KR102356757B1

KR102356757B1 - 단백질 정제

Info

Publication number: KR102356757B1
Application number: KR1020167012940A
Authority: KR
Inventors: 알로이스 융바우어; 랄프 소머
Original assignee: 노바셉 이큅먼트 솔루션즈
Priority date: 2013-10-18
Filing date: 2014-10-17
Publication date: 2022-02-03
Also published as: US20160272675A1; WO2015056237A3; CN106029690B; WO2015056237A2; EP3057987B1; KR20160078994A; EP3057987A2; CN106029690A; SG11201603028SA; US10508133B2; SG10201811186XA

Abstract

본원은 친수성 중합체(예를 들면, PEG), 지방산(예를 들면, 카프릴산) 및/또는 또 다른 제제(예를 들면, 염화칼슘)를 사용한 항체와 같은 단백질의 정제 방법에 관한 것이다.

Description

단백질 정제{PURIFICATION OF PROTEINS}

관련 출원

본원은 2013년 10월 18일자로 출원된 미국 우선권 번호 제61/892,975호의 우선권을 주장한다.

본 개시의 분야

본원은 항체와 같은 단백질의 정제 방법에 관한 것이다.

소수성 중합체(폴리에틸렌 글리콜 = PEG)에 의한 IgG(재조합 항체)의 침전은 모노클로날 항체의 정제를 위한 종래의 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 대한 대안적 방법이다. PEG에 의한 단백질 침전은 폴슨(Polson)에 의해 확립되었다(참조: Polson et al. 1964). 아타(Atha) 및 잉엄(Ingham)(참조: Atha and Ingham 1981)은 침전된 단백질의 농도가 PEG 농도의 증가에 따라 증가하며 침전은 또한 PEG 크기 및 pH 값에 영향을 받는 것을 밝혀냈다(참조: Polson et al. 1964). 폴리에틸렌 글리콜에 의한 침전 기전은 용적 배제(volume exclusion) 반응인 것으로 추정된다(참조: Mahadevan and Hall 1990). PEG는 거대 단백질(예를 들면, 숙주 세포 단백질(HCP))뿐만 아니라 DNA를 침전시키는데 사용될 수 있다. 그러나, 약 2배의 분자 질량의 차이로 PEG에 의한 DNA(뿐만 아니라 다른 거대 단백질)로부터의 IgG의 분리는 완전한(예를 들면, 100%) 분리를 달성하는 것이 요구된다(참조: Lis and Schleif 1975). 필요한 DNA 및 HCP 제거율을 얻기 위해, PEG 침전을 또 다른 침전 접근법과 조합할 수 있다. 카프릴산 침전은 말 혈장 밖으로 독을 분리하는 보통의 방법이다(참조: Rojas et al. 1994). 몇몇 공보에서는 카프릴산 침전을 위한 침전 파라미터가 기재되어 있다(참조: McKinney and Parkinson 1987; Mohanty and Elazhary 1989; Russo et al. 1983). 카프릴산 침전을 황산암모늄 침전과 같은 상이한 정제법과 조합하여 사람 면역글로불린을 정제하거나(참조: Perosa et al. 1990) 이온-교환 크로마토그래피와 조합하여 말 해독제(equine antivenom)를 분리했다(참조: Raweerith and Ratanabanangkoon 2003). 또한, CHO 세포 배양물 상청액에서의 공정-유래된 불순물의 CA 침전이 추가의 양이온-교환 크로마토그래피 단계와 조합되어 또한 수행되었다(참조: Wang et al. 2009).

카프릴산은 또한 사람 혈장으로부터 비-면역글로불린 단백질을 침전시키는데 사용되었다. 상청액에 존재하는 조질(crude)의 IgG(흡광도 단위의 측면에서 총 단백질 중 26 내지 29%를 함유하거나 중량 기준으로 78 내지 87%의 IgG를 함유함)를 DEAE-셀룰로즈 상에서 분별시켜 디스크 전기영동, 면역전기영동 및 겔 여과에 의해 확인된 바와 같이 순수한 IgG를 수득했다. 순수한 IgG는 플라스민 및 플라스미노겐이 없었으며 40℃에서 4주 이하의 기간 동안의 저장 동안 어떠한 단편화 또는 응집도 나타내지 않았고 이의 항보체 활성은 낮았다. 바이러스 감염원(viral agent)에 대한 항체는 변하지 않은채 회수되었다(참조: Habeeb, et al. Preparation of Human Immunoglobulin by Caprylic Acid Precipitation. Preparative Biochemistry, 14(1): 1-17 (1984)).

파키넨 등(참조: Parkkinen, et al., Vax Sanguinis, 90: 97-104 (2006))은 단백질 및 지질을 오염시키는 외피보유 바이러스 및 침전물을 불활성화시키기 위한 카프릴산 처리에 의해 사람 콘 분획(Cohn fraction) II+III으로부터 순수한, 본질적으로 중합체-비함유 IgG를 단리하고, IgG를 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 침전시키고 음이온-교환 크로마토그래피로 최종 정제하는 방법을 기재한다. US 2007/0244305 A1(파키넨, J.)은 유사한 공정을 기재한다.

베르그만-라이트너 등(참조: Bergmann-Leitner, et al., Malaria J. 7: 129-139 (2008))은 면역글로불린(Ig) 공급원으로서 면역화된 토끼 혈청 또는 말라리아-노출된 사람 혈청을 사용하여 다양한 면역글로불린(Ig) 절차들을 비교한다. 시험된 절차들은 혈청 단백질의 카프릴산 소모에 이어서 황산암모늄 침전(CA-AS)에 의한 총 Ig의 농축을 포함했다. 상기 CA-AS 방법은 유의미한 분해 없이 양호한 수율을 제공하는 것으로 밝혀졌다. PEG 침전은 사람 Ig를 단리하는데 최적인 것으로 밝혀졌다.

바르가스 등(참조: Vargas, et al., Biotechnol. Prog., 28(4): 1005-1011 (2012))은 PEG 침전에 의해 상부 및 하부 상으로서의 알부민으로부터 사람 IgG의 분리를 기재한다. 상부 상에 존재하는 IgG는 이때 카프릴산 침전 및 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 단리되었다.

미국 특허 제4,164,495호(참조: Hansen, J.)는 4 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 모노알칸산 또는 폴리알칸산, 예를 들면, 카프릴산의 존재 하에 중축합된 디올 또는 폴리올, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 면역글로불린(Ig)을 단리하는 방법을 기재한다. 우선 PEG를 단독으로 사용하여 사람 혈장으로부터 피브리노겐을 침전시키고, Ig를 포함하는 침전물을 단리하고, 염화나트륨 용액에 상기 침전물을 용해시키고, 상기 용액을 카프릴산 및 PEG와 혼합하여 사람 혈장으로부터 Ig를 단리하는 방법이 상기 문헌에 기재되어 있다. 수득된 침전물을 제거하고 액체 상을 PEG 단독으로 침전시켜 60% 수율로 "순수한" Ig를 수득한다.

미국 특허 제5,164,487호(참조: Kothe, et al.)는 크로마토그래피 또는 콘 공정(Cohn process)에 의해 수득된 IgG를 함유하는 비가공(raw) 분획을 처리하고 0.4 내지 1.5% 옥탄산(용적 기준) 및 크로마토그래피(이온 또는 양이온 교환기 또는 소수성 매트릭스)를 사용하여 IgG를 농축시켜 "정맥내로 용인되는" Ig를 단리하는 방법에 관한 것이다. "정맥내로 용인되는" 제제는 부작용 없이 환자에게 투여될 수 있는 것으로 기재된다.

슈타인부흐 등(참조: Steinbuch, et al., Arch. Biochem. Biophys. 134: 279-284 (1969))은 사람 혈청으로부터의 정제된 IgG를 (카프릴산/아세테이트 완충액(pH 4.8)을 사용하여 90%까지) 침전시키기 위한 카프릴산 및 (IgA, 세룰로플라스민 및 α₁-산-당단백질을 제거하기 위한) 이온 교환 셀룰로즈 및/또는 크기 배제 크로마토그래피의 사용을 기재한다. 유사한 절차가 동물(말, 양, 토끼) 혈청으로부터 Ig를 단리하는데 사용되었다.

맥키니(참조: McKinney, J. Immunol. Meth. 96: 271-8 (1987))는 포유동물 복수 유체로부터 IgG를 단리하기 위한 2-단계 절차를 개시한다. 제1 단계는 알부민 및 기타 비-IgG 단백질을 카프릴산(옥탄산)과 함께 침전시키고 제2 단계는 IgG를 황산암모늄으로 침전시킨다(예를 들면, 토끼 혈청으로부터 80 내지 90% 회수율).

미국 특허 제5,747,031호(참조: Ruch, et al.)는 지질 및 비-Ig 단백질을 하전된 중합체(예를 들면, 키토산) 및 지방산(예를 들면, 카프릴산)과 함께 동시에 공침시켜 유청(예를 들면, 과면역 우유로부터 제조됨)으로부터 Ig를 단리하는 방법을 기재한다. 이어서 수득된 상청액을, 예를 들면, 정용여과(diafiltration)로 추가로 처리하여 단리된 Ig를 수득한다(예를 들면, 66 내지 79%).

WO 86/05099A1(참조: Steinbuch, et al.)은 카프릴산과 같은 포화된 지방산을 사용하여 사람 혈장으로부터 IgG4를 단리하는 방법에 관한 것이다.

US 2002/177693 AA(참조: Lebing, et al.)는 침전된 Ig를 포함하는 조성물을 제조하고, pH 3.8 내지 4.5의 용액 중에서 Ig를 용해시키고, 카프릴레이트 이온을 첨가하고 pH를 5.0 내지 5.2로 증가시키고, 침전된 단백질, 지질 및 카프릴레이트를 여과하여 제거함으로써 사람 혈장으로부터 항체를 정제하는 방법을 기재한다. 이어서 카프릴레이트를 수득된 용액에 첨가하고, 온도를 증가시키고, 필터 조제를 도입했다. 이어서 수득된 침전물을 유동 여과에 의해 제거한다. 이어서 용액을 2개의 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 통과시켜 >99% 순도의 Ig를 수득한다.

WO 2012/136172A1(참조: Segura Ruiz, et al.)은 페놀을 포함하는 2상 시스템에서 공급 물질을 분별하여 주사가능한 혈액-유래 단백질 물질의 생산 방법을 기재하며, 상기 2상 시스템에서 한 상은 카프릴산으로 침전되고 다른 상은 열응고로 처리된다.

스벤드센 등(참조: Svendsen, et al. (Lab. Animal Sci. 45(1): 89-93 (1995))은 각각 황산암모늄, PEG 및 카프릴산에 의한 달걀 노른자로부터의 항체들의 정제를 비교한다. 황산암모늄은 최고의 순도 및 수율을 제공하는 것으로 측정되었고, 카프릴산은 임의의 정제된 항체를 산출하지 않는 것으로 밝혀졌다.

츠헬리스니크 등(참조: Tscheliessnig, et al., J. Chromatogrphy, 1216: 7851-7864 (2009))은 PEG 및 음이온-교환 크로마토그래피를 사용하여 IgM(하이브리도마 기원)으로부터 2-단계 정제 공정을 기재한다. 순도는 46% 내지 >95%의 범위였고 수율은 28 내지 84%였다.

크네벨만 등(참조: Knevelman, et al., Biotechnol. Prog. 26: 697-705 (2010))은 세포 배양물 배지로부터 IgG4의 신속한 PEG-기반 침전을 기재한다. 최대 수율 및 순도는 10 내지 18% PEG(w/v)의 사용으로부터 초래되는 것으로 측정되었다.

쿠체프스키 등(참조: Kuczewski, et al., Biopharm. Int., Supp., pp. 20-28 (March 2010))은 대략 90%의 수율 및 7배의 숙주 세포 단백질(HCP) 함량의 감소를 초래하는, 정화된 세포 배양물 배지로부터 모노클로날 항체의 PEG-기반 침전을 기재한다. 항체는 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 포획되었다. PEG-3350의 사용은 높은 회수율을 제공하지만 더 적은 HCP 감소를 제공하는 것으로 밝혀졌다. PEG-6000은 HCP를 더 우수하게 감소시키지만 낮은 수율을 초래하는 것으로 밝혀졌다. 14%의 PEG-3350(pH 8.5)이 최적의 조건으로 선택되었다.

깁슨 등(참조: Gibson, et al., J. Pharm. Sci. 100(3): 1009-1021 (2011))은 CHO 세포 또는 뮤린 세포주(각각 mAb에 대한 상이한 글리코실화 패턴을 제공함)에 의해 생성된 IgGl mAb의 용해도를 시험하기 위해 PEG를 다양한 pH 값에 걸쳐 시트레이트, 아세테이트, 히스티딘 또는 포스페이트 완충액과 함께 사용하는 방법에 관한 것이다. 이들 비교는 mAb 제제의 고효율 분석에 사용하기 위한 전략을 확인하도록 이루어졌다.

세포 배양물 상청액으로부터 항체와 같은 단백질을 단리하기 위한 향상된 방법에 대한 당해 분야에서의 필요가 존재한다. 본 발명은 이러한 향상된 방법을 제공한다.

일부 양태에서, 본 발명은 pH 5.0 내지 8.5에서 세포 배양물 상청액을 10 내지 14% 폴리에틸렌 글리콜(PEG(예를 들면, PEG2000, PEG4000, PEG6000 및 PEG20000))(예를 들면, 약 14% 또는 약 21%)과 배합함을 포함하는, 목적하는 단백질을 포함하는 상기 세포 배양물 상청액에 존재하는 핵산 및 기타 숙주 세포 단백질로부터 목적하는 단백질을 단리하는 방법에 관한 것이다. 일부 양태에서, 14% PEG6000이 사용된다. 일부 양태에서, 이들 방법은 우선 염화칼슘을 사용하여 핵산과 단백질 불순물을 침전시킴을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 이들 방법은 지방산(예를 들면, 카프릴산)을 사용하여 숙주 세포 단백질을 침전시킴을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 약 5 내지 약 200mM 또는 0.1 내지 10% 지방산(예를 들면, 카프릴산)이 사용될 수 있고/있거나 pH는 약 4.0 내지 약 6.0(예를 들면, pH 4.5)일 수 있다. 일부 양태에서, 이러한 제제는 대안적으로 및/또는 또한 염화칼슘(250mM CaCl₂, pH 8.5)을 사용하여 처리되어 불순물(예를 들면, DNA)을 침전시킬 수 있다. 목적하는 단백질은 카프릴산 및/또는 염화칼슘을 사용한 불순물의 침전, 중합체(예를 들면, PEG)를 사용한 목적하는 단백질의 침전 및 차가운 에탄올을 사용한 추가의 침전(예를 들면, 세척)과 같은 방법들을 임의의 순서로(그러나, 에탄올의 존재 하에서의 침전은 전형적으로 마지막에 수행된다) 임의로 조합하여 단리될 수 있다. 일부 양태에서, 항체는 카프릴산을 사용한 불순물의 침전, 중합체(예를 들면, PEG)를 사용한 목적하는 단백질의 침전, 목적하는 단백질의 재용해 및 조성물로부터 불순물의 침전, 이러한 불순물의 제거 및 차가운 에탄올을 사용한 단리된 항체의 침전(예를 들면, 세척)에 의해 단리될 수 있다. 임의의 이러한 방법에서, 목적하는 단백질은 항체일 수 있다. 또한, 이들 방법은 크로마토그래피의 사용 없이 완료될 수 있다(예를 들면, 목적하는 단백질은 원하는 수율(예를 들면, 약 80% 이상)에서 원하는 수준(예를 들면, 약 95% 이상의 순도)으로 정제된다).

일부 양태에서, 본 발명은 (a) 완충액(예를 들면, 시트레이트, 예를 들면, 나트륨 시트레이트) 중에서 적어도 하나의 지방산(예를 들면, 카프릴산)을 사용하여 세포 배양물 상청액으로부터 (예를 들면, 직접적으로) 숙주 세포 오염물을 침전시켜 면역글로불린을 포함하는 제2 상청액을 생성하는 단계; 및 (b) 임의로 적어도 하나의 염을 포함하는, 적어도 하나의 친수성 중합체(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(PEG))를 사용하여 제2 상청액으로부터 IgG를 침전시키는 단계에 의해 세포 배양물 상청액으로부터 면역글로불린 G(IgG)를 단리시키는 방법에 관한 것이며; 여기서 IgG는 적어도 약 95%로 정제되고; 수율은 적어도 약 80%이다. 전형적으로, 이들 방법은 크로마토그래피의 사용을 포함하지 않는다. 특정 양태에서, 단계 (a) 동안 사용된 카프릴산의 농도는 약 0.1% 내지 약 10%(예를 들면, 1%) 및/또는 약 5mM 내지 약 200mM일 수 있다. 일부 양태에서, 단계 (a)에서 사용된 pH는 약 4.0 내지 약 6.0(예를 들면, 약 pH 4.5)일 수 있다. 단계 (b)에서, PEG의 농도는 약 10% 내지 약 30%(예를 들면, 약 14% 또는 약 21%)일 수 있으며; 단계 b)에서 침전 동안의 pH는 약 5 내지 약 8.5일 수 있고; 온도는 약 4℃ 내지 약 35℃일 수 있다. 특정 양태에서, 단계 b)는 약 15분 후 완료될 수 있고/있거나 약 30분 내지 약 60분 후 평형에 도달한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 추가의 침전 절차(예를 들면, 차가운 에탄올 침전)는 단계 b)를 따른다. 또한, 이들 방법은 크로마토그래피의 사용 없이 완료될 수 있다(예를 들면, 항체는 원하는 수율(예를 들면, 약 80% 이상)에서 원하는 수준(예를 들면, 약 95% 이상의 순도)으로 정제된다).

일부 양태에서, 본 발명은 또한 실질적으로 단리된 목적하는 단백질(예를 들면, 항체)을 포함하는 제제의 연속적 생산을 위한 장치 및 방법을 제공한다. 상기 장치는, 예를 들면, 2-단계 침전 반응기(예를 들면, 도 18a 및 18b)일 수 있다. 일부 양태에서, 반응기는 약 2리터 용적 및/또는 적합한 유속(예를 들면, 20ml/분)을 제공한다. 상기 장치는 튜빙(예를 들면, 5mm 직경 실리콘 튜브), 전자 밸브, 필터 유닛 등을 포함할 수 있다. 장치는 또한 제1 및 제2 침전 반응이 서로 독립적으로 수행될 수 있도록 배치될 수 있다.

다른 양태는 본원에 제공된 개시내용으로부터 명백할 것이다.

도 1. PEG 침전 분석.
도 2. 2-D 겔 전기영동 결과.
도 3. 예시적인 카프릴산(CA) 침전 프로토콜.
도 4a 및 4b. B03(패널 A) 및 B07(패널 B) 상청액(pH 4.5에서의 상청액(SN) 및 ph 4.5에서 CA 침전 후 SN)의 SEC(BIO-SEC 3, 에이질런트(Agilent)) 크로마토그램 비교.
도 5a 및 5b. pH 5.5 및 40rpm 혼합 속도에서 상이한 NaAc 염 농도의 존재 하에 CA 침전(1% CA) 후 B03 및 B07의 수율; 세포 배양물 상청액(패널 A) 또는 pH 조정된 세포 배양물 상청액(패널 B)과 비교됨.
도 6. 예시적인 CA/PEG 침전 프로토콜.
도 7a 및 7b. 상이한 pH 값에서 CA 및 CA/PEG 침전 후 mAbs의 수율(BIO-SEC 3, 에이질런트) 및 HCP(HCP-ELISA, 시그너스(Cygnus))(패널 A: B03; 패널 B: B07).
도 8a 및 8b. mAb 침전에 대한 PEG 농도의 증가에 따른 수율(BIO-SEC 3, 에이질런트) 향상(패널 A: B03; 패널 B: B07).
도 9a 및 9b. 상이한 pH 값에서 CA(갈색 막대) 및 CA/PEG(녹색 막대) 침전 후 수율(BIO-SEC 3, 에이질런트) 및 CA/PEG 침전(청색 막대) 후 순도(HCP-ELISA, 시그너스)(패널 A: B03; 패널 B: B07).
도 10a 및 10b. 상이한 NaAc 완충액 농도에서 CA(갈색 막대) 및 CA/PEG(녹색 막대) 침전 후 mAbs의 수율(BIO-SEC 3, 에이질런트) 및 CA/PEG 침전(청색 막대) 후 순도(HCP-ELISA, 시그너스)(패널 A: B03; 패널 B: B07).
도 11a 및 11b. 상이한 pH 값에서 CA(갈색 막대) 및 CA/PEG (녹색 막대) 침전 후 mAbs의 수율(BIO-SEC 3, 에이질런트) 및 CA/PEG 침전(청색 막대) 후 순도(HCP-ELISA, 시그너스)(패널 A: B03; 패널 B: B07).
도 12a 및 12b. CA 및 PEG 침전 후 수율 및 배수-HCP 감소(패널 A: B03; 패널 B: B07).
도 13a 및 13b. 100 및 200mM NaCit E에서 CA(갈색 막대) 및 CA/PEG(녹색 막대) 침전 후 mAb의 수율(BIO-SEC 3, 에이질런트) 및 CA/PEG 침전(청색 막대) 후 순도(HCP-ELISA, 시그너스): CA/PEG 침전 후 수율 및 순도(mAb 1).
도 14a 및 14b. NaCit 완충계 중에서 상이한 CA 농도에서 CA(갈색 막대) 및 CA/PEG(녹색 막대) 침전 후 mAb의 수율(BIO-SEC 3, 에이질런트) 및 CA/PEG 침전(청색 막대) 후 순도(HCP-ELISA, 시그너스)(패널 A: B03; 패널 B: B07).
도 15a 및 15b. NaCit 완충계 중에서 상이한 CA 농도에서 CA(갈색 막대) 및 CA/PEG(녹색 막대) 침전 후 mAbs의 수율(단백질 A 친화성 크로마토그래피) 및 CA/PEG 침전(청색 막대) 후 순도(HCP-ELISA, 시그너스)(패널 A: B03; 패널 B: B07).
도 16a 및 16b. CA/PEG 침전 정제된 mAbs 및 세포 배양물 상청액의 비교(SEC TSK3000 SWXL, 도소(Tosho), 280nm)(패널 A: B03; 패널 B: B07).
도 17a 내지 17f. 침전 데이타(A: 나트륨 아세테이트(NaAc); B: 나트륨 시트레이트(NaCit); C: NaAc 스크리닝; D: NaCit 스크리닝; E: CA/PEG 침전(mAb 1) 후 수율 및 순도; F: CA/PEG 침전(mAb 2) 후 수율 및 순도.
도 18a 및 b. 카프릴산 침전, PEG 침전, CaCl₂ 침전 및 에탄올 침전을 조합한 예시적 공정들.
도 19. mAb 정제를 위한 예시적인 반응기.

상기 간략히 기재되고 하기 더 상세히 기재된 바와 같이, 본 발명은 항체(예를 들면, 모노클로날 항체)와 같은 단백질의 정제 동안 전형적으로 마주치는 문제들을 해결하는 방법에 관한 것이다. 본원에 기재된 방법은 놀랍게도 다른 성분들 중에서도 항체, 기타 단백질 및/또는 핵산을 포함하는 조성물로부터 정제된 항체 제제를 제공하는데 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 기재된 방법은 세포-비함유 배양물 상청액으로부터 직접적으로 고도로 순수한 항체(예를 들면, 95% 이상)를 고 수율(예를 들면, 80% 이상)로 생산하기 위해 제공된다.

상기 및 청구범위에 기재된 바와 같이, 본 발명은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 사용하여 목적하는 단백질을 포함하는 세포 배양물 상청액(세포-비함유 배양물 상청액일 수 있음)에 존재하는 핵산 및 기타 숙주 세포 단백질로부터 목적하는 단백질을 단리하는 방법에 관한 것이다. 일부 양태에서, 상기 방법은 이러한 세포 배양물 상청액을 제1 침전제(예를 들면, 염화칼슘 및/또는 지방산, 예를 들면, 카프릴산)와 배합하여 침전된 단백질 및/또는 기타 성분들을 제거함으로써 제2 세포 배양물 상청액(예를 들면, 여전히 목적하는 단백질을 포함하는 세포 배양 상청액)을 생성하고, 침전 중합체(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(PEG))를 도입하여 제2 세포 배양물 상청액으로부터 목적하는 단백질(예를 들면, 항체)을 침전시킴을 포함한다. 일부 양태에서, 염화칼슘은 이후 PEG-침전된 단백질로부터 불순물을 추가로 제거하는데 사용될 수 있다.

특정 양태에서, 이들 방법은 하나 이상의 지방산(예를 들면, 카프릴산)을 사용하여 세포 배양물 성분, 예를 들면, 숙주 세포 단백질(HCP)을 침전시킴을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 지방산은 침전 혼합물에 약 0.1% 내지 약 10%(v/v)의 양(예를 들면, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0. 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5 또는 10.0% 중 대략 어느 양)으로 존재할 수 있고/있거나 약 5 내지 약 250mM 지방산(예를 들면, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245 또는 250mM 중 대략 어느 농도)이 사용될 수 있다. 약 4 내지 6의 pH(예를 들면, 약 4.5 내지 약 5.5, 또는 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0. 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9 또는 6.0 중 대략 어느 pH)가 사용될 수 있다. 지방산은 또한 염(예를 들면, 나트륨 아세테이트 또는 나트륨 시트레이트(예를 들면, 0.1 내지 200mM의 상기 염들 중 어느 하나, 예를 들면, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200mM 중 대략 어느 농도)의 존재 또는 부재 하에 사용될 수 있다. 침전은 적절한 시간, 예를 들면, 5 내지 90분(예를 들면, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 또는 90분 중 대략 어느 시간) 동안 수행될 수 있다. 이러한 반응을 위한 적절한 온도는, 예를 들면, 약 4℃ 내지 약 35℃일 수 있다. 예시적인 방법은 약 1% 카프릴산을 포함하는 세포 배양물 상청액을 제조하고, 나트륨 아세테이트 또는 나트륨 시트레이트 제제(예를 들면, 약 10 내지 300mM, 예를 들면, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 또는 300mM 중 대략 어느 농도로 존재함)를 사용하여 세포 배양물 상청액/카프릴산을 pH 4.5로 조정하고, 이들 성분들을 약 10분 동안 실온(예를 들면, 약 25℃)에서 혼합하는 단계를 포함할 수 있다. 이후 침전제를 세포 배양물 상청액으로부터 제거하여 제2 세포 배양물 상청액을 생성할 수 있다.

이후, 제2 세포 배양물 상청액을 중합체로 처리하여 목적하는 단백질(들)(예를 들면, 항체)을 침전시킬 수 있다. 적합한 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다. 적합한 PEG 중합체는, 예를 들면, PEG2000, PEG4000, PEG6000 및 PEG20000을 포함하지만 이들에 제한되지 않을 수 있다. 침전은 약 5 내지 30%(예를 들면, 약 10 내지 21% 또는 약 10 내지 14%, 또는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30% 중 대략 어느 양)의 양으로 PEG를 제2 세포 배양물 상청액 내로 도입하여 달성될 수 있다. 상기 혼합물의 적절한 pH는 4 내지 9 중 대략 어느 pH(예를 들면, 약 5.0 내지 8.5, 또는 약 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5 또는 9)일 수 있다. 이들 방법에 사용된 pH는 전형적으로 목적하는 단백질의 pI를 고려하지 않고 선택된다. 침전은 적절한 시간, 예를 들면, 5 내지 9분(예를 들면, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 또는 90분 중 대략 어느 시간) 동안 수행될 수 있다. 이러한 반응을 위한 적절한 온도는, 예를 들면, 약 4℃ 내지 약 35℃일 수 있다. 예시적인 방법은 약 5 내지 약 8.5의 pH(예를 들면, 목적하는 단백질의 pI와 무관함)에서 약 14% 또는 약 21% PEG(예를 들면, PEG6000)를 포함하는 세포 배양물 상청액을 제조하고, 적절한 온도(예를 들면, 대략 실온 또는 약 25℃)에서 적어도 약 10 내지 15-60분 동안 침전을 발생시키고, 목적하는 단백질을 함유하는 침전물을 단리하는 단계를 포함할 수 있다. 이후, 목적하는 단백질을 단리하고/하거나 적절한 완충액 및/또는 용액 중에서 재현탁시켜 목적하는 단백질을 포함하는 조성물을 생성할 수 있다. 일부 양태에서, 이들 방법은 염화칼슘을 사용하여 조성물로부터 핵산 및 단백질 불순물을 침전시킴을 포함할 수 있다. 일부 이러한 양태에서, 목적하는 단백질을 포함하는 조성물을 적절한 pH(예를 들면, 약 6 내지 약 9 중 대략 어느 pH, 예를 들면, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5 또는 9 중 대략 어느 pH)에서 염화칼슘(CaCl₂)(예를 들면, 10 내지 400mM 중 대략 어느 농도, 예를 들면, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350 또는 400mM 중 대략 어느 농도)으로 처리하여 이러한 불순물(예를 들면, DNA)을 침전시킬 수 있다. 전형적으로, 염화칼슘 침전은 카프릴산 침전 및 PEG 침전 후 에탄올 침전(예를 들면, 도 18a 및 18b) 전에 수행될 수 있다. 그러나, 이들 침전 단계들 중 어느 단계는 당업자에 의해 결정될 수 있는 한 임의의 다른 침전 단계의 전, 후 또는 이와 동시에 사용될 수 있다.

이들 방법은 목적하는 단백질이 크로마토그래피의 사용 없이 원하는 수율(예를 들면, 약 80% 이상)에서 및/또는 원하는 수준(예를 들면, 약 95% 이상의 순도)으로 정제되면 완료되는 것으로 간주될 수 있다. 수율은, 물론, 80%보다 높거나 낮을 수 있다(예를 들면, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.9 또는 100% 중 대략 어느 수율). 순도의 수준은 또한 95%보다 높거나 낮을 수 있다(예를 들면, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.9 또는 100% 중 대략 어느 순도). 순도는 또한 세포 배양물 상청액으로부터 제거된 숙주 세포 단백질(HCP)의 양과 관련하여 정의될 수 있으며, 이는 "배수-HCP 감소" 또는 유사한 용어(예를 들면, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 또는 500-배 HCP 감소 중 대략 어느 것)로 표현될 수 있다. 이들 측정법은 임의의 원하는 형태로 조합될 수 있다(예를 들면, 수율/순도, 수율/배수-HCP 감소, 수율/배수-HCP 감소/순도, 및/또는 순도/배수-HCP 감소). 수율, 순도 및/또는 HCP 수준은 크로마토그래피(예를 들면, 크기 배제(SEC), 단백질 A) 및/또는 효소 면역측정법(ELISA)을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 당업자에게 이용가능한 임의의 툴을 사용하여 측정될 수 있다. 수율 및/또는 순도의 다른 측정법 및 이러한 측정 방법은 당업자에게 이용가능하며, 당업자에게 이해되는 바와 같이 본원에 사용하기에 적절할 수 있다.

일부 양태에서, 본 발명은 (a) 완충액(예를 들면, 시트레이트, 예를 들면, 나트륨 시트레이트) 중에서 적어도 하나의 지방산(예를 들면, 카프릴산)을 사용하여 세포 배양물 상청액으로부터 (예를 들면, 직접적으로) 숙주 세포 오염물을 침전시켜 면역글로불린을 포함하는 제2 상청액을 생성하는 단계; (b) 임의로 적어도 하나의 염을 포함하는, 적어도 하나의 친수성 중합체(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(PEG))를 사용하여 제2 상청액으로부터 IgG를 침전시키는 단계; 및, 임의로, (c) 단계 (b)에서 침전된 항체를 포함하는 조성물로부터 불순물을 침전시키는 단계에 의해 세포 배양물 상청액으로부터 면역글로불린 G(IgG)와 같은 항체인 목적하는 단백질을 단리하는 방법에 관한 것이며; 여기서 IgG는 적어도 약 95%로 정제되고; 수율은 적어도 약 80%이다. 전형적으로, 이들 방법은 크로마토그래피의 사용을 포함하지 않는다. 특정 양태에서, 단계 (a) 동안 사용된 카프릴산의 농도는 약 0.5% 내지 약 10%(v/v) 및/또는 약 5mM 내지 약 200mM일 수 있다. 일부 양태에서, 단계 (a)에서 사용된 pH는 약 4.5 내지 약 5.5(예를 들면, 약 4.5)일 수 있다. 단계 (b)에서, PEG의 적절한 농도는 상기 기재된 바와 같을 수 있고(예를 들면, 약 14% 또는 약 21%); 단계 b)에서 침전 동안의 pH는 약 5 내지 약 8.5(예를 들면, 약 pH 7)일 수 있고; 온도는 약 4℃ 내지 약 35℃일 수 있다. 임의의 단계 (c)에서 사용된 염화칼슘(CaCl₂)의 양은 임의의 적절한 양, 예를 들면, 250mM일 수 있다. 특정 양태에서, 단계 b)는 약 15분 후 완료될 수 있고/있거나 약 30 내지 약 60분 후 평형에 도달한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 추가의 침전 절차(예를 들면, 차가운 에탄올 침전)는 단계 b)를 따른다. 또한, 이들 방법은 크로마토그래피의 사용 없이 원하는 수준(예를 들면, 약 95% 이상의 순도)으로 완료될 수 있다(예를 들면, 항체는 원하는 수율(예를 들면, 약 80% 이상)로 정제된다).

일부 양태에서, 본 발명은 또한 실질적으로 단리된 목적하는 단백질(예를 들면, 항체)을 포함하는 제제의 연속적 생산을 위한 장치 및 방법을 제공한다. 상기 장치는, 예를 들면, 2-단계 침전 반응기(예를 들면, 도 18a 및 18b)일 수 있다. 일부 양태에서, 상기 반응기는 약 2리터의 용적 및/또는 적절한 유속(예를 들면, 20ml/분)을 제공한다. 상기 장치는 튜빙(예를 들면, 5mm 직경 실리콘 튜브), 전자 밸브, 필터 유닛 등을 포함할 수 있다. 상기 장치는 또한 제1 및 제2 침전 반응(또는 추가의 침전 단계)이 서로 독립적으로 수행될 수 있도록 배치될 수 있다.

어구 "세포 배양물 상청액으로부터 직접적으로"는 전형적으로 배양물 상청액(예를 들면, 세포-비함유 배양물 상청액)이 프로세싱을 위해 수집되는 것을 제외하고 처리되지 않아서(예를 들면, "전처리"가 없음) 배양물 상청액 중 다른 성분들(예를 들면, 비-항체 성분들, 예를 들면, 숙주 세포 단백질(HCP)) 대 목적하는 단백질(예를 들면, 항체)의 비율이 본원에 기재된 방법을 수행하기 전에 실질적으로 변경되지 않음을 의미한다(예를 들면, 배양물 상청액은 면역글로불린으로부터 HCP를 분리 및/또는 단리하고/하거나 HCP로부터 면역글로불린을 정제하는 것으로 이해될 수 있는 방식으로 처리되지 않는다). 따라서, 항체를 단리하기 위해, 본원에 기재된 방법은 단리되는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 세포-비함유 배양물 상청액으로 시작할 수 있다. 다른 출발 물질(예를 들면, 결정화되는 항체를 함유하는 아시트(ascites), 반정제된 또는 정제된 제제)이 또한 사용될 수 있음이 이해되어야 한다. 이들 방법은 또한 혈청 등으로부터 "정제된" 폴리클로날 항체의 단리에 적합할 수 있다. 세포-비함유 배양물 상청액과 관련하여, 배양물로부터 직접적으로 사용될 수 있거나, 일부 양태에서, 프로세싱 전에 농축될 수 있다. 세포-비함유 배양물 상청액은, 예를 들면, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20배로 농축되어 더 적은 용적 및 이에 따라 더 높은 농도의 단백질(및 다른 성분)을 제공할 수 있다(예를 들면, 100ml를 10배 농축된 10ml로 또는 10:1). 세포-비함유 상청액의 단백질 농도는, 예를 들면, 약 1 내지 100g/L, 예를 들면, 약 10g/L, 25g/L 또는 50g/L 중 어느 것일 수 있다. 농도는 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 예를 들면, 원심분리, 황산암모늄 농도, 스핀 원심분리 및/또는 한외여과(예를 들면, 울트라셀-10(Ultracel-10) 막을 갖는 아미콘 울트라-15 원심 필터 유닛(Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit))와 같은 몇몇 널리 이용가능한 기술 중 어느 것을 사용하여 달성될 수 있다. 이들 및 다른 적합한 출발 물질들은 당업자가 잘 알고 있을 것이다.

따라서, 본 발명은 불순물(숙주 세포 단백질, dsDNA)의 분리를 위한 지방산, 예를 들면, 카프릴산(CA) 및 항체 침전을 위한 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 사용하여 항체와 같은 단백질의 정제를 위한 방법을 제공한다. 세포 배양물 상청액의 불순물은 카프릴산을 사용하고, 일부 양태에서, 나트륨 시트레이트 lOOmM를 첨가하고 pH를 4.5로 조정하여 이러한 단백질로부터 분리될 수 있다. 특정 양태에서, 침전은 대략 30 내지 60분의 격렬한 혼합 후 실질적으로 완료될 수 있다. 단백질은 적절한 온도(예를 들면, 약 4 내지 35℃) 및 적절한 pH(예를 들면, 약 5 내지 8.5(단백질 pI와 무관함))에서 염의 존재 또는 부재 하에 PEG를 첨가하여 침전시킬 수 있다. 침전은 대략 10 내지 15분 후 거의 완료될 수 있으며; 대략 30 내지 60분 후 평형에 도달할 수 있다. 이후 상청액을 버리고 염화칼슘과 같은 또 다른 제제를 사용한 추가의 정제를 위해 침전물을 세척 및/또는 재현탁시킨 후 재침전시킬(예를 들면, 세척할) 수 있다. 최종 침전물을 적절한 완충액에 용해시키거나 저장을 위해 동결건조시킬 수 있다. 상기 과정은 배치 및 연속적 조작으로 수행될 수 있다. 상기 방법은 크로마토그래피 공정에 대한 대안으로서 재조합 항체 및 단편(아마도 또한 다른 재조합 단백질)을 대규모로 정제하고자 한다. 상기 공정은 다른 크로마토그래프 또는 비-크로마토그래프 단계들과 조합될 수 있다. 이 방법은 일반적으로 재조합 항체, 단편 및 유사한 단백질의 정제에 적용될 수 있다.

일부 양태에서, 본 발명은 지방산(들) 및 친수성 중합체 용액에 의해 단백질(예를 들면, 재조합 항체)을 정제하여 dsDNA, 숙주 세포 단백질 및 항체의 제조 동안 생성된 기타 불순물로부터 분리된 고유 단백질을 수득하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 본 발명은 지방산(예를 들면, 카프릴산)(작업 용적의 증가 없음) 및 주요 완충 성분으로서 나트륨 아세테이트 대신에 나트륨 시트레이트를 사용한 불순물/단백질(pI≤ 7)의 침전 방법이다. 작업 용적은, 더 적은 용적이 공정 속도를 가속화시키고 장비의 풋프린트(footprint)를 감소시키기 때문에 다운스트림 프로세싱 방법에서 매우 중요한 사안인 것으로 당업자에게 이해된다. 일부 양태에서, 이러한 이점은 본원에 기재된 방법에 의해 인지된다.

특정 양태에서, 본 발명은 염(인산나트륨)의 첨가 및/또는 항체 pI로의 pH의 조절 없이 친수성 중합체 용액(폴리에틸렌 글리콜)을 사용하여 세포 배양물 또는 발효 상청액으로부터 단백질(예를 들면, 항체)을 침전시키는 방법을 제공한다. 본원에 기재된 방법은 또한 배양물 상청액 조건과 무관하게 기능한다. 따라서, 컨디셔닝 단계를 필요로 하지 않고 이는 차후에 공정을 간소화한다. 더욱이, 침전은 10 내지 15분 내에 완료될 수 있다. 본 발명은 또한 제1 포획 단계 요건에 도달하기 위한 불순물의 지방산 침전과 재조합 항체/유사한 단백질의 친수성 중합체 침전 간의 조합을 입증한다.

특정 양태에서, 카프릴산 침전, PEG 침전 및/또는 CaCl₂ 침전은 단일 공정(예를 들면, 도 18a 및 18b)으로 조합될 수 있다. 예시적인 양태에서, 정화된 세포 배양물 상청액을 우선 본원에 기재된 바와 같이 적합한 pH에서 나트륨 시트레이트 또는 나트륨 아세테이트 및 카프릴산(예를 들면, 100mM 나트륨 시트레이트(NaCit), pH 4.5, 1% 카프릴산)을 사용하여 침전시키며 수득된 침전물을 제거하여 제2 상청액을 제공할 수 있다. 이후 항체를 적절한 pH에서 적절한 양의 PEG를 사용하여(예를 들면, PEG 21%, pH 7) 제2 상청액으로부터 침전시키고, 단리하고 적절한 완충액에 재현탁시킬 수 있다. 이후 단리된 항체는 적절한 pH에서 적절한 양의 염화칼슘을 사용하여(예를 들면, 250mM CaCl₂, pH 8.5) 이 제제로부터 침전될 수 있다. 이후 침전물을 적절한 완충액 중에서 재현탁시키고 에탄올(예를 들면, 25% (v/v), pH 6.5, -10℃) 중에서 재침전시킬(예를 들면, 세척할) 수 있다. 이러한 조합된 공정 및 이의 결과의 예시적인 양태는 실시예 5에 기재된다. 이러한 공정에 의해 단리된 항체는 본원에 기재된 다른 방법들과 같이 더욱 바람직한 수율, 순도, HCP에서의 감소를 제공할 수 있다. 일부 양태에서, 한외여과, 정용여과 및/또는 이온 교환 크로마토그래피가 항체를 추가로 정제하기 위한 추가의 단계로서 추가될 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, 특정 양태에서, 목적하는 단백질은 항체일 수 있다. 예시적인 항체는, 예를 들면, 사람 항체(예를 들면, IgG(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA(IgA1 및 IgA2), IgD, 및 IgE), 개(canine) 항체(예를 들면, IgGA, IgGB, IgGC, IgGD), 닭 항체(예를 들면, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, IgY), 염소 항체(예를 들면, IgG), 마우스 항체(예를 들면, IgG, IgD, IgE, IgG, IgM), 돼지 항체(예를 들면, IgG, IgD, IgE, IgG, IgM), 랫트 항체(예를 들면, IgG, IgD, IgE, IgG, IgM) 및/또는 이들의 단편 및/또는 유도체를 포함할 수 있다. 적절한, 예시적인 유형의 항체는, 예를 들면, 사람 IgG일 수 있다. 예시적인 단편 및/또는 유도체는, 예를 들면, Fab, F(ab')₂, Fab' 단일쇄 항체, Fv, 단일쇄, 일특이적 항체, 이특이적 항체, 삼특이적 항체, 다가 항체, 키메라 항체, 개-사람 키메라 항체, 개-마우스 키메라 항체, 개 Fc를 포함하는 항체, 사람화된 항체, 사람 항체, 개화된(caninized), CDR-그래프팅된 항체, 샤크 항체(shark antibody), 나노바디(예를 들면, 단일 단량체성 가변 도메인으로 이루어진 항체), 카멜리드 항체(camelid antibody)(예를 들면, 낙타과(Camelidae)의 항체 일원) 미세소체, 인트라바디(intrabody)(예를 들면, 세포내 항체), 및/또는 탈푸코실화된(de-fucosylated) 항체 및/또는 이의 유도체를 포함할 수 있다. 결합제 및/또는 항체의 모방체가 또한 제공된다. 당업자에 의해 이해되는 한, 다른 유형의 항체 및/또는 이의 단편 및/또는 유도체가 또한 본원에 기재된 방법을 사용한 단리/정제에 적합하다.

본원에 기재된 공정들을 사용하여 단리된 목적하는 단백질은 조성물(이들 중 일부는 약제학적 조성물일 수 있다) 내로 제형화될 수 있다. 본원에 기재된 이러한 조성물은 연구에 사용하기에 적합하고/하거나 숙주(예를 들면, 포유동물, 예를 들면, 사람)로의 투여에 적합한 임의의 형태를 가질 수 있다. 적합한 형태는, 예를 들면, 액체, 캡슐, 에멀젼, 과립, 필름, 이식물, 액체 용액, 로젠지, 다중-미립자, 사쉐제, 고체, 정제, 트로키, 펠렛, 분말 및/또는 현탁액을 포함한다. 액체 제형은 약제학적으로 허용되는 계면활성제를 부가하거나 부가하지 않은 희석제, 예를 들면, 물 및 알코올, 예를 들면, 에탄올, 벤질 알코올 및 폴리에틸렌 알코올을 포함할 수 있다. 캡슐 형태는 젤라틴(예를 들면, 경질- 또는 연질-쉘)으로 형성될 수 있다. 이러한 조성물 중 어느 것은, 예를 들면, 계면활성제, 윤활제 및 불활성 충전제, 예를 들면, 락토즈, 수크로즈, 인산칼슘, 옥수수 전분 및/또는 유사 성분을 포함할 수 있다. 정제 형태는, 예를 들면, 부형제 및/또는 다른 제제, 예를 들면, 락토즈, 수크로즈, 만니톨, 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산, 미세결정성 셀룰로즈, 아카시아, 젤라틴, 구아검, 콜로이드성 이산화규소, 붕해제(예를 들면, 크로스카르멜로즈 나트륨), 활석, 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트, 아연 스테아레이트, 스테아르산, 착색제, 희석제, 완충제, 붕해제, 습윤제, 보존제 및/또는 풍미제를 포함할 수 있다. 로젠지 형태는 또한, 전형적으로 불활성 기재, 예를 들면, 젤라틴 및 글리세린 또는 수크로즈 및 아카시아, 에멀젼, 겔 등과 함께 사용될 수 있다. 상기 조성물은 또한 동결건조된 형태로 제조될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 한, 다른 형태도 또한 적합할 수 있다.

약제학적 조성물은 상기 기재되거나 당해 분야에 공지된 바와 같은 형태 중 어느 것을 가질 수 있다. 약제학적 조성물은 연구에 사용하고/하거나 숙주(예를 들면, 동물, 예를 들면, 사람)에 투여하기 전에 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 사용하여 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않지 않은 물질이며, 예를 들면, 상기 물질은 연구에 사용되고/되거나 바람직하지 않은 생물학적 효과를 유발하거나 이를 함유하는 약제학적 조성물의 다른 성분들 중 어느 것 및/또는 이것을 사용한 반응과 유해한 방식으로 상호작용하지 않고 대상체에게 투여될 수 있다. 당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 담체는 당연히 활성제의 어떠한 분해도 최소화하고 대상체에서 임의의 불리한 부작용을 최소화하도록 선택될 것이다. 적합한 약제학적 담체 및 이의 제형은 예를 들면, 문헌(참조: Remington's: The Science and Practice of Pharmacy, 21^st Edition, David B. Troy, ed., Lippicott Williams & Wilkins (2005))에 기재되어 있다. 전형적으로, 적절한 양의 약제학적으로-허용되는 염은 제형을 등장성이 되게 하기 위해 상기 제형에 사용된다. 약제학적으로-허용되는 담체의 예는 멸균수, 염수, 링거 용액과 같은 완충된 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다. 용액의 pH는 일반적으로 약 5 내지 약 8 또는 약 7 내지 약 7.5이다. 다른 담체는 지속-방출 제제, 예를 들면, 폴리펩타이드 또는 이의 단편들을 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함한다. 매트릭스는 성형된 물품의 형태, 예를 들면, 필름, 리포솜 또는 미세입자일 수 있다. 예를 들면, 투여 경로 및 투여될 조성물의 농도에 따라 특정 담체가 더욱 바람직할 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 치료를 필요로 하는 숙주에 조성물(예를 들면, 약제학적 조성물로서)을 투여함으로써 질환을 치료하는 방법이 또한 제공된다. 적합한 투여 경로는, 예를 들면, 경구, 협측, 직장, 경점막, 국소, 경피, 피내, 장 및/또는 비경구 경로를 포함한다. 당업자에 의해 이해되는 한, 다른 투여 경로 및/또는 본원에 기재된 조성물의 형태가 또한 적합할 수 있다.

본원에 기재된 조성물은 암 및 비-암 병태를 포함하지만 이들에 제한되지 않는 다양한 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 치료될 수 있는 암- 및/또는 세포 성장-관련된 병태는, 예를 들면, 양성 종양, 음성 종양, 사마귀, 폴립 등을 포함한다. 본원에 기재된 조성물을 사용하여 치료될 수 있는 암의 예는 방광암, 유방암, 자궁경부 암종, 결장직장암, 식도암, 림프종(예를 들면, 버킷, 비-호지킨), 자궁내막 암종, 두경부 암, 백혈병, 간암, 폐암, 비폴립증(nonpolyposis), 흑색종, 난소암, 전립선암 등을 포함하지만 이들에 제한되지 않을 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 한, 다른 암- 및/또는 세포 성장-관련 질환도 치료될 수 있다.

본원에 기재된 조성물로 치료될 수 있는 암 이외의 전형적인 질환은, 예를 들면, 위장 장애, 예를 들면, 만성 설사, 소장의 질환(예를 들면, 십이지장염, 공장염, 회장염을 포함하지만, 이들에 제한되지 않는 장염), 소화/십이지장 궤양(예를 들면, 컬링(Curling) 궤양), 및 흡수장애(예를 들면, 복강 질환, 열대 스프루(tropical sprue), 맹장관 증후군, 휘플(Whipple), 단장 증후군, 지방변증, 밀로이병(Milroy disease)), 대장 질환(예를 들면, 충수염, 대장염(예를 들면, 가성막성, 궤양성, 허혈성, 현미경적, 아교질, 림프구성), 기능성 대장 질환(IBS, 가성 장 폐쇄/오길비 증후군(Ogilvie syndrome)), 거대결장/독성 거대결장, 게실염/게실증), 소장대장염(예를 들면, 괴사성), 염증성 장 질환("IBD"), 크론병, 설사(예를 들면, 염증성, 만성), 허혈성 복통, 장간막 허혈, 혈관형성이상, 직장염(예를 들면, 방사선 직장염), 일과성 직장통증, 항문 열창/치루, 항문 농양, 관절염 등을 포함할 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 다른 비-암성 또는 세포-성장 관련된 질환도 치료될 수 있다.

본원에 기재된 바와 같이 생성된 단백질 및/또는 상기 단백질을 포함하는 조성물은 세포, 조직 등에서 단백질 및/또는 핵산 기능/발현을 생체내 및/또는 시험관내에서 검출하는 연구에 사용될 수 있다. 예를 들면, 모노클로날 항체는 특정 단백질을 발현시키는 것들을 식별하기 위해 세포를 염색하는데 사용될 수 있다. 모노클로날 항체는 또한 검출가능한 표지 및/또는 세포독성 부분에 접합될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이 생성된 모노클로날 항체에 대한 다른 용도는 당업자에 의해 쉽게 확인가능할 것으로 예상된다.

세포-비함유 상청액으로부터 단백질을 단리하는데 필요한 시약들을 포함하는 키트들도 제공된다. 예시적인 키트는 본 발명을 수행하는데 필요한 하나 이상의 용액 및/또는 완충액(염화칼슘, 카프릴산 및/또는 PEG의 스톡 용액)을 함유할 수 있다. 상기 키트는 또한 본원에 기재된 방법을 수행하는데 필요하거나 유용할 수 있는 다양한 유형의 장비(예를 들면, 도 18a 및 18b에 예시된 장치)를 포함할 수 있다. 상기 키트는 또한 필요한 경우 상기 방법이 기능하는지를 확인하는데 사용될 수 있는 양성 및/또는 음성 대조군을 포함할 수 있다. 사용 지침서도 포함될 수 있다. 목적하는 단백질 및/또는 상기 단백질을 포함하는 조성물을 포함하는 키트가 또한 제공된다. 일부 양태에서, 상기 키트는 본원에 기재된 조성물 또는 이들의 혼합물을 포함하는 하나 이상의 용기, 및 시험관내 또는 생체내 사용을 위한 지침서를 포함한다. 예를 들면, 상기 키트는 본원에 기재된 조성물을 포함하는 용기, 및 예를 들면, 상기 조성물을 벌크로 세포 배양물에 또는 단일 세포들에 첨가함으로써 시험관내에서 상기 조성물을 세포로 도입하기 위한 지침서를 포함할 수 있다. 생체내 사용과 관련하여, 키트는 목적하는 단백질의 조성물을 함유하는 용기, 및 질환 상태의 예방 또는 치료를 위해 동물(예를 들면, 사람)에게 상기 조성물을 투여하기 위한 지침서를 포함할 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 한 키트의 다른 양태들도 제공된다.

범위는 약 하나의 특정 값으로부터 및/또는 약 또 하나의 특정 값까지로서 본원에서 표시될 수 있다. 이러한 범위가 표시될 때, 또 다른 측면은 하나의 특정 값으로부터 및/또는 다른 특정 값까지를 포함한다. 이와 유사하게, 값이 선행사 약 또는 대략을 사용하여 근사치로 표시될 때, 이는 특정 값이 또 다른 측면을 형성하는 것으로 이해될 것이다. 각각의 범위의 종점은 다른 종점과 관련하여 그리고 다른 종점과 독립적으로 둘다 유의미한 것으로 추가로 이해될 것이다. 범위(예를 들면, 90 내지 100%)는 그 자체의 범위 뿐만 아니라 각각의 값이 개별적으로 열거된 것처럼 상기 범위 내의 각각의 독립적인 값을 포함시키고자 하다.

본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 단수형("a", "an" 및 "the")은 달리 문맥상 분명하게 지시되지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함하는 것으로 주지되어야 한다. 따라서, 예를 들면, 단편에 대한 언급은 단편들의 혼합물을 포함할 수 있으며, 약제학적 담체 또는 보조제에 대한 언급은 둘 이상의 이러한 담체들 또는 보조제들의 혼합물을 포함할 수 있다. 용어 "약", "대략" 등은, 수치적 값들의 목록 또는 범위가 선행될 때, 목록 또는 범위 내에 있는 각각의 개별적인 값이 상기 용어 바로 앞에 선행되는 것과 같이 목록 또는 범위 내에 있는 각각의 개별적 값을 독립적으로 나타낸다. 상기 용어는 그것을 지칭하는 값이 거기에 정확하거나, 근사하거나 유사함을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, 대상체 또는 숙주는 개체인 것으로 의도된다. 상기 대상체는 가축화된 동물, 예를 들면 개 및 고양이, 가축류(예를 들면, 소, 말, 돼지, 양 및 염소), 실험실 동물(예를 들면, 마우스, 토끼, 래트, 기니아 피그) 및 조류를 포함할 수 있다. 한 측면에서, 상기 대상체는 영장류 또는 사람과 같은 포유동물이다. 임의의 또는 임의로는 이후에 기재된 사건 또는 상황이 일어날 수 있거나 일어나지 않을 수 있으며, 상기 기재는 사건 또는 상황이 일어나는 경우와 일어나지 않는 경우를 포함함을 의미한다. 예를 들면, 어구 "임의로 상기 조성물은 배합물을 포함할 수 있다"는 상기 기재가 배합물 및 배합물(즉, 배합물의 개별적인 구성원들)의 부재 둘 모두를 포함하도록, 상기 조성물이 상이한 분자들의 배합물을 포함할 수 있거나 배합물을 포함할 수 없음을 의미한다.

본원에 인용된 모든 참조는 이의 전문이 본 개시내용에 참조로 포함된다. 본 발명 및 이의 다수의 이점의 더 나은 이해는 예시로서 제공된 하기 실시예로부터 얻어질 것이다.

실시예

실시예 1

폴리에틸렌 글리콜을 사용한 항체 침전

A. 폴리에틸렌 글리콜을 사용한 세포 배양물 상청액으로부터 항체 침전의 키네틱 (kinetics)

출발 물질로서 하이브리도마 A, B07, B03 및 C의 상청액 및 PEG2000(12.5%), PEG4000(10.0%), PEG6000(7.5%), PEG20000(2.5%) 중 하나를 사용하여 PEG 침전 키네틱을 개별적으로 측정하고; 5.0, 7.0 또는 8.5의 pH 값; 및 15, 30, 60 및 180분의 반응 시간을 선택했다. 60분 후, 수율 균일화에 의해 지시된 침전 공정의 평형에 도달했다. 각각의 항체에 대해, 파라미터 PEG 크기/농도 및 pH 값에 따라, 상이한 수율이 관찰되었다. C 침전의 수율은 다른 3개의 항체에 대한 것보다 더 낮았고, 이는 C의 더 높은 가용성에 의해 설명될 수 있다. 그러나, 항체는 유사한 침전 키네틱을 갖는다. 항체 A는 PEG4000(10.0%)과 함께 침전하고, 가장 높은 IgG 수율을 나타냈다. 따라서, A의 PEG4000(10.0%)과의 침전은 대규모 시험에 사용되었다.

소규모 및 대규모(각각 1.5ml 및 150ml)에서 A의 PEG4000(10.0%)과의 키네틱 시험은 대규모에서 침전된 IgG의 농도가 약간 더 높았음을 보여주었다. 그러나, 소규모 및 대규모 반응의 키네틱은 유사했다. 대규모 반응을 위한 최적의 침전 시간은 60분인 것으로 측정되었다.

B. PEG 농도 스크리닝

다양한 농도의 PEG(0%, 1%, 2.5%, 5%, 7.5%, 10%, 12.5% 및 14%)를 하이브리도마 B03 및 B07의 배양물 상청액에서 항체에 대한 침전제로서 시험했다. 항체 침전은 고 분자 질량의 PEG에 의해 낮은 PEG 농도에서 달성되었다. 예를 들면, 대략 10% IgG는 PEG2000을 12.5%의 농도에서 사용하여 침전되며, 한편 PEG20000은 5%에서 동일한 양을 침전시킨다. PEG4000, PEG6000 및 PEG20000을 사용하여 침전은 약 80%에 도달했다. 이것은 침전된 단백질을 함유하는 현탁액을 제거한 후 미량 역가판의 웰들의 웰에 남아있는 액체 필름에 의해 설명된다. 잔여 20% IgG는 이 필름에서 포획된다. 출발 용액의 pH는 이들 실험에서 침전 수율에 영향을 주지 않는다. 낮은 PEG 농도를 갖는 침전은 pH에 영향을 거의 받지 않았다. PEG 농도가 증가함에 따라, 침전된 단백질의 순도도 증가했지만, 최대 수율은 추가로 증가될 수 없는 특정 PEG 농도에서 수득된다(예를 들면, 순도는 PEG 농도가 특정 수준을 초과하여 증가할 때 감소할 수 있다). B03의 순도는 상이한 상청액들의 조성물에 관한 것일 수 있는 C의 순도보다 약 5 내지 10% 더 높다.

미량 역가판에서의 PEG 침전 스크리닝 및 15mL 규모의 실험은 시험된 다양한 항체(B03, B07, A 및 C)에 대한 최적의 침전 파라미터(14% PEG6000)를 측정하는데 사용되었다. PEG 농도는 세포 배양물 상청액의 항체 농도에 의존적이다. 상청액 중 항체 농도가 높은 경우, 낮은 PEG 농도가 요구되고 낮은 항체 농도의 경우 높은 PEG 농도가 요구된다. PEG6000은, 낮은 분자 질량의 PEG와 비교하여 낮은 PEG 농도를 필요로 하기 때문에 선택되었고, 반면 PEG20000은 20%를 초과하는 농도에서 높은 점성으로 인해 옵션이 아니었다.

C. pH 최적화

PEG 침전(14% PEG6000)을 위한 pH-최적 조건은 B03, B07, A 및 C에 대해 측정되었다. pH와 무관하게, 90 내지 95%의 수율이 수득되었다. 순도는 pH에 영향을 받지 않았다. 각각의 항체 제제가 상이한 출발 순도를 가졌기 때문에 수율 차이가 관찰되었다. PEG 침전은 20 내지 40%의 순도 증가를 제공했다.

D. 온도 최적화

mAb 침전의 수율 및 순도에 대한 온도의 영향도 연구되었다. 상청액(B03, B07 및 A)을 대략 pH 7.0에서 14%(v/v) PEG6000과 함께 15mL 규모로 침전시켰다. 수율 및 순도에 대한 온도의 유의미한 영향은 시험된 상청액들 중 어느 것에서도 관찰되지 않았다. mAbs B03 및 B07은 약간 높은 순도를 나타냈지만 또한 높은 온도(35℃)에서 약간 낮은 수율을 나타냈다. 낮은 온도(5℃)에서, 반대 현상이 관찰되었다(약간 높은 수율 그러나 낮은 순도). A의 경우, 온도의 영향이 관찰되지 않았다. 따라서, 수율과 순도 사이의 트레이드-오프(trade-off) 및 대규모 공정에서의 용이한 적용성을 고려하여, 실온(~25℃)이 추가의 모든 침전에 대해 선택되었다. 이들 연구에서, pH 7.0에서 14%(v/v) PEG6000과의 침전물의 세척을 또한 평가했다. 세척된 침전물의 분석은 비-세척된 침전물과 비교하여 높은 순도 그러나 낮은 수율을 나타냈다.

E. 정제된 mAbs 및 총 단백질 불순물의 PEG 침전 용해도 곡선

정제된 mAbs(B03, B07 및 A)의 용해도 곡선을 또한 작성했다. 용액 중 단백질 성분의 반응을 계산하기 위해, PEG 농도의 증가와 함께, 하기 방정식으로 표시된 저키스(Juckes 1971a) 이론을 사용했다.

이 방정식에서, S는 용해도이고, S₀는 상수이고, ω는 중합체 농도이고,

는 부분 비용적(partial specific volume)이고,

은 배제된 분자의 반경이고,

는 중합체의 횡단 반경이다. B03 및 B07이 상이한 발효를 통한 동일한 항체를 나타낼 때 B03 및 B07의 용해도 곡선은 동일하여야 한다. B03 및 B07의 용해도 곡선의 피트(fit)가 상이한 기울기(B03: -0.3767; B07: -0.3331) 및 절편(intercept)(B03: 2.4643; B07: 1.9713)을 나타내더라도, 신뢰 구간(95%)은 중첩되며, 이는 상기 곡선들 사이의 유사성이 있음을 시사한다. 용해도 곡선의 절편은 침전제가 존재하지 않을 때 mAb의 용해도를 제공한다. B07 및 B03의 경우, 용해도는 80 내지 500mg/mL인 것으로 측정되었다. A의 경우, 3.2 내지 32mg/mL 사이의 낮은 SO이 측정되었다. 단백질의 용해도는 부분 비용적, 분자의 반경 및 침전제의 특성에 의존적이다(참조: Arakawa and Timasheff 1985). 용해도 곡선의 기울기는 mAb와 PEG의 유체역학적 상호작용과 관련되며 PEG 침전 농도에 영향을 준다(참조: Juckes 1971a). PEG 침전 기전(용적 배제 효과(참조: Arakawa and Timasheff 1985; Lee and Lee 1981; Lee and Lee 1979))로 인해, 수율은 첨가된 PEG의 양 뿐만 아니라 상청액 중 mAb의 농도에도 의존적이다. 예를 들면, 14%(v/v) PEG6000을 사용하여 mAb B07을 침전시킬 때, 단지 1.8μg/mL의 mAb가 가용성 분획에 남아있다. 따라서, 1mg/ml의 농도를 갖는 상청액의 경우, 99.8%의 수율이 이론상 가능하다. 상청액이 10mg/mL의 농도를 갖는 경우, 침전은 대략 3%(v/v) PEG6000 및 대략 9%(v/v) PEG6000에서 시작될 것이며, 99.9%의 이론적 수율이 달성될 것이다.

단백질 A 정제된 세포 배양물 상청액의 통과액(flow-through)에서 발견된 정제된 mAb B07 및 B03의 용해도 곡선 뿐만 아니라 총 단백질 불순물의 용해도 곡선을 또한 비교하고 유사한 것으로 발견되었다. 상청액 중 단백질 불순물은 상이한 용해도를 나타낸다(예를 들면, 사용된 발효 계획의 상이함에 기인함). 편평한 기울기는 (예를 들면, 기울기가 상당히 가파른 mAb 용해도와는 달리) PEG가 단백질 불순물의 용해도에 거의 영향을 주지 않음을 나타낸다. 반면, 0%(v/v) PEG600에서의 용해도는 mAbs에 대한 것보다 불순물에 대해 더 낮다. 이들 측정 결과는 다른 신규한 연속적 침전 기술(카프릴산 침전)을 실행하려는 이유이다. 신규한 정제 단계는 PEG 침전 동안 mAbs와 함께 침전되는 불순물 분획을 분리해야 한다.

F. 상이한 pH 값에서 정제된 mAbs 의 PEG 침전 용해도 곡선

B03, B07 및 A의 용해도 곡선을 5.0 내지 9.0의 pH 값에서 측정했다(A에 대해서는 pH 4.5 내지 9.0). 14% PEG6000 값과의 침전은 -2의 log S를 야기하는 것으로 측정되었다(0.01mg/mL 침전되지 않음). 이들 결과는 pH에 독립적이다. 유일한 예외는 낮은 범위에서의 pH 값이다. B03 및 B07의 경우, 이 pH는 5.0 및 5.5이고, A의 경우 이 pH는 4.5, 5.0, 5.5 및 9.0이다. mAbs의 상이함에 대한 이유는 pI 값이 다르기 때문이다. 그러나, PEG 농도의 증가는 log S의 감소를 유발하고 결과적으로 수율을 증가시킨다. 이는 mAb 침전이 매우 넓은 pH 범위에서 수행될 수 있으며 단지 PEG 농도의 증가(25%까지)만을 필요로 함을 의미한다.

G. CHO 세포 상청액으로부터의 PEG 침전

PEG 침전의 자동화된 웰 플레이트 스크리닝을, PEG 크기(2000 내지 20,000), 농도(0 내지 14%) 및 pH 값(5.0 내지 8.5)이 상이한, 5개의 CHO 세포 배양물 상청액에서 수행했다. 수율 및 순도를 분석용 단백질 A CIM 디스크(disk)(BIA)를 사용하여 측정하고 pH 7.0에서 14% PEG6000에 의한 것이 최적인 것으로 나타냈다. 상기 데이타는 도 1에 주어진다.

실시예 2

조합된 CaCl ₂ /PEG 침전

폴리에틸렌 글리콜(PEG) 침전에 의한 침전 기전은 용적 배제 반응이다. PEG는 물 분자와 반응하여 단백질 주위의 수화물 층을 배출시키고 단백질을 응집시킬 것이다. PEG는 거대 단백질(예를 들면, 상기 나타난 바와 같은 mAbs) 뿐만 아니라 DNA를 침전시키는데 사용될 수 있다. DNA의 분리를 위해, CaCl₂ 공침을 수행했다. P0₄ ^3-와 함께 CaCl₂는 거대한 음전하 분자를 공침시키는 상이한 종류의 불용성 인산칼슘 침전물을 형성하게 한다. CaCl₂/PEG 공침 연구의 파라미터는 표 1에 나타난다.

본원에 나타난 바와 같이, 이러한 공침의 수율은 85 내지 90%의 범위 내였으며; SEC는 단백질 A 크로마토그래피와 CaCl₂ PEG 정제 사이에 유사한 HMWI 및 HCP 감소를 나타냈고; CaCl₂/PEG 침전의 HCP ELISA는 3 내지 13배 감소였으며 30 내지 900이어야 한다(단백질 A). SEC 및 HCP ELISA에 의한 순도 분석에서의 임의의 불일치는 HCP ELISA에서 Ca² ⁺의 간섭에 의해 유발된 것일 수 있다. 단백질 A(protA) 및 CaCl₂/PEG 정제는 DS와 비교하여 2D DIGE 상의 스팟들(spots)의 동등한 감소를 나타낸다(도 2 및 표 2). 단백질 A 크로마토그래피 정제는 CaCl₂/PEG 침전보다 더욱 HCP를 감소시키는 것으로 밝혀졌다.

실시예 3

향상된 HCP 감소를 위한 카프릴산 (CA) 침전

CA 침전에서의 주요 향상은 나트륨 아세테이트를 사용한 pH의 안정화였다. 완충 능력에 도달하기 위해, 관련 문헌(참조: Mohanty and Elazhary 1989; Raweerith and Ratanabanangkoon 2003)에 따라서 나트륨 아세테이트 양을 계산했다(대략 50mM). 따라서, 농축된 완충 용액을 CHO 세포 배양물 상청액과 혼합하여 용액 중 CA 침전 전에 50mM 나트륨 아세테이트의 농도를 가졌다(pH 조정은 CH₃COONa 농도를 약간 증가시킨다). 완충된 상청액을 아세트산을 사용하여 pH 4.0로 조정하고 이후 4개의 유사한 분획으로 나눴다. 각각의 분획을 수산화나트륨을 사용하여 특정 pH(4.5, 5.0, 5.5 및 6.0)로 조정했다. 이것은 공정 동안 상이한 온도를 시험하기 위해 2개의 mAbs(B03 및 B07)에 대해 3회 수행되었다. 제1 공정 정렬(process alignment)을 수행하고, 원심분리하고 실온에서 보관했고, 제2 공정 정렬을 수행하고 실온에서 원심분리하고 4℃에서 보관했고, 제3 공정 정렬을 실온에서 수행하고 원심분리하고 4℃에서 보관했다(도 3).

pH/완충액 시험으로부터의 샘플을 수집하고 SEC 및 브래드포드 검정법을 사용하여 측정했다. 상이하게 템퍼링된(tempered) 공정 정렬(상이한 pH 값들(4.5, 5.0, 5.5 및 6.0))을 비교하여 수율에서 차이가 없었음을 보여주었다. CA 침전은 10 내지 20% 수율의 감소를 야기한다. pH 조정 후 수율은 약 20 내지 30% 감소한다. 이러한 이유로 인해 pH 조정의 향상이 필요하다. 가장 높은 수율은 가장 낮은 pH(pH 4.5)에서 도달되었다. 그 이유는 낮은 pH에서 염 농도가 더 낮아질 수 있거나 심지어 낮은 pH 때문일 수 있다. 그러므로, 이러한 가정을 증명하기 위해, 정확한 pH 조정이 낮은 염 농도를 갖는데 필요하다. 수율 측정을 위해, 세포 배양물 상청액 및 샘플로부터 크기 배제 크로마토그램의 IgG 면적을 비교했다. 수율 측정 방법을 변화시킨 이유는 대략 4.5인 샘플 pH 때문이다. 이 값은 재현가능한 데이타를 얻기 위한 분석용 친화성 크로마토그래피의 용출 pH(pH 3)와 너무 가깝다.

표 4에서, 총 단백질 측정의 데이타가 열거된다. 공정 정렬을 비교하여 단백질 농도에서의 유의미한 차이가 없었음을 보여주었다. 이는 온도 변화가 상기 공정에 영향을 주지 않음을 암시한다. pH 조정 후 총 단백질 감소가 분명히 관찰되며, 가장 높은 감소는 pH 4.5에서이다. CA 침전 후 총 단백질 감소는 거의 일정했으며, 총 단백질 수율은 60 내지 70%이다. 가장 높은 수율 및 총 단백질 감소는 pH 4.5에서 발생한다. 이 pH를 갖는 샘플은 이후의 측정을 위해 선택되었다.

가장 높은 mAb 수율 및 가장 낮은 총 단백질 농도(pH 4.5에서)를 갖는 B03 및 B07의 샘플들의 크기 배제 크로마토그램을 비교하여 pH 조정 후 고분자량 및 저분자량 불순물이 약간 감소함을 보여준다(도 4a 및 4b). 이러한 감소는 CA 침전 후 증가했지만 주요 불순물은 제거되지 않았다.

상기 샘플들을 또한 HCP-ELISA로 비교했다. 표 5a 및 5b는 pH 조정 및 CA 침전 후 ELISA 데이타를 나타낸다. 숙주 세포 감소(HCP)는 pH 조정 후 대략 2배였고, CA 침전 후 10배가 넘었다. CA 침전에 의한 HCP의 감소는 PEG 침전과 유사하지만(참조: Jungbauer et al. 2011), 단, SEC 크로마토그램은 PEG 침전 후 불순물 감소를 나타낸다. 그 이유는 상이한 방법을 사용한 상이한 단백질의 분리 때문일 수 있다. 그러므로, PEG 및 CA 침전의 조합이 평가되어야 한다.

모든 mAbs(B03 및 B07)의 "pH 4.5 샘플"의 DNA 함량이 또한 측정되었다(표 6). pH 조정은 3 내지 10배의 DNA 감소를 나타냈다. CA 침전 후 DNA 함량은 검출 한계 미만이었다. 이 데이타는 SEC 크로마토그램과 유사하다. CA 침전시 고분자량 불순물의 뚜렷한 감소가 일어난다.

CA 침전의 파라미터 스크리닝

카프릴산 침전의 최적화를 위해, 염 농도, 혼합 속도 및 반응 시간의 스크리닝을 수행했다. 카프릴산 농도(1% CA) 및 pH 값(pH 5.5)은 일정하게 유지되었다. 도 5a 및 5b는 B03 및 B07의 수율에 대한 NaAc 염 농도의 영향을 예시한다. 높은 염 농도는 수율의 감소를 유발했다. 이것은 높은 염 농도에서 유도된 pH 이동 때문일 수 있다. 이전(참조: Jungbauer et al. 2011)에 나타난 바와 같이, 수율은 pH가 증가함에 따라 감소된다. 도 5a 및 5b의 비교는 CA 침전 전 pH 조정(대략 pH 7로부터 5.5까지)의 영향을 보여준다. 도면들의 수율 데이타는 세포 배양물 상청액 농도(도 5a) 및 pH 조정된 세포 배양물 상청액(도 5b)과 관련하여 설정되었다. 수율을 비교하여 모든 염 농도에서 두 개의 mAbs(B03 및 B07)에 대해 대략 10%의 차이를 보여주었다.

CA 침전 동안 최적의 혼합 속도가 또한 조사되었다. 50mM 나트륨 아세테이트 및 1% CA를 침전제로서 사용하여 pH 5.5에서 60분 동안 침전을 수행했다. 혼합 속도 시험을 로테이터(rotator) 상에서 5, 10, 20, 30 및 40rpm으로 달성했다. 이러한 셋업은 세포 배양물 상청액 및 pH-조정된 세포 배양물 상청액에 의해 비교된 샘플에 대해 2개의 mAbs(B03, B07)로 실현되었다. 상기 주지된 바와 같이, pH 조정은 수율의 유의미한 감소(대략 10%)를 유발한다. 더욱이, 혼합 속도 시험은 침전 시간이 증가함에 따라 수율이 감소함을 나타냈다. 가장 높은 수율은 5rpm의 혼합 속도에서 도달할 수 있었다(숙주 세포 단백질(HCP) 데이타는 수집되지 않았음을 주지함). 높은 혼합 속도에서의 수율의 감소는 수성 상으로부터 유기 상(카프릴산)으로의 단백질 상 전이를 유발하는 단백질에 대한 증가된 기계적 압력 및 유기 환경으로 인한 이후의 침전 및 변성으로부터 야기될 수 있다. 또 다른 이유는 카프릴산의 음으로 하전된 단백질/IgG와의 직접적인 상호작용 때문일 것이다. 이상적인 혼합 속도는 낮은 수율 손실과 함께 HCP의 적절한 감소를 제공하는 5 또는 10 내지 30rpm일 수 있다.

CA 침전의 반응 시간을 또한 연구했다. B03 및 B07 배양물 상청액(pH-조정된 배양물 상청액 포함)으로부터의 침전을 일정한 혼합 속도(40rpm(로테이터))에서 5, 15, 30, 45 및 60분 동안 50mM 나트륨 아세테이트 및 침전제로서 1% CA를 사용하여 pH 5.5에서 수행했다. 상기 기재된 바와 같이, pH 조정은 IgG를 손실시켰다(대략 10%). 증가된 반응 시간은 수율을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 가장 높은 수율은 5분의 반응 시간으로 달성될 수 있었다(숙주 세포 단백질(HCP) 데이타는 수집되지 않았음을 주지함). 긴 반응 시간에서 수율의 감소는 수성 상으로부터 유기 상(카프릴산)으로의 단백질 상 전이를 유발하는 단백질에 대한 기계적 압력의 증가 및 유기 환경으로 인한 이후의 단백질 침전(또한 IgG)과 관련될 수 있거나, 카프릴산의 음으로 하전된 단백질과의 직접적인 상호작용은 단백질 침전 및 변성의 원인일 수 있다. 이상적인 반응 시간은 아마도 낮은 수율 손실과 함께 HCP의 적절한 감소를 제공하는 15 내지 45분에 위치한다.

실시예 3

향상된 HCP 감소를 위한 PEG 및 CA 침전의 조합

실온 공정 정렬의 CA 침전 상청액 샘플을 이후 CA/PEG 침전 조합을 추정하기 위해 14% PEG6000과 함께 침전시키는데 사용했다. 샘플을 이전에 기재된 PEG 침전과 같이 처리했다. PEG 침전이 뒤따르는 CA 침전 정렬은 도 6에 도시된다. CA/PEG 침전된 샘플의 수율을 SEC(BIO-SEC3, 에이질런트)로 측정했다. 순도를 HCP-ELISA로 측정했다. 2개의 mAb(B03 및 B07)의 데이타는 도 7a 및 도 7b에서 도시된다. CA 및 PEG 침전의 조합은 2개의 mAbs에 대해 유사한 결과를 나타냈다. CA 침전 후, 수율은 60 내지 80%였고 HCP 감소는 모든 pH 값들에 대해 대략 10배였다. 이후의 PEG 침전의 수율은 pH 5.0 내지 6.0인 샘플들에 대해 40 내지 50%까지 떨어졌다. 약 10% 수율을 pH 4.5에서 수득했다. pH 5.0에서 PEG 침전 후, HCP 농도는 200배 내지 400배 HCP 감소 및 pH 6.0에서 대략 100배 HCP 감소로 개시했다. 따라서, HCP의 가장 큰 감소는 pH 5.0에서 관찰되었다. B03에 대한 가장 높은 수율은 pH 6.0에서 관찰되었고, B07에 대해서는 pH 5.0 내지 6.0에서 관찰되었다. 그러나, 수율은 단지 40%였다. 수율을 향상시키기 위해, 높은 PEG 농도가 선택되거나 PEG 침전 전에 pH를 더 높게 조정할 것이다.

PEG 침전의 수율 향상을 위해, PEG 농도의 스크리닝을 수행했다. CA 침전 상청액(예를 들면, 카프릴산 침전 후 상청액)의 샘플을 3개의 상이한 PEG 농도(14, 18 및 21%)로 침전시켰다. 침전을 공정 단계 정렬 1 및 3(실온 및 4℃에서)에 의해 pH 값 4.5, 5.0, 5.5 및 6.0에 대해 2개의 mAbs(B03 및 B07)로 수행했다. 2개의 mAbs에 대한 수율 증가가 유사한 침전 파라미터로 관찰되었다. 상이한 공정 단계 정렬의 비교는 온도가 수율에 영향을 주지 않음을 나타냈다. 증가된 PEG 농도는 CA 침전 후 출발 값과 비교하여 높은 수율을 야기했다. 또한, 높은 pH 값은 증가된 수율을 유발한다. PEG 침전 데이타의 비교 및 이들 pH 값은 PEG 농도가 증가함에 따라 pH의 증가를 나타내므로 수율도 증가한다. 그러므로, CA 침전 후 pH의 대략 pH 7.0으로의 상승 및 PEG 농도의 증가는 수율을 향상시킬 것으로 기대된다. 새로운 결과는 PEG 농도의 증가가 pH 효과를 뒤엎는 PEG 침전의 과거 경험에 상반된다. 낮은 pH에서 증가된 PEG 농도와 함께 낮은 수율은 다시 CA 참여를 야기할 수 있다.

도 8a 및 8b에 도시된 막대 도표는 PEG 침전 후 SN에 대해 측정된 pH로 표지된다. PEG 침전의 경우, pH 값은 14% PEG와의 침전에 대해 낮은 pH에서 개시되고 21% PEG와의 침전에 대해 높은 pH에서 종료된다. 18% PEG와의 침전에 대한 pH는 가장 높은 pH 값과 가장 낮은 pH 값의 사이에 있다.

이전의 최적 pH(4.5 내지 6.0) 스크리닝을 수행했고, 상기 스크리닝은 높은 숙주 세포 단백질(HCP) 감소를 나타냈지만 PEG 침전 후 낮은 수율을 나타냈다. CA 침전을 또한 HMWI 및 HCP 침전물을 분리하기 위해 3개의 pH 값(4.5, 5.0 및 5.5)에서 수행하고, 이후 pH를 약 7(6.9 내지 7.1)로 조정했다. 이전 데이타와 비교하여, pH 변화는 PEG 침전(14% PEG6000) 후 수율을 증가시켰다. 그러나, HCP 양의 약간의 증가가 또한 관찰되었다. 모든 pH 값 시험을 2개의 mAbs(B03 및 B07)로 수행했고; 데이타는 도 9a 및 9b에 주어진다. 본원에 나타난 바와 같이, CA 침전 후 가장 높은 수율은 pH 4.5에서 도달했다. 가장 높은 HCP 감소 및 전체 수율은 mAb B03에 대해 pH 5.0에서였고 B07에 대해 pH 4.5에서였다. 이러한 데이타에 기인하여, CA 침전 후 수율의 추가 향상 및 CA/PEG 침전 후 수율을 증가시키는 PEG 농도의 증대를 위해 초기 완충액 농도의 스크리닝을 필요로 한다.

CA/PEG 침전의 추가 향상을 위해, 나트륨 아세테이트 완충액 스크리닝을 수행했다. CA 침전은 pH 5.5에서 40rpm에서 60분 동안(로테이터) 1% CA로 달성되었다. 단지 나트륨 아세테이트 완충액 농도만이 변화되었다(5, 10, 20, 40, 50, 100, 125 및 200mM 나트륨 아세테이트). PEG 침전 전, CA 상 및 침전물을 상청액으로부터 분리했다. 이후, 상청액의 pH 값을 대략 pH 7로 조정했고 14%(v/v)의 최종 농도로 PEG6000을 첨가했다. 도 10a 및 10b는 상이한 염 농도에서 CA 및 CA/PEG 침전 후 각각 B03 및 B07에 대한 수율 및 HCP 감소 데이타를 도시한다. 가장 높은 수율 및 HCP 감소는 낮은 염 농도(5mM 나트륨 아세테이트)에서 달성되었다. 따라서, pH는 염 농도에 영향을 받고 그 자체는 수율에 영향을 준다. PEG 침전 후 수율의 추가 증가는 증가된 PEG 농도에 의해 달성될 수 있었다. 그러나, 나트륨 아세테이트로부터 나트륨 시트레이트(동일한 범위 내의 완충액)로의 완충계 변화도 또한 mAb의 수율 및 순도를 향상시킬 수 있다. 따라서 유사한 완충액 및 나트륨 시트레이트에 의한 염 농도 스크리닝을 수행했다.

B03(도 11a) 및 B07(도 11b)의 나트륨 시트레이트 pH 스크리닝을 나트륨 아세테이트 pH 스크리닝에서와 동일한 파라미터로 수행했다. 이전 연구와 유일한 차이는 나트륨 아세테이트를 나트륨 시트레이트로 교체한 것이었다. 시트레이트 완충액 데이타를 아세테이트 완충액 데이타와 비교하여 나트륨 아세테이트 완충액과의 PEG 침전 후 수율 및 순도의 증가를 보여준다. pH 값의 영향은 두 가지 완충계에 대해 유사했다(pH 4.5 침전이 최적임).

나트륨 시트레이트 염 농도 스크리닝(도 12a 및 12b)을 나트륨 아세테이트 염 농도 스크리닝에서와 동일한 방식으로 수행했다. 데이타는 CA 후 수율 감소를 나타냈지만 PEG 침전 후 수율 및 순도의 증가를 나타냈다. 특히 높은 염 농도(100 내지 200mM)에서, 이러한 값들이 발생한다. 그 이유는 다시 염-단백질 또는 염-침전제 상호작용을 야기할 수 있기 때문이다. 이들 발견들은 가장 높은 수율이 낮은 염 농도에서 달성되었던 나트륨 아세테이트 데이타와 대조적이며, 이는 낮은 pH에서 그리고 그 결과 높은 수율을 유도한다.

이들 결과들을 감안하여, 완충계로서 100 및 200mM 나트륨 시트레이트를 갖고 mAb 침전에 대해 3가지 상이한 PEG 농도(14%, 18% 및 21%[v/v])를 갖는 B03 및 B07 세포 배양물 상청액을 사용한 향상된 일련의 시험을 수행했다. 혼합 속도(40rpm), 혼합 시간(60분) 및 반응 온도와 같은 파라미터를 이전 스크리닝에서와 같이 적용했다. pH를 CA 침전 이전에 pH 4.5으로 조정하고 PEG 침전 이전에 대략 7(pH 6.90 내지 7.10)로 조정했다. B03에 대한 데이타는 도 13a에 주어진다. 100mM 나트륨 시트레이트에서, 총 수율은 PEG 농도가 증가함에 따라 증가하지만 순도는 감소되는 것으로 관찰되었다. 200mM 나트륨 시트레이트에서, 수율 및 순도 둘 모두는 PEG 농도가 증가함에 따라 감소했다. 이러한 대조적 방식은 염 농도의 변화에서 염-단백질 또는 염-침전제 상호작용의 변화에 의해 유도될 것이다. B03의 경우, 가장 높은 총 수율 뿐만 아니라 HCP 감소를 1OOmM 나트륨 시트레이트 및 21% PEG를 사용하여 달성했다. B07에 대한 데이타는 도 13b에 주어진다. lOOmM 나트륨 시트레이트에서, PEG 농도가 증가함에 따라 수율 및 순도에서 유의미한 변화가 없었다. 200mM 나트륨 시트레이트에서, 증가된 PEG 농도는 수율을 증가시키는 것으로 나타나지 않았지만; PEG 농도가 높아짐에 따라 순도의 감소가 관찰되었다. B07에 대한 가장 높은 수율은 lOOmM 나트륨 시트레이트 및 21% PEG로부터 초래되는 것으로 측정되었지만, 가장 높은 HCP 감소는 200mM HCP 및 14% PEG에 의해 도달되었다. 이러한 데이타의 비교는 B07의 열등한 수율 및 순도를 보여주었고 이는 세포 배양물 상청액 중 낮은 mAb 농도(B03 = 2.6mg/mL; B07 = 1mg/mL)로부터 초래될 수 있다. 이들 발견을 근거하여, 파라미터 100mM 나트륨 시트레이트 및 21% PEG가 추가의 스크리닝을 위해 선택되었다.

추가로 순도를 향상시키기 위해, CA/PEG 침전에 대한 CA 농도 스크리닝을 수행했다. 따라서, 파라미터 혼합 속도, 혼합 시간, 완충계, 염 농도, pH 조정 및 PEG 농도는 이전 스크리닝 발견으로부터 추정되었다(로테이터 상에서 40rpm; 60분 반응 시간; lOOmM 나트륨 시트레이트; 수산화나트륨 및/또는 시트르산으로 조정된 pH; 이전 CA 침전 4.5, 이전 PEG 침전 6.9 내지 7.1). CA 농도는 0.5 내지 10%(0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0 및 10.0%)의 범위에 있었다. 도 14a 및 14b는 2개의 mAbs에 대한 CA 농도 스크리닝의 수율 및 순도를 도시한다. 모든 수율 데이타의 비교는 CA 농도의 영향이 없음을 보여준다. 예외는 1% CA에서 B07 샘플에 대한 총 수율 데이타였고, 이는 다른 것들보다 2배 더 높았으며, 아마도 세포 배양물 상청액의 출발 농도(이는 2.5mg/mL 이하의 단백질 A 정제된 mAb로 농축되었음(B07의 최초 농도 = 1 mg/mL)) 때문일 것이다. 2개의 mAb의 순도 데이타는 CA 농도의 유의미한 영향이 없음을 지시했다. 10% CA와 함께 B03의 침전은 높은 HCP 감소를 나타냈으나, 이러한 높은 CA 농도는 관리하기 어렵기 때문에 이는 무시해도 좋다(또는 이상치 분석(outlier analysis)이다). 도 14a 및 14b의 수율 데이타는 낮은 pH에서 샘플 측정과 관련된 최초의 문제 때문에 SEC로 측정되었다. 이러한 문제는 상기 기재된 바와 같이 해결되므로, 수율 측정은 분석용 친화성 크로마토그래피로 수행될 수 있다(도 15a 및 15b). 이들 데이타의 비교는 유사한 순도 값을 나타낸다. 그러나, 측정된 수율 데이타(분석용 친화성 크로마토그래피, 단백질 A)는 대략 20% 더 높았다. 이들 발견을 통해, (SEC에 의해) 이전에 측정된 모든 수율 값들은 너무 낮을 수 있다는 가정을 할 수 있다(참조: Jungbauer et al. 2010a).

CA 농도 스크리닝 연구(도 16a 및 16b로부터 침전을 위한 1% CA)로부터의 샘플을 수율 및 순도에 대해 분석했다. mAb의 농도는 대략 2.5mg/mL(B03 = 2.65mg/mL 및 B07 = 2.59mg/mL)에서 2개의 세포 배양물 상청액에 대한 것이었다. 수율 및 순도 데이타는 표 7 및 8에 주어진다.

이들 비교는 모든 측정된 파라미터가 유사한 것으로 나타났지만, 응집물의 함량(고분자량 불순물 = HMWI)은 Nov 시스템을 사용한 것이 더 높은 것으로 측정되었다. 이것은 측정에 사용된 상이한 파장(280nm 대 210nm) 또는 다른 이유에 기인할 수 있다. mAb의 회수율은 80%를 초과했고 HCP(숙주 세포 단백질)의 감소는 약 100배였다. 그러나, 세포 배양물 상청액과 CA/PEG 정제된 mAb의 크기 배제 크로마토그램 비교는 도 16a 및 16b에 도시된 2개의 mAbs에 대한 것이다. 이들 공정들로부터 초래된 HMWI(응집물) 및 LMWI(저분자량 불순물)의 유의미한 감소는 여기에서 분명하다.

침전 단계 후 수율 및 HCP 측정과 함께 최적의 염 종류(아세테이트 또는 시트레이트), 농도(5 내지 200mM) 및 pH 값(4.5, 5.0, 5.5)을 위한 CA/PEG 침전 스크리닝은 침전 최적 조건으로서 lOOmM 나트륨 시트레이트, pH 4.5를 선택했다. 도 17a 내지 17f 및 표 9는 2가지 예시적인 모노클로날 항체에 대해 최적화된 CA/PEG 침전에 대한 수율, SEC, HCP 및 HMWI 데이타를 나타낸다.

요약

2가지 침전 조합 CaCl₂/PEG 및 CA/PEG가 개발되었다. CaCl₂ 침전은 HMWI 예를 들면, dsDNA 및 응집물을 분리하는데 사용된다. CA 침전은 HMWI에 대해서 뿐만 아니라 HCP 감소를 위해 사용되었고 PEG 침전은 LMWI로부터 mAbs를 분리한다. CaCl₂/PEG 침전 시험을 5가지 상이한 CHO 세포 배양물 상청액으로 수행했고 단백질 A 크로마토그래피 정제와 대략 유사한 데이타를 나타냈다. CA/PEG 침전은 대략 3000ppm HCP 및 2% 미만의 HMWI와 함께 80 내지 85%의 수율을 야기했다. 이 침전은 단백질 A 크로마토그래피와 매우 경쟁적이다.

실시예 5

카프릴산 침전, PEG 침전 및 CaCl₂ 침전이 또한 단일 공정 내로 조합될 수 있다. 예시적인 양태에서, 정화된 세포 배양물 상청액을 우선 100mM 나트륨 시트레이트(NaCit), pH 4.5, 1% 카프릴산을 사용하여 침전시키고 수득된 침전물을 제거하여 제2 상청액을 제공했다. 이어서 항체를 pH 7에서 21% PEG를 사용하여 제2 상청액으로부터 침전시키고 단리하고 적절한 완충액에 재현탁시켰다. 이어서 이 제제를 염화칼슘(250mM CaCl₂, pH 8.5)을 사용하여 처리하여 추가의 불순물(예를 들면, DNA)을 침전시켰다. 이어서 침전된 불순물을 제거하여 항체를 포함하는 용액을 제공했다. 이어서 이 용액을 적절한 완충액에 재현탁시키고 그 안의 항체를 25%(v/v) 에탄올, pH 6.5, -10℃에서 침전시켰다(예를 들면, 세척했다). 이 공정의 결과(도 18a 및 18b)는 표 10에 요약된다:

일부 양태에서, 한외여과, 정용여과 및/또는 이온 교환 크로마토그래피가 항체를 추가로 정제하기 위한 추가 단계로서 추가될 수 있다.

실시예 6

mAbs 의 연속적 생산

상기 기재된 바와 같이, 염화칼슘(CaCl₂), 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 카프릴산(CA) 침전과 같은 침전 방법을 스크리닝하고 통상적인 제1 포획 단계에 대해서는 적어도 동등한 수율 및 순도에 도달하도록 조합했다. 최종 공정은 단백질 A 친화성 크로마토그래피와 경쟁적이고 관형 반응기에서 연속적으로 구동될 수 있는 2가지 침전 방법의 조합이었다. 이러한 침전 공정의 개발 후, 실험실 규모의 파일럿 플랜트(pilot plant)가 디자인되었고 제작되었다(도 19). 이러한 파일럿 플랜트는 대략 2리터 용적 및 20ml/분의 유속; 침전 면적을 위한 20m 실리콘 튜브(5mm 직경); 침전물 분리를 위한 블랙 플러쉬 모드(black flush mode)를 갖는 필터 유닛 및 전자 밸브가 장착된 2-단계 침전 반응기로 구성되며; 여기서 수동으로 및/또는 2개의 침전 라인들에 의해 필터 상태를 전환시킬 가능성이 있는 유사한 시스템 제어가 독립적으로 실행될 수 있다. 그러나, 전체 mAb 다운스트림 프로세싱의 대체를 위해, 추가의 정제/폴리싱 단계가 실시되어야 한다. 따라서, 추가의 침전 단계(차가운 에탄올 침전, CEP)를 시험하며 모든 방법들의 몇몇 조합을 수행했다. 결국, 12개의 상이한 침전 정렬들 중 2개만이 주목할 만한 양호한 수율(대략 70%) 및 순도(대략 280ppm HCP 및 응집물 없음) 데이타를 나타냈다. 상기 2가지 공정들은 컬럼을 사용하지 않으며 연속적으로 작동될 수 있는 단지 4개의 정제 단계(7 또는 8 단계 대신에)로 이루어진다. 이러한 신규 침전 공정은 적어도 제1 포획 단계(단백질 A 친화성 크로마토그래피)를 대체하기 위해 연속적으로 구동될 수 있지만 아마도 본 mAb 정제 공정의 전체일 수 있다.

본 발명이 바람직한 양태의 측면에서 기재되었더라도, 당업자에 의해 변화 및 변형이 일어날 것임을 이해한다. 따라서, 첨부된 청구범위는 청구된 바와 같이 본 발명의 범위 내에 있는 모든 이러한 동등한 변화를 포괄하는 것으로 의도된다.

Claims

항체를 포함하는 세포 배양물 상청액에 존재하는 핵산 및 기타 숙주 세포 단백질로부터 항체를 단리하는 방법으로서,
(a) 상기 세포 배양물 상청액을 염화칼슘 및/또는 카프릴산인 제1 침전제와 배합하고, 이때 카프릴산은 염과 함께 사용하여, 침전된 단백질 및/또는 기타 성분을 제거함으로써, 제2 세포 배양물 상청액을 생성하고,
(b) 상기 제2 세포 배양물 상청액에 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 도입하여, 상기 제2 세포 배양물 상청액으로부터 항체를 침전시킴을 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 PEG가 PEG2000, PEG4000, PEG6000 및 PEG20000으로부터 선택되는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 PEG가 상기 제2 세포 배양물 상청액에 5 내지 30%의 양으로 도입되는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단계 b)의 pH가 4 내지 9인, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 침전제가 카프릴산인, 방법.
제5항에 있어서, 상기 카프릴산이 0.1% 내지 10%(v/v)의 농도로 상기 단계 (a) 중에 존재하는, 방법.
제5항에 있어서, 상기 단계 (a)의 pH가 4 내지 6인, 방법.
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제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 염이 나트륨 아세테이트 및 나트륨 시트레이트 중에서 선택되는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 침전제가 염화칼슘인, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, (c) 염화칼슘을 사용하여 불순물을 후속적으로 침전시킴을 포함하는, 방법.
제11항에 있어서, 상기 단계 (c)의 pH가 6 내지 9인, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 차가운 에탄올을 사용하는 후속적 침전을 포함하는, 방법.
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제1항 또는 제2항에 있어서, 연속적 방식으로 수행되는, 방법.
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