CN111777683A

CN111777683A - 神经坏死病毒MCP与鮰爱德华氏菌ompN1的融合蛋白及其制备方法

Info

Publication number: CN111777683A
Application number: CN201910407330.5A
Authority: CN
Inventors: 王大勇; 张转丹; 裴业春
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2019-04-03
Filing date: 2019-05-16
Publication date: 2020-10-16

Abstract

现有商品化鱼类神经坏死病毒疫苗须经注射接种。本发明涉及一种神经坏死病毒（Nervous necrosis virus）主要外壳蛋白（MCP）与鮰爱德华氏菌（Edwarsiella ictaluri）中具有跨膜作用的外膜蛋白1（ompN1）的基因重组融合蛋白MCP‑ompN1，及其表达和制备方法。MCP与ompN1蛋白通过四个氨基酸“GGGS”构成的序列柔性连接。本发明首先针对BL21‑DE3工程菌株的密码子偏好性对编码MCP‑ompN1的核苷酸序列加以优化，然后构建表达质粒并在BL21‑DE3菌株中表达，再经过菌体破碎，包涵体处理，蛋白质复性，镍柱纯化，用生物素标记的凝血酶切除组蛋白标签，利用亲和素树脂除掉凝血酶等步骤分离纯化出MCP‑ompN1融合蛋白。基因重组MCP‑ompN1融合蛋白可作为神经坏死病毒疫苗抗原、或神经坏死病毒与鮰爱德华氏菌疫苗抗原，其中的ompN1蛋白介导黏膜免疫作用。

Description

神经坏死病毒MCP与鮰爱德华氏菌ompN1的融合蛋白及其制备方法

技术领域

本发明属于基因工程领域。具体涉及DNA及蛋白质一级结构、表达载体的构建和表达、以及蛋白质的分离和纯化。

背景技术

病毒性神经坏死病是我国东南沿海地区，特别是在海南最常见、危害也最大的传染病，常导致大批石斑鱼鱼苗和幼体发病死亡。该传染病具有典型的神经症状，使鱼类中枢神经和视网膜组织出现空泡坏死病变，并表现出游动异常。病鱼除了神经异常外，无其它临床病症，体表及体内也无明显的病理变化或寄生虫寄生。该病可通过鱼卵垂直传播，也可经养殖水体水平传播。来自受感染亲本的垂直传播是鱼苗感染的主要途径。各种石斑鱼以及不同日龄的石斑鱼均易感，但对幼体的危害更加严重。该病具有明显的季节性，通常每年的4-8月份为发病高峰期。

神经坏死病毒(Nervous necrosis virus，NNV)属于罗达病毒科，主要由衣壳和核心两部分组成，无囊膜。衣壳由180个衣壳蛋白亚单位组成。病毒基因组大小约4.5kb，主要由RNA1和RNA2两条单链正义RNA组成，两条核酸链在5’端都有帽子结构，但没有多聚腺苷酸尾。其中RNA2分子量约1.3-1.4kb，编码病毒核衣壳蛋白的前体；RNA1分子量约3.0-3.2kb，主要编码非结构的A蛋白，即RNA依赖性RNA聚合酶，参与复制RNA1和RNA2的复制。病毒的主要衣壳蛋白(Major capsid protein，MCP)包含该病毒的主要原决定簇，参与激活鱼体内的抗原-抗体免疫反应。目前VNN病毒疫苗须经注射接种才能发挥有效的预防作用，目前尚无通过黏膜免疫，例如浸泡或投饲，实现有效预防接种的基因工程疫苗及抗原。

鮰爱德华氏菌(Edwarsiella ictaluri)属于肠杆菌科爱德华氏菌属的一种G-短杆菌。该菌是水生动物的常见高致死率的致病菌，其在鱼类中主要引起斑点叉尾鮰肠型败血症。研究表明，它可以通过胃肠道、鳃、皮肤等粘膜组织或鼻孔进入鱼体。该菌编码的外膜蛋白N(ompN)参与细菌的粘附和侵袭，其中的ompN1蛋白参与了鞭毛在内膜和外膜之间的肽聚糖层的锚定，并且参与细胞的识别和蛋白信号的转导，在鮰爱德华氏菌的跨粘膜致病机制中发挥重要作用。具体作用为：(1)参与粘附，在大多数感染中，病原菌只有吸附在宿主上才能致病；(2)帮助细菌跨越宿主的粘膜防御屏障；(3)帮助细菌逃避宿主免疫系统的免疫防御机制。因为ompN1蛋白所发挥的跨黏膜免疫作用，所以鮰爱德华氏菌疫苗可以通过浸泡的方法接种。

发明内容

1.发明的目的

本发明利用基因工程方法制备一种神经坏死病毒主要外壳蛋白MCP与鮰爱德华氏菌外膜蛋白ompN1的融合蛋白。MCP-ompN1融合蛋白可用作神经坏死病毒疫苗抗原、也可用做神经坏死病毒与鮰爱德华氏菌疫苗的抗原，其中的ompN1蛋白介导黏膜免疫作用。

2.发明的技术方案

一、从NCBI Genbank中分别获得编码神经坏死病毒MCP蛋白及鮰爱德华氏菌ompN1蛋白的基因序列。依据原核生物密码子偏嗜性优化设计编码MCP与ompN1融合蛋白的cDNA序列；编码MCP和ompN1蛋白的cDNA通过编码柔性连接氨基酸序列“GGGS”的cDNA相连。

二、人工合成5′端带有BamHI酶切位点、3′端带有SalI酶切位点的BamHI-MCP-ompN1-SalI双链cDNA。

三、利用BamHⅠ和SalⅠ限制性内切酶分别双酶切BamHI-MCP-ompN1-SalIcDNA以及带有His标签的pET-28a载体产生利用粘性连接末端。再通过凝胶电泳以及胶回收得到带有粘性末端的cDNA和pET-28a质粒片段。

四、用T4连接酶构将切出粘性末端的BamHI-MCP-ompN1-SalI cDNA与pET-28a质粒片段相连接，构建出原核表达基因重组MCP-ompN1融合蛋白的完整pET-28a质粒，质粒图谱参见图2。

五、将构建好的质粒转入大肠杆菌菌株BL21-DE3，诱导表达。

六、破碎菌体，收集包涵体并洗涤。再破碎和溶解包涵体，调整蛋白浓度至0.1-1.0mg/mL，依次用6M脲素、4M脲素、2M脲素和PBS缓冲液进行梯度透析复性，然后用超滤管进行浓缩，得到复性后的MCP-ompN1融合蛋白的溶液。

七、利用镍(Ni)柱纯化MCP-ompN1融合蛋白。

3.发明的有益效果

本发明利用基因工程方法制备神经坏死病毒主要外壳蛋白MCP与鮰爱德华氏菌外膜蛋白ompN1的融合蛋白，作为一种新型的神经坏死病毒疫苗抗原、或神经坏死病毒与鮰爱德华氏菌疫苗抗原，其中的ompN1蛋白介导黏膜免疫作用。

附图说明

图1.基因重组MCP-ompN1pET-28a表达质粒图谱，其中BamHI和SalI之间的红色标记为融合蛋白MCP-ompN1。

图2.基因重组MCP-ompN1pET-28a表达质粒的双酶切鉴定。M：DNA分子量标记；泳道1：由BamHI、SalI双酶切基因重组MCP-ompN1pET-28a表达质粒产物的电泳图谱；泳道2：pET-28a空载体双酶切对照。

图3.基因重组MCP-ompN1pET-28a表达质粒中MCP-ompN1编码链(正义链)1～364nt测序结果，1-3nt为起始密码子ATG。

图4.基因重组MCP-ompN1pET-28a表达质粒中MCP-ompN1编码链(正义链)的365～728nt测序结果，364nt。

图5.基因重组MCP-ompN1pET-28a表达质粒中MCP-ompN1模板链(反义链)的729～1092nt反向测序结果，364nt。

图6.基因重组MCP-ompN1pET-28a表达质粒中MCP-ompN1模板链(反义链)的1093～1456nt nt反向测序结果，364nt。

图7.基因重组MCP-ompN1pET-28a表达质粒中MCP-ompN1模板链(反义链)的1457～1820nt反向测序结果，364nt。

图8.基因重组MCP-ompN1pET-28a表达质粒中MCP-ompN1模板链(反义链)的1821～2205nt反向测序结果，385nt。

图9.基因重组MCP-ompN1融合蛋白表达及纯化结果。MCP-ompN1pET-28a重组质粒在BL21-DE3工程菌中表达后，经超声破碎，包涵体复性及纯化后，经SDS-PAGE(10％Tris-Glycine胶)分离后，考马斯亮蓝R-250原位染色。M：蛋白分子量标记；泳道1:未诱导菌体裂解液；泳道2:诱导表达后菌体裂解液；泳道3:复性及纯化后的MCP-ompN1融合蛋白。

图10.纯化后的MCP-ompN1的Western blot检测图。M:蛋白分子量标记；A.用ompN1抗体检测MCP-ompN1融合蛋白。泳道1：ompN1蛋白对照；泳道2：MCP-ompN1融合蛋白。B.用MCP抗体检测MCP-ompN1融合蛋白。泳道1：MCP蛋白对照；泳道2：MCP-ompN1融合蛋白。MCP、ompN1及MCP-ompN1蛋白经SDS-PAGE(10％Tris-Glycine胶)分离后，转印到低荧光背景PVDF膜检测，一抗分别为抗ompN1抗体(A)或抗MCP抗体，二抗为Alexa488荧光标记羊抗鼠抗体，用Typhoon FLA 9500检测蛋白荧光条带。

具体实施方式

具体实施方式：本实施方式表达并分离纯化基因重组MCP-ompN1融合蛋白，按以下步骤进行：

1.根据原核表达体系中的密码子偏好性优化设计MCP-ompN1CDS序列，以适合在大肠杆菌BL21-DE3菌株中高效表达，CDS序列参见图3-8。以BamHI和SalI作为融合表达蛋白CDS序列的上下游两端的酶切位点，pET-28a载体自带His标签，再His标签与MCP-ompN1融合蛋白之间带有编码凝血酶底物序列“LVPRGS”的核苷酸序列。

2.用BamHI和SalI分别酶切CDS片段BamHI-MCP-link-ompN1-SalI和pET-28a空白载体。

3.用T4连接酶连接双酶切后的BamHI-MCP-link-ompN1-SalI片段和pET-28a载体，构建基因重组MCP-ompN1pET-28a表达质粒，图谱见图1，构建好的质粒经BamHI与SalI双酶切鉴定结果见图2。

4.在40℃水浴加热45s将重组质粒MCP-ompN1pET-28a转入大肠杆菌表达菌株BL21-DE3中，转化完成后立刻冰浴降温。菌体在37℃静止恢复1h，取50μL涂在卡那霉素抗性LB固体培养板，37℃倒置培养16h。挑选板上的单菌落，转转移到含有卡那霉素的250mL液体LB培养基中，37℃摇菌至OD₆₀₀数值为0.6，加入终浓度为0.2mM的IPTG，180rpm 37℃诱导表达4h。

5.处理包涵体及蛋白质复性

5.1将诱导表达的菌液以8,000rpm，4℃离心15min，弃去上清。用缓冲液A(50mMTris-HCl、1mM EDTA、100mM NaCl、1％Triton X-100，pH8.5)重悬，超声破碎：功率40％，工作5s，暂停3s，反复破碎13min。再以8,000rpm离心15min，将离心收集到的包涵体用PBS(pH7.4)缓冲液洗涤，离心，收集沉淀。

5.2将沉淀用缓冲液B(50mM Tris-HCl、1mM EDTA、100mM NaCl、1％Triton X-100、2M尿素，pH8.5)重悬，以与5.1同样的条件超声破碎5min；10,000rpm离心10min，弃上清，收集包涵体沉淀。

5.3用缓冲液C(50mM Tris-HCl、1mM EDTA、100mM NaCl、1％TritonX-100、2M盐酸胍，pH8.5)清洗包涵体沉淀，8,000rpm离心15min收集沉淀。

5.4用缓冲液D(50mM Tris-HCl、1mM EDTA、100mM NaCl、10mMβ-巯基乙醇/DTT、2mM脱氧胆酸钠、8M脲素，pH 8.5)溶解包涵体，缓慢摇动使其缓慢溶解，室温放置30min后8,000rpm离心15min，取上清；调节蛋白浓度在0.1-1.0mg/mL范围内。

5.5将浓度调整后的蛋白溶液装入透析袋，放置在分别在含6M脲素、4M脲素、2M脲素的复性缓冲液(50mM Tris-HCl、100mM NaCl、1％甘氨酸、5％甘油、0.2％PEG(分子量3550)、1mM氧化型谷胱甘肽、1mM还原型谷胱甘肽，pH 8.5)、以及PBS缓冲液中进行梯度透析复性。

6.pET-28a质粒带有编码His标签序列，表达出来的MCP-ompN1融合蛋白在N端带有His标签，可以用镍柱纯化，具体步骤如下：再生好的Ni柱用2倍体积25％乙醇洗过，再用2倍体积的去离子水冲洗。更换流动相为平衡缓冲液(50mMNaH₂PO₄、300mM NaCl、10mM咪唑,pH8.0)，平衡5个柱体积。用复性后的蛋白溶液上样，更换流动相为冲洗缓冲液(50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl、30mM咪唑，pH 8.0)，冲洗40个柱体积。更换流动相为洗脱液(50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl、250mM咪唑，pH 8.0)，收集洗脱出的带有His标签的MCP-ompN1融合蛋白。用分子量截留为3kD的超滤膜以3,000rpm离心浓缩，定量蛋白质浓度。

7.pET-28a质粒在BamHI酶切位点前与His标签之间带有编码凝血酶底物识别切割序列“LVPRGS”的核苷酸序列，可在体外用凝血酶切除His标签，具体步骤如下：将浓缩后的MCP-ompN1融合蛋白加入到含有凝血酶(带生物素标签)的酶切缓冲液中(20mM Tris-HCl、150mM NaCl、2.5mM CaCl₂，pH 8.4)，每1毫克MCP-ompN1融合蛋白需要0.04U生物素标记的凝血酶，4℃缓慢振荡过夜。

8.生物素标记凝血酶的去除：按照每单位生物素标记的凝血酶加入35μL50％混悬的亲和素琼脂糖树脂微球的量，向步骤7酶切后的反应体系中加入亲和素琼脂糖树脂微球，室温缓慢震荡30min。以1,000rpm离心5min，收集上清液。纯化后的蛋白样品经SDS-PAGE分离(10％Tris-Glycine聚丙烯酰胺胶)，用考马斯亮蓝染色来检测纯度(图9)；用Westernblot定性检测样品中的MCP-ompN1融合蛋白(图10)。

序列表

<110> 王大勇

<120> 神经坏死病毒MCP与鮰爱德华氏菌ompN1的融合蛋白及其制备方法

<130> 2019-05-16

<141> 2019-05-16

<150> 2019102663878

<151> 2019-04-03

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2205

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggttcgta aaggtgaaaa aaaactggct aaaccggcta ccaccaaagc tgctaacccg 60

cagccgcgtc gtcgtgctaa caaccgtcgt cgttctaacc gtaccgacgc tccggtttct 120

aaagcttcta ccgttaccgg tttcggtcgt ggtaccaacg acgttcacct gtctggtatg 180

tctcgtatct ctcaggctgt tctgccggct ggtaccggta ccgacggtta cgttgttgtt 240

gacgctacca tcgttccgga cctgctgccg cgtctgggtc acgctgctcg tatcttccag 300

cgttacgctg ttgaaaccct ggaattcgaa atccagccga tgtgcccggc taacaccggt 360

ggtggttacg ttgctggttt cctgccggac ccgaccgaca acgaccacac cttcgacgct 420

ctgcaggcta cccgtggtgc tgttgttgct aaatggtggg aatctcgtac cgttcgtccg 480

cagtacaccc gtaccctgct gtggacctct tctggtaaag aacagcgtct gacctctccg 540

ggtcgtctga tcctgctgtg cgttggtaac aacaccgacg ttgttaacgt ttctgttctg 600

tgccgttggt ctgttcgtct gtctgttccg tctctggaaa ccccggaaga aaccaccgct 660

ccgatcatga cccagggttc tctgtacaac gactctctgt ctaccaacga cttcaaatct 720

atcctgctgg gttctacccc gctggacatc gctccggacg gtgctgtttt ccagctggac 780

cgtccgctgt ctatcgacta ctctctgggt accggtgacg ttgaccgtgc tgtttactgg 840

cacctgaaaa aattcgctgg taacgctggt accccggctg gttggttccg ttggggtatc 900

tgggacaact tcaacaaaac cttcaccgac ggtgttgctt actactctga cgaacagccg 960

cgtcagatcc tgctgccggt tggtaccgtt tgcacccgtg ttgactctga aaacggtggt 1020

ggtggttctg gtggtggtgg ttctggtggt ggtggtgctg aaatctacaa caaaaacggt 1080

aacaaactgg acctgtacgg tcgtctggct ggtgaattct actctggtga aggtaacggt 1140

gacgactctt acgctcgtct gggtttcaaa ggtgaaaccc agatcaacga agttctgacc 1200

ggttacggtc gttgggaatt ccagaccaaa gcttctcgtg acgaaggtaa cccgaactct 1260

tacacccgtc tgggtttcgt tggtttcaac atcacccagt tcggttctct ggactacggt 1320

cgtaacaacg gtgttctgaa agacgttgaa aacttcaccg acgttttccc ggtttacggt 1380

ggtgactctt acaccatgac cgacaactac atgaccggtc gtgctaacaa cctggctacc 1440

taccgtaacc gtaacttctt caacctgatc gacggtctga acatcgctct gcagtaccag 1500

ggtaaaaacg aaggtaacgg tgacgaagtt aaacgtacca tcccggttaa aaacgctgtt 1560

accggtaaca tcgaaaacat ctctgtttct gaaaaacgtg acctgcagtc tggtacctct 1620

aaccgtggta acgcttctgt tcgtcgtgac aacggtgacg gtgttgctct ggctgttacc 1680

tacgaactgc cgatcggtat cggtctggct gctgcttact ctggttctga ccgttctgac 1740

gctcagacct ctggtctgct gggtaaagct cgtggtcagc gtgctgaagc ttggaccatc 1800

gctgctaaat acgacgctaa caacctgtac ctggctgcta tgtacgctga aacccgtaac 1860

atgaccccgt tcaacaaaaa caacctgatc gctaacaaaa cccagaactt cgaagctgtt 1920

gctcagtacc agttcgactt cggtctgcgt ccgtctatcg gttacgttct gtctcgtggt 1980

ctggacctga acgctgactc tggtaccctg ggtgacggtt cttctgttaa atctgctgac 2040

ctggttaact acctgtcttt cggtgctgaa ttcgctctga acaaaaacat gctgacctac 2100

atcgaataca aagttaacct gctggacgaa gacaaattct ctcgttctaa caacgttgac 2160

accgacaacc aggttggtat cggtatccag tacaacttct aataa 2205

<210> 2

<211> 733

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Val Arg Lys Gly Glu Lys Lys Leu Ala Lys Pro Ala Thr Thr Lys

1 5 10 15

Ala Ala Asn Pro Gln Pro Arg Arg Arg Ala Asn Asn Arg Arg Arg Ser

20 25 30

Asn Arg Thr Asp Ala Pro Val Ser Lys Ala Ser Thr Val Thr Gly Phe

35 40 45

Gly Arg Gly Thr Asn Asp Val His Leu Ser Gly Met Ser Arg Ile Ser

50 55 60

Gln Ala Val Leu Pro Ala Gly Thr Gly Thr Asp Gly Tyr Val Val Val

65 70 75 80

Asp Ala Thr Ile Val Pro Asp Leu Leu Pro Arg Leu Gly His Ala Ala

85 90 95

Arg Ile Phe Gln Arg Tyr Ala Val Glu Thr Leu Glu Phe Glu Ile Gln

100 105 110

Pro Met Cys Pro Ala Asn Thr Gly Gly Gly Tyr Val Ala Gly Phe Leu

115 120 125

Pro Asp Pro Thr Asp Asn Asp His Thr Phe Asp Ala Leu Gln Ala Thr

130 135 140

Arg Gly Ala Val Val Ala Lys Trp Trp Glu Ser Arg Thr Val Arg Pro

145 150 155 160

Gln Tyr Thr Arg Thr Leu Leu Trp Thr Ser Ser Gly Lys Glu Gln Arg

165 170 175

Leu Thr Ser Pro Gly Arg Leu Ile Leu Leu Cys Val Gly Asn Asn Thr

180 185 190

Asp Val Val Asn Val Ser Val Leu Cys Arg Trp Ser Val Arg Leu Ser

195 200 205

Val Pro Ser Leu Glu Thr Pro Glu Glu Thr Thr Ala Pro Ile Met Thr

210 215 220

Gln Gly Ser Leu Tyr Asn Asp Ser Leu Ser Thr Asn Asp Phe Lys Ser

225 230 235 240

Ile Leu Leu Gly Ser Thr Pro Leu Asp Ile Ala Pro Asp Gly Ala Val

245 250 255

Phe Gln Leu Asp Arg Pro Leu Ser Ile Asp Tyr Ser Leu Gly Thr Gly

260 265 270

Asp Val Asp Arg Ala Val Tyr Trp His Leu Lys Lys Phe Ala Gly Asn

275 280 285

Ala Gly Thr Pro Ala Gly Trp Phe Arg Trp Gly Ile Trp Asp Asn Phe

290 295 300

Asn Lys Thr Phe Thr Asp Gly Val Ala Tyr Tyr Ser Asp Glu Gln Pro

305 310 315 320

Arg Gln Ile Leu Leu Pro Val Gly Thr Val Cys Thr Arg Val Asp Ser

325 330 335

Glu Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

340 345 350

Ala Glu Ile Tyr Asn Lys Asn Gly Asn Lys Leu Asp Leu Tyr Gly Arg

355 360 365

Leu Ala Gly Glu Phe Tyr Ser Gly Glu Gly Asn Gly Asp Asp Ser Tyr

370 375 380

Ala Arg Leu Gly Phe Lys Gly Glu Thr Gln Ile Asn Glu Val Leu Thr

385 390 395 400

Gly Tyr Gly Arg Trp Glu Phe Gln Thr Lys Ala Ser Arg Asp Glu Gly

405 410 415

Asn Pro Asn Ser Tyr Thr Arg Leu Gly Phe Val Gly Phe Asn Ile Thr

420 425 430

Gln Phe Gly Ser Leu Asp Tyr Gly Arg Asn Asn Gly Val Leu Lys Asp

435 440 445

Val Glu Asn Phe Thr Asp Val Phe Pro Val Tyr Gly Gly Asp Ser Tyr

450 455 460

Thr Met Thr Asp Asn Tyr Met Thr Gly Arg Ala Asn Asn Leu Ala Thr

465 470 475 480

Tyr Arg Asn Arg Asn Phe Phe Asn Leu Ile Asp Gly Leu Asn Ile Ala

485 490 495

Leu Gln Tyr Gln Gly Lys Asn Glu Gly Asn Gly Asp Glu Val Lys Arg

500 505 510

Thr Ile Pro Val Lys Asn Ala Val Thr Gly Asn Ile Glu Asn Ile Ser

515 520 525

Val Ser Glu Lys Arg Asp Leu Gln Ser Gly Thr Ser Asn Arg Gly Asn

530 535 540

Ala Ser Val Arg Arg Asp Asn Gly Asp Gly Val Ala Leu Ala Val Thr

545 550 555 560

Tyr Glu Leu Pro Ile Gly Ile Gly Leu Ala Ala Ala Tyr Ser Gly Ser

565 570 575

Asp Arg Ser Asp Ala Gln Thr Ser Gly Leu Leu Gly Lys Ala Arg Gly

580 585 590

Gln Arg Ala Glu Ala Trp Thr Ile Ala Ala Lys Tyr Asp Ala Asn Asn

595 600 605

Leu Tyr Leu Ala Ala Met Tyr Ala Glu Thr Arg Asn Met Thr Pro Phe

610 615 620

Asn Lys Asn Asn Leu Ile Ala Asn Lys Thr Gln Asn Phe Glu Ala Val

625 630 635 640

Ala Gln Tyr Gln Phe Asp Phe Gly Leu Arg Pro Ser Ile Gly Tyr Val

645 650 655

Leu Ser Arg Gly Leu Asp Leu Asn Ala Asp Ser Gly Thr Leu Gly Asp

660 665 670

Gly Ser Ser Val Lys Ser Ala Asp Leu Val Asn Tyr Leu Ser Phe Gly

675 680 685

Ala Glu Phe Ala Leu Asn Lys Asn Met Leu Thr Tyr Ile Glu Tyr Lys

690 695 700

Val Asn Leu Leu Asp Glu Asp Lys Phe Ser Arg Ser Asn Asn Val Asp

705 710 715 720

Thr Asp Asn Gln Val Gly Ile Gly Ile Gln Tyr Asn Phe

725 730

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgcggatcca tggttcgtaa aggtgaaaaa aaac 34

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acgcgtcgac ttattagaag ttgtactgg 29

Claims

1.一种基因重组神经坏死病毒主要衣壳蛋白(MCP)与鮰爱德华氏菌外膜蛋白1(ompN1)构成的融合蛋白MCP-ompN1。其特征在于，一条多肽链上同时包含MCP氨基酸序列与ompN1氨基酸序列。

2.MCP与ompN1通过若干氨基酸构成的肽链相连。

3.MCP位于ompN1蛋白的N末端或C末端。

4.序列表中所描述的编码MCP-ompN1融合蛋白的优化的核苷酸序列的全部或部分。

5.权利要求1所述的MCP-ompN1融合蛋白的氨基酸序列。

6.权利要求1所述的MCP-ompN1融合蛋白的表达方法的全部或部分。

7.权利要求1所述的MCP-ompN1融合蛋白的分离和纯化方法的全部或部分。