CN113683707B - 一种抗原融合蛋白及其编码基因和应用 - Google Patents

一种抗原融合蛋白及其编码基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗原融合蛋白及其编码基因和应用。该抗原融合蛋白包括通过连接肽连接的维氏气单胞菌LamB蛋白、拟态弧菌TolC蛋白和鮰爱德华氏菌OmpN3，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明制备了BL21(DE3)‑pET30a‑LamB‑TolC‑OmpN3表达菌株，通过培养该菌株，可获得同时具备3种细菌的抗原融合蛋白，获得的蛋白易于纯化，产量高且稳定性好，可用于后续三联亚单位疫苗和诊断试剂盒开发。

Description

一种抗原融合蛋白及其编码基因和应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种抗原融合蛋白及其编码基因和应用。
背景技术
维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)，属气单胞菌科，气单胞菌属，是一种革兰氏阴性短杆菌。该菌是一种机会性人鱼共患致病菌，是水生动物疾病常见的致病菌。拟态弧菌(Vibrio mimicus)，属弧菌科、弧菌属，是一种革兰氏阴性弧菌菌，也是一种人鱼共患病，可感染多种经济鱼类，包括：草鱼(Ctenopharyngodon idella)、黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)、南方鲇(Silurus meridionalis)、锦鲤(Cyprinus carpio)等。由V.mimicus感染引起鱼病的死亡率高是制约水产养殖业发展的瓶颈。鮰爱德华氏菌(Edwardsiellaictaluri)属肠杆菌科，爱德华氏菌属，是一种革兰氏阴性短杆菌。该菌首次分离至患病斑点叉尾鮰，之后主要在鲇形目中爆发，对一些非鲶形目鱼类也具有致病性。目前这三种菌仍是引起水生动物疾病，造成鱼体死亡的重要病原。开发这三种菌的诊断方法和疫苗对于保障水生动物绿色健康发展具有重要意义。
外膜蛋白(Out membrane protein,Omp)是革兰氏阴性菌外膜的重要组成成分，主要参与了维持菌体结构、物质运转以及对宿主的致病致病等过程。由于Omp通常直接暴露于宿主的免疫系统中，易于被免疫系统识别而产生有效的免疫反应，因此Omp被认为是开发诊断方法和渔用疫苗的候选材料。麦芽糖孔蛋白(LamB)是A.veronii重要的粘附相关毒力因子，重组蛋白LamB具有较好的免疫原性和保护作用，是A.veronii外膜蛋白基因工程疫苗的候选蛋白。易位蛋白(TolC)是V.mimicus外膜蛋白中将各种极性分子(包括氨基酸、蛋白质、糖类和离子)转位通过膜(包括质膜和细胞器膜)的一类蛋白质，具有保守性好，抗原性强的特点。外膜蛋白OmpN3(outer membrane protein N3)是E.ictaluri表面蛋白中保守性好，抗原性强的一种蛋白，可作为E.ictaluri基因工程疫苗的候选蛋白。这三种蛋白均被认为具有良好的保守性和抗原性，可作为疫苗候选。因此，融合这三种蛋白将对三联疫苗具有重要意义。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种抗原融合蛋白及其编码基因和应用，本发明制备得到的蛋白产量高、成本低、操作简单、免疫原性好可为三联亚单位疫苗的研发的蛋白候选。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种抗原融合蛋白，该抗原融合蛋白包括通过连接肽连接的维氏气单胞菌LamB蛋白、拟态弧菌TolC蛋白和鮰爱德华氏菌OmpN3，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，维氏气单胞菌LamB蛋白、拟态弧菌TolC蛋白和鮰爱德华氏菌OmpN3之间的连接肽的氨基酸序列为：GGGSGGGS。
一种编码上述抗原融合蛋白的基因，该基因为经大肠杆菌密码子优化后的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，基因的5’设计有酶切位点Nde I(CATATG)，基因的3’端设计有酶切位点Hind III(AAGCTT)。
一种质粒，包括上述基因。
一种菌株，包括上述基因，或质粒。
一种三联疫苗，包括上述抗原融合蛋白。
一种诊断试剂盒，包括上述抗原融合蛋白诱导产生的特异性抗体。
上述蛋白的制备方法如下：
(1)通过生物信息学分析，对每个外膜蛋白分别截取抗原决定簇集中的基因片段，获得抗原决定簇丰富的三个基因片段tLamB、tTolC和tOmpN3；
(2)对tLamB、tTolC和tOmpN3添加2段linker，将三种基因串联形成串联基因tLamB-linker-tTolC-linker-tOmpN。
(3)根据融合基因序列，采用铭研生物最新开发的密码子优化软件MaxCodon TMOptimization Program(V13)对tLamB-linker-tTolC-linker-tOmpN进行碱基序列进行优化。
(4)在优化后融合碱基序列的5’端加上在设计限制性酶切位点Nde I(CATATG)，3’端加上设计限制性酶切位点Hind III(AAGCTT)。
(5)人工合成Nde I-tLamB-tTolC1-linker-tTolC2-linker-tOmpN-Hind III DNA片段，并将该片段连接到pET30表达载体中，构建形成pET30a-LamB-TolC-OmpN3表达质粒
(6)将pET30a-LamB-TolC-OmpN3转化入BL21(DE3)感受态细胞中，获得表达菌株：BL21(DE3)-pET30a-LamB-TolC-OmpN3
(7)BL21(DE3)-pET30a-LamB-TolC-OmpN3使用IPTG诱导表达，SDS-PAGE检测LamB-TolC-OmpN3表达产物。
(8)扩大培养BL21(DE3)-pET30a-LamB-TolC-OmpN3，收集菌体进行超声破碎，离心分离上清和包涵体沉淀。
(9)上清和沉淀分别使用Ni-IDA经常纯化并优化咪唑洗脱浓度。
(10)质检纯化蛋白LamB-TloC-OmpN3，包括：稳定性测试，浓度测定和WesternBlot检测。
本发明的有益效果：
本发明制备了BL21(DE3)-pET30a-LamB-TolC-OmpN3表达菌株，通过培养该菌株，可获得同时具备3种细菌的抗原融合蛋白，获得的蛋白易于纯化，产量高且稳定性好，可用于后续三联亚单位疫苗和诊断试剂盒开发。
附图说明
图1为pET30a-LamB-TolC-OmpN3表达载体重组质粒的构建示意图；
图2为pET30a-LamB-TolC-OmpN3重组表达质粒的鉴定结果图；
图3为表达蛋白的SDS-PAGE图；其中0：未诱导表达BL21(DE3)-pET30a-LamB-TolC-OmpN3产物；1：15℃诱导16h；2：37℃诱导16h；M：蛋白Marker:160、120、70、50、40、35、25、20、10kDa(由上至下)。
图4为表达菌株上清纯化结果的SDS-PAGE图；其中M：蛋白Marker:160、120、70、50、40、35、25、20、10kDa(由上至下)，1：全菌破碎离心后上清；2：上清同Ni-IDA作用后的流出液；3:50mM咪唑的洗脱组分；4:100mM咪唑的洗脱组分；5和6：500mM咪唑的洗脱组分；
图5为表达菌株包涵体纯化结果的SDS-PAGE图；其中M：蛋白Marker:160、120、70、50、40、35、25、20、10kDa(由上至下)，1：包涵体溶解离心后的上清；2：上清同Ni-IDA作用后的流出液；3-6:50mM咪唑的洗脱组分；7-10:100mM咪唑的洗脱组分；
图6为LamB-TloC-OmpN3蛋白纯度与浓度测定SDS-PAGE图；其中M：蛋白Marker:160、120、70、50、40、35、25、20、10kDa(由上至下)；1：BSA；2：LamB-TloC-OmpN3纯化蛋白；
图7为LamB-TloC-OmpN3 Western Blot检测图；其中M：蛋白Marker:160、120、70、50、40、35、20、10kDa(由上至下)；1：BSA；2：LamB-TloC-OmpN3纯化蛋白。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
实施例1 BL21(DE3)-pET30a-LamB-TloC-OmpN3表达菌株的构建
根据GenBank中已报道的LamB、TolC、OmpN3基因的序列(GenBank登录号：维氏气的单胞菌-Lamb CP012504.1:c3971056-3969743、拟态弧菌-TolC DQ296639.1、鮰爱德华氏菌-ompN3 KJ831564.1)，利用抗原表位预测在线分析网址(http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl)分析三个基因编码氨基酸的抗原决定簇区域，选取抗原决定簇丰富的区域，LamB(碱基序列从70-450，氨基酸序列从24-150)、TolC(碱基序列从67-567，氨基酸序列从23-189)、OmpN3(碱基序列从691-1050，氨基酸序列从231-350)。并在融合基因的中间加入2段linker序列氨基酸(GGGGSGGGGS)，5’端加上在设计限制性酶切位点Nde I(CATATG)，3’端加上设计限制性酶切位点Hind III(AAGCTT)。
采用密码子优化软件MaxCodonTM Optimization Program(V13)对融合蛋白碱基序列进行优化，采用全基因合成优化后的序列LamB-TloC-OmpN3(见序列)。将合成的LamB-TloC-OmpN3通过限制性酶切位点NdeI和HindIII与表达载体pET30a连接，连接体系如下(表1，图1)：
表1 T4连接酶连接反应体系
Figure BDA0003258445860000051
将连接产物转化至Top10克隆菌株中，具体步骤如下：
(1)将10μL连接产物加入50μL Top10克隆菌株中(注：加入液面以下，勿吹打)，然后迅速轻旋转EP管两周，立即置于冰上冰浴30min；
(2)冰浴完成后转入42℃水浴中热激90s(注：不超过90s)，再置于冰上3-5min；
(3)转化完成后，在超净工作台中向反应管中加入940μL LB肉汤，37℃，180r/min震荡培养90min；冷冻离心机4℃，12000r/min离心后去700μL上清液取300μL菌液铺于Kana-LB(含50μg/mL的硫酸卡那霉素)琼脂平板上，37℃培养12-16h。次日挑取单个菌株，培养在Kana-LB肉汤中，一部分用于保菌，抽提质粒，通过酶切鉴定和测序鉴定正确的菌株，命名为Top10-pET30a-LamB-TloC-OmpN3，置于10％甘油中-20℃下保存。(酶切鉴定体系件表2，结果见图2)
表2酶切反应体系和反应程序
Figure BDA0003258445860000061
将测序鉴定正确Top10-pET30a-LamB-TloC-OmpN3接种于10mL LB肉汤中，过夜培养后，提取质粒pET30a-LamB-TloC-OmpN3并转化入BL21(DE3)感受态细胞，从转化的平板中挑选单克隆BL21(DE3)-pET30a-LamB-TloC-OmpN3，接种到4mL的LB培养基中(含50μg/mL的硫酸卡那霉素)，待培养至OD600为0.5-0.8，向试管培养液中加入终浓度0.2mM IPTG，之后分别置于15℃、37℃诱导表达。(酶切鉴定见图2)
取诱导后的培养液12000rpm离心5min，去除上清液，加入PBS液重悬沉淀，最后加入SDS-PAGE上样缓冲液于100℃下加热样品10min，然后离心取上清电泳。160V稳压电泳至溴酚蓝带迁移至离凝胶底部1cm，取出凝胶利用蛋白凝胶快速处理系统染脱色(蛋白表达见图3)。
实施例2 LamB-TloC-OmpN3大量表达与纯化
含Kana的LB液体培养基中，37℃振荡培养BL21(DE3)-pET30a-LamB-TloC-OmpN3培养约5-6h至菌液OD600值达到0.8，加入IPTG＝0.2mM，15℃诱导16h后离心收集菌体。共培养12L。
全菌采用20mM PB(pH7.2)，300mM NaCl，20mM Imidazole含1％Triton X-100，1mMDTT，1mM PMSF超声裂解，4℃,12000r/min离心10min，分别将表达蛋白可溶部分和包涵体溶解液溶解部分用镍离子柱亲和层析纯化。
上清纯化：以20mM PB(pH7.2)，300mM NaCl，20mM咪唑缓冲液平衡Ni-IDA亲和层析柱，上样上清后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE分析检测结果显示：LamB-TloC-OmpN3蛋白表达不在上清中，分析结果见图4。
包涵体纯化：以20mM PB(pH7.2)，300mM NaCl含1％Triton X-100，2mM EDTA，5mMDTT洗涤后，以20mM PB(pH7.2)，300mM NaCl，8M Urea，20mM咪唑缓冲液溶解包涵体。将溶解的包涵体上样至已平衡的Ni-IDA柱，用不同浓度咪唑洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE分析检测结果显示：LamB-TloC-OmpN3蛋白表达在包涵体中，50mM咪唑洗脱蛋白纯度较高，分析结果见图5。
包涵体复性：收集Lane 3-6，将其加入到处理后的透析袋中，4℃环境下，透析到缓冲液[1×PBS(pH7.4)，4mM GSH，0.4mM GSSG，0.4M L-Arginine，1M Urea]中复性，复性后LamB-TloC-OmpN3蛋白最终透析于储存液1×PBS(pH7.4)溶液约6-8h。透析复性结束后，上清用0.22μm滤器过滤后分装，并将其冻存至-80℃。
实施例3 LamB-TloC-OmpN3质检
1、蛋白稳定性测试(冻融实验)
取一支冻于-80℃的LamB-TloC-OmpN3蛋白，放置于冰水浴中5-10min待其缓慢融化，融化后放置于4℃冰箱内0.5h，无异常现象，说明蛋白冻融实验是正常的。
2、LamB-TloC-OmpN3蛋白浓度与纯度测定
测定蛋白浓度采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒，以BSA为标准品，结果显示：蛋白浓度为0529mg/mL。根据SDS-PAGE胶R250染色结果显示蛋白纯度＞90％(图6)。
3、LamB-TloC-OmpN3蛋白反应原性分析
WB实验操作流程参考《蛋白质电泳实验技术》郭尧君著，以anti-His为抗体，结果显示LamB-TloC-OmpN3融合了His，能被Anti-His抗体识别(图7)。
4、LamB-TloC-OmpN3蛋白免疫原性分析
选取5只6-8周龄雌性BALB/c小鼠，将LamB-TolC-OmpN3蛋白与弗氏佐剂混合免疫，按皮下注射50μg/只进行免疫，2-3周加强免疫一次。采血检测，通过间接ELISA方法确定抗血清针对LamB-TolC-OmpN3蛋白的效价。结果显示：LamB-TolC-OmpN3蛋白3免后鼠抗LamB-TolC-OmpN3血清效价在81K左右(表1)，表明LamB-TloC-OmpN3具有较好的免疫原性，可作为疫苗的候选蛋白。
表1三免后鼠抗LamB-TolC-OmpN3血清间接ELISA结果
Figure BDA0003258445860000091
                         序列表
<110>  内江师范学院
<120>  一种抗原融合蛋白及其编码基因和应用
<160>  2
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  444
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  1
His Met Val Asp Phe His Gly Tyr Phe Arg Ser Gly Val Gly Val Ser
1               5                   10                  15
Gly Asp Gly Asp Met Val Lys Tyr Asn Val Asn Lys Val Gly Arg Leu
            20                  25                  30
Gly Asn Glu Asn Asp Thr Tyr Gly Glu Val Gln Leu Gly Gln Glu Val
        35                  40                  45
Phe Asn Lys Asp Gly Lys Thr Phe Tyr Val Asp Ser Met Phe Ala Met
    50                  55                  60
Ala Ser Asn Gly Ser Asn Asp Trp Glu Gly Thr Gly Thr Val Cys Asn
65                  70                  75                  80
Phe Asp Ala Lys Gln Cys Asn Gly Asp Ser Asp Phe Ala Leu Arg Gln
                85                  90                  95
Phe Asn Val Gln Ala Lys Gly Leu Leu Asn Phe Ala Pro Glu Ala Thr
            100                 105                 110
Leu Trp Ala Gly Lys Arg Tyr Tyr Gln Arg His Asp Ile His Ile Ser
        115                 120                 125
Asp Glu Asn Leu Ala Glu Ile Tyr Asn Gln Ala Lys Asp Asn Asp Pro
    130                 135                 140
Gln Leu Leu Ser Val Ala Ala Gln Arg Asp Ala Ala Phe Glu Ala Val
145                 150                 155                 160
Thr Ser Ser Arg Ser Thr Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
                165                 170                 175
Ser Leu Pro Gln Ile Asn Leu Thr Ala Gly Tyr Asn Val Asn Arg Ser
            180                 185                 190
Asp Gln Asp Pro Arg Glu Ser Asp Leu Phe Ser Ala Gly Ile Asn Phe
        195                 200                 205
Ser Gln Glu Leu Tyr Gln Arg Ser Ser Trp Val Thr Leu Asp Thr Ala
    210                 215                 220
Glu Lys Lys Ala Arg Gln Ala Asp Ser Glu Tyr Ala Ala Thr Gln Gln
225                 230                 235                 240
Gly Leu Ile Leu Arg Val Ser Lys Ala Tyr Phe Glu Val Leu Arg Ala
                245                 250                 255
Gln Asp Asn Leu Glu Phe Val Arg Ala Glu Lys Ala Ala Val Gly Arg
            260                 265                 270
Gln Leu Glu Gln Thr Lys Gln Arg Phe Glu Val Gly Leu Ser Ala Ile
        275                 280                 285
Thr Asp Val His Asp Ala Gln Ala Gln Tyr Asp Gly Val Leu Ala Asp
    290                 295                 300
Glu Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn His Asn Val
305                 310                 315                 320
Tyr Leu Ala Ala Ile Tyr Gly Glu Val Lys Asn Met His Tyr Ile Gly
                325                 330                 335
Lys Gln Asp Arg Phe Ala Pro Lys Ala Arg Gly Tyr Glu Leu Leu Ala
            340                 345                 350
Gln Tyr Gln Phe Asp Cys Gly Leu Lys Pro Ser Leu Ala Tyr Leu Asn
        355                 360                 365
Gly Thr Ala Lys Asp Leu Lys Gly Asn Ala Ser Ser Asn Gln Thr Tyr
    370                 375                 380
Val Lys Phe Ile Asp Leu Ala Thr Thr Tyr Ser Phe Asn Lys Asn Leu
385                 390                 395                 400
Ala Leu Ile Phe Glu Tyr Lys Ile Asn Leu Leu Asp Asp Asn Thr Phe
                405                 410                 415
Thr Arg Asn Asn Gly Ile Ser Thr Asp Asp Val Phe Val Thr Met Leu
            420                 425                 430
Asn Tyr Lys Phe His His His His His His
        435                 440
<210>  2
<211>  1338
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  2
catatggtgg actttcacgg ttattttcgt agcggcgttg gcgtttctgg cgacggcgat  60
atggttaaat acaacgtcaa caaagtcggc cgtctgggta acgaaaacga tacctacggc 120
gaagtccagc tgggtcagga agtcttcaac aaagacggca aaaccttcta cgtcgactcc 180
atgttcgcaa tggcaagcaa cggtagtaac gattgggaag gtaccggcac cgtttgcaat 240
tttgacgcca aacagtgcaa cggcgatagc gattttgcac tgcgtcagtt taacgttcag 300
gcgaaaggcc tgctgaattt tgcaccggaa gctaccctgt gggcaggtaa acgttactat 360
cagcgtcacg acatccatat cagcgacgaa aacctggcgg aaatctacaa ccaggcgaaa 420
gacaacgatc cgcaactgct gtctgttgct gctcaacgtg atgcagcgtt tgaagcagtt 480
accagtagtc gtagtaccct gggcggcggc ggttctggcg ggggcggttc actgccgcaa 540
attaatctga ccgcgggcta taacgttaat cgttctgatc aggatccgcg cgaatctgac 600
ctgttttctg cgggcattaa ctttagccag gaactgtatc agcgcagtag ttgggttacc 660
ctggataccg cggagaaaaa agcgcgtcaa gcagatagcg aatacgcagc aacccaacaa 720
ggtctgatcc tgcgcgttag caaagcgtac ttcgaagttc tgcgcgcaca agataacctg 780
gaattcgttc gtgcagaaaa agcagcagtt ggtcgtcaac tggaacagac caaacagcgc 840
ttcgaagttg gtctgagcgc tattaccgac gttcatgatg cgcaagcaca atacgacggc 900
gttctggcag atgaagttgg cggcggcggt tctggtggcg gcggtagtaa ccataacgtt 960
tatctggcgg cgatttacgg cgaagtcaaa aacatgcact acatcggcaa acaggatcgc 1020
tttgcaccga aagcacgcgg ttacgaactg ctggcacagt atcagttcga ttgcggtctg 1080
aaaccgagtc tggcatatct gaacggtacc gcgaaagatc tgaaaggtaa cgcaagcagc 1140
aaccagacct acgtcaaatt catcgatctg gcgaccacct acagcttcaa caaaaacctg 1200
gcgctgatct tcgagtacaa aatcaacctg ctggacgaca acacctttac ccgtaacaac 1260
ggcatcagta ccgacgacgt tttcgttacc atgctgaact acaaattcca ccaccaccac 1320
caccactaat gaaagctt                                               1338

Claims (5)

1.一种抗原融合蛋白，其特征在于，所述抗原融合蛋白包括通过连接肽连接的维氏气单胞菌LamB蛋白、拟态弧菌TolC蛋白和鮰爱德华氏菌OmpN3，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种编码权利要求1所述抗原融合蛋白的基因，其特征在于，所述基因为经大肠杆菌密码子优化后的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种质粒，其特征在于，包括权利要求2所述的基因。
4.一种菌株，其特征在于，包括权利要求2所述的基因，或权利要求3所述的质粒。
5.一种疫苗，其特征在于，包括权利要求1所述抗原融合蛋白。
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