CN114621963A - 一种猪魏氏梭菌a型的亚单位疫苗及其制备 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及亚单位疫苗领域，尤其涉及一种猪魏氏梭菌A型的亚单位疫苗及其制备。本发明通过优化密码子，实现了α毒素蛋白及其截短片段的可溶性表达，并通过Ni‑NTA层析得到高纯度的蛋白。为了降低生产成本，分别尝试用pH沉降法、硫酸铵沉降法或高温沉降法代替Ni‑NTA亲和层析法，只有高温沉降法能达到目的：α毒素片段表现出较高的热稳定性，蛋白粗提取物在65℃沉降30min后，杂蛋白去除率在85％以上。随后将纯化的蛋白与佐剂混合制备成疫苗，免疫小鼠展现出100％的保护率。本发明提供了可溶性α毒素片段并优化了其制备方法，极大地简化了生产工艺，使得猪魏氏梭菌疫苗的制备更简单高效。

Description

一种猪魏氏梭菌A型的亚单位疫苗及其制备
技术领域
本发明涉及亚单位疫苗领域，尤其涉及一种猪魏氏梭菌A型的亚单位疫苗及其制备。
背景技术
猪魏氏梭菌病又叫猪梭菌性肠炎、猪传染性坏死性肠炎、仔猪肠毒血症，俗称仔猪红痢。猪魏氏梭菌病主要发生于1周龄以内的仔猪，该病往往无任何先驱症状,突然发病死亡,以排出红色带血的稀粪，全身实质器官及消化道出血、小肠节段坏死为特征。该病病程短，死亡快，死亡率高，一旦流行会导致大批动物死亡。
抗生素滥用使得猪群体对抗生素产生了耐药性，国家也限制了抗生素的使用，因此，抗生素不是用于猪魏氏梭菌感染最好的方法。安全有效的疫苗被认为是预防猪魏氏梭菌感染和减少魏氏梭菌传播最有效的方法。
猪魏氏梭菌病由猪魏氏梭菌(cl.welchii)引起，猪产气荚膜梭菌曾称为猪魏氏梭菌或产气荚膜杆菌，该菌的致病因子是其所产生的外毒素，到目前为止，已发现的外毒素有12种之多，起主要作用的毒素为α、β、ε和ι毒素，也根据产生毒素的差异将该菌分为A、B、C、D、E等型。α毒素是A型猪魏氏梭菌的主要毒素，但α毒素也可以被各型猪魏氏梭菌产生，α毒素是猪魏氏梭菌最重要的毒素之一。α毒素是由370个氨基酸组成的单链多肽，分子量为43KD，它具有磷脂酶C和鞘磷脂酶活性，能同时水解磷脂酰胆碱和鞘磷脂，从而具备破坏细胞膜结构完整性的能力，可以导致细胞裂解。这些外毒素常用于猪魏氏梭菌疫苗制备。
目前魏氏行业普遍流行的猪魏氏梭菌疫苗为全菌灭活疫苗，它的制备方案为：分离临床梭菌病规模扩大培养，然后使用灭活剂灭活，添加免疫佐剂制备成疫苗使用。这种疫苗的使用存在一些问题：总蛋白含量大，存在免疫应激；过多无效蛋白的引入导致免疫效果不佳；灭活过程中引入的灭活剂或对抗原蛋白有一定损伤。
另一种魏氏梭菌疫苗为亚单位疫苗，它的制备方案为：用工具菌表达魏氏梭菌的菌体蛋白、鞭毛蛋白等免疫原性蛋白，然后纯化这些蛋白，用作魏氏梭菌疫苗。常用于制备猪魏氏梭菌亚单位疫苗的蛋白为该菌的外毒素，它们一般具有较强的免疫原性，尤其是α毒素。α毒素作为猪魏氏梭菌最重要的毒素之一，在工具菌里常以与促溶标签融合或包涵体的形式表达，前者用作为疫苗难以避免促溶标签带来的副反应，后者纯化过程复杂、蛋白活性低。亚单位疫苗的使用避免了导入过多无效蛋白的问题，但同时带来了制备过程中蛋白不可溶的问题。
综上，猪魏氏梭菌的基因工程亚单位疫苗的开发中主要存在的问题为：目的蛋白的不可溶性限制了基因工程疫苗的制备和应用，所以目前市面上很少有此类猪魏氏梭菌疫苗。
因此，为了制备有效的猪魏氏梭菌疫苗，需要解决猪魏氏梭菌α毒素的可溶性问题。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供可溶的猪魏氏梭菌α毒素及其片段，本发明通过优化α毒素的密码子以实现蛋白的可溶性表达，从而获得了溶解性好、生物活性高且易制备的α毒素蛋白及其片段，并基于所述的α毒素片段制备了高效的猪传染性胸膜肺炎疫苗。
本发明提供了编码猪魏氏梭菌α毒素的核酸，其具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。该片段编码猪魏氏梭菌α毒素的全长，其氨基酸序列如SE Q ID NO:4所示。
本发明还提供了编码猪魏氏梭菌α毒素片段的核酸，其具有如SEQ ID NO:3所示的序列。该片段编码猪魏氏梭菌α毒素的第247～370位氨基酸片段(α-C片段)。
本发明提供的编码猪魏氏梭菌α毒素的核酸或者编码猪魏氏梭菌α毒素片段的核酸密码子经优化，优化后序列在大肠杆菌中的表达效果优于其他优化方案，能更有效的提高蛋白的可溶性表达量。
本发明提供了一种载体，包括骨架载体和所述的α毒素或其片段的核酸。
所述的骨架载体上不包括编码GST蛋白的核酸。
本发明提供的载体上可以包括筛选标记。优选的方案为载体上不包括筛选标记，特别是不包括GST筛选标记，从而避免该筛选标记对活性的干扰。对于不含有GST筛选标记的载体转化宿主后表达的蛋白可采用高温沉降法进行纯化。
一些实施例中，所述骨架载体为pET-28a载体。
本发明提供了转化了所述载体的重组宿主。
所述宿主为大肠杆菌。
一些实施例中，所述宿主为大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明提供的猪魏氏梭菌α毒素片段的制备方法，包括：培养所述的重组宿主获得含猪魏氏梭菌α毒素片段的培养物、破碎培养物获得含所述蛋白的粗提取物。
一些实施例中，所述培养至菌体OD600数值在0.6～0.7时开始诱导，所述诱导的试剂为IPTG，诱导的温度为25℃，诱导的时间为12～16h。
进一步地，所述的破碎方式包括加入溶菌酶、反复冻融处理和/或超声破碎。
所述α毒素片段的制备方法中，还包括纯化所述的蛋白粗提取物。
本发明的实施例中，所述蛋白粗提取物为所述培养物破碎后离心所得的上清溶液。
所述纯化方法包括Ni-NTA亲和层析法；
或者，所述纯化方法包括高温沉降法，所述沉降的温度为60℃～75℃。
一些实施例中，采用所述的Ni-NTA亲和层析法纯化蛋白粗提取物，其包括：平衡吸附柱、蛋白粗提取物流穿吸附柱、洗去吸附柱上的杂蛋白、洗脱吸附柱上的蛋白。所述层析法的环境中，pH为7.4，盐环境为150mmol/L的NaCl。
另一些实施例中，采用所述的高温沉降法纯化蛋白粗提取物，其包括，在60℃～75℃沉降所述蛋白粗提取物5～180min。
优选地，所述高温沉降法包括在65℃沉降所述蛋白粗提取物30min。
本发明还提供了所述的核酸或其编码的蛋白、所述载体、所述的宿主和/或所述方法制得的α毒素片段在制备猪魏氏梭菌疫苗中的应用。
本发明提供了一种猪魏氏梭菌疫苗，包括所述的核酸编码的蛋白和佐剂。
所述的猪魏氏梭菌疫苗中，所述佐剂为弗氏佐剂或弗氏不完全佐剂。
优选地，蛋白和佐剂的比例为1：1。
本发明涉及亚单位疫苗领域，尤其涉及一种猪魏氏梭菌A型的亚单位疫苗及其制备。本发明通过优化密码子，实现了α毒素蛋白及其片段的可溶性表达，并基于Ni-NTA层析得到高纯度的蛋白。为了降低生产成本，分别尝试用pH沉降法、硫酸铵沉降法或高温沉降法代替Ni-NTA亲和层析法，只有高温沉降法能达到目的：α毒素片段表现出较高的热稳定性，蛋白粗提取物在65℃沉降30min后，杂蛋白去除率在85％以上。随后将纯化的蛋白与佐剂混合制备成疫苗，免疫小鼠展现出100％的保护率。本发明提供了可溶性α毒素片段并优化了其制备方法，极大地简化了生产工艺，使得猪魏氏梭菌疫苗的制备更简单高效。
附图说明
图1示a片段、α-C片段构建截短示意图；
图2示pET-21a载体模式图；
图3示pET-21a-梭菌a构建模式图；
图4示pET-21a-梭菌α-C构建模式图；
图5示梭菌密码子优化前后的a蛋白表达胶图；
图6示梭菌a蛋白、α-C蛋白的胶图；
图7示pH沉降法、硫酸铵沉降法或高温沉降法纯化α-C蛋白的胶图；
图8示不同温度的高温沉降法纯化α-C蛋白的统计图；
图9示不同时间的高温沉降法纯化α-C蛋白的蛋白胶图；
图10示α-C蛋白免疫小鼠实验统计图。
具体实施方式
本发明提供了一种猪魏氏梭菌疫苗，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1构建表达载体
1、猪场病料基因组提取后，使用特异性引物PCR鉴定梭菌毒素阳性后，送测序获得序列。
2、获得梭菌毒素全序列之后，根据氨基酸兼并偏好来优化该碱基序列的密码子，通过降低基因片段中GC含量的均一度，并提高密码子偏好性，以便在mRNA水平促使蛋白能更好地翻译与表达。优化得到的核酸碱基序列如SEQ ID NO:1所示。
3、根据a毒素蛋白全序列分别设计包括第1～246个氨基酸、第247～370个氨基酸及第1～370个氨基酸(全长)的肽段，依次命名为a-N、a-C、a全长，然后分别设计引物扩增这些片段(未以起始密码子开头的片段在最前面添加起始密码子)。
4、通过BamHI和XhoI两种限制性内切酶对上述a-N、a-C、a全长片段共三种片段进行酶切后，经琼脂糖凝胶电泳分离匹配片段。
5、基于实验室原有载体pET-21a进行质粒提取制备后，同样使用BamHI和XhoI两种限制性内切酶进行酶切，后经琼脂糖凝胶电泳分离匹配片段回收。
6、将上述a全长(SEQ ID NO:1)、a-N(SEQ ID NO:2)、a-C(SEQ ID NO:3)的核酸片段分别与载体pET-21a进行连接。
7、使用T4连接酶在16℃条件下连接12-16h。
8、次日将连接产物转化BL21感受态细胞，涂布氨苄抗性平板进行筛选。
9、14-16h后用特异性引物进行鉴定。
10、鉴定正确的单克隆菌株送测序公司测序。
11、将鉴定正确的pET-21a-α、pET-21a-α-C和pET-21a-α-N的质粒分别按照1：100的比例扩大后在37℃复苏14-16h。
实施例2诱导菌体表达蛋白
将鉴定测序正确a片段、α-C片段、α-N片段的质粒分别转化感受态细胞表达菌株BL21(DE3)并诱导蛋白表达。具体操作步骤如下：
①首先是-80℃中取出保存的感受态细胞，在其刚刚融化时加入质粒轻柔的在感受态细胞中吹打均匀，然后完全置于冰中25-30min。
②提前开启金属孵育器或者水浴锅，温度设置为42℃，冰浴完成后立即于42℃热激处理90s，保证质粒进入细胞内，随后再次于冰中放置3-5min，使感受态细胞膜闭合。
③在超净工作台中，往上述转化完的感受态细胞中加入600uL无抗培养基在37℃、220rpm转速下1小时，使阳性转化子长出第一代后，再取100ul均匀涂布在对应抗性的固体培养基上在37℃生化培养箱中过夜，约12-15h可以筛选出阳性单克隆。
④次日挑取阳性单克隆扩大培养后，保存甘油菌或用于扩大诱导表达。诱导表达过程中实时监测OD600的数值，当数值在0.6～0.7时，冷却后向培养基中加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG，然后分别在25℃，180rpm条件下诱导12-16h，同时设置未加IPTG组作为阴性对照。
⑤当OD600数值在0.6～0.8时，取1ml阴性对照菌液作为未诱导样品，另取诱导后的菌液1ml作为诱导后样品。将上述样品分别于8000g，离心3min，弃上清后，用OD600值乘以100倍的值(体积，mL)的PBS溶液重悬菌体，然后吸取30μL的重悬菌体于新的离心管中，加入等体积的2×loading buffer(蛋白上样缓冲液)混匀，于99℃金属浴10min充分变性并瞬间离心，样品记作“未诱导/诱导”，留备待做SDS-PAGE检测。
实施例3菌体处理和SDS-PAGE检测
处理实施例2中a全长蛋白的诱导表达的菌液，并进行SDS-PAGE检测。具体操作步骤如下：
①将50ml菌液于8000g，离心20min，弃上清，菌体用重悬液(20mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl，pH＝7.4)清洗三次，8000g，离心20min，弃上清，沉淀用10ml裂解液(20mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl，2％Tr iton X-100，0.1mM PMSF，pH＝7.4)重悬并进行超声破碎(超声破碎前可选择性加入溶菌酶或者反复冻融处理)。
②为防止破坏蛋白，整个超声过程中重悬液必须放置在冰水混合物中。超声破碎仪的参数设置为：on 5s；off 7s；total 5～10min；功率为35％×100W。
③破碎结束后，取30μL的菌体混合液加30μL的2X loading buffer进行制样，99℃金属浴10min，也可记作”诱导”。然后将剩下的菌体混合液于12000g，4℃离心30min。取上清液30μL加30μL的2×loading buffer，99℃金属浴10min，记作”上清”。沉淀用10ml的裂解液重悬，同样取30μL按照相同的方法制样，记作”沉淀”。以上“诱导”、“上清”和“沉淀”样品都留备做SDS-PAGE检测。
④SDS-PAGE检测。将实施例2和3中所述的“未诱导”、“诱导”、“上清”和“沉淀”样品各取10μL点样并电泳。在进行蛋白质电泳时，样品首先在5％的浓缩胶中于80V电压下电泳进行浓缩，然后在10％的分离胶中于120V电压下进行蛋白分离。跑胶结束后，放入考马斯亮蓝染色液中进行染色2h，染色结束后，将考马斯亮蓝染色液进行回收，然后将蛋白凝胶放入脱色液中进行脱色，及时更换脱色液直至洗去底色。通过Image J软件对条带进行灰度扫描，计算目的蛋白的比重和目的蛋白的可溶性表达水平等数据。
a全长蛋白的“未诱导”、“诱导”、“上清”和“沉淀”样品的SDS PAGE电泳的结果如图5胶图所示，反映了a全长蛋白的表达情况。图5左是未经密码子优化的核酸所表达的蛋白的情况，从中可以看到，该蛋白主要以包涵体形式表达，极少部分是以可溶形式表达。图5右展示的是密码子优化后的核酸表达的蛋白，该蛋白主要以可溶的形式表达，少部分表达在包涵体里。可见，密码子优化提升了该蛋白的可溶表达水平。经过密码子优化，实现了梭菌a蛋白的可溶表达。
实施例4纯化蛋白
a毒素的功能域主要集中在a-C片段上，也就是说a-C截短体具备本发明所需的生物活性功能，故在后续实验中重点进行a全长和a-C截短体蛋白的纯化。按照实施例3所述的步骤分别制备密码子优化过的a全长和a-C蛋白的的表达菌的上清液，然后采用亲和层析法(Ni-NTA重力柱)分别进行蛋白纯化。纯化的具体步骤(全程低温处理)如下：
1、配液：
平衡液：20mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl，pH＝7.4；
洗杂液：20mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl，20mM咪唑，pH＝7.4；
洗脱液：20mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl，500mM咪唑，pH＝7.
2、用5-10CV纯水冲洗柱子；
3、用5-10CV平衡液平衡柱子；
4、加入蛋白样品(不超过10CV)收集流穿液；
5、用5-10CV平衡液平衡柱子；
6、用5-10CV洗杂液冲洗柱子(此步需要摸索洗杂浓度)；
7、用0.5CV洗脱液冲洗柱子，收集洗脱液；
8、Ni柱使用完后用5-10CV洗脱液冲洗柱子，再用5-10CV纯水冲洗柱子，最后用20％乙醇进行封存，4℃保存。
9、将纯化的α全长和α-C片段的蛋白脱盐。
10、最后用SDS-PAGE电泳分析Ni-NTA分离纯化的α全长和α-C片段的蛋白，SDS-PAGE电泳的具体操作同实施例3中的步骤4。
结果如图6所示，经Ni-NTA亲和层析分离得到的a片段、α-C片段蛋白纯较高，尤其是α-C片段的蛋白。该分离过程的回收效率可通过优化纯化方法和步骤来进一步提高。
实施例5α-C片段热处理纯化
a全长蛋白的表达量比a-C截短体蛋白要低，后续规模化生产倾向于选择表达量多的继续做研究。且a全长蛋白包含两种酶活性中心，细胞毒性过大，而a-C完美的规避了此问题，毒性相对较小。因此，在后续规模化生产方案的研究中，选择用a-C截短体对纯化方法做进一步的优化。
Ni-NTA亲和层析的方法虽然能有效地提供蛋白的纯度，但是该方法回收率低、操作复杂且成本高，不适用于规模化的生产。为了实现蛋白的规模化生产，分别尝试用不同的pH、不同浓度的硫酸铵处理、不同的温度来处理蛋白粗提取物(实施例3步骤3获得的α-C蛋白的菌体上清液)，以期沉降更多的杂蛋白，实现目的蛋白的纯化。具体操作步骤如下：
①尝试不同的pH处理以纯化蛋白粗提取物。超声破碎诱导表达完的菌体后，12000rpm、低温离心30min。将上清分装为500ul/管的量，分别调节蛋白溶液的pH至2、4、6、7、8、9、10，孵育，然后于12000prm、离心30min，取上清样30ul加入30ul 2×loading buffer后，99℃煮沸10min制备样品，然后将上述制得的样品都进行SDS-PAGE电泳。
②尝试不同浓度的硫酸铵处理以纯化蛋白粗提取物。超声破碎诱导表达完的菌体后，12000rpm、低温离心30min。将上清分装为500ul/管的量，分别加入0％、10％、20％、30％、40％、50％(v/v)的硫酸铵溶液沉降蛋白，然后将样品于12000prm、离心30min，取上清样30ul加入30ul 2×loading buffer后，99℃煮沸10min制备样品，然后将上述制得的样品都进行SDS-PAGE电泳。
③尝试不同的温度处理以纯化蛋白粗提取物。超声破碎诱导表达完的菌体后，12000rpm、低温离心30min。将上清分装为500ul/管的量，分别放入30℃、37℃、44℃、51℃、58℃、65℃、72℃的金属浴中孵育5min、然后放入4℃终止，12000prm、离心30min，取上清样30ul加入30ul 2×loading buffer后，99℃煮沸10min制备样品，然后将上述制得的样品都进行SDS-PAGE电泳。
用三种不同方式处理α-C蛋白的粗提取物的结果如图7所示：
如图7最左边的图所示，6种浓度的硫酸铵的处理下，上清液中仍然有很多杂蛋白，无法实现蛋白纯化。
如图7中间的图所示，pH为2和pH为4的处理下，杂蛋白和目的蛋白都发生了沉降，而其它的pH条件下，上清液中依然有很多杂蛋白，所试pH条件皆无法实现蛋白的纯化。
如图7最右边的图所示，在30℃、37℃、44℃、51℃或58℃温度的处理下，上清液中依然有很多杂蛋白。而在65℃或72℃的高温处理下，杂蛋白几乎部沉降，上清液中主要含有目的蛋白。对此实验的蛋白含量和蛋白纯度进行量化的统计分析，结果如图8所示，在65℃～72℃处理蛋白粗提取物5mi n后，目的蛋白纯度达70％以上。
④进一步优化温度处理去除杂蛋白的条件，筛选不同的处理温度和不同的处理时间。设置65℃和70℃两种温度如图9所示、设置10min、30min、60min、90min和120min或180min不同处理时间，按照实施例5步骤③的操作进行沉降试验，结果如图9所示。统计计算得α-C蛋白在65℃高温中沉降30min后，杂蛋白去除率在85％以上，且靶蛋白含量损失较小；而在70℃高温中沉降10min即可去除大部分杂蛋白。
α-C蛋白表现出较高的热稳定性，而伴随的杂蛋白高温下不稳定。这为后续规模化生产，纯化提供了有利条件。蛋白只需要经过热处理，就可以获得较高纯度的目标蛋白，这一项将极大的改变目前经过N纯化的复杂工艺，同时节省的成本非常大。
实施例6小鼠免疫攻毒实验
如表1所示的分组分别选取6-7周龄、体重在20g左右的BALb/C小鼠，每组5只，于腹腔注射相应剂量实施例4中所制备的α-C蛋白，进行第一次免疫。在间隔21天后以相同的方法实施第二次免疫，然后在二免完成后的第15天进行攻毒实验。
攻毒实验方法：首先确定攻毒剂量，将实施例4中所制备的α毒素全长蛋白做不同浓度稀释，然后每种剂量(50μg、100μg、200μg、300μg、400μg、500μg)分别注射5只小鼠。注射后观察小鼠存活情况，最终确定300μg为半数致死剂量，故在后续试验中选用300ug做为攻毒剂量。具体攻毒方法：蛋白用BSA法定量后，取300μg实施例4中所制备的α毒素全长蛋白与佐剂混合(第一次攻毒预实验使用完全弗氏佐剂，第二次扩大攻毒实验使用不完全弗氏佐剂)，然后按照表1所示的分组分别注射腹腔注射免疫组和对照组即可。
表1小鼠免疫攻毒实验表
Figure BDA0003542782990000101
结论：小鼠免疫和攻毒的实验结果如表1所示，将保护率和时间进行统计，如图10所示：本发明制备的α-C疫苗在第一次免疫攻毒预实验中保护率达到100％，在第二次免疫攻毒扩大试验中保护率达到70％。分析原因为：第二次免疫攻毒实验使用的蛋白批次不同于第一次使用的蛋白，纯度有不足，导致总免疫剂体积偏大(相同免疫剂量下，蛋白纯度低，则所需体积更大)；其次第二次免疫攻毒实验采用的佐剂为不完全弗氏佐剂，可能刺激过于强烈引起小鼠死亡。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 牧原食品股份有限公司
<120> 一种猪魏氏梭菌A型的亚单位疫苗及其制备
<130> MP21038409
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1113
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgggatggaa aaattgatgg aacaggaact catgctatga ttgtaactca aggggtttca 60
atcttagaaa atgatctgtc caaaaatgaa ccagaaagtg taagaaaaaa cttagagatt 120
ttaaaagaga acatgcatga gcttcaatta ggttctactt atccagatta tgataagaac 180
gcctatgatc tatatcaaga tcatttctgg gatcctgata cagataataa tttctcaaag 240
gataatagtt ggtatttagc ttattctata cctgacacag gggaatcaca aataagaaaa 300
ttttcagcat tagctagata tgaatggcaa agaggaaact ataaacaagc tacattctat 360
cttggagagg ctatgcacta ttttggagat atagatactc catatcatcc tgctaatgtt 420
actgccgttg atagcgcagg acatgttaag tttgagactt ttgcagagga aagaaaagaa 480
cagtataaaa taaacacagt aggttgcaaa actaatgagg atttttatgc tgatatctta 540
aaaaacaaag attttaatgc atggtcaaaa gaatatgcaa gaggttttgc taaaacagga 600
aaatcaatat actatagtca tgctagcatg agtcatagtt gggatgattg ggattatgca 660
gcaaaggtaa ctctagctaa ctctcaaaaa ggaacagcag gatatattta tagattctta 720
cacgatgtat cagagggtaa tgatccatca gttggcaaga atgcaaaaga actagtagct 780
tacatatcaa ctagtggtga aaaagatgct ggaacagatg actacatgta ttttggaatc 840
aaaacaaagg atggaaaaac tcaagaatgg gaaatggaca acccaggaaa tgactttatg 900
actggaagta aagacactta tactttcaaa ttaaaagatg aaaatctaaa aattgatgat 960
atacaaaata tgtggattag aaaaagaaaa tatacagcat tcccagatgc ttataagcca 1020
gaaaacataa aggtaatagc aaatggaaaa gttgtagtgg acaaagatat aaatgagtgg 1080
atttcaggaa attcaactta taatataaaa taa 1113
<210> 2
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgggatggaa aaattgatgg aacaggaact catgctatga ttgtaactca aggggtttca 60
atcttagaaa atgatctgtc caaaaatgaa ccagaaagtg taagaaaaaa cttagagatt 120
ttaaaagaga acatgcatga gcttcaatta ggttctactt atccagatta tgataagaac 180
gcctatgatc tatatcaaga tcatttctgg gatcctgata cagataataa tttctcaaag 240
gataatagtt ggtatttagc ttattctata cctgacacag gggaatcaca aataagaaaa 300
ttttcagcat tagctagata tgaatggcaa agaggaaact ataaacaagc tacattctat 360
cttggagagg ctatgcacta ttttggagat atagatactc catatcatcc tgctaatgtt 420
actgccgttg atagcgcagg acatgttaag tttgagactt ttgcagagga aagaaaagaa 480
cagtataaaa taaacacagt aggttgcaaa actaatgagg atttttatgc tgatatctta 540
aaaaacaaag attttaatgc atggtcaaaa gaatatgcaa gaggttttgc taaaacagga 600
aaatcaatat actatagtca tgctagcatg agtcatagtt gggatgattg ggattatgca 660
gcaaaggtaa ctctagctaa ctctcaaaaa ggaacagcag gatatattta tagattctta 720
cacgatgtat cagagggt 738
<210> 3
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aatgatccat cagttggcaa gaatgcaaaa gaactagtag cttacatatc aactagtggt 60
gaaaaagatg ctggaacaga tgactacatg tattttggaa tcaaaacaaa ggatggaaaa 120
actcaagaat gggaaatgga caacccagga aatgacttta tgactggaag taaagacact 180
tatactttca aattaaaaga tgaaaatcta aaaattgatg atatacaaaa tatgtggatt 240
agaaaaagaa aatatacagc attcccagat gcttataagc cagaaaacat aaaggtaata 300
gcaaatggaa aagttgtagt ggacaaagat ataaatgagt ggatttcagg aaattcaact 360
tataatataa aataa 375
<210> 4
<211> 371
<212> PRT
<213> Clostridium perfringens
<400> 4
Met Trp Asp Gly Lys Ile Asp Gly Thr Gly Thr His Ala Met Ile Val
1 5 10 15
Thr Gln Gly Val Ser Ile Leu Glu Asn Asp Leu Ser Lys Asn Glu Pro
20 25 30
Glu Ser Val Arg Lys Asn Leu Glu Ile Leu Lys Glu Asn Met His Glu
35 40 45
Leu Gln Leu Gly Ser Thr Tyr Pro Asp Tyr Asp Lys Asn Ala Tyr Asp
50 55 60
Leu Tyr Gln Asp His Phe Trp Asp Pro Asp Thr Asp Asn Asn Phe Ser
65 70 75 80
Lys Asp Asn Ser Trp Tyr Leu Ala Tyr Ser Ile Pro Asp Thr Gly Glu
85 90 95
Ser Gln Ile Arg Lys Phe Ser Ala Leu Ala Arg Tyr Glu Trp Gln Arg
100 105 110
Gly Asn Tyr Lys Gln Ala Thr Phe Tyr Leu Gly Glu Ala Met His Tyr
115 120 125
Phe Gly Asp Ile Asp Thr Pro Tyr His Pro Ala Asn Val Thr Ala Val
130 135 140
Asp Ser Ala Gly His Val Lys Phe Glu Thr Phe Ala Glu Glu Arg Lys
145 150 155 160
Glu Gln Tyr Lys Ile Asn Thr Val Gly Cys Lys Thr Asn Glu Asp Phe
165 170 175
Tyr Ala Asp Ile Leu Lys Asn Lys Asp Phe Asn Ala Trp Ser Lys Glu
180 185 190
Tyr Ala Arg Gly Phe Ala Lys Thr Gly Lys Ser Ile Tyr Tyr Ser His
195 200 205
Ala Ser Met Ser His Ser Trp Asp Asp Trp Asp Tyr Ala Ala Lys Val
210 215 220
Thr Leu Ala Asn Ser Gln Lys Gly Thr Ala Gly Tyr Ile Tyr Arg Phe
225 230 235 240
Leu His Asp Val Ser Glu Gly Asn Asp Pro Ser Val Gly Lys Asn Ala
245 250 255
Lys Glu Leu Val Ala Tyr Ile Ser Thr Ser Gly Glu Lys Asp Ala Gly
260 265 270
Thr Asp Asp Tyr Met Tyr Phe Gly Ile Lys Thr Lys Asp Gly Lys Thr
275 280 285
Gln Glu Trp Glu Met Asp Asn Pro Gly Asn Asp Phe Met Thr Gly Ser
290 295 300
Lys Asp Thr Tyr Thr Phe Lys Leu Lys Asp Glu Asn Leu Lys Ile Asp
305 310 315 320
Asp Ile Gln Asn Met Trp Ile Arg Lys Arg Lys Tyr Thr Ala Phe Pro
325 330 335
Asp Ala Tyr Lys Pro Glu Asn Ile Lys Val Ile Ala Asn Gly Lys Val
340 345 350
Val Val Asp Lys Asp Ile Asn Glu Trp Ile Ser Gly Asn Ser Thr Tyr
355 360 365
Asn Ile Lys
370

Claims (11)

1.编码猪魏氏梭菌α毒素的核酸，其特征在于，具有如SEQ ID NO:1所SE示的核苷酸序列。
2.编码猪魏氏梭菌α毒素片段的核酸，其特征在于，具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
3.一种载体，其特征在于，包括骨架载体和权利要求1或2所述的核酸。
4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，所述骨架载体上不包括编码GST蛋白的核酸。
5.转化了权利要求3所述载体的重组宿主。
6.根据权利要求5所述的重组宿主，其特征在于，所述宿主为大肠杆菌。
7.猪魏氏梭菌α毒素片段的制备方法，其特征在于，包括：培养权利要求5所述的重组宿主获得含猪魏氏梭菌α毒素片段的培养物、破碎培养物获得含所述蛋白的粗提取物。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，还包括纯化所述的蛋白粗提取物；
所述纯化方法包括Ni-NTA亲和层析法；
或者，所述纯化方法包括高温沉降法，所述沉降的温度为60℃～75℃。
9.权利要求1或2所述的核酸或其编码的蛋白、权利要求3所述载体、权利要求5所述的宿主和/或权利要求7所述方法制得的α毒素片段在制备猪魏氏梭菌疫苗中的应用。
10.一种猪魏氏梭菌疫苗，其特征在于，包括权利要求1或2所述核酸编码的蛋白和佐剂。
11.根据权利要求10所述的猪魏氏梭菌疫苗，其特征在于，所述佐剂为弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂。
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