CN110964096A

CN110964096A - 一种重组人源c反应蛋白的制备方法

Info

Publication number: CN110964096A
Application number: CN201911374784.3A
Authority: CN
Inventors: 霍栋栋; 杨文魁; 黄磊; 夏志平; 游可为; 陈浩源
Original assignee: Redpharm Beijing Biomedical Research Institute Co ltd; Runfang Changchun Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Redpharm Beijing Biomedical Research Institute Co ltd
Priority date: 2019-12-27
Filing date: 2019-12-27
Publication date: 2020-04-07
Anticipated expiration: 2039-12-27
Also published as: CN110964096B

Abstract

本发明公开了一种重组人源C反应蛋白的制备方法，从NCBI上获取人源C反应蛋白的蛋白序列，根据大肠杆菌密码子偏嗜性特征，人工优化并合成C反应蛋白编码基因，进一步构建人源C反应蛋白的表达载体，并转化至大肠杆菌中进行诱导表达，然后将表达产物纯化得到纯的重组蛋白。ELISA检测结果表明本发明表达及纯化的重组人源C反应蛋白和天然人源C反应蛋白的免疫学特性是十分相近的，可以满足检测要求。另外，本发明的重组人源C反应蛋白的纯化工艺有利于质量控制，符合工业化生产要求。

Description

一种重组人源C反应蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组人源C反应蛋白的制备方法。

背景技术

C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)是指在机体受到感染或组织损伤时血浆中一些急剧上升的蛋白质(急性蛋白)。C反应蛋白可以激活补体和加强吞噬细胞的吞噬而起调理作用，从而清除入侵机体的病原微生物和损伤、坏死、凋亡的组织细胞，在机体的天然免疫过程中发挥重要的保护作用。

目前，C反应蛋白主要从人体血液里直接提取，由于正常人血清中C反应蛋白含量特别低，在10ug/ml以下，而且人体血液获取不便，不能满足大量的临床和科研的需求。现有技术中也有通过原核基因重组表达C反应蛋白的报道，但是由于C反应蛋白是以包涵体的形式存在，所以在蛋白纯化的过程中复性困难，并且复性后大多以多聚体形式存在，不具备天然CRP的免疫原性，无法同CRP抗体特异性结合，无法进行ELISA检测，也不能用于临床检测。因此，重组表达并纯化制备具有天然免疫活性的人C反应蛋白是需要解决的技术难题。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种重组人源C反应蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)人源C反应蛋白基因的DNA序列PCR扩增

从NCBI上获取人源C反应蛋白的蛋白序列，根据大肠杆菌密码子偏嗜性特征，人工优化并合成C反应蛋白编码基因，N端加入pelB leader信号肽序列，以10个连续组氨酸序列(-10×His-)作为纯化标签；设计引物进行PCR反应用于扩增合成基因，并在引物的首尾两端引入Nde I、Xho I酶切位点，PCR条件如下：

94℃预变性5min，

72℃延伸10min结束扩增。

(2)人源C反应蛋白表达载体的构建

将步骤(1)的PCR产物和原核表达质粒pET26b+分别采用限制性内切酶NdeI和XhoI进行双酶切，酶切条件为37℃，2h，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒对酶切片段进行回收，然后用T4连接酶将目的基因与表达载体pET26b+连接，将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进行阳性克隆验证，得到人源C反应蛋白的表达载体。

(3)人源C反应蛋白重组菌的获得

将步骤(2)的人源C反应蛋白的表达载体转入用于表达的大肠杆菌，得到人源C反应蛋白重组菌。

(4)人源C反应蛋白重组菌的诱导表达

将步骤(3)的人源C反应蛋白重组菌接种于含有卡那霉素抗性的LB液体培养基中，加入0.2-5mM的IPTG进行诱导，16-37℃震荡培养6-12h。

(5)重组人源C反应蛋白的分离纯化

A:将完成步骤(4)中的菌液在6000-12000r/min条件下离心2-15min，收集菌体，将菌体使用含0.5M NaCl的Tris-HCl溶液(5～50mM，pH6～8)，在6000～12000r/min条件下离心洗涤2～15min，重复操作2～5次，收集菌体沉淀。

B:将完成步骤A的菌体沉淀用洗涤缓冲液a(20mmol/L Tris－HCl，0.5mol/LNaCl，2mol/L尿素，2％Triton，pH 8.0)重悬，于4℃，80～160r/min搅拌洗涤20～30min，然后在12000r/min条件下离心15min，弃去上清液，重复操作一次，收集菌体沉淀。

C:将完成步骤B的菌体沉淀用溶解缓冲液b(20mmol/L Tris－HCl，pH 8.0，0.5mol/L NaCl，1％SDS，)重悬，室温条件下，80～160r/min搅拌5～20h，然后在4℃，12000r/min离心15min，收集上清液。

D:将完成步骤C的上清液在4℃条件下透析复性12-48h，每隔4h更换一次透析液缓冲液(20mM Tris-HCl pH＝8.0，0.5M NaCl,50mM EDTA，1％Gly，10％甘油)，得到复性蛋白溶液，然后超滤浓缩，得到蛋白浓缩液。

E:将完成步骤D的蛋白浓缩液采用镍离子亲和层析柱对进行纯化，然后过分子筛层析柱得到纯化的重组人源C反应蛋白。

在本发明的实施方案中，所述人源C反应蛋白的蛋白序列如SEQ ID NO.1所示，人源C反应蛋白编码基因序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的实施方案中，所述PCR反应的正向引物如SEQ ID NO.3所示，PCR反应的反向引物如SEQ ID NO.4所示。

本发明优化了原核表达的重组人源C反应蛋白的基因序列并建立了配套的原核表达体系，提高了原核表达的重组人源C反应蛋白的产量，并通过对重组人源C反应蛋白纯化及复性工艺的优化，使得复性后的重组人源C反应蛋白聚集状态接近天然人源C反应蛋白(五聚体)，具备天然C反应蛋白的免疫原性，与多种抗C反应蛋白单克隆抗体均能特异性识别，能够满足临床检测需求。本发明不仅摆脱了传统使用人体血液提取C反应蛋白的限制，解决了原材料获取的难题，而且本发明的重组人源C反应蛋白的纯化工艺有利于质量控制，符合工业化生产要求。

附图说明

图1为本发明提供的人源C反应蛋白表达载体PCR验证图；其中，1：Marker；2：Marker；3：阴性对照(无模板，条带为引物二聚体)；4～7分别为4株阳性克隆菌株的质粒PCR。

图2为本发明提供的重组人源C反应蛋白的SDS-PAGE电泳验证图；其中，1：Marker，2：天然的人源C反应蛋白，3：重组菌a(未加诱导剂)，4：重组菌a(加1mM的IPTG)，5：重组菌b(未加诱导剂)，6：重组菌b(加1mM的IPTG)，7：重组菌c(未加诱导剂)，8：重组菌c(加1mM的IPTG)，9：重组菌d(未加诱导剂)，10：重组菌d(加1mM的IPTG)。

图3为本发明提供的纯化后的重组人源C反应蛋白的SDS-PAGE电泳验证图；其中，1：Marker，2：天然的人源C反应蛋白，3：重组人源C反应蛋白。

图4为本发明提供的纯化后的重组人源C反应蛋白的ELISA验证结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步的详细说明。

实施例1

重组人源C反应蛋白的原核表达及纯化的过程如下：

(1)人源C反应蛋白基因的克隆

从NCBI上获取人源C反应蛋白的氨基酸序列，根据大肠杆菌密码子偏嗜性特征，人工优化并合成C反应蛋白编码基因，N端加入pelB leader信号肽序列，以10个连续组氨酸序列(-10×His-)作为纯化标签，具体蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO：1，蛋白编码基因的核苷酸序列见SEQ ID NO：2。

设计引物进行PCR反应用于扩增合成基因，并在引物的首尾两端引入Nde I、Xho I酶切位点，正向引物序列见SEQ ID NO：3，反向引物序列见SEQ ID NO：4。PCR条件如下：

94℃预变性5min，

72℃延伸10min结束扩增。

目的基因全序列和正反向引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。

(2)人源C反应蛋白表达载体的构建

将完成步骤(1)的PCR产物和原核表达质粒pET26b+分别采用限制性内切酶NdeI和XhoI进行双酶切，37℃酶切两个小时后使用琼脂糖凝胶回收试剂盒对pET26b+和基因的目的条带进行回收，然后用T4连接酶在37℃条件连接2h，将目的基因与表达载体pET26b+连接。

将上述人源C反应蛋白表达载体50ng加入到200μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，置于冰中30min。将感受态细胞迅速从冰移至42℃水浴热激90s，再快速将其转移到冰浴中冷却5min，加入800μL的LB液体培养基(1g胰蛋白胨，0.5g酵母提取物，0.5gNaCl，100ml去离子水，121℃湿热灭菌30min)，将经上述操作后的感受态细胞于37℃，120rpm振荡培养50min。将已转化的感受态细胞均匀涂布到含有卡那霉素(50μg/ml)固体LB培养基上，37℃倒置培养12～16h。

挑取4株单菌落，提质粒双酶切及PCR进行验证，PCR的参数同步骤(1)，确定序列无误后提取表达载体并保存。(PCR鉴定结果如附图1所示)

(3)人源C反应蛋白重组菌的获得

将完成步骤(2)的人源C反应蛋白表达载体50ng加入200μL的肠杆菌BL21感受态细胞中，轻轻混匀，置于冰中30min，然后将感受态细胞迅速从冰移至42℃水浴热激90s，再快速将其转移到冰浴中冷却5min，加入800μL的LB液体培养基(1g胰蛋白胨，0.5g酵母提取物，0.5g氯化钠，100ml去离子水，121℃湿热灭菌30min)，于37℃，120rpm振荡培养50min。将已转化的大肠杆菌BL21感受态细胞均匀涂布到含有卡那霉素(50μg/ml)的LB固体培养基上，37℃倒置培养14h，获得人源C反应蛋白重组菌。

(4)人源C反应蛋白重组菌的诱导表达

挑取四株步骤(3)的人源C反应蛋白重组菌的阳性单菌落(重组菌a，重组菌b，重组菌c，重组菌d)分别接种于5ml含有卡那霉素(50μg/ml)抗性的LB液体培养基中，在37℃，180r/min条件下培养12h，然后分别取1ml菌液，并分别加入100ml含有卡那霉素(50μg/ml)抗性的LB液体培养基中，在37℃，180rpm条件下培养6h，加入1mM的IPTG进行诱导，在16℃，180rpm条件下培养12h。

取少部分菌液离心分离，收集菌体，进行SDS-PAGE电泳验证(验证结果如附图2所示)。

(5)重组人源C反应蛋白的分离纯化

A：将完成步骤(4)的菌液，在10000r/min条件下离心15min，收集菌体，将菌体使用含0.5M NaCl的Tris-HCl溶液(50mM，pH6)，在12000r/min条件下离心洗涤10min，重复操作3次，收集菌体沉淀。

B：将步骤A的菌体沉淀用洗涤缓冲液a(20mmol/L Tris－HCl，0.5mol/L NaCl，2mol/L尿素，2％Triton，pH 8.0)重悬，于4℃，150r/min搅拌洗涤20min，然后在12000r/min条件下离心15min，弃去上清液，重复操作一次，收集菌体沉淀。

C：将完成步骤B的菌体沉淀用溶解缓冲液b(20mmol/L Tris－HCl，pH 8.0，0.5mol/L NaCl，1％SDS，)重悬，室温条件下，160r/min搅拌5h，然后在4℃，12000r/min离心15min，收集上清液。

D：将完成步骤C的上清液在4℃条件下透析复性12h，每隔4h更换一次透析液缓冲液(20mM Tris-HCl pH＝8.0，0.5M NaCl,50mM EDTA，1％Gly，10％甘油)，得到复性蛋白溶液，然后超滤浓缩，得到蛋白浓缩液。

E：将完成步骤D的蛋白浓缩液采用镍离子亲和层析柱对进行纯化，然后过分子筛层析柱得到纯化的重组人源C反应蛋白，并进行SDS-PAGE电泳验证(验证结果如附图3所示)。

(6)重组人源C反应蛋白的ELISA验证

用纯化的重组人源C反应蛋白(天然的人源C反应蛋白作为对照)包被96孔酶标板(100ng/孔)，用辣根过氧化物酶标C反应蛋白单抗进行ELISA测定。本实施例中使用了4种不同的C反应蛋白单克隆抗体，结果均表明本发明的重组人源C反应蛋白和天然人源C反应蛋白的免疫学特性是十分相近的(ELISA验证结果如附图4)，可以满足检测要求。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 润方（长春）生物科技有限公司

润方（北京）生物医药研究院有限公司

<120> 一种重组人源C反应蛋白的制备方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 248

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Gln Pro Ala Met Ala His His His His His His His His His His

20 25 30

Ser Ser Gly His Ile Asp Asp Asp Asp Lys Gln Thr Asp Met Ser Arg

35 40 45

Lys Ala Phe Val Phe Pro Lys Glu Ser Asp Thr Ser Tyr Val Ser Leu

50 55 60

Lys Ala Pro Leu Thr Lys Pro Leu Lys Ala Phe Thr Val Cys Leu His

65 70 75 80

Phe Tyr Thr Glu Leu Ser Ser Thr Arg Gly Tyr Ser Ile Phe Ser Tyr

85 90 95

Ala Thr Lys Arg Gln Asp Asn Glu Ile Leu Ile Phe Trp Ser Lys Asp

100 105 110

Ile Gly Tyr Ser Phe Thr Val Gly Gly Ser Glu Ile Leu Phe Glu Val

115 120 125

Pro Glu Val Thr Val Ala Pro Val His Ile Cys Thr Ser Trp Glu Ser

130 135 140

Ala Ser Gly Ile Val Glu Phe Trp Val Asp Gly Lys Pro Arg Val Arg

145 150 155 160

Lys Ser Leu Lys Lys Gly Tyr Thr Val Gly Ala Glu Ala Ser Ile Ile

165 170 175

Leu Gly Gln Glu Gln Asp Ser Phe Gly Gly Asn Phe Glu Gly Ser Gln

180 185 190

Ser Leu Val Gly Asp Ile Gly Asn Val Asn Met Trp Asp Phe Val Leu

195 200 205

Ser Pro Asp Glu Ile Asn Thr Ile Tyr Leu Gly Gly Pro Phe Ser Pro

210 215 220

Asn Val Leu Asn Trp Arg Ala Leu Lys Tyr Glu Val Gln Gly Glu Val

225 230 235 240

Phe Thr Lys Pro Gln Leu Trp Pro

245

<210> 2

<211> 764

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggtacatatg aaatacctgc tgccgaccgc tgctgctggt ctgctgctcc tcgctgccca 60

gccggcgatg gcccatcatc atcatcatca tcatcatcat catagcagcg gccatatcga 120

cgacgacgac aagcagacgg atatgtctcg taaagctttt gtgtttccga aagaaagcga 180

taccagctac gtgagcctga aggcccctct taccaagccg ctcaaagctt tcactgtgtg 240

tttgcatttc tacactgaac ttagtagtac tcgcggttat tcaattttct catacgcgac 300

caaacgccag gataacgaaa ttctgatttt ctggagtaag gatattggct atagcttcac 360

cgtaggtggt agcgaaatct tatttgaagt accggaagtt accgtggcgc cggtacatat 420

ttgcaccagc tgggaaagcg cgtctggtat tgttgaattt tgggtggatg gtaaaccgcg 480

cgtgcgcaaa tctctgaaga aaggttatac ggtgggtgct gaggcctcta ttattcttgg 540

tcaagaacag gattcttttg ggggcaattt cgaaggcagc cagagtctgg taggtgatat 600

tgggaatgtc aatatgtggg atttcgtatt gtctccggat gagattaata ccatttatct 660

ggggggcccg ttttcaccga acgtgttaaa ttggcgcgcg ctgaaatatg aagtgcaggg 720

tgaagtgttc acgaaaccgc agctgtggcc gtgactcgag atgg 764

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtacatatg aaatacctgc tgccg 25

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccatatcgag tcacggccac 20

Claims

1.一种重组人源C反应蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)人源C反应蛋白基因的DNA序列PCR扩增

从NCBI上获取人源C反应蛋白的氨基酸序列，根据大肠杆菌密码子偏嗜性特征，人工优化并合成C反应蛋白编码基因，N端加入pelB leader信号肽序列，以10个连续组氨酸序列(-10×His-)作为纯化标签，设计引物进行PCR反应，并在引物的两端引入Nde I/Xho I酶切位点；

所述人源C反应蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述人源C反应蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)人源C反应蛋白表达载体的构建

将完成步骤(1)的PCR产物和原核表达质粒pET26b+分别采用限制性内切酶NdeI和XhoI进行双酶切，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒对酶切片段进行回收，然后用T4连接酶将目的基因与表达载体pET26b+连接，将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进行阳性克隆验证，得到人源C反应蛋白的表达载体；

(3)人源C反应蛋白重组菌的获得

将完成步骤(2)的人源C反应蛋白的表达载体转入用于表达的大肠杆菌，得到人源C反应蛋白重组菌；

(4)人源C反应蛋白重组菌的诱导表达

将完成步骤(3)的人源C反应蛋白重组菌接种于含有卡那霉素抗性的LB液体培养基中，加入0.2-5mM的IPTG进行诱导，16-37℃震荡培养6-12h；

(5)重组人源C反应蛋白的分离纯化

A：将完成步骤(4)中的菌液在6000-12000r/min条件下离心2-15min，收集菌体，将菌体使用含0.5M NaCl的Tris-HCl溶液(5～50mM，pH6～8)，在6000～12000r/min条件下离心洗涤2～15min，重复操作2～5次，收集菌体沉淀；

B：将完成步骤A的菌体沉淀用洗涤缓冲液a(20mmol/L Tris－HCl，0.5mol/L NaCl，2mol/L尿素，2％Triton，pH 8.0)重悬，于4℃，80～160r/min搅拌洗涤20～30min，然后在12000r/min条件下离心15min，弃去上清液，重复操作一次，收集菌体沉淀；

C：将完成步骤B的菌体沉淀用溶解缓冲液b(20mmol/L Tris－HCl，pH 8.0，0.5mol/LNaCl，1％SDS，)重悬，室温条件下，80～160r/min搅拌5～20h，然后在4℃，12000r/min离心15min，收集上清液；

D：将完成步骤C的上清液在4℃条件下透析复性12-48h，每隔4h更换一次透析液缓冲液(20mM Tris-HClpH＝8.0，0.5M NaCl，50mM EDTA，1％Gly，10％甘油)，得到复性蛋白溶液，然后超滤浓缩，得到蛋白浓缩液；

E：将完成步骤D的蛋白浓缩液采用镍离子亲和层析柱对进行纯化，然后过分子筛层析柱得到纯化的重组人源C反应蛋白。

2.如权利要求1所述的一种重组人源C反应蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中PCR反应的正向引物如SEQ ID NO.3所示，PCR反应的反向引物如SEQ ID NO.4所示。