CN101616930B - 疏水性蛋白质的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于由细胞获得高度纯化的疏水性蛋白质的方法，该方法使用含有洗涤剂的缓冲液进行萃取、并且通过羟基磷灰石(HA)柱层析除去所述洗涤剂。

Description

疏水性蛋白质的纯化方法
相关申请的交叉引用
本申请要求申请日为2007年2月22日的美国临时专利申请No.60/902,803的优先权，在此将其全部内容引入本文以供参考。对于在联邦政府赞助下的研究或开发的发明权利的声明 
未申请参考“序列表”，一种表格、或者载于高密度磁盘上的计算机程序附表。 
未应用 
技术领域
本发明涉及一种用于由细胞获得高度纯化的疏水性蛋白质的方法，该方法使用含有洗涤剂的缓冲液进行萃取、并且通过羟基磷灰石(HA)柱层析除去所述洗涤剂。 
背景技术
一种用于膜蛋白、特别是疏水性蛋白质的萃取和增溶的有前景的概念是洗涤剂的应用。洗涤剂是两亲性分子，其含有极性化学基团和非极性化学基团。因此，它们在水中显示出独特的特性。它们可溶于水，并且可以通过与其疏水性区域(例如跨膜区域)互相作用而使疏水性蛋白质增溶。许多洗涤剂已为公众所知，但是原则上可以将它们分为非离子型洗涤剂、离子型洗涤剂和两性离子型洗涤剂。洗涤剂的增溶效力依据分子中两亲性基团的亲水/亲油平衡值(HLB)而改变。具有较高增溶力的洗涤剂(比如十二烷基磺酸钠-SDS)还对待被增溶的蛋白质的结构具有变性作用。因此，用于某使用目的的适当的洗涤剂的选择取决于靶蛋白质的特性和工艺技术条件(参见，例如，L.M.Hjelmeland和A.Chrambach，“功能性膜蛋白的增溶”，Meth.Enzymol.，1984，Vol.104，C部，第305-328页)。 
使用洗涤剂用于增溶生物分子比如蛋白质的主要缺点之一是洗涤剂本身对于期望的生物分子的污染。完全除去洗涤剂通常是耗时的并且繁琐的，有时甚至不可能。另外，因为需要较大数量的萃取后提纯步骤，预期产物的最终总回收率可能会下降至不经济的程度。 
进一步地，本技术领域已知的用于细胞碎片分离的最普遍方法是离心法。然而，特别是考虑到工业化大规模生产工艺，离心法显示出多种缺陷，比如工业规模离心机的高成本和在微粒情况下的低效能。 
因此，强烈需要一种可以克服上述缺点的、可用于由细胞获得高度纯化的疏水性蛋白质的方法。 
因此，本发明的目的在于提供一种用于由细胞获得高度纯化的蛋白质比如膜蛋白、特别是疏水性蛋白质的新方法。 
发明内容
本发明涉及一种用于由细胞获得高度纯化的疏水性蛋白质的方法，该方法使用洗涤剂来增溶蛋白质、并且采用羟基磷灰石柱层析步骤用于随后的洗涤剂去除。 
根据本发明的方法在纯化脂质性蛋白质(lipidated protein)中高度有效，所述蛋白质比如是作为一种原核生物或者真核生物的细胞膜结合性蛋白质(membrane-bound protein)天然存在的蛋白质。通过使用洗涤剂增溶预期的例如来自寄主细胞的疏水性蛋白质，可以有效地分离靶蛋白质。本发明的方法可以，例如，被用于纯化重组体合成莱姆抗原(Synthetic Lyme Antigens，“rSLA′s”)，该重组体抗原包含外膜蛋白质(OspA)的功能区，OspA是来自疏螺旋体Borrelia sp.的两个分离基因型的蛋白质。 
本发明还涉及一种药物组合物，其包含根据本发明的方法得到的疏水性蛋白质，比如脂质性蛋白质。 
附图说明
图1显示了考马斯亮蓝(Coomassie)凝胶的照片，展示了细菌细胞提取物，其中测试了不同的TRITONTM X100浓度。纯化的血清型5/3的嵌合rSLA被用作参照(泳道2)。逐渐提高的TRITONTM X100浓度(0.5％至3.0％，增量为半个百分率)被用于萃取(泳道9-13)。SDS PAGE显示出提取效率对逐渐提高的TRITONTM X100浓度的依赖性(泳道9-13)。在DE 53-阴离子交换层析后，上清液中大部分E.coli(大肠杆菌)蛋白质(“SN DE53”)被结合到树脂上，而rSLA则不结合(泳道15-19)。采用1.5％TRITONTMX100(泳道17)发现了最佳的产率与可接受纯度的组合。 
图2显示了使用离心法与使用微过滤法(microfiltration)的纯化方案的对比。 
图3显示了通过离心法或微过滤法纯化的rSLA所诱导的高抗体滴度的产生的比较图。用0.1μg、0.03μg和0.01μg的rSLA/每只小鼠对10只小鼠的各组进行皮下免疫(第0天)。为了产生对rSLA特异的抗体，在所有情况下单一剂量是足够的。在3周(21天)后可检测到显著响应。平行地比较通过微过滤法或离心法进行纯化的全部3个嵌合rSLA蛋白。“新”表示使用微过滤法，“旧”表示经离心的rSLA。两种制品的免疫原特性是相当的。因此，微过滤法不会不利地影响rSLA的免疫原性。 
图4显示了考马斯亮蓝凝胶和Western blot(蛋白质印迹)，用于检验使用TRITONTM X100通过微渗滤法(microdiafiltration)来萃取rSLA的可操作性。产生rSLA-血清型6/4的细菌细胞被悬浮并均浆(泳道2、3、10和11)。首先，通过微过滤法进行生物质的浓缩，接着用3次体积变化的Tris缓冲液洗涤浓缩物。少量可溶性蛋白质被洗去，并且在微滤液中被发现(泳道4)。通过Western blotting(蛋白质印迹)确认，rSLA的损失是最小的(泳道12)。因为渗滤缓冲液-1不包含任何洗涤剂，所以浓缩的滞留物含有大多数靶蛋白质。微渗滤液(microdiafiltrate)-1被确认通过洗涤而除去了蛋白质(泳道5)。小部分可溶的rSLA被损失(泳道13)进入滤液。通过变成含有TRITONTM X100的缓冲液(渗滤缓冲液-2)，在微渗滤液-2(泳道6和14，参见箭头)中可检测到显著含量的rSLA。 
图5显示了考马斯亮蓝凝胶和Western blot，检验发现，使用TRITONTM X100通过微渗滤法萃取血清型1/2的rSLA是可再现的。按照类似于血清型6/4的rSLA的萃取，进行该实验。考马斯亮蓝染色凝胶和Western blotting检验了在第一次实验中获得的结果，该结果是：使用微过滤法，血清型1/2的rSLA可以被TRITONTM X100有效地提取。这通过在微渗滤缓冲液-2(泳道7，参见箭头)中靶蛋白质的积聚而被显示。这不是在微渗滤缓冲液-1(泳道5，参见箭头)中的情形。 
图6显示了用于确定随微渗滤缓冲液-2(+TRITONTM X100)的体积变化次数的凝胶照片，微渗滤缓冲液-2用于从最初的微渗滤滞留物中定量萃取rSLA。悬浮液和均浆液由泳道2和3表示。微过滤法在没有rSLA显著损失的情况下除去了杂质(泳道4)。微渗滤液-1(泳道5)的情况与此相同。靶蛋白质存在于微渗滤滞留物-1中(泳道6)。用含有TRITONTM X100的缓冲液进行微渗滤会使rSLA增溶，这在微渗滤液-2中被发现(泳道7，参见箭头)。在随微渗滤缓冲液-2的每次体积变化后，提取样本用于SDS-凝胶分析。在每次体积变化后，靶蛋白质的量略微地降低。在随微渗滤缓冲液-2进行约6次体积变化后，rSLA差不多定量地被萃取，并且微渗滤萃取在该点被终止(泳道12；参见箭头)。最后所有的10个部分被汇聚在一起(泳道17)。为进行比较，将微渗滤滞留物-2以浓缩物形式和1至10倍稀释液形式加载到凝胶上，以便显示定量萃取(参见箭头)。 
图7显示了使用0.2μm薄膜(凝胶1)的实验中的考马斯亮蓝凝胶和Western blot的照片：在微过滤期间通过TRITONTM X100萃取的rSLA富集的效果。微滤滞留物(MR)被浓缩2倍，以减少工作体积(泳道4)。rSLA在微滤液(MF)中损失的量可检测到，但是是适度的(泳道5)。微渗滤显示出相同的靶蛋白质损失，但是仍然存在足够的rSLA，值得进行纯化(泳道6和7)。用这种0.2μm孔径尺寸的薄膜在微渗滤液-2(MDF-2)中进行rSLA的富集和从大肠杆菌蛋白质中分离是有效的，如箭头显示的那样。在微渗滤滞留物-2中在各个尺寸处仅有最小量的rSLA被观察到(泳道8)。 
图8显示了使用1000kD薄膜(凝胶2)的实验的凝胶照片：用1000kD薄膜时E.coli蛋白质的滞留明显更高(泳道11和13)。最终，rSLA在微渗滤液中的损失是最小的(泳道12和14)。用TRITONTM X100萃取rSLA是可能的(泳道16)，但是不完全，这通过在微渗滤滞留物-2(即，MDR-2)中仍有高含量的rSLA而被显示出来(泳道15)。另外，在MDF-2中来自E.coli的大量蛋白质的减少的效率要小得多，因为其是用0.2μm孔径尺寸的薄膜完成的(参见图7)。 
图9显示了使用HA ULTROGELTM用于嵌合rSLA血清型5/3纯化方案的层析谱。该纯化方案基本上适用于所有3种rSLA嵌合体。最初的第一高峰表征了样本施加。在样本加载开始时，由于溶液中的TRITONTM X100，强紫外线信号极大。在样本加载后，紫外线将减弱至接近零的水平。随后开始洗脱步骤，具有两步模式-18％和25％缓冲液-B步骤，通过绿线显示出来。此后，线性梯度延续至100％缓冲液B。两个步骤(18％和25％)都显示了E.coli蛋白质的去除。在18％缓冲液B处的蛋白质峰是清楚可见地，在25％缓冲液B处的峰值仅是很小的隆起(参见箭头)。残余E.coli蛋白质的减少允许得到非常高纯度的rSLA。 
图10显示了应用于rSLA纯化的工艺步骤的流程图。 
具体实施方式
本发明的一个方面涉及一种用于根据本发明由细胞获得高度纯化的疏水性蛋白质的方法，其包括下述步骤：(i)对细胞均浆液进行微过滤；(ii)使用含有至少一种洗涤剂的缓冲溶液通过微渗滤萃取由所述微过滤获得的滞留物；以及(iii)对由所述微渗滤获得的滤液进行羟基磷灰石(HA)柱层析。 
根据本发明的方法，在步骤(i)中对细胞均浆液进行微过滤以除去可溶性杂 质(洗涤步骤)。根据本发明的上述方法中的步骤(iii)除HA柱层析之外还可以包含一个以上柱层析步骤，以除去洗涤剂和其他杂质。 
在此，术语“高度纯化的”是指，例如，在羟基磷灰石柱层析之后所述疏水性蛋白质的纯度高过99％，其中，在羟基磷灰石柱层析之后杂质的含量是，例如，低于1％，优选低于0.5％。 
在此使用的术语“杂质”包括任何来源于疏水性蛋白质的生产的杂质，并且可以包括例如寄主细胞蛋白质、寄主细胞核酸、与工艺相关的杂质比如缓冲液和盐，来源于细胞培养基的杂质和与产品相关的杂质比如多聚体或者片段。杂质不包括预期的最终组成成分，例如，末了缓冲配方成分，或者可以被加入至用于最后的治疗剂组合物的纯化蛋白质的添加剂比如辅助剂、赋形剂、或防腐剂。 
根据本发明，术语“疏水性蛋白质”并不做特别的限制，并且包括任何可以通过使用如上限定的方法从细胞中进行提纯的疏水性蛋白质。另外，所述术语并不涉及特定的疏水性数值或范围，而是指如下任何疏水性，即通过与细胞结构结合、或者自缔合作用而赋予靶蛋白质在水溶液中的不溶解性，并且允许通过如上限定的方法对所述蛋白质进行纯化。所述术语“疏水性蛋白质”进一步包括蛋白质本身，例如膜蛋白、及其任何生物活性衍生物。按照本发明，术语“生物活性衍生物”包括任何具有基本与所述疏水性蛋白质相同的功能性和/或生物学特性比如结合特性、和/或相同的结构基础比如肽骨架的蛋白质、蛋白质络合物或多肽的衍生物。不改变所述多肽生物活性的靶蛋白质多肽序列上少量氨基酸的缺失、添加和/或取代，也作为生物活性衍生物而包括在本申请中。 
根据本发明，通过使用本发明的方法进行纯化的疏水性蛋白质可以是脂质性蛋白质，比如作为一种原核生物或者真核生物的细胞膜结合性蛋白质天然存在的蛋白质。例如，脂质性蛋白质可以作为在细菌种类中的细胞膜结合性蛋白质而天然存在。根据本发明的另一个实施例，待被纯化的疏水性蛋白质来自疏螺旋体(Borrelia)的脂蛋白。 
在此使用的术语“脂质性蛋白质”是指任何与脂质共价或非共价相连接的肽或蛋白质。脂质性蛋白质的一个例子是Borrelia sp.的外表面蛋白质(Osp蛋白)组。 
已经证明根据本发明的方法对于纯化脂质性Osp状蛋白质特别有用。可以通过本发明的方法进行纯化的Osp状蛋白质包括在结构上类似于Borrelia sp.的OspA蛋白质的脂质性蛋白质。结构上的相似性可以例如根据下述文献描述的方法，通过纯化的蛋白质序列与OspA蛋白质进行蛋白质-蛋白质BLAST比较而确定：Altschul，StephenF，ThomasL.Madden，Alejandro A. 
Figure G2008800053139D00051
-fer，Jinghui Zhang，Zheng Zhang，Webb Miller，以及David J.Lipman，“Gapped BLAST和PSI-BLAST：新一代蛋白质数据库检索程序”，Nuc.AcidsRes.，1997，25：3389-3402；和 Alejandro A.，L Aravind，Thomas L.Madden，SergeiShavirin，John L.Spouge，Yuri I.Wolf，Eugene V.Koonin，以及Stephen F.Altschul，“用基于组合的统计及其他细化提高PSI-BLAST蛋白质数据库检索的精度”，2001，Nuc.AcidsRes.，29：2994-3005。可以通过用于生物技术信息国家中心网址(www.ncbi.nlm.nih.gov)公开利用用于进行BLAST分析的软件。该算法涉及首先通过识别询问序列中短字的长度W而识别高得分序列配对(HSPs)，当与数据库序列中相同长度的字进行比对时，该询问序列或者匹配、或者满足一些正值的阈值分数T。其中T被称为邻近字分数阈值(Altschul等，参见前述)。这些最初的邻近字采样数用作用于启动检索的种子以便发现包含它们的较长HSPs。该字采样(word hits)沿着每个序列沿双向延伸，用于直到累积比对分数可以被提高。对于核苷酸序列，通过使用参数M(用于一对匹配残基的回报分数；始终＞0)和N(用于错配残基的损失分数；始终＜0)计算出累积分数。对于氨基酸序列，记分矩阵被用于计算累积分数。当下述情况时，沿每个方向的字采样的延伸被终止：来自其最大获得数值的数值X使累积比对记分减少；由于一个以上负记分的残基比对的积聚，使累积记分走至零或低于零；或者达到两个序列之一的端点。BLAST算法参数W、T、以及X确定了比对的敏感性和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用字长(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4、以及两条链的对比。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用字长(W)3、和期望值(E)10、以及BLOSUM62记分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：10915，1989)比对值(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝-4、以及两条链的对比。 
BLAST算法还可以进行两个序列之间的相似性统计分析(参见，例如，Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：5873-87，1993)。通过BLAST算法提供的一个相似性测量值是最小的合计概率(P(N))，其对偶然发生在两个核苷酸或氨基酸序列之间的匹配提供概率指示。例如，如果在测试核酸与参照核酸的对比中最小合计概率小于约0.2、典型地小于约0.01、并且更典型地小于约0.001，则认为核酸类似于参照序列。 
在一些实施方式中，通过本发明的方法进行纯化的蛋白质具有与Borrelia sp.的OspA蛋白质在含至少130个邻接的氨基酸的整个序列中至少50％的一致性。在其他实施方式中，通过本发明的方法进行纯化的蛋白质具有与Borrelia sp.的OspA蛋白质在含至少130个邻接的氨基酸的整个序列中至少60％的一致性。在其他实施方式中，通过本发明的方法进行纯化的蛋白质具有与Borrelia sp.的OspA蛋白质在含至少130个邻接的氨基酸 的整个序列中至少70％的一致性。在其他实施方式中，通过本发明的方法进行纯化的蛋白质具有与Borrelia sp.的OspA蛋白质在含至少130个邻接的氨基酸的整个序列中至少75％的一致性。在其他实施方式中，通过本发明的方法进行纯化的蛋白质具有与Borrelia sp.的OspA蛋白质在含至少130个邻接的氨基酸的整个序列中至少80％的一致性。在其他实施方式中，通过本发明的方法进行纯化的蛋白质具有与Borrelia sp.的OspA蛋白质在含至少130个邻接的氨基酸的整个序列中至少85％的一致性。在其他实施方式中，通过本发明的方法进行纯化的蛋白质具有与Borrelia sp.的OspA蛋白质在含至少130个邻接的氨基酸的整个序列中约87％的一致性。 
根据本发明的一个实施方式，当与Borrelia sp.的OspA蛋白质相比时，通过本发明的方法进行纯化的蛋白质具有最小360的BLAST得分。在其他实施方式中，当与Borrelia sp.的OspA蛋白质相比时，通过本发明的方法进行纯化的蛋白质具有最小400的BLAST得分。在其他实施方式中，当与Borrelia sp.的OspA蛋白质相比时，通过本发明的方法进行纯化的蛋白质具有最小440的BLAST得分。在其他实施方式中，当与Borrelia sp.的OspA蛋白质相比时，通过本发明的方法进行纯化的蛋白质具有最小480的BLAST得分。在其他实施方式中，当与Borrelia sp.的OspA蛋白质相比时，通过本发明的方法进行纯化的蛋白质具有最小520的BLAST得分。在其他实施方式中，当与Borrelia sp.的OspA蛋白质相比时，通过本发明的方法进行纯化的蛋白质具有最小560的BLAST得分。在其他实施方式中，当与Borrelia sp.的OspA蛋白质相比时，通过本发明的方法进行纯化的蛋白质具有最小580的BLAST得分。在其他实施方式中，当与Borrelia sp.的OspA蛋白质相比时，通过本发明的方法进行纯化的蛋白质具有最小600的BLAST得分。在其他实施方式中，当与Borrelia sp.的OspA蛋白质相比时，通过本发明的方法进行纯化的蛋白质具有最小620的BLAST得分。 
在实施例中，本发明的方法被用于纯化重组体合成莱姆抗原(“rSLA′s”)，该重组体抗原包含来自Borrelia sp.的两个分离基因型的OspA蛋白质的功能区、以及稳定化点突变体。适合于与本发明一起使用的OspA蛋白质为本领域技术人员所熟知。适合于与本发明一起使用的非限制性的示例性OspA蛋白质序列可以源自于布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferiss)(GenBank登记号No.Q45050)、阿氏疏螺旋体(Borrelia afzelii)(GenBank登记号No.Q0SLZ0)、以及嘎氏疏螺旋体(Borrelia garinii)(GenBank登记号No.Q1HLI9、Q44959、Q44961、以及Q932R4)。当与GenBank中的OspA序列相比时，该rSLA′s具有与OspA序列在含至少130个邻接的氨基酸的整个序列中约56％至约 87％的一致性；并且当与Borrelia sp.的不同OspA蛋白质相比时，有约360至约620的BLAST得分。 
根据本发明的疏水性蛋白质可以通过本技术领域任何已知的方法进行生产。这可以包括本技术领域任何已知的用于下述的方法：(i)通过基因工程，例如，通过RNA逆转录和/或DNA扩增来生产重组DNA；(ii)通过转染，例如，通过化学介导转染、电穿孔或微注射将重组DNA导入原核或真核细胞；(iii)例如，以连续的或分批的方式培养所述转化的细胞；(iv)例如，组成性地或者诱导性地表达疏水性蛋白质；以及(v)例如，从培养基中或者通过收集转化细胞来分离蛋白质，以便获得疏水性蛋白质。另外，编码所述疏水性蛋白质的重组DNA，例如质粒，还可以包含编码选择性标记的DNA序列，该标记用于选择已经成功转染了重组DNA的细胞。根据本发明的一个实施例，根据本技术领域任何已知的方法由收集的培养细胞得到疏水性蛋白质。 
根据本发明使用的术语“细胞均浆液”是指可通过本领域的技术人员熟知的任何均质化和/或细胞破裂工艺而获得的任何种类的细胞均浆液。这些用于制备根据本发明的细胞均浆液的工艺包括例如研磨、高速混合、切碎、破碎、超声处理、压力变化、渗透性震荡、冻融、以及掺加细胞破裂剂比如酶或洗涤剂、或这些工艺的任何组合。 
本发明中使用的术语“缓冲溶液”，包括本领域的技术人员熟知的可用于蛋白质纯化的任何缓冲液、以及两种以上这些缓冲液的任何混合物。这些缓冲液的例子是水、Tris-缓冲液、磷酸盐缓冲液、或柠檬酸盐缓冲液。然而，在本发明的方法中可用的缓冲液不限于特定的方式，并且可以进一步包含任何在纯化蛋白质中有用的物质或物质的混合物，比如蛋白质稳定剂。另外，在根据本发明的方法中的每一步骤中使用的各个缓冲液的浓度不具体限定，即，取决于其需要，在每一个各自的步骤中所述缓冲液浓度可以相同，也可以不同。例如，缓冲液浓度可以是约0.1mM至约1.0M，或者约1mM至约600mM。另外，在根据本发明的方法中使用的缓冲液的pH值不具体限制，只要允许如上限定的方法可操作即可。根据本发明的一个实施例，各个缓冲液的pH值范围为约3至约10、或者约6至约8。 
根据本发明的特定实施例，在如上限定方法的微过滤步骤(i)中使用的缓冲液是Tris-缓冲液。在本发明的另一个实施例中，在如上限定方法的萃取步骤(ii)中使用的缓冲液是包含洗涤剂的Tris-缓冲液。根据本发明的方法的另一实施例，在羟基磷灰石柱层析步骤(iii)中使用的缓冲液是磷酸钠缓冲液。 
根据本发明使用的术语“洗涤剂”包括任何两亲性物质或者两亲性物质的混 合物，并且可以，例如，提高疏水性物质在水溶液中的溶解性或分散性。术语“洗涤剂”通常涉及一种包含疏水基团和亲水基团的有机化合物。在本发明的方法中可用的洗涤剂可以例如是离子型、两性离子型或非离子型。在本发明的方法中可用的洗涤剂不具体限制，只要其对所述疏水性蛋白质的纯化没有负面影响，并且可以进一步包含两种或数种不同的洗涤剂组成的混合物。 
根据本发明的一个实施例，在如上限定的方法中，在萃取步骤(ii)之前，使用合适的缓冲液洗涤细胞均浆液。 
在此使用的术语“合适的缓冲液”不作具体限制，并且包括任何允许在不会将预期疏水性蛋白质溶解至不希望有的程度的情况下用于洗涤均浆液的缓冲液。用于洗涤均浆液的合适的缓冲液例子包括Tris-缓冲液、HEPES缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、或磷酸盐缓冲液。 
根据本发明的另一个实施例，在上述限定的方法中，在羟基磷灰石柱层析步骤(iii)之前，对从所述萃取步骤(ii)获得的滤液进行离子交换层析。 
在本发明的方法中使用的离子交换层析材料(树脂)不具体限制，只要如上限定的杂质被除去以得到高度纯化的疏水性蛋白质即可。按照本发明，离子交换树脂包括适用于离子交换层析的任何材料。在本发明的特定实施例中，离子交换树脂包含带正电荷的基团，并且因此是阴离子交换材料。优选的选择是DE-53-一种以纤维素材料为基础的阴离子交换树脂。 
在离子交换层析步骤中可用的缓冲液不限制于特定的方式，并且包括任何在离子交换层析中可用的本技术领域已知的缓冲液。合适的缓冲液包含Tris-缓冲液、HEPES缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、或磷酸盐缓冲液、或其混合物。 
根据本发明，如上限定方法的萃取步骤(ii)可以包含额外的步骤，比如浓缩步骤、洗涤步骤等，其可以为任何顺序和/或任何组合。根据本发明的特定实施例，如上限定的方法中的萃取步骤(ii)包括下述步骤：(a)洗涤生物质，并且通过微渗滤法回收；和(b)使用包含至少一种洗涤剂的缓冲液通过微过滤法，从上述步骤(a)获得的滞留物中萃取疏水性蛋白质。根据另一个具体的实施例，除了上述步骤(a)和(b)之外，萃取步骤还包含步骤(c)：其中，使用0.2μm孔径尺寸的微过滤过滤片对由上述步骤(b)所获得的滤液进行微过滤和/或微渗滤。 
根据本发明的羟基磷灰石柱层析步骤(iii)不限于特定的方式，并且包括本领域的技术人员已知的所有羟基磷灰石层析材料和方案。 
在如上限定的方法的具体实施例中，在羟基磷灰石柱层析中使用的羟基磷灰石柱材料可在市场上买得到，比如是HA ULTROGELTM。 
在如上限定的方法的羟基磷灰石柱层析步骤(vi)中可用的缓冲液不具体限定，并且包括本技术领域已知的可以在羟基磷灰石柱层析中使用的任何缓冲液。在本发明的特定例子中，在所述羟基磷灰石柱层析中使用的缓冲液是磷酸钠缓冲液，其浓度为约1mM至约600mM并且pH值为约6至约8。 
根据本发明的再一个实施例，在如上限定的方法中，在羟基磷灰石柱层析步骤(iii)之前，通过使用薄膜吸附器，对从所述萃取步骤(ii)获得的滤液进行离子交换过滤。合适的吸附器购自Pall公司(Pall Inc.)或Sartorius公司。在本发明的特定实施例中，使用的阴离子交换薄膜吸附器是Mustang Q(Pall公司)。 
根据如上限定方法的一个实施例，待被纯化的疏水性蛋白质是重组体合成莱姆抗原(rSLA)。 
在根据本发明方法的再一个实施例中，在步骤(i)中提供的包含所述疏水性蛋白质的寄主细胞是选自E.coli的寄主细胞。但是任何能够表达重组疏水性蛋白质的寄主细胞，比如酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、鸟类细胞或哺乳动物细胞都可以进行所述的工序。 
根据本发明的特定实施例，在如上所述的方法中使用的洗涤剂可以是：阴离子型，比如胆酸和其衍生物、N，N-二甲基十二基胺N-氧化物、1-烷基磺酸钠、N-月桂基肌氨酸或脂肪酸盐；阳离子型，比如烷基三甲基溴化铵和其衍生物、或者苯扎氯铵；两性离子型，比如十二基甜菜碱、烷基二甲胺氧化物和其衍生物、或者3-(N，N-二甲基烷基氨基)丙烷磺酸盐；或者非离子型，比如辛基苯酚乙氧基酯、聚氧化乙烯单油酸山梨醇酐酯、烷基聚环氧乙烷和其衍生物、烷基多葡糖甙、或脂肪醇。 
根据本发明的另一个特定实施例，在如上限定的方法中使用的洗涤剂是可在市场上买到的洗涤剂，比如辛基苯酚乙氧基酯(例如TRITONTM X100或TRITONTM X114)、聚氧化乙烯单油酸山梨醇酐酯(例如吐温TM 80)、或者N-烷基-N，N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸酯(例如ZwittergentTM 3-14)。 
在如上限定方法的另一个实施例中，在步骤(ii)中使用的缓冲液含有作为洗涤剂的辛基苯酚乙氧基酯(TRITONTM X100)。 
根据本发明的再一个实施例，在如上限定的方法中，在萃取步骤(ii)之后，例如使用0.2μm孔径尺寸的微过滤过滤片进行微过滤和/或微渗滤步骤。 
在根据本发明的方法中采用的操作温度不作具体限制，并且可以是，例如，在大约室温下或者低于室温，比如在约0至约15℃的范围内。 
根据如上限定方法的一个实施例，可以由细胞获得高度纯化的脂质性蛋白质的方法包括下述步骤：(i)提供含有所述脂质性蛋白质的细胞；(ii)均质化所述细胞；(iii)对这样获得的均浆液进行包括下述步骤的微过(渗)滤：(a)通过微过滤浓缩所述均浆液；(b)通过微渗滤洗涤生物质，借此获得微渗滤液-1和微渗滤滞留物-1；(c)使用含有洗涤剂的缓冲液，通过微渗滤从所述微渗滤滞留物-1中萃取脂质性蛋白质，借此获得微渗滤液-2和微渗滤滞留物-2；(iv)对含有萃取的脂质性蛋白质的所述微渗滤液-2进行离子交换层析，其洗脱液含有纯化的脂质性蛋白质；(v)对步骤(iv)中由离子交换层析得到的洗脱液进行阴离子交换过滤，用于除去残留的内毒素；以及(vi)对这样获得的含有脂质性蛋白质的蛋白质溶液进行羟基磷灰石(HA)柱层析。 
根据如上限定方法的一个具体实施例，可以由细胞获得高度纯化的重组体合成莱姆抗原(rSLA)的方法包括下述步骤：(i)提供含有所述rSLA的细胞；(ii)均质化所述细胞；(iii)对这样获得的均浆液进行包括下述步骤的微过(渗)滤：(a)通过微过滤浓缩所述均浆液；(b)通过微渗滤洗涤生物质，借此获得微渗滤液-1和微渗滤滞留物-1；(c)使用含有洗涤剂的缓冲液，通过微渗滤从所述微渗滤滞留物-1中萃取rSLA，借此获得微渗滤液-2和微渗滤滞留物-2；(iv)对含有萃取的rSLA的所述微渗滤液-2进行离子交换层析，其洗脱液含有纯化的rSLA；(v)对步骤(iv)中由离子交换层析得到的洗脱液进行阴离子交换过滤，用于除去残留的内毒素；以及(vi)对这样获得的含有rSLA的蛋白质溶液进行羟基磷灰石(HA)柱层析。 
根据本发明方法的如上限定的实施例，还可以包括在萃取步骤(iii)(c)之后的微过滤和/或微渗滤的步骤，例如使用0.2μm孔径尺寸的微过滤过滤片。 
本发明的另一方面涉及一种药物组合物，其包含可通过如上限定的方法而获得的疏水性蛋白质、以及至少一种药学可接受的载体。 
在本发明的另一个实施例中，如上限定的药物组合物包含治疗有效量的通过如上限定方法进行纯化的疏水性蛋白质、和任选的一种以上选自下组的附加成分：药学可接受的载体、药学可接受的盐、佐剂、稀释剂和溶剂、或其任何组合。 
根据一个实施例，如上限定的药物组合物包含可通过如上限定方法而获得的脂质性蛋白质、以及至少一种药学可接受的载体和/或稀释剂。 
在如上限定的药物组合物的另一个具体实施例中，所述药物组合物包含可通过如上限定方法而获得的rSLA、以及至少一种药学可接受的载体和/或稀释剂。 
本发明的方法提供了一种得到高度纯化的疏水性蛋白质的途径，其可以有利地在其制备中使用，并且可用于药物和诊断应用。特别地，用于使所述疏水性蛋白质增溶的洗涤剂的应用和在本发明中限定的参数下通过羟基磷灰石柱层析连续地去除所述洗涤剂，能够产生令人惊讶的效率和纯化疏水性蛋白质的通用性，并且导致有利地降低来源于用来生产所述疏水性蛋白质的细胞培养和来源于纯化工序的杂质含量。 
以下用实施例进一步阐明本发明，但并不是对本发明作任何限制。实施例实施例1用于rSLA萃取的TRITONTM X100的浓度 
使用不同的TRITONTM X100浓度，测试从细胞膜萃取rSLA的效果。因为提高的TRITONTM X100浓度可以导致E.coli蛋白质和细胞膜脂蛋白的溶解提高，所以其或许会对后续提纯步骤的效率产生负面影响。因此，为了发现最优TRITONTM X100浓度，比较了在可有效地去除大部分E.coli蛋白质的阴离子交换层析过程前后具有不同TRITONTM X100浓度的各份额。 
测试在重悬浮缓冲液中的下述TRITONTM X100浓度(0.5％、1.0％、1.5％、2.0％和3.0％)。将团粒再悬浮于各个含有TRITONTM X100的缓冲液中，并且室温下搅拌1小时。将悬浮液在16.000rpm下(在具有JA20转子的Beckman离心机中)离心20分钟。随后分析得到的上清液，并且进一步用阴离子交换树脂纯化样本等分，以便清除大部分E.coli蛋白质。这对于评估TRITONTM X100浓度对阴离子交换层析后rSLA纯度的影 响而言很有必要。使用不同的TRITONTM X100浓度，通过确定总蛋白和rSLA的含量而测量的萃取过程的效果列于表1中。 
表1：阴离子交换树脂DE-53从TRITONTM X100萃取后的离心上清液中除去了大部分E.coli蛋白质。由于rSLA蛋白质对DE-53树脂的结合是最小的，故其以较高程度被保留在上清液部分中。在DE53批次保温后，rSLA的百分比在使用1.0-1.5％TRITONTMX100(黑体加粗)的萃取物中是最大的。 
  探针OspA/110803   总蛋白质含量  (μg/mL)   rSLA含量  (μg/mL)   rSLA/蛋白质  以％计
  原始材料   16215   1018.4   6.3
  SN 0.5％TX   2169   403.8   18.6
  SN 1.0％TX   2117   448.4   21.2
  SN 1.5％TX   2525   467.1   18.5
  SN 2.0％TX   2369   440.3   18.6
  SN 3.0％TX   2512   463.2   18.4
  SN DE530.5％TX   439   267.0   60.8
  SN DE531.0％TX   318   251.9   79.2
  SN DE531.5％TX   373   281.6   75.5
  SN DE532.0％TX   307   223.5   72.8
  SN DE533.0％TX   433   313.9   72.5
SN：萃取物离心后的上清液；SN DE-53：来自DE-53树脂批次保温的上清液 
在用DE-53树脂纯化后，与萃取物离心后的上清液相比，总蛋白质水平被减小，但是rSLA蛋白质明显地被富集。在1.5和1.0％的TRITONTM X100浓度下，来自溶液中总蛋白质(以μg/mL为单位测量)的rSLA的百分比分别达到约75％至几乎80％的水平。由于rSLA产率的略微提高，所以后一浓度是优选的。为了明确地决定什么TRITONTMX100浓度是优选的，进行考马斯亮蓝染色的PAGE(参见图1)。实施例2微过滤法与离心法的对比 
混浊溶液的离心通常是用于细胞碎片分离的第一选择。关于建立工业生产规模的工序，由于工业规模离心机的高成本和工作液体处理的繁重，所以交替的方法似乎是有利的投资。通过微过滤提供交替的分离策略。因此，对于其中离心法被微过滤法取代的纯化策略进行了研究(参见图2)。 通过微过滤法或离心法进行纯化的rSLA产率和纯度的对比
列于表2中的下述数据显示，微过滤法可以代替离心法。因此微过滤法可以有效地整合到用于rSLA杂化蛋白的纯化工序中。 
表2：对于所有3种嵌合体，提供了rSLA的纯度。通过离心法或微过滤法进行纯化。与通过利用离心法进行纯化的临床使用前的组相比，经微过滤的rSLA的产率和纯度甚至更高。 
Figure G2008800053139D00141
*1在HA层析法期间用18％缓冲液B首次纯化；*2用18％+25％缓冲液B第二次纯化；**未确定，样本进行无菌过滤，用于小鼠体内免疫原性测试。 
将微过滤法整合入纯化工序，对于所有3种嵌合构建体，都可以产生高纯度rSLA。为了证明来自经微过滤的rSLA的免疫原性特性与来自临床使用前的组中的rSLA相同，在小鼠体内对来自所有3种rSLA嵌合体的免疫原性进行研究。 通过使用离心法或者微过滤法进行纯化的rSLA的免疫原性对比
为了证实在其中离心法被微过滤法取代的工序中进行纯化的rSLA的免疫原性未被减小，在免疫原性研究中比较来自两个纯化策略的产品。使用来自经微过滤的rSLA(“新”)的材料产生高抗体滴度的效率与通过利用离心法(“旧”)进行纯化的材料的效率相当(参见图3)。实施例3微过滤工艺 
微过滤法分两步进行：1)在微过滤工艺开始时，通过微过滤进行均浆液浓缩，用Tris-缓冲液接着洗涤生物 质(＝微渗滤-1)。2)随后，通过微渗滤，用含有TRITONTM X100的缓冲液从微渗滤滞留物中萃取rSLA。 
对于第一个试验性的微过滤，使用脂质性rSLA血清型6/4。本质上，进行微过滤法是为了除去少量可溶性蛋白质并且浓缩样本。对于最初的微过滤，已经确定2倍浓缩是最优的。该浓缩倍数不会进一步损害后续的提纯步骤。在较早的实验中采用4倍浓缩，但是后来被放弃了，因为微渗滤滞留物-1的粘度过高。在通过微过滤法浓缩后，使用3次体积变化的渗滤缓冲液1(不含TRITONTM X100)进行微渗滤。一部分可溶性蛋白质被洗去。 通过微渗滤用TRITON TM  X100萃取rSLA
在微渗滤-1后，进行萃取过程。在浓缩微渗滤滞留物-1后，加入TRITONTMX100至终浓度为1.5％。在磁力搅拌器上搅拌该生物质。保温30分钟的时间足以用于萃取。然后用含有TRITONTM X100的萃取缓冲液进行微渗滤-2(MDF-2)。微渗滤液-2含有萃取的rSLA(图1、图4)。在微渗滤缓冲液的体积变化期间恒定的TRITONTM X100浓度对于允许萃取和保持rSLA在滤液中溶解很重要。 
使用脂质性rSLA血清型1/2进行如上相当的过程，以再现使用rSLA血清型6/4而获得的结果，以便证实通过微过滤法萃取rSLA的方法(参见图5)。 
为了优化萃取过程，研究了为定量萃取rSLA所必需的微渗滤缓冲液-2的体积变化(VC)次数。在每个体积变化(VC)之后，从微渗滤液-2中收集样本，并且通过SDSPAGE分析rSLA含量(图6)。 
优化实验显示，渗滤缓冲液-2的6次体积变化足以用于rSLA的定量萃取。实施例4通过选择正确的过滤片孔径尺寸来优化微过滤法 
为了评估最优的大部分E.coli蛋白质的去除和足够的靶蛋白质的保留，研究了具有两个不同孔径尺寸的微过滤过滤片。对于这些微过滤实验，使用了购自Pall公司的聚醚砜薄膜(supor TFF)。其尺寸(0.1m2过滤面积)适用于实验室规模的体积。比较了两个孔径尺寸0.2μm和1000kD。通过考马斯亮蓝染色的PAGE凝胶和Western blot分析法分析了各组分(参见图7)。 
使用购自Pall公司的具有相同过滤面积的1000kD薄膜进行了相当的过程。用1000kD薄膜保留的E.coli蛋白质的量明显更高(参见图8，泳道11和13)。最终，在微渗滤液中rSLA的损失是最小的(泳道12和14)。用TRITONTM X100萃取rSLA是可能的(泳道16)，但是不完全，这通过在微渗滤滞留物-2(即，MDR-2)中仍有高含量 的rSLA而被显示出来(泳道15)。另外，在MDF-2中来自E.coli的大量蛋白质的减少的效率要比用0.2μm孔径尺寸的薄膜完成的小得多(参见图7)。 
使用0.2μm孔径尺寸的薄膜来萃取rSLA更有效率，其因此可用于所有将来的微过滤实验(参见图7，泳道9和20)。实施例5通过羟基磷灰石除去洗涤剂羟基磷灰石(HA)ULTROGELTM层析法 
在使用DE-53的阴性层析步骤之后，大多数E.coli蛋白质从rSLA溶液中被除去。对于人类疫苗，纯度是最优先的。因此最后的精加工步骤以除去残留的细菌细胞蛋白质是必需的。 
HA ULTROGELTM具有一些优点。HA显示出出色的化学和机械稳定性、较宽的pH值工作范围、在室温下储存的可能性、以及提供使用0.1N至1N NaOH溶液来再生和去除热原的便利性。 
在开发HA层析法期间的一个中心任务是除去洗涤剂TRITONTM X100，以及产生高纯度rSLA。在工艺过程开发开始时的初始试验证实了去除洗涤剂的效果。该方法的结果是，在除去来自溶液的TRITONTM X100中非常有效，其对于萃取和增溶rSLA是必需的。所有3种rSLA杂化蛋白的纯化显示了在HA步骤之后TRITONTM X100的最小残留量。在开发HA层析过程期间的第二种策略是通过改进洗脱条件来提高靶蛋白质的纯度。该途径是通过应用增加离子强度的延长的步骤来提高洗脱条件的严格性。 使用羟基磷灰石ULTROGEL TM 的层析工艺
该实施例描述了HA层析过程，包括在使用之前羟基磷灰石的适当制备。羟基磷灰石ULTROGELTM(HA)被挤入柱子，以便进行柱层析工艺，其可以通过 
Figure G2008800053139D00161
Explorer控制系统(GE保健公司)进行控制。为了长期储存，将HA投入20％EtOH+1MNaCl。为了HA凝胶的再生和除热原，用2倍柱容积的0.5N NaOH冲洗柱子。为了启动层析工序，不得不用一组不同的液体清洗柱子。首先，用2倍柱容积(CV)的水(WFI，water for injection，注射用水)冲洗填充的柱子，接着用2CV的0.5N NaOH冲洗，并且最后用包含预清洗过程的8CV的WFI再次冲洗。这可确保在层析工艺开始时所有的残留污染物和可能的致热物质被除去。后续的平衡过程包含3个清洗步骤。使用1CV的10mM磷酸钠缓冲液pH 6.8(平衡缓冲液)冲洗树脂，接着用2CV的500mM磷酸钠缓冲液pH6.8(洗脱缓冲液或缓冲液B)冲洗，并且再次用3CV的平衡缓冲液冲洗。中间的500mM步骤模拟了在该层析步骤中应用的最大离子强度。这保证了在最大洗脱条件下，在施加蛋 白质溶液之前，残余蛋白质从树脂中被洗去。 
在这种情况下，柱子已准备好施加样本。样本量限定了加载时间(以mL每分钟给定的加载速度；通过系统压力-最大6bar，来限制高速加载)。通过紫外灯在280nm下检测蛋白质。在样本加载期间，加载峰值非常高。这反映了如下事实：TRITONTM 100被溶于蛋白质溶液，已知其同样在280nm下有吸收(参见图9)。在完成样本加载后，再次用平衡缓冲液冲洗柱子。持续冲洗直至280nm的信号保持不变。这在约3CV的平衡缓冲液冲洗以后会发生。 
在紫外线信号在基线处稳定之后，启动洗脱程序。其包含几个分开的步骤。首先，连续添加洗脱缓冲液，逐渐地增加离子强度并且导致在层析中看得见的杂质的减少，在约18％的洗脱缓冲液(“缓冲液B”)处出现小峰。该步骤被暂时中止，直到蛋白质峰的紫外线再次在基线处。在25％的缓冲液B处，梯度再次被暂时中止，直到在线性梯度继续之前紫外线信号再次满足基线水平。一般来讲，在约30-35％的缓冲液B处，rSLA开始洗脱并且形成峰值，该洗脱在约60％的缓冲液B处中止。该组分被收集在分开的小瓶中，现在含有纯化产物。 
对于rSLA洗脱，缓冲液B百分比的观察带(window)被选择得较窄(35-55％缓冲液B，而不是30-60％)。少量的靶蛋白质损失不能避免，但是在所有3种嵌合rSLA的情况中都取得了最终产品的高纯度。实施例6完成rSLA纯化方案的具体实施例 
按下述进行根据本发明方法的具体实施例： 
将表达rSLA的E.coli的湿细胞团块再悬浮并且均质化，以便破裂细菌细胞。然后该细胞悬液进行微过滤，并且用Tris缓冲液洗涤(微渗滤)，以便洗去细小颗粒和可溶性的E.coli蛋白质。通过含有TRITONTM X100的第二微渗滤缓冲液进行萃取，这使来自E.coli细胞膜的rSLA增溶。该蛋白质溶液然后进行0.2μm过滤，以便保持随后的阴离子交换柱不含细菌。阴离子交换层析被用作阴性层析步骤。E.coli白质很大程度上被结合。相反，rSLA大量地穿过柱子，并且因此在流动通过液中被发现。该含有靶蛋白质的流动通过液然后穿过薄膜吸附器(阴离子交换过滤)用于除去残留的内毒素。为了改变缓冲条件用于随后的最后层析步骤，进行超滤。具有大量rSLA和TRITONTM X100的蛋白质溶液然后被加载到HA柱上，减少残留的E.coli蛋白质和TRITONTM X100。进行最后的超滤，以便将rSLA转移进入生理学缓冲系统。最后的无菌过滤完成纯化工艺。 

Claims (55)

1.一种由细胞获得高度纯化的疏水性蛋白质的方法，包括下述步骤：
(i)使细胞均浆液进行微过滤；
(ii)使用含有至少一种洗涤剂的缓冲溶液，通过微渗滤，萃取由所述微过滤获得的滞留物；以及
(iii)对由所述微渗滤获得的滤液进行羟基磷灰石(HA)柱层析，其中，在所述HA柱层析之前任选地对由所述微渗滤获得的所述滤液进行进一步的层析步骤。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在萃取步骤(ii)之前，使用选自下组的合适缓冲液洗涤所述细胞均浆液：Tris-缓冲液、HEPES缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、以及磷酸盐缓冲液。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在羟基磷灰石柱层析步骤(iii)之前，对从所述萃取步骤(ii)获得的所述滤液进行离子交换层析。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在羟基磷灰石柱层析步骤(iii)之前，使用薄膜吸附器对从所述萃取步骤(ii)获得的所述滤液进行阴离子交换过滤。
5.权利要求1所述的方法，其特征在于，待被纯化的所述疏水性蛋白质是重组体合成莱姆抗原(rSLA)。
6.权利要求1所述的方法，其特征在于，待被纯化的所述疏水性蛋白质是脂质性蛋白质。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，待被纯化的所述疏水性蛋白质是来自疏螺旋体的脂蛋白。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，待被纯化的所述疏水性蛋白质是脂蛋白，所述脂蛋白与Borrelia sp.的OspA蛋白质在含至少130个邻接的氨基酸的整个初始序列中具有至少50％的一致性。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，含有所述疏水性蛋白质的所述细胞是选自下组的寄主细胞：大肠杆菌、酵母、植物细胞、昆虫细胞、鸟类细胞、或哺乳动物细胞。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(ii)中使用的所述缓冲液含有选自下组的洗涤剂：阴离子洗涤剂、阳离子洗涤剂、两性离子型洗涤剂、以及非离子型洗涤剂，
其中，所述阴离子洗涤剂选自下组：胆酸和其衍生物、N，N-二甲基十二基胺N-氧化物、1-烷基磺酸钠、N-月桂基肌氨酸、或脂肪酸盐；
其中，所述阳离子洗涤剂选自下组：烷基三甲基溴化铵和其衍生物、或苯扎氯铵；
其中，所述两性离子型洗涤剂选自下组：十二基甜菜碱、烷基二甲胺氧化物和其衍生物、或3-(N，N-二甲基烷基氨基)-丙烷磺酸盐；并且
其中，所述非离子型洗涤剂选自下组：辛基苯酚乙氧基酯、聚氧化乙烯单油酸山梨醇酐酯、烷基聚环氧乙烷和其衍生物、烷基多葡糖甙、或脂肪醇。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述洗涤剂以约0.5％至约3.0％的含量存在。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述洗涤剂以约1％至约1.5％的含量存在。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(ii)中使用的所述缓冲液是Tris-缓冲液。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(ii)中使用的所述缓冲液含有辛基苯酚乙氧基酯作为洗涤剂。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述萃取步骤(ii)之后，使用0.2μm孔径尺寸的微过滤过滤片进行微过滤和/或微渗滤步骤。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液的浓度范围为约0.1mM至约1.0M。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液的浓度范围为约1.0mM至约600mM。
18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液的pH范围为约3.0至约10.0。
19.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液的pH范围为约6.0至约8.0。
20.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法在室温下进行。
21.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法在约0℃至约15℃的温度下进行。
22.一种由细胞获得高度纯化的脂质性蛋白质的方法，包括下述步骤：
(i)提供含有所述脂质性蛋白质的细胞；
(ii)均质化所述细胞；
(iii)对这样获得的均浆液进行包括下述步骤的微渗滤：
(a)通过微过滤浓缩所述均浆液；
(b)通过微渗滤洗涤所述生物质，借此获得微渗滤液-1和微渗滤滞留物-1；
(c)使用含有洗涤剂的缓冲液，通过微渗滤从所述微渗滤滞留物-1中萃取脂质性蛋白质，借此获得微渗滤液-2和微渗滤滞留物-2；
(iv)对含有所述萃取的脂质性蛋白质的所述微渗滤液-2进行离子交换层析，其洗脱液含有所述纯化的脂质性蛋白质；
(v)对步骤(iv)中由离子交换层析得到的所述洗脱液进行阴离子交换过滤，用于除去残留的内毒素；以及
(vi)对这样获得的含有所述脂质性蛋白质的蛋白质溶液进行羟基磷灰石(HA)柱层析。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，在萃取步骤(c)之前，使用选自下组的合适缓冲液洗涤所述细胞均浆液：Tris-缓冲液、HEPES缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、以及磷酸盐缓冲液。
24.如权利要求22所述的方法，其特征在于，在羟基磷灰石柱层析步骤(vi)之前，对从所述萃取步骤(c)获得的所述滤液进行离子交换层析。
25.如权利要求22所述的方法，其特征在于，在羟基磷灰石柱层析步骤(vi)之前，使用薄膜吸附器对从所述萃取步骤(c)获得的所述滤液进行阴离子交换过滤。
26.如权利要求22所述的方法，其特征在于，含有所述疏水性蛋白质的所述细胞是选自下组的寄主细胞：大肠杆菌、酵母、植物细胞、昆虫细胞、鸟类细胞、或哺乳动物细胞。
27.如权利要求22所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中使用的所述缓冲液含有选自下组的洗涤剂：阴离子洗涤剂、阳离子洗涤剂、两性离子型洗涤剂、以及非离子型洗涤剂，
其中，所述阴离子洗涤剂选自下组：胆酸和其衍生物、N，N-二甲基十二基胺N-氧化物、1-烷基磺酸钠、N-月桂基肌氨酸、或脂肪酸盐；
其中，所述阳离子洗涤剂选自下组：烷基三甲基溴化铵和其衍生物、或苯扎氯铵；
其中，所述两性离子型洗涤剂选自下组：十二基甜菜碱、烷基二甲胺氧化物和其衍生物、或3-(N，N-二甲基烷基氨基)-丙烷磺酸盐；并且
其中，所述非离子型洗涤剂选自下组：辛基苯酚乙氧基酯、聚氧化乙烯单油酸山梨醇酐酯、烷基聚环氧乙烷和其衍生物、烷基多葡糖甙、或脂肪醇。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述洗涤剂以约0.5％至约3.0％的含量存在。
29.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述洗涤剂以约1％至约1.5％的含量存在。
30.如权利要求22所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中使用的所述缓冲液是Tris-缓冲液。
31.如权利要求22所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中使用的所述缓冲液含有辛基苯酚乙氧基酯作为洗涤剂。
32.如权利要求22所述的方法，其特征在于，在所述萃取步骤(c)之后，使用0.2μm孔径尺寸的微过滤过滤片进行微过滤和/或微渗滤步骤。
33.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述缓冲液的浓度范围为约0.1mM至约1.0M。
34.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述缓冲液的浓度范围为约1.0mM至约600mM。
35.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述缓冲液的pH范围为约3.0至约10.0。
36.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述缓冲液的pH范围为约6.0至约8.0。
37.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述方法在室温下进行。
38.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述方法在约0℃至约15℃的温度下进行。
39.一种由细胞获得高度纯化的重组体合成莱姆抗原(rSLA)的方法，包括下述步骤：
(i)提供含有所述rSLA的细胞；
(ii)均质化所述细胞；
(iii)对这样获得的均浆液进行包括下述步骤的微渗滤：
(a)通过微过滤浓缩所述均浆液；
(b)通过微渗滤洗涤所述生物质，借此获得微渗滤液-1和微渗滤滞留物-1；
(c)使用至少含有辛基苯酚乙氧基酯的缓冲液，通过微渗滤从所述微渗滤滞留物-1中萃取rSLA，借此获得微渗滤液-2和微渗滤滞留物-2；
(iv)对含有所述萃取的rSLA的所述微渗滤液-2进行阴离子交换层析，其洗脱液含有纯化的rSLA；
(v)对步骤(iv)中由阴离子交换层析得到的所述洗脱液进行阴离子交换过滤，用于除去残留的内毒素；以及
(vi)对这样获得的含有rSLA的蛋白质溶液进行羟基磷灰石(HA)柱层析。
40.如权利要求39所述的方法，其特征在于，在萃取步骤(c)之前，使用选自下组的合适缓冲液洗涤所述细胞均浆液：Tris-缓冲液、HEPES缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、以及磷酸盐缓冲液。
41.如权利要求39所述的方法，其特征在于，在羟基磷灰石柱层析步骤(vi)之前，对从所述萃取步骤(c)获得的所述滤液进行离子交换层析。
42.如权利要求39所述的方法，其特征在于，在羟基磷灰石柱层析步骤(vi)之前，使用薄膜吸附器对从所述萃取步骤(c)获得的所述滤液进行阴离子交换过滤。
43.如权利要求39所述的方法，其特征在于，含有所述疏水性蛋白质的所述细胞是选自下组的寄主细胞：大肠杆菌、酵母、植物细胞、昆虫细胞、鸟类细胞、或哺乳动物细胞。
44.如权利要求39所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中使用的所述缓冲液含有选自下组的洗涤剂：阴离子洗涤剂、阳离子洗涤剂、两性离子型洗涤剂、以及非离子型洗涤剂，
其中，所述阴离子洗涤剂选自下组：胆酸和其衍生物、N，N-二甲基十二基胺N-氧化物、1-烷基磺酸钠、N-月桂基肌氨酸、或脂肪酸盐；
其中，所述阳离子洗涤剂选自下组：烷基三甲基溴化铵和其衍生物、或苯扎氯铵；
其中，所述两性离子型洗涤剂选自下组：十二基甜菜碱、烷基二甲胺氧化物和其衍生物、或3-(N，N-二甲基烷基氨基)-丙烷磺酸盐；并且
其中，所述非离子型洗涤剂选自下组：辛基苯酚乙氧基酯、聚氧化乙烯单油酸山梨醇酐酯、烷基聚环氧乙烷和其衍生物、烷基多葡糖甙、或脂肪醇。
45.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述洗涤剂以约0.5％至约3.0％的含量存在。
46.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述洗涤剂以约1％至约1.5％的含量存在。
47.如权利要求39所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中使用的所述缓冲液是Tris-缓冲液。
48.如权利要求39所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中使用的所述缓冲液含有辛基苯酚乙氧基酯作为洗涤剂。
49.如权利要求39所述的方法，其特征在于，在所述萃取步骤(c)之后，使用0.2μm孔径尺寸的微过滤过滤片进行微过滤和/或微渗滤步骤。
50.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述缓冲液的浓度范围为约0.1mM至约1.0M。
51.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述缓冲液的浓度范围为约1.0mM至约600mM。
52.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述缓冲液的pH范围为约3.0至约10.0。
53.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述缓冲液的pH范围为约6.0至约8.0。
54.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述方法在室温下进行。
55.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述方法在约0℃至约15℃的温度下进行。
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