercialmente de Sigma Genosys, Woodlands, TX. El cebador en la dirección 5’ localizado en el gen ypic (CPE0035), 5' AGCTGCATAAGCAAAAGTTCCAACTC 3' (SEC ID Nº: 14) corresponde a los nucleótidos 4767547700 de la cepa 13 (SEC ID Nº: 2). El cebador en la dirección 3’ localizado en el gen cobW (CPE0037). 5' GCAGAAACTCTTCTTAGACCTATTCTTTTAGGC 3' (SEC ID Nº: 15), es complementario a los nucleótidos 5059750629 de la cepa 13. Estos cebadores se utilizaron junto con el ADN genómico de la cepa CP6 de C. perfringens en una reacción en cadena de la polimerasa de intervalo largo (PCR). Se realizó una predicción de un producto de 2955 pares de bases procedentes del gen ypic en la dirección 5’ al gen cobW en la dirección 3’ a partir de la secuencia

45 conocida de la cepa 13 (tal como se ilustra por la FIG. 1). El promotor de la toxina alfa, la secuencia señal y la secuencia de codificación del gen plc (CPE0036) están contenidos en este fragmento, es decir, entre el gen ypic y el gen cobW en la dirección 3’. El fragmento de la PCR de 2955 pares de bases se clonó a continuación en el vector de clonación pCR-Blunt (Invitrogen Corporation, Carslbad, CA) dando como resultado el plásmido 1162-52.1. La secuencia de nucleótidos de la región de codificación plc del fragmento de 2955 pares de bases de la cepa CP 6, se determinó a partir de este fragmento (SEC ID Nº: 22; y el polipéptido correspondiente es la SEC ID Nº: 23) y se mostró que era sustancialmente homólogo que el del gen plc de la cepa 13 de C. perfringens (SEC ID Nº: 2).

A continuación, la región de replicación de E. coli y los genes de resistencia de C. perfringens se clonaron a partir del plásmido lanzadera pJIR418 (Sloan, y col, 1992, Plasmid 27, 207-219; Genebank M77169). El plásmido pJIR418

55 se digirió con las enzimas de restricción Bam HI y Spe I y los extremos se rellenaron con la polimerasa Klenow. La ligadura del fragmento grande produjo el plásmido 1162-45.1 y restauró el sitio de restricción Bam HI. Este plásmido retiene la región de replicación de E. coli, pero, a diferencia de pJIR418, no contienen un origen de replicación de C. perfringens. El plásmido es por tanto capaz de replicación autónoma en E. coli, pero no en C. perfringens.

En la siguiente etapa, la mitad del extremo C del gen plc se subclonó en el plásmido intermedio 1162-45.1. La digestión del plásmido 1162-52.1 con Bam HI y Eco RI liberó un fragmento de 1742 pares de bases que contenían la porción C terminal del gen de la toxina alfa procedente del único sitio Bam HI localizado en el gen plc en la dirección 3’ hacia el gen cobW en un sitio Eco RI localizado en el sitio de clonación múltiple del plásmido 1162-45.1. En el plásmido 1162-53.7 resultante, la mitad C terminal del gen plc está en la misma orientación transcripcional que los

65 genes catP y ermBP del plásmido parental.

En la etapa final, la mitad del extremo N del gen plc se clonó en un único sitio Bam HI del plásmido 1162-53.7. Esto se llevó a cabo creando un fragmento de la PCR derivado del gen de la toxina alfa subclonado en el plásmido 1162

52.1. El cebador en la dirección 5’, 5' ggatccAGCTGCATAAGCAAMGTTCCMCTC 3' (SEC ID Nº: 16) era idéntico al cebador de ypic anteriormente señalado (SEC ID Nº: 4) excepto en que se incluyó un sitio Bam HI flanqueante. El 5 cebador en la dirección 3’ localizado en el gen de la toxina alfa, 5' ggatccaATGCATTCTTATCATMTCTGGATMGTAGMCC 3' (SEC ID Nº: 17) era complementario a los nucleótidos 48824-48857 de la cepa 13 e incluía un sitio de restricción Bam HI flanqueante y un nucleótido separador para mantener el marco de lectura (minúsculo). El fragmento Bam HI resultante de la PCR con estos cebadores y el molde de ADN del plásmido 1162-52-1 se clonó en un sitio Bam HI único del plásmido 1162-53.7. Se aisló un

10 plásmido que contenía las regiones de los dos genes plc en la misma orientación transcripcional. Este plásmido 1162-55.20 contiene el gen plc con la eliminación de los nueve aminoácidos deseados y la adición de un resto de Leu entre el resto ala 61 y el resto asp 71 de la toxina natural (véase la FIG. 2). La secuenciación del ADN del plásmido confirmó el marco de lectura y la eliminación neta de 24 codones (que codifican ocho restos de aminoácidos).

EJEMPLO 2

CONSTRUCCIÓN DE CPERF001 RECOMBINANTE DE CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

20 La versión eliminada del gen plc construido en el Ejemplo 1 se introdujo en C. perfringens utilizando la siguiente estrategia. El vector de homología 1162-55.20 se denomina “plásmido suicida” de C. perfringens debido a que se ha eliminado su origen de replicación de C. perfringens.

Cuando este plásmido se transforma en C. perfringens, es incapaz de replicarse y no sobrevive. Sin embargo si la

25 bacteria transformada se coloca bajo selección con cloranfenicol y/o eritromicina, se puede forzar que el ADN plásmido se recombine en el genoma bacteriano mediante homología con el gen plc. La bacteria recombinante resultante se denomina un integrante. El integrante contenía una copia del vector de homología introducido que se integró en el locus del gen plc. De esta manera, el integrante resultante contenía dos copias del gen plc, la copia formal original, y la versión eliminada introducida. Los genes de resistencia introducidos se localizaron entre las dos

30 copias del gen plc. Cuando se eliminó la selección por antibiótico del integrante, se produjo la recombinación entre las dos copias del gen plc. Este episodio de recombinación puede producir uno de dos resultados. En ambos casos, se ha eliminado el ADN que interviene entre las dos copias del gen plc (incluyendo los genes de resistencia). En el primer resultado, se restauró el gen plc normal, dando como resultado una recuperación de la cepa progenitora original. En el segundo resultado, el gen plc normal esta sustituido por la copia eliminada, produciendo la

35 construcción eliminadora de la toxina alfa deseada. Debido a que la toxina alfa de la cepa eliminadora está inactivada, esta cepa no era hemolítica. Por tanto se identificó el integrante eliminador deseado cribando los clones no hemolíticos en placas de agar sangre.

Debido a que se esperaba que el episodio de recombinación que da como resultado el integrante deseado se

40 produjera a una frecuencia baja, un aspecto crítico fue el empleo de cepas de C. perfringens progenitoras que tenían una elevada eficacia de transformación. De este modo, se analizaron algunos aislados recientes de C. perfringens de aves para establecer la eficacia de la transformación. Se transformaron los aislados con el plásmido lanzadera pJIR418 tal como describen Allen y Blaschek (Applied and Environmental Microbiology 54. 2322 (1988)) con ligeras modificaciones (descritas a continuación). La cepa 1240 presentó la eficacia de transformación más elevada (véase

45 la Tabla 1), 9,2 x 106 transformaciones/μg de pJIR418 de ADN plásmido. Se seleccionó esta cepa para que fuera la cepa progenitora de la construcción de la CPERF001 eliminadora. Se seleccionó la cepa 29 para que fuera la cepa progenitora de CPERF002.

Tabla 1

50 Eficacia de transformación de aislados de C. perfringens de aves

Cepa A de C. perf. A Transformantes/μg de pJIR418 29 3,6 x 104 23 5,6 x 102

1220 4,0 x 108 1240 9,2x106 CP-2 Ninguno 1230 7,1 x 103 5227 Ninguno 5230 Ninguno

La fuente de las cepas anteriormente relacionados fue el Dr J. Glenn Songer Dept. of Veterinary Sciences and Microbiology, University of Arizona, Tucson, Arizona 85721

Se diluyeron células de la cepa 1240 de C. perfringens procedentes de un cultivo anaerobio durante la noche en medio TSYC (30 g/l de caldo tríptico de soja, 5 g/l de extracto de levadura, 0,5 g/l de cisteína) 1:25 y se hicieron

55 crecer hasta A600 = 0,5436. Después de la centrifugación de 100 ml de células a 18.000 x g durante 10 minutos, se prepararon células electrocompetentes volviendo a suspender dos veces las células en un volumen igual de tampón de fosfato de sacarosa magnesio reducido (“SMP” se preparó como sacarosa 270 mM, MgCl2 1 mM, NaPO4 7 mM, pH 7,3) seguido por una resuspensión con 0,5 ml de SMP. Esto dio como resultado un volumen final de ~ 2,0 ml.

5 Se sometieron a electroporación alícuotas de 100 μl de células con 4 μg del plásmido 1162-55. 20 en cubetas de 0,2 cm. Se utilizó un Bio-Rad Gen Pulser II a 1,37 kilovoltios, 100 ohmios de resistencia y 50 microfaradios de capacitancia. Inmediatamente después de la electroporación, se diluyeron las células con 2,0 ml de medio tríptico de soja levadura cisteína prerreducido (“TSYC” se preparó como 30 g de caldo tríptico de soja, 5 g de extracto de levadura, 0,5 g de cisteína, 950 ml de agua) y se incubó durante tres horas a 37º C en una jarra anaerobia. Tras el periodo de recuperación, se plaquearon las diluciones de las células on TSYC + 25 μg/ml de placas de cloranfenicol. Se incubaron estas placas a 37º C durante la noche en una jarra anaerobia.

Tras el crecimiento durante la noche, se observó un promedio de 50 colonias resistentes al cloranfenicol por microgramo de ADN de 1162-55.20. Las colonias individuales de siete presuntos integrantes se hicieron crecer en

15 medio TSYC no selectivo durante cuatro rondas sucesivas de crecimiento y se plaquearon en placas de agar sangre no selectivo. Una de las reservas no seleccionadas, 1192-31.7, presentó algunas colonias no hemolíticas. Veintiuna de estas colonias no hemolíticas se dividieron en placas maestras no selectivas y las réplicas se plaquearon en placas de TSYC + cloranfenicol. Dos de las colonias fueron sensibles al cloranfenicol.

Uno de los presuntos eliminadores sensibles al cloranfenicol, 1192-32.14 se hizo crecer junto con la cepa 1240 natural y el integrante 1192-31.7 y se plaqueó en placas de agar sangre. La cepa 1240 natural mostró zonas transparentes de beta hemolisis mientras que el eliminador 1192-32.14 fue un cultivo puro de colonias no hemolíticas y se renombró CPERF001.

25 Se utilizaron otras placas de agar sangre como maestras y se plaquearon las réplicas en medio no selectivo y selectivo. La cepa 1240 natural y CPERF001 fueron sensibles al cloranfenicol y a la eritromicina. El integrante, 119231.7, fue resistente al cloranfenicol y a la eritromicina tal como se esperaba.

Para descartar la posibilidad de que genes resistentes a antibióticos estuvieran presentes, pero no se expresaran en CPERF001, se sintetizaron cebadores específicos de la PCR para los genes del cloranfenicol y la eritromicina a usar en reacciones de la PCR. Se prepararon los ADN genómicos a partir de la cepa natural, el integrante y las cepas CPERF001 y se usaron como moldes para las reacciones de la PCR con los cebadores del gen resistente al antibiótico. Los resultados del análisis de la PCR mostraron respuestas positivas procedentes solo del plásmido suicida y el integrante y no de la cepa 1240 progenitora o de la CPERF001 eliminadora. Esto confirma la pérdida

35 prevista de las secuencias del gen de la resistencia.

Para confirmar la eliminación en el gen de la toxina alfa, se amplificó mediante la PCR una región de 1086 pb de la región que rodeaba la eliminación utilizando los cebadores adecuados específicos de la toxina alfa. El fragmento amplificado se clonó y se secuenció. Los resultados de la secuenciación confirmaron la eliminación de los nueve aminoácidos desde tyr 62 a trp 70 del gen de la toxina alfa y la inserción de una única Leu (véanse las FIG. 2A-2C).

Se evaluó CPERF001 para determinar la expresión de la proteína inactivada del toxoide alfa. Después de 6 horas de crecimiento anaerobio, se recogieron alícuotas de 1 ml de células y se centrifugaron. Se analizaron quince microlitros de medio sobrenadante no concentrado mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y se sometieron

45 al análisis de transferencia Western con un anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra la proteína de la toxina alfa recombinante (Vaccine 11(12): 1253-1258 (1993)). Los resultados mostraron reactividad específica del anticuerpo con una proteína del tamaño esperado de la proteína del toxoide alfa.

CPERF001 es una cepa de Clostridium perfringens de Tipo A eliminadora diseñada mediante ingeniería genética. Esta cepa sepa secreta una forma de toxoide inactivado de la toxina alfa de C. perfringens. Debido a que esta cepa ya no expresa la toxina alfa activa pero retiene aún una porción significativa de la antigenicidad de la toxina, será útil como vacuna para proteger contra la enfermedad producida por C. perfringens.

EJEMPLO 3

Construcción de CPERF002 recombinante de Clostridium perfringens

Con el fin de compensar la baja eficacia de transformación de la cepa 29 de C. perfringens (véase la Tabla 1, más arriba) se construyó un nuevo vector de homología. El nuevo vector incorporaba secuencias de C. perfringens clonadas directamente a partir del genoma de la cepa 29. Se realizó una predicción de que el resultado daría una etapa de recombinación más eficaz. El nuevo vector fue 1192-38.3, creado como sigue.

En la primera etapa, la región de replicación de E. coli y los genes de resistencia de C. perfringens se clonaron a partir del plásmido lanzadera pJIR418 (Sloan y col, Plasmid 27, 207 (1992); Genebank M77169). El plásmido 65 pJIR418 se digirió con el enzima de restricción NdeI. La ligadura del fragmento grande produjo el plásmido 1192

23.1. Este plásmido carece de un origen de replicación de C. perfringens, pero a diferencia del plásmido 1162-45.1,

que se construyó en el Ejemplo 1, retiene el sitio de clonación múltiple completo de pJIR418.

En la siguiente etapa, la mitad del extremo C del gen plc se subclonó en el plásmido intermedio 1192-23.1. Se usó el ADN genómico de la cepa 29 como molde para una PCR de intervalo largo. Se amplificó la región del gen plc (toxina 5 alfa) del sitio Bam HI mediante una porción del gen CPE0038. El cebador plc en la dirección 5’, 5' CTGGGATCCTGATACAGATAATAATTTCTCAAAGGAT 3' (SEC ID Nº: 18) corresponde a los nucleótidos 4888048916 de la cepa 13 (Genbank NC 003366). El cebador en la dirección 3’ en el gen CPE0038, 5' actctgcagTTGTCATATCAATTAAATTAACTATAATCCC 3' (SEC ID Nº: 19) es complementario con los nucleótidos 51244-51275 de la cepa 13 y contiene nucleótidos flanqueantes que incluyen un sitio de restricción Pst I (minúsculo). 10 Se obtuvo un producto de 2402 pares de bases que se digirió con las enzimas de restricción Bam HI y Pst I. Este fragmento se ligó con el fragmento grande de Bam HI y Pst I digirió 1192-23.1 para producir el plásmido 1192-36.10.

En la etapa final, la mitad del extremo N del gen plc se clonó mediante la PCR. El cebador en la dirección 5’, 5' actgagctcCTAGACACTTTGCTTCAATATTTGGGAA 3' (SEC ID Nº: 20) corresponde a los nucleótidos 46513-46540 15 de la cepa 13 e incluye los nucleótidos flanqueantes y un sitio Sac I (minúsculo). El cebador en la dirección 3’, 5' actggatccGCATTCTTATCATAATCTGGATAAGTAGAACC 3' (SEC ID Nº: 21) es complementario con los nucleótidos 48824-48855 de la cepa 13 e incluye nucleótidos flanqueantes y un sitio Bam HI. Se produjo un producto de 2363 pares de bases que se digirió con los enzimas de restricción Sac I y Bam HI. El fragmento digerido se ligó con el fragmento grande de Sac I y Bam HI digirió 1192-36.10 para producir el plásmido 1192-38.3. La posterior

20 secuenciación de la región flanqueante del sitio Bam HI de plc en 1192-36 confirmó la eliminación de nueve aminoácido desde tyr 62 a trp 70.

Se usó el plásmido 1192-38.3 para electroporar células de la cepa 29 de C. perfringens. Se había demostrado anteriormente que la cepa 29 se transformaba con una eficacia de 3,6 x 104 transformantes/μg de ADN del plásmido 25 pJIR418. Se hicieron crecer células de la cepa 29 y se sometieron a electroporación como en el Ejemplo 2 con la excepción de que se usó una técnica de selección en medio líquido después de las tres horas del periodo de recuperación. En vez de plaquear, se diluyeron alícuotas de 0,67 ml en 12 ml de TSYC + 25 μg/ml de cloranfenicol y se hicieron crecer durante la noche a 37º C en una jarra anaerobia. Se utilizó esta modificación debido a las bajas eficacias de transformación y plaqueo de la cepa 29 frente a la cepa 1240. Tras el crecimiento durante la noche, se 30 diluyeron las células de nuevo en medio de selección. A continuación se pasaron las células de la segunda ronda de crecimiento cinco veces sin selección antes de plaquear en placas de agar sangre. Ninguna de las colonias procedentes de placas de agar sangre fueron no hemolíticas. A continuación se plaquearon por replicado dos placas de agar sangre en TSYC, placas de TSYC + 25 μg/ml de cloranfenicol y TSYC + 50 μg de eritromicina. Todas las colonias fueron sensibles a la eritromicina pero solo una de las 130 colonias fue sensible al cloranfenicol. Esta 35 colonia, 1192-45.4B, se renombró CPERF002. El análisis de la PCR del ADN genómico de CPERF002 con cebadores específicos de la toxina alfa mostró una banda positiva para la toxina alfa. Esta banda fue más pequeña que la banda correspondiente de ADN de la cepa 29 natural. Los cebadores específicos para los genes de resistencia al cloranfenicol y la eritromicina fracasaron en amplificar el ADN de CPERF002 pero mostraron fuertes bandas positivas procedentes del plásmido 1192-38.3. La secuenciación de la toxina alfa de CPERF002 confirmó la

40 eliminación de los nueve aminoácidos (véase la FIG. 3).

Se evaluó CPERF002 para determinar la expresión de la proteína del toxoide alfa inactivada. Después de 6 horas de crecimiento anaerobio, se recogieron alícuotas de 1 ml de células y se centrifugaron. Se analizaron quince microlitros de medio sobrenadante no concentrado mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y se sometieron

45 al análisis por transferencia Western con un anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra la proteína de la toxina alfa recombinante (Vaccine 11: 1253 (1993)). Los resultados mostraron reactividad específica contra el anticuerpo con una proteína del tamaño esperado de la proteína del toxoide alfa.

CPERF002 es una cepa eliminadora de C. perfringens de Tipo A diseñada mediante ingeniería genética. Esta cepa

50 secreta una forma toxoide inactivada de la toxina alfa de c. perfringens. Debido a que esta cepa ya no expresa la toxina alfa activa, y retiene además una porción significativa de la antigenicidad de la toxina, será útil como vacuna para proteger contra la enfermedad producida por C. perfringens

EJEMPLO 4

Vacunas eliminadoras de C. perfringens

Las cepas de vacuna eliminadora CPERF001 y CPERF002 descritas en los ejemplo 2 y 3 se evaluaron con respecto a su capacidad de proporcionar protección contra el estímulo de C perfringens de tipo natural. La primera parte del

60 estudio se diseñó para determinar si la administración de las cepas de vacuna viva tenía algún efecto adverso sobre la capacidad de incubación de los huevos con embrión. La asignación de grupos experimentales y los resultados de seguridad se han descrito en las Tablas 2.

TABLA 2

RESULTADOS DE SEGURIDAD

Grupo* Vacuna {dosis}** Número de huevos incubados (%)

1 CPERF001 (0,8 x 102)X

18 (90%) 2 CPERF001 (0,8 x 103)

17 (85%) 3 CPERF001 (0,8 x 104)

11 (55%) 4 CPERF001 (0,8 x 105)

16 (80%) 5 CPERF002 (1,9 x 102)

16 (80%) 6 CPERF002 (1,9 x 102)

17 (85%) 7. CPERF002 (1,9 x 104)

14 (70%) 8 CPERF002 (1,9 x 105)

12 (60%) 9 Cepa 1240 (1,5 x 103)

16 (80%) 10 Cepa 29 (3,7 x 103)

13 (65%)

11 Controles de los medios 19 (95%)

12 Controles no inoculados 18 (90%)

* 20 huevos por grupo ** Dosis de 100 µl proporcionadas in ovo a los 18 desde la formación del embrión (IM) X El título por dosis se mide como Unidades formadoras de colonias (ufc")

A la dosis de 103 o menos, la capacidad de incubación de estos grupos no fue significativamente inferior a la

5 observada en el grupo inoculado solamente con medio (grupo 11) o el grupo no inoculado (grupo 12). A la dosis inferior, CPERF001 mostró la misma capacidad de incubación que el control de los medios, y mejor que el grupo de control no inoculado.

Puesto que las dosis más elevadas de eliminadores pueden tener un efecto adverso sobre la capacidad de

10 incubación de los huevos, solo los dos grupos con la dosificación inferior de cada eliminador se incluyeron en la parte de eficacia del estudio. Estos grupos, junto con las aves del control de medios (grupo 11), se sometieron a estímulo con la cepa CP6 de C. perfringens (tipo natural), que fue administrada por vía oral a aproximadamente 108 ufc/ave cuando las aves tenían 20, 21 y 22 días de edad. Todas las aves se sometieron a necropsia a los 25 días de edad y las lesiones del intestino delgado se puntuaron con la escala de puntuación para la enteritis necrosante que

15 se resume a continuación.

0 Puntuación

Enteritis necrosante Enteritis necrosante Enteritis necrosante Enteritis necrosante

1+

2+ 3+ 4+

No hay grandes lesiones NE en el intestino delgado; el intestino tiene una elasticidad normal (se enrolla sobre sí mismo tras abrirse).

Pared intestinal delgada y flácida (el intestino permanece plano cuando se abre y no se enrolla sobre sí mismo en posición normal); mucus espeso o en exceso que cubre la membrana mucosa o leve enrojecimiento focal o multifocal de la Una única o pocas áreas multifocales de enrojecimiento e hinchazón de la pared intestinal; una única o pocas zonas multifocales de ulceración y necrosis de la mucosa intestinal. Extensas zonas multifocales de necrosis y ulceración de la mucosa intestinal ± hemorragia significativa o capa de fibrina o restos necróticos en la superficie de la mucosa (aspecto de toalla de felpa). Animal muerto con grandes lesiones NE con una puntuación 2+ o superior.

mucosa o

congestión de los

vasos serosos.

Puntuación con modificaciones menores de acuerdo con el Dr. Charles Hofacre, D.V.M., M.A.M., University of Georgia, Poultry Diagnostic and Research Center, 953 College Station Road, Athens, GA 30602

Cinco (5) aves del grupo del control sin vacunar (no estimulados) se sometieron a necropsia al término del estudio para confirmar que no hubo exposición a C. perfringens durante el curso del estudio. Los resultados se representan 20 en la Tabla 3

TABLA 3

GRUPOS DE TRATAMIENTO PARA PROTECCIÓN*

RESULTADOS

Grupo*

Vacuna Dosis para vacuna ln-ovo (ufc) Días de edad al estímulo con C. perfringens N Promedio

1

CPERF001 1x102 20, 21 y 22 9 0,67

2

CPERF001 1x103 20, 21 y 22 13 0,46

GRUPOS DE TRATAMIENTO PARA PROTECCIÓN*

RESULTADOS

Grupo*

Vacuna Dosis para vacuna ln-ovo (ufc) Días de edad al estímulo con C. perfringens N Promedio

5

CPERF002 1x102 20, 21 y 22 12 1,33

6

CPERF002 1x103 20, 21 y 22 12 1,08

11

Control de los medios Ninguno 20, 21 y 22 15 1,80

12

Ninguno Ninguno No estimulado 5 0,00

*necropsia a los 25 días de edad

Cada una de las puntuaciones de los Grupos 1 y 2 fue significativamente inferior de forma estadística en comparación con los Grupos 11 (Prueba de la Suma de Rangos Exactos de Wilcoxon p ≥ 0,2177). Se llevó a cabo una estimación de la eficacia de la vacuna de acuerdo con el procedimiento descrito por David Siev [Journal of

5 Modern Applied Statistical Methods Vol. 4, Nº 2, 500-508 (2005)]. Se estimó la eficacia de la vacuna en la reducción de la gravedad de la enfermedad en un 54% para el Grupo 1, 65% para el Grupo 2, 20% para el Grupo 5 y 27% para el Grupo 6 cuando se comparó con el Grupo 11.

EJEMPLO 5

Construcción de una cepa eliminadora de C. perfringens de porcino

Se usaron las estrategias utilizadas en los ejemplos 1 y 2, más arriba, para construir mutantes de eliminación de la toxina alfa procedentes de cepas de C. perfringens de porcino. Inicialmente, los aislados en el campo procedentes

15 de porcinos enfermos se sometieron a electroporación con el plásmido pJIR418 para evaluar su transformabilidad. Los aislados dieron como resultado ≥ 104 transformantes por microgramo de ADN plásmido y, puesto que son susceptibles tanto al cloranfenicol como a la eritromicina, son candidatos para la eliminación.

El ADN genómico de las cepas candidatas se utilizó como molde para una PCR de intervalo largo del gen plc (toxina

20 alfa) y las secuencias flanqueantes. Tras la subclonación de los productos de la PCR, el gen de la toxina alfa y se secuenciaron las regiones flanqueantes y se cartografió la restricción. Se sintetizaron nuevos cebadores de oligonucleótidos con los sitios de restricción flanqueantes y se clonaron los productos de dos amplificaciones separadas en el plásmido suicida 1192-23.1 para crear la eliminación de 27 pares de bases como en el Ejemplo 1.

25 El vector suicida de porcino se sometió a electroporación en la cepa de C. perfringens de porcino correspondiente y los mutantes de la eliminación se aislaron utilizando los procedimientos descritos en el Ejemplo 2, más arriba. Se confirmaron los mutantes de eliminación por la ausencia de beta hemolisis en las placas de agar sangre y mediante la secuenciación del ADN del gen de la toxina alfa.

30 Esta construcción es una cepa eliminadora de C. perfringens de Tipo A diseñada mediante ingeniería genética. Esta cepa secreta una forma toxoide inactivada de la toxina alfa de C. perfringens. Debido a que esta cepa ya no expresa la toxina alfa activa y retiene además una significativa porción de la antigenicidad de la toxina, es útil como vacuna para proteger al ganado porcino frente a las enfermedades producidas por C. perfringens.

35 DEPÓSITO BIOLÓGICO

Se han depositado cultivos de los siguientes materiales biológicos en el siguiente depositario internacional:

American Type Culture Collection (ATCC) 10801 University Boulevard, Manassas, Va 20110-2209, EE.UU. bajo

40 condiciones que satisfacen el Tratado de Budapest con respecto al Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a Fines del Procedimiento de Patente.

Organismo Nº de Acceso

Fecha del Depósito Clostridium perfringens CPERF/Δα Toxin 365-054 PTA7364 7 de febrero de 2006 Clostridium perfringens CPERF/Δα Toxin 365-053 PTA7365 7 de febrero de 2006

LISTADO DE SECUENCIAS 45

<110> Cochran, Mark Lair, Steven Synenki, Richard Petersen, Gary

<120> ORGANISMOS CLOSTRIDIUM ATENUADOS Y VACUNA RECOMBINANTE

50 <130> AH06175 <150> 60/792.553

<151> 5 <160> 23

<170> Patentln versión 3.3

<210> 1 10 <211> 398

<212> PRT

<213> Cepa 13 de Clostridium perfringens

<400> 1

<210> 2

<211> 1197

<212> ADN

<213> Cepa 13 de Clostridium perfringens

<400> 2

<210> 3

<211> 370

<212> PRT

<213> Cepa 13 de Clostridium perfringens

<400> 3

<210> 4

<211> 39

5

<212> ADN

<213> Oligonucleótido

<400> 4

aacgcctatg atctatatca agatcatttc tgggatcct

39

10

<210> 5

<211> 13

<212> PRT

<213> Oligopéptido

15

<400> 5

20 <210> 6

<211> 14

<212> ADN

<213> Oligonucleótido

25 <400> 6 aatgcattgg atcc 14

<210> 7

<211> 4 30 <212> PRT

<213> Oligopéptido

<400> 7

<210> 8

<211> 15

<212> ADN 40 <213> Oligonucleótido

<400> 8 aatgcattgg atcct 15

45 <210> 9

<211> 5

<212> PRT

<213> Oligopéptido

50 <400> 9

5

<210> 10 <211> 14 <212> ADN <213> Oligonucleótido <400> 10 aatgcggatc cagt 14

<210> 11 <211> 4 <212> PRT <213> Oligopéptido

15

<400> 11

<210> 12 <211> 12 <212> ADN <213> Oligonucleótido

25

<400> 12 aatgcggatc ct 2 <210> 13 <211> 4 <212> PRT <213> Oligopéptido

<400> 13

35

<210> 14 <211> 26 <212> ADN <213> Oligonucleótido

<400> 14 agctgcataa gcaaaagttc caactc

26

45

<210> 15 <211> 33 <212> ADN <213> Oligonucleótido

<400> 15 gcagaaactc ttcttagacc tattctttta ggc

33

55

<210> 16 <211> 32 <212> ADN <213> Oligonucleótido <400> 16 ggatccagct gcataagcaa aagttccaac tc 32

<210> 17 <211> 41 <212> ADN <213> Oligonucleótido

<400> 17 ggatccaatg cattcttatc ataatctgga taagtagaac c

41

5

<210> 18 <211> 37 <212> ADN <213> Oligonucleótido

10

<400> 18 ctgggatcct gatacagata ataatttctc aaaggat 37

15

<210> 19 <211> 40 <212> ADN <213> Oligonucleótido

20 25

<400> 19 actctgcagt tgtcatatca attaaattaa ctataatccc <210> 20 <211> 37 <212> ADN <213> Oligonucleótido <400> 20 actgagctcc tagacacttt gcttcaatat ttgggaa 40 37

30

<210> 21 <211> 41 <212> ADN <213> Oligonucleótido

35

<400> 21 actggatccg cattcttatc ataatctgga taagtagaac c 41

40

<210> 22 <211> 1197 <212> ADN <213> Cepa CP6 de Clostridium perfringens

<400> 22

<210> 23

<211> 398

<212> PRT

<213> Cepa CP6 de Clostridium perfringens

<400> 23

LISTADO DE SECUENCIAS

5 <110> Cochran, Mark D Petersen, Gary R Lair, Stephen V Synenki, Richard M

10 <120> Organismos Clostridium atenuados y vacuna recombinante

<130> AH06175WO

<140> PCT/US2007/009135 15 <141>

<150> US 60/792.553

<151> 20 <160> 23

<170> Patentln versión 3.4

<210> 1 25 <211> 398

<212> PRT

<213> Cepa 13 de Clostridium perfringens

<400> 1 30

<210> 2

<211> 1197

<212> ADN

<213> Cepa 13 de Clostridium perfringens

<400> 2

<210> 3

<211> 370

<212> PRT

<213> Cepa 13 de Clostridium perfringens

<400> 3

<210> 4

<211> 39

5

<212> ADN

<213> Clostridium perfringens

<400> 4

aacgcctatg atctatatca agatcatttc tgggatcct

39

10

<210> 5

<211> 13

<212> PRT

<213> Clostridium perfringens

15

<400> 5

20 <210> 6

<211> 14

<212> ADN

<213> Artificial

25 <220>

<223> Sintetizado químicamente

<400> 6

aatgcattgg atcc 14 30

<210> 7

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial 35

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos contenida/insertada en una proteína después de una deleción. Se puede sintetizar químicamente

40 <400> 7

<210> 8 45 <211> 15

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 50 <223> sintetizado químicamente

<400> 8 aatgcattgg atcct 15

55 <210> 9

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

60 <220> <223> Secuencia de aminoácidos contenida/insertada en una proteína después de una deleción. Se puede sintetizar químicamente

<400> 9

<210> 10

<211> 14 10 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> sintetizado químicamente 15

<400> 10 aatgcggatc cagt 14

<210> 11 20 <211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

25 <223> Secuencia de aminoácidos contenida/insertada en una proteína después de una deleción. Puede ser sintetizado químicamente

<400> 11

<210> 12

<211> 12

<212> ADN 35 <213> Artificial

<220>

<223> sintetizado químicamente

40 <400> 12 aatgcggatc ct 12

<210> 13

<211> 4 45 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos contenida/insertada en una proteína después de una deleción. Se puede 50 sintetizar químicamente

<400> 13

55

<210> 14

<211> 26

<212> ADN

<213> Artificial

60

<220>

<223> sintetizado químicamente

<400> 14 agctgcataa gcaaaagttc caactc

26

5

<210> 15 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> sintetizado químicamente

<400> 15 gcagaaactc ttcttagacc tattctttta ggc

33

15

<210> 16 <211> 32 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> sintetizado químicamente

25

<400> 16 ggatccagct gcataagcaa aagttccaac tc <210> 17 <211> 41 <212> ADN <213> Artificial 32

<220> <223> sintetizado químicamente

35

<400> 17 ggatccaatg cattcttatc ataatctgga taagtagaac c 41

<210> 18 <211> 37 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> sintetizado químicamente

45

<400> 18 ctgggatcct gatacagata ataatttctc aaaggat 37

<210> 19 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial

55

<220> <223> Sintetizado químicamente <400> 19 actctgcagt tgtcatatca attaaattaa ctataatccc 40

<210> 20 <211> 37 <212> ADN <213> Artificial

65

<220> <223> sintetizado químicamente

<400> 20 actgagctcc tagacacttt gcttcaatat ttgggaa

37

5

<210> 21 <211> 41 <212> ADN <213> Artificial

10

<220> <223> Sintetizado químicamente

<400> 21 actggatccg cattcttatc ataatctgga taagtagaac c

41

15

<210> 22 <211> 1197 <212> ADN <213> Cepa CP6 de Clostridium perfringens

20

<400> 22

<210> 23

<211> 398

<212> PRT

<213> Cepa CP6 de Clostridium perfringens

<400> 23

Claims (24)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una molécula de ácido nucleico que codifica una muteína sustancialmente no tóxica de la toxina alfa de

   Clostridium perfringens, en la que la muteína de la toxina alfa comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID 5 Nº: 3 menos 9 restos de aminoácidos consecutivos que van de Tyr62 a Trp70.

2. 2.

   La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que dicha molécula de ácido nucleico codifica una muteína en la que dichos nueve aminoácidos consecutivos eliminados están sustituidos dichos por un único resto de leucina.

3. 3.

   La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 que comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 2, en la que están eliminados los nucleótidos 288-294 de la molécula de ácido nucleico.

4. 4. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 3, en la que los nucleótidos eliminados están sustituidos por 15 una secuencia de nucleótidos que codifica un único resto de Leu.

5. 5.

   Una muteína sustancialmente no tóxica de la toxina alfa de Clostridium perfringens, en la que la muteína de la toxina alfa comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3 menos nueve restos de aminoácidos consecutivos que van de Tyr62 a Trp70.

6. 6.

   La muteína sustancialmente no tóxica de la toxina alfa de Clostridium perfringens de la reivindicación 5, en la que dichos nueve restos de aminoácidos consecutivos están eliminados y sustituidos por un único resto de Leu.

7. 7.

   Un organismo Clostridium perfringens atenuado sustancialmente no tóxico construido integrando la molécula de

   25 ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en un cromosoma de un organismo Clostridium perfringens no atenuado.

8. 8.

   El organismo Clostridium perfringens atenuado de la reivindicación 7, en el que la molécula de ácido nucleico está localizada en una posición en el cromosoma que es homóloga a la locación de una molécula de ácido nucleico que codifica una toxina alfa natural presente en el Clostridium perfringens no atenuado.

9. 9.

   El organismo Clostridium perfringens atenuado de la reivindicación 7 o de la reivindicación 8 que es un Clostridium perfringens de tipo A.

   35 10. El organismo Clostridium perfringens atenuado de una cualquiera de las reivindicaciones 7-9 en el que el Clostridium perfringens no atenuado a partir del cual se construyó el anterior fue aislado de un animal hospedador que es bien un mamífero o un ave.

10. 11.

    El organismo Clostridium perfringens atenuado de la reivindicación 10, en el que dicho mamífero se selecciona entre el grupo que consiste en un bovino, ovino, y porcino.

11. 12.

    El organismo Clostridium perfringens atenuado de la reivindicación 10 en el que dicha ave es un pollo, un pavo, un ganso, un pato, un cisne, una paloma, un pichón, un urogallo, o una perdiz.

    45 13. El organismo Clostridium perfringens atenuado de una cualquiera de las reivindicaciones 7-12 que comprende al menos un gen que codifica un polipéptido no de Clostridium perfringens.

12. 14.

    El organismo Clostridium perfringens atenuado de la reivindicación 13 en el que dicho polipéptido no de Clostridium perfringens es un polipéptido no bacteriano.

13. 15.

    El organismo Clostridium perfringens atenuado de la reivindicación 14 en el que el polipéptido no bacteriano es un polipéptido de ave o de mamífero.

14. 16. El organismo Clostridium perfringens atenuado de la reivindicación 15 en el que el polipéptido no bacteriano es 55 un polipéptido de ave.

15. 17.

    El organismo Clostridium perfringens atenuado de la reivindicación 15 en el que el polipéptido no bacteriano es una citoquina.

16. 18.

    El organismo Clostridium perfringens atenuado de la reivindicación 17 en el que la citoquina es IL-18 de pollo.

17. 19.

    Un Clostridium perfringens atenuado tal como se define en las anteriores reivindicaciones 7-18 para uso como una vacuna en un procedimiento para inducir inmunidad a enfermedades producidas por infecciones con Clostridium perfringens en un animal, en el que dicho Clostridium perfringens atenuado se administra en una dosis

    65 inmunológicamente eficaz.
18. 20. El Clostridium perfringens atenuado para uso de acuerdo con la reivindicación 19, en el que la vacuna es para administración mediante las rutas oral, intramuscular, intravenosa, intradérmica, subcutánea, o intranasal.
19. 21. El Clostridium perfringens atenuado para uso de acuerdo con la reivindicación 19, en el que la vacuna se reparte 5 en el alimento del animal.
20. 22. El Clostridium perfringens atenuado para uso de acuerdo con la reivindicación 19, en el que la vacuna es para la administración como una pulverización sobre los animales para proporcionar la administración oral.

    10 23. Un organismo Clostridium perfringens que es CPERF/ΔαToxin 365-054 que tiene el Nº de Depósito PTA7364 de la ATCC.
21. 24. Un organismo clostridium perfringens que es CPERF/ΔαToxin 365-053 que tiene el Nº de depósito PTA7365 de

    la ATCC. 15
22. 25. Una vacuna que comprende el organismo Clostridium perfringens atenuado de una cualquiera de las reivindicaciones 7-18, 23, o 24.
23. 26. La vacuna de la reivindicación 25 que comprende además uno o más de los siguientes: un tampón 20 farmacológicamente aceptable, un excipiente, o un adyuvante.
24. 27. Un pienso animal que comprende la vacuna de la reivindicación 25 o 26.