JP2003515330A - 抗前立腺幹細胞抗原（ｐｓｃａ）抗体組成物及び使用方法 - Google Patents

抗前立腺幹細胞抗原（ｐｓｃａ）抗体組成物及び使用方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、インヴィボにおいて哺乳動物のＰＳＣＡへの結合時に内部移行する単離された抗前立腺幹細胞抗原(ＰＳＣＡ)を提供する。また本発明は、抗ＰＳＣＡ抗体と担体を含有する組成物も含む。これらの組成物は製造品又はキットにて提供することができる。本発明の他の態様は、抗ＰＳＣＡ抗体をコードする単離された核酸、及び該単離された核酸を含有する発現ベクターにある。また抗ＰＳＣＡ抗体を生成する細胞も提供する。本発明は、抗ＰＳＣＡ抗体を産生する方法を含む。本発明の他の態様は、ガン細胞と抗ＰＳＣＡ抗体を接触させることを含むＰＳＣＡ-発現ガン細胞の死滅方法、並びに治療的有効量の抗ＰＳＣＡ抗体を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物のＰＳＣＡ-発現ガンの治療又は緩和方法にある。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 (発明の分野) 本発明は抗ＰＳＣＡ抗体組成物及びＰＳＣＡ-発現ガン細胞を殺傷する方法に
関する。
【０００２】 (発明の背景) ヒトにおいて、前立腺ガンは、男性において最も一般的に診断される悪性腫瘍
の一つであり、男性が死に至る第２の原因である。米国ガン学会では、２０００
年において、１８０４００の新たな前立腺ガンの事例が診断され、その患者の３
１９００人が死亡していると推定している。段階が進行すると前立腺ガンは骨に
転移する。初期診断及び局所的に限られた腫瘍の治療には進歩があったが、前立
腺ガンはひとたびそれが転移すると治療できなくなる。結局、ホルモン治療にお
いて転移性の前立腺ガンを患っている患者はアンドロゲン-不応性(アンドロゲン
非依存性)状態を発病し、疾患が進行し死に至る。現在、前立腺-特異抗原(ＰＳ
Ａ)が、前立腺ガンのスクリーニング、診断及びモニタリング用の腫瘍マーカー
として最も幅広く使用されている。しかしながら、ＰＳＡは良性と悪性の前立腺
疾患を正確に識別することができないため、スクリーニングのための道具として
のＰＳＡの広範囲な使用については論議されている。 ガンの段階に応じて、前立腺ガン及び膀胱ガン治療には、次の治療法：外科手
術によるガン組織の除去、放射線治療法、化学治療法、前立腺ガンの場合にはア
ンドロゲン欠乏(例えばホルモン治療法)の一つ又はそれらの組合せが含まれる。
外科的又は放射線治療は、疾患の初期段階においては、患者の生存率を有意に改
善するが、進行した場合、特にホルモン剥離に続く腫瘍の再発に対しては、治療
的選択は非常に制限される。ホルモン治療を受けている患者の多くはアンドロゲ
ン-非依存性疾患の発病が進行している。現在では、外科的又は放射線治療後に
再発した前立腺ガン患者の２０-４０％に対して、又は診断時にガンが転移して
いた患者に対して有効な治療法はない。化学治療法は、特に老年の患者において
は毒性の副作用がある。前立腺ガンの治療技術においては、特にアンドロゲン欠
乏に対する不応性疾患のための新規の治療形態の開発が急務である。
【０００３】 新規な細胞表面抗原である前立腺幹細胞抗原(ＰＳＣＡ)の同定については、例
えば米国特許第5,856,136号(ＳＣＡＨ２)、国際公開第99/14328号(プロテインＰ
ＲＯ２３２)、国際公開第98/40403号(ＰＳＣＡ)、国際公開第98/51805号(ＰＳ１
１６)及びReiterら、Proc. Natl. Acad. Sci. 95：1735-1740(1998)に記載され
ている。ＰＳＣＡは、最初、前立腺ガン患者からのＬＡＰＣ-４キセノグラフト
のｃＤＮＡライブラリからクローニングされた。 ＰＳＣＡは前立腺及び膀胱腫瘍細胞を含む、多くの細胞型の表面で発現する、
１２３アミノ酸のＧＰＩ-結合分子である。遺伝子は、８０％の前立腺ガンで増
幅された領域である８Ｑ２４.２のｍｙｃ座に位置している。ＰＳＣＡはＳＣＡ-
２と３０％の相同性を示す。該タンパク質はＮ-末端の最初の２０アミノ酸に疎
水性シグナル配列を、Ｃ末端のアミノ酸１００-１２３にＧＰＩ-アンカー配列を
有する(Reiterら(1998)の1737頁の図２)。４つの予測グリコシル化部位がある。
細胞表面タンパク質は、培養約１０時間でｔ１／２になる。ＰＳＣＡは、高度前
立腺上皮内腫瘍形成(ＰＩＮ)、及びアンドロゲン依存性と非依存性双方の前立腺
腫瘍を含む前立腺ガンのあらゆる段階にわたって広く過剰発現されることが報告
されている。インヴィボにおいてＰＳＣＡ-発現腫瘍細胞を標的にし、細胞への
結合時に内部移行可能な抗体は報告されていない。 抗体をベースとする治療法は、種々のガンの治療において非常に効果的である
ことは証明されている。例えば、ハーセプチン(HERCEPTIN)(登録商標)及びリツ
キサン(RITUXAN)(登録商標)(双方ともGenentech, S. San Francisco)は、それぞ
れ、乳ガン及び非ホジキンリンパ腫の治療に成功裏に使用されている。ハーセプ
チン(登録商標)はヒト上皮細胞増殖因子レセプター２(ＨＥＲ２)プロト-オンコ
ジーンの細胞外ドメインに選択的に結合する組換えＤＮＡ誘導ヒト化モノクロー
ナル抗体である。ＨＥＲ２タンパク質の過剰発現は、原発性乳ガンの２５-３０
％で観察されている。リツキサン(登録商標)は、正常及び悪性Ｂリンパ球の表面
で見出されるＣＤ２０抗原に対する遺伝子操作されたキメラマウス／ヒトモノク
ローナル抗体である。これらの抗体は双方ともＣＨＯ細胞において生産される。 本発明は、従来の治療方法の限界を克服し、また以下の詳細な記載から明らか
になる付加的な利点を付与する、ガンの治療のための別法を提供するものである
。
【０００４】 (発明の概要) 本発明は、インヴィボで哺乳動物細胞上のＰＳＣＡへの結合時に内部移行する
単離された抗ＰＳＣＡ抗体を提供する。これらの抗体はインヴィボにおいてＰＳ
ＣＡ-発現腫瘍細胞を標的とすることができる。特定の実施態様では、抗ＰＳＣ
Ａ抗体は、前立腺ガン、尿道ガン(例えば膀胱ガン)及び肺ガンを含むガン細胞上
のＰＳＣＡへの結合時に内部移行する。モノクローナル抗体である、内部移行す
る抗ＰＳＣＡ抗体が提供される。特定の実施態様では、抗体は、アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクションに受託番号ＰＴＡ-７１７、ＰＴＡ-７１８、ＰＴ
Ａ-７１９、ＰＴＡ-７２０、ＰＴＡ-８８０、ＰＴＡ-２２６５及びＰＴＡ-２２
６４で寄託されているハイブリドーマにより産生される１０Ｅ３、６Ｆ８、８Ｄ
１１、５Ｆ２、６Ｃ３、６Ｂ８及び１０Ｃ５である。６Ｆ８、８Ｄ１１、５Ｆ２
、６Ｂ８抗体のＶ領域配列を図１２(配列番号：３-９)に示す。配列番号：１０
、配列番号：１１、配列番号：１２又は配列番号：１３のアミノ酸配列を有する
キメラマウス-ヒト抗体ポリペプチドが提供される。本発明は、配列番号：１-１
３の任意の一つのアミノ酸配列を含む抗ＰＳＣＡ抗体及び抗体融合ポリペプチド
を提供する。 上述したモノクローナル抗体の任意のものが結合するエピトープと同じエピト
ープへの結合に対して競合する抗体がまた提供される。他の実施態様では、イン
ヴィボでＰＳＣＡ-発現ガン細胞の増殖を阻害し、又はこのような細胞及びこの
ような細胞を含む腫瘍に対してインヴィボで細胞障害性を有する単離された抗Ｐ
ＳＣＡモノクローナル抗体が提供される。
【０００５】 また本発明は、細胞障害剤又は成長阻害剤に結合している抗ＰＳＣＡ抗体を提
供する。抗体は内部移行する、及び／又は成長阻害性の抗体である。細胞障害剤
は、毒素、抗生物質、放射性同位体、又は核分解性(nucleolytic)酵素であり得
る。好ましい実施態様では、毒素はメイタンシノイド(maytansinoids)、より好
ましくは図２２に示す構造を有するメイタンシノイドである。 上述した実施態様の抗ＰＳＣＡ抗体には、無傷(全長)抗体並びに抗体断片が含
まれる。本発明の抗ＰＳＣＡ抗体には、ヒト抗体及びキメラ抗体並びに異種ポリ
ペプチドに融合した抗体Ｖ領域配列を少なくとも含む抗体融合ポリペプチドが含
まれる。好ましい実施態様では、上述した実施態様の任意のものの抗ＰＳＣＡ抗
体は、キメラ又はヒト抗体である。好ましい実施態様では、キメラ抗体はヒト化
抗体である。ヒト化抗ＰＳＣＡ抗体には、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クションに受託番号ＰＴＡ-７１７、ＰＴＡ-７１８、ＰＴＡ-７１９、ＰＴＡ-７
２０、ＰＴＡ-８８０、及びＰＴＡ-２２６５で寄託されているハイブリドーマに
より生産される任意の抗体のヒト化型が含まれ、キメラ抗体には、図１３に示す
配列番号：１０-１３のアミノ酸配列を有するものが含まれる。本発明の抗体に
は、哺乳動物又は細菌細胞で生産されるものが含まれる。
【０００６】 さらに本発明は、上述した実施態様の抗ＰＳＣＡ抗体の任意のものの一つと担
体とを含有する組成物を包含する。一実施態様では、組成物中の抗体は、ＡＴＣ
Ｃ受託番号ＰＴＡ-７１７、ＰＴＡ-７１８、ＰＴＡ-７１９、ＰＴＡ-７２０、Ｐ
ＴＡ-８８０、ＰＴＡ-２２６５及びＰＴＡ-２２６４で寄託されているハイブリ
ドーマの任意のものの一つにより生産されたモノクローナル抗体のヒト化形態、
又はヒト抗体である。特定の一実施態様では、組成物中の抗体はメイタンシノイ
ドに結合している。好ましい実施態様では、担体は製薬的に許容可能な担体であ
る。これらの組成物は製造品又はキットにて提供することができる。 本発明の他の態様は、上述した実施態様の抗ＰＳＣＡ抗体の任意のものの一つ
をコードする単離された核酸、並びに発現調節配列に作用可能に結合した単離さ
れた核酸を含んでなる発現ベクターにある。 また本発明においては、上述した抗ＰＳＣＡ抗体を生産する細胞も提供される
。一実施態様では、抗体生産細胞は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ-７１７、ＰＴＡ-
７１８、ＰＴＡ-７１９、ＰＴＡ-７２０、ＰＴＡ-８８０、及びＰＴＡ-２２６５
及びＰＴＡ-２２６４を有する特定のハイブリドーマ細胞を含むハイブリドーマ
細胞である。他の実施態様では、細胞は細菌細胞である。上述したベクターを含
む宿主細胞が特に提供される。 本発明は、上述した実施態様の細胞を培養し、細胞培養物から抗体を回収する
ことを含む、上述した実施態様の抗ＰＳＣＡ抗体の生産方法をさらに含む。
【０００７】 本発明の別の態様は、上述した何れかの実施態様の抗ＰＳＣＡ抗体とガン細胞
を接触させ、ガン細胞を死滅させることを含む、ＰＳＣＡ-発現ガン細胞の死滅
方法にある。他の態様は、哺乳動物に治療的有効量の本発明の抗ＰＳＣＡ抗体を
投与することを含む、哺乳動物におけるＰＳＣＡ-発現ガンを緩和し又は治療す
る方法にある。上述した２つの方法の好ましい実施態様では、ガンは、前立腺、
膀胱又は肺ガン、より好ましくは前立腺ガン、特にアンドロゲン非依存性前立腺
ガン細胞又は転移性前立腺ガンである。これらの方法の好ましい実施態様では、
抗ＰＳＣＡ抗体はヒト又はヒト化抗体である。他の好ましい実施態様では、抗体
は細胞障害剤、例えば毒素又は放射性同位体に結合している。好ましくは、毒素
はカリケアマイシン(calicheamicins)又はメイタンシノイド、例えば図２２の構
造を有する「ＤＭ１」である。ＰＳＣＡ-発現性ガンを緩和する方法は、化学療
法と組合せて抗ＰＳＣＡ抗体を投与することであると予想され、ここで哺乳動物
は、少なくとも１つの化学療法剤を受けている。特定の実施態様では、化学療法
剤はタキサン、例えばパクリタキセル(タキソール(TAXOL)(登録商標)又はドセタ
キセル、又はそれらの誘導体及び類似体である。 さらなる態様において、本発明は、容器と、そこに含まれる組成物を具備し、
組成物が上述した実施態様の抗ＰＳＣＡ抗体を含有し、更に組成物がＰＳＣＡ-
発現ガン、特に前立腺ガンの緩和又は治療に使用可能であることを示すパッケー
ジ挿入物を含んでなる製造品を提供する。
【０００８】 (好ましい実施態様の詳細な説明) Ｉ． 定義 ここで使用されるヒト「ＰＳＣＡ」又は「前立腺幹細胞抗原」とは、そのヌク
レオチド及びアミノ酸配列が、例えば米国特許第5,856,136号(ＳＣＡＨ２；配列
番号：４)；国際公開第99/14328号(ＰＲＯ２３２、配列番号：１のヌクレオチド
配列、図１；図２；配列番号：２のアミノ酸配列)；Reiterら, Proc. Natl. Aca
d. Sci.95：1735-1740(1998)の1737頁の図２(アミノ酸配列)；国際公開第98/518
05号(配列番号：１２及び２５)；及び国際公開第98/40403号(図１Ａ及び１Ｂ)に
開示されている、グルコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)-アンカータ
ンパク質として細胞表面で発現される１２３アミノ酸の単一サブユニット糖タン
パク質を意味する。マウスＰＳＣＡのアミノ酸配列はReiterら, Proc. Natl. Ac
ad. Sci.95：1735-1740(1998)の1737頁、図２に提供されている。タンパク質は
アミノ末端にシグナル配列を有しており、ＧＰＩ-アンカー配列はカルボキシ末
端に存在する。ヒトＰＳＣＡ配列において、アミノ酸１-２０は成熟タンパク質
で切断されるＮ末端シグナル配列を表し、アミノ酸位１００-１２３はＣ末端Ｇ
ＰＩ-アンカー配列を表す(Reiterら, 1998, 図２参照)。よって、アミノ酸２１
ないし約１００はおそらく細胞表面に存在する。ここで使用されるＰＳＣＡには
、ＰＳＣＡ生物学的活性を有するタンパク質の保存的置換変異体及び対立遺伝子
変異体が含まれる。これらの対立遺伝子変異体及び保存的置換変異体は、タンパ
ク質のＧＰＩ-結合又は分泌形態であってよい。
【０００９】 ここで使用される場合の「抗体」という用語にはモノクローナル抗体、ポリク
ローナル抗体、多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、及びそれらが所望の生
物活性を示す限り抗体断片が含まれる。「免疫グロブリン」(Ｉｇ)という用語は
、ここでは「抗体」と相互に交換可能に使用される。 「単離された抗体」とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又
は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、抗体の診断又は治療へ
の使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タ
ンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、（１）ローリ
ー法で測定して抗体の９５重量％を越え、最も好ましくは９９重量％を越えるま
で、（２）スピニングカップシークエネーターを使ったＮ末端又は内在するアミ
ノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、又は（３）クーマシ
ーブルー又は好ましくは銀染色を用いた還元又は非還元状態の下でのＳＤＳ-Ｐ
ＡＧＥにより均一になるまで、精製される。単離された抗体は、抗体の自然な環
境の少なくとも一成分が存在しないことから、組換え細胞のインサイツ抗体を含
む。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製段階によっ
て調製される。
【００１０】 塩基性４-鎖抗体ユニットは２つの同一の軽(Ｌ)鎖と２つの同一の重(Ｈ)鎖か
ら構成されるヘテロ４量体の糖タンパクである(ＩｇＭ抗体はＪ鎖と称される付
加的なポリペプチドと共に５つの塩基性ヘテロ四量体ユニットからなり、よって
１０の抗原結合を部位を有するが、分泌されたＩｇＡ抗体は重合して、Ｊ鎖と共
に２-５の塩基性４-鎖を含む多価集合を形成可能である)。ＩｇＧの場合、４-鎖
ユニットは一般的に約１５００００ダルトンである。それぞれのＬ鎖は１つの共
有ジスルフィド結合によって重鎖に結合されるが、２つのＨ鎖はＨ鎖のアイソタ
イプに応じて一又は複数のジスルフィド結合により互いに結合している。それぞ
れのＨ及びＬ鎖はまた規則的な間隔を持った鎖内ジスルフィド結合を持つ。それ
ぞれのＨ鎖は、α及びγ鎖の各々に対しては３つの定常ドメイン(ＣＨ)が、μ及
びεアイソタイプに対しては４つのＣＨドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)をＮ
末端に有する。それぞれのＬ鎖は、その他端に定常ドメイン(ＣＬ)が続く可変ド
メイン(ＶＬ)をＮ末端に有する。ＶＬはＶＨと整列し、ＣＬは重鎖の第一定常ド
メイン(ＣＨ１)と整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメ
イン間の界面を形成すると考えられている。ＶＬとＶＨは共同して対になって、
単一の抗原結合部位を形成する。異なるクラスの抗体の構造及び特性は、例えば
Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Te
rr and Tristram G. Parslow(eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, 7
1頁及び6章を参照のこと。
【００１１】 任意の脊椎動物種からのＬ鎖には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づい
て、カッパ及びラムダと呼ばれる２つの明確に区別される型の一つを割り当てる
ことができる。また、その重鎖の定常ドメイン(ＣＨ)のアミノ酸配列に応じて、
免疫グロブリンには異なったクラス又はアイソタイプを割り当てることができる
。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭという免疫グロブリンの５つの主
要なクラスがあり、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる重鎖を有する。さ
らにγ及びαのクラスは、ＣＨ配列及び機能等の比較的小さな差異に基づいてサ
ブクラスに分割され、例えば、ヒトにおいては次のサブクラス：ＩｇＧ１、Ｉｇ
Ｇ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２が発現する。
【００１２】 「可変」という用語は、可変ドメインのある部分が抗体の間で配列が広範囲に
異なることを意味する。Ｖドメインは抗原結合性を媒介し、その特定の抗原に対
する特定の抗体の特異性を定める。しかし、可変性は可変ドメインの１１０-ア
ミノ酸スパンを通して均等には分布されていない。代わりに、Ｖ領域は、それぞ
れ９-１２アミノ酸長である「高頻度可変領域」と称される極度の可変性を有す
るより短い領域によって分離された１５-３０アミノ酸のフレームワーク領域(Ｆ
Ｒ)と呼ばれる比較的不変の伸展からなる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメイン各
々は、大きなβ-シート配置をとり、３つの高頻度可変領域により接続された４
つのＦＲ領域を含み、それはループ状の接続を形成し、β-シート構造の一部を
形成することもある。各鎖の高頻度可変領域はＦＲにより他の鎖からの高頻度可
変領域とともに極近傍に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（
Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ED. Public
Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）。
定常ドメインは抗体の抗原への結合に直接は関係ないが、種々のエフェクター機
能、例えば抗体依存性細胞障害(ＡＤＣＣ)における抗体の寄与を示す。 ここで使用される場合、「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合性の原因と
なる抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は「相補性決定領域」又は
「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基(すなわち、ＶＬにおいては、およそ残基２４-３
４(Ｌ１)、５０-５６(Ｌ２)及び８９-９７(Ｌ３)、及びＶＨにおいては、およそ
１-３５(Ｈ１)、５０-６５(Ｈ２)及び９５-１０２(Ｈ３)；Kabatら, Sequences
of Proteins of Immunological Interest,５Ed. Public Health Service, Natio
nal Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991))及び／又は「高度可変ループ
」からの残基(すなわち、ＶＬにおいては、およそ残基２６-３２(Ｌ１)、５０-
５２(Ｌ２)及び９１-９６(Ｌ３)、及びＶＨにおいては、およそ２６-３２(Ｈ１)
、５３-５５(Ｈ２)及び９６-１０１(Ｈ３);Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 196:9
01-917 (1987))を含んでなる。
【００１３】 ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体
の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、
少量で存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクロー
ナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対している。さらに、異なる
決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と比べ
て、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対するものである。その
特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体によって汚染されずに合成さ
れる点で有利である。「モノクローナル」との修飾詞は、抗体を何か特定の方法
で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明におい
て有用なモノクローナル抗体は、最初にKohlerら, Nature 256, 495 (1975)によ
り記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ
法によって、細菌、真核細胞動物又は植物細胞から作ることができる(例えば、
米国特許第4,816,567号参照)。また「モノクローナル抗体」は、例えばClackson
ら, Nature 352:624-628(1991)、及びMarksほか, J. Mol. Biol. 222:581-597(1
991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離することもでき
る。 ここで、モノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種由来の
抗体あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同
一であるか相同であり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体あるいは他の抗体ク
ラスあるいはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同である
「キメラ」抗体、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りこのような抗体の
断片を特に含む(米国特許第4,816,567号;及びMorrisonほか, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 81:6851-6855(1984))。ここで関心あるキメラ抗体には、非ヒト霊長
類(例えば旧世界ザル、Ape(ヒトニザル)等)から由来する可変ドメイン抗原-結合
配列及びヒト定常領域配列を含む「プリマタイズした(primatized)」抗体を含む
。
【００１４】 「無傷」の抗体は、抗原-結合部位、並びにＣＬ及び少なくとも重鎖定常ドメ
イン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含むものである。定常ドメインは天然配列定
常ドメイン(例えば、ヒト天然配列定常ドメイン)又はそれらのアミノ酸配列変異
体であってよい。好ましくは、無傷の抗体は一又は複数のエフェクター機能を有
する。 「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可
変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ')２、及びＦｖ断
片；ダイアボディ(diabodies)；直鎖状抗体（米国特許第5,641,870号、実施例２
；Zapata等, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]）；単鎖抗体分子；及び抗
体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
【００１５】 抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片
と、容易に結晶化する能力を反映して命名された残留「Ｆｃ」断片を産生する。
Ｆａｂ断片は全長Ｌ鎖とＨ鎖の可変領域ドメイン(ＶＨ)、及び一つの重鎖の第一
定常ドメイン(ＣＨ１)からなる。各Ｆａｂ断片は抗原結合性に関して一価である
、すなわち単一の抗原-結合部位を有する。抗体のペプシン処理により、単一の
大きなＦ(ａｂ')２断片が生じ、これは２価の抗原結合部位を持つ２つのジスル
フィド結合されたＦａｂ断片にほぼ対応し、抗原を交差結合させることができる
ものである。また、Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステ
インを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されてい
ることによりＦａｂ断片と相違する。Ｆａｂ'-ＳＨは、ここでは定常ドメインの
システイン残基(類)が遊離のチオール基を持つＦａｂ'を表す。Ｆ(ａｂ')２抗体
断片は、通常はＦａｂ'断片の対として生成され、それらの間にヒンジシステイ
ンを有する。抗体断片の他の化学的結合も知られている。 Ｆｃ断片はジスルフィドにより一緒に保持されている双方のＨ鎖のカルボキシ
ル末端部位を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域の配列により決定され
、該領域は、所定の型の細胞に見出されるＦｃレセプター(ＦｃＲ)によって認識
される部位である。
【００１６】 「Ｆｖ」は、完全な抗原-認識及び-結合部位を含む最小の抗体断片である。こ
の断片は、密接に非共有結合した１本の重鎖と１本の軽鎖の可変領域の二量体か
らなる。これら２つのドメインの折り畳みから、抗原結合のためのアミノ酸残基
に寄与し、抗体に対する抗原結合特異性を付与する６つの高頻度可変ループ(Ｈ
及びＬ鎖から、それぞれ３つのループ)が生じる。しかしながら、単一の可変ド
メイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含んでなるＦｖの半分）でさえ
、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。 「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」と略称される「単鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチ
ド鎖内に結合したＶＨ及びＶＬドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓ
ＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含
み、それはｓＦＶが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓＦｖ
の概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, R
osenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)；Borr
ebaeck 1995, 以下を参照のこと。
【００１７】 「ダイアボディ(diabodies)」という用語は、鎖間ではなく鎖内でＶドメイン
を対形成させ、結果として二価の断片、すなわち２つの抗原-結合部位を有する
断片が得られるように、ＶＨとＶＬドメインとの間に、短いリンカー(約５-１０
残基)を持つｓＦｖ断片（前の段落を参照）を構築することにより調製される小
型の抗体断片を意味する。二重特異性ダイアボディは２つの「交差」ｓＦｖ断片
のヘテロダイマーであり、そこでは２つの抗体のＶＨ及びＶＬドメインが異なる
ポリペプチド鎖上に存在する。ダイアボディは、例えば、EP 404,097; WO 93/11
161; 及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)に
より十分に記載されている。 「天然配列」ポリペプチドは、天然から誘導されたポリペプチド(例えば抗体)
と同一のアミノ酸配列を有するものである。このような天然配列ポリペプチドは
、天然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することも
できる。よって、天然配列ポリペプチドは、自然に生じるヒトポリペプチド、マ
ウスポリペプチド、又は任意の他の哺乳動物種からのポリペプチドのアミノ酸配
列を有することができる。 「アミノ酸配列変異体」という用語は、天然配列ポリペプチドと或る程度異な
っているアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。通常、ＰＳＣＡのアミ
ノ酸配列変異体は天然配列ＰＳＣＡと少なくとも約７０％、好ましくは少なくと
も約８０％、さらに好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも
約９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有している。アミノ酸配
列変異体は、天然アミノ酸配列のアミノ酸配列内の或る位置において置換、欠失
及び／又は挿入を有している。
【００１８】 抗体の「機能的断片又は類似体」という語句は、全長抗体と共通した定性的生
物学的活性を有する化合物である。例えば、抗ＩｇＥ抗体の機能的断片又は類似
体は、高親和性レセプターＦｃεＲＩに結合する能力を有するような分子の能力
を防止し又は実質的に低減させるような形でＩｇＥ免疫グロブリンに結合可能な
ものである。 「相同性」とは、アミノ酸配列変異体において、最大のパーセント相同性を達
成するために、必要ならば間隙を導入して、配列を整列させた後に同一である残
基のパーセンテージとして定義される。アラインメントのための方法およびコン
ピュータープログラムは本技術分野においてよく知られているものである。その
ようなコンピュータープログラムの一つは、ジェネンテック社により著作された
「Align2」で、1991年12月10日にアメリカ合衆国著作権庁、Washington, DC 205
59に利用者資料を付して提出されている。
【００１９】 非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、非ヒト抗体から得られた最小
配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの
高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所
望の抗体特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変領
域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。あ
る場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する
非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも
ドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特
性をさらに洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、
典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、全てあるいはほとんど全
ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほ
とんど全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、場合
によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの
定常領域の少なくとも一部を含んでなる。さらなる詳細は、Jones等, Nature 32
1, 522-525(1986)；Reichmann等, Nature 332, 323-329(1988)；及びPresta, Cu
rr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992)を参照のこと。
【００２０】 ここで使用される場合、「内部移行する」抗ＰＳＣＡ抗体とは、哺乳動物細胞
上のＰＳＣＡ(すなわち細胞表面ＰＳＣＡ)への結合時に細胞によって取り込まれ
る(すなわち入る)もののことである。もちろん、内部移入抗体には、抗体断片、
ヒト又はヒト化抗体及び抗体コンジュゲートが含まれる。治療用途においてはイ
ンヴィボにおける内部移行が考慮される。内部移行した抗体分子の数はＰＳＣＡ
-発現細胞、特にＰＳＣＡ-発現ガン細胞を死滅させるのに十分な、又は適切な数
である。抗体又は抗体コンジュゲートの効能に応じて、ある例においては、細胞
への単一の抗体分子の取込みが、抗体が結合する標的細胞を死滅させるのに十分
である。例えば、ある毒素は高い殺傷効能を有しており、抗体に結合した一分子
の毒素の内部移行で、腫瘍細胞を死滅させるのに十分である。 哺乳動物細胞においてＰＳＣＡへの結合時に抗ＰＳＣＡ抗体が内部移行したか
否かは、以下の実施例に記載したものを含む種々のアッセイにより決定すること
ができる。例えば、インヴィボにおける内部移行を試験するために、試験抗体を
標識し、所定の細胞表面にＰＳＣＡが発現していることが分かっている動物に導
入する。抗体は、例えば放射標識、又は蛍光もしくは金粒子で標識することがで
きる。このアッセイに適した動物には、ヒトＰＳＣＡ発現腫瘍移植片又は異種移
植片を含むＮＣＲヌードマウス、又はヒトＰＳＣＡで形質移入した細胞が導入さ
れたマウス、又はヒトＰＳＣＡ導入遺伝子を発現するトランスジェニックマウス
等の動物が含まれる。適切なコントロールには、試験抗体を受容していない、又
は関連のない抗体を受容した動物、及び関心ある細胞において他の抗原に対する
抗体を受容した動物が含まれ、ここでその抗体は抗原への結合時に内部移行する
ことが知られているものである(例えば、実施例３においてヒト乳房腫瘍株化細
胞ＭＣＦ-７に発現したＨｅｒ２に結合するハーセプチン)。抗体は、例えば静脈
注射により動物に投与することができる。適切な間隔をあけて、動物の組織切片
は公知の方法を使用するか、又は以下の実施例に記載されているようにして調製
することができ、光学顕微鏡又は電子顕微鏡により、内部移行度合い、並びに細
胞内の内部移行した抗体の位置が分析される。インヴィトロにおける内部移行に
対しては、細胞を、培養培地に添加された適切な抗体の存在又は不在下で組織培
養皿にてインキュベートし、所定の時点で顕微鏡分析するためにプロセシングす
る。細胞内の内部移行した標識化抗体の存在は、顕微鏡、又は放射標識された抗
体が使用されるならばオートラジオグラフィーにより、直接可視化することがで
きる。あるいは、定量的生化学アッセイにおいては、ＰＳＣＡ-発現細胞を含有
する細胞の個体群を、放射標識された試験抗体とインヴィトロ又はインヴィボで
接触させ、細胞(インヴィボにおいて接触させたならば、次に適当な時間の後に
細胞を単離する)をプロテアーゼで処理するか、又は酸洗浄にかけて、細胞表面
上の内部移行していない抗体を除去する。細胞を粉砕し、プロテアーゼ耐性の量
、各バッチの細胞に関連する１分当たりの放射性カウント(ｃｐｍ)を、シンチレ
ーションカウンターにホモジェネートを通して測定する。放射標識された抗体の
公知の特定の活性に基づき、細胞当たりの内部移行した抗体分子の数は、粉砕し
た細胞のシンチレーションカウントから推定することができる。例えば培養皿又
はフラスコの細胞培養培地に細胞を添加し、抗体に細胞が均一にさらされるよう
に培地と抗体をよく混合することにより、好ましくは溶液形態で、細胞は抗体と
インヴィトロで「接触させる」。培養培地に添加する代わりに、細胞を、所望の
時間、テスト用チューブに入ったＰＢＳ等の等張液において抗体と接触させるこ
ともできる。インヴィボにおいては、患者に投与する場合、以下に記載する投与
方法等の、試験抗体を投与するための任意の適切な方法により、細胞は抗体と接
触させる。
【００２１】 インヴィボでのＰＳＣＡ発現細胞への結合時において抗体の内部移行の速度が
速くなればなる程、例えば細胞障害性免疫コンジュゲートにより、標的とするＰ
ＳＣＡ-発現細胞での所望の死滅又は成長阻害効果をより早く達成することがで
きる。好ましくは、抗ＰＳＣＡ抗体の内部移行の速度（キネティクス）は、ＰＳ
ＣＡ-発現標的細胞の迅速な殺傷が望ましいようになされる。よって、抗ＰＳＣ
Ａ抗体は、インヴィボで抗体を投与してから２４時間以内、より好ましくは１２
時間以内、さらにより好ましくは３０分ないし１時間以内、最も好ましくは３０
分以内に速やかな内部移行を示すことが望ましい。本発明はインヴィボにおいて
抗ＰＳＣＡ抗体を導入した時間から約１５分と、非常に早く内部移行する抗体を
提供する。抗体は、好ましくは、細胞表面上のＰＳＣＡへの結合時に数時間以内
、好ましくは１時間以内、より好ましくは１５-３０分内で細胞中に内部移行す
る。
【００２２】 試験抗体が、ＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマにより生産される抗体を含
む本発明の抗ＰＳＣＡ抗体が結合したエピトープと同じエピトープへの結合に対
して競合可能であるか否かを決定するために、交差ブロッキングアッセイ、例え
ば競合ＥＬＩＳＡアッセイを実施することができる。例示的な競合ＥＬＩＳＡア
ッセイにおいては、マイクロタイタープレートのウェルのコートしたＰＳＣＡを
候補の競合抗体を伴い又は伴わないでプレインキュベートし、ついでビオチン標
識された本発明の抗ＰＳＣＡ抗を添加する。ウェル中のＰＳＣＡ抗原に結合した
標識抗ＰＳＣＡ抗体の量は、アビジンペルオキシダーゼコンジュゲートと適切な
基質を使用することで測定される。抗体は放射標識又は蛍光標識、又は検出可能
で測定可能な他の標識で標識することができる。抗原に結合した標識された抗Ｐ
ＳＣＡ抗体の量は、同じエピトープへの結合に対して競合する候補競合抗体(試
験抗体)の能力に間接的に相関している。すなわち同じエピトープに対する試験
抗体の親和性が大きくなればなる程、標識された抗体の抗原コートウェルへの結
合性は低下する。候補の競合抗体が存在しない状態(しかし、公知の非競合抗体
は存在していてもよい)で平行して実施されたコントロールと比較して、候補抗
体が、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２０-５０％、さらに好ましく
は少なくとも５０％、ＰＳＣＡ抗体の結合をブロックできるならば、該候補競合
抗体は本発明の抗ＰＳＣＡ抗体と同じエピトープに実質的に結合するか、又は同
じエピトープへの結合に対して競合する抗体であると考えられる。このアッセイ
を変形して実施しても、同じ定量値に達することができることは理解されるであ
ろう。
【００２３】 モノクローナル抗体１０Ｅ３、６Ｆ８、８Ｄ１１及び５Ｆ２の何れかのように
、指定された抗体の「生物学的特徴」を有する抗体は、同じ抗原ＰＳＣＡに結合
する他の抗体とは区別される抗体の生物学的特徴を一又は複数有するものである
。例えば、６Ｆ８の生物学的特徴を有する抗体は、６Ｆ８が結合する同じエピト
ープに結合して(例えば、ＰＳＣＡに対するモノクローナル抗体６Ｆ８の結合に
競合するか、又はその結合をブロックする)、インヴィボにおいてＰＳＣＡ発現
腫瘍細胞を標的とし、インヴィボにおいて哺乳動物細胞上のＰＳＣＡへの結合時
に内部移行する。同様に、５Ｆ２又は６Ｂ８抗体の生物学的特徴を有する抗体は
、該抗体と同じエピトープ結合性、標的性、内部移行性、腫瘍成長阻害性及び細
胞障害性を有する。
【００２４】 「アンタゴニスト」抗体なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した
天然ＰＳＣＡタンパク質の生物学的活性を部分的又は完全に阻止、阻害、又は中
和する抗体を含む。ＰＳＣＡポリペプチドのアンタゴニストの同定方法は、ＰＳ
ＣＡポリペプチド又は細胞表面においてＰＳＣＡを発現している細胞を候補アン
タゴニスト抗体と接触させ、ＰＳＣＡポリペプチドに通常付随する一又は複数の
生物学的活性の検出可能な変化を測定することを含みうる。 「ＰＳＣＡを発現する腫瘍細胞の成長を阻害する抗体」又は「成長阻害」抗体
という用語は、ＰＳＣＡを発現又は過剰発現しているガン細胞に結合し、その結
果として該ガン細胞の測定可能な成長阻害を生じるものである。好ましい成長阻
害抗ＰＳＣＡ抗体は、適切なコントロールと比較して、２０％以上、好ましくは
約２０％〜約５０％、より好ましくは５０％以上(例えば、約５０％〜約１００
％)、ＰＳＣＡ-発現腫瘍細胞の成長を阻害するもので、ここでコントロールとは
典型的には試験される抗体で処理されていない腫瘍細胞である。成長阻害度は、
細胞培養中約０．１〜３０μｇ／ｍｌ又は０．５ｎＭ〜２００ｎＭの抗体濃度で
測定することができ、ここで成長阻害度は抗体に腫瘍細胞を暴露させて１-１０
日後に測定したものである。インヴィボにおける腫瘍細胞の成長阻害度は以下の
実施例の項に記載するような、種々の方法により測定することができる。抗ＰＳ
ＣＡ抗体を約１μｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重で投与した場合に、抗
体の最初の投与から５日ないし３ヶ月内、好ましくは約５日〜３０日以内に腫瘍
サイズ又は腫瘍細胞の増殖が低減されていたならば、該抗体はインヴィボにおい
て成長阻害性であるとされる。
【００２５】 「アポトーシスを誘発する」抗体は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、
細胞収縮、小胞体の拡張、細胞断片化、及び／又は膜小胞の形成(アポトーシス
体と呼ばれる)等により決定されるようなプログラム細胞死を誘発するものであ
る。細胞は、通常、ＰＳＣＡを過剰発現しているものである。好ましくは、細胞
は腫瘍細胞、例えば前立腺、乳房、卵巣、胃、子宮内膜、肺、腎臓、結腸、膀胱
細胞である。アポトーシスに伴う細胞のイベントを評価するために種々の方法が
利用できる。例えば、ホスファチジルセリン(ＰＳ)転位置をアネキシン結合によ
り測定することができ；ＤＮＡ断片化はＤＮＡラダーリングにより評価すること
ができ；ＤＮＡ断片化に伴う細胞核／染色質凝結は低二倍体細胞の何らかの増加
により評価することができる。好ましくは、アネキシン結合アッセイにおいて、
アポトーシスを誘発する抗体は、未処理細胞の約２〜５０倍、好ましくは約５〜
５０倍、最も好ましくは約１０〜５０倍のアネキシン結合を誘発するという結果
を生じるものである。 抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域又はア
ミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に帰する生物学的活性を意味し、抗体のアイソタイ
プにより変わる。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性
細胞障害；Ｆｃ領域結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)；貪食作
用；細胞表面レセプター（すなわち、Ｂ細胞レセプター）のダウンレギュレーシ
ョン；及びＢ細胞活性化が含まれる。
【００２６】 「抗体依存性細胞媒介性細胞障害」又は「ＡＤＣＣ」とは、ある種の細胞障害
細胞(例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ）上
に存在するＦｃレセプター(ＦｃＲｓ)と結合した分泌Ｉｇにより、これらの細胞
障害エフェクター細胞が抗原-担持標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒に
より標的細胞を死滅させることを可能にする細胞障害性の形態を意味する。抗体
は細胞障害細胞を「備えて」おり、これはこのような死滅には絶対に必要なもの
である。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現す
るのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。
造血細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-
92 (1991) の４６４頁の表３に要約されている。関心ある分子のＡＤＣＣ活性を
アッセイするために、米国特許第5,500,362号又は同5,821,337号に記載されてい
るようなインヴィトロＡＤＣＣアッセイを実施することができる。このようなア
ッセイにおいて有用なエフェクター細胞には、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）及
びナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）が含まれる。代わりとして、もしくは付加
的に、関心ある分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynesら, PNAS (USA) 95:652-
656 (1998)において開示されているような動物モデルにおいて、インヴィボで評
価することが可能である。
【００２７】 「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプター
を記載するものである。好適なＦｃＲは天然配列ヒトＦｃＲである。さらに好適
なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマレセプター）と結合するもので、ＦｃγＲＩ、
ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含み、これらのレセ
プターの対立遺伝子変異体、選択的にスプライシングされた形態のものも含まれ
る。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性型レセプター」）及
びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害型レセプター」）が含まれ、主としてその細胞質ドメ
インは異なるが、類似のアミノ酸配列を有するものである。活性型レセプターＦ
ｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター活性化モチー
フ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif ;ITAM）を含んでいる。
阻害型レセプターＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセ
プター阻害性モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif ;IT
IM）を含んでいる（Daeron, Annu. Rev. immunol. 15:203-234 (1997)を参照）
。ＦｃＲsに関しては、 Ravetch and Kinet, Annu.Rev. Immunol. 9:457-92 (19
91); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); 及びde Haasら, J.Lab. C
lin. Med. 126:330-41 (1995) に概説されている。他のＦｃＲs、ここでは、将
来的に同定されるものも含めて、「ＦｃＲ」という言葉によって包含される。ま
た、該用語には、母性ＩｇＧｓが胎児に受け継がれる要因となっている新生児性
レセプターＦｃＲｎ（Guyerら, J. Immunol. 117:587 (1976) Kimら, J. Immuno
l.24:249 (1994))も含まれる。
【００２８】 「ヒトエフェクター細胞」とは、一又は複数のＦｃＲｓを発現し、エフェクタ
ー機能を実行する白血球のことである。その細胞が少なくともＦｃγＲＩＩＩを
発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行することが望ましい。ＡＤＣＣを媒介
するヒト白血球の例として、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー
（ＮＫ）細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞及び好中球が含まれるが、ＰＢＭＣｓと
ＮＫ細胞が好適である。エフェクター細胞は天然源、例えば血液から単離しても
よい。 「補体依存性細胞障害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解す
ることを意味する。典型的な補体経路の活性化は補体系(Ｃｌｑ)の第１補体が、
同族抗原と結合した(適切なサブクラスの)抗体に結合することにより開始される
。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro
等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施すること
ができる。
【００２９】 「ガン」及び「ガン性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特
徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。ガンの例には、こ
れらに限定されるものではないが、ガン腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白
血病又はリンパ様悪性腫瘍が含まれる。このようなガンのより特定の例には、扁
平細胞ガン(squamous cell cancer)(例えば扁平上皮細胞ガン)、小細胞肺ガン、
非小細胞肺ガン、肺の腺ガン、及び肺の扁平ガン腫(squamous carcinoma)を含む
肺ガン、腹膜ガン、肝細胞ガン、胃腸ガンを含む胃(gastric)又は腹部(stomach)
ガン、膵臓ガン、神経膠芽細胞腫、子宮頸管ガン、卵巣ガン、肝臓ガン、膀胱ガ
ン、尿道ガン、肝ガン、乳ガン、結腸ガン、直腸ガン、結腸直腸ガン、子宮内膜
又は子宮ガン、唾液腺ガン、腎臓(kidney)又は腎(renal)ガン、前立腺ガン、産
卵口ガン、甲状腺ガン、肝臓ガン、肛門ガン、陰茎ガン、黒色腫、多発性骨髄腫
及びＢ-細胞リンパ腫、脳、並びに頭部及び頸部のガン、及び関連した転移が含
まれる。
【００３０】 「ＰＳＣＡ-発現細胞」は、細胞表面上の内因性の又は形質移入したＰＳＣＡ
を発現する細胞である。「ＰＳＣＡ-発現ガン」は、ＰＳＣＡタンパク質が細胞
表面に存在する細胞を含むガンである。「ＰＳＣＡ-発現ガン」はその細胞表面
上に十分なレベルのＰＳＣＡを産生し、抗ＰＳＣＡ抗体はそこに結合して、ガン
に対する治療効果を持つ。ＰＳＣＡを「過剰発現させる」ガンは、その細胞表面
におけるＰＳＣＡのレベルが、同じ組織型の非ガン細胞に比べて有意に高いもの
のことである。このような過剰発現は遺伝子増幅又は転写もしくは翻訳の増加に
起因する。ＰＳＣＡ過剰発現は、細胞表面上に存在するＰＳＣＡタンパク質の増
加したレベルを評価することにより、診断又は予後アッセイにおいて測定されう
る(例えば、免疫組織化学的アッセイ；ＦＡＣＳ分析)。あるいは、又は付加的に
、蛍光インサイツハイブリッド形成；(FISH；1998年10月に公開された国際公開
第98/45479号を参照のこと)、サザンブロット、ノーザンブロット、又はポリメ
ラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)技術、例えば実時間定量ＰＣＲ(ＲＴ-ＰＣＲ)により、
細胞内のＰＳＣＡ-コード化核酸又はｍＲＮＡのレベルを測定してもよい。また
、血清等の生体液の分断抗原を、例えば抗体-ベースアッセイを使用して測定す
ることにより、ＰＳＣＡの過剰発現を研究してもよい(例えば、1990年6月12日に
発行された米国特許第4,933,294号；1991年4月18日に公開された国際公開第91/0
5264号；1995年3月28日に発行された米国特許第5,401,638号；及びSiasら, J. I
mmunol. Methods 132：73-80(1990)を参照のこと)。上述したアッセイの他に、
種々のインヴィボアッセイが当業者に利用される。例えば、患者の体内で細胞を
、例えば放射性同位体等の検出可能な標識で標識されていてもよい抗体にさらし
、患者の細胞に対する抗体の結合性を、例えば放射性の外部スキャニング、又は
抗体にさらされる前に患者から取り込んだバイオプシーの分析により評価するこ
とができる。ＰＳＣＡ-発現ガンには、前立腺、膀胱、肺、子宮及び乳房のガン
が含まれる。
【００３１】 ガンの治療又はガンの徴候の緩和の目的のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭
及び農業用動物、及び動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、
ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどを含む任意の哺乳動物を称する。
好ましくは、哺乳動物はヒトである。 ここで使用される「治療する」又は「治療」又は「緩和」とは、治癒的療法、
及び予防的又は防止的手段の両方を意味し、目的は標的とする病理学的状態又は
疾患を防止又は遅延化させる（少なくする）ことにある。治療が必要なものとは
、既に疾患に罹っているもの、並びに疾患に罹りやすいもの又は疾患が防止され
るべきものを含む。患者又は哺乳動物は、本発明の方法で治療量の抗ＰＳＣＡ抗
体を受けた後、患者が、次のものの一又は複数において観察可能及び／又は測定
可能な低減又は消失が示されるならば、ＰＳＣＡ-発現ガンが成功裏に「治療」
されている：ＰＳＡレベルの低減、ガン細胞数の低減又はガン細胞の消失；腫瘍
サイズの低減；軟組織及び骨へのガンの拡大を含む末梢器官におけるガン細胞浸
潤の阻害(すなわち、有る程度の拡散の遅延化、好ましくは停止)；腫瘍転移の阻
害(すなわち、有る程度の拡散の遅延化、好ましくは停止)；ある程度、腫瘍成長
の阻害；及び／又は特定のガンに関連した一又は複数の徴候のある程度の軽減；
羅漢率及び死亡率の低減、及び人生の問題の質的改善。抗ＰＳＣＡ抗体がガン細
胞の成長を防止し及び／又は存在するガン細胞を死滅させる限り、それは細菌増
殖抑制性及び／又は細胞障害性である。これらの前兆又は徴候の低減は患者にも
感じられるであろう。
【００３２】 疾患の成功裏の治療及び改善を評価するための上述したパラメータは、医師に
よく知られている常套的な手段により、容易に測定可能である。ガン治療におけ
る効能は、例えば病状の進行時間(ＴＴＰ)の評価、及び／又は応答速度(ＲＲ)の
決定により測定され得る。前立腺ガンに対しては、治療の進行は血清ＰＳＡ(前
立腺特異的抗原)レベルを測定することによる常套的な方法で評価することがで
き；血中のＰＳＡレベルが高くなればなる程、ガンが広がっている。ＰＳＡを検
出するための市販のアッセイ、例えばHybitech Tandem-Ｅ及びTandem-Ｒ ＰＳＡ
アッセイキット、Yang ProsCheck polyclonal assay(Yang Labs, Bellevue, WA)
、Abbott Imx(Abbott Labs, Abbott Park, IL)等を利用できる。転移はステージ
ングテスト及び骨のスキャニングにより測定可能で、骨への広がりを測定するた
めには、カルシウムレベル及び他の酵素を試験する。またＣＴスキャンを実施し
て、領域内の骨盤及びリンパ節への広がりを探査することができる。胸部Ｘ線及
び公知の方法による肝臓酵素レベルの測定が、肺及び肝臓へのそれぞれの転移を
探査するために使用される。疾患のモニタリングのための他の常套的な方法には
、経直腸的超音波検査(ＴＲＵＳ)及び経直腸的針バイオプシー(ＴＲＮＢ)が含ま
れる。 より局在化したガンである膀胱ガンに対しては、疾患の進行を測定するための
方法には、膀胱鏡による泌尿細胞学的評価、尿中の血液の存在性のモニタリング
、音波ホログラフィー又は静脈内腎盂像による尿路上皮管の可視化、コンピュー
タＸ線断層撮影法(ＣＴ)及び磁気共鳴映像法(ＭＲＩ)が含まれる。遠位転移の存
在は、腹部のＣＴ、胸部Ｘ線、又は骨格の放射線核種映像法により評価すること
ができる。
【００３３】 「治療的有効量」という用語は、患者又は哺乳動物の疾患又は疾病を「治療」
するのに効果的な抗体又は薬剤の量を意味する。ガンの場合には、治療的有効量
の薬剤により、ガン細胞の数が減少し；腫瘍の大きさが小さくなり；末梢器官に
おけるガン細胞浸潤が阻害され(すなわち、ある程度の遅延化、好ましくは停止)
；腫瘍の転移が阻害され(すなわち、ある程度の遅延化、好ましくは停止)；ある
程度、腫瘍成長が阻害され；及び／又はガンに関連した一又は複数の徴候がある
程度軽減される。上述の「治療する」の定義を参照。薬剤がガン細胞の成長を防
止し、及び／又は存在するガン細胞を死滅させるならば、それは細胞成長抑制性
及び／又は細胞障害性であり得る。 「慢性」投与とは、急性様式とは異なり連続的な様式で薬剤(類)を投与し、初
期の治療効果（活性）を長時間に渡って維持することを意味する。「間欠」投与
とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる
処置である。 一又は複数のさらなる治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時（同時期）及
び任意の順序での連続した投与を含む。
【００３４】 ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定化
剤を含み、用いられる用量及び濃度でそれらに暴露される細胞又は哺乳動物に対
して非毒性である。生理学的に許容可能な担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であること
が多い。生理学的に許容可能な担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有
機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基
未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫
グロブリン；疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば
グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン；グルコース、マ
ンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ
等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム
等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばTWEENＴＭ、ポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びPLURONICSＴＭを含む。
【００３５】 ここで用いられる「細胞障害剤」なる用語は、細胞の機能を阻害又は抑制する
及び／又は細胞破壊を生ずる物質を称する。この用語は、放射性同位体(例えば
、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１ ５３ 、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体)、化学療法剤、例えばメト
トレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカノイド類(ビンクリスチン、ビ
ンブラスチン、エトポシド)、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシン
Ｃ、クロラムブチル、ダウノルビシン又は他の挿入剤(intercalating agents)、
酵素及びそれらの断片、例えば核分解性酵素、抗体、及び毒素、例えば細菌、真
菌、植物又は動物由来の酵素的活性毒素小分子毒素、それらの断片及び／又は変
異体を含む。他の細胞障害剤を以下に記載する。殺腫瘍性剤により腫瘍細胞の破
壊が生じる。 ここで使用される場合の「成長阻害剤」とは、インヴィトロ又はインヴィボの
いずれかにおいて、細胞、特にＰＳＣＡ発現ガン細胞の成長を阻害する化合物又
は組成物を称する。よって、成長阻害剤とは、Ｓ相におけるＰＳＣＡ発現細胞の
パーセンテージを有意に低減させるものである。成長阻害剤の例には、細胞分裂
周期の進行をブロックする薬剤(Ｓ相以外の場所において)、例えばＧ１停止及び
Ｍ相停止を誘発する薬剤が含まれる。伝統的なＭ相ブロッカーには、ビンカ(ビ
ンクリスチン及びビンブラスチン)、タキサン、及びトポイソメラーゼＩＩイン
ヒビター、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド
、及びブレオマイシンが含まれる。Ｇ１を停止させるこれらの薬剤、例えばＤＮ
Ａアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニソン、ダカーバジン、メクロ
レタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びａｒ
ａ-ＣがＳ相停止に溢流する。更なる情報は、Murakamiらにより「細胞分裂周期
の調節、オンコジーン、及び抗新生物薬」と題された、ガンの分子的基礎、Mend
elsohn及びIsrael編、第１章(WB Saunders；Philadelphia, 1995)、特に１３頁
に見出すことができる。タキサン(パクリタキセル及びドセタキセル)は、双方と
もイチイ木から得られる抗ガン剤である。ヨーロッパイチイから得られるドセタ
キセル(TAXOTERE(登録商標)、Rhone-Poulenc Rorre)は、パクリタキセル(TAXOL(
登録商標)、Bristol-Myers Squibb)の半合成類似体である。パクリタキセル及び
ドセタキセルはチューブリン二量体からの微小管のアセンブリを促進し、解重合
を防止することで微小管を安定化し、結果として細胞の有糸分裂が阻害される。
【００３６】 ここで使用される「標識」とは、「標識された」抗体を生じせしめるために、
抗体に直接的に又は間接的に結合した検出可能な化合物又は組成物を称する。標
識はそれ自体が検出可能(例えば、放射性標識又は蛍光標識)であり得、あるいは
酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変化を触媒しうる
。 「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチ
ド」に融合した抗ＰＳＣＡ抗体ポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチドを
称す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するに十
分な残基を有しているが、その長さは、融合するＩｇポリペプチドの活性を阻害
しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエ
ピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリ
ペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミ
ノ酸残基(好ましくは約１０〜約２０のアミノ酸残基)を有する。 「小分子」とは、ここで約５００ダルトン未満の分子量を有するものと定義さ
れる。 「パッケージ挿入物」という用語は、指示、用法、用量、投与方法、禁忌及び
／又はかかる治療製品の使用に関する警告についての情報を含む、治療製品の市
販用パッケージに通常含まれる注意書きを指すために使用される。
【００３７】 「単離された核酸」は、天然配列に自然に付随している、他のゲノムＤＮＡ配
列並びにタンパク質又は複合体、例えばリボソーム及びポリメラーゼから実質的
に分離された、核酸、例えばＲＮＡ、ＤＮＡ又は混合ポリマーである。前記用語
には、その自然に生じる環境から取り出された核酸配列が含まれ、組換え又はク
ローンされたＤＮＡ単離物、及び化学的に合成された類似体、又は異種系から生
化学的に合成された類似体も含まれる。実質的に純粋な分子には分子の単離され
た形態が含まれる。 「ベクター」にはシャトル及び発現ベクターが含まれる。典型的には、プラス
ミド構築物は、細菌においてプラスミドの複製と選択のそれぞれのための複製開
始点(例えばＣｏｌＥ１複製起点)及び選択可能マーカー(例えばアンピシリン又
はテトラサイクリン耐性)を含む。「発現ベクター」とは、細菌又は真核生物細
胞において、本発明の抗体断片を含む抗体の発現に必要なコントロール配列又は
調節エレメントを含むベクターを意味する。適切なベクターは以下に開示される
。 本発明の抗ＰＳＣＡ抗体を産出する細胞には、親ハイブリドーマ細胞、例えば
ＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ、並びに抗体をコードする核酸が導入され
た細菌又は真核生物宿主細胞が含まれる。適切な宿主細胞を以下に開示する。
【００３８】 ＩＩ． 本発明の組成物及び方法 本発明は、抗ＰＳＣＡ抗体を提供する。好ましい実施態様では、抗ＰＳＣＡ抗
体は哺乳動物細胞の細胞表面ＰＳＣＡへの結合時に内部移行する。他の好ましい
実施態様では、抗ＰＳＣＡ抗体はＰＳＣＡを担持する腫瘍細胞を破壊するか、又
は破壊に至らしめる。 ＧＰＩアンカー分子の内部移行の経路及びキネティクスは、クラスリンをコー
トしたレセプター-媒介性内部移行経路のようには十分には研究されていない。
また、ＰＳＣＡが内部移行コンピテントであることも明らかではなかった。さら
に、抗体の内部移行能力は、親和性、親和力及び抗体のアイソタイプ、及びそれ
が結合するエピトープを含む複数の因子に依存する。我々は、ＧＰＩ-結合、細
胞表面ＰＳＣＡが、本発明の抗ＰＳＣＡ抗体による結合時に内部移行コンピテン
トであることをここに実証した。加えて、本発明の抗ＰＳＣＡ抗体が、インヴィ
ボにおいてＰＳＣＡ-発現腫瘍細胞を特異的に標的し、これらの細胞を阻害又は
死滅させることができることを実証した。抗ＰＳＣＡ抗体のこれらのインヴィボ
での腫瘍ターゲティング、内部移行及び成長阻害特性により、これらの抗体は、
例えば前立腺、尿道及び肺のガンを含む種々のガンの治療における治療的使用に
非常に適したものになる。抗ＰＳＣＡ抗体の内部移行は、抗体又は抗体コンジュ
ゲートが細胞内の作用部位を有し、抗体に結合した細胞障害剤が原形質を容易に
通過しない場合に好ましい(例えば、毒素、カリケアマイシン)。内部移行は、抗
体又は抗体に結合した薬剤が細胞内作用部位を有さない場合、例えば抗体がＡＤ
ＣＣにより、又は他のメカニズムにより腫瘍細胞を殺傷可能な場合には必要ない
。 また、本発明の抗ＰＳＣＡ抗体は種々の非治療的用途を有する。前立腺ガンの
スクリーニング又は診断のための道具としてのＰＳＡの使用が論議されていると
いう事実を考慮すると、本発明の抗ＰＳＣＡ抗体はＰＳＣＡ-発現ガンの診断及
びステージング(例えば、放射映像)に有用である。また抗体は他の細胞の精製工
程と同様、混合細胞の個体群からＰＳＣＡ-発現細胞を殺傷及び除去するために
、例えばＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロット等のインヴィトロにおけるＰＳＣＡ
の検出及び定量のための、細胞からのＰＳＣＡの精製又は免疫沈降に有用である
。
【００３９】 本発明の内部移行する抗ＰＳＣＡ抗体とは、ここでの「抗体」の定義に含まれ
る種々の形態であってよい。よって、抗体には、全長又は無傷抗体、抗体断片、
天然配列抗体又はアミノ酸変異体、ヒト化、キメラ又は融合抗体、免疫コンジュ
ゲート、及びそれらの機能的断片が含まれる。融合抗体において、抗体配列は異
種ポリペプチド配列に融合している。抗体はＦｃ領域が修飾されて、所望のエフ
ェクター機能を提供することができる。以下の段落に詳細に記載されているよう
に、適切なＦｃ領域を共に、細胞表面に結合したそのままの抗体は、例えば抗体
-依存性細胞障害(ＡＤＣＣ)を介して又は補体依存性細胞障害において補体を補
充することにより、又は他のいくつかのメカニズムにより、細胞障害性を誘発し
得る。また、副作用及び治療による合併症を最小にするようにエフェクター機能
を除去又は低減することが望まれている場合には、所定の他のＦｃ領域が使用さ
れる。 一実施態様では、抗体は、本発明の抗体と同じエピトープへの結合に競合する
か、又はこれに実質的に結合する。本発明の抗ＰＳＣＡ抗体の生物学的特徴を有
する抗体、例えばＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ-７１７、ＰＴＡ-７１８、ＰＴＡ-７
１９、ＰＴＡ-７２０、ＰＴＡ-８８０、ＰＴＡ-２２６５又はＰＴＡ-２２６４で
寄託されているハイブリドーマにより生産されるモノクローナル抗体の生物学的
特徴を有する抗ＰＳＣＡ抗体、特にインヴィボ腫瘍ターゲティング、内部移行及
び任意の細胞増殖阻害又は細胞障害特性を含むものが考察される。 特に、配列番号：１に示すヒトＰＳＣＡのアミノ酸２１-４０、又は４１-６０
、又は６１-８０、又は８１-１００に存在するエピトープに結合する抗ＰＳＣＡ
抗体が提供される。 上述した抗体の産生方法を以下に詳細に記載する。
【００４０】 本抗ＰＳＣＡ抗体は、ＰＳＣＡ-発現ガンの治療又は哺乳動物における一又は
複数のガンの徴候の緩和に有用である。このようなガンには、前立腺ガン、尿道
ガン、肺ガン、乳ガン、結腸ガン及び卵巣ガン、特に前立腺ガン腫(prostate ad
enocarcinoma)、腎細胞ガン腫、結腸直腸腺ガン、肺腺ガン、肺細胞の扁平ガン
腫、及び胸膜中皮腫が含まれる。ガンには、上述した任意の転移性ガン、例えば
前立腺ガン転移が含まれる。抗体は、哺乳動物においてＰＳＣＡを発現している
ガン細胞の少なくとも一部に結合可能で、好ましくはＨＡＭＡ反応を最小にする
か、又は誘発しないものである。好ましい実施態様では、抗体は、インヴィボ又
はインヴィトロにおいて細胞のＰＳＣＡに結合して、ＰＳＣＡ-発現腫瘍を破壊
又は殺傷するか、又はこのような腫瘍細胞の成長を阻害するのに効果的である。
このような抗体には、そのままの(ネーキッド)抗ＰＳＣＡ抗体(任意の薬剤に結
合していない)が含まれる。インヴィボにおいて腫瘍成長阻害特性を有する裸の
抗ＰＳＣＡ抗体には、以下の実施例に記載される抗体が含まれる。細胞障害又は
細胞成長阻害特性を有するそのままの抗体は、細胞障害剤と併用すると、より強
く腫瘍細胞を破壊する。細胞障害特性は、例えば細胞障害剤と抗体とを結合させ
、以下に記載するような免疫コンジュゲート形成させることにより、抗ＰＳＣＡ
抗体に付与することができる。細胞障害剤又は成長阻害剤は、好ましくは小分子
である。毒素、例えばカリケアマイシン又はメイタンシノイド、及びそれらの類
似物又は誘導体が好ましい。 本発明は、本発明の抗ＰＳＣＡ抗体と担体を含有する組成物を提供する。ガン
のターゲティングの目的のために、組成物はこのような治療の必要性に応じて患
者に投与することができ、ここで組成物は免疫コンジュゲート又はそのままの抗
体として存在する一又は複数の抗ＰＳＣＡ抗体を含有し得る。さらなる実施態様
においては、組成物は、他の療法剤、例えば化学療法剤を含む成長阻害剤又は細
胞障害剤とこれらの抗体を組合せて含有することもできる。また本発明は、本発
明の抗ＰＳＣＡ抗体と担体を含有する製剤も提供する。一実施態様において、製
剤は製薬的に許容可能な担体を含有する治療用製剤である。
【００４１】 本発明の他の態様は、内部移行する抗ＰＳＣＡ抗体をコードする単離された核
酸分子にある。Ｈ及びＬ鎖、特に高頻度可変領域残基をコードする核酸、天然配
列抗体及び変異体をコードする鎖、該抗体の修飾体及びヒト化形態を含む。 本発明は、内部移行する抗ＰＳＣＡ抗体を治療的有効量、哺乳動物に投与する
ことを含む、ＰＳＣＡ-発現ガンの治療又はガンの一又は複数の徴候を緩和する
のに有用な方法を提供する。抗体治療組成物は、医師により直接、短い期間(急
性)又は慢性的に、又は間欠的に投与することができる。また、ＰＳＣＡ-発現細
胞の成長を阻害し、該細胞を殺傷する方法も提供される。 最後に、本発明は少なくとも１つの内部移行する抗ＰＳＣＡ抗体を含有するキ
ット又は製造品を提供する。抗ＰＳＣＡ抗体を含有するキットは、例えばＰＳＣ
Ａ細胞殺傷アッセイ、細胞からのＰＳＣＡの精製又は免疫沈降における用途が見
出されている。例えば、ＰＳＣＡの単離及び精製のためには、キットはビーズ(
例えばセファロースビース)に結合した抗ＰＳＣＡ抗体を含有することができる
。インヴィトロにおけるＰＳＣＡの検出及び定量、例えばＥＬＩＳＡ又はウエス
タンブロットのための抗体を含有するキットを提供することもできる。検出に有
用なこのような抗体は、蛍光又は放射標識などの標識が付されて提供され得る。
【００４２】 ＩＩＩ．抗ＰＳＣＡ抗体の産生 次に、本発明に有用な抗体の例示的な産生技術を記載する。これらの技術のい
くつかを、さらに実施例１及び表２にＡに記載する。抗体の生産に使用されるＰ
ＳＣＡ抗原は、例えば(ホスファチジルイノシトール-ホスホリパーゼで酵素的に
切断することによって得ることができる)ＧＰＩアンカー配列を欠く可溶形態の
ＰＳＣＡを含む全長ポリペプチド又はその一部、又はタンパク質の選択部分に対
して合成されたペプチドであってよい。また、細胞表面でＰＳＣＡを発現してい
る細胞(例えば、ＰＳＣＡを過剰発現するように形質転換されたＣＨＯ又はＮＩ
Ｈ-３Ｔ３細胞；前立腺又は他のＰＳＣＡ発現腫瘍細胞系)、又はこのような細胞
から調製された膜を抗体の産生のために使用することができる。ヒト及びマウス
ＰＳＣＡのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、上述したようにして入手すること
ができる。ＰＳＣＡは、標準的な組換えＤＮＡ法を使用して、細菌又は真核生物
細胞から組換えて生成し、単離することができる。ＰＳＣＡはタグ(例えばエピ
トープタグ)又は他の融合タンパク質として発現させ、種々のアッセイにおける
単離及び同定を容易にすることもできる。種々のタグ及び融合配列に結合する抗
体又は結合タンパク質は、以下に詳細に述べるようにして入手できる。抗体の産
生に有用なＰＳＣＡの他の形態は、当業者にとっては明らかであろう。
【００４３】 タグ 種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている
。例としては、ポリ-ヒスチジン（poly-his）又はポリ-ヒスチジン-グリシン（p
oly-his-gly）タグ；flu ＨＡタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Field
等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する８
Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evan等, Molecular an
d Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］；及び単純ヘルペスウイルス糖タン
パク質Ｄ（gD）タグ及びその抗体［Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):54
7-553 (1990)］を含む。ＦＬＡＧ-ペプチド[Hoppら, BioTechnology, 6：1204-1
210(1988)]は抗-ＦＲＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体により認識される(Eastman K
odak Co., New Haven, CT)。ＦＬＡＧペプチドを含有するタンパク質の精製は、
アガロースに共有結合した抗-ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体を含有するアフ
ィニティーマトリックスを使用する免疫親和性クロマトグラフィーにより実施す
ることができる(Eastman Kodak Co., New Haven, CT)。他のタグポリペプチドは
、ＫＴ３エピトープペプチド［Martin等, Science, 255:192-194 (1992)］；α-
チューブリンエピトープペプチド［Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-151
66 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuth等
, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)］を含む。
【００４４】 (ｉ) ポリクローナル抗体 ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮
下(ｓｃ)又は腹腔内(ｉｐ)注射することにより動物に産生される。免疫化される
種において免疫原性であるタンパク質に関連抗原を結合させることが有用である
(特に合成ペプチドが使用される)。例えば、抗原は、二官能性又は誘導体形成剤
、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基
による結合)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基による)、グルタルアル
デヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲとＲ１が異なったアルキル基である
Ｒ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲを使用し、キーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)、血清
アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターに結合さ
せることができる。 動物を、例えば１００μｇ又は５μｇ(それぞれウサギ又はマウスの場合)のタ
ンパク質又はコンジュゲートを完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この
溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、
又は誘導体に対して免疫化する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバ
ントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用
いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動
物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達する
まで追加免疫する。コンジュゲートはまたタンパク融合として組換え細胞培養中
で調製することもできる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増
強のために好適に使用される。
【００４５】 (ｉｉ) モノクローナル抗体 モノクローナル抗体は、Kohlerら, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載
されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第4,8
16,567号)によって作製することができる。 ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハ
ムスターを上記したようにして免疫し、免疫化に用いられるタンパク質と特異的
に結合する抗体を生産するか又は生産することのできるリンパ球を導き出す。別
法として、リンパ球をインヴィトロで免疫することもできる。免疫化後、リンパ
球を単離し、次にリンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融剤を用
いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclona
l Antibodies: Principles and Practice,590-103頁(Academic Press, 1986))。 このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫
細胞(融合パートナーとも称される)の成長または生存を阻害する一又は複数の物
質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、成長させる。例えば、親の骨髄腫細胞が
酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ
又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための選択的培養培地は、
典型的には、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の成長を妨げる物質であるヒポキサンチン、ア
ミノプテリン及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
【００４６】 好ましい融合親骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞によ
る抗体の安定な高レベルの生産を支援し、融合していない親細胞に対して選択さ
れる選択培地に対して感受性である。好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫
系、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・セ
ンター、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡから入手し得るＭＯＰＣ-２１
及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及びアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン、ロックヴィル、メリーランド、ＵＳＡから入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-
Ａｇ８-６５３細胞から誘導されたものである。ヒト骨髄腫及びマウス-ヒトヘテ
ロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために記載されている
(Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；及びBrodeurら, Monoclonal Antibody
Production Techniques and Applications,51-63頁(Marcel Dekker, Inc., New
York, 1987))。 ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体
の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生され
るモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインヴィトロ結合検定、例
えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によ
って測定する。 モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunsonほか, Anal. Biochem., 10
7:220 (1980)のスキャッチャード分析法によって測定することができる。
【００４７】 所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞
が同定された後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な
方法により成長させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principl
es and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な
培地には、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地が包含される。加えて
、該ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインヴィボで、例えば
マウスの細胞に注射することにより成長させることができる。 サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばアフィニティー
クロマトグラフィー(例えば、プロテインＡ又はプロテインＧ-セファロースを使
用)、又はイオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラ
フィー、ゲル電気泳動、透析等のような従来からの抗体精製法により、培養培地
、腹水、又は血清から好適に分離される。 モノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、従来からの方法用いて(例え
ば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオ
リゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に分離され配列決定される
。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび
分離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、そうしない
と免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイ
ニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中にトラ
ンスフェクトし、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体を合成させることがで
きる。抗体をコードするＤＮＡの細菌中での組換え発現に関する概説論文には、
Skerraら, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262(1993)及びPlueckthum, Immu
nol. Revs., 130:151-188(1992)がある。
【００４８】 さらなる実施態様では、モノクローナル抗体又は抗体断片は、McCaffertyら,
Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファー
ジライブラリから分離することができる。Clacksonら, Nature, 352:624-628 (1
991)及び Marksら, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリ
を使用したマウス及びヒト抗体の単離を記述している。続く刊行物は、鎖混合に
よる高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生産(Marksら, Bio/Technology, 10:779-7
83[1992])、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策とし
てコンビナトリアル感染とインヴィボ組換え(Waterhouseら, Nuc.Acids.Res., 2
1:2265-2266(1993))を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗
体の単離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可
能な別法である。 抗体をコードするＤＮＡはまた、キメラ又は融合抗体ポリペプチドを生産する
ために、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメイン(ＣＨ及びＣＬ)配列を、相同的
マウス配列に代えて置換することにより(米国特許第4,816,567号；Morrisonら,
Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非
免疫グロブリンポリペプチド(異種ポリペプチド)のコード配列の全部又は一部を
融合させることで修飾できる。非免疫グロブリンポリペプチド配列は、抗体の定
常ドメインに置換され、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換さ
れて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特
異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
【００４９】 (ｉｉｉ) ヒト化抗体 非ヒト抗体をヒト化する方法は従来からよく知られている。好ましくは、ヒト
化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非
ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる
「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的にはヒト抗体の該当する配列を高頻
度可変領域配列で置換することによりウィンターと共同研究者の方法(Jonesほか
, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmannほか, Nature, 332:323-327 (1988)
、Verhoeyenほか, Science, 239:1534-1536(1988))を使用して実施することがで
きる。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質
的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許
第４，816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくらかの高頻
度可変領域及び場合によってはいくらかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位から
の残基によって置換されているヒト抗体である。
【００５０】 抗体がヒトの治療用途を意図している場合、抗原性及びＨＡＭＡ反応(ヒト抗-
マウス抗体)を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両
方の可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」で
は、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブ
ラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒトＶド
メイン配列を同定し、ヒト化抗体のヒトフレームワーク領域(ＦＲ)として受け入
れる(Simsほか, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothiaら, J. Mol. Biol., 1
96:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全
てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同
じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carterほか, Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Prestaほか, J. Immunol., 151:26
23(1993))。 更に、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持して
ヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親
及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物
の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的
に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリ
ン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは
購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能にお
ける残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合
能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原
に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ
残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般
的に、高頻度可変領域残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼし
ている。 ヒト化抗ＰＳＣＡ抗体の種々の形態が考えられる。例えばヒト化抗体は、免疫
結合体を生成するために一又は複数の細胞障害剤(類)と結合していてもよい抗体
断片、例えばＦａｂであってもよい。また、ヒト化抗体は無傷抗体、例えば無傷
ＩｇＧ１抗体であってもよい。
【００５１】 (ｉｖ)ヒト抗体 ヒト化の別法として、ヒト抗体を生成することができる。例えば、内因性の免
疫グロブリン産生がなくともヒト抗体の全レパートリーを免疫化することで産生
することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが今は可
能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合
領域(ＪＨ)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすこと
が記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列
免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。Ja
kobovitsら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovitsら, Nature
362:255-258 (1993); Bruggermanら, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特
許第5,545,806号、同5,569,825号、同5,591,669号(全てGenPharm)；同5,545,807
号；及び国際公開第97/17852号を参照されたい。
【００５２】 別法として、ファージディスプレイ技術(McCaffertyら, Nature 348：552-53[
1990])を、非免疫化ドナーからの免疫グロブリン可変(Ｖ)ドメイン遺伝子レパー
トリーから、インヴィトロでヒト抗体及び抗体断片を産出させるために使用する
ことができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、繊維状バクテリオ
ファージ、例えばＭ１３の大きい又は小さいコートタンパク質遺伝子のいずれか
においてイン-フレームをクローンし、ファージ粒子の表面において機能的抗体
断片として表示される。繊維状粒子がファージゲノムの単一ストランドのＤＮＡ
コピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択により、これらの特性を示す
抗体をコードする遺伝子の選択がなされる。よって、ファージはＢ細胞の特性の
いくつかを模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができ
る；例えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in S
tructural Biology 3：564-571(1993)を参照のこと。Ｖ-遺伝子セグメントのい
くつかの供給源がファージディスプレイのために使用可能である。Clacksonら,
Nature, 352：624-628(1991)は、免疫化されたマウス脾臓から得られたＶ遺伝子
の小ランダム組合せライブラリからの抗-オキサゾロン抗体の異なった配列を単
離した。非免疫化ヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構成可能で、抗原
(自己抗原を含む)とは異なる配列の抗体を、Marksら, J. Mol. Biol. 222：581-
597(1991)、又はGriffithら, EMBO J. 12：725-734(1993)に記載の技術に本質的
に従って単離することができる。また、米国特許第5,565,332号及び同5,573,905
号を参照のこと。 上述したように、ヒト抗体はインヴィトロ活性化Ｂ細胞により生産することが
できる(米国特許第5,567,610号及び同5,229,275号)。
【００５３】 (ｉｖ) 抗体断片 ある状況においては、全抗体よりも抗体断片を使用する方が有利である。断片
のサイズが小さいと迅速にクリアランスされ、固形腫瘍へのアクセス性が改善さ
れる。 抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これら
の断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化を介して誘導された(例えば、Morim
otoら, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)
及びBrennanら, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断
片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ及び
ＳｃＦｖ抗体断片は、全て大腸菌中で発現し、そこから分泌されて、多量のこれ
ら断片が容易に生成される。抗体断片は上において検討した抗体ファージライブ
ラリから分離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直
接回収することができ、化学的に結合してＦ(ａｂ')２断片を形成することがで
きる(Carterら, Bio/Technology 10:163-167[1992])。他のアプローチ法では、
Ｆ(ａｂ')断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。サルベー
ジレセプター結合エピトープ残基を含有し、インヴィボ半減期が増大したＦａｂ
及びＦ(ａｂ')２断片が米国特許第5,869,046号に記載されている。抗体断片を生
産するための他の技術は、当業者には明らかである。他の実施態様において、選
択された抗体は単鎖Ｆｖ断片((ｓｃＦｖ)である。国際公開第93/16185；米国特
許第5,571,894号；及び米国特許第5,587,458号を参照のこと。Ｆｖ及びｓＦｖは
定常領域を欠く無傷の結合部位を有する唯一の種であり；よってインヴィボ使用
に際して非特異的結合の減少に適している、ｓＦｖ融合タンパク質が構成されて
、ｓＦｖのアミノ又はカルボキシ末端のいずれかにエフェクタータンパク質の融
合体が生成される。上掲のAntibody Engineering, ed. Borrebaeckを参照のこと
。また、抗体断片は、例えば米国特許第5,641,870号に記載されているような「
直鎖状抗体」であってもよい。このような直鎖状抗体断片は単一特異性又は二重
特異性であってよい。
【００５４】 (ｖｉ) 二重特異性抗体 二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を
有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、ＰＳＣＡタンパク質の２つの異
なるエピトープに結合しうる。他のこのような抗体では他のタンパク質に対する
結合部位とＰＳＣＡ結合部位とが結合しうる。あるいは、抗ＰＳＣＡアームは、
ＰＳＣＡ-発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させ局在させるように、Ｆｃγ
ＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)及びＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)等のＩ
ｇＧ(ＦｃγＲ)に対するＦｃレセプター、又はＴ細胞レセプター分子(例えばＣ
Ｄ３)等の白血球上のトリガー分子に結合するアームと結合しうる。また、二重
特異性抗体はＰＳＣＡを発現する細胞に細胞障害剤を局在化するためにも使用さ
れうる。これらの抗体はＰＳＣＡ結合アーム及び細胞障害剤(例えば、サポリン(
saporin)、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトト
レキセート又は放射性同位体ハプテン)と結合するアームを有する。二重特異性
抗体は全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製す
ることができる。 国際公開第96/16673号には、二重特異性抗-ＥｒｂＢ２／抗-ＦｃγＲＩＩＩ抗
体が記載されており、米国特許第5,837,234号には、二重特異性抗-ＥｒｂＢ２／
抗-ＦｃγＲＩ抗体が開示されている。二重特異性抗-ＥｒｂＢ２／Ｆｃα抗体は
国際公開第98/02463号に示されている。米国特許第5,821,337号は、二重特異性
抗-ＥｒｂB２／抗-ＣＤ３抗体を教示するものである。
【００５５】 二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。全長二重特異
性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき
、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Millsteinら, Nature, 305:537-
539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、
これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合
物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィ
ニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩
わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開第93/08829号及びTraunecker
ら、EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。 異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗
原-抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好
ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むＩｇ重鎖定常
ドメインである。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を
、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融
合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現
ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェクトする。これにより
、組立に使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が所望の二重特異性
抗体の最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割
合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド
鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が所望の鎖の結
合にあまり影響がないときは、２または３個全てのポリペプチド鎖のためのコー
ド化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【００５６】 このアプローチ法の好適な実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異
性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハ
イブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからな
る。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提
供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロ
ブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプ
ローチ法は、国際公開第94/04690号に開示されている。二重特異性抗体を産生す
る更なる詳細については、例えばSureshら, Methods in Enzymology, 121:210 (
1986)を参照されたい。 米国特許第5,731,168号に記載された他のアプローチ法によれば、一対の抗体
分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセ
ントを最大にすることができる。好適な界面はＣＨ３ドメインの少なくとも一部
を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸
側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。
大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸
側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２
の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最
終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【００５７】 二重特異性抗体は、架橋した又は「ヘテロコンジュゲート」抗体もまた含む。
例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の一方はアビジンに結合され、他方はビオ
チンに結合され得る。そのような抗体は、例えば、不要の細胞に対する免疫系細
胞をターゲティングするため(米国特許第4,676,980号)、及びＨＩＶ感染の治療
のために提案された(国際公開第91/00360号、同92/00373号、及び欧州特許第030
89号)。ヘテロコンジュゲート抗体は、あらゆる簡便な架橋法を用いて作製する
ことができる。好適な架橋剤は当該分野において良く知られており、幾つかの架
橋技術と共に米国特許第4,676,980号に開示されている。 抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例
えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら,
Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')
２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤
、亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジ
スルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾ
アート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメル
カプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-
ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特
異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【００５８】 最近の進歩により、大腸菌からのＦａｂ'-ＳＨ断片の直接の回収が容易になり
、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalabyら,
J.Exp.Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ'
)２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、イ
ンヴィトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにし
て形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞、及びＥｒｂＢ２レセプター
を過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リ
ンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。 組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法
もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して
生産されている。Kostelnyら, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及
びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの
異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還
元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。こ
の方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollinge
rら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイ
アボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断
片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカ
ーによりＶＬにＶＨを結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメイ
ンは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、よって
２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特
異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruberら, J.Immunol.
152:5368 (1994)を参照されたい。 二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することがで
きる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。
【００５９】 (ｖｉｉ)多価抗体 多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早く
内部移行(及び／又は異化)されうる。本発明の抗体は、３又はそれ以上の結合部
位を有する多価抗体(ＩｇＭクラス以外のもの)であり得(例えば四価抗体)、抗体
のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することがで
きる。多価抗体は二量化ドメインと３又はそれ以上の抗原結合部位を有する。好
ましい二量化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域を有する(又はそれらからなる)
。このシナリオにおいて、抗体はＦｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端に３又はそ
れ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ここで、好ましい多価抗体は３な
いし８、好ましくは４の抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。多価抗体
は少なくとも１つのポリペプチド鎖(好ましくは２つのポリペプチド鎖)を有し、
ポリペプチド鎖(類)は２又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペ
プチド鎖(類)はＶＤ１-(Ｘ１)ｎ-ＶＤ２-(Ｘ２)ｎ- Ｆｃを有し、ここでＶＤ１
は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ
領域のポリペプチド鎖の一つであり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチド
を表し、ｎは０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖(類)は：ＶＨ-ＣＨ１-柔
軟なリンカー-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領
域鎖を有し得る。ここで多価抗体は、好ましくは少なくとも２つ(好ましくは４
つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに有する。ここで多価抗体は、例え
ば約２〜約８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを有する。ここで考察される軽鎖
可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを有し、場合によってはＣＬドメ
インをさらに有する。
【００６０】 (ｖｉｉｉ)他のアミノ酸配列の修飾 ここで記載する抗ＰＳＣＡ抗体のアミノ酸配列の修飾を考慮する。例えば、抗
体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれている。抗
ＰＳＣＡ抗体のアミノ酸配列変異体は、抗ＰＳＣＡ抗体核酸に適当なヌクレオチ
ド変化を導入することにより、又はペプチド合成により調製される。そのような
修飾は、例えば、抗ＰＳＣＡ抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失及び／又は挿入
及び／又は置換を含む。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせは、最終構造
物に達するまでなされるが、その最終構造物は所望の特徴を有する。また、アミ
ノ酸変化は、グリコシル化部位の数の変化などの、抗ＰＳＣＡ抗体の翻訳後過程
を変更しうる。 突然変異誘発の好ましい位置である抗ＰＳＣＡ抗体の或る残基又は領域の同定
のために有用な方法は、Cunningham及びWells, Science 244: 1081-1085 (1989)
に記載されているように「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる。
ここで、標的残基の残基又は基が同定され（例えば、arg, asp, his, lys,及びg
lu等の荷電残基）、中性又は負荷電アミノ酸（最も好ましくはアラニン又はポリ
ペプチドアニリン）に置換され、アミノ酸とＰＳＣＡ抗原との相互作用に影響を
及ぼす。次いで置換に対する機能的感受性を示すこれらのアミノ酸の位置は、置
換部位において又はそれに対して更に又は他の置換を導入することにより精密に
される。即ち、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異自体
の性質は予め決める必要はない。例えば、与えられた部位における性能を分析す
るために、ａｌａスキャンニング又はランダム突然変異誘発を標的コドン又は領
域で実施し、発現された抗ＰＳＣＡ抗体変異体を所望の活性についてスクリーニ
ングする。
【００６１】 アミノ酸配列挿入は、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドの長さ
の範囲のアミノ-及び／又はカルボキシル末端融合物、並びに一又は複数のアミ
ノ酸残基の配列内挿入物を含む。末端挿入物の例は、Ｎ-末端メチオニル残基を
持つ抗ＰＳＣＡ抗体又は細胞障害性ポリペプチドに融合した抗体を含む。抗ＰＳ
ＣＡ抗体の他の挿入変異体は、抗体の血清半減期を向上させる酵素(例えばＡＤ
ＥＰＴ)又はポリペプチドに、抗ＰＳＣＡ抗体のＮ-又はＣ-末端への融合物を含
む。 他の型の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗ＰＳＣＡ
抗体分子において少なくとも一つのアミノ酸残基が異なる残基で置換されている
。置換突然変異について最も興味深い部位は高頻度可変領域を含むが、ＦＲ交互
変化も考慮される。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表１に示す。これ
らの置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表１に「例示的置換」と名前を
付けた又はアミノ酸の分類を参照して以下に更に記載するような、より実質的な
変化を導入し、生成物をスクリーニングしてよい。
【００６２】
【００６３】 抗体の生物学的活性における実質的な修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド
骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の分子の電荷又は疎水
性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において実質的に異なる
置換基を選択することにより達成される。天然発生残基は共通の側鎖特性に基づ
いて群に分けることができる： （１）疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile; （２）中性の親水性：cys, ser, thr; （３）酸性：asp, glu; （４）塩基性：asn, gln, his, lys, arg; （５）鎖配向に影響する残基：gly, pro; 及び （６）芳香族：trp, tyr, phe。 非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを
必要とするであろう。 抗ＰＳＣＡ抗体の適切な配置の維持に含まれない任意のシステイン残基は、一
般的にセリンで置換し、分子の酸化的安定性を向上させて異常な架橋を防止する
。逆に、抗体にシステイン結合を付加して、その安定性を向上させてもよい（特
に、抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合）。
【００６４】 特に好ましい型の置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体）の一
又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的に、さらなる発展のために
選択され、得られた変異体は、それらが生成された親抗体に比較して向上した生
物学的特性を有している。そのような置換変異体を生成する簡便な方法は、ファ
ージディスプレイを使用する親和性突然変異を含む。簡潔に言えば、高頻度可変
領域部位（例えば６-７部位）を突然変異させて各部位における全ての可能なア
ミノ酸置換を生成させる。このように生成された抗体変異体は、繊維状ファージ
粒子から、各粒子内に充填されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物として表
示される。ファージディスプレイ変異体は、次いで、ここに開示されるようなそ
れらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。修
飾の候補となる高頻度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング
突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定す
ることができる。あるいは、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を
分析して抗体とヒトＰＳＣＡとの接点を同定するのが有利である場合もある。こ
のような接触残基及び隣接残基は、ここに述べた技術に従う置換の候補である。
そのような変異体が生成されたら、変異体のパネルにここに記載するようなスク
リーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を
更なる開発のために選択する。
【００６５】 抗体のアミノ酸変異の他の型は、抗体の元のグリコシル化パターンを変更する
。変更とは、抗体に見られる一又は複数の炭水化物部分の欠失、及び／又は抗体
に存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。 抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ-結合又はＯ-結合の何れかである。Ｎ
-結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。アスパラ
ギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン、ここでＸはプロリンを除く任
意のアミノ酸であるが、該トリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への炭水化物
部分の酵素的結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれ
らのトリペプチド配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作出
される。Ｏ-結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン
又はスレオニンに、糖類Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシ
ロースの一つが結合することを称するが、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロ
キシリジンもまた用いられる。
【００６６】 抗体へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、それが一又は複数の上
述したトリペプチド配列(Ｎ-結合グリコシル化部位のもの)を含むように変化さ
せることによって簡便に達成される。この変化は、元の抗体への一又は複数のセ
リン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる(Ｏ-結
合グリコシル化部位の場合)。 抗ＰＳＣＡ抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、この分野で知
られた種々の方法によって調製される。これらの方法は、限定するものではない
が、天然源からの単離（天然発生アミノ酸配列変異体の場合）又はオリゴヌクレ
オチド媒介（又は部位指向性）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセッ
ト突然変異誘発による初期調製された変異体又は抗ＰＳＣＡ抗体の非変異体の調
製を含む。
【００６７】 エフェクター機能、例えば抗体の細胞依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)及
び／又は補体依存性細胞障害(ＣＤＣ)を向上させるために、本発明の抗体を修飾
することが望ましい。このことは、抗体のＦｃ領域に一又は複数のアミノ酸置換
を導入することで達成される。別に、又は付加的にシステイン残基をＦｃ領域に
導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成させるようにして
もよい。そのようにして生成されたホモダイマーは、向上した内部移行能力及び
／又は増加した補体媒介性細胞殺傷及び抗体-依存性細胞性細胞障害（ＡＤＣＣ
）を有しうる。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, B.
J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。向上した抗腫瘍活性を持つホモダイ
マー抗体はまた、Wolff等, Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載され
たような異種二官能性架橋を用いても調製しうる。あるいは、抗体は、２つのＦ
ｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上さ
せることもできる。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)
参照。 抗体の血清半減期を増大させるために、例えば米国特許第5,739,277号に記載
されたようにして、抗体(特に抗体断片)にサルベージレセプター結合エピトープ
が導入される。ここで使用される場合の「サルベージレセプター結合エピトープ
」なる用語は、ＩｇＧ分子のインヴィボ血清半減期を増加させる原因であるＩｇ
Ｇ分子(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４)のＦｃ領域のエピ
トープを意味する。
【００６８】 (ｉｘ) 所望の特性を有する抗体のスクリーニング 抗体を生産するための技術は上述している。所望されているような、所定の生
物学的特徴を有する抗体がさらに選択される。 本発明の抗ＰＳＣＡ抗体の成長阻害効果は、当該分野において公知の方法、例
えば内在的に又はＰＳＣＡ遺伝子での形質移入に続いてＰＳＣＡを発現する細胞
を使用して評価することができる。例えば、以下の実施例２で提供されるＰＳＣ
Ａ-形質移入細胞と腫瘍株化細胞を、種々の濃度で数日間(例えば２-７)、本発明
の抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体で処理し、クリスタルバイオレット又はＭＴＴ
で染色するか、又はいくつかの他の比色アッセイで分析する。増殖度合いを測定
するための他の方法は、本発明の抗ＰＳＣＡ抗体の存在下又は非存在下で処理さ
れた細胞による３Ｈ-チミジンの取込を比較することでなされる。抗体で処理し
た後、細胞を収集し、ＤＮＡに取り込まれた放射性量をシンチレーションカウン
ターで定量する。適切な正のコントロールには、選択された株化細胞の成長を阻
害することが知られている成長阻害抗体で該株化細胞を処理したものが含まれる
。インヴィボにおける腫瘍細胞の成長阻害は、以下の実施例(例えば実施例６)に
記載したような種々の方法で測定することができる。好ましくは、腫瘍細胞はＰ
ＳＣＡを過剰発現するものである。好ましくは、抗ＰＳＣＡ抗体は、抗体濃度が
約０．５-３０μｇ／ｍｌである場合に、インヴィトロ又はインヴィボにおいて
、未処理の腫瘍細胞と比べて約２５-１００％、好ましくは約３０-１００％、さ
らに好ましくは約５０-１００％、又は７０-１００％のＰＳＣＡ-発現腫瘍細胞
の細胞増殖を阻害する。成長阻害度は、細胞培養中、約０．５〜３０μｇ／ｍｌ
又は約０．５ｎＭ〜２００ｎＭの抗体濃度で測定することができ、成長阻害度は
抗体に腫瘍細胞をさらして１-１０日後に測定される。体重当たり約１μｇ／ｋ
ｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの抗ＰＳＣＡ抗体を投与した結果、最初に抗体を投与し
て５日〜３ヶ月以内、好ましくは約５〜３０日以内に腫瘍の大きさ又は腫瘍細胞
の増殖が低減した場合、該抗体はインヴィボにおける成長阻害性である。
【００６９】 細胞死を誘発する抗体を選択するために、例えばヨウ化プロピジウム(ＰＩ)、
トリパンブルー又は７ＡＡＤの取込みにより示される膜インテグリティの損失度
合いをコントロールと比較して評価する。ＰＩ取込アッセイは補体及び免疫エフ
ェクター細胞の不在下で行うことができる。ＰＳＣＡ-発現腫瘍細胞を、例えば
約１０μｇ／ｍｌの培地単独、又は適切なモノクローナル抗体を含有する培地と
共にインキュベートする。細胞を３日間インキュベートする。各処理に続いて、
細胞を洗浄し、細胞凝塊除去のために３５ｍｍのストレーナキャップ付き１２ｘ
７５チューブ(チューブ当たり１ｍｌ、処理グループ当り３チューブ)に等分する
。サンプルをＦＡＣＳＣＡＮＴＭフローサイトメータとＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴ ＴＭ セルクエスト(CellQuest)ソフトウエア(Becton Dickinson)を使用して分析
する。ＰＩ取込みにより測定されるような、統計的に有意なレベルの細胞死を誘
発する抗体が選択される。 関心のある抗体により結合したＰＳＣＡ上のエピトープに結合する抗体をスク
リーニングするため、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, Ed Harlow及びDavid Lane(1988)に記載されているような通常の交
差ブロッキングアッセイを実施することができる。このアッセイは試験用抗体が
本発明の抗ＰＳＣＡ抗体と同様の部位又はエピトープに結合する場合に使用する
ことができる。別法として、又は付加的に、従来から公知の方法により、エピト
ープマッピングを実施することもできる。例えば、抗体配列をアラニンスキャン
ニング等により突然変異させ、接触残基を同定することもできる。最初、変異抗
体をポリクローナル抗体との結合性についてテストし、確実に適切に折り畳みさ
せる。異なる方法では、ＰＳＣＡの異なる領域に相当するペプチドを、試験用抗
体類との、又は特徴付けられているか、既知のエピトープを有する抗体と試験用
抗体との、競合アッセイに使用することができる。
【００７０】 (ｘ)免疫コンジュゲート また本発明は、細胞障害剤又は成長阻害剤等の抗ガン剤に結合した抗体を含有
する免疫コンジュゲートに関する。 このような免疫コンジュゲートの生成に有用な化学療法剤は上述している。 抗体のコンジュゲートと一又は複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、
メイタンシノイド、トリコセン(trichothene)及びＣＣ１０６５、及び毒性活性
を有するこれらの毒素の誘導体が、ここで考察される。
【００７１】 Ａ．メイタンシン及びメイタンシノイド 好ましい一実施態様では、本発明の抗ＰＳＣＡ抗体(全長又は断片)は一又は複
数のメイタンシノイド分子と結合している。 メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤
である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離さ
れたものである(米国特許第3,896,111号)。その後、ある種の微生物がメイタン
シノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ-３メイタンシノールエステルを生
成することが発見された(米国特許第4,151,042号)。合成メイタンシノール及び
その誘導体及び類似体は、例えば米国特許第4,137,230号；同4,248,870号；同4,
256,746号；同4,260,608号；同4,265,814号；同4,294,757号；同4,307,016号；
同4,308,268号；同4,308,269号；同4,309,428号；同4,313,946号；同4,315,929
号；同4,317,821号；同4,322,348号；同4,331,598号；同4,361,650号；同4,364,
866号；同4,424,219号；同4,450,254号；同4,362,663号；及び同4,371,533号に
開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。
【００７２】 Ｂ．メイタンシノイド-抗体コンジュゲート 治療指標を改善する試みにおいて、メイタンシン及びメイタンシノイドは、腫
瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体と結合している。メイタンシノイドを含有す
る免疫コンジュゲート及びそれらの治療用途は、例えば米国特許第5,208,020号
、同5,416,064号、欧州特許第0425235B1号に開示されており、その開示は出典を
明示してここに取り込まれる。Liuら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：8618-8
623(1996)には、ヒト結腸直腸ガンに対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合
するＤＭ１と命名されたメイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲートが記載
されている。前記コンジュゲートは培養された結腸ガン細胞に対して高い細胞障
害性を有することが見出されており、インヴィボ腫瘍成長アッセイにおいて抗腫
瘍活性を示す。Chariら, Cancer Research, 52：127-131(1992)には、メイタン
シノイドが、ジスルフィド結合を介して、ヒト結腸ガン株化細胞の抗原に結合す
るマウス抗体Ａ７、又はＨＥＲ-２／ｎｅｕオンコジーンに結合する他のマウス
モノクローナル抗体ＴＡに結合している免疫コンジュゲートが記載されている。
ＴＡ.１-メイタンシノイドコンジュゲートの細胞障害性はヒト乳ガン株化細胞Ｓ
Ｋ-ＢＲ-３におけるインヴィトロで試験され、細胞当たり３ｘ１０５ＨＥＲ-２
表面抗原が発現した。薬剤コンジュゲートにより、遊離のメイタンシノイド剤に
類似した細胞障害度が達成され、該細胞障害度は、抗体分子当たりのメイタンシ
ノイド分子の数を増加させることにより増加する。Ａ７-メイタンシノイドコン
ジュゲートはマウスにおいては低い全身性細胞障害性を示した。
【００７３】 Ｃ．抗ＰＳＣＡ抗体-メイタンシノイドコンジュゲート(免疫コンジュゲート) 抗ＰＳＣＡ抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体又はメイタンシノ
イド分子のいずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、メイタンシノイ
ド分子に抗ＰＳＣＡ抗体を化学的に結合させることにより調製される。１分子の
毒素／抗体は、裸抗体の使用において細胞障害性を高めることが予期されている
が、抗体分子当たり、平均３-４のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗
体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞障害性を
向上させるといった効力を示す。メイタンシノイドは当該技術分野でよく知られ
ており、公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切
なメイタンシノイドは、例えば米国特許第5,208,020号、及び他の特許、及び上
述した特許ではない刊行物に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、メ
イタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール
分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体である。 例えば、米国特許第5,208,020号又は欧州特許第0425235B1号、及びChariら, C
ancer Research, 52：127-131(1992)に開示されているもの等を含む、抗体-メイ
タンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基
がある。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チ
オエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエ
ステラーゼ不安定性基が含まれるが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好まし
い。
【００７４】 抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カ
ップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナ
ート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-
１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘
導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリ
ン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビス
アジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジ
アゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミ
ン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活
性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用し
て作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、及びジスルフィド
結合により提供されるＮ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)プロピオナー
ト(ＳＰＰ)及びＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(
ＳＰＤＰ)(Carlssonら, Biochem. J. 173：723-737[1978])が含まれる。例えば
以下の実施例７を参照のこと。 リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し
得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応さ
せることによりエステルリンカーを形成することができる。反応はヒドロキシル
基を有するＣ-３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ-１４、ヒドロキシル基で
修飾されたＣ-１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ-２０位で生じる。好まし
い実施態様において、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体の
Ｃ-３位で形成される。
【００７５】 カリケアマイシン 関心ある他の免疫コンジュゲートには、一又は複数のカリケアマイシン分子と
結合した抗ＰＳＣＡ抗体が含まれる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーは
サブ-ピコモルの濃度で二重ストランドＤＮＡ破壊を生じることができる。カリ
ケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第5,712,
374号、同5,714,586号、同5,739,116号、同5,767,285号、同5,770,701号、同5,7
70,710号、同5,773,001号、同5,877,296号(全て、American Cyanamid Company)
を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するもので
はないが、γ１ Ｉ、α２ Ｉ、α３ Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１ Ｉ、ＰＳＡＧ及びθ１ Ｉ (Hinmanら, Cancer Research, 53：3336-3342(1993)、Lodeら. Cancer Research
, 58：2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる
。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリ
ケアマイシン及びＱＦＡは双方とも、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易
に通過しない。よって抗体媒介性内部移行によるこれらの薬剤の細胞への取込に
より、細胞障害効果が大きく向上する。
【００７６】 他の細胞障害剤 本発明の抗ＰＳＣＡ抗体と結合可能な他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプ
トゾイシン、ビンクリスチン及び５-フルオロウラシル、米国特許第5,053,394号
、同5,770,710号に記載されており、集合的にＬＬ-Ｅ３３２８８複合体として公
知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第5,8
77,296号)が含まれる。 使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の
非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas
aeruginosa))、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ
-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイ
ン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca
americana)プロテイン(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・
キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロ
チン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelon
in)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマ
イシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば
、1993年10月28日公開の国際公開第93/21232号を参照のこと。 本発明は、抗体と核分解活性(nucleolytic activity)を有する化合物(例えば
リボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレア
ーゼ；ＤＮアーゼ)との間に形成される免疫コンジュゲートをさらに考察する。
【００７７】 腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい
。免疫コンジュゲートした抗ＰＳＣＡ抗体を生成するために、種々の放射性同位
体が利用される。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８ ６ 、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射
性同位体が含まれる。コンジュゲートが診断用に使用される場合、それはシンチ
グラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共
鳴(ＮＭＲ)映像(磁気共鳴映像、mriとしても公知)用のスピン標識、例えばヨウ
素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒
素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マグネシウム又は鉄を含有し得る。 放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、
ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-１９を含む適切なア
ミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えば
ｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチド
のシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-９０はリジン残基を
介して結合可能である。IODOGEN法(Frakerら(1978) Biochem. Biophys. Res. Co
mmun. 80：49-57)は、ヨウ素-１２３の導入に使用することができる。他の方法
の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Pr
ess 1989)に記載されている。
【００７８】 抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリン
グ剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(Ｓ
ＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カル
ボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例
えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジス
クシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化
合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウ
ム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイ
ソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素
化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製す
ることができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitettaら, Science 238:1098(19
87)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソ
チオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)
が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である
。国際公開第94/11026号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞障害剤の放出
を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リ
ンカー、ペプチターゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー
又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chariら, Cancer Research, 52
：127-131(1992)；米国特許第5,208,020号)。 別法として、抗ＰＳＣＡ抗体及び細胞障害剤を含有する融合タンパク質は、例
えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。ＤＮＡの長さは、コンジュ
ゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離
間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの２つの部分をコードす
る領域をそれぞれ含有する。 他の実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセ
プター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体-
レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いてキレート剤を使用し、循環か
ら未結合コンジュゲートを除去し、細胞障害剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコ
ンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
【００７９】 (ｘｉ) 抗体依存性酵素媒介性プロドラッグ治療法(ＡＤＥＰＴ) また、本発明の抗体は、プロドラッグ(例えばペプチジル化学療法剤、国際公
開第81/01145号を参照)を活性な抗ガン剤に転化させるプロドラッグ活性化酵素
に抗体をコンジュゲートさせることにより、ＡＤＥＰＴにおいて使用することが
できる。例えば国際公開第88/07378及び米国特許第4,975,278号を参照されたい
。 ＡＤＥＰＴに有用な免疫コンジュゲートの酵素成分には、より活性な細胞毒形
態に転化するように、プロドラッグに作用し得る任意の酵素が含まれる。 限定するものではないが、この発明の方法に有用な酵素には、ホスファート含
有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；
スルファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアリールスル
ファターゼ；非毒性５-フルオロシトシンを抗ガン剤５-フルオロウラシルに転化
するのに有用なシトシンデアミナーゼ；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテア
ーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン(
例えば、カテプシンＢ及びＬ)で、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に転
化するのに有用なもの；Ｄ-アミノ酸置換基を含有するプロドラッグの転化に有
用なＤ-アラニルカルボキシペプチダーゼ；炭水化物切断酵素、例えばグリコシ
ル化プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なノイラミニダーゼ及びβガ
ラクトシダーゼ；βラクタムで誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化させるの
に有用なβラクタマーゼ；及びペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれフェノキ
シアセチル又はフェニルアセチル基で、それらのアミン性窒素において誘導体化
された薬剤を遊離の薬剤に転化するのに有用なペニシリンＶアミダーゼ又はペニ
シリンＧアミダーゼが含まれる。あるいは、「アブザイム」としてもまた公知の
酵素活性を有する抗体を、遊離の活性薬剤に本発明のプロドラッグを転化させる
ために使用することもできる(例えば、Massey, Nature 328:457-458(1987)を参
照)。抗体-アブザイムコンジュゲートは、ここで記載されているようにして、腫
瘍細胞個体群にアブザイムを送達するために調製することができる。 この発明の酵素は、当該分野においてよく知られている技術、例えば上で検討
したヘテロ二官能性架橋試薬を使用することにより、抗ＰＳＣＡ抗体に共有的に
結合させることができる。あるいは、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を
本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部位に結合せしめてなる融合タンパク
質を、当該技術においてよく知られている組換えＤＮＡ技術を使用して作成する
ことができる(Neubergerら, Nature 312:604-608(1984))。
【００８０】 (ｘｉｉ)他の抗体の修飾 抗体の他の修飾をここで考察する。例えば、抗体は種々の非タンパク質様ポリ
マー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシ
アルキレン、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリ
マーに結合してもよい。また抗体は、例えばコロイド状薬剤送達系(例えば、リ
ポソーム、アルブミンマイクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及び
ナノカプセル)、又はマクロエマルションにおいて、例えばコアセルベーション
技術又は界面重合により調製されたマイクロカプセル(例えばヒドロキシメチル
セルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリラート)マ
イクロカプセル)に捕捉されている。このような技術はRemington's Pharmaceuti
cal Sciences, 16th edition, Osal A.編 (1980)に開示されている。 また、ここに開示する抗ＰＳＣＡ抗体は、免疫リポソームとして調製されても
よい。「リポソーム」は哺乳動物への薬剤の送達に有用な、種々の種類の脂質、
リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小胞体である。リポソームの成分は、通
常、生物膜の脂質配置に似た２層構造に配されている。抗体を含有するリポソー
ムは、Epstein等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang等, P
roc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 及び米国特許第4,485,045号及
び第4,544,545号；及び1997年10月23日に公開された国際公開第97/38731号に記
載されたような、この分野で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持
つリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。 特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ
-誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ-ＰＥ）を含む脂質組成物での逆
相蒸発法によって生成される。リポソームは、所定サイズのフィルターを通して
押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のＦａｂ
’断片は、Martin等, J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載されているよ
うに、ジスルフィド交換反応を介してリポソームにコンジュゲートされ得る。化
学療法剤は、場合によってはリポソーム内に包含される。Gabizon等, J. Nation
al Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)参照。
【００８１】 ＩＶ．ベクター、宿主細胞及び組換え方法 本発明はまた、ヒト化抗ＰＳＣＡ抗体をコードしている単離された核酸、該核
酸を含むベクター及び宿主細胞、及び抗体の生産に対する組換え方法を提供する
。 抗体の組換え生産のために、それをコードする核酸が単離され、さらなるクロ
ーニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター内に挿入される
。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは直ぐに単離され、従来からの手法(
例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌ
クレオチドプローブを使用するもの)を用いて配列決定される。多くのベクター
が公的に入手可能である。ベクター成分としては、一般に、これらに制限される
ものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点
、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び
転写終結配列である。
【００８２】 （ｉ）シグナル配列成分 本発明の抗ＰＳＣＡ抗体は直接的に組換え手法によって生産されるだけではな
く、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ末端に特異
的切断部位を有する他のポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。好
ましく選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識されプロセシングさ
れる(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。天然抗
ＰＳＣＡ抗体シグナル配列を認識せずプロセシングしない原核生物宿主細胞に対
しては、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌ
ｐｐあるいは熱安定なエンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物
シグナル配列により置換される。酵母の分泌に関しては、天然シグナル配列は、
酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)
及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含む)、又は酸ホスフ
ォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー、又は国際特許
出願第90/13646号に記載されているシグナルにより置換されうる。哺乳動物細胞
の発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例え
ば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用できる。 このような前駆体領域のＤＮＡは、抗ＰＳＣＡ抗体をコードするＤＮＡにリー
ディングフレームが結合される。
【００８３】 （ｉｉ）複製開始点 発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞におい
てベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。一般に、この配列はクローニン
グベクターにおいて、宿主染色体ＤＮＡとは独立にベクターが複製することを可
能にするものであり、複製開始点又は自律的複製配列を含む。そのような配列は
多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３
２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラス
ミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ
、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベ
クターに有用である。一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は
不要である(ＳＶ４０開始点が典型的には初期プロモーターを有しているため用
いられる)。
【００８４】 （ｉｉｉ）選択遺伝子成分 発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択可能なマーカーとも称さ
れる選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシ
ン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の
毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、(c)例えばバシリに対する遺伝子
コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素
を供給する、タンパク質をコードする。 選択技術の一例においては、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異
種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、抗薬物性を付与し、選択工程を生存
するタンパク質を生産する。このような優性選択の例としては、薬物ネオマイシ
ン、ミコフェノール酸又はハイグロマイシンが使用される。 哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの他の例は、抗ＰＳＣＡ抗体核酸を
捕捉することのできる細胞成分を同定することのできるもの、例えばＤＨＦＲ、
チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩ及びＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチ
オネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等々
である。 例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、ＤＨＦＲ
の競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Mtx)を含む培地において形質
転換物の全てを培養することで同定される。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適
な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)
株化細胞である（例えば、ATCC CRL-9096）。
【００８５】 あるいは、抗ＰＳＣＡ抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク
質、及びアミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼ(APH)のような他の選
択可能なマーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性
ＤＨＦＲを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはＧ４１８
のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能なマーカーの選択剤を含む
培地における細胞増殖により選択することができる。米国特許第4,965,199号を
参照。 酵母中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒ
ｐ１遺伝子である(Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)）。ｔｒｐ１遺伝子は
、例えば、ＡＴＣＣ第４４０７６号あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファ
ン内で成長する能力に欠ける酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する
。Jones, Genetics, 85:12 (1977)。酵母宿主細胞ゲノムにｔｒｐ１破壊が存在
することは、トリプトファンの不存在下における成長による形質転換を検出する
ための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠陥酵母株(ATCC 20,622あるい
は 38,626)は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって補完される。 さらに、１．６μｍの円形プラスミドｐＫＤ１由来のベクターは、クルイヴェ
ロマイシス(Kluyveromyces)酵母の形質転換に用いることができる。あるいは、
組換え子ウシのキモシンの大量生産のための発現系がＫ.ラクティス(lactis)に
対して報告されている。Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)。クルイ
ヴェロマイシスの工業的な菌株からの、組換えによる成熟したヒト血清アルブミ
ンを分泌する安定した複数コピー発現ベクターも開示されている。Fleer 等, Bi
o/Technology,9:968-975 (1991)。
【００８６】 (ｉｖ)プロモーター成分 発現及びクローニングベクターは、通常、宿主生物体により認識され、抗ＰＳ
ＣＡ抗体核酸に作用可能に結合するプロモーターを含む。原核生物宿主での使用
に好適なプロモーターは、ｐｈｏＡプロモーター、βラクタマーゼ及びラクトー
スプロモーター系、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファン(trp
)プロモーター系、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター
を含む。しかし、他の既知の細菌プロモーターも好適である。細菌系で使用する
プロモータもまた抗ＰＳＣＡ抗体をコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャ
イン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。 真核生物に対してもプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生
物の遺伝子は、転写開始部位からおよそ２５ないし３０塩基上流に見出されるＡ
Ｔ富化領域を有する。多数の遺伝子の転写開始位置から７０ないし８０塩基上流
に見出される他の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域であ
る。大部分の真核生物遺伝子の３'末端には、コード配列の３'末端へのポリＡ尾
部の付加に対するシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て
真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。 酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリ
セラートキナーゼ又は他の糖分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド
-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ
、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグ
リセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホス
ホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
【００８７】 他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効
果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチ
トクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネ
イン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガ
ラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母の発現に好適
に用いられるベクターとプロモータはEP 73657に更に記載されている。また酵母
エンハンサーも酵母プロモーターと共に好適に用いられる。 哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの抗ＰＳＣＡ抗体転写は、例えば、
ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス、アデノウィルス(例えばアデノウ
ィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、
レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及び最も好ましくはサルウィルス４０(SV40)
のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモー
ター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、熱衝撃プ
ロモーターにより調節され、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る
限り、調節される。 ＳＶ４０ウィルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製開
始点をさらに含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウ
ィルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として簡便に得られ
る。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを用いて哺乳動物宿主でＤＮＡを発現す
る系が、米国特許第4,419,446号に開示されている。この系の変更例は米国特許
第4,601,978号に開示されている。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジン
キナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞におけるヒトβインターフェロン
ｃＤＮＡの発現について、Reyes等, Nature, 297：598-601(1982)を参照された
い。あるいは、ラウス肉腫ウィルス長末端反復をプロモーターとして使用するこ
とができる。
【００８８】 （ｖ）エンハンサーエレメント成分 より高等の真核生物による本発明の抗ＰＳＣＡ抗体をコードしているＤＮＡの
転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。
哺乳動物の遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン
、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしな
がら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう
。例としては、複製開始点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００-２７０塩基
対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期
側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核
生物のプロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297
:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、抗ＰＳＣＡ抗体コード配列
の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモー
ターから５'位に位置している。
【００８９】 （ｖｉ）転写終結成分 真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生
物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、また転写の終結及びｍＲＮＡ
の安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮ
Ａ又はｃＤＮＡの５'、時には３'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの
領域は、抗ＰＳＣＡ抗体をコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル
化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結
成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第94/11026号とこ
こに開示した発現ベクターを参照されたい。
【００９０】 （ｖｉｉ）宿主細胞の選択及び形質転換 ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な
宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的に
とって適切な原核生物は、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、
例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エル
ウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチ
フス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに
桿菌、例えば枯草菌及びバシリ・リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、19
89年4月12日に公開された DD 266,710に開示されたバシリ・リチェニフォルミス
４１Ｐ)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。
一つの好適な大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４(ATCC31446)であるが、他
の大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６(ATCC31537)及び大腸菌Ｗ３１１０(ATCC27325)の
ような株も好適である。これらの例は限定するものではなく例示的なものである
。 全長抗体、抗体断片及び抗体融合タンパク質は、特にグルコシル化及びＦｃエ
フェクター機能が必要とされない場合、例えば治療用抗体が、それ自体で腫瘍細
胞破壊における有効性を示すことにより、免疫コンジュゲート及び細胞障害剤(
例えば毒素)に結合する場合に、細菌内で生成させることができる。全長抗体は
循環においてより長い半減期を有する。大腸菌における生成は、より早くコスト
的にも有効である。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、
例えば翻訳開始領域(ＴＩＲ)、及び発現及び分泌の最適化のためのシグナル配列
について記載した米国特許第5,648,237号(Carterら)、米国特許第5,789,199号(J
olyら)及び米国特許第5,840,523号(Simmonsら)が参照され、これらの特許は出典
を明示してここに取り込まれる。発現後、抗体を可溶性フラクションにおいて大
腸菌の細胞ペレットから単離し、アイソタイプに応じて、例えばプロテインＡ又
はＧカラムを通して精製できる。最終精製は、例えばＣＨＯ細胞で発現した抗体
の精製と類似したプロセスで実施することができる。
【００９１】 原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、抗ＰＳＣＡ抗体
をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカ
ロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は下等真核生物宿主微生物のな
かで最も一般的に用いられる。しかしながら、多数の他の属、種及び菌株も、一
般的に入手可能でここで使用でき、例えば、シゾサッカロマイセスポンベ；クル
イベロマイセス宿主、例えばＫ.ラクティス、Ｋ．フラギリス(ATCC12424)、Ｋ.
ブルガリカス(ATCC16045)、Ｋ．ウィッケラミイ(ATCC24178)、Ｋ.ワルチイ(ATCC
56500)、Ｋ．ドロソフィラルム(ATCC36906)、Ｋ．サーモトレランス、及びＫ．
マルキシアナス；ヤローウィア(EP402226)；ピチアパストリス(EP183070)；カン
ジダ；トリコデルマ・リーシア(EP244234)；アカパンカビ；シュワニオマイセス
、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス；及び糸状真菌、例えばパンカビ
属、アオカビ属、トリポクラジウム、及びコウジカビ属宿主、例えば偽巣性コウ
ジ菌及びクロカビが使用できる。 グリコシル化抗ＰＳＣＡ抗体の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導
される。無脊椎動物細胞の例としては植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキ
ュロウィルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポド
プテラ・フルギペルダ(毛虫)、アエデス・アエジプティ(蚊)、アエデス・アルボ
ピクトゥス(蚊)、ドゥロソフィラ・メラノガスター(ショウジョウバエ)、及びボ
ンビクス・モリが同定されている。トランスフェクションのための種々のウィル
ス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ-１変異体とボンビ
クス・モリ ＮＰＶのＢｍ-５株が公に利用でき、そのようなウィルスは本発明に
おいてここに記載したウィルスとして使用でき、特にスポドプテラ・フルギペル
ダ細胞の形質転換に使用できる。 綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコのような
植物細胞培養を宿主として利用することができる。
【００９２】 しかしながら、脊椎動物細胞におけるものが最も興味深く、培養(組織培養)中
での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になった。有用な哺乳動物宿主株化細胞
の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (COS-7, ATCC CRL
1651);ヒト胚腎臓株(293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された29
3細胞、Grahamほか, J. Gen Virol., 36:59 (1977));ハムスター乳児腎細胞(BHK
, ATCC CCL 10)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub及
びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細
胞(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980));サルの腎細胞 (CVI ATCC
CCL 70); アフリカミドリザルの腎細胞(VERO-76, ATCC CRL-1587); ヒト子宮頸
ガン細胞 (HELA, ATCC CCL 2); イヌ腎細胞 (MDCK, ATCC CCL 34); バッファロ
ーラット肝細胞 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75);
ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065); マウス乳房腫瘍細胞 (MMT 060562, ATTC CCL51
);ＴＲＩ細胞(Matherほか, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982));ＭＲ
Ｃ５細胞;ＦＳ４細胞；及びヒト肝ガン株(HepG2)である。 宿主細胞は、抗ＰＳＣＡ抗体生成のための上述した発現又はクローニングベク
ターで形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配
列をコードしている遺伝子を増幅するために適当に修飾された従来からの栄養培
地で培養する。
【００９３】 （ｖｉｉｉ）宿主細胞の培養 本発明の抗ＰＳＣＡ抗体を生成するために用いられる宿主細胞は種々の培地に
おいて培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ham)のＦ１０(シグ
マ)、最小必須培地((ＭＥＭ),シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベ
ッコの改良イーグル培地((DMEM),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また
、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980
), 米国特許第4,767,704号；同4,657,866号；同4,927,762号；4,560,655号；又
は同5,122,469号；国際公開第90/03430号；国際公開WO第87/00195号；又は米国
特許再発行第30,985号に記載された任意の培地も宿主細胞に対する培養培地とし
て使用できる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子(例
えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナ
トリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰ
ＥＳ)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、商品
名ゲンタマイシン薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無
機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応
じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られて
いる適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現
のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者
には明らかであろう。
【００９４】 （ｉｘ）抗ＰＳＣＡ抗体の精製 組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内、細胞膜周辺腔に生成され、又は媒質
内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第１の工程として、粒子
状の細片、宿主細胞又は溶解された断片のいずれかが、例えば遠心分離又は限外
濾過によって除去される。Carter等, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)は、
大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌された抗体の単離方法を記載している。簡単には、
細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（pH3.5）、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルス
ルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約30分間解凍する。細胞細片は遠心
分離で除去できる。抗体が媒質に分泌された場合、そのような発現系からの上清
は、一般的には第１に市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばAmicon又はMill
ipore Pelliconの限外濾過ユニットを用いて濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテア
ーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めてタンパク質分解を阻害してもよく、抗生
物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
【００９５】 細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラ
フィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティクロマトグラフィを用いて精製
でき、アフィニティクロマトグラフィが好ましい精製技術である。アフィニティ
リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体に存在する免疫グロブリンＦｃ
ドメインの種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、
又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる（Lindmark等, J. immun
ol. Meth. 62: 1-13 (1983)）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及
びヒトγ３に推奨されている（Guss等, EMBO J. 5: 1567-1575 (1986)）。アフ
ィニティリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが
、他のマトリクスも使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベ
ンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い
流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Bakerb
ond ABX(商品名)樹脂（J.T. Baker, Phillipsburg, NJ）が精製に有用である。
イオン交換膜での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグ
ラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラム）上での
ヘパリンSEPHAROSE(商品名)クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、Ｓ
ＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿も、回収される抗体に応じて利用可
能である。 任意の予備精製工程に続いて、関心ある抗体と汚染物とを含む混合物に、約2.
5-4.5のｐＨでの溶離バッファーを用いて、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラ
フィーを施してもよく、好ましくは低い塩濃度（例えば、約0-0.25M塩）で実施
される。
【００９６】 Ｖ．製薬製剤 本発明の抗体の治療用製剤は、所定の純度を持つ抗体と、場合によっては製薬
的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤を混合することにより（Remington's
Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. 編, (1980)）、凍結乾燥製
剤又は水溶液の形態で調製され貯蔵される。許容される担体、賦形剤又は安定化
剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、酢酸塩、Tris、リン酸
塩、クエン酸塩、及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニ
ンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロ
リド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンズアルコニウムクロリド、ベンズエトニ
ウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール、メチル又はプロピ
ルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサ
ノール；３-ペンタノール、及びｍ-クレゾール等）；低分子量（約１０残基未満
）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等のタンパ
ク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アス
パラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マン
ノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ
等のキレート化剤；トレハロース又は塩化ナトリウムなどの強壮剤(tonicifiers
)；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ポリソ
ルバート等の界面活性剤；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、
Ｚｎ-タンパク質複合体）；及び／又はTWEEN(商品名)、PLURONICS(商品名)又は
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。抗体は、
５-２００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０-１００ｍｇ／ｍｌの濃度で含有される。
【００９７】 ここでの製剤は、治療される特定の徴候のために必要ならば１以上の活性化合
物も含んでよく、好ましくは互いに悪影響を与えない相補的活性を持つものであ
る。例えば、内部移行する抗ＰＳＣＡ抗体に加えて、一つの製剤に付加的な抗体
、例えばＰＳＣＡの異なるエピトープに結合する第２の抗ＰＳＣＡ抗体、又は特
定のガンの成長に影響を与える成長因子等の他の標的に対する抗体を含むことが
望ましい。別法として、又はこれに加えて、組成物は化学療法剤、細胞障害剤、
サイトカイン、成長阻害剤、抗-ホルモン剤、及び／又は心臓保護剤をさらに含
有してよい。このような分子は、意図する目的に有効な量でで組み合わされて存
在する。 また活性成分は、各々例えばコアセルベーション技術又は界面重合により調製
されたマイクロカプセル、例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイ
クロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル、コロイド状薬
剤送達系（例えば、リポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルション、ナ
ノ-粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルションに捕捉させてもよい。この
ような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A.
編, (1980)に開示されている。
【００９８】 徐放性調合物を調製してもよい。徐放性調合物の好ましい例は、抗体を含む疎
水性固体ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリクスは成形物、例えば
フィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリクスの例は、ポリエ
ステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチルメタクリラート)又は
ポリ(ビニルアルコール)、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号)）、Ｌ-グルタ
ミン酸及びγエチル-Ｌ-グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビ
ニル、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOT(商品名)（乳
酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能な微小球）
、及びポリ-Ｄ-(−)-３-ヒドロキシブチル酸を含む。 インヴィボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。このことは、滅
菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
【００９９】 ＶＩ．抗ＰＳＣＡ抗体を用いた治療 本発明において、細胞表面のＰＳＣＡに結合して内部移行する抗ＰＳＣＡ抗体
は、ＰＳＣＡ-発現ガン細胞、特に膀胱ガン及び前立腺ガン、例えばアンドロゲ
ン非依存性前立腺ガン又はアンドロゲン依存性前立腺ガン、及び関連した転移を
治療するために使用される。アンドロゲン非依存性前立腺ガンを患っている患者
は抗アンドロゲン治療に対してもはや反応せず、アンドロゲン依存性前立腺ガン
を患っている患者は抗アンドロゲン治療に反応する。ガンは一般的にＰＳＣＡ-
発現細胞を含有しており、抗ＰＳＣＡ抗体はそこに結合することができる。ガン
はＰＳＣＡ分子の過剰発現により特徴付けられるが、本出願はＰＳＣＡ-過剰発
現細ガンであると考えられないガンの治療方法もさらに提供する。 ガンにおけるＰＳＣＡ発現を測定するために、種々の診断アッセイが利用でき
る。一実施態様では、ＰＳＣＡ過剰発現は免疫組織化学(ＩＨＣ)により分析する
ことができる。組織バイオプシーからのパラフィン埋設組織切片をＩＨＣアッセ
イにかけ、次のようなＰＳＣＡタンパク質染色強度基準を設ける： スコア０ 染色が観察されないか、又は膜染色が腫瘍細胞の１０％未満で観察さ
れる。 スコア１＋ わずかに／弱く認知できる程度の染色が腫瘍細胞の１０％を越えて
検出される。細胞はそれらの膜の一部のみが染色される。 スコア２＋ 弱いないしは中程度の完全な膜染色が腫瘍細胞の１０％を越えて観
察される。 スコア３＋ 中程度から強い完全な膜染色が腫瘍細胞の１０％を越えて観察され
る。 ＰＳＣＡ発現における０又は１＋スコアの腫瘍はＰＳＣＡが過剰発現していな
いことを特徴付けるものであるのに対し、２＋又は３＋スコアの腫瘍はＰＳＣＡ
が過剰発現していることを特徴付ける。
【０１００】 別に、又は付加的に、ＦＩＳＨ分析、例えばＩＮＦＯＲＭＴＭ(Ventana, Ariz
onaから販売)又はＰＡＴＨＶＩＳＩＯＮＴＭ(Vysis, Illinois)を、ホルマリン
固定、パラフィン埋設された腫瘍組織で実施して、腫瘍におけるＰＳＣＡ過剰発
現の程度(生じているならば)を測定してもよい。 ＰＳＣＡ過剰発現又は増幅は、インヴィボ診断アッセイを使用して評価するこ
とができ、例えば検出される分子に結合し、検出可能な標識(例えば、放射性同
位体又は蛍光標識)が付けられた分子(例えば抗体)を投与し、標識の局在化につ
いて患者を外部スキャニングする。
【０１０１】 現在、ガンの段階に応じて、前立腺ガンの治療には、次の治療：外科手術によ
るガン組織の除去、放射線治療、アンドロゲン欠乏(例えばホルモン治療)、及び
化学治療の一つ、又はそれらを組合せたものが含まれる。抗ＰＳＣＡ抗体による
治療は、特に、化学治療における副作用や毒素に対する耐性がない老年の患者、
放射線治療の有用性に限界がある転移性疾患、及びアンドロゲン欠乏治療に耐性
のある前立腺ガンの治療において所望されている。本発明の抗ＰＳＣＡ抗体は腫
瘍をターゲティングし内部移行するので、疾患の初期診断時及び再発中における
ＰＳＣＡ-発現ガン、例えば前立腺ガン及び膀胱ガンの緩和に有用である。治療
用途において、抗ＰＳＣＡ抗体は、前立腺ガンが顕著で、分断細胞が達すること
ができない場合に、ホルモン、抗血管形成(antiangiogen)、又は放射標識された
化合物と共に、又は外科手術、寒冷療法、及び／又は放射線治療と組み合わせて
もよく、単独で使用してもよい。抗ＰＳＣＡ抗体による治療は、従来的治療の前
又は後のいすれかに連続させて、他の形態の従来的治療と共に実施することがで
きる。化学療法剤、例えばタキソテレ(登録商標)(ドセタキセル)、タキソール(
登録商標)(パクリタキセル)、エストラムスチン及びミトキサントロンは、転移
性及びホルモン難治性前立腺ガン、特にかなりの危険性がある患者の治療に使用
される。ガン、特にアンドロゲン非依存性及び／又は転移性前立腺ガンを治療又
は緩和するための本発明の方法において、上述した一又は複数の化学療法剤との
治療と組合せて、ガン患者に抗ＰＳＣＡ抗体を投与することができる。特に、パ
クリタキセル及びその誘導体との組合せ治療が考えられる(例えば、欧州特許第0
600517号を参照のこと)。抗ＰＳＣＡ抗体は治療的有効量の化学療法剤と共に投
与されるであろう。他の実施態様において、抗ＰＳＣＡ抗体は化学療法剤、例え
ばパクリタキセルの活性及び効力を高めるための化学治療と組合せて投与される
。医師デスクレファレンス(Physicians' Desk Reference)(ＰＤＲ)には、種々の
ガン治療に使用されるこれらの薬剤の用量が開示されている。治療的に有効な上
述の化学療法剤の投薬計画及び用量は、治療される特定のガン、疾患の程度、及
び当該技術の医師によく知られている他の因子に依存し、医師により決定するこ
とができる。
【０１０２】 特定の一実施態様では、細胞障害剤に結合した抗ＰＳＣＡ抗体を含有する免疫
コンジュゲートを患者に投与する。好ましくは、ＰＳＣＡタンパク質に結合した
免疫コンジュゲートは細胞により内部移行し、結果として、それが結合したガン
細胞の殺傷性における免疫コンジュゲートの治療的効果が向上する。好ましい実
施態様では、細胞障害剤は、ガン細胞内の核酸を標的とするか、又はこれに干渉
する。このような細胞障害剤の例は、上述されており、メイタンシノイド、カリ
ケアマイシン、リボヌクレアーゼ及びＤＮＡエンドヌクレアーゼが含まれる。 抗ＰＳＣＡ抗体又は免疫コンジュゲートは、公知の方法、例えばボーラス、も
しくは一定時間にわたる連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内
、皮下、関節内、滑液包内、くも膜下腔内、経口、局所的、又は吸入経路により
、ヒトの患者に投与される。抗体の静脈内又は皮下投与が好ましい。 他の治療計画を抗ＰＳＣＡ抗体の投与と組合せてもよい。組合せ投与には、別
々の調製物又は単一の医薬製剤を使用する同時投与、及び好ましくは両方(又は
全ての)活性剤が同時にその生物学的活性を働かせる時間がある、いずれかの順
での連続投与が含まれる。このような組合せ治療により、結果として相乗的治療
効果が生じることが好ましい。 また、特定のガンに関連した他の腫瘍抗原に対する抗体の投与と共に、抗ＰＳ
ＣＡ抗体又は抗体類の投与を組合せることが望ましい。
【０１０３】 他の実施態様では、本発明の抗体治療方法は、異なる化学療法剤の混合物の同
時投与を含む、抗ＰＳＣＡ抗体(又は抗体類)と一又は複数の化学療法剤又は成長
阻害剤との組合せ投与を含む。化学療法剤には、リン酸エストラムスチン、プレ
ドニムスチン、シスプラチン、５-フルオロウラシル、メルファラン、シクロホ
スファミド、オキシ尿素及びオキシ尿素タキサン(hydroxyureataxanes)(例えば
パクリタキセル及びドキセタキセル)及び／又はアントラサイクリン抗生物質が
含まれる。このような化学療法剤の調製及び投与スケジュールは製造者の注意書
きに従い使用されるか、又は熟練した実務者により経験的に決定される。このよ
うな化学療法の調製及び投与スケジュールは、Chemotherapy Service M.C.Perry
編, Williams & Wilkins, Baltimore, MD(1992)に記載されている。 抗体は、抗ホルモン化合物、例えばタモキシフェン等の抗-エストロゲン化合
物、例えば；抗プロゲステロン、例えばオナプリストン(onapristone)(欧州特許
616812号を参照)；又は抗アンドロゲン、例えばフルタミドを、このような分子
に対して既知の用量で組合せてもよい。治療されるガンがアンドロゲン非依存性
ガンである場合、患者は予め抗アンドロゲン治療を受け、ガンがアンドロゲン非
依存性になった後、抗ＰＳＣＡ抗体(及び場合によってはここに記載した他の薬
剤)を患者に投与してもよい。 しばしば、心臓保護剤(治療に関連する心筋の機能不全を防止又は低減するた
め)又は一又は複数のサイトカインを患者に同時投与することも有益なことであ
る。上述した治療摂生に加えて、抗体治療の前、同時又は治療後に、外科的にガ
ン細胞を取り除くか、及び／又は放射線治療を施してもよい。上述した任意の同
時投与される薬剤の適切な用量は現在使用されている量であり、抗ＰＳＣＡ抗体
と薬剤の組合せ作用(相乗作用)に応じてより少なくすることができる。
【０１０４】 疾患の予防又は治療のための投与量及び方式は、公知の基準に従い、医師によ
り選択されるであろう。抗体の適切な用量は、治療される疾患の種類、疾患の重
症度及び過程、抗体を防止目的で投与するのか治療目的で投与するのか、過去の
治療、患者の臨床歴及び抗体の応答性、手当てをする医師の裁量に依存するであ
ろう。抗体は一度に又は一連の処置にわたって患者に適切に投与される。好まし
くは、抗体は静脈注入又は皮下注射により投与される。疾患の種類及び重症度に
応じて、例えば一又は複数の別個の投与又は連続注入のいずれであれ、体重当た
り約１μｇ／ｋｇないし５０ｍｇ／ｋｇ(例えば０．１-１５ｍｇ／ｋｇ／用量)
の抗体が患者への最初の投与量の候補である。投薬計画は、約４ｍｇ／ｋｇ、続
いて１週間に約２ｍｇ／ｋｇの抗ＰＳＣＡ抗体の維持用量で投与することを含む
。しかしながら、他の投薬計画も有効であろう。上述した因子に応じて、典型的
な一日の投与量は約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇあるいはそれ以上の範囲
である。数日間又はそれ以上の繰り返し投与の場合、状態によっては、疾患の徴
候の望ましい抑制が生じるまで処置を維持する。この治療の進行状態は、医師又
は他の当業者に公知の基準をベースにした通常の方法やアッセイで容易にモニタ
ーされる。 抗体タンパク質の患者への投与の他に、本出願は遺伝子治療による抗体の投与
を考察する。抗体をコードする核酸の投与は「抗体を治療的有効量で投与する」
という表現に含まれる。例えば、遺伝子治療を用いた細胞内抗体の生産に関する
、1996年3月14日に公開された国際公開第96/07321号を参照のこと。
【０１０５】 核酸（場合によってはベクター内に含まれたもの）を患者の細胞に入れるため
に：インヴィボ及びエキソビボという２つの主要な方法がある。インヴィボ送達
では、核酸は、通常は抗体が必要とされている部位に直接注入される。エキソビ
ボ処理では、患者の細胞を取り出し、核酸をこれらの単離された細胞に導入し、
修飾された細胞を患者に、直接、又は例えば患者に埋め込まれる多孔性膜にカプ
セル化して投与する（米国特許第4,892,538号及び第5,283,187号参照）。核酸を
生細胞に導入するために利用可能な種々の技術がある。これらの技術は、核酸が
培養された細胞にインヴィトロで移入されるか、又は対象とする宿主にインヴィ
ボで移入されるかに依る。哺乳動物細胞にインヴィトロで核酸を移入するのに適
した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション
、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などを含む。遺
伝子のエキソビボ送達に通常用いられるベクターはレトロウイルスである。 現在インヴィボ核酸移入技術で好ましいのは、ウイルスベクター（例えば、ア
デノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ関連ウイルス）、及び脂質
ベースの系（例えば、遺伝子の脂質媒介移入に有用な脂質は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯ
ＰＥ、及びＤＣ-Ｃｈｏｌである）での形質移入を含む。現在知られている遺伝
子マーキング及び遺伝子治療プロトコールの概説については、Anderson等, Scie
nce, 256:808-813 (1992)を参照のこと。また、WO 93/25673及びそこに引用され
た参考文献も参照。
【０１０６】 ＶＩＩ． 製造品 本発明の他の実施態様では、抗ＰＳＣＡ発現ガン、特に前立腺ガン及び膀胱ガ
ンの治療に有用な物質を含有する製造品である。この製造品は容器とラベル又は
容器内に挿入されるか添付されるパッケージ挿入物を含んでなる。好適な容器は
、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等を含む。容器は、ガラス又はプラスチッ
クなどの多様な材料から形成されてよい。容器は、ガンの状態の治療に有効な組
成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で
貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。
組成物中の少なくとも１つの活性剤は本発明の抗ＰＳＣＡ抗体である。ラベル又
はパッケージ挿入物は、組成物が前立腺ガン、アンドロゲン非依存性前立腺ガン
、又はアンドロゲン依存性前立腺ガン、又は膀胱ガンの治療のために使用される
ことを示す。ラベル又はパッケージ挿入物は、ガン患者に抗体組成物を投与する
旨の注意書きをさらに具備する。製造品はさらに、製薬的に許容可能な希釈バッ
ファー、例えば注射用の静菌水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝塩水、リンガー液及びデ
キストロース溶液を含む第２の容器を具備してもよい。さらに、他のバッファー
、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ま
しい他の材料を含んでもよい。
【０１０７】 種々の目的、例えばＰＳＣＡ細胞殺傷アッセイ、細胞からのＰＳＣＡの精製、
又は免疫沈降に有用なキットが提供されている。ＰＳＣＡの単離及び精製におい
て、キットはビーズ(例えばセファロースビーズ)に結合した抗ＰＳＣＡ抗体を含
み得る。インヴィトロにおけるＰＳＣＡの検出及び定量、例えばＥＬＩＳＡ又は
ウエスタンブロットのための抗体を含むキットを提供することもできる。製造品
と同様、キットも容器とラベル又は容器内に挿入されるか添付されるパッケージ
挿入物を含んでなる。容器には少なくとも１つの本発明の抗ＰＳＣＡ抗体を含有
する組成物が収容されている。希釈液及びバッファー、コントロール抗体等を収
容する付加的な容器を具備していてもよい。ラベル又はパッケージ挿入物は、組
成物についての記載、並びにインヴィトロを意図することの注意書き又は診断用
途を提供するものである。
【０１０８】 ＶＩＩＩ．実験例 本発明の前述の特徴及びその他の特徴は、添付の図を参照してより詳しく説
明され、また、請求項において示される。以下に記載される特定の実施態様は例
示的に提示されるものであって、発明の範囲に対する限定と解釈されることを意
味するものではない。本発明の理念又は本質的な特徴から逸脱することなく、本
発明に対して多くの変更を行うことができることは当業者には明らかであろう。
【０１０９】 実施例１ 抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体の調製及び特徴付けについて記述する。 Ｉ．材料及び方法 マウス及びヒトの抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体（Ｍａｂｓ）を産生するハイ
ブリドーマが調製された。融合細胞はマウスミエローマのP3X63Ag8.653株（Kear
ney, J. F.等、J. Immunology 123:1548-1550, 1979）であった。 表２Ａには、免疫計画が要約されており、免疫に使用された抗原の特徴、アジ
ュバント、免疫量、抗原投与経路、免疫スケジュール、用いられた宿主動物が示
されている。表２Ｂには、種々のアッセイにより決定された抗ＰＳＣＡＳモノク
ローナル抗体の特徴が要約されている。ここでの抗体名は、抗体を産生するハイ
ブリドーマクローンの最初の３−４文字に由来する（表２Ｂを参照のこと）。ク
ローン名におけるピリオドの前の最初の３−４文字は、親クローン名を示し、さ
らにサブクローン名がある場合には、最初のピリオドの後に続く。あるいは、こ
こでの抗ＰＳＣＡ抗体は、それらの命名された腹水番号により参照されることも
ある。muＰＳＣＡが示される場合を除いて、ヒト（hu）ＰＳＣＡ自体、又はｇＤ
タグ（ｇＤＰＳＣＡ）もしくはヒスチジンタグ（his-ＰＳＣＡ）に融合されたヒ
ト（hu）ＰＳＣＡが用いられた。大腸菌で発現されたヒト又はマウスＰＳＣＡは
、ヒスチジンタグ化された。特に示されない場合、大腸菌で発現されたＰＳＣＡ
は、免疫するにあたり以下に記載されるようにしてリフォールディングされた。
ｇＤＰＳＣＡ−ＣＨＯは、ＣＨＯ細胞内で発現され、ＣＨＯ細胞から精製された
可溶性ＰＳＣＡを意味する。キセノマイス（Xenomice）（Abgenix, Fremont, Ca
lifornia）から調製された抗体は、完全体ヒト抗体である。 huＰＳＣＡ核酸及びアミノ酸配列については、国際公開第９９／１４３２８号
（Genentech；ＰＲＯ２３２タンパク質、図１中の核酸配列；図２中のアミノ酸
配列）；１９９９年１月５日発行の米国特許第５８５６１３６号（Incyte;ＳＣ
ＡＨ２ 配列番号４；又はReiter等によるProc. Natl. Acad. Sci. 95:1735-1740
(1998)の１７３７頁）を参照のこと。便宜上、ＰＳＣＡの１２３のアミノ酸配列
とｃＤＮＡのコード配列を、それぞれ配列番号１及び配列番号２としてここに示
す。ここで適用されるアミノ酸配列の番号付けは、配列番号１中に示されるReit
er等（1998）と同じ番号付けに従う。
【０１１０】 細胞株及び形質移入 huＰＳＣＡ又はgＤＰＳＣＡをコードするプラスミドベクターは、以下に示す
細胞に形質移入された；Rasを発現しているNIH3T3（Ras 3T3）；及びCHO；HCT11
6。大腸菌での発現には、huＰＳＣＡのアミノ酸１０−１０１をコードする配列
（His タグに融合される）が、ＧＰＩアンカー配列が除去された状態で使用され
た。3T3細胞での発現には、ＰＳＣＡのＮ末端シグナル配列（アミノ酸1-20）が
成熟gDの２５アミノ酸が後に続くgDタグのシグナル配列と置換された。
【０１１１】 結合アッセイ 抗ＰＳＣＡ抗体は、細胞上のＰＳＣＡとの結合に関し蛍光発色セルソーター(F
ACS)を用いて解析された。ハイブリドーマの培養上清から精製されたマウス抗Ｐ
ＳＣＡ抗体 6B8.1D7.2B3(#2761)及び完全体ヒト抗ＰＳＣＡ抗体10C5.6E4.6D1(#2
910)は、FACSを用いて細胞表面との結合性について解析された。N末端にgDタグ
が付加されたhuＰＳＣＡで形質移入されたコンフルエントな接着安定ＣＨＯ細胞
は、PBSで洗浄され、Cell Dissociation Solution（Sigma）を用いて剥がされた
。細胞は、種々の濃度（1-10μg/ml）の抗ＰＳＣＡ抗体とインキュベートされ、
FITC結合二次抗体とインキュベートする前にPBSで洗浄した。細胞は、細胞固定
のため、1% FBS又は1%ホルムアルデヒドを含むPBS中に再懸濁された。その後、
抗体の細胞表面との結合性を、FACScanで解析した。 溶液中のＰＳＣＡを捕獲するMabsの能力を評価するために、各抗体が直接マイ
クロタイタープレート上にコートされるか、又は前もってプレートにコートされ
たＦｃ領域に特異的な抗マウスＩｇＧと結合される、アッセイ法が開発された。
その後、ビオチン化されたＰＳＣＡ抗原（１μg/ml）が、ストレプトアビジン-H
RPとのインキュベーションの前にプレートへ添加された。OPDが基質として使用
され、プレートは492 nmで読みとられた。
【０１１２】 形質移入された細胞表面に発現されたＰＳＣＡとのMab#2403の結合を確かめる
ために、125Ｉ-標識Mab #2403（ラクトペルオキシダーゼ法）を用いてコールド
競合結合アッセイが実施された。PC3.gD.huPSCA細胞（1ｘ105）が２４ウェルデ
ィッシュにプレーティングされ、種々の濃度の非標識Mab 2403及び一定量の125I
-Mab 2403と４℃で１６時間培養液中でインキュベートされた。結合しなかった
抗体は除去され、細胞は氷冷された培養液で洗浄された。8M 尿素/3M 氷酢酸中
で細胞を可溶化後、結合した放射線量がγカウンターを用いて測定された。IC50 値は、ｍ３がIC50を示す曲線の４変数適合計算法により計算された。このアッセ
イ結果は図４にプロットされている。 ダイレクトELISA法は、#2761（6B8）抗体の結合活性を決定するために行われ
た。HuＰＳＣＡとマウスＰＳＣＡ（mＰＳＣＡ）は、1μg/mlの濃度で一晩かけて
マイクロタイタープレート（Nunc）上にコートされた。抗ＰＳＣＡ Mabとコント
ロールは、抗原をコートしたウェルに添加され、室温でインキュベートされた。
結合しなかった抗体は洗浄により除去し、西洋ワサビのペルオキシダーゼ（HRP
）結合二次抗体がウェルに添加され、室温で抗体とインキュベートされた。OPD
の基質溶液が最後に添加され、反応を停止させるために濃硫酸が使用された。プ
レートはマイクロタイタープレートリーダーを用い、492 nmで読み取られた。 エピトープの分類は、競合ELISAにより決定された。各抗体はビオチン化され
、過剰量の非標識の各抗ＰＳＣＡ Mabの存在下又は非存在下で、プレート上にコ
ートされたＰＳＣＡとの結合について調べられた。その後、ストレプトアビジン
-HRPは、ペルオキシダーゼの基質が続いて添加されるプレートに添加された。ビ
オチン化されたMabsのＰＳＣＡとの結合性の減少（少なくとも50%）又は欠如は
、コールドの抗体とビオチン化抗体の両方がＰＳＣＡ上の同じ（又は近接した）
エピトープに対して結合することを示した。
【０１１３】 大腸菌で産生されるHisタグタンパク質の精製及びリフォールディング 以下の方法は、Hisタグタンパク質を発現する大腸菌の0.5から1Ｌの発酵から
生産されるタンパク質に対しての使用に適合された。 0.5から1Ｌ発酵からの大腸菌のペースト（6-10 mgのペレット）は、7Ｍグアニ
ジン、20 mM トリス, pH 8のバッファーの10倍量（w/v）中に再懸濁された。固
体の亜硫酸ナトリウム及び四チオン酸ナトリウムが、各々、最終濃度0.1 M 及び
0.02 Mとなるように添加され、４℃で一晩撹拌された。このステップの結果、亜
硫酸化により全てのシステイン残基がブロックされた変性タンパク質が生じる。
この溶液をベックマンの超遠心機で30分間、40Ｋ rpm遠心した。上清は3-5倍量
の金属キレートカラムバッファー（6 M グアニジン、20 mM トリス, pH7.4）で
希釈し、浄化するために0.22ミクロンのフィルターを通して濾過した。所望のタ
ンパク質の発現に依存して、30-50 mlの浄化された抽出液が金属キレートカラム
バッファーで平衡化された5 mlのキアゲンNi-NTA金属キレートカラムに添加され
た。カラムは、50 mMイミダゾール（Calbiochem, Utrol grade）, pH7.4を含む
更なるバッファーで洗浄された。タンパク質は、250mM イミダゾールを含むバッ
ファーで溶出された。所望のタンパク質を含む画分は、プールされ４℃で保存さ
れた。タンパク質濃度は、そのアミノ酸配列に基づいて計算された吸光係数を用
いて、280 nmにおける吸収により見積もられた。
【０１１４】 通常、タンパク質は、以下のもので構成される、新たに調製されたリフォール
ディングバッファーでゆっくりと試料を希釈することによりリフォールディング
される：20mM トリス、pH8.6、0.3 M 塩化ナトリウム、2.5 M 尿素、5 mM シス
テイン、20 mM グリシン及び1 mM EDTA。PSCAの場合、3.5 M 尿素及び1 mM シス
テインが2.5 M 尿素及び5 mM システインの代わりに用いられた。リフォールデ
ィングの容量は、最終タンパク質濃度が50から100mg/mlの間になるように選択さ
れた。リフォールディング溶液は、４℃で12から36時間穏やかに撹拌された。リ
フォールディング反応は、トリフルオロ酢酸(TFA)を最終濃度0.4％（およそ3のp
H）になるように添加して停止させた。タンパク質を更に精製する前に、タンパ
ク質溶液は0.22ミクロンのフィルターを通して濾過され、アセトニトリルが2-10
％の最終濃度になるように添加された。リフォールディングされたタンパク質は
、0.1％のTFAの移動バッファーを用い、10％から80％のアセトニトリル濃度勾配
の溶出によりVydac C4逆相カラムでクロマトグラフィーが行われた。A280におけ
る吸収を持つ画分の一定分量がSDSポリアクリルアミドゲル上で分析され、均一
のリフォールディングタンパク質を含む画分がプールされた。一般に、大抵のタ
ンパク質の適切にリフォールドされたものは、逆相レジンとの相互作用から遮蔽
された疎水性の内部を有し最もコンパクトであるため、最も低いアセトニトリル
濃度において溶出される。通常、凝集したものは、より高いアセトニトリル濃度
で溶出される。誤ってフォールディングされたタンパク質の形態を所望の形態と
分離することに加え、逆相カラム工程は、試料からエンドトキシンも除去する。 所望のフォールディングされたタンパク質を含む画分はプールされ、アセトニ
トリルは、溶液に向けられた窒素の穏やかな流れを用いて除去された。通常、タ
ンパク質は、透析又は製剤化バッファーで平衡化されたG25スーパーファイン（P
harmacia）を用いたゲル濾過により20 mM Hepes、pH6.8、0.14 M 塩化ナトリウ
ム、及び４％のマンニトール中に製剤化され、滅菌的に濾過された。時折、6か
ら7.5のpH範囲に等電点を持つタンパク質は、溶解度を保つために1 mM 塩酸、0.
14 M 塩化ナトリウムバッファー中に製剤化されることもある。製剤化されたタ
ンパク質は等分され、凍結されて−８０℃で保存された。続いて、タンパク質は
、SDSゲル、タンパク定量のためのアミノ酸分析により特徴分析され、エンドト
キシンアッセイによりエンドトキシンレベルが調べられ、タンパクの同一性を確
立するためにN-末端タンパク配列決定が行われ、タンパクの整合性を確立するた
めにマススペクトロメトリーが行われ、他の必要な又は所望の分析方法が行われ
た。
【０１１５】 イムノグロブリンの配列及び構成 精製された抗体は、確立された方法によりアミノ酸配列決定が行われた。N-末
端配列が得られ、その結果から、RT-PCRによりIg可変領域（V）をクローン化す
るためにプライマーが設計された。VL又はVH領域をコード化するDNA断片がベク
ター中にクローン化された。最初、ベクターに対するプライマーで、確立された
方法によりシークエンシングが行われた。残りの配列を得るために、得られた抗
体の最初の核酸配列から抗体の配列に特異的なプライマーが設計された。 配列が図１３に示されるキメラのマウス−ヒト抗ＰＳＣＡ抗体全長及びFabは
、マウスVL及びVH領域のドメイン配列をヒトCκ及びCγ１配列と結合させること
により構築された。マウス抗体V領域断片は、容易に切り出され得る制限酵素サ
イトカセットとしてベクターにクローン化され、ＰＳＣＡに特異的なキメラをマ
ウス−ヒト抗体を発現させるために、前もって構築された異なるアイソタイプの
ヒトL及びH定常領域を含むベクター中へ連結された。Fabキメラ鎖は、pRKベクタ
ー（EP307,247中に記載）であるpUC119:Igベクターに由来するvegfchimと呼ばれ
るベクターから発現された。 図１２は、ハイブリドーマクローン、6F8.2F4、Asc#2395（配列番号３及び配
列番号４）；5F2.4H4.1E3、Asc#2403（配列番号５及び配列番号６）；6B8.1D7.2
B3、Asc#2761（配列番号７及び配列番号８）、から得られる抗体の軽鎖及び重鎖
の可変領域ドメイン（VL及びVH）のアミノ酸配列、及びクローン8D11.2E9（Asc#
2399（配列番号９））からのVHのアミノ酸配列を示す。図１３は、シグナルペプ
チド配列を含む全長キメラ2403 IgGのアミノ酸配列（L鎖は配列番号１０；H鎖は
配列番号１１）及びキメラ6B8Fabの配列（L鎖は配列番号１２；H鎖は配列番号１
３）を示す。キメラ抗体2403は、ヒトイムノグロブリンのCκ及びCγ1配列とMab
5F2.4H4.1E3(#2403)のマウスのVL及びVH配列とを、哺乳動物細胞発現ベクター
、pRK中で、それぞれ融合させることにより作製した。pRK5発現ベクターの構築
は、1989年3月13日公開のEP307,247中に開示されている。キメラ2403のH鎖及びL
鎖をコードするpRKベクターは、DNA pRK-2403H及びDNA pRK-2403LとしてATCCに
寄託された（Xの項を参照のこと）。マウスVHはヒトＣγ1と、配列残基#Pro122
（図13の配列中の／により示す）の位置で連結された。マウスVLはヒトCLと配列
残基#Arg113の位置で連結された。2403VHのインサートは、430bpのEcoRI-ApaI断
片又はClaI-ApaI断片として、pRK-2403Hから切り出すことができる。2403VLは、
pRK-2403L中に400bp断片のEcoRI-CpoI断片としてクローン化された。キメラ2716
のH鎖及びL鎖をコードするpRKベクターは、DNA pRK-2761H及びDNA pRK-2761Lと
してATCCに寄託された（Xの項を参照のこと）。同様に、2716VLは、pRK-2761L中
に400bp断片のEcoRI-CpoI断片としてクローン化された。2761VHのインサートは
、430bpのEcoRI-ApaI断片又はClaI-ApaI断片としてpRK-2761Hから切り出すこと
ができる。 キメラ6B8FabのL鎖とH鎖は、Mab 6B8.1D7.2B3のマウスVL及びVH配列をIgG1配
列のヒトイムノグロブリンCκ及びCＨ1ドメインと、vegf4chimと称するベクター
中にそれぞれ融合させることにより作製され、大腸菌で発現された。vegf4chim
は、ampR選択マーカーを持ち、抗体配列は、アルカリホスファターゼプロモータ
ーの下、動作可能に連結され、発現される。 これらのV領域カセットは、切り出されることが可能で、異なるFc特性を有す
るキメラを生産するために異なるヒトイムノグロブリンアイソタイプの定常領域
ドメインと連結され得る。ADCC、補体結合活性、又はFcレセプター結合などのエ
フェクター機能を欠く抗ＰＳＣＡ抗体を生産するために、マウスVH領域はヒトC
γ2又はCγ4の定常領域配列と融合される。
【０１１６】 ＩＩ．結果 表２Ｂには、ここでのアッセイにより決定された抗ＰＳＣＡ抗体の特徴が要約
される。表２Ｂ中、huPSCA-E.coliは、大腸菌で発現させたhisタグＰＳＣＡを示
す；タンパク質は、バクテリアより精製され、その後、上述したようにリフォー
ルディングされる；+ホルマリンは、ホルマリン固定の細胞が免疫原として使用
されたことを示す；prk5.huPSCAは、pRK5プラスミド中にhuPSCA遺伝子を有する
ネーキッドなcDNAを示す。ゼノマイス（Abgenix, Fremont, California）とは、
内在性のマウスIg部位を、ヒト抗体を形成するようにヒト生殖系列のイムノグロ
ブリン部位と置換するために遺伝学的に操作されたマウスのことである。ＰＳＣ
Ａに対するヒト抗体は、ゼノマイスを大腸菌で発現させたＰＳＣＡで、腹腔内（
i.p.）又はフットパッドを経由して免疫することにより作製された。 テストされた全ての抗ＰＳＣＡ Mabsは、FACSによりアッセイするとPSCA形質
移入細胞の染色において顕著なシフトを生じさせた。図１（Mab 5F2）及び図２
（Mab 10C5）は、典型的な染色結果を示す。FITC結合二次抗体のみとインキュベ
ートされた細胞は、ネガティブコントロールとして用いた；これらの細胞は、い
ずれの抗体結合活性も示さなかった。ポジティブコントロールとして用いた抗-g
D Mab 1766 gDは、gD-huPSCAを発現させるCHO細胞と有意に結合することを示し
た。また、完全体ヒトMab 10C5.6E4.6D1を含むハイブリドーマの上清も細胞表面
に対して強い結合性を示した。マウス抗PSCA Mab 5F2(#2403)は、本実験におい
てポジティブコントロールとして及びネガティブコントロールの媒体として使用
された。 マウスMab 6B8(#2761)は、プレート上に固定化させたPSCAの種々の可溶性形態
と結合する能力に関しテストされ、図３中に結果が示される。変性PSCAタンパク
質に対して作られたMab 6B8は、リフォールディングされていないhuPSCAよりも
リーフォールディングされたhuPSCAに対して強い親和性を示した。Mabは、gD-hu
PSCA CHO可溶性抗原に対しても結合することが示されたが、リフォールド又はリ
フォールドされていないhuPSCAと比較するとより低い親和性であった。しかしな
がら、無関連の抗原であるTGF-β及びマウスPSCAには結合せず、このことは抗体
がhuPSCAに特異的であることを示している。 コールド競合結合アッセイ（図4及びすぐ下の表を参照のこと）から、Mab 240
3に対する結合親和性は、12.9 nMであると決定された。
【０１１７】
【０１１８】 実施例２ この実施例は、抗PSCA抗体2395(6F8), 2399(8D11), 2403(5F2), 2761(6B8)[腹
水番号の後に括弧内に抗体番号を示す；表２Ｂを参照のこと]の、PSCA発現腫瘍
細胞（MCF-7Her2gdPSCA及びHCT-gdPSCA）におけるインヴィボでの結合及び局在
を示した。抗体を蛍光色素Cy3で標識することにより、抗体の結合は蛍光顕微鏡
により視覚化することができる。当該技術は、Her-2を発現させる腫瘍を持つマ
ウスにおいて、Cy3で標識したハーセプチン（抗-Her2モノクローナル抗体）を用
いることで充分に確立されていた。抗PSCA抗体のインヴィボでの結合は、ヒトgd
連結PSCAで形質移入された腫瘍細胞においてテストされた。コントロールの抗体
には、MCF-7Her2gdPSCA細胞に対するポジティブコントロールとしてCy3で標識し
たハーセプチンを含まれていた。また、非常に優れた結合活性を有するCy3標識
抗gd抗体がPSCA抗体に対するポジティブコントロールとして使用された。形質移
入されたPSCAにはgdが連結されており、その結果、gdタンパク質レベルがPSCAタ
ンパク質の発現と直接相関する。gdPSCAで形質移入されていない細胞株は、ネガ
ティブコントロールとして使用した。
【０１１９】 Ｉ．材料及び方法 細胞株 HCT-116(ATCC CCL-247)はヒト結腸腫瘍細胞株である；HCT-47は、親株のHCT-1
16を形質移入することに由来するPSCA発現クローンである。MCF-7(ATCC HTB-22
；Soule, D.G.等、J.Natl.Cancer Inst., 51:1409-1416, 1973)は、以前に形質
移入されたヒト乳ガン細胞株で、Her2を発現する（Benz等、Breast Cancer Rese
arch and Treatment 24:85-95 (1992)）。PC3(ATCC CRL-1435)は、ヒト前立腺ガ
ン腫細胞株（Kaign等、Invest. Urol., 17:16-23, 1979）である。これらの細胞
は、ヒトPSCA(huPSCA)又はgD-huPSCAで形質移入された。gD又はgdは、ヘルペス
単純ウィルスの糖タンパク質Dのエピトープタグを意味する。gD-huPSCAの構築す
る過程において、PSCAのシグナル配列はgDエピトープタグをコードする配列で置
換された；gD-PSCA配列はpRKベクターへクローン化された。Her2抗体（HERCEPTI
NR）は、インヴィボにおいてHer2発現腫瘍細胞に局在することが知られているの
で、細胞表面上におけるHer2発現は、コントロールとして役立った。このような
形質移入により、ヒトPSCA発現腫瘍細胞が得られた。 抗体の調製 ここでの実験において用いられたマウス抗PSCAモノクローナル抗体に関するリ
ストについては表２Ｂを参照のこと。抗体名は、抗体を産生するクローンの最初
の3-4文字に由来する。全ての抗体は、FluoroLink Cy3単官能色素（Amersham Ph
armacia, PA23001）を用い製造者の説明書に従って標識された。標識化反応に対
し抗体は0.1 M 炭酸ナトリウム pH9.3中、1 mg/mlの濃度であった。1 mg/mlの抗
体ストックの1 mlがCy3標識混合物と共にチューブに添加され、完全に混合され
、室温で30分間シェーカー上でインキュベートさせた。サンプルは、光に対する
露光を抑えるためスズ箔でくるんだ。NAP10カラム(Amicon)がPBSで平衡化され、
結合反応の終了時に反応溶液がカラムに添加された。1.5 ml PBSが添加され、未
吸着画分が回収された。分光光度計の読み取りは、A552とA280で行われた。タン
パク質濃度及びタンパクに対する色素の割合は以下に示すようにして計算された
： 抗体の濃度：｛[A280-(0.08 X A552)]X 希釈係数}/1.4= mg/ml タンパクに対する色素の割合：[1.13 X (A552)]/[A280-(0.08 X A552)] 標識化の後、全ての抗体が結合性についてFACS解析によりチェックされた（表２
Ｂ参照）。
【０１２０】 腫瘍の播種及び生育 NCRのヌードメスマウスは、エストロジェンのペレットが移植され、その後、M
CF-7Her2gdPSCAの2 x 107細胞、又はネガティブコントロールとして形質移入さ
れていないMCF-7細胞株の2 x 107細胞が皮下的に播種された。オスのNCRヌード
マウスは、HCT-gdPSCAの5 x 106細胞が皮下的に播種された。腫瘍は皮下的に注
射され、マウスの脇腹部に着床された。デジタル出力可能なキャリパー計を用い
、腫瘍の測定が毎週２回、腫瘍の体積が100から500 mm3に達するまで行われた。
Cy3抗体のインジェクション及び組織の回収 腫瘍体積が少なくとも150 mm3に到達した段階で、マウスに３つのCy3標識化抗
PSCA抗体（6F2, 8D11, 5F2）の一つ、Cy3抗gd抗体、又はCy3標識化HERCEPTINが1
0 mg/kgで腹腔内で注射された。２４時間後、マウスは麻酔され、1 % パラホル
ムアルデヒドで灌流された。腫瘍組織と他の器官は回収され、蛍光顕微鏡による
抗体の局在解析のためOCT凍結保護物質（Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura F
inetek U.S.A. Inc., Torrance CA 90504）中で凍結された。同様の実験がCy3標
識化6B8抗体でも実施された。 蛍光顕微鏡 凍結サンプルは、5μmの薄片に切片化され、ダピ(dapi)(Vectastatin)を含む
蛍光マウント剤が加えられた。ダピは核を染色し、対比染色を提供する。
【０１２１】 ＩＩ．結果 抗体へのCy3標識化が抗原に結合する抗体の能力に対して負の影響を与えなかっ
たことを確認するために、抗体はFACS解析により結合特異性についてテストされ
た。表３中の「シフト」とは、蛍光でスクリーニングしたときの、細胞集団中に
おけるシフトを示し、Cy3標識化抗体が特異的な抗原に結合する能力を維持して
いることを示すものである。 表４中に要約された結果は、抗PSCA抗体がインヴィボにおいてPSCA発現腫瘍細胞
に特異的に局在し結合することができることを示した。肺又は腎臓では染色は認
められなかった。Cy3染色は、たいがい抗体を取り込む食細胞のKupffer細胞によ
り、肝臓において全てのPSCA抗体、抗gd、及びハーセプチンに対して観察された
。また、腫瘍関連で悪性ではない細胞では、たいがいマクロファージであるが、
形質移入された細胞株及び形質移入されていない細胞株の双方において、全ての
抗体に関しポジティブな染色が観察された。さらに、インヴィボにおいて抗体6B
8はPSCA発現PC-3腫瘍細胞に局在し、コントロールの形質移入PC3腫瘍細胞には局
在しないこともまた示された。染色パターンは、主に膜状であった。ポジティブ
な染色は、腫瘍内と腫瘍に隣接するマクロファージにも観察された。
【０１２２】 実施例３ この実施例は、PSCA発現細胞により内部移行される本発明の抗PSCAモノクロー
ナル抗体の能力について記述する。これらの研究は、蛍光又は放射標識した抗体
又は金が結合された抗体を用いて実施された。放射標識された抗体により、各細
胞株中に内部移行した抗体の量の定量化が解析された。 Ｉ．材料及び方法 インヴィトロの研究 gD PSCA(HCT-47及びPC3-19細胞)を発現する形質移入細胞、及びPSCA/HER2を発
現するMCF-7細胞（ここでは、MCF7/PSCA/HER2細胞とも称される）をカバースリ
ップ上に増殖させ、一連の抗PSCAモノクローナル抗体（10μg/ml）と1時間(hr)
インキュベートさせ、PBS中で洗浄し、PBS中の3%ホルムアルデヒドで固定し、PB
S中1%トリトンで膜透過性にし、Cy3-蛍光標識化抗マウスIgGで標識化した。コン
トロール実験として、親株の形質移入されていない細胞が使用された。免疫標識
された細胞は、モレキュラーダイナミクスの共焦点顕微鏡で観察された。 電子顕微鏡観察については、形質移入されたgD-PSCA発現NIH-3T3細胞が25μg/
mlの抗gD抗体と共に１時間、４℃でインキュベートされた。他の組の実験におい
て、PSCAを発現するCHO細胞は、20μg/mlの10E3及び6C3抗PSCA抗体と共に、４℃
でインキュベートされた。一次抗体とのインキュベーションに続いて、細胞はヤ
ギ抗マウスIgGの10 nm金付加物（gold adduct）で１時間処理された。細胞はカ
ルノフスキー固定液で固定する前に、15分及び1時間37℃に移され、電子顕微鏡
観察のために処理された。薄切片は、デジタル化GATANカメラを備えたPhilips C
M12で観察された。 電子顕微鏡オートラジオグラフィーについては、10A1及び8D11抗PSCA抗体はIo
do-Genに対する製造者の説明書に従ってヨウ素化された。125I-10A1及び125I-8D
11抗PSCA抗体は、HCT116gD PSCA細胞（上述されたgDヒトPSCAで形質移入された
ヒト大腸腫瘍株化細胞）と共に15分間、1時間及び6時間インキュベートされた。
インキュベーション後、細胞は洗浄され、0.1 M カコジル酸バッファー, pH7.2
中、2% ホルムアルデヒド、2.5 % グルタルアルデヒドで固定され、1 % オスミ
ウム四酸化物でさらに固定された。脱水し、EPONATE12エポキシレジン中に包埋
後、薄切片は切り出されIlford 1.4エマルジョンでコートされた。暴露後、切片
はMicrodol X中で現像し、酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で染色を行い、Philips
CM12 電子顕微鏡で観察した。
【０１２３】 6B8抗PSCA抗体の内部移行はgD.huPSCAを発現するPC3細胞を用いて電子顕微鏡
により結球された。6B8抗PSCA抗体はIodo-Genに関する製造者説明書に従ってヨ
ウ素化された。125I-6B8抗体は、PC3.gDhuPSCAクローン4細胞と共に15分間及び2
4時間インキュベートされた。インキュベーション後、細胞は洗浄され、0.1 M
カコジル酸バッファー, pH7.2中、2% ホルムアルデヒド、2.5 % グルタルアルデ
ヒドで固定され、1 % オスミウム四酸化物でさらに固定された。脱水し、EPONAT
E12エポキシレジン中に包埋後、薄切片は切り出されIlford 1.4エマルジョンで
コートされた。暴露後、切片はMicrodol X中で現像し、酢酸ウラニル及びクエン
酸鉛で染色を行い、Philips CM12 電子顕微鏡で観察した。 定常状態内部移行研究は以下のように行われた：MCF7/Her2 細胞（図.11、右
のパネル）はピューロマイシン選択マーカー(PurR)を含むベクターのみで形質移
入される；この細胞株は、PSCA抗体の内部移行に対する負のコントロールとなっ
た。MCF7/Her2/gD.PSCA細胞株は実施例２に記載されている。MCF7/Her2及びMCF7
/Her2/gD.PSCA細胞は、37℃で5時間以下の抗体の一つとインキュベートされた：
22 nM 125I標識抗PSCAモノクローナル抗体2395，2399，2403，及び0.8 nM 125I
標識抗Her2抗体、ハーセプチン。非結合抗体は除去され、細胞は冷やした培地で
洗浄された。細胞に結合した放射性の量は、酸洗浄液中（2 M 尿素、0.5 M 塩化
ナトリウム、50 mM グリシン pH2.4）で10分間細胞をインキュベートした後、洗
浄液を取り除きその放射性をカウントして定量した。その後、細胞は溶解バッフ
ァー（8 M 尿素、3 M 氷酢酸）で溶解後、内部に移行した放射性量を決定するた
めに、生じた抽出液がカウントされた。放射性標識された抗体の比活性と各アッ
セイサンプル中の細胞数を用いて、cpmが分子/細胞に変換された。 インヴィボにおける研究 MCF7/HER2/PSCA異種移植片腫瘍を持つマウスにCy3標識された6F8,5F2,又は8D1
1 PSCA抗体が腹腔内経由で投与された。24時間後、腫瘍は除去され、5，10，20
及び50μmに凍結切片化され、共焦点顕微鏡により観察された。 抗PSCA抗体は、前述のインヴィトロの実験で記述したように125Iでラベル化さ
れた。MCF-7/Her2/gdPSCA細胞が調製され、NCRヌードマウスに移植され、125I標
識化抗PSCA抗体、125I抗gd 抗体、又は125I標識化HERCEPTINRが前述の実施例２
に記載したようにマウスへインジェクトされた。腫瘍細胞は解析を行うために切
片化される。
【０１２４】 ＩＩ．結果 インヴィトロにおける研究では、免疫標識されたHCT47 gD PSCA, PC3-19 gD P
SCA及びMCF7/HER2/PSCA細胞の共焦点顕微鏡観察により、これらの細胞が様々な
度合いで以下の抗PSCAモノクローナル抗体、8D11, 10A1, 6C3, 6F8, 5F2, 7A6及
び10E3に結合し内部移行することを示した（図5から8を参照のこと）。内部移行
の染色パターンは、細胞質小胞及びゴルジ装置の近くにあるエンドソームに対応
するような核周辺小器官の存在により特徴づけられた。 インヴィボにおける研究では、標識化は、ほとんどの凍結切片化された細胞の
細胞表面上に観察され、細胞のわずかな割合において、細胞表面近くの小胞中に
内部移行される。 10 nm金粒子で視覚化された抗gD抗体とインキュベートされた上述の3T3細胞を
用いたEMによる内部移行研究は、gD-PSCAが内部移行されエンドソームの区画中
に輸送されたことを示した。金粒子は小胞及び多小胞体において視覚化された。
また、PSCA形質移入CHO細胞を用いたEMによる内部移行研究により、10E3及び6C3
両抗体のどちらの内部移行においても同じ経路が関与したことが示された（図9A
から9Dを参照のこと）。PSCA内部移行のキネティクスは、速いようであった（細
胞膜からエンドソームまで15分）。 125I-10AI及び125I-8D11抗PSCA抗体により、オートラジオグラフィーの銀粒子
が細胞膜、特に微絨毛に結合して観察された。また、125I-標識10AI及び8D11抗
体の添加後、オートラジオグラフィーの銀粒子は15分ほどの速さで細胞内に内部
移行されることも観察された。図10の顕微鏡写真中に見られる内部移行は、本実
験における結果の典型例である。ネオマーカーでは形質移入されたが、PSCAでは
形質転換されていないコントロールのHCT116細胞は、内部移行を示さなかった。 6B8抗体の結果は、125I-10A1抗PSCA抗体で得られた結果と同様であった。抗体
6B8の内部移行は、15分後から観察され、24時間後の時点まで続いた。オートラ
ジオグラフィーの粒子は、最初、細胞膜小胞と結合して観察され、その後、エン
ドソーム中に内部移行された。 図11は、gD-PSCAで形質移入されたHer2発現MCF7細胞において５時間後におけ
る、3つの抗PSCA抗体[腹水番号 2395(6F8), 2399(8D11), 2403(5F2)]の内部移行
の定常状態レベルを示す。細胞あたりの結合した抗PSCA抗体分子に対する溶解物
中に遊離して存在する分子の数が定量化された。
【０１２５】 ＩＩＩ．結論 PSCAに対して作製された抗体（6C3, 10E3, 10A1, 6F8, 5F2, 8D11, 6B8）はイ
ンヴィボ及びインヴィトロのどちらにおいても効率よくエンドサイトーシスされ
内部移行された。6C3, 10E3, 及び6B8の内部移行が小胞を通して起こるらしいこ
とが、超微細構造学的解析により示された。抗体は、ゴルジ装置に近接して存在
する多小胞体中に蓄積する。従って、種々のアプローチにより、本発明の抗PSCA
抗体は、細胞表面上のPSCAとの結合時に内部移行されることが示された。
【０１２６】 実施例４ 種々の細胞及び腫瘍組織における豊富なPSCAの量が、cDNAライブラリーのデー
タベースから、異なる組織及び器官で発現される遺伝子を代表するcDNAライブラ
リー中に存在するPSCAヌクレオチド配列のコピー数を決定することにより評価さ
れた（図14を参照のこと）。図18（x軸）に示される各器官に対し、数ダースのc
DNAライブラリーのプールが代表された。「全て(All)」とは、図に示される種々
の器官を代表するDNAライブラリーだけでなく、骨、子宮、小腸、胸腺、胃、結
合組織、及び分類されていない組織型を含む様々な組織から調製されたcDNAライ
ブラリーの混合物を意味する。正常及び腫瘍器官における相対的な豊富さは、プ
ールされたライブラリー中の全配列の数でライブラリー中のPSCA配列のコピー数
を除した数により決定され、図14中、#hits/100,000ランダム配列として示され
る。絶対的な豊富さ（Absabu）から、PSCA発現が、前立腺及び膀胱腫瘍において
高度に上方制御されていることは明らかである。
【０１２７】 実施例５ 抗PSCA抗体の抗腫瘍活性が、インヴィボにおいて評価された。 Ｉ．材料及び方法 ヒト前立腺ガン細胞株であるPC3は、ATCC(ATCC CRL-1435)より得られたもので
ある。株化細胞PC3.gDhuPSCAサブクローンは、親株PC3をpRK.gDPSCA.tkneoでFug
ene法（Roche Molecular Biochemical）を用いて形質移入させ、400μg/mlのG41
8（Life Technologies）中にプレートすることにより得られた。生育から２週間
後、G418耐性サブクローンが選択され、それを増殖させ、gDPSCA発現に関しアッ
セイが行われた。細胞株PC3.Neoは親株PC3をベクターpRK.tkneoで形質移入し、4
00μg/mlのG418で選択することにより作製された。安定化コロニーをプールし、
増殖させた。 NCRヌードマウス（Taconic Germantown, New York, USA）は、5 x 106 gDPSCA
で形質移入されたPC-3細胞又はneoで形質移入されたPC-3細胞で皮下的にインジ
ェクトされた。抗PSCAモノクローナル抗体2395(6F8), 2399(8D11), 2403(5F2),
及び2761(6B8)は10 mg/kgの投与量で細胞の播種一日前に腹腔内へ投与された。
ネガティブコントロールとして、抗ブタクサ（ragweed）モノクローナル抗体、M
ARG2（Genentech）が、同じ投与計画で投与された。細胞の播種に続いて、動物
は2週間毎に10 mg/kg 抗体で処理された。腫瘍の測定は2週間毎に行われた。こ
れらの実験の結果は、図18-20に示される。 別の実験（処置後の）において、マウスが抗PSCA抗体で処置される前に腫瘍が
あるサイズになるまで放置されたが、前立腺ガンの患者の症状及び治療を模倣す
るものである。至適には、腫瘍サイズは、抗体処理前におよそ75-100 mm3である
べきである。この実験において、NCRヌードマウス（Taconic Germantown, New Y
ork, USA）は、皮下的に5 x 106のgDPSCA形質移入PC-3細胞でインジェクトされ
、腫瘍を1週間増殖させた。その後、マウスは９匹のマウスの４つのグループに
分けられ、各グループおよそ200 mm3の平均腫瘍体積である。その後、マウスは2
週間毎に10 mg/kgの抗PSCAモノクローナル抗体2395(6F8), 2399(8D11), 2761(6B
8), 及び2403(5F2)又は抗ブタクサ抗体MARG2(Genentech)で処理された。腫瘍の
測定は2週間毎に行われた。これらの実験の結果は図21に示される。
【０１２８】 ＩＩ．結果 テストされた４つの抗PSCA抗体、即ち2395(6F8), 2399(8D11), 2403(5F2), 及
び2761(6B8)は、コントロールのブタクサ抗体と比較した場合、抗体そのもの（
何も結合されていない状態）がインヴィボにおいてPSCA発現前立腺ガン細胞細胞
を死滅させる細胞障害性活性を示した（図19-21を参照のこと）。p値は、図19中
の2395及び2399、図20中の2399, 2403, 及び2761、及び図21中の2395に対してp<
0.05でコントロールの集団の値とは著しく異なる。殺腫瘍性活性は、PSCA発現腫
瘍細胞（図19-21）に特異的で、コントロール、PSCA非発現PC3腫瘍細胞には見ら
れなかった（図18）。一旦マウスにインジェクトされるとPC3腫瘍細胞の生育速
度を予測しコントロールすることは困難であり、適時に抗体処理を開始すること
は困難であった。その結果、これら最初の処置後実験において抗PSCA抗体の投与
時には、腫瘍は至適サイズ（75-100 mm3）よりも大きく（150-200 mm3）なって
いた。抗PSCA抗体を用いた治療は、腫瘍がより小さく、より典型的なサイズの時
に開始される場合、及び抗体の投与量が10 mg/kg以上に増加された場合、腫瘍に
対する細胞障害活性においてより大きな効果が期待できる。
【０１２９】 実施例６ カニクイザルのPSCA 本実験は、カニクイザルPSCAのクローニングについて記載し、当該抗ヒトPSCA
抗体が高い相同性を持つカニクイザルPSCAとヒトPSCAに同等の親和性で結合する
ことを示す。高い相同性に加え、カニクイザルの尿路上皮はヒトの尿路上皮で見
られるのと同じ様式でPSCAを発現し、これにより、抗PSCA抗体細胞障害研究に対
して当該霊長類が良好で適当な動物モデルとなることを見いだした。抗PSCAその
もの及び毒素を結合させた抗PSCA抗体がこのモデルにおいてテストされる。 Ｉ．材料及び方法 カニクイザルPSCAのクローニング RNAは一匹のカニクイザルの膀胱から精製された。PSCAをクローン化するため
に、プライマーpsca.2F(AAGGCTGTGCTGCTTGCCCT-配列番号：14）及びpsca.1R(GAG
TGGCACAAAGGCCTGGG-配列番号：15)を用いて、RT-PCRが実施された。２回の独立
のPCR反応から得られる合成されたPCR産物は、PCRサブクローニングベクターpCR
2.1-TOPO(Invitrogen)中にサブクローン化され、その後配列決定された。 細胞表面PSCA上の親和性測定 ヒト及びカニクイザルのPSCAに対する全コード配列は、発現ベクターpRK中に
クローン化された。抗PSCAモノクローナル抗体5F2(腹水番号2403)はラクトペル
オキシダーゼ法を用い、125Iで標識化された。PC3細胞又はCHO細胞は、Fugene R
eagent (Roche)を用い、pRK.gD.human psca又はpRK.gD.cynomolgus pscaで一過
的に形質移入された。形質移入２日後、細胞は、再度24ウェルプレート上に播か
れ、種々の濃度の非標識Mab 2403と一定量の125I-Mab 2403を含む培地中、４℃
で16時間インキュベートされた。非結合抗体は、除去され、細胞は氷冷した培地
で洗浄された。結合した放射性量は、細胞を8 M 尿素/3 M 氷酢酸中で溶解させ
ることにより決定された。Kd値は、NewLigandプログラムを用いてスキャッチャ
ード解析により計算された。 FACS解析： COS細胞(アフリカミドリザルの腎臓細胞)は、ベクターpRK.human.psca又はpRK
.cynomolgus.pscaのいずれかにより一過的に形質移入された。形質移入2日後、
細胞は培養皿から5 mM EDTAを用いて剥離させ、PBSで1回洗浄した。細胞は何本
かのチューブに分配し、10μg/mlの抗体8D11(腹水#2399)又は6B8を用いて4℃で1
時間 染色した。PBSで2回洗浄後、細胞はFITC抗マウス(ICN)抗体で染色され、フ
ローサイトメトリーを用いて解析された。ゼノマウス（Xenomouse）抗体（10C5
からのサブクローンである1D8, 3B8, 及び6D1）は反応あたり100μlのハイブリ
ドーマ上清で用い、FITC抗ヒトカッパー鎖抗体で染色され、再度フローサイトメ
トリーで解析された。FACS解析の結果は以下の表5に示される。
【０１３０】 ＩＩ．結果 サルPSCAの７つのサブクローンが配列決定され、それから２タイプの配列が得
られた：タイプＩ(4つのサブクローン)とタイプＩＩ(3つのサブクローン)である
。このＤＮＡ及び翻訳されたアミノ酸配列は、タイプＩ(配列番号16及び17)につ
いては図15に、タイプＩＩ(配列番号18及び19)については図16中に示される。RN
Aは個別のサルの膀胱から精製され、サルは野生種（純系種ではない）であった
ので、これら２つのタイプはおそらく同一遺伝子の異なる対立遺伝子を表すもの
である。タイプＩ及びタイプＩＩのカニクイザルPSCAは、DNAレベルで98.64%の
同一性を示し、タンパク質レベルではアミノ酸119(セリン対グリシン)において
唯一のアミノ酸の相違を持ち99.18%の同一性を示した。PSCAはGPI-アンカー表面
タンパク質である。ヒトPSCAにおいて、GPI結合に関する切断位置はアミノ酸100
の位置である。この切断及びGPI結合はカニクイザルPSCAにおいても同様に起こ
ると考えられるので、成熟タイプＩ及びタイプＩＩのサルPSCAは、アミノ酸配列
上100%の同一性を持つであろう。両タイプは、全コード配列においてヒトPSCAと
およそ94%の同一性を持つ。図17にヒト(配列番号1)とカニクイザルタイプＩPSCA
(配列番号17)のアミノ酸配列を比較する。 COS細胞表面上に発現されたヒト又はカニクイザルPSCAに結合する抗PSCA抗体
についてのFACSシフトの平均値（FITCのユニットで示される）は、表5（マウス
抗体）及び表6（ゼノマウス抗体）に示される。他の研究から、5F2, 8D11及び6F
8抗体がヒトPSCAに対して非常に似た結合親和性を有することが知られていた。
従って、これら3つの抗体のうち5F2が代表例としてコールド競合アッセイにおい
て使用された。表７には、コールド競合アッセイで決定された抗体5F2及び6B8の
細胞表面上のヒト及びカニクイザルPSCAに対する親和性を比較する。FACS解析及
びコールド競合アッセイの結果は、マウスとゼノマウスヒト抗体が、天然の条件
で細胞表面上に発現されたヒト及びカニクイザルPSCAと、同等の親和性（許容範
囲内での誤差）で結合することを示した。
【０１３１】
【０１３２】 実施例７ 抗PSCA抗体-DM1結合 本実施例は、抗PSCA抗体のメイタンシノイド（maytansinoid）、DM1との結合
について記載する。DM1は、細胞中で活性化されるプロドラッグである；微小管
構築の阻害剤であり、有糸分裂を中断させる。DM1の構造は図22に示される。DM1
結合-抗PSCA抗体の構造は、図23に示される。以下の結合に関し、図22中のR基は
SH又はその保護された誘導体である；特にジスルフィド誘導体が好ましい。例え
ばpH又は個々の抗体に対する試薬濃度を至適化させるために、この方法に対して
変形が施されてもよい；これらの変形は本質的には常套的であり、タンパク質化
学の当業者にとっては周知であろう。 SPPによる抗PSCA抗体の修飾 精製された抗PSCA抗体（例えば、表２Ｂに列挙される抗PSCA抗体の一つ）は、
N-スクシニミジル-4-(2-ピリジルチオ)ペンタノエート(SPP)でジチオピリジル基
を導入するために修飾された。塩化ナトリウム(50 mM)とEDTA(1 mM)を含むリン
酸カリウムバッファー（PPB; 例えば、50 mM PPB pH6.5）中で抗体(例えば、約6
-10 mg/mL)がSPP(例えば、2.3 mLのエタノール中5.3モル等量)で処理された。外
界温度下、アルゴン存在下にて90分間インキュベーションした後、反応混合物は
標準的な方法、例えば、35 mM クエン酸ナトリウム、154 mM 塩化ナトリウム、2
mM EDTAで平衡化させたSephadex G25カラムでゲル濾過することにより、濾過さ
れた。抗体を含む画分がプールされアッセイされた。抗体の修飾の程度は、上記
のようにして決定される。 抗PSCA抗体-SPP-PyのDM1による結合 修飾された抗体(例えば、9.5μモルの遊離可能な2-チオピリジン基を持つ)は
、上記の35 mM クエン酸ナトリウム緩衝液, pH6.5で最終濃度、例えば2.5 mg/mL
になるように希釈される。その後、3.0 mM ジメチルアセトアミド(DMA、最終反
応混合液中3% v/v )中、DM1(例えば、1.7等量、16.1μモル)が抗体溶液に添加さ
れる。アルゴン存在の下外界温度下で20時間反応が進行した。 反応産物は、ゲル濾過カラム、例えば、35 mM クエン酸ナトリウム、154 mM
塩化ナトリウム、pH6.5で平衡化されたSephacryl S300ゲル濾過カラム(5.0 cm x
90.0 cm, 1.77L)にかけられた。流速は、例えば、5.0 mL/minで65画分(各20.0
mL)が回収される。主たるピークが単体の抗PSCA抗体-DM1を含む。主たるピーク
の周辺の画分はプールされ、アッセイが行われる。抗体分子に対して結合された
DM1薬物分子の数は、例えば、252 nmと280 nmの吸収を測定することにより決定
され、抗体分子あたり約3-5の薬物分子の結合が明らかにされた。
【０１３３】 実施例８ 培養細胞上における抗PSCA-DM1結合体の細胞障害 抗PSCA抗体#2761(6B8)と#2399(8D11)が、上述したようにDM1と結合された。内部
移行研究において、DM1結合抗体がPSCA発現細胞により効率的に取り込まれるこ
とが予想された。２つの抗ブタクサ抗体は抗原特異性及びイムノグロブリンアイ
ソタイプに対するコントロールとして使用された。最初の４つのDM1結合体に関
するインヴィトロにおける細胞障害の結果が報告される。細胞障害は、PC3.Neo
細胞及びPC3.gDヒトPSCA clone4細胞上でのクローン原性アッセイにおいて測定
された。これら２つの細胞株は、DM1非結合の抗体(図.24)と同等に感受性がある
ことが示され、PC3.Neo細胞株はPC3.gDヒトPSCAclone4細胞に対する良好なネガ
ティブコントロール抗原であることを示唆した。 Ｉ．方法 細胞は、テストされるべき抗体結合体を含んだ、又は含まない成長培地中、6
ウェル組織培養用プレートに播かれた。コントロールの培養は、500 細胞/プレ
ートで播かれた。結合抗体に暴露される培養は、500 から5000細胞/プレートの
間の幾つかの密度でプレートされた。その後、細胞はコロニーを形成させるため
37℃で5から7日インキュベートされた。細胞は固定され、クリスタルバイオレッ
ト色素で染色され、コロニー数が数値化された。播き効率（PE）は、コロニー/
播かれた細胞数で計算された。生存率は、処理した細胞のPE/処理されない細胞
のPEで計算された。コントロール培養物の播き効率は、コントロール株及びPSCA
発現細胞株のいずれに対しても40％から60％の範囲内であった。
【０１３４】 ＩＩ．結果（濃度は各抗体に対する濃度で与えられる） 結合体 引用＃ アイソタイプ DM1/Ab IC10, M 抗PSCA抗体#2761-DM1 1461-44 IgG2a 3.39 〜1 x 10-9 抗PSCA抗体#2399-DM1 1461-165 IgG2b 2.94 〜3 x 10-10 抗ブタクサ抗体#1428-DM1 1461-154 IgG2a 2.68 無毒性 抗ブタクサ抗体#1429-DM1 1461-175 IgG2b 1.85 無毒性 結合抗体2399-DM1はPC3.gDヒトPSCAclone4細胞に対し、連続暴露においてIC10 〜3 x10-10の細胞障害性を示した（図25）。アイソタイプの一致したコントロー
ルである1429-DM1はテストされた最高濃度（3 x 10-9M）においても細胞に対し
て毒性を示さなかった。第二の結合抗体2761-DM1はPC3.gDヒトPSCAclone4細胞に
対し、連続暴露においてIC10〜1 x 10-9の細胞障害性を示した（図26）。アイソ
タイプの一致したコントロールである1428-DM1はテストされた最高濃度（3 x 10 -9 M）においても細胞に対して毒性を示さなかった。４つのDM1結合抗体いずれも
テストされた最高濃度（3 x 10-9M）においてPC3.Neoに対し毒性を示さなかった
、図27を参照のこと。 結論 結合抗体2399-DM1及び2761-DM1は、PSCA抗原ポジティブ細胞に対し特異的に細
胞障害性を示した。
【０１３５】 実施例９ インヴィボにおける腫瘍の成長に対するDM1結合抗体の影響 Ｉ．材料及び方法 6-8週齢のメスのNCRヌードマウス（Toconic, Inc）に、5 x 106PC-3gdPSCA細
胞を1日目に0.2 ml容量で皮下的にインジェクトした。5日間腫瘍を生育させ、そ
の後キャリパー計を用いて二次元的に測定された。腫瘍の体積は、以下の式を用
いてmm3で表される：V=0.5a x b2, ここでa及びbはそれぞれ腫瘍の長径と短径で
ある。マウスは、平均腫瘍体積160 mm3で7匹の6グループに分類された。6日目、
抗体処理が開始された。抗体のみ（DM1非結合）の抗PSCA抗体2399(8D11), 2761(
6B8)及び抗ブタクサネガティブコントロール抗体、1428が10 mg/kgの投与量で週
に2回腹腔内注射された。本処置療法は実験全体にわたり続けられた。細胞毒素
メイタンシノイド、DM1が結合された同一の抗体が、75μg/kgのDM1濃度で静脈内
（IV）にインジェクトされた。DM1抗体は全8投与量に対して週2回投与された。
腫瘍は、実験を通じて週2回測定された。以下の表8は投与計画を示す。
【０１３６】 結果 図28に示されるように、処置後26日までに、非結合抗PSCA抗体及びDM1結合抗
ブタクサコントロール抗体のいずれと比較しても、DM1結合抗PSCA抗体(2399及び
2761)で処理された動物においてヒト前立腺腫瘍(PSCA発現細胞)が実質的に除去
されていた。DM1-2399又はDM1-2761で処置された７匹の動物の各グループ内では
、4匹の動物は検出可能な腫瘍を有していなかった。残存する腫瘍を持つ３匹の
動物については、DM1結合抗ブタクサコントロール抗体処置グループの約550 mm3 の腫瘍体積に比して、平均腫瘍サイズがたったの6mm3であった。DM1処理は29日
目に終了するまでにもう一回続ける。33日目、全グループのマウスが処理され、
組織化学的解析のために腫瘍組織が回収される。肝臓、腎臓及び膀胱を含む他の
組織は、回収され、抗体処置に関係する細胞障害の徴候に関し調べられた。
【０１３７】 実施例１０ 組織マイクロアレイを用いたPSCA発現解析 正常組織及び悪性腫瘍におけるヒトPSCAの発現は、複数組織アレイ上のアイソ
トピックインサイツハイブリダイゼーション(ISH)を用いて調べられた。組織マ
イクロアレイ(TMA)は、典型的には100から1000を超える範囲の個々の組織サンプ
ルを含むパラフィンブロックである。TMAは、パラフィンブロックに包埋された
「ドナー」組織から少量の生検サンプルを得、アレイを形成するように一つの「
レシピエント」ブロック中に生検サンプルを一緒に再包埋することで構築される
。 Ｉ．方法 PCRプライマー(上流- 5' ACCCACGCGTCCGGCTGCTT 3' [配列番号24]及び下流- 5
'CGGGGGACACCACGGACCAGA 3' [配列番号25])がヒトPSCAの768bpを増幅させるよう
に設計された。プライマーには、増幅産物から、センス又はアンチセンスプロー
ブそれぞれのインヴィトロ転写を可能にするために、27ヌクレオチドのT7又はT3
RNAポリメラーゼ開始部位をコードする伸展部が含まれていた。腫瘍マイクロア
レイのスライド板は、脱パラフィン化され、20μg/mlのプロテイネースK中で37
℃15分間脱タンパク化され、さらにインサイツハイブリダイゼーションのために
処理された。33P-UTP標識化センス及びアンチセンスプローブは、55℃で一晩切
片に対してハイブリ化された。結合しなかったプローブは、20 mg/ml のRNase中
でインキュベーションにより除去された。37℃での30分間の処理後、0.1 x SSC
中、55℃で2時間の高緊縮性の洗浄、及び段階的エタノール濃度による脱水が行
われた。このスライド板はNBT2 nuclear track emulsion(Eastman Kodak)中に浸
され、乾燥剤を入れた密封スライドボックス中で4℃、4週間暴露され、現像後、
ヘマトキシリンとエオシンで対比染色された。
【０１３８】 ＩＩ．結果 正常前立腺及び前立腺腫瘍に対するISHアッセイの結果が表９にまとめられて
いる。 原発性前立腺ガンのグループには、前立腺上皮内腫瘍（PIN；PSCAに対して１
例はネガティブ、１例は弱いポジティブ、5例は強いポジティブを示した）の7例
が含まれる。転移前立腺ガンのグループは、リンパ節転移の25例、肝臓転移の2
例（両例はPSCAに強いポジティブを示す）、及び脳転移の1例（PSCAに対して弱
いポジティブを示す）から構成される。別途の前立腺複組織アレイ（正常前立腺
、原発性及び転移前立腺ガン）における予備的な結果は、これらの数値を実証す
る。他の腫瘍タイプ（肺及び大腸）に対する結果は、予備的であり、およそ10%
の肺ガン及び5％の大腸ガンがPSCAを少量又は中程度のレベルで発現することを
示すようである。
【０１３９】 実施例１１ 腫瘍及び正常組織におけるPSCA分布 実施例１１では、ここでの抗PSCA mAbsを用いて免疫組織化学(IHC)により評価
される腫瘍及び正常組織におけるPSCAの分布について記述する。一連の原発性の
、器官に閉じこめられた前立腺ガンがPSCAの発現に関して評価される。また、PS
CAの発現は、乳ガン、肺ガン、大腸ガン、及び腎臓ガンの凍結切片、及び大腸ガ
ン腫細胞株においてもアッセイされる。別途、PSCAに対するTaqmanTM解析が本IH
C研究に対して用いられる幾つかの同一の事例に対して実施されている。TaqManT M は、実時間での遺伝子増幅をモニターするためにTaq DNAポリメラーゼの5' エ
クソヌクレアーゼ活性を使用する蛍光PCRに基づく技術である。 凍結切片上でのPSCA染色法 5μ厚の凍結切片は、新鮮に凍結された腫瘍組織からLeicaクライオスタットで
切断され、さらなる使用時まで-20℃で保存された。 切片は完全に乾燥させ、アセトン/エタノール中で5分間固定させる。その後切
片は、リン酸バッファー(PBS)でそれぞれ5分間、2回リンスする。内在性のペル
オキシダーゼ活性はグルコースオキシダーゼ／グルコース法を用いて37℃、60分
間処理し失活させる。この後、PBSで2回、各々5分間毎に交換してリンスする。
内在性のビオチンのブロッキングは、Vector Avidin/Biotin Blocking Kitを用
いて行われる。内在性のイムノグロブリン結合サイトに対するブロッキングは、
10 %通常ウマ血清で30分間行われる。ブロッキング血清は洗い流さない。 切片は、ブロッキング血清で10μg/mlに希釈された抗PSCAマウス抗体で、室温
（RT）にて60分間インキュベートされる。マウスアイソタイプコントロール抗体
(Zymed)はネガティブコントロールとして使用される。切片はPBSで各5分間2回洗
浄される。特異的に結合した一次抗体の検出は、ビオチン化ウマ抗マウスIgで達
成される。切片は、ブロッキング血清で1:200に希釈されたビオチン化ウマ抗マ
ウスIgGと30分間インキュベートされる。切片はPBSで各5分間2回洗浄され、希釈
されたABC試薬で30分間インキュベートされ、再度PBSで各5分間2回洗浄される。
切片は、Pierce Metal Enhanced DABで5分間インキュベートされ、その後水道水
で5分間リンスされ、Mayer's hematoxylinで1分間対比染色され、水でリンス後7
0%, 95%,100%のエタノール中に移し、キシレン処理後カバーグラスを載せる。そ
の後、切片は脱水し、夾雑物を除去し、合成マウント剤でマウントする。 結果 悪性上皮細胞においてPSCAの発現が認められる。発現のレベルは、弱い発現か
ら非常に強い発現にわたり、悪性の細胞でポジティブな集団は10%以下から>95%
の範囲に及ぶ。PSCA mRNAについては、既に、結腸直腸腺ガンにおいてインサイ
ツハイブリダイゼーションにより示されていた。
【０１４０】 実施例１２ 動物モデルは病原性のメカニズムを理解し新規治療法の開発に有用である。本
研究は、インサイツハイブリダイゼーションによる胎児及び成体組織におけるマ
ウスPSCAの発現パターンと、ヒト前立腺腺ガンに対するマウスモデルについて報
告する。 構造学的に、PSCAは、Thy-1/ly-6ファミリータンパク質のメンバーと相同性を
持つGPI結合膜糖タンパク質である。未成熟リンパ球に対する細胞表面マーカー
であるSca2と極めて近い関連性を持つ(Noda S.等、Journal of Experimental Me
dicine 1996;183:2355-60)。正常組織でのヒトPSCA RNAの発現は、本来、組織特
異的のみならず、前立腺基底細胞に本質的に限定されるものとして記述されてい
た。著者は後者の観察とSca2に対する構造上の相同性から、PSCAは「幹」細胞抗
原であることを推測した。 マウスホモログは、核酸及びアミノ酸レベルでヒトPSCAと70%の同一性を示す
ことが示されていた（Reiter RE等、1998, Proc.Natl.Acad.Sci. 95:1735-40）
。ヒト前立腺ガンに対するモデル動物として十分確立されたものの一つは、Tran
sgenic Adenocarcinoma of the Mouse ProstateTM(TRAMPTM)(Greenberg NM, 199
5, PNAS 92:3439-43)である。解剖学的に著しい相違がヒトの前立腺と比較した
場合に存在するが、分泌機能及びホルモン制御を含む先天的な共通の特徴を持つ
。TRAMPTMモデルにおいて、ラットのプロバシン遺伝子の最小プロモーターは、S
V40ラージT抗原の発現を前立腺上皮に標的化する。全てのオスのTRAMPマウスが
通常8-12週で前立腺ガンへと移行する（Gingrich JR等、1997 Cancer Reaserch
57:4687-91)。原産のTRAMPTMモデルは、ガンの発生が前立腺上皮に特異的で、初
期にアンドロゲンにより制御される点でヒト前立腺腺ガンに特に関連がある。さ
らに、離れた部位への転移が最終的には生じる(Gingrich JR等、1996, Cancer R
esearch 56:4096-102；Gingrich JR等, 1999, Prostate Cancer & Prostatic Di
seases 2:70-75）。
【０１４１】 Ｉ．材料及び方法 マウス及び組織収集 10から24週齢の間のオスとメスの成体CD-1マウスはCharles River laboratori
esから得られた。妊娠中のマウスが胎児を集めるためにオーダーされた。膣栓に
よる分離の日は、胎児期第1日と判断された。ISHで調べられる胎児組織には：E1
0, E13, E14, E15, E17及びE18が含まれた。調べられる成体組織には：オスの泌
尿生殖器システムの組織、メスの膀胱及び腎臓、青年期の乳腺、妊娠14日の乳腺
、授乳中の乳腺、肝臓、心臓、皮膚、及び腸が含まれた。全ての組織は、4%ホル
マリンで固定され、パラフィンに包埋された。TRAMPTMのプリーダーペアー(Bree
der pairs)の遺伝子組換えマウスはNorman Greenberg博士から供与頂いた（Bayl
or College of Medicine,Housotn, TX）。野生型の同腹仔C57BL/6からの泌尿生
殖器組織は、週齢が一致した遺伝子組換えマウスTRAMPTMとの比較のために12及
び24週齢で採取された。12週齢までに、TRAMPTMマウスは典型的にはPINに移行し
、及び／又は十分に分化した腫瘍になる。12から39週齢の間の9匹のTRAMPTMオス
マウスが処理され、常套的な組織学及びISH調査のため回収された。前立腺ガン
の組織学的グレードが、TRAMPTMモデルにおける既刊の研究内容（Gingrich JR等
、1999, Prostate Cancer & Prostatic Diseases 2:70-75）に従って決定された
。 マウスPSCAのオーソログのクローニング マウスPSCAに対する全長cDNAは、17日の胎児マウスからMarathon-Ready cDNA(
Clontech)を用いて増幅された。プライマーは、Genbankに存在するEST配列に基
づいて設計された。センスプライマー(5' ACTATGAAGCTTTGCAGCTCATCCCTTCACAATC
G 3' (配列番号20))及び3'非翻訳領域におけるアンチセンスプライマー(5' GAAT
TCGGATCCACCATGAAGACCGTCTTCTTTCTCCTGCTG 3' (配列番号21))は、引き続きPCRサ
ブクローニングベクターPCR2.1TOPO(Invitrogen)中にクローン化される420bp断
片を作製するのに使用された。クローンはＤＮＡシークエンシングによって確認
された。 インサイツハイブリダイゼーション PCRプライマー(上流-5' CCTGCTGGCCACCTACT 3' 及び 下流-5' CCTTCACAATCG
GGCTAT 3'-各々配列番号22及び23)は、マウスPSCAの388bp断片を増幅させるため
に設計された。プライマーには、増幅産物から、センス又はアンチセンスプロー
ブそれぞれのインヴィトロ転写を可能にするために、27ヌクレオチドのT7又はT3
RNAポリメラーゼ開始部位をコードする伸展部が含まれていた(Lu等、Cell Visi
on 1994, 1:169-176)。5μm厚の切片は、脱パラフィン化され、4μg/mlのプロテ
イネースK中で37℃30分間脱タンパク化され、さらにインサイツハイブリダイゼ
ーションのために処理された。33P-UTP標識化センス及びアンチセンスプローブ
は、切片に対して55℃で一晩、ハイブリ化された。結合しなかったプローブは、
20 mg/ml のRNaseAで37℃で30分間インキュベーションすることで除去され、0.1
x SSC中、55℃で2時間の高緊縮性の洗浄、及び段階的エタノール濃度による脱
水が行われた。スライド板はNBT2 nuclear track emulsion(Eastman Kodak)中に
浸され、乾燥剤を入れた密封スライドボックス中で4℃、4週間暴露され、現像後
、ヘマトキシリンとエオシンで対比染色された。インサイツハイブリダイゼーシ
ョンは、常套的にセンス及びアンチセンスによる2組の切片に対して実施された
。センスプローブでハイブリダイズされた切片には顕著なハイブリダイゼーショ
ンシグナルは観察されなかった。
【０１４２】 結果 結果をまとめると、マウスPSCAは、尿生殖洞、皮膚、胃腸管において胎児の発
達期に発現される。これらの組織における発現は最上層の細胞層に限定される。
成体のマウスにおいては、その発現は尿路の粘膜の裏打ち中に最も高度である。
正常成体の前立腺において、PSCAの発現は、分泌上皮中に排他的に検出される。
TRAMPTMモデルにおけるマウス前立腺の発ガン期におけるPSCAの検査により、腫
瘍形成領域における顕著な増加が示された。 これらの研究により、マウスPSCAの発現は、前立腺特異的でもなければ、幹細
胞マーカーと一致しているわけでもないことが示される。本結果は、上皮表面中
でのPSCA発現は、adluminal又は表層性の細胞層に限定されるのであって、ヒト
遺伝子の報告にあるような基底細胞にはないことを明白に示すものである。adlu
minal外層の細胞は典型的には高度な分化を示すが、幹細胞とは異なり低い増殖
性又は自己再生能を示す。従って、当該分子を「幹細胞抗原」と命名することに
は疑問が生じる。これらの結果は、正常組織及びマウス前立腺腺ガン組織におけ
るマウスPSCAの発現パターンが、ヒト前立腺腺ガンにおいて発表されているデー
タと異なることを示唆する。おそらく、TRAMPTMの腫瘍とヒト前立腺腺ガンとの
間のPSCA発現における差違は、PSCA発現の種特異的制御を示すものか、又は進行
中の発ガン事象のタイプに関連するものである。 PSCAの最も強い発現は、発育中の尿路上皮及び成熟尿路中に見いだされる。成
体において、発現は腎盂から尿道全体にかけて生じる。前立腺での発現はパッチ
状だが、大前立尿管と尿道との接合部において目立って増大する。この発見が排
尿反射と関連するならば、このタンパク質の機能に関する潜在的な解決の糸口を
提供するこれらの構造に考えを巡らすことは魅力的である。PSCAの発現を示す上
皮表面の共通の特徴は、常に体液、粘膜、分泌物と接触状態にある構造に裏打ち
しているという事実である。これは、明らかに尿路上皮の事例であるが、この知
見は、顕著なPSCA発現が羊膜、肛門管、中咽頭、食道、及び発育中の胎児の皮膚
に認められるとの観察に対しても当てはまる。いずれの仮説や機序によっても限
定されるものではないが、胎児の気管支内ツリーのような他の体液に曝される上
皮組織はPSCAを発現しないので、更なる共通の特徴が働いているようである。胎
児の皮膚における発現が一過的に制御されるかどうかは、調べられた胎児の数が
少ないので、現時点で決定づけることは困難である。しかし、皮膚におけるPSCA
の発現は、出生後、つまり子宮外での生活においてはもはや必要とされないよう
に思える。複数層の上皮表面内での発現パターンは、PSCAが外的な侵襲に対する
バリア又はバッファーとして機能することを示唆する。PSCAノックアウトマウス
の作製など、更なる研究が正常組織におけるPSCAの主要な機能を明らかにするの
に役立つであろう。 胎児及び成体組織における多くのPSCAの選択的発現により、マウスがこのタン
パク質の生理的な機能を決定するのに適するモデルに仕立てられる。PSCAは進行
ガンの段階では消失するが、TRAMPTMモデルは、なお、前立腺ガンに対する標的
としてPSCAを研究するために潜在的に有用なツールとなりうる。
【０１４３】 結論 上記の実施例は、本発明の抗PSCA抗体がインヴィボにおいてPSCA発現ガン細胞
を効率よくに標的とすること、GPI結合PSCA分子及びそれに結合する抗体がPSCA
を発現するガン細胞への抗体の結合時に速やかに内部移行されることを示した。
抗PSCA抗体は、インヴィボにおけるガン細胞の破壊及び腫瘍増殖阻害において特
異性及び効率性を示した。腫瘍細胞の細胞障害性は、毒素、特に細胞内で機能す
る毒素であるメイタンシノイド、DM1を結合させた抗体を用いることで、著しく
増大された。DM1結合抗PSCA抗体での処理により、PSCAを発現するヒト前立腺腫
瘍細胞がインヴィボにおいて完全に除去された（実施例９を参照のこと）。
【０１４４】 ＩＸ．文献 特許、公開出願及び他の刊行物を含む、この出願において引用した文献を出典
明示よりここに取り込む。 本発明の実施には、特に他のものを示さない限り、当業者の技量内である分子
生物学の一般的な技術等が使用される。そのような技術は文献に十分に説明され
ている。例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (J. Sambrook等,
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989); Current
Protocols in Molecular Biology (F. Ausubel等編, 1987改訂); Essential Mol
ecular Biology (T. Brown編, IRL Press 1991); Gene Expression Technology
(Goeddel編, Academic Press 1991); Methods for Cloning and Analysis of Eu
karyotic Genes (A. Bothwell等編, Bartlett Publ. 1990); Gene Transfer and
Expression (M. Kriegler, Stockton Press 1990); Recombinant DNA Methodol
ogy II (R. Wu等編, Academic Press 1995); PCR: A Practical Approach (M. M
cPherson等, IRL Press at Oxford University Press 1991); Oligonucleotide
Synthesis (M. Gait編, 1984); Cell Culture for Biochemists (R. Adams編, E
lsevier Science Publishers 1990); Gene Transfer Vectors for Mammalian Ce
lls (J. Miller & M. Calos編, 1987); Mammalian Cell Biotechnology (M. But
ler編, 1991); Animal Cell Culture (J. Pollard等編, Humana Press 1990); C
ulture of Animal Cells, 2版(R. Freshney等編, Alan R. Liss 1987); Flow Cy
tometry and Sorting (M. Melamed等編, Wiley-Liss 1990); シリーズ Methods
in Enzymology (Academic Press, Inc.); Wirth M.及びHauser H. (1993); Immu
nochemistry in Practice, 3版, A. Johnstone & R. Thorpe, Blackwell Scienc
e, Cambridge, MA, 1996; Techniques in Immunocytochemistry, (G. Bullock &
P. Petrusz編, Academic Press 1982, 1983, 1985, 1989); Handbook of Exper
imental Immunology, (D. Weir & C. Blackwell編); Current Protocols in Imm
unology (J. Coligan等編, 1991); Immunoassay (E. P. Diamandis & T.K. Chri
stopoulos編, Academic Press, Inc., 1996); Goding (1986) Monoclonal Antib
odies: Principles and Practice (2版) Academic Press, New York; Ed Harlow
及びDavid Lane, Antibodies A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labor
atory, Cold Spring Harbor, New York, 1988; Antibody Engineering, 2版 (C.
Borrebaeck編, Oxford University Press, 1995);及びシリーズAnnual Review
of Immunology; シリーズAdvances in Immunologyを参照されたい。
【０１４５】 Ｘ．株化細胞とＤＮＡの寄託 次のハイブリドーマ株化細胞を、アメリカ合衆国20110-2209バージニア州マナ
ッサスのユニバーシティ・ブールバード10801に所在するアメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション（ATCC）に寄託し、次の受託番号が与えられた： ハイブリドーマ ATCC受託番号 寄託日 PSCA.10E3 PTA-717 1999年9月16日 PSCA.6F8 PTA-718 1999年9月16日 PSCA.8D11 PTA-719 1999年9月16日 PSCA.5F2 PTA-720 1999年9月16日 PSCA.6C3 PTA-880 1999年10月26日 PSCA.6B8 PTA-2265 2000年7月25日 PSCA.10C5 PTA-2264 2000年7月25日 次のベクターDNA（実施例１を参照）をＡＴＣＣに寄託した pRK-2403L 2000年10月 pRK-2716L 2000年10月 pRK-2403H 2000年10月 pRK-2716H 2000年10月
【０１４６】 上記の寄託されたハイブリドーマ株化細胞の名前は簡単にするために短縮され
ている；これらのハイブリドーマは表２Ｂに列挙した（その完全な名前が付され
ている）クローンに対応する。 この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条
約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付
から３０年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。
寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテック社とＡＴＣＣとの間
の合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、どれが最初であろう
とも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、
寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許
法第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号８８６ＯＧ６３８の
３７ＣＦＲ第１．１４条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定
した者に後代を入手可能とすることを保証するものである。
【０１４７】 本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に
死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のもの即座に
取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政
府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであると
みなされるものではない。これらの寄託をなすことは、寄託が本発明の実施に必
要であること認めるものでは決してない。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＦＡＣＳによりアッセイされた、Ｍａｂ ５Ｆ２によるｇＤ-ＰＳ
ＣＡ形質移入ＣＨ細胞への結合性及びその染色性を示す(実施例１を参照)。
【図２】 ＦＡＣＳによりアッセイされた、Ｍａｂ １０Ｃ５によるｇＤ-Ｐ
ＳＣＡ形質移入ＣＨ細胞への結合性及びその染色性を示す(実施例１を参照)。
【図３】 種々の可溶性ＦＡＣＳ抗原に対する、６Ｂ８．１Ｄ７．２Ｂ３抗
ＰＳＣＡの結合活性を示す(実施例１を参照)。
【図４】 抗体腹水番号２４０３(５Ｆ２)に対する結合曲線を示す(実施例
１を参照)。
【図５】 Ｃｙ３蛍光の強度により１時間内で測定した、３つの細胞型にお
ける種々の抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体(６Ｃ３；６Ｆ８；１０Ａ１；８Ｄ１
１；５Ｆ２；７Ａ６)の内部移行を示すグラフである(実施例３を参照)。
【図６】 Ｃｙ３蛍光の強度により測定した、３つの細胞型における種々の
抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体(６Ｃ３；６Ｆ８；１０Ａ１；８Ｄ１１；５Ｆ２
；７Ａ６)によるＰＳＣＡの表面標識性を示すグラフである(実施例３を参照)。
【図７】 Ｃｙ３蛍光の強度により１時間内で測定した場合の、表面量対各
抗体に対して内部移行した抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体を比較したグラフであ
る。表面量及び内部移行した抗体は、図５及び６で使用した異なる細胞系の結果
得られたものの平均である。
【図８】 図８Ａ、図８Ｂ及び図８Ｃは共焦顕微鏡法で観察した場合の、Ｐ
ＳＣＡ発現細胞系ＨＣＴ ４７ｇＤ、ＭＣＦ７／ＨＥＲ２／ＰＳＣＡ、及びＰＣ
３ １９ ｇＤ ＰＳＣＡのそれぞれ中の、蛍光標識された８Ｄ１１抗ＰＳＣＡ抗
体の分布を示す顕微鏡写真である(実施例３を参照)。
【図９】 図９Ａ-Ｄは金付加生成物で標識された抗ＰＳＣＡ抗体を用いて
処置されたＰＳＣＡ発現ＣＨＯ細胞の電子顕微鏡写真を示す。図９Ａ及び９Ｂは
、それぞれ１５分及び１時間、抗体６Ｃ３とインキュベートした細胞を示す。図
９Ｃ及び９Ｄは、それぞれ１５分及び１時間、抗体１０Ｅ３とインキュベートし
た細胞を示す。
【図１０】 抗体と接触させて１５分後の、ＨＣＴ１１６ｇＤＰＳＣＡ細胞
における１２５Ｉ-Ｄ１１抗体の内部移行を示す顕微鏡写真である(実施例３を参
照)。
【図１１】 ｇＤ-ＰＳＣＡ又はベクター単独のいずれかで形質移入された
Ｈｅｒ２-発現ＭＣＦ７細胞における、３７℃５時間後の、３つの抗ＰＳＣＡ抗
体[腹水＃２３９５(６Ｆ８)、＃２３９９(８Ｄ１１)、＃２４０３(５Ｆ２)]の内
部移行のレベルを示す(実施例３を参照)。ハーセプチンは抗-Ｈｅｒ２抗体であ
る。
【図１２】 ハイブリドーマクローン６Ｆ８．２Ｆ４，Ａｓｃ＃２３９５；
８Ｄ１１．２Ｅ９，Ａｓｃ＃２３９９；５Ｆ２．４Ｈ４．１Ｅ３，Ａｓｃ＃２４
０３；及び６Ｂ８．１Ｄ７．２Ｂ３，Ａｓｃ＃２７６１から得られた抗体の重鎖
及び軽鎖可変領域ドメイン(ＶＨ及びＶＬ)のアミノ酸配列を示す。
【図１３】 シグナルペプチド配列を含む、全長キメラ２４０３ＩｇＧのア
ミノ酸配列、及びキメラ６Ｂ８ Ｆａｂの配列を示す。
【図１４】 種々の腫瘍対正常組織におけるＰＳＣＡの相対発現レベルの比
較を示す(実施例４を参照)。
【図１５】 カニクイザルのＩ型ＰＳＣＡのＤＮＡ及びタンパク質配列(そ
れぞれ配列番号：１６及び１７)を示す。実施例６を参照。アミノ酸配列末端の
「ｏ」は、オーカー停止コドンを表す。
【図１６】 カニクイザルのＩＩ型ＰＳＣＡのＤＮＡ及びタンパク質配列(
それぞれ配列番号：１８及び１９)を示す。実施例６を参照。アミノ酸配列末端
の「ｏ」は、オーカー停止コドンを表す。
【図１７】 ヒトＰＳＣＡ(配列番号：１)とカニクイザルのＩ型ＰＳＣＡ(
配列番号：１７)のアミノ酸配列を比較したものである。
【図１８】 抗ブタクサのネガティブコントロール抗体と比較した場合の、
３つの抗ＰＳＣＡ抗体(６Ｂ８、８Ｄ１１及び５Ｆ２)で処理されたマウスにおけ
るコントロールＰＣ-３腫瘍細胞(ＰＳＣＡ-ネガティブ)の成長を示す(実施例５
を参照)。
【図１９】 抗ブタクサのネガティブコントロール抗体と比較した場合の、
３つの抗ＰＳＣＡ抗体(６Ｂ８、８Ｄ１１及び５Ｆ２)で処理されたマウスにおけ
るＰＣ-３．ｇＤＰＳＣＡ腫瘍の成長を示す。抗体はＰＳＣＡ-形質移入ＰＣ-３
細胞を播種する１日前に、腹膜内注射することにより投与し、続いて細胞播種に
続いて隔週で注射を行った。矢印の下の「ＲＸ」はマウスへの抗体注射の時点(
日)を示す(実施例５を参照)。
【図２０】 図１９に記載したようにして、抗体８Ｄ１１、５Ｆ２、６Ｂ８
及びコントロールブタクサ抗体で処置されたＰＣ-３．ｇＤＰＳＣＡ腫瘍の成長
を示す(実施例５を参照)。
【図２１】 マウスにおけるＰＣ-３．ｇＤＰＳＣＡ腫瘍の成長を示し、こ
こで抗ＰＳＣＡ抗体６Ｂ８、８Ｄ１１又は５Ｆ２を用いた治療は、マウスにおい
て腫瘍を１週間成長させ、マウスのグループ当たりの平均腫瘍体積が約２００ｍ
ｍ３に達した後に開始した。抗体投与は隔週で行った。矢印の下の「ＲＸ」はマ
ウスへの抗体の腹膜内注射の時点(日)を示す(実施例５を参照)。
【図２２】 「ＤＭ１」と称されるメイタンシノイドの構造を示す(実施例
７を参照)。
【図２３】 抗ＰＳＣＡ抗体-ＤＭ１結合体の構造を示す(実施例７を参照)
。
【図２４】 非結合ＤＭ１に対する、アッセイ細胞系、ＰＣ３．ネオ細胞及
びＰＣ３．ｇＤヒトＰＳＣＡクローン４細胞の敏感度を示す(実施例８を参照)。
【図２５】 アイソタイプコントロール１４２９-ＤＭ１と比較した、ＰＣ
３．ｇＤヒトＰＳＣＡクローン４細胞に対する抗体結合２３９９-ＤＭ１の細胞
障害性を示す(実施例８を参照)。
【図２６】 アイソタイプコントロール１４２８-ＤＭ１と比較した、ＰＣ
３．ｇＤヒトＰＳＣＡクローン４細胞に対する２７６１-ＤＭ１の細胞障害性を
示す(実施例８を参照)。
【図２７】 抗原-陰性ＰＣ３．ネオ細胞における抗体-ＭＤ１結合体の毒性
の欠如を示す(実施例８を参照)。
【図２８】 マウスモデルにおけるＰＳＣＡ発現ＰＣ３ヒト前立腺腫瘍細胞
の成長を示し、ここで、マウスはそのままの(無毒で結合していない)抗体又はＤ
Ｍ１-結合抗体のいずれかで処置されたものである。抗ＰＳＣＡ抗体は２３９９
又は６Ｂ８であり、抗ブタクサ抗体１４２８はコントロール抗体となっている(
実施例９を参照)。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年５月２５日（２００１．５．２５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１５】 イムノグロブリンの配列及び構成 精製された抗体は、確立された方法によりアミノ酸配列決定が行われた。N-末
端配列が得られ、その結果から、RT-PCRによりIg可変領域（V）をクローン化す
るためにプライマーが設計された。VL又はVH領域をコード化するDNA断片がベク
ター中にクローン化された。最初、ベクターに対するプライマーで、確立された
方法によりシークエンシングが行われた。残りの配列を得るために、得られた抗
体の最初の核酸配列から抗体の配列に特異的なプライマーが設計された。 配列が図１３に示されるキメラのマウス−ヒト抗ＰＳＣＡ抗体全長及びFabは
、マウスVL及びVH領域のドメイン配列をヒトCκ及びCγ１配列と結合させること
により構築された。マウス抗体V領域断片は、容易に切り出され得る制限酵素サ
イトカセットとしてベクターにクローン化され、ＰＳＣＡに特異的なキメラをマ
ウス−ヒト抗体を発現させるために、前もって構築された異なるアイソタイプの
ヒトL及びH定常領域を含むベクター中へ連結された。Fabキメラ鎖は、pRKベクタ
ー（EP307,247中に記載）であるpUC119:Igベクターに由来するvegfchimと呼ばれ
るベクターから発現された。 図１２は、ハイブリドーマクローン、6F8.2F4、Asc#2395（配列番号３及び配
列番号４）；5F2.4H4.1E3、Asc#2403（配列番号５及び配列番号６）；6B8.1D7.2
B3、Asc#2761（配列番号７及び配列番号８）、から得られる抗体の軽鎖及び重鎖
の可変領域ドメイン（VL及びVH）のアミノ酸配列、及びクローン8D11.2E9（Asc#
2399（配列番号９））からのVHのアミノ酸配列を示す。図１３は、シグナルペプ
チド配列を含む全長キメラ2403 IgGのアミノ酸配列（L鎖は配列番号１０；H鎖は
配列番号１１）及びキメラ6B8Fabの配列（L鎖は配列番号１２；H鎖は配列番号１
３）を示す。キメラ抗体2403は、ヒトイムノグロブリンのCκ及びCγ1配列とMab
5F2.4H4.1E3(#2403)のマウスのVL及びVH配列とを、哺乳動物細胞発現ベクター
、pRK中で、それぞれ融合させることにより作製した。pRK5発現ベクターの構築
は、1989年3月13日公開のEP307,247中に開示されている。キメラ2403のH鎖及びL
鎖をコードするpRKベクターは、DNA pRK-2403H及びDNA pRK-2403LとしてATCCに
寄託された（Xの項を参照のこと）。マウスVHはヒトＣγ1と、配列残基#Pro122
（図13の配列中の／により示す）の位置で連結された。マウスVLはヒトCLと配列
残基#Arg113の位置で連結された。2403VHのインサートは、430bpのEcoRI-ApaI断
片又はClaI-ApaI断片として、pRK-2403Hから切り出すことができる。2403VLは、
pRK-2403L中に400bp断片のEcoRI-CpoI断片としてクローン化された。キメラ2761 のH鎖及びL鎖をコードするpRKベクターは、DNA pRK-2761H及びDNA pRK-2761Lと
してATCCに寄託された（Xの項を参照のこと）。同様に、2761VLは、pRK-2761L中
に400bp断片のEcoRI-CpoI断片としてクローン化された。2761VHのインサートは
、430bpのEcoRI-ApaI断片又はClaI-ApaI断片としてpRK-2761Hから切り出すこと
ができる。 キメラ6B8FabのL鎖とH鎖は、Mab 6B8.1D7.2B3のマウスVL及びVH配列をIgG1配
列のヒトイムノグロブリンCκ及びCＨ1ドメインと、vegf4chimと称するベクター
中にそれぞれ融合させることにより作製され、大腸菌で発現された。vegf4chim
は、ampR選択マーカーを持ち、抗体配列は、アルカリホスファターゼプロモータ
ーの下、動作可能に連結され、発現される。 これらのV領域カセットは、切り出されることが可能で、異なるFc特性を有す
るキメラを生産するために異なるヒトイムノグロブリンアイソタイプの定常領域
ドメインと連結され得る。ADCC、補体結合活性、又はFcレセプター結合などのエ
フェクター機能を欠く抗ＰＳＣＡ抗体を生産するために、マウスVH領域はヒトC
γ2又はCγ4の定常領域配列と融合される。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４５】 Ｘ．株化細胞とＤＮＡの寄託 次のハイブリドーマ株化細胞を、アメリカ合衆国20110-2209バージニア州マナ
ッサスのユニバーシティ・ブールバード10801に所在するアメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション（ATCC）に寄託し、次の受託番号が与えられた： ハイブリドーマ ATCC受託番号 寄託日 PSCA.10E3 PTA-717 1999年9月16日 PSCA.6F8 PTA-718 1999年9月16日 PSCA.8D11 PTA-719 1999年9月16日 PSCA.5F2 PTA-720 1999年9月16日 PSCA.6C3 PTA-880 1999年10月26日 PSCA.6B8 PTA-2265 2000年7月25日 PSCA.10C5 PTA-2264 2000年7月25日 次のベクターDNA（実施例１を参照）をＡＴＣＣに寄託した pRK-2403L PTA-2623 2000年10月24日 pRK-2761L PTA-2620 2000年10月24日 pRK-2403H PTA-2622 2000年10月24日 pRK-2761H PTA-2621 2000年10月24日
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年１２月１０日（２００１．１２．１０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/705 ４Ｃ０８６ Ｃ０７Ｋ 14/705 16/30 ４Ｈ０４５ 16/30 16/46 16/46 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 21/08 15/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ドゥボォ，ブリジット アメリカ合衆国 カリフォルニア 94061， レッドウッド シティー，オリバー スト リート 1113 (72)発明者 ケラー，ギルバート−アンドレ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94002， ベルモント，カーメリタ アヴェニュー 2523 (72)発明者 ケッペン，ハートムット アメリカ合衆国 カリフォルニア 94709， バークレー，ミルヴィア ストリート 1746 (72)発明者 ラスキー，ローレンス，エー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94965， サウサリート，スター ルート ボックス 460 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA42 CA03 DA06 EA04 GA11 HA01 HA15 4B064 AG27 CA02 CA19 CC24 DA01 4B065 AA26X AA91Y AA93Y AB01 BA02 CA25 CA44 4C084 AA17 NA14 4C085 AA14 CC02 DD33 DD61 4C086 AA01 AA02 BA02 CB22 MA01 MA04 ZB26 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA76 EA20 FA74 GA26

Claims (56)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 インヴィボで哺乳動物細胞上のＰＳＣＡに内部移行する単離
    された抗前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）。
  2. 【請求項２】 モノクローナル抗体である請求項１に記載の抗体。
  3. 【請求項３】 抗体断片である請求項１に記載の抗体。
  4. 【請求項４】 キメラ又はヒト化抗体である請求項１に記載の抗体。
  5. 【請求項５】 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション受託番号PT
    A-717、PTA-718、PTA-719、PTA-720、PTA-880、PTA-2265、又はPTA-2264で寄託
    されたハイブリドーマの群から選択されるハイブリドーマによって産生されるか
    、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、又は配列番号：１３のア
    ミノ酸配列を有する請求項２に記載の抗体。
  6. 【請求項６】 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション受託番号PT
    A-717、PTA-718、PTA-719、PTA-720、PTA-880、PTA-2265、又はPTA-2264で寄託
    されたハイブリドーマの群から選択されるハイブリドーマによって産生されるモ
    ノクローナル抗体によって結合されるエピトープと同じエピトープに抗体が結合
    する、請求項２に記載の抗体。
  7. 【請求項７】 成長阻害剤に結合している請求項２に記載の抗体。
  8. 【請求項８】 細胞毒性剤に結合している請求項２に記載の抗体。
  9. 【請求項９】 毒素、抗生物質、放射性同位元素及びヌクレオリティック酵
    素からなる群から選択される請求項８に記載の抗体。
  10. 【請求項１０】 細胞毒性剤が毒素である請求項９に記載の抗体。
  11. 【請求項１１】 毒素がメイタンシノイド又はカリケアマイシンらなる群か
    ら選択される請求項１０に記載の抗体。
  12. 【請求項１２】 毒素がメイタンシノイドである請求項１１に記載の抗体。
  13. 【請求項１３】 メイタンシノイドが図２２に示される構造を有している請
    求項１２に記載の抗体。
  14. 【請求項１４】 哺乳動物細胞がガン細胞である請求項２に記載の抗体。
  15. 【請求項１５】 インヴィボでＰＳＣＡ発現ガン細胞の成長を阻害する抗Ｐ
    ＳＣＡモノクローナル抗体。
  16. 【請求項１６】 抗体がガン細胞上のＰＳＣＡへの結合時に内部移行する請
    求項１５に記載の抗体。
  17. 【請求項１７】 ヒト化又はヒト抗体である請求項１６に記載の抗体。
  18. 【請求項１８】 細菌において生産される請求項１７に記載の抗体。
  19. 【請求項１９】 ＡＴＣＣ受託番号PTA-717、PTA-718、PTA-719、PTA-720、
    PTA-880、又はPTA-2265を持つハイブリドーマの群から選択されるハイブリドー
    マによって産生される抗ＰＳＣＡ抗体のヒト化抗体である請求項１５に記載の抗
    体。
  20. 【請求項２０】 ガン細胞が、前立腺ガン、膀胱ガン及び肺ガンからなる群
    から選択されるガン由来である請求項１５に記載の抗体。
  21. 【請求項２１】 ガンが前立腺ガンである請求項２０に記載の抗体。
  22. 【請求項２２】 配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：
    ６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：
    １１、配列番号：１２、又は配列番号：１３からなる群から選択されるアミノ酸
    配列を有するポリペプチドをコードする配列を含んでなる単離核酸。
  23. 【請求項２３】 発現制御配列に作用可能に結合した請求項２２に記載の核
    酸を含んでなる発現ベクター。
  24. 【請求項２４】 請求項２に記載の抗体を産生する細胞。
  25. 【請求項２５】 細胞が、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
    受託番号PTA-717、PTA-718、PTA-719、PTA-720、PTA-880、PTA-2264、又はPTA-2
    265で寄託されたハイブリドーマ細胞の群から選択される請求項２４に記載の細
    胞。
  26. 【請求項２６】 請求項２３に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
  27. 【請求項２７】 細菌細胞である請求項２６に記載の宿主細胞。
  28. 【請求項２８】 請求項２４に記載の細胞を培養し、細胞培養物から抗体を
    回収することを含んでなる、請求項２に記載の抗体の産生方法。
  29. 【請求項２９】 請求項２又は請求項１５に記載の抗体と担体を含有する組
    成物。
  30. 【請求項３０】 抗体が細胞毒性剤に結合している請求項２９に記載の組成
    物。
  31. 【請求項３１】 細胞毒性剤がメイタンシノイドである請求項３０に記載の
    組成物。
  32. 【請求項３２】 抗体がヒト又はヒト化抗体であり、担体が製薬的担体であ
    る請求項３１に記載の組成物。
  33. 【請求項３３】 ヒト化抗体が、ＡＴＣＣ受託番号PTA-717、PTA-718、PTA-
    719、PTA-720、PTA-880、又はPTA-2265を持つハイブリドーマの群から選択され
    るハイブリドーマにより産生される抗ＰＳＣＡ抗体のヒト化型である請求項３２
    に記載の組成物。
  34. 【請求項３４】 ガン細胞を請求項１に記載の抗体に接触させ、それによっ
    てガン細胞を死滅させる、ＰＳＣＡ発現細胞を死滅させる方法。
  35. 【請求項３５】 ガン細胞が、前立腺ガン、膀胱ガン及び肺ガンからなる群
    から選択される請求項３４に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 ガン細胞が前立腺ガン細胞である請求項３５に記載の方法
    。
  37. 【請求項３７】 前立腺ガンがアンドロゲン非依存性である請求項３６に記
    載の方法。
  38. 【請求項３８】 ガン細胞が転移性前立腺ガン由来である請求項３６に記載
    の方法。
  39. 【請求項３９】 抗体が抗体断片である請求項３４に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 抗体がヒト化抗体である請求項３４に記載の抗体。
  41. 【請求項４１】 抗体が細胞毒性剤に結合している請求項４０に記載の方法
    。
  42. 【請求項４２】 細胞毒性剤がメイタンシノイド又はカリケアマイシンらな
    る群から選択される毒素である請求項４１に記載の方法。
  43. 【請求項４３】 細胞毒性剤がメイタンシノイドである請求項４２に記載の
    方法。
  44. 【請求項４４】 ＡＴＣＣ受託番号PTA-718、PTA-719、PTA-720、PTA-880、
    又はPTA-2265を持つハイブリドーマの群から選択されるハイブリドーマによって
    産生される抗体のヒト化型である請求項４３に記載の方法。
  45. 【請求項４５】 細胞毒性剤が放射性同位元素である請求項４１に記載の方
    法。
  46. 【請求項４６】 請求項１５に記載の抗体の治療的有効量を哺乳動物に投与
    することを含んでなる、哺乳動物におけるＰＳＣＡ発現ガンを軽減する方法。
  47. 【請求項４７】 ガンが、前立腺ガン、膀胱ガン及び肺ガンからなる群から
    選択される請求項４６に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 ガンが前立腺ガンである請求項４７に記載の方法。
  49. 【請求項４９】 前立腺ガンがアンドロゲン非依存性又は転移性前立腺ガン
    である請求項４８に記載の方法。
  50. 【請求項５０】 抗体がヒト化抗体である請求項４６に記載の抗体。
  51. 【請求項５１】 抗体が細胞毒性剤に結合している請求項５０に記載の方法
    。
  52. 【請求項５２】 細胞毒性剤がメイタンシノイドである請求項５１に記載の
    方法。
  53. 【請求項５３】 メイタンシノイドが図２２に示される構造を有している請
    求項５２に記載の方法。
  54. 【請求項５４】 抗体が少なくとも１種の化学療法剤と併用されて投与され
    る請求項４６に記載の方法。
  55. 【請求項５５】 化学療法剤がパクリタキセル又はその誘導体である請求項
    ５４に記載の方法。
  56. 【請求項５６】 容器とそこに含まれる組成物を含んでなる製造品において
    、組成物が請求項２に記載の抗体を含み、組成物を前立腺ガンを治療するために
    使用可能であることを示すパッケージ挿入物を更に含んでなる製造品。
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