KR20210025692A - 이온 교환 막 크로마토그래피 - Google Patents

Abstract

(a) 관심의 폴리펩티드 및 다양한 오염물들을 포함하는 조성물을 이온 교환 막을 통해 통과시키는 단계 (상기 폴리펩티드 및 막은 폴리펩티드의 전하를 증진시키기 위해 폴리펩티드의 pI와 충분히 구별되는 pH 및 완충액 이온들에 의해 전하들의 차폐를 방지하기에 효과적인 낮은 이온 강도를 갖는 완충액으로 구성된 작동 조건들에서 반대 전하를 갖음으로써 상기 막이 폴리펩티드 및 적어도 하나의 오염물에 결합하도록 유발함); (b) 관심의 폴리펩티드가 주로 유출물 중에 존재하는 동안 적어도 하나의 오염물이 남아 상기 막에 결합하도록 상기 이온 교환 막을 과부화시키는 단계; (c) 관심의 폴리펩티드를 포함하는 상기 이온 교환 막으로부터 유출물을 수집하는 단계; (d) 상기 관심의 폴리펩티드를 포함하는 막 유출물을 이전의 막과 유사한 전하의 정제 단계에 적용시키는 단계, 및 (e) 상기 하전된 이온 교환 크로마토그래피 정제 단계의 유출물로부터 정제된 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 단백질들의 정제를 위한 다운스트림 크로마토그래피 단계들의 효율을 증진시키는 방법들이 개시되어 있다.

Description

이온 교환 막 크로마토그래피{ION EXCHANGE MEMBRANE CHROMATOGRAPHY}

본 발명은 일반적으로 단백질 정제에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 업스트림 이온 교환 막 크로마토그래피의 사용을 통해 불순물들을 제거하기 위해 다운스트림 정제 단계들의 성능을 개선시키기 위한 방법들에 관한 것이다.

단백질들의 대규모의 경제적 정제는 생명 공학 산업을 위한 점점 더 중요한 문제이다. 일반적으로, 단백질들은 그 단백질을 위한 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드의 삽입에 의해 관심있는 단백질을 생산하도록 조작된 진핵 또는 원핵 세포주들을 사용하는 세포 배양에 의해 생산된다. 이들 세포들은 일반적으로 동물 혈청의 제제들로부터 공급되는 당들, 아미노산들 및 성장 인자들을 함유하는 복합 성장 배지에 의해 공급되어야 한다. 세포들에 공급된 화합물들의 혼합물로부터 및 세포들 자체의 부산물로부터 인간 치료용으로 사용하기에 충분한 순도에 이르는 단백질의 분리는 강력한 도전을 제기한다.

세포 파편으로부터 단백질들의 정제를 위한 절차들은 초기에 주어진 단백질에 대한 발현 메커니즘에 좌우된다 일부 단백질들은 세포로부터 주변 성장 배지 내로 직접적으로 분비되게 하는 원인이 될 수 있고; 다른 단백질들은 세포 내에서 만들어진다. 후자 단백질들에 대해, 정제 과정의 제1 단계는 세포의 용균을 포함하는데, 이는 기계적 전단, 삼투압 충격 또는 효소적 처치들을 포함하는 다양한 방법들에 의해 수행될 수 있다. 그러한 분열은 세포의 전체 내용물들을 균질물 내로 방출하고, 또한 이들의 작은 크기로 인해 제거하기 곤란한 준세포 분획들을 생산한다. 이들은 일반적으로 차동 원심 분리 또는 여과에 의해 제거된다. 비록 소규모이지만, 세포들의 자연 사멸 및 단백질 생산 실행 과정에서 세포내 숙주 세포 단백질들의 방출로 인해 직접적으로 분비된 단백질들에 의해 동일한 문제가 발생한다.

큰 세포 파편 성분들 없이 흥미있는 단백질을 함유하는 정제된 용액이 일단 수득되면, 세포에 의해 생산된 나머지 다른 단백질들로부터 그의 분리는 일반적으로 다른 크로마토그래피 기술들의 조합을 사용하여 시도된다. 이들 기술들은 단백질들의 혼합물들 및 다른 불순물들을 이들의 전하, 소수성의 정도 또는 크기에 기초하여 분리한다. 여러 가지 상이한 크로마토그래피 수지들이 이들 기술들 각각을 위해 이용될 수 있고, 연관된 특정 단백질들에 대한 정제 도식의 정확한 맞춤을 허용한다. 이들 분리 방법들의 각각의 본질은 단백질들이 긴 컬럼 아래로 상이한 속도로 이동하여 그것들이 컬럼 아래로 더 통과할 때 증가하는 물리적 분리를 달성하거나, 또는 상이한 용매들 또는 디스플레이서들에 의해 차별적으로 용출되거나 또는 대체되는 분리 매질에 선택적으로 부착되는 원인이 될 수 있다는 것이다. 일부 경우들에서, 목적하는 단백질은 불순물들이 특히 컬럼에 부착될 때 불순물들로부터 분리되고, 관심의 단백질은 그렇지 않고, 즉 관심의 단백질은 "흐름을 통해" 존재한다. 단백질 정제에 관한 출판물들은 하기를 포함한다: Fahrner 등의 Biotechnol Genet Eng Rev. 2001;18:301-27.

항체들을 위한 일반적인 대규모 정제 공정은 종종 다른 컬럼 작업들과 조합된 주요 캡처 및 정제 단계로서 고정된 단백질 A의 고용 주위에 구축되어 있다. 단백질 A는 IgG의 Fc 영역에 대한 친화도를 갖는 황색 포도상구균로부터 세포벽 단백질이다. 이러한 이유 때문에, 그것은 IgG 정제를 위해 광범위하게 사용된다. 단백질 A 컬럼 오퍼레이션들은 일반적으로 불순물들이 통과액 분획 중에서 세척되는 대부분의 공정에 의해 98%를 초과하는 생성물-관련된 순도를 전달한다. 그러나, 단백질 A 크로마토그래피의 사용에 대한 수많은 단점들이 있다. 먼저, 결합은 일반적으로 중성 내지 약한 염기성 pH에서 이루어지고 용출은 일반적으로 산성 pH에서 이루어진다. 잠재적인 문제들 중의 하나는 낮은 pH가 IgG를 변성시키거나 또는 부분적으로 변성시킬 수 있다는 것이다. 이것 및 임상 용도들에 요구되는 높은 제품 순도 때문에, 추가의 농축 및 정제 단계들은 제품-관련 이성질체들 및 나머지 양의 숙주 세포 단백질들/DNA, 세포 배양 불순물들, 침출된 단백질 A, 및 바이러스들의 제거를 위해 요구된다. 배합 문제는 많은 이들 불순물들이 정제된 항체들을 단리시키기 위한 다운스트림 공정 오퍼레이션 단위들의 효율성을 방해할 수 있다는 것이다. 또 다른 주요 문제는 가격이다; 단백질 A 컬럼들은 종래의 이온 교환 컬럼들보다 훨씬 더 고가이다. 마지막으로, 단백질 A 크로마토그래피가 예를 들면 폴리펩티드들, 항체-같은 분자들, 항체 단편들, 및/또는 특정 세포 시스템들로부터 정제된 완전 항체들의 정제에 의해 적합하지 않거나 또는 비용 금지되는 수 많은 시나리오들이 있다.

본 발명의 특성은 상기 식별된 문제들을 다루고 그의 구현예들에서 항체, 항체 단편 및 폴리펩티드 정제에서 단백질 A 단계를 사용하여 당업계에서 현재 이용 가능한 것들에 대한 대안의 정제 방법들을 보여준다.

발명의 요약

본 발명은 (a) 관심의 폴리펩티드 및 다양한 오염물들을 포함하는 조성물을 이온 교환 막을 통해 통과시키는 단계 (상기 폴리펩티드 및 막은 폴리펩티드의 전하를 증진시키기 위해 폴리펩티드의 pI와 충분히 구별되는 pH 및 완충액 이온들에 의해 전하들의 차폐를 방지하기에 효과적인 낮은 이온 강도를 갖는 완충액으로 구성된 작동 조건들에서 반대 전하를 갖음으로써 상기 막이 폴리펩티드 및 적어도 하나의 오염물에 결합하도록 유발함), (b) 관심의 폴리펩티드를 포함하는 상기 이온 교환 막으로부터 분획을 수집하는 단계; (c) 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 1개 이상의 추가의 정제 단계(들)에 적용시키는 단계, 및 (d) 정제된 폴리펩티드를 유출물로부터 회수하는 단계를 포함하는 단백질들의 정제를 위한 다운스트림 크로마토그래피 단계들의 효율을 증진시키는 방법들에 관한 것이다.

하나의 대안에서, 본 발명은 (a) 관심의 폴리펩티드 및 다양한 오염물들을 포함하는 조성물을 양이온 교환 막을 통해 통과시키는 단계 (상기 폴리펩티드 및 막은 폴리펩티드의 pI 미만의 약 1 내지 약 5 pH 단위의 pH 및 ≤ 약 40 mS/cm의 전도도를 갖는 완충액으로 구성된 작동 조건들에서 반대 전하를 갖음으로써 상기 막이 폴리펩티드 및 적어도 하나의 오염물에 결합하도록 유발함), (b) 관심의 폴리펩티드를 포함하는 상기 이온 교환 막으로부터 분획을 수집하는 단계; (c) 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 1개 이상의 추가의 정제 단계(들)에 적용시키는 단계, 및 (d) 정제된 폴리펩티드를 유출물로부터 회수하는 단계를 포함하는 단밸질들의 정제를 위한 다운스트림 크로마토그래피 단계들의 효율을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

또 다른 대안에서, 본 발명은 (a) 관심의 폴리펩티드 및 다양한 오염물들을 포함하는 조성물을 음이온 교환 막을 통해 통과시키는 단계 (상기 폴리펩티드 및 막은 폴리펩티드의 pI 초과의 약 1 내지 약 5 pH 단위의 pH 및 ≤ 약 40 mS/cm의 전도도를 갖는 완충액으로 구성된 작동 조건들에서 반대 전하를 갖음으로써 상기 막이 폴리펩티드 및 적어도 하나의 오염물에 결합하도록 유발함), (b) 관심의 폴리펩티드를 포함하는 상기 이온 교환 막으로부터 분획을 수집하는 단계; (c) 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 1개 이상의 추가의 정제 단계(들)에 적용시키는 단계, 및 (d) 정제된 폴리펩티드를 유출물로부터 회수하는 단계를 포함하는 단밸질들의 정제를 위한 다운스트림 크로마토그래피 단계들의 효율을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

일 측면에서, 오염물은 중국 햄스터 난소 단백질 (CHOP)이다. 또 다른 측면에서, 오염물은 대장균 단백질 (ECP)이다. 또 다른 측면에서, 오염물은 겐타마이신이다. 훨씬 또 다른 측면에서, 오염물은 폴리에틸렌이민 (PEI)이다.

일 측면에서, 폴리펩티드는 CH2/CH3 영역을 포함한다. 또 다른 측면에서, 폴리펩티드는 항체이다. 훨씬 또 다른 측면에서, 항체는 모노클로날 항체이다.

다른 측면들에서, 이 방법들은 상기 단계들 a 및 b 이전에, 그 동안에 또는 그 후에 폴리펩티드를 포함하는 상기 조성물을 1개 이상의 추가의 정제 단계(들)에 적용시키는 단계를 추가로 포함하고, 상기 정제 단계는 하나의 대안에서 Fc-결합 친화도 크로마토그래피 (예 단백질 A 크로마토그래피)이고, 또 다른 대안에서, 바인드/용출물에서, 통과액 또는 대체 모드로 작동되는 컬럼 또는 막을 사용하는 이온 교환 크로마토그래피이다. 훨씬 또 다른 측면에서, 이온 교환 막은 모놀리쓰 또는 깊이 필터에 의해 대체된다.

또한, 본 발명은 정제된 폴리펩티드를 제약학적으로 허용되는 담체와 조합함으로써 제약 조성물의 제법을 제공한다.

도 1. 초기 단백질 A 컬럼의 존재 또는 부재 하에 CEX 컬럼을 보호하기 위해 CEX 막을 사용함으로써이루어지는 항체 정제의 개요.
도 2. 초기 단계로서 CEX 컬럼을 보호하기 위해 CEX 막을 사용하는 비-항체 정제의 개요.
도 3. pH 5.5 및 6.4 mS/cm에서 및 pH 8.0 및 5.0 mS/cm에서 mAb 1 음이온 교환 풀에 대한 수율, Mustang^TM S (소규모, 0.18 mL MV, 667 MV/시간).
도 4. pH 8.0에서 mAb 2 음이온 교환 풀에 대한 수율, Mustang^TM Q (소규모, 0.35 mL MV, 600 MV/시간).
도 5. pH 5.5, 3.2 mS/cm에서 mAb 3 단백질 A 풀에 대한 CHOP 청소능, Mustang^TM S (소규모, 0.18 mL MV, 1333 MV/시간).
도 6. CEX 막들에 의한 과부하 후 불순물들의 청소능.
도 7. 각각의 분획에서 구배 용출 및 가장 높은 종들 농도에 이르는 정상화에 의해 측정된 바의 다양한 종들의 Mustang S 결합 강도.
도 8. 최대 질량으로 정상화되고 전체 구배 용출 분획 질량들의 합에 의해 계산되고 상이한 막 부하 밀도들에서 비교된 바의 다양한 종들의 Mustang S 전체 결합된 질량
도 9. Mustang S 막은 단백질과 함께 부하되고, UV 흡광도가 기준선에 도달할 때까지 20mM 아세테이트 완충액으로 세척되고, 이어서 겐타마이신에 의해 항체 변위를 나타내기 위해 20mM 아세테이트/겐타마이신 완충액으로 용출된다.
도 10. 다양한 겐타마이신 농도들에서 CEX 막을 이용하거나 또는 이용함이 없이 CEX 컬럼 (Fractogel SE Hicap) 상에서 항체 동적 결합 용량 (DBC)을 결정하기 위한 프로토콜을 묘사하는 개요.
도 11. Fractogel SE Hicap 항체 DBC에 대한 겐타마이신 농도의 효과.
도 12. 2개의 CEX 막들 (Mustang S 및 Natrix S)에 대한 겐타마이신 DBC의 비교.
도 13. 30% DBC 개선을 보여주는 과부하된 Natrix S 풀에 의한 Fractogel SE Hicap 항체 DBC.
도 14. 더 적은 PEI가 사용될 때 36 내지 51 g/L 개선을 보여주는 세파로스 고속 흐름 (SPSFF) 단백질 DBC에 대한 추출 공정에 사용된 PEI %의 효과
도 15. 더 많은 PEI가 사용될 때 감소된 단계 수율 및 증가된 풀 불순물들을 보여주는 SPSFF에 대한 추출 공정에서 사용하는 PEI %의 효과
도 16. 123 mg/mL 막에서 단백질과 ECP 돌파구에 비교하여 330 mg/mL 막에서 PEI 돌파구를 보여주는 단백질, ECP, 및 PEI의 Natrix S DBC.

바람직한 구현예의 상세한 설명

정의:

여기서, 용어 "약"으로 서두를 뗀 수치 범위들 또는 양들은 정확한 범위 또는 정확한 수치량을 명백히 포함한다.

본원에서 정제되어야 할 "조성물"은 관심의 폴리펩티드 및 1개 이상의 오염물들을 포함한다. 조성물은 "부분적으로 정제될 수 있거나" (즉, 1개 이상의 정제 단계들, 예를 들면 단백질 A 크로마토그래피에 적용됨) 또는 폴리펩티드를 생산하는 숙주 세포 또는 유기체로부터 직접적으로 얻을 수 있다 (예, 조성물은 수확된 세포 배양 유체를 포함할 수 있다).

본원에 사용된 바의, "폴리펩티드"는 일반적으로 펩티드들 및 약 10개 이상의 아미노산들을 갖는 단백질들을 의미한다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 포유 동물의 단백질이고, 그의 예들은 다음을 포함한다: 레닌; 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬을 포함하는 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 리포단백질들; 알파-1-안티트립신; 인슐린 A-사슬; 인슐린 B-사슬; 프로인슐린; 난포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체 형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자들, 예를 들면 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자, 및 폰 빌레플란트 인자; 항응고 인자들, 예를 들면 단백질 C; 심방 나트륨 이뇨 인자; 폐 계면 활성제; 플라스미노겐 활성제, 예를 들면 유로키나제 또는 인간 소변 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성제 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나제; RANTES (일반적으로 T-세포 발현 및 분비된 활성화에 대해 조절됨); 인간 매크로파지 염증 단백질 (MIP-1-알파); 혈청 알부민, 예를 들면 인간 혈청 알부민; 뮬러리안-억제 기질; 릴랙신 A-사슬; 릴랙신 B-사슬; 프로릴랙신; 생쥐 성선 자극 호르몬-관련 펩티드; 미생물 단백질, 예를 들면 베타-락타마제; DNase; IgE; 세포 독성 T-림프구 관련 항원 (CTLA), 예를 들면 CTLA-4; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬들 또는 성장 인자들에 대한 수용체들; 단백질 A 또는 D; 류마티스성 인자들; 신경 영양성 인자, 예를 들면 골-유도 신경 영양성 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예를 들면 NGF-β; 혈소판-유도 성장 인자 (PDGF); 섬유아세포 성장 인자, 예를 들면 aFGF 및 bFGF; 표피 성장 인자 (EGF); 변형 성장 인자 (TGF), 예를 들면 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, 또는 TGF-β5를 포함하는 TGF-알파 및 TGF-베타; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질들 (IGFBPs); CD 단백질들, 예를 들면 CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD20; 에리쓰로포이에틴; 골 유도 인자들; 면역 독소들; 골 형태 형성 단백질 (BMP); 인터페론, 예를 들면 인터페론-알파, -베타, 및 -감마; 콜로니 자극 인자들 (CSFs), 예, M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF; 인터류킨들 (ILs), 예, IL-1 내지 IL-10; 초과산화물 디스뮤타제; T-세포 수용체들; 표면 막 단백질들; 부식 가속화 인자; 바이러스성 항원, 예를 들면, 예를 들면, AIDS 엔벨로프의 일부; 수송 단백질들; 귀환 수용체들; 어드레신들; 조절 단백질들; 인테그린들, 예를 들면 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 종양 관련 항원, 예를 들면 HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 및 임의의 상기-열거된 폴리펩티드들의 단편들 및/또는 변종들 뿐만 아니라 상기 열거된 폴리펩티드들 중의 어느 것에 결합된 항체 단편들을 포함하는 항체들.

"오염물"은 목적하는 폴리펩티드 생성물과는 상이한 물질이다. 오염물은 제한 없이 숙주 세포 물질들, 예를 들면 중국 햄스터 난소 단백질들 (CHOP) 또는 대장균 단백질들 (ECP); 침출된 단백질 A; 핵산; 목적하는 폴리펩티드의 변종, 단편, 집합체, 이성질체 또는 유도체; 또 다른 폴리펩티드; 엔도톡신; 바이러스 오염물; 아미노글리코사이드 항생제 성분들 (예, 겐타마이신, 스트렙토마이신, 네오마이신, 카나마이신); 또는 정제 공정에 부가된 음이온성 중합체 (예, 폴리에틸렌이민 (PEI), 폴리비닐아민, 폴리아르기닌, 폴리비닐술폰산, 폴리아크릴산), 등을 포함한다.

본원에 사용될 때 용어 "C_H2/C_H3 영역"은 이뮤노글로불린 분자의 Fc 영역에서 아미노산 잔기들을 의미한다. 바람직한 구현예들에서, C_H2/C_H3 영역은 손상되지 않은 C_H3 영역이 이어지는 손상되지 않은 C_H2 영역을 포함하고, 가장 바람직하게는 이뮤노글로불린의 Fc 영역을 포함한다. C_H2/C_H3 영역-함유 폴리펩티드들의 예들은 항체들, 면역 접합체들 및 C_H2/C_H3 영역에 융합되거나 또는 그와 콘쥬게이트된 관심의 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질들을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예들에서, 본원에서 정제되어야 할 항체는 재조합 항체이다. "재조합 항체"는 항체를 인코딩하는 핵산에 의해 형질 전환되거나 또는 형질 감염되거나, 또는 상동성 재조합의 결과로서 항체를 생산하는 숙주 세포에서 생산되는 것이다. "형질 전환" 및 "형질 감염"은 핵산을 세포 내로 도입하는 공정을 의미하도록 상호 교환 가능하게 사용된다. 형질 전환 또는 형질 감염 후에, 핵산은 숙주 세포 게놈 내로 통합되거나 또는 염색체 외의 요소로서 존재할 수 있다. "숙주 세포"는 숙주 동물 내의 세포 뿐만 아니라 시험관 내 세포 배양액 중의 세포를 포함한다. 폴리펩티드들의 재조합 생산 방법들은 예를 들면 본원에 참고 문헌으로서 명시적으로 인용된 미국 특허 제5,534,615호에 기재되어 있다.

용어 "항체"는 넓은 의미로 사용되고 특히 이들이 본원에 정의된 바의 C_H2/C_H3 영역을 유지하거나 또는 이를 포함하도록 변형되는 한 모노클로날 항체들 (전체 길이 모노클로날 항체들을 포함함), 폴리클로날 항체들, 다중 특이성 항체들 (예, 이중 특이성 항체들), 및 항체 단편들을 커버한다.

본원에서 항체는 관심의 "항원"에 반하는 것이다. 바람직하게는, 항원은 생물학적으로 중요한 폴리펩티드이고 질병 또는 장애로 고통받는 포유 동물에 대한 항체의 투여는 그 포유 동물에서 치료 효과를 초래할 수 있다. 그러나, 비-폴리펩티드 항원들 (예를 들면 종양-관련 글리코리피드 항원들; 미국 특허 제5,091,178호 참조)에 반하여 관련된 항체들이 또한 고려된다. 항원이 폴리펩티드인 경우, 그것은 막전위 분자 (예, 수용체) 또는 리간드, 예를 들면 성장 인자일 수 있다. 예시적인 항원들은 상기 고찰된 폴리펩티드들을 포함한다. 본 발명에 포함되는 항체들에 대해 바람직한 분자 표적들은 CD 폴리펩티드들, 예를 들면 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 및 CD34; 수용체 부류의 구성원들, 예를 들면 EGF 수용체 (HER1), HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 세포 접착 분자들, 예를 들면 LFA-1, Mac1, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM 및 그의 a 또는 b 서브유닛들 중 하나를 포함하는 av/b3 인테그린 (예, 항-CD11a, 항-CD18 또는 항-CD11b 항체들); 성장 인자들, 예를 들면 VEGF; IgE; 혈액형 항원들; flk2/flt3 수용체; 비만 (OB) 수용체; mpl 수용체; CTLA-4; 폴리펩티드 C 등을 포함한다. 가용성 항원들 또는 그의 단편들은 임의로 다른 분자들에 콘쥬게이트되어 항체들을 생성하기 위한 면역원들로서 사용될 수 있다. 수용체들과 같은 막전위 분자들에 대해, 이들의 단편들 (예, 수용체의 세포 외 도메인)이 면역원으로서 사용될 수 있다. 대안으로, 막전위 분자를 발현하는 세포들이 면역원으로서 사용될 수 있다. 그러한 세포들은 천연 소스 (예, 암 세포주들)로부터 유도될 수 있거나, 또는 막전위 분자를 발현하기 위한 재조합 기술들에 의해 형질 전환된 세포들일 수 있다.

본원에서 정제되어야 할 항체들의 예들은 트라스투주맙 (HERCEPTIN®) (Carter 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289 (1992), 미국 특허 제5,725,856호) 및 페르투주맙 (OMNITARG^TM) (을 포함하는 HER2 항체들을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는다. SEQ CHAPTER \h \r 1WO01/00245); CD20 항체들 (이하 참조); IL-8 항체들 (St John 등, Chest, 103:932 (1993), 및 국제 특허 공고 제WO 95/23865호); 인간화된 및/또는 친화도 성숙된 VEGF 항체들을 포함하는 VEGF 또는 VEGF 수용체 항체들, 예를 들면 인간화된 VEGF 항체 huA4.6.1 베바시주맙 (AVASTIN®) 및 라니비주맙 (LUCENTIS®) (Kim 등, Growth Factors, 7:53-64 (1992), 국제 특허 공고 제WO 96/30046호, 및 WO 98/45331, 1998년 10월 15일자로 공개됨); PSCA 항체들 (WO01/40309); 에팔리주맙 (RAPTIVA®) 을 포함하는 CD11a 항체들 (미국 특허 제5,622,700호, WO 98/23761, Steppe 등, Transplant Intl. 4:3-7 (1991), 및 Hourmant 등, Transplantation 58:377-380 (1994)); 오말리주맙 (XOLAIR®)을 포함하여 IgE에 결합한 항체들 (Presta 등, J. Immunol. 151:2623-2632 (1993), 및 국제 특허 공고 제WO 95/19181호; 1998년 2월 3일자로 발행된 미국 특허 제5,714,338호, 1992년 2월 25일자로 발행된 미국 특허 제5,091,313호, 1993년 3월 4일자로 공고된 WO 93/04173, 또는 1998년 6월 30일자로 출원된 국제 특허 출원 제PCT/US98/13410호, 미국 특허 제5,714,338); CD18 항체들 (1997년 4월 22일자로 발행된 미국 특허 제5,622,700, 또는 1997년 7월 31일자로 공고된 WO 97/26912); Apo-2 수용체 항체 항체들 (1998년 11월 19일자로 공고된 WO 98/51793); 조직 인자 (TF) 항체들 (1994년 11월 9일자로 승인된 유럽 특허 제0 420 937 B1호); α₄-α₇ 인테그린 항체들 (1998년 2월 19일자로 공고된 WO 98/06248); EGFR 항체들 (예, 키메라화된 또는 인간화된 225 항체, 세툭시맙, ERBUTIX®, 1996년 12월 19일자로 공고된 WO 96/40210에서와 같음); CD3 항체들, 예를 들면 OKT3 (1985년 3월 7일자로 발행된 미국 특허 제4,515,893호); CD25 또는 Tac 항체들, 예를 들면 CHI-621 (SIMULECT®) 및 ZENAPAX® (1997년 12월 2일자로 발행된 미국 특허 제5,693,762호 참조); CD4 항체들, 예를 들면 cM-7412 항체 (Choy 등, Arthritis Rheum 39(1):52-56 (1996)); CD52 항체들, 예를 들면 CAMPATH-1H (ILEX/Berlex) (Riechmann 등, Nature 332:323-337 (1988)); Fc 수용체 항체들, 예를 들면 Fc에 반하여 지향된 M22 항체 (RI Graziano 등, J. Immunol. 155(10):4996-5002 (1995)에서와 같음); 태아 성암 항원 (CEA) 항체들, 예를 들면 hMN-14 (Sharkey 등, Cancer Res. 55(23Suppl): 5935s-5945s (1995)); huBrE-3, hu-Mc 3 및 CHL6을 포함하여 유방 상피 세포들에 반하여 지향된 항체들 (Ceriani 등, Cancer Res. 55(23): 5852s-5856s (1995); 및 Richman 등, Cancer Res. 55(23 Supp): 5916s-5920s (1995)); 대장 암종 세포들에 결합한 항체들, 예를 들면 C242 (Litton 등, Eur J. Immunol. 26(1):1-9 (1996)); CD38 항체들, 예, AT 13/5 (Ellis 등, J. Immunol. 155(2):925-937 (1995)); CD33 항체들, 예를 들면 Hu M195 (Jurcic 등, Cancer Res 55(23 Suppl):5908s-5910s (1995)) 및 CMA-676 또는 CDP771; EpCAM 항체들, 예를 들면 17-1A (PANOREX®); GpIIb/IIIa 항체들, 예를 들면 압식시맙 또는 c7E3 Fab (REOPRO®); RSV 항체들, 예를 들면 MEDI-493 (SYNAGIS®); CMV 항체들, 예를 들면 PROTOVIR®; HIV 항체들, 예를 들면 PRO542; 간염 항체들, 예를 들면 the Hep B 항체 OSTAVIR®; CA 125 항체 OvaRex; 이디오타입 GD3 에피토프 항체 BEC2; αvβ3 항체 (예, VITAXIN®; Medimmune); 인간 신장 세포 암종 항체, 예를 들면 ch-G250; ING-1; 항-인간 17-1An 항체 (3622W94); 항-인간 결장 종양 항체 (A33); GD3 강글리오시드에 반하여 지향된 항-인간 흑색종 항체 R24; 항-인간 편평-세포 암종 (SF-25); 인간 백혈구 항원 (HLA) 항체, 예를 들면 Smart ID10 및 항-HLA DR 항체 온콜림 (Lym-1); CD37 항체, 예를 들면 TRU 016 (Trubion); IL-21 항체 (Zymogenetics/Novo Nordisk); 항-B 세포 항체 (Impheron); B 세포 표적화 MAb (Immunogen/Aventis); 1D09C3 (Morphosys/GPC); LymphoRad 131 (HGS); Lym-1 항체, 예를 들면 Lym -1Y-90 (USC) 또는 항-Lym-1 온콜림 (USC/Peregrine); LIF 226 (Enhanced Lifesci.); BAFF 항체 (예, WO 03/33658); BAFF 수용체 항체 (예, WO 02/24909 참조); BR3 항체; Blys 항체, 예를 들면 벨리무맙; LYMPHOSTAT -B^TM; ISF 154 (UCSD/Roche/Tragen); 고밀릭시마 (Idec 152; Biogen Idec); IL-6 수용체 항체, 예를 들면 아틀리주맙 (ACTEMRA^TM; Chugai/Roche); IL-15 항체, 예를 들면 HuMax-Il-15 (Genmab/Amgen); 케모카인 수용체 항체, 예를 들면 CCR2 항체 (예, MLN1202; Millieneum); 항-보충 항체, 예를 들면 C5 항체 (예, 에쿨리주맙, 5G1.1; Alexion); 인간 이뮤노글로불린의 경구 제형 (예, IgPO; Protein Therapeutics); IL-12 항체, 예를 들면 ABT-874 (CAT/Abbott); 테넬릭시맙 (BMS-224818; BMS); S2C6 및 인간화된 그의 변종들 (WO00/75348) 및 TNX 100 (Chiron/Tanox)를 포함하는 CD40 항체들; cA2 또는 인플릭시맙 (REMICADE®), CDP571, MAK-195, 아달리무맙 (HUMIRA^TM)을 포함하는 TNF-α 항체들, 페길화된 TNF-α 항체 단편, 예를 들면 CDP-870 (Celltech), D2E7 (Knoll), 항-TNF-α 폴리클로날 항체 (예, PassTNF; Verigen); CD22 항체들, 예를 들면 LL2 또는 에프라투주맙 Y-90 및 에프라투주맙 I-131를 포함하는 에프라투주맙 (LYMPHOCIDE®; Immunomedics), Abiogen의 CD22 항체 (Abiogen, Italy), CMC 544 (Wyeth/Celltech), 콤보톡스 (UT Soutwestern), BL22 (NIH), 및 LympoScan Tc99 (Immunomedics).

CD20 항체들의 예들은 현재 "리툭시맙" ("RITUXAN®")이라 칭하는 "C2B8," (미국 특허 제5,736,137호); IDEC 제약 주식 회사로부터 상업적으로 입수할 수 있는 "Y2B8" 또는 "이브리투모맙 티욱세탄" (ZEVALIN®)으로 지정된 이트륨-[90]-라벨된 2B8 쥐의 항체를 포함한다. (미국 특허 제5,736,137호; 1993년 6월 22일자로 수탁 번호 HB11388로 ATCC 하에 기탁된 2B8); 쥐의 IgG2a "B1," 또한 "토시투모맙,"이라 칭하기도 함, Corixa로부터 상업적으로 입수할 수 있는 "131I-B1" 또는 "요오드 I131 토시투모맙" 항체 (BEXXAR^TM)를 발생시기키 위해 ¹³¹I로 임의로 라벨화됨 (또한, 미국 특허 제5,595,721호 참조); 쥐의 모노클로날 항체 "1F5" (Press 등, Blood 69(2):584-591 (1987)) 및 "패치된 프레임워크" 또는 인간화된 1F5를 포함하는 그의 변종들 (WO 2003/002607, Leung, S.; ATCC 기탁 HB-96450); 쥐의 2H7 및 키메라 2H7 항체 (미국 특허 제5677180호); 인간화 2H7 (WO 2004/056312, Lowman 등); 2F2 (HuMax-CD20), B-세포들 의 세포 막 내의 CD20 분자에서 표적화된 완전한 인간, 고-친화도 항체 (Genmab, Denmark; 예를 들면, Glennie 및 van de Winkel, Drug Discovery Today 8: 503-510 (2003) 및 Cragg 등, Blood 101: 1045-1052 (2003); WO 2004/035607; US2004/0167319 참조); WO 2004/035607 및 US2004/0167319에 명시된 인간 모노클로날 항체들 세트 (Teeling 등); US 2004/0093621에 기재된 Fc 영역에 결합된 착물 N-글리코시드-링크된 당 체인들을 갖는 항체들 (Shitara 등); CD20에 대한 모노클로날 항체들 및 항원-결합 단편들 결합 (WO 2005/000901, Tedder 등), 예를 들면 HB20-3, HB20-4, HB20-25, 및 MB20-11; CD20 결합 분자들, 예를 들면 항체들의 AME 시리즈, WO 2004/103404 및 US2005/0025764에 명시된 바의 예, AME 33 항체들 (Watkins 등, Eli Lilly/Applied Molecular Evolution, AME); CD20 결합 분자들, 예를 들면 US 2005/0025764에 기재된 것들 (Watkins 등); A20 항체 또는 그의 변종들, 예를 들면 키메라 또는 인간화된 A20 항체 (cA20, hA20, 각각) 또는 IMMU-106 (US 2003/0219433, Immunomedics); US 2005/0069545A1 및 WO 2005/16969에서와 같이 임의로 IL-2와 콘주게이트된 에피토프-고갈된 Leu-16, 1H4, 또는 2B8을 포함하는 CD20-결합 항체들 (Carr 등); CD22 및 CD20에 결합한 이중 특이성 항체, 예를 들면, hLL2xhA20 (WO2005/14618, Chang 등); 국제 백혈구 타이핑 워크샵으로부터 입수할 수 있는 모노클로날 항체들 L27, G28-2, 93-1B3, B-C1 또는 NU-B2 (Valentine 등, In: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., p. 440, 옥스포드 대학 출판부 (1987)); 1H4 (Haisma 등, Blood 92:184 (1998)); 항-CD20 오리스타틴 E 콘주게이트 (Seattle Genetics); 항-CD20-IL2 (EMD/Biovation/ City of Hope); 항-CD20 MAb 치료 (EpiCyte); 항-CD20 항체 TRU 015 (Trubion).

본원에 사용된 바의 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체들의 개체군으로부터 수득된 항체를 의미하고, 즉, 그 개체군을 포함하는 개별 항체들은 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연적으로 발생한 돌연변이들을 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체들은 고도로 특이적이고 단일 항원성 사이트에 반하여 지향된다. 더욱이, 통상적으로 상이한 결정 인자들 (에피토프들)에 반하여 지향된 항체들을 포함하는 종래의 (폴리클로날) 항체 제제들과 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원의 단일 결정 인자에 반하여 지향된다. 개질제 "모노클로날"은 항체들의 실질적으로 균질한 개체군으로부터 수득되는 것으로서 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의해 항체의 생산을 요구하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용되어야 하는 모노클로날 항체들은 Kohler 등의, Nature 256:495 (1975)에 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법들에 의해 제조될 수 있다 (예, 미국 특허 제4,816,567호 참조). 추가의 구현예에서, "모노클로날 항체들"은 McCafferty 등의, Nature, 348:552-554 (1990)에 기재된 기술들을 사용하여 생성된 항체 파지 라이브러리들로부터 단리될 수 있다. Clackson 등의, Nature, 352:624-628 (1991) 및 Marks 등의, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)은 파지 라이브러리들을 사용하는 쥐의 및 인간 항체들 각각의 단리를 기재한다. 후속 간행물들은 체인 셔플링 (Marks 등, Bio/Technology, 10:779-783 (1992))에 의해서 뿐만 아니라, 조합 감염 및 매우 큰 파지 라이브러리들을 구성하기 위한 전략으로서 생체내 생체내 재조합에 의한 높은 친화도 (nM 범위) 인간 항체들의 생산을 기재하고 있다 (Waterhouse 등, Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993)). 따라서, 이들 기술들은 모노클로날 항체들의 단리를 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술들에 대한 실행 가능한 대안들이다. 대안으로, 내인성 이뮤노글로불린 생산의 부재하에 면역화에 따라 인간 항체들의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 형질 전환 동물들 (예, 생쥐들)을 생산하는 것이 현재 가능하다. 예를 들면, 키메라 및 세균-라인 돌연변이체 생쥐들에서 항체 중쇄 결합 영역 (J_H) 유전자의 동형 접합 결실이 내인성 항체 생산의 완전한 억제를 초래하는 것으로 기재되고 있다. 그러한 세균-라인 돌연변이체 생쥐들에서 인간 세균-라인 이뮤노글로불린 유전자 배열의 전이는 항원 도전에 따른 인간 항체들의 생산을 초래할 것이다. 예, Jakobovits 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits 등, Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann 등, Year in Immuno., 7:33 (1993); 및 Duchosal 등, Nature 355:258 (1992) 참조.

본원의 모노클로날 항체들은 구체적으로 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종들로부터 유도된 항체들 내의 또는 특정 항체 부류 또는 부분 부류에 속하는 대응하는 서열들과 동일하거나 또는 상동성인 한편, 사슬(들)의 나머지는 또 다른 종들로부터 유도된 항체들 내의 또는 또 다른 항체 부류 또는 부분 부류에 속하는 대응하는 서열들과 동일하거나 또는 상동성인 "키메라" 항체들 (이뮤노글로불린들) 뿐만 아니라 그것들이 원하는 생물학적 할성을 나타내는 한 그러한 항체들의 단편들을 포함한다 (미국 특허 제4,816,567호; 및 Morrison 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).

본원에 사용될 때 용어 "초가변 영역"은 항원-결합에 대한 책임이 있는 항체의 아미노산 잔기들을 의미한다. 초가변 영역은 경쇄 가변 도메인에서 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" (즉, 잔기들 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 및 중쇄 가변 도메인에서 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3)로부터 아미노산 잔기들을 포함하고; Kabat 등, Sequences of Polypeptides of Immunological Interest, 제5판 편집. 보건 서비스, 국립 보건원, Bethesda, MD. (1991)) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기들 (즉, 경쇄 가변 도메인에서 잔기들 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인에서 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); Chothia 및 Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). "프레임워크" 또는 "FR" 잔기들은 본원에 정의된 바의 초가변 영역 잔기들 이외의 가변 도메인 잔기들이다.

비-인간 (예, 쥐의) 항체들의 "인간화된" 형태들은 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체들이다. 대개, 인간화된 항체들은 수령인의 초가변 영역으로부터의 잔기들이 비-인간 종들 (공여자 항체), 예를 들면 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 생쥐, 쥐, 토끼 또는 인간이 아닌 영장류의 초가변 영역으로부터의 잔기들로 대체되는 인간 이뮤노글로불린들 (수령인 항체)이다. 몇몇 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기들은 대응하는 비-인간 잔기들로 대체된다. 더욱이, 인간화된 항체들은 수령인 항체에서 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기들을 포함할 수 있다. 이들 변형들은 항체 성능을 추가로 세분화하도록 이루어진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 가변 도메인들의 적어도 하나, 및 전형적으로 2개의 실질적으로 전부를 포함할 것이고, 여기서 초가변 루프들의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 이뮤노글로불린의 것들에 대응하고, FR 영역들의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 이뮤노글로불린 서열의 것들이다. 인간화된 항체는 선택적으로 또한 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 그것인 이뮤노글로불린 일정 영역 (Fc)의 적어도 일부를 포함할 것이다.

인간화된 항체들을 만드는데 사용될 경쇄 및 중쇄 모두의 인간 가변 도메인들의 선택은 항원성을 줄이기 위해 매우 중요하다. 소위 "최적합" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열은 공지된 인간 가변-도메인 서열들의 전체 라이브러리에 반하여 선별된다. 설치류의 그것과 가장 가까운 인간 서열은 이어서 인간화된 항체에 대한 인간 프레임워크 (FR)로서 허용된다 (Sims 등, J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia 등, J. Mol. Biol., 196:901 (1987)).

또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄들의 특정 하위 그룹의 모든 인간 항체들의 합의 서열로부터 유도된 특정 프레임워크를 사용한다. 동일한 프레임워크는 여러 가지 상이한 인간화된 항체들을 위해 사용될 수 있다 (Carter 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta 등, J. Immnol., 151:2623 (1993)).

항체들은 항원에 대한 높은 친화도 및 기타 유리한 생물학적 특성들을 보유함에 따라 인간회되는 것이 더 중요하다. 이 목표를 달성하기 위해, 바람직한 방법에 따라, 인간화된 항체들은 부모 및 인간화된 서열들의 3 차원 모델들을 사용하여 부모 서열들 및 다양한 개념적인 인간화된 제품들의 분석 공정에 의해 제조된다. 3 차원 이뮤노글로불린 모델들은 일반적으로 이용될 수 있고 당업계의 숙련자들에게 익숙하다. 선택된 후보 이뮤노글로불린 서열들의 가능한 3 차원 형태적 구조들을 예시하고 표시하는 컴퓨터 프로그램들이 이용될 수 있다. 이들 디스플레이들의 검사는 후보 이뮤노글로불린 서열의 기능화에서 잔기들의 가능한 역할의 분석, 즉, 그의 항원에 결합하는 후보 이뮤노글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 허용한다. 이러한 방식으로, FR 잔기들은 원하는 항체 특성, 예를 들면 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도가 달성되도록 수령인 및 수입 서열들로부터 선택되거나 또는 조합될 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기들은 항원 결합에 영향을 주는데 있어서 직접적으로 및 가장 실질적으로 연관된다.

"항체 단편들"은 전체 길이 항체의 일부, 일반적으로 그의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편들의 예들은 Fab, Fab', F(ab')₂, 및 Fv 단편들; 2가 항체 절편들; 선형 항체들; 단일쇄 항체 분자들; 및 항체 단편들로부터 형성된 다중 특이성 항체들을 포함한다. 다양한 기술들이 항체 단편들의 생산을 위해 개발되어 왔다. 전통적으로, 이들 단편들은 손상되지 않은 항체들의 단백질 분해 소화를 통해 유도되었다 (예, Morimoto 등, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) 및 Brennan 등, Science, 229:81 (1985) 참조). 그러나, 이들 단편들은 재조합 숙주 세포들에 의해 현재 직접적으로 생산될 수 있다. 예를 들면, 항체 단편들은 상기 고찰된 항체 파지 라이브러리들로부터 단리될 수 있다. 대안으로, Fab'-SH 단편들은 대장균으로부터 직접적으로 회수될 수 있고 화학적으로 결합되어 F(ab')₂ 단편들을 형성할 수 있다 (Carter 등, Bio/Technology 10:163-167 (1992)). 또 다른 구현예에서, F(ab')₂는 F(ab')₂ 분자의 조립을 촉진하기 위해 류신 지퍼 GCN4를 사용하여 형성된다. 또 다른 접근법에 따라, F(ab')₂ 단편들은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접적으로 단리될 수 있다. 항체 단편들의 생산을 위한 다른 기술들은 당업자들에게 명백할 것이다.

다른 구현예들에서, 선택된 항체는 단일쇄 Fv 단편 (scFv)이다. WO 93/16185 참조. "단일쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편들은 항체의 V_H 및 V _L 도메인들을 포함하고, 여기서 이들 도메인들은 단일 폴리펩티드 체인 내에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 V_H와 V_L 도메인들 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함함으로써 sFv가 항원 결합을 위한 바람직한 구조를 형성하게 한다. sFv의 검토를 위해, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg 및 Moore eds에서 Pluckthun 참조. Springer-Verlag, New York, 269-315페이지 (1994).

용어 "2가 항체 절편들"은 2개의 항원-결합 부위들을 갖는 작은 항체 단편들을 의미하고, 여기서 단편들은 동일한 폴리펩티드 체인 (V_H - V_L)에서 경쇄 가변 도메인 (V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (V_H)을 포함한다. 동일한 사슬 상의 2개의 도메인들 사이에서 짝짓기를 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인들은 또 다른 사슬의 상보적 도메인들과 짝을 이루어 2개의 항원-결합 부위들을 생성하도록 강요받는다. 2가 항체 절편들은 예를 들면, EP 404,097; WO 93/11161; 및 Hollinger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)에 더 충분히 기재되어 있다.

본 출원 전반에 사용될 때의 표현 "선형 항체들"은 Zapata 등, Polypeptide Eng. 8(10):1057-1062 (1995)에 기재된 항체들을 의미한다. 간략하게, 이들 항체들은 항원 결합 영역들의 쌍을 형성하는 탠덤 Fd 세그먼트들 (V_H-C_H1-V_H-C _H1)의 쌍을 포함한다. 선형 항체들은 이중 특이성 또는 단일 특이성일 수 있다.

"다중 특이성 항체들"은 적어도 2개의 상이한 에피토프들에 대한 결합 특이성들을 갖고, 여기서 에피토프들은 보통 상이한 항원들로부터 있다. 그러한 분자들은 정상적으로 2개의 항원들 (즉, 이중 특이성 항체들, BsAbs)에만 결합할 것이지만, 추가의 특이성들을 갖는 항체들, 예를 들면 삼중 특이성 항체들은 본원에 사용될 때 이러한 표현에 의해 포함된다. BsAbs의 예들은 한쪽 팔이 종양 세포 항원에 반하여 지향된 것 및 다른 팔이 세포 독성 트리거 분자에 반하여 지향된 것들, 예를 들면 항-FcγRI/항-CD15, 항-p185 ^HER2/FcγRIII (CD16), 항-CD3/항-악성 B-세포 (1D10), 항-CD3/항-p185^HER2, 항-CD3/항-p97, 항-CD3/항-신장 세포 암종, 항-CD3/항-OVCAR-3, 항-CD3/L-D1 (항-대장 암종), 항-CD3/항-멜라닌 세포 자극 호르몬 유사체, 항-EGF 수용체/항-CD3, 항-CD3/항-CAMA1, 항-CD3/항-CD19, 항-CD3/MoV18, 항-신경 세포 접착 분자 (NCAM)/항-CD3, 항-엽산 결합 단백질 (FBP)/항-CD3, 항-팬 암종 관련 항원 (AMOC-31)/항-CD3; 한쪽 팔이 종양 항원에 특이적으로 결합되고 한쪽 팔이 독소에 결합된 BsAbs, 예를 들면 안티-사포린/항-Id-1, 항-CD22/안티-사포린, 항-CD7/안티-사포린, 항-CD38/안티-사포린, 항-CEA/항-리신 A 체인, 항-인터페론-α(IFN-α)/항-하이브리도마 유전자형, 항-CEA/항-일일초 알카로이드; 효소 활성화된 전구 약물들을 전환시키기 위한 BsAbs, 예를 들면 항-CD30/항-알칼리성 인산가수분해효소 (미토마이신 인산염 전구 약물의 미토마이신 알코올로의 전환을 촉매한다); 혈전 용해제들로서 사용될 수 있는 BsAbs, 예를 들면 항-피브린/항-조직 플라스미노겐 활성제 (tPA), 항-피브린/항-유로키나제-유형 플라스미노겐 활성제 (uPA); 면역 복합체들을 세포 표면 수용체들에 표적화하기 위한 BsAbs, 예를 들면 항-저밀도 지질 단백질 (LDL)/항-Fc 수용체 (예, FcγRI, 또는 FcγRIII); 전염성 질병들의 치료에 사용하기 위한 BsAbs, 예를 들면 항-CD3/항-단순 포진 바이러스 (HSV), 항-T-세포 수용체:CD3 착물/항-인플루엔자, 항-FcγR/항-HIV; 종양 검출을 위한 BsAbs 시험관 내 또는 생체내, 예를 들면 항-CEA/항-EOTUBE, 항-CEA/항-DPTA, 항-p185^HER2/항-햅텐; 백신 아주반트로서 BsAbs; 및 진단 도구들로서 BsAbs, 예를 들면 항-토끼 IgG/항-페리틴, 항-고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)/항-호르몬, 항-소마토스타틴/항-기질 P, 항-HRP/항-FITC, 항-CEA/항-β-갈락토시다제를 포함한다. 삼중 특이성 항체들의 예들은 항-CD3/항-CD4/항-CD37, 항-CD3/항-CD5/항-CD37 및 항-CD3/항-CD8/항-CD37을 포함한다. 이중 특이성 항체들은 전체 길이 항체들 또는 항체 단편들로서 제조될 수 있다 (예, F(ab')₂ 이중 특이성 항체들).

2 이상의 원자가들을 갖는 항체들이 예상된다. 예를 들면, 삼중 특이성 항체들이 제조될 수 있다. Tutt 등, J. Immunol. 147: 60 (1991).

본원의 목적들을 위한 "네이키드 항체"는 세포 독성 잔기 또는 방사선 표지에 콘주게이트되지 않은 항체이다.

본원에서 "손상되지 않은 항체"는 2개의 항원 결합 영역들, 및 Fc 영역을 포함하는 것이다. 바람직하게는, 손상되지 않은 항체는 기능성 Fc 영역을 갖는다.

"치료"는 치료적 치료 및 예방적 치료 또는 예방 조치들 모두를 의미한다. 치료가 필요한 사람들은 이미 장애를 가진 사람들 뿐만 아니라 장애가 방지되어야 할 사람들을 포함한다.

"장애"는 본원에 기재된 바와 같이 정제된 항체에 의한 치료로 득을 볼 수 있는 임의의 상태이다. 이것은 만성 및 급성 장애들 및 질병들 및 포유 동물이 문제의 장애에 걸리기 쉽게 하는 병리학적 상태들 모두를 포함한다.

어구 "이온 교환 크로마토그래피"는 화합물들이 그들의 순수 전하에 기초하여 분리되는 분리 기술을 의미한다. 분자들은 (음전하를 갖는) 음이온들 또는 (양전하를 갖는) 양이온들로서 분류된다. 일부 분자들 (예, 폴리펩티드들)은 음이온성 및 양이온성 기들 모두를 가질 수 있다.

이온-교환 수지 또는 이온-교환 중합체는 유기 중합체 기판으로부터 제조된 일반적으로 작은 (1-2 mm 직경) 구슬들의 형태의 불용성 매트릭스 (또는 지지체 구조물)이다. Horie 등 Pure Appl. Chem. (2004) 76권, 4호, 889-906페이지. 이 물질은 그의 표면 상에 쉽게 트래핑되고 방출되는 이온들을 갖는 부위들인 공극들의 구조물을 고도로 개발하였다. 이온들의 트래핑은 다른 이온들의 동시 방출과 함께만 발생하고; 따라서, 이 공정은 이온-교환이라 칭한다. 이온들의 하나 또는 여러 가지 상이한 유형들을 선택적으로 선호하도록 제조되는 이온-교환 수지의 다수의 상이한 유형들이 있다.

대부분의 전형적인 이온-교환 수지들은 가교된 폴리스티렌을 기재로 한다. 필요한 활성기들은 중합 반응 후에 도입될 수 있거나, 또는 치환된 단량체들이 사용될 수 있다. 예를 들면, 가교는 종종 중합 공정에서 스티렌에 디비닐벤젠 0.5-25 %를 첨가함으로써 달성된다. 비-가교된 중합체들은 이들이 덜 안정적이기 때문에 거의 사용되지 않는다. 가교는 수지의 이온-교환 용량을 감소시키고, 이온 교환 공정들을 수행하는 데 필요한 시간을 연장시킨다. 입자 크기는 또한 수지 매개 변수들에 영향을 미치고; 작은 입자들은 더 큰 외부 표면을 갖지만 컬럼 공정들에서 더 큰 헤드 손실을 유발한다.

그들의 관능기들에는 상이한 이온 교환 수지들의 네 가지 주요 유형들: 즉, 강산성 (일반적으로 술폰산 기들, 예를 들면 폴리스티렌 술폰산 나트륨 또는 polyAMPS); 강염기, (4급 아미노기들, 예를 들면, 트리메틸암모늄기들, 예 polyAPTAC); 약산성 (주로, 카르복실산 기들); 약염기성 (1급, 2급 및/또는 3급 아미노기들, 예를 들면 폴리에틸렌 아민)이 있다. 특화된 유형들: 즉, 킬레이트 수지들 (이미노디아세트산, 티오우레아, 및 기타 다른 수지들)이 있다.

이온 교환 크로마토그래피 막은 혼합물을 전체 양전하 또는 음전하와 결합시킬 것이다. 결합 부위들은 흡착제의 공극들을 따라 위치한다. 이 화합물은 대류에 의해 결합 부위로 수송된다. 양으로 하전된 막 (음이온 교환기)는 화합물을 전체 음전하와 결합시킬 것이다. 반대로, 음으로 하전된 막 (양이온 교환기)는 화합물을 전체 양전하와 결합시킬 것이다.

이온 교환 막들은 강한 것이나 또는 약한 것으로서 추가로 범주화될 수 있다. 강한 이온 교환 막들은 광범위한 pH 레벨들에 걸쳐 하전된다 (이온화된다). 약한 이온 교환 막들은 좁은 pH 범위 내에서 이온화된다. 4개의 가장 통상적인 이온 교환 화학적 특성들은 다음과 같다:

일반적으로, 이온 교환 막들은 0.1 내지 100 μm의 공극 크기를 갖는다. 참고물로서, 사르토바인드 Q (Sartorius AG)는 3-5 μm의 공칭 공극 크기를 갖는 강한 음이온 교환막으로서 단일 또는 다중층 형태로 시판되고 있으며, Mustang Q (Pall Corporation)는 0.8 μm의 공칭 공극 크기를 갖는 강한 음이온 교환막으로서 마찬가지로 단일 또는 다중층 형태로 시판되고 있다. 또 다른 참고물로서, 사르토바인드 S (는 Sartorius AG)는 3-5 μm의 공칭 공극 크기를 갖는 강한 양이온 교환막으로서 단일 또는 다중층 형태로 시판되고 있으며, Mustang S (Pall Corporation)는 0.8 μm의 공칭 공극 크기를 갖는 강한 양이온 교환막으로서 마찬가지로 단일 또는 다중층 형태로 시판되고 있다. 또 다른 참고물로서, 또 다른 참고 물로서, Natrix S (Natrix Separations Inc.)는 높은 표면적의 매크로 다공성 하이드로겔 내에 둘러싸인 부직포의 높은 섬유 내구성의 중합체 기판으로 구성된 강한 양이온 교환 막이다.

"공칭" 공극 크기 등급은 60 내지 98%의 평가된 공극 크기에서 미립자들의 대부분을 보유하는 막의 능력을 기재한다.

용액 "pH"는 물 샘플의 이온화에 상대적인 산도 또는 알칼리도를 측정한다. 물의 pH는 중성, 즉, 7이다. 대부분의 pH 판독치는 0 내지 14 범위이다. 물보다 더 높은 [H+]를 갖는 용액들 (pH가 7 미만)은 산성이고; 물보다 더 낮은 [H+]를 갖는 용액들 (pH가 7 초과)은 염기성 또는 알칼리성이다. pH는 pH 미터를 사용하여 측정될 수 있다. 완충액 pH는 HCl 또는 NaOH와 같은 산 또는 염기를 사용하여 조절될 수 있다.

분자, 예를 들면 폴리펩티드의 "pI" 또는 "등전점"은 폴리펩티드가 동일한 수의 양전하들 및 음전하들을 함유하는 pH를 의미한다. pI는 폴리펩티드의 아미노산 잔기들의 순 전하로부터 산출될 수 있거나 또는 등전위 집중에 의해 결정될 수 있다. 음이온성 및 양이온성 기들 모두를 갖는 폴리펩티드들의 양쪽 특성은 조작될 수 있다. 폴리펩티드의 pH는 목적하는 폴리펩티드가 (양전하를 갖는) 양이온으로서 작용하는 지점까지 저하될 수 있다. 대안으로, 폴리펩티드의 pH는 목적하는 폴리펩티드가 (음전하를 갖는) 음이온으로서 작용하는 지점까지 증가될 수 있다.

용어 "전도도"는 두 전극들 사이에 전류를 전도하는 용액의 능력을 의미한다. 전도도의 기본 단위는 이전에 mho라고 칭한 지멘스 (S)이다. 전도도는 일반적으로 mS/cm의 단위로 표현된다. 용액 내의 이온들의 전하는 전류의 컨덕턴스를 고무시키기 때문에, 용액의 전도도는 그의 이온 농도에 비례한다. 이들 측정들 모두는 이온 강도와 잘 상관된다. 이온 강도는 전해질들의 농도와 밀접한 관련이 있으며, 특정 이온 상의 전하가 전해질 중의 다른 이온들에 의해 얼마나 효과적으로 차폐되거나 또는 안정화되는지를 나타낸다. 이온 강도와 전해질 농도 사이의 주요 차이점은 이온들의 일부가 더 높게 하전되는 경우에 전자가 높다는 것이다. 둘 사이의 또 다른 차이점은 이온 강도가 자유 이온들의 농도뿐 아니라 얼마나 많은 소금이 용액에 첨가되었는지를 반영한다는 것이다. 전도도는 전도도 미터, 예를 들면 오리온 전도도 미터들의 다양한 모델들을 사용하여 측정될 수 있다. 용액의 전도도는 내부의 이온들의 농도를 변화시킴으로써 변경될 수 있다. 예를 들면, 용액 중의 완충제의 농도 및/또는 염 (예, 염화나트륨, 아세트산 나트륨 또는 염화 칼륨)의 농도는 원하는 전도도를 얻기 위해 변경될 수 있다. 바람직하게는, 다양한 완충액들의 염 농도는 원하는 전도도를 달성하기 위해 변경될 수 있다.

막 크로마토그래피를 위해, "유속"은 일반적으로 시간당 막 부피 (MV/h)로 기재된다.

막 크로마토그래피를 위해, "부하 밀도"는 종종 막의 리터당 처리된 조성물의 그램으로서 표현된다.

"완충액"은 그의 산-염기 콘주게이트 성분들의 작용에 의해 pH의 변화에 저항하는 용액이다. 예를 들면 완충액의 원하는 pH에 따라 사용될 수 있는 다양한 완충액들은 완충액들에 기재되어 있다. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., Ed. Calbiochem Corporation (1975).

폴리펩티드 및 1개 이상의 오염물들을 포함하는 조성물로부터 폴리펩티드를 "정제한다"는 것은 조성물로부터 적어도 하나의 오염물을 (완전히 또는 부분적으로) 제거함으로써 조성물 내의 폴리펩티드의 순도의 정도를 증가시키는 것을 의미한다. "정제 단계"는 "균질한" 조성물을 초래하는 전체적인 정제 공정의 일부일 수 있다. "균질한"는 본원에서 조성물의 총 중량을 기준으로 관심의 항체의 적어도 약 70중량%, 바람직하게는 적어도 약 80중량%, 더 바람직하게는 적어도 약 90중량%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 95 중량%를 포함하는 조성물을 의미하도록 사용된다.

분자를 이온 교환 막에 "결합시킨다"는 것은 분자와 이온 교환 막의 하전된 기 또는 하전된 기들 사이의 정전기적 상호 작용들에 의해 이온 교환 막 내에서 또는 그 위에서 분자가 가역적으로 고정되도록 적절한 조건들 (pH 및/또는 전도도) 하에 분자를 이온 교환 막에 노출시키는 것을 의미한다.

이온 교환 막을 "세정한다"는 것은 이온 교환 막을 통해서 또는 그 위로 적절한 완충액을 통과시키는 것을 의미한다.

이온 교환 막으로부터 분자 (예, 항체 또는 오염물)을 "용출시킨다"는 것은 그로부터 분자를 제거하는 것을 의미한다.

막 크로마토그래피를 위해, "통과액"은 화합물이 보유되지 않는 동안 막에 대한 불순물들의 결합을 의미한다.

막 크로마토그래피를 위해, "경쟁적 흡착"은 주어진 조건에서 막에 대한 하나 이상의 성분의 결합을 의미한다.

막 크로마토그래피를 위해, "과부하 크로마토그래피"는 막에 대한 관심의 화합물과 불순물들 모두의 경쟁적 흡착을 촉진시키는 것을 의미한다. 막은 화합물의 결합 능력 너머로 하중된다. 화합물과 불순물들의 차동 결합 강도를 이용함으로써, 불순물은 더욱 강하게 결합하고, 화합물은 불순물들에 의해 대체되고, 막으로부터 탈착되어 막 유출물로 흐른다.

"변위 크로마토그래피"는 샘플이 컬럼 또는 막 상으로 배치되고, 이어서 원래의 혼합물의 성분들보다 더 강하게 흡착된 용질에 의해 대체되는 크로마토그래피 기수을 의미한다. 결과는 성분들이 용매-분리된 "피크들"보다 오히려 고도로 농축된 순수한 기질들의 연속적인 "직사각형" 구역들 내로 분해된다는 것이다. Tugcu (1994) Methods in Molecular Biology: Vol 421 Affinity Chromatography: Methods and Protocols pp 71-89. 더 높은 생성물 농도, 더 높은 순도 및 증가된 처리량은 다른 크로마토그래피 모드들에 비해 얻어질 수 있다. 변위 크로마토그래피는 다양한 용도들 내의 높은 컬럼 부하들에서 착물 혼합물들로부터 단백질들의 정제를 위한 효율적인 기술이다. 변위 크로마토그래피는 표준 분석 크로마토그래피 컬럼들을 벤치 규모로 사용하여 착물 혼합물들로부터 정제된 단백질들의 mg 정량을 얻기에 매우 적합하다. 그것은 또한 피드 내의 미량 선분들을 풍부화시키는데 특히 매우 접합하다. 변위 크로마토그래피는 이온 교환, HIC 및 RPLC를 포함하는 각종 수지 시스템들을 사용하여 용이하게 수행될 수 있다. Freitag 및 Breier. (1995) J. Chromatogr. A 691, 101-112.

어구 "혼합 모드"는 두 개의 상이한 메커니즘 예를 들면 순 전하에 기초한 분리에 가로 놓인 폴리펩티드들 사이의 친수성/소수성의 차이들에 기초한 분리를 기반으로 화합물을 분리하는 능력을 가진 흡착제를 의미한다. 이것은 종종 이온성 상호 작용 및 수소 결합 또는 소수성 상호 작용을 포함하는 여러 가지 상이한 방식들로 표적 분자와 상호 작용할 수 있는 멀티-모달 리간드를 사용함으로써 달성된다. GE 헬스케어 Capto^TM MMC 및 Capto^TM를 어드히어와 같은 흡수제들은 "혼합 모드" 크로마토그래피 수지들의 예이다.

"깊이 필터"는 매질 전반적으로, 오히려 매질의 표면 상에만 입자들을 유지하도록 다공성 여과 매질을 사용하는 각종 필터이다. 이들 필터들은 다른 유형의 필터들에 대해 상대적으로 이들이 클로깅되기 전에 큰 질량의 입자들을 유지할 수 있기 때문에 여과될 유체가 높은 부하의 입자들을 함유할 때 일반적으로 사용된다.

"모놀리쓰"는 특정 용도에 대해 화학적으로 변경된 다공성 기판으로 구성된 크로마토그래피 매질들을 의미한다. 이온 교환 모놀리쓰들은 전형적으로 더 나은 대량 수송 및 더 낮은 압력들을 초래하는 높은 삼투성 및 짧은 확산 거리들을 나타내고, 더 높은 유동 속도들 및/또는 더 짧은 체류 시간들에서 이들의 사용을 가능케 하는 크로마토그래피의 수지에 대한 대안으로서 개발되어 왔다.

본 발명을 실시하기 위한 방식들

본원에서 본 발명은 폴리펩티드 및 1개 이상의 오염물들을 포함하는 조성물 (예, 수용액)로부터 폴리펩티드를 정제하는 방법들을 제공한다. 조성물은 일반적으로 폴리펩티드의 재조합 생산으로 초래되는 것이지만, 펩티드 합성 (또는 다른 합성 수단)에 의해 폴리펩티드의 생산으로 초래되는 것일 수 있거나 또는 폴리펩티드는 이 폴리펩티드의 천연 소스로부터 정제될 수 있다. 바람직하게는 폴리펩티드는 C_H2/C_H3 영역-함유 폴리펩티드. 이다. 바람직한 구현예들에서, C_H2/C_H3 영역-함유 폴리펩티드는 항체이다.

항체들의 재조합 생산

폴리펩티드의 재조합 생산을 위해, 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 핵산은 추가의 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 단리되어 복제 가능한 벡터 내로 삽입된다. 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA는 통상의 절차들을 사용하여 (예, 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자들에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리되고 서열화된다. 많은 벡터들이 이용될 수 있다. 벡터 성분들은 일반적으로 다음: 즉, 신호 서열, 복제의 기원, 1개 이상의 마커 유전자들, 개선제 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열 (예, 참고 문헌으로서 본원에 구체적으로 인용된 미국 특허 제5,534,615호에 기재된 바와 같음) 중의 1개 이상을 포함하지만 이들로만 제한되지 않는다.

본원에서 벡터들 내의 DNA를 클로닝하거나 또는 발현시키기 위해 적합한 숙주 세포들은 원핵 생물, 효모, 또는 더 고등 진핵 세포이다. 이 목적에 적합한 원핵 생물들은 진정 세균, 예를 들면 그람-음성 또는 그람-양성 유기체들, 예를 들면, 장내 세균, 예를 들면 대장균속, 예, 대장균, 엔테로박터, 에르위니아, 클레브시엘라, 프로테우스, 살모넬라, 예, 쥐티프스균, 세라티아속, 예, 세라티아 마라세스칸스, 및 이질균, 뿐만 아니라 바실루스, 예를 들면 B. 서브틸리스 및 B. 리케니포르미스 (예, 1989년 4월 12일자로 공개된 DD 266,710에 개시된 B. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스, 예를 들면 녹농균, 및 스트렙토마이세스를 포함한다. 다른 균주들, 예를 들면 대장균 B, 대장균 X1776 (ATCC 31,537), 및 대장균 W3110 (ATCC 27,325)이 적합하더라도 하나의 바람직한 대장균 클로닝 숙주는 대장균 294 (ATCC 31,446)이다. 이들 예들은 제한적이기보다는 예시적이다.

원핵 생물들 외에, 진행 미생물들, 예를 들면 사상균 또는 효모는 항체 인코딩 벡터들을 위한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주들이다. 사카로미세스 세르비지에, 또는 일반적인 제빵사의 효모는 저급 진핵 생물 숙주 미생물들 사이에서 가장 통상적으로 사용된다. 그러나, 많은 다른 속들, 종들 및 균주들, 예를 들면 스키조사카로마이세스 폼베; 클루이베로마이세스 숙주들, 예를 들면, 예, K. 락티스, K. 프래길리스 (ATCC 12,424), K. 불가리쿠스 (ATCC 16,045), K. 위커라미 (ATCC 24,178), K. 왈티 (ATCC 56,500), K. 드로소필라룸 (ATCC 36,906), K . 테르모톨레란스, 및 K. 마르시아너스; 야로이야 (EP 402,226); 피키아 파스토리스 (EP 183,070); 칸디다; 트리코데르마 리지어 (EP 244,234); 빵곰팡이; 쉬반니오마이세스, 예를 들면 쉬반니오마이세스 옥시덴탈리스; 및 사상균, 예를 들면, 예, 빵곰팡이, 푸른곰팡이, 톨리포클라디움, 및 누룩곰팡이속 숙주들, 예를 들면 A. 니둘란스 및 A. 니게르.가 본원에서 이용될 수 있고, 유용하다.

글리코실화된 폴리펩티드의 발현을 위해 적합한 숙주 세포들은 다세포 유기체들로부터 유도된다. 무척추 동물 세포들의 예들은 식물 및 곤충 세포들을 포함한다. 수많은 배큘로바이러스 균주들 및 변종들 및 숙주들로부터 대응하는 허용되는 곤충 숙주 세포들, 예를 들면 스포도프테라 프루기페르다 (애벌레), 아에데스 아에기프티 (모기), 아에데스 알보픽투스 (모기), 노랑 초파리 (과실파리), 및 누에 나방이 확인되었다. 형질 감염을 위한 각종 바이러스성 균주들, 예, 오토그라파 캘리포니아 NPV의 L-1 변종 및 누에나방 NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 이용될 수 있고, 그러한 바이러스들은 본 발명에 따라, 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포들의 형질 감염을 위해 본원에서 바이러스로서 사용될 수 있다. 면화, 옥수수, 감자, 대두, 피튜니아, 토마토, 담배의 식물 세포 배양액들은 숙조들로서 이용될 수도 있다.

그러나, 척추 동물 세포들에 관심이 커졌고, 배양액 (조직 배양액)에서 척추 동물 세포들의 전파는 일상의 절차가 되고 있다. 유용한 포유 동물 숙주 세포주들의 예들은 SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651)에 의해 형질 전환된 원숭이 신장 CV1 세포들; 현탁액 배양액에서 성장을 위해 서브클로닝된 인간 배아 신장 세포들 (293 또는 293 세포들, Graham 등, J. Gen Virol.를 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는다. 36:59 (1977)); 아기 햄스터 신장 세포들 (BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포들/-DHFR (CHO, 울라웁 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 생쥐 세르톨리 세포들 (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포들 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포들 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁 경부 암종 세포들 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포들 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 쥐 간 세포들 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포들 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포들 (Hep G2, HB 8065); 생쥐 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포들 (Mather 등, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포들; FS4 세포들; 및 인간 간암 세포들 (Hep G2). 종종, CHO 세포들은 항체들의 발현을 위해 바람직하고, 본 발명에 따라 정제된 항체들을 생산하기 위해 유리하게 사용될 수 있다.

숙주 세포들은 폴리펩티드 생산을 위한 상기 발현 및 클로닝 벡터들에 의해 형질 전환되고, 프로모터들을 생산하거나, 형질 전환체들을 선택하거나 또는 원하는 서열들을 인코딩하는 유전자들을 증폭시키기 위해 적절하게 변형된 종래의 영양 배지 중에서 배양된다.

본 발명의 폴리펩티드를 생산하기 위해 사용된 숙주 세포들은 각종 매질 중에서 배양될 수 있다. 시판 중인 매질, 예를 들면 Ham's F10 (Sigma), 최소 필수 배지 ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), 및 둘베코의 개질된 이글 배지 ((DMEM), Sigma)가 숙주 세포들을 배양하기에 적합하다. 또한, Ham 등, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes 등, Anal. Biochem.102:255 (1980), 미국 특허 번호들 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 Patent Re. 30,985에서 기재된 임의의 배지는 숙주 세포들을 위한 배양 배지로서 사용될 수 있다. 이들 매질중의 임의의 것은 호르몬들 및/또는 다른 성장 인자들 (예를 들면 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염들 (예를 들면 염화 나트륨, 칼슘, 마그네슘, 및 인산염), 완충액들 (예를 들면 HEPES), 뉴클레오티드들 (예를 들면 아데노신 및 티미딘), 아미노글리코사이드 항생제들 (예를 들면 겐타마이신), 미량 원소들 (통상적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도들로 존재하는 무기 화합물들로서 정의됨), 및 포도당 또는 등가의 에너지원으로 필요에 따라 보충될 수 있다 임의의 다른 필요한 보충물들이 당업계의 숙련자들에게 공지될 수 있는 적절한 농도에서 포함될 수도 있다. 배양액 조건들, 예를 들면 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것들이고, 당업계의 통상의 기술을 가진 자들에게 명백 할 것이다.

재조합 기술들을 사용할 때, 폴리펩티드는 주변 세포질 공간에서 세포 내로 생산될 수 있거나, 또는 배지 내로 직접적으로 분비될 수 있다. 폴리펩티드가 제1 단계로서 세포 내로 생산되는 경우, 숙주 세포들 또는 용균된 세포들인 미립자 파편 (예, 균질화로부터 초래됨)은 예를 들면 원심 분리 또는 한외 여과에 의해 제거된다. 폴리펩티드가 배지 내로 분비되는 경우, 그러한 발현 시스템들로부터의 상층액은 아미콘 또는 밀리포어 펠리콘 한외 여과 단위와 같은 시판중인 단백질 농축 필터를 사용하여 농축될 수 있다.

본 발명의 한 측면은 CEX 컬럼들에 대한 겐타마이신의 영향을 고려한다. 겐타마이신, 및 다른 아미노글리코사이드 항생제들은 비-저항 오염을 방지하기 위해 세포 배양액 용도들에서 살균 첨가제로서 사용될 수 있다. 세포 배양액에 첨가될 때 그것은 공정 관련된 불순물로서 제거되어야 한다. 전형적인 제거는 친화도 크로마토그래피 단계를 사용하여 수행되지만, 일부 공정들에서 친화도 단계는 제1 정제 단계가 아닐 것이다.

양이온성 아미노글리코사이드 항생제로서, 겐타마이신은 중성 pH에서 또는 그 미만에서 양으로 하전된다. CEX 컬럼이 중성 pH에서 또는 그 미만에서 관심의 폴리펩티드의 결합의 의도를 갖는 제1 크로마토그래피 단계인 경우, 겐타마이신은 컬럼 상의 결합 부위들에 대해 경쟁하게 될 것이다. 이전 작업은 겐타마이신이 항체보다 CEX 막 또는 수지에 대해 더 강하게 결합할 것임을 나타내고 있다. CEX 컬럼에 대한 효과는 항체 결합 능력의 명백한 감소이다.

본 발명의 또 다른 측면은 CEX 컬럼들에 대한 폴리에틸렌이민의 (PEI) 또는 다른 양이온성 중합체들의 영향을 고려한다. PEI는 대장균 폴리펩티드 정제 공정들에서 수확전 응집제로서 사용될 수 있다. PEI가 세포 균질화 단계 후에 첨가될 때, 그것은 불순물 결합제로서 작용하고, 원심 분리 및 여과 모두를 더 강력한 공정들로 만든다. 이 단계와 통합된 우려는 불순물들을 응집시키는데 사용되지 않는 임의의 여분의 PEI의 효과이고, 이는 그 후에 결국 CEX 컬럼들과 접촉하게 되는 정제 풀들에 남아있기 때문이다.

선형 내지 분지형 중합체에 이르는 범위의 PEI의 많은 다른 형태들이 있으며, 이들은 1급, 2급 또는 3급 아민을 포함할 수 있다. PEI의 형상은 그것이 대부분의 처리 조건들에서 양으로 하전된다는 사실과 같은 우려의 정도는 아니다. 따라서 그것은 CEX 컬럼에 매우 강하게 결합할 것이다. 더욱이, 대부분의 대장균 단백질들을 위한 제1 크로마토그래피 단계는 이들의 상대적으로 높은 결합 능력들로 인해 CEX 컬럼일 수 있다. 또한, PEI에 대한 CEX 컬럼의 강한 결합으로 인해, 그것은 때때로 더 약한 CEX 컬럼의 사용을 요구함으로써 PEI는 각각의 수행 후에 컬럼으로부터 용출될 수 있다.

이전 작업은 PEI의 다양한 수준들이 응집을 위해 사용될 때 CEX 컬럼의 결합 능력은 더 낮은 PEI가 사용됨에 따라 증가할 것임을 보여 주었다. CEX 크로마토그래피 단계 수율은 부하된 PEI의 더 낮은 수준들에 의해 증가할 것임이 또한 관찰되었다.

불순물들을 줄이기 위해 이온 교환 컬럼 이전에 마찬가지로 하전된 이온 교환 막을 사용하는 것은 결합 능력, 수율, 불순물 청소능에서 증가응 초래할 수 있고, 이들 모두는 더 효율적인 공정 및 감소된 운영 비용들을 가능하게 할 수 있다.

본 발명의 막 이온 교환 크로마토그래피 방법

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본원의 정제 방법에 적용되어야 할 조성물은 재조합으로 생산된 폴리펩티드, 바람직하게는 중국 햄스터 난소 (CHO) 또는 대장균 재조합 숙주 세포 배양액에 의해 발현된 손상되지 않은 항체이다. 선택적으로, 조성물은 막 이온 교환 크로마토그래피 이전에 적어도 하나의 정제 단계에 적용되었다. 조성물은 관심의 폴리펩티드 및 1개 이상의 오염물들, 예를 들면 중국 햄스터 난소 단백질들 (CHOP); 대장균 단백질들 (ECP); 침출된 단백질 A; 핵산; 원하는 항체의 변종, 단편, 집합체 또는 유도체; 또 다른 폴리펩티드; 엔도톡신; 바이러스성 오염물; 아미노글리코사이드 항생제 성분들 (예, 겐타마이신); 또는 정제 공정에 첨가된 음이온성 중합체 (예, 폴리에틸렌이민 (PEI), 폴리비닐아민, 폴리아르기난, 폴리비닐술폰 산, 폴리아크릴산), 등을 함유한다.

막 이온 교환 크로마토그래피 방법 이전에, 그 동안에 또는 그 후에 수행될 수 있는 추가의 정제 절차들의 예들은 소수성 상호 작용 크로마토그래피 상의 분획화 (예, PHENYL-SEPHAROSE^TM 상에서), 에탄올 침전, 열적 침전, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 침전, 등전위 포커싱, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, HEPARIN SEPHAROSE^TM 상의 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 혼합 모드 이온 교환, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산 암모늄 침전, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 연기 영동, 투석, 친수성 전하 유도 크로마토그래피, 고성능 접선 흐름 여과 (HPTFF), 및 친화도 크로마토그래피 (예, 포획 시약으로서 단백질 A, 단백질 G, 항체, 또는 특이적 기판, 리간드 또는 항원을 사용함)를 포함한다.

재조합 기술들을 사용할 때, 폴리펩티드는 주변 세포질 공간에서 세포 내로 생산될 수 있거나, 또는 배지 내로 직접적으로 분비될 수 있다. 폴리펩티드가 제1 단계로서 세포 내로 생산되는 경우, 숙주 세포들 또는 용균된 단편들인 미립자 파편은 예를 들면, 원심 분리 또는 여과에 의해 제거된다. 폴리펩티드가 배지 내로 분비되는 경우, 재조합 숙주 세포들은 예를 들면 원심 분리 또는 여과에 의해 세포 배양 배지로부터 분리될 수 있다.

항체들을 단리하는 경우에, 정제의 대부분은 제1 단계로서 사용되는 경우의 단백질 A 친화도 크로마토그래피 동안 발생한다. 단백질 A는 항체들의 Fc 영역에 특이적으로 결합하는 세균 세포벽 단백질이다. 크로마토그래피 배지 상으로 고정된 경우, 단백질 A는 그것이 착물 용액들 내의 항체들에 선택적으로 결합할 수 있고, 불순물들이 그를 통해 흐르도록 허용하기 때문에 재조합 항체들을 정제하기 위한 기술을 제공한다.

단백질 A 친화도 컬럼의 기본 프로토콜은 간단하다: 즉, 거의 중성 pH에서 결합하고 산성 pH에서 용출된다. 고체상에 고정된 단백질 A는 C_H2/C_H3 영역-함유 폴리펩티드를 정제하기 위해 사용된다. 고체 상은 바람직하게는 단백질 A를 고정시키기 위해 유리, 실리카, 한천 또는 폴리스티렌디비닐벤젠 표면을 포함하는 컬럼이다. 바람직하게는, 고체 상은 조절된 공극 유리 컬럼, 규산 컬럼, 또는 고도로 가교된 한천 컬럼이다. GE 헬스케어에서 상업적으로 입수할 수 있는 맙셀렉트 SuRe^TM 컬럼은 항체들을 정제하는데 효과적인 고도로 가교된 한천 단백질 A 컬럼의 예이다. 때때로, 컬럼은 시약, 예를 들면 컬럼에 대한 비특이적 접착을 방지하기 위한 시도로서 글리세롤에 의해 코팅되었다. 밀리포어 사로부터 상업적으로 입수할 수 있는 PROSEP A^TM 컬럼은 글리세롤로 코팅된 단백질 A 제어된 공극 유리 컬럼의 예이다. 단백질 A 크로마토그래피를 위한 고체상은 적합한 완충액에 의해 평형화된다.

재조합 숙주 세포들로부터 유래된 오염된 제제는 평형 완충액과 동일할 수 있는 로딩 완충액을 사용하여 평형화된 고체 상 위로 부하된다. 오염된 제제가 고체 상을 통해 흐를 때, 폴리펩티드는 고정화된 단백질 A에 흡착되고, 다른 오염물들 (예를 들면 중국 햄스터 난소 단백질들, CHOP, 여기서 폴리펩티드는 CHO 세포, 겐타마이신, 및 폴리에틸렌이민 (PEI)에서 생산됨)은 고체 상에 비특이적으로 결합한다.

수행된 다음 단계는 중간 세척 단계에서 염, 아미노산, 및/또는 소수성 전해질 용매를 함유하는 용액으로 고체 상을 세척함으로써 고체 상에 결합된 오염물들을 제거하는 단계를 순차로 수반한다. 바람직한 구현예들에서, 이러한 세척 단계에서 염은 인산 칼륨이고, 아미노산은 아르기닌이고, 소수성 전해질은 TEMAC 및/또는 TEAC이다. 하나의 용질이 세척액에 존재할 수 있지만, 특정 구현예들에서, 둘 이상의 이러한 용질들이 사용될 수 있다. 용질(들)은 바람직하게는 거의 중성에서 pH를 갖는 pH 완충된 용액에 첨가된다.

전 단락의 중간 세척 단계 후에, 관심의 폴리펩티드는 컬럼으로부터 회수된다. 이것은 일반적으로 적합한 용출 완충액을 사용하여 달성된다. 폴리펩티드는 예를 들면 예, 약 2 내지 약 5, 바람직하게는 약 2.5 내지 약 3.5 범위에서 낮은 pH를 갖는 용출 완충액을 사용하여 칼럼으로부터 용출될 수 있다. 이 목적을 위해 용출 완충액들의 예들은 구연산 또는 아세테이트 완충액들을 포함한다.

막 이온 교환 크로마토그래피는 본원에 특허 청구된 바와 같이 수행된다. 결정은 음이온 또는 양이온 교환 막이 사용되어야 하는지 여부에 관하여 먼저 판정된다. 일부 항체들의 등전점 (pI)은 대략적으로 6.7 내지 9.4 범위이지만, 많은 항체들의 pI는 높다 (종종 >8 및 때때로 >9). 일반적으로, 양이온 교환 막은 약 8을 초과하는 pI를 갖는 항체들을 위해 사용될 수 있고, 음이온 교환 막은 약 8 미만인 pI를 갖는 항체들을 위해 사용될 수 있다.

막 양이온 교환 크로마토그래피는 과부하 모드로 실행되기 때문에, 부하 물질의 pH는 항체의 pI 미만의 약 1 내지 약 5 pH 단위들로 조절되고, 부하 물질의 전도도는 pH에 따라 ≤ 약 40 mS/cm로 조절되고, 이어서 항체는 막을 통해 펌핑된다. 일부 구현예들에서, 부하 물질의 pH는 항체의 pI 미만의 약 1 내지 4 pH 단위, 약 1 내지 3 pH 단위, 약 1 내지 2 pH 단위, 또는 약 1 pH 단위로 조절된다. 다른 구현예들에서, 부하 물질의 전도도는 pH에 따라 ≤ 약 20 mS/cm 또는 ≤ 약 10 mS/cm로 조절된다. 부하의 pH는 항체의 pI 미만이기 때문에, (양으로 하전되게 되는) 항체는 초기에 흐르지 않을 것이다. 오히려, 항체는 양이온 교환기의 음의 기능기들에 정전기적으로 결합될 것이다. 이는 항체 (양성) 및 막 (음성)이 반대 전하를 갖기 때문이다. 단백질 A 친화도 크로마토그래피 동안 항체에 의해 용출되는 많은 오염물들, 예, 숙주 세포 단백질들, 예를 들면 CHOP 또는 ECP, 아미노글리코사이드 항생제들, 예를 들면 겐타마이신, 및 음이온성 중합체 첨가제들, 예를 들면 폴리에틸렌이민 (PEI)의 pI는 항체의 pI와 단지 약간 다르기 때문에, 즉, pI들은 단지 약 0.05 내지 약 0.2 pI 단위들 만큼 상이할 수 있기 때문에, "염기성" 항체들과 같은 이들 오염물들은 또한 막에 결합할 것이다. 단백질 A 크로마토그래피가 사용되지 않는 정제 도식들에서, 겐타마이신 또는 PEI 또는 다른 불순물들은 막이 사용되지 않는 한 IEX 컬럼의 성능을 방해하기에 충분히 높은 농도로 남겨질 것이다. 이론에 얽매이지 않고, 과부하 모드로, 최소 이온 차폐에 의해 전하를 유도하는 pH 및 전도도 조건들에서 실행되는 막 양이온 교환 크로마토그래피를 위해 경쟁적 흡착이 발생하고, 오염물들이 막에 우선적으로 결합하거나, 또는 그렇지 않으면 막으로부터 항체를 효과적으로 "대체할 수 있는" 것으로 보인다 (RR Drager, FE Regnier, J Chromatogr. 359:147-55 (1986)), 항체가 매트릭스로부터 "용출되거나" 또는 결합 후 그를 통해 흐르게 하고, 유출액으로부터 회수될 수 있게 허용한다.

과부하 모드로 실행되는 막 음이온 교환 크로마토그래피를 위해, 부하 물질의 pH는 항체의 pI를 초과하는 약 1 내지 약 5 pH 단위로 조절되고, 부하 물질의 전도도는 pH에 따라 ≤ 약 40 mS/cm로 조절되고, 이어서 항체는 막을 통해 펌핑된다. 일부 구현예들에서, 부하 물질의 pH는 항체의 pI를 초과하는 약 1 내지 4 pH 단위, 약 1 내지 3 pH 단위, 약 1 내지 2 pH 단위, 또는 약 1 pH 단위로 조절된다. 다른 구현예들에서, 부하 물질의 전도도는 pH에 따라 ≤ 약 20 mS/cm 또는 ≤ 약 10 mS/cm로 조절된다. 부하의 pH는 항체의 pI를 초과하기 때문에, (음으로 하전되게 되는) 항체는 초기에 흐르지 않을 것이다. 오히려, 항체는 양이온 교환기의 양의 기능기들에 정전기적으로 결합될 것이다. 이는 항체 (음성) 및 막 (양성)이 반대 전하를 갖기 때문이다. 단백질 A 친화도 크로마토그래피 동안 항체에 의해 용출되는 많은 오염물들, 예를 들면, 숙주 세포 단백질들, 예컨대 CHOP의 pI는 항체의 pI와 단지 약간 다르기 때문에, 즉, pI들은 단지 약 0.05 내지 약 0.2 pI 단위들 만큼 상이할 수 있기 때문에, "산성" 항체들과 같은 이들 오염물들은 또한 막에 결합할 것이다. 이론에 얽매이지 않고, 과부하 모드로, 최소 이온 차폐에 의해 전하를 유도하는 pH 및 전도도 조건들에서 실행되는 막 음이온 교환 크로마토그래피를 위해 경쟁적 흡착이 발생하고, 오염물들이 막에 우선적으로 결합하거나, 또는 그렇지 않으면 막으로부터 항체를 효과적으로 "대체할 수 있는" 것으로 보인다 (RR Drager, FE Regnier, J Chromatogr. 359:147-55 (1986)), 항체가 매트릭스로부터 "용출되거나" 또는 결합 후 그를 통해 흐르게 하고, 유출액으로부터 회수될 수 있게 허용한다.

일 실시예에서, 막 크로마토그래피는 표준 크로마토그래피 시스템이나 또는 압력 게이지들, 센서들, 및 펌프 플러스 펌프 조절기들이 장착된 AKTA^TM Explorer (GE Healthcare)와 같은 사용자 지정 크로마토그래피 시스템 상에서 실행된다 이 실시예에서, 막 장치는 압력 게이지의 다운스트림에 설치된다. 상기 실시예에서, pH 및 전도도 검출기들은 막 장치의 다운스트림에 설치된다. 이 실시예를 계속하면, 시스템은 물로 플러싱되고, 이어서 막을 설치하기 전에 평형 완충액으로 플러싱된다. 이 실시예를 추가로 계속하면, 막을 갖는 시스템은 용액의 pH 및 전도도 배출 수단이 평형 완충액 사양에 일치하고 (약 5 막 부피) 안정한 기준이 관찰될 때까지 평형 완충액에 의해 플러싱된다. 이 실시예를 더 추가로 계속하면, 피드 물질은 333 - 2667 MV/시간으로, (가상의 "염기성" 항체의 정제를 위해) pH 5.5에서, (가상의 "산성" 항체의 정제를 위해) pH 8.0에서, 및 대략적으로 4 mS/cm 의 전도도에서 펌프에 의해 부하된다. 이 실시예를 여전히 추가로 계속하면, 작동 배압, 및 작동시 pH 및 전도도 변화가 기록된다. 마지막으로, 이 실시예에서, 막 유출물 중의 폴리펩티드는 280 nm에서 자외선 (UV) 흡광도 추적이 기준선을 초과하는 0.2 흡광도 단위일 때 즉시 수집된다. 피드 물질을 로딩한 후, 막은 적절한 세척 완충액으로 세척되고, 및 풀 수집은 일단 280 nm에서 UV 흔적이 0.2 흡광도 단위들 미만이면 정지되고 막 유출물 분획 중의 풀로부터 샘플들은 폴리펩티드 농도, 이량체/집합체 레벨l, 숙주 세포 단백질들, DNA, 및 침출된 단백질 A에 대해 분석된다. 단계 회복은 일반적으로 부하된 폴리펩티드 및 막 유출물 중의 폴리펩티드를 사용하여 산출된다. 막은 전통적으로 단지 일회용이다.분석 시험법에 관하여, 폴리펩티드 함량 (폴리펩티드 농도)는 베크만 분광 광도계를 이용하여 280 nm에서 흡광도에 의해 결정될 수 있다. 폴리펩티드 집합체는 크기-배제 크로마토그래피에 의해 결정될 수 있다. 숙주 세포 단백질, 예, CHOP 또는 ECP, 레벨들은 효소-링크된 면역 흡착제 분석 (ELISA)에 의해 분석될 수 있다. 숙주-세포 DNA는 TaqMAN PCR (중합 효소 연쇄 반응)의 사용에 의해 정량화될 수 있다. 침출된 단백질 A는 단백질 A 수지 벤더에 의해 권장되는 면역 화학적 ELISA-기반의 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 겐타마이신은 ELISA 및 폴리에틸렌이민 (PEI)에 의해 분석될 수 있고, 레벨들은 Q 세파로스 고속 흐름 크로마토그래피 또는 핵 자기 공명 (NMR)에 의해 정량화될 수 있다.

다음 완충액들은 S 막과 함께 사용하기 위해 가설에 의해 설계되고 시험된다: (1) 89 mM 아세트산, 127 mM 트리스 염기, 21 mM 구연산, pH 5.5, 6.0 mS/cm, (2) 28 mM MES, 95 mM NaCl, pH 6.0, 11 mS/cm, (3) 200 mM NaOAc, pH 5.5, 12 mS/cm, (4) 100 mM NaOAc, pH 5.5, 6.4 mS/cm, (5) 96 mM 아세트산, 65 mM 트리스, pH 5.0, 3.6 mS/cm, (6) 25 mM MOPS, pH 7.1, 0.8 mS/cm, (7) 50 mM HEPES, 90 mM NaCl, pH 7.0, 10 mS/cm, (8) 0.5x 인산염 완충된 식염수 (PBS), 4.5 mM 아세트산, pH 5.0, 8.0 mS/cm, 25 mM NaOAc, pH 5.0, 6.0 mS/cm.

다음 완충액들은 Q 막과 함께 사용하기 위해 가설에 의해 설계되고 시험된다: (1) 50 mM 트리스, 15 mM NaCl, pH 8.0, 4.3 mS/cm, (2) 25 mM 트리스, pH 8.0, 1.3 mS/cm, (3) 60 mM 트리스, 118 mM NaCl, pH 8.0, 15.7 mS/cm, (4) 50 mM 트리스, 50 mM NaOAc, pH 8.0, 7.0 mS/cm, (5) 25 mM HEPES, 85 mM NaOAc, pH 7.0, 6.5 mS/cm, 및 (6) 91 mM 아세트산, 130 mM 트리스, pH 8.0, 5.0 mS/cm, (7) 75 mM 글리신, 9 mM 인산, 115 mM 트리스, pH 8.9, 0.8 mS/cm (8) 25 mM 트리스, 5 mM NaCl, pH 8.9, 1.0 mS/cm. (9) 25 mM 트리스, 10 mM NaCl, pH 9.0, 1.5 mS/cm, (10) 1x 인산염 완충된 식염수 (PBS), pH 7.3, 15.2 mS/cm

추가로, 임의의 완충액 시스템은 적합한 pH에 도달하도록 아세트산, 구연산, HEPES, 염산, 인산, 수산화 나트륨, 트리스, 또는 다른 그러한 산성 및 염기성 완충액들의 부가에 의해 상향 또는 하향으로 pH 조절될 수 있다. 임의의 완충액 시스템은 적합한 전도도에 도달하도록 정제수, 주사용 물 (WFI), 아세트산 나트륨, 염화 나트륨, 인산 칼륨, 또는 기타 그러한 낮은 염 및 높은 염 함유 완충액들을 사용하여 상향 또는 하향으로 전도도 조절될 수 있다.

경쟁적 흡착 막 크로마토그래피 단계의 개발은 다양한 레벨들의 pH 및 전도도에서 막을 통해 부하 물질을 실행시키는 것을 포함한다. 폴리펩티드의 유지를 위해, 관심의 폴리펩티드 또는 오염물은 분자가 큰 정전기적 상호 작용을 가질 때 증진될 수 있다. 정전기적 상호 작용들은 폴리펩티드들이 고도로 하전된 조건들 하에 작동될 때, 즉, 폴리펩티드의 pI와 충분히 구별되는 pH를 갖는 완충액을 사용할 때 중진될 수 있고, 폴리펩티드의 전하, 및 낮은 이온성 강도를 증진시켜 완충액 이온들에 의해 전하들의 차폐를 방지한다. 이와 대조적으로, 정전기적 상호 작용들은 폴리펩티드들이 불량하게 하전된 조건들 하에 작동될 때, 즉, 폴리펩티드의 pI와 충분히 근접한 pH를 갖는 완충액을 사용할 때 감소될 수 있고, 폴리펩티드의 전하, 및 높은 이온성 강도를 감소시켜 완충액 이온들에 의해 전하들의 차폐를 허용한다. 결과적으로, 상이한 물리-화학적 특성들을 갖는 폴리펩티드들은 완충액 용액을 최적화함으로써 막 흡착에 의해 분리될 수 있다. 일부 분자들은 주어진 막 상에 유지될 수 있는 한편 다른 분자들은 완충액의 pH 및 이온성 강도의 적절한 선택에 기초하여 그를 통해 흐른다.

본원에서 막 이온 교환 크로마토그래피 방법에 따라 얻어진 폴리펩티드 제제는 필요할 경우 추가의 정제 단계들에 적용될 수 있다. 예시적인 추가의 정제 단계들이 상기 고찰되었다.

도 1을 참조하면, 항체에 대한 성공적인 정제 도식의 일 실시예는 단백질 A 친화도 크로마토그래피의 초기 포획 단계, 결합 및 용출 모드로 실행되는 양이온 교환 컬럼, 이어서 최종 연마 단계 또는 단계들을 수반하는 회수 공정이다.

도 1을 참조하면, 개선된 정제 도식의 하나의 실시예는 항체에 대한 성공적인 정제 도식의 일 실시예는 단백질 A 친화도 크로마토그래피의 초기 포획 단계, 결합 및 용출 모드로 실행되는 양이온 교환 컬럼을 보호하는 과부하 모드로 실행되는 양이온 교환 막, 이어서 최종 연마 단계 또는 단계들을 수반하는 회수 공정이다.

도 1을 참조하면, 개선된 정제 도식의 또 다른 실시예는 결합 및 용출 모드로 실행되는 양이온 교환 컬럼을 보호하는 과부하 모드로 실행되는 초기 양이온 교환 막, 이어서 최종 연마 단계 또는 단계들을 수반하는 회수 공정이다.

도 2를 참조하면, 비-항체를 위한 성공적인 정제 도식의 일 실시예는 양이온 교환 크로마토그래피의 초기 포획 단계, 이어서 최종 연마 단계 또는 단계들을 수반하는 회수 공정이다.

도 2를 참조하면, 개선된 정제 도식의 일 실시예는 결합 및 용출 모드로 실행되는 양이온 교환 컬럼을 보호하는 과부하 모드로 실행되는 초기 양이온 교환 막, 이어서 최종 연마 단계 또는 단계들을 수반하는 회수 공정이다.

주로 단일 정제 단계 또는 최종 연마 단계로서 IEX 막들을 사용하는 용도들과 달리, 본 발명의 정제 방법에서 막들은 유사하게 하전된 이온 교환 막 (예, 양이온 교환 수지 앞에 직접적으로 배치된 양이온 교환 막)을 보호하기 위해 사용되는 것이다. 이것은 막들이 폴리펩티드들/항체들보다 불순물들에 대해서 더 선택적이거나 또는 컬럼 상으로 가는 불순물들을 제거하기 때문에 유리하다. 이 불순물들은 폴리펩티드/항체를 대체할 수도 있음으로써 그것은 결국 컬럼 상으로 그의 길을 만든다. 막들은 상기 컬럼에 의해 연속적으로 또는 비연속적으로 사용될 수 있다.

이러한 정제 방법에서 유사하게 하전된 이온 교환 컬럼에 앞서 막득을 사용하는 것은 부하 중의 불순물들이 양이온 교환 컬럼의 성능을 감소시킬 때마다 유리할 수 있다. 이들 불순물들을 막에 의해 제거함으로써, 더 높은 결합 능력으로 로딩될 양이온 교환 컬럼을 허용할 수 있고, 감소된 컬럼 크기 또는 실행당 감수된 수의 주기를 초래한다. 대안으로, 이들 불순물들을 막에 의해 제거함으로써, 양이온 교환 컬럼이 증가 단계 수율을 갖거나, 또는 폐기되기 전에 더 긴 수지 수명을 갖거나, 또는 양이온 교환 풀에서 감소된 불순물 레벨들을 초래하거나, 또는 다운스트림 연마 단계들의 수를 감소시키는 것을 허용한다. 단백질 A 친화도 수지에 대한 더 저렴한 대안이 필요한 경우, 또는 관심의 폴리펩티드가 단백질 A 친화도 수지에 결합되지 않을 경우에 유리할 수 있는 단백질 A 친화도 컬럼을 대체하도록 양이온 교환 컬럼을 허용할 수도 있다. 연속 작동에 양이온 교환 막 및 양이온 교환 컬럼을 사용하는 것은 전체 처리 시간, 완충액들, 또는 장비, 예를 들면 탱크들 또는 크로마토그래피 스키드들을 감소시킴으로써 유리할 수 있다.

선택적으로, 폴리펩티드는 원하는 바의 1개 이상의 이종 분자들에 콘주게이트된다. 이종 분자는 예를 들면 폴리펩티드 (예, 폴리에틸렌 글리콜, PEG)의 혈청 반감기를 증가시키는 것일 수 있거나, 또는 하나의 라벨 (예, 효소, 형광 라벨 및/또는 방사선 핵종), 또는 세포 독성 분자 (예, 독소, 화학 요법 약물, 또는 방사성 동위원소 등)일 수 있다.

이종 분자에 의해 선택적으로 콘주게이트된 폴리펩티드를 포함하는 치료 제형은 원하는 정도의 순도를 갖는 폴리펩티드를 선택적인 제약학적으로 허용되는 담체들, 부형제들 또는 안정화제들과 혼합함으로써 제조될 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences 제16판, Osol, A. Ed. (1980)), 동결 건조된 제형들 또는 수용액들의 형태로. "제약학적으로 허용 가능한" 담체들, 부형제들, 또는 안정화제들은 사용된 복용량 및 농도들에서 수혜자들에게 무독성이며, 완충액들, 예를 들면 인산염, 구연산염, 및 다른 유기 산들; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제들; 방부제들 (예를 들면 염화 옥타데실디메틸벤질 암모늄; 염화 헥사메토늄; 염화 벤잘코늄, 염화 벤제토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤들, 예를 들면 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 클로로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10 미만의 잔기들) 폴리펩티드; 단백질들, 예를 들면 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 이뮤노글로불린들; 친수성 중합체들, 예를 들면 폴리비닐피롤리돈; 아미노산들, 예를 들면 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 포도당, 만노스 또는 덱스트린들을 포함하는 기타 탄수화물들; 킬레이트제들, 예를 들면 EDTA; 당류, 예를 들면 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온들 예를 들면 나트륨; 금속 착물들 (예, Zn-단백질 착물들); 및/또는 비-이온성 계면 활성제들, 예를 들면 TWEEN^TM, PLURONICS^TM 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)를 포함한다.

활성 성분들은 또한 제조된 마이크로캡슐 내에, 예를 들면, 코아세르베이션 기술들에 의해 또는 계면 중합 반응에 으해, 예를 들면, 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에서 각각, 콜로이드성 약물 전달 시스템들 (예를 들면, 리포좀들, 알부민 미소구들, 마이크로에멀전들, 나노-입자들 및 나노캡슐들) 또는 매크로에멀젼들 내에서 트래핑될 수 있다. 그러한 기술들은 Remington's Pharmaceutical Sciences 제16판, Osol, A. Ed. (1980)에 기재되어 있다.

생체내 투여를 위해 사용될 제형은 멸균되어야 한다. 이것은 멸균 여과 막들을 통해 여과에 의해 용이하게 수행된다.

서방형 제제들이 제조될 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예들은 폴리펩티드를 함유하는 고체 소수성 중합체들의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 그의 매트릭스는 성형된 물품들, 예, 필름들, 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 서방형 매트릭스들의 예들은 폴리에스테르, 하이드로겔들 (예를 들어, 폴리 (2-히드록시에틸-메타 크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드들 (미국 특허. 번호 3,773,919), L-글루탐산의 공중합체들 및 γ 에틸-L-글루타메이트, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체들, 예를 들면 LUPRON DEPOT^TM (락트 산-글리콜 산 공중합체 및 류프로라이드 아세테이트으로 구성된 주사가능한 미소구들), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다.

본원에 개시된 바와 같이 정제된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드와 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물은 이어서 그러한 폴리펩티드들 및 조성물들에 대해 공지된 다양한 진단, 치료 또는 기타 용도들을 위해 사용된다. 예를 들면, 폴리펩티드는 치료 유효량의 폴리펩티드를 포유 동물에 투여함으로써 포유 동물에서 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다.

다음 실시예(들)은 제한하고자 함이 아니라 예시하기 위해 제공된다. 본 명세서에서 모든 인용들의 개시 내용들은 본원에 참고로 명백히 혼입된다.

실시예들

실시예 1

도입

이 연구는 다운스트림 컬럼들의 효율을 증진시키기 위해 경쟁적 흡착 모드로 이온 교환 막들을 사용하는 모노클로날 항체들의 정제에 초점을 맞춘다. 경쟁적 흡착 모드로 작동하는 막들은 모노클로날 항체들 또는 관심의 다른 폴리펩티드들보다 더 강력하게 많은 불순물들에 결합하기 때문에, 막은 유사하게 하전된 다운스트림 컬럼에 해로운 영향을 미칠 수 있는 불순물들을 효과적으로 제거한다.

이 접근법은 쓸모없는 양이온 교환 또는 음이온 교환 정제 단계들을 제거하고자 하는 많은 정제 공정들에 대해 직관에 반대한다. 본 출원에서, 다운스트림 컬럼에 앞서 불필요한 막은 전체적인 공정이 더 효율적이도록 컬럼의 성능을 향상시킬 수 있다.

mAb를 유도한 하나의 재조합 DNA, 외팔 항체를 유도한 하나의 재조합 DNA, 및 폴리펩티드를 유도한 하나의 재조합 DNA는 그들의 분자 다양성에 기초한 분석을 위해 선택되었다. mAb는 CHO 세포 배양액들에서 생산되었고 크로마토그래피 정제 없음에서 3회의 컬럼 크로마토그래피 단계들 (단백질 A, 음이온 교환, 및 양이온 교환)에 이르는 범위의 정제 정도에서 변화되었다. 외팔 항체는 대장균 세포 배양액들에서 생산되었고 단백질 A 크로마토그래피 단계를 통해 정제되었다. 폴리펩티드는 대장균 세포 배양액들에서 생산되었고, 어떠한 사전 크로마토그래피 정제도 없었다. 공급 스트림들은 크로마토그래피 컬럼에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 불순물들의 잔류 수준들에 따라 선택되었다.

이 연구는 이온 교환 컬럼들에 부정적인 영향을 미치는 불순물들, 예를 들면 겐타마이신 및 폴리에틸렌이민 (PEI)의 능력 및 개선된 컬럼 성능을 초래하는 불순물들을 청소하기 위한 이온 교환 막들, 예를 들면 Mustang^TM S 및 Natrix S의 능력을 탐구한다.

재료들 및 방법들

공급 스트림

공급 스트림들은 산업적으로, 파일럿으로 또는 상업적 또는 연구 목적으로 초기에 생산된 소규모 세포 배양 배치들 (제넨테크 인크, 사우스 샌프란시스코, 캘리포니아)에서 취하였다. 공급 스트림들은 변화하는 정제 정도를 가졌고, 이는 세포들이 분리되었고, 분류된 유체는 적어도 하나의 컬럼 크로마토그래피 단계에 걸쳐 정제되었거나 또는 정제되지 않았음을 의미한다. 표적 치료 폴리펩티드 및 정량화될 수 있는 수준의 불순물들을 함유하였다. 각각의 공급 스트림의 조성물은 개별적인 폴리펩티드 공정 및 정제 수준에 따라 변화되었다. 표 1은 본 연구에 사용된 항체들, 폴리펩티드, 또는 일가 항체들의 각각에 대한 공급 스트림 특성들을 보여준다.

표 1: 공급 스트림 특성들

폴리펩티드 정량화

폴리펩티드의 농도는 3가지 방법들을 사용하여 측정되었다. 불순물 레벨들이 UV 흡광도에 대한 상당한 효과를 갖기에는 너무 낮을 때, 280 및 320 nm에서 UV-분광도계 스캔이 사용되었다. 불순물 레벨들 또는 색깔이 UV 흡광도에 대해 상당한 효과를 미칠 수 있을 때, 분석 친화도 컬럼 또는 이온 교환 컬럼이 항체 또는 폴리펩티드 농도들 각각을 정량화하기 위해 사용되었다.

UV-분광광도계 스캔에 의해 테스트된 샘플들을 위해, 폴리펩티드를 함유하는 샘플들은 0.1 내지 1.0 AU 범위 내로 적합한 비-간섭성 희석제로 희석하였다. 샘플 준비 및 스펙 스캔 판독은 중복으로 수행되었고, 평균값이 기록되었다. 시험된 폴리펩티드들에 흡광도 계수는 1.45 - 1.70 (mg/mL)^-1cm^-1이었다. 280 및 320 nm에서 흡광도, 희석 인자, 경로 길이 (1 cm), 및 흡수 소광 계수가 비어-램버트 법칙으로 공지된 수학식을 사용하여 mAb 농도를 산출하기 위해 사용되었다.

분석 친화도 컬럼들에 의해 시험된 샘플들을 위해, 항체를 함유하는 샘플들은 필요할 경우 0.025 - 4.0 mg/mL.의 범위 내로 적합한 비-간섭성 희석제에 의해 희석하였다. 대안으로, 주사 부피는 각각 더 낮거나 또는 더 높은 농도의 샘플들에 대해 두배로 되거나 또는 반감될 수 있다. 샘플 준비 및 HPLC 시험은 중복으로 수행되었고, 평균값이 기록되었다. 일반 항체 HPLC 분석으로서, 샘플 농도 결과들은 기준 물질의 항체 흡수 소광 계수에 반하여 대응하는 흡수 소광 계수를 사용함으로써 특이적 항체에 대해 정정되었다.

분석 이온 교환 컬럼에 의해 시험된 샘플들을 위해, 폴리펩티드를 함유하는 샘플들은 필요할 경우 0.1 - 0.8 mg/mL.의 범위 내로 적합한 비-간섭성 희석제에 의해 희석하였다. 샘플 준비 및 HPLC 시험은 중복으로 수행되었고, 평균값이 기록되었다. 샘플 농도 결과들은 주사 피크 아래 영역을 통합함으로써 측정되고 기준 물질을 사용하여 표준 곡선에 상관된다.

CHO 숙주 세포 단백질들 (CHOP) 정량화

효소 링크된 면역 흡착제 분석 (ELISA)은 CHOP의 레벨들을 정량화시키기 위햐 사용되었다. 친화도-정제된 염소 항-CHOP 항체들은 미세적정 플레이트 웰들 상에 고정되었다. CHOP를 함유하는 샘플들, 표준물들, 및 대조군들의 희석물들은 웰들 내에서 배양되었고, 이어서 고추냉이 퍼옥시다제에 콘주게이트된 염소 항-CHOP 항체들에 의해 배양되었다. 고추냉이 퍼옥시다제 효소 활성은 o-페닐렌디아민 디클로라이드에 의해 검출되었다. CHOP는 미세적정 플레이트 판독기에서 492 nm에서 흡광도를 판독함으로써 정량화되었다. 컴퓨터 곡선-피팅 프로그램은 표준 곡선을 생성하고 자동으로 샘플 농도를 계산하기 위해 사용되었다. ELISA를 위한 범석 범위는 일반적으로 5 ng/ml 내지 320 ng/ml이었다. 각각의 샘플에 대해, 2-4 희석액들이 분석되었고 그 값들은 평균되었다. CHOP 값들은 단백질 농도로 나누어졌고, 그 결과들은 ppm (ng CHOP/mg 단백질) 단위로 보고되었다.

E. 대장균 단백질들 (ECP) 정량화

효소 링크된 면역 흡착제 분석 (ELISA)은 CHOP 정량화를 위해서와 유사한 방식으로 ECP의 레벨들을 정량화하기 위해 사용되었다.

겐타마이신 정량화

효소 링크된 면역 흡착제 분석 (ELISA)은 겐타마이신의 레벨들을 정량화시키기 위해 사용되었다. 겐타마이신-BSA에 대한 염소 폴리클로날 항체는 미세적정 플레이트 웰들 상에 고정된다. 겐타마이신은 항체에 결합하기 위해 비오틴-겐타마이신과 경쟁한다. 결합된 비오틴-겐타마이신의 양은 그의 효소 활성이 테트라메틸 벤지딘 (TMB)에 의해 검출되는 고추냉이 퍼옥시다제-스트렙타비딘에 의해 측정된다. 샘플들은 샘플 정성화 동안 확립된 허용 가능한 희석에 따라 ELISA 분석 희석액에 의해 희석된다. 겐타마이신은 미세적정 플레이트 판독기에서 450 nm에서 흡광도를 판독함으로써 정량화된다. 최소 4-파라미터 컴퓨터 곡선-피팅 프로그램은 표준 곡선을 생성하고 자동으로 샘플 농도를 계산하기 위해 사용된다. 일반적으로, 겐타마이신 분석에서 표준 곡선에 대해 보고된 범위는 0.58 ng/mL 내지 90 ng/mL이다. 각각의 샘플에 대해, 2-4 희석액들이 분석되었고 그 값들은 평균되었다. 겐타마이신 값들은 단백질 농도로 나누어졌고, 그 결과들은 ppm (ng 겐타마이신/mg 단백질) 단위로 보고되었다.

폴리에틸렌이민 정량화

모든 데이터는 5mm 구배-장착된 TCI 저온 탐침 및 자동 샘플러가 장착된 브루커 600 MHz 분광계 상에 기록되었다. 데이터는 용액 내의 단백질로부터 공명 신호들을 최소화하도록 설계된 스핀-에코 펄스 서열을 사용하여 획득되었다. 예비 포화 펄스 서열과 결합된 여기 조각 펄스 서열은 용액 내의 물로부터 공명 신호를 최소화하도록 설게되었다. NMR 측정에 앞서, D₂O는 10% 샘플의 최종 농도에 이르기까지 모든 샘플들에 첨가되었다 (샘플 630 mL + D₂O 70 mL).

정량적 NMR 분석은 일반적인 분석 방법이며, 예외적으로 큰 수의 유기 분자들에 적용될 수 있다. 일반적으로, 모든 분자들은 특징적인 공명 주파수들, 상대 피크 강도들, 선폭들, 커플링 패턴들을 갖는 NMR 신호의 고유한 집합을 갖는다. 작은 양성자-함유 분자의 농도를 결정하기에 적합한 NMR 분석을 위한 유일한 기준은 분석물과 완충액 성분들의 NMR 신호가 중첩되지 않는다는 것이다. NMR 분석은 광범위한 분석물 농도들에 걸쳐 정확하고 정밀하다 (예를 들어, 프로필렌 글리콜에 대해 1 ug/mL 내지 154,500 ug/mL.)

크로마토그래피 막들

시험된 막들은 Mustang^TM S (Pall Corporation, East Hills, New York) 및 Natrix S (Natrix Separations, Burlington, Canada)였다. Mustang^TM S 및 Natrix S는 양으로-하전된 단백질들 및 바이러스성 입자들에 효과적으로 결합하는 강한 양이온 교환 막들이다. Mustang^TM S는 0.8 μm 공극들을 갖는 폴리에테르술폰 (PES)으로 제조되고 술폰산의 형태로 개질된다. Natrix S 막은 가요성의 다공성 지지체 매트릭스 내에 형성된 중합성 하이드로겔로 구성된다. 지지체 매트릭스는 기계적 강도를 제공하는 한편, 하이드로겔 특성들은 생성물의 분리 화학을 결정한다. 결합 능력을 증가시키기 위해, 제조업체는 막의 다수의 층들을 각각의 장치 내로 조합시킬 수 있다. 층들 및 두께의 총 수는 제조업체 및 제조?? 있는 장치의 크기에 따라 변화한다. 막 부피 (MV)는 막 (고체들 및 보이드들)의 물리적 부피이고 mL 단위로 측정된다. 다중 스케일을 나타내는 다양한 막 장치들이 본 연구에서 사용되었다. 표 2는 시험된 각각의 막에 대한 적절한 명세를 열거한다.

표 2: 강한 양이온 교환 막 특성들.

크로마토그래피 수지들

시험된 수지들은 Fractogel SE Hicap (EMD Chemicals Inc., Gibbstown, New Jersey) 및 SP 세파로스 고속 흐름 (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, New Jersey)이었다. Fractogel SE Hicap 및 SP 세파로스 고속 흐름 수지들은 강한 양이온 교환 수지들이다. 프랙토겔 SE Hicap 수지는 약 800 Å의 공극 크기를 갖는 40 - 90 μm 직경의 가교된 폴리메타크릴레이트 입자들로 구성된다. 기능성 리간드는 긴 선형 중합체 사슬에 의해 입자에 공유적으로 부착된다. SP 세파로스 고속 흐름 수지는 ~4,000,000 Da 배제 한계를 갖는 45 - 165 μm 직경의 고도로 가교된 한천 입자들로 제조된다. 세파로스 고속 흐름은 관능기로서 술포프로필 리간드와 세파로스의 가교된 유도체이다. 이 가교 방법은 제조업체에 소유권이 있다.

막 및 수지 정제 시스템들

소규모 시험들은 통합 계량 펌프, 압력 센서, 및 인라인 pH, 전도도, 및 UV 센서를 포함하는 프로그램 가능한 공정 정제 시스템인 AKTA Explorer^TM 100 (GE Healthcare, Fairfield, Connecticut)에 의해 프로그램된다. Explorer 시스템은 컴퓨터 운영 UNICORN^TM v5.10 소프트웨어 (GE Healthcare, Fairfield, Connecticut).를 통해 프로그램되고 제어되었다. 소규모 시험들은 또한 Masterflex® L/S® 디지털 경제 구동 연동 펌프 (Cole Parmer, Vernon Hills, Illinois), 인라인 DTX^TM Plus TNF-R 압력 센서 (Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey), 및 AND EK-1200i 밸런스 (A&D Company, Ltd., Tokyo, Japan)로 구성된 수동 시스템을 사용하여 수행되었다. 밸런스는 질량 누적을 측정함으로써 펌프의 유속을 물리적으로 모니터링하기 위해 사용되었다. 질량은 1.0 g/mL의 공급 스트림 밀도를 가정하여 부피로 전환되었다. 인라인 변환기들로부터의 압력 및 밸런스로부터의 질량은 압력 및 질량 수집을 위해 각각 컴퓨터 운영 Trendlink^TM 버전 3.1.1 (Canary Labs Inc., Martinsburg, Pennsylvania) 및 RsCom 버전 2.40 (A&D Company, Ltd., Tokyo, Japan) 소프트웨어에 링크된 NetDAQ^TM 2640A/41A 네트워크 데이터 획득 시스템 (Fluke, Everett, Washington)을 사용하여 연속적으로 모니터링되었다.

샘플 수집 기술들을 통한 막 흐름

샘플들을 통한 흐름은 세 가지 다른 방법들로 수집하였다. grab 샘플들 및 분획들은 가장 통상적이었다. grab 샘플은 특정 처리량에서 취해진 통과액의 작은 순간적 분취량이다. 분획들은 샘플들을 통해 더 큰 흐름이고 처리량 범위들로 정의된다. 통과액은 또한 단일의 큰 풀로서 수집되었다. 풀 분석은 효과적이지만, grab 샘플들 및 분획들은 연속 샘플들이 추세를 나타내기 위해 결합될 수 있기 때문에 일반적으로 mAb 및 불순물 레벨들을 모니터링하는데 더 유용하다.

동적 결합 능력 (DBC) 기술들

막들 및 수지들의 동적 결합 용량들 (DBC)은 전형적인 공정 유속에서 매질 상으로 공급 스트림을 로딩함으로써 측정되었다. 이것은 전형적으로 정적 결합 능력을 측정하기 위해 행해지는 바와 같이, 오히려 부하 공급 스트림 내에 매질이 담기는 것을 선호하였다. 이러한 용도에 대해, DBC는 매질의 성능의 더 적합한 측정치였다. DBC는 로딩 단계 동안 통과액 grab 샘플들 또는 분획들을 취함으로써 측정되었다. grab 샘플들의 특정 처리량 또는 모든 분획들의 부피 및 모든 grab 샘플들 또는 분획들에 대한 폴리펩티드 또는 불순물의 농도를 사용하는 것은 DBC 그래프가 발생되게 하였다. 추가로, 부하 물질 중의 폴리펩티드 또는 불순물 농도들이 공지된 경우, 그래프는 여액 농도들 (C)을 부하 농도 (C₀)에 비교하기 위해 생성될 수 있다. 이 경우에, C/C₀ 0의 값은 여액 농도가 부하 농도보다 훨씬 더 낮음을 나타내는 한편, C/C₀ 1의 값은 여액 농도가 부하 농도와 유사한 것을 나타낸다.

실험

공급 원료는 저온 저장 (2-8℃ 또는 ≤ -70℃)으로부터 제거되어 실온에 이르기까지 평형화되도록 허용되었다. 그것은 적절한 적정제 (즉, 1.5 M 트리스 염기 또는 1 M 구연산) 또는 희석제 (정제수 또는 5 M 염화 나트륨)을 사용하여 표 1에 나타낸 조건들로부터 조절된 선택적으로 pH 및/또는 전도도였다. 그것은 이어서 저온 저장 또는 조건화 동안 형성될 수 있는 임의의 침전물들을 제거하기 위해 AcroPak^TM 20 (Pall Corporation, East Hills, New York), AcroPak^TM 1000 (Pall Corporation, East Hills, New York), 또는 1000 mL 진공 필터 (Thermo Fisher Scientific, Rochester, New York)를 사용하여 오프라인으로 여과되었다.

정제 시스템은 정제수 또는 적절한 완충액을 사용하여 부하물 및 통과액을 플러싱함으로써 제조되었다. 막은 공급 펌프와 압력 센서의 인라인 다운스트림에 놓였고, 이어서 그것은 정제수 또는 평형 완충액 50 - 500 MV로 플러싱되었다. 플러싱 후에, 공급 스트림은 막 상에 로딩되었고, 가변량은 333 - 2667 MV/시간의 일정한 유속으로 로딩되었다. 로딩 단계 동안 통과액은 필요에 따라 샘플링되었다. 막은 이어서 임의의 잔류 생성물을 수거하기 위하여 완충액에 의해 선택적으로 추적되었다. 막 상에 불순물들의 보존을 유지하기 위해, 추적 (일명 세척 완충액) 완충액은 일반적으로 pH에서 유사하였고 공급물로의 전도도에서는 동일하거나 또는 더 낮았다.

결과의 막 grab 샘플들, 분획들, 또는 풀들은 이어서 폴리펩티드 및/또는 불순물 농도들을 측정하기 위해 분석되었다.

일부 경우들에서, 결과의 막 풀들은 이어서 수지 상으로 로딩되었다. 수지 크로마토그래피는 단지 UV, pH, 및 전도도는 실시간 추세일 수 있고, 풀링은 인라인 UV 센서에 의해 촉진될 수 있도록 Akta Explorer를 사용하여 수행되었다. 로딩 단계 동안 통과액은 필요에 따라 샘플링되었다.

일부 경우에는 막이 용출되었다. 막 용출은 단지 풀링이 인라인 UV 센서에 의해 촉진될 수 있도록 Akta Explorer를 사용하여 수행되었다. 막은 높은 염 완충액 (20 mM 아세트산 나트륨 및 350 mM 염화 나트륨, pH 5.5)을 사용하여 용출되었다. 추가로, 일부 경우들에서, 막은 20 mL.에 걸쳐 0 - 100%로 2개의 완충액들의 구배에 의해 용출되었다 (20 mM 아세트산 나트륨, 0 mM 염화 나트륨, pH 5.5 및 20 mM 아세트산 나트륨, 2000 mM 염화 나트륨, pH 5.5).

일부 경우들에서, 수지가 용출되었다. 수지 용출은 단지 풀링이 인라인 UV 센서에 의해 촉진될 수 있도록 Akta Explorer를 사용하여 수행되었다. 수지들은 200 cm/hr의 일정한 유속에서 높은 염 완충액 구배 (50 내지 500 mM 아세트산 나트륨, pH 5.5) 또는 높은 염 단계 (50 mM HEPES, 200 mM 염화 나트륨, 0.05% Triton, 1 mM DTT, pH 7.5)를 사용하여 용출되었고 Fractogel SE Hicap 및 SP 세파로스 고속 흐름, 각각을 위해 0.5 - 1.0 OD 또는 1.25 - 1.25 OD로부터 풀링되었다.

결과들

소규모 양이온 교환 막 수율

pH 8.0 및 5.0 mS/cm에서 MAb 1 음이온 교환 풀 및 1M 구연산을 사용하여 pH 5.5 및 6.4 mS/cm로 조절될 수 있는 mAb 1 음이온 교환 풀은 667 MV/시간에서 Mustang^TM S 막 상에서 처리되었다. 사용된 Mustang^TM S 막은 0.18 mL Acrodisc® 장치였다. pH 5.5 및 pH 8.0에서 mAb 1 공급 스트림들은 모두 항체의 pI 미만이었고, 따라서 양으로 하전되었다. 공급 및 통과액 grab 샘플들은 항체 농도에 대해 분석되었다. 초기 샘플들은 막에 결합하는 일부 항체를 보였지만, 도 3은 수율이 두 pH 조건들에서 유사하고, 1000 g/L 부하 밀도 하에 급속하게 증가하고, ≥ 96%은 대략적으로 5000 g/L의 부하 밀도 후에 달성될 수 있음을 보여준다.

소규모 음이온 교환 막 수율

비교 목적을 위해, mAb 2는 7.7의 등전점을 초과하는 음이온 교환 막을 사용하여 테스팅을 위해 선택되었다. 단백질들은 높은 pH에서 탈아미드호 및 응집하는 경향이 있음으로써 유사한 시험들은 mAb 1에 대해 수행되지 않았다. pH 5.5 및 9 mS/cm에서 양이온 교환 풀은 1.5 M 트리스 염기를 사용하여 8.0으로 pH 조절되었다. 공급 원료는 이어서 3개의 개별 풀들로 분할되었고 전도도는 정제수를 사용하여 조절되었다. 제1 풀은 10 mS/cm에 있었고, 제2 풀 및 제3 풀은 각각 7 mS/cm 및 4 mS/cm로 조절되었다. 모든 3개의 풀들은 pH 8.0에서 유지되었다. 각각의 공급 스트림은 이어서 600 MV/시간의 일정한 유속으로 소규모 0.35 mL Mustang^TM Q 상으로 처리되었다 pH 8.0에서 mAb 3은 pI를 초과하는 0.3 pH 단위였고, 따라서 항체는 음으로 하전되었다. 부하 및 처리액 풀들은 항체 농도에 대해 분석되었다. 도 4는 수율이 모든 3개의 pH 조건들에서 유사하고, 200 g/L 부하 밀도 하에 초기에 급속하게 증가하고, 좌크같이고 96%은 대략적으로 1000 g/L의 부하 밀도 후였다.

소규모 양이온 교환 막 불순물 청소능

양이온 교환 막 불순물 청소능을 평가하기 위해, pH 5.5 및 3.2 mS/cm에서 mAb 3 단백질 A 풀은 1333 MV/시간의 일정한 유속으로 소규모 0.18 mL Mustang^TM S 막 상으로 처리되었다. mAb 3 부하는 산출된 pI 미만의 3.4 단위 였고, 따라서 항체는 양으로 하전되었다. 부하, 통과액 분획들, 및 용출 샘플들이 분석되었고 CHOP에 대한 결과들은 도 5에 나타낸다. 이 데이터는 Mustang^TM S가 초기에 CHOP를 438에서 109 ppm으로 감소시켰음을 보여준다. 부하 밀도로서 318 ppm으로 증가된 CHOP는 55,300 g/L에 도달하였다. 막은 높은 염을 함유하는 용액을 사용하여 용출되었다. 염 이온들은 전하들을 차폐하기 위해 사용되고, 따라서 정전기적 상호 작용들을 방해하고 단백질들이 막 표면으로부터 탈착되게 하고 이동 상 내로 자유롭게 이동하게 한다. 용출 풀의 분석은 CHOP가 정전기력으로 인해 막에 결합하는 것을 풍부한 불순물들이 확인함으로 보여준다.

흡착제 성능을 추가로 평가하기 위해, pH 5.5 및 6.0 mS/cm에서 mAb 3 음이온 교환 풀은 667 MV/시간의 일정한 유속으로 소규모 0.18 mL Mustang^TM S 막 상에서 처리되었다. mAb 3 pH는 pI 미만의 3.4 pH 단위였고, 따라서 항체는 양으로 하전되었다. 공급 및 통과액 grab 샘플들은 mAb, CHOP, 및 겐타마이신 농도들에 대해 분석되었다. 공급 및 grab 샘플 농도들을 비교하기 위해, 막 부하 밀도의 기능으로서 C/C₀ 그래프 (grab 샘플 / 부하)가 생성되었다. 도 6에 도시된 바와 같이, mAb C/C₀ 값들은 2 내지 16 kg/L 부하 밀도들에서 1.0 근처였고, 이는 grab 샘플 농도들이 부하 농도와 거의 동일하고, 일단 다시 수율은 높을 수 있음을 시사한다. 반대로, CHOP 및 겐타마이신 C/C₀ 값들은 2 내지 16 kg/L 부하 밀도들에서 ≤ 0.2으로 낮고, 이는 grab 샘플 농도들이 부하 농도보다 훨씬 더 낮고, Mustang^TM S는 mAb에 의해 과부하되었음에도 불구하고 이들 불순물들의 대부분을 제거하고 있다.

소규모 양이온 교환 막 결합 선택성

양이온 교환 막들이 mAb에 대비하여 특정 불순물들을 결합하기 위해 선택되는지 여부를 평가하기 위해, mAb 3 단백질 A 풀을 사용하여 일련의 실험들이 설계되고 실행되었다. 이 풀은 높은 분자량 종들 (HMWS), 이량체, 낮은 분자량 종들 (LMWS), 겐타마이신, 및 CHOP을 포함하는 더 높은 수준의 불순물들로 인해 선택되었다. 단백질 A 풀은 pH 5.5 및 4.4 mS/cm로 조절되었다. 로딩에 앞서, 각각의 Mustang^TM S 막은 20 mM 아세트산 나트륨, pH 5.5 및 1.3 mS/cm 완충액에 의해 평형화되었다. 4개의 실험들이 수행되었고, 각각 1000, 5000, 10000, 또는 15000 g/L의 부하 밀도들에 이르기까지 1333 MV/시간에서 0.18 mL Mustang^TM S 막을 로딩하였다. 로딩 후, 막들은 20 mM 아세트산 나트륨, pH 5.5 및 1.3 mS/cm 완충액에 의해 세척되었다. 세척 후, 세척 완충액 및 20 mM 아세트산 나트륨, 2M 염화 나트륨, pH 5.1 및 ~500 mS/cm을 사용하는 구배 용출은 막을 용출시키기 위해 사용되었다. 구배는 20 mL에 걸쳐 형성되었고, 용출 분획들은 분석되어야 할 2 mL마다 취해졌다. 4개의 실험들에 대해, 용출 분획들은 모든 불순물들 및 mAb 농도들에 대해 분석되었다. 임의의 주어진 부하 밀도 실험에서, 분획들은 불순물 또는 mAb가 막으로부터 용출되고 있을 때를 측정하기 위해 비교될 수 있고, 나중에 용출되는 종들은 초기에 용출되는 종들보다 더 치밀하게 결합되고 있다. 도 7은 5000 g/L 부하 밀도 실험을 위해 10 분획 용출에 걸쳐 분석된 다양한 종들의 % 정규화된 농도들을 보여준다. 각각의 피크의 위치는 mAb 단량체가 그것이 가장 일찍 용출되기 때문에 가장 약한 것을 막에 결합시킴을 시사한다 결합 강도의 증가하는 순서로, 단량체는 HMWS, 이량체, CHOP, LMWS, 및 겐타마이신으로 이어진다. 많은 종들이 구배에서 유사한 위치에서 용출되고 있지만, 이 그래프는 겐타마이신이 경쟁하는 종들보다 훨씬더 강하게 결합함을 분명히 보여준다.

또한, 각각의 부하 밀도에 대해, 컬럼에 결합된 각각의 불순물 또는 mAb의 총 질량은 산출될 수 있고 다양한 부하 밀도 실험들을 통해 비교될 수 있다. 도 8은 증가하는 막 부하 밀도의 함수로서 각각의 종들의 % 정규화된 질량을 보여준다. 라인들의 방향은 종들의 질량이 증가되고 있는지 또는 감소되고 있는지 여부를 나타낸다. 가장 약한 것에 결합하는 것으로 이전에 도시된 mAb 단량체는 부하 밀도가 증가함에 따라 질량의 감소하는 레벨들을 가졌다. 반대로, 이량체, HMWS, CHOP, 겐타마이신, 및 LMWS는 부하 밀도기 증가함에 따라 질량에서 모두 증가하고 있다. 이는 이전의 결합 강도 결과들을 확인하고, mAb 단량체가 막에 여속적으로 결합하는 다른 종들로 인해 감소하고 있음을 시사한다.

소규모 양이온 교환 막 변위

강한 결합 종들, 예를 들면 겐타마이신이 결합 선택성 결과들을 설명하기 위한 가설로서 mAb 단량체를 용출시킬 수 있는지를 결정하기 위해, 실험은 mAb 3 단백질 A 풀을 사용하여 수행되었다. 단백질 A 풀은 pH 5.5 및 4.2 mS/cm로 조절되었다. 실험은 20 mM 아세트산 나트륨, pH 5.4에 의해 0.18 mL Mustang^TM S 막을 평형화시킴으로써 수행되었다. mAb 1 단백질 A 풀은 UV 추이가 mAb 돌파구를 분명히 보여줄 때까지 부하되었다. 막은 이어서 평형 완충액 및 2 g/L 겐타마이신으로 구성된 용출 완충액이 막을 용출시키기 위해 사용되기 전에 평형 완충액으로 세척되었다. 평형 완충액 및 용출 완충액은 막에 결합한 mAb의 임의의 효과를 방지하기 위해 동일한 pH 및 전도도로 되어 있음에 주의해야 한다. 도 9는 부하, 세척, 및 용출 단계 동안 UV, pH, 및 전도도 추이들을 포함하는 크로마토그램을 보여준다. 크로마토그램은 용출 단계가 개시되기 전에 세척 단계가 UV 추이를 기준선으로 되돌리는데 충분하였음을 보여준다. 또한 용출 단계 동안, 큰 UV 피크가 pH 또는 전도도 추이에 대한 임의의 상당한 변화 없이 관찰되는 것을 또한 나타낸다. 이는 겐타마이신이 양이온 교환 막으로부터 결합된 mAb 단량체를 효과적으로 대체할 수 있음을 나타낸다.

CEX 막들 겐타마이신 결합 비교

겐타마이신의 CEX 막 결합 능력을 결정하기 위해, 0.18 mL Mustang^TM S 막 및 0.23 mL Natrix S를 시험하는 실험들이 수행되었다. pH 7.2에서 PBS 완충액은 5.00의 최종 pH 및 8.10 mS/cm의 전도도에 이르기까지 2.0M 아세트산 및 PW에 의해 조절되었다. 조절된 완충액은 이어서 대략적으로 1.0 mg/mL 및 40,000 ng/mL의 최종 농도에 이르기까지 mAb 3 UF/DF 풀 및 겐타마이신에 의해 스파이크되었다. 결과의 스파이크된 용액은 부하 공급 스트림으로서 사용되었다.

실험들을 수행하기 위해, 두 막들은 PW로 플러싱되었고, 조절된 완충액에 의해 평형화되었고, 스파이크된 용액에 의해 부하되었고, 조절된 완충액에 의해 세척되었다. 로딩 단계 동안, 4 mL 통과액 grab 샘플들은 20, 40, 60, 및 80 mL에서 Mustang^TM S에 대해 수집되었다. Natrix S에 대해, 4 mL 통과액 grab 샘플이 10 mL에서 수집되었고, 이어서 전체 19 샘플들에 대해 60 mL 마다 수집되었다. 모든 샘플들은 이어서 mAb 및 겐타마이신 농도에 대해 분석되었고 도 10에 나타낸 바와 같이 막 부하 밀도에 반하여 C/C₀ 그래프를 생성하도록 부하 농도들에 비교되었다.

플로팅되지 않았지만, mAb 농도는 이 단계가 통과액 중의 항체에 대해 높은 수율일 수 있음을 시사하는 1.0의 C/C₀ 값에 도달한다. 겐타마이신 C/C₀ 값들은 반대로 훨씬 나중에 1.0에 도달하고, 이는 두 막들이 현저한 레벨들에 결합함을 시사한다. Mustang^TM S는 4.4 및 8.9 g/L_m 사이에 겐타마이신 결합 능력을 갖는 한편, Natrix S는 더 큰 겐타마이신 결합 능력을 갖고, 더 느린 돌파구를 보여 주었다. 50 g/L에서, C/C₀ 값은 0.3이었고, 돌파구 곡선은 약 125 g/L_m 및 약 0.8의 C/C₀ 값에 이르기까지 다소 선형이었다. 125 g/L_m후에 막이 여전히 겐타마이신에 결합되는 한편 작은 레벨의 mAb.를 대체할 가능성이 있음을 시사하하는 돌파구 곡선이 차츰 편평해진다.

이 결과들은 상이한 CEX 막들이 상이한 젠타마이신 결합 능력들 및 돌파구 곡선들을 가짐을 보여준다. Natrix S는 그의 높은 결합 능력 및 점진적인 돌파구와 더불어, 겐타마이신을 제거하는데 더 효과적인 막을 만들 것이다. 추가로, 더 높은 레벨들의 겐타마이신을 결합함으로써, 더 많은 mAb가 치환되어 더 높은 수율의 작동을 초래할 것이 예상된다.

CEX 수지들 및 강하게 결합한 아미노글리코사이드 항생제들의 효과

강하게 결합한 불순물, 예를 들면 겐타마이신이 CEX 수지의 팩된 컬럼에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 측정하기 위해, 컬럼을 보호하는 CEX 막의 존재 또는 부재 하에 모든 모델 공급 스트림들 및 실제 공급 스트림들을 시험하는 일련의 실험들이 설계되었다. 도 11은 다양한 실험들, 항체 및 불순물 농도들, 및 단계들이 이들 실험들을 수행하는데 필요함을 보여준다.

먼저, mAb 3 UF/DF에 의해 스파이크된 PBS의 모델 공급 스트림을 사용하고 겐타마이신의 레벨들을 변화시킨 후, Fractogel SE Hicap 수지는 돌파구 곡선들을 생성함으로써 항체 결합 능력에 대해 시험하였다. PBS는 먼저 1.0M 아세트산에 의해 pH 5.0로 조절되었고, 이어서 PW에 의해 8.0 mS/cm의 전도도로 조절되었다. UF/DF 풀은 대략적으로 1.6 mg/mL의 mAb 농도까지 조절된 완충액 내로 스파이크되었다.

수행된 각각의 크로마토그래피 실험에 대해, Fractogel SE Hicap은 원하는 공급 스트림으로 로딩하기에 앞서 pH 5에서 25 mM 아세트산 나트륨에 의해 먼저 평형화되었다. 로딩 후, 컬럼은 pH 5.5에서 50 mM 아세트산 나트륨으로 세척되고, pH 7.7에서 25 mM HEPES으로 세척되고, pH 5.5에서 50 mM 아세트산 나트륨으로 세척되고, pH 5.5에서 350 mM 아세트산 나트륨으로 세척되고, 1 M NaCl 및 0.5N NaOH를 사용하여 재생되고, 이어서 컬럼의 다음 사용까지 0.1N NaOH에 저장되었다.

스파이킹 겐타마이신 없이, 제1 실험이 수행되었고 108 g/L의 항체 DBC를 보였다. 다음으로, 상기 조절 및 스파이킹은 24,100 mg/mL의 최종 농도까지 겐타마이신을 추가함에 따라 수행되었다. 이 실험은 89 g/L의 감소된 항체 DBC를 보였다. 그 상태는 30,500의 겐타마이신 농도에 의해 반복되었고 88 g/L의 항체 DBC가 산출되었다. 그 데이터는 PBS의 모델 시스템, 정제된 항체를 사용하고 겐타마이신의 레벨들을 변화시킴으로써, 겐타마이신의 존재는 108 mg/mL로부터 대략적으로 88 g/L까지 Fractogel SE Hicap 수지에 대한 항체 DBC를 감소시킴을 보여준다.

다음으로, 2개의 실험들은 대략적으로 0.9 mg/mL mAb 3, 24,100 - 30,000 ng/mL 겐타마이신, 및 408,000 ng/mL CHOP를 함유하는 수확된 세포 배양액 유체 (HCCF)를 사용하여 수행되었다. 겐타마이신 레벨들에서 HCCF를 사용하는 것은 모델 공급 스트림, 68 및 71 g/L의 항체 DBC들과 일치한다. HCCF를 사용하는 88 및 89 g/L의 모델 공급 스트림 DBC들과 68 및 71 g/L의 DBC들 사이의 차이에 대해 가능한 설명은 공급 스트림 내의 높은 레벨의 CHOP의 존재이다.

도 12는 상기 실험들로부터 모든 항체 돌파구 곡선들, 뿐만 아니라 공급 스트림의 불순물 레벨들, 및 대략화된 DBC들을 보여준다. 그 실행들은 또한 실행할 때마다 컬럼 또는 겐타마이신 캐리오버의 가능한 저하를 방지하기 위해 무작위한 순서로 수행되었다. 실험들의 순서는 도 12을 수반하는 표에 열거된다. 실험들의 순서와 항체 DBC 사이에 어떠한 상관 관계도 없었고, 따라서 컬럼이 저하되거나 또는 겐타마이신 캐리오버가 후속 실행들에 영향을 미치고 있음직 하지 않다.

마지막으로, 공급 스트림 내의 겐타마이신의 존재는 컬럼 DBCs 내의 상당한 감소를 부여주고 CEX 막들은 현저한 레벨들의 항체에 결합하지 않고 겐타마이신에 결합할 수 있음을 알게 됨으로써, 두 실험들은 CEX 막이 보호될 수 있는지 여부 및 CEX 수지의 성능을 개선할 수 있는지 여부를 시험하기 위해 수행되었다. Natrix S는 Mustang^TM S 상에서 겐타마이신의 개선된 결합 능력을 보여주었기 때문에 그것은 Fractogel SE Hicap를 보호하기 위해 사용되었다. HCCF 2L가 해동되었고, 2M 아세트산에 의해 pH 5로 조절되었고, PW에 의해 8 mS/cm로 조절되었고, 공급 스트림의 동결 및 해동으로부터 어떠한 효과도 제거하기 위해 오프라인 멸균 여과되었다. 이러한 조절되고 여과된 공급 스트림으로부터, 부하는 다른 부분이 0.75 mL Natrix S를 통해 처리되고 Fractogel SE Hicap 상으로 부하된 한편 컬럼 상으로 부하되고 있는 하나의 부분으로 분할되었다. 두 컬럼 부하 단계들에 대해, 15 mL 분획들은 약 60 샘플들 각각에 대해 취해졌다. 조절된 HCCF, 네이트릭스 통과액, 및 Fractogel SE Hicap 분획들이 항체 및 겐타마이신 농도들에 대해 분석되었다. 결과의 HCCF 및 네이트릭스 통과액 공급 스트림 항체 및 불순물 농도들, 뿐만 아니라 결과의 Fractogel SE Hicap 돌파구 곡선들이 도 13에 도시된다. 결과의 데이터는 네이트릭스가 24,100 ng/mL에서 870 ng/mL로 조절된 HCCF에서 겐타마이신 레벨들을 성공적으로 감소시켰음을 보여준다. CHOP 레벨들은 408,000 ng/mL에서 328,000 ng/mL로 약간 감소되었다. 항체 농도는 0.88 mg/mL의 조절된 HCCF 농도에 비해 0.83 mg/mL로 약간 감소되었고, 약 94%의 수율을 나타낸다. 마지막으로, 결과의 CEX 컬럼 돌파구 곡선들은 컬럼이 조절된 HCCF를 사용하여 72 g/L의 항체 DBC를 갖고 네이트릭스 통과액을 사용하여 94 g/L의 항체 DBC를 가짐을 보여준다. 이는 CEX 컬럼 상으로 로딩하기에 앞서 겐타마이신 함유 공급 스트림을 CEX 막을 통해 통과시킴으로써 DBC에서 대략적으로 30% 증가를 나타낸다.

CEX 막 ECP 및 PEI 돌파구

다른 불순물들, 예를 들면 ECPs 또는 PEI를 갖는 CEX 막을 사용하여 유사한 수행이 관찰될 수 있는지 여부를 시험하기 위해, 실험은 일가 항체 1 단백질 A 풀 및 0.23 mL Natrix S 막을 사용하여 수행되었다. 사용된 단백질 A 풀은 1.5M 트리스 염기를 사용하여 pH 6.7로 이미 조절되었고, PW를 사용하여 2.5 mS/dm의 전도도로 희석되었다. 4.7 g/L의 항체 농도, 130 ug/mL PEI, 및 8,870 ng/mL ECP를 갖는 부하가, 평형화된 Natrix S 상으로 부하되었고, 10 샘플들에 대해 2 mL의 통과액 분획들, 이어서 12 샘플들에 대해 5 mL 분획들이 취해졌다. 통과액 분획들은 이어서 막의 항체 부하 밀도에 반하여 C/C₀를 발생시키기 위해 사용된 항체, PEI, 및 ECP 농도에 대해 분석되었다. 도 14는 대략적으로 123 mg/mL에서 CEX 막을 통해 두 항체 및 ECPs 돌파구를 보여준다. 정량화의 PEI 레벨은 30 ug/mL이기 때문에, 처음 몇 샘플들은 그 레벨에서 또는 그 미만에서 거의 없었고, 도 14는 그 샘플들에서 어떤 농도의 PEI가 존재하는지 알려져 있지 않기 때문에 0.23의 C/C₀ 값을 보여준다. 0.23에서 PEI 레벨들을 무시함으로써, PEI는 두 항체 및 ECPs보다 상당히 나중에 330 mg/mL에서 돌파됨을 나타낸다. 이들 결과들은 CEX 막들이 항체 수율에 부정적으로 영향을 미치지 않고 음이온성 중합체들을 제거하는데 또한 효과적이다.

CEX 수지들 및 강하게 결합한 음이온성 중합체들의 효과

강하게 결합한 불순물, 예를 들면 PEI가 CEX 수지의 팩된 컬럼 상에 어떤 영향을 미치는지 측정하기 위해, 폴리펩티드 1의 추출 동안 사용된 PEI의 레벨들 및 SP 세파로스 고속 흐름 컬럼에 대한 이들의 효과를 평가하는 일련의 실험들이 수행되었다. 공급 스트림이 이 생성물에 대해 더 불순했기 때문에, 추출 동안 사용된 PEI의 레벨들이 주목되는 대신에 컬럼 상으로 진행되는 PEI 레벨들을 정량화하는 것은 불가능하다.

이들 실험들을 위해, 추출된 생성물은 0.75 내지 1.05% 범위의 변화하는 PEI의 레벨들로 조건화되었고, PW로 희석되었고, 원심 분리되어 4 농축물 샘플들을 생산하였다. 대략적으로 pH 7.0 및 8.0 mS/cm에서 각각의 농축물 샘플은 이어서 폴리펩티드 농도를 위해 수집되고 분석된 통과액 샘플들에 의해 SP 세파로스 고속 흐름 컬럼 상으로 부하되었다. 결과의 데이터는 수지 폴리펩티드 부하 밀도의 함수로서 C/C₀ 그래프를 생성하기 위해 사용되었다. 도 15는 시험된 각각의 농축물에 대해 컬럼의 돌파구 곡선들 및 대응하는 DBC를 보여준다. 표에 나타낸 바와 같이, PEI %가 추출 공정 동안 증가함에 따라, 컬럼의 DBC는 감소한다.

추가로, 폴리펩티드 1을 사용하는 실험들의 제2의 집합에 대해, 변화하는 PEI %의 농축물들은 SP 세파로스 고속 흐름 컬럼 상으로 부하되었고, 컬럼은 각각의 실험을 위해 후속하여 세척되고 용출되었다. 각각의 실험으로부터 결과의 풀들은 이어서 크기 배제 크로마토그래프에 의해 폴리펩티드 농도, ECPs, 및 생성물 사이즈에 대해 분석되었다. 도 16은 추출 동안 PEI%의 증가하는 레벨들을 사용하여 발생된 풀들이 단계 수율의 감소를 초래하고 이 풀은 불순물, 예를 들면 ECPs, 생성물 집합체들, 또는 이량체들을 증가시킴을 보여준다.

PEI가 이전 실험들로부터 Natrix S에 의해 결합될 수 있음을 알고 PEI %의 함수로서 감소된 CEX 컬럼의 성능을 보면서 실험들이 이러한 CEX 컬럼 이전에 CEX 막을 사용하여 수행되지 않았더라도, 이러한 공급 스트림 상에 CEX 막을 사용하는 것은 컬럼의 결합 능력을 개선시킬 뿐만 아니라 결과의 풀을 개선시킬 수 있는 것으로 가설될 수 있다.

결론

이온 교환 막들은 단백질 결합을 유발하는 pH 및 전도도 조건들에서 불순물들을 제거하는데 효과적인 것으로 보였다. 과부하 크로마토그래피를 통해 작동하고 불순물들과 관심의 단백질 사이의 경쟁적 흡착을 촉진시킴으로써, 수율들은 1000 - 5000 g/L_m 의 부하 밀도들이 성취된 후 ≥ 96%인 것으로 보였다. 양이온 교환 막들은 막 통과액 분획들 내의 불순물들, 예를 들면 CHOP 및 겐타마이신을 결합시키고 16,000 g/L_m의 부하 밀도들까지 < 0.2의 C/C₀ 값으로 상당히 감소시키는 것으로 보였다. 양이온 교환 막들은 또한 고 분자량 종들, 이량체, 낮은 분자량 종들, 겐타마이신, 및 CHOP를 함유하는 더 많은 조야한 공급 스트림들을 사용하여 항체에 반하여 특정 불순물들을 결합시키기 위한 선택성을 나타내는 것으로 보였다. 이들 연구들에서, 이들 불순물들은 변화하는 강도에 따라 결합하고, 증가하는 막 부하 밀도들은 불순물들의 연속된 결합을 보여주는 한편 막에 결합된 항체는 감소하고, 작은 분자량의 고도로 하전된 종들, 예를 들면 겐타마이신은 경쟁하는 종들보다 훨씬 더 강하게 결합하는 것으로 보였다. 더욱이, 경쟁적 흡착 및 변위 크로마토그래피는 완충액 함유 겐타마이신을 사용하여 양이온 교환 막으로부터 항체를 용출시킴으로써 발생하는 것으로 확인되었다. 2개의 양이온 교환 막들, Mustang^TM S 및 Natrix S는 4.4 - 8.9 g/L_m 및 50 g/L_m의 겐타마이신 각각에 대한 동적 결합 능력들을 갖는 것으로 보였다. Natrix S에 대한 돌파구 곡선은 또한 Mustang^TM S보다 더 점진적인 것으로 보였다. Natrix S는 전통적인 막들보다 더 큰 결합 능력들을 갖도록 설계되고, 점진적인 돌파구에 따른 이러한 특성은 그것이 불순물들을 세정하는데 매우 적합하게 만든다.

양이온 교환 수지들은 공급 스트림 내의 겐타마이신 농도들이 증가함에 따라 감소하는 DBC에 의해 겐타마이신의 존재 하에 변화하는 동적 결합 능력들을 나타내는 것으로 보였다. Fractogel SE Hicap 컬럼은 0 내지 30,500 ng/mg의 겐타마이신을 함유하는 모델 공급 스트림을 사용하여 108에서 88 g/L로 DBC 중에서 감소되었다. 대표적인 공급 스트림을 사용함으로써, Fractogel SE Hicap은 68-71 g/L의 DBCs를 보였다. 양이온 교환 막의 유용성은 94%의 수율로 그 공급 스트림에서 겐타마이신 농도들을 24,100 ng/mg에서 870 ng/mg 겐타마이신으로 감소시킬 수 있을 때 검증되었다. 감소된 겐타마이신 농도 공급 스트림은 직접적으로 비교될 때 72 g/L에 비교하여 Fractogel SE Hicap이 94 g/L의 DBC을 갖게 할 수 있다. 겐타마이신과 훨씬 더 같이, 양이온 교환 막들은 일가 항체 및 ECPs의 존재하에 고도로 하전된 음이온성 중합체들, 예를 들면 PEI를 결합시키는 것으로 보였다. 마지막으로, 양이온 교환 수지들은 공급 스트림에서 변화하는 PEI 농도들에 의해 부정적인 영향을 받고, PEI 농도들이 증가하에 따라 감소된 동적 결합 능력 및 증가된 풀 불순물들을 초래하는 것으로 보였다 SP 세파로스 고속 흐름 컬럼은 PEI가 0.75%에서 1.05% 업스트림으로 증가함에 따라 51 g/L에서 36 g/L로 감소하는 것으로 보였다. 별개의 연구에서, 업스트림에 사용된 PEI 농도가 0.6%에서 1.1%로 증가됨에 따라 단계 수율은 96%에서 70%로 감소되었고, ECPs는 155 ng/mg에서 904 ng/mg로 증가되었고, 집합체는 2.5%에서 17.3%로 증가되었고, 이량체는 3.7%에서 5.9%로 증가되었다 SP 세파로스 고속 흐름 컬럼에 앞서 양이온 교환 막의 사용은 시험되지 않았지만, 컬럼은 PEI에 의해 부정적인 영향을 받지 않고 막은 PEI를 결합하는데 효과적임을 안다면, 적절한 크기의 막은 더 큰 결합 능력들 및 수율로 유도되고 한편으로는 또한 풀 불순물 농도들을 감소시키는 컬럼 상으로 진행하는 PEI %를 감소시켜야 한다.

더 나은 정제 기술들이 끊임없이 출현되고 있다. 더 큰 결합 능력 이온 교환 수지들이 개발됨에 따라, 단백질 A 친화도 수지 대체물로서 이들의 용도는 감소된 작동 단가로 인한 것으로 보인다. 그러나, 증가하는 불순물 레벨들, 또는 불순물들, 예를 들면 겐타마이신 또는 다운스트림 용도들에서 일반적으로 관찰되지 않는 PEI의 공급 스트림들에 적용될 때, 이들의 진정한 효과는 감소될 것이다. 그러한 이온 교환 수지에 앞서 이온 교환 막의 사용은 컬럼 상으로 부하된 불순물들을 감소시킴으로써 컬럼을 보호할 수 있다. 이는 컬럼에 대한 여러가지 개선들, 예를 들면 더 높은 동적 결합 능력들, 증가된 단계 수율들, 또는 감소된 풀 불순물 농도를 유도할 수 있다. 충분한 불순물 결합 능력, 부피, 및 삼투성을 갖는 적절한 막을 선택함으로써, 2개의 단계들은 연속적으로 작동될 수 있고, 작동 시간을 추가로 감소시키고 궁극적으로 정제 공정 단가를 감소시킨다.

상기 기록된 명세서는 당업계의 숙련자가 본 발명을 실시하는데 충분한 것으로 간주된다. 예치된 구현예는 본 발명의 특정 측면의 단일 예시로서 의도되고 기능적으로 등가인 임의의 구조들은 본 발명의 범위에 속하기 때문에, 본 발명은 예치된 구조에 의해 범위가 제한되지 않는 것이다. 본원에서 소재의 예치는 본원에 포함된 서면 설명이 그의 최상의 모드를 포함하여 본 발명의 임의의 측면의 실시를 가능케 하기에 부적절하다는 승인을 구성하지 않을 뿐만 아니라, 특허 청구의 범위를 그것이 나타내는 특정 예시들로 제한하는 것으로서 해석되지 않아야 한다. 사실 상, 본원에 도시되고 기재된 것들 이외의 본 발명의 다양한 변형들은 상기 설명으로부터 당업계의 숙련자들에게 명백하고 첨부된 특허 청구의 범위 내에 속할 것이다.

Claims (27)

1. 다음 단계들을 포함하는, 항체의 정제를 위한 다운스트림 크로마토그래피 단계들의 효율을 증진시키는 방법으로서,
   a. 관심의 항체 및 하나 이상의 오염물을 포함하는 조성물을 이온 교환 막을 통해 통과시키는 단계로서, 상기 항체 및 막은 항체의 전하를 증진시키기 위해 항체의 pI와 1 내지 5 pH 단위 차이나는 pH 및 완충액 이온들에 의한 전하들의 차폐를 방지하기에 효과적인 낮은 이온 강도를 갖는 완충액으로 구성된 작동 조건들에서 반대 전하를 갖음으로써 상기 막이 항체 및 적어도 하나의 오염물에 결합하도록 유발시키는 단계이며, 여기서 하나 이상의 오염물은 핵산, 관심의 항체의 변종, 또 다른 항체, 엔도톡신, 또는 바이러스 오염물 중 하나 이상임;
   b. 관심의 항체가 주로 유출물 중에 존재하는 동안 적어도 하나의 오염물이 남아 상기 막에 결합하도록 1000 내지 5000 g/L의 부하 밀도로 상기 이온 교환 막을 과부하시키는 단계; 및
   c. 관심의 항체를 포함하는 상기 이온 교환 막으로부터 유출물을 수집하는 단계;
   이때, 상기 다운스트림 크로마토그래피 단계가 상기 관심의 항체를 포함하는 막 유출물에 적용되는 이전의 막과 유사한 전하의 이온 교환 크로마토그래피 단계, 및 상기 하전된 이온 교환 크로마토그래피 단계의 유출물로부터 정제된 항체를 회수하는 단계를 포함하는 것인 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 이온 교환 막이 0.1 내지 100 μm의 공극 크기를 갖는 것인 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 이온 교환 막이 모놀리스 또는 심도 필터로 대체되는 것인 방법.
4. 다음 단계들을 포함하는, 항체의 정제를 위한 다운스트림 크로마토그래피 단계들의 효율을 증진시키는 방법으로서,
   a. 관심의 항체 및 하나 이상의 오염물을 포함하는 조성물을 양이온 교환 막을 통해 통과시키는 단계로서, 상기 항체 및 막은 항체의 pI 보다 1 내지 5 pH 단위 낮은 pH 및 ＜ 40 mS/cm의 전도도를 갖는 완충액으로 구성된 작동 조건들에서 반대 전하를 갖음으로써 상기 막이 항체 및 적어도 하나의 오염물에 결합하도록 유발시키는 단계이며, 여기서 하나 이상의 오염물은 핵산, 관심의 항체의 변종, 또 다른 항체, 엔도톡신, 또는 바이러스 오염물 중 하나 이상임;
   b. 관심의 항체가 주로 유출물 중에 존재하는 동안 적어도 하나의 오염물이 남아 상기 막에 결합하도록 1000 내지 5000 g/L의 부하 밀도로 상기 양이온 교환 막을 과부하시키는 단계; 및
   c. 관심의 항체를 포함하는 상기 양이온 교환 막으로부터 유출물을 수집하는 단계;
   이때, 상기 다운스트림 크로마토그래피 단계가 상기 관심의 항체를 포함하는 막 유출물에 적용되는 양이온 교환 크로마토그래피 정제 단계, 및 상기 양이온 교환 크로마토그래피 정제 단계의 유출물로부터 정제된 항체를 회수하는 단계를 포함하는 것인 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 pH가 관심의 항체의 pI 보다 1 내지 4 pH 단위 낮은 것인 방법.
6. 제4항에 있어서, 상기 pH가 관심의 항체의 pI 보다 1 내지 3 pH 단위 낮은 것인 방법.
7. 제4항에 있어서, 상기 pH가 관심의 항체의 pI 보다 1 내지 2 pH 단위 낮은 것인 방법.
8. 제4항에 있어서, 상기 pH가 관심의 항체의 pI 보다 1 pH 단위 낮은 것인 방법.
9. 제4항에 있어서, 상기 전도도가 ＜ 20 mS/cm인 방법.
10. 제4항에 있어서, 상기 전도도가 ＜ 10 mS/cm인 방법.
11. 제4항에 있어서, 상기 양이온 교환 막이 양이온 교환 모놀리스 또는 심도 필터인 방법.
12. 다음 단계들을 포함하는, 항체의 정제를 위한 다운스트림 크로마토그래피 단계들의 효율을 증진시키는 방법으로서,
    a. 관심의 항체 및 하나 이상의 오염물을 포함하는 조성물을 음이온 교환 막을 통해 통과시키는 단계로서, 상기 항체 및 막은 항체의 pI 보다 1 내지 5 pH 단위 높은 pH 및 ＜ 40 mS/cm의 전도도를 갖는 완충액으로 구성된 작동 조건들에서 반대 전하를 갖음으로써 상기 막이 항체 및 적어도 하나의 오염물에 결합하도록 유발시키는 단계이며, 여기서 하나 이상의 오염물은 핵산, 관심의 항체의 변종, 또 다른 항체, 엔도톡신, 또는 바이러스 오염물 중 하나 이상임;
    b. 관심의 항체가 주로 유출물 중에 존재하는 동안 적어도 하나의 오염물이 남아 상기 막에 결합하도록 1000 내지 5000 g/L의 부하 밀도로 상기 음이온 교환 막을 과부하시키는 단계; 및
    c. 관심의 항체를 포함하는 상기 음이온 교환 막으로부터 유출물을 수집하는 단계;
    이때, 상기 다운스트림 크로마토그래피 단계가 상기 관심의 항체를 포함하는 막 유출물에 적용되는 음이온 교환 크로마토그래피 정제 단계, 및 상기 음이온 교환 크로마토그래피 정제 단계의 유출물로부터 정제된 항체를 회수하는 단계를 포함하는 것인 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 pH가 관심의 항체의 pI 보다 1 내지 4 pH 단위 높은 것인 방법.
14. 제12항에 있어서, 상기 pH가 관심의 항체의 pI 보다 1 내지 3 pH 단위 높은 것인 방법.
15. 제12항에 있어서, 상기 pH가 관심의 항체의 pI 보다 1 내지 2 pH 단위 높은 것인 방법.
16. 제12항에 있어서, 상기 pH가 관심의 항체의 pI 보다 1 pH 단위 높은 것인 방법.
17. 제12항에 있어서, 상기 전도도가 ＜ 20 mS/cm인 방법.
18. 제12항에 있어서, 상기 전도도가 ＜ 10 mS/cm인 방법.
19. 제12항에 있어서, 상기 음이온 교환 막이 음이온 교환 모놀리스 또는 심도 필터로 대체되는 것인 방법.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막이 혼합 모드 흡착제인 방법.
21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심의 항체가 CH2/CH3 영역을 포함하는 것인 방법.
22. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심의 항체는 모노클로날 항체인 방법.
23. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 추가의 정제 단계(들)을 포함하는 것인 방법.
24. 제23항에 있어서, 상기 추가의 정제 단계(들)은 단계들 a 내지 c와 연속적으로 수행되고, 상기 정제 단계는 이온 교환 크로마토그래피인 방법.
25. 제23항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피는 양이온 교환 컬럼을 포함하는 것인 방법.
26. 제23항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피는 음이온 교환 컬럼을 포함하는 것인 방법.
27. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 항체를 제약학적으로 허용되는 담체와 조합함으로써 제약 조성물을 제조하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

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