CN108892706A - 使用离子交换膜层析改进下游蛋白质纯化步骤的方法 - Google Patents
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Abstract
提高用于纯化蛋白质的下游层析步骤的效率的方法,其包括:(a)在包含缓冲液的操作条件下,使包含目的多肽和多种污染物的组合物通过离子交换膜,其中所述多肽和膜具有相反的电荷,所述缓冲液具有足以与所述多肽的pI区分开来以增加所述多肽的电荷的pH和有效防止缓冲液离子屏蔽电荷的低离子强度,所述操作条件导致所述膜与所述多肽以及至少一种污染物结合;(b)过载所述离子交换膜,以使所述至少一种污染物仍与膜结合,而所述目的多肽主要在流出物中;(c)从所述离子交换膜收集包含所述目的多肽的流出物;(d)使包含所述目的多肽的膜流出物进行与前述膜带相似电荷的纯化步骤,和(e)从所述带电荷的离子交换层析纯化步骤的流出物中回收纯化的多肽。
Description
本申请是申请日为2012年12月18日的、发明名称为“使用离子交换膜层析改进下游蛋白质纯化步骤的方法”的中国专利申请201280070369.9(PCT/US2012/070373)的分案申请。
发明领域
本发明一般地涉及蛋白质纯化。特别地,本发明涉及通过使用上游离子交换膜层析改进下游纯化步骤的性能以除去杂质的方法。
发明背景
对于生物技术产业而言,蛋白质的大规模经济纯化是日益重要的问题。通常,使用真核或原核细胞系,通过细胞培养产生蛋白质,通过插入含该蛋白质的基因的重组质粒来改造所述真核或原核细胞系以产生目的蛋白。必须使用含糖、氨基酸和生长因子的复杂生长培养基培养这些细胞,所述生长因子通常由动物血清制备物提供。从培养细胞的化合物的混合物中以及从细胞自身的副产物中分离期望的蛋白质以达到足够用于人类治疗的纯度是一种艰难的挑战。
从细胞碎片中纯化蛋白质的方法最初取决于表达给定蛋白质的机制。一些蛋白质可从细胞中直接分泌到周围的生长培养基中;其他蛋白质则在细胞内产生。对于后一种蛋白质而言,纯化方法的第一个步骤涉及细胞的裂解,其可以通过多种方法完成,所述方法包括机械剪切、渗透压休克或者酶处理。此种破坏将细胞的全部内含物释放到匀浆中,并另外地产生了由于其体积小而难以除去的亚细胞片段。这些通常通过差速离心或者通过过滤除去。在蛋白质产生进行期间,由于细胞自然死亡而直接分泌的蛋白质以及释放的胞内宿主细胞蛋白质造成了相同的问题,尽管量较少。
一旦获得了含目的蛋白且没有大细胞碎片组分的澄清溶液,通常使用不同层析技术的组合,尝试将目的蛋白与通过细胞产生的剩余的其他蛋白质分离。这些技术基于蛋白质和其他杂质的电荷、疏水程度或大小来分离蛋白质和其他杂质的混合物。对于这些技术中的每一种,都可采用数种不同的层析树脂,其允许精确地制定所涉及的特定蛋白质的纯化方案。这些分离方法的本质是使蛋白质以不同的速率沿长的柱子向下移动,实现物理分离,该物理分离随着它们进一步通过柱子而不断加大,或者与分离介质选择性粘附,然后通过不同的溶剂或置换剂差异洗脱或者置换所述蛋白质。在一些实例中,当杂质特异地与柱子粘附,并且目的蛋白不与柱子粘附时,即目的蛋白存在于“流通液”中,目的蛋白即可与杂质分离开来。涉及蛋白质纯化的文献包括Fahrner等人,Biotechnol Genet Eng Rev.2001;18:301-27。
一般用于抗体的大规模纯化方法通常建立在作为初级捕获和纯化步骤的固定化A蛋白与其他柱操作组合的应用。A蛋白是来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的细胞壁蛋白,对IgG的Fc区具有亲和力。为此,将其广泛地用于IgG纯化。A蛋白柱操作通常实现了98%以上的产物相关纯度,其中在流通液级分中洗掉了大多数处理杂质(processimpurity)。然而,使用A蛋白层析存在很多缺点。首先,通常在中性至弱碱性pH进行结合,并且通常在酸性pH洗脱。一个潜在的问题是低pH可以变性或者部分变性IgG。为此以及由于临床应用需要的高产物纯度,还需要其他浓缩和纯化步骤来分离产物相关的异构体以及除去残留量的宿主细胞蛋白/DNA、细胞培养杂质、浸出的A蛋白和病毒。一个复杂的问题是这些杂质中的许多可以干扰用于分离纯化的抗体的下游处理操作装置的效率。另一主要问题是费用;A蛋白柱比常规离子交换柱贵得多。最后,当A蛋白层析不合适或者费用过高时,例如在纯化多肽、抗体样分子、抗体片段和/或纯化来自某些细胞系统的完全抗体的情况下存在许多方案。
本发明的特性处理了以上已鉴定的问题,并且在本发明的实施方案中展示了当前本领域在抗体、抗体片段和多肽纯化中使用A蛋白步骤的这一方法的备选纯化方法。
发明概述
在本文中,本发明涉及提高用于蛋白质纯化的下游层析步骤的效率的方法,其包括(a)在包含缓冲液的操作条件下,使包含目的多肽和多种污染物的组合物通过离子交换膜,其中多肽和膜具有相反的电荷,所述缓冲液具有足以与多肽的pI区分开来以增加所述多肽的电荷的pH和有效防止缓冲液离子屏蔽电荷的低离子强度,所述操作条件导致膜与多肽以及至少一种污染物结合,(b)从离子交换膜收集包含目的多肽的级分,(c)使包含多肽的组合物进行一个或多个另外的纯化步骤,和(d)从洗脱液中回收纯化的多肽。
在一个备选方案中,本发明涉及提高用于蛋白质纯化的下游层析步骤的效率的方法,其包括(a)在包含缓冲液的操作条件下,使包含目的多肽和多种污染物的组合物通过阳离子交换膜,其中多肽和膜具有相反的电荷,所述缓冲液具有低于多肽pI约1至约5个pH单位的pH和≤约40mS/cm的电导率,所述操作条件导致膜与多肽以及至少一种污染物结合,(b)收集来自离子交换膜的包含目的多肽的级分,(c)使包含多肽的组合物进行一个或多个另外的纯化步骤,和(d)从洗脱液中回收纯化的多肽。
在另一备选方案中,本发明涉及提高用于蛋白质纯化的下游层析步骤的效率的方法,其包括(a)在包含缓冲液的操作条件下,使包含目的多肽和多种污染物的组合物通过阴离子交换膜,其中多肽和膜具有相反的电荷,所述缓冲液具有高于多肽的pI约1至约5个pH单位的pH和≤约40mS/cm的电导率,所述操作条件导致膜与多肽以及至少一种污染物结合,(b)收集来自离子交换膜的包含目的多肽的级分,(c)使包含多肽的组合物进行一个或多个另外的纯化步骤,和(d)从洗脱液中回收纯化的多肽。
在一个方面,污染物是中国仓鼠卵巢蛋白(CHOP)。在另一方面,污染物是大肠杆菌蛋白(ECP)。在另一方面,污染物是庆大霉素。在另一方面,污染物是聚乙烯亚胺(PEI)。
在一个方面,多肽包含CH2/CH3区。在另一方面,多肽是抗体。又在另一方面,抗体是单克隆抗体。
在其他方面,该方法进一步包括在上述步骤a至b之前、期间或之后,将包含多肽的组合物进行一个或多个另外的纯化步骤,在一个备选方案中,该纯化步骤是Fc-结合的亲和层析(例如,A蛋白层析)以及在另一备选方案中的离子交换层析,其使用以结合/洗脱、流通或置换模式操作的柱子或膜。又在另一方面中,用单块过滤器(monolith filter)或者厚度过滤器替换离子交换膜。
另外,本发明通过将纯化的多肽与可药用载体组合,提供了药物组合物的制备。
附图简述
图1.在存在或不存在最初的A蛋白柱的情况下,通过使用保护CEX柱的CEX膜纯化抗体的示意图。
图2.使用保护CEX柱的CEX膜作为最初步骤纯化非抗体的示意图。
图3.在MustangTMS(小规模,0.18mL MV,667MV/小时),pH 5.5和6.4mS/cm以及pH8.0和5.0mS/cm时的mAb 1阴离子交换池的产率。
图4.在MustangTMS(小规模,0.35mL MV,600MV/小时),pH 8.0时的mAb 2阳离子交换池的产率。
图5.在MustangTMS(小规模,0.18mL MV,1333MV/小时),pH 5.5,3.2mS/cm时的mAb3A蛋白池的CHOP清除率。
图6.过载CEX膜后杂质的清除率。
图7.通过梯度洗脱测定的并且对每一级分中最高种类浓度归一化的多种种类的Mustang S结合强度。
图8.通过合计全部梯度洗脱级分质量计算的并在不同膜装载密度比较的,并且对最大质量归一化的多种种类的Mustang S总结合质量。
图9.用蛋白质装载Mustang S膜,用20mM乙酸缓冲液洗涤直到UV吸收达到基线,然后用20mM乙酸/庆大霉素缓冲液洗脱,以证明抗体被庆大霉素置换。
图10.描述在多种庆大霉素浓度,在使用或者不使用CEX膜的情况下,测定CEX柱(Fractogel SE Hicap)上抗体动态结合量(DBC)的方法的示意图。
图11.庆大霉素浓度对Fractogel SE Hicap抗体DBC的影响。
图12.在两种CEX膜(Mustang S和Natrix S)上比较庆大霉素DBC。
图13.用过载的Natrix S池,Fractogel SE Hicap抗体DBC显示出30%的DBC提高。
图14.由于使用了较少的PEI,在萃取(extraction)方法中使用的PEI%对SPSepharose Fast Flow(SPSFF)蛋白质DBC的影响显示出36至51g/L的改进。
图15.由于使用了更多的PEI,在萃取方法中使用的PEI%对SPSFF的影响显示出减少的步骤产率以及增加的池杂质。
图16.与在123mg/mL膜处穿透的蛋白质和ECP相比,蛋白质、ECP和PEI的Natrix SDBC显示PEI在330mg/mL膜处穿透。
优选实施方案的详述
定义:
在本文中,由术语“大约”开始的数值范围或量明确地包括精确的范围或精确的数值量。
在本文中,待纯化的“组合物”包含目的多肽和一种或多种污染物。组合物可以是“部分纯化的”(即,已经进行了一个或多个纯化步骤,例如A蛋白层析)或者可以直接获自产生多肽的宿主细胞或生物(例如,组合物可以包含已收获的细胞培养液)。
如本文中所用,“多肽”一般指具有多于10个氨基酸的肽和蛋白质。优选地,多肽是哺乳动物蛋白,实例包括肾素;生长激素,包括人生长激素和牛生长激素;生长激素释放因子;甲状旁腺激素;促甲状腺激素;脂蛋白;α-1-抗胰蛋白酶;胰岛素A链;胰岛素B链;胰岛素原;促卵泡激素;降钙素;促黄体素;胰高血糖素;凝血因子如因子VIIIC、因子IX、组织因子和von Willebrand因子;抗凝血因子如C蛋白;心钠素;肺表面活性物质;纤溶酶原激活物,如尿激酶或人尿或组织纤溶酶原激活物(t-PA);铃蟾肽;凝血酶;造血生长因子;组织坏死因子-α和-β;脑啡肽酶;RANTES(其通常是T细胞表达和分泌的来调节激活(regulated onactivation normally T-cell expressed and secreted));人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α);血清白蛋白如人血清白蛋白;Muellerian-inhibiting substance;松弛素A链;松弛素B链;松弛素原(prorelaxin);小鼠促性腺激素相关的肽;微生物蛋白,如β-内酰胺酶;DNase;IgE;细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA),如CTLA-4;抑制素;激活蛋白;血管内皮生长因子(VEGF);激素或生长因子的受体;A蛋白或D蛋白;类风湿因子;神经营养因子如骨源神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或神经生长因子如NGF-β;血小板源生长因子(PDGF);成纤维细胞生长因子如aFGF和bFGF;表皮生长因子(EGF);转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β(包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5);胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II);des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)、胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP);CD蛋白如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20;促红细胞生成素;骨诱导因子;免疫毒素;骨形态发生蛋白(BMP);干扰素如干扰素-α、-β和-γ;集落刺激因子(CSF),例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF;白细胞介素(IL),例如IL-1至IL-10;超氧物歧化酶;T细胞受体;表面膜蛋白;衰变加速因子;病毒抗原如例如AIDS包膜的一部分;转运蛋白;归巢受体;地址素;调节蛋白;整合蛋白如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM;肿瘤相关抗原如HER2、HER3或HER4受体;和任意上述多肽以及与任意上述多肽结合的抗体(包括抗体片段)的片段和/或变体。
“污染物”是不同于期望的多肽产物的物质。污染物包括但不限于:宿主细胞物质,例如中国仓鼠卵巢蛋白(CHOP)或大肠杆菌蛋白(ECP);浸出的A蛋白;核酸;期望多肽的变体、片段、聚集物、异构体或衍生物;另一多肽;内毒素;病毒污染物;氨基糖苷类抗生素组分(例如,庆大霉素、链霉素、新霉素、卡那霉素);或者加入纯化方法的离子聚合物(例如,聚乙烯亚胺(PEI)、聚乙烯胺、聚精氨酸、聚乙烯磺酸、聚丙烯酸)等。
当在本文中使用时,术语“CH2/CH3区”指免疫球蛋白分子的Fc区中的那些氨基酸残基。在优选的实施方案中,CH2/CH3区包含完整的CH2区,之后是完整的CH3区,以及最优选的免疫球蛋白的Fc区。含CH2/CH3区的多肽的实例包括抗体、免疫黏附素,以及包含与CH2/CH3区融合的或者连接的目的多肽的融合蛋白。
在本发明优选的实施方案中,在本文中待纯化的抗体是重组抗体。“重组抗体”是在宿主细胞中产生的抗体或者由于同源重组而产生的抗体,其中已经用编码抗体的核酸转化或转染了所述宿主细胞。“转化”和“转染”可互换使用,指将核酸引入细胞的方法。转化或转染后,核酸可以整合到宿主细胞基因座中,或者可以存在为染色体外元件。“宿主细胞”包括体外培养的细胞,以及宿主动物内的细胞。用于重组产生多肽的方法例如描述于美国专利号5,534,615中,将所述专利明确并入本文作为参考。
术语“抗体”以其广义使用,并且特别地涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如,双特异性抗体)和抗体片段,只要它们保留或者经修饰包含如本文中所定义的CH2/CH3区。
本文中的抗体靶向目的“抗原”。优选地,抗原是在生物学上重要的多肽,并且将抗体施用给患病的哺乳动物可以在该哺乳动物中产生治疗益处。然而,还考虑了靶向非多肽抗原(如肿瘤相关的糖脂抗原,参见美国专利5,091,178)的抗体。当抗原是多肽时,其可以是跨膜分子(例如,受体)或配体如生长因子。示例性抗原包括上述的那些多肽。本发明包括的优选抗体分子靶标包括CD多肽如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20和CD34;HER受体家族的成员如EGF受体(HER1)、HER2、HER3或HER4受体;细胞黏着分子如LFA-1、Mac1、p150、p95、VLA-4、ICAM-1、VCAM和包括整联蛋白的a或b亚基的av/b3整联蛋白(例如,抗-CD11a、抗-CD18或抗-CD11b抗体);生长因子如VEGF;IgE;血型抗原;flk2/flt3受体;肥胖(OB)受体;mpl受体;CTLA-4;多肽C等。可将可溶性抗原或其片段,任选地与其他分子缀合的可溶性抗原或其片段用作产生抗体的免疫原。对于跨膜分子例如受体,可将其片段(例如,受体的胞外域)用作为免疫原。备选地,可将表达跨膜分子的细胞用作为免疫原。此类细胞可以来源于天然来源(例如,癌细胞系)或者可以是已经通过重组技术进行转化的表达跨膜分子的细胞。
在本文中待纯化的抗体的实例包括但不限于:HER2抗体包括曲妥珠单抗(Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285-4289(1992))、美国专利号5,725,856)和帕妥珠单抗(pertuzumab)(OMNITARGTM)(WO01/00245);CD20抗体(参见下文);IL-8抗体(St John等人,Chest,103:932(1993)和国际公开号WO 95/23865);VEGF或VEGF受体抗体,其包括人源化的和/或亲和力成熟的VEGF抗体如人源化VEGF抗体huA4.6.1贝伐单抗和兰尼单抗(ranibizumab)(Kim等人,Growth Factors,7:53-64(1992)、国际公开号WO 96/30046和WO 98/45331、公开于1998年10月15日);PSCA抗体(WO01/40309);CD11抗体包括依法珠单抗(美国专利号5,622,700、WO 98/23761、Steppe等人,Transplant Intl.4:3-7(1991)和Hourmant等人,Transplantation58:377-380(1994));结合IgE的抗体包括奥马佐单抗(Presta等人,J.Immunol.151:2623-2632(1993)和国际公开号WO 95/19181;1998年2月3日发布的美国专利号5,714,338或者1992年2月25日发布的美国专利号5,091,313、1993年3月4日公开的WO 93/04173或者1998年6月30日提交的国际申请号PCT/US98/13410、美国专利号5,714,338);CD18抗体(1997年4月22日发布的美国专利号5,622,700或者1997年7月31日公开的WO 97/26912);Apo-2受体抗体的抗体(1998年11月19日公开的WO 98/51793);组织因子(TF)抗体(1994年11月9日授权的欧洲专利号0 420 937 B1);α4-α7整联蛋白抗体(1998年2月19日公开的WO 98/06248);EGFR抗体(例如,嵌合或人源化225抗体、西妥昔单抗、1996年12月19日公开的WO 96/40210中的);CD3抗体如OKT3(1985年5月7日公开的美国专利号4,515,893);CD25或Tac抗体如CHI-621和(参见1997年12月2日公开的美国专利号5,693,762);CD4抗体如cM-7412抗体(Choy等人,Arthritis Rheum 39(1):52-56(1996));CD52抗体如CAMPATH-1H(ILEX/Berlex)(Riechmann等人,Nature 332:323-337(1988));Fc受体抗体例如靶向Fc的M22抗体(如Graziano等人,J.Immunol.155(10):4996-5002(1995)中的RI);癌胚抗原(CEA)抗体如hMN-14(Sharkey等人,Cancer Res.55(23Suppl):5935s-5945s(1995));靶向乳腺上皮细胞的抗体,其包括huBrE-3、hu-Mc 3和CHL6(Ceriani等人,CancerRes.55(23):5852s-5856s(1995);和Richman等人,Cancer Res.55(23Supp):5916s-5920s(1995));与结肠癌细胞结合的抗体如C242(Litton等人,Eur J.Immunol.26(1):1-9(1996));CD38抗体,例如AT 13/5(Ellis等人,J.Immunol.155(2):925-937(1995));CD33抗体如Hu M195(Jurcic等人,Cancer Res 55(23Suppl):5908s-5910s(1995))和CMA-676或CDP771;EpCAM抗体如17-1AGpIIb/IIIa抗体如阿昔单抗或c7E3 FabRSV抗体如MEDI-493CMV抗体如HIV抗体如PRO542;肝炎抗体如Hep B抗体CA 125抗体OvaRex;独特型GD3表位抗体BEC2;αvβ3抗体(例如,Medimmune);人肾细胞癌抗体如ch-G250;ING-1;抗人17-1An抗体(3622W94);抗人结直肠肿瘤抗体(A33);靶向GD3神经节苷脂的抗人黑素瘤抗体R24;抗人鳞状细胞癌(SF-25);人白细胞抗原(HLA)抗体如Smart ID10和抗-HLADR抗体Oncolym(Lym-1);CD37抗体如TRU 016(Trubion);IL-21抗体(Zymogenetics/NovoNordisk);抗-B细胞抗体(Impheron);靶向B细胞的MAb(Immunogen/Aventis);1D09C3(Morphosys/GPC);LymphoRad 131(HGS);Lym-1抗体,如Lym-1Y-90(USC)或抗-Lym-1Oncolym(USC/Peregrine);LIF 226(Enhanced Lifesci.);BAFF抗体(例如,WO 03/33658);BAFF受体抗体(参见例如,WO 02/24909);BR3抗体;Blys抗体如贝利木单抗;LYMPHOSTAT-BTM;ISF 154(UCSD/Roche/Tragen);gomilixima(Idec 152;Biogen Idec);IL-6受体抗体如atlizumab(ACTEMRATM;Chugai/Roche);IL-15抗体如HuMax-Il-15(Genmab/Amgen);趋化因子受体抗体,如CCR2抗体(例如,MLN1202;Millieneum);抗-补体抗体如C5抗体(例如,依库丽单抗(eculizumab),5G1.1;Alexion);人免疫球蛋白的口服制剂(例如,IgPO;ProteinTherapeutics);IL-12抗体如ABT-874(CAT/Abbott);替奈昔单抗(Teneliximab)(BMS-224818;BMS);CD40抗体,包括S2C6及其人源化变体(WO00/75348)和TNX 100(Chiron/Tanox);TNF-α抗体,其包括cA2或英夫单抗CDP571、MAK-195、阿达木单抗(HUMIRATM)、聚乙二醇化TNF-α抗体片段如CDP-870(Celltech)、D2E7(Knoll)、抗-TNF-α多克隆抗体(例如,PassTNF;Verigen);CD22抗体如LL2或依帕珠单抗(Immunomedics),包括依帕珠单抗Y-90和依帕珠单抗I-131、Abiogen’s CD22抗体(Abiogen,意大利)、CMC 544(Wyeth/Celltech)、combotox(UTSoutwestern)、BL22(NIH)和LympoScan Tc99(Immunomedics)。
CD20抗体的实例包括“C2B8”,现在将其称为“利妥昔单抗”(美国专利号5,736,137);钇-[90]-标记的2B8鼠抗体,(美国专利号5,736,137;1993年6月22日以保藏号HB11388在ATCC保藏的2B8),也称作“Y2B8"或“Ibritumomab Tiuxetan”可从IDEC Pharmaceuticals,Inc.购买;鼠IgG2a“B1”,也称为“Tositumomab”,任选地用131I标记以产生“131I-B1”或者“碘I131tositumomab”抗体(BEXXARTM),其可从Corixa购买(也参见美国专利号5,595,721);鼠单克隆抗体“1F5”(Press等人,Blood 69(2):584-591(1987))及其变体,其包括“构架区经修饰的”或者人源化的1F5(WO 2003/002607,Leung,S.,ATCC保藏号HB-96450);鼠2H7和嵌合的2H7抗体(美国专利号5,677,180);人源化2H7(WO 2004/056312,Lowman等人);2F2(HuMax-CD20),靶向B细胞的细胞膜上的CD20分子的全长人类高亲和力抗体(Genmab,Denmark;参见例如,Glennie和vande Winkel,Drug Discovery Today 8:503-510(2003)和Cragg等人,Blood 101:1045-1052(2003);WO 2004/035607;US2004/0167319);WO 2004/035607和US2004/0167319中所述的人单克隆抗体(Teeling等人);US 2004/0093621中所述的具有与Fc区结合的复杂N-糖苷连接的糖链的抗体(Shitara等人);与CD20结合的单克隆抗体和抗原结合片段(WO 2005/000901,Tedder等人)如HB20-3、HB20-4、HB20-25和MB20-11;CD20结合分子如AME系列的抗体,例如WO 2004/103404和US2005/0025764中所述的AME 33抗体(Watkins等人,EliLilly/Applied Molecular Evolution,AME);CD20结合的分子如US 2005/0025764中所述的那些分子(Watkins等人);A20抗体或其变体如嵌合的或人源化的A20抗体(分别为cA20、hA20)或IMMU-106(US 2003/0219433,Immunomedics);CD20-结合的抗体,包括US 2005/0069545A1和WO 2005/16969(Carr等人)中任选地与IL-2缀合的表位缺失的Leu-16、1H4或2B8;结合CD22和CD20的双特异性抗体,例如hLL2xhA20(WO2005/14618,Chang等人);可获自International Leukocyte Typing Workshop的单克隆抗体L27、G28-2、93-1B3、B-C1或NU-B2(Valentine等人,In:Leukocyte Typing III(McMichael,Ed.,p.440,OxfordUniversity Press(1987));1H4(Haisma等人,Blood 92:184(1998));抗-CD20auristatinE缀合物(Seattle Genetics);抗-CD20-IL2(EMD/Biovation/City of Hope);抗-CD20 MAb疗法(EpiCyte);抗-CD20抗体TRU 015(Trubion)。
如本文中所用,术语“单克隆抗体”指获自基本上是同质性抗体群体的抗体,即除可能天然存在少量突变外,包含该群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异的,靶向单一的抗原位点。此外,与通常包括靶向不同决定簇(表位)的常规(多克隆)抗体制备物相反,每一单克隆抗体靶向抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”指获自基本上为同质性抗体群体的抗体的特征,并且并不应理解为需要通过任一特定方法产生抗体。例如,可以通过第一次由Kohler等人,Nature 256:495(1975)所述的杂交瘤方法制备或者可以通过重组DNA方法(参见,例如美国专利号4,816,567)制备根据本发明待使用的单克隆抗体。在另外的实施方案中,“单克隆抗体”可以分离自使用McCafferty等人,Nature,348:552-554(1990)所述的方法产生的抗体噬菌体文库。Clackson等人,Nature,348:552-554(1990)和Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)描述了使用噬菌体文库分别分离鼠和人抗体。随后的出版物描述了通过链改组(Marks等人,Bio/Technology,10:779-783(1992)),以及作为构建非常大的噬菌体文库的策略的组合感染和体内重组(Waterhouse等人,Nuc.Acids.Res.,21:2265-2266(1993)来产生高亲和力(nM范围)人抗体。因此,对于单克隆抗体的分离,这些技术是常规单克隆抗体杂交瘤技术的可行备选。备选地,现在有可能在免疫后,在不产生内源免疫球蛋白的情况能产生人抗体的全部组成成分的转基因动物(例如,小鼠)。例如,已经描述,在嵌合的和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合性缺失导致了内源抗体产生的完全抑制。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到此种系突变小鼠中将导致抗原攻击后人抗体的产生。参见,例如Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993);Jakobovits等人,Nature,362:255-258(1993);Bruggermann等人,Year in Immuno.,7:33(1993);and Duchosal等人,Nature 355:258(1992)。
本文中的单克隆抗体特别地包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白),其中重链和/或轻链的一部分与来自特定物种或者属于特定抗体种类或亚类的抗体以及该抗体的片段中相应的序列是相同的或者同源的,而链的剩余部分与来自另一物种或者属于另一抗体种类或亚类的抗体以及该抗体的片段中相应的序列是相同的或者同源的,只要它们显示出期望的生物学活性(美国专利号4,816,567;和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。
当在本文中使用时,术语“高变区”指抗体负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即轻链可变域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)和重链可变域中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3);Kabat等人,Sequences of Polypeptides of Immunological Interest,5th Ed.Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))和/或来自“高变环”的那些残基(即,轻链可变域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)和重链可变域中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3);Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。如本文中所定义,“构架”或“FR”残基是除高变区残基以外的那些可变域残基。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是含来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。对于大部分而言,人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体),其中用来自非人物种(供体抗体)例如小鼠、大鼠、兔或具有期望的特异性、亲和力和能力的非人灵长类动物的高变区的残基替换来自受体的高变区的残基。在一些实例中,用相应的非人残基替换人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基。此外,人源化抗体可以包含在受体抗体中或者在供体抗体中没有的残基。可以进行这些修饰,以进一步改进抗体性能。通常,人源化抗体包含至少一个可变区以及一般地两个可变区的基本上全部区域,其中全部或者基本上全部高变环对应于非人免疫球蛋白的那些高变环,并且全部或者基本上全部FR区是人免疫球蛋白序列的那些FR区。人源化抗体任选地还包含免疫球蛋白(一般是人免疫球蛋白)的恒定区(Fc)的至少一部分。
对于降低抗原性而言,在制备人源化抗体中待使用的人可变域(轻链和重链两种)的选择是非常重要的。根据所谓的“最适”(best-fit)方法,针对已知的人可变域序列的整个文库筛选啮齿类动物抗体的可变域序列。然后将与啮齿类动物的序列最接近的人序列接受为用于人源化抗体的人构架(FR)(Sims等人,J.Immunol.,151:2296(1993);Chothia等人,J.Mol.Biol.,196:901(1987))。
另一方法使用来源于全部人抗体的特定亚型的轻链或重链的共有序列的特定构架。可将相同的构架用于几种不同的人源化抗体(Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992);Presta等人,J.Immnol.,151:2623(1993)。
还重要的是人源化的抗体保留了对抗原的高亲和力以及其他有利的生物学性质。为了实现该目标,根据优选的方法,通过使用亲本和人源化序列的三维模型,分析亲本序列以及多种概念上(conceptual)人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是通常可得到的,并且是本领域技术人员熟悉的。图解和展示选定的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序是可得到的。观察这些显示图(display)允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用,即分析残基对候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的影响。因此,可以选择FR残基,并与受体和输入序列组合,以实现期望的抗体特征,例如对靶抗原增加的亲和力。总之,CDR残基直接并且大量地参与影响抗原结合。
“抗体片段”包含全长抗体,一般地其抗原结合区或可变区的一部分。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段;双抗体;线性抗体;单链抗体分子;和由抗体片段形成的多特异性抗体。已经研发了多种技术用于抗体片段的产生。常规地,这些片段通过完整抗体的蛋白水解消化衍生(参见例如,Morimoto等人,Journal of Biochemical andBiophysical Methods 24:107-117(1992)和Brennan等人,Science,229:81(1985))。然而,现在可以通过重组的宿主细胞直接产生这些片段。例如,抗体片段可以分离自如上所讨论的抗体噬菌体文库。备选地,可以直接从大肠杆菌回收Fab'-SH片段,并且将其化学偶联以形成F(ab')2片段(Carter等人,Bio/Technology 10:163-167(1992))。在另一实施方案中,使用促进F(ab')2分子装配的亮氨酸拉链GCN4来形成F(ab')2。根据另一方法,可以从重组的宿主细胞培养物直接分离F(ab')2片段。用于产生抗体片段的其他技术对于技术人员而言是显而易见的。
在其他实施方案中,选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185。“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域,其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常,Fv多肽还包含VH和VL结构域之间的多肽连接体,所述连接体使得sFv形成用于抗原结合的期望结构。对于sFv的综述,参见Pluckthun in The Pharmacology of MonoclonalAntibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段,所述片段包含在同一多肽链(VH-VL)中与轻链可变域(VL)连接的重链可变域(VH)。通过使用太短而不允许同一链上两个结构域之间配对的连接体,使该结构域与另一链的互补结构域配对,并产生两个抗原结合位点。例如在EP 404,097;WO 93/11161;和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)中更详细地描述了双抗体。
当在本申请中使用时,表述“线性抗体”指在Zapata等人,Polypeptide Eng.8(10):1057-1062(1995)中描述的抗体。简言之,这些抗体包含一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1),其形成了一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性或者单特异性的。
“多特异性抗体”具有对至少两个不同表位的结合特异性,其中该表位通常来自不同抗原。尽管此类分子通常仅结合两个抗原(即,双特异性抗体,BsAb),但当在本文中使用时,该表述包括具有另外的特异性的抗体如三特异性抗体。BsAb的实例包括那些一条臂靶向肿瘤细胞抗原,并且另一条臂靶向细胞毒性引发分子的抗体如抗-FcγRI/抗-CD15、抗-p185HER2/FcγRIII(CD16)、抗-CD3/抗-恶性B-细胞(1D10)、抗-CD3/抗-p185HER2、抗-CD3/抗-p97、抗-CD3/抗-肾细胞癌、抗-CD3/抗-OVCAR-3、抗-CD3/L-D1(抗-结肠癌)、抗-CD3/抗-促黑素细胞激素类似物、抗-EGF受体/抗-CD3、抗-CD3/抗-CAMA1、抗-CD3/抗-CD19、抗-CD3/MoV18、抗-神经细胞黏着分子(NCAM)/抗-CD3、抗-叶酸结合蛋白(FBP)/抗-CD3,抗-泛肿瘤相关抗原(AMOC-31))/抗-CD3;一条臂与肿瘤抗原特异性结合,并且一条臂与毒素结合的BaAb,例如抗-皂草毒蛋白/抗-Id-I、抗-CD22/抗-皂草毒蛋白、抗-CD7/抗皂草毒蛋白、抗-CD38/抗-皂草毒蛋白、抗-CEA/抗-蓖麻毒蛋白A链、抗-干扰素-α(IFN-α)/抗杂交瘤独特型、抗-CEA/抗-长春花生物碱;用于转变酶活化的前体药物的BsAb,如抗-CD30/抗-碱性磷酸酶(其催化磷酸丝裂霉素前体药物转变成丝裂霉素醇);能用作为纤溶剂的BsAb,如抗-纤维蛋白/抗-组织纤溶酶原激活物(tPA),抗-纤维蛋白/抗-尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA);用于将免疫复合物靶向细胞表面受体的BsAb,例如抗-低密度脂蛋白(LDL)/抗-Fc受体(如FcγRI,或FcγRIII);用于治疗感染性疾病的BsAb,例如抗-CD3/抗单纯疱疹病毒(HSV),抗-T-细胞受体:CD3复合体/抗-流感,抗-FcγR/抗-HIV;用于体外或体内肿瘤检测的BsAb,例如抗-CEA/抗-EOTUBE、抗-CEA/抗-DPTA、抗-p185HER2/抗-半抗原;作为疫苗佐剂的BsAb;和作为诊断工具的BsAb,例如抗-兔IgG/抗-铁蛋白,抗-辣根过氧化物酶(HRP)/抗-激素,抗-生长抑素/抗-底物P,抗-HRP/抗-FITC,抗-CEA/抗-β-半乳糖苷酶。三特异性抗体的例子包括:抗-CD3/抗-CD4/抗-CD37,抗-CD3/抗-CD5/抗-CD37和抗-CD3/抗-CD8/抗-CD37。可以将双特异性抗体制备为全长抗体或抗体片段(如F(ab')2双特异性抗体)。
也考虑了具有二价以上的抗体。例如可以制备三特异性抗体。Tutt等,J.Immunol.147:60(1991)。
对于本文中的目的,“裸抗体”是未与细胞毒性部分或者放射性标记缀合的抗体。
在本文中,“完整抗体”是这样的抗体,其包含两个抗原结合区和Fc区。优选地,完整抗体具有功能性Fc区。
“治疗”指治疗性处理和预防性处理或预防措施。需要治疗的人包含已患病症和待预防病症的人。
“病症”指受益于用如本文所述纯化的抗体进行的治疗的任何病症。其包括:慢性病症、急性病症、疾病和具有使哺乳动物易患所讨论病症的那些病理状态。
短语“离子交换层析”指基于化合物的净电荷来分离化合物的分离技术。将分子分类为阴离子(具有负电荷)或阳离子(具有正电荷)。一些分子(例如,多肽)可以具有阴离子和阳离子基团两种。
离子交换树脂或离子交换聚合物是通常从有机聚合物底物制备的以小(1–2mm直径)珠子形式存在的不溶性基质(或者支持结构)。Horie等人,Pure Appl.Chem.(2004)Vol.76,No.4,pp.889-906。该材料具有高度发达的孔结构,在所述孔的表面具有容易捕获和释放离子的位点。离子的捕获仅与其他离子释放同时发生;因此,该方法称为离子交换。存在多种不同类型的制备型离子交换树脂,其选择性地优选一种或几种不同类型的离子。
大多数一般的离子交换树脂都基于交联的聚苯乙烯。可以在聚合后引入所需的活性基团,或者可以使用所取代的单体。例如,通常在聚合处理时,通过加入0.5-25%的二乙烯苯至苯乙烯中来实现交联。较少使用未交联的聚合物,因为它们更不稳定。交联降低了树脂的离子交换能力,并且延长了实现离子交换过程所需的时间。颗粒大小也影响树脂参数;更小的颗粒具有更大的外表面,但在柱处理中造成了更大的压头损失(head loss)。
存在四种主要类型的离子交换树脂,它们在其官能团方面不同:强酸性(一般地,磺酸基,例如聚苯乙烯磺酸钠或聚AMPS);强碱性(季氨基,例如三甲基铵基如聚APTAC);弱酸性(大多数为羧酸基);弱碱性(伯氨基、仲氨基和/或叔氨基如聚乙烯胺)。也存在特异性类型:螯合树脂(亚氨基二乙酸、硫脲及其他)。
离子交换层析膜结合具有总体为正电荷或者负电荷的化合物。结合位点沿吸附器的孔定位。化合物通过对流运输到结合位点。正电荷膜(阴离子交换剂)结合具有总体为负电荷的化合物。相反地,负电荷膜(阳离子交换剂)结合具有总体为正电荷的化合物。
可以将离子交换膜进一步分类成强或弱。强离子交换膜在宽范围的pH水平都带电荷(离子化)。弱离子交换膜在窄pH范围内是离子化的。4种最常用的离子交换化学物质是:
总之,离子交换膜具有0.1至100μm的孔径。作为参考,Sartobind Q(SartoriusAG)是具有3-5μm的标称孔径的强阴离子交换膜,并且是以单层或多层形式市售的,MustangQ(Pall Corporation)是具有0.8μm的标称孔径的强阴离子交换膜,并且同样是以单层或多层形式市售的。作为另一参考,Sartobind S(Sartorius AG)是具有3-5μm标称孔径的强阳离子交换膜,并且是以单层或多层形式市售的,Mustang S(Pall Corporation)是具有0.8μm的标称孔径的强阳离子交换膜,并且相似地是以单层或多层形式市售的。作为另一参考,Natrix S(Natrix Separations,Inc.)是由高比表面积大孔水凝胶内装入未编织的高纤维耐用聚合底物组成的强阳离子交换膜。
“标称”孔径等级描述了膜在60-98%额定孔径截留大多数微粒的能力。
溶液的“pH”测量了相对于水样品的离子化的酸碱度。水的pH是中性,即7。大多数pH读数为0至14。具有比水更高[H+](pH低于7)的溶液是酸性的;具有比水更低[H+](pH大于7)的溶液是碱性的。可以使用pH计测量pH。可以使用酸或碱如HCl或NaOH调整缓冲液pH。
分子如多肽的“pI”或“等电点”指含数量相等的正电荷和负电荷的多肽的pH。可从多肽氨基酸残基的净电荷计算pI,或者可以通过等电点聚焦测定pI。可以利用多肽具有阴离子和阳离子基团的两性特性。当期望的多肽表现为阳离子(具有正电荷)时,多肽的pH可以降低至该点以下。备选地,当期望的多肽表现为阴离子(具有负电荷)时,多肽的pH可以增加至该点以上。
术语“电导率”指溶液在两个电极间传导电流的能力。电导率的基本单位是西门(S),以前称为欧姆(mho)。通常以单位mS/cm表示电导率。由于溶液中离子上的电荷有助于电流的传导,所以溶液的电导率与其离子浓度成比例。这些测量结果都与离子强度很好相关。离子强度与电解质的浓度密切相关,并且指示如何有效地通过电解质中的其他离子屏蔽了特定离子上的电荷。离子强度与电解质浓度之间的主要差异在于如果一些离子带更多的电荷,那么前者更大。两者之间的另一差异在于离子强度反映了游离的离子的浓度,而不仅仅是向溶液中加入了多少盐。可以使用电导率仪,例如多种模式的Orion电导率仪测量电导率。可以通过改变其中离子的浓度来改变溶液的电导率。例如,为了实现期望的电导率,可以改变溶液中缓冲剂的浓度和/或盐(例如,氯化钠、乙酸钠或氯化钾)的浓度。优选地,可以改变各种缓冲液的盐浓度来实现所需电导率。
对于膜层析,通常将“流速”描述为每小时的膜体积(MV/h)。
对于膜层析,通常将“装载密度(load density)”表述为每升膜处理的组合物的克数。
“缓冲液”是通过其酸-碱结合组分的作用来抵抗pH变化的溶液。在Buffers.AGuide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems,Gueffroy,D.,Ed.Calbiochem Corporation(1975)中描述了取决于,例如所希望的缓冲液pH而使用的不同缓冲液。
从含有多肽和一种或多种污染物的组合物中“纯化”多肽,指通过从组合物中(完全地或部分地)除去至少一种污染物来提高组合物中多肽的纯度。“纯化步骤”可以是得到“均一”组合物的总纯化方法中的一部分。在本文中所用的“均一”指这样的组合物,其包含目的抗体的重量占所述组合物的总重量的至少约70%,优选至少约80%,更优选地至少约90%,甚至更优选地至少约95%。
将分子“结合”到离子交换膜上,指在合适的条件下(pH和/或电导率)将该分子暴露于离子交换膜,以使该分子通过分子和离子交换膜上一个或多个带电基团之间的静电作用可逆的固定在离子交换膜中或膜上。
“洗涤”离子交换膜,指使合适的缓冲液在离子交换膜中或上通过。
将分子(例如,抗体或污染物)从离子交换膜上“洗脱”下来,指从离子交换膜上除去该分子。
对于膜层析,“流通”指杂质与膜结合,而没有保留化合物。
对于膜层析,“竞争吸附”指在给定的条件下,一种以上的组分与膜结合。
对于膜层析,“过载层析(overload chromatography)”指促进目的化合物和杂质与膜的竞争吸附。在超出化合物的结合量的情况下装载膜。通过利用化合物和杂质的差别结合强度(其中杂质结合更强),化合物被杂质置换,并从膜中解吸附且流到膜洗脱液中。
“顶替层析”指这样的层析技术,其中将样品放置在柱子或膜上,然后用比原始混合物的组分吸附更强的溶质置换。结果组分溶解到高浓度纯物质的连续“矩形”区域,而不是溶剂分离“峰”。Tugcu(1994)Methods in Molecular Biology:Vol 421 AffinityChromatography:Methods and Protocols pp 71-89。与其他的层析模式比较,顶替层析可以获得更高的产物浓度、更高的纯度和增加的处理量。在多种应用中,对于从以高柱装载的复杂混合物中纯化蛋白质,替换层析是有效的技术。使用小试规模的标准分析层析柱,显示替换层析很好地适合于从复杂的混合物中获得mg量的纯化蛋白质。其还特别适合于进料中富集的微量组分。使用多种树脂系统,包括离子交换、HIC和RPLC,可以容易地实施替换层析。Freitag和Breier.(1995)J.Chromatogr.A 691,101–112。
短语“混合模式”指具有基于两种不同机制分离化合物的能力的吸着剂,例如,基于净电荷的分离和基于多肽之间亲水性/疏水性差异的分离。这通常通过使用多式配体完成,所述多式配体可以以几种不同的方式与靶分子相互作用,所述方式包括离子相互作用、氢键结合或者疏水相互作用。吸着剂如GE Healthcare CaptoTMMMC和CaptoTMAdhere是层析树脂的“混合模式”的实例。
“厚度过滤器”是这样的各种滤器,其使用多孔过滤介质以使颗粒保留在基质中,而不是仅仅在基质表面。当待过滤的液体含高载量的颗粒时,这些滤器是常用的,因为相对于其他类型的滤器,它们可以在堵塞前截留大量的颗粒。
“单块(monolith)”指由多孔底物组成的层析介质,所述多孔底物已经针对特定应用而在化学上改变。已经将离子交换单块研发为层析树脂的备选,所述离子交换单块通常显示出高渗透性和短扩散距离,导致了更好的质量传输和更低的压力,使得可以在更高的流速和更短的驻留时间使用它们。
用于实施本发明的方式
在本文中,本发明提供了用于从包含多肽和一种或多种污染物的组合物中纯化多肽的方法。组合物通常是这样的组合物,其由多肽的重组产物产生,也可以由通过肽合成(或者其他合成方法)产生的多肽或者可能从天然来源的多肽纯化的多肽产生。优选地,多肽是含CH2/CH3区的多肽。在优选的实施方案中,含CH2/CH3区的多肽是抗体。
抗体的重组产生
对于多肽的重组产生,分离编码多肽的核酸,并插入到用于进一步克隆(扩增DNA)或者用于表达的可复制载体中。使用常规方法(例如,通过使用能与编码抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)可以容易地分离和测序编码多肽的DNA。许多载体都是可用的。载体组分通常包括但不限于一种或多种以下组分:信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列(例如,如美国专利5,534,615中所述,特别地将所述美国专利并入本文作为参考)。
在本文中,用于克隆和表达载体中DNA的合适宿主细胞是原核细胞、酵母或者高等真核细胞。用于该目的的合适的原核细胞包括真细菌,如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物,例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)如埃希氏菌属(Escherichia)例如大肠杆菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)和志贺氏菌属(Shigella),以及杆菌属(Bacilli)如枯草芽孢杆菌(B.Subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.Licheniformis)(例如1989年4月12日公布的DD 266,710中公开的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和链霉菌属(Streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446),尽管其他菌株如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)都是合适的。这些实例都是说明性的而不是限制性的。
除原核生物外,真核微生物如丝状真菌或酵母也是用于抗体编码载体的合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常见的面包酵母(baker'syeast)是低等真核宿主微生物中最常使用的。然而,在本文中常用的和使用的是一些其他种属、物种和菌株,例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe);克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主例如如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.Bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、瓦尔提克鲁维酵母(K.waltii)(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)、耐热克鲁维酵母(K.Thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus);子囊菌酵母属(yarrowia)(EP 402,226);巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)(EP 183,070);念珠菌属(Candida);里氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234);粗糙链孢菌(Neurospora crassa);许旺酵母属(Schwanniomyces)如许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis);和丝状真菌,包括链孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium),或曲霉属(Aspergillus)宿主如构巢曲霉(A.nidulans)或黑曲霉(A.niger)。
用于表达糖基化多肽的合适的宿主细胞来源于多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定了许多杆状病毒株(baculoviral strain)和变体以及相应的来自宿主的所允许的昆虫宿主细胞,如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda(幼虫))、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊))、白纹伊蚊(Aedes albopictus(蚊))、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster((果蝇))和家蚕(bombyx mori)。用于转染的各种病毒株是公众可得到的,如苜蓿银纹夜蛾(Autograoha californica)NPV的L-1变种和家蚕NPV的Bm-5菌株,并且这些病毒可用作本文中根据本发明的病毒,特别地用于转染草地夜蛾细胞。还能将棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物用作宿主。
然而,最感兴趣的是脊椎动物细胞,并且在培养(组织培养)中增殖脊椎动物细胞已成为常规方法。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例包括但不限于用SV40转化的猴肾CV1细胞(COS-7,ATCC CRL1651);人胚肾细胞(293细胞或亚克隆的用于在悬浮培养中生长的293细胞,Graham等人,J.Gen virol.36:59(1977));幼地鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL 10);中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO,Urlaub等人Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,77:4216(1980));小鼠支持细胞(TM4,Mather,Biol,reprod.23:243-251(1980));猴肾细胞(CV1IATCC CCL 70);非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587);人宫颈癌细胞(HELA,ATCC CCL 2);犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL 34);水牛鼠肝细胞(BRL3A,ATCC CRL 1442);人肺细胞(W138,ATCCCCL75);人肝细胞(Hep G2,HB 8065);小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562,ATCC CCL 51);TRI细胞(Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci,383:44-68(1982));MRC 5细胞;FS4细胞和人肝癌细胞(Hep G2)。通常,对于抗体的表达,CHO细胞是优选的,并且可以有利地用于产生根据本发明纯化的抗体。
用上述表达或克隆载体转化宿主细胞以用于多肽产生,并在常规营养培养基(被改良为适用于诱导启动子、选择转化体或扩增编码期望序列的基因)中培养。
用于产生本发明多肽的宿主细胞可在不同培养基中培养。商业上可得到的培养基如Ham's F10(Sigma)、最小必需培养基((MEM),(Sigma)、RPM1-1640(Sigma)和Dulbecco'sModified Eagle's Medium((DMEM),Sigma)对培养宿主细胞是适合的。此外,在Ham等人,Meth.Enz.58:44(1979)、Barnes等人,Anal.Biochem.102:255(1980)、美国专利号4,767,704;4,657,866;4,927,762;4,560,655或5,122,469;WO 90/03430;WO 87/00195或美国专利Re.30,985中描述的任何培养基都可用作宿主细胞的培养基。这些培养基的任一种可能必须补充激素和/或其它生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、氨基糖苷类抗生素(如庆大霉素)、痕量元素(定义为通常以微摩尔级的终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等价能源。还可包含本领域技术人员已知的,以合适浓度加入的任何其他必需的补充剂。培养条件如温度、PH等,是前面用于为表达而选择的宿主细胞的那些条件,并且对本领域一般技术人员而言是显而易见的。
当使用重组技术时,可在细胞内、周质间隙内产生多肽,或者将其直接分泌到培养基中。如果多肽在细胞内产生,第一步将通过如离心或超滤除去宿主细胞或裂解细胞(如匀浆时产生的)的颗粒碎片。当多肽分泌到培养基中,可以使用商业上可购得的蛋白质浓缩滤器如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元浓缩这些表达系统的上清液。
本发明的一个方面考虑了庆大霉素对CEX柱的影响。可将庆大霉素和其他氨基糖苷类抗生素用作细胞培养应用中的杀菌添加剂,以防止非抗性污染。当加入到细胞培养物中时,必须将其作为处理相关的杂质而除去。通常使用亲和层析步骤完成除去,然而,在一些方法中,亲和步骤可以不是第一纯化步骤。
作为阳离子氨基糖苷类抗生素,庆大霉素在中性pH或中性pH以下是带正电荷的。如果CEX柱是第一层析步骤,在中性pH或中性pH以下结合目的多肽的情况下,庆大霉素可能竞争柱子上的结合位点。以前的工作显示,与抗体相比,庆大霉素与CEX膜或树脂结合更强。庆大霉素对CEX柱的影响是明显降低了抗体的结合量。
本发明的另一方面考虑了聚乙烯亚胺(PEI)或其他阳离子聚合物对CEX柱的影响。在大肠杆菌多肽纯化方法中,可将PEI用作收获前絮凝剂。当在细胞匀浆步骤后加入PEI时,其用作杂质结合剂,并使得离心和过滤成为了更强化的处理。掺入该步骤的作用不是用于絮凝杂质的任意额外的PEI,这是因为其随后保留在最终与CEX柱接触的纯化池中。
存在许多不同形式的PEI(线性或分支聚合物),并且它们可以含有伯胺、仲胺或叔胺。无需过多考虑PEI的形状,因为事实上其在大多数处理条件下是带正电荷的。因此,PEI与CEX柱非常强地结合。此外,由于CEX柱相对高的结合量,用于大多数大肠杆菌蛋白的第一层析步骤可以是CEX柱。另外地,由于CEX柱与PEI的强结合,偶尔需要使用更弱的CEX柱,以使在每次运行后可以将PEI从柱子中洗脱下来。
以前的工作显示,当将不同水平的PEI用于絮凝时,使用的PEI水平越低,CEX柱的结合量越高。还观察到,随着装载中PEI的水平的降低,CEX层析步骤产率是增加的。
在应用到离子交换柱之前使用相似电荷的离子交换膜来减少杂质可以导致增加的结合量、产率、杂质清除率,这些方面全部都使得处理效率更高同时运行费用降低。
本发明的膜离子交换层析方法
在本发明优选的实施方案中,待进行本文中纯化方法的组合物是重组产生的多肽,优选地完整抗体,所述多肽通过中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或大肠杆菌重组宿主细胞培养物表达。任选地,在膜离子交换层析之前,已经将组合物进行了至少一个纯化步骤。组合物含有目的多肽和一种或多种污染物,例如中国仓鼠卵巢蛋白(CHOP);大肠杆菌蛋白(ECP);浸出的A蛋白;核酸;期望抗体的变体、片段、聚集物或衍生物;另一多肽;内毒素;病毒污染物;氨基糖苷类抗生素组分(例如,庆大霉素);或者加入纯化方法的离子聚合物(例如,聚乙烯亚胺(PEI)、聚乙烯胺、聚精氨酸、聚乙烯磺酸、聚丙烯酸)等。
可以在膜离子交换层析方法之前、期间或之后进行的其他纯化方法的实例包括在疏水相互作用层析上(例如PHENYL-SEPHAROSETM)的分级分离、乙醇沉淀、热沉降、聚乙二醇(PEG)沉淀、等电点聚焦、反向HPLC、在硅石上层析、在HEPARIN SEPHAROSETM上层析、阴离子交换层析、阳离子交换层析、混合模式的离子交换层析、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析、亲水电荷诱导层析(hydrophic charge inductionchromatography)、高效切向流过滤(HPTFF)和亲和层析(例如,使用A蛋白、G蛋白、抗体或特异性底物、配体或抗原作为捕获剂)。
当使用重组技术时,可在细胞内、周质间隙内产生多肽,或者将其直接分泌到培养基中。如果多肽在细胞内产生,第一步将通过如离心或过滤除去颗粒碎片,如宿主片段或裂解片段。当多肽分泌到培养基中,可以例如通过离心或过滤从细胞培养基中分离重组的宿主细胞。
在分离抗体的情况下,如果将A蛋白亲和层析用作第一步,那么主要的纯化在A蛋白亲和层析期间发生。A蛋白是与抗体的Fc区特异性结合的细菌细胞壁蛋白。当将A蛋白固定化在层析介质上时,A蛋白提供了纯化重组抗体的技术,因为其可以选择性地结合复杂溶液中的抗体,而允许杂质通过。
A蛋白亲和柱的基本方案是简单的:在约中性pH结合并在酸性pH洗脱。将在固相上固定化的A蛋白用于纯化含CH2/CH3区的多肽。固相优选地是包含玻璃、硅石、琼脂糖或聚苯乙烯二乙烯基苯表面的柱子,其用于固定化A蛋白。优选地,固相是定孔(controlled pore)玻璃柱、硅酸柱或高度交联的琼脂糖柱。市售自GE Healthcare的Mabselect SuReTM柱是有效纯化抗体的高度交联的琼脂糖A蛋白柱的实例。有时,用试剂如甘油涂布柱子,以试图防止与柱子的非特异性黏着。市售自MilliporeCorporation的PROSEP ATM柱是用甘油涂布的A蛋白定孔玻璃柱的实例。用合适的缓冲液平衡A蛋白层析的固相。
使用可能与平衡缓冲液相同的加样缓冲液将来源于重组宿主细胞的受污染的制备物装载在已平衡的固相上。随着受污染的制备物流过固相,多肽被吸附在固定化的A蛋白上,而其他污染物(如中国仓鼠卵巢蛋白、CHOP(其中多肽在CHO细胞中产生)、庆大霉素和聚乙烯亚胺(PEI))与固相非特异性结合。
顺次进行的下一步骤必须在中间洗涤步骤中通过用含盐、氨基酸和/或疏水电解质的溶剂除去与固相结合的污染物。在优选的实施方案中,该洗涤步骤中的盐是磷酸钾(potassium phosphate),氨基酸是精氨酸,并且疏水电解质是TEMAC和/或TEAC。在某些实施方案中,尽管在洗涤液中可以存在单一溶质,但可以使用两种或多种此类溶质。优选地将溶质加入到具有约中性pH的pH缓冲液中。
前述中间洗涤步骤之后,从柱子中回收目的多肽。这通常通过使用合适的洗脱液实现。例如,可以使用具有低pH,例如约2至约5,和优选地约2.5至约3.5的洗脱液从柱子中洗脱多肽。为此,洗脱液的实例包括柠檬酸缓冲液或乙酸缓冲液。
如本文主张的那样进行离子交换层析。首先决定使用阴离子还是阳离子交换膜。尽管一些抗体的等电点(pI)为约6.7至9.7,但许多抗体的pI较高(通常>8并且有时>9)。通常,阳离子交换膜可用于Pl大于8的抗体,阴离子交换膜可以用于pI小于8的抗体。
对于以过载模式运行的膜阳离子交换层析,将上样物质的pH调整至低于抗体的pI约1至约5个pH单位,取决于pH,将上样物质的电导率调整至≤约40mS/cm,并将抗体泵送通过膜。在一些实施方案中,将上样物质调整至低于抗体的pI约1至约4个pH单位,约1至约3个pH单位,约1至约2个pH单位或者约1个pH单位。在其他实施方案中,取决于pH,将上样物质的电导率调整至≤约20mS/cm或者≤约10mS/cm。因为上样物的pH低于抗体的pI,所以抗体(其具有正电荷)不会最先流过。相反,抗体与阳离子交换剂的带负电荷官能团静电结合。这是因为抗体(带正电荷)和膜(带负电荷)具有相反的电荷。由于在A蛋白亲和层析期间与抗体一起洗脱的许多污染物例如宿主细胞蛋白如CHOP或ECP、氨基糖苷类抗生素如庆大霉素和离子聚合物添加剂如聚乙烯亚胺(PEI)的pI仅与抗体的pI轻微地不同(即pI可能仅相差约0.05至约0.2个pI单位),这些污染物跟“碱性”抗体一样也会与膜结合。在不使用A蛋白层析的纯化方案中,如果不使用膜,那么就会保留足够高的浓度的庆大霉素或PEI或者其他杂质,从而破坏IEX柱的性能。不被理论所束缚,对于以过载模式运行的膜阳离子交换层析,在诱导具有最小离子屏蔽的电荷的pH和电导率条件下,似乎会发生竞争吸附,并且污染物会优先与膜结合,或者另外有效地从膜上“置换”抗体(RR Drager,FE Regnier,JChromatogr.359:147-55(1986)),这允许抗体从基质中“洗脱”或者在结合后流过并在流出物中回收。
对于以过载模式运行的膜阴离子交换层析,将上样物质的pH调整至高于抗体的pI约1至约5个pH单位,取决于pH,将上样物质的电导率调整至≤约40mS/cm,并将抗体泵送通过膜。在一些实施方案中,将上样物质的pH调整至高于抗体的pI约1至约4个pH单位,约1至约3个pH单位,约1至约2个pH单位或者约1个pH单位。在其他实施方案中,取决于pH,将上样物质的电导率调整至≤约20mS/cm或者≤约10mS/cm。因为上样物的pH大于抗体的pI,所以抗体(其具有负电荷)不会最先流过。相反,抗体将与阴离子交换剂的带正电荷官能团静电结合。这是因为抗体(带负电荷)和膜(带正电荷)具有相反的电荷。由于在A蛋白亲和层析期间与抗体一起洗脱的许多污染物例如宿主细胞蛋白如CHOP的pI仅与抗体的pI轻微地不同(即pI可能仅相差约0.05至约0.2个pI单位),这些污染物跟“酸性”抗体一样也会与膜结合。不被理论所束缚,对于以过载模式运行的膜阴离子交换层析,在具有诱导最小离子屏蔽的电荷的pH和电导率条件下,明显会发生竞争吸附,并且污染物会优先与膜结合,或者另外有效地从膜上“置换”抗体(RR Drager,FE Regnier,J Chromatogr.359:147-55(1986)),这允许抗体从基质中“洗脱”或者在结合后流过并在流出物中回收。
在一个实例中,在标准层析系统或者定制层析系统(custom chromatographysystem)如装备了压力计、传感器和泵以及泵控制器的AKTATMExplorer(GE Healthcare)上运行膜层析。在该实例中,膜装置安装在压力计的下游。在所述实例中,pH和电导率检测器安装在膜装置的下游。在所述实例中,在安装膜之前用水然后用平衡缓冲液彻底冲洗系统。在所述实例中,用平衡缓冲液冲洗具有膜的系统,直到溶液pH和电导率匹配平衡缓冲液规格(大约5个膜体积),并且观察到稳定的基线。在所述实例中,通过泵,以333–2667MV/小时,在pH 5.5(对于纯化假定的“碱性”抗体或者pH 8.0(对于纯化假定的“酸性”抗体),以及大约4mS/cm的电导率下装载进料物质。在所述实例中,记录运行期间的运行反压力和pH以及电导率改变。最后,在该实例中,当在280nm处的紫外(UV)吸光度迹线高于基线0.2个吸收单位时,立即收集膜流出物中的多肽。装载进料物质后,用合适的洗涤缓冲液洗涤膜,并且当280nm处的UV迹线低于0.2个吸收单位时,停止池收集,并测定来自膜流出物级分中的池样品的多肽浓度、二聚体/聚集水平、宿主细胞蛋白、DNA和浸出的A蛋白。通常使用装载的多肽和膜流出物中的多肽计算回收步骤。在常规上膜是一次性的。对于分析测定,可以使用Beckman分光光度计通过280nm处的吸光度来测定多肽含量(多肽浓度)。可以通过大小排阻层析测定多肽聚集。可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)分析宿主细胞蛋白如CHOP或ECP水平。可以通过使用TaqMAN PCR(聚合酶链反应)定量宿主细胞DNA。可以使用A蛋白树脂供应商推荐的基于免疫化学ELISA的方法处理浸出的A蛋白。可以通过ELISA分析庆大霉素,并且可以通过Q Sepharose Fast Flow层析或核磁共振(NMR)定量聚乙烯亚胺(PEI)水平。
假定地设计并测试了用于S膜的以下缓冲液:(1)89mM乙酸、127mM TRIS碱、21mM柠檬酸,pH 5.5,6.0mS/cm,(2)28mM MES、95mM NaCl,pH 6.0,11mS/cm,(3)200mM NaOAc,pH5.5,12mS/cm,(4)100mM NaOAc,pH 5.5,6.4mS/cm,(5)96mM乙酸、65mM TRIS,pH 5.0,3.6mS/cm,(6)25mM MOPS,pH 7.1,0.8mS/cm,(7)50mM HEPES、90mM NaCl,pH 7.0,10mS/cm,(8)0.5x磷酸缓冲盐水(PBS)、4.5mM乙酸,pH 5.0,8.0mS/cm、25mM NaOAc,pH 5.0,6.0mS/cm。
假定地设计并测试了用于Q膜的以下缓冲液:(1)50mM TRIS、15mM NaCl,pH 8.0,4.3mS/cm,(2)25mM TRIS,pH 8.0,1.3mS/cm,(3)60mM TRIS、118mM NaCl,pH 8.0,15.7mS/cm,(4)50mM TRIS、50mM NaOAc,pH 8.0,7.0mS/cm,(5)25mM HEPES、85mM NaOAc,pH 7.0,6.5mS/cm,和(6)91mM乙酸、130mM TRIS,pH 8.0,5.0mS/cm,(7)75mM甘氨酸、9mM磷酸、115mMTRIS,pH 8.9,0.8mS/cm(8)25mM TRIS、5mM NaCl,pH 8.9,1.0mS/cm.(9)25mM TRIS、10mMNaCl,pH 9.0,1.5mS/cm,(10)1x磷酸缓冲盐水(PBS),pH 7.3,15.2mS/cm。
另外地,添加乙酸、柠檬酸、HEPES、盐酸、磷酸、氯化钠、TRIS或者其他此类酸性和碱性缓冲液可以上调或下调任何缓冲系统的pH至合适的pH。还可以使用纯化的水、注射用水(WFI)、乙酸钠、氯化钠、磷酸钾或者其他含此类含低和高盐的缓冲液上调或下调任何缓冲系统的电导率至合适的电导率。
竞争吸附膜层析的研发涉及在多个水平的pH和电导率使上样物质通过膜。当分子具有强静电作用时,可以增强多肽(目的多肽或污染物)的截留。当在多肽高度带电荷的条件下运行时,可以增强静电作用,即当使用具有足够与多肽的pI区分开来的pH的缓冲液时,其增加了多肽的电荷,并且低离子强度防止了缓冲液离子屏蔽电荷。相反,当在多肽带电荷较少的条件下运行时,可以降低静电作用,即当使用具有足够接近于多肽的pI的pH的缓冲液时,其降低了多肽的电荷,并且高离子强度允许缓冲液离子屏蔽电荷。结果,通过使用优化的缓冲液进行的膜吸附,可以分离具有不同物理-化学特性的多肽。基于缓冲液pH和离子强度的合适选择,一些分子可以在给定的膜上保留,而其他分子可以流过膜。
根据需要,可以将根据本文中膜离子交换层析获得的多肽制备物进行另外的纯化步骤。上文讨论了示例性的其他纯化步骤。
参照图1,用于抗体成功纯化方案的一个实例是回收方法,其要求A蛋白亲和层析的初始捕获步骤,然后是以结合和洗脱模式运行的阳离子交换柱,然后是最终的精制步骤。
参照图1,改进的纯化方案的一个实例是回收方法,其要求A蛋白亲和层析的初始捕获步骤,然后是以过载模式运行的阳离子交换膜(其可以保护以结合和洗脱模式运行的阳离子交换柱),然后是最终的精制步骤。
参照图1,改进的纯化方案的另一实例是回收方法,其要求以过载模式运行初始阳离子交换膜(其可以保护以结合和洗脱模式运行的阳离子交换柱),然后是精制步骤。
参照图2,用于非抗体的成功纯化方法的一个实例是回收方法,其要求阳离子交换层析的初始捕获步骤,然后是最终的精制步骤。
参照图2,改进的纯化方案的一个实例是回收方法,其要求以过载模式运行的初始阳离子交换膜(其可以保护以结合和洗脱模式运行的阳离子交换柱),然后是精制步骤。
不同于将IEX膜主要地用作唯一的纯化步骤或最终精制步骤的应用,本发明纯化方法的膜用于保护带相似电荷的离子交换膜(例如,将阳离子交换膜直接放置在阳离子交换树脂的前面)。这是有益的,因为膜对杂质比多肽/抗体更具选择性,所以它们可以降低或去除进入柱上的杂质。杂质也可以置换多肽/抗体,以使其最终进入柱子上。膜可以与前述柱子连续地或者非连续地使用。
无论上样物质中的杂质是否会降低阳离子交换柱的性能,在该纯化方法中在使用带相似电荷的离子交换柱之前使用膜都是有利的。通过用膜除去这些杂质,这可以允许待装载的阳离子交换柱具有更高结合量,导致每次运行减少的柱尺寸或者减少的循环数。备选地,通过用膜除去这些杂质,允许阳离子交换柱具有增加的步骤产率,或者在丢弃前具有更长的树脂寿命,或者导致阳离子交换池中降低的杂质水平,或者减少了下游精制步骤的数目。当需要比A蛋白亲和树脂更便宜的备选或者目的多肽不与A蛋白亲和树脂结合时,允许阳离子交换柱替换A蛋白亲和柱是有利的。使用连续运行的阳离子交换膜和阳离子交换柱在降低总的处理时间、减少缓冲液或设备如罐或层析滑道(skid)方面是有利的。
任选地,根据需要将多肽与一种或多种异源分子缀合。异源分子可以例如是增加多肽的血清半寿期的分子(例如,聚乙二醇,PEG)或者其可以是标记(例如,酶、荧光标记和/或放射性核素)或细胞毒性分子(例如,毒素、化疗药物或放射性同位素等)。
可以通过将具有所需纯度的多肽与任选地可药用载体、赋形剂或稳定剂(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980))混合,以冻干制剂或以水溶液形式制备包含多肽、任选地与异源分子缀合的多肽的治疗制剂。“可药用”载体、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度对接受者是无毒的,并且包含缓冲剂如磷酸、柠檬酸和其它有机酸;抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸;防腐剂(如氯化十八烷基二甲基苄基铵;六甲氯铵;氯化苯甲烃铵;苯索氯铵;酚,丁醇或苯甲醇;烷基对羟基苯甲酸酯如尼泊金甲酯或尼泊金丙酯;儿茶酚;间二苯酚;环己醇;3-戊醇和间-甲酚);低分子量(小于10个残基)的多肽;蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸;单糖、二糖或其它糖类,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合剂如EDTA;糖如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇;成盐抗衡离子如钠;金属复合物(如Zn-蛋白复合物);和/或非离子型表面活性剂,如TWEENtm,PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
还可以在胶体给药系统(如脂质体、白蛋白微球体、微乳化液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或在粗乳状液中,将活性成分包裹在例如分别通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微囊(如羟甲基纤维素或明胶-微囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊)中。这些技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)中。
用于体内施药的制剂必须是无菌的。这可容易的通过无菌滤过膜来完成。
可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适例子包括:含有多肽的固态疏水聚合物的半渗透性基质,该基质以有型制品形式,如:薄膜或微囊存在。缓释基质的例子包括聚酯、水凝胶(如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(polylactide)(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、非降解性的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解乳酸-乙醇酸共聚物,如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球体)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
然后将如本文公开的纯化的多肽或含有多肽和可药用载体的组合物用于针对此类多肽和组合物的各种诊断、治疗或其它已知用途。例如,通过给哺乳动物施用治疗有效量的多肽,可将多肽用于治疗哺乳动物的病症。
给出下面的实施例用于说明性的而非限制性的。将在说明书中所有的引用文献的公开内容并入本文作为参考。
实施例
实施例1
简介
本研究集中于以竞争吸附模式使用离子交换膜纯化单克隆抗体,以提高下游柱子的效率。由于相对于单克隆抗体或者其他目的多肽,以竞争吸附模式运行的膜与许多杂质更强地结合,所以膜有效地除去了对带相似电荷的下游柱子具有有害作用的杂质。
该方法对于许多试图减少过多的阳离子交换或阴离子交换纯化步骤的纯化方法是违反直觉的。在本申请中,下游柱子之前的多余膜可以增强柱子的性能,以使整个方法更加高效。
将选定的一个重组DNA衍生的mAb、一个重组DNA衍生的单臂抗体和一个重组DNA衍生的多肽用于基于其分子种类的分析。在CHO细胞培养物中产生mAb,并且纯化程度不同(没有层析纯化至三种柱层析步骤(A蛋白、阴离子交换和阳离子交换))。在大肠杆菌细胞培养物中产生单臂抗体,并将其通过A蛋白层析步骤纯化。在大肠杆菌细胞培养物中产生多肽,并且不使其进行先前的纯化步骤。基于可能负面地影响层析柱的杂质的残留水平来选择进料流。
本研究探讨:杂质如庆大霉素和聚乙烯亚胺(PEI)负面地影响离子交换柱的能力、以及离子交换膜如MustangTMS和Natrix S清除这些杂质从而导致改进的柱性能的能力。
材料和方法
进料流
进料流取自最初为商业和研究目的而生产的工业的、试验性的或小规模细胞培养批次(Genentech Inc.,South San Francisco,California)。进料流具有不同的纯化程度,意为分离了细胞,并且澄清的液体在至少一种柱层析步骤上纯化或者不纯化。每一进料流含有靶治疗性多肽,以及可定量水平的杂质。取决于各个多肽处理以及纯化的水平,每一进料流的组成是不同的。表1显示了本研究的每一抗体、多肽或单价抗体的进料流特征。
a用于全部产物的原种收集自工业的、试验性的和小规模处理。
b已经事先调整池pH和电导率,以确保足够的产物稳定性。
c基于每一mAb的氨基酸序列计算等电点(pI)。
多肽定量
使用三种方法测定多肽的浓度。当杂质水平足够低从而不能对UV吸光度具有可评估的影响时,使用UV-分光光度计在280和320nm处扫描。当杂质水平或颜色对UV吸光度具有可评估的影响时,分别将分析亲和柱或离子交换柱用于定量抗体或多肽浓度。
对于通过UV-分光光度计扫描测试的样品,使用合适的无干扰的稀释剂将含多肽的样品稀释成0.1至1.0AU的范围。一式两份地进行样品制备和分光光度计扫描读数,并记录平均值。所测试多肽的吸收系数为1.45–1.70(mg/mL)-1cm-1。使用称作Beer-Lambert Law的等式,将280和320nm处的吸光度、稀释因子、光程长(1cm)和吸收消光系数用于计算mAb浓度。
对于通过分析亲和柱测试的样品,根据需要,使用合适的无干扰的稀释剂将含抗体的样品稀释成0.025-4.0mg/mL的范围。备选地,对于更低或更高浓度的样品,注射体积应当分别加倍或者减半。一式两份地进行样品制备和HPLC测试,并记录平均值。对于普通的抗体HPLC测定,通过使用与参照物质的抗体吸收消光系数相对应的吸收消光系数,校正特定抗体的样品浓度结果。
对于通过分析离子交换柱测试的样品,根据需要,使用合适的无干扰的稀释剂将含多肽的样品稀释成0.1-0.8mg/mL的范围。一式两份地进行样品制备和HPLC测试,并记录平均值。通过积分注射峰下面积测定样品浓度结果,并与使用参照物质得到的标准曲线相关联。
CHO宿主细胞蛋白(CHOP)定量
将酶联免疫吸附测定(ELISA)用于定量CHOP的水平。将亲和纯化的山羊抗CHOP抗体固定化在微量滴定板孔上。在孔中温育含CHOP的样品的稀释物、标准品和对照,然后同与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗CHOP抗体一起温育。使用邻苯二胺盐酸盐检测辣根过氧化物酶活性。在微量滴定板中,通过读取492nm处的吸光度定量CHOP。将计算机曲线拟合程序用于产生标准曲线,并自动计算样品浓度。ELISA的测定范围通常为5ng/ml至320ng/ml。对于每一样品,测定了2-4个稀释度,并平均化数值。将CHOP除以蛋白质浓度,并将结果以ppm(ngCHOP/mg蛋白质)为单位报告。
大肠杆菌蛋白(ECP)定量
以与CHOP定量相似的方式,将酶联免疫吸附测定(ELISA)用于定量ECP的水平。
庆大霉素定量
将酶联免疫吸附测定(ELISA)用于定量庆大霉素的水平。将庆大霉素-BSA的山羊多克隆抗体固定化在微量滴定板孔上。庆大霉素与生物素-庆大霉素竞争结合抗体。使用辣根过氧化物酶-链霉亲和素测量结合的生物素-庆大霉素的量,所述辣根过氧化物酶-链霉亲和素的酶活性使用四甲基联苯胺(TMB)检测。根据样品鉴定(qualification)期间建立的可接受稀释度,使用ELISA测定稀释液稀释样品。在酶标仪中,通过读取450nm处的吸光度定量庆大霉素。将最小4-参数计算机曲线拟合程序用于产生标准曲线,并自动计算样品浓度。通常,在庆大霉素测定中,标准曲线的报告范围为0.58ng/mL至90ng/mL。对于每一样品,测定了2-4个稀释度,并平均化数值。将庆大霉素值除以蛋白质浓度,并将结果以ppm(ng庆大霉素/mg蛋白质)为单位报告。
聚乙烯亚胺定量
在配备了具有5mm倾斜度的TCI冷冻探子和自动取样器的Bruker600MHz分光光度计上记录全部数据。使用设计的自旋回波脉冲序列获取数据,以最小化来自溶液中蛋白质的共振信号。设计与预饱和脉冲序列偶联的激发塑型脉冲序列(excitation sculptingpulse sequence),以最小化来自溶液中水的共振信号。在NMR测量之前,将D2O加入全部样品至10%的终浓度(630mL的样品+70mL的D2O)。
定量NMR测定是一般的分析方法,并且可以应用于巨大量的有机分子。通常,每一分子具有一组独特的NMR信号(特征性共振频率、相对峰强度、谱线宽度和偶联模式)。适合于测定小的、含质子的分子的浓度的NMR测定的唯一标准是分析物的NMR信号和缓冲液组分不重叠。对于大范围的分析物浓度,NMR测定是准确且精确的(例如,对于丙二醇,1ug/mL至154,500ug/mL)。
层析膜
测试的膜是MustangTMS(Pall Corporation,East Hills,New York)和Natrix S(Natrix Separations,Burlington,Canada)。MustangTMS和Natrix S是有效结合带正电荷蛋白质和病毒颗粒的强阳离子交换膜。MustangTMS由具有0.8μm孔的聚醚砜(PES)制备,并用磺酸形式修饰。Natrix S膜由在可弯曲的多孔支持基质内形成的聚合水凝胶组成。支持基质提供了机械强度,而水凝胶性质决定了产物的分离化学。为了增加结合量,厂商可以将多层膜组合到每一装置中。层的总数和厚度基于厂商和制造的装置的大小而改变。膜体积(MV)是膜的物理体积(固体和空间),并且测量为单位mL。本研究使用了代表多个规格的多种膜装置。表2列出了所测试的每一膜的相关规格。
表2:强阳离子交换膜特征
层析树脂
所测试的树脂为Fractogel SE Hicap(EMD Chemicals Inc.,Gibbstown,NewJersey)和SP Sepharose Fast Flow(GE Healthcare Life Sciences,Piscataway,NewJersey)。Fractogel SE Hicap和SP Sepharose Fast Flow树脂是强阳离子交换树脂。Fractogel SE Hicap树脂由具有约 孔径的40-90μm直径的交联的聚甲基丙烯酸酯颗粒制备。功能性配体使用长的线性聚合物链与颗粒共价结合。SP Sepharose Fast Flow树脂由具有~4,000,000Da排阻限的45-165μm直径的高度交联的琼脂糖颗粒制备。SepharoseFast Flow是琼脂糖与作为官能团的磺丙基配体交联的衍生物。交联方法是厂商的专利。
膜和树脂纯化系统
使用AKTA ExplorerTM100(GE Healthcare,Fairfield,Connecticut)进行小规模测试,其是可编程处理纯化系统,且包括整合的计量泵、压力传感器和在线pH、电导率和UV传感器。探测系统是可编程的,并且通过计算机运行的UNICORNTMv5.10软件(GEHealthcare,Fairfield,Connecticut)控制。小规模测试还使用由数字经济驱动蠕动泵(digital economy drive peristaltic pump)(Cole Parmer,VernonHills,Illinois)、在线DTXTMPlus TNF-R压力传感器(Becton Dickinson,Franklin Lakes,New Jersey)和AND EK-1200平衡表(balance)(A&D Company,Ltd.,Tokyo,日本)组成的手动系统来进行。平衡表通过测量质量积累用于物理监测泵的流速。将质量转变成假定进料流密度为1.0g/mL时的体积。使用NetDAQTM2640A/41A网络数据获取系统连续监测来自线上传感器的压力和来自平衡表的质量,所述网络数据获取系统与分别用于压力和质量收集的计算机运行的TrendlinkTM版本3.1.1(Canary Labs Inc.,Martinsburg,Pennsylvania)和RsCom版本2.40(A&D Company,Ltd.,Tokyo,日本)软件连接。
膜流通样品收集技术
以三种不同的方式收集流通样品。定时收集样品和级分是最常见的。定时收集的样品是在特定处理量时取得的流通液的小的瞬时等分试样。级分是较大的流通样品,并通过处理量范围限定。也将流通液收集为单个大池。池分析是有效的,但对于监测mAb和杂质水平,定时收集的样品和级分通常是更有用的,因为可以组合连续的样品,以显示趋势。
动态结合量(DBC)技术
通过将进料流以一般的处理流速装载到介质上,测定膜和树脂的动态结合量(DBC)。相对于通常进行的静态结合量的测定中将介质浸泡在装载进料流中,上述处理是优选的。对于本申请,DBC是介质的性能的更适合的量度。通过在装载时期取得流通定时收集的样品或者级分来测定BDC。使用定时收集的样品的特定处理量或者全部级分的体积以及全部定时收集的样品或级分中的多肽或杂质的浓度,能产生DBC图。此外,如果已知装载物质中的多肽或杂质浓度,可以产生图,来比较滤液浓度(C)与装载浓度(C0)。在该情况下,C/C0值为0表示滤液浓度比装载浓度低得多,而C/C0值为1表示滤液浓度与装载浓度相似。
实验
从冷藏库(2-8℃或≤-70℃)中移除原种,并允许平衡至室温。然后,任选地使用合适的滴定剂(即1.5M tris碱或1M柠檬酸)或稀释液(纯化的水或5M氯化钠)将pH和/或电导率调整至表1中所示的条件。然后,使用AcroPakTM20(Pall Corporation,East Hills,NewYork)、AcroPakTM1000(Pall Corporation,East Hills,New York)或1000mL真空滤器(Thermo Fisher Scientific,Rochester,New York)离线过滤,以除去在冷藏中或调节期间形成的任何沉淀物。
通过使用纯化的水或合适的缓冲液冲洗装载管道和流通管道,来准备纯化系统。将膜放置在进料泵和压力传感器的管线内下游,然后用50-500MV的纯化水或平衡缓冲液冲洗。冲洗后,将进料流装载在膜上,并以333-2667MV/小时的恒定流速装载可变的量。在装载期间,根据需要对流通液取样。然后,任选地用缓冲液冲洗(chase)膜,以收集任何残留的产物。为了维持杂质在膜上的保留,冲洗缓冲液(也称为洗涤缓冲液)一般在pH方面与进料相似,并且电导率等于或低于进料。
然后分析得到的膜的定时收集的样品、级分或池,以测定多肽和/或杂质浓度。
在一些情况中,然后将得到的膜池装载在树脂上。仅使用Explorer进行树脂层析,从而可以实时监测UV、pH和电导率的趋势,并且可以通过线上UV传感器帮助池合并。在装载期间,根据需要对流通液取样。
在一些情况中,进行膜洗脱。仅使用Explorer进行膜洗脱,从而可以通过线上UV传感器帮助池合并。使用高盐缓冲液(20mM乙酸钠和350mM氯化钠,pH 5.5)洗脱膜。此外,在一些情况中,使用20mL以上两种缓冲液的0-100%梯度(20mM乙酸钠、0mM氯化钠,pH5.5和20mM乙酸钠、2000mM氯化钠,pH 5.5)洗脱膜。
在一些情况中,进行树脂洗脱。仅使用Explorer进行树脂洗脱,从而可以通过线上UV传感器帮助池合并。使用高盐缓冲液梯度(50至500mM乙酸钠,pH 5.5)或高盐步骤(50mM HEPES、200mM氯化钠、0.05%Triton、1mM DTT,pH 7.5)以200cm/hr的恒定流速洗脱树脂,并且将0.5-1.0 OD或1.25-1.25 OD合并的池分别用于Fractogel SE Hicap和SPSepharose Fast Flow。
结果
小规模阳离子交换膜产率
在MustangTMS膜上以667MV/小时处理以下阴离子交换池:用1M柠檬酸调整至pH5.5和6.4mS/cm的mAb 1阴离子交换池以及pH 8.0和5.0mS/cm的MAb 1阴离子交换池。所使用的MustangTMS膜为0.18mL装置。pH 5.5和pH 8.0的mAb 1进料流低于抗体的pI,因此带正电荷。分析进料和流通时定时收集的样品中的抗体浓度。尽管最初的样品显示一些抗体与膜结合,但图3显示在两种pH条件下产率是相似的,所述产率在1000g/L装载密度下是快速增加的,并且在大约5000g/L的装载密度后,可达到≥96%。
小规模阴离子交换膜产率
对于比较目的,在使用7.7以上等电点的阴离子交换膜的测试中选择mAb 2。蛋白质在高pH易于脱酰胺和聚集,所以不在mAb 1上进行相似的测试。使用1.5M tris碱,将pH5.5和9mS/cm的阳离子交换池的pH调整至8.0。然后将原种分成3个单独的池,并使用纯化水调整电导率。第一池为10mS/cm,并将第二和第三池分别调整至7mS/cm和4mS/cm。将全部三种池都维持在pH 8.0。然后将每一进料流以600MV/小时的恒定流速,在小规模0.35mLMustangTMQ上处理。pH 8.0的mAb 2比pI高0.3个pH单位,因此抗体带负电荷。分析装载池和流通池中的抗体浓度。图4显示在全部三种电导率条件下产率是相似的,所述产率最初在200g/L装载密度下是快速增加的,并且在大约1000g/L的装载密度后为≥96%。
小规模阳离子交换膜杂质清除
为了评价阳离子交换膜杂质清除率,将pH 5.5和3.2mS/cm mAb 3A蛋白池以1333MV/小时的恒定流速在小规模0.18mL MustangTMS膜上处理。装载的mAb 3比计算的pI低3.4个单位,因此该抗体带正电荷。分析装载物、流通级分,以及洗脱样品,并且在图5中显示了CHOP的结果。数据显示,MustangTMS最初将CHOP从438ppm降低至109ppm。随着装载密度达到55,300g/L,CHOP增加至318ppm。使用含高盐的溶液洗脱膜。将盐离子用于屏蔽电荷,因此破坏了静电作用,并导致蛋白质从膜表面解吸附,并且自由地移动到流动相中。洗脱池的分析显示,杂质的富集确认了CHOP由于静电力与膜结合。
为了进一步评价吸附器的性能,在小规模0.18mL MustangTMS膜上以667MV/小时的恒定流速处理pH 5.5和6.0mS/cm的mAb 3阴离子交换池。mAb 3pH比pI低3.4个pH单位,因此该抗体带正电荷。分析了进料和流通时定时收集的样品中的mAb、CHOP和庆大霉素浓度。为了比较进料和定时收集的样品浓度,产生了以膜装载密度为函数的C/C0(定时收集的样品/装载物)图。如图6中所示,从2至16kg/L装载密度,mAb C/C0值在1.0附近,表明定时收集的样品浓度几乎与装载浓度相同,并且产率可能较高。相反地,尽管用mAb过载,但CHOP和庆大霉素C/C0值较低(从2至16kg/装载密度,该值为≤0.2),表明定时收集的样品浓度比装载浓度低得多,并且MustangTMS除去了绝大多数的这些杂质。
小规模阳离子交换膜结合选择性
为了评价阳离子交换膜是否相对于mAb选择性结合某些杂质,设计了一系列实验,并使用mAb 3A蛋白池进行。选择该池是因为其杂质水平更高,所述杂质包括高分子量种类(HMWS)、二聚体、低分子量种类(LMWS)、庆大霉素和CHOP。将A蛋白池调整至pH 5.5和4.4mS/cm。装载前,将每一MustangTMS膜用20mM乙酸钠,pH 5.5和1.3mS/cm缓冲液平衡。进行四次实验,每次都以1333MV/小时装载0.18mL MustangTMS膜至1000、5000、10000或15000g/L的装载密度。装载后,用20mM乙酸钠,pH 5.5和1.3mS/cm缓冲液洗涤膜。洗涤后,使用洗涤缓冲液梯度洗脱,并将20mM乙酸钠、2M氯化钠pH 5.1、~500mS/cm用于洗脱膜。形成的梯度超过20mL,并且每一次获取2mL洗脱级分用于分析。对于4次实验,分析洗脱级分中的全部杂质和mAb浓度。在任意给定的装载密度实验中,可以比较级分,以测定杂质或mAb何时从膜上洗脱下来,其中较晚洗脱的种类比较早洗脱的种类结合更紧。图7显示,对于5000g/L装载密度实验,分析了10种级分洗脱液中的多种种类的%归一化浓度。每一峰的位置表明mAb单体与膜结合最弱,因为它最先被洗脱下来。在结合强度的递增次序中,单体之后是HMWS、二聚体、CHOP、LMWS和庆大霉素。尽管许多种类在梯度中相似的位置被洗脱下来,该图清楚显示,庆大霉素比竞争种类结合更强。
此外,对于每一装载密度,可以计算与柱子结合的每一杂质或mAb的总质量,并将其在多个装载密度实验中进行比较。图8显示了以增加的膜装载密度为函数的每一种类的%归一化质量。线条的方向表示种类的质量是增加还是减少。随着装载密度增加,mAb单体(之前显示其结合最弱)的质量水平是减少的。相反,随着装载密度增加,二聚体、HMWS、CHOP、庆大霉素和LMWS的质量都是增加的。这确认了以前的结合强度结果,并表明由于其他种类不断地与膜结合,导致与膜结合的mAb单体是减少的。
小规模阳离子交换膜置换
为了测定强结合种类如庆大霉素是否可以洗脱mAb单体,以作为解释结合选择性结果的假设,使用mAb 3A蛋白池进行了实验。将A蛋白池调整至pH 5.5and 4.2mS/cm。通过用20mM乙酸钠,pH 5.4平衡0.18mL MustangTMS膜进行实验。装载mAb 1A蛋白池,直到UV迹线明确显示mAb穿透(breakthrough)。然后用平衡缓冲液洗涤膜,之后将由平衡缓冲液以及2g/L庆大霉素组成的洗脱液用于洗脱膜。应当注意,平衡缓冲液和洗脱液具有相同的pH和电导率,以防止影响mAb与膜的结合。图9显示了装载、洗涤和洗脱时期的层析图,其包括UV、pH和电导率迹线。层析图显示,在洗脱期起始之前,洗涤期足以使UV迹线回到基线。还显示,在洗脱期间,在pH或电导率迹线没有任何显著改变的情况下,观察到了大的UV峰。这表明庆大霉素可以有效地从阳离子交换膜置换结合的mAb单体。
CEX膜与庆大霉素的结合比较
为了测定庆大霉素的CEX膜结合量,进行了实验来测试0.18mL MustangTMS膜和0.23mL Natrix S。用2.0M乙酸和PW将pH 7.2的PBS缓冲液调整至最终5.00的pH和8.10mS/cm的电导率。然后将mAb 3UF/DF池和庆大霉素掺入到调整过的缓冲液中至大约1.0mg/mL和40,000ng/mL的终浓度。将得到的掺料溶液用作装载进料流。
为了进行实验,用PW冲洗两种膜,用调整过的缓冲液平衡,用掺料溶液装载,并用调整过的缓冲液冲洗。在装载期间,在20、40、60和80mL时,收集MustangTMS的4mL流通定时收集样品。对于Natrix S,在10mL时以及之后每60mL收集一次4mL流通定时收集样品,总共19个样品。然后分析全部样品中的mAb和庆大霉素浓度,并与装载浓度比较,以产生如图10所示的相对于膜装载密度的C/C0图。
尽管没有作图,mAb浓度达到1.0的C/C0值表明在该步骤的流通液中存在高产率的抗体。相反地,庆大霉素C/C0值更晚达到1.0表明两种膜都具有显著的结合水平。MustangTMS具有4.4至8.9g/Lm之间的庆大霉素结合量,而Natrix S具有更高的庆大霉素结合量,并显示出更慢的穿透。在50g/L,C/C0值为0.3,穿透曲线稍略为线性,一直到约125g/Lm和约0.8的C/C0值。125g/Lm后,穿透曲线变得平坦,表明膜仍结合庆大霉素,同时可能置换了低水平的mAb。
这些结果显示,不同的CEX膜具有不同的庆大霉素结合量和穿透曲线。对于除去庆大霉素而言,Natrix S(具有更高的结合量和渐增穿透)是更有效的膜。此外,通过结合更高水平的庆大霉素,期望置换更多的mAb,导致了更高产率的操作。
CEX树脂和强结合氨基糖苷类抗生素的作用
为了测定强结合杂质如庆大霉素对CEX树脂填充柱的影响,设计了一系列的实验,在有和没有CEX膜保护柱的情况下测试两种模式进料流。图11显示了各个实验、抗体和杂质浓度,以及进行这些实验所需的步骤。
首先,使用掺入了mAb 3UF/DF池和多种水平庆大霉素的PBS模式进料流,通过产生穿透曲线测试Fractogel SE Hicap树脂的抗体结合量。先用1.0M乙酸将PBS调整至pH 5.0,然后用PW调整至8.0mS/cm的电导率。将UF/DF池掺入到调整过的缓冲液中,以达到大约1.6mg/mL的mAb浓度。
对于进行的每一层析实验,在用期望的进料流装载之前,首先用pH 5的25mM乙酸钠平衡Fractogel SE Hicap。装载后,用pH 5.5的50mM乙酸钠、pH 7.7的25mM HEPES、pH5.5的50mM乙酸钠洗涤柱子,用pH 5.5的350mM乙酸钠洗脱,使用1M NaCl和0.5N NaOH再生,然后储存在0.1N NaOH中直到下次使用柱子。
在没有掺入庆大霉素的情况下,进行了第一实验,并显示出108g/L的抗体DBC。接下来,在添加了24,100mg/mL的终浓度的庆大霉素的情况下进行上述调整和掺入。该实验显示抗体DBC减少至89g/L。使用30,500的庆大霉素浓度重复该条件,并计算出了88g/L的抗体DBC。该数据显示使用PBS模式系统纯化的抗体和不同水平的庆大霉素,庆大霉素的存在使抗体DBC在Fractogel SE Hicap树脂上从108mg/mL减少到大约88g/L。
接下来,使用收获的含大约0.9mg/mL mAb 3、24,100-30,000ng/mL庆大霉素和408,000ng/mL CHOP的细胞培养液(HCCF)进行两个实验。使用在庆大霉素水平上与模式进料流一致的HCCF,抗体DBC为68和71g/L。对于模式进料流DBC为88和89g/L与使用HCCF得到的DBC为68和71g/L之间的差异,可能的解释是进料流中高水平CHOP的存在。
图12显示了上述实验的全部抗体穿透曲线,以及进料流的杂质水平和大约的DBC。还可以以随机顺序进行该运行,以避免柱子的可能降解或者庆大霉素在运行与运行之间的遗留(carryover)。实验的顺序在图12所附的表中列出。在实验顺序和抗体DBC之间不存在相关性,因此柱子不可能降解或者庆大霉素的遗留不可能影响后续运行。
最后,已知进料流中存在的庆大霉素在柱DBC中显示出显著的减少,并且CEX膜能结合庆大霉素而不结合显著水平的抗体,进行了两个实验以测试CEX膜是否能保护并改进CEX树脂的性能。由于相对于MustangTMS,Natrix S显示出对庆大霉素的提高的结合量,所以将其用于保护Fractogel SE Hicap。解冻2L HCCF,用2M乙酸调整至pH 5,用PW调整至8mS/cm,并离线无菌过滤,以除去冻融对进料流的任何影响。对于调整过的且过滤的进料流,将装载液分成两部分,将一部分装载在柱子上,用0.75mL Natrix S处理另一部分,然后将其装载在Fractogel SE Hicap上。在两种柱装载期间,取得了15mL级分,每一级分大约60个样品。分析了调整过的HCCF、Natrix流通液和Fractogel SE Hicap级分中的抗体和庆大霉素浓度。图13中显示了得到的HCCF和Natrix流通进料流抗体和杂质浓度,以及得到的Fractogel SE Hicap穿透曲线。得到的数据显示,Natrix将调整过的HCCF中的庆大霉素水平成功地从24,100ng/mL降低至了870ng/mL。CHOP水平从408,000ng/mL稍微减少到了328,000ng/mL。与调整过的0.88mg/mL的HCCF浓度比较,抗体浓度稍低(0.83mg/mL),显示的产率为约94%。最后,得到的CEX柱穿透曲线显示,使用调整过的HCCF,柱子具有72g/L的抗体DBC,并且使用Natrix流通液具有94g/L的抗体DBC。这表明在装载于CEX柱之前,通过将含庆大霉素的进料流通过CEX膜大约增加了30%的DBC。
CEX膜ECP和PEI穿透
为了测试在其他杂质如ECP或PEI存在的情况下,使用CEX膜是否可以观察到相似的性能,使用单价抗体1A蛋白池和0.23mL Natrix S膜进行了实验。使用1.5M TRIS碱已经预先将A蛋白池调整至pH 6.7,并使用PW将其稀释至2.5mS/cm的电导率。将具有4.7g/L抗体浓度、130ug/mL PEI和8,870ng/mL ECP的装载液装载在平衡的Natrix S上,并获取针对10个样品的2mL流通级分,以及针对12个样品的5mL级分。然后分析流通级分中的抗体、PEI和ECP浓度,然后将所述浓度用于产生相对于膜抗体装载密度的C/C0。图14显示,抗体和ECP以大约123mg/mL穿透CEX膜。由于定量的PEI水平为30ug/mL,所以最先的一些样品都处于或者低于该水平,同时图14显示C/C0值为0.23,这是因为这些样品中存在的PEI浓度是未知的。不考虑0.23的PEI水平,PEI以330mg/mL穿透,比抗体和ECP明显更晚。这些结果表明,在无不利地影响抗体产率的情况下,CEX膜在除去离子聚合物中也是有效的。
CEX树脂和强结合离子聚合物的作用
为了测定强结合杂质如PEI对CEX树脂的填充柱具有何种影响,进行了一系列实验来评价多肽1萃取期间所使用的PEI的水平,及其对SP Sepharose Fast Flow柱的影响。由于对于该产物,进料流的杂质更多,所以不可能定量柱子上的PEI水平,相反,记录了萃取期间所使用的PEI的水平。
对于这些实验,用0.75至1.05%不同水平的PEI调整萃取的产物,用PW稀释,并离心以产生4个浓缩的样品。然后将大约pH 7.0和8.0mS/cm的每一浓缩样品装载在SPSepharose Fast Flow柱上,其中收集流通样品并分析其中的多肽浓度。将得到的数据用于产生以树脂多肽装载密度为函数的C/C0图。图15显示了所测试的每一浓缩物的穿透曲线,以及柱子的相应DBC。如表中所示,随着萃取处理期间PEI%增加,柱子的DBC是减少的。
此外,在使用多肽1进行的第二组实验中,将具有不同PEI%的浓缩物装载在SPSepharose Fast Flow柱上,其中对于每一实验,随后洗涤并洗脱柱子。分析每一实验得到的池中的多肽浓度、ECP,并通过大小排阻层析分析产物大小。图16显示在萃取期间使用增加的%水平的PEI产生的池导致步骤产率的降低,并且该池增加了杂质如ECP、产物聚集体或二聚体的水平。
尽管在实验中没有在该CEX柱之前使用CEX膜,但从之前的实验已知Natrix S可以结合PEI,并且观察到CEX柱降低的性能是PEI%的函数,所以可以推断,在该进料流上使用CEX膜不仅可以提高柱子的结合量,还可以改善得到的池。
结论
在引起蛋白质结合的pH和电导率下,显示离子交换膜可以有效地除去杂质。通过运行过载层析并促进杂质和目的蛋白之间的竞争吸附,在达到1000-5000g/Lm的装载密度后,产率显示为≥96%。显示阳离子交换膜结合并显著降低膜流通级分中的杂质如CHOP和庆大霉素,其中装载密度为16,000g/Lm时,C/C0值<0.2。使用更粗制的含高分子量种类、二聚体、低分子量种类、庆大霉素和CHOP的进料流,相对于抗体,阳离子交换膜还显示出对某些杂质的选择性结合。在这些研究中,显示这些杂质可以以不同的强度结合,增加膜装载密度显示出杂质的持续结合而抗体与膜结合减少,并且小分子量、带电荷多的种类如庆大霉素比竞争种类结合更强。此外,通过使用含庆大霉素的缓冲液从阳离子交换膜上洗脱抗体证实发生了竞争吸附和顶替层析。两种阳离子交换膜,MustangTMS和Natrix S对庆大霉素分别显示出4.4-8.9g/Lm和50g/Lm的动态结合结合量。Natrix S的穿透曲线也显示比MustangTMS更平缓(gradual)。设计的Natrix S比常规膜具有更高的结合量,并且这种特性以及逐渐穿透使得Natrix S非常适合用于清除杂质。
在庆大霉素存在的情况下,阳离子交换树脂显示出不同的动态结合量,其中随着进料流中庆大霉素浓度的增加,DBC是减少的。使用含0至30,500ng/mg庆大霉素的模式进料流,Fractogel SE Hicap柱的DBC从108g/L减少到了88g/L。使用代表性进料流,FractogelSE Hicap显示出68-71g/L的DBC。当阳离子交换膜能将进料流中的庆大霉素浓度从24,100ng/mg减少到870ng/mg庆大霉素,并且产量为94%时,证实了阳离子交换膜的有效性。当与72g/L直接比较时,庆大霉素浓度降低的进料流能够使Fractogel SE Hicap具有94g/L的DBC。与庆大霉素相似,在单价抗体和ECP存在的情况下,阳离子交换膜显示出结合高度带电荷的离子聚合物如PEI。最后,随着PEI浓度增加,阳离子交换树脂显示出受进料流中不同PEI浓度的负面影响,导致降低的动态结合量以及增加的池杂质。随着PEI在上游从0.75%增加到1.05%,SP Sepharose Fast Flow柱显示出从51g/L减少到36g/L。在单独的研究中,随着上游所使用的PEI浓度从0.6%增加到1.1%,步骤产率从96%减少到70%,ECP从155ng/mg增加到904ng/mg,聚集体从2.5%增加到17.3%,并且二聚体从3.7%增加到5.9%。没有测试在SP Sepharose Fast Flow柱之前使用阳离子交换膜,但已知该柱子受PEI负面影响,而膜可以有效结合PEI,合适大小的膜可以降低柱子上的PEI%,导致更高的结合量和产率,并且还降低池杂质浓度。
更好的纯化技术不断涌现。研发了更高结合量的离子交换树脂,有可能是由于降低了运行成本,将所述离子交换树脂用作A蛋白亲和树脂的备选。然而,当用于进料流时,上述离子交换树脂增加了杂质水平或者在下游应用中通常不会注意到的杂质如庆大霉素或PEI,所以它们的真实有效性可能降低。在该离子交换树脂之前使用离子交换膜可以通过减少装载在柱子上的杂质来保护柱子。这导致了对柱子的一些改进,例如更高的动态结合量、增加的步骤产率或者降低了池杂质浓度。通过选择具有足够杂质结合量、体积和渗透性的合适膜,可以连续地运行两个步骤,这进一步降低了运行时间以及最终的纯化处理费用。
认为前述书面说明足以使本领域技术人员实施本发明。本发明并不局限于所保藏的构建体,因为保藏的实施方案意为本发明某些方面的单独说明,并且在功能上等同的任何构建体包含在本发明范围中。本文的材料的保藏物并不承认本文包含的书面描述不足以实施本发明的任何方面,包括其最佳实施方式,也不是视为将权利要求的范围限制到其表示的具体说明。事实上,对于本领域技术人员而言,从前述说明中可知,除本文中显示和描述的修改外,本发明的其他的多种修改是显而易见的,并且也落入所附权利要求的范围中。
Claims (35)
1.提高用于纯化蛋白质的下游层析步骤的效率的方法,其包括:
a.在包含缓冲液的操作条件下,使包含目的多肽和多种污染物的组合物通过离子交换膜,其中所述多肽和膜具有相反的电荷,所述缓冲液具有足以与所述多肽的pI区分开来以增加所述多肽的电荷的pH和有效防止缓冲液离子屏蔽电荷的低离子强度,所述操作条件导致所述膜与所述多肽以及至少一种污染物结合;
b.过载所述离子交换膜,以使所述至少一种污染物仍与膜结合,而所述目的多肽主要在流出物中;
c.从所述离子交换膜收集包含所述目的多肽的流出物;
d.使包含所述目的多肽的膜流出物进行与前述膜带相似电荷的离子交换层析步骤,和
e.从带电荷的离子交换层析步骤的流出物中回收纯化的多肽。
2.权利要求1的方法,其中所述离子交换膜具有0.1至100μm的孔径。
3.权利要求1的方法,其中用单块过滤器或厚度过滤器替换所述离子交换膜。
4.提高用于蛋白质纯化的下游层析步骤的效率的方法,其包括:
(a)在包含缓冲液的操作条件下,使包含目的多肽和多种污染物的组合物通过阳离子交换膜,其中所述多肽和膜具有相反的电荷,所述缓冲液具有低于所述多肽pI约1至约5个pH单位的pH和≤约40mS/cm的电导率,所述操作条件导致所述膜与所述多肽以及至少一种污染物结合;
b.过载所述阳离子交换膜,以使所述至少一种污染物仍与所述膜结合,而所述目的多肽主要在流出物中;
c.从所述阳离子交换膜收集包含所述目的多肽的流出物;
d.使包含所述目的多肽的膜流出物进行阳离子交换层析纯化步骤,和
e.从所述阳离子交换层析纯化步骤的流出物中回收纯化的多肽。
5.权利要求4的方法,其中所述pH低于所述多肽的pI约1至约4个pH单位。
6.权利要求4的方法,其中所述pH低于所述多肽的pI约1至约3个pH单位。
7.权利要求4的方法,其中所述pH低于所述多肽的pI约1至2个pH单位。
8.权利要求4的方法,其中所述pH对于所述多肽的pI约1个pH单位。
9.权利要求4的方法,其中所述电导率为≤约20mS/cm。
10.权利要求4的方法,其中所述电导率为≤约10mS/cm。
11.权利要求4的方法,其中所述阳离子交换膜是阳离子交换单块过滤器或厚度过滤器。
12.提高用于蛋白质纯化的下游层析步骤的效率的方法,其包括:
(a)在包含缓冲液的操作条件下,使包含目的多肽和多种污染物的组合物通过阴离子交换膜,其中所述多肽和膜具有相反的电荷,所述缓冲液具有高于所述多肽pI约1至约5个pH单位的pH和≤约40mS/cm的电导率,所述操作条件导致所述膜与多肽以及至少一种污染物结合;
b.过载所述阴离子交换膜,以使所述至少一种污染物仍与膜结合,而所述目的多肽主要在流出物中;
c.从所述阴离子交换膜收集包含所述目的多肽的流出物;
d.使包含所述目的多肽的膜流出物进行阴离子交换层析纯化步骤,和
e.从所述阴离子交换层析纯化步骤的流出物中回收纯化的多肽。
13.权利要求12的方法,其中所述pH高于所述多肽的pI约1至约4个pH单位。
14.权利要求12的方法,其中所述pH高于所述多肽的pI约1至约3个pH单位。
15.权利要求12的方法,其中所述pH高于所述多肽的pI约1至约2个pH单位。
16.权利要求12的方法,其中所述pH高于所述多肽的pI约1个pH单位。
17.权利要求12的方法,其中所述电导率为≤约20mS/cm。
18.权利要求12的方法,其中所述电导率为≤约10mS/cm。
19.权利要求12的方法,其中用阴离子交换单块过滤器或厚度过滤器替换所述阴离子交换膜。
20.权利要求1至19中任一项的方法,其中所述膜是混合模式的吸附器。
21.权利要求1至20中任一项的方法,其中所述污染物是宿主细胞蛋白。
22.权利要求21的方法,其中所述宿主细胞蛋白是中国仓鼠卵巢蛋白(CHOP)。
23.权利要求21的方法,其中所述宿主细胞蛋白是大肠杆菌蛋白(ECP)。
24.权利要求1至20中任一项的方法,其中所述污染物是氨基糖苷类抗生素。
25.权利要求24的方法,其中所述氨基糖苷类抗生素是庆大霉素。
26.权利要求1至20中任一项的方法,其中所述污染物是离子聚合物。
27.权利要求26的方法,其中所述离子聚合物是聚乙烯亚胺(PEI)。
28.权利要求1至20中任一项的方法,其中所述多肽包含CH2/CH3区。
29.权利要求28的方法,其中所述多肽是抗体。
30.权利要求29的方法,其中所述抗体是单克隆抗体。
31.权利要求1至30中任一项的方法,其中另外的纯化步骤包括离子交换层析。
32.权利要求1至30中任一项的方法,其中另外的纯化步骤在所述步骤a至e期间连续进行,所述纯化步骤是离子交换层析。
33.权利要求31或32的方法,其中所述离子交换层析包含阳离子交换柱。
34.权利要求31或32的方法,其中所述离子交换层析包含阴离子交换柱。
35.权利要求1至34中任一项的方法,其进一步包括将所述纯化的多肽与可药用载体组合来制备药物组合物。
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WO (1) | WO2013096322A1 (zh) |
ZA (2) | ZA201404593B (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116371011A (zh) * | 2023-05-26 | 2023-07-04 | 湖南杰萃生物技术有限公司 | 一种从桑叶中提取黄酮和生物碱的方法 |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
BR112014015101A8 (pt) * | 2011-12-22 | 2021-06-08 | Genentech Inc | métodos para intensificar eficiência de etapas de cromatografia a jusante para purificação de anticorpos |
WO2015088677A1 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-18 | Emd Millipore Corporation | Protein separations using an acrylamide containing filter |
RU2714967C2 (ru) * | 2013-12-27 | 2020-02-21 | Чугаи Сейяку Кабусики Кайся | Способ очистки антител с низкой изоэлектрической точкой |
CN104693303B (zh) * | 2015-02-28 | 2018-03-13 | 苏州金盟生物技术有限公司 | 一种蛋白制品中的核酸去除方法 |
JP6889149B2 (ja) | 2015-08-13 | 2021-06-18 | アムジエン・インコーポレーテツド | 抗原結合タンパク質の荷電深層ろ過 |
GB201711481D0 (en) | 2017-07-17 | 2017-08-30 | Ucb Biopharma Sprl | Protein purification |
EP3546475A1 (en) * | 2018-03-27 | 2019-10-02 | Sanofi | Full flow-through process for purifying recombinant proteins |
US10792618B2 (en) | 2018-06-19 | 2020-10-06 | Sartorius Stedim Biotech Gmbh | Particle separation and/or purification of a fluid |
GB201815405D0 (en) * | 2018-09-21 | 2018-11-07 | Fujifilm Mfg Europe Bv | Membranes suitable for detecting, filtering and/or purifying biomolecules |
EP3899526B1 (en) * | 2018-12-21 | 2024-05-01 | Solventum Intellectual Properties Company | Method for testing a chromatography device used for ion exchange |
TW202112799A (zh) * | 2019-06-05 | 2021-04-01 | 美商建南德克公司 | 過載層析管柱之再生方法 |
US11416468B2 (en) * | 2020-07-21 | 2022-08-16 | International Business Machines Corporation | Active-active system index management |
CN117866038B (zh) * | 2024-03-11 | 2024-05-28 | 北京百力格生物科技有限公司 | 纯化含有宿主核酸的带亲和标签的酸性蛋白的方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0313343A1 (en) * | 1987-10-23 | 1989-04-26 | Schering Corporation | Method of purifying protein |
WO1997027757A1 (en) * | 1996-01-31 | 1997-08-07 | John Stephen Ayers | Production of an immunoglobulin enriched fraction from whey protein solutions |
CN1439649A (zh) * | 2003-04-07 | 2003-09-03 | 中国科学院生态环境研究中心 | 高效离子交换膜色谱纯化卵黄蛋白原技术 |
CN102149724A (zh) * | 2008-08-14 | 2011-08-10 | 健泰科生物技术公司 | 使用原地蛋白质置换离子交换膜层析清除污染物的方法 |
Family Cites Families (75)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE266710C (zh) | ||||
US3773919A (en) | 1969-10-23 | 1973-11-20 | Du Pont | Polylactide-drug mixtures |
USRE30985E (en) | 1978-01-01 | 1982-06-29 | Serum-free cell culture media | |
US4515893A (en) | 1979-04-26 | 1985-05-07 | Ortho Pharmaceutical Corporation | Hybrid cell line for producing complement-fixing monoclonal antibody to human T cells |
US4560655A (en) | 1982-12-16 | 1985-12-24 | Immunex Corporation | Serum-free cell culture medium and process for making same |
US4657866A (en) | 1982-12-21 | 1987-04-14 | Sudhir Kumar | Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
DD266710A3 (de) | 1983-06-06 | 1989-04-12 | Ve Forschungszentrum Biotechnologie | Verfahren zur biotechnischen Herstellung van alkalischer Phosphatase |
US4767704A (en) | 1983-10-07 | 1988-08-30 | Columbia University In The City Of New York | Protein-free culture medium |
JPS6150925A (ja) | 1984-08-17 | 1986-03-13 | Toray Ind Inc | 抗原または抗体の精製方法 |
US4879231A (en) | 1984-10-30 | 1989-11-07 | Phillips Petroleum Company | Transformation of yeasts of the genus pichia |
GB8516415D0 (en) | 1985-06-28 | 1985-07-31 | Celltech Ltd | Culture of animal cells |
US5091178A (en) | 1986-02-21 | 1992-02-25 | Oncogen | Tumor therapy with biologically active anti-tumor antibodies |
US4927762A (en) | 1986-04-01 | 1990-05-22 | Cell Enterprises, Inc. | Cell culture medium with antioxidant |
GB8610600D0 (en) | 1986-04-30 | 1986-06-04 | Novo Industri As | Transformation of trichoderma |
IL85035A0 (en) | 1987-01-08 | 1988-06-30 | Int Genetic Eng | Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same |
US5091313A (en) | 1988-08-05 | 1992-02-25 | Tanox Biosystems, Inc. | Antigenic epitopes of IgE present on B cell but not basophil surface |
US5720937A (en) | 1988-01-12 | 1998-02-24 | Genentech, Inc. | In vivo tumor detection assay |
EP0420937B1 (en) | 1988-06-21 | 1994-11-09 | Genentech, Inc. | Therapeutic compositions for the treatment of myocardial infarction |
EP0435911B1 (en) | 1988-09-23 | 1996-03-13 | Cetus Oncology Corporation | Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression |
US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
JP2844346B2 (ja) | 1989-05-31 | 1999-01-06 | 昭 梶 | 新規ペプチドならびに新規dna |
EP0402226A1 (en) | 1989-06-06 | 1990-12-12 | Institut National De La Recherche Agronomique | Transformation vectors for yeast yarrowia |
DE3920358A1 (de) | 1989-06-22 | 1991-01-17 | Behringwerke Ag | Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung |
US5122469A (en) | 1990-10-03 | 1992-06-16 | Genentech, Inc. | Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins |
ES2193136T3 (es) | 1991-08-14 | 2003-11-01 | Genentech Inc | Variantes de inmunoglubina para receptores especificos de fc epsilon. |
ES2241710T3 (es) | 1991-11-25 | 2005-11-01 | Enzon, Inc. | Procedimiento para producir proteinas multivalentes de union a antigeno. |
EP0625200B1 (en) | 1992-02-06 | 2005-05-11 | Chiron Corporation | Biosynthetic binding protein for cancer marker |
MX9305070A (es) | 1992-08-21 | 1994-04-29 | Genentech Inc | Compocicion farmaceutica que contiene un antagonista de lfa-1 para el tratamiento de transtornos o desordenes mediados por el lfa-1 |
US5736137A (en) | 1992-11-13 | 1998-04-07 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma |
US5595721A (en) | 1993-09-16 | 1997-01-21 | Coulter Pharmaceutical, Inc. | Radioimmunotherapy of lymphoma using anti-CD20 |
DE69416103T2 (de) * | 1993-09-21 | 1999-08-05 | Hemosol Inc | Verdrängungschromatographisches verfahren und gereinigtes hämoglobin |
ATE157455T1 (de) | 1993-12-10 | 1997-09-15 | Genentech Inc | Methoden zur diagnose von allergie und prüfung anti-allergischer therapeutika |
EP0739214B1 (en) | 1994-01-18 | 1998-03-18 | Genentech, Inc. | A METHOD OF TREATMENT OF PARASITIC INFECTION USING IgE ANTAGONISTS |
EP0749488A1 (en) | 1994-03-03 | 1996-12-27 | Genentech, Inc. | Anti-il-8 monoclonal antibodies for treatment of inflammatory disorders |
US5534615A (en) | 1994-04-25 | 1996-07-09 | Genentech, Inc. | Cardiac hypertrophy factor and uses therefor |
IL117645A (en) | 1995-03-30 | 2005-08-31 | Genentech Inc | Vascular endothelial cell growth factor antagonists for use as medicaments in the treatment of age-related macular degeneration |
US5641870A (en) | 1995-04-20 | 1997-06-24 | Genentech, Inc. | Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification |
AU6267896A (en) | 1995-06-07 | 1996-12-30 | Imclone Systems Incorporated | Antibody and antibody fragments for inhibiting the growth oftumors |
DK0877626T3 (da) | 1996-01-23 | 2002-12-30 | Univ Vermont | Anti-CD18 antistoffer til anvendelse mod slagtilfælde |
US7147851B1 (en) | 1996-08-15 | 2006-12-12 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Humanized immunoglobulin reactive with α4β7 integrin |
DK1516629T3 (da) | 1996-11-27 | 2013-06-03 | Genentech Inc | Humaniseret anti-CD-11a antibodies |
AU743758B2 (en) | 1997-04-07 | 2002-02-07 | Genentech Inc. | Anti-VEGF antibodies |
ES2293682T5 (es) | 1997-05-15 | 2011-11-17 | Genentech, Inc. | Anticuerpo anti-apo2. |
US6054293A (en) | 1997-07-08 | 2000-04-25 | The Regents Of The University Of California | Semaphorin receptors |
US6946129B1 (en) | 1999-06-08 | 2005-09-20 | Seattle Genetics, Inc. | Recombinant anti-CD40 antibody and uses thereof |
ES2329437T3 (es) | 1999-06-25 | 2009-11-26 | Genentech, Inc. | Anticuerpos anti-erbb2 humanizados y tratamiento con anticuerpos anti-erbb2. |
BR0015224A (pt) | 1999-10-29 | 2002-07-09 | Genentech Inc | Anticorpo anti-antìgeno de célula estaminal prostática (psca) isolado, anticorpo monoclonal anti-psca, ácido nucleico isolado, vetor de expressão, célula, célula hospedeira, método de produção de anticorpo, composição método in vitro para matar uma célula cancerosa que expresse psca, uso de uma anticorpo monoclonal anti-psca e artigo industrializado |
US20020012982A1 (en) | 2000-07-13 | 2002-01-31 | Invitrogen Corporation | Methods and compositions for rapid protein and peptide extraction and isolation using a lysis matrix |
UA83458C2 (uk) | 2000-09-18 | 2008-07-25 | Байоджен Айдек Ма Інк. | Виділений поліпептид baff-r (рецептор фактора активації в-клітин сімейства tnf) |
US7321026B2 (en) | 2001-06-27 | 2008-01-22 | Skytech Technology Limited | Framework-patched immunoglobulins |
WO2003025156A2 (en) | 2001-09-18 | 2003-03-27 | Affinium Pharmaceuticals, Inc. | Methods and apparatuses for purification |
AU2002332130A1 (en) | 2001-10-16 | 2003-04-28 | Exelixis, Inc. | Msrebps as modifiers of the srebp pathway and methods of use |
AU2002351495A1 (en) | 2001-10-17 | 2003-04-28 | Human Genome Sciences, Inc. | Neutrokine-alpha and neutrokine-alpha splice variant |
US20040093621A1 (en) | 2001-12-25 | 2004-05-13 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd | Antibody composition which specifically binds to CD20 |
CA2476166C (en) | 2002-02-14 | 2011-11-15 | Immunomedics, Inc. | Anti-cd20 antibodies and fusion proteins thereof and methods of use |
ES2744275T3 (es) | 2002-10-17 | 2020-02-24 | Genmab As | Anticuerpos monoclonales humanos contra CD20 para su uso en el tratamiento de esclerosis múltiple |
SI1572744T1 (sl) | 2002-12-16 | 2010-09-30 | Genentech Inc | Imunoglobulinske variante in njihove uporabe |
AU2004252067B2 (en) | 2003-05-09 | 2012-04-12 | Duke University | CD20-specific antibodies and methods of employing same |
AR044388A1 (es) | 2003-05-20 | 2005-09-07 | Applied Molecular Evolution | Moleculas de union a cd20 |
WO2005014618A2 (en) | 2003-08-08 | 2005-02-17 | Immunomedics, Inc. | Bispecific antibodies for inducing apoptosis of tumor and diseased cells |
US8147832B2 (en) | 2003-08-14 | 2012-04-03 | Merck Patent Gmbh | CD20-binding polypeptide compositions and methods |
US20080274501A1 (en) * | 2007-05-02 | 2008-11-06 | Chenming Zhang | Method of purifying acidic proteins expressed in plants |
US9433922B2 (en) | 2007-08-14 | 2016-09-06 | Emd Millipore Corporation | Media for membrane ion exchange chromatography based on polymeric primary amines, sorption device containing that media, and chromatography scheme and purification method using the same |
CA2703086C (en) | 2007-10-26 | 2014-11-25 | Asahi Kasei Chemicals Corporation | Method for purifying protein |
PL2840090T3 (pl) | 2007-10-30 | 2018-07-31 | Genentech, Inc. | Oczyszczanie przeciwciał za pomocą chromatografii kationowymiennej |
WO2009135656A1 (en) * | 2008-05-06 | 2009-11-12 | Lonza Biologics Plc. | A method for the purification of antibodies using displacement chromatography |
GB0816242D0 (en) | 2008-09-05 | 2008-10-15 | Immunobiology Ltd | Method of purifying protien complexes |
MX346115B (es) | 2009-08-06 | 2017-03-08 | Genentech Inc * | Metodo para mejorar la eliminación de virus en la purificacion proteica. |
WO2011028753A1 (en) * | 2009-09-01 | 2011-03-10 | Genentech, Inc. | Enhanced protein purification through a modified protein a elution |
ES2617777T5 (es) * | 2010-04-23 | 2022-10-13 | Hoffmann La Roche | Producción de proteínas heteromultiméricas |
SG10201710439UA (en) * | 2010-05-25 | 2018-01-30 | Genentech Inc | Methods of purifying polypeptides |
CA2850765A1 (en) * | 2011-10-03 | 2013-04-11 | Sachem, Inc. | Anionic displacer molecules for hydrophobic displacement chromatography |
BR112014015101A8 (pt) * | 2011-12-22 | 2021-06-08 | Genentech Inc | métodos para intensificar eficiência de etapas de cromatografia a jusante para purificação de anticorpos |
WO2015198451A1 (ja) | 2014-06-26 | 2015-12-30 | 楽天株式会社 | 情報処理装置、情報処理方法及び情報処理プログラム |
-
2012
- 2012-12-18 BR BR112014015101A patent/BR112014015101A8/pt not_active Application Discontinuation
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-
2014
- 2014-06-16 IL IL233158A patent/IL233158B/en active IP Right Grant
- 2014-06-20 MX MX2018013356A patent/MX2018013356A/es unknown
- 2014-06-23 ZA ZA2014/04593A patent/ZA201404593B/en unknown
-
2015
- 2015-04-27 HK HK15104046.9A patent/HK1203526A1/zh unknown
-
2018
- 2018-01-10 AU AU2018200194A patent/AU2018200194B2/en active Active
- 2018-02-13 JP JP2018023128A patent/JP2018109024A/ja not_active Withdrawn
- 2018-11-05 HR HRP20181846TT patent/HRP20181846T1/hr unknown
-
2019
- 2019-06-06 US US16/433,763 patent/US11945837B2/en active Active
- 2019-06-20 ZA ZA2019/03994A patent/ZA201903994B/en unknown
- 2019-10-24 JP JP2019193276A patent/JP7402011B2/ja active Active
-
2020
- 2020-02-14 AU AU2020201070A patent/AU2020201070A1/en not_active Abandoned
-
2021
- 2021-06-22 JP JP2021102974A patent/JP7359807B2/ja active Active
-
2022
- 2022-03-25 JP JP2022050501A patent/JP2022101557A/ja active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0313343A1 (en) * | 1987-10-23 | 1989-04-26 | Schering Corporation | Method of purifying protein |
WO1997027757A1 (en) * | 1996-01-31 | 1997-08-07 | John Stephen Ayers | Production of an immunoglobulin enriched fraction from whey protein solutions |
CN1439649A (zh) * | 2003-04-07 | 2003-09-03 | 中国科学院生态环境研究中心 | 高效离子交换膜色谱纯化卵黄蛋白原技术 |
CN102149724A (zh) * | 2008-08-14 | 2011-08-10 | 健泰科生物技术公司 | 使用原地蛋白质置换离子交换膜层析清除污染物的方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
侯率: "重组蛋白A的分离纯化工艺研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116371011A (zh) * | 2023-05-26 | 2023-07-04 | 湖南杰萃生物技术有限公司 | 一种从桑叶中提取黄酮和生物碱的方法 |
CN116371011B (zh) * | 2023-05-26 | 2023-08-18 | 湖南杰萃生物技术有限公司 | 一种从桑叶中提取黄酮和生物碱的方法 |
Also Published As
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Publication | Publication Date | Title |
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