TARIFNAME IYON DEGISIM MEMBRANI KROMATOGRAFISI Bulusun Alani Mevcut bulus genel olarak antikor saflastirmasi ile ilgilidir. Özellikle, mevcut bulus, yukari akis iyon degisim membrani kromatografisi kullanilarak safsizliklari uzaklastirmak üzere asagi akis saflastirma asamalarinin performansini gelistirmeye yönelik yöntemler ile ilgilidir. Bulusun Arka Plani Proteinlerin büyük ölçekli ve ekonomik olarak saflastirilmasi, biyoteknoloji endüstrisi için önemi gittikçe artan bir problemdir. Proteinler genel olarak hücre kültüründe ilgili proteinin üretilmesi için tasarlanan ökaryotik veya prokaryotik hücre hatlari kullanilarak bu proteine yönelik geni içeren bir rekombinant plazmidin yerlestirilmesi yoluyla üretilir. Söz konusu hücrelerin genellikle hayvan serumu preparatlarindan saglanan ve sekerler, amino asitler ve büyüme faktörlerini içeren kompleks bir büyüme ortami ile beslenmesi gerekir. Istenen proteinin hücreleri besleyen bilesiklerin karisimindan ve hücrelerin yan ürünlerinin kendilerinden bir insan terapötigi olarak kullanilmak üzere yeterli bir safliga ayrilmasi zorlu bir engel olusturur. Proteinlerin hücre artiklarindan saflastirilmasina yönelik prosedürler söz konusu proteine yönelik ekspresyon mekanizmasina baglidir. Bazi proteinlerin, hücreden, çevreleyen büyüme ortamina dogrudan salgilanmasina neden olabilirken digerleri ise hücre içi yapilir. Söz konusu olan ikinci proteinlere yönelik bir saflastirma isleminin ilk asamasi, mekanik kesme, ozmotik sok veya enzimatik tedaviler dahil olmak üzere çesitli yöntemler ile yapilabilen hücre lizizini içerir. Bu tür bozulma, hücrenin tüm içerigini homojen hale getirir ve ayrica küçük boyutlarindan dolayi uzaklastirilmasi zor olan hücre içi fragmanlari üretir. Bunlar genellikle diferansiyel santrifügasyon ile veya filtrasyon ile uzaklastirilir. Ayni problem, daha küçük Ölçekte olsa da, hücrelerin dogal ölümüne ve protein üretimi esnasinda hücre içi konakçi hücre proteinlerinin salinmasina bagli olarak dogrudan salgilanan proteinlerle ortaya çikar. Büyük hücresel artiklailesenleri olmaksizin.ilgili proteini içeren berraklastirilmis bir çözelti elde edildikten sonra, hücre tarafindan üretilen diger proteinlerin kalanindan ayrilmasi, genellikle farkli kromatografi tekniklerinin bir kombinasyonu kullanilarak denenir. Söz konusu teknikler, proteinlerin ve diger safsizliklarin karisimlarini, yük, hidrofobiklik derecesi veya boyutuna dayanarak ayirir. Söz konusu tekniklerin her biri için, dahil edilen belirli proteine yönelik dogru saflastirma planinin uyarlanmasina olanak taniyan birkaç farkli kromatografi reçinesi bulunur. Söz konusu ayirma yöntemlerinin her birinin temeli, proteinlerin uzun bir kolon içerisinde farkli hizlarda hareket ettirilebilmesi ve böylece proteinler kolonda asagi dogru indikçe artan bir fiziksel ayirma saglanmasi ya da ayirma ortamina seçici olarak yapisma saglanmasi ve ardindan farkli çözücülerle veya yer degistiricilerle kademeli biçimde elüte edilmesi veya yerinin degistirilmesidir. Bazi durumlarda, istenen protein, safsizliklar kolona spesifik olarak yapistiginda ve ilgili protein yapismadiginda, baska bir ifadeyle, ilgili protein "sürekli akis" halinde oldugunda safsizliklardan ayrilir. Protein saflastirmasi ile ilgili yayinlar arasinda Fahrner ve dig., Biotechnol Genet Eng ReV. 2001;l8:30l-27 bulunur. Antikorlara yönelik tipik bir büyük ölçekli saflastirma islemi, genellikle diger› kolon operasyonlari ile kombinasyon. halinde birincil yakalama ve saflastirma.asamasi olarak immobilize protein A'nin kullanilmasi etrafinda gelistirilir. Protein A, IgG'nin Fc bölgesi için yüksek bir afiniteye sahip Staphylococcus aureus'tan bir hücre duvari proteinidir. Bu nedenle IgG saflastirmasi için yaygin olarak kullanilir. Protein A kolon operasyonlari, genel olarak, sürekli akis fraksiyonunda yikanmis birçok islem safsizligina sahip %98'in üzerinde ürün ile ilgili bir saflik sunar. Bununla birlikte, Protein A kromatografisi kullaniminin birçok dezavantaji da vardir. Ilk olarak, baglanma genellikle nötr ile hafif bazik bir pH'ta yapilir ve elüsyon ise genellikle asidik bir pH'ta yapilir. Potansiyel problemlerden biri düsük pH'in nedenle ve klinik uygulamalar için gerekli yüksek ürün safligi nedeniyle, ürün ile ilgili izomerlerin ayrilmasi ve kalan konakçi hücre proteinleri/DNA, hücre kültürü safsizliklari, özütlenmis protein A ve virüs miktarlarinin uzaklastirilmasi için ilave konsantre etme ve saflastirma asamalari gereklidir. Söz konusu safsizliklarin birçogunun saflastirilmis antikorlari izole etmeye yönelik asagi akis islemi operasyonel birimlerinin etkinligine müdahale edebilmesi bir bilesik hazirlama problemidir. Diger bir ana problem ise fiyattir; Protein A kolonlari, konvansiyonel iyon degisim kolonlarindan çok daha pahalidir. Son olarak, Protein A kromatografisinin, örnegin polipeptitlerin, antikor benzeri moleküllerin, antikor fragmanlarinin ve/veya belirli hücre sistemlerinden saflastirilmis tam antikorlarin saflastirilmasi için uygun olmadigi ya da fahis fiyatlara.mal oldugu.birçok senaryo yer degistirme iyon degisim membrani kromatografisi ile saflastirilmasina yönelik bir yöntemi açiklar. WO9727757 Al sayili belge, asiri yüklü katyon degisim kromatografisi ile peynir alti suyu çözeltilerinden immünoglobülin ile zenginlestirilmis bir fraksiyonun üretilmesi ile ilgilidir. Mevcut bulusun dogasi, yukarida belirtilen problemleri ele alir ve uygulamalarinda, antikor, antikor fragmani ve polipeptit saflastirmasinda bir Protein A asamasinin kullanildigi, teknikte halihazirda mevcut olan yöntemlere alternatif bir saflastirma yöntemi sunar. Bulusun Özeti Mevcut bulus, antikorlarin saflastirilmasi için asagi akis kromatografisi asamalarinin etkinligini arttirmaya yönelik yöntemler ile ilgili olup söz konusu yöntemler asagidaki adimlari içerir: (a) polipeptidin yükünü artirmak için polipeptidin pI'sindan yeterince farkli bir pH'a ve tampon iyonlari tarafindan yüklerin perdelenmesini önlemek için etkili olan düsük bir iyonik güce sahip bir tampondan olusan çalisma kosullarinda polipeptidin ve membranin zit bir yüke sahip oldugu bir iyon degisim membranindan ilgili antikoru ve çesitli kontaminantlari içerenloir bilesimin geçirilmesi, bu membranin polipeptide ve en az bir kontaminanta baglamasina neden olur; (b) ilgili antikor ilk olarak eflüentte ikerien azlair`kontaminant1nembrana bagli kalacak sekilde iyon degisim membraninin 1000 - 5000 g/L'lik bir yükleme yogunluguna asiri yüklenmesi; (c) ilgili antikoru içeren iyon degisim nembranindan bir fraksiyonun toplanmasi; (d) antikor içeren bilesimin bir veya daha fazla saflastirma asamasina/asamalarina tabi tutulmasi ve (e) saflastirilmis polipeptidin eflüentten geri kazanilmasi. Bir alternatifte, mevcut bulus, antikorlarin saflastirilmasi için asagi akis kromatografisi asamalarinin etkinligini arttirmaya yönelik bir yöntem ile ilgili olup söz konusu yöntem asagidaki adimlari içerir: (a) polipeptidin pI'si altindaki yaklasik 1 ila yaklasik 5 pH birimlik bir pH'a ve S yaklasik 40 mS/cm'lik bir iletkenlige sahip bir tampondan olusan çalisma kosullarinda antikorun veinembranin zit bir yüke sahip oldugu bir katyon degisim membranindan ilgili antikoriive çesitli kontaminantlari içeren bir bilesimin geçirilmesi, bu membranin antikora ve en az bir kontaminanta baglamasina neden olur; (b) ilgili antikor ilk olarak eflüentte ikeneniaz bir kontaminantinembrana bagli kalacak.sekilde katyon degisim membraninin 1000 - 5000 g/L'lik bir yükleme yogunluguna asiri yüklenmesi; (c) ilgili antikoru içeren iyon degisim membranindan bir fraksiyonun toplanmasi; (d) polipeptit içeren bilesimin bir veya daha fazla saflastirma asamasina/asamalarina tabi tutulmasi ve (e) saflastirilmis polipeptidin eflüentten geri kazanilmasi. Baska bir alternatifte, mevcut bulus, antikorlarin saflastirilmasi için asagi akis kromatografisi asamalarinin etkinligini arttirmaya yönelik bir yöntem ile ilgili olup söz konusu yöntem asagidaki adimlari içerir: (a) antikorun pI'si üstündeki yaklasik 1 ila 5 pH birimlik bir pH'a ve S yaklasik 40 mS/cm'lik bir iletkenlige sahip bir tampondan olusan çalisma kosullarinda antikorun ve membranin zit bir yüke sahip oldugu bir anyon degisim› membranindan ilgili antikoru ve çesitli kontaminantlari içeren bir bilesimin geçirilmesi, bu membranin antikora ve en az bir kontaminanta baglamasina neden olur; (b) ilgili antikor ilk olarak eflüentte iken en az bir kontaminant membrana bagli kalacak sekilde anyon degisim membraninin 1000 - 5000 g/L'lik bir yükleme yogunluguna asiri yüklenmesi; (c) ilgili polipeptidi içeren iyon degisini membranindan, bir fraksiyonun toplanmasi; (d) polipeptit içeren bilesimin bir veya daha fazla saflastirma asamasina/asamalarina tabi tutulmasi ve (e) saflastirilmis polipeptidin eflüentten geri kazanilmasi. Bir görünümde kontaminant, bir Çin Hamster Yumurtalik Proteinidir (CHOP). Baska bir görünümde kontaminant, bir E. coli Proteinidir (ECP). Baska bir görünümde kontaminant, gentamisindir. Yine baska bir görünümde kontaminant, polietilenimindir (PEI). Bir görünümde polipeptit, bir CH2/CH3 bölgesi içerir. Baska bir görünümde antikor, bir monoklonal antikordur. Diger görünümlerde yöntem ayrica, antikor içeren bilesimi, yukarida tarif edilen b araciligiyla a asamalarindan önce, esnasinda ya da sonra bir veya daha fazla saflastirma asamasina/asamalarina tabi tutmayi içermekte olup söz konusu saflastirma asamasi, baglama/elüsyon, sürekli akis veya yer degistirme modu kullanilarak, bir alternatifte, Fc-baglanma afinitesi kromatografisi (örnegin Protein A kromatografisi) ve, baskaküiîalternatifte, iyon degisinikromatografisidir. YineIbaska bir görünümde iyon degisim membrani, bir monolit veya derinlik filtresi ile degistirilir. Ayrica, bulus, saflastirilmis polipeptidi farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici ileloirlestirerek farmasötikkniîbilesimin hazirlanmasini saglar. Sekillerin Kisa Açiklamasi Sekil 1. Bir baslangiç protein A kolonu ile veya olmaksizin bir CEX kolonunu korumak üzere bir CEX membrani kullanarak antikor saflastirma taslagi. Sekil 2. Baslangiç asamasi olarak bir CEX kolonunu korumak üzere bir CEX membrani kullanarak antikor olmayan saflastirma taslagi. Sekil 3. pH 5,5 ve 6,4 mS/cm'de ve pH 8,0 ve 5,0 mS/cm, MustangTM S'de mAb l anyon degisim havuzu verimi (Küçük ölçekli, 0,18 mL MV, Sekil 4. pH 8,0, MustangTM Q'da mAb 2 katyon degisim havuzu verimi (Küçük ölçekli, . Sekil 5. pH 5,5, 3,2 mS/cm, MustangTM S'de mAb 3 Protein A havuzu CHOP kleransi (Küçük ölçekli, . Sekil 6. CEX membranlari ile asiri yükleme sonrasi safsizlik kleransi. Sekil 7. Gradyan elüsyonu ile belirlenen sekilde çesitli türlerin Mustang S baglanma kuvveti ve her fraksiyonda en yüksek tür konsantrasyonuna normalize etme. Sekil 8. Tüm gradyan elüsyon fraksiyonu kütlelerinin toplami ile hesaplanan ve farkli membran yükleme yogunluklarinda karsilastirilan sekilde çesitli türlerin Mustang 8 toplam bagli kütlesi ve maksimum kütleye normalize etme. Sekil 9. Protein ile yüklenmis, UV absorbansi referans degerine ulasincaya kadar 20mM asetat tamponu ile yikanmis ve daha sonra gentamisin ile antikor yer degistirmesini göstermek için 20mM asetat/gentamisin tamponu ile elüte edilmis Mustang S membrani. Sekil 10. Çesitli gentamisin konsantrasyonlarinda CEX membrani kullanilarak veya kullanilmadan bir CEX kolonu (Fractogel SE Hicap) üzerindeki antikor dinamik baglanma Kapasitesinin (DBC) belirlenmesi için taslak tasvir protokolü. Sekil 11. Gentamisin konsantrasyonunun Fractogel.SE.Hicaç›antikoru DBC üzerindeki etkisi. Sekil 12. Iki CEX membraninda gentamisin DBC'nin karsilastirmasi (Mustang S ve Natrix 8). Sekil 13. %30 DBC gelisimi gösteren asiri yüklü Natrix S havuzu ile Fractogel SE Hicap antikoru DBC. Sekil 14. Ekstraksiyon isleminde kullanilan PEI %'nin daha az PEI kullanildikça 36 ila 51 g/L gelisme gösteren SP Sefaroz Hizli Akis (SPSFF) protein DBC'si üzerindeki etkisi. Sekil 15. Ekstraksiyon isleminde kullanilan PEI %'nin daha fazla PEI kullanildikça azalan asama verimini ve artan havuz safsizliklarini gösteren SPSFF üzerindeki etkisi. Sekil 16. Natrix protein DBC'si, ECP ve 123 mg/nüimembranda.protein ve ECP hamlesine kiyasla.330ing/Hdimembranda.PEI hamlesini.gösteren protein PEI. Tercih Edilen Uygulamanin Detayli Açiklamasi Tanimlar: Burada, "yaklasik" terimi ile baslayan sayisal araliklar veya miktarlar açikça kesin araligi veya kesin sayisal miktari içerir. Burada saflastirilacak "bilesim", ilgili herhangikoru (anybody) ve bir veya daha fazla kontaminanti içerir. Bilesini "kismen saflastirilmis" (baska.bir*ifadeyle,jproteinZXkromatografisi.gibi bir veya daha fazla saflastirma asamasina tabi tutulmus) olabilir veya polipeptit üreten bir konakçi hücre veya organizmadan dogrudan elde edilebilir (örnegin,bilesim hasat edilmis hücre kültürü sivisini içerebilir). Burada kullanilan sekliyle "polipeptid", genellikle, yaklasik ondan fazla amino aside sahip peptitler ve proteinleri ifade eder. Tercihen, polipeptit bir memeli proteinidir, örnekleri arasinda asagidakiler bulunur: renin; insan büyüme hormonu ve sigir büyüme hormonu gibi bir büyüme hormonu; büyüme hormonu salim faktörü; paratiroid hormonu; tiroid uyarici hormon; lipoproteinler; alfa-l-antitripsin; insülin A zinciri; insülin B zinciri; proinsülin; folikül uyarici hormon; kalsitonin; lüteinize edici hormon; glukagon; faktör VIIIC, faktör IX, doku faktörü (TF) ve von Willebrands faktörü gibi pihtilasma faktörleri; ProteinC3gibi pihtilasmayi önleyici faktörler; atriyal natriüretik faktör; akciger sürfaktani; ürokinaz veya insan idrar veya doku tipi plazminojen aktivatörü (t-PA) gibi bir plazminojen aktivatörü; bombesin; trombin; hemopoietik büyüme faktörü; tümör nekroz faktör-alfa ve beta; enkefalinaz; (Normal T hücresi tarafindan eksprese edilmis ve salgilanmis aktivasyonla düzenlenmis) RANTES; insan makrofaj inflamatuvar proteini (MIP-l-alfa); insan serum albümini gibi bir serum albümini; Muellerian inhibe edici madde; relaksin A zinciri; relaksin B zinciri; prorelaksin; fare gonadotropinle iliskili peptidi; beta-laktamaz gibi bir mikrobiyal protein; DNaz; IgE; CTLA-4 gibi bir sitotoksik T-lenfosit iliskili antijen (CTLA); inhibin; aktivin; vasküler endotelyal.büyüme faktörü (VEGF): hormonlar veya.büyüme faktörleri için reseptörler; protein A veya D; romatizmal faktörler; kemik kökenli nörötrofik faktör (BDNF), nörotrofin-3, -4, -5 veya -6 (NT-3, NT-4, NT-S veya NT-6), veya NGF-ß gibi bir sinir büyüme faktörü gibi bir nörotrofik faktör; trombosit türevli büyüme faktörü (PDGF): aFGF ve bFGF gibi fibroblast büyüme faktörü; epidermal büyüme faktörü (EGF): TGF-ßl, TGF-ßZ, TGF-ß3, TGF-ß4 veya'TGF-ßS dahil olmak'üzere TGF-alfaxmeTGF-beta.gibi dönüstürücü büyüme faktörü (TGF); insülin benzeri büyüme faktörü-I ve -II (IGF-I ve IGF-II); des(l-3)-IGF-I (beyin IGF-I), insülin benzeri büyüme faktörü baglayici proteinler (IGFBP'ler); CD3, CD4, CD8, CD19 ve CDZO gibi CD proteinleri; eritropoietin; osteoindüktif faktörler; immünotoksinler; bir kemik morfogenetik proteini (BMP); interferon-alfa, -beta ve -gama.gibi bir interferon; koloni uyarici faktörler (CSF'ler) örnegin M-CSF, GM-CSF ve G-CSF; interlökinler (IL'ler) örneginL-l ila IL-lO; süperoksit.dismutaz; T hücresi reseptörleri; yüzey membran proteinleri; bozunmayi hizlandirici faktör; örnegin, AIDS zarfinin bir parçasi gibi viral antijen; tasima proteinleri; hedefe yönlendirici reseptörler; adresinler; düzenleyici proteinler; CDlla, CDllb, CDllc, CDlB, bir reseptörü gibi bir tümörle iliskili antijen; ve yukarida listelenen polipeptitlerin ve bununla birlikte, antikor fragmanlari dahil olmak üzere, yukarida listelenen polipeptidlerin herhangi birine baglanan antikorlarin herhangi birine ait fragmanlar ve/Veya varyantlar. Bir "kontaminant" istenen polipeptit ürününden farkli bir materyaldir. Kontaminant sinirlama olmaksizin asagidakileri içerir: Çin Hamsteri Yumurtalik Proteinleri (CHOP) veya E. coli Proteinleri (ECP) gibi konakçi hücre materyalleri; özütlenmis protein A; nükleik asit; endotoksin; Viral kontaminant; aminoglikozit antibiyotik bilesenleri (örnegin, gentamisin, streptomisin, neomisin, kanamisin); veya saflastirma islemine eklenen iyonik bir polimer (örnegin, polietilenimin (PEI), polivinilamin, poliarjinin, polivinilsülfonik asit, poliakrilik asit), Vb. Burada kullanildiginda `Wh2/CH3 bölgesi" terimi, bir immünoglobülin molekülünün Fc bölgesindeki amino asit kalintilarini ifade eder. Tercih edilen uygulamalarda, CH2/CH3 bölgesi, bütün bir(hQ bölgesini ve ardindan bütün.bir(hß bölgesini ve en çok tercihen bir immünoglobülinin bir Fc bölgesini içerir. Polipeptit içeren CHZ/CH3 bölgesi örnekleri arasinda antikorlar, immünoadezinler' ve bir` GHZ/CH3 bölgesine kaynastirilmis veya konjüge edilmis ilgili bir polipeptidi içeren füzyon proteinleri Bulusun tercih edilen uygulamalarinda, burada saflastirilacak antikor bir rekombinant antikordur. Bir "rekombinant antikor", antikoru kodlayan nükleik asitle transforme veya transfekte edilmis veya homolog rekombinasyonun bir sonucu olarak antikoru üreten bir konakçi hücrede üretilmis bir antikordur. asidi dahil etme islemine deginmek üzere birbirinin yerine kullanilir. Transformasyon veya transfeksiyonun ardindan, nükleik asit, konakçi hücre genomuna entegre olabilir veya kromozom disi bir element olarak varolabilir. "Konakçi hücre", in vitro hücre kültüründeki bir hücre ile birlikte bir konakçi hayvandaki bir hücreyi de içerir. Polipeptitlerin rekombinant üretimine yönelik yöntemler, örnegin, burada referans olarak açikça dahil edilen ,534,615 sayili US Patentinde tarif edilmistir. monoklonal antikorlari (tam uzunluktaki Hwnoklonal antikorlar dahildir), poliklonal antikorlari, multispesifik antikorlari (Örnegin, bispesifik.antikorlar) ve burada tanimlanan sekilde bir CHZ/CH3 bölgesini tuttuklari, veya bunlara içerecek sekilde modifiye edildikleri, sürece antikor fragmanlarini kapsar. Buradaki antikor ilgili bir antijene karsi yönlendirilir. Tercihen, antijen biyolojik açidan önemli bir polipeptittir ve bir hastalik veya bozukluktan muzdarip bir memeliye antikorun uygulanmasi söz konusu memelide terapötik bir fayda saglayabilir. Ancak, polipeptit olmayan antijenlere (örnegin tümörle iliskili glikolipid antijenler; bkz. US Patent 5,091,178) karsi yönlendirilen antikorlar da kapsam dahilindedir. Antijenin bir polipeptit olmasi durumunda, bir transmembran molekülü (örnegin reseptör) veya bir büyüme faktörü gibi ligant olabilir. Örnek antijenler yukarida ele alinan polipeptitleri içerir. Mevcut bulusun kapsaminda bulunan antikorlar için tercih.edilen1noleküler hedefler arasinda CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 ve CD34 gibi CD polipeptitleri; EGF reseptörü (HERl), HER2, HER3 veya HER4 reseptörü gibi HER.reseptör ailesi üyeleri; bunlarin a ya da b alt birimlerini içeren (örnegin anti-CDlla, anti-CDl8 veya anti-CDllb antikorlari) LFA-l, Macl, p150,95, VLA-4, ICAM-l, VCAM ve av/b3 integrini gibi hücre adezyon molekülleri; VEGF gibi büyüme faktörleri; IgE; kan grubu antijenleri; flk2/flt3 reseptörü; obezite (OB) reseptörü; mp1 reseptörü; CTLA-4; polipeptit C vb. Çözünebilir antijenler veya bunlarin, istege bagli olarak diger moleküllere konjüge edilen, fragmanlari, antikorlarin üretilmesi için immünojenler olarak kullanilabilmektedir. Reseptörler gibi transmembran molekülleri için bunlarin fragmanlari (örnegin bir reseptörün hücre disi domeni), immünojen olarak kullanilabilmektedir. Alternatif olarak, transmembran molekülü eksprese eden hücreler, immünojen olarak kullanilabilmektedir. Bu tür hücreler, dogal bir kaynaktan (örnegin kanser hücre hatlari) türetilebilmektedir` ya da bu hücreler, transmembran molekülü eksprese etmek 'üzere rekombinant teknikler` ile dönüstürülmüs hücreler olabilir. Saflastirilacak.antikorlarin Örnekleri arasinda, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, asagidakiler bulunur: Trastuzumab (HERCEPTIN®) U.S. Patent No. dahil olmak üzere HER2 antikorlari; CD20 antikorlari (asagiya ve Uluslararasi Yayin No. WO 95/23865); insanlastirilmis VEGF antikoru huA ve ranibizumab WO 98/45331) gibi insanlastirilmis ve/veya afinitesi olgunlastirilmis VEGF antikorlari dahil olmak.üzere VEGE'veya.VEGF reseptör antikorlari; PSCA antikorlari (W001/40309): efalizumab Transplant Intl. 4:3-7 (1991) ve Hourmant ve dig., Transplantation Haziran 1998 tarihinde kayda geçirilmis Uluslararasi Basvuru tarihinde yayinlanmis WO 97/26912); Apo-2 reseptör antikoru Doku Faktörü (TF) antikorlari (9 KasiH11994 tarihinde kabul edilmis (Örnegin kimerize veya insanlastirilmis 225 antikoru, cetuximab, CD3 antikorlari; GHI- ve ZENAPAX® (bkz. 2 Aralik Tac antikorlari; cM-7412 antikoru (Choy ve dig., Arthritis Rheum CD52 antikorlari; Fc'ye karsi yönlendirilen M22 antikoru (R1, reseptör antikorlari; hMN-14 gibi karsinoembriyonik antijen (CEA) (1995)); huBrE-S, hu-Mc 3 ve CHL6 dahil olmak üzerememe epitel hücrelerine karsi yönlendirilen antikorlar (Ceriani ve dig., hücrelerine baglanan antikorlar (Litton ve dig., Eur J. Immunol. (PANOREX®); abciximab veya c7E3 Fab gibi GpIIb/IIIa antikorlari (REOPRO®); MEDI- gibi RSV antikorlari; PROTOVIR® gibi CMV antikorlari; PR0542 gibi HIV antikorlari; Hep B antikoru OSTAVIR® gibi hepatit antikorlari; CA. 125 antikoru OvaRex; idyotipik GD3 epitop antikoru BECZ; dvß3 antikoru (örnegin VITAXIN®; Medimmune); ch-G250 gibi insan renal hücre karsinom kolorektal tümör antikoru (A33); GD3 gangliozidine karsi yönlendirilen anti-insan melanom antikoru R24; anti-insan skuamöz-hücre karsinomu (SF-25); Smart IDlO ve anti-HLA DR antikoru Oncolym (Lym-l) gibi insan lökosit (HLA) antikoru; TRU gibi CD37 antikoru; IL-21 antikoru (Zymogenetics/Novo Nordisk); anti-B hücre antikoru (Impheron); B hücre hedefleyici MAb (Immunogen/Aventi5); 1DO veya anti-Lym-l Oncolym (USC/Peregrine) gibi Lym-l antikoru; LIF 226 (Enhanced Lifesci.); BAFF antikoru (örnegin WO O3/33658); BAFF reseptör antikoru (bkz. örnegiri WO 02/24909); BR3 antikoru; belimumab gibi Blys antikoru; LYMPHOSTAT - Bm; ISF ; atlizumab (ACTEMRAW; Chugai/Roche) gibi IL-6 receptor antikoru; HuMax-II-lS (Genmab/Amgen) gibi IL-15 antikoru; bir CCR2 antikoru gibi kemokin reseptör antikoru (örnegin MLN1202; Millieneum); C5 antikoru (örnegin eculizumab, 561.1; Alexion) gibi anti-kompleman antikoru; insan immünoglobülinin oral formülasyonu (Örnegin IgPO; Protein Terapötikleri); ABT- gibi IL-12 antikoru; Teneliximab (EMS-; 82C6 ve bunun insanlastirilmis varyantlari (WOOO/ gibi CD4O antikorlari; cA2 veya infliximab (REMICADE®), CDP571, MAK-195, adalimumab (HUMIRAm) gibi TNF-d antikorlari, GBP-, D gibi peglenmis TNF-d antikor fragmani, anti-TNF-d poliklonal antikoru (örnegin PassTNF; Verigen); epratuzumab Y-9O ve epratzumab 1-131, Abiogen CD22 antikoru (Abiogen, Italya), CMC LympoScan Tc99 (Immunomedics) dahil olmak üzere LL2 veya epratuzumab (LYMPHOCIDE®; Immunomedics) gibi CD22 antikorlari. CD20 antikorlari örnekleri arasinda asagidakiler bulunur: ,736,137): piyasada IDEC Pharmaceuticals, Inc.'den temin edilebilen ve "Y olarak adlandirilan itriyum-[90]-etiketli 2B8 murin antikoru (22 Haziran 1993 tarihinde HB11388 erisim.numarasi altinda ATCC'ye yatirilmis edilebilen ve "13lI-Bl" veya "iyodin 1131 tositumomab" antikorunu (BEXXARW) üretmek üzere istege göre 1311 ile etiketlenmis ve ayni zamanda "Tositumomab" olarak da adlandirilan murin IgG2a "B1" (ayrica bkz. US Patent No. 5,595,721); murin monoklonal antikoru yamali" veya insanlastirilmis 1F5'i içeren varyantlari (WO ve kimerik 2H7 antikoru (US Patent No. 5,677,180): insanlastirilmis ; , B-hücrelerinin hücre zarindaki CD2O molekülünde hedeflenmis bir tamamen insan, yüksek afiniteli antikor (Genmab, Danimarka; bkz., örnegin, Glennie ve van de Winkel, Drug'Discovery US2004/Ol67319 sayili belgelerde belirtilen insan monoklonal tarif edilen FC bölgesine bagli kompleks N-glikozit-baglantili seker zincirlerine sahip antikorlar (Shitara ve dig.,); HB20-3, ve dig.,); AME antikor dizileri gibi CD2O baglayici moleküller, belirtilen› sekilde AME 33 antikorlari (Watkins ve digu, Eli belgede tarif edilenler gibi CD20-bag1ayici moleküller (Watkins ve dig.,); A20 antikoru veya bunun kimerik veya insanlastirilmis A20 antikoru (sirasiyla CA20, hA20) veya IMMU-106 (US edilmis, epitopu tükenmis Leu-16, 1H4 veya 2B8 dahil olmak üzere CD20-bag1ayici antikorlar (Carr ve dig.,); CD22 ve CD20'yi Chang ve dig.,); International Leukocyte Typing Workshop'dan temin antikorlari (Valentine ve dig., In: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., s. 440, Oxford University Press (1987)); ; anti-CDZO auristatin E konjügati (Seattle Genetics); anti-CD20-IL2 (EMD/Biovation/City of Hope); anti-CDZO MAb tedavisi (EpiCyte); anti-CD2O antikoru TRU Burada kullanilan sekliyle "monoklonal antikor" terimi, büyük ölçüde homojen bir antikor popülasyonundan elde edilen bir antikoru ifade eder, baska bir ifadeyle, popülasyonu içeren münferit antikorlar, minör miktarlarda mevcut olabilecek, dogal olarak olusan olasi mutasyonlar haricinde özdestir. Monoklonal antikorlar oldukça spesifik olup tek bir antijen bölgesine karsi yönlendirilmistir. Ayrica, farkli belirleyicilere (epitoplar) karsi tipik olarak farkli antikorlar içeren konvansiyonel (poliklonal) antikor preparatlarinin aksine, her monoklonal antikor, antijen üzerindeki tek bir belirleyiciye karsi yönlendirilmistir. "Monoklonal" ifadesi, antikorun büyük ölçüde homojen antikorlar popülasyonundan elde edilmis özellikte oldugunu belirtir ve antikorun, herhangi bir belirli yöntemle üretimini gerektirecek sekilde sinirlandirilmamalidir. Örnegin mevcut.bulusa uygun olarak kullanilacakinonoklonal antikorlar, ilk edilen hibridom yöntemiyle yapilabilir ya da rekombinant DNA yöntemleriyle yapilabilir (bkz., Örnegin U.S. Patent No 4,816,567). Baska bir uygulamada, "monoklonal antikorlar", edilen teknikler kullanilarak olusturulan antikor faj kütüphanelerinden izole edilebilmektedir. Clackson ve dig., sirasiyla murin ve insan antikorlarinin izolasyonu tarif edilir. Sonraki yayinlar, zincir karma yoluyla yüksek afiniteli (nM araliginda) insan antikorlarinin üretimini (Marks ve dig., kütüphanelerinin olusturulmasi için bir strateji olarak birlesimsel enfeksiyon ve in vivo rekombinasyonu (Waterhouse ve Dolayisiyla bu teknikler, monoklonal antikorlarin izolasyonu için konvansiyonel monoklonal antikor hibridom tekniklerine uygulanabilir alternatiflerdir. Alternatif olarak, günümüzde immünizasyonun ardindan, endojen immünoglobülin üretiminin yoklugunda.tanibir insan antikor repertuvarini üretme kabiliyetine sahip transgenik hayvanlar (örnegin fareler) üretmek mümkündür. Örnegin, kimerik ve gernihatti.mutant farelerde antikor agir zincir birlesme bölgesinin (JH) homozigot olarak silinmesinin, endojen antikor üretiminin tamamen inhibe olmasina yol açtigi tarif edilmistir. Insan gernihatti immünoglobülin gen diziliminin.bu tür gern1hatti.mutant farelere aktarilmasi.antijen yüklemesinden sonra insan antikorlarinin üretimiyle sonuçlanir. Bkz., örnegin dig., Year in Immuno., 7:33 (1993); ve Duchosal ve dig., Nature Burada bahsi geçen monoklonal antikorlar özellikle agir ve/veya hafif zincirin bir kisminin özel bir antikor sinifi veya alt sinifina ait veya özel bir türden köken alan antikorlardaki ilgili sekanslarla özdes veya bu sekanslarin homologu oldugu "kimerik" antikorlari (immünoglobülinleri) içerirken, zincir(ler)in geri kalani, istenen biyolojik etkinligi sergilemek kosuluyla, bir baska antikor sinifina veya alt sinifina ait veya bir baska türden köken alan antikorlardaki ilgili sekanslarin yani sira bu tür antikorlarin fragmanlariyla özdes veya bunlarin homologudur (U.S. Patent No. 4,816,567; ve Morrison ve dig., Proc. Natl. Acad. Sci. antikorun, antijen baglamasindan sorumlu olan amino asit kalintilarini ifade eder. Asiri degisken bölge, "tamamlayicilik belirleme bölgesi" veya "CDR"'den elde edilen amino asit kalintilarini (baska bir ifadeyle, hafif zincir degisken domenindeki kalintilarini ve agir zincir degisken domenindeki ve kalintilarini; Kabat ve dig., Sequences of Polypeptides of National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) ve/veya bir hafif zincir degisken domenindeki ve , kalintilarini; Chothia ve Lesk J. Mol. burada tarif edilen sekilde asiri degisken bölge kalintilarinin disinda kalan degisken domen kalintilaridir. Insan olmayan (örnegin murin) antikorlarin "insanlastirilmis" formlari, minimum seviyede insan olmayan immünoglobülinden türetilen sekans içeren kimerik antikorlardir. Insanlastirilmis antikorlar çogu zaman insan immünoglobülinleridir (alici antikor), burada alicinin bir asiri degisken bölgesine ait kalintilar, insan olmayan bir türün (verici antikor), örnegin fare, siçan, tavsan ya da istenen antikor spesifikligine, afinitesine ve kapasitesine sahip olan insan disi primatin bir asiri degisken bölgesinden elde edilen kalintilarla ikame edilir. Bazi durumlarda, insan immünoglobülinin FV çerçeve bölge (FR) kalintilari, iliskin insan olmayan kalintilarla degistirilir. Ayrica, insanlastirilmis antikorlar, alici antikorunda ya da verici antikorunda bulunmayan kalintilar içerebilir. Bu modifikasyonlar antikor performansini daha da iyilestirmek için yapilir. Genellikle, insanlastirilmis antikor, en az bir ve tipik olarak iki degisken domenin büyük ölçüde tamamini içerecek olup, bunlarin içinden asiri degisken döngülerin tamami ya da büyük ölçüde tamami, insan olmayan bir immünoglobülininkilere denk.düser ve FR bölgelerinin tamami ya da büyük ölçüde tamami bir insan immünoglobülin sekansidir. Insanlastirilmis antikor, istege bagli olarak ayrica, immünoglobülin sabit bölgesinin (FC), tipik olarak bir insan immünoglobülinin en az bir kismini içerir. Insanlastirilmis antikorlarin yapiminda kullanilacak olan hem hafif hem de agir insan degisken domenlerinin seçimi antijenikligin azaltilmasi.bakimindan çok.önemlidir. "En iyi uyum" adi verilen yönteme göre, bir kemirgen antikorunun degisken domeninin sekansi, insan degisken domen sekanslarinin bilinen tüm kütüphanesine karsi taranir. Daha sonra, kemirgeninkine en yakin insan sekansi, insanlastirilmis antikorun insan çerçevesi (FR) Chothia ve dig., J. Mol. Biol., 196:90l (1987)). Baska bir yöntemde, hafif veya agir zincirlerin belirli bir alt grubuna ait tüm. insan antikorlarinin konsensus sekansindan türetilen belirli bir çerçeve bölgesi kullanilir. Ayni çerçeve bölgesi, birkaç farkli insanlastirilmis antikor için kullanilabilir (Carterrve dig., Proc. Natl. Acadd Sci. USA, 89:4285 Ayrica, antikorlarin antijene yönelik yüksek afiniteleri ve diger avantajli biyolojik özellikleri korunarak insanlastirilmasi da önemlidir. Bu amaca ulasmak için, tercih edilen bir yönteme göre, insanlastirilmis antikorlar, parental ve insanlastirilmis sekanslarin üç boyutlu modellerini kullanmak suretiyle, parental sekanslarin ve çesitli kavramsal, insanlastirilmis ürünlerin bir analiz prosesi ile hazirlanirx Üç boyutlu immünoglobülininodelleri yaygin olarak bulunabilir ve teknikte uzman kisiler tarafindan iyi bilinir. Seçilen aday immünoglobülin sekanslarinin muhtemel üç boyutlu konformasyonel yapilarini resmeden ve görüntüleyen bilgisayar programlari mevcuttur. Bu görüntülerin incelenmesi, kalintilarin, aday immünoglobülin sekansinin isleyisindeki olasi rolünün analizine, baska bir ifadeyle,, aday immünoglobülinin kendi antijenini baglama kabiliyetini etkileyen kalintilarin analizine olanak tanir. Bu sayede FR kalintilari alici ve ithal sekanslardan seçilebilir ve birlestirilebilir, böylece istenen antikor özelligi, örnegin hedef antijene veya antijenlere yönelik afinitenin artirilmasi saglanabilir. Genellikle, CDR.kalintilari, antijen baglanmasini dogrudan ve en önemli ölçüde etkilemede rol degisken bölgesi olmak üzere tam uzunluktaki bir antikorun bir kismini içerir. Antikor fragmanlarinin örnekleri arasinda Fab, Fab', F(ab')2 ve FV fragmanlari; diyakorlar; dogrusal antikorlar; tek zincirli antikor` molekülleri; ve antikor fragmanlarindan olusturulan multispesifik antikorlar bulunur. Antikor fragmanlarinin üretimi için çesitli teknikler gelistirilmistir. Geleneksel olarak, bu fragmanlar, bütün antikorlarin proteolitik sindirimi yoluyla türetilmistir (bkz., örnegin Morimoto ve dig., ve Brennan ve dig., Science, 229:81 (1985)). Ancak bu fragmanlar günümüzde rekombinant konakçi hücreler tarafindan dogrudan üretilebilmektedir. Örnegin antikor fragmanlari yukarida ele alinan antikor faj kütüphanelerinden izole edilebilmektedir. Alternatif olarak, Fab'-SH fragmanlari, dogrudan E. coli'den geri kazanilabilmekte ve kimyasal olarak kenetlenerek F(ab')2 fragmanlarini olusturabilmektedir (Carter ve digu, Bio/Technology molekülünün birlesmesini kolaylastirmak için lösin fermuari GCN4 kullanilarak olusturulur. Baska bir yaklasima göre, F(ab')2 fragmanlari, dogrudan, rekombinant konakçi hücre kültüründen izole edilebilmektedir. Antikor fragmanlarinin üretimine yönelik diger teknikler ilgili alanin uzmanlarinca bilinir. Diger uygulamalarda, tercih edilen antikor bir tek zincirli FV fragmanidir (scFV). Bkz. WO 93/16185. "Tek zincirli FV" veya "st" antikor fragmanlari, antikorunlhive\h,domenlerini içermekte olup, burada bu domenler bir tek polipeptit zinciri içinde bulunur. Genellikle, FV polipeptidi ayrica VE ve V: domenleri arasinda, sFV'nin antijen baglanmasi için istenen yapiyi olusturmasini saglayan bir polipeptit baglayici içerir. scFv'ye iliskin bir derleme için bkz. Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, cilt 113, Rosenburg ve Moore eds. Springer-Verlag, New antikor fragmanlarini belirtmekte olup, bu fragmanlar, ayni polipeptit zincirinde (VH_ Vü bir hafif zincir degisken domenine (vw bagli olan bir agir zincir degisken domenini (vm içerir. Ayni zincir üzerinde iki domen arasinda eslesme saglamak için çok kisa olan bir baglantilayici kullanilarak domenler baska bir zincirin tamamlayici domenleriyle eslesmeye zorlanir ve böylece iki adet antijen baglanma.bölgesi olusturulur. Diyakorlarin daha ayrintili Zapata ve dig., Polypeptide Eng. 8(lO):lO57-lO62 (1995) yayininda tarif edilen antikorlari ifade eder. Kisacasi, bu antikorlar bir çift antijen baglanma bölgesi olusturan bir çift tandem Fd segmentini (Vh-CHl-Vn-CHl) içerir. Dogrusal antikorlar bispesifik veya monospesifik olabilmektedir. antijenlerden olustugu en az iki farkli epitop için baglanma spesifitelerine sahiptir. Bu tür moleküller normalde sadece iki antijeni (baska bir ifadeyle, bispesifik antikorlar, BsAbs) baglayacak olsa da, trispesifik antikorlar gibi ilave spesifitelere sahip antikorlar burada kullanildiginda.bu ifadenin kapsami dahilindedir. BsAbs örnekleri arasinda bir tümör hücresi antijenine karsi yönlendirilen bir kollu olanlar ve anti-FcyRI/anti-CDIS, anti-pl85HmQ/FcyRIII (CD16), anti-CDB/anti-malign B-hücresi (lDlO), anti-CD3/anti-pl85MRÄ anti-CDB/anti-p97, anti-CDB/anti-renal hücre karsinomu, anti-CD3/anti-OVCAR-3, anti-CD3/L-Dl (anti-kolon karsinomu), anti-CD3/anti-melanosit uyarici hormon analogu, anti-EGF reseptörü/anti-CD3, anti-CD3/anti-CAMA1, anti-CD3/anti-CD19, anti-CD3/MoVl8, anti-nöral hücre adezyon molekülü (NCAM)/anti-CD3, anti-folat baglayici protein (FBP)/anti-CD3, anti-pan karsinomla iliskili antijen (AMOC-31)/anti-CD3 gibi bir sitotoksik tetikleyici moleküle karsi yönlendirilen diger kollu olanlar; spesifik olarsk bir tümör antijenine baglanan bir kollu BsAbs ve anti-saporin/anti-Id-l, anti-CDZZ/anti-saporin, anti-CD7/anti-saporin, anti-CD38/anti-saporin, anti-interferon-a(IFN-a)/anti-hibridom idiyotipi, anti-CEA/anti-Vinca alkaloidi gibi bir toksine baglanan bir kollu BsAbs; anti-CDBO/anti-alkalin fosfataz (mitomisin fosfat ön ilacinin mitomisin alkolüne dönüsümünü katalize eder) gibi enzim aktif ön ilaçlari dönüstürmeye yönelik BsAbs; anti-fibrin/anti-doku plazminojen aktivatörü (tPA), anti-fibrin/anti-ürokinaz-tipi plazminojen aktivatörü (uPA) gibi fibrinolitik ajanlar olarak kullanilabilen. BsAbs; anti-düsük yogunluklu lipoprotein (LDL)/anti-Fc reseptörü (örnegin FcvRI, veya FcyRIII) gibi immün komplekslerinin hücre yüzeyi reseptörlerine hedeflenmesine yönelik BsAbs; anti-CD3/anti-herpes simplex virüsü (HSV), anti-T-hücre reseptörü:CD3 kompleksi/anti-influenza, anti-FcyR/anti-HIV gibi enfeksiyöz hastaliklarin tedavisinde kullanilmaya yönelik BsAbs; anti-CEA/anti-EOTUBE, anti-CEA/anti-DPTA, anti-p185HHQ/anti-hapten gibi in vitro veya in Vivo tümör tespitine yönelik BsAbs; asi adjuvani olarak.BsAbs; ve anti-tavsan (HRP)/anti-hormon, anti-somatostatin/anti-madde P, anti-HRP/anti-FITC, anti-CEA/anti-P-galaktosidaz gibi teshis araçlari olarak.BsAbs bulunur. Trispesifik antikorlarin örnekleri arasinda anti-CD3/anti-CD4/anti-CD37, bulunur. Bispesifik antikorlar, tam uzunluktaki antikorlar veya antikor fragmanlari (örnegin F(ab')2 bispesifik antikorlari) olarak hazirlanabilmektedir. Ikiden fazla degerlige sahip antikorlar tasarlanmistir. Örnegin trispesifik antikorlar hazirlanabilmektedir. Tutt ve dig., J. Buradaki amaç çerçevesinde bir "çiplak antikor", bir sitotoksik gruba veya radyoaktif etikete konjüge edilmeyen bir antikordur. Burada bir "bütün antikor", iki antijen baglanma bölgesini ve bir PC bölgesini içeren bir antikordur. Tercihen, bütün antikor, fonksiyonel bir Fc bölgesine sahiptir. önlemleri ifade eder. Tedaviye ihtiyaç duyanlar arasinda, bozukluga halihazirda sahip olan kisiler ve bozuklugun önlenecegi kisiler yer alir. Bir "bozukluk", burada tarif edilen sekilde saflastirilmis antikor ile tedaviden fayda saglayacak herhangi bir durumdur. Bu, hem kronik ve akut bozukluklar ve hastaliklari hem de memeliyi söz konusu bozukluga yatkinlastiran patolojik kosullari içerir. göre ayrildigi bir ayirma teknigini ifade eder. Moleküller, (negatif bir yüke sahip) anyonlar ya da (pozitif bir yüke sahip) katyonlar olarak siniflandirilir. Bazi moleküller (örnegin polipeptitler) hem anyonik hem de katyonik gruplara sahip olabilir. Bir iyon degisim reçinesi veya iyon degisinipolimeri normal olarak bir organik polimer substrattan imal edilen küçük (1-2 mm çapli) boncuklar seklinde çözünmeyen bir matristir (veya destek yapisidir). Horie ve dig. Pure Appl. Chem. (2004) Cilt 76, No. 4, s. 889-906. Materyal, yüzeyinde kolayca tutulmus ve salinmis iyonlara sahip oldukça gelismis bir gözenek yapisina sahiptir. Iyonlarin tutulmasi sadece diger iyonlarin ayni anda birakilmasiyla gerçeklesir; bu nedenle islem iyon degisimi olarak adlandirilir. Bir veya birkaç farkli iyon türünü seçici olarak tercih etmek için imal edilen çok sayida farkli türlerde iyon degisim reçinesi vardir. Tipik iyon degisim reçinelerinin çogu çapraz bagli polistirene dayanir. Gerekli aktif gruplar polimerizasyondan sonra dahil edilebilmekte veya ornatilmis monomerler kullanilabilmektedir. Örnegin çapraz baglama genellikle polimerizasyon isleminde edilir. Çapraz bagli olmayan polimerler, sadece daha az stabil olduklari için nadiren kullanilir. Çapraz baglama, reçinenin iyon degisim kapasitesini azaltir ve iyon degisim islemlerini gerçeklestirmek için reçine parametrelerini de etkiler; daha küçük parçaciklar daha fazla dis yüzeye sahiptir, ancak kolon islemlerinde daha büyük basinç kaybina neden olur. Fonksiyonel gruplarinda farklilik gösteren dört ana türde iyon degisim reçinesi bulunur: kuvvetli asidik (tipik olarak sülfonik asit gruplari, örnegin sodyum.polistiren sülfonat veya poliAMPS); kuvvetli bazik, (kuaterner amino gruplar, örnegin trimetilamonyum gruplari, örnegin poliAPTAC); zayif asidik (çogunlukla karboksilik asit gruplari): zayif bazik (birincil, ikincil ve/veya üçüncül amino gruplari, örnegin polietilen amin). Özel türler de bulunur: selatlama reçineleri (iminodiasetik asit, tiyoüre ve digerleri). Bir iyon degisim kromatografisi membrani, bütünüyle bir pozitif veya negatif yüke sahip bir bilesigi baglayacaktir. Baglanma bölgeleri, adsorberin gözenekleri boyunca yer alir. Bilesik, konveksiyon yoluyla baglanma bölgesine tasinir. Pozitif yüklü bir membran (anyon degistirici) bütünüyle bir negatif yüke sahip bir bilesigi baglayacaktir. Buna karsilik, negatif yüklü bir membran (katyon degistirici), bütünüyle bir pozitif yüke sahip bir bilesigi baglayacaktir. Iyon.degisin1membranlari ayrica.güçlüiyackizayif olarak kategorize edilebilmektedir. Güçlü iyon degisim membranlari genis bir pH seviyesi araliginda yüklenir (iyonize edilir). Zayif iyon degisim membranlari dar bir pH araliginda iyonize edilir. En yaygin dört iyon degisim yapilari sunlardir: Iyon Degisim Türü Ortak Kisaltma Fonksiyonel Grup Güçlü Anyon Q Kuaterner Amonyum Zayif Anyon D Dietilamin Güçlü Katyon S Sülfonik Asit Zayif Katyon c Karboksilik Asit Genel olarak, iyon degisim membranlari O,l ila 100 um'lik gözenek boyutlarina sahiptir. Bir referans olarak, Sartobind Q (Sartorius AG), 3-5 um'lik nominal bir gözenek boyutuna sahip kuvvetli bir anyon degisim membranidir ve tek veya çok katmanli bir formatta piyasadan temin edilebilir ve Mustang Q (Pall Corporation) ise 0,8 um'lik nominal bir gözenek boyutuna sahip güçlü bir anyon degisim membranidir ve ayni sekilde tek veya çok katmanli bir formatta piyasadan temin edilebilir. Bir diger referans olarak, Sartobind S (Sartorius AG), 3-5 um'lik nominal bir gözenek boyutuna sahip kuvvetli bir katyon degisim membranidir ve tek veya çok katmanli bir formatta piyasadan temin edilebilir* ve Mustang S (Pall Corporation) ise 0,8 um'lik nominal bir gözenek boyutuna sahip güçlü bir katyon degisim membranidir ve ayni sekilde tek veya çok katmanli bir formatta. piyasadan temin edilebilir. Baska bir referans olarak, Natrix S (Natrix Separations, Inc.), yüksek yüzey alanli› makro gözenekli hidrojel içinde kaplanmis, dokumasiz, yüksek derecede fibröz dayanikli polimerik bir substrattan olusan güçlü bir katyon degisim membranidir. Bir "nominal" gözenek boyutu derecesi, membranin, partiküllerin çogunlugunu derecelendirilmis gözenek boyutu olan %60 ila 98'de tutmasi kabiliyetini tarif eder. Bir çözeltinin "pH"i, bir su numunesinin iyonizasyonuna göre asitligi veya alkaliligi ölçer. Suyun pH'i nötrdür, baska bir ifadeyle 7'dir. Çogu pH degeri 0 ila 14 arasindadir. Sudan daha yüksek [H+] çözeltiler (pH 7'den düsüktür) asidiktir; sudan daha düsük [H+] çözeltiler (pH 7'den yüksektir) bazik.veya alkalindir. pH, bir pH ölçer kullanilarak ölçülebilmektedir. Tampon pH, HCI veya NaOH gibi bir asit veya baz kullanilarak ayarlanabilir. Bir polipeptit gibi bir molekülün "pl"si veya "izoelektrik noktasi", polipeptidin esit sayida pozitif ve negatif yük içerdigi pH'i ifade eder. pl, polipeptidin amino asit kalintilarinin net yükünden hesaplanabilmekte veya izoelektrik odaklama ile belirlenebilmektedir. Polipeptitlerin hem anyonik hem de katyonik gruplara sahip olmasi ile ilgili olan amfoterik dogasi manipüle edilebilir- Bir polipeptidin pH degeri, istenen polipeptidin (pozitif bir yüke sahip) bir katyon olarak hareket ettigi noktaya düsürülebilir. Alternatif olarak, bir polipeptidin pH degeri, istenen polipeptidin (negatif bir yüke sahip) bir anyon olarak hareket ettigi noktaya yükseltilebilir. elektrik akimini iletme kabiliyetidir. Temel iletkenlik birimi, daha önce mho olarak adlandirilan siemenstir (S). Iletkenlik genellikle mS/cm birimleri seklinde ifade edilir. Çözeltideki iyonlar üzerindeki yük elektrik akiminin iletkenligini kolaylastirdigi için bir çözeltinin iletkenligi iyon konsantrasyonu ile orantilidir. Her iki ölçüm de iyonik güç ile iyi korelasyon gösterir. Iyonik güç, elektrolitlerin konsantrasyonu ile yakindan iliskilidir ve belirli bir iyon üzerindeki yükün, bir elektrolit.içindeki diger iyonlar tarafindan ne kadar etkin bir sekilde korundugunu ya da stabilize edildigini gösterir. Iyonik.güçive elektrolit.konsantrasyonu arasindaki temel fark, iyonlarin bir kisminin daha yüksek oranda yüklü olmasi durumunda iyonik gücün daha yüksek.olmasidir. Ikisi arasindaki bir diger fark, iyonik gücün, sadece bir çözeltiye ne kadar tuz eklendigini degil, serbest iyonlarin konsantrasyonunu da yansitmasidir. Iletkenlik, Çesitli Orion iletkenlik ölçüm cihazlari modelleri gibi bir iletkenlik ölçer kullanilarak ölçülebilmektedir. Bir çözeltinin iletkenligi, içindeki iyonlarin konsantrasyonunu degistirerek degistirilebilir. Örnegin istenen iletkenligi elde etmek amaciyla, solüsyon içindeki bir tamponlayici ajanin konsantrasyonu ve/Veya bir tuzun (örnegin sodyum klorür, sodyum asetat veya potasyum klorür) konsantrasyonu degistirilebilir. Tercihen, istenen iletkenligi elde etmek için çesitli tamponlarin tuz konsantrasyonlari modifiye edilir. Membran kromatografisi için, "akis hizi" genellikle saat basina membran hacimleri (MV/s) olarak belirtilir. Membran kromatografisi için, "yükleme yogunlugu" çogu zaman bir litre membran basina islenen bilesim grami olarak ifade edilir. Bir "tampon", asit-baz konjügat bilesenlerinin etkisi ile pH degerindeki degisikliklere direnç gösteren bir çözeltidir. Örnegin tamponun istenen pH'ina bagli olarak kullanilabilen çesitli tamponlar Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in .Biological Systems, Gueffroy, D., Ed. Calbiochem Corporation (1975) adli yayinda tarif edilir. Polipeptit.ve bir veya daha fazla kontaminant içeren birloilesimden bir polipeptidin "saflastirilmasi" ile, bilesimdeki en az bir kontaminantin (tamamen veya kismen) uzaklastirilmasiyla bilesimdeki polipeptidin saflik derecesini arttirmak kastedilir. Bir "saflastirma asamasi", "homojen" bir bilesim ortaya çikaran genel bir saflastirma isleminin bir parçasi olabilir. "Homojen" terimi burada, bilesimin toplam agirligina göre, agirlikça en az yaklasik %70, tercihen agirlikça en az yaklasik %80, daha tercihen agirlikça en az yaklasik %90, daha da tercihen ise agirlikça en az yaklasik %95 ilgili antikor içeren bir bilesimi belirtmek için kullanilir. Bir inolekülün bir iyon degisini membranina "baglanmasi" ile, molekülün uygun kosullar altinda (pH ve/veya iletkenlik) iyon degisinimembranina maruz birakilmasi kastedilir, böylece molekül, molekül ve yüklü bir iyon degisim membrani grubu veya yüklü iyon degisim membrani gruplari arasindaki elektrostatik etkilesimler sayesinde iyon degisim membrani içinde veya üzerinde tersine çevrilerek immobilize edilir. Iyon degisini membranini "yikama" ile, iyon degisini membrani içinden veya üzerinden uygun bir tamponun geçirilmesi kastedilir. Bir molekülün (örnegin antikor veya kontaminant) bir iyon degisim membranindan "elüte edilmesi" ile buradaki molekülün uzaklastirilmasi kastedilir. Membran kromatografisi için, "sürekli akis" terimi, bilesik serbest halde iken safsizliklarin membranlara baglanmasini ifade Membran kromatografisi için, "rekabetçi adsorpsiyon", belirli bir durumda membrana baglanan birden fazla bileseni ifade eder. Membran kromatografisi için, "asiri yükleme kromatografisi", hem ilgili bilesigin hem de safsizliklarin membrana olan rekabetçi adsorpsiyonunun tesvik edilmesini ifade eder. Membran bir bilesigin baglama kapasitesinden daha fazla yüklenir. Bilesigin ve safsizliklarin diferansiyel baglama kuvvetinin kullanilmasiyla, burada safsizlik daha kuvvetli bir sekilde baglanir, bilesik, safsizliklar ile yer degistirir ve membrandan desorve olur ve membran eflüentine akar. membran üzerine yerlestirildigi ve daha sonra orijinal karisimin bilesenlerinden daha güçlü bir sekilde adsorbe edilen bir çözücü ile yer degistirdigi bir kromatografi teknigini ifade eder. Sonuç, bilesenlerin, çözücüyle ayrilmis "pikler" yerine yüksek konsantrasyonlu saf maddelerin ardisik "dikdörtgen" bölgelerine ayrilmasidir. Tugcu (1994) Methods in Molecular Biology: Cilt 421 Affinity Chromatography: Methods and Protocols s. 71-89. Diger kromatografi modlarina kiyasla daha yüksek ürün konsantrasyonu, daha yüksek saflik ve arttirilmis verim elde edilebilir. Yer degistirme kromatografisi, çesitli uygulamalarda yüksek kolon yüklemelerindeki kompleks karisimlardan proteinlerin saflastirilmasina yönelik etkili bir tekniktir. Yer degistirme kromatografisi, laboratuvar ölçeginde standart analitik kromatografi kolonlari kullanilarak kompleks karisimlardan mg miktarlarinda saflastirilmis proteinlerin elde edilmesi için oldukça uygundur. Ayrica beslemedeki eser bilesenlerin zenginlestirilmesi için de oldukça uygundur. Yer degistirme kromatografisi, iyon degisimi, HIC ve RPLC dahil olmak üzere çesitli reçine sistemleri kullanilarak kolayca gerçeklestirilebilmektedir. Freitag ve Breier. (1995) J. Chromatogr. A 691, 101-112. ayirma kabiliyetine, örnegin net yüke dayali bir ayirma üzerine kaplanan polipeptitler arasindaki hidrofiliklik/hidrofobiklik farkliliklarina.dayanan.bir ayirma, sahip bir sorbenti ifade eder. Bu, genellikle, bir hedefinolekül ile, iyonik etkilesinive hidrojen bagi veya hidrofobik etkilesim dahil olmak üzere birçok farkli yolla etkilesebilen çok modlu bir ligant kullanilarak gerçeklestirilir. GE Healthcare CaptoTM MMC ve CaptoTM Adhere gibi sorbentler, "karisik mod" kromatografi reçinesi örnekleridir. Bir "derinlik filtresi", gözenekli bir filtrasyon ortamini, parçaciklari, yalnizca ortami yüzeyinden ziyade ortami boyunca tutmak için kullanan bir filtre çesididir. Bu filtreler, diger filtre türlerine göre tikanmadan önce büyük bir parçacik kütlesini tutabildikleri için filtrelenecek olan sivi yüksek bir parçacik yükü içerdiginde yaygin olarak kullanilir. Bir "monolit", spesifik bir uygulama için kimyasal olarak degistirilmis olan gözenekli bir substrattan olusan kromatografik bir ortami ifade eder. Tipik olarak, daha yüksek kütle tasima ve daha düsük basinçlara neden olan yüksek geçirgenlik ve kisa difüzyon. mesafeleri gösteren ve daha yüksek akis hizlarinda ve/veya daha kisa kalma sürelerinde kullanimlarini saglayan iyon degisim monolitleri kromatografik reçineye bir alternatif olarak gelistirilmistir. Mevcut Bulusun Gerçeklestirilme Sekilleri Mevcut bulus, antikor ve bir veya daha fazla kontaminant içeren bir bilesimden (örnegin sulu bir çözelti) bir antikorun saflastirilmasina yönelik yöntemler sunar. Bilesim genel olarak polipeptidin rekombinant üretiminden kaynaklanir, fakat polipeptidin peptit sentezi (veya baska sentetik araçlar) ile üretilmesinden kaynaklanabilir ya da polipeptit, dogal bir polipeptit kaynagindan saflastirilabilir. Tercihen polipeptidldir GHZ/CH3 bölge içeren polipeptittir. Tercih edilen uygulamalarda, CH2/CH3 bölge içeren polipeptit bir antikordur. Antikorlarin Rekombinant Üretimi Polipeptidin rekombinant üretimi için, polipeptit sekansini kodlayan nükleik asit izole edilir ve daha fazla klonlama (DNA'nin amplifikasyonu) veya.ekspresyon.için replike edilebilir bir vektör içine yerlestirilir. Polipepti kodlayan DNA kolaylikla izole edilir ve konvansiyonel prosedürler kullanilarak (örnegin bir antikorun agir ve hafif Zincirlerini kodlayan genlere spesifik olarak baglanabilen oligonükleotit problar kullanilarak) sekanslanir. Kullanima uygun birçok vektör vardir. Vektör bilesenleri genellikle: (örnegin US Patent 5,534,615'de tarif edilen sekilde) bir sinyal sekansi, bir replikasyon kökeni, bir veya daha fazla isaretleyici gen, bir güçlendirici eleman, bir promotör ve bir transkripsiyon sonlandirma sekansindaribirini veya daha fazlasini içerir, ancak bunlarla sinirli degildir. Buradaki vektörlerdeki DNA'yi klonlamaya veya eksprese etmeye uygun konakçi hücreler, prokaryot, maya veya daha yüksek.ökaryotik hücreleridir. Bu amaca uygun prokaryotlar asagidakileri içerir: eubacteria, örnegin Gram-negatif veya Gram-pozitif organizmalar, örnegin, Enterobacteriaceae, örnegin Escherichia, örn., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Örn., Salmonella typhimurium, Serratia, Örn., Serratia marcescans, ve Shigella, ve ayrica.Bacilli örnegin.B. subtilis;ve B. licheniformis (örn., B. licheniformis 4lP, 12 Nisan 1989 tarihinde yayinlanan DD 266,710'da açiklanmistir), Pseudomonas örnegin P. aeruginosa, ve Streptomyces. Tercih edilen bir E. coli klonlama konakçisi, diger suslar, örnegin E. coli E, E. coli X ve E.coliWckauygunolmasinaragmenll coli294'tür (ATCC 31,446). Bu örnekler açiklama amaçlidir. Prokaryotlara ek olarak, ökaryotik mikroplar, örnegin filamentöz mantarlar veya mayalar, antikor kodlayan vektörler için uygun klonlama veya ekspresyon konakçilaridir. Saccharomyces cerevisiae veya yaygin firinci mayasi, düsük ökaryotik konakçi mikroorganizmalar arasinda en yaygin kullanilanidir. Bununla birlikte, çok sayidaki baska cins, tür ve suslar, örnegin Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces konakçilari örnegin, K. iactis, K. fragilis (ATCC , K. wickeramii (ATCC , K. drosophilarum (ATCC 36,906), K) thermotolerans, ve K) marxianus; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces örnegin Schwanniomyces occidentalis; ve filamentöz mantarlar örnegin Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, ve Aspergillus konakçilari örnegin A. nidulans ve A. niger yaygin olarak bulunabilir ve burada kullanislidir. Glikozile polipeptitlerin ekspresyonuna yönelik uygun konakçi hücreler çok hücreli organizmalardan türetilir. Omurgasiz hücrelerinin örnekleri arasinda bitki ve böcek hücreleri bulunur. Çok sayida baküloviral suslar ve varyantlar ve bunlara karsilik gelen Spodoptera frugiperda (tirtil), Aedes aegypti (sivrisinek), Aedes albopictus (sivrisinek), Drosophila melanogaster (meyve sinegi) ve Bombyx mori gibi konakçilardan elde edilen yatkin böcek konakçi hücreleri belirlenmistir. Örnegin Autographa californica NPV'nin L-l varyanti ve Bombe' mori NPV'nin Bm-5 susu gibi transfeksiyona yönelik çesitli viral suslar kamuya açiktir ve bu tür Virüsler Özellikle Spodoptera frugiperda hücrelerinin transfeksiyonuna yönelik buradaki Virüs olarak mevcut bulusa göre kullanilabilir. Pamuk, misir, patates, soya fasülyesi, petunya, domates ve tütünün bitki hücre kültürleri de konakçilar olarak kullanilabilmektedir. Ancak, ilgi omurgali hücrelerde oldukça yogundur ve omurgali hücrelerinin kültürde (doku kültürü) çogaltilmasi rutin bir prosedür haline gelmistir. Kullanisli memeli konakçi hücre hatlarinin örnekleri arasinda, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, SV4O tarafindan dönüstürülen maymun böbrek CV1 hatti (CCS-7, ATCC CRL 1651); insan embriyonik böbrek hatti (süspansiyon kültüründe büyüme için alt klonlanmis 293 ya da 293 hücreleri, Graham.ve dig., Ji Gen Virol. 36:59 (1977)); bebek hamster böbrek hücreleri (BHK, ATCC CCL 10); Çin hamsteri yumurtalik.hücreleri/-DHFR (CHO, Urlaub böbrek hücreleri (CVl ATCC CCL 70); Afrika yesil maymunu böbrek hücreleri (VERO-76, ATCC CRL-1587); insan servikal karsinom hücreleri (HELA, ATCC CCL 2); köpek böbrek hücreleri (MDCK, ATCC CCL 34); buffalo siçan karaciger hücreleri (BRL 3A, ATCC CRL 1442); insan akciger hücreleri (W; insan karaciger CCL51); TRI hücreleri (Mather ve dig., Annals NY. Acad. Sci. hücreleri (Hep G2) bulunur. Çogunlukla, antikorlarin ekspresyonu için CHO hücreleri tercih edilir ve mevcut bulusa uygun olarak saflastirilmis antikorlarin üretilmesi için avantajli bir sekilde kullanilabilir. Konakçi hücreler, polipeptit üretimi için yukarida tarif edilen ekspresyon ya da klonlama vektörleri ile dönüstürülür ve promotörleri uyarmak, dönüstürücüleri seçmek ya da istenen sekanslari kodlayan genleri amplifiye etmek için uygun sekilde modifiye edilmis olan konvansiyonel besleyici ortamda kültürlenir. Mevcut bulusa ait bir antikorun üretiminde kullanilan konakçi hücreler çesitli ortamlarda kültürlenebilir. Ham's FlO (Sigma), Minimal Esansiyel Ortam ((MEM-Minimal Essential Medium), (Sigma), RPMI-l ve Dulbecco Modifiye Eagle Ortami ((DMEM-Dulbecco's Modified Eagle's Medium), Sigma) gibi piyasadaki mevcut ortamlar, konakçi hücrelerin kültürlenmesi için uygundur. Ayrica, Ham ve dig., Meth. Enz. 58:44 (l979), Barnes ve edilen ortamlardan herhangi biri konakçi hücreler için kültür ortami olarak kullanilabilir. Bu ortamlardan herhangi birisi, hormonlar ve/veya diger büyüme faktörleri (örnegin insülin, transferin ya da epidermal büyüme faktörü), tuzlar (Örnegin sodyum klorür, kalsiyum, magnezyum, ve fosfat), tamponlar, (örnegin HEPES), nükleotitler (örnegin adenozin ve timidin), aminoglikozit antibiyotikler (örnegin gentamisin), eser elementler (genellikle mikromolar düzeydeki son konsantrasyonlarda bulunan inorganik bilesikler olarak tanimlanir) ve glükoz ya da buna esdeger bir enerji kaynagi ile gereken sekilde takviye edilebilir. Diger gerekli takviyeler de, teknikte uzman kisilerce bilinen uygun konsantrasyonlarda dahil edilebilir. Sicaklik, pH ve benzeri gibi kültür kosullari, ekspresyon için seçilen konakçi hücrede önceden kullanilan kosullardir ve teknikte siradan uzmanliga sahip kisiler tarafindan anlasilacaktir. Rekombinasyon teknikleri kullanilirken polipeptitler hücre içinde periplazmik boslukta üretilebilir ya da dogrudan ortamin içine salgilanabilir. Polipeptidin hücre içinde üretilmesi durumunda, birinci asama olarak, konakçi hücreler veya lize edilmis hücreler (örnegin homojenizasyondan kaynaklanir) biçimindeki parçacikli artiklar, örnegin, santrifügasyon veya ultrafiltrasyon yoluyla uzaklastirilir. Polipeptit ortama salgilandiginda, bu tür ekspresyon sistemlerinin süpernatanlari piyasadan temin edilebilen bir polipeptit konsantrasyon filtresi, örnegin bir Amicon veya Millipore Pellicon ultrafiltrasyon birimi kullanilarak konsantre edilebilir. Mevcut bulusun bir görünümünde, gentamisinin CEX kolonlari üzerindeki etkisi ele alinir. Gentamisin ve diger aminoglikozit antibiyotikler, dirençsiz kontaminasyonlari önlemek için hücre kültürü uygulamalarinda bakterisidal bir katki maddesi olarak kullanilabilmektedir. Bir hücre kültürüne eklendiginde, süreçle ilgili bir safsizlik olarak uzaklastirilmalidir. Tipik uzaklastirma, bir afinite kromatografisi asamasi kullanilarak gerçeklestirilir, ancak, bazi islemlerde bir afinite asamasi, ilk saflastirma asamasi olmayabilir. Bir katyonik aminoglikozit antibiyotik olarak, gentamisin nötr pH'ta veya altinda pozitif olarak yüklenir. Bir CEX kolonu, ilgili polipeptidi nötr pH'ta veya altinda baglama niyetiyle, ilk kromatografi asamasi olsaydi, gentamisin, kolondaki baglanma bölgeleri için yarisiyor olurdu. Önceki çalisma, gentamisinin bir CEX membrani veya reçinesine bir antikordan daha güçlü baglanacagini göstermistir. Bir CEX kolonu üzerindeki etki, antikor baglama kapasitesindeki belirgin bir düsüstür. Mevcut bulusun baska bir görünümünde, polietilenimin (PEI) veya diger katyonik polimerlerin CEX kolonlarina etkisi ele alinir. PEI, bir E.coli polipeptit saflastirma islemlerinde bir hasat öncesi flokülasyon ajani olarak kullanilabilmektedir. PEI bir hücre homojenizasyon asamasinin ardindan eklendiginde, bir safsizlik baglayicisi görevi görür ve hem santrifügasyon hem de filtrasyonu daha saglam islemler haline getirir. Safsizliklarin flokülasyonu için kullanilmayan herhangi bir ilave PEl'nin etkisi, bu asamanin dahil edilmesine dair bir endisedir çünkü daha sonra CEX kolonlariyla temas haline olan saflastirma.havuzlarinda kalir. Dogrusal veya dallanmis polimerler arasinda degisen farkli PEI formlari bulunur ve bunlar birincil, ikincil veya üçüncül aminleri içerebilir. PEI'nin sekli, isleme kosullarinin Çogunda pozitif yüklü oldugu gerçegi kadar çok endise yaratmamistir. Böylece CEX kolonuna çok güçlü bir sekilde baglanacaktir. Ayrica, çogu E.coli proteinleri için ilk kromatografi asamasi nispeten yüksekloaglanma kapasiteleri nedeniyle bir CEX kolonu olabilir. Ek olarak, CEX kolonunun PEI'ye kuvvetli baglanmasi nedeniyle, zaman zaman daha zayif bir CEX kolonunun kullanilmasini gerektirir, böylece PEI her bir çalismadan sonra kolondan elüte edilebilmektedir. Önceki çalismalar, flokülasyon için degisen seviyelerde PEI kullanildiginda, CEX kolonunun baglanma kapasitesinin daha düsük PEI seviyeleri kullanildikça artacagini göstermistir. CEX kromatografisi asamasi veriminin, yüklemedeki düsük PEI seviyeleri ile artacagi da gözlenmistir. Safsizliklari azaltmak için bir iyon degisim kolonundan önce benzer sekilde yüklü bir iyon degisim membraninin kullanilmasi, hepsi daha verimli bir islem ve düsük isletme maliyetleri saglayabilen baglama kapasitesi, verim, safsizlik kleransinin artmasina neden olabilmektedir. Bulusa Ait Membran Iyon Degisim Kromatografisi Yöntemi Bulusun tercih edilen uygulamasinda, buradaki saflastirma yöntemine tabi tutulacak bilesim, bir Çin Hamsteri Yumurtaligi (CHO) veya E.Coli rekombinant konakçi hücre kültürü ile eksprese edilen rekombinant olarak üretilmis bir polipeptit, tercihen bütün bir antikordur. Istege bagli olarak, bilesinu membran iyon degisim kromatografisinden önce en az bir saflastirma asamasina tabi tutulmustur. Bilesim ilgili polipeptidi ve bir veya daha fazla kontaminanti, örnegin Çin Hamsteri Yumurtalik Proteinleri (CHOP);E. coli Proteinleri (ECP); özütlenmis protein A; nükleik asit; istenen antikorun bir varyanti, fragmani, agregati veya türevi; baska bir polipeptit; endotoksin; Viral kontaminant; aminoglikozit antibiyotikJOilesenleri (örnegin, gentamisin); veya saflastirma islemine eklenen iyonik bir polimeri (örnegin, polietilenimin (PEI), polivinilamin, poliarjinin, polivinilsülfonik asit, poliakrilik asit), vb içerir. Membran iyon degisim kromatografisi yöntemi öncesinde, esnasinda veya sonrasinda gerçeklestirilebilen ilave saflastirma prosedürlerinin örnekleri arasinda bir hidrofobik etkilesim kromatografisi üzerinde (örnegin PHENYL-SEPHAROSETM üzerinde) fraksiyonasyon, etanol çöktürmesi, termal çöktürme, polietilen glikol (PEG) Çöktürmesi, izoelektrik odaklama, Ters Faz HPLC, silika üzerinde kromatografi, HEPARIN SEPHAROSETM üzerinde kromatografi, anyon degisim kromatografisi, katyon degisim kromatografisi, karisik mod iyon degisimi, kromatoodaklama, SBS-PAGE, amonyum sülfat çöktürmesi, hidroksiapatit kromatografisi, jel elektroforezi, diyaliz, hidrofik yük indüksiyon kromatografisi, yüksek performansli teget akis filtrasyonu (HPTFF) ve (örnegin yakalama reaktifi olarak protein A, protein G, bir antikor, veya spesifik bir substrat, ligant veya antijen kullanilan) afinite kromatografisi bulunur. Rekombinasyon teknikleri kullanilirken polipeptitler hücre içinde periplazmik boslukta üretilebilir ya da dogrudan ortamin içine salgilanabilir. Polipeptidin hücre içinde üretilmesi durumunda, birinci asama olarak, konakçi hücreler veya lize edilmis fragmanlar biçimindeki parçacikli artiklar, örnegin, santrifügasyon veya filtrasyon yoluyla uzaklastirilir. Polipeptidin ortam› içine salgilanmasi durumunda, rekombinant konakçi hücreler, örnegin, santrifügasyon veya filtrasyon ile hücre kültür ortamindan ayrilabilir. Izole edici antikorlar durumunda, saflastirmanin büyük bir kismi, birinci asama olarak kullanilmasi durumunda protein A afinite kromatografisi esnasinda ortaya çikar. Protein.A, spesifik olarak antikorlarin Fc bölgesine baglanan. bir bakteri hücre duvari proteindir. Kromatografi ortamina immobilize edildiginde protein A, kompleks çözeltilerdeki antikorlari seçici olarak baglayabilmesinden ve safsizliklarin sürekli akisina izin vermesinden dolayi rekombinant antikorlarin› saflastirilmasina yönelik bir teknik saglar. Protein A afinite kolonunun temel protokolü basittir: yaklasik nötr pH'aibaglanir ve asit.pH'da elüte edilir. Kati.bir faz üzerinde immobilize edilmis Protein A, CH2/CH3 bölge içeren polipeptidi saflastirmak için kullanilir. Kati faz tercihen protein A'nin immobilize edilmesi için bir cam, silika, agaroz veya polistirendivinilbenzen yüzeyi içeren bir kolondur. Tercihen kati faz, kontrollü bir gözenekli cam kolonu, silisik asit kolonu veya yüksek ölçüde çapraz bagli agaroz kolonudur. Piyasada GE Healthcare'den temin edilebilen bir Mabselect SuReTM kolonu, antikorlarin saflastirilmasinda etkili olan çapraz bagli agaroz protein A kolonunun bir örnegidir. Bazen, kolon, kolona spesifik olmayan yapismanin önlenmesi amaciyla bir reaktif ile örnegin gliserolle kaplanmistir. Piyasada Millipore Corporation'dan temin edilebilen PROSEP ATM kolonu, gliserol ile kaplanmis bir protein A kontrollü gözenekli cam kolonunun bir örnegidir. Protein A kromatografisi için kati faz uygun bir tampon ile dengelenmistir. Rekombinant konakçi hücrelerden türetilen kontamine preparat, dengeleme tamponu ile ayni olabilen bir yükleme tamponu kullanilarak dengelenmis kati faza yüklenir. Kontamine preparat kati fazdan sürekli akis halindeyken, polipeptit, immobilize edilmis protein A'ya adsorbe edilir` ve diger kontaminantlar (örnegin, polipeptidin bir CHO hücresi, gentamisin ve polietileniminde (PEI) üretildigi Çin Hamster Yumurtalik Proteinleri, CHOP) kati faza spesifik olmayan bir sekilde baglanir. Ardisik olarak gerçeklestirilen bir sonraki asama, kati fazin bir ara yikama adiminda bir tuz, amino asit ve/Veya hidrofobik elektrolit çözücüsü içeren bir çözelti ile yikanmasiyla kati faza baglanan kontaminantlarin uzaklastirilmasini gerektirir. Tercih edilen uygulamalarda, bu yikamadaki tuz potasyum fosfattir, amino asit arjinindir ve hidrofobik elektrolit TEMAC ve/veya TEAC'dir. Yikamada tek bir çözücü bulunabilirken, bazi uygulamalarda, iki veya daha fazla çözücü de kullanilabilir. Çözücü(ler) tercihen yaklasik nötralitede bir pH'a sahip olan pH tamponlu.bir çözeltiye ilave edilir. Önceki paragraftaki ara yikama adiminin ardindan, ilgili polipeptit kolondan geri kazanilir. Bu normal olarak uygun bir elüsyon tamponu kullanilarak elde edilir. Polipeptit, örnegin, düsük bir pH'a, örnegin, yaklasik 2 ila yaklasik 5 arasinda ve tercihen yaklasik 2,5 ila yaklasik 3,5 arasinda bir pH'a sahip bir elüsyon tamponu kullanilarak kolondan elüte edilebilir. Bu amaca yönelik olarak elüsyon tamponlarinin örnekleri sitrat veya asetat tamponlarini içerir. Membran iyon degisim kromatografisi burada talep edildigi sekilde gerçeklestirilir. Bir anyon veya katyon degisini membraninin kullanilip kullanilmayacagina dair bir karar verilir. Bazi antikorlarin izoelektrik noktasi (pl), yaklasik olarak 6,7 ila 9,4 arasinda degismesine ragmen, birçok antikorun.pl degeri yüksektir (genellikle 8 ve bazen 9). Genel olarak, yaklasik 8'den daha yüksek pI'ya sahip antikorlar için bir katyon degisim membrani kullanilabilir ve yaklasik 8'den daha düsük pI'ya sahip antikorlar için bir anyon degisim membrani kullanilabilir. Asiri yükleme modunda çalistirilan membran katyon degisim kromatografisi için, yükleme materyalinin pH'i, antikorun pl'sinin yaklasik 1 ila yaklasik 5 pH birim altina ayarlanir, yükleme materyalinin iletkenligi ise pH'a bagli olarak 5 yaklasik 40 mS/cm'e ayarlanir ve antikor daha sonra membrandan pompalanir. Bazi uygulamalarda, yükleme materyalinin pH'i, antikorun pl'sinin yaklasik 1 ila yaklasik 4 pH birimi, yaklasik 1 ila yaklasik 3 pH birimi, yaklasik 1 ila yaklasik 2 pH birimi veya yaklasik 1 pH birimi altina ayarlanir. Diger uygulamalarda, yükleme materyalinin iletkenligi.pH'a.bagli olarakfêyaklasiki201nS/cniveya S yaklasik 10 m8 / cm'ye ayarlanir. Yüklemenin pH'i antikorun pl'sindan daha düsük oldugu için, antikor (pozitif yüklü hale gelir) baslangiçta sürekli akis halinde olmayacaktir. Aksine, antikor, katyon degistiricinin negatif fonksiyonel gruplarina elektrostatik olarak baglanacaktir. Bunun nedeni, antikorun (pozitif) ve membranin (negatif) zit yüke sahip olmasidir. Birçok kontaminantin, örnegin, protein A afinite kromatografisi sirasinda antikor ile elüte olan CHOP veya ECP gibi konakçi hücre proteinleri, gentamisin gibi aminoglikozit antibiyotikleri ve polietilenimin (PEI) gibi iyonik polimer katki maddelerinin, pI degeri antikorun pI degerinden yalnizca biraz farkli oldugundan, baska bir ifadeyle, pI'lar yalnizca yaklasik 0,05 ila yaklasik 0,2 pl birimiyle farklilik gösterebildiginden dolayi "bazik" antikorlar gibi kontaminantlar ayrica membrana da baglanir. Protein A kromatografisinin kullanilmadigi saflastirma planlarinda, gentamisin veya PEI ya da diger safsizliklar, bir membran kullanilmadikça bir IEX kolonunun performansini bölmek için yeterince yüksek konsantrasyonlarda kalacaktir. Teoriye bagli kalmaksizin, asiri yükleme modunda çalistirilan membran katyon degisim kromatografisi için, minimal iyonik.kalkanlama ile yük indükleyen pH ve iletkenlik kosullarinda, rekabetçi adsorpsiyon meydana gelir ve kontaminantlar tercihen membrana baglanir veya etkili bir sekilde membrandan gelen antikoru "yer degistirir" (RR Drager, FE Regnier, J Chromatogr. 359zl47-55 (1986)) ve böylece antikorun natristen "elüte" olmasina veya baglamadan sonra sürekli akis halinde olmasina ve eflüent içinde geri kazanilmasina olanak saglar. Asiri yükleme modunda çalistirilan membran anyon degisim kromatografisi için, yükleme materyalinin pH'i, antikorun pl'sinin yaklasik 1 ila yaklasik 5 pH birim üstüne ayarlanir, yükleme materyalinin iletkenligi ise pH'a bagli olarak S yaklasik 40 mS/cm'e ayarlanir ve antikor daha sonra membrandan pompalanir. Bazi uygulamalarda, yükleme materyalinin pH'i, antikorun pl'sinin yaklasik 1 ila yaklasik 4 pH birimi, yaklasik 1 ila yaklasik 3 pH birimi, yaklasik 1 ila yaklasik 2 pH birimi veya yaklasik 1 pH birimi üstüne ayarlanir. Diger uygulamalarda, yükleme materyalinin iletkenligi.pH'a.bagli olarakfêyaklasikLZOInS/cniveya S yaklasik 10 ms / cm'ye ayarlanir. Yüklemenin pH'i antikorun pI'sindan daha yüksek oldugu için, antikor (negatif yüklü hale gelir) baslangiçta sürekli akis halinde olmayacaktir. Aksine, antikor, anyon degistiricinin pozitif fonksiyonel gruplarina elektrostatik olarak baglanacaktir. Bunun nedeni, antikorun (negatif) ve membranin (pozitif) zit yüke sahip olmasidir. Birçok kontaminantin, örnegin, protein A afinite kromatografisi sirasinda antikor ile elüte olan CHOP gibi konakçi hücre proteinlerinin pI degeri antikorun pI degerinden yalnizca biraz farkli oldugundan, baska bir ifadeyle, pI'lar yalnizca yaklasik 0,05 ila yaklasik 0,2 pl birimiyle farklilik gösterebildiginden dolayi "asidik" antikorlar gibi kontaminantlar ayrica membrana da baglanir. Teoriye bagli kalmaksizin, asiri yükleme modunda çalistirilan membran anyon degisim kromatografisi için, minimal iyonik kalkanlama ile yük indükleyen pH ve iletkenlik kosullarinda, rekabetçi adsorpsiyon meydana gelir ve kontaminantlar tercihen.membrana baglanir veya etkili bir sekilde membrandan gelen antikoru "yer degistirir" (RR Drager, FE Regnier, olmasina ve eflüent içinde geri kazanilmasina olanak saglar. Bir örnekte, membran kromatografisi, standart bir kromatografi sistemi ya da basinç ölçer, sensör ve pompa ile birlikte pompa kontrolörleri ile donatilmis bir AKTATM Explorer (GE Healthcare) gibi özel bir kromatografi sistemi üzerinde gerçeklestirilir. Bu örnekte, membran cihazi.bir basinç ölçerin asagi akis yönündeinonte edilmistir. Söz konusu örnekte, pH ve iletkenlik dedektörleri, membran cihazinin asagi akis yönünde monte edilmistir. Söz konusu örnekle devam edecek olursak, membranin yerlestirilmesinden önce sistem suyla ve ardindan dengeleme tamponuyla iyice yikanir. Yine söz konusu örnekle devaniedecek olursak, membranli sistem, çözelti pH'i ve iletkenlik çikisi, dengeleme tamponu spesifikasyonuna (yaklasik bes membran hacmi) denk olana ve stabil bir referans degeri gözlenene kadar dengeleme tamponu ile yikanir. Söz konusu örnekle daha da devaniedecek olursak, beslemeinateryali, 333 - pH 5,5 veya (varsayimsal "asidik" bir antikorun saflastirilmasi için) pH 8,0 ve yaklasik 4 mS/cm'lik bir iletkenlikteki bir pompa ile yüklenir. Söz konusu örnekle yine devam.edecek olursak, islem geri basinci ile operasyon esnasinda pH ve iletkenlik degisiklikleri kaydedilir. Son olarak, söz konusu örnekte, membran eflüentindeki polipeptit, 280 nm'deki bir ultraviyole (UV) absorbans izinin, referans degere göre 0,2 absorbans birimi olmasi halinde derhal toplanir. Besleme materyalinin yüklenmesinin ardindan, membran uygun bir yikama tamponu ile yikanir ve 280 nm'deki UV izi 0,2'lik absorbans birimlerinin altinda oldugunda havuz toplanmasi durdurulur ve membran eflüent fraksiyonundaki havuzdan alinan numuneler polipeptit konsantrasyonu, dimer/agregasyon seviyesi, konakçi hücre proteinleri, DNA ve özütlenmis protein A için analiz edilir. Asama geri kazanimi tipik olarak, yüklenen polipeptit ve membran eflüentindeki polipeptit kullanilarak hesaplanir. Membran geleneksel olarak yalnizca tek kullanimliktir. Analitik analizlerle ilgili olarak, polipeptit içerigi (polipeptit konsantrasyonu), bir Beckman spektrofotometresi kullanilarak 280 nm'deki absorbans ile belirlenebilir. Polipeptit agregasyonu, boyut dislama kromatografisi ile belirlenebilir. Konakçi hücre proteini, örnegin CHOP veya ECP, seviyeleri enzime bagli bagisiklik analizi (ELISA) ile analiz edilebilir. Konakçi hücre DNA'si, TaqMAN PCR (polimeraz zincir reaksiyonu) kullanilarak ölçülebilir. Özütlenmis protein.A, protein.A reçine saticisi tarafindan tavsiye edilen immünokimyasal ELISA bazli yöntem kullanilarak gerçeklestirilebilir. Gentamisin, ELISA ve polietilenimin (PEI) ile analiz edilebilir, seviyeler Q Sefaroz Hizli Akis kromatografisi veya nükleer manyetik rezonans (NMR) ile Ölçülebilir. Asagidaki tamponlar varsayimsal olarak tasarlanmis ve S membrani ile kullanim için test edilmistir: (1) 89 mM asetik asit, 127 mM TRIS baz, 21 mM sitrik asit, pH 5,5, 28 mM MES, 95 pH 50 mM HEPES, 90 mM NaCl, pH 7,0, 10 mS/cm, (8) 0,5x fosfat tamponlu tuz 6,0 mS/cm. Asagidaki tamponlar varsayimsal olarak tasarlanmis ve Q membrani ile kullanim.için test edilmistir: (1) 50 mM TRIS, 15 mM NaCl, pH 60 mM TRIS, 50 mM TRIS, 50 mM NaOAc, pH ve (6) 91 mM asetik asit, 75 mM TRIS, 5 mM NaCl, pH 8,9, 25 mM TRIS, 10 mM NaCl, pH , pH 7,3, ,2 mS/cm. Ayrica, herhangi.bir tampon sisteminifipH'i, uygunküirpH'aiilasmak için asetik asit, sitrik asit, HEPES, hidroklorik asit, fosforik asit, sodyum hidroksit, TRIS veya diger bu tür asidik ve bazik tamponlarin eklenmesiyle yukari veya asagi ayarlanabilmektedir. Ayrica, herhangi bir tampon sisteminin iletkenligi, uygun bir iletkenlige ulasmak için saflastirilmis su, enjeksiyonluk su (WFI), sodyum asetat, sodyum klorür, potasyum fosfat veya bu tür düsük ve yüksek tuz içeren tamponlar kullanilarak yukari veya asagi ayarlanabilmektedir. Rekabetçi adsorpsiyon membran kromatografisi asamasinin gelistirilmesi, yükleme materyalinin membran boyunca çesitli pH ve iletkenlik seviyelerinde çalistirilmasini içerir. Molekülün büyük bir elektrostatik etkilesime sahip olmasi durumunda, polipeptidin, ilgili polipeptit veya kontaminantin tutulmasi arttirilabilmektedir. Polipeptitlerin iyi sekilde yüklendigi kosullar altinda çalisirken, baska bir ifadeyle, polipeptidin yükünü arttiran, polipeptidin pI'sindan yeterince farkli bir pH'a ve tampon iyonlari tarafindan yüklerin korunmasini önlemeye yönelik düsük bir iyonik güce sahip olan bir tampon kullanildiginda, elektrostatik etkilesimler arttirilabilmektedir. Buna karsilik, polipeptitlerin kötü sekilde yüklendigi kosullar altinda çalisirken, baska bir ifadeyle, polipeptidin yükünü azaltan, polipeptidin pI'sina yeterince yakin bir pH'a ve tampon iyonlari tarafindan yüklerin korunmasina olanak saglamaya yönelik yüksek bir iyonik güce sahip olan bir tampon kullanildiginda, elektrostatik etkilesimler azaltilabilmektedir. Sonuç olarak, farkli fiziko-kimyasal özelliklere sahip polipeptitler, tampon çözeltisini optimize ederek membran adsorpsiyonu ile ayrilabilmektedir. Bazi moleküller belirli bir membran üzerinde tutulabilirken, digerleri tamponun pH ve iyonik gücünün uygun seçimine dayanarak sürekli akis halinde olabilmektedir. Buradaki membran iyon degisim kromatografi yöntemine göre elde edilen polipeptit preparati, gerekli olmasi halinde, ilave saflastirma asamalarina tabi tutulabilir. Örnek saflastirma asamalari yukarida ele alinmistir. Sekil 1'e istinaden, bir antikor için basarili bir saflastirma planina ait bir örnek, protein A afinite kromatografisinin bir baslangiç yakalama asamasini, ardindan bagla ve elüte et modunda çalistirilan bir katyon degisim kolonunu ve ardindan nihai bir parlatma asamasi veya asamalarini içeren bir geri kazanim islemidir. Sekil l'e istinaden, gelistirilmis bir saflastirma planina ait bir örnek, protein A afinite kromatografisinin bir baslangiç yakalama asamasini, ardindan bagla ve elüte et modunda çalistirilan bir katyon.degisin1kolonunu koruyan asiri yüklemelnodunda çalistirilan bir katyon degisim membranini ve ardindan nihai bir parlatma asamasi veya asamalarini içeren bir geri kazanim islemidir. Sekil l'e istinaden, gelistirilmis bir saflastirma planina ait.bir diger örnek, bagla ve elüte et modunda çalistirilan bir katyon degisim kolonunu koruyan asiri yükleme modunda çalistirilan bir baslangiç katyon degisinimembranini.ve ardindan nihai.bir parlatma asamasi veya asamalarini içeren bir geri kazanim islemidir. Sekil 2'ye istinaden, bir antikor olmayan için basarili bir saflastirma planina ait bir örnek, katyon degisim kromatografisinin bir baslangiç yakalama asamasini ve ardindan nihai.bir parlatma.asamasi'veya asamalarini içereribir geri kazanim islemidir. Sekil Z'ye istinaden, gelistirilmis bir saflastirma planina ait bir örnek, bagla ve elüte et modunda çalistirilan bir katyon degisim kolonunu koruyan asiri yükleme modunda çalistirilan bir baslangiç katyon degisinimembranini ve ardindan nihai birjparlatma asamasi veya asamalarini içeren bir geri kazanim islemidir. cilalama asamasi olarak kullanan uygulamalardan farkli olarak, mevcut saflastirma yöntemindeki membranlar benzer sekilde yüklenmis bir iyon degisim membranini (örnegin bir katyon degisim reçinesinin hemen önüne yerlestirilmis bir katyon degisim membrani) korumak için kullanilir. Bu, membranlar safsizliklar için polipeptitler/antikorlara göre daha fazla selektif olduklari için faydalidir, böylece kolona giden safsizliklari azaltir veya ortadan kaldirirlar. Safsizliklar ayrica polipeptidin/antikorun yerini, sonunda kolonun üzerine dogru ilerleyecek sekilde de degistirebilmektedir. Membranlar, yukarida belirtilen kolon ile sürekli ya da sürekli olmayan sekilde kullanilabilmektedir. Bu saflastirma yönteminde benzer sekilde yüklü iyon degisim kolonundan önce membranlarin kullanilmasi, yüklemedeki safsizliklarin katyon degisim kolonunun performansini düsürdügü zaman avantajli olabilir. Söz konusu safsizliklari membran ile uzaklastirmak suretiyle katyon degisini kolonunun daha yüksek baglama kapasitesine yüklenmesine izin olanak saglanabilir ve bu da her' bir çalisma için azaltilmis bir kolon boyutuna. veya azaltilmis döngü sayisina neden olur. Alternatif olarak, söz konusu safsizliklari bir nembran ile uzaklastirmak suretiyle katyon degisinikolonunun bir artis asamasi verimine sahip olmasina veya atilmadan önce daha uzun bir reçine Ömrüne sahip olmasina veya katyon degisim havuzundaki safsizlik seviyelerinin azalmasina veya akis asagi Cilalama asamalarinin sayisinin azaltilmasina olanak saglanabilir. Ayni zamanda, bir katyon degisim kolonunun, protein A afinite reçinesi için daha ucuz bir alternatife gerek duyuldugunda ya da ilgili polipeptit bir protein A afinite reçinesine baglanmayacaksa avantajli olabilecek bir protein A afinite kolonunun yerini almasina olanak saglanabilir. Sürekli operasyon içinde bir katyon degisim membrani ve katyon degisim kolonu kullanmak, toplam isleme süresi, tamponlar veya tanklar veya kromatografi kizaklari gibi ekipmanin azaltilmasi ile avantajli hale gelebilir. Istege bagli olarak, polipeptit, istendigi gibi bir veya daha fazla heterolog moleküle konjüge edilir. Heterolog molekül, örnegin, polipeptidin (örnegin polietilen glikol, PEG) serum yari ömrünü arttiran bir molekül olabilir veya bir etiket (örnegin bir enzim, floresan etiketi ve/veya radyonüklit) veya bir sitotoksik molekül (örnegin bir toksin, kemoterapötik ilaç veya radyoaktif izotop Vb.) olabilir. Heterolog bir molekül ile istege bagli olarak konjüge edilmis, polipeptit içeren terapötik bir formülasyon, istenen saflik seviyesine sahip bir polipeptidin, istege bagli farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilar, eksipiyanlar veya stabilizörlerle (Remington's Pharmaceutical Sciences l6'nci baski, Osol, A. Ed. (1980)), liyofilize formülasyonlar veya sulu Çözeltiler biçiminde karistirilmasi yoluyla hazirlanabilir. "Farmasötik olarak kabul edilebilir" tasiyicilar, eksipiyanlar veya stabilizörler, uygulanan dozajlarda ve konsantrasyonlarda alicilar için toksik degildir ve bunlarin arasinda tamponlar, örnegin fosfat, sitrat ve diger organik asitler; askorbik asit ve metiyonin dahil olmak üzere antioksidanlar; koruyucular (örnegin oktadesildimetilbenzil amonyum klorür; heksametonyum klorür; benzalkonyum klorür, benzetonyum klorür; fenol, bütil veya benzil alkol; alkil parabenler, örnegin metil veya propil paraben; katekol; resorsinol; sikloheksanol; 3-pentanol; ve m-kresol); düsükinolekül kütleli (yaklasik.lO kalintinin altinda) polipeptit; proteinler, örnegin serum albümin, jelatin veya immünoglobülinler; hidrofilik polimerler, örnegin polivinilpirolidon; amino asitler, örnegin glisin, glutamin, asparajin, histidin, arjinin veya lizin; monosakaritler, disakaritler ve diger karbonhidratlar, örnegin glukoz, mannoz veya dekstrinler; selatlama ajanlari, örnegin EDTA; sekerler, örnegin sukroz, mannitol, trehaloz veya sorbitol; tuz olusturan karsi iyonlar, örnegin sodyum; metal kompleksleri (örnegin Zn-protein kompleksleri); ve/veya iyonik olmayan yüzey aktif maddeler, örnegin TWEENW, PLURONICSm-Veya polietilen glikol (PEG) bulunur. Aktif bilesenler ayrica, örnegin koaservasyon teknikleriyle ya da interfasiyal polimerizasyonla hazirlanan mikrokapsüller, örnegin, sirasiyla hidroksimetilselüloz ya da jelatin mikrokapsüller ve poli-(metilmetasilat) mikrokapsüller içinde, kolloidal ilaç dagitim sistemleri (örnegin, lipozomar, albumin mikrokürecikler, mikroemülsiyonlar, nano-parçaciklar ve nanokapsüller) ya da makroemülsiyonlar içinde hapsedilebilir. Bu gibi teknikler, Remington's Pharmaceutical Sciences, l6'nci baski, Osol, A. Ed. (1980) referansli yayinda açiklanmistir. olmasi gerekir. Sterillik, steril filtrasyon membranlari içerisinden filtrasyon yoluyla kolaylikla saglanir. Sürekli salimli preparatlar hazirlanabilir. Sürekli salimli preparatlarin uygun örnekleri arasinda, polipeptit içeren kati hidrofobik polimerlerin yari geçirgen matrisleri bulunur ve bu matrisler, sekilli malzemeler, örnegin filmler veya mikrokapsül biçimindedir. Sürekli salimli matrislerin örnekleri arasinda polyesterler, hidrojeller (örnegin, poli(2-hidroksietil-metakrilat) ya da poli(vinilalkol)), polilaktitler (U-S. Pat. No. 3,773,919), L-glutamik asit ve y etil-L-glutamat kopolimerleri, bozunmaz etilen-vinil asetat, bozunur laktik asit-glikolik asit kopolimerleri, Örnegin LUPRON DEPOTTM (laktik asit-glikolik asit kopolimeri ve löprolit.asetattan olusan enjekte edilebilir mikrokürecikler) ve poli-D-(-)-3-hidroksibütirik asit bulunur. Burada açiklanan sekilde saflastirilan polipeptit veya.polipeptit ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici içeren bilesim daha sonra çesitli teshis amaçli, terapötik veya bu tür polipeptitler ve bilesimler için bilinen diger kullanimlar için kullanilir. Örnegin, polipeptit, bir polipeptidin terapötik olarak etkili bir miktarinin memeliye uygulanmasiyla bir memelideki bir bozuklugun tedavi edilmesi için kullanilabilir. Asagidaki örnek(ler) örnekleme amaciyla sunulmustur. ÖRNEKLER Bu çalisma, asagi akis kolonlarinin etkinligini arttirmak için rekabetçi adsorpsiyon modunda iyon degisim› membranlari kullanilmasiyla monoklonal antikorlarin saflastirilmasina odaklanir. Rekabetçi adsorpsiyon modunda çalisan membranlar, birçok safsizligi, monoklonal antikorlardan veya ilgili diger polipeptitlerden daha güçlü bir sekilde bagladigindan, membran, benzer sekilde yüklü, bir asagi akis kolonu üzerinde zararli bir etkiye sahip olabilecek safsizliklari etkili bir sekilde uzaklastirir. Bu yaklasim, ihtiyaç fazlasi katyon degisim veya anyon degisim saflastirma asamalarini ortadan kaldirmaya çalisan birçok saflastirma islemi kanisinin aksinedir. Bu uygulamada, bir asagi akis kolonundan önceki ihtiyaç fazlasi bir membran, tüm islemin daha verimli olacagi sekilde kolonun performansini arttirabilmektedir. Bir rekombinant DNA'dan türetilmis mAb, bir rekombinant DNA'dan türetilmis tek kollu antikor ve bir rekombinant DNA'dan türetilmis polipeptit moleküler çesitliliklerine dayali olarak analiz için seçilmistir. mAb, CHO hücre kültürlerinde üretilmis ve hiçbir kromatografi saflastirmasi ile üç kolon kromatografisi asamasi (Protein A, anyon degisim ve katyon degisim) arasinda degisen saflastirma derecelerinde degisiklik göstermistir. Tek kollu antikor, E. coli hücre kültürlerinde üretilmis ve bir Protein A kromatografi asamasi ile saflastirilmistir. Polipeptit, E. coli hücre kültürlerinde üretilmis ve daha önce hiçbir kromatografi saflastirmasina tabi tutulmamistir. Besleme akislari, bir kromatografi kolonunu olumsuz etkileyebilecek kalan safsizlik Bu çalisma, gentamisin ve polietilenimin (PEI) gibi safsizliklarin, iyon degisim kolonlarini olumsuz yönde etkileme kabiliyetini ve MustangTM S ve Natrix 8 gibi iyon degisim membranlarinin, gelistirilmis kolon performansina neden olan bu safsizliklari temizleme kabiliyetini arastirir. Materyaller ve Yöntemler Besleme Akisi Besleme akislari.baslangiçta'ticari'veya.arastirnß.amaçli'üretilen endüstriyel, pilot veya küçük ölçekli hücre kültürü partilerinden (Genentech Inc., Güney San Francisco, California) alinmistir. Besleme akislari farkli saflastirma derecesine sahipti, baska bir ifadeyle hücreler ayrilmis ve berraklastirilmis sivi en az bir kolon kromatografisi asamasinda saflastirilmis veya saflastirilmamistir. Her besleme akisinda, bir hedef terapötik polipeptit. ve ölçülebilir bir safsizlik. seviyesi vardi. Her besleme akisinin bilesimi, münferit polipeptit islemine ve saflastirma seviyesine bagli olarak degisiklik göstermistir. Tablo 1, bu çalismada kullanilan antikorlarin, polipeptitlerin veya tek degerli antikorlarin her biri için besleme akisi özelliklerini gösterir. Tablo 1: Besleme akisi özellikleri. . Molekül Ürün 3 Molekül Turu _ Adlandirma pH Agirligi pl 5 Protein A, Anyon Monoklonal antikor Sürekli Akis Havuzu Protein A, Katyon Monoklonal antikor Bagla/Elüte et Havuzu Sentrat 1,2-1 Santrifügasyon 7,6 ,4 Protein A " 5,5 3,2 Monoklonal Protein A' mAb Q v_ ' Anyon Sürekli Akis* Protein A, Anyon Degisim, Katyon 6,2 4,2 31,6 Degisim, UF/DF Ekstraksiyon, Degerli Tek degerli Protein A Antikor antikor Havuzu 1 Santrifügasyon Ekstraksiyon, Polipept PEI 6.6 - Polipeptit Merkezi 7,0 8,0 UD 60 9,1 it 1 Kosullandirma, 7.5 Santrifügasyon a Tüm ürünler için olan besleme stogu endüstriyel, pilot ve küçük ölçekli islemlerden toplanmistir. b Havuz pH'i ve iletkenligi yeterli ürün stabilitesi saglamak amaciyla daha önce ayarlanmistir. C Izoelektrik noktasi (pl) her bir mAb için olan amino asit Polipeptit Miktar Ölçümü Polipeptit konsantrasyonu üç yöntem kullanilarak belirlenmistir. Safsizlik seviyelerinin UV absorbansi üzerinde kayda deger bir etkide bulunmayacak kadar düsük olmasi durumunda 280 ve 320 nm'de bir UV-spektrofotometrik tarama kullanilmistir. Safsizlik seviyelerinin veya renginin, UV absorbansi üzerinde kayda deger bir etki gösterebilmesi durumunda, sirasiyla, antikor veya polipeptit konsantrasyonlarinin miktarini ölçmek için analitik bir afinite kolonu veya iyon degisim kolonu kullanilmistir. UV-spektrofotometrik tarama ile test edilen numuneler için, polipeptit içeren numuneler, 0,1 ila 1,0 AU araligindaki uygun müdahaleci olmayan seyreltici ile seyreltilmistir. Numune hazirlama ve spek tarama Okumalari iki kopya halinde yapilmis ve ortalama deger kaydedilmistir. Test edilen polipeptitlerin absorpsiyon katsayisi 1,45 - 1,70 (mg/mL)_1cm"l idi. Beer-Lambert Yasasi olarak bilinen denklemi kullanarak mAb konsantrasyonunu hesaplamak için 280 ve 320 nm'de absorbans, seyreltme faktörü, yol uzunlugu CLCHU ve absorpsiyon sönümleme katsayisi kullanilmistir. | A280 - A320 Protein Konsantrasyonu (mg/mL) =_________ x seyreltme faktörü Analitik afinite kolonlari ile test edilen numuneler için, antikor içeren numuneler, gerektigi durumda, 0,025 - 4,0 mg/mL araligindaki uygun müdahaleci olmayan seyreltici ile seyreltilmistir. Alternatif olarak, enjeksiyon hacmi, sirasiyla daha düsük veya daha yüksek konsantrasyon numuneleri için ikiye katlanabilir veya yariya indirilebilir. Numune hazirlama ve HPLC testi iki kopya.halinde yapilmis ve ortalama deger kaydedilmistir. Bir jenerik antikor HPLC testi olarak, numune konsantrasyonu sonuçlari, referans materyalin antikor absorpsiyon sönümleme katsayisina karsilik gelen emilim sönümleme katsayisi kullanilarak spesifik antikor için düzeltilmistir. Analitik iyon degisim kolonu ile test edilen numuneler için, polipeptit içeren numuneler, gerektigi durumda, 0,1 - 0,8 mg/mL araligindaki uygun müdahaleçi olmayan seyreltici ile seyreltilmistir. Numune hazirlama ve HPLC testi iki kopya halinde yapilmis ve ortalama deger kaydedilmistir. Numune konsantrasyonu sonuçlari, enjeksiyon pikinin.altindaki alanin birlestirilmesiyle belirlenir ve referans materyal kullanilarak standart bir egri ile iliskilendirilir. CHO Konakçi Hücre Proteinleri (CHOP) Miktar Ölçümü CHOP seviyelerinin miktarini ölçmek için enzime bagli bir bagisiklik analizi (ELISA) kullanilmistir. Afinite ile saflastirilmis keçi anti-CHOP antikorlari mikrotitre plaka kuyucuklarinda immobilize edilmistir. CHOP, standartlar ve kontrolleri içeren numunelerin seyreltileri kuyucuklarda inkübe edilmis ve ardindan yaban turpu peroksidazi ile konjüge keçi anti-CHOP antikorlariyla inkübe edilmistir. Yaban turpu peroksidazinin enzimatik aktivitesi o-fenilendiamin dihidroklorür ile saptanmistir. CHOPIniktari, birinikrotitre plaka okuyucuda 492 nm'de absorbansin okunmasiyla ölçülmüstür. Bilgisayarda bir egri oturtma programi kullanilarak standart egri olusturulmus ve numune konsantrasyonu otomatik olarak hesaplanmistir. ELISA için analiz araligi tipik olarak 5 ng/ml ila 320 ng/ml idi. Her numune için 2-4 seyrelti analiz edilmis ve degerlerin ortalamasi alinmistir. CHOP degerleri protein konsantrasyonu ile bölünmüs ve sonuçlar ppm (ng CHOP/mg protein) biriminde rapor edilmistir. E. Coli Proteinleri (ECP) Miktar Ölçümü CHOP miktar ölçümüne benzer bir sekilde ECP seviyelerinin miktarini ölçmek için enzime bagli bir bagisiklik analizi (ELISA) kullanilmistir. Gentamisin Miktar Ölçümü Gentamisin seviyelerinin miktarini ölçmek için enzime bagli bir bagisiklik analizi (ELISA) kullanilmistir. Gentamisin-BSA'ya yönelik keçi poliklonal antikoru mikrotitre plaka kuyucuklari üzerinde immobilize edilmistir. Gentamisin, antikora baglanma bakimindan biyotin-gentamisinle rekabet eder. Bagli biyotin-gentamisinin Haktari, enzimatik aktivitesi tetrametil benzidin (TMB) ile saptanan yaban turpu peroksidaz-streptavidin ile ölçülür. Numuneler, numune kalifikasyonu esnasinda.belirlenen kabul edilebilir seyreltiye göre ELISA analizi seyrelticisi ile seyreltilir. Gentamisin, bir mikrotitre plaka okuyucuda 450 nm'de absorbansin okunmasiyla ölçülür. Bilgisayarda minimum 4-parametreli.bir egri oturtma.programi kullanilarak standart.egri olusturulmus ve numune konsantrasyonu otomatik olarak hesaplanir. Tipik olarak, gentamisin analizinde standart egri için raporlama araligi 0,58 ng/mL ila 90 ng/mL'dir. Her numune için 2-4 seyrelti analiz edilmis ve degerlerin ortalamasi alinmistir. Gentamisin degerleri protein konsantrasyonu ile bölünmüs ve sonuçlar ppm (ng gentamisin/mg protein) biriminde rapor edilmistir. Polietilenimin Miktar Ölçümü Tüniveriler, 5mm gradyan donanimli TCI kriyoprobun ve otomatik bir numuneleyici ile donatilmis bir Bruker 600 MHz spektrometre üzerinde kaydedilmistir. Veriler, çözeltideki proteinden rezonans sinyallerini en aza indirmek için tasarlanmis bir spin-eko darbe sekansi kullanilarak elde edilmistir. Bir presatürasyon darbe sekansi ile birlestirilmis bir uyarim olusturma darbe sekansi, çözeltideki sudan rezonans sinyalini en aza indirecek sekilde tasarlanmistir. NMR ölçümünden önce tüm numunelere %lO'luk ( bir nihai konsantrasyona kadar D20 ilave edilmistir. Nicel NMR.analizi, genel bir analitik yöntemdir ve son derece fazla sayidaki organik moleküle uygulanabilmektedir. Genel olarak, her molekül, karakteristik rezonans frekanslari, nispi pik yogunluklari, çizgi genislikleri ve birlestirme paternlerine sahip benzersiz bir NMR sinyalleri kümesine sahiptir. NMR analizinin küçük, proton içeren bir molekülün konsantrasyonunu belirlemek için uygun olmasina yönelik tek kriter, analitin NMR sinyalinin ve tampon bilesenlerin örtüsmemesidir. NMR analizi, genis bir analit konsantrasyonlari araligina (örnegin propilen glikol için 1 ug/mL ila 154,500 ug/mL) göre dogru ve kesindir. Kromatografi Membranlari Test edilen membranlar MustangTM S (Pall Corporation, East Hills, New'York) ve'Natrix S UNatrix Separations, Burlington, Kanada) idi. Mustang'TM S ve Natrix S, pozitif yüklü, proteinleri ve viral parçaciklari etkin bir sekilde baglayan güçlü katyon degisim membranlaridir. MustangTM S, 0,8 um'lik gözeneklere sahip polietersülfondan (PES) yapilir ve bir sülfonik asit formu ile modifiye edilir. Natrix S membrani, esnek bir gözenekli destek matrisi içinde olusturulan polimerik bir hidrojelden olusur. Destek matrisi mekanik güç saglarken hidrojel özellikleri ürünün ayirma kimyasini belirler. Baglama kapasitesini arttirmak için üretici her bir cihaz ile birden fazla membran katmanini birlestirebilmektedir. Toplam katman sayisi ve kalinlik, üreticiye ve imal edilen cihazin boyutuna bagli olarak degisir. Membran hacmi (MV), membranin (katilarin ve bosluklarin) fiziksel hacmidir ve mL birimlerinde ölçülür. Bu çalismada çoklu ölçekleri temsil eden Çesitli membran cihazlari kullanilmistir. Tablo 2'de test edilen her bir membranin ilgili özellikleri listelenmistir. Tablo 2: Güçlü katyon degisim membrani özellikleri. 4 Gözenek Katmanlar Membran Hacmi (MV) Membran Üretici Cihaz Part No. boyutu Mustang" Q Corporation Coin MSTGlBQ16 16 0,35 0,8 mm Siringa Natrix NXlOOl 1 0,23 UD Natrix S Separations, nc. NXllOl 1 0,75 UD Kromatografi Reçineleri Test edilen reçineler Fractogel SE Hicap (EMD Chemicals Inc., Gibbstown, New Jersey) ve SP Sefaroz Hizli Akis (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, New Jersey) idi. Fractogel SE Hicap ve SP Sefaroz Hizli Akis reçineleri güçlü katyon degisim reçineleridir. Fractogel SE Hicap reçinesi, yaklasik 800 Ã'lik gözenek boyutuna sahip 40 - 90 um çapindaki çapraz bagli polimetakrilat parçaciklarindan yapilmistir. Fonksiyonel ligant, uzun, dogrusal bir polimer zinciri ile parçaciga kovalent olarak ilave edilir. SP Sefaroz Hizli Akis reçinesi, ~4,000,000 Da'lik bir dislama sinirina sahip 45 - 165 um çapindaki yüksek çapraz bagli agaroz parçaciklarindan olusur. Sefaroz Hizli Akis, fonksiyonel grup olarak bir sülfopropil ligant ile Sefaroz'un çapraz bagli bir türevidir. Çapraz baglama yöntemi üreticiye aittir. Membran ve Reçine Saflastirma Sistemleri Küçük ölçekli testler, entegre bir ölçüm pompasi, basinç sensörü ve in-line pH, iletkenlik ve UV sensörü içeren programlanabilir bir islem saflastirma sistemi olan AKTA ExplorerTM 100 (GE Healthcare, Fairfield, Connecticut) ile gerçeklestirilmistir. Explorer sistemi, UNICORNTM v5.10 yazilimi (GE Healthcare, Fairfield, Connecticut) çalistiran bir bilgisayar araciligiyla programlanmis ve kontrol edilmistir. Küçük ölçekli testler ayrica bir Masterflex® L/S® dijital ekonomi tahrik peristaltik pompasi (Cole Parmer, Vernon Hills, Illinois), in-line DTXTM Plus TNF-R basinç sensörü (Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey) ve bir AND EK-lZOOi dengesinden (A&D Company, Ltd., Tokyo, Japonya) olusan manuel bir sistem kullanilarak gerçeklestirilmistir. Denge, kütle birikimini ölçerek pompanin akis hizini fiziksel olarak izlemek için kullanilmistir. Kütle, 1,0 g/mL'lik bir besleme akisi yogunlugu varsayilarak hacme dönüstürülmüstür. basinç ve kütle toplamasina yönelik TrendlinkTM versiyon 3. ve RsCom versiyon yazilimini çalistiran bir bilgisayara baglanmis bir NetDAQTM 264OA/41A. ag veri toplama sistemi (Fluke, Everett, Washington) kullanilarak sürekli olarak izlenmistir. Membran Sürekli Akis Numunesi Toplama Teknikleri Sürekli akis numuneleri üç farkli sekilde toplanmistir. Yakalama numuneleri ve fraksiyonlar en yaygin olaniydi. Bir yakalama numunesi, belirli bir verimde alinan küçük.bir anlik sürekli akis miktaridir. Fraksiyonlar, daha büyük sürekli akis numuneleridir ve verim araliklari ile tanimlanmistir. Sürekl akis tek bir büyük havuz olarak toplanmistir. Havuz analizi etkili olmakla birlikte, yakalama numuneleri ve fraksiyonlar, mAb ve safsizlik seviyelerini izlemek için genellikle daha kullanislidir çünkü ardisik.numuneler egilimleri göstermek için birlestirilebilmektedir. Dinamik Baglanma Kapasitesi (DBC) Teknikleri Membranlarin ve reçinelerin dinamik baglama kapasiteleri (DBC), tipik bir islem akis hizinda besleme akisinin ortam üzerine yüklenmesiyle belirlenmistir. Ortamin, statik bir baglama kapasitesini belirlemek için tipik olarak yapildigi gibi yükleme besleme akisinda islanmasina izin vermek yerine bu tercih edilmistir. Bu uygulama için DBC, ortamin performansinin daha uygun bir ölçütüdür. DBC, yükleme fazi esnasinda sürekli akis yakalama numuneleri veya fraksiyonlari ile belirlenmistir. Yakalama numuneleri veya tüm. fraksiyonlarin hacmine yönelik spesifik verim ve polipeptit ya da tüm yakalama numuneleri veya fraksiyonlara yönelik safsizlik konsantrasyonu kullanilarak bir DBC grafiginin olusturulmasi saglanmistir. Ayrica, yükleme materyalindeki polipeptit veya safsizlik konsantrasyonlarinin bilinmesi durumunda, filtrat konsantrasyonlari ile (C) yükleme konsantrasyonunu (Co) karsilastirmak için bir grafik olusturulabilir. Bu durumda, O'in bir C/Co degeri, filtrat konsantrasyonunun yükleme konsantrasyonundan çok daha düsük oldugunu gösterirken l'in bir C/Co degeri, filtrat konsantrasyonunun yükleme konsantrasyonuna benzer oldugunu gösterir. Deneysel Besleme stogu soguk depodan çikarilmis (2-8°C veya S -70°C) ve oda sicakligina dengelenmeye birakilmistir. Daha sonra, istege göre, uygun titrasyon ajani (baska bir ifadeyle 1,5 M tris baz veya 1 M sitrik asit) veya seyreltici (saflastirilmis su veya 5 M sodyum klorür) kullanilarak Tablo 1'de gösterilen kosullardan pH ve/veya iletkenlik ayarlanmistir. Daha sonra, soguk depolama veya kosullandirma esnasinda olusmus olabilecek herhangi bir çökeltiyi uzaklastirmak üzere bir AcroPakn'ZO (Pall Corporation, East Hills, New York), AcroPakTM lOOO (Pall Corporation, East Hills, New York) veya 1000 mL'lik vakum filtresi (Thermo Fisher Scientific, Rochester, New York) kullanilarak offline sekilde filtre edilmistir. Saflastirma sistemi, saflastirilmis su veya uygun tampon kullanilarak yüklemenin ve sürekli akis hatlarinin yikanmasi ile hazirlanmistir. Membran, besleme pompasinin ve basinç sensörünün asagi akisina in-line olarak yerlestirilmis ve daha sonra 50 - 500 MV'lik saf su veya dengeleme tamponu ile yikanmistir. Yikama isleminden sonra, besleme akisi membran üzerine yüklenmis ve degisken birIniktar ise 333-2667 MV/saatlik sabit bir akis hizinda yüklenmistir. Yükleme fazi esnasinda, gerekmesi halinde, sürekli akis numunelendirilmistir. Membran ürünü toplamak için istege bagli olarak tampon ile izlenmistir. Safsizliklarin membran üzerinde tutulmasini saglamak için izleme (yikama tamponu olarak da bilinir) tamponu genellikle pH'ta besleme ile benzerdir ve iletkenlikte esit veya daha düsüktür. Elde edilen membran yakalama numuneleri, fraksiyonlari veya havuzlari daha sonra polipeptit ve/veya safsizlik konsantrasyonlarini belirlemek için analiz edilmistir. Bazi durumlarda, elde edilen membran havuzlari daha sonra bir reçineye yüklenmistirx Reçine kromatografisi sadece bir Äkta Explorerkullanilarak gerçeklestirilmistir ve böylece UV, pH ve iletkenlik gerçek zamanli olarak egilim gösterebilmis ve in-line UV sensörü havuzlamayi kolaylastirabilmistir. Yükleme fazi esnasinda, gerekmesi halinde, sürekli akis numunelendirilmistir. Bazi durumlarda membran elüte edilmistir. Membran elüsyonu yalnizca Ãkta Explorer kullanilarak gerçeklestirilmis ve böylece in-line UV sensörü havuzlamayi kolaylastirabilmistir. Membran yüksek bir tuz tamponu (20 mM sodyuniasetat ve 350 mM sodyuniklorür, pH 5,5) kullanilarak elüte edilmistir. Ayrica, bazi durumlarda membran, 20 mL üzerinde %0 - lOO'den iki tamponlu bir gradyan (20 mM sodyuniasetatq O mM sodyuniklorür, pH 5,5 ve 20 mM sodyuniasetat, ile elüte edilmistir. Bazi durumlarda reçine elüte edilmistir. Reçine elüsyonu yalnizca Äkta Explorer kullanilarak gerçeklestirilmis ve böylece in-line UV' sensörü havuzlamayi kolaylastirabilmistir. Reçineler, 200 cm/saatlilçbir sabit akis hizindaki yüksek bir tuz tamponu (50 ila veya yüksek bir tuz asamasi (50 mM HEPES, kullanilarak elüte edilmis ve, sirasiyla, Fractogel SE Hicap ve havuzlanmistir. Bulgular Küçük Ölçekli Katyon Degisim Membrani verimi pH 8,0 ve 5,0 mS/cm'deki mAbl anyon degisim havuzu ve 1M sitrik asit kullanilarak pH 5,5 ve 6,4 mS/cm'ye ayarlanmis mAb 1 anyon degisim havuzu, 667 MV/saatte bir MustangTM S membrani üzerinde islenmistir. Kullanilan Mustang"4s membrani 0,18 mL'lik.Acrodisc® Cihaziydi . pH 5, 5 ve pH 8, O'deki mAb l besleme akislarinin her ikisi de antikorun pl'sinin altindaydi ve bu nedenle pozitif yüklüydü. Besleme ve sürekli akis yakalama numuneleri, antikor konsantrasyonu için analiz edilmistir. Ilk numuneler, membrana bazi antikor baglanmasi göstermesine ragmen, Sekil 3 verimin, her iki pH kosulunda benzer oldugunu, lOOO g/L'lik yükleme yogunlugunun altinda hizla arttigini ve yaklasik 5000 g/L'lik bir yükleme yogunlugundan sonra 2 %96'ya ulasilabilir oldugunu gösterir. Küçük Ölçekli Anyon Degisim Membrani verimi Karsilastirma amaciyla mAbZ, 7,7 izoelektrik noktasinin üzerinde bir anyon degisim membrani kullanilarak test için seçilmistir. Proteinler yüksek pH'ta deamidasyon ve agregasyona yatkindir, bu yüzden mAb l üzerinde benzer testler yapilmamistir. pH 5,5 ve 9 mS/cm'deki katyon degisim havuzu, 1,5 M tris bazi kullanilarak pH 8,0'a ayarlanmistir. Besleme stogu daha sonra üç ayri havuza bölünmüs ve saflastirilmis su kullanilarak iletkenlik ayarlanmistir. Ilk havuz 10 mS/cm idi, ikinci ve üçüncü havuzlar sirasiyla 7 mS/cm ve 4 mS/cm'ye ayarlanmistir. Her üç havuz da pH 8,0'da tutulmustur. Her bir besleme akisi daha sonra 6OOIMV/saat1ik sabit akis hizinda küçük ölçekli bir 0,35 mL MustangTM Q üzerinde islenmistir. pH 8,0'daki mAb3, pI'nin 0,3 pH birim üzerindeydi ve bu nedenle antikor negatif yüklüydü. Yükleme ve sürekli akis havuzlari, antikor konsantrasyonu için analiz edilmistir. Sekil 4, verimin, her üç pH kosulunda benzer oldugunu, 200 g/L'lik yükleme yogunlugunun altinda hizla arttigini ve yaklasik 1000 g/L'lik bir yükleme yogunlugundan sonra 2 %96 oldugunu gösterir. Küçük Ölçekli Katyon Degisim Membrani Safsizlik Kleransi Katyon degisinimembrani safsizlik kleransini degerlendirmek için, pH 5,5 ve 3,2 mS/cm'deki mAb 3 Protein A havuzu, 1333 MV/saatlik sabit bir akis hizinda küçük ölçekli.bir 0,18nüiMustangmESmembrani üzerinde islenmistir. mAb3 yüklemesi hesaplanan pl'nin 3,4 birim altindaydi ve bu nedenle antikor` pozitif yüklüydü. Yükleme, sürekli akis fraksiyonlari ve elüsyon numuneleri analiz edilmis ve CHOP sonuçlari Sekil 5'te gösterilmistir. Veriler, MustangTM S'nin baslangiçta CHOP'yi 438'den 109 ppm'ye düsürdügünü gösterir. Yükleme yogunlugu 55,300 g/L'ye yaklastikça CHOP 318 ppm'ye çikmistir. Membran yüksek tuz içeren bir çözelti kullanilarak elüte edilmistir. Tuz iyonlari, yükleri korumak ve böylece elektrostatik etkilesimleri bozmak ve proteinlerin membran yüzeyinden desorbe edilmesine ve hareketli faza serbestçe hareket etmesine neden olmak için kullanilir. Elüsyon havuzunun analizi, CHOP'un elektrostatik kuvvetler nedeniyle membrana baglandigini dogrulayan safsizliklarin zenginlestigini gösterir. Adsorber performansini daha da degerlendirmek için, pH 5,5 ve 6,0 mS/cm'deki mAb 3 anyon degisim havuzu, 667 MV/saatlik sabit bir akis hizinda küçük ölçekli bir 0,18 m1.Mustang""S membrani üzerinde islenmistir. mAb3 pH'i, pI'nin 3,4 pH birim üzerindeydi ve bu nedenle antikor pozitif yüklüydü. Yakalama ve sürekli akis yakalama.numuneleri_mAb, CHOEve gentamisin konsantrasyonlari için analiz edilmistir. Besleme ve yakalama numune konsantrasyonlarini karsilastirmak için bir Hßmbran yükleme yogunlugu fonksiyonu olarak bir C/Co grafigi (yakalama numunesi / yükleme) olusturulmustur. Sekil 6'da gösterildigi gibi, mAb C/Codegerleri 2 ila 16 kg/L'lik yükleme yogunluklari arasinda 1,0'a yakindir, bu da yakalama.numune konsantrasyonlarinin.yükleme konsantrasyonu ile neredeyse özdes oldugunu ve verimin bir kez daha yüksek olacagini düsündürür. Buna karsilik, CHOP ve gentamisin C/Co degerleri düsüktür, 2 ila 16 kg/L'lik yükleme yogunluklari arasinda 5 0,2'dedir, bu da yakalama numune konsantrasyonlarinin yükleme konsantrasyonundan çok daha düsük oldugunu ve MustangTM S'nin mAb ile asiri yüklenmesine ragmen söz konusu safsizliklarin çogunu uzaklastirdigini düsündürür. Küçük Ölçekli Katyon Degisim Membrani Baglama Seçiciligi Katyon degisim membranlarinin mAb'ye karsi belirli safsizliklari baglamada seçici olup olmadigini degerlendirmek için bir dizi deney tasarlanmis ve mAb 3 Protein A havuzu kullanilarak gerçeklestirilmistir. Bu havuz, yüksek molekül kütleli türler (HMWS), dimer, düsük molekül kütleli türler (LMWS), gentamisin ve CHOP dahil olmak üzere daha yüksek safsizlik seviyeleri nedeniyle seçilmistir. ProteinZXhavuzu1ü15,5xKe4,4 mS/cm'ye ayarlanmistir. Yükleme öncesinde, her bir'MustangWISinembrani.20 mM sodyuniasetat, pH 5,5 ve 1,3 mS/cm'lik tampon ile dengelenmistiru Her birinde 1333 deney gerçeklestirilmistir. Yükleme isleminden sonra, membranlar 20n$îsodyuniasetat, pH 5,5 ve 1,3InS/cm'lik tampon ile yikanmistir. Yikama isleminden sonra, membrani elüte etmek için yikama tamponu ve 20 mM sodyum asetat, ZM sodyum klorür, pH 5,1 ve ~500 mS/cm kullanilarak bir gradyan elüsyonu kullanilmistir. Gradyan, 20 mL üzerinde olusturulmus ve analiz edilecek her 2 nm'de elüsyon fraksiyonlari alinmistir. Dört deney için, elüsyon fraksiyonlari tüm safsizliklar ve mAb konsantrasyonlari için analiz edilmistir. Belirli herhangi bir yükleme yogunlugu deneyinde, fraksiyonlar, bir safsizligin veya mAb'nin membrandan ne zaman elüte edildigini belirmek için daha önceki elüsyon türlerinden daha siki baglanmis sonraki elüsyon türleri ile karsilastirilabilir. Sekil 7, 5000 g/L'lik yükleme yogunlugu, deneyi için 10 fraksiyon elüsyonu boyunca analiz edilen çesitli türlerin % normalize edilmis konsantrasyonlarini gösterir. Her bir pikin konumu, mAb monomerinin, en önce elüte edildigi için membrana en zayifini baglandigini gösterir. Baglama kuvvetinin artan sirasinda, monomer, HMWS, Dimer, CHOP, LMWS ve gentamisin tarafindan takip edilir. Pek çok tür gradyanda.benzer bir pozisyonda elüte olmasina ragmen, bu grafik gentamisinin rakip türlerden daha güçlü bir sekilde baglandigini açikça gösterir. Ayrica, her bir yükleme yogunlugu için, kolona baglanan her bir safsizlik veya mAb'nin toplam kütlesi hesaplanabilir ve çesitli yükleme yogunlugu deneylerinde karsilastirilabilir. Sekil 8, artan bir membran yükleme yogunlugu fonksiyonu olarak her türün artmakta mi yoksa azalmakta mi oldugunu gösterir. Daha önce en zayifini bagladigi gösterilen mAb monomeri, yükleme yogunlugu arttikça azalan kütle seviyelerine sahiptir. Buna karsilik, yükleme yogunlugu.arttikça kütledeki dimer, HMWS, CHOP, gentamisin ve LMWS artar. Bu, önceki baglama kuvveti sonuçlarini onaylar ve mAb monomerinin, sürekli olarak membrana baglanan diger türlere bagli olarak azaldigini gösterir. Küçük Ölçekli Katyon Degisim Membrani Yer Degistirmesi Gentamisin.gibi güçliibir baglama türünürimAbinonomerini elüte edip edemeyecegini belirlemek için, baglama seçiciligi sonuçlarini açiklamaya yönelik bir hipotez olarak, mAb 3 Protein A havuzu kullanilarak bir deney gerçeklestirilmistir. Protein A havuzu pH ,5 ve 4,2 mS/cm'ye ayarlanmistir. Deney, 0,18 mL'lik MustangTM S membraninin 20 mM sodyuni asetat, pH 5,4 ile dengelenmesiyle gerçeklestirilmistir. mAb l Protein A havuzu, UV egilimi açikça mAb hamlesini gösterene kadar yüklenmistir. Membran daha sonra dengeleme tamponundan olusan bir elüsyon tamponu öncesinde dengeleme tamponu ile yikanmis ve membrani elüte etmek için 2 g/L gentamisin kullanilmistir. Dengeleme tamponu ve elüsyon tamponunun, mAb'nin membrana baglanmasi üzerindeki herhangi bir etkiyi önlemek için ayni pH ve iletkenlige sahip olmasina dikkat edilmelidir. Sekil 9, yükleme, yikama ve elüsyon fazlari esnasinda UV, pH ve iletkenlik egilimlerini içeren kromatogrami gösterir. Kromatogram, yikama fazinin, elüsyon fazi baslatilmadan önce UV trendini referans degerine geri döndürmede yeterli oldugunu gösterir. Ayrica, elüsyon fazi esnasinda, pH veya iletkenlik egilimlerinde önemli bir degisiklik olmaksizin. büyük bir UV pikinin gözlemlendigini gösterir. Bu, gentamisinin, bagli mAb monomerin bir katyon degisim membranindan etkili bir sekilde yer degistirebildigini gösterir. CEX Membranlari Gentamisin Baglanma Karsilastirmasi Gentamisinin CEX membran baglama kapasitesini belirlemek için, deneyler, 0,18 mL MustangTM S membraninin test edilmesiyle gerçeklestirilmis ve pH 7.2'deki 0,23 mL Natrix S. A PBS tamponu, 2,0NIasetik.asit ve PW ile 5.00'lik bir nihai pH'a ve 8,10 mS/cm'lik iletkenlige ayarlanmistiru Ayarlanmis tampon daha sonra.mAb3 UF/DF havuzu ve gentamisin ile yaklasik 1,0 mg/mL ve 40,000 ng/mL'lik nihai konsantrasyonlara aniden yükselmistir. Elde edilen aniden yükselmis çözelti, yükleme besleme akisi olarak kullanilmistir. Deneyleri gerçeklestirmek için her iki membran da PW ile yikanmis, ayarlanmis tampon ile dengelenmis, aniden yükselmis çözelti ile yüklenmis ve ayarlanmis tampon ile yikanmistir. Yükleme fazi akis yakalama numuneleri toplanmistir. Natrix S için, 10 mL'de 4 mL'lik bir sürekli akis yakalama numunesi toplanmis ve daha sonra toplam 19 numune için her 60 mL toplanmistir. Tüm numuneler daha sonrainAb\Kagentamisin konsantrasyonu için analiz edilmis ve Sekil lO'da.gösterilen sekildeinembran yükleme yogunluguna.karsi.bir`C/Co grafigi olusturmak üzere yükleme konsantrasyonlari ile karsilastirilmistir. Grafikte yer almamasina ragmen, mAb konsantrasyonu, l,O'lik bir C/Cb degerine ulasiry bu da asamanin sürekli akis halindeki antikor için yüksek verimli olacagini düsündürür. Gentamisin C/Co degerleri, buna karsilik, daha sonra 1,0'a ulasir, bu da her iki membranin da önemli seviyelerde baglandigini düsündürür. MustangTM S, 4,4 ve 8,9 g/Lm arasinda bir gentamisin baglama kapasitesine sahip iken Natrix:3daha.yüksekküiîgentamisiribaglama.kapasitesine sahip idi ve daha yavas bir atilim göstermistir. 50 g/L'de, C/Co degeri 0,3 idi ve atilim egrisi yaklasik 125 g/Lm'ye ve yaklasik O,8'lik13ir(3/Codegerine kadar dogrusaldi. 125 g/Lm'den sonra hamle egrisi, membranin, muhtemelen küçük mAb seviyelerini yer degistirirken hala gentamisin baglayabildigini düsündürecek sekilde düzlesir. Bu sonuçlar farkli CEX membranlarinin farkli gentamisin baglama kapasitelerine ve hamle egrilerine sahip oldugunu gösterir. Daha yüksek baglanma kapasitesi ve dereceli hamleye sahip Natrix S, gentamisini uzaklastirmak. için daha etkili bir membran olusturacaktir. Ayrica, daha yüksek gentamisin seviyelerini baglayarak, daha yüksek bir verim operasyonuna neden olacak sekilde daha fazla mAb'nin yer degistirmesi beklenir. CEX Reçineleri ve Güçlü Baglanma Aminoglikozit Antibiyotiklerinin Etkileri Gentamisin gibi güçlü bir baglanma safsizliginin, CEX reçinesinin dolu bir kolonu üzerinde ne gibi bir etkiye sahip olabilecegini belirlemek için, henimodel besleme akislarini henide gerçek besleme akislarini test etmek için, kolonu koruyan bir CEX membrani ile veya olmaksizin bir dizi deney tasarlanmistir. Sekil 11, çesitli deneyleri, antikoru ve safsizlik konsantrasyonlarini ve bu deneyleri gerçeklestirmek için gerekli olan asamalari gösterir. Birincisi, mAb 3 UF/DF havuzu ve degisen seviyelerde gentamisin ile aniden yükselmis bir PBS model besleme akisi kullanilarak, bir Fractogel SE Hicap reçinesi, hamle egrileri üreterek antikor baglama kapasitesi için test.edilmistiru PBS ilk asit ile pH 5,0'a ayarlanmis ve daha sonra PW ile 8,0 mS/cm'lik bir iletkenlige ayarlanmistir. UF/DF havuzu, yaklasik 1,6 mg/mL'lik bir mAb konsantrasyonuna ayarlanmis tampon içine eklenmistir. Gerçeklestirilen her bir kromatografi deneyi için, Fractogel SE Hicap, istenen besleme akisi ile yüklenme öncesinde ilk olarak pH 'de 25 mM sodyum asetat ile dengelenmistir. Yükleme isleminden sonra, kolon, pH 5,5'te 50 mM sodyum asetat ile yikanmis, pH 7,7'de mM HEPES ile yikanmis, pH 5,5'te 50 mM sodyum asetat ile yikanmis, pH 5,5'te 350 mM sodyuni asetat kullanilarak elüte edilmis, 1 M NaCl ve 0,5N NaOH ile yeniden üretilmis ve daha sonra kolonun bir sonraki kullanimina kadar 0,1 N NaOH içinde saklanmistir. Gentamisin eklemeksizin, birinci deney gerçeklestirilmis ve 108 g/L'lik bir antikor DBC'si göstermistir. Daha sonra, yukaridaki ayarlama ve ekleme, gentamisinin nihai bir 24,100 mg/mL'lik konsantrasyona ilave edilmesi ile gerçeklestirilmistir. Bu deney, 89 g/L'lik azalan bir antikor DBC'sini göstermistir. Bu durum ,500'lük bir gentamisin konsantrasyonu ile tekrarlanmis ve 88 g/L'lik antikor DBC'si hesaplanmistir. Bu veriler, bir PBS model sistemi, saflastirilmis antikor ve degisen gentamisin seviyeleri kullanilarak, gentamisin varliginin, 108 mg/mL'den yaklasik 88 g/L'ye kadar Fractogel SE Hicap reçinesi üzerindeki antikor gentamisin ve 408,000 ng/HEJCHOP içeren hasat edilmis hücre kültürü sivisi (HCCF) kullanilarak iki deney gerçeklestirilmistir. Model besleme akisi ile uyumlu gentamisin seviyelerinde HCCF kullanilmasi, 68 ve 71 g/L'lik antikor DBC'lerine neden olmustur. HCCF kullanilarak 88 ve 89 g/L model besleme akisi DBC'leri ve 68 ve 71 g/L DBC'ler arasindaki farka dair olasi bir açiklama, besleme akisinda yüksek düzeyde CHOP bulunmasidir. Sekil 12, besleme akisi safsizlik seviyelerinin yani sira yukarida belirtilen deneylerden elde edilen tüm antikor atilim egrilerini ve yaklasik DBC'leri gösterir. Çalismalar ayrica, kolonun ya da gentamisin aktariminin çalismalar arasindaki muhtemel bozulmasini önlemek için rastgele bir sirada gerçeklestirilmistir. Deneylerin sirasi, Sekil 12'ye ekli tabloda listelenmistir. Deney sirasi ile antikor DBC'si arasinda bir korelasyon yoktu, bu nedenle kolonun bozulmasi ya da gentamisin aktariminin sonraki islemleri etkilemesi imkan dahilinde degildi. Son olarak, besleme akisinda gentamisin varliginin kolon DBC'lerinde önemli bir azalma gösterdigini ve CEX membranlarinin önemli seviyedeki antikoru baglamadan gentamisin baglama yetenegine sahip oldugunu bilerek, bir CEX membraninin bir CEX reçinesi üzerindeki performansi korudugunu mu yoksa arttirdigini mi test etmek için iki deney gerçeklestirilmistir. Natrix S, MustangTM S'ye göre daha yüksek gentamisin baglama kapasitesi gösterdiginden, Fractogel SE Hicap'i korumak için kullanilmistir. 2L HCCF çözülmüs, ZM asetik asit ile pH 5'e ayarlanmis, PW ile 8 mS/cm'ye ayarlanmis ve besleme akisinin donmasindan ve çözülmesinden kaynakli herhangi bir etkiyi yok etmek için off-line sekilde steril filtre edilmistir. Bu ayarlanmis ve filtre edilmis besleme akisindan, yükleme, diger parça 0,75 mL'lik bir Natrix S ile islenirken kolona yüklenmis bir parçaya ayrilmis ve daha sonra Fractogel.SE Hicap›üzerine yüklenmistiru Her iki kolon yükleme fazi için, her biri yaklasik 60 numune için olan 15 mL'lik fraksiyonlar alinmistir. Ayarlanmis HCCF, Natrix sürekli akisi ve Fractogel SE Hicap fraksiyonlari, antikor ve gentamisin konsantrasyonlari için analiz edilmistir. Elde edilen Fractogel SE Hicap hamle egrilerinin yani sira elde edilen HCCF ve Natrix sürekli akis besleme akisi antikoru ve safsizlik konsantrasyonlari da Sekil 13'te gösterilmistir. Elde edilen veriler, Natrix'in ayarlanmis HCCF'deki gentamisin düzeylerini 24,100 ng/mL'den 870 ng/mL'ye basarili sekilde düsürdügünü gösterir. CHOP seviyeleri, 408,000 ng/mL'den 328,000 ng/mL'ye hafif bir sekilde düsürülmüstür. Antikor konsantrasyonu, yaklasik %94'1ük bir verimi temsil eden, 0,88 mg/mL'lik ayarlanmis HCCF konsantrasyonuna kiyasla 0,83 mg/mL'de biraz daha düsük olmustur. Son olarak, elde edilen CEX kolon hamle egrileri, kolonunun ayarlanmis HCCF kullanarak 72 g/L'lik bir antikora ve Natrix sürekli akisini kullanarak 94 g/L'lik bir antikor DBC'sine sahip oldugu gösterilmistir. Bu, CEX kolonuna.yük1enmeden önce besleme akisi içeren bir gentamisini bir CEX membranindan geçirilmesiyle DBC'deki yaklasik %30'luk bir artisi temsil eder. CEX Membrani ECP ve PEI Hamlesi Benzer performansin ECP'ler veya PEI gibi diger safsizliklarla birlikte bir CEX membrani kullanilarak gözlemlenip gözlemlenemeyecegini test etmek için, Tek Degerli Antikor l Protein A havuzu ve 0,23 mL'lik Natrix S membrani kullanilarak bir deney gerçeklestirilmistir. Kullanilan Protein A havuzu daha önce 1,5M TRIS baz kullanilarak pH 6,7'ye ayarlanmis ve PW kullanilarak 2,5 mS/cm'lik bir iletkenlige seyreltilmistir. 4.7 g/L, 130 ug/mL PEI ve 8,870 ng/mL ECP'lik.bir antikor konsantrasyonuna sahip olan yukleme, dengelenmis bir Natrix S'ye yüklenmis ve 10 numune için 2 mL'lik sürekli akis fraksiyonlari ve ardindan 12 numune için 5 mL'lik fraksiyonlar alinmistir. Sürekli akis fraksiyonlari daha sonra membranin antikor yükleme yogunluguna karsi bir C/Coüretmek için kullanilan antikor, PEI ve ECP konsantrasyonu için analiz edilmistir. Sekil 14, hem antikor hem de ECP'lerin CEX membrani hamlesini yaklasik 123 mg/mL'de yaptigini gösterir. PEI ölçüm miktarinin 30 ug/mL olmasi nedeniyle ilk birkaç numune bu seviyede veya bunun altindaydi ve Sekil 14 bu numunelerde hangi PEI konsantrasyonunun oldugu bilinmedigi için O,23'lük:bir C/Ch degeri gösterir. PEI seviyelerini 0,23'te göz ardi ederek, PEI'nin hem antikor henide ECP'lerden.çok görülüru Bu sonuçlar, CEXinembranlarinin, antikor verimini olumsuz olarak etkilemeden iyonik polimerlerin uzaklastirilmasinda da etkili oldugunu gösterir. CEX Reçineleri ve Güçlü Baglanma iyonik Polimerlerinin Etkileri PEI gibi güçlü bir baglanma safsizliginin, CEX reçinesinin dolu bir kolonu üzerinde ne gibi bir etkiye sahip olabilecegini belirlemek için, Polipeptit 1'in ekstraksiyonu esnasinda kullanilan PEI seviyelerini ve bunlarin SP Sefaroz Hizli Akis kolonu üzerindeki etkisini degerlendiren bir dizi deney tasarlanmistir. Besleme akisi.bu ürün için daha az saf oldugu için, kolona giden PEI seviyelerini belirlemek mümkün olmamistir, bunun yerine ekstraksiyon sirasinda kullanilan PEI seviyeleri kaydedilmistir. Bu deneyler için, ekstrakte edilen ürün, %O,75 ila %l,05 arasinda degisen çesitli seviyelerle kosullandirilmis, PW ile seyreltilmis ve 4 sentrat numunelerini üretmek için santrifüje edilmistir. Yaklasik olarak pH 7,0 ve 8,0 mS/cm'deki her bir sentrat numunesi daha sonra toplanan ve polipeptit konsantrasyonu için analiz edilen sürekli akis numuneleri ile SP Sefaroz Hizli Akis kolonuna yüklenmistir. Elde edilen veriler bir reçine polipeptit yükleme yogunlugu fonksiyonu olarak bir C/Co grafigi üretmek için kullanilmistir. Sekil 15, test edilen her bir sentrat için hamle egrilerini ve kolonun karsilik gelen DBC'sini gösterir. Tabloda gösterilen sekilde, ekstraksiyon islemi esnasinda % PEI arttikça, kolonun DBC'si azalir. Ayrica, Polipeptit l'in kullanildigi ikinci bir deney seti üzerinde, degiseri% PEI sentratlari, SP Sefaroz Hizli Akis kolonuna yüklenmis, daha sonra her deney için kolonla birlikte yikanmis ve elüte edilmistir. Her deneyden elde edilen havuzlar daha sonra polipeptit konsantrasyonu, ECP'ler ve boyut dislama kromatografisi ile ürün boyutu için analiz edilmistir. Sekil 16, ekstraksiyon esnasinda artan % PEI seviyeleri kullanilarak olusturulan havuzlarin, asama veriminde azalmaya ve havuzun ECP'ler, ürün agregatlari veya dimerler gibi safsizlik seviyelerinin artmasina neden oldugunu gösterir. Deneyler, bu CEX kolonu Öncesinde bir CEX membrani kullanilarak yapilmadigi halde, PEI'nin önceki deneylerden Natrix 8 tarafindan baglanabildigini ve CEX kolonunun performansinin %PEI'nin bir fonksiyonu olarak:görülebildigini.bilerek,knibeslene akisindaloir CEX membraninin kullanilmasinin yalnizca kolonun baglama kapasitesini degil ayni zamanda elde edilen havuzu fa gelistirdigi varsayilabilir. Iyon.degisinimembranlarinin, pH'daki.ve protein baglanmasina.neden olan iletkenlik kosullarindaki safsizliklari gidermede etkili oldugu gösterilmistir. Asiri yükleme kromatografisi ile çalistirilmasiyla ve safsizliklar ile ilgili protein arasindaki rekabetçi adsorpsiyonun tesvik edilmesiyle, verimlerin, lOOO - 5000 g/Lm'lik yükleme yogunluklari elde edilmesinin ardindan 2 %96 oldu gösterilmistir. Katyon degisim membranlarinin, 16,000 g/Lm'lik yükleme yogunluklarina C/Co degerleri < 0,2 ile, membran sürekli akis fraksiyonlarindaki CHOP ve gentamisin gibi safsizliklari bagladigi ve önemli ölçüde azalttigi gösterilmistir. Katyon degisini membranlarinin ayrica, yüksek molekül kütleli türler, dimer, düsük molekül kütleli türler, gentamisin ve CHOP içeren daha fazla ham besleme akislari kullanilarak antikora karsi belirli safsizliklari baglamasi için seçicilik sergiledikleri gösterilmistir. Bu çalismalarda, bu safsizliklarin degisen kuvvet ile baglandigi ve böylece artan membran yükleme yogunluklarinin, membrana bagli antikor azalirken, safsizliklara baglanmasinin devam.ettigi ve gentamisin gibi düsük molekül kütleli, çok yüklü türlerin rakip türlere göre çok daha kuvvetli bir sekilde baglandigi gösterilmistir. Ayrica, rekabetçi adsorpsiyon ve yer degistirme kromatografisinin, gentamisin içeren tampon kullanilarak bir katyon degisim membranindan antikorun elüte edilmesiyle gerçeklestigi dogrulanmistir. MustangTM S ve Natrix S gibi iki katyon degisim membraninin, sirasiyla 4.4-8.9 g/Lmve 50 baglanma kapasitesine sahip oldugu gösterilmistir. Natrix 8 için hamle egrisinin, MustangTM S'den daha kademeli oldugu gösterilmistir. Natrix S, geleneksel membranlardan daha yüksek baglama kapasitelerine sahip olacak sekilde tasarlanmistir ve bu özellik kademeli hamle ile birlikte, safsizliklari temizlemek için oldukça uygundur. Katyon degisim reçinelerinin, besleme akisindaki gentamisin konsantrasyonlari arttikça azalan DBC ile, gentamisin varliginda degisken dinamik baglanma kapasiteleri sergiledikleri gösterilmistir. Bir Fractogel SE Hicap kolonu, 0 ila 30,500 ng/mg gentamisin içeren bir model besleme akisi kullanilarak DBC'de 108 ila 88 g/L azalmistir. Temsili bir besleme akisi kullanilmasiyla Fractogel SE Hicap, 68-71 g/L'lik DBC'leri göstermistir. Bir katyon degisim membraninin yararliligi, bu besleme akisindaki gentamisin konsantrasyonlarini %94'lük bir verimle 24,100 ng/mg'den 870 ng/mg gentamisine azaltabildiginde dogrulanmistir. Azaltilmis gentamisin konsantrasyon besleme akisi, dogrudan karsilastirildigi zaman Fractogel SE Hicap'in 72 g/L'ye kiyasla 94 g/L'lik bir DBC'ye sahip olmasini saglamistir. Gentamisin gibi katyon degisim membranlarinin, tek degerli bir antikor ve ECP'lerin varliginda, PEI gibi yüksek oranda yüklü iyonik polimerleri bagladigi gösterilmistir. Son olarak, katyon degisim reçinelerinin yem akisinda degisken PEI konsantrasyonlari tarafindan negatif olarak etkilendigi gösterilmistir, bu da PEI konsantrasyonlari arttikça azalan dinamik baglanma kapasitesi ve artan havuz safsizliklarina neden olmustur. PE Sefaroz Hizli Akis kolonunun, PEI %O,75'ten %l,05 yukari akisa arttiginda 51 g/L'den 36 g/L'ye azaldigi görülmüstür. Ayri bir çalismada, asama verimi agregat %2,5'ten %17,3'e yükselmis ve %O,6'dan %1,1'e artan yukari akista kullanilan PEI konsantrasyonu olarak dimer %3,7'den %5,9'a artmistir. SP Sefaroz Hizli Akis kolonundan önceki bir katyon degisinimembraninin kullanilmasi test edilmemistir, ancak kolonun PEI tarafindan negatif bir sekilde etkilendiginin.ve bir membranin PEI'yi baglamada etkili oldugunun bilinmesiyle, düzgüriboyutlu bir membranin kolondaki PEI %'sini azaltmasi gerekir, böylece daha yüksek baglama kapasitelerine ve verimlerine yol açarken ayni zamanda havuz safsizlik konsantrasyonlarini da azaltir. Daha iyi saflastirma teknolojileri sürekli olarak ortaya çikmaktadir. Daha yüksek baglanma kapasitesi olan iyon degisim reçineleri gelistirilirken, Protein A afinite reçinesi alternatifi olarak kullanilmalari, azalan isletme maliyetlerinden kaynaklanir. Bununla birlikte, artan safsizlik seviyelerinin besleme akislarina veya tipik olarak asagi akis uygulamalarinda gözlemlenmeyen gentamisin veya PEI gibi safsizliklara maruz kaldiklarinda bunlarin gerçek etkinligi azaltilabilir. Bu tür bir iyon degisim reçinesi öncesinde bir iyon degisim membraninin kullanilmasi, kolona yüklenen safsizliklari azaltarak kolonu koruyabilmektedir. Bu, daha yüksek dinamik baglanma kapasiteleri, arttirilmis asama verimleri veya azaltilmis havuz safsizlik konsantrasyonlari gibi kolon için birkaç iyilestirmeye neden olabilmektedir. Yeterli safsizlik baglama kapasitesine, hacme ve geçirgenlige sahip uygun bir membranin seçilmesiyle, iki asama sürekli olarak çalistirilabilir, böylece çalisma süresi ve sonuçta saflastirma islemi maliyetleri daha da azaltilabilir. TR