CN115785193A - 一种用于包涵体蛋白复性的复性缓冲液以及方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及用于包涵体蛋白复性的复性缓冲液以及方法。所述复性缓冲液包括20~50mM的Tris‑HCl，50~150mM的NaCl，0.5~1.5M的L‑精氨酸，0.5~1wt%的β‑环状糊精和0.05~5wt%的去污剂，且pH值为8~9。本申请所述复性缓冲液中同时包括β‑环状糊精和去污剂，二者能够发挥协同作用，进而使得利用所述复性缓冲液对包涵体进行蛋白复性时能够显著提高包涵体的复性效果，更利于变性蛋白质折叠为天然活性蛋白质。另外，利用所述复性缓冲液对包涵体进行复性的操作简单，成本低，重组蛋白产量高。
Description
技术领域
本申请涉及蛋白质工程技术领域，尤其是涉及一种用于包涵体蛋白复性的复性缓冲液以及方法。
背景技术
大肠杆菌蛋白表达系统以其基因背景清楚，易于培养和控制，转化操作简单，表达水平高，成本低，周期短，表达效率高等，成为科研者研究重组蛋白质的重要工具。但外源目的蛋白质在大肠杆菌高效表达时，目的蛋白经常发生错误的折叠，并聚集成为包涵体。经过诱导，目的蛋白通常可达细胞总蛋白的50％以上。虽然有一定比例的蛋白以可溶的单体形式存在，而多达95％(甚至更多)的蛋白则在包涵体中。让目的蛋白以包涵体形式聚集在以下情况下非常有利：1.以包涵体形式表达的蛋白产量往往很高；2.包涵体蛋白与宿主细胞其他蛋白的分离比可溶蛋白的分离方法简便且造价低。用核酸酶处理，并经简单洗涤，通常可以获得纯度达75-95％的目的蛋白。3.包涵体致密的结构有助于防止蛋白酶对它的降解作用。4.有些外源蛋白对细胞有毒或能致死，大量表达会导致细胞死亡，使最终的细胞数量和产物相当低，而包涵体形式的蛋白质由于丧失了生物活性从而可以高效大量地表达。
破碎细菌后获得纯净的包涵体，经变性剂(6M盐酸胍或8M尿素)溶解后，必须经过复性使蛋白正确折叠，提高溶解度并且恢复生物活性后才能达到临床应用的水平。如果蛋白不能很好地复性，则直接表现为溶解度下降，蛋白析出沉淀，从而造成蛋白的大量损失。由于技术水平的限制，蛋白质的复性和纯化是限制生物制药领域快速发展的瓶颈。
在复性过程中通过添加复性缓冲液，能够提高包涵体的复性效果，但现有的复性缓冲液对包涵体复性的效果均不理想。因此，需要提供一种新的用于包涵体蛋白复性的复性缓冲液。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本申请提供了一种用于包涵体蛋白复性的复性缓冲液，所述复性缓冲液中同时包括β-环状糊精和去污剂，二者能够发挥协同复性效果，进而使得利用所述复性缓冲液对包涵体进行蛋白复性时显著提高了包涵体的复性效果。
为此，本申请第一方面提供了一种用于包涵体蛋白复性的复性缓冲液，所述复性缓冲液包括20～50mM的Tris-HCl，50～150mM的NaCl，0.5～1.5M的L-精氨酸，0.5～1wt％的β-环状糊精和0.05～5wt％的去污剂，且pH值为8～9。
本申请中，所述复性缓冲液中的β-环状糊精内部的疏水性空腔能够结合变性蛋白质多肽链的疏水性位点，可以抑制其相互聚集失活，从而促进肽链正确折叠为活性蛋白质；复性缓冲液中的去污剂能够捕获非天然状态的蛋白质，形成蛋白质去污剂复合物，从而阻止蛋白质的聚集失活。本申请的发明人通过研究发现，当复性缓冲液中同时包括β-环状糊精和去污剂时，二者能够发挥协同作用，能够更利于变性蛋白质折叠为天然活性蛋白质。
本申请中，所述复性缓冲液中的L-精氨酸能够创造一个适合于复性后的活性蛋白质存在的溶液环境，使形成的活性蛋白质在溶液中更容易保存，避免相互聚集；另外L-精氨酸也能够特异性地结合于错配的二硫键和错误的折叠结构，使折叠错误的分子不稳定，从而推动分子形成正确的结构。
在一些具体实施例中，所述复性缓冲液中β-环状糊精的含量例如可以为0.5wt％、0.6wt％、0.7wt％、0.8wt％、0.9wt％或1.0wt％等。在一些优选的实施方式中，所述复性缓冲液中β-环状糊精的含量为0.7～0.9wt％。
在一些具体实施例中，所述复性缓冲液中去污剂的含量例如可以为0.05wt％、1wt％、2wt％、3wt％、4wt％或5wt％等。在一些优选的实施方式中，所述复性缓冲液中去污剂的含量为2wt％～4wt％。
在一些实施方式中，所述去污剂选自十二烷基肌氨酸钠和Triton X-100中的至少一种。
在一些优选的实施方式中，所述去污剂为十二烷基肌氨酸钠和Triton X-100的混合物，且所述十二烷基肌氨酸钠和Triton X-100的质量比为1:(1～3)。
本申请中，当所述无污剂中同时含有十二烷基肌氨酸钠和Triton X-100时，能够提升蛋白复性效果。
在一些具体实施例中，所述十二烷基肌氨酸钠和Triton X-100的质量比为1:1、1:2或1:3等。在一些优选的实施方式中，所述十二烷基肌氨酸钠和Triton X-100的质量比为1:2。
本申请的发明人通过研究发现，当将十二烷基肌氨酸钠和Triton X-100的质量比控制在1:2，能够进一步提升包涵体的蛋白复性效果。
在一些实施方式中，所述复性缓冲液中还包括聚乙二醇，所述聚乙二醇的含量为0.05～0.15wt％。
在一些优选的实施方式中，所述聚乙二醇为PEG4000和PEG8000中的至少一种。
本申请中，聚乙二醇含有疏水和亲水两种基团，疏水基团同蛋白质折叠中间体作用，亲水基团朝向溶液中，防止折叠体之间相互作用，阻止聚集体的产生。另外，聚乙二醇还可增加溶液的黏度，使折叠体的运动受阻，折叠体与折叠体之间不易结合，从而促进蛋白质的复性过程。进一步地，当聚乙二醇为PEG4000和/或PEG8000时，能够进一步提升包涵体的蛋白复性效果。
本申请第二方面提供了一种包涵体蛋白复性的方法，所述方法包括如下步骤：
S1，诱导目的蛋白在宿主细胞中表达，然后裂解宿主细胞获得目的蛋白的包涵体；
S2，对所述目的蛋白的包涵体进行洗涤和溶解后，获得目的蛋白的包涵体溶液；
S3，将所述目的蛋白的包涵体溶液与如本申请第一方面所述的复性缓冲液混合后，对所述目的蛋白的包涵体进行蛋白复性，获得复性后的目的蛋白。
本申请中，所述目的蛋白例如可以为C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)，所述宿主细胞例如为大肠杆菌，如大肠杆菌M15工程菌。
本申请中将目的蛋白的基因导入到宿主细胞中，进而获得能够表达目的蛋白的宿主细胞的方法为本领域的常规方法。例如，通过人工合成目的蛋白的基因序列，并将合成的基因序列连接到pQE-60载体上，然后将该载体转化到大肠杆菌M15工程菌中，经IPTG诱导表达和SDS-PAGE鉴定表达产物，获得正确的表达目的蛋白的宿主细胞。
本申请中所述步骤S1具体可以为：培养所述宿主细胞后，加入诱导剂继续培养进而诱导目的蛋白在宿主细胞中表达；培养结束后离心收集菌体，裂解细胞，离心获得沉淀，即为目的蛋白的包涵体；优选地，所述的诱导剂为IPTG或乳糖，所述的诱导剂的添加时机为将细菌培养到OD600在0.5～1范围内时；所述诱导剂的添加量使得其终浓度为0.4mM～1.2mM。
在一些实施方式中，步骤S2中，所述洗涤采用的洗涤缓冲液中包括20～50mM的Tris-HCl，50～150mM的NaCl和1～5wt％的Triton X-100，且pH值为8～9。
本申请中，对所述目的蛋白的包涵体进行洗涤的方式例如可以为：将所述目的蛋白的包涵体与所述洗涤缓冲液混合后重悬，然后将重悬后的混合液进行离心后去上清，获得洗涤后的目的蛋白的包涵体。
在一些实施方式中，步骤S3中，所述溶解采用的溶解缓冲液中包括20～50mM的Tris-HCl，50～150mM的NaCl和6～8M的尿素，且pH值为8～9。
本申请中，对洗涤后的目的蛋白的包涵体进行溶解的方式例如可以为：将所述洗涤后的目的蛋白的包涵体与所述溶解缓冲液混合后重悬，然后将重悬后的混合液进行离心后去除沉淀，获得目的蛋白的包涵体溶液。
在一些实施方式中，洗涤后的目的蛋白的包涵体与所述溶液缓冲液的质量体积比为1g:(3～8)mL。在一些具体实施例中，所述洗涤后的目的蛋白的包涵体与所述溶液缓冲液的质量体积比例如可以为1g:5mL。
本申请中，上述质量体积比中洗涤后的目的蛋白的包涵体的质量为湿重，也即经离心后获得的未经干燥的目的蛋白的包涵体的质量。本申请通过采用上述质量体积比，能够更好地溶解目的蛋白的包涵体。
在一些实施方式中，所述目的蛋白的包涵体溶液与所述复性缓冲液的体积比为1:(2～5)。
在一些具体实施例中，所述目的蛋白的包涵体溶液与所述复性缓冲液的体积比例如可以为1:2、1:3、1:4或1:5等。在一些优选的实施方式中，所述目的蛋白的包涵体溶液与所述复性缓冲液的体积比为1:3。本申请中，通过将所述目的蛋白的包涵体溶液与所述复性缓冲液的体积比控制在上述范围内，能够将混合后的溶液中的尿素的含量控制在2M以下，进而有利于目的蛋白的复性。在一些实施方式中，所述蛋白复性的条件为：温度3～5℃，时间8～12h。
在一些具体实施方式总，所述蛋白复性的条件为：温度4℃，时间10h。
本申请的有益技术效果：本申请提供了一种新的用于包涵体蛋白复性的复性缓冲液，所述复性缓冲液中同时包括β-环状糊精和去污剂，β-环状糊精内部的疏水性空腔能够结合变性蛋白质多肽链的疏水性位点，可以抑制其相互聚集失活，从而促进肽链正确折叠为活性蛋白质；复性缓冲液中的去污剂能够捕获非天然状态的蛋白质，形成蛋白质去污剂复合物，从而阻止蛋白质的聚集失活；当复性缓冲液中同时包括β-环状糊精和去污剂时，二者能够发挥协同作用，进而使得利用所述复性缓冲液对包涵体进行蛋白复性时能够显著提高包涵体的复性效果，更利于变性蛋白质折叠为天然活性蛋白质。另外，利用所述复性缓冲液对包涵体进行复性的操作简单，成本低，重组蛋白产量高。
具体实施方式
为使本申请更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本申请，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本申请的应用范围。本申请中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。
实施例1：C-反应蛋白(CRP)包涵体的制备
人工合成CRP的基因序列，CRP的基因序列具体如SEQ ID NO：1所示。利用限制性内切酶技术将合成的CRP的基因连接到pQE-60载体上构建表达载体，并将构建的表达载体转化导入到大肠杆菌M15工程菌中，然后经IPTG诱导表达和SDS-PAGE鉴定表达产物，获得正确的表达CRP的工程菌细胞。对正确表达CRP的工程菌细胞进行规模化培养，待菌液OD600值为0.8时，在培养液中添加IPTG诱导剂，IPTG的添加量使得其终浓度为0.5mM，然后继续培养，6小时后停止发酵培养，发酵液经离心后收集菌体。
收集的菌体采用PBS缓冲液重悬，得到重悬液。对上述重悬液采用冰浴超声破碎10min(功率150W，破碎/间隔的时间为5s/5s)，之后12000rpm离心10min，收集沉淀，该沉淀即为CRP包涵体。
实施例2：CRP包涵体的复性
取5g实施例1制备的CRP包涵体，使用30mL洗涤缓冲液(Tris-HCl 50mM，NaCl100mM，Triton X-100 1wt％，pH值为8)进行重悬，将重悬的混合液采用离心机离心后去除上清，获得洗涤后的CRP包涵体。
取3g洗涤后的CRP包涵体中加入15mL溶解缓冲液(Tris-HCl50mM，NaCl 100mM，尿素8M，pH值为8)进行重悬，洗涤后的CRP包涵体与溶液缓冲液的质量体积比为1g:5mL；将重悬的混合液采用离心机离心后，去除沉淀收集上清液，获得CRP的包涵体溶液。
取10mL的CRP的包涵体溶液与30mL的复性缓冲液混合，CRP的包涵体溶液与复性缓冲液的体积比1:3，将混合液于4℃下放置10h进行初次蛋白复性，获得初次复性CRP溶液；将初次复性CRP溶液与复性缓冲液以体积比1:1混合，将混合液于4℃下放置10h进行二次蛋白复性，获得二次复性CRP溶液；将二次复性CRP溶液与复性缓冲液以体积比1:1混合，将混合液于4℃下放置10h进行三次蛋白复性，得到三次复性CRP溶液；将三次复性CRP溶液采用离心机离心后取上清，上清用复性缓冲液完全透析，最终获得复性的CRP溶液。
本实施例中采用的复性缓冲液的组成为：Tris-HCl50mM，NaCl 100mM，L-精氨酸1M，β-环状糊精0.9wt％，十二烷基肌氨酸钠1wt％，Triton X-100 2wt％，pH值8.5；去污剂的总含量为3wt％，去污剂中十二烷基肌氨酸钠与Triton X-10的质量比为1:2。
实施例3：CRP包涵体的复性
复性过程基本同实施例2，不同之处在于，β-环状糊精的含量为0.5wt％。
实施例4：CRP包涵体的复性
复性过程基本同实施例2，不同之处在于，十二烷基肌氨酸钠的含量0.5wt％，Triton X-1001wt％，去污剂的总含量为1.5wt％，去污剂中十二烷基肌氨酸钠与Triton X-100的质量比为1:2。
实施例5：CRP包涵体的复性
复性过程基本同实施例2，不同之处在于，十二烷基肌氨酸钠的含量1.5wt％，Triton X-1001.5wt％，去污剂的总含量为3wt％，去污剂中十二烷基肌氨酸钠与Triton X-100的质量比为1:1。
实施例6：CRP包涵体的复性
复性过程基本同实施例2，不同之处在于，复性缓冲液中还包括0.1wt％的PEG8000。
对比例1：CRP包涵体的复性
复性过程基本同实施例2，不同之处在于，β-环状糊精的含量为3.9wt％，且不含有去污剂十二烷基肌氨酸钠和Triton X-100。
对比例2：CRP包涵体的复性
复性过程基本同实施例2，不同之处在于，十二烷基肌氨酸钠的含量为1.3wt％，Triton X-100的含量为2.6wt％；去污剂的总含量为3.9wt％，去污剂中十二烷基肌氨酸钠与Triton X-100的质量比为1:2，且不含有β-环状糊精。
测试例1
采用考马斯亮蓝法检测实施例2-6和对比例1-2中获得的复性CRP溶液中CRP的含量，结果如表1所示。
表1
| CRP含量(mg/mL) | |
| 实施例2 | 0.080 |
| 实施例3 | 0.076 |
| 实施例4 | 0.065 |
| 实施例5 | 0.071 |
| 实施例6 | 0.083 |
| 对比例1 | 0.039 |
| 对比例2 | 0.047 |
从表1可知，相较于对比例1和2，实施例2中获得的复性CRP溶液中CRP含量明显提高，表明当复性缓冲液中同时含有β-环状糊精和去污剂时，二者能够发生协同效应，进而明显提高CRP包涵体的复性效果。另外，实施例2和实施例5的结果可知，当去污剂中十二烷基肌氨酸钠与Triton X-100的质量比为1:2时，CRP包涵体的复性效果更好。
测试例2：CRP蛋白活性检测
采用ELISA法检测实施例2-6和对比例1-2中复性后的CRP蛋白的活性。具体过程为：将100uL浓度为2ug/mL的实施例2-6和对比例1-2中获得的复性后的CRP蛋白溶液分别加入到酶标板的不同孔中进行包被，作为实验组；同时设置阴性对照和阳性对照，阴性对照孔中添加100uL不含有CRP蛋白的缓冲液，阳性对照孔中添加100uL浓度为2ug/mL CRP蛋白溶液，每孔设置3个重复。包被结束后对酶标板进行封闭，然后依次进行CRP蛋白的多克隆抗体孵育、酶(辣根过氧化物酶)标二抗孵育。孵育后，将孔内二抗稀释液甩出，用PBST洗3遍，1min/次。洗涤结束后，将孔内液体甩出，并在吸水纸上面拍板，尽量将孔内液体拍出。加入TMB显色液，100μL/孔，封板膜封好，37℃孵育15min。直接往酶标孔加入终止液50μL/孔，立即放进酶标仪，在450nm波长下读数。将获得的读数带入到OD450值-CRP蛋白浓度的标准曲线中，进而计算出不同孔中CRP蛋白的含量，结果如表2所示。
表2
从表2可知，相较于对比例1和2，本申请实施例2获得的复性后的CRP蛋白的活性更优，表明当复性缓冲液中同时含有β-环状糊精和去污剂时，二者能够发生协同效应，进而明显提高CRP包涵体的复性效果，提高复性蛋白的活性。另外，实施例2和实施例5的结果可知，当去污剂中十二烷基肌氨酸钠与Triton X-100的质量比为1:2时，CRP包涵体的复性效果更好。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本申请，并不构成对本申请的任何限制。通过参照典型实施例对本申请进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本申请权利要求的范围内对本申请作出修改，以及在不背离本申请的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本申请涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本申请限于其中公开的特定例，相反，本申请可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
Claims (10)
1.一种用于包涵体蛋白复性的复性缓冲液，其特征在于，所述复性缓冲液包括20~50mM的Tris-HCl，50~150mM的NaCl，0.5~1.5M的L-精氨酸，0.5~1wt%的β-环状糊精和0.05~5wt%的去污剂，且pH值为8~9。
2.根据权利要求1所述的复性缓冲液，其特征在于，所述去污剂选自十二烷基肌氨酸钠和Triton X-100中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的复性缓冲液，其特征在于，所述去污剂为十二烷基肌氨酸钠和Triton X-100的混合物，且所述十二烷基肌氨酸钠和Triton X-100的质量比为1:（ 1~3）。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的复性缓冲液，其特征在于，所述复性缓冲液中还包括聚乙二醇，所述聚乙二醇的含量为0.05~0.15wt%；优选地，所述聚乙二醇为PEG4000和PEG8000中的至少一种。
5.一种包涵体蛋白复性的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1，诱导目的蛋白在宿主细胞中表达，然后裂解宿主细胞获得目的蛋白的包涵体；
S2，对所述目的蛋白的包涵体进行洗涤和溶解后，获得目的蛋白的包涵体溶液；
S3，将所述目的蛋白的包涵体溶液与如权利要求1-3中任意一项所述的复性缓冲液混合后，对所述目的蛋白的包涵体进行蛋白复性，获得复性后的目的蛋白。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述洗涤采用的洗涤缓冲液中包括20~50mM的Tris-HCl，50~150mM的NaCl和1~5wt%的Triton X-100，且pH值为8~9。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤S3中，所述溶解采用的溶解缓冲液中包括20~50mM的Tris-HCl，50~150mM的NaCl和6~8M的尿素，且pH值为8~9。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，洗涤后的目的蛋白的包涵体与所述溶液缓冲液的质量体积比为1g:（3~8）mL。
9.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述目的蛋白的包涵体溶液与所述复性缓冲液的体积比为1:（2~5）。
10.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述蛋白复性的条件为：温度3~5℃，时间8~12h。
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