ES2309012T3 - Composiciones del anticuerpo anti-psca y a sus procedimientos contra celulas cancerigenas que expresen psca. - Google Patents
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Abstract
Anticuerpo monoclonal anti-antígeno de células madre prostáticas (PSCA) que se internaliza tras la unión a PSCA en una célula de mamífero in vivo, cuyo anticuerpo: a) es producido por un hibridoma seleccionado entre el grupo de hibridomas depositados en la American Type Culture Collection bajo el número de acceso PTA-717, PTA-718, PTA-719, PTA-720 y PTA-880; b) es producido por un hibridoma depositado en la American Type Culture Collection bajo el número de acceso PTA-2265; c) presenta la secuencia de aminoácidos de: SEQ ID Nº 10 y SEQ ID Nº 11; o SEQ ID Nº 12 y SEQ ID Nº 13; d) es una forma humanizada de un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma seleccionado entre el grupo de hibridomas depositados en la American Type Culture Collection bajo el número de acceso PTA-717, PTA-718, PTA-719, PTA-720, PTA-880 y PTA-2265; e) es un polipéptido de fusión que comprende al menos las secuencias de la región variable (V) de un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma seleccionado entre el grupo de hibridomas depositados en la American Type Culture Collection bajo el número de acceso PTA-717, PTA-718, PTA-719, PTA-720, PTA-880 y PTA-2265 fusionado con un polipéptido heterólogo; o f) compite por unirse al mismo epítopo al que se une el anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma seleccionado entre el grupo de hibridomas depositados en la American Type Culture Collection bajo el número de acceso PTA-717, PTA-718, PTA-719, PTA-720, PTA-880 y PTA-2265.
Description
Composiciones del anticuerpo
anti-PSCA y a sus procedimientos contra células
cancerígenas que expresen PSCA.
La presente invención se refiere a las
composiciones del anticuerpo anti-PSCA y a los
procedimientos empleados para matar células cancerígenas que
expresen PSCA.
En los humanos, el cáncer de próstata es una de
las enfermedades masculinas más comúnmente diagnosticadas y es la
segunda causa de mortalidad por cáncer en hombres. La American
Cancer Society estima que en el año 2000 se diagnosticarán 180.400
nuevos casos de cáncer de próstata con 31.900 muertes debidas a esta
enfermedad. En fases avanzadas, el cáncer de próstata metastatiza a
los huesos. Aunque se han conseguido avances en el diagnóstico y
tratamiento temprano de tumores localizados y limitados, el cáncer
de próstata es incurable una vez metastatizado. Los pacientes con
cáncer de próstata metastático sometidos a terapia hormonal
desarrollarán con el tiempo un estado refractario a los andrógenos
(andrógeno-independiente) que llevará a una
progresión de la enfermedad y a la muerte. Actualmente, el antígeno
específico de la próstata (PSA) es el marcador tumoral más
ampliamente utilizado para el cribado, diagnóstico y monitorización
del cáncer de próstata. Sin embargo, el uso generalizado del PSA
como una herramienta de cribado resulta controvertido, ya que el PSA
no discrimina con precisión entre la enfermedad prostática maligna
y la benigna.
Dependiendo de la fase en la que se encuentre el
cáncer, el tratamiento del cáncer de próstata y de vejiga implica
una o una combinación de las siguientes terapias: cirugía para
extirpar el tejido canceroso, radioterapia, quimioterapia,
deprivación de andrógenos (por ejemplo, terapia hormonal) en el caso
del cáncer de próstata. Aunque la terapia quirúrgica o de radiación
mejora significativamente la supervivencia en pacientes que se
encuentren en fases tempranas de la enfermedad, las opciones
terapéuticas son muy limitadas para los casos avanzados,
particularmente para los casos de recurrencia del tumor posterior a
la ablación hormonal. La mayoría de los pacientes que reciben
terapia hormonal terminan por desarrollar una enfermedad
andrógeno-independiente. Actualmente, no existe
ningún tratamiento eficaz para el 20-40% de los
pacientes con cáncer de próstata que desarrollan una enfermedad
recurrente después de haber sido sometidos a cirugía o a
radioterapia, ni para aquellos en los que el cáncer ha
metastatizado cuando se produce el diagnóstico. La quimioterapia
tiene efectos secundarios tóxicos, especialmente en pacientes de
avanzada edad. El desarrollo de nuevas formas de terapia,
especialmente para la enfermedad refractaria a la deprivación de
andrógenos es una necesidad urgente en la gestión del carcinoma
prostático.
La identificación de un nuevo antígeno de
superficie celular, un antígeno de células madre prostáticas
(PSCA), ha sido descrita, por ejemplo, en la Patente estadounidense
nº 5.856.136 (SCAH2), WO 99/14328 (proteína PRO232), WO 98/40403
(PSCA), WO 98/51805 (PS116) y en Reiter et al. Proc. Nat.
Acad. Sci. 95:1735-1740 (1998). El PSCA se clonó
inicialmente de una librería de ADNc de un xenoinjerto
LAPC-4 procedente de un paciente con cáncer de
próstata.
El PSCA es una molécula de 123 aminoácidos
ligada a GPI que se expresa sobre la superficie de varios tipos de
células, incluyendo las células de tumores de próstata y vejiga. El
gen se localiza en el locus myc de 8Q24.2, que es una región
amplificada en un 80% de los cánceres de próstata. El PSCA muestra
un 30% de homología con SCA-2. La proteína presenta
una secuencia de señal hidrofóbica en los primeros 20 aminoácidos
del extremo N-terminal y una secuencia de anclaje a
GPI en los aminoácidos 100-123 del extremo
C-terminal (Fig. 2 de la página 1737 de Reiter
et al. (1998)). Existen cuatro sitios de glicosilación
previstos. La proteína de superficie celular es desprendida con un
tiempo medio de aproximadamente 10 horas en cultivo. Se ha descrito
que el PSCA se sobreexpresa de forma generalizada en todas las fases
del cáncer de próstata, incluyendo la neoplasia intraepitelial
prostática (PIN) de alto grado, y tanto en los tumores de próstata
andrógeno-dependientes como en los
andrógeno-independientes. No se han descrito
anticuerpos que sean capaces de dirigirse contra células tumorales
que expresen PSCA in vivo y que puedan internalizarse tras la
unión a las células.
La terapia basada en anticuerpos ha demostrado
ser muy efectiva en el tratamiento de diversos cánceres. Por
ejemplo, HERCEPTIN® y RITUXAN® (ambos de Genentech, San Francisco),
han sido utilizados con éxito para tratar el cáncer de mama y el
linfoma no-Hodgkin, respectivamente. HERCEPTIN® es
un anticuerpo monoclonal humanizado derivado de ADN recombinante
que se une de forma selectiva al dominio extracelular del
protooncogen del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico
humano (HER2). La sobreexpresión de la proteína HER2 se observa en
el 25-30% de los cánceres de mama primarios.
RITUXAN® es un anticuerpo monoclonal quimérico
humano-murino creado por ingeniería genética y
dirigido contra el antígeno CD20 hallado sobre la superficie de
linfocitos B normales y malignos. Estos dos anticuerpos se producen
en células CHO.
La presente invención proporciona procedimientos
alternativos para el tratamiento del cáncer que superan las
limitaciones de los procedimientos terapéuticos convencionales,
además de ofrecer ventajas adicionales que resultarán aparentes en
la descripción detallada que se muestra a continuación.
La invención proporciona anticuerpos
anti-PSCA aislados que se internalizan tras la unión
a PSCA en una célula de mamífero in vivo. Estos anticuerpos
también pueden dirigirse contra una célula tumoral que exprese PCSA
in vivo, y los anticuerpos anti-PSCA se
pueden internalizar tras la unión a PSCA en células cancerígenas,
incluyendo el cáncer de próstata, cánceres del tracto urinario (por
ejemplo, cáncer de vejiga) y cáncer de pulmón. Se proporcionan
anticuerpos anti-PSCA internalizantes que son
anticuerpos monoclonales. En realizaciones específicas, los
anticuerpos producidos por los hibridomas son 10E3, 6F8, 8D11, 5F2,
6C3 y 6B8 depositados bajo el número de acceso a la American Type
Culture Collection PTA-717, PTA-718,
PTA-719, PTA-720,
PTA-880 y PTA-2265. Las secuencias
de la región V de los anticuerpos 6F8, 8D11, 5F2, 6B8 se muestran
en las Figuras 12 (SEQ ID N^{os} 3-9). Se
proporcionan los polipéptidos del anticuerpo quimérico
murino-humano que poseen la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID Nº 10, SEQ ID Nº 11, SEQ ID Nº 12 ó SEQ ID Nº
13. La invención proporciona anticuerpos anti-PSCA
y polipéptidos de fusión de anticuerpos que comprenden las
secuencias de aminoácidos de SEQ ID Nº 3 y SEQ ID Nº 4; SEQ ID Nº 5
y SEQ ID Nº 6; ó SEQ ID Nº 7 y SEQ ID Nº 8.
También se proporcionan anticuerpos que compiten
por unirse al mismo epítopo que el epítopo unido por cualquiera de
los anticuerpos monoclonales anteriormente mencionados. En otra
realización, se proporciona un anticuerpo monoclonal
anti-PSCA aislado que inhibe el crecimiento de
células cancerígenas que expresan PSCA in vivo, o es
citotóxico in vivo, para dichas células y para tumores que
contengan dichas células.
La invención también proporciona anticuerpos
anti-PSCA que están conjugados con un agente
citotóxico o a un agente inhibidor del crecimiento. Los anticuerpos
son anticuerpos internalizantes y/o inhibidores del crecimiento. El
agente citotóxico puede ser una toxina, un antibiótico, un isótopo
radioactivo o una enzima nucleolítica. En una realización
ventajosa, la toxina es un maitansinoide, más ventajosamente el
maitansinoide que posee la estructura mostrada en la Fig. 22.
Los anticuerpos anti-PSCA de las
realizaciones precedentes incluyen anticuerpos intactos (de longitud
completa), así como fragmentos de anticuerpo. Los anticuerpos
anti-PSCA de la invención incluyen anticuerpos
humanos y anticuerpos quiméricos, así como polipéptidos de fusión de
anticuerpos que comprenden al menos las secuencias de la región V
del anticuerpo fusionadas a un polipéptido heterólogo. En una
realización ventajosa, el anticuerpo anti-PSCA de
cualquiera de las realizaciones precedentes es un anticuerpo
quimérico o humano. En una realización ventajosa, el anticuerpo
quimérico es un anticuerpo humanizado. Los anticuerpos
anti-PSCA humanizados incluyen formas humanizadas
de cualquiera de los anticuerpos producidos por los hibridomas
depositados en la American Type Culture Collection bajo el número
de acceso PTA-717, PTA-718,
PTA-719, PTA-720,
PTA-880 y PTA-2265 y los
anticuerpos quiméricos incluyen aquellos que poseen las secuencias
de aminoácidos de SEQ ID Nº 10-13, como se muestra
en la Fig. 13. Los anticuerpos de la invención incluyen aquellos
anticuerpos producidos en células de mamíferos o bacterias.
La invención también abarca una composición que
comprende cualquiera de los anticuerpos anti-PSCA de
las realizaciones anteriores, y un transportador. En una
realización, el anticuerpo de la composición es un anticuerpo
humano o una forma humanizada del anticuerpo monoclonal producido
por cualquiera de los hibridomas depositados bajo el número de
acceso a ATCC PTA-717, PTA-718,
PTA-719, PTA-720,
PTA-880 y PTA-2265.
En una realización específica, el anticuerpo de
la composición está conjugado con un maitansinoide. En una
realización ventajosa, el transportador es un transportador
aceptable desde el punto de vista farmacéutico. Estas composiciones
se pueden suministrar en un artículo de fabricación o en un kit.
Otro aspecto de la invención es un ácido
nucléico aislado que codifica cualquiera de los anticuerpos
anti-PSCA de las realizaciones anteriores, así como
un vector de expresión que comprende el ácido nucléico aislado
unido de forma operativa a una secuencia reguladora de la
expresión.
La invención también proporciona células que
producen los anticuerpos anti-PSCA anteriormente
descritos. En una realización, las células productoras de
anticuerpos son células de hibridoma que incluyen las células
específicas del hibridoma con números de acceso a ATCC
PTA-717, PTA-718,
PTA-719, PTA-720,
PTA-880 y PTA-2265.
En otra realización, la célula es una célula
bacteriana. Se proporciona específicamente una célula huésped que
comprenda el vector anteriormente descrito.
La invención abarca además un procedimiento de
producción de los anticuerpos anti-PSCA de las
realizaciones anteriores, que comprende el cultivo de las células
de las realizaciones anteriores y la recuperación del anticuerpo
del cultivo celular.
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Otro aspecto diferente de la invención es un
procedimiento in vitro para matar una célula cancerígena que
exprese PSCA, que comprende el contacto de la célula cancerígena con
un anticuerpo anti-PSCA de cualquiera de las
realizaciones anteriores, matando de ese modo la célula cancerígena.
En realizaciones ventajosas del procedimiento precedente, el cáncer
es un cáncer de próstata, de vejiga o de pulmón, más ventajosamente
un cáncer de próstata y especialmente una célula cancerígena de
próstata andrógeno-independiente o un cáncer de
próstata metastático. En una realización ventajosa del
procedimiento, el anticuerpo anti-PSCA es un
anticuerpo humano o uno humanizado. En otra realización ventajosa,
el anticuerpo está conjugado con un agente citotóxico como una
toxina o un isótopo radiactivo. Ventajosamente, la toxina es una
caliqueamicina o un maitansinoide como "DM1" que posee la
estructura mostrada en la Fig. 22. Un procedimiento de mitigación
del cáncer que expresa PSCA anticipa la administración del
anticuerpo anti-PSCA junto con quimioterapia, en
donde el mamífero también recibe al menos un agente
quimioterapéutico. En una realización específica, el agente
quimioterapéutico es un taxano como paclitaxel (TAXOL®) o
docetaxel, o derivados y análogos de los mismos.
En un aspecto adicional, la invención
proporciona un artículo de fabricación que comprende un contenedor
y una composición contenida en él, en donde la composición comprende
un anticuerpo anti-PSCA de las realizaciones
anteriores, y además comprende un prospecto que indica que la
composición se puede utilizar para aliviar o tratar un cáncer que
exprese PSCA y, en particular, el cáncer de próstata.
La Figura 1 muestra la unión a y la tinción de
células CHO transfectadas con gD-PSCA por Mab por
5F2, según el ensayo realizado por FACS (ver el Ejemplo 1).
La Figura 2 muestra la unión a y la tinción de
células CHO transfectadas con gD-PSCA por Mab por
10C5, según el ensayo realizado por FACS (ver el Ejemplo 1).
La Figura 3 muestra la actividad de unión del
6B8.1D7.2B3 Mab anti-PSCA a varios antígenos PSCA
solubles (ver el Ejemplo 1).
La Figura 4 muestra la curva de unión para el
ascites con anticuerpo nº 2403 (5F2) (ver el Ejemplo 1).
La Figura 5 es un gráfico que muestra la
internalización de los diferentes anticuerpos monoclonales
anti-PSCA (6C3; 6F8; 10A1; 8D11; 5F2; 7A6) en los
tres tipos de células, medida en 1 hora por la intensidad de la
fluorescencia Cy3 (ver el Ejemplo 3).
La Figura 6 es un gráfico que muestra el marcaje
en superficie del PSCA por los diferentes anticuerpos monoclonales
anti-PSCA (6C3; 6F8; 10A1; 8D11; 5F2; 7A6) en los
tres tipos de células, medida por la intensidad de la fluorescencia
Cy3 (ver el Ejemplo 3).
La Figura 7 es un gráfico que compara la
cantidad de anticuerpo monoclonal anti-PSCA en
superficie frente al correspondiente internalizado para cada uno de
los anticuerpos, medida en 1 hora por la intensidad de la
fluorescencia Cy3. La cantidad de anticuerpo de superficie y de
anticuerpo internalizado es un promedio de los resultados obtenidos
para las tres líneas celulares diferentes utilizadas en las Figuras
5 y 6.
Las Figuras 8A, 8B y 8C son micrografías que
muestran la distribución del anticuerpo anti-PSCA
marcado fluorescentemente 8D11 en líneas celulares que expresan
PSCA HCT 47 gD, MCF7/HER2/PSCA y PC3-19
gD-PSCA respectivamente, como se observa mediante
microscopía confocal (ver el Ejemplo 3).
Las Figuras 9A-D muestran
micrografías de electrones de células CHO que expresan PSCA tratadas
con anticuerpos anti-PSCA marcados con aductos de
oro. Las Figuras 9A y 9B muestran células incubadas con anticuerpo
6C3 durante 15 minutos y 1 hora, respectivamente.
Las Figuras 9C y 9D muestran células incubadas
con anticuerpo 10E3 durante 15 minutos y 1 hora,
respectivamente.
La Figura 10 es una micrografía que muestra la
internalización del anticuerpo ^{125}I-8D11 en
células HCT116 gD-PSCA, 15 minutos después del
contacto con el anticuerpo (ver el Ejemplo 3 más adelante).
La Figura 11 muestra los niveles de
internalización de tres anticuerpos anti-PSCA
[ascites nº 2395 (6F8), nº 2399 (8D11), nº 2403 (5F2)] a 37ºC
después de 5 horas, en células MCF7 que expresan Her2 transfectadas
con gD-PSCA o únicamente con un vector (ver el
Ejemplo 3 más adelante). Herceptin es un anticuerpo
anti-Her2.
La Figura 12 muestra las secuencias de
aminoácidos de los dominios de la región variable de cadena pesada
y ligera (V_{H} y V_{L}) de los anticuerpos de los clones de
hibridoma 6F8.2F4, Asc nº 2395; 8D11.2E9, Asc nº 2399;
5F2.4H4.1E3, Asc nº 2403; y 6B8.1D7.2B3, Asc nº 2761.
La Figura 13 muestra las secuencias de
aminoácidos de la IgG 2403 quimérica de longitud completa que
incluye las secuencias de péptido señal y las secuencias de 6B8 Fab
quimérico.
La Figura 14 muestra una comparación de los
niveles relativos de expresión de PSCA en varios tumores frente a
tejidos normales (ver el Ejemplo 4).
La Figura 15 muestra el ADN y las secuencias
proteicas del PSCA tipo I de mono Cynomolgus (SEQ ID Nº 16 y Nº 17,
respectivamente), ver el Ejemplo 6. La "o" en el extremo de la
secuencia de aminoácidos representa el codón de terminación
Ocre.
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La Figura 16 muestra el ADN y las secuencias
proteicas del PSCA tipo II de mono Cynomolgus (SEQ ID Nº 18 y Nº
19, respectivamente), ver el Ejemplo 6. El "o" en el extremo de
la secuencia de aminoácidos representa el codón de terminación
Ocre.
La Figura 17 compara las secuencias de
aminoácidos para el PSCA humano (SEQ ID Nº 1) y el PSCA tipo I de
mono Cynomolgus (SEQ ID Nº 17).
La Figura 18 muestra el crecimiento de células
tumorales PC3 de control (PSCA negativo) en ratones tratados con 3
de los anticuerpos anti-PSCA (6B8, 8D11 y 5F2), en
comparación con el anticuerpo de control negativo
anti-ambrosía (ver el Ejemplo 5).
La Figura 19 muestra el crecimiento de tumores
PC3.gD-PSCA en ratones tratados con 3 de los
anticuerpos anti-PSCA (6F8, 8D11 y 5F2), en
comparación con el control negativo, el anticuerpo
anti-ambrosía. Los anticuerpos fueron administrados
por inyección intraperitoneal comenzando un día antes de la
inoculación con células PC3 transfectadas con PSCA, seguido de
inyecciones quincenales tras la inoculación de células. "RX"
bajo las flechas indica la hora (día) de inyección de los
anticuerpos en los ratones (ver el Ejemplo 5).
La Figura 20 muestra el crecimiento de tumores
PC3.gD-PSCA tratados con anticuerpos 8D11, 5F2, 6B8
y anticuerpos control anti-ambrosía, según se
describe en la Figura 19 (ver el Ejemplo 5).
La Figura 21 muestra el crecimiento de tumores
PC3.gD-PSCA en ratones en los que el tratamiento con
anticuerpos anti-PSCA 6F8, 8D11 ó 5F2 se inició
después de que los tumores se hubieran dejado crecer durante 1
semana en los ratones y se hubiera alcanzado un volumen medio de
tumor de aproximadamente 200 mm^{3} por grupo de ratones. La
administración del anticuerpo fue quincenal. "RX" bajo las
flechas indica la hora (día) de inyección intraperitoneal de los
anticuerpos en los ratones (ver el Ejemplo 5).
La Figura 22 muestra la estructura del
maitansinoide denominado "DM1" (ver el Ejemplo 7).
La Figura 23 ilustra la estructura del
anticuerpo anti-PSCA conjugado con DM1 (ver el
Ejemplo 7).
La Figura 24 muestra la sensibilidad de las
líneas celulares del ensayo, de células PC3.Neo y de células
PC3.gD-PSCA humano clon 4, frente al DM1 no
conjugado (ver el Ejemplo 8).
La Figura 25 muestra la citotoxicidad del
conjugado anticuerpo 2399-DM1 a las células
PC3.gD-PSCA humano clon 4 en comparación con el
isotipo control 1421-DM1 (ver el Ejemplo 8).
La Figura 26 muestra la citotoxicidad del
2761-DM1 a las células PC3.gD-PSCA
humano clon 4 en comparación con el isotipo control
1428-DM1 (ver el Ejemplo 8).
La Figura 27 muestra la ausencia de toxicidad de
los conjugados anticuerpo-DM1 en células PC3.Neo
antígeno-negativo (ver el Ejemplo 8).
La Figura 28 muestra el crecimiento de células
tumorales de próstata PC3 humanas que expresan PSCA en un modelo de
ratón en el que los ratones fueron tratados con el anticuerpo
desnudo (no conjugado con toxina) o con el anticuerpo conjugado con
DM1. Los anticuerpos anti-PSCA fueron 2399 o 6B8 y
el anticuerpo anti-ambrosía 1428 sirvió como
anticuerpo control (ver el Ejemplo 9).
"PSCA" o "antígeno de células madre
prostáticas" humano, tal como se utiliza en la presente
invención, se refiere a una glicoproteína de subunidad simple de
123 aminoácidos que se expresa en la superficie celular como una
proteína anclada por glicosilfosfatidilinositol (GPI), cuyas
secuencias de nucleótidos y aminoácidos son las que se revelan, por
ejemplo, en la Patente estadounidense nº 5.856.136 (SCAH2; SEQ ID Nº
4); WO 99/14328 (PRO32, secuencia de nucleótidos de SEQ ID Nº 1,
Fig. 1; secuencia de aminoácidos de la Fig. 2; SEQ ID Nº 2); Fig. 2
(secuencia de aminoácidos) en la página 1737 de Reiter et al.
Proc. Nat. Acad. Sci. 95:1735-1740 (1998); WO
98/51805 (SEQ ID N^{os} 12 y 25); y WO 98/40403 (Figuras 1A y 1B).
La secuencia de aminoácidos de PSCA murino se proporciona en la
Fig. 2 de la página 1737 de Reiter et al. Proc. Nat. Acad.
Sci. 95:1735-1740 (1998). La proteína posee una
secuencia de señal en el extremo amino-terminal y la
secuencia de anclaje a GPI esté presente en el extremo
carboxi-terminal. En la secuencia de PSCA humano,
los aminoácidos 1-20 representan la secuencia de
señal N-terminal que es liberada de la proteína
madura, y las posiciones de los aminoácidos 100-123
representan las secuencias C-terminal de anclaje a
GPI (Reiter et al., 1998, ver la Fig. 2). Así, los
aminoácidos del 21 a aproximadamente 100 están presumiblemente en la
superficie celular. El PSCA, tal como se utiliza en la presente
invención, incluye variantes alélicas y mutaciones por sustitución
conservativa de la proteína que posee actividad biológica de PSCA.
Estas variantes alélicas y mutaciones por sustitución conservativa
pueden ser formas ligadas a GPI o formas secretadas de la
proteína.
\newpage
El término "anticuerpo" (Ab), tal como se
utiliza en la presente invención, incluye anticuerpos monoclonales,
anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo,
anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpos, siempre que
exhiban la actividad biológica deseada. El término
"inmunoglobulina" (Ig) se utiliza aquí de manera
intercambiable con "anticuerpo".
Un "anticuerpo aislado" es aquel que ha
sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su
entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural
son materiales que interferirían con los usos diagnósticos o
terapéuticos del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y
otros solutos proteináceos o no proteináceos. En las realizaciones
ventajosas, el anticuerpo se purificará (1) en más del 95% en peso
de anticuerpo tal como se determina en el procedimiento de Lowry y,
en el caso más ventajoso posible, en más del 99% en peso, (2) hasta
un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la
secuencia de aminoácidos N-terminal o interna
mediante la utilización de un secuenciador tipo Edman o (3) hasta
conseguir la homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo
condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomasie
o, ventajosamente, un colorante de plata. El anticuerpo aislado
incluye el anticuerpo in situ dentro de las células
recombinantes, ya que al menos un componente del entorno natural del
anticuerpo no estará presente. Sin embargo, el anticuerpo aislado
se preparará, normalmente, mediante al menos un paso de
purificación.
La unidad básica de 4 cadenas de anticuerpo es
una glucoproteína heterotetramérica compuesta de dos cadenas
ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas (un
anticuerpo IgM consta de 5 de las unidades básicas de
heterotetrámero junto con un polipéptido adicional denominado cadena
J y, por lo tanto, contiene 10 sitios de unión a antígeno, mientras
que los anticuerpos IgA secretados se pueden polimerizar para formar
uniones polivalentes que comprendan 2-5 de las
unidades básicas de 4 cadenas junto con la cadena J). En el caso de
las IgGs, la unidad de 4 cadenas es, generalmente, de
aproximadamente 150.000 daltons. Cada cadena L está unida a una
cadena H por un enlace disulfuro covalente, mientras que las dos
cadenas H están unidas entre sí por uno o más enlaces disulfuro
dependiendo del isotipo de la cadena H. Cada cadena H y L presenta
también puentes disulfuro intracadena dispuestos regularmente. Cada
cadena H presenta, en el extremo N-terminal, un
dominio variable (V_{H}) seguido de tres dominios constantes
(C_{H}) para cada una de las cadenas \alpha y \gamma y cuatro
dominios C_{H} para los isotipos \mu y \varepsilon. Cada
cadena L presenta, en el extremo N-terminal, un
dominio variable (V_{L}) seguido de un dominio constante (C_{L})
en su otro extremo. El V_{L} está alineado con el V_{H} y el
C_{L} está alineado con el primer dominio constante de la cadena
pesada (C_{H}1). Se cree que los residuos de aminoácidos
específicos forman una interfase entre los dominios variables de la
cadena ligera y de la cadena pesada. El apareamiento de un V_{H} y
un V_{L} entre sí forma un único sitio de unión a antígeno. En
cuanto a la estructura y las propiedades de las diferentes clases de
anticuerpos, ver, por ejemplo, Basic and Clinical Immunology, 8ª
edición, Daniel P. Stites, Abba I. Terr y Tristram G. Parslow
(eds.), Appleton & Lange, Norwalk (CT), EE.UU., 1994, página 71
y Capítulo 6.
La cadena L de cualquier especie vertebrada se
puede asignar a uno de los dos tipos claramente diferenciados,
denominados kappa y lambda, basándose en las secuencias de
aminoácidos de sus dominios constantes. Dependiendo de la secuencia
de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas
(C_{H}), las inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes
clases o isotipos. Existen cinco clases de inmunoglobulinas: IgA,
IgD, IgE, IgG e IgM, que poseen cadenas pesadas denominadas
\alpha, \delta, \varepsilon, \gamma y \mu,
respectivamente. Las clases \gamma y \alpha se subdividen
adicionalmente en subclases en base a diferencias relativamente
pequeñas en la secuencia y en la función de la C_{H}, por ejemplo,
los humanos expresan las siguientes subclases: IgG1, IgG2, IgG3,
IgG4, IgA1 e IgA2.
El término "variable" se refiere al hecho
de que ciertos segmentos de los dominios variables difieran
ampliamente en cuanto a la secuencia entre los diferentes
anticuerpos. El dominio V media en la unión al antígeno y define la
especificidad de un anticuerpo en particular para su antígeno en
particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye de forma
uniforme a través de toda la extensión de los 110 aminoácidos de los
dominios variables. En cambio, las regiones V constan de
extensiones relativamente invariables denominadas regiones de
entramado (FRs), de 15-30 aminoácidos separados por
regiones más cortas de variabilidad extrema denominadas "regiones
hipervariables", cada una de ellas con una longitud de
9-12 aminoácidos. Los dominios variables de las
cadenas nativas pesadas y ligeras comprenden cada uno cuatro FRs,
que adoptan mayoritariamente una configuración en lámina \beta,
conectadas por tres regiones hipervariables, que forman bucles que
conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura en
lámina \beta. Las regiones hipervariables de cada cadena se
mantienen unidas en estrecha proximidad gracias a las FRs, y junto
con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la
formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos (ver
Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological
Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of
Health, Bethesda (MD), EE.UU. (1991)). Los dominios constantes no
están directamente involucrados en la unión de un anticuerpo a un
antígeno, aunque exhiben diversas funciones efectoras, como la
participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular
dependiente de anticuerpos (ADCC).
El término "región hipervariable", cuando
se utiliza aquí, se refiere a los residuos de aminoácido de un
anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región
hipervariable comprende generalmente residuos de aminoácido de una
"región determinante de la complementariedad" o "CDR" (por
ejemplo, alrededor aproximadamente de los residuos
24-34 (L1), 50-56 (L2) y
89-97 (L3) de la V_{L}, y alrededor
aproximadamente de 1-35 (H1), 50-65
(H2) y 95-102 (H3) de la V_{H}; Kabat et
al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed.
Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda (MD),
EE.UU. (1991)) y/o aquellos residuos de un "bucle
hipervariable" (por ejemplo, los residuos 26-32
(L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) de la
V_{L}, y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y
96-101 (H3) de la V_{H}; Chothia y Lesk J. Mol.
Biol. 196:901-917 (1987)).
El término "anticuerpo monoclonal", tal
como se utiliza en la presente invención, se refiere a un anticuerpo
obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea,
es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población
son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que pueden
estar presentes en cantidades minoritarias. Los anticuerpos
monoclonales son altamente específicos, y se dirigen contra un
único sitio antigénico. Además, en contraste con las preparaciones
de anticuerpos policlonales que incluyen diferentes anticuerpos
dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada
anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante del
antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales
son ventajosos en cuanto a que se pueden sintetizar sin que resulten
contaminados por otros anticuerpos. El modificador
"monoclonal" no se construye como se requiere para la
producción del anticuerpo mediante ningún procedimiento específico.
Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales de utilidad para la
presente invención se pueden preparar siguiendo la metodología de
hibridoma inicialmente descrita por Kohler et al., Nature,
256:495 (1975), o se pueden obtener utilizando procedimientos de ADN
recombinante en células bacterianas, células eucariotas de animales
o plantas (ver, por ejemplo, la Patente estadounidense nº
4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también se pueden
aislar de librerías de anticuerpos en fagos utilizando, por ejemplo,
las técnicas descritas por Clackson et al., Nature,
352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol.
Biol., 222:581-597 (1991).
Los anticuerpos monoclonales aquí descritos
incluyen anticuerpos "quiméricos" en los que una porción de la
cadena pesada y/o ligera es idéntica a, u homóloga de, las
secuencias correspondientes a anticuerpos derivados de una especie
específica o pertenecientes a una clase o subclase específica de
anticuerpo, mientras que el resto de la(s)
cadena(s) es(son) idéntica(s) a, u homóloga(s) de, las secuencias correspondientes a anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (ver la Patente estadounidense nº 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos que son de interés en la presente invención incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de unión a antígeno de dominios variables derivadas de secuencias de la región constante de un primate no humano (por ejemplo, Mono del Viejo Mundo, Simio, etc.) y de humano.
cadena(s) es(son) idéntica(s) a, u homóloga(s) de, las secuencias correspondientes a anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (ver la Patente estadounidense nº 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos que son de interés en la presente invención incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de unión a antígeno de dominios variables derivadas de secuencias de la región constante de un primate no humano (por ejemplo, Mono del Viejo Mundo, Simio, etc.) y de humano.
Un anticuerpo "intacto" es aquel que
comprende un sitio de unión a antígeno, así como una C_{L} y al
menos dominios constantes de cadena pesada C_{H}1, C_{H}2 y
C_{H}3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de
secuencia nativa (por ejemplo, dominios constantes de secuencia
nativa humana) o una secuencia de aminoácidos variante de la misma.
Ventajosamente, el anticuerpo intacto posee una o más funciones
efectoras.
Un "fragmento de anticuerpo" comprende una
parte de un anticuerpo intacto, ventajosamente la región de unión
al antígeno o la región variable del anticuerpo intacto. Ejemplos de
fragmentos de anticuerpos incluyen los fragmentos Fab, Fab',
F(ab')_{2} y Fv, diabodies, anticuerpos lineales (ver la
Patente estadounidense nº 5.641.870, Ejemplo 2; Zapata et
al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062
[1995]); moléculas de anticuerpo de cadena simple y anticuerpos
multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
La digestión de anticuerpos con papaína produce
dos fragmentos idénticos de unión al antígeno, denominados
fragmentos "Fab" y un fragmento residual "Fc", una
designación que refleja la capacidad para cristalizarse de manera
sencilla. El fragmento Fab consta de una cadena L completa junto con
el dominio de la región variable de la cadena H (V_{H}) y el
primer dominio constante de una cadena pesada (C_{H}1). Cada
fragmento Fab es monovalente con respecto a la unión al antígeno,
es decir, tiene un único sitio de unión al antígeno. El tratamiento
de un anticuerpo con pepsina produce un único fragmento grande
F(ab')_{2} que corresponde aproximadamente a dos
fragmentos Fab unidos por puente disulfuro que presentan actividad
de unión al antígeno divalente y que todavía es capaz de
entrecruzarse con el antígeno. Los fragmentos Fab' difieren de los
fragmentos Fab en que poseen algunos residuos adicionales en el
extremo carboxi-terminal del dominio C_{H}1,
incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo.
Fab'-SH es la designación utilizada aquí para un
Fab' en el que el(los) residuo(s) de cisteína de los
dominios constantes soportan un grupo tiol libre. Los fragmentos de
anticuerpo F(ab')_{2} se produjeron originalmente como
pares de fragmentos Fab' que poseían cisteínas bisagra entre ellos.
Se conocen también otros acoplamientos químicos de fragmentos de
anticuerpos.
El fragmento Fc comprende las porciones
carboxi-terminal de las dos cadenas H que se
mantienen unidas por puentes disulfuro. Las funciones efectoras de
los anticuerpos vienen determinadas por secuencias de la región Fc,
y dicha región es también la parte reconocida por los receptores Fc
(FcR) encontrados en ciertos tipos de células.
"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo
que contiene un sitio de unión y reconocimiento del antígeno
completo. Este fragmento consta de un dímero de un dominio de región
variable de una cadena pesada y de una cadena ligera en estrecha
asociación no covalente. Del plegamiento de estos dos dominios
surgen seis bucles hipervariables (3 bucles en cada una de las
cadenas H y L) que aportan los residuos de aminoácidos necesarios
para la unión al antígeno y que confieren al anticuerpo
especificidad de unión al antígeno. Sin embargo, incluso un único
dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende tan solo tres
CDRs específicos para un antígeno) tiene la capacidad necesaria
para reconocer un antígeno y unirse a él, aunque con menor afinidad
que el sitio de unión completo.
Los "Fv de cadena simple", también
abreviado como "sFv" o "scFv", son fragmentos de
anticuerpo que comprenden los dominios de anticuerpo V_{H} y
V_{L} conectados en una cadena de polipéptido simple.
Ventajosamente, el polipéptido sFv comprende además un enlace de
polipéptido entre los dominios V_{H} y V_{L} que permite que el
sFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una
revisión de sFv, ver Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal
Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds.,
Springer-Verlag, Nueva York, EE.UU., pp.
269-315 (1994); Borrebaeck 1995, infra.
El término "diabodies" hace referencia a
pequeños fragmentos de anticuerpos preparados mediante construcción
de fragmentos sFv (ver el párrafo anterior) con enlaces cortos (de
aproximadamente 5-10 residuos) entre los dominios
V_{H} y V_{L}, de forma que se consigue el emparejamiento
intercadena pero no intracadena de los dominios V, obteniéndose un
fragmento bivalente, es decir, un fragmento que presenta dos sitios
de unión al antígeno. Los diabodies biespecíficos son heterodímeros
de dos fragmentos sFv "entrecruzados" en los que los dominios
V_{H} y V_{L} de los dos anticuerpos están presentes en cadenas
de polipéptidos diferentes. Los diabodies se describen más en
detalle, por ejemplo, en EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448
(1993).
Un polipéptido de "secuencia nativa" es
aquél que presenta la misma secuencia de aminoácidos que un
polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo) procedente de la
naturaleza. Dichos polipéptidos de secuencia nativa se pueden
aislar de la naturaleza o se pueden producir por medios
recombinantes o sintéticos. Así, un polipéptido de secuencia nativa
puede presentar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido humano
que se produce naturalmente, de un polipéptido murino o de un
polipéptido de cualquier otra especie de mamíferos.
El término "variante de secuencia de
aminoácidos" se refiere a un polipéptido que presenta secuencias
de aminoácidos que difieren en cierto grado de los de un polipéptido
de secuencia nativa. Normalmente, las variantes de secuencias de
aminoácidos de PSCA poseerán al menos aproximadamente un 70% de
homología con la secuencia nativa de PSCA, ventajosamente, al menos
aproximadamente un 80%, más ventajosamente aproximadamente un 85%,
incluso más ventajosamente al menos aproximadamente un 90% de
homología y en la realización más ventajosa posible al menos un
95%. Las variantes de secuencia de aminoácidos pueden poseer
sustituciones, deleciones y/o inserciones en ciertas posiciones de
la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos
nativa.
La frase "fragmento funcional o análogo" de
un anticuerpo es un compuesto que posee una actividad biológica
cualitativa común con un anticuerpo de longitud completa. Por
ejemplo, un fragmento funcional o análogo de un anticuerpo
anti-IgE es aquel que puede unirse a una
inmunoglobulina IgE de forma que se prevenga o se reduzca
sustancialmente la capacidad de dicha molécula para unirse al
receptor de alta afinidad, Fc\varepsilonRI.
"Homología" se define como el porcentaje de
residuos de la variante de secuencia de aminoácidos que son
idénticos tras alinear las secuencias e introducir huecos, si es
necesario, para alcanzar el máximo porcentaje de homología. Los
procedimientos y los programas informáticos para el alineamiento son
bien conocidos en la técnica. Uno de dichos programas informáticos
es "Align 2", creado por Genentech, Inc., que fue registrado
con la documentación de usuario en la United States Copyright
Office, Washington, DC 20559, EE.UU. el 10 de diciembre de
1991.
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no
humanos (por ejemplo, de roedor) son anticuerpos quiméricos que
contienen la secuencia mínima derivada del anticuerpo no humano. En
su mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas
humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región
hipervariable del receptor han sido reemplazados por residuos
procedentes de una región hipervariable de una especie no humana
(anticuerpo donante) como ratón, rata, conejo o primate no humano
que posea la especificidad, afinidad y capacidad del anticuerpo
deseado. En algunos casos, los residuos de la región de entramado
(FR) de la inmunoglobulina humana son reemplazados por los
correspondientes residuos no humanos. Más aún, los anticuerpos
humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el
anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donante. Estas
modificaciones se realizan para refinar aún más el rendimiento del
anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá
sustancialmente la totalidad de al menos uno, y normalmente dos,
dominios variables, en los que la totalidad o sustancialmente la
totalidad de los bucles hipervariables corresponden a los de una
inmunoglobulina no humana y en los que la totalidad o
sustancialmente la totalidad de los FRs son los de una secuencia de
inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá
opcionalmente al menos una porción de una región constante de
inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana.
Para obtener más detalles, ver Jones et al., Nature
321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature
332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct.
Biol. 2:593-596 (1992).
Tal como se utiliza aquí, un anticuerpo
anti-PSCA que "se internaliza" es aquel que es
absorbido (es decir, incorporado) por la célula al unirse a PSCA de
una célula de mamífero (es decir, PSCA de superficie celular). El
anticuerpo internalizante incluirá evidentemente fragmentos de
anticuerpos, anticuerpo humano o humanizado y conjugado de
anticuerpo. Para aplicaciones terapéuticas, se contempla la
internalización in vivo. El número de moléculas de
anticuerpo internalizadas será suficiente o adecuado para matar una
célula que exprese PSCA, especialmente una célula cancerígena que
exprese PSCA. Dependiendo de la potencia del anticuerpo o del
conjugado de anticuerpo, en algunos casos, la absorción de una única
molécula de anticuerpo dentro de la célula será suficiente para
matar la célula diana a la que se une el anticuerpo. Por ejemplo,
ciertas toxinas poseen una gran capacidad para matar, de forma que
la internalización de una molécula de la toxina conjugada con el
anticuerpo es suficiente para matar la célula tumoral.
La internalización de un anticuerpo
anti-PSCA al unirse a PSCA de una célula de mamífero
se puede determinar mediante diversos ensayos incluyendo los
descritos más adelante en los ejemplos experimentales. Por ejemplo,
para comprobar la internalización in vivo, el anticuerpo de
prueba se marca y se introduce en un animal conocido por presentar
PSCA expresado en la superficie de ciertas células. El anticuerpo se
puede radiomarcar o marcar con fluorescencia o con partículas de
oro, por ejemplo. Los animales adecuados para este ensayo incluyen
mamíferos como un ratón nude NCR que contenga un transplante o
xenoinjerto de tumor que exprese PSCA humano, o un ratón en el que
se hayan introducido células transfectadas con PSCA humano, o un
ratón transgénico que exprese el transgen de PSCA humano. Controles
adecuados incluyen animales que no recibieron el anticuerpo de
prueba o que recibieron un anticuerpo no relacionado, y animales que
recibieron un anticuerpo para otro antígeno de las células de
interés, sabiéndose que dicho anticuerpo se internaliza al unirse al
antígeno (por ejemplo, HERCEPTIN que se une a Her2 expresado en la
línea de células tumorales de mama humana, MCF-7 en
el Ejemplo 3). El anticuerpo se puede administrar al animal, por
ejemplo, mediante inyección intravenosa. A intervalos de tiempo
adecuados, se pueden preparar secciones de tejido del animal
utilizando procedimientos conocidos o los procedimientos descritos
más adelante en los ejemplos experimentales, y se pueden analizar
mediante microscopía óptica o microscopía electrónica tanto la
internalización como la localización del anticuerpo internalizado
en la célula. Para la internalización in vitro, las células
pueden incubarse en placas de cultivos de tejidos en presencia o
ausencia de los anticuerpos relevantes añadidos al medio de cultivo
y procesados mediante análisis microscópico en los momentos
deseados. La presencia en las células de un anticuerpo internalizado
y marcado se puede visualizar directamente mediante microscopía o
mediante autorradiografía si se utiliza un anticuerpo radiomarcado.
Alternativamente, en un ensayo bioquímico cuantitativo, una
población de células que comprenda células que expresen PSCA se
pone en contacto in vitro o in vivo con un anticuerpo
de prueba radiomarcado y las células (si se ponen en contacto in
vivo, entonces las células se aíslan después de un tiempo
adecuado) se tratan con una proteasa o se someten a un lavado ácido
para retirar el anticuerpo no internalizado de la superficie
celular. Las células se pulverizan y los recuentos por minuto (cpm)
de proteasa resistente y radioactiva asociados a cada lote de
células se miden pasando el homogeneizado por un contador de
centelleo. En base a la actividad específica conocida del anticuerpo
radiomarcado, es posible deducir el número de moléculas de
anticuerpo internalizadas por célula a partir de los recuentos de
centelleo de las células pulverizadas. Ventajosamente, las células
"se ponen en contacto" con el anticuerpo in vitro en
forma de disolución añadiendo las células a los medios de cultivo
celular en una placa de cultivo o en un matraz y mezclando el
pocillo de anticuerpo con los medios para garantizar una exposición
uniforme de las células al anticuerpo. En lugar de añadirse a los
medios de cultivo, las células se pueden poner en contacto con el
anticuerpo de prueba en una disolución isotónica como PBS en un tubo
de ensayo durante el periodo de tiempo deseado. In vivo, las
células se ponen en contacto con el anticuerpo mediante cualquier
procedimiento adecuado de administración del anticuerpo de prueba,
tales como los procedimientos de administración descritos más
adelante cuando se administra a un paciente.
Cuanto mayor sea la tasa de internalización del
anticuerpo al unirse a la célula que expresa PSCA in vivo,
más rápidamente se podrá alcanzar la muerte o el efecto inhibidor
del crecimiento deseados sobre la célula diana que expresa PSCA,
por ejemplo, mediante un inmunoconjugado citotóxico. Ventajosamente,
la cinética de la internalización de los anticuerpos
anti-PSCA es tal que favorece la muerte rápida de la
célula diana que expresa PSCA. Por lo tanto, resulta deseable que
el anticuerpo anti-PSCA exhiba una elevada tasa de
internalización, ventajosamente en las 24 horas posteriores a la
administración del anticuerpo in vivo, más ventajosamente en
aproximadamente 12 horas, incluso más ventajosamente en
aproximadamente 30 minutos a 1 hora, y en la realización más
ventajosa posible en aproximadamente 30 minutos. La presente
invención provee anticuerpos que se internalizan en tan sólo
aproximadamente 15 minutos desde el momento de la introducción del
anticuerpo anti-PSCA in vivo. El anticuerpo
se internalizará ventajosamente en la célula en unas pocas horas
tras la unión a PSCA sobre la superficie celular, ventajosamente en
1 hora, incluso más ventajosamente en 15-30
minutos.
Para determinar si un anticuerpo de prueba puede
competir por la unión al mismo epítopo que el epítopo al que se
unen los anticuerpos anti-PSCA de la presente
invención, incluyendo los anticuerpos producidos por los hibridomas
depositados con el ATCC, se puede llevar a cabo un ensayo
transversal, por ejemplo, un ensayo competitivo por ELISA. En un
ejemplo de ensayo competitivo por ELISA, el PSCA recubierto de los
pocillos de una placa microtiter se preincuba con o sin el
anticuerpo competidor candidato y, a continuación, se añade el
anticuerpo anti-PSCA marcado con biotina de la
invención. La cantidad de anticuerpo anti-PSCA
marcado unido al antígeno PSCA en los pocillos se mide utilizando
un conjugado avidina-peroxidasa y un sustrato
adecuado. El anticuerpo se puede marcar con un marcador radioactivo
o fluorescente o con algún otro marcador detectable y medible. La
cantidad de anticuerpo anti-PSCA marcado que se une
al antígeno estará indirectamente correlacionada con la capacidad
del anticuerpo competidor candidato (anticuerpo de prueba) para
competir por la unión al mismo epítopo, es decir, cuanto mayor sea
la afinidad del anticuerpo de prueba por el mismo epítopo, menor
será la cantidad de anticuerpo marcado que se unirá a los pocillos
recubiertos de antígeno. Un anticuerpo competidor candidato se
considera un anticuerpo que se une sustancialmente al mismo epítopo
o que compite por la unión al mismo epítopo que un anticuerpo
anti-PSCA de la invención si el anticuerpo candidato
puede bloquear la unión del anticuerpo dirigido contra PSCA al
menos en un 20%, ventajosamente al menos en un
20-50%, incluso más ventajosamente al menos en un
50% en comparación con el control realizado en paralelo en ausencia
del anticuerpo competidor candidato (aunque puede estar en presencia
de un anticuerpo no competidor conocido). Se entenderá que se
pueden realizar variaciones de este ensayo para alcanzar el mismo
valor cuantitativo.
Un anticuerpo que posea una "característica
biológica" de un anticuerpo designado, como cualquiera de los
anticuerpos monoclonales 10E3, 6F8, 8D11 y 5F2, es un anticuerpo que
posee una o más de las características biológicas de dicho
anticuerpo que lo distinguen de otros anticuerpos que se unen al
mismo antígeno, PSCA. Por ejemplo, un anticuerpo con una
característica biológica de 6F8 se unirá al mismo epítopo al que se
une 6F8 (por ejemplo, el que compite por la unión o bloquea la
unión del anticuerpo monoclonal 6F8 a PSCA), podrá dirigirse a una
célula tumoral que exprese PSCA in vivo y se internalizará al
unirse a PSCA en una célula de mamífero in vivo. Asimismo,
un anticuerpo con la característica biológica del anticuerpo 5F2 o
6B8 tendrá las mismas propiedades de unión a epítopo, focalización,
internalización, inhibición del crecimiento tumoral y propiedades
citotóxicas que el anticuerpo.
El término anticuerpo "antagonista" se
utiliza en el sentido más amplio e incluye un anticuerpo que
bloquee, inhiba o neutralice parcial o totalmente una actividad
biológica de una proteína PSCA nativa aquí revelada. Los
procedimientos para identificar antagonistas de un polipéptido PSCA
pueden comprender la puesta en contacto de un polipéptido PSCA o de
una célula que exprese PSCA en la superficie celular, con un
anticuerpo antagonista candidato y la medición de un cambio
detectable en una o más actividades biológicas normalmente
asociadas al polipéptido PSCA.
Un "anticuerpo que inhibe el crecimiento de
células tumorales que expresan PSCA" o un anticuerpo "inhibidor
del crecimiento" es aquel que se une a células cancerígenas que
expresan o sobreexpresan PSCA y que da como resultado una
inhibición medible del crecimiento de dichas células cancerígenas
que expresan o sobreexpresan PSCA. Los anticuerpos
anti-PSCA inhibidores del crecimiento ventajosos
inhiben el crecimiento de células tumorales que expresan PSCA (por
ejemplo, células de cáncer de próstata) en más de un 20%,
ventajosamente de aproximadamente el 20% a aproximadamente el 50%,
e incluso más ventajosamente en más del 50% (por ejemplo, desde
aproximadamente el 50% hasta aproximadamente el 100%) en
comparación con el control apropiado, correspondiendo generalmente
el control a células tumorales no tratadas con el anticuerpo que
está siendo probado. La inhibición del crecimiento se puede medir a
una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0,1 a 30
\mug/ml o aproximadamente 0,5 nM a 200 nM en cultivo celular, en
donde la inhibición del crecimiento se determina
1-10 días después de que las células tumorales sean
expuestas al anticuerpo. La inhibición del crecimiento de las
células tumorales in vivo se puede determinar de diversas
maneras, tal como se describe más adelante en la sección de Ejemplos
Experimentales. El anticuerpo inhibe el crecimiento in vivo
si la administración del anticuerpo anti-PSCA a
aproximadamente 1 \mug/kg a 100 mg/kg de peso corporal reduce el
tamaño del tumor o la proliferación de células tumorales tras
aproximadamente 5 días a 3 meses a partir de la primera
administración del anticuerpo, ventajosamente tras aproximadamente
5 a 30 días.
Un anticuerpo que "induce la apoptosis" es
aquel que induce la muerte celular programada tal como se determina
mediante la unión de anexina V, fragmentación de ADN, contracción
celular, dilatación del retículo endoplásmico, fragmentación
celular y/o formación de vesículas de membrana (llamadas cuerpos
apoptóticos). La célula es normalmente una célula que sobreexpresa
PSCA. Ventajosamente, la célula es una célula tumoral, por ejemplo,
una célula de próstata, mama, ovario, estómago, endometrio, pulmón,
riñón, colon, vejiga. Para evaluar los eventos celulares asociados
a la apoptosis se dispone de diversos procedimientos. Por ejemplo,
la traslocación de fosfatidilserina (PS) se puede medir mediante la
unión a anexina; la fragmentación de ADN se puede evaluar mediante
el análisis de desarrollo escalonado (laddering) de ADN; y la
condensación nuclear/de cromatina junto con la fragmentación de ADN
se pueden evaluar mediante cualquier aumento del número de células
hipodiploides. Ventajosamente, el anticuerpo que induce la apoptosis
es un anticuerpo que genera un valor aproximadamente 2 a 50 veces,
ventajosamente de aproximadamente 5 a 50 veces y más ventajosamente
de aproximadamente 10 a 50 veces, superior en la inducción de la
unión a anexina con respecto a una célula no tratada en un ensayo
de unión a anexina.
"Funciones efectoras" del anticuerpo se
refiere a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región
Fc (una región Fc de secuencia nativa o una región Fc de una
variante de secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo, y varían en
función del isotipo del anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras
de anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente de
complemento; unión al receptor Fc; citotoxicidad mediada por
células dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación a
la baja de receptores de superficie celular (por ejemplo, del
receptor de células B); y activación de células B.
"Citotoxicidad mediada por células dependiente
de anticuerpos" o "ADCC" se refiere a una forma de
citotoxicidad en la que la Ig secretada unida a receptores Fc
(FcRs) que está presente en ciertas células citotóxicas (por
ejemplo, células natural killer (NK), neutrófilos y macrófagos)
permite que estas células efectoras citotóxicas se unan de forma
específica a una célula diana que contiene el antígeno para
posteriormente matar la célula diana con citotoxinas. Los
anticuerpos "arman" las células citotóxicas y son absolutamente
necesarios para dicha muerte. Las células primarias para mediación
ADCC, es decir, las células NK, expresan únicamente Fc\gammaRIII,
mientras que los monocitos expresan Fc\gammaRI, Fc\gammaRII y
Fc\gammaRIII. La expresión de FcR en las células hematopoyéticas
se resume en la Tabla 3, en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu.
Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Para evaluar la
actividad ADCC de una molécula de interés, se puede realizar un
ensayo ADCC in vitro, tal como se describe en la Patente
estadounidense nº 5.500.362 ó 5.821.337. Las células efectoras
útiles para dicho ensayo incluyen células mononucleares de sangre
periférica (PBMC) y células natural killer (NK). Alternativamente,
o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés se
puede evaluar in vivo, por ejemplo, en un modelo animal como
el revelado en Clynes et al. PNAS (USA)
95:652-656 (1998).
"Receptor Fc" o "FcR" describe un
receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR
ventajoso es un FcR humano de secuencia nativa. Además, un FcR
ventajoso es aquel que se une a un anticuerpo IgG (un receptor
gamma) y que incluye receptores de las subclases Fc\gammaRI,
Fc\gammaRII y Fc\gammaRIII, incluyendo variantes alélicas y
formas alternativamente enlazadas de estos receptores. Los
receptores Fc\gammaRII incluyen Fc\gammaRIIA (un "receptor
activante") y Fc\gammaRIIB (un "receptor inhibidor"), que
presentan secuencias de aminoácidos similares que difieren
fundamentalmente en los dominios citoplasmáticos de las mismas. El
receptor activante Fc\gammaRIIA contiene un motivo de activación
de inmunoreceptor basado en tirosina (ITAM) en su dominio
citoplasmático. El receptor inhibidor Fc\varepsilonRIIB contiene
un motivo de inhibición de inmunoreceptor basado en tirosina (ITIM)
en su dominio citoplasmático (ver la revisión de M. in Daëron, Annu.
Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Los FcRs se
detallan en la revisión de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:
457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods
4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab.
Clin. Med. 126:330-41 (1995). El término "FcR"
abarca aquí otros FcRs, incluyendo aquellos que se identificarán en
el futuro. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn,
que es el responsable de transferir las IgGs maternas al feto (Guyer
et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J.
Immunol. 24:249 (1994)).
Las "células efectoras humanas" son
leucocitos que expresan uno o más FcRs y que realizan funciones
efectoras. Ventajosamente, las células expresan al menos
Fc\gammaRIII y realizan una función efectora de la ADCC. Ejemplos
de leucocitos humanos que median en la ADCC incluyen células
mononucleares de sangre periférica (PMBC), células natural killer
(NK), monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos, siendo más
ventajosas las células PBMC y las NK. Las células efectoras se
pueden aislar de una fuente natural, por ejemplo, de la sangre.
"Citotoxicidad dependiente de complemento"
o "CDC" se refiere a la lisis de una célula diana en presencia
de un complemento. La activación de la ruta clásica del complemento
se inicia mediante la unión del primer componente del sistema del
complemento (C1q) a los anticuerpos (de la subclase adecuada) que se
unen a su antígeno análogo. Para evaluar la activación del
complemento, se puede llevar a cabo un ensayo de CDC, por ejemplo,
según se describe en Gazzano-Santoro et al.,
J. Immunol. Methods 202:163 (1996).
Los términos "cáncer" y "canceroso" se
refieren a o describen la condición fisiológica de los mamíferos
que se caracteriza generalmente por un crecimiento celular no
controlado. Ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a,
carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia o neoplasias
linfoides. Ejemplos más específicos de dichos cánceres incluyen el
cáncer de células escamosas (por ejemplo, el cáncer de células
escamosas epiteliales), el cáncer de pulmón incluyendo el cáncer de
pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas,
adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer
del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago
incluyendo el cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático,
glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado,
cáncer de vejiga, cáncer del tracto urinario, hepatoma, cáncer de
mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorectal, carcinoma
endometrial o uterino, carcinoma de la glándula salivar, cáncer de
riñón o renal, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer del
tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma de pene,
melanoma, mieloma múltiple y linfoma de células B, cáncer de
cerebro, así como el cáncer de cabeza y de cuello, y las metástasis
asociadas.
Una "célula que expresa PSCA" es una célula
que expresa PSCA endógeno o transfectado en la superficie celular.
Un "cáncer que expresa PSCA" es un cáncer que comprende células
que tienen la proteína del PSCA presente en la superficie celular.
Un "cáncer que expresa PSCA" produce niveles suficientes de
PSCA en la superficie de dichas células como para que un anticuerpo
anti-PSCA pueda unirse a ellas y tener un efecto
terapéutico respecto al cáncer. Un cáncer que "sobreexpresa"
PSCA es aquel que presenta niveles significativamente más altos de
PSCA en la superficie celular de éstas, en comparación con células
no cancerosas del mismo tipo de tejido. Dicha sobreexpresión puede
deberse a amplificación génica o al incremento en la transcripción o
la traducción. La sobreexpresión de PSCA se puede determinar en un
ensayo de diagnóstico o de pronóstico mediante la evaluación de los
incrementados niveles de proteína de PSCA presentes en la superficie
de una célula (por ejemplo, a través de un ensayo
inmunohistoquímico; análisis FACS). Alternativamente, o
adicionalmente, se pueden medir los niveles de ácido nucléico
codificante de PSCA o niveles de ARNm en la célula, por ejemplo,
vía hibridación fluorescente in situ, (FISH, ver WO 98/45479
publicada en octubre de 1998), Southern blotting, Northern
blotting, o técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR),
como PCR cuantitativa en tiempo real (RT-PCR).
También se puede estudiar la sobreexpresión de PSCA midiendo la
cantidad de antígeno desprendido en un fluido biológico como el
suero, por ejemplo, utilizando ensayos basados en anticuerpos (ver,
por ejemplo, la Patente estadounidense nº 4.933.294 expedida el 12
de junio de 1990; WO91/05264 publicada el 18 de abril de 1991;
Patente estadounidense nº 5.401.638 expedida el 28 de marzo de 1995;
y Sias et al. J. Immunol. Methods 132: 73-80
(1990)). Además de los ensayos anteriormente mencionados, hay
disponibles varios ensayos in vivo para el practicante
experto en la técnica. Por ejemplo, se pueden exponer células del
cuerpo de un paciente a un anticuerpo que esté opcionalmente
marcado con un marcador detectable, por ejemplo, un isótopo
radioactivo, y se puede evaluar la unión del anticuerpo a las
células del paciente, por ejemplo, mediante escaneo externo por
radioactividad o mediante análisis de una biopsia tomada a un
paciente antes de ser expuesto al anticuerpo. Un cáncer que expresa
PSCA incluye el cáncer de próstata, de vejiga, de pulmón, de útero y
de mama.
Un "mamífero", con fines de tratamiento de
un cáncer o de mitigación de los síntomas del cáncer, se refiere a
cualquier mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de
granja y animales de zoológico, animales de competición, o
mascotas, como perros, gatos, ganado vacuno, caballos, oveja,
cerdos, cabras, conejos, etc. Ventajosamente, el mamífero es
humano.
"Tratar" o "tratamiento" o
"mitigación" se refieren tanto a los tratamientos terapéuticos
como a las medidas profilácticas o preventivas, en donde el
objetivo es prevenir o ralentizar (disminuir) la condición o
trastorno patológico fijados como objetivo. Aquellos que necesitan
tratamiento incluyen a aquellos que ya presentan el trastorno, así
como a aquellos que sean propensos a presentar el trastorno o
aquellos en los que el trastorno se debe prevenir. Un sujeto o
mamífero es "tratado" con éxito contra un cáncer que expresa
PSCA si, después de recibir una cantidad terapéutica de un
anticuerpo anti-PSCA de acuerdo con los
procedimientos de la presente invención, el paciente muestra una
reducción observable y/o medible en presencia o ausencia de uno o
más de los siguientes: reducción de los niveles de PSCA, reducción
en el número de células cancerígenas o ausencia de células
cancerígenas; reducción del tamaño del tumor; inhibición (es decir,
ralentizar en cierto grado y ventajosamente detener) de la
infiltración de células cancerígenas en los órganos periféricos,
incluyendo la propagación del cáncer al tejido blando y los huesos;
inhibición (es decir, ralentización en cierto grado y
ventajosamente detención) de la metástasis del tumor, inhibición en
cierto grado del crecimiento del tumor; y/o alivio en cierto grado
de uno o más síntomas asociados al cáncer específico; reducida
morbosidad y mortalidad, y mejora en las cuestiones relacionadas
con la calidad de vida. En la medida en que el anticuerpo
anti-PSCA pueda prevenir el crecimiento y/o matar
las células cancerígenas existentes, puede ser citostático y/o
citotóxico. El paciente puede sentir también la reducción de estos
signos o síntomas.
Los parámetros anteriormente mencionados
empleados para evaluar el tratamiento eficaz y la mejora de la
enfermedad se pueden medir de manera sencilla mediante
procedimientos rutinarios que resultan familiares para un médico.
En cuanto a la terapia del cáncer, la eficacia se puede medir, por
ejemplo, mediante la evaluación del tiempo transcurrido hasta la
progresión de la enfermedad (TTP) y/o la determinación de la tasa de
respuesta (RR). En el caso del cáncer de próstata, el progreso de
la terapia se puede evaluar mediante procedimientos rutinarios, por
lo general midiendo los niveles de PSA (antígeno específico de la
próstata) en suero; cuanto mayor es el nivel de PSA en la sangre,
más extendido está el cáncer. Se dispone de ensayos comerciales para
detectar PSA, por ejemplo, kits de ensayo para PSA Hybitech
Tandem-E y Tandem-R, el ensayo
policlonal Yang ProsCheck (Yang Labs, Bellevue (WA), EE.UU), Abbott
Imx (Abbott Labs, Abbott Park (IL), EE.UU), etc. La metástasis se
puede determinar mediante pruebas de estado funcional y mediante el
escaneo de los huesos y pruebas para la determinación del nivel de
calcio y de otras enzimas para determinar la propagación a los
huesos. También se pueden realizar escáneres de TC para buscar
propagación a la pelvis y a los nódulos linfáticos en el área. Las
radiografías de tórax y la medición de los niveles de enzima
hepática mediante procedimientos conocidos se utilizan para buscar
metástasis en los pulmones y en el hígado, respectivamente. Otros
procedimientos rutinarios para monitorizar la enfermedad incluyen
la ultrasonografía transrectal (TRUS) y la biopsia por punción
transrectal (TRNB).
En el caso del cáncer de vejiga, que es un
cáncer más localizado, los procedimientos para determinar el
progreso de la enfermedad incluyen la evaluación citológica urinaria
mediante citoscopia, la monitorización para detectar la presencia
de sangre en la orina, la visualización del tracto urotelial
mediante sonografía o en pielograma intravenoso, la tomografía
computerizada (TC) y la imagen por resonancia magnética (IRM). La
presencia de metástasis distante se puede evaluar mediante TC del
abdomen, radiografía del tórax o imagen con radionuclidos del
esqueleto.
El término "cantidad terapéuticamente
efectiva" se refiere a una cantidad de un anticuerpo o de un
fármaco que resulte efectiva para "tratar" una enfermedad o un
trastorno en un sujeto o mamífero. En el caso del cáncer, la
cantidad terapéuticamente efectiva de fármaco puede reducir el
número de células cancerígenas; reducir el tamaño del tumor;
inhibir (es decir, ralentizar en cierto grado y ventajosamente
detener) la infiltración de células cancerígenas en los órganos
periféricos; inhibir (es decir, ralentizar en cierto grado y
ventajosamente detener) la metástasis del tumor; inhibir en cierto
grado el crecimiento del tumor; y/o aliviar en cierto grado uno o
más síntomas asociados al cáncer. Ver la definición anterior de
"tratar". En la medida en que el fármaco pueda prevenir el
crecimiento y/o matar las células cancerígenas existentes, puede ser
citostático y/o citotóxico.
Administración "crónica" se refiere a la
administración del(los) agente(s) de un modo continuo
en vez de en hacerlo de un modo agudo, de forma que se mantenga el
efecto (actividad) terapéutico inicial durante un periodo de tiempo
prolongado. Administración "intermitente" es el tratamiento que
no se lleva a cabo se forma consecutiva sin interrupción, sino que
es de naturaleza cíclica.
Administración "combinada con" uno o más
agentes terapéuticos adicionales incluye la administración
simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.
"Transportadores", tal como se utiliza en
la presente invención, incluye transportadores farmacéuticamente
aceptables, excipientes, o estabilizadores que no son tóxicos para
la célula o el mamífero que se expone a las dosificaciones y
concentraciones empleadas. A menudo, el transportador
fisiológicamente aceptable es una solución acuosa a pH tamponado.
Ejemplos de transportadores fisiológicamente aceptables incluyen
tampones como el fosfato, el citrato y otros ácidos orgánicos;
antioxidantes, incluyendo el ácido ascórbico; polipéptidos de bajo
peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas,
como la albúmina sérica, la gelatina o las inmunoglobulinas;
polímeros hidrofílicos como la polivinilpirrolidona; aminoácidos
como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina;
monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa,
manosa o dextrinas; agentes quelantes como el EDTA; alcoholes de
azúcares como el manitol y el sorbitol; contraiones que forman
sales como el sodio; y/o surfactantes no aniónicos como
TWEEN^{TM}, el polietilenglicol (PEG) y PLURONICS^{TM}.
El término "agente citotóxico", tal como se
utiliza en la presente invención, se refiere a una sustancia que
inhibe o previene la función de las células y/o causa la destrucción
de las células. El término pretende incluir isótopos radioactivos
(por ejemplo, At^{211}, I^{131}, I^{125}, Y^{90},
Re^{186}, Re^{188}, Sm^{153}, Bi^{212}, P^{32} e isótopos
radiactivos de Lu), agentes quimioterapéuticos, por ejemplo,
metotrexato, adriamicina, alcaloides de vinca (vincristina,
vinblastina, etopósido), doxorubicina, melfalán, mitomicina C,
clorambucil, daunorubicina u otros agentes intercalantes, enzimas y
fragmentos de ellas como enzimas nucleolíticas, antibióticos, y
toxinas como toxinas de moléculas pequeñas o toxinas enzimáticamente
activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo
fragmentos y/o variantes de las mismas, y los diversos agentes
antitumorales o anticancerígenos revelados más adelante. Más
adelante se describen otros agentes citotóxicos. Un agente
tumoricida causa la destrucción de las células tumorales.
Un "agente inhibidor del crecimiento",
cuando se utiliza aquí, se refiere a un compuesto o composición que
inhibe el crecimiento de una célula, especialmente una célula
cancerígena que expresa PSCA, tanto in vitro como in
vivo. Así, el agente inhibidor del crecimiento puede ser aquel
que reduce de forma significativa el porcentaje de células que
expresan PSCA en la fase S. Ejemplos de agentes inhibidores del
crecimiento incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo
celular (en un lugar distinto a la fase S), tales como los agentes
que inducen la detención en G1 y la detención en la fase M.
Bloqueantes clásicos de la fase M incluyen las vincas (la
vincristina y la vinblastina), los taxanos y los inhibidores de la
topoisomerasa II como la doxorubicina, la epirubicina, la
daunorubicina, el etopósido y la bleomicina. Los agentes que
detienen el ciclo celular en G1 también llegan a afectar a la
detención en la fase S, por ejemplo, agentes alquilantes de ADN como
el tamoxifeno, la prednisona, la dacarbazina, la meclorotamina, el
cisplatino, el metotrexato, el 5-fluorouracilo y el
ara-C. Información adicional puede encontrarse en
The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn e Israel, eds., capítulo
1, titulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic
drugs" por Murakami et al. (WB Saunders: Filadelfia,
EE.UU., 1995), especialmente en la pág. 13. Los taxanos (paclitaxel
y docetaxel) son fármacos anticancerígenos derivados ambos del
tejo. El docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer),
derivado del tejo europeo, es un análogo semisintético del
paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). El
paclitaxel y el docetaxel estimulan el ensamblaje de microtúbulos
de dímeros de tubulina y estabilizan los microtúbulos previniendo
la despolimerización, lo que provoca la inhibición de la mitosis en
las células.
"Marcador", tal como se utiliza aquí, se
refiere a un compuesto o a una composición detectable que se
conjuga directa o indirectamente con el anticuerpo, de forma tal que
genere un anticuerpo "marcado". El marcador puede ser
detectable por sí mismo (por ejemplo, marcadores radioisótopos o
marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático,
puede catalizar la alteración química de un compuesto o de una
composición de sustrato que sea detectable.
El término "epítopo etiquetado" aquí
utilizado se refiere a un polipéptido quimérico que comprende un
polipéptido de anticuerpo anti-PSCA fusionado a un
"polipéptido etiqueta". El polipéptido etiqueta posee
suficientes residuos para proporcionar un epítopo contra el que se
pueda crear un anticuerpo, aunque sigue siendo suficientemente
corto como para no interferir en la actividad del polipéptido de Ig
al que está fusionado. Ventajosamente, el polipéptido etiqueta
también resulta verdaderamente único como para que el anticuerpo no
presente una reactividad cruzada sustancial con otros epítopos. Los
polipéptidos etiqueta adecuados poseen generalmente al menos seis
residuos de aminoácido y normalmente entre aproximadamente 8 y 50
residuos de aminoácido (ventajosamente, entre aproximadamente 10 y
20 residuos de aminoácido).
Una "molécula pequeña" se define aquí como
una molécula que tiene un peso molecular inferior a aproximadamente
500 daltons.
El término "prospecto" se utiliza para
referirse a las instrucciones incluidas por regla general en los
paquetes comerciales de los productos terapéuticos, que contiene
información relativa a las indicaciones, utilización, dosificación,
administración, contraindicaciones y/o advertencias que conciernen
al uso de dichos productos terapéuticos.
Un "ácido nucléico aislado" es un ácido
nucléico, por ejemplo, un ARN, un ADN o un polímero mixto, que está
sustancialmente separado de otras secuencias de ADN genómico así
como de proteínas o de complejos como los ribosomas y las
polimerasas, que acompañan naturalmente a la secuencia nativa. El
término abarca una secuencia de ácido nucléico que haya sido
extraída de su entorno natural, e incluye aislados de ADN
recombinante o clonado y análogos químicamente sintetizados o
análogos biológicamente sintetizados por sistemas heterólogos. Una
molécula sustancialmente pura incluye formas aisladas de la
molécula.
"Vector" incluye vectores transbordadores y
vectores de expresión. Normalmente, la construcción plásmida
también incluirá un origen de replicación (por ejemplo, el origen de
replicación ColE1) y un marcador seleccionable (por ejemplo,
resistencia a ampicilina o tetraciclina), para la replicación y la
selección, respectivamente, de los plásmidos en la bacteria. Un
"vector de expresión" se refiere a un vector que contiene las
secuencias control o los elementos reguladores necesarios para la
expresión de los anticuerpos, incluyendo el fragmento de anticuerpo
de la invención, en células bacterianas o eucariotas. Los vectores
disponibles se revelan más adelante.
La célula que produce un anticuerpo
anti-PSCA de la invención incluirá la célula de
hibridoma parental, por ejemplo, los hibridomas que se depositan
con el ATCC, así como células huésped bacterianas y eucariotas en
las que se ha introducido el ácido nucléico que codifica los
anticuerpos. Las células huésped disponibles se revelan más
adelante.
La invención provee anticuerpos
anti-PSCA. En una realización ventajosa, los
anticuerpos anti-PSCA se internalizan tras la unión
a PSCA sobre la superficie celular de una célula de mamífero. En
otra realización ventajosa, los anticuerpos
anti-PSCA destruyen o llevan a la destrucción de
células tumorales que presenten PSCA.
La ruta y la cinética de la internalización de
moléculas ancladas a GPI no han sido tan bien estudiadas como la
ruta de internalización mediada por receptor recubierto con
clatrina. No resultaba aparente que el PSCA fuera competente para
internalización. Además, la capacidad de un anticuerpo para
internalizarse depende de diversos factores, incluyendo la
afinidad, la avidez y el isotipo del anticuerpo, así como del
epítopo al que se une. Por la presente hemos demostrado que el PSCA
de superficie celular ligado a GPI es competente para
internalización tras unirse a los anticuerpos
anti-PSCA de la invención. Adicionalmente, se ha
demostrado que los anticuerpos anti-PSCA de la
presente invención pueden dirigirse específicamente contra células
tumorales que expresen PSCA in vivo y pueden inhibir o matar
dichas células. Estas propiedades de focalización in vivo al
tumor, internalización e inhibición del crecimiento de los
anticuerpos anti-PSCA convierten a estos
anticuerpos en muy adecuados para usos terapéuticos, por ejemplo,
para el tratamiento de diversos cánceres incluyendo el cáncer de
próstata, del tracto urinario y de pulmón. La internalización del
anticuerpo anti-PSCA es ventajosa, por ejemplo, si
el anticuerpo o conjugado del anticuerpo presenta un sitio
intracelular de actuación y si el agente citotóxico conjugado con
el anticuerpo no atraviesa realmente el plasma (por ejemplo, la
toxina caliqueamicina). La internalización no es necesaria si los
anticuerpos o el agente conjugado con los anticuerpos no presentan
sitios intracelulares de actuación, por ejemplo, si el anticuerpo
puede matar la célula tumoral mediante un mecanismo ADCC o mediante
algún otro mecanismo.
Los anticuerpos anti-PSCA de la
invención también presentan diversas aplicaciones no terapéuticas.
En vista de que el uso de PSA como una herramienta para el cribado o
diagnóstico del cáncer de próstata resulta controvertido, los
anticuerpos anti-PSCA de la presente invención
pueden resultar útiles para el diagnóstico y la escenificación de
cánceres que expresen PSCA (por ejemplo, en radioimagen). Los
anticuerpos también resultan útiles para la purificación o
inmunoprecipitación del PSCA presente en las células, para la
detección y cuantificación de PSCA in vitro, por ejemplo, en
un ELISA o un Western blot, para matar y eliminar células que
expresen PSCA en una población de células mixtas como un paso en la
purificación de otras células.
Los anticuerpos anti-PSCA
internalizantes de la invención se pueden presentar en diferentes
formas, aquí englobadas por la definición de "anticuerpo".
Así, los anticuerpos incluyen un anticuerpo intacto o de longitud
completa, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de secuencias
nativas o variantes de aminoácidos, anticuerpos humanizados,
quiméricos o de fusión, inmunoconjugados, y fragmentos funcionales
de los mismos. En los anticuerpos de fusión, una secuencia de
anticuerpo está fusionada a una secuencia de polipéptido heteróloga.
La región Fc de los anticuerpos se puede modificar para proveer las
funciones efectoras deseadas. Como se discutirá más detalladamente
en las secciones siguientes, con las regiones Fc apropiadas, el
anticuerpo desnudo unido a la superficie celular puede inducir
citotoxicidad, por ejemplo, mediante citotoxicidad celular
dependiente de anticuerpos (ADCC) o reclutando complementos
mediante citotoxicidad dependiente de complemento, o mediante algún
otro mecanismo. Alternativamente, cuando resulte deseable eliminar
o reducir la función efectora, así como minimizar los efectos
secundarios o las complicaciones terapéuticas, se podrán utilizar
otras regiones Fc.
En una realización, el anticuerpo compite por
unirse, o se une sustancialmente, al mismo epítopo que los
anticuerpos de la invención. También se contemplan los anticuerpos
que posean las características biológicas de los anticuerpos
anti-PSCA presentes en la invención, por ejemplo, un
anticuerpo anti-PSCA que posea las características
biológicas de un anticuerpo monoclonal producido por los hibridomas
con números de acceso a ATCC PTA-717,
PTA-718, PTA-719,
PTA-720, PTA-880,
PTA-2265 o PTA-2264, incluyendo
específicamente la focalización in vivo del tumor, la
internalización y cualquier característica de inhibición de la
proliferación celular o característica citotóxica.
Se proveen específicamente anticuerpos
anti-PSCA que se unan a un epítopo presente en los
aminoácidos 21-40, ó 41-60, ó
61-80, ó 81-100 de PSCA humano,
mostrados en el SEQ ID Nº 1.
Los procedimientos de producción de los
anticuerpos anteriores se describen de forma detallada más
adelante.
Los anticuerpos anti-PSCA
presentes en la invención resultan útiles para tratar un cáncer que
exprese PSCA o para aliviar uno o más síntomas del cáncer en un
mamífero. Dicho cáncer incluye el cáncer de próstata, el cáncer del
tracto urinario, el cáncer de pulmón, el cáncer de mama, el cáncer
de colon y el cáncer de ovario, más específicamente, el
adenocarcinoma de próstata, los carcinomas de células renales, los
adenocarcinomas colorectales, los adenocarcinomas de pulmón, los
carcinomas de células escamosas de pulmón y el mesotelioma pleural.
Los cánceres abarcan los cánceres metastáticos de cualquiera de los
cánceres precedentes, por ejemplo, las metástasis de cáncer de
próstata. El anticuerpo es capaz de unirse a al menos una porción de
las células cancerosas que expresen PSCA en el mamífero y,
ventajosamente, es un anticuerpo que no induce o que minimiza la
respuesta HAMA. En una realización ventajosa, el anticuerpo es
efectivo para destruir o matar células tumorales que expresen PSCA
o para inhibir el crecimiento de dichas células tumorales, in
vitro o in vivo, tras la unión al PSCA de la célula.
Dicho anticuerpo incluye un anticuerpo anti-PSCA
desnudo (no conjugado con ningún agente). Los anticuerpos
anti-PSCA desnudos que poseen propiedades
inhibidoras del crecimiento in vivo del tumor incluyen los
anticuerpos descritos en los Ejemplos experimentales siguientes. Los
anticuerpos desnudos que poseen propiedades citotóxicas o
inhibidoras del crecimiento celular se pueden anclar adicionalmente
a un agente citotóxico para que resulten aún más potentes en la
destrucción de células tumorales. A un anticuerpo
anti-PSCA se le pueden conferir propiedades
citotóxicas mediante, por ejemplo, conjugación del anticuerpo con
un agente citotóxico para formar un inmunoconjugado como el que se
describe más adelante. El agente citotóxico o un agente inhibidor
del crecimiento es ventajosamente una molécula pequeña. Son
ventajosas las toxinas como la caliqueamicina o como un
maitansinoide y los análogos o derivados de ellas.
La invención provee una composición que
comprenda un anticuerpo anti-PSCA de la invención, y
un transportador. Con el objetivo de tratar el cáncer, las
composiciones se pueden administrar al paciente que precise dicho
tratamiento, en donde la composición puede comprender uno o más
anticuerpos anti-PSCA presentes en forma de
inmunoconjugado o de anticuerpo desnudo. En una realización
adicional de la invención, las composiciones pueden comprender
estos anticuerpos en combinación con otros agentes terapéuticos como
los agentes citotóxicos o inhibidores del crecimiento, incluyendo
los agentes quimioterapéuticos. La invención provee una composición
que comprenda un anticuerpo anti-PSCA de la
invención, y un transportador. En una realización de la invención,
la formulación es una formulación terapéutica que comprende un
transportador aceptable desde el punto de vista farmacéutico.
Otro aspecto de la invención son los ácidos
nucléicos aislados que codifican los anticuerpos
anti-PSCA internalizantes. Se incluyen los ácidos
nucléicos que codifican tanto las cadenas H como las L, y
especialmente los residuos de la región hipervariable, cadenas que
codifican el anticuerpo de secuencia nativa, así como las
variantes, modificaciones y versiones humanizadas del
anticuerpo.
En la presente invención también se revelan
procedimientos útiles para tratar un cáncer que exprese PSCA o para
aliviar uno o más síntomas del cáncer en un mamífero, comprendiendo
la administración al mamífero de una cantidad de un anticuerpo
anti-PSCA internalizante que resulte efectiva desde
el punto de vista terapéutico. Las composiciones terapéuticas de
anticuerpo se pueden administrar a corto plazo (agudo) o de forma
crónica, o intermitentemente conforme a las directrices del médico.
También se proporcionan procedimientos in vivo de inhibición
del crecimiento de, y la muerte de, una célula que exprese PSCA.
Finalmente, la invención también provee kits y
artículos de fabricación que comprenden al menos un anticuerpo
anti-PSCA internalizante. Los kits que contienen
anticuerpos anti-PSCA encuentran su utilidad, por
ejemplo, en ensayos de muerte de células con PSCA, para la
purificación o inmunoprecipitación del PSCA presente en las
células. Por ejemplo, para el aislamiento y purificación de PSCA, el
kit puede contener un anticuerpo anti-PSCA acoplado
a perlas (por ejemplo, perlas de sefarosa). Se pueden proveer kits
que contengan anticuerpos para la detección y cuantificación del
PSCA in vitro, por ejemplo, en un ELISA o un Western blot.
Dicho anticuerpo útil para detección se puede proveer con un
marcador como un marcador fluorescente o un radiomarcador.
A continuación se describen ejemplos de técnicas
empleadas para la producción de los anticuerpos que resultan de
utilidad en la presente invención. Algunas de estas técnicas se
describen adicionalmente en el Ejemplo 1 y en la Tabla 2A. El
antígeno PSCA a utilizar para la producción de anticuerpos puede
ser, por ejemplo, el polipéptido de longitud completa o una porción
del mismo, incluyendo una forma soluble de PSCA que no posea la
secuencia de anclaje a GPI (que se puede obtener mediante liberación
enzimática con fosfatidilinositol fosfolipasas), o péptidos
sintéticos para porciones seleccionadas de la proteína.
Alternativamente, para generar los anticuerpos se pueden utilizar
células que expresen PSCA en su superficie celular (por ejemplo,
células CHO o NIH-3T3 transformadas para que
sobreexpresen PSCA; línea de células tumorales de próstata u otra
línea de células tumorales que expresen PSCA), o membranas
preparadas a partir de dichas células. Las secuencias de
nucleótidos y aminoácidos de PSCA humano y murino están disponibles,
según se ha provisto anteriormente. El PSCA se puede producir de
forma recombinante en, y aislado de, células bacterianas o
eucariotas utilizando la metodología estándar de ADN recombinante.
El PSCA se puede expresar como una proteína etiquetada (por ejemplo,
etiqueta de epítopo) o como otra proteína de fusión para facilitar
el aislamiento, así como la identificación en diversos ensayos. Los
anticuerpos o proteínas de unión que se unen a diferentes etiquetas
y secuencias de fusión están disponibles según se establece más
adelante. Otras formas de PSCA que resultan útiles para la
generación de anticuerpos resultarán aparentes para los expertos en
la técnica.
Varios polipéptidos etiqueta y sus respectivos
anticuerpos son bien conocidos en la técnica. Ejemplos de ello
incluyen las etiquetas de polihistidina (poli-His) o
poli-histidina-glicina
(poli-His-Gly); el polipéptido
etiqueta HA de la gripe y su anticuerpo 12CA5 [Field et al.,
Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]; la etiqueta
c-myc y sus anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y
9E10 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology,
5:3610-3616 (1985)]; y la etiqueta de glicoproteína
D (gD) del virus del Herpes Simplex y su anticuerpo [Paborsky et
al., Protein Engineering, 3(6):547-553
(1990)]. El péptido FLAG [Hopp et al., BioTechnology,
6:1204-1210 (1988)] está reconocido como un
anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2 (Eastman Kodak
Co., New Haven (CT), EE.UU.). La purificación de una proteína que
contenga el péptido FLAG puede realizarse mediante cromatografía de
inmunoafinidad utilizando una matriz de afinidad que comprenda el
anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2 unido
covalentemente a agarosa (Eastman Kodak Co., New Haven (CT),
EE.UU.).
Otros polipéptidos etiqueta incluyen el péptido
epítopo KT3 [Martin et al., Science,
255:192-194 (1992)]; un péptido epítopo de
\alpha-tubulina [Skinner et al., J. Biol.
Chem., 266:15163-15166 (1991)]; y la etiqueta
peptídica de la proteína del gen 10 de T7
[Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)].
Los anticuerpos policlonales se obtienen
ventajosamente a partir de animales mediante múltiples inyecciones
subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y
de un adyuvante. Puede resultar de utilidad conjugar el antígeno
relevante (especialmente cuando se usan péptidos sintéticos) con una
proteína que sea inmunogénica en la especie a inmunizar. Por
ejemplo, el antígeno se puede conjugar con hemocianina de lapa
californiana (KLH), con albúmina sérica, con tiroglobulina bovina, o
con un inhibidor de tripsina de soja, utilizando un agente
bifuncional o derivatizante, por ejemplo, maleimidobenzoato de
sulfosuccinimida (conjugación a través de los residuos de
cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de los
residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico,
SOCl_{2}, o R^{1}N=C=NR, en donde R y R^{1} son grupos
alquílicos diferentes.
Los animales se inmunizan frente al antígeno,
frente a conjugados inmunogénicos o frente a derivados mediante
combinación, por ejemplo, de 100 \mug ó 5 \mug de proteína o
conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes
del adyuvante completo de Freund e inyectando intradérmicamente la
disolución en múltiples sitios. Un mes después, los animales son
estimulados con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de péptido o
conjugado en el adyuvante completo de Freund mediante inyección
subcutánea en múltiples sitios. Siete a 14 días después, los
animales son sangrados y el suero es sometido a ensayos para
analizar los títulos de anticuerpo. Los animales son estimulados
hasta alcanzar el máximo de titulación. Los conjugados también
pueden obtenerse a partir de cultivos de células recombinantes como
fusiones de proteínas. Además, agentes agregantes como el alumbre
se utilizan adecuadamente para mejorar la respuesta inmune.
Los anticuerpos monoclonales se pueden obtener
utilizando el procedimiento de hibridoma inicialmente descrito por
Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), o se pueden obtener
mediante procedimientos de ADN recombinante (Patente estadounidense
nº 4.816.567).
En el procedimiento de hibridoma, un ratón u
otro animal huésped apropiado, como un hámster, es inmunizado según
se ha descrito anteriormente para obtener linfocitos que produzcan o
sean capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente
a la proteína utilizada para la inmunización. Alternativamente, los
linfocitos se pueden inmunizar in vitro. Tras la
inmunización, los linfocitos se aíslan y posteriormente fusionan
con una línea celular de mieloma utilizando un agente de fusión
adecuado, como el polietilenglicol, para formar una célula de
hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,
pp.59-103 (Academic Press, 1986)).
Las células de hibridoma así preparadas se
siembran y hacen crecer en un medio de cultivo adecuado que
contendrá ventajosamente una o más sustancias que inhiban el
crecimiento o la supervivencia de las células parentales de mieloma
no fusionadas (también referidas como socio de fusión). Por ejemplo,
si las células parentales de mieloma no presentan la enzima
hipoxantina-guanina
fosforibosil-transferasa (HGPRT o HPRT), el medio
de cultivo selectivo para los hibridomas incluirá normalmente
hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), cuyas sustancias
previenen el crecimiento de células deficientes en HGPRT.
Las células de mieloma del socio de fusión que
resultan ventajosas son aquellas que se fusionan de forma efectiva,
que soportan una producción estable de anticuerpo a alto nivel por
parte de las células productoras de anticuerpo seleccionadas, y que
son sensibles a un medio selectivo que selecciona frente a células
parentales no fusionadas. Las líneas celulares de mieloma que
resultan ventajosas son líneas de mieloma murino, como las
derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y
MPC-11 disponibles en el Salk Institute Cell
Distribution Center, San Diego, California, EE.UU., y
SP-2 y derivados, por ejemplo, células
X63-Ag8-653 disponibles en la
American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, EE.UU. Las
líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma
ratón-humano también han sido descritas como
adecuadas para la producción de anticuerpos monoclonales humanos
(Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); y Brodeur et al.,
Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.
51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, EE.UU.
1987)).
El medio de cultivo en el que se hacen crecer
las células de hibridoma es utilizado para la producción de
anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno.
Ventajosamente, la especificidad de unión de los anticuerpos
monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina
mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in
vitro, como un radioinmunoensayo (RIA) o un ensayo
inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA).
La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal
se puede determinar, por ejemplo, mediante el análisis de Scatchard
descrito en Munson et al., Anal. Biochem., 107:220
(1980).
Una vez identificadas las células de hibridoma
que producen anticuerpos con la especificidad, afinidad y/o
actividad deseadas, los clones se pueden subclonar mediante
procedimientos de dilución limitante y se pueden hacer crecer
mediante los procedimientos estándares (Goding, Monoclonal
Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103
(Academic Press, 1986)). Los medios de cultivo adecuados para este
propósito incluyen, por ejemplo, el medio D-MEM o
RPMI-1640. Además, las células de hibridoma se
pueden hacer crecer in vivo como tumores ascites en un
animal, por ejemplo, mediante inyección intraperitoneal de las
células en ratones.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los
subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, fluido
ascites o suero mediante los procedimientos convencionales de
purificación de anticuerpos como, por ejemplo, mediante
cromatografía de afinidad (por ejemplo, usando proteína A o proteína
G-Sefarosa) o cromatografía de intercambio iónico,
cromatografía con hidroxiapatita, electroforesis en geles, diálisis,
etc.
El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales
se aísla y secuencia de manera sencilla utilizando los
procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas
oligonucleótidas que sean capaces de unirse específicamente a los
genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos
murinos). Las células de hibridoma sirven como una fuente ventajosa
de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN puede integrarse en vectores
de expresión, que serán transferidos entonces a células huésped como
las células de E. coli, células COS de simio, células de
Ovario de Hámster Chino (CHO), o células de mieloma que, en caso
contrario, no producirían la proteína de anticuerpo, para obtener
la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped
recombinantes. Entre los artículos de revisión sobre la expresión
recombinante en bacterias de ADN que codifica el anticuerpo se
incluyen las revisiones de Skerra et al., Curr. Opinion in
Immunol., 5:256-262 (1993) y Plückthun, Immunol.
Revs., 130:151-188 (1992).
En una realización adicional, los anticuerpos
monoclonales o fragmentos de anticuerpos se pueden aislar de las
librerías de anticuerpos en fagos generadas utilizando las técnicas
descritas en McCafferty et al., Nature,
348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature,
352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol.
Biol., 222:581-597 (1991) describen el aislamiento
de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, usando librerías
de fagos. Publicaciones posteriores describen la producción de
anticuerpos humanos de alta afinidad (rango nM) mediante el
intercambio de cadenas (chain shuffling) (Marks et
al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), así
como mediante la infección combinatoria y la recombinación in
vivo como una estrategia para la construcción de librerías de
fagos muy extensas (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res.,
21:2265-2266 (1993)). Así, estas técnicas son
alternativas viables a las técnicas tradicionales de hibridomas de
anticuerpos monoclonales para el aislamiento de anticuerpos
monoclonales.
El ADN que codifica el anticuerpo se puede
modificar para producir polipéptidos de anticuerpos quiméricos o de
anticuerpos de fusión, por ejemplo, sustituyendo las secuencias de
los dominios humanos constantes de cadena pesada y de cadena ligera
(C_{H} y C_{L}) por las secuencias murinas homólogas (Patente
estadounidense nº 4.816.567; y Morrison, et al., Proc. Natl
Acad Sci. USA, 81:6851 (1984)), o fusionando la secuencia
codificante de inmunoglobulina con toda o parte de la secuencia
codificante de un polipéptido no-inmunoglobulina
(polipéptido heterólogo). Las secuencias de polipéptido
no-inmunoglobulina pueden sustituirse por los
dominios constantes de un anticuerpo, o pueden ser sustituidos por
los dominios variables de un sitio de combinación con el antígeno
de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que
comprenda un sitio de combinación con antígeno que presente
especificidad para un antígeno y que comprenda también un sitio de
combinación con antígeno que presente especificidad para un
antígeno diferente.
Los procedimientos para humanizar anticuerpos no
humanos han sido descritos en la técnica. Ventajosamente, un
anticuerpo humanizado presenta uno o más residuos de aminoácido
introducidos en él a partir de una fuente que no sea humana. Estos
residuos de aminoácido no humanos se denominan frecuentemente
residuos "de importación", que normalmente son extraídos de
un dominio variable "de importación". La humanización se puede
realizar, esencialmente, siguiendo el procedimiento de Winter y
colaboradores (Jones et al., Nature, 321:
522-525 (1986); Reichmann et al., Nature,
332:323-327 (1988); Verhoeyen et al.,
Science, 239:1534-1536 (1988)), sustituyendo las
secuencias de la región hipervariable por las secuencias
correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos
anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente
estadounidense nº 4.816.567) en donde se ha sustituido
sustancialmente menos de un dominio humano variable intacto por la
correspondiente secuencia de una especie no humana. En la práctica,
los anticuerpos humanizados son normalmente anticuerpos humanos en
los que algunos residuos de la región hipervariable y posiblemente
algunos residuos FR son sustituidos por residuos de sitios análogos
de anticuerpos de roedores.
La elección de los dominios variables humanos,
tanto ligeros como pesados, a utilizar para fabricar los
anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la
antigenicidad y la respuesta HAMA (anticuerpo humano
anti-ratón) cuando el anticuerpo pretende utilizarse
para usos terapéuticos en humanos. Conforme al denominado
procedimiento de "mejor ajuste", la secuencia del dominio
variable de un anticuerpo de roedor es cribada frente a toda la
librería de secuencias conocidas de dominios variables humanos. Así,
la secuencia del dominio V humano que se aproxima más a la del
roedor es identificada y la región de entramado humana (FR) de
dicha secuencia es aceptada como adecuada para el anticuerpo
humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993);
Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Otro
procedimiento utiliza una región de entramado específica procedente
de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un
subgrupo específico de cadenas ligeras o pesadas. El mismo
entramado se puede utilizar para diversos anticuerpos humanizados
diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623
(1993)).
Resulta aún más importante que los anticuerpos
se humanicen reteniendo la elevada afinidad de unión por el
antígeno y reteniendo otras propiedades biológicas favorables. Para
conseguir este objetivo, según un procedimiento ventajoso, los
anticuerpos humanizados se preparan siguiendo un proceso de análisis
de las secuencias parentales y de diversos productos humanizados
conceptuales, utilizando para ello modelos tridimensionales de las
secuencias parentales y humanizadas. Los modelos tridimensionales de
inmunoglobulina están disponibles comúnmente y resultan familiares
para los expertos en la técnica. También se dispone de programas
informáticos que ilustran y muestran las estructuras
conformacionales tridimensionales probables de las secuencias de
inmunoglobulina candidatas que han sido seleccionadas. La
inspección de estas visualizaciones permite analizar el papel que,
probablemente, jugarán los residuos en el funcionamiento de la
secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de
los residuos que afectan a la capacidad de la inmunoglobulina
candidata para unirse a su antígeno. De esta forma, los residuos FR
se pueden seleccionar y combinar a partir de secuencias receptoras
y de importación, de forma tal que se consiga la característica
deseada del anticuerpo, como la mayor afinidad por el(los)
antígeno(s) diana. En general, los residuos de la región
hipervariable influyen directamente y de forma muy sustancial en la
unión al antígeno.
Se contemplan diversas formas de un anticuerpo
anti-PSCA humanizado. Por ejemplo, el anticuerpo
humanizado puede ser un fragmento de anticuerpo, como un Fab, que
se conjuga opcionalmente con uno o más agentes citotóxicos con el
fin de generar un inmunoconjugado. Alternativamente, el anticuerpo
humanizado puede ser un anticuerpo intacto, como un anticuerpo IgG1
intacto.
Como una alternativa a la humanización, se
pueden generar anticuerpos humanos. Por ejemplo, ahora es posible
producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que sean
capaces, mediante inmunización, de producir un completo repertorio
de anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de
inmunoglobulina. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción
homocigótica del gen de unión (J_{H}) de cadenas pesadas de los
anticuerpos en ratones quiméricos y mutantes en la línea germinal
conlleva la inhibición completa de la producción endógena de
anticuerpos. La transferencia de la matriz de genes de
inmunoglobulinas humanas de la línea germinal a ratones mutantes en
dicha línea germinal dará como resultado la producción de
anticuerpos humanos durante la exposición al antígeno. Ver, por
ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature,
362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year
in Immuno., 7:33 (1993); Patentes estadounidenses n^{os}
5.545.806, 5.569.825, 5.591.669 (todas de GenPharm); 5.545.807; y WO
97/17852.
Alternativamente, se puede usar la tecnología de
visualización de fagos (McCafferty et al., Nature
348:552-553 [1990]) para producir anticuerpos
humanos y fragmentos de anticuerpos in vitro, a partir de
repertorios de genes de los dominios variables (V) de
inmunoglobulinas procedentes de donantes no inmunizados. Conforme a
esta técnica, los genes de los dominios V de anticuerpo se clonan en
un gen de la proteína mayor o menor de la cápside de un
bacteriófago filamentoso, como el bacteriófago M13 o fd, y se
visualizan como fragmentos funcionales de anticuerpos sobre la
superficie de la partícula de fago. Dado que la partícula
filamentosa contiene una copia de ADN de cadena simple del genoma
del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales
del anticuerpo también conllevan la selección del gen que codifica
el anticuerpo que exhibe dichas propiedades. Así, el fago imita
algunas de las propiedades de la célula B. La visualización del fago
se puede realizar en una variedad de formatos, revisados, por
ejemplo, en Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Current Opinion
in Structural Biology 3:564-571 (1993). Para la
visualización del fago se pueden utilizar diversas fuentes de
segmentos del gen V. Clackson et al., Nature,
352:624-628 (1991) aislaron un variado rango de
anticuerpos anti-oxazolona a partir de una librería
combinatoria aleatoria de genes V derivados del bazo de ratones
inmunizados. Siguiendo esencialmente las técnicas descritas por
Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597
(1991), o Griffith et al., EMBO J.
12:725-734 (1993), se puede construir un repertorio
de genes V a partir de donantes humanos no inmunizados y se pueden
aislar anticuerpos para un variado rango de antígenos (incluyendo
los autoantígenos). Ver, también, las Patentes estadounidenses
n^{os} 5.565.332 y 5.573.905.
Como se ha discutido anteriormente, los
anticuerpos humanos también pueden ser generados por células B
activadas in vitro (ver las Patentes estadounidenses
n^{os} 5.567.610 y 5.229.275).
En ciertas circunstancias, la utilización de
fragmentos de anticuerpos, en lugar de los anticuerpos completos,
conlleva ciertas ventajas. El menor tamaño de los fragmentos permite
una rápida remoción, y puede conllevar un acceso mejorado a los
tumores sólidos.
Para la producción de fragmentos de anticuerpo
se han desarrollado diversas técnicas. Tradicionalmente, estos
fragmentos proceden de la digestión proteolítica de anticuerpos
intactos (ver, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of
Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117
(1992); y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Sin
embargo, en la actualidad estos fragmentos pueden ser producidos
directamente por células huésped recombinantes. Los fragmentos de
anticuerpos Fab, Fv y ScFv pueden todos ellos expresarse en y
secretarse por E. coli, permitiendo así la producción de
manera sencilla de grandes cantidades de dichos fragmentos. Los
fragmentos de anticuerpos se pueden aislar a partir de las librerías
de anticuerpos de fagos discutidas anteriormente en esta invención.
Alternativamente, los fragmentos Fab'-SH se pueden
recuperar directamente de E. coli y se pueden acoplar
químicamente para formar fragmentos F(ab')_{2} (Carter
et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)).
Conforme a otra aproximación, los fragmentos F(ab')_{2} se
pueden aislar directamente a partir del cultivo de células huésped
recombinantes. Los fragmentos Fab y
F(ab')_{2} con mayor vida media in vivo que comprendan residuos epítopos de unión a un receptor de reciclaje se describen en la Patente estadounidense nº 5.869.046. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo resultarán aparentes para el practicante experto en la técnica. En otras realizaciones, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de cadena simple (scFv). Ver WO 93/16185; Patente estadounidense nº 5.571.894; y Patente estadounidense nº 5.587.458. Fv y sFv son las únicas especies con sitios de combinación intactos que están desprovistas de regiones constantes; por ello, resultan adecuadas para conseguir una reducida unión no específica durante el uso in vivo. Las proteínas de fusión sFv se pueden construir para conseguir la fusión a una proteína efectora al extremo amino-terminal o al extremo carboxi-terminal de una sFv. Ver Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, el que se describe en la Patente estadounidense nº 5.641.870. Dichos fragmentos de anticuerpo lineal pueden ser monoespecíficos o biespecíficos.
F(ab')_{2} con mayor vida media in vivo que comprendan residuos epítopos de unión a un receptor de reciclaje se describen en la Patente estadounidense nº 5.869.046. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo resultarán aparentes para el practicante experto en la técnica. En otras realizaciones, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de cadena simple (scFv). Ver WO 93/16185; Patente estadounidense nº 5.571.894; y Patente estadounidense nº 5.587.458. Fv y sFv son las únicas especies con sitios de combinación intactos que están desprovistas de regiones constantes; por ello, resultan adecuadas para conseguir una reducida unión no específica durante el uso in vivo. Las proteínas de fusión sFv se pueden construir para conseguir la fusión a una proteína efectora al extremo amino-terminal o al extremo carboxi-terminal de una sFv. Ver Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, el que se describe en la Patente estadounidense nº 5.641.870. Dichos fragmentos de anticuerpo lineal pueden ser monoespecíficos o biespecíficos.
Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos
que presentan especificidades de unión para al menos dos epítopos
diferentes. Algunos anticuerpos biespecíficos se pueden unir a dos
epítopos diferentes de la proteína PSCA. Otros de estos anticuerpos
pueden combinar un sitio de unión a PSCA con un sitio de unión a
otra proteína. Alternativamente, un brazo anti-PSCA
se puede combinar con un brazo que se una a una molécula
desencadenante en un leucocito, por ejemplo, una molécula receptora
de células T (por ejemplo, CD3), o receptores Fc para IgG
(Fc\gammaR), como Fc\gammaRI (CD64), Fc\gammaRII (CD32) y
Fc\gammaRIII (CD16), de forma que los mecanismos de defensa
celular se centren y localicen en la célula que expresa PSCA. Los
anticuerpos biespecíficos también se pueden utilizar para localizar
agentes citotóxicos para células que expresen PSCA. Dichos
anticuerpos poseen un brazo de unión a PSCA y un brazo que se une al
agente citotóxico (por ejemplo, saponina,
anti-interferón \alpha, alcaloide de vinca, cadena
A de ricina, metotrexato o isótopo radioactivo de hapteno). Los
anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de
longitud completa o como fragmentos de anticuerpos (por ejemplo,
anticuerpos biespecíficos F(ab')_{2}).
La patente WO 96/16673 describe un anticuerpo
biespecífico
anti-ErbB2/anti-Fc\gammaRIII y la
Patente estadounidense nº 5.837.234 revela un anticuerpo
biespecífico
anti-ErbB2/anti-Fc\gammaRI. Un
anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/Fc\alpha se
muestra en WO 98/02463. La Patente estadounidense nº 5.821.337
muestra un anticuerpo biespecífico
anti-ErbB2/anti-CD3.
Los procedimientos para la fabricación de
anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. La
producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud
completa se basa en la coexpresión de dos pares cadena
ligera-cadena pesada de inmunoglobulina, en donde
las dos cadenas presentan diferentes especificidades (Millstein
et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Debido a
la variedad aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de
inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla
potencial de 10 moléculas diferentes de anticuerpo, de las cuales
sólo una posee la estructura biespecífica correcta. La purificación
de la molécula correcta, que suele realizarse mediante etapas de
cromatografía de afinidad, es bastante ardua, y los rendimientos de
producto son bajos. Procedimientos similares se revelan en WO
93/08829, y en Traunecker et al., EMBO J.,
10:3655-3659 (1991).
Conforme a una aproximación diferente, los
dominios variables de anticuerpo que posean las especificidades de
unión deseadas (sitios de combinación
anticuerpo-antígeno) se fusionan con las secuencias
de dominio constante de inmunoglobulina. Ventajosamente, la fusión
se realiza con un dominio constante de cadena pesada de Ig, que
comprende al menos una parte de las regiones bisagra, C_{H}2 y
C_{H}3. Resulta ventajoso que la primera región constante de
cadena pesada (C_{H}1), que contiene el sitio necesario para
realizar una unión de cadena ligera, esté presente en al menos una
de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada
de inmunoglobulina y, en caso deseado, la cadena ligera de
inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión
independientes y son cotransfectados a una célula huésped adecuada.
Esto provee una mayor flexibilidad en el ajuste de las proporciones
relativas de los tres fragmentos de polipéptido en las
realizaciones, cuando el uso de proporciones desiguales de las tres
cadenas de polipéptido en la construcción proporciona el rendimiento
óptimo del anticuerpo biespecífico deseado. No obstante, resulta
posible insertar la secuencia codificante para dos o para las tres
cadenas de polipéptido en un único vector de expresión, cuando la
expresión de al menos dos cadenas de polipéptido en proporciones
iguales genera elevados rendimientos o cuando las proporciones no
afectan de forma significativa al rendimiento de la combinación de
cadenas deseada.
En una realización ventajosa de esta
aproximación, los anticuerpos biespecíficos se componen de una
cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera
especificidad de unión en un brazo, y de un par cadena
pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que
proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo.
Se ha observado que esta estructura asimétrica facilita la
separación del compuesto biespecífico deseado con respecto a las
combinaciones no deseadas de cadenas de inmunoglobulina, ya que la
presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en sólo una de
las mitades de la molécula biespecífica provee una forma sencilla
de separación. Esta aproximación se revela en WO 94/04690. Para
obtener detalles adicionales acerca de la generación de anticuerpos
biespecíficos, ver, por ejemplo, Suresh et al., Methods in
Enzymology, 121:210 (1986).
Conforme a otra aproximación descrita en la
Patente estadounidense nº 5.731.168, la interfaz entre un par de
moléculas de anticuerpo se puede diseñar de forma que se maximice el
porcentaje de heterodímeros que se recuperarán del cultivo de
células recombinantes. La interfaz ventajosa comprende al menos una
parte del dominio C_{H}3. En este procedimiento, una o más
cadenas laterales pequeñas de los aminoácidos de la interfaz de la
primera molécula de anticuerpo son sustituidas por cadenas laterales
grandes (por ejemplo, de tirosina o triptófano). En la interfaz de
la segunda molécula de anticuerpo se crean "cavidades"
compensatorias de tamaño idéntico o similar a las cadenas laterales
grandes al sustituir las cadenas laterales grandes de los
aminoácidos por otras más pequeñas (por ejemplo, de alanina o
treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el
rendimiento del heterodímero con respecto a los productos finales no
deseados, como los homodímeros.
Los anticuerpos biespecíficos incluyen
anticuerpos entrecruzados o "heteroconjugados". Por ejemplo,
uno de los anticuerpos del heteroconjugado se puede acoplar a
avidina, y el otro a biotina. Dichos anticuerpos han sido
propuestos, por ejemplo, para dirigirse contra células no deseadas
del sistema inmune (Patente estadounidense nº 4.676.980), y para el
tratamiento de la infección por VIH (WO 91/00360, WO 92/200373 y EP
03089). Los anticuerpos heteroconjugados se pueden obtener mediante
el uso de cualquier procedimiento de entrecruzamiento que resulte
conveniente. Los agentes de entrecruzamiento adecuados son bien
conocidos en la técnica, y se revelan en la Patente estadounidense
nº 4.676.980, junto con un cierto número de técnicas de
entrecruzamiento.
En la literatura también se describen técnicas
para la generación de anticuerpos biespecíficos a partir de
fragmentos de anticuerpos. Por ejemplo, se pueden preparar
anticuerpos biespecíficos utilizando un enlace químico. Brennan
et al., Science, 229: 81 (1985) describen un procedimiento en
el que anticuerpos intactos son liberados proteolíticamente para
generar fragmentos F(ab')_{2}. Dichos fragmentos se reducen
en presencia de un agente complejante de ditiol, el arsenito
sódico, para estabilizar los ditioles vecinales y prevenir la
formación de puentes disulfuro intermoleculares. Los fragmentos Fab'
generados se convierten entonces en derivados de tionitrobenzoato
(TNB). Uno de los derivados Fab'-TNB es reconvertido
a continuación en el Fab'-tiol mediante reducción
con mercaptoetilamina y es mezclado con una cantidad equimolar del
otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo
biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos así producidos se pueden
utilizar como agentes para la inmovilización selectiva de
enzimas.
Avances recientes han facilitado la recuperación
directa de fragmentos Fab'-SH de E. coli, que
se pueden acoplar químicamente para formar anticuerpos
biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:
217-225 (1992) describen la producción de una
molécula de anticuerpo biespecífico F(ab')_{2} totalmente
humanizado. Cada fragmento Fab' fue secretado de forma
independiente por E. coli y fue sometido a un acoplamiento
químico in vitro dirigido para formar el anticuerpo
biespecífico. El anticuerpo biespecífico así formado fue capaz de
unirse a células que sobreexpresaban el receptor ErbB2 y a células T
humanas normales, así como de desencadenar la actividad lítica de
linfocitos humanos citotóxicos frente a tumores de mama en
humanos.
También se han descrito diversas técnicas para
obtener y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos
directamente a partir de cultivos de células recombinantes. Por
ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos usando
cremalleras de leucina. Ver Kostelny et al., J. Immunol.,
148(5):1547-1553 (1992). Los péptidos
cremallera de leucina procedentes de las proteínas Fos y Jun se
unieron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante
fusión génica. Los homodímeros de anticuerpos se redujeron a la
región bisagra para formar monómeros y, a continuación, se
reoxidaron para formar los heterodímeros de anticuerpos. Este
procedimiento también se puede utilizar para producir homodímeros
de anticuerpos. La tecnología de "diabody" descrita por
Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo
alternativo para la obtención de fragmentos de anticuerpos
biespecíficos. Los fragmentos comprenden un V_{H} conectado a un
V_{L} mediante un enlace que es demasiado corto para permitir el
emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena. Por
consiguiente, los dominios V_{H} y V_{L} de un fragmento se ven
obligados a emparejarse con los dominios V_{L} y V_{H}
complementarios del otro fragmento, formando así dos sitios de unión
a antígeno. También se ha publicado otra estrategia para la
obtención de fragmentos de anticuerpos biespecíficos mediante el
uso de dímeros de Fv de cadena simple (sFv). Ver Gruber et
al., J. Immunol., 152:5368 (1994).
Se contemplan anticuerpos con más de dos
valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos
triespecíficos. Ver Tutt et al. J. Immunol. 147: 60
(1991).
Un anticuerpo multivalente puede ser
internalizado (y/o catabolizado) más rápidamente que un anticuerpo
bivalente por una célula que exprese un antígeno al que se unan los
anticuerpos. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser
anticuerpos multivalentes (que son diferentes de los de la clase
IgM) con tres o más sitios de unión a antígeno (por ejemplo,
anticuerpos tetravalentes), que se pueden producir de forma sencilla
mediante expresión recombinante del ácido nucléico que codifica las
cadenas de polipéptido del anticuerpo. El anticuerpo multivalente
puede comprender un dominio de dimerización y tres o más sitios de
unión a antígeno. El dominio de dimerización ventajoso comprende (o
consta de) una región Fc o una región bisagra. En este escenario,
el anticuerpo comprenderá una región Fc y tres o más sitios de unión
a antígeno amino-terminales a la región Fc. El
anticuerpo multivalente ventajoso de la presente invención comprende
(o consta de) tres a aproximadamente ocho, pero ventajosamente
cuatro, sitios de unión a antígeno. El anticuerpo multivalente
comprende al menos una cadena de polipéptido (y ventajosamente dos
cadenas de polipéptido), en donde la(s) cadena(s) de
polipéptido comprende(n) dos o más dominios variables. Por
ejemplo, la(s) cadena(s) de polipéptido
puede(n) comprender
VD1-(X1)_{n}-VD2-(X2)_{n}-Fc,
en donde VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo
dominio variable, Fc es una cadena de polipéptido de una región Fc,
X1 y X2 representan un aminoácido o polipéptido, y n es 0 ó 1. Por
ejemplo, la(s) cadena(s) de polipéptido
puede(n) comprender:
VH-CH1-enlace
flexible-VH-CH1-cadena
de región Fc; o
VH-CH1-VH-CH1-cadena
de región Fc. El anticuerpo multivalente que resulta ventajoso para
la invención comprende además al menos dos (y ventajosamente
cuatro) polipéptidos del dominio variable de cadena ligera. El
anticuerpo multivalente de la invención puede comprender, por
ejemplo, entre dos y aproximadamente ocho polipéptidos del dominio
variable de cadena ligera. Los polipéptidos del dominio variable de
cadena ligera aquí contemplados comprenden un dominio variable de
cadena ligera y, opcionalmente, comprenden además un dominio
CL.
Se contemplan las modificaciones de la secuencia
de aminoácidos de los anticuerpos anti-PSCA aquí
descritos. Por ejemplo, puede resultar deseable mejorar la afinidad
de unión y/o otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las
variantes de secuencias de aminoácidos del anticuerpo
anti-PSCA se preparan mediante la introducción de
cambios de nucleótidos apropiados en el ácido nucléico del
anticuerpo anti-PSCA, o mediante síntesis peptídica.
Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de y/o
inserciones en y/o sustituciones de residuos incluidos en la
secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-PSCA.
Cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución se
realiza para llegar a la construcción final, siempre que la
construcción final posea las características deseadas. Los cambios
de aminoácidos también pueden alterar procesos
post-traslacionales del anticuerpo
anti-PSCA, como el cambio del número o de la
posición de los sitios de glicosilación.
Un procedimiento de utilidad para la
identificación de ciertos residuos o regiones del anticuerpo
anti-PSCA que son ubicaciones ventajosas para la
mutagénesis se denomina "mutagénesis por barrido de alanina",
según describen Cunningham y Wells en Science,
244:1081-1085 (1989). Aquí, un residuo o grupo de
residuos objetivo se identifican (por ejemplo, residuos cargados
como Arg, Asp, His, Lys y Glu) y se sustituyen por un aminoácido
neutro o negativamente cargado (alanina o polialanina en el caso más
ventajoso posible) para afectar a la interacción de los aminoácidos
con el antígeno de PSCA. Aquellas ubicaciones de aminoácidos que
demuestren una sensibilidad funcional a las sustituciones serán
refinadas a continuación mediante la introducción de variantes
adicionales o diferentes en, o para, los sitios de sustitución. De
esta manera, mientras que el sitio en el que se introduce una
variación de secuencia está predeterminado, la naturaleza de la
mutación per se no tiene por qué estar predeterminada. Por
ejemplo, para analizar el rendimiento de una mutación en un sitio
determinado, la mutagénesis por barrido de alanina o aleatoria se
lleva a cabo en el codón o región diana y las variantes de
anticuerpos anti-PSCA expresadas se criban para la
actividad deseada.
Las inserciones en la secuencia de aminoácidos
incluyen fusiones amino-terminales y/o
carboxi-terminales cuya longitud varía desde un
residuo hasta polipéptidos que contienen cien o más residuos, así
como inserciones intrasecuencia de residuos únicos o múltiples de
aminoácidos. Ejemplos de inserciones terminales incluyen un
anticuerpo anti-PSCA con un residuo de metionina en
el extremo N-terminal o el anticuerpo fusionado a un
polipéptido citotóxico. Otras variantes insercionales de la
molécula de anticuerpo anti-PSCA incluyen la fusión
al extremo N-terminal o C-terminal
del anticuerpo anti-PSCA para una enzima (por
ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que aumente la vida media en
suero del anticuerpo.
Otro tipo de variante es una variante de
sustitución de aminoácidos. Estas variantes presentan al menos un
residuo de aminoácido de la molécula de anticuerpo
anti-PSCA que ha sido sustituido por un residuo
diferente. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis de
sustitución incluyen las regiones hipervariables, aunque las
alteraciones FR también se contemplan. Las sustituciones
conservativas se muestran en la Tabla 1 bajo el encabezamiento de
"sustituciones ventajosas". Si dichas sustituciones provocan un
cambio en la actividad biológica, entonces se podrán introducir
cambios más sustanciales, denominadas "sustituciones
ejemplares" en la Tabla 1 o descritas con mayor detalle más
adelante en referencia a las clases de aminoácidos; y los productos
obtenidos podrán cribarse.
Modificaciones sustanciales de las propiedades
biológicas del anticuerpo se consiguen seleccionando las
sustituciones que difieran de forma significativa en cuanto a su
efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto
del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una
conformación de lámina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad
de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen estérico de
la cadena lateral. Los residuos naturales se dividen en grupos en
función de las propiedades comunes de sus cadenas laterales:
1. (1) hidrofóbicos: norleucina, Met, Ala, Val,
Leu, Ile;
2. (2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr;
3. (3) ácidos: Asp, Glu;
4. (4) básicos: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
5. (5) residuos que influyen en la orientación
de la cadena: Gly, Pro; y
6. (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
Las sustituciones no conservativas implicarán el
intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de
otra clase.
Cualquier residuo de cisteína que no esté
involucrado en el mantenimiento de la adecuada conformación del
anticuerpo anti-PSCA también puede ser sustituido,
generalmente por serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de
la molécula y prevenir entrecruzamientos aberrantes. Contrariamente,
se pueden añadir enlaces de cisteína al anticuerpo para mejorar su
estabilidad (especialmente allí donde el anticuerpo sea un fragmento
de anticuerpo como un fragmento Fv).
Un tipo de variante de sustitución especialmente
ventajoso conlleva la sustitución de uno o más residuos de la
región hipervariable de un anticuerpo parental (por ejemplo, un
anticuerpo humanizado o humano). En general, la variante o
variantes resultantes que se seleccionen para llevar a cabo un
desarrollo adicional presentarán mejoradas propiedades biológicas
con respecto al anticuerpo parental a partir del cual han sido
generadas. Una manera conveniente de generar dichas variantes de
sustitución conlleva la maduración por afinidad utilizando la
visualización de fagos. Brevemente, diversos sitios de la región
hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) son
sometidos a mutación para generar todas las sustituciones amino
posibles en cada sitio. Las variantes del anticuerpo así generadas
se visualizan de una forma monovalente a partir de partículas
filamentosas de fagos como fusiones al producto del gen III de M13
empaquetadas dentro de cada partícula. Las variantes visualizadas
en fagos se criban entonces en función de su actividad biológica
(por ejemplo, afinidad de unión), tal como se revela en la presente
invención. Con el fin de identificar los sitios de la región
hipervariable que son candidatos para someterse a modificación, se
puede realizar una mutagénesis por barrido de alanina para poder
identificar aquellos residuos de la región hipervariable que
contribuyen significativamente a la unión a antígeno.
Alternativamente, o adicionalmente, puede resultar beneficioso
analizar una estructura cristalina del complejo
antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de
contacto entre el anticuerpo y el PSCA humano. Dichos residuos de
contacto y los residuos colindantes serán candidatos a la
sustitución conforme a las técnicas elaboradas en la presente
invención. Una vez generadas dichas variantes, el panel de variantes
es sometido a cribado según se describe aquí y los anticuerpos que
presenten las mejores propiedades en uno o más ensayos relevantes
podrán ser seleccionados para llevar a cabo un desarrollo
adicional.
Otro tipo de variante de aminoácidos del
anticuerpo modifica el patrón original de glicosilación del
anticuerpo. Por modificación se entiende la deleción de uno o más
carbohidratos encontrados en el anticuerpo, y/o la adición de uno o
más sitios de glicosilación que no están presentes en el
anticuerpo.
La glicosilación de los anticuerpos se realiza,
normalmente, mediante enlace N-glicosídico o
mediante enlace O-glicosídico. El enlace
N-glicosídico se refiere a la unión del carbohidrato
a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de
tripéptido asparagina-X-serina y
asparagina-X-treonina, en donde X
es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de
reconocimiento para la unión enzimática del carbohidrato a la
cadena lateral de la asparagina. Por ello, la presencia de
cualquiera de estas secuencias de tripéptido en un polipéptido crea
un potencial sitio de glicosilación. La glicosilación por enlace
O-glicosídico se refiere a la unión de uno de los
azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a
un hidroxiaminoácido, lo más comúnmente serina o treonina, aunque
también se pueden utilizar 5-hidroxiprolina o
5-hidroxilisina.
La adición de sitios de glicosilación al
anticuerpo se consigue de forma conveniente alterando la secuencia
de aminoácidos de forma tal que contenga una o más de las secuencias
de tripéptidos anteriormente descritas (para sitios de
glicosilación por enlace N-glicosídico). La
alteración también puede realizarse mediante la adición de, o la
sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina en la
secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación por
enlace O-glicosídico).
Las moléculas de ácido nucléico que codifican
las variantes de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo
anti-PSCA se preparan mediante una variedad de
procedimientos conocidos en la técnica. Dichos procedimientos
incluyen, pero no están limitados a, el aislamiento a partir de una
fuente natural (en el caso de las variantes de secuencias de
aminoácidos naturales) o la preparación mediante mutagénesis mediada
por oligonucleótidos (o dirigida al sitio de unión), mutagénesis
por PCR, y mutagénesis en casete de una variante preparada con
anterioridad o de una versión no-variante del
anticuerpo anti-PSCA.
Resulta deseable modificar el anticuerpo de la
invención con respecto a su función efectora, por ejemplo, de forma
tal que aumente la citotoxicidad mediada por células dependientes de
anticuerpos (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente de complemento
(CDC) del anticuerpo. Esto puede conseguirse introduciendo una o más
sustituciones de aminoácidos en una región Fc del anticuerpo.
Alternativamente o adicionalmente, se pueden introducir uno o
varios residuos de cisteína en la región Fc, permitiendo así la
formación de puentes disulfuro intercadena en esta región. El
anticuerpo homodimérico así generado puede poseer una mejorada
capacidad de internalización y/o una mayor capacidad de muerte
celular mediada por complemento y citotoxicidad celular dependiente
de anticuerpo (ADCC). Ver Caron et al., J. Exp Med.
176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol.
148:2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos
con mejorada actividad antitumoral también se pueden preparar
utilizando cross-enlaces heterobifuncionales como
los descritos por Wolff et al. Cancer Research
53:2560-2565 (1993). Alternativamente, se puede
diseñar un anticuerpo que presente regiones Fc duales y que pueda
presentar mejoradas capacidades de lisis por complemento y ADCC.
Ver Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design
3:219-230 (1989).
Para aumentar la vida media en suero del
anticuerpo, se puede incorporar un epítopo de unión al receptor de
reciclaje en el anticuerpo (especialmente un fragmento de
anticuerpo), tal como se describe, por ejemplo, en la Patente
estadounidense nº 5.739.277. Tal como se utiliza en la presente
invención, el término "epítopo de unión al receptor de
reciclaje" se refiere a un epítopo de la región Fc de una
molécula de IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4) que es
responsable de incrementar la vida media en suero in vivo de
la molécula de IgG.
Las técnicas para la generación de anticuerpos
han sido descritas anteriormente. También se pueden seleccionar
anticuerpos con ciertas características biológicas, a voluntad.
Los efectos inhibidores del crecimiento de un
anticuerpo anti-PSCA de la invención se pueden
evaluar mediante procedimientos conocidos en la técnica, por
ejemplo, usando células que expresen PSCA, ya sea de forma
endogénica o tras la transfección con el gen de PSCA. Por ejemplo,
las líneas de células tumorales y las células transfectadas con
PSCA proporcionadas en el Ejemplo 2 siguiente se pueden tratar con
un anticuerpo monoclonal anti-PSCA de la invención
a diferentes concentraciones durante varios días (por ejemplo,
2-7 días) para posteriormente teñirse con violeta
cristal o MTT o analizarse mediante algún otro ensayo colorimétrico.
Otro procedimiento para medir la proliferación conllevaría la
comparación de la absorción de 3H-timidina por
parte de células que hayan sido tratadas en presencia o ausencia de
un anticuerpo anti-PSCA de la invención. Tras el
tratamiento con anticuerpos, las células se recogen y la cantidad de
radioactividad incorporada en el ADN se cuantifica en un contador
de centelleo. Controles positivos apropiados incluyen el tratamiento
de una línea celular seleccionada con un anticuerpo inhibidor del
crecimiento conocido por inhibir el crecimiento de dicha línea
celular. La inhibición del crecimiento de las células tumorales
in vivo se puede determinar de diversas maneras, tal como se
describe más adelante en la sección de Ejemplos Experimentales (ver
Ejemplo 6). Ventajosamente, la célula tumoral es una célula que
sobreexpresa PSCA. Ventajosamente, el anticuerpo
anti-PSCA inhibirá la proliferación celular de una
célula tumoral que expresa PSCA in vitro o in vivo en
aproximadamente un 25-100% en comparación con la
célula tumoral no tratada, más ventajosamente en aproximadamente un
30-100%, y aún más ventajosamente en
aproximadamente un 50-100% ó
70-100%, a una concentración de anticuerpo de
aproximadamente 0,5 a 30 \mug/ml. La inhibición del crecimiento
se puede medir a una concentración de anticuerpo de aproximadamente
0,5 a 30 \mug/ml o aproximadamente 0,5 nM a 200 nM en cultivo
celular, en donde la inhibición del crecimiento se determina
1-10 días después de que las células tumorales sean
expuestas al anticuerpo. El anticuerpo será un inhibidor de
crecimiento in vivo si la administración de anticuerpo
anti-PSCA a aproximadamente 1 \mug/kg a 100 mg/kg
de peso corporal reduce el tamaño del tumor o disminuye la
proliferación de células tumorales tras aproximadamente 5 días a 3
meses a partir de la primera administración del anticuerpo,
ventajosamente tras aproximadamente 5 a 30 días.
Para seleccionar los anticuerpos que inducen la
muerte celular, la pérdida de integridad de membrana con respecto
al control se puede evaluar, por ejemplo, mediante la absorción de
ioduro de propidio (PI), azul de tripán o de 7AAD. El ensayo de
absorción de PI se puede llevar a cabo en ausencia de complemento y
de células efectoras inmunes. Las células tumorales que expresan
PSCA se incuban en un medio aislado o en un medio que contenga el
anticuerpo monoclonal apropiado a, por ejemplo, aproximadamente 10
\mug/ml. Las células se incuban durante un periodo de 3 días.
Tras cada tratamiento, las células se lavan y alicuotan en tubos 12
x 75 cerrados con un tamiz de 35 mm (1 ml por tubo, 3 tubos por
cada grupo de tratamiento) para la retirada de los agrupamientos de
células. A continuación, los tubos reciben PI (10 \mug/ml). Las
muestras se pueden analizar usando un citómetro de flujo
FACSCAN^{TM} y el software FACSCONVERT^{TM} CellQuest (Becton
Dickinson). Aquellos anticuerpos que induzcan niveles
estadísticamente significativos de muerte celular, determinado por
la absorción de PI, se pueden seleccionar como anticuerpos que
inducen la muerte celular.
Para seleccionar los anticuerpos que se unirán a
un epítopo de PSCA unido a un anticuerpo de interés, se puede
llevar a cabo un ensayo rutinario de bloqueo cruzado como el
descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, Ed Harlow y David Lane (1988). Este ensayo se puede
utilizar para determinar si un anticuerpo de prueba se une al mismo
sitio o epítopo que un anticuerpo anti-PSCA de la
invención. Alternativamente, o adicionalmente, se puede llevar a
cabo un mapeado de epítopos siguiendo procedimientos conocidos en la
técnica. Por ejemplo, la secuencia del anticuerpo se puede
mutagenizar por barrido de alanina, para identificar los residuos
de contacto. La capacidad del anticuerpo mutante para unirse a un
anticuerpo policlonal se comprobará inicialmente para garantizar el
adecuado plegamiento. En un procedimiento diferente, los péptidos
correspondientes a diferentes regiones de PSCA se pueden utilizar
en ensayos de competencia con los anticuerpos de prueba o con un
anticuerpo de prueba y un anticuerpo con un epítopo caracterizado o
conocido.
La invención también corresponde a la terapia
con inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado con un
agente anticancerígeno como un agente citotóxico o un agente
inhibidor del crecimiento.
Los agentes quimioterapéuticos que resultan
útiles para la generación de dichos inmunoconjugados han sido
descritos anteriormente.
Los conjugados de un anticuerpo y de una o más
toxinas de molécula pequeña, como una caliqueamicina,
maitansinoides, un tricoteno y CC1065, y los derivados de estas
toxinas que presenten actividad de toxina, también se contemplan
aquí.
En una realización ventajosa, un anticuerpo
anti-PSCA (de longitud completa o fragmentos) de la
invención se conjuga con una o más moléculas de maitansinoide.
Los maitansinoides son inhibidores mitóticos que
actúan inhibiendo la polimerización de tubulina. La maitansina se
aisló por primera vez en un arbusto de Maytenus serrata al
este de África (Patente estadounidense nº 3.896.111).
Posteriormente, se descubrió que ciertos microbios también producían
maitansinoides, como el maitansinol y los ésteres
C-3 de maitansinol (Patente estadounidense nº
4.151.042). El maitansinol y sus derivados y análogos se revelan,
por ejemplo, en las Patentes estadounidenses n^{os} 4.137.230;
4.248.870; 4.256.746; 4.260.608; 4.265.814; 4.294.757; 4.307.016;
4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821;
4.322.348; 4.331.598; 4.361.650; 4.364.866;
4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; y 4.371.533.
4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; y 4.371.533.
En un intento por mejorar su índice terapéutico,
la maitansina y los maitansinoides han sido conjugados a
anticuerpos que se unen específicamente a antígenos de células
tumorales. Los inmunoconjugados que contienen maitansinoides y su
uso terapéutico se revelan, por ejemplo, en las Patentes
estadounidenses n^{os} 5.208.020, 5.416.064 y en la Patente
europea EP 0 425 235 B1.
Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
93:8618-8623 (1996) describieron inmunoconjugados
que comprenden un maitansinoide designado DM1 unido al anticuerpo
monoclonal C242 dirigido contra el cáncer colorectal humano. El
conjugado resultó ser altamente citotóxico hacia las células de
cáncer de colon cultivadas, y mostró actividad antitumoral en un
ensayo de crecimiento in vivo del tumor. Chari et al.
Cancer Research 52:127-131 (1992) describen
inmunoconjugados en los que un maitansinoide se conjuga a través de
un enlace disulfuro con el anticuerpo murino A7 que se une a un
antígeno en líneas de células de cáncer de colon humano, o se
conjuga con otro anticuerpo monoclonal murino TA.1 que se une al
oncogen HER-2/neu. La citotoxicidad del conjugado
TA.1-maitansinoide fue probada in vitro en
la línea de células de cáncer de mama humano
SK-BR-3, que expresan 3 x 105
antígenos de superficie HER-2 por cada célula. El
fármaco conjugado alcanzó un grado de citotoxicidad similar al del
fármaco maitansinoide libre, que podría aumentarse al incrementar el
número de moléculas de maitansinoide por cada molécula de
anticuerpo. El conjugado A7-maitansinoide mostró una
baja citotoxicidad sistémica en ratones.
Los conjugados anticuerpo
anti-PSCA-maitansinoide se preparan
uniendo químicamente un anticuerpo anti-PSCA con
una molécula de maitansinoide sin que disminuya de forma
significativa la actividad biológica del anticuerpo ni de la
molécula de maitansinoide. Se ha demostrado que resulta eficaz
conjugar una media de 3-4 moléculas de
maitansinoide por cada molécula de anticuerpo para mejorar la
citotoxicidad de las células diana sin afectar negativamente a la
función o la solubilidad del anticuerpo, aunque incluso una molécula
de toxina/anticuerpo mejoraría probablemente la citotoxicidad con
respecto al uso del anticuerpo desnudo. Los maitansinoides son bien
conocidos en la técnica y se pueden sintetizar mediante técnicas
conocidas o aislar de fuentes naturales. Los maitansinoides
adecuados se revelan, por ejemplo, en la Patente estadounidense nº
5.208.020 y en el resto de las patentes y publicaciones no
patentadas referidas anteriormente. Los maitansinoides ventajosos
son el maitansinol y los análogos de maitansinol modificados en el
anillo aromático o en otras posiciones de la molécula de
maitansinol, como son diversos ésteres de maitansinol.
Existen numerosos grupos de enlace conocidos en
la técnica que se utilizan para producir conjugados
anticuerpo-maitansinoide, incluyendo, por ejemplo,
los revelados en la Patente estadounidense nº 5.208.020 o en la
Patente europea EP 0 425 235 B1, y en Chari et al. Cancer
Research 52: 127-131 (1992). Los grupos de enlace
incluyen grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos ácidos lábiles,
grupos fotolábiles, grupos lábiles a peptidasa, o grupos hábiles a
esterasa, tal como se revela en las patentes anteriormente
identificadas, siendo ventajosos los grupos disulfuro y
tioéter.
Los conjugados del anticuerpo y el maitansinoide
se pueden obtener utilizando una variedad de agentes bifuncionales
de acoplamiento de proteínas como son el
N-succinimidil-3-(2-piridilditio)
propionato (SPDP), el
succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexan-1-carboxilato,
el iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (como
el dimetil adipimidato HCl), ésteres activos (como el disuccinimidil
suberato), aldehídos (como el glutaraldehído), compuestos
bis-azido (como la
bis(p-azidobenzoil)-hexandiamina),
derivados de bis-diazonio (como el
bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina),
diisocianatos (como el
toluen-2,6-diisocianato), y
compuestos de flúor bis-activos (como el
1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno).
Agentes de acoplamiento que resultan especialmente ventajosos
incluyen el
N-succinimidil-3-(2-piridilditio)
propionato (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J.
173:723-737) y el
N-succinimidil-4-(2-piridiltio)
pentanoato (SPP) para proveer un enlace disulfuro. Ver el Ejemplo 7
más adelante.
El enlace puede acoplarse a la molécula de
maitansinoide en diferentes posiciones, dependiendo del tipo de
enlace. Por ejemplo, un enlace éster se puede formar mediante
reacción con un grupo hidroxilo utilizando técnicas convencionales
de acoplamiento. La reacción se puede producir en la posición
C-3 que presenta un grupo hidroxilo, en la posición
C-14 modificada con hidroximetilo, en la posición
C-15 modificada con un grupo hidroxilo, y en la
posición C-20 que presenta un grupo hidroxilo. En
una realización ventajosa, el enlace se forma en la posición
C-3 del maitansinol o de un análogo de
maitansinol.
Otro inmunoconjugado de interés comprende un
anticuerpo anti-PSCA conjugado con una o más
moléculas de caliqueamicina. Los antibióticos de la familia de las
caliqueamicinas son capaces de producir rupturas en el ADN de
cadena doble a concentraciones subpicomolares. Para la preparación
de conjugados de la familia de las caliqueamicinas, ver las
Patentes estadounidenses n^{os} 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116,
5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001, 5.877.296 (todas de
American Cyanamid Company). Análogos estructurales de
caliqueamicina que se pueden utilizar incluyen, pero no están
limitados a, \gamma_{1}^{I}, \alpha_{2}^{I},
\alpha_{3}^{I},
N-acetil-\gamma_{1}^{I}, PSAG
y \theta_{1}^{I} (Hinman et al. Cancer Research 53:
3336-3342 (1993), Lode et al. Cancer Research
58: 2925-2928 (1998) y las patentes estadounidenses
anteriormente mencionadas de American Cyanamid). Otro fármaco
antitumoral al que se puede conjugar el anticuerpo es QFA, que es
un antifolato. Tanto la caliqueamicina como el QFA presentan sitios
de acción intracelulares y no atraviesan realmente la membrana
plasmática. En consecuencia, la absorción celular de estos agentes
mediante internalización mediada por anticuerpo mejora enormemente
sus efectos citotóxicos.
Otros agentes antitumorales que se pueden
conjugar con los anticuerpos anti-PSCA de la
invención incluyen BCNU, estreptozoicina, vincristina y
5-fluorouracil, la familia de agentes conocidos
colectivamente como el complejo LL-E33288 descrito
en las Patentes estadounidenses n^{os} 5.053.394, 5.770.710, así
como las esperamicinas (Patente estadounidense nº 5.877.296).
Las toxinas enzimáticamente activas y los
fragmentos de ellas que se pueden utilizar incluyen la cadena A de
difteria, fragmentos no enlazantes activos de la toxina de la
difteria, la cadena A de exotoxina (de Pseudomonas
aeruginosa), la cadena A de ricina, la cadena A de abrina, la
cadena A de modecina, la alfa-sarcina, proteínas de
Aleurites fordi, proteínas de diantina, proteínas de
Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S),
el inhibidor de Momordica charantia, la curcina, la crotina,
el inhibidor de Saponaria officinalis, la gelonina, la
mitogellina, la restrictocina, la fenomi-
cina, la enomicina y los tricotecenos. Ver, por ejemplo, la patente WO 93/21232 publicada el 28 de octubre de 1993.
cina, la enomicina y los tricotecenos. Ver, por ejemplo, la patente WO 93/21232 publicada el 28 de octubre de 1993.
La presente invención contempla además un
inmunoconjugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con
actividad nucleolítica (por ejemplo, una ribonucleasa o una ADN
endonucleasa como una desoxiribonucleasa; ADNasa).
Para la destrucción selectiva del tumor, el
anticuerpo puede comprender un átomo altamente radioactivo. Para la
producción de anticuerpos anti-PSCA radioconjugados
se dispone de una variedad de isótopos radioactivos. Ejemplos de
ello incluyen At^{211}, I^{131}, I^{125}, Y^{90},
Re^{186}, Re^{188}, Sm^{153}, Bi^{212}, P^{32},
Pb^{212} y los isótopos radioactivos de Lu. Cuando el conjugado se
usa para el diagnóstico, puede comprender un átomo radioactivo que
permita realizar estudios gammagráficos, por ejemplo, Tc^{99m} o
I^{123}, o un marcador de espín para imagen por resonancia
magnética nuclear (RMN) (también conocida como imagen por
resonancia magnética, IRM), como iodo-123
nuevamente, iodo-131, indio-111,
flúor-19, carbono-13,
nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio,
manganeso o hierro.
El radiomarcador u otro marcador se pueden
incorporar al conjugado mediante procedimientos conocidos. Por
ejemplo, el péptido se puede biosintetizar o se puede sintetizar
mediante síntesis química de aminoácidos usando los adecuados
precursores de aminoácidos que incorporen, por ejemplo,
flúor-19 en lugar de hidrógeno. Marcadores como
Tc^{99m} o I^{123}, Re^{186}, Re^{188} e In^{111} se
pueden unir al péptido a través de un residuo de cisteína. El
itrio-90 se puede unir a través de un residuo de
lisina. El procedimiento IODOGEN (Fraker et al (1978)
Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57) se puede
utilizar para incorporar iodo-123. "Monoclonal
Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989)
describe otros procedimientos de forma detallada.
Los conjugados del anticuerpo y el agente
citotóxico se pueden obtener utilizando una variedad de agentes
bifuncionales de acoplamiento de proteínas como son el
N-succinimidil-3-(2-piridilditio)
propionato (SPDP), el
succinimidil-4-(N-maleimidometil)
ciclohexan-1-carboxilato, el
iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (como el
dimetil adipimidato HCl), ésteres activos (como el disuccinimidil
suberato), aldehídos (como el glutaraldehído), compuestos
bis-azido (como la
bis(p-azidobenzoil)-hexandiamina),
derivados de bis-diazonio (como el
bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina),
diisocianatos (como el
toluen-2,6-diisocianato), y
compuestos de flúor bis-activos (como el
1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno).
Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina se puede preparar según se
describe en Vitetta et al. Science 238: 1098 (1987). El ácido
1-isotiocianatobencil-3-metildietileno
triamino-pentaacético (MX-DTPA)
marcado con carbono-14 es un ejemplo de agente
quelante para la conjugación del radionucleótido del anticuerpo.
Ver la patente WO 94/11026. El enlace puede ser un "enlace
desconectable" que facilite la liberación del fármaco citotóxico
en el interior de la célula. Por ejemplo, se puede usar un enlace
lábil a ácidos, un enlace sensible a peptidasa, un enlace disulfuro
o un enlace que contenga disulfuro (Chari et al. Cancer
Research 52: 127-131 (1992); Patente estadounidense
nº 5.208.020).
Alternativamente, se puede obtener una proteína
de fusión que comprenda el anticuerpo anti-PSCA y el
agente citotóxico, por ejemplo, mediante técnicas recombinantes o
de síntesis de péptidos. La longitud del ADN puede comprender
regiones que codifiquen respectivamente las dos porciones del
conjugado que sean adyacentes entre sí o que estén separadas por
una región que codifique un enlace peptídico que no destruya las
propiedades deseadas para el conjugado.
En otra realización más, el anticuerpo se puede
conjugar con un "receptor" (como estreptavidina) para
utilizarse en la fase previa de focalización al tumor, en donde el
conjugado anticuerpo-receptor se administra al
paciente, seguido de retirada de la circulación del conjugado no
enlazado usando un agente clarificante y posterior administración
de un "ligando" (por ejemplo, avidina) que se conjugue con el
agente citotóxico (por ejemplo, un radionucleótido).
Los anticuerpos de la presente invención también
se pueden utilizar en terapia ADEPT mediante la conjugación del
anticuerpo con una enzima activadora del profármaco que convierte el
profármaco (por ejemplo, un agente peptídico quimioterapéutico, ver
WO 81/01145) en un fármaco anti-cancerígeno activo.
Ver, por ejemplo, WO 88/07378 y la Patente estadounidense nº
4.975.278.
El componente enzimático del inmunoconjugado que
resulta útil para ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar en
un profármaco de forma que lo convierta en su forma citotóxica más
activa.
Las enzimas que resultan de utilidad en el
procedimiento de esta invención incluyen, pero no están limitados
a, la fosfatasa alcalina de utilidad para convertir los profármacos
que contienen fosfato en fármacos libres; la arilsulfatasa de
utilidad para convertir los profármacos que contienen sulfato en
fármacos libres; la citosina desaminasa de utilidad para convertir
la 5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco
anti-cancerígeno, 5-fluorouracil;
proteasas, como la proteasa de Serratia, la termolisina, la
subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (como las catepsinas B
y L), que resultan de utilidad para convertir los profármacos que
contienen péptidos en fármacos libres; las
D-alanilcarboxipeptidasas, de utilidad para
convertir los profármacos que contienen sustituyentes de
D-aminoácidos; las enzimas que liberan carbohidratos
como la \beta-galactosidasa y la neuraminidasa de
utilidad para convertir los profármacos glicosilados en fármacos
libres; la \beta-lactamasa de utilidad para
convertir fármacos derivatizados con
\beta-lactamas en fármacos libres; y las
penicilina amidasas, como la penicilina V amidasa o la penicilina G
amidasa, de utilidad para convertir fármacos derivatizados en sus
nitrógenos amino con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo,
respectivamente, en los fármacos libres. Alternativamente, los
anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la
técnica como "abzimas", se pueden utilizar para convertir los
profármacos de la invención en fármacos activos libres (ver, por
ejemplo, Massey, Nature 328: 457-458 (1987)). Los
conjugados anticuerpo-abzima se pueden preparar
según se describe aquí para suministrar la abzima a una población
de células tumorales.
Las enzimas de esta invención se pueden unir de
forma covalente a los anticuerpos anti-PSCA mediante
técnicas bien conocidas en la técnica como el uso de los reactivos
de entrecruzamiento heterobifuncionales discutidos más arriba.
Alternativamente, las proteínas de fusión que comprendan al menos la
región de unión a antígeno del anticuerpo de la invención que estén
unidas a, al menos, una porción funcionalmente activa de una enzima
de la invención se pueden construir utilizando técnicas de ADN
recombinante bien conocidas en la técnica (ver, por ejemplo,
Neuberger et al., Nature, 312: 604-608
(1984).
Aquí se contemplan otras modificaciones del
anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo se puede unir a uno de los
diversos polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilenglicol,
polipropilengilcol, polioxialquilenos, o copolímeros de
polietilenglicol o polipropilengilcol. El anticuerpo también puede
atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante
técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial (por
ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y
microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente), en
sistemas coloidales de suministro de fármacos (por ejemplo,
liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones,
nanopartículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones. Dichas
técnicas se revelan en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª
edición, Oslo, A., Ed., (1980).
Los anticuerpos anti-PSCA aquí
revelados también se pueden formular como inmunoliposomas. Un
"liposoma" es una pequeña vesícula compuesta por varios tipos
de lípidos, fosfolípidos y/o surfactantes que resulta de utilidad
para el suministro de un fármaco a un mamífero. Los componentes del
liposoma se disponen comúnmente en una formación bicapa, similar a
la disposición lipídica de las membranas biológicas. Los liposomas
que contienen el anticuerpo se preparan mediante procedimientos
conocidos en la técnica, como el descrito por Epstein et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et
al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); en las Patentes
estadounidenses n^{os} 4.485.045 y 4.544.545; y en WO 97/38731
publicada el 23 de octubre de 1997. Los liposomas con un mejorado
tiempo de circulación se revelan en la Patente estadounidense nº
5.013.556.
Liposomas especialmente útiles se pueden generar
mediante el procedimiento de evaporación en fase reversa con una
composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y
fosfatidiletanolamina con PEG derivatizado
(PEG-PE). Los liposomas son extruídos a través de
filtros de un tamaño de poro definido para obtener liposomas con el
diámetro necesario. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la
presente invención se pueden conjugar con los liposomas, según se
describe en Martin et al. J. Biol. Chem. 257:
286-288 (1982) a través de una reacción de
intercambio de disulfuro. El liposoma contiene opcionalmente un
agente quimioterapéutico. Ver Gabizon et al. J. National
Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989).
La invención también provee ácidos nucléicos
aislados que codifican el anticuerpo anti-PSCA
humanizado, vectores y células huésped que comprenden el ácido
nucléico, y técnicas recombinantes para la producción del
anticuerpo.
Para la producción recombinante del anticuerpo,
el ácido nucléico que lo codifica se aísla e inserta en un vector
replicable para su posterior clonación (amplificación del ADN) o
para expresión. El ADN que codifica el anticuerpo monoclonal se
aísla y secuencia de manera sencilla utilizando procedimientos
convencionales (por ejemplo, utilizando sondas oligonucleótidas que
sean capaces de unirse específicamente a los genes que codifican
las cadenas pesada y ligera del anticuerpo). Existen numerosos
vectores disponibles. En general, los componentes del vector
incluyen, pero no están limitados a, uno o más de los siguientes:
una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes
marcadores, un elemento intensificador, un promotor, y una
secuencia de terminación de la transcripción.
El anticuerpo anti-PSCA de esta
invención se puede producir de forma recombinante no sólo
directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un
polipéptido heterólogo, que es ventajosamente una secuencia de
señal u otro polipéptido que presente un sitio de liberación
específico en el extremo N-terminal de la proteína
o polipéptido maduro. La secuencia de señal heteróloga seleccionada
será ventajosamente aquella que sea reconocida y procesada (es
decir, liberada por una peptidasa de señal) por la célula huésped.
En el caso de células huésped procariotas que no reconozcan y
procesen la secuencia nativa de señal del anticuerpo
anti-PSCA, la secuencia de señal se sustituye por
una secuencia de señal procariota seleccionada, por ejemplo, del
grupo de la fosfatasa alcalina, la penicilasa, lpp o líderes
termoestables de enterotoxina II. Para la secreción en levaduras,
la secuencia de señal nativa se puede sustituir por, por ejemplo, el
líder de invertasa de levadura, líder del factor \alpha
(incluyendo los líderes de factor \alpha de Saccharomyces y
Kluyveromyces), o el líder de la fosfatasa ácida, el líder
de glucoamilasa de C. albicans, o la señal descrita en WO
90/13646. En la expresión de células de mamífero, se dispone de
secuencias de señal de mamíferos, así como de líderes secretores
virales, por ejemplo, la señal gD del virus del herpes simplex.
El ADN de dicha región precursora está unido en
el marco de lectura al ADN que codifica el anticuerpo
anti-PSCA.
Tanto los vectores de expresión como los de
clonación contienen una secuencia de ácido nucléico que permite que
el vector se replique en una o más de las células huésped
seleccionadas. En general, en los vectores de clonación, esta
secuencia es tal que permite que el vector se replique
independientemente del ADN cromosómico huésped, e incluye los
orígenes de replicación o las secuencias autónomamente replicantes.
Dichas secuencias son bien conocidas en una variedad de bacterias,
levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es
adecuado para la mayoría de las bacterias
Gram-negativas, el origen del plásmido 2 \mu es
adecuado para levaduras, y diversos orígenes virales (SV40,
polioma, adenovirus, VSV o BPV) resultan útiles para los vectores
de clonación de las células de mamíferos. En general, el componente
del origen de replicación no es necesario en los vectores de
expresión de mamíferos (el origen SV40 se puede utilizar normalmente
únicamente porque contiene el promotor temprano).
Los vectores de expresión y de clonación pueden
contener un gen de selección, también denominado marcador
seleccionable. Los genes de selección estándares codifican proteínas
que (a) confieren resistencia a antibióticos y otras toxinas, por
ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b)
complementan las deficiencias auxotróficas, o (c) suministran
nutrientes críticos no disponibles en los medios complejos como, por
ejemplo, el gen que codifica D-alanina racemasa
para Bacilli.
Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un
fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Dichas
células, que se transforman satisfactoriamente con un gen
heterólogo, producen una proteína que confiere resistencia al
fármaco y, por tanto, sobreviven al régimen de selección. Ejemplos
de dicha selección dominante utilizan los fármacos neomicina, ácido
micofenólico e higromicina.
Otro ejemplo de marcadores seleccionables
adecuados para células de mamífero son aquellos que permiten la
identificación de células que compiten por la absorción del ácido
nucléico del anticuerpo anti-PSCA, como DHFR,
timidinquinasa, metalotioneína-I y -II,
ventajosamente genes de metalotioneína de primates,
adenosindesaminasa, ornitin-descarboxilasa,
etc.
Por ejemplo, las células transformadas con el
gen de selección DHFR se identifican inicialmente cultivando todos
los transformantes en un medio que cultivo que contenga metotrexato
(Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. Una célula huésped
apropiada cuando se emplea DHFR de tipo natural es la línea de
células de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad
DHFR (por ejemplo, ATCC CRL-9096).
Alternativamente, las células huésped
(especialmente los huéspedes de tipo natural que contienen DHFR
endógeno) transformadas o cotransformadas con secuencias de ADN que
codifican el anticuerpo anti-PSCA, la proteína DHFR
de tipo natural y otros marcadores seleccionables como la
aminoglicósido 3'-fosfotransferasa (APH), se pueden
seleccionar mediante crecimiento celular en un medio que contenga un
agente de selección para el marcador seleccionable como un
antibiótico aminoglicosídico, por ejemplo, kanamicina, neomicina o
G418. Ver la Patente estadounidense nº 4.965.199.
Un gen de selección adecuado para su utilización
en levaduras es el gen trp1 presente en el plásmido de
levadura YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)). El
gen trp1 provee un marcador de selección para una cepa
mutante de levadura que no presenta la capacidad de crecer en
triptófano, por ejemplo, ATCC nº 44076 o PEP4-1
(Jones, Genetics, 85:12 (1977)). La presencia de la lesión
trp1 en el genoma de la célula huésped de levadura provee
entonces un entorno efectivo para detectar la transformación
mediante crecimiento en ausencia de triptófano. De forma similar,
las cepas de levadura deficientes en Leu2 (ATCC 20.622 ó
38.626) son complementadas por plásmidos conocidos que portan en gen
Leu2.
Además, se pueden utilizar vectores derivados
del plásmido circular de 1.6 \mum pKDl para transformar las
levaduras Kluyveromyces. Alternativamente, se ha publicado un
sistema de expresión para la producción a gran escala de quimosina
bovina recombinante para K. lactis (Van den Berg,
Bio/Technology, 8:135 (1990)). También se han revelado vectores de
expresión estable multicopia para la secreción de albúmina sérica
humana recombinante por parte de cepas industriales de
Kluyveromyces (Fleer et al., Bio/Technology,
9:968-975 (1991)).
Los vectores de expresión y de clonación
contener normalmente un promotor, que es reconocido por el
organismo huésped y que va unido de forma operativa al ácido
nucléico del anticuerpo anti-PSCA. Los promotores
adecuados para utilizarse con huéspedes procariotas incluyen el
promotor phoA, sistemas de promotores de
\beta-lactamasa y lactosa, promotor de fosfatasa
alcalina, un sistema promotor de triptófano (Trp), y promotores
híbridos como el promotor tac. No obstante, otros promotores
bacterianos conocidos también son adecuados. Los promotores para
uso en sistemas bacterianos contendrán además una secuencia
Shine-Dalgarno (S.D.) unida de forma operativa al
ADN que codifica el anticuerpo anti-PSCA.
Las secuencias promotoras son conocidas para
eucariotas. Teóricamente, todos los genes eucariotas presentan una
región rica en AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases corriente
arriba desde el sitio en el que se inicia la transcripción. Otra
secuencia encontrada 70 a 80 bases corriente arriba desde el sitio
en el que se inicia la transcripción de numerosos genes es una
región CNCAAT en donde N puede ser cualquier nucleótido. En el
extremo 3' de la mayoría de los genes eucariotas hay una secuencia
AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola poliA al
extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias se
insertan de forma adecuada en vectores de expresión eucariotas.
Ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para
uso con huéspedes de levadura incluyen los promotores para
3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas
glicolíticas, como enolasa,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa,
fosfofructoquinasa,
glucosa-6-fosfato isomerasa,
3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa,
triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucoquinasa.
Otros promotores de levadura, que son promotores
inducibles que presentan la ventaja adicional de que la
transcripción se realiza de forma controlada por las condiciones de
crecimiento, son las regiones promotoras para la alcohol
deshidrogenasa 2, el isocitocromo C, la fosfatasa ácida, enzimas
degradativas asociadas al metabolismo del nitrógeno, la
metalotioneína, la
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, y las enzimas responsables de la utilización de
maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para
utilizarse en la expresión en levaduras se describen adicionalmente
en la patente EP 0 073 657. Los intensificadores de levaduras
también se usan de forma ventajosa con promotores de levaduras.
\newpage
La transcripción de anticuerpos
anti-PSCA a partir de vectores en células huésped de
mamífero está controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos a
partir de genomas de virus como poliomavirus, virus de la viruela
aviar, adenovirus (como el Adenovirus 2), virus del papiloma bovino,
virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de
la hepatitis B y, más ventajosamente, el virus simio 40 (SV40), a
partir de promotores de mamíferos heterólogos, por ejemplo, el
promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, a partir de
promotores de choque térmico, siempre que dichos promotores sean
compatibles con los sistemas de células huésped.
Los promotores tempranos y tardíos del virus
SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción
SV40 que también contiene el origen de replicación viral SV40. El
promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene
convenientemente como un fragmento de restricción HindIII E. Un
sistema para expresar ADN en huéspedes mamíferos utilizando el
virus del papiloma bovina como un vector se revela en la Patente
estadounidense nº 4.419.446. Una modificación de este sistema de
describe en la Patente estadounidense nº 4.601.978. Ver también
Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982)
acerca de la expresión de ADN de \beta-interferón
humano en células de ratón bajo el control de un promotor de
timidina quinasa a partir del virus del herpes simplex.
Alternativamente, la repetición terminal larga del virus del sarcoma
de Rous se puede utilizar como promotor.
La transcripción de un ADN que codifique el
anticuerpo anti-PSCA de esta invención por parte de
eucariotas superiores se ve incrementada con frecuencia por la
inserción de una secuencia intensificadora en el vector. En la
actualidad, se conocen numerosas secuencias intensificadoras para
genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina,
\alpha-fetoproteína e insulina). No obstante,
normalmente se utilizará un intensificador procedente de un virus
de célula eucariota. Ejemplos de ello incluyen el intensificador de
SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pares de bases
100-270), el intensificador del promotor temprano
del citomegalovirus, el intensificador de polioma en el lado tardío
del origen de replicación, y los intensificadores de adenovirus.
Ver también Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) acerca de
los elementos intensificadores para la activación de promotores
eucariotas. El intensificador se puede unir al vector en una
posición 5' ó 3' con respecto a la secuencia que codifica el
anticuerpo anti-PSCA, pero está ventajosamente
situado en un sitio 5' del promotor.
Los vectores de expresión utilizados en células
eucariotas (células de levadura, hongo, insecto, planta, animal,
humano o células nucleadas de otros organismos multicelulares)
también contendrán las secuencias necesarias para terminar la
transcripción y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias están
comúnmente disponibles a partir de regiones no traducidas 5', y
ocasionalmente 3', de ADN o ADNc eucariotas o virales. Estas
regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como
fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que
codifica el anticuerpo anti-PSCA. Un componente de
terminación de la transcripción que resulta de utilidad es la
región de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina. Ver
WO 94/11026 y el vector de expresión en ella revelado.
Las células huésped adecuadas para clonar o
expresar el ADN en los vectores de la presente invención son las
células procariotas, de levadura, o de eucariotas superiores
anteriormente descritas. Los procariotas adecuados para este
propósito incluyen eubacterias, como los organismos
Gram-negativos o Gram-positivos, por
ejemplo, Enterobacterias como Escherichia, por ejemplo,
E. coli, Enterobacter, Erwinia,
Klebsiella, Proteus; Salmonella, por ejemplo,
Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo,
Serratia marcescans y Shigella, así como Bacilos como
B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo,
B. licheniformis 41P revelada en DD 266.710 publicada el 12
de abril de 1989), Pseudomonas como P. aeruginosa, y
Streptomyces. Un huésped de clonación E. coli
ventajoso es E. coli 294 (ATCC 31.446), aunque otras cepas
como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537), y E.
coli W3110 (ATCC 27.325) son adecuadas. Estos ejemplos son más
ilustrativos que limitantes.
El anticuerpo de cadena completa, los fragmentos
de anticuerpo y las proteínas de fusión al anticuerpo se pueden
producir en bacterias, especialmente cuando no se requiere
glicosilación ni función efectora Fc, como cuando el anticuerpo
terapéutico se conjuga con un agente citotóxico (por ejemplo, una
toxina) y el inmunoconjugado muestra por sí mismo una cierta
efectividad en la destrucción de las células tumorales. Los
anticuerpos de cadena completa poseen una mayor vida media en
circulación. La producción en E. coli es más rápida y más
rentable. Para la expresión de fragmentos de anticuerpo y de
polipéptidos en bacterias, ver, por ejemplo, las Patentes
estadounidenses n^{os} 5.648.237 (Carter et. al.),
5.789.199 (Joly et al.) y 5.840.523 (Simmons et al.)
que describen la región de iniciación de la traducción (TIR) y las
secuencias de señal que permiten optimizar la expresión y la
secreción. Tras la expresión, el anticuerpo se aíslan de la pasta de
células de E. coli en una fracción soluble y se pueden
purificar mediante, por ejemplo, una columna de proteína A o G
dependiendo del isotipo. La purificación final se puede llevar a
cabo de forma similar al proceso de purificación del anticuerpo
expresado, por ejemplo, en células CHO.
Además de los procariotas, los microbios
eucariotas como los hongos filamentosos o las levaduras son
huéspedes adecuados de clonación o expresión para vectores que
codifican en anticuerpo anti-PSCA. Saccharomyces
cerevisiae, o levadura de pan común, es la más comúnmente
utilizada de todos los microorganismos huéspedes eucariotas
inferiores. No obstante, existen otros géneros, especies y cepas que
están comúnmente disponibles y que resultan de utilidad para la
presente invención, como Schizosaccharomyces pombe; los
huéspedes Kluyveromyces como, por ejemplo, K. lactis,
K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC
16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC
56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K.
thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (EP
402.226); Pichia pastoris (EP 183.070); Candida;
Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa;
Schwanniomyces como Schwanniomyces
occidentalis; y hongos filamentosos como, por ejemplo,
Neurospora, Penicillium, Tolypocladium y
huéspedes Aspergillus como A. nidulans y A.
niger.
Las células huésped adecuadas para la expresión
del anticuerpo anti-PSCA glicosilado derivan de
organismos multicelulares. Ejemplos de células de invertebrados
incluyen células de plantas e insectos. Se han identificado
numerosas cepas y variantes baculovirales y sus correspondiente
células huésped de insectos permisivos de huéspedes como
Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti
(mosquito), Aedes albopictus (mosquito),
Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), y Bombyx
mori. Una variedad de cepas virales para transfección están
públicamente disponibles, por ejemplo, la variante
L-1 de Autographa californica NPV y la cepa
Bm-5 de Bombyx mori NPV, y dichos
virus se pueden utilizar aquí conforme a la presente invención,
especialmente para la transfección de células de Spodoptera
frugiperda.
Los cultivos de células de plantas de algodón,
maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco también han sido
utilizados como huéspedes.
No obstante, el interés ha sido máximo por las
células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados
en cultivos (cultivos titulares) se ha convertido en un
procedimiento de rutina. Ejemplos de líneas de células huésped de
mamíferos que resultan de utilidad son la línea de células CV1 de
riñón de mono transformadas por SV40 (COS-7, ATCC
CRL 1651); la línea de riñón embrionario humano (células 293 o
células 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión,
Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñón
de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster
chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
77:4216 (1980)); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol.
Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñón de
mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano
(VERO-76, ATCC CRL-1587); células
de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón
canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata Buffalo (BRL
3A, ATCC CRL 1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75);
células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); células de tumor de
mama de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et
al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982));
células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep
G2).
Las células huésped se transforman con los
vectores de expresión o clonación anteriormente descritos para la
producción del anticuerpo anti-PSCA y se cultivan en
medios nutrientes modificados para que resulten apropiados para
inducir a los promotores, seleccionar los transformantes, o
amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.
Las células huésped utilizadas para producir el
anticuerpo anti-PSCA de la invención se pueden
cultivar en una gran variedad de medios. Medios de cultivo
disponibles comercialmente como Ham's F10 (Sigma), Medio Mínimo
Esencial (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y Medio de
Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma) son adecuados para el
cultivo de células huésped. Además, cualquiera de los medios
descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979); Barnes
et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980); en las Patentes
estadounidenses n^{os} 4.767.704, 4.657.866, 4.927.762, 4.560.655
o 5.122.469; en WO 90/03430, WO 87/00195; o en el
re-examen de la Patente estadounidense nº 30.985 se
pueden usar como cultivos celulares para células huésped. Cualquiera
de estos medios se puede complementar según sea necesario con
hormonas y/o otros factores de crecimiento (como insulina,
transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (como
cloruro sódico, calcio, magnesio y fosfato), tampones (como HEPES),
nucleótidos (como adenosina y timidina), antibióticos (como el
fármaco GENTAMYCIN^{TM}), oligoelementos (definidos como
compuestos inorgánicos que suelen presentarse en concentraciones
finales del rango micromolar), y glucosa o una fuente de energía
equivalente. También puede incluirse cualquier otro suplemento
necesario con la concentración apropiada que sea conocido por los
expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo, como la
temperatura, el pH y similares son las empleadas previamente con la
célula huésped seleccionada para su expresión, y resultarán
evidentes para el experto en la técnica.
Cuando se utilizan técnicas recombinantes, el
anticuerpo se puede producir intracelularmente, en el espacio
periplásmico, o se puede secretar directamente al medio. Si el
anticuerpo se produce intracelularmente, en un primer paso se
extraerán los restos de partículas, tanto de células huésped como de
fragmentos lisados, por ejemplo, mediante centrifugación o
ultrafiltración. Carter et al., Bio/Technology
10:163-167 (1992) describen un procedimiento para
el aislamiento de anticuerpos que son secretados al espacio
periplásmico de E. coli. Brevemente, la pasta celular se
descongela en presencia de acetato sódico (pH 3,5), EDTA y
fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) durante aproximadamente 30 min.
Los restos celulares se pueden extraer mediante centrifugación.
Cuando el anticuerpo es secretado al medio, los sobrenadantes de
dichos sistemas de expresión se concentran, generalmente,
utilizando un filtro para concentración de proteínas comercialmente
disponible, por ejemplo, una unidad de ultracentrifugación Amicon o
Millipore Pellicon. En cualquiera de los pasos precedentes se puede
incluir un inhibidor de proteasa como PMSF con el fin de inhibir la
proteolisis y se pueden incluir antibióticos para prevenir el
crecimiento de contaminantes inesperados.
La composición de anticuerpo preparada a partir
de las células se puede purificar usando, por ejemplo,
cromatografía con hidroxiapatita, electroforesis en geles, diálisis,
y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad la
técnica de purificación ventajosa. La idoneidad de la proteína A
como un ligando de afinidad depende de la especie y del isotipo de
cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que esté presente en el
anticuerpo. La proteína A se puede utilizar para purificar
anticuerpos basados en cadenas pesadas \gamma1, \gamma2, o
\gamma4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth.
62:1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para
todos los isotipos de ratón y para \gamma3 humana (Guss et
al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). La matriz a la que se acopla
el ligando de afinidad es muy frecuentemente agarosa, aunque también
existen otras matrices disponibles. Las matrices mecánicamente
estables como el vidrio de poro controlado o el
poli(estirenodivinil)benceno permiten mayores
caudales y menores tiempos de procesamiento que los que se pueden
conseguir con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio
C_{H}3, la resina Bakerbond ABX^{TM} (J. T. Baker, Phillipsburg
(NJ), EE.UU.) resulta de utilidad para la purificación. Dependiendo
del anticuerpo a recuperar, también existen otras técnicas de
purificación de proteínas disponibles, como el fraccionamiento en
una columna de intercambio iónico, la precipitación con etanol, el
HPLC en fase reversa, la cromatografía en sílica, la cromatografía
en heparina SEPHAROSE^{TM}, la cromatografía en una resina de
intercambio aniónico o catiónico (como una columna de ácido
poliaspártico), el cromatoenfoque, SDS-PAGE, y
precipitación con sulfato amónico.
Tras los pasos preliminares de purificación, la
mezcla que comprende el anticuerpo de interés y los contaminantes
se puede someter a una cromatografía de interacción hidrofóbica a pH
bajo utilizando una elución de tampón a un pH de aproximadamente
2,5-4,5, ventajosamente realizado a bajas
concentraciones salinas (por ejemplo, a aproximadamente
0-0,025 M de sal).
Las formulaciones terapéuticas de los
anticuerpos utilizados de conformidad con la presente invención se
preparan para su almacenamiento mezclando un anticuerpo que presente
el grado deseado de pureza con transportadores, excipientes o
estabilizadores opcionales aceptables desde el punto de vista
farmacéutico (Remington's Pharmaceutical Sciences 16ª edición,
Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o de
disoluciones acuosas. Los transportadores, excipientes o
estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las
dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones
como acetato, Tris, fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos;
antioxidantes incluyendo el ácido ascórbico y la metionina;
conservantes (como el cloruro de octadecildimetilbenzil amonio;
cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de
bencetonio; fenol, butil o bencil alcohol; parabenos alquílicos
como el metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol;
3-pentanol; y m-cresol);
polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10
residuos); proteínas, como la albúmina sérica, la gelatina o las
inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como la
polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina,
asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos
y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa, o dextrinas;
agentes quelantes como EDTA; reguladores de isotonicidad como la
trehalosa y el cloruro sódico; azúcares como sucrosa, manitol,
trehalosa o sorbitol; surfactantes como polisorbato; contraiones
formadores de sales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo,
complejos de proteína de Zn); y/o surfactantes no iónicos como
TWEEN^{TM}, PLURONICS^{TM} o polietilenglicol (PEG). El
anticuerpo comprende ventajosamente el anticuerpo a una
concentración entre 5 y 200 mg/ml, ventajosamente entre 10 y 100
mg/ml.
La formulación aquí descrita también puede
contener más de un compuesto activo si resulta necesario para la
indicación específica para la que está siendo tratado,
ventajosamente aquellos con actividades complementarias que no
afecten negativamente al otro. Por ejemplo, además del anticuerpo
anti-PSCA que se internaliza, puede resultar
deseable incluir en una formulación un anticuerpo adicional, por
ejemplo, un segundo anticuerpo anti-PSCA que se una
a un epítopo diferente de PSCA, o un anticuerpo para algún otro
objetivo como un factor de crecimiento que afecte al crecimiento
del cáncer en particular. Alternativamente, o adicionalmente, la
composición puede comprender además un agente quimioterapéutico, un
agente citotóxico, una citoquina, un agente inhibidor del
crecimiento, un agente antihormonal, y/o un protector cardiaco.
Dichas moléculas estarán adecuadamente presentes y se combinarán en
cantidades que resulten efectivas para el objetivo previsto.
Los ingredientes activos también pueden
atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante
técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por
ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y
microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, en
sistemas coloidales de suministro de fármacos (por ejemplo,
liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas
y nanocápsulas), o en macroemulsiones. Dichas técnicas se revelan
en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, Oslo, A., Ed.,
(1980).
Se pueden preparar preparaciones de liberación
sostenida. Algunos ejemplos de preparaciones de liberación
sostenida incluyen las matrices semipermeables de polímeros
hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices se
encuentran en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas
o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida
incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo,
poli(2-hidroxietil-metacrilato),
o poli(vinilalcohol)), poliláctidos (Patente estadounidense
nº 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y
\gamma-\betaetil-L-glutamato,
acetato de etilenvinilo no degradable, copolímeros degradables de
ácido láctico y ácido glicólico como el LUPRON DEPOT^{TM}
(microesferas inyectables compuestas por copolímero de ácido
láctico y ácido glicólico y por acetato de leuprolide) y ácido
poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
Las formulaciones a utilizar para la
administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue
de manera sencilla mediante filtración a través de membranas de
filtración estéril.
Conforme a la presente invención, el anticuerpo
anti-PSCA que se internaliza durante la unión a PSCA
sobre una superficie celular se usa para tratar las células
cancerígenas que expresan PSCA, en particular, de cáncer de vejiga
y próstata, como el cáncer de próstata
andrógeno-independiente o el cáncer de próstata
andrógeno-dependiente, y las metástasis asociadas. A
un paciente se le puede diagnosticar un cáncer de próstata
andrógeno-independiente por el hecho de que ya no
responda más a la terapia anti-andrógenos y el
paciente al que se le diagnostica un cáncer de próstata
andrógeno-dependiente puede ser aquel que responda a
la terapia anti-andrógenos. El cáncer comprenderá
generalmente células que expresen PSCA, de forma que el anticuerpo
anti-PSCA sea capaz de unirse a ellas. Mientras que
el cáncer se puede caracterizar por la sobreexpresión de la
molécula de PSCA, la presente aplicación provee adicionalmente un
procedimiento para tratar cánceres que no se consideren como un
cáncer que sobreexprese PSCA.
Para determinar la expresión de PSCA en el
cáncer, se dispone de diversos ensayos diagnósticos. En una
realización, la sobreexpresión de PSCA se puede analizar mediante
inmunohistoquímica (IHC). Las secciones de tejido embebidas en
parafina de una biopsia de tumor se pueden someter a un ensayo IHC y
los criterios de intensidad de tinción de la proteína PSCA se
pueden acordar como:
Puntuación 0 correspondiente a la ausencia de
tinción o a una tinción de membrana observada en menos del 10% de
las células tumorales.
Puntuación 1+ correspondiente a una tinción de
membrana ligera/apenas perceptible detectada en más del 10% de las
células tumorales. Las células sólo se tiñen en parte de su
membrana.
Puntuación 2+ correspondiente a una tinción de
membrana completa débil a moderada observada en más del 10% de las
células tumorales.
Puntuación 3+ correspondiente a una tinción de
membrana completa de moderada a fuerte observada en más del 10% de
las células tumorales.
Aquellos tumores que presenten puntuaciones 0 ó
1+ para la expresión de PSCA se pueden caracterizar como no
sobreexpresantes de PSCA, mientras que aquellos tumores con
puntuaciones 2+ ó 3+ se pueden caracterizar como sobreexpresantes
de PSCA.
Alternativamente, o adicionalmente, se pueden
llevar a cabo ensayos FISH como el INFORM^{TM} (vendido por
Ventana, Arizona, EE.UU.) o PATHVISION^{TM} (Vysis, Illinois,
EE.UU.) en tejido de tumor fijado con formalina y embebido en
parafina para determinar el alcance (si existe) de la sobreexpresión
de PSCA en el tumor.
La sobreexpresión o amplificación de PSCA se
puede evaluar utilizando ensayos diagnósticos in vivo, por
ejemplo, mediante la administración de una molécula (como un
anticuerpo) que se una a la molécula a detectar y que esté marcada
con un marcador detectable (por ejemplo, un isótopo radioactivo o un
marcador fluorescente) y realizando en barrido externo del paciente
para localizar el marcador.
Actualmente, dependiendo de la fase en la que se
encuentre el cáncer, el tratamiento del cáncer de próstata implica
una o una combinación de las siguientes terapias: cirugía para
extirpar el tejido canceroso, radioterapia, deprivación de
andrógenos (p.ej., terapia hormonal) y quimioterapia. La terapia con
anticuerpos anti-PSCA puede ser especialmente
deseable en pacientes de avanzada edad que no toleren bien la
toxicidad y los efectos secundarios de la quimioterapia, en el caso
de enfermedad metastática en la que la terapia con radiación tenga
una utilidad limitada, y para la gestión del carcinoma prostático
que sea resistente al tratamiento de deprivación de andrógenos. Los
anticuerpos anti-PSCA de la invención que se
internalizan y dirigen contra el tumor resultan de utilidad para
aliviar los cánceres que expresan PSCA, por ejemplo, los cánceres de
próstata y vejiga en el diagnóstico inicial de la enfermedad o
durante una recaída. Para aplicaciones terapéuticas, el anticuerpo
anti-PSCA se puede utilizar solo, o en terapia
combinada con, por ejemplo, hormonas, antiangiogenes, o compuestos
radiomarcados, o con cirugía, crioterapia, y/o radioterapia,
notablemente para cánceres de próstata, y especialmente también
cuando no se alcanzan las células desprendidas. El tratamiento con
anticuerpos anti-PSCA se puede administrar junto
con otras formas de terapia convencional, ya sea de forma
consecutiva, previa o posterior a la terapia convencional. Fármacos
quimioterapéuticos como taxotere® (docetaxel), taxol® (paclitaxel),
estramustina y mitoxantrona se usan en el tratamiento de cáncer de
próstata metastático y hormono-refractario, en
particular, en pacientes de bajo riesgo. En el presente
procedimiento de la invención para el tratamiento o alivio del
cáncer, en particular, del cáncer de próstata
andrógeno-independiente y/o metastático, al paciente
con cáncer se le puede administrar el anticuerpo
anti-PSCA además del tratamiento con uno o más de
los agentes quimioterapéuticos precedentes. En particular, se
contempla la terapia combinada con paclitaxel y con derivados
modificados (ver, por ejemplo, EP 0600517). El anticuerpo
anti-PSCA se administrará con una dosificación
terapéuticamente efectiva del agente quimioterapéutico. En otra
realización, el anticuerpo anti-PSCA se administrará
junto con quimioterapia para mejorar la actividad y la eficacia del
agente quimioterapéutico, por ejemplo, paclitaxel. La guía de
referencia médica Physicians' Desk Reference (PDR) revela las
dosificaciones de estos agentes que se han utilizado en el
tratamiento de diversos cánceres. El régimen de posología y las
dosificaciones de los fármacos quimioterapéuticos anteriormente
mencionados que resultan terapéuticamente efectivas dependerá del
cáncer específico que se esté tratando, del alcance de la enfermedad
y de otros factores que resulten familiares para el médico experto
en la técnica y que puedan ser determinados por el médico.
En una realización en particular, al paciente se
le administra un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo
anti-PSCA conjugado con un agente citotóxico.
Ventajosamente, el inmunoconjugado unido a la proteína PSCA es
internalizado por la célula, con el consiguiente aumento de la
eficacia terapéutica del inmunoconjugado para matar las células
cancerígenas a las que se une. En una realización ventajosa, el
agente citotóxico se dirige a o interfiere con el ácido nucléico en
la célula cancerígena. Ejemplos de dichos agentes citotóxicos se
describen arriba e incluyen maitansinoides, caliqueamicinas,
ribonucleasas y ADN endonucleasas.
Los anticuerpos anti-PSCA o
inmunoconjugados se administran a un paciente humano, conforme a
procedimientos conocidos, como la administración intravenosa, por
ejemplo, como un bolo o mediante infusión continua durante un
cierto periodo de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal,
intracerobroespinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial,
intratecal, oral, tópica, o por inhalación. La administración
intravenosa o subcutánea del anticuerpo resulta ventajosa.
Otros regímenes terapéuticos se pueden combinar
con la administración del anticuerpo anti-PSCA. La
administración combinada incluye coadministración, utilizando
formulaciones independientes o una única formulación farmacéutica,
y la administración consecutiva en cualquier orden, en donde
ventajosamente existirá un periodo de tiempo hasta que ambos (o
todos los) agentes activos ejerzan simultáneamente sus actividades
biológicas. Ventajosamente, dicha terapia generará un efecto
terapéutico sinérgico.
También puede resultar deseable combinar la
administración del anticuerpo o anticuerpos
anti-PSCA con la administración de un anticuerpo
dirigido contra otro antígeno del tumor asociado al cáncer
específico.
En otra realización, el procedimiento de la
presente invención para el tratamiento terapéutico con anticuerpo
conlleva la administración combinada de un anticuerpo (o
anticuerpos) anti-PSCA y de uno o más agentes
quimioterapéuticos o agentes inhibidores del crecimiento, incluyendo
la coadministración de cócteles de diferentes agentes
quimioterapéuticos. Los agentes quimioterapéuticos incluyen
estramustina fosfato, prednimustina, cisplatina,
5-fluorouracilo, melfalán, ciclofosfamida,
hidroxiurea e hidroxiureataxanos (como paclitaxel y doxetaxel) y/o
antibióticos de antraciclina. La preparación y los esquemas
posológicos para dichos agentes quimioterapéuticos se pueden
utilizar conforme a las instrucciones del fabricante o según
determine empíricamente el practicante experto en la técnica. La
preparación y los esquemas posológicos para dicha quimioterapia
también se describen en Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry,
Williams & Wilkins, Baltimore (MD), EE.UU. (1992).
El anticuerpo se puede combinar con un compuesto
anti-hormonal; por ejemplo, un compuesto
anti-estrógeno como el tamoxifeno; una
anti-progesterona como la onapristona (ver EP 616
812); o un anti-andrógeno como la flutamida, en
dosificaciones conocidas para otras moléculas. Allí donde el cáncer
a tratar sea un cáncer andrógeno-independiente, el
paciente puede haber sido sometido previamente a una terapia
anti-andrógenos y, el anticuerpo
anti-PSCA (y opcionalmente otros agentes según se
describe aquí) podrá administrarse al paciente después de que el
cáncer se convierta en andrógeno-independiente.
En ocasiones, puede resultar beneficioso
coadministrar también al paciente un protector cardiaco (para
prevenir o reducir la disfunción miocárdica asociada a la terapia) o
una o más citoquinas. Además de los regímenes terapéuticos
anteriores, el paciente puede someterse a extracción quirúrgica de
las células cancerígenas y/o a terapia de radiación, de forma
previa, simultánea o posterior a la terapia con anticuerpos. Las
dosificaciones adecuadas para cualquiera de los anteriores agentes
coadministrados son aquellas que se utilizan actualmente y pueden
reducirse debido a la acción combinada (sinergia) del agente y el
anticuerpo anti-PSCA:
Para prevenir o tratar la enfermedad, la
dosificación y el modo de administración serán elegidos por el
médico conforme a criterios conocidos. La adecuada dosificación del
anticuerpo dependerá del tipo de enfermedad a tratar, según se ha
definido anteriormente, de la gravedad y del transcurso de la
enfermedad, de si el anticuerpo se administra con fines preventivos
o terapéuticos, antes de la terapia, del historial clínico del
paciente y la respuesta al anticuerpo, y de la discreción del
médico que lo atienda. El anticuerpo se administra de forma
adecuada al paciente de una sola vez o durante una serie de
tratamientos. Ventajosamente, el anticuerpo se administra por
infusión intravenosa o por inyecciones subcutáneas. Dependiendo del
tipo y de la gravedad de la enfermedad, una dosificación candidata
inicial para ser administrada al paciente puede ser de
aproximadamente 1 \mug/kg a aproximadamente 50 mg/kg de peso
corporal (por ejemplo, aproximadamente 0,1-15
mg/kg/dosis) de anticuerpo, ya sea, por ejemplo, en una o más
administraciones independientes, o mediante infusión continua. Un
régimen de dosificación puede comprender la administración de una
dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguida de una
dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 2 mg/kg de
anticuerpo anti-PSCA. No obstante, otros regímenes
de dosificación pueden resultar de utilidad. Una dosificación diaria
típica puede variar entre aproximadamente 1 \mug/kg y 100 mg/kg o
más, dependiendo de los factores anteriormente mencionados. Para
administraciones repetidas a lo largo de varios días o durante un
periodo de tiempo mayor, dependiendo del estado del paciente, el
tratamiento se mantendrá hasta que se produzca la deseada supresión
de los síntomas de la enfermedad. El progreso de esta terapia se
puede monitorizar de manera sencilla mediante procedimientos y
ensayos convencionales y se basa en criterios conocidos por el
médico o por otras personas expertas en la técnica.
Además de la administración al paciente de la
proteína del anticuerpo, la presente aplicación contempla la
administración del anticuerpo mediante terapia génica. Dicha
administración del ácido nucléico que codifica el anticuerpo va
acompañada de la expresión "administrar una cantidad
terapéuticamente efectiva de un anticuerpo". Ver, por ejemplo,
la patente WO 96/07321 publicada el 14 de marzo de 1996 relativa al
uso de la terapia génica para generar anticuerpos
intracelulares.
Existen dos grandes aproximaciones para que el
ácido nucléico (opcionalmente contenido en un vector) llegue a las
células del paciente: in vivo y ex vivo. Para el
suministro in vivo, el ácido nucléico es inyectado
directamente en el paciente, normalmente en el sitio en donde se
requiere el anticuerpo. Para el tratamiento ex vivo, las
células del paciente se extraen, el ácido nucléico se introduce en
dichas células aisladas y las células modificadas se administrar al
paciente de forma directa o, por ejemplo, encapsuladas en membranas
porosas que se implantan en el paciente (ver, por ejemplo, las
Patentes estadounidenses n^{os} 4.892.538 y 5.283.187). Existe
una variedad de técnicas disponibles para la introducción de ácidos
nucléicos en células viables. Las técnicas varían dependiendo de si
el ácido nucléico es transferido a células cultivadas in
vitro, o in vivo en las células del huésped previsto.
Técnicas adecuadas para la transferencia del ácido nucléico a las
células de mamífero incluyen el uso de liposomas, la
electroporación, la microinyección, la fusión celular, el
procedimiento del DEAE-dextrano, el procedimiento de
precipitación con fosfato cálcico, etc. Un vector comúnmente
utilizado para el suministro ex vivo del gen es un vector
retroviral.
Las técnicas de transferencia de ácidos
nucléicos in vivo que resultan ventajosas actualmente
incluyen la transfección con vectores virales (como adenovirus,
virus del Herpes simplex I, o virus adeno-asociado)
y sistemas basados en lípidos (lípidos útiles para la transferencia
mediada por lípidos del gen son DOTMA, DOPE y
DC-Chol, por ejemplo). Para obtener una revisión de
los protocolos de marcado de genes y terapia génica que se conocen
en la actualidad, ver Anderson et al., Science
256:808-813 (1992). Ver también la patente WO
93/25673 y las referencias allí citadas.
Otra realización de la invención es un artículo
de fabricación que contenga materiales útiles para el tratamiento
del cáncer que expresa anti-PSCA, en particular, el
cáncer de próstata y el cáncer de vejiga. El artículo de
fabricación comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto en o
asociado al recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por
ejemplo, botellas, viales, jeringas, etc. Los recipientes pueden
fabricarse a partir de una variedad de materiales como vidrio o
plástico. El recipiente guardará una composición que sea efectiva
para tratar el estado canceroso y puede tener un punto de acceso
estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa con una
solución intravenosa o un vial que contenga un tapón perforable para
una aguja hipodérmica). Al menos un agente activo de la composición
será un anticuerpo anti-PSCA de la invención. La
etiqueta o prospecto indicará que la composición se utiliza para
tratar el cáncer de próstata, el cáncer de próstata
andrógeno-independiente o el cáncer de próstata
andrógeno-dependiente, o el cáncer de vejiga. La
etiqueta o prospecto comprenderá además instrucciones para la
administración de la composición de anticuerpo al paciente con
cáncer. Adicionalmente, el artículo de fabricación podrá comprender
también un segundo recipiente que comprenda un tampón aceptable
desde el punto de vista farmacéutico, como agua bacteriostática para
inyección (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución
de Ringer y solución de dextrosa. También puede incluir otros
materiales deseables desde el punto de vista comercial o del
usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y
jeringas.
También se proveen kits que resultarán de
utilidad para diversos propósitos, por ejemplo, para ensayos de
muerte de células con PSCA, para purificación o inmunoprecipitación
de PSCA presente en las células. Para el aislamiento y la
purificación de PSCA, el kit puede contener un anticuerpo
anti-PSCA acoplado a perlas (por ejemplo, perlas de
sefarosa). Se pueden proporcionar kits que contengan los anticuerpos
para la detección y cuantificación de PSCA in vitro, por
ejemplo, en un ELISA o un Western blot. Al igual que el artículo de
fabricación, el kit comprenderá un recipiente y una etiqueta o
prospecto en o asociado al recipiente. El recipiente guardará una
composición que comprenda al menos un anticuerpo
anti-PSCA de la invención. Se pueden incluir
recipientes adicionales que contengan, por ejemplo, diluyentes o
tampones, anticuerpos control. La etiqueta o prospecto puede
proveer una descripción de la composición, así como instrucciones
para el uso diagnóstico o in vitro previsto.
Las características anteriores y otras
características de la invención se describirán ahora de forma más
específica con referencia a las figuras que lo acompañan y con la
vista puesta en las reivindicaciones. Las realizaciones específicas
que se describen a continuación se proveen con fines ilustrativos y
no pretenden constituir una limitación del alcance de la invención.
Para un experto en la técnica resultará aparente que se pueden
realizar numerosas modificaciones de la presente invención sin con
ello desviarse de las características esenciales de la
invención.
Se describe la preparación y caracterización de
los anticuerpos monoclonales anti-PSCA.
Se generaron hibridomas que producen anticuerpos
monoclonales (Mabs) anti-PSCA murinos y humanos. El
socio de fusión fue la línea de mieloma de ratón P3X63Ag8.653
(Kearney, J.F. et al., J. Immunology
123:1548-1550, 1979).
La Tabla 2A resume las estrategias de
inmunización y muestra la naturaleza del antígeno utilizado para la
inmunización, del adyuvante, la dosificación, la ruta de
administración, el programa de dosificación y el animal huésped
utilizado. La Tabla 2B resume las características del Mabs
anti-PSCA, determinadas mediante diversos ensayos.
Los nombres de los anticuerpos aquí utilizados se derivan de los
3-4 primeros caracteres del clon del hibridoma que
produce el anticuerpo (ver la Tabla 2B). En el nombre del clon, los
3-4 primeros caracteres que aparecen antes del
punto indican el clon parental, seguido del nombre de más subclones
después del primer punto, si existen. Alternativamente, los
anticuerpos anti-PSCA de la presente invención se
nombran también por su número de ascites designado. Excepto en el
caso de que se indique muPSCA, se utilizó PSCA humano (hu) solo o
fusionado a una etiqueta gD (gD-PSCA) o una etiqueta
histidina (his-PSCA). El PSCA humano o murino
expresado en E. Coli se etiquetó con histidina. A menos que
se indique lo contrario, el PSCA expresado en E. coli se
replegó, según se describe a continuación, para la inmunización.
gD-PSCA-CHO se refiere al PSCA
soluble expresado en y purificado de células CHO. Los anticuerpos
preparados a partir de Xenomice (Abgenix, Fremont, California,
EE.UU.) son anticuerpos totalmente humanos.
Para las secuencias de nucleótidos y aminoácidos
de huPSCA, consultar la patente WO 99/14328 (Genentech; proteína
PRO232, secuencia de nucleótidos de la Fig. 1; secuencia de
aminoácidos de la Fig. 2); la Patente estadounidense nº 5.856.136
expedida 5 de enero de 1999 (Incyte; SCAH2 SEQ ID Nº 4); o la Fig. 2
de la página 1737 de Reiter et al. Proc. Nat. Acad. Sci.
95:1735-1740 (1998). Por comodidad, la secuencia de
123 aminoácidos y la secuencia que codifica el ADNc del PSCA se
proporcionan aquí como SEQ ID Nº 1 y SEQ ID Nº 2, respectivamente.
La numeración de las secuencias de aminoácidos aquí citadas será
conforme con la mostrada en SEQ ID Nº 1, que es la misma que la
mostrada en Reiter et al. (1998).
Un vector plasmídico que codifica huPSCA o
gD-PSCA se transfectó en las siguientes células:
células NIH 3T3 que expresan Ras (Ras 3T3); y células CHO; HCT116.
Para la expresión en E. coli, se utilizó la secuencia que
codifica los aminoácidos 10-101 de huPSCA (fusionada
a una etiqueta His), habiendo eliminado la secuencia de anclaje a
GPI. Para la expresión en células 3T3, la secuencia señal
N-terminal (aminoácidos 1-20) de
PSCA se reemplazó por la secuencia señal de la etiqueta gD, seguida
por 25 aminoácidos de la gD madura.
Los anticuerpos anti-PSCA se
analizaron para la unión a PSCA en células mediante separación de
células activada por fluorescencia (FACS). Mediante FACS, se
analizó la unión a la superficie celular del anticuerpo
anti-PSCA murino purificado 6B8.1D7.2B3 (nº 2761) y
del anticuerpo anti-PSCA totalmente humano
10C5.6E4.6D1 (nº 2910) de hibridoma sobrenadante. Las células CHO
estables confluentes adherentes transfectadas con huPSCA con una
etiqueta gD en su extremo N-terminal se lavaron con
PBS y se separaron utilizando una solución de disociación celular
(Sigma). Las células se incubaron con los anticuerpos
anti-PSCA a diversas concentraciones
(1-10 \mug/ml) y se lavaron con PBS antes de la
incubación con un anticuerpo secundario conjugado a FITC. Las
células se resuspendieron en PBS que contenía FBS al 1% o
formaldehído al 1% para la fijación de las células. La unión de los
anticuerpos a la superficie celular se analizó entonces en un
escáner FACS.
Para evaluar la capacidad de los Mabs para
capturar PSCA en solución, se desarrolló un ensayo en el que cada
anticuerpo se cubrió directamente en placas microtiter o se unió a
una IgG anti-ratón específica de la región Fc,
previamente cubierta en la placa. A continuación, se añadió el
antígeno PSCA biotinilado (1 \mug/ml) a la placa antes de la
incubación con estreptavidina-HRP. Se utilizó OPD
como sustrato y las placas se leyeron a 492 nm.
Para verificar la unión del Mab nº 2403 a PSCA
expresado sobre la superficie celular de las células transfectadas,
se llevó a cabo un ensayo de unión de competición en frío utilizando
el Mab nº 2403 marcado con ^{125}I (procedimiento de la
lactoperoxidasa). Las células PC3.gD-PSCA humano
(1x10^{5}) se colocaron en placas con 24 pocillos y se incubaron
en un medio con diferentes concentraciones de Mab 2403 sin marcar y
con una cantidad constante de ^{125}I-Mab 2403
durante 16 horas a 4ºC. El anticuerpo no unido se extrajo y las
células se lavaron en medio helado. Tras la solubilización de las
células en urea 8 M/ácido acético glacial 3 M, la cantidad de
radioactividad unida se determinó utilizando un contador gamma. El
valor de IC_{50} se calculó a partir de un cálculo de ajuste de
cuatro parámetros de la curva, en el que m3 representa la IC_{50}.
Los resultados de este ensayo se representan en la Figura 4.
Para determinar la actividad de unión del
anticuerpo nº 2761 (6B8) se llevó a cabo un ELISA directo. El PSCA
humano y el PSCA murino (muPSCA) se cubrieron durante la noche a
1\mug/ml en una placa microtiter (Nunc). El Mab
anti-PSCA y los controles fueron añadidos a los
pocillos cubiertos con antígeno y se incubaron a temperatura
ambiente. El anticuerpo no unido se eliminó mediante lavado y a los
pocillos se añadió un anticuerpo secundario conjugado con
peroxidasa de rábano picante (HRP), que se incubó con los
anticuerpos a temperatura ambiente. Finalmente, se añadió la
solución de sustrato OPD y se utilizó ácido sulfúrico concentrado
para detener la reacción. La placa se leyó a 492 nm utilizando un
lector de placas microtiter.
Los agrupamientos de epítopos se determinaron
mediante ELISA competitivo. Cada uno de los anticuerpos fue
biotinilizado y se analizó su unión al PSCA cubierto en las placas,
en presencia o en ausencia de un exceso de cada uno de los Mabs
anti-PSCA no marcados. A continuación, se añadió
estreptavidina-HRP a las placas, seguido del
sustrato peroxidasa. La disminución (al menos del 50%) o la ausencia
de unión de los Mabs biotinilizados a PSCA indicó que tanto los
anticuerpos fríos como los anticuerpos biotinilizados se unían al
mismo epítopo (o a un epítopo proximal) en el PSCA.
El siguiente procedimiento ha sido adaptado para
utilizarse en proteínas producidas a partir de fermentaciones de
0,5 a 1 L de E. coli que expresa proteínas marcadas con His.
Resulta fácilmente escalable a cantidades mucho mayores.
La pasta de E. coli de 0,5 a 1 L de
fermentaciones (gránulos de 6-10 g) se resuspendió
en 10 volúmenes (p/v) de tampón guanidina 7 M, Tris 20 mM a pH=8.
Se añadió sulfito sódico sólido y tetrationato sódico para obtener
concentraciones finales de 0,1 M y 0,02 M, respectivamente, y la
solución se agitó durante la noche a 4ºC. Este paso generó una
proteína desnaturalizada con todos los residuos de cisteína
bloqueados por sulfitolización. La solución se centrifugó a 40 Krpm
en una ultracentrífuga Beckman durante 30 minutos. El sobrenadante
se diluyó con 3-5 volúmenes de tampón para columna
de quelato metálico (guanidina 6 M, Tris 20 mM, pH=7,4) y se filtró
a través de filtros de 0,22 micras para clarificarse. Dependiendo de
la expresión de la proteína deseada, 30-50 ml del
extracto clarificado fueron cargados en una columna de quelato
metálico Qiagen Ni-NTA de 5 ml equilibrada con el
tampón para columna de quelato metálico. La columna se lavó con un
tampón adicional que contenía imidazol 50 mM (Calbiochem, grado
Utrol), pH 7,4. La proteína se eluyó con un tampón que contenía
imidazol 250 nM. Las fracciones que contenían la proteína deseada se
reunieron y almacenaron a 4ºC. La concentración de proteína se
determinó a partir de su absorbancia a 280 nm utilizando el
coeficiente de extinción calculado a partir de su secuencia de
aminoácidos.
Normalmente, las proteínas se repliegan mediante
dilución lenta de la muestra en un tampón de replegamiento recién
preparado que consta de: Tris 20 mM a pH=8,6, NaCl 0,3 M, urea 2,5
mM, cisteína 5 mM, glicina 20 mM y EDTA 1 mM. En el caso de PSCA,
se utilizó urea 3,5 M y cisteína 1 mM en lugar de urea 2,5 M y
cisteína 5 mM. Los volúmenes de replegamiento se eligieron de forma
que la concentración final de proteína estuviera entre 50 y 100
microgramos/ml. La solución de replegamiento se agitó suavemente a
4ºC durante 12-36 horas. La reacción de
replegamiento se detuvo mediante la adición de ácido
trifluoroacético (TFA) hasta obtener una concentración final del
0,4% (pH de aproximadamente 3). Antes de llevar a cabo la
purificación adicional de la proteína, la solución se filtró a
través un filtro de 0,22 micras y se añadió acetonitrilo hasta
obtener una concentración final del 2-10%. La
proteína replegada se cromatografió en una columna de fase reversa
Vydac C4 utilizando un tampón móvil de TFA al 0,1% con elución de
un gradiente de acetonitrilo desde un 10% hasta un 80%. Las
alícuotas de las fracciones con absorbancia A280 se analizaron en
geles de poliacrilamida SDS y las fracciones que contenían la
proteína replegada homogénea fueron reunidas. En general, las
especies adecuadamente replegadas de la mayoría de las proteínas se
eluyen a las concentraciones más bajas de acetonitrilo, ya que
dichas especies son las más compactas debido a sus interiores
hidrofóbicos que están protegidos de la interacción con la resina
de fase reversa. Las especies agregadas se eluyen normalmente a
concentraciones de acetonitrilo más altas. Además, para separar las
formas mal plegadas de las proteínas de la forma deseada, el paso de
fase reversa también elimina la endotoxina de las muestras.
Las fracciones que contenían la proteína plegada
deseada se reunieron y el acetonitrilo se eliminó utilizando una
corriente suave de nitrógeno dirigida a la solución. Las proteínas
se formularon normalmente en Hepes 20 mM, pH=6,8 con NaCl 0,14 M y
manitol al 4% mediante diálisis o mediante filtración en gel
utilizando resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas con el
tampón de formulación y filtradas de forma estéril. Ocasionalmente,
las proteínas con puntos isoeléctricos en el rango de pH
6-7,5 se formularían en un tampón de HCl 1 mM, NaCl
0,14 M para mantener la solubilidad. Se extrajeron alícuotas de las
proteínas formuladas, que se congelaron y almacenaron a -80ºC. La
proteína se caracterizó posteriormente mediante geles SDS, análisis
de aminoácidos para la cuantificación de la proteína, evaluado para
los niveles de endotoxina mediante un ensayo de endotoxina,
secuenciación de la proteína N-terminal para
establecer la identidad de la proteína, espectrometría de masas
para establecer la integridad de la proteína y otros procedimientos
analíticos según resulte necesario o deseado.
Los anticuerpos purificados se sometieron a
secuenciación de aminoácidos utilizando los procedimientos
establecidos. Se obtuvo la secuencia N-terminal y, a
partir de ella, se diseñaron los cebadores para la clonación de las
secuencias de la región variable (V) de Ig mediante
RT-PCR. El fragmento de ADN que codifica la región
V_{L} o la región V_{H} se clonó dentro de un vector. La
secuenciación se llevó a cabo utilizando los procedimientos
establecidos, inicialmente con cebadores para el vector. A partir de
la secuencia de nucleótido inicial del anticuerpo que se había
obtenido, se diseñaron los cebadores específicos para la secuencia
del anticuerpo con el fin de obtener la secuencia restante.
Los anticuerpos quiméricos de longitud completa
y los anticuerpos anti-PSCA
ratón-humano Fab cuyas secuencias se muestran en la
Figura 13 se construyeron uniendo las secuencias murinas de los
dominios de la región V_{L} y de la región V_{H} a las
secuencias de C\kappa y C\gamma1 humanas. Los fragmentos de la
región V del anticuerpo murino se clonaron en vectores como casetes
de sitios de restricción que pueden escindirse fácilmente y ligarse
en vectores preconstruidos que contengan las regiones constantes L y
H humanas de diferentes isotipos para expresar los anticuerpos
quiméricos ratón-humano con especificidad para PSCA.
Las cadenas quiméricas Fab se expresaron a partir del vector
denominado vegfchim, derivado del vector pUC119:Ig que es un vector
pRK (descrito en EP 307.247).
La Figura 12 muestra las secuencias de
aminoácidos de los dominios de la región variable de cadena ligera
y pesada (V_{L} y V_{H}) de los anticuerpos de los clones de
hibridoma 6F8.2F4, Asc nº 2395 (SEQ ID Nº 3 y Nº 4); 5F2.4H4.1E3,
Asc nº 2403 (SEQ ID Nº 5 y Nº 6) ; 6B8.1D7.2B3, Asc nº 2761 (SEQ ID
Nº 7 y Nº 8), y de la región V_{H} del anticuerpo del clon
8D11.2E9 (Asc nº 2399 (SEQ ID Nº 9). La Figura 13 muestra las
secuencias de aminoácidos de la IgG 2403 quimérica de longitud total
que incluye las secuencias de péptido señal (la cadena L es SEQ ID
Nº 10; la cadena H es SEQ ID Nº 11) y las secuencias de Fab 6B8
quimérico (la cadena L es SEQ ID Nº 12; la cadena H es SEQ ID Nº
13). El anticuerpo quimérico 2403 se obtuvo fusionando las
secuencias murinas V_{L} y V_{H} del Mab 5F2.4H4.1E3 (nº 2403)
con secuencias C\kappa y C\gamma1 de inmunoglobulina humana,
respectivamente, en el vector de expresión de células de mamíferos,
pRK. La construcción del vector de expresión pRK5 se revela en EP
307.247, publicada el 13 de marzo de 1989. Los vectores pRK que
codifican las cadenas H y L de 2403 quimérico se han depositado en
ATCC como ADN pRK-2403H y ADN
pRK-2403L (ver X más adelante). El dominio V_{H}
de ratón se unió a C\gamma1 humano en el residuo secuencial nº
Pro122 (indicado por / en la secuencia de la Fig. 13). El dominio
V_{L} de ratón se unió a C_{L} humano en el residuo secuencial
nº Arg113. El inserto V_{H} de 2403 se puede escindir de
pRK-2403H como un fragmento
EcoRI-Apal o un fragmento ClaI-ApaI
de 430 pares de bases. El dominio V_{L} de 2403 se clonó en
pRK-2403L como un fragmento
EcoRI-CpoI de un fragmento de 400 pares de bases.
Los vectores pRK que codifican las cadenas H y L de 2761 quimérico
se han depositado en ATCC como ADN pRK-2761H y ADN
pRK-2761L (véase X más adelante). Asimismo, el
dominio V_{L} de 2761 se clonó en pRK-2761L como
un fragmento EcoRI-CpoI de un fragmento de 400
pares de bases. El inserto V_{H} de 2761 se puede escindir de
pRK-2761H como un fragmento
EcoRI-ApaI o un fragmento ClaI-ApaI
de 430 pares de bases.
Las cadenas L y H de 6B8 Fab quimérico se
obtuvieron fusionando las secuencias V_{L} y V_{H} murinas del
Mab 6B8.1D7.2B3 con inmunoglobulina humana C\kappa y con el
dominio C_{H}1 de las secuencias de IgG1, respectivamente, en el
vector denominado vegf4chim, y se expresaron en E. coli. El
vector vegf4chim presenta un marcador seleccionable ampR y las
secuencias de anticuerpo se unieron de forma operativa a y se
expresaron bajo, el promotor fosfatasa alcalina.
Estos casetes de la región V pueden escindirse y
ligarse a los dominios de la región constante de los diferentes
isotipos de inmunoglobulinas humanas para producir quimeras con
diferentes propiedades Fc. Para producir anticuerpos
anti-PSCA que no presenten funciones efectoras tales
como ADCC, actividad de unión a complemento o unión a receptor Fc,
las regiones V_{H} murinas se fusionaron a las secuencias de la
región constante C\gamma2 o C\gamma4 humana.
La Tabla 2B resume las características de los
anticuerpos anti-PSCA, determinadas mediante los
ensayos aquí descritos. En la Tabla 2B, huPSCA-E. coli se
refiere a PSCA marcado con histidina expresado en E. coli;
la proteína se purificó a partir de la bacteria, para replegarse a
continuación según se describió anteriormente; + formalina indica
que las células fijadas a formalina se utilizaron como inmunogenes;
prk5.huPSCA se refiere al ADNc desnudo que transporta el gen huPSCA
en el plásmido pKR5. Xenomice (Abgenix, Fremont, California,
EE.UU.) son ratones que han sido diseñados genéticamente para
reemplazar su locus Ig murino endógeno por el locus de
inmunoglobulina de la línea germinal humana, de forma que fabriquen
anticuerpos humanos. Los anticuerpos humanos para PSCA se obtienen
mediante inmunización de Xenomice con PSCA expresado de E.
coli, intraperitonealmente (i.p.) o vía plantar.
Todos los Mabs anti-PSCA
analizados producían un cambio significativo en la tinción de las
células transfectadas con PSCA, determinada por FACS. La Figura 1
(Mab 5F2) y la Figura 2 (Mab 10C5) muestran resultados
representativos de la tinción. Las células incubadas únicamente con
anticuerpo secundario conjugado a FITC se utilizaron como control
negativo; estas células no mostraron ninguna actividad de unión a
anticuerpo. El Mab anti-gD 1766 gD, utilizado como
control positivo, mostró una unión significativa a células CHO que
expresan gD-huPSCA. El hibridoma sobrenadante que
contiene el Mab 10C5.6E4.6D1 totalmente humano también mostró una
fuerte unión a la superficie celular. El Mab
anti-PSCA 5F2 (nº 2403) se utilizó como un control
positivo en este experimento y como un control negativo en los
medios.
Se analizó la capacidad del Mab 6B8 (nº 2761)
murino para unirse a diversas formas solubles de PSCA inmovilizado
en una placa y los resultados obtenidos se muestran en la Figura 3.
El Mab 6B8 generado contra proteína PSCA desnaturalizada mostró una
afinidad más marcada por el huPSCA replegado que por el huPSCA no
replegado. También se observó que el Mab se unía al antígeno soluble
CHO gD-huPSCA, aunque con una afinidad menor en
comparación con el huPSCA replegado y no replegado. Sin embargo, no
existió unión a un antígeno TGF-\beta irrelevante
ni a PSCA murino, sugiriendo así que el anticuerpo era específico
para PSCA humano.
A partir del ensayo de unión de competición en
frío (ver la Figura 4 y la tabla situada inmediatamente debajo), se
determinó que la afinidad de unión del Mab 2403 era de 12,9 nM.
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Este ejemplo demostró la unión y la localización
de los anticuerpos anti-PSCA 2395 (6F8), 2399
(8D11), 2403 (5F2), 2761 (6B8) [número de ascites seguido por el nº
de anticuerpo entre paréntesis, ver la Tabla 2B] para células
tumorales que expresan PSCA
(MCF-7Her2-gd-PSCA y
HCT-gd-PSCA) in vivo.
Mediante el marcaje de los anticuerpos con colorante fluorescente,
Cy3, resulta posible visualizar la unión del anticuerpo mediante
microscopía de fluorescencia. Esta tecnología fue bien establecida
utilizando Herceptin (anticuerpo monoclonal
anti-Her2) marcado con Cy3 en ratones que presentan
tumores que expresan Her2. La unión in vivo de los
anticuerpos anti-PSCA se evaluó en células tumorales
transfectadas con PSCA unido a gD. Los anticuerpos control incluían
Herceptin marcado con Cy3 como un control positivo para las células
MCF-7Her2-gd-PSCA.
Además, un anticuerpo anti-gd marcado con Cy3, con
muy buena actividad de unión, se utilizó como control positivo para
los anticuerpos PSCA. El PSCA transfectado está unido a gd, de modo
que el nivel de proteína gd está directamente correlacionado con la
expresión de la proteína PSCA. Las líneas celulares no transfectadas
con gd-PSCA se utilizaron como controles
negativos.
negativos.
HCT-116 (ATCC
CCL-247) es una línea celular de tumor de colon
humano; HCT-47 es un clon que expresa PSCA derivado
de la transfección del HCT-116 parental.
MCF-7 (ATCC HTB-22; Soule, D. G.
et al., J. Natl. Cancer Inst., 51:1409-1416,
1973) es una línea celular de tumor de mama humano que se transfectó
previamente con y que expresa Her2 (Benz et al. Breast
Cancer Research and Treatment 24: 85-95 (1992)). PC3
(ATCC CRL-1435) es una línea celular de carcinoma
prostático humano (Kaign et al. Invest. Urol., 17:
16-23, 1979). Estas células se transfectaron con
PSCA humano (huPSCA) o con gD-huPSCA. gD o gd se
refiere a la etiqueta del epítopo D de la glicoproteína del virus
del Herpes Simplex. En la construcción de gD-huPSCA,
la secuencia señal de PSCA se reemplazó por la secuencia que
codifica la etiqueta del epítopo gD; la secuencia de
gD-PSCA se clonó en el vector pRK. La expresión de
Her2 sobre la superficie celular sirvió como un control, ya que el
anticuerpo Her2 (HERCEPTIN®) es conocido por poder localizar las
células tumorales que expresan Her2 in vivo. A partir de
estas transfecciones, se obtuvieron las células tumorales humanas
que expresan PSCA.
Consultar la Tabla 2B para obtener una lista de
los anticuerpos anti-PSCA monoclonales murinos
utilizados en estos experimentos. Los nombres de los anticuerpos se
derivan de los 3-4 primeros caracteres del clon que
produce el anticuerpo. Todos los anticuerpos fueron marcados usando
el colorante monofuncional FluoroLink Cy3 (Amersham Pharmacia,
PA23001) conforme a las instrucciones del fabricante. Para llevar a
cabo la reacción de marcaje, los anticuerpos se disolvieron en
carbonato sódico 0,1 M a pH=9,3 hasta obtener una concentración de
1 mg/ml. Un ml de dicha disolución de anticuerpos se añadió al tubo
que contenía la mezcla de marcaje Cy3, que se mezcló vigorosamente
y se permitió la incubación a temperatura ambiente durante 30
minutos en un agitador. Las muestras se envolvieron en papel de
aluminio para reducir la exposición a la luz. A continuación,
columnas NAP 10 (Amicon) se equilibraron con PBS; cuando la
reacción de conjugación finalizó, se añadió la solución de reacción
a la columna. Se añadieron 1,5 ml de PBS y se recogieron las
diferentes fracciones. Las lecturas del espectrofotómetro se
realizaron a A552 y A280. La concentración de proteína y las
relaciones colorante/proteína se calcularon de la siguiente
manera:
Concentraciones
de AB: {[A280-(0,08 x A552)] x factor de dilución} / 1,4 =
mg/ml
Relación
colorante/proteína: [1,13 x (A552)] / [A280-(0,08 x
A552)]
Tras el marcaje, se comprobó la unión de todos
los anticuerpos mediante análisis FACS (ver la Tabla 2B).
A ratones nude NCR hembras se les implantaron
gránulos de estrógeno y, a continuación, se les inocularon
subcutáneamente 20 millones de células de
MCF-7Her2-gd-PSCA o
20 millones de células de la línea celular MCF-7 no
transfectada como un control negativo. A ratones nude NCR machos se
les inocularon subcutáneamente 5 millones de células
HCT-gd-PSCA. Los tumores se
inyectaron subcutáneamente, que forma que se situaran en el costado
del ratón. Usando un calibrador con lectura digital, el tamaño de
los tumores se midió dos veces por semana hasta que el volumen del
mismo alcanzó los 100 a 500 mm^{3}.
Cuando los tumores alcanzaron un volumen de al
menos 150 mm^{3}, a los ratones se les inyectaron IP 10 mg/kg de
uno de los tres anticuerpos anti-PSCA marcados con
Cy3 (6F2, 8D11, 5F2), un anticuerpo anti-gd marcado
con Cy3 o HERCEPTIN marcado con Cy3. Veinticuatro horas más tarde,
los ratones fueron anestesiados y se les realizó una perfusión de
paraformaldehído al 1%. Se recogieron tejidos del tumor y de otros
órganos, que se congelaron en crioprotector OCT (compuesto
Tissue-Tek O.C.T., Sakura Finetek U.S.A. Inc.,
Torrance CA 90504, EE.UU.) para poder localizar el anticuerpo
mediante microscopía de fluorescencia. Experimentos similares
fueron llevados a cabo con el anticuerpo 6B8 marcado con Cy3.
Las muestras congeladas se cortaron en secciones
de 5 um y se aplicó un medio para montaje fluorescente con DAPI
(Vectastain). EL DAPI tiñe los núcleos y proporciona un
contratinte.
Para confirmar que el marcaje con Cy3 de los
anticuerpos no había afectado negativamente a su capacidad para
unirse al antígeno, la especificidad de unión de los anticuerpos en
células se evaluó mediante análisis FACS. En la Tabla 3,
"cambio" se refiere a un cambio en la población celular cuando
se realiza una determinación de la fluorescencia e indica que los
anticuerpos marcados con Cy3 conservan su capacidad para unirse a su
antígeno específico.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados que se resumen en la Tabla 4
demuestran que los anticuerpos anti-PSCA fueron
capaces de localizar y de unirse específicamente a las células
tumorales que expresan PSCA in vivo. No se detectó tinción
alguna en el pulmón ni en el riñón. La tinción con Cy3 se observó
en el hígado para todos los anticuerpos anti-PSCA,
anti-gd y Herceptin en las que probablemente son las
células Kupffer fagocíticas que más han incorporado el anticuerpo.
Las células no malignas asociadas a los tumores, muy probablemente
macrófagos, también se tiñeron positivamente con Cy3 para todos los
anticuerpos tanto en las líneas celulares transfectadas como en las
no transfectadas. Adicionalmente, también que observó que el
anticuerpo 6B8 localizaba las células tumorales PC3 que expresan
PSCA, pero no las células tumorales PC3 transfectadas al control
in vivo. El patrón de tinción fue principalmente membranoso.
También se observó tinción positiva en los macrófagos del tumor y
adyacentes al tumor.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Este ejemplo describe la capacidad de los
anticuerpos monoclonales anti-PSCA de la invención
para ser internalizados por células que expresen PSCA. Estos
estudios fueron realizados utilizando anticuerpos fluorescentes o
radiomarcados o anticuerpos con aductos de oro. En el caso de los
anticuerpos radiomarcados, se determinó la cantidad de anticuerpo
internalizado en cada línea celular.
Las células transfectadas que expresan
gD-PSCA (células HCT-47 y
PC3-19) y las células MCF7 que expresan PSCA/HER2
(también referidas aquí como células MCF7/PSCA/HER2) se hicieron
crecer sobre cubreobjetos, se incubaron con una serie de
anticuerpos monoclonales anti-PSCA (10 \mug/mL)
durante una hora (hr), se lavaron en PBS, se fijaron en
formaldehído tamponado con PBS al 3%, se permeabilizaron con Triton
al 1% en PBS y se marcaron con IgG anti-ratón
marcada fluorescentemente con Cy3. En los experimentos de control,
se utilizaron células parentales no transfectadas. Las células
inmunomarcadas fueron observadas a través de un microscopio confocal
Molecular Dynamics.
Para la microscopía electrónica, se incubaron
células NIH-3T3 transfectadas que expresan
gD-PSCA a 4ºC durante 1 hr con 25 ug/ml de
anticuerpo anti-gD. En otro grupo de experimentos,
se incubaron células CHO que expresan PSCA a 4ºC con 20 ug/ml de
anticuerpos anti-PSCA 10E3 y 6C3. Tras la incubación
con los anticuerpos primarios, las células fueron tratadas con
aductos de oro de 10 nm de IgG de cabra anti-ratón
durante 1 hr. Las células se pasaron a 37ºC durante 15 minutos y 1
hr antes de fijarse en fijador de Karnovsky, y se procesaron para
analizarse por microscopía electrónica. Secciones finas de las
mismas fueron observadas en un microscopio electrónico Philips CM12
equipado con una cámara GATAN de digitalización.
Para la autorradiografía por microscopía
electrónica, los anticuerpos anti-PSCA 10A1 y 8D11
fueron yodados conforme a las instrucciones del fabricante para
Iodo-Gen. Los anticuerpos anti-PSCA
^{125}I-10A1 e ^{125}I-8D11 se
incubaron durante 15 min, 1 hr y 6 hr con células
gD-PSCA HCT116 (línea de células tumorales de colon
humano transfectadas con gD-PSCA humano, descrita
anteriormente). Tras la incubación, las células se lavaron y
fijaron en formaldehído al 2%, glutaraldehído al 2,5% en tampón
cacodilato 0,1 M a pH 7,2 y se postfijaron en tetróxido de osmio al
1%. Tras la deshidratación y la incorporación a resina epoxi EPONATE
12, se cortaron secciones finas, que se recubrieron con emulsión
Ilford 1.4. Tras la exposición, las secciones se revelaron en
Microdol X, se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo, y
se observaron a través de un microscopio electrónico Philips
CM12.
La internalización del anticuerpo
anti-PSCA 6B8 se estudió mediante microscopía
electrónica utilizando células PC3 que expresan
gD-huPSCA. Los anticuerpos 6B8 fueron yodados
conforme a las instrucciones del fabricante para
Iodo-Gen. Los anticuerpos
^{125}I-6B8 se incubaron durante 15 min y 24 hr
con células PC3.gD-huPSCA clon 4. Tras la
incubación, las células se lavaron y fijaron en formaldehído al 2%,
glutaraldehído al 2,5% en tampón cacodilato 0,1 M a pH 7,2 y se
postfijaron en tetróxido de osmio al 1%. Tras la deshidratación y
la incorporación a resina epoxi EPONATE 12, se cortaron secciones
finas, que se recubrieron con emulsión Ilford 1.4. Tras la
exposición, las secciones se revelaron en Microdol X, se tiñeron con
acetato de uranilo y citrato de plomo, y se observaron a través de
un microscopio electrónico Philips CM12.
Un estudio de internalización en estado de
reposo fue llevado a cabo de la siguiente manera: las células
MCF7/Her2 (Fig. 11, panel derecho) se transfectaron con un vector
único que contenía el marcador seleccionable puromicina (PurR);
esta línea celular sirvió como control negativo para la
internalización de los anticuerpos dirigidos contra PSCA. La línea
celular MCF7/Her2/gD-PSCA se describe en el Ejemplo
2. La células MCF7/Her2 y MCF7/Her2/gD-PSCA se
incubaron durante 5 horas a 37ºC con uno de los siguientes
anticuerpos: anticuerpos monoclonales anti-PSCA
2395, 2399, 2403 marcados con ^{125}I a una concentración de 22 nM
y el anticuerpo anti-Her2 (Herceptin) marcado con
^{125}I a una concentración de 0,8 nM. El anticuerpo no unido fue
extraído y las células fueron lavadas con un medio frío. La
cantidad de radioactividad unida a las células se determinó
mediante incubación de las células en lavado ácido (urea 2 M, NaCl
0,5 M, glicina 50 mM a pH=2,4) durante 10 minutos, para
posteriormente retirar el lavado y realizar un recuento del mismo.
Las células se solubilizaron entonces con Tampón de lisis (urea 8
M, ácido acético glacial 3 M) y se realizó un recuento de los
lisatos resultantes para determinar la cantidad de radioactividad
internalizada. Usando la actividad específica de los anticuerpos
radiomarcados y el número de células de cada muestra de ensayo, el
cpm se convirtió en moléculas/célula.
A ratones que presentaban un tumor xenoinjertado
MCF7/HER2/PSCA se les administraron de forma intraperitoneal (IP)
los anticuerpos dirigidos contra PSCA 6F8, 5F2, ó 8D11 marcados con
Cy3. Tras 24 hr, los tumores se extrajeron y crioseccionaron a 5,
10, 20 y 50 \mum y se observaron mediante microscopía
confocal.
Los anticuerpos anti-PSCA
estaban marcados con ^{125}I, según se describe arriba en el
experimento in vitro. Las células
MCF-7/Her2/gd-PSCA se prepararon e
inocularon en ratones nude NCR, a los que se les inyectaron
anticuerpos anti-PSCA marcados con ^{125}I, un
anticuerpo anti-gd marcado con ^{125}I, o
HERCEPTIN® marcado con ^{125}I, según se ha descrito anteriormente
en el Ejemplo 2. Las células tumorales se seccionaron para su
análisis.
\global\parskip1.000000\baselineskip
En los estudios in vitro, la microscopía
confocal de las células HCT 47 gD-PSCA,
PC3-19.gD-PSCA y MCF7/
HER2/PSCA inmunomarcadas mostró que estas células se unen a e internalizan los anticuerpos monoclonales anti-PSCA 8D11, 10A1, 6C3, 6F8, 5F2, 7A6 y 10E3 en grados variables (ver las Figuras 5-8). El patrón de tinción de internalización se caracterizó por la presencia de vesículas citoplásmicas y organelos perinucleares que probablemente correspondan a los endosomas que se encuentran en las proximidades del aparato de Golgi.
HER2/PSCA inmunomarcadas mostró que estas células se unen a e internalizan los anticuerpos monoclonales anti-PSCA 8D11, 10A1, 6C3, 6F8, 5F2, 7A6 y 10E3 en grados variables (ver las Figuras 5-8). El patrón de tinción de internalización se caracterizó por la presencia de vesículas citoplásmicas y organelos perinucleares que probablemente correspondan a los endosomas que se encuentran en las proximidades del aparato de Golgi.
En el estudio in vivo, el marcaje se pudo
observar sobre la superficie celular de la mayoría de las células
crioseccionadas y internalizadas en vesículas pequeñas situadas
cerca de la superficie celular en un pequeño porcentaje de las
células.
Los estudios de internalización por microscopía
electrónica (EM) utilizando células 3T3 anteriormente descritas
incubadas con anticuerpos anti-gD visualizados con
partículas de oro de 10 nm indicaron que el gD-PSCA
había sido internalizado y transportado hasta el compartimento
endosomal. Las partículas de oro se visualizaron en los cuerpos
caveolares y multivesiculares. Los estudios de internalización EM
utilizando células CHO transfectadas con PSCA también demostraron
que en la internalización de ambos anticuerpos 10E3 y 6C3 estaba
involucrada una misma ruta (ver las Figuras 9A-9D).
La cinética de la internalización de PSCA parece ser rápida (15 min
desde la membrana plasmática hasta los endosomas).
En el caso de los anticuerpos
anti-PSCA ^{125}I-10A1 e
^{125}I-8D11, se observaron granos de plata de la
autorradiografía asociados a la membrana celular, especialmente a la
microvilli. Los granos de la autorradiografía también aparecieron
internalizados en las células tan sólo 15 minutos después de la
adición de los anticuerpos 10A1 y 8D11 marcados con ^{125}I. La
internalización observada en la micrografía de la Figura 10 es
representativa de los resultados obtenidos en este experimento. Las
células HCT116 control transfectadas con marcador Neo, pero
no con PSCA, no mostraron ninguna internalización.
Los resultados obtenidos con el anticuerpo 6B8
fueron similares a los obtenidos con el anticuerpo
anti-PSCA ^{125}I-10A1. La
internalización del anticuerpo 6B8 se observó tras 15 minutos,
continuando hasta el punto de control de 24 hr. Los granos de la
autorradiografía se observaron inicialmente asociados a la cavéola
de la membrana celular y posteriormente internalizados en los
endosomas.
La Figura 11 muestra los niveles de
internalización en estado de reposo de tres anticuerpos
anti-PSCA [ascites nº 2395 (6F8), 2399 (8D11), 2403
(5F2)] después de 5 horas, en células MCF7 que expresan Her2
transfectadas con gD-PSCA. Herceptin sirvió como
anticuerpo control. Se cuantificó el número de moléculas de
anticuerpos anti-PSCA unidas por cada célula frente
al número de moléculas libres en el lisato.
Los anticuerpos dirigidos contra PSCA (6C3,
10E3, 10A1, 6F8, 5F2, 8D11, 6B8) se endocitosaron e internalizaron
de forma efectiva tanto in vivo como in vitro. El
análisis ultraestructural indicó que la internalización de los
anticuerpos 6C3, 10E3 y 6B8 tiene lugar probablemente a través de la
cavéola. Los anticuerpos se acumulan en los cuerpos
multivesiculares en ubicaciones muy próximas al aparato de Golgi.
Así, mediante diferentes aproximaciones, se demostró que los
anticuerpos anti-PSCA de la invención se
internalizaban tras la unión al PSCA sobre la superficie
celular.
La abundancia de PSCA en diversos tejidos
normales y tumorales se evaluó a partir de una base de datos de
librerías de ADNc mediante la determinación del número de copias de
la secuencia de nucleótidos de PSCA presentes en la librerías de
ADNc que representan genes expresados en diferentes tejidos y
órganos (ver la Figura 14). Para cada órgano indicado en la Figura
18 (eje X), se representan conjuntos de varias docenas de librerías
de ADNc. "Todo" significa una mezcla de las librerías de ADNc
representativas de los diferentes órganos indicados en la figura,
así como de librerías de ADNc preparadas a partir de diversos
tejidos, incluyendo huesos, útero, intestino delgado, timo,
estómago, tejido conectivo y tejido no clasificado. La abundancia
relativa en órganos normales y tumorales viene determinada por el
número de copias de la secuencia de PSCA en la librería conjunta,
dividido por el número total de secuencias que hay en dicha librería
conjunta y se representa en la Figura 14 como nº hits/100.000
secuencias aleatorias. A partir de la abundancia absoluta (Absabu),
queda claro que la expresión de PSCA está altamente desregulada en
los tumores de próstata y de vejiga.
Se evaluó la actividad antitumoral in
vivo de los anticuerpos anti-PSCA.
La línea celular de próstata humana, PC3, se
obtuvo del ATCC (ATCC CRL-1435). El subclon de la
línea celular PC3.gD-huPSCA se obtuvo mediante
transfección de la línea PC3 parental con
pRK.gD-PSCA.tkNeo utilizando el procedimiento de
Fugene (Roche Molecular Biochemical) y las células se cultivaron
sobre placas en 400 ug/ml de G418 (Life Technologies). Tras dos
semanas de crecimiento, se seleccionaron los subclones resistentes a
G418, que se ampliaron y sometieron a ensayos para la expresión de
gD-PSCA. La línea celular PC3.Neo se obtuvo
mediante transfección de la línea PC3 parental con el vector
pRK.tkNeo y posterior selección en 400 ug/ml de G418. Las colonias
estables se reunieron y ampliaron.
A ratones nude NCR (Taconic, Germantown, Nueva
York, EE.UU.) se les inyectaron de forma subcutánea 5 x 10^{6}
células PC3 transfectadas con gD-PSCA o células PC3
transfectadas con Neo. Los anticuerpos monoclonales
anti-PSCA 2395 (6F8), 2399 (8D11), 2403 (5F2) y 2761
(6B8) se administraron de forma intraperitoneal mediante inyección
a una dosis de 10 mg/kg un día antes de la inoculación de las
células. Como control negativo se administró un anticuerpo
monoclonal anti-ambrosía, MARG2 (Genentech), con el
mismo régimen de dosificación. Tras la inoculación de las células,
los animales fueron tratados quincenalmente con 10 mg/kg de
anticuerpo. Las mediciones de los tumores se realizaron
quincenalmente. Los resultados de estos experimentos se muestran en
las Figuras 18-20.
En un experimento independiente
(post-tratamiento), se permitió que los tumores
alcanzaran un cierto tamaño antes de tratar a los ratones con el
anticuerpo anti-PSCA, reproduciendo así las
condiciones y el tratamiento de pacientes con cáncer de próstata.
De manera óptima, el tamaño del tumor debía ser de aproximadamente
75-100 mm^{3} antes de ser tratado con los
anticuerpos. En este experimento, a los ratones nude NCR (Taconic,
Germantown, Nueva York, EE.UU.) se les inyectaron de forma
subcutánea 5 x 10^{6} células PC3 transfectadas con
gD-PSCA y se permitió que los tumores crecieran
durante 1 semana. Los ratones se agruparon entonces en cuatro grupos
de 9 ratones, cada grupo con un volumen de tumor medio de
aproximadamente 200 mm^{3}. A continuación, los ratones fueron
tratados quincenalmente con 10 mg/kg de anticuerpos monoclonales
anti-PSCA 2395 (6F8), 2399 (8D11), 2761 (6B8) y
2403 (5F2) o con anticuerpo anti-ambrosía, MARG2
(Genentech). Las mediciones de los tumores se realizaron
quincenalmente. Los resultados de estos experimentos se muestran en
la Figura 21.
Los cuatro anticuerpos anti-PSCA
probados, es decir, 2395 (6F8), 2399 (8D11), 2403 (5F2) y 2761
(6B8), mostraron actividad citotóxica como anticuerpos desnudos (no
conjugados) en la muerte de células de cáncer de próstata que
expresan PSCA in vivo (ver las Figuras
19-21), en comparación con el anticuerpo control de
ambrosía. Los valores de p fueron significativamente diferentes de
los obtenidos en el grupo control a p<0,05 para los anticuerpos
2395 y 2399 de la Fig. 19, los anticuerpos 2399, 2403 y 2761 de la
Fig. 20, y el anticuerpo 2395 de la Fig. 21. La actividad
tumoricida fue específica para células tumorales que expresan PSCA
(Figuras 19-21) y estuvo ausente en el control,
células tumorales PC3 negativas para PSCA (Figura 18). Tras
inyectar las células tumorales PC3 en los ratones, resultó difícil
predecir o controlar la tasa de crecimiento de las mismas para
poder iniciar puntualmente el tratamiento con anticuerpos. Como
resultado, en estos experimentos iniciales
post-tratamiento, los tumores tenían un tamaño mayor
(150-200 mm^{3}) que el tamaño óptimo
(75-100 mm^{3}) en el momento de la
administración del anticuerpo anti-PSCA. Cabe
esperar una mayor eficacia en la citotoxicidad tumoral si el
tratamiento con anticuerpos anti-PSCA se inicia en
un momento en que el tumor sea más pequeño y de un tamaño más
representativo, así como si la dosis de anticuerpo se aumenta por
encima de los 10 mg/kg.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo describe la clonación del PSCA de
mono Cynomolgus y demuestra que los anticuerpos
anti-PSCA humano se unen al PSCA de Cynomolgus
altamente homólogo y al PSCA humano con afinidades similares. Además
de la alta homología, hemos encontrado que el urotelio de
Cynomolgus expresa PSCA de una manera que resulta idéntica a la
observada para el urotelio humano, convirtiendo así a este primate
en un modelo animal conveniente y adecuado para realizar estudios
de citotoxicidad de los anticuerpos anti-PSCA. En
este modelo se probarán anticuerpos anti-PSCA
desnudos y conjugados a toxinas.
El ARN se purificó a partir de una vejiga de un
mono Cynomolgus. Para clonar el PSCA, se llevó a cabo una
RT-PCR utilizando cebadores PSCA.2F
(AAGGCTGTGCTGCTTGCCCT, SEQ ID Nº 14) y PSCA.1R (GAGTGGCA
CAAAGGCCTGGG, SEQ ID Nº 15). Los productos de PCR resultantes de dos reacciones de PCR independientes fueron subclonados en el vector de subclonación para PCR pCR2.1-TOPO (Invitrogen) y, posteriormente, fueron secuenciados.
CAAAGGCCTGGG, SEQ ID Nº 15). Los productos de PCR resultantes de dos reacciones de PCR independientes fueron subclonados en el vector de subclonación para PCR pCR2.1-TOPO (Invitrogen) y, posteriormente, fueron secuenciados.
Las secuencias codificantes completas para PSCA
humano y para PSCA de Cynomolgus se clonaron en un vector de
expresión, pRK. El anticuerpo monoclonal anti-PSCA
5F2 (ascites nº 2403) se marcó con ^{125}I utilizando el
procedimiento de la lactoperoxidasa. Células PC3 o células CHO se
transfectaron de forma transitoria con el vector
pRK.gD-PSCA humano o pRK.gD-PSCA de
Cynomolgus utilizando el reactivo de Fugene (Roche). Tras 2 días de
transfección, las células se colocaron nuevamente en una placa de 24
pocillos y se incubaron en un medio con diversas concentraciones de
Mab 2403 no marcado y una cantidad constante de
^{125}I-Mab 2403 durante 16 horas a 4ºC. El
anticuerpo no unido fue extraído y las células fueron lavadas con un
medio enfriado con hielo. La cantidad de radioactividad unida se
determinó mediante la solubilización de las células en una mezcla
de urea 8 M/ácido acético glacial 3 M. El valor de Kd se calculó
mediante análisis de Scatchard utilizando el programa
NewLigand.
Células COS (células de riñón de mono verde
africano) se transfectaron de forma transitoria con el
vector
pRK.PSCA humano o con el vector pRK.PSCA de Cynomolgus. Dos días después de la transfección, las células se extrajeron de las placas de cultivo con EDTA 5 mM y se lavaron 1 vez con PBS. Las células se dividieron en varios tubos y se tiñeron a 4ºC durante 1 hora con 10 ug/ml de anticuerpo 8D11 (ascites nº 2399) o 6B8. Tras lavarlas 2 veces con PBS, las células se tiñeron con anticuerpos anti-ratón marcados con FITC (ICN), para posteriormente analizarse utilizando citometría de flujo. Los anticuerpos Xenomice (de subclones 10C5 ID8, 3B8 y 6D1) se utilizaron en cantidades de 100 \mul de sobrenadante de hibridoma por cada reacción y se tiñeron con anticuerpos de cadena Kappa anti-humanos marcados con FITC, para analizarse nuevamente por citometría de flujo. Los resultados de los análisis de FACS se muestran en la Tabla 5 siguiente.
pRK.PSCA humano o con el vector pRK.PSCA de Cynomolgus. Dos días después de la transfección, las células se extrajeron de las placas de cultivo con EDTA 5 mM y se lavaron 1 vez con PBS. Las células se dividieron en varios tubos y se tiñeron a 4ºC durante 1 hora con 10 ug/ml de anticuerpo 8D11 (ascites nº 2399) o 6B8. Tras lavarlas 2 veces con PBS, las células se tiñeron con anticuerpos anti-ratón marcados con FITC (ICN), para posteriormente analizarse utilizando citometría de flujo. Los anticuerpos Xenomice (de subclones 10C5 ID8, 3B8 y 6D1) se utilizaron en cantidades de 100 \mul de sobrenadante de hibridoma por cada reacción y se tiñeron con anticuerpos de cadena Kappa anti-humanos marcados con FITC, para analizarse nuevamente por citometría de flujo. Los resultados de los análisis de FACS se muestran en la Tabla 5 siguiente.
Siete subclones de PSCA de mono se secuenciaron
para obtener dos tipos de secuencias: tipo I (4 subclones) y tipo
II (3 subclones). Las secuencias de ADN y de aminoácidos traducidos
se muestran en la Figura 15 para el tipo I (SEQ ID Nº 16 & 17)
y en la Figura 16 para el tipo II (SEQ ID Nº 18 & 19). Dado que
el ARN se purificó a partir de una vejiga de mono individual y que
el mono era de la cepa natural (no de una cepa endocriada), estos
dos tipos corresponden muy probablemente a alelos diferentes del
mismo gen. El PSCA de Cynomolgus de tipo I y de tipo II muestran un
98,64% de identidad a nivel de ADN, y un 99,18% de identidad a nivel
de proteína con una diferencia entre ambos tipos de tan sólo un
aminoácido, el aminoácido 119 (Ser vs. Gly). El PSCA es una
proteína de superficie anclada a GPI. En el PSCA humano, la posición
de corte del acoplamiento a GPI es el aminoácido 100. Asumiendo que
el corte y la unión a GPI ocurren en una posición similar en el PSCA
de Cynomolgus, el PSCA de mono maduro de tipo I y tipo II serían
100% idénticos en cuanto a la secuencia de aminoácidos. Ambos tipos
muestran aproximadamente un 94% de identidad con el PSCA humano a lo
largo de toda la secuencia codificante. La Figura 17 compara la
secuencia de aminoácidos del PSCA humano (SEQ ID Nº 1) con la del
PSCA tipo I de Cynomolgus (SEQ ID Nº 17).
Las variaciones medias de FACS (indicadas en
unidades de FITC) para anticuerpos anti-PSCA en
PSCA humano o en PSCA de Cynomolgus expresados en células COS se
muestran en la Tabla 5 (para anticuerpos murinos) y en la Tabla 6
(para anticuerpos Xenomice). Gracias a otros estudios anteriores, es
conocido que los anticuerpos 5F2, 8011 y 6F8 presentan unas
afinidades de unión muy similares para PSCA humano. Por ello, de
estos 3 anticuerpos, se utilizó 5F2 como anticuerpo representativo
en un ensayo de competición en frío. La Tabla 7 compara las
afinidades de los anticuerpos 5F2 y 6B8 para PSCA de superficie
celular humano y de Cynomolgus, conforme a lo determinado en el
ensayo de competición en frío. Los resultados para las células
transfectadas PC3 y CHO fueron similares. Los resultados de los
análisis de FACS y del ensayo de competición en frío indicaron que
los anticuerpos humanos murinos y Xenomice (ratones transgénicos
humanizados) se unían a PSCA humano y de Cynomolgus que había sido
expresado en su contexto natural sobre la superficie celular, con
una afinidad equivalente (dentro del margen de error).
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Este ejemplo describe la conjugación de un
anticuerpo anti-PSCA con el maitansinoide DM1. El
DM1 es un profármaco que resulta activado en la célula; es un
potente inhibidor de la formación de microtúbulos e interrumpe la
mitosis. La estructura de DM1 se muestra en la Figura 22. La
estructura de los conjugados anticuerpo
anti-PSCA-DM1 se ilustra en la
Figura 23. Para la siguiente conjugación, el grupo R de la Figura 22
es SH o un derivado protegido del mismo, siendo especialmente
ventajosos un derivado disulfuro. Es posible realizar
modificaciones de este protocolo, por ejemplo, para optimizar el pH
o las concentraciones de reactivos para anticuerpos individuales;
dichas modificaciones son rutinarias en la naturaleza y resultarán
familiares para un químico de proteínas experto en la técnica.
Un anticuerpo anti-PSCA
purificado (por ejemplo, uno de los anticuerpos
anti-PSCA enumerados en la Tabla 2B) fue modificado
con
N-succinimidil-4-(2-piridiltio)
pentanoato (SPP) para introducir grupos ditiopiridilo. El
anticuerpo (por ejemplo, a aproximadamente 6-10
mg/mL) en un tampón de fosfato potásico (PPB; por ejemplo, 50 mM en
PPB a pH=6,5) que contenía NaCl (50 mM) y EDTA (1 mM) se trató con
SPP (por ejemplo, a 5,3 equivalentes molares en 2,3 mL de etanol).
Tras la incubación durante 90 minutos bajo argón a temperatura
ambiente, la mezcla de reacción se filtró siguiendo los
procedimientos estándares, por ejemplo, mediante filtración en gel
a través de una columna Sephadex 25 equilibrada con una mezcla de
citrato sódico 35 mM, NaCl 154 mM y EDTA 2 mM. Las fracciones que
contenían anticuerpos se reunieron y sometieron a ensayo. El grado
de modificación del anticuerpo se determinó según se ha descrito
anteriormente.
El anticuerpo modificado (por ejemplo, con 9,5
\mumoles de grupos 2-tiopiridina liberables) se
diluyó con el anterior tampón de citrato sódico 35 mM a pH=6,5
hasta alcanzar una concentración final de, por ejemplo, 2,5 mg/mL.
A continuación, a la solución de anticuerpo se le añadió el DM1 (por
ejemplo, 1,7 equivalentes, 16,1 \mumoles) en dimetilacetamida 3,0
mM (DMA al 3% v/v en la mezcla de reacción final). La reacción se
llevó a cabo a temperatura ambiente bajo argón durante 20 horas.
Una vez transcurrido dicho periodo, la reacción
fue cargada en una columna de filtración en gel, por ejemplo, una
columna de filtración en gel Sephacryl S300 (5,0 cm x 90,0 cm, 1,77
L) equilibrada con una mezcla de citrato sódico 35 mM, NaCl 154 mM
a pH=6,5. El caudal utilizado fue, por ejemplo, de 5,0 mL/min y se
recogieron 65 fracciones (de 20,0 mL cada una). El pico de mayor
tamaño comprendía el conjugado anticuerpo
anti-PSCA-DM1. Las fracciones
anteriores y posteriores al pico de mayor tamaño se reunieron y
sometieron a ensayo. El número de moléculas de fármaco DM1 unidas
por cada molécula de anticuerpo se determinó, por ejemplo, midiendo
la absorbancia a 252 nm y a 280 nm, y resultó ser de
3-5 moléculas de fármaco por cada molécula de
anticuerpo
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Los anticuerpos anti-PSCA nº
2761 (6B8) y nº 2399 (8D11) se conjugaron con DM1, tal como se ha
descrito anteriormente. De los resultados obtenidos en los estudios
de internalización, cabía esperar que los conjugados
anticuerpo-DM1 fueran incorporados de forma
eficiente por las células que expresan PSCA. Como controles para
determinar la especificidad para el antígeno y el isotipo de
inmunoglobulina se utilizaron dos anticuerpos
anti-ambrosía. A continuación se describen los
resultados obtenidos para la citotoxicidad in vitro de los
cuatro primeros conjugados DM1. La citotoxicidad se midió en ensayos
clonogénicos con células PC3.Neo y células
PC3.gD-huPSCA clon 4. Estas dos líneas celulares
resultaron ser igualmente sensibles al DM1 no conjugado (Fig. 24),
sugiriendo así que la línea celular PC3.Neo era un buen control
antígeno-negativo para las células
PC3.gD-huPSCA clon 4.
Las células se colocaron en placas de tipo
cultivo tisular de 6 pocillos en un medio de crecimiento que
contenía o no contenía el conjugado anticuerpo a probar. Los
cultivos de control se colocaron en placas a 500 células/placa. Los
cultivos que fueron expuestos al conjugado se colocaron en placas a
diversas densidades comprendidas entre 500 y 5000 células/pocillo.
Las células se incubaron entonces a 37ºC durante 5 a 7 días para
permitir la formación de colonias. Las células se fijaron, tiñeron
con colorante violeta Cristal, y se llevó a cabo un recuento de las
colonias. La eficiencia del cultivo en placa (PE) se calculó como el
número de colonias/número de células cultivadas en placas. La
fracción de supervivencia se calculó como PE de células tratadas/PE
de células no tratadas. Las eficiencias de cultivo en placa de los
cultivos control estuvieron en el rango del 40 a 60% tanto para el
control como para la línea celular que expresa PSCA.
\newpage
El conjugado anticuerpo 2399-DM1
resultó citotóxico para células PC3.gD-huPSCA clon 4
con un IC_{10} \sim 3 x 10^{-10} M, en exposición continua
(Fig. 25). Un control de isotipo coincidente,
1429-DM1, no resultó tóxico para las células hasta
la máxima concentración probada (3 x 10^{-9} M). El segundo
conjugado, 2761-DM1, resultó citotóxico para
células PC3.gD-huPSCA clon 4 con un IC_{10} \sim
1 x 10^{-9} M, en exposición continua (Fig. 26). Un control de
isotipo coincidente, 1428-DM1, no resultó tóxico
para las células hasta la máxima concentración probada (3 x
10^{-9} M). Ninguno de los cuatro conjugados
anticuerpo-DM1 resultó tóxico para células
PC2-Neo hasta la máxima concentración probada (3 x
10^{-9} M), ver la Figura 27.
Los conjugados anticuerpo
2399-DM1 y 2761-DM1 resultaron
específicamente citotóxicos hacia las células
antígeno-positivas de PSCA.
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A ratones nude NCR hembras (Taconic, Inc.) de
6-8 semanas de edad se les inyectaron de forma
subcutánea 5 x 10^{6} células PC3.gd-PSCA en un
volumen de 0,2 ml en el Día 1. Se permitió que los tumores crecieran
durante 5 días y, a continuación, se midieron en dos dimensiones
usando un calibrador. El volumen de los tumores se expresó en
mm^{3} usando la fórmula: V = 0,5a x b^{2}, en donde a y b son
el diámetro mayor y menor del tumor, respectivamente. Los ratones
se agruparon en 6 grupos de 7 ratones con un volumen medio de tumor
de 160 mm^{3}. En el Día 6, se iniciaron los tratamientos con
anticuerpos. Los anticuerpos anti-PSCA desnudos (no
conjugados con DM1) 2399 (8D11), 2761 (6B8) y el anticuerpo control
negativo anti-ambrosía, 1428, fueron inyectados de
forma intraperitoneal (IP) dos veces por semana en una dosis de 10
mg/kg. Este régimen de tratamiento se mantuvo durante todo el
experimento. Estos mismos anticuerpos conjugados con la citotoxina
maitansinoide, DM1, fueron inyectados de forma intravenosa (IV) a
una concentración de 75 ug/kg de DM1. Los anticuerpos DM1 se
administraron dos veces por semana hasta un total de 8 dosis. Los
tumores se midieron dos veces por semana durante todo el
experimento. La Tabla 8 muestra el régimen de posología.
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\newpage
Como se muestra en la Figura 28, en el día 26 de
tratamiento, los tumores de próstata humanos (células que expresan
PSCA) habían sido virtualmente eliminados en los animales tratados
con anticuerpos anti-PSCA conjugados con DM1 (2399
y 2761) en comparación con los anticuerpos anti-PSCA
no conjugados y con el anticuerpo control
anti-ambrosía conjugado con DM1. Dentro de cada
grupo de 7 animales tratados con 2399-DM1 ó
2761-DM1, cuatro de los animales no presentaban
ningún tumor detectable. Para los tres animales que seguían
presentando un tumor, el tamaño medio del mismo era de tan sólo 6
mm^{3}, en comparación con un volumen de tumor de aproximadamente
550 mm^{3} para el grupo del anticuerpo control
ambrosía-DM1. Los tratamientos con DM1 se
mantuvieron durante una dosis adicional para finalizar en el día 29.
En el día 33, los ratones de todos los grupos se sacrificaron y se
extrajeron tejidos tumorales para realizar análisis histológicos.
También se recogieron y examinaron otros tejidos, incluyendo tejido
del hígado, riñón y vejiga, en busca de evidencias de citotoxicidad
relacionada con los tratamientos con anticuerpos.
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La expresión de PSCA humano en tejidos normales
y en tumores malignos se investigó mediante el uso de hibridación
isotópica in situ (ISH) en matrices
multi-tejido. Una micromatriz de tejido (TMA) es un
bloque de parafina que suele contener entre cien y más de mil
muestras de tejido individuales. Las TMAs se construyen tomando
pequeñas muestras de biopsia de los tejidos "donantes"
embebidas en bloques de parafina y embebiendo nuevamente todas las
biopsias juntas en un único bloque "receptor" para formar una
matriz.
Los cebadores de PCR
(superior-5' ACC CAC GCG TCC GGC TGC TT 3' [SEQ ID
Nº 24] e inferior-5' CGG GGG ACA CCA CGG ACC AGA 3'
[SEQ ID Nº 25]) se diseñaron para amplificar un fragmento de 768
pares de bases de PSCA humano. Los cebadores incluían extensiones
que codifican los sitios de iniciación para la ARN polimerasa T7 ó
T3 en el nucleótido 27 para permitir la transcripción in
vitro de las sondas sentido o antisentido, respectivamente, a
partir de los productos amplificados. Los portaobjetos de muestras
de la micromatriz de tumores se desparafinaron, desproteinizaron en
20 \mug/ml de proteinasa K durante 15 minutos a 37ºC, para
posteriormente procesarse para hibridación in situ. Las
sondas sentido y antisentido marcadas con
^{33}P-UTP se hibridaron con las secciones a 55ºC
durante toda la noche. La sonda no unida se extrajo mediante
incubación en 20 mg/ml de ARNasa A durante 30 minutos a 37ºC,
seguido de un lavado de alta astringencia a 55ºC en 0,1 x SSC
durante 2 horas y de deshidratación mediante la adición de
diferentes concentraciones de etanol. Los portaobjetos se
sumergieron en emulsión NBT2 de seguimiento nuclear (Eastman Kodak),
se expusieron durante 4 semanas a 4ºC en cajas herméticas para
portaobjetos de plástico que contenían desecante, se revelaron y se
sometieron a contratinción con hematoxilina y eosina.
Los resultados del ensayo ISH para próstata
normal y para tumores de próstata se resumen en la Tabla 9.
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El grupo del cáncer de próstata primario
contiene 7 casos de neoplasia intraepitelial prostática (PIN; un
caso es negativo, un caso es ligeramente positivo y cinco casos son
fuertemente positivos para PSCA). El grupo de los cánceres de
próstata metastáticos consta de 25 casos de metástasis en nódulo
linfático, 2 casos de metástasis en el hígado (ambos casos son
fuertemente positivos para PSCA) y 1 caso de metástasis en el
cerebro (ligeramente positivo para PSCA). Los resultados
preliminares de una matriz multi-tejido adicional
de próstata (próstata normal, cáncer de próstata primario y
metastático) confirman estos valores. Los resultados para otros
tipos de tumor (pulmón y colon) son preliminares y parecen indicar
que aproximadamente el 10% de los tumores de pulmón y el 5% de los
tumores de colon expresan PSCA a un nivel ligero a moderado.
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El Ejemplo 11 describe la distribución de PSCA
en los tumores y en el tejido normal, evaluada mediante
inmunohistoquímica (IHC) utilizando los anticuerpos monoclonales
anti-PSCA de la invención. La expresión de PSCA se
evaluó en una serie de cánceres de próstata primarios confinados en
los órganos. La expresión de PSCA también se evaluó en secciones
congeladas de tumores de cerebro, pulmón, colon y riñón, y en líneas
celulares de carcinoma de colon. De forma independiente, se está
llevando a cabo el análisis TaqMan^{TM} para PSCA en algunos de
los casos utilizados en este estudio IHC. TaqMan^{TM} es una
técnica basada en PCR fluorescente que utiliza la actividad
exonucleasa 5' de la enzima Taq ADN polimerasa para monitorizar la
amplificación génica en tiempo real.
Secciones congeladas de 5 micras de grosor se
cortaron a partir de tejido tumoral recién congelado en un
criostato Leica y las secciones se almacenaron a -20ºC hasta su
posterior uso.
Las secciones se secaron minuciosamente y se
fijaron en acetona/etanol durante 5 minutos. A continuación, se
lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS)
durante 5 minutos cada lavado. La actividad peroxidasa endógena se
detuvo utilizando el procedimiento de la glucosa oxidasa/glucosa a
37ºC durante 60 minutos. Seguidamente, se realizaron 2 lavados con
PBS de 5 minutos cada uno. El bloqueo para biotina endógena se
realizó usando el Kit de bloqueo avidina/biotina de Vector. El
bloqueo para los sitios de unión a inmunoglobulina endógena se
realizó con suero de caballo normal al 10% durante 30 minutos. El
suero de bloqueo no se retiró.
Las secciones se incubaron con anticuerpo
anti-PSCA murino a 10 ug/ml diluido en suero de
bloqueo durante 60 minutos a temperatura ambiente (t.a.). Como
control negativo se utilizó un anticuerpo de control de isotipo de
ratón (Zymed). Las secciones se lavaron dos veces con PBS durante 5
minutos cada lavado. La detección del anticuerpo primario unido de
forma específica se realizó con Ig anti-ratón
biotinilado de caballo. Las secciones se incubaron durante 30
minutos con Ig anti-ratón biotinilado de caballo
diluido en proporción 1:200 en suero de bloqueo. Las secciones se
lavaron dos veces con PBS durante 5 minutos cada lavado, se
incubaron durante 30 minutos con reactivo ABC diluido y se lavaron
de nuevo dos veces con PBS durante 5 minutos cada lavado Las
secciones se incubaron con Metal Enhanced DAB de Pierce durante 5
minutos, se lavaron con agua corriente durante 5 minutos, se
sometieron a contratinción con hematoxilina de Mayer durante 1
minuto, se lavaron con agua, se transfectaron en etanol al 70%, 95%
y 100%, seguido de xileno, y los portaobjetos se cubrieron. A
continuación, las secciones se deshidrataron, clarificaron y
montaron en un medio de montaje sintético.
Se observó la expresión de PSCA en células
epiteliales malignas. El nivel de expresión varió entre ligero y
muy potente, la proporción de células malignas positivas varió entre
menos del 10% y más del 95%. El ARNm PSCA ya se había demostrado
anteriormente en un caso de adenocarcinoma colorectal mediante
hibridación in situ.
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Los modelos animales resultan de utilidad para
comprender los mecanismos patogenéticos y para el desarrollo de
nuevas terapias. Este estudio describe el patrón de expresión del
PSCA murino en tejidos fetales y adultos mediante hibridación in
situ, así como en un modelo murino para adenocarcinoma de
próstata humano.
Estructuralmente, el PSCA es una glicoproteína
de membrana unida a GPI que presenta homología con los miembros de
la familia de proteínas Thy-1/Ly-6.
Está más estrechamente relacionado con Sca2, un fabricante de
superficie celular para linfocitos inmaduros (Noda S. et al.
Journal of Experimental Medicine 1996; 183:2355-60).
La expresión de ARN PSCA humano en tejidos normales se describió
originalmente no sólo como específica de tejido, sino también como
esencialmente limitada a las células basales prostáticas. De esta
última observación, y de la homología estructural con Sca2, los
autores deducen que el PSCA puede representar un antígeno de células
"madre".
Se ha demostrado que el homólogo murino presenta
un 70% de identidad con el PSCA humano a nivel de nucleótidos y de
aminoácidos (Reiter RE et al., 1998, Proc. Nat. Acad. Sci.
95:1735-40). Un modelo animal bien establecido para
el cáncer de próstata humano es el adenocarcinoma transgénico de la
próstata de ratón (TRAMP^{TM}) (Greenberg NM, 1995, PNAS
92:3439-43). Aunque existen diferencias anatómicas
significativas entre la próstata de ratón y la de humano, también
existen características comunes inherentes, incluyendo la función
secretora y la regulación hormonal. En el modelo TRAMP^{TM}, el
promotor mínimo del gen de la probasina de rata dirige la expresión
del T-antígeno SV40 grande en el epitelio
prostático. En todos los ratones TRAMP machos, el cáncer de
próstata progresa normalmente en 8-12 semanas
(Gingrich JR et al., 1997, Cancer Research
57:4687-91). El modelo TRAMP^{TM} autóctono es
especialmente relevante para carcinomas de próstata humano en los
que el desarrollo del cáncer es específico para el epitelio
prostático y está inicialmente regulado por andrógenos. Más aún,
con el tiempo se producen metástasis en sitios distantes (Gingrich
JR et al., 1996, Cancer Research
56:4096-102; Gingrich JR et al., 1999,
Prostate Cancer & Prostatic Diseases
2:70-75).
Los ratones CD-1 adultos machos
y hembras con edades comprendidas entre 10 y 24 semanas se
obtuvieron de los laboratorios Charles River. También se pidieron
ratones preñados para la recogida de embriones. El día de
aislamiento con acto copulatorio se consideró como el Día 1 del
desarrollo embrionario. Los tejidos fetales examinados por ISH
incluyeron E10, E13, E14, E15, E17 y E18. Los tejidos adultos
examinados incluyeron tejidos del sistema urogenital masculino,
vejiga urinaria femenina y riñón, glándula mamaria pubescente,
glándula mamaria en el día 14 de preñez, glándula mamaria lactante,
hígado, corazón, piel e intestino. Todos los tejidos se fijaron en
formalina al 4% y se embebieron en parafina. Los pares de cría de
ratones transgénicos TRAMP^{TM} se obtuvieron del Dr. Norman
Greenberg (Baylor College of Medicine, Houston (TX), EE.UU.). Los
tejidos urogenitales de C57BL/6 de la misma camada de tipo salvaje
se obtuvieron a edades de 12 y 24 semanas para poder compararse con
los de los ratones transgénicos TRAMP^{TM} de la misma edad. A la
edad de 12 semanas, los ratones TRAMP^{TM} suelen presentar una
neoplasia intraepitelial prostática (PIN) y/o tumores bien
definidos. Nueve ratones TRAMP^{TM} machos con edades
comprendidas entre las 12 y las 39 semanas se sacrificaron y se les
extrajeron tejidos para realizar una histología de rutina y
estudios ISH. El grado histológico del cáncer de próstata se
determinó conforme a los estudios anteriormente publicados para el
modelo TRAMP^{TM} (Gingrich JR et al., 1999, Prostate
Cancer & Prostatic Diseases 2:70-75).
El ADNc de longitud completa para PSCA murino se
amplificó a partir de ADNc Marathon-Ready de un
embrión de ratón de 17 días (Clontech). Los cebadores se diseñaron
en base a las secuencias EST presentes en GenBank. El cebador
sentido (5' ACT ATG AAG CTT TGC AGC TCA TCC CTT CAC AAT CG 3' (SEQ
ID Nº 20)) y el cebador antisentido de la región 3' no traducida
(5' GAA TTC GGA TCC ACC ATG AAG ACC GTC TTC TTT CTC CTG CTG 3' (SEQ
ID Nº 21)) se utilizaron para obtener un fragmento de 420 pares de
bases que se clonó posteriormente en un vector de subclonación para
PCR pCR2.1-TOPO (Invitrogen). Los clones se
confirmaron mediante secuenciación de ADN.
Los cebadores PCR (superior-5'
CCT GCT GGC CAC CTA CT 3' e inferior-5' CCT TCA CAA
TCG GGC TAT 3', SEQ ID Nº 22 y 23, respectivamente) se diseñaron
para amplificar un fragmento de 388 pares de bases de PSCA murino.
Los cebadores incluían extensiones que codifican los sitios de
iniciación para la ARN polimerasa T7 ó T3 en el nucleótido 27 para
permitir la transcripción in vitro de las sondas sentido o
antisentido, respectivamente, a partir de los productos
amplificados (Lu et al. Cell Vision 1994,
1:169-176). Las secciones de 5 \mum de grosor se
desparafinaron, desproteinizaron en 4 \mug/ml de proteinasa K
durante 30 minutos a 37ºC, para posteriormente procesarse para
hibridación in situ. Las sondas sentido y antisentido
marcadas con ^{33}P-UTP se hibridaron con las
secciones a 55ºC durante toda la noche. La sonda no unida se extrajo
mediante incubación en 20 mg/ml de ARNasa A durante 30 minutos a
37ºC, seguido de un lavado de alta astringencia a 55ºC en 0,1 x SSC
durante 2 horas y de deshidratación mediante la adición de
diferentes concentraciones de etanol. Los portaobjetos se
sumergieron en emulsión NBT2 de seguimiento nuclear (Eastman Kodak),
se expusieron durante 4 semanas a 4ºC en cajas herméticas para
portaobjetos de plástico que contenían desecante, se revelaron y se
sometieron a contratinción con hematoxilina y eosina. La hibridación
in situ se llevó a cabo de forma rutinaria sobre secciones
duplicadas con sondas sentido y antisentido. No se observó una señal
de hibridación significativa en las secciones hibridazas con la
sonda sentido.
En resumen, los resultados muestran que el PSCA
murino se expresó durante el desarrollo fetal en el seno
urogenital, la piel y el tracto gastrointestinal. La expresión en
dichos tejidos se restringió a la capa celular más superficial. En
el ratón adulto, la expresión fue máxima en la mucosa del tracto
urinario. En la próstata de adulto normal, la expresión de PSCA se
detectó exclusivamente en el epitelio secretor. El examen de PSCA
durante la carcinogénesis de la próstata murina en el modelo
TRAMP^{TM} mostró una expresión marcadamente incrementada en
áreas de neoplasia.
Estos estudios demuestran que la expresión de
PSCA murino no es ni próstata específica ni consistente con ello,
siendo un marcador de células madre. Los resultados indican
claramente que la expresión de PSCA en las superficies epiteliales
está restringida a la capa de células adluminales o superficiales, y
no a las células basales, como se ha publicado para el gen humano.
Las células de la capa exterior adluminal suelen mostrar un elevado
grado de diferenciación, pero contrariamente a las células madre,
muestran también una baja capacidad proliferativa o de
auto-renovación. La designación de esta molécula
como un "antígeno de células madre" es, por tanto,
cuestionable. Estos resultados sugieren que el patrón de expresión
de PSCA murino en tejidos normales y en tejidos de adenocarcinoma
prostático murino es diferente de los datos publicados acerca de
los adenocarcinomas de próstata humanos. Muy probablemente, las
diferencias existentes en la expresión de PSCA entre los tumores
TRAMP^{TM} y el adenocarcinoma prostático humano son indicativas
de que la regulación de la expresión de PSCA es específica de la
especie o está relacionada con el tipo de evento carcinogénico que
está en juego.
La máxima expresión de PSCA se detectó en el
urotelio del tracto urinario maduro y en desarrollo. En el
organismo adulto, la expresión es continua desde la pelvis renal a
todo lo largo de la uretra. La expresión prostática es desigual,
aunque aumenta notablemente en la unión de los grandes conductos
prostáticos con la uretra. Resulta tentador especular si este
hallazgo está relacionado con el reflujo urinario que se produce
hacia estas estructuras, ofreciendo una posible clave acerca de la
función de esta proteína. Una característica común de las
superficies epiteliales que exhiben expresión de PSCA es el hecho de
que revisten las estructuras que están en contacto continuo con los
fluidos, la mucosa o las secreciones. Éste es obviamente el caso
para el urotelio. Sin embargo, este concepto también es válido para
la observación de que la expresión de PSCA está presente en la
membrana amniótica, el canal anal, la orofaringe, el esófago y la
piel del feto en desarrollo. Sin limitarse a ninguna hipótesis o
mecanismo, es probable que haya otros denominadores en juego, ya que
existen otros tejidos epiteliales expuestos a fluidos, como el
árbol traqueobronquial fetal, que no expresan PSCA. En este punto,
resulta difícil determinar si la expresión de PSCA en la piel del
feto se regula de forma temporal, ya que el número de embriones
evaluados ha sido escaso. Sin embargo, parece que la expresión de
PSCA en la piel deja de ser necesaria en la vida extrauterina tras
el nacimiento. El patrón de expresión en las superficies
epiteliales multicapa sugiere que el PSCA puede funcionar como una
barrera o tampón frente a los ataques externos. Estudios
adicionales, como la generación de ratones con knockout para PSCA
serían de utilidad para esclarecer la función primaria del PSCA en
los tejidos normales.
La expresión bastante selectiva de PSCA en los
tejidos fetales y adultos convierte al ratón en un modelo adecuado
para la determinación de la función fisiológica de esta proteína.
Aunque el PSCA se pierde en las etapas avanzadas del tumor, el
modelo TRAMP^{TM} puede seguir representando una herramienta
potencialmente útil para estudiar el PSCA como un objetivo para el
cáncer de próstata.
Los ejemplos de trabajo anteriores han
demostrado que los anticuerpos anti-PSCA de la
invención se dirigían de forma efectiva contra células cancerígenas
que expresan PSCA in vivo y que la molécula de PSCA ligada a
GPI y el anticuerpo unido a ella se internalizaron rápidamente tras
la unión del anticuerpo a una célula cancerígena que expresa PSCA.
Los anticuerpos anti-PSCA mostraron especificidad y
eficacia en la muerte de células tumorales y en la detención in
vivo del crecimiento del tumor. La citotoxicidad de las células
tumorales se mejoró enormemente usando un anticuerpo conjugado con
toxina, específicamente el maitansinoide, DM1, que es una toxina
que actúa intracelularmente. El tratamiento con el anticuerpo
anti-PSCA conjugado con DM1 eliminó completamente
las células tumorales de cáncer de próstata humano que expresan PSCA
(ver el Ejemplo 9).
La práctica de la presente invención empleará, a
menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de
biología molecular y similares, que forman parte del estado de la
técnica. Dichas técnicas se explican detalladamente en la
literatura. Ver, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, N.Y., EE.UU., 1989); Current Protocols in
Molecular Biology (F. Ausubel et al., eds., 1987
actualizado); Essential Molecular Biology (T. Brown ed., IRL Press
1991); Gene Expression Technology (Goeddel ed., Academic Press
1991); Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes (A.
Bothwell et al. eds., Bartlett Publ. 1990); Gene Transfer and
Expression (M. Kriegler, Stockton Press 1990); Recombinant DNA
Methodology II (R. Wu et al. eds., Academic Press 1995); PCR:
A Practical Approach (M. McPherson et al., IRL Press at
Oxford University Press 1991); Oligonucleotide Synthesis (M. Gait
ed., 1984); Cell Culture for Biochemists (R. Adams ed., Elsevier
Science Publishers 1990); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells
(J. Miller & M. Calos eds., 1987); Mammalian Cell Biotechnology
(M. Butler ed., 1991); Animal Cell Culture (J. Pollard et
al. eds., Humana Press 1990); Culture of Animal Cells, 2ª Ed.
(R. Freshney et al. eds., Alan R. Liss 1987); Flow Cytometry
and Sorting (M. Melamed et al. eds.,
Wiley-Liss 1990); la serie Methods in Enzymology
(Academic Press, Inc.); Wirth M. and Hauser H. (1993);
Immunochemistry in Practice, 3ª edición, A. Johnstone & R.
Thorpe, Blackwell Science, Cambridge (MA), EE.UU., 1996; Techniques
in Immunocytochemistrv, (G. Bullock & P. Petrusz eds., Academic
Press 1982, 1983, 1985, 1989); Handbook of Experimental Immunology,
(D. Weir & C. Blackwell, eds.); Current Protocols in Immunology
(J. Coligan et al. eds. 1991); Immunoassay (E. P. Diamandis
& T.K. Christopoulos, eds., Academic Press, Inc., 1996); Goding
(1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2ª ed.)
Academic Press, Nueva York, EE.UU.; Ed Harlow y David Lane,
Antibodies A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, Nueva York, EE.UU., 1988; Antibody Engineering, 2ª
edición (C. Borrebaeck, ed., Oxford University Press, 1995); y la
serie Annual Review of Immunology; la serie Advances in
Immunology.
Las siguientes líneas celulares de hibridomas
fueron depositadas en la American Type Culture Collection (ATCC),
ubicada en 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia
20110-2209, EE.UU., y se acordaron los siguientes
números de acceso:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los nombres de las anteriores líneas celulares
de hibridomas depositadas han sido reducidos para facilitar su
referencia; estos hibridomas corresponden a los clones (con sus
nombres completos) enumerados en la Tabla 2B.
Este depósito se realizó bajo las provisiones el
Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del
Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en Materia
de Patentes y bajo la reglamentación allí expuesta (Tratado de
Budapest). Esto garantiza el mantenimiento de cultivos viables
durante 30 años a partir de la fecha de depósito. Los organismos
quedarán a disposición del ATCC bajo los términos del Tratado de
Budapest, y estarán sujetos a un acuerdo entre Genentech, Inc. y
ATCC, que garantiza la disponibilidad permanente y restringida de
la progenie de los cultivos para el público tras la emisión de la
pertinente patente estadounidense o tras exponer al público
cualquier solicitud de patente estadounidense o extranjera, lo que
suceda primero, y garantiza la disponibilidad de la progenie para
aquellos a los que el Comisionado de Patentes y Marcas Registradas
estadounidense haya decidido otorgar derechos sobre la misma
conforme a 35 USC \NAK122 y a las reglas del Comisionado según lo
acordado (incluyendo 37 CFR \NAK1.14 con referencia particular a
886 OG 638).
El cesionario de la presente solicitud ha
acordado que si los cultivos que se encuentran en depósito resultan
muertos o perdidos o destruidos mientras se cultivan en las
condiciones adecuadas, serán puntualmente sustituidos tras
notificación por un espécimen viable del mismo cultivo. La
disponibilidad de las cepas depositadas no será interpretada como
una licencia para la práctica de la invención en contravención los
derechos concedidos bajo la autoridad de cualquier gobierno
conforme a sus leyes de patentes. La confección de estos depósitos
no constituye en modo alguno una admisión de que los depósitos son
necesarios para permitir la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto
el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u
omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este
respecto.
\bullet US5856136A [0004] [0021] [0226]
\bullet WO9914328A [0004] [0021] [0226]
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<160> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 123
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 372
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3.
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 115
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus Musculus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> no seguro
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 46-48,
50-52
\vskip0.400000\baselineskip
<223> aminoácido desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 124
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 121
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 118
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 238
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia es ratón/humano
quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 466
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia es ratón/humano
quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 218
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia es ratón/humano
quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 222
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia es ratón/humano
quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia es un primero
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaggctgtgc tgcttgccct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia es un primero
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagtggcaca aaggcctggg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 372
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Macaca fascicularis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 123
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Macaca fascicularis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 372
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Macaca fascicularis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 123
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Macaca fascicularis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia es un primero
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactatgaagc tttgcagctc atcccttcac aatcg
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia es un primero
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaattcggat ccaccatgaa gaccgtcttc tttctcctgc tg
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia es un primero primero
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctgctggcc acctact
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia es un primero
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccttcacaat cgggctat
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia es un primero PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacccacgcgt ccggctgctt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia es un primero PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgggggacac cacggaccag a
\hfill21
Claims (53)
1. Anticuerpo monoclonal
anti-antígeno de células madre prostáticas (PSCA)
que se internaliza tras la unión a PSCA en una célula de mamífero
in vivo, cuyo anticuerpo:
a) es producido por un hibridoma seleccionado
entre el grupo de hibridomas depositados en la American Type
Culture Collection bajo el número de acceso PTA-717,
PTA-718, PTA-719,
PTA-720 y PTA-880;
b) es producido por un hibridoma depositado en
la American Type Culture Collection bajo el número de acceso
PTA-2265;
c) presenta la secuencia de aminoácidos de: SEQ
ID Nº 10 y SEQ ID Nº 11; o SEQ ID Nº 12 y SEQ ID Nº 13;
d) es una forma humanizada de un anticuerpo
monoclonal producido por un hibridoma seleccionado entre el grupo
de hibridomas depositados en la American Type Culture Collection
bajo el número de acceso PTA-717,
PTA-718, PTA-719,
PTA-720, PTA-880 y
PTA-2265;
e) es un polipéptido de fusión que comprende al
menos las secuencias de la región variable (V) de un anticuerpo
monoclonal producido por un hibridoma seleccionado entre el grupo de
hibridomas depositados en la American Type Culture Collection bajo
el número de acceso PTA-717,
PTA-718, PTA-719,
PTA-720, PTA-880 y
PTA-2265 fusionado con un polipéptido heterólogo;
o
f) compite por unirse al mismo epítopo al que se
une el anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma seleccionado
entre el grupo de hibridomas depositados en la American Type
Culture Collection bajo el número de acceso PTA-717,
PTA-718, PTA-719,
PTA-720, PTA-880 y
PTA-2265.
2. Anticuerpo según la reivindicación
1(e), en donde las secuencias de la región V son: SEQ ID Nº 3
y SEQ ID Nº 4; SEQ ID Nº 5 y SEQ ID Nº 6; o SEQ ID Nº 7 y SEQ ID Nº
8.
3. Anticuerpo según las reivindicaciones 1 ó 2,
que es un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo quimérico o un
anticuerpo humanizado.
4. Anticuerpo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, que está conjugado con un agente inhibidor
del crecimiento.
5. Anticuerpo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, que está conjugado con un agente
citotóxico.
6. Anticuerpo según la reivindicación 5, en
donde el agente citotóxico se selecciona entre el grupo formado por
toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos y enzimas
nucleolíticas.
7. Anticuerpo según la reivindicación 6, en
donde el agente citotóxico es una toxina.
8. Anticuerpo según la reivindicación 7, en
donde la toxina se selecciona entre el grupo formado por
maitansinoide y caliqueamicina.
9. Anticuerpo según la reivindicación 8, en
donde la toxina es un maitansinoide.
10. Anticuerpo según la reivindicación 9, en
donde el maitansinoide presenta la estructura mostrada en la Fig.
22.
11. Anticuerpo según la reivindicación 1, en
donde la célula de mamífero es una célula cancerígena.
12. Anticuerpo según la reivindicación 11, que
inhibe el crecimiento de células cancerígenas que expresan PSCA
in vivo.
13. Anticuerpo según la reivindicación 12, que
es un anticuerpo humanizado o humano.
14. Anticuerpo según la reivindicación 13, que
es producido en bacterias.
15. Anticuerpo según la reivindicación 13, que
es una forma humanizada de un anticuerpo anti-PSCA
producido por un hibridoma seleccionado entre el grupo de
hibridomas que presentan el número de acceso ATCC
PTA-717, PTA-718,
PTA-719, PTA-720,
PTA-880, o PTA-2265.
16. Anticuerpo de la reivindicación 12, en donde
las células cancerígenas proceden de un cáncer seleccionado entre
el grupo formado por cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de
pulmón y cáncer pancreático.
17. Anticuerpo de la reivindicación 16, en donde
el cáncer es un cáncer de próstata.
18. Ácido nucléico aislado que comprende una
secuencia que codifica un polipéptido que presenta las secuencias
de aminoácidos seleccionadas entre el grupo formado por SEQ ID Nº 3
y SEQ ID Nº 4; SEQ ID Nº 5 y SEQ ID Nº 6; SEQ ID Nº 7 y SEQ ID Nº
8; SEQ ID Nº 10 y SEQ ID Nº 11; y SEQ ID Nº 12 y SEQ ID Nº 13.
19. Vector de expresión que comprende el ácido
nucléico de la reivindicación 18 unido de forma operativa a una
secuencia reguladora de la expresión.
20. Célula que produce el anticuerpo de la
reivindicación 1.
21. Célula de la reivindicación 20, en donde la
célula es una célula de hibridoma.
22. Célula huésped que comprende el vector de la
reivindicación 19.
23. Célula huésped de la reivindicación 22, que
es una célula bacteriana.
24. Procedimiento para producir el anticuerpo
de la reivindicación 1, que comprende el cultivo de la célula de la
reivindicación 20 o de la reivindicación 21 y la recuperación del
anticuerpo del cultivo celular.
25. Composición que comprende el anticuerpo de
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 y un transportador.
26. Composición de la reivindicación 25, en
donde el anticuerpo es un anticuerpo humano o humanizado y el
transportador es un transportador farmacéutico.
27. Composición de la reivindicación 26, en
donde el anticuerpo humanizado es una forma humanizada de un
anticuerpo anti-PSCA producido por un hibridoma
seleccionado entre el grupo de hibridomas que presentan el número de
acceso ATCC PTA-717, PTA-718,
PTA-719, PTA-720,
PTA-880, o PTA-2265.
28. Procedimiento in vitro para provocar
la muerte una célula cancerígena que expresa PSCA, que comprende el
contacto de la célula cancerígena con el anticuerpo de la
reivindicación 1, produciendo así la muerte de la célula
cancerígena.
29. Procedimiento de la reivindicación 28, en
donde la célula cancerígena se selecciona entre el grupo formado
por cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón y cáncer
pancreático.
30. Procedimiento de la reivindicación 29, en
donde la célula cancerígena es una célula de cáncer de próstata.
31. Procedimiento de la reivindicación 30, en
donde el cáncer de próstata es
andrógeno-independiente.
32. Procedimiento de la reivindicación 30, en
donde la célula cancerígena procede de un cáncer de próstata
metastático.
33. Procedimiento de la reivindicación 28, en
donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo.
34. Procedimiento de la reivindicación 28, en
donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
35. Procedimiento de la reivindicación 34, en
donde el anticuerpo está conjugado con un agente citotóxico.
36. Procedimiento de la reivindicación 35, en
donde el agente citotóxico es una toxina seleccionada entre el
grupo formado por maitansinoide y caliqueamicina.
37. Procedimiento de la reivindicación 36, en
donde el agente citotóxico es un maitansinoide.
38. Procedimiento de la reivindicación 37, en
donde el anticuerpo es una forma humanizada del anticuerpo producido
por un hibridoma seleccionado entre el grupo de hibridomas que
presentan el número de acceso ATCC PTA-718,
PTA-719, PTA-720,
PTA-880, o PTA-2265.
39. Procedimiento de la reivindicación 35, en
donde el agente citotóxico es un isótopo radioactivo.
40. Anticuerpo monoclonal
anti-PSCA según cualquiera de las reivindicaciones
12 a 17 para uso en un procedimiento de tratamiento médico.
41. Uso de un anticuerpo monoclonal
anti-PSCA según cualquiera de las reivindicaciones
12 a 17 para uso en la preparación de un medicamento que alivie un
cáncer que expresa PSCA.
42. Uso según la reivindicación 41, en donde el
cáncer es un cáncer de próstata, un cáncer de vejiga, un cáncer de
pulmón o un cáncer pancreático.
43. Uso según la reivindicación 42, en donde el
cáncer es un cáncer de próstata.
44. Uso según la reivindicación 43, en donde el
cáncer de próstata es andrógeno-independiente o un
cáncer de próstata metastático.
45. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
41 a 44, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
46. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
41 a 45, en donde el anticuerpo está conjugado con un agente
citotóxico.
47. Uso de la reivindicación 46, en donde el
agente citotóxico es un maitansinoide.
48. Uso de la reivindicación 47, en donde el
maitansinoide presenta la estructura mostrada en la Fig. 22.
49. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
41 a 48, en donde el anticuerpo se administra junto con al menos un
agente quimioterapéutico.
50. Uso de la reivindicación 49, en donde el
agente quimioterapéutico es un taxano.
51. Uso de la reivindicación 49, en donde el
agente quimioterapéutico es paclitaxel o derivados del mismo.
52. Artículo de fabricación que comprende un
contenedor y una composición contenida en él, en donde la
composición comprende un anticuerpo de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17 y además comprende un prospecto que indica
que la composición se puede utilizar para tratar el cáncer de
próstata.
53. Artículo de fabricación que comprende un
contenedor y una composición contenida en él, en donde la
composición comprende un anticuerpo de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17 y además comprende un prospecto que indica
que la composición se puede utilizar para tratar el cáncer de
vejiga.
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