KR100747412B1 - 면역크로마토그래피법을 이용한 전립선암 및 전립선비대증 진단용 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 전립선암 및 전립선 비대증 진단 키트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 면역크로마토그래피(Immunochromatography) 법을 이용하여 혈액내의 전체 전립선-특이 항원 및/또는 단독형 전립선-특이 항원의 양을 키트 상에서 반 정량적으로 각각 측정할 수 있는 진단 키트에 관한 것이다. 상기 진단 키트는 전립선암 환자를 육안으로 간단하고 신속하게 진단할 수 있고 전립선암 환자를 전립선 비대증 환자로부터 명확하게 구별할 수 있다.

전립선암, 전립선 비대증, 면역크로마토그래피, 전체 전립선-특이 항원, 단독형 전립선-특이 항원, PSA

Description

면역크로마토그래피법을 이용한 전립선암 및 전립선 비대증 진단용 키트{A diagnostic kit for prostatic cancer and prostatic hyperlasi using immunochromatography}

도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 진단 키트의 개략도이고,

도 2는 본 발명의 전체 전립선-특이 항원(total prostate-specific agntigen, tPSA) 검출용 진단 키트의 예를 나타낸 것이고,

도 3은 본 발명의 단독형 전립선-특이 항원(free prostate-specific agntigen, fPSA) 검출용 진단 키트의 예를 나타낸 것이고,

도 4는 본 발명의 전립선암 또는 전립선 비대증 진단 키트의 예를 나타낸 것이고,

도 5는 본 발명의 진단 키트에 따른 측정결과 무효인 경우를 나타낸 것이고,

도 6은 본 발명의 진단 키트에 따른 측정결과 정상인 경우를 나타낸 것이고,

도 7은 본 발명의 진단 키트에 따른 측정결과 전립선 비대증인 경우를 나타낸 것이고,

도 8은 본 발명의 진단 키트에 따른 측정결과 전립선암인 경우를 나타낸 것이다.

<도면부호에 대한 설명>

1: 샘플 패드 2: 접합체 패드(conjugate pad) 3: 멤브레인(membrane)

4: 단일클론항체 제1 라인 5: 단일클론항체 제2 라인

6: 종료선 7: 흡수패드

본 발명은 전립선암 및 전립선 비대증 진단 키트 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 면역크로마토그래피(Immunochromatography) 법을 이용하여 혈액내의 전체 전립선-특이 항원(total prostate-specific agntigen, tPSA) 및/또는 단독형 전립선-특이 항원(free prostate-specific agntigen, fPSA)의 양을 키트 상에서 반 정량적으로 각각 측정할 수 있는 진단 키트에 관한 것이다.

전립선은 고환, 정낭과 함께 생식기능을 가능하게 하는 성부속기관중의 하나로서, 이곳에서 나오는 전립선 액은 남성 정액의 액체 성분중 약 1/3을 차지한다. 따라서 전립선에 이상이 발생하면 성기능의 장애를 가져올 수 있으며 배뇨에도 큰 어려움을 느끼게 된다.

국내 전립선암의 발생빈도는 남성 인구 10만 명당 2.7명 정도이나 미국에서는 폐암과 함께 남자에게 발생하는 암 중 1-2위를 다투고 있으며 암 사망 원인의 3위를 차지한다. 또한, 무 증상의 환자를 계산에 넣으면 전립선암 환자의 수는 훨씬 더 많을 것으로 추정되고 있다. 전립선암의 발생 원인으로는 유전적 소인, 남성 호르몬 영향, 음식 및 식이 습관, 직업, 과거 전립선염을 앓은 적이 있는지 유무 등 이 거론되나 아직 구체적인 위험인자가 확인되지는 않고 있다.

전립선암 환자의 양상은 혈중 전립선-특이 항원(PSA ; prostate specific antigen, 이하 "PSA"라 명명한다)의 증가, 직장수지검사(DRE ; digital rectal examination)에서 딱딱한 결절의 관찰, 경직장 초음파 검사(TRUS ; transrectal ultrasound)에서 이상 조직의 관찰, 또는 전립선 비대증으로 생각하고 떼어낸 조직에서 암세포가 발견되는 경우가 대부분이다. 전립선암이 국소암인 경우 별다른 증상이 없으나 어느 정도 진행되면 방광출구 막힘 증상, 급성 요 막힘, 혈뇨(피 오줌) 및 요실금과 같은 증상을 나타내기도 한다. 심하면 콩팥이 망가져 신부전에 의한 증상이 있을 수 있다. 가끔 골전이에 의한 골통증 이라든가 척수압박에 의한 신경증상 또는 병적 골절이 있어 우연히 발견되기도 한다. 전립선암은 다른 암과는 달리 매우 천천히 증식하는 특징이 있다. 따라서 이 암을 조기에 진단할 수 있다면 치료의 가능성을 높일 수 있기 때문에 초기진단의 중요성이 대두된다.

PSA는 분자량이 약 33 kDa로 전립선 표피에서 높은 수준으로 발현되는 세린 단백질 분해효소이다(Ulf-Hakan Stenman, et als., Cancer Biology, 9 : 83-93, 1999). 건강한 남자의 혈액에서는 2ng/ml 이하의 PSA가 존재하며 악성 전립선 조직, 전립선암 등에서 그 양이 증가하는 것으로 알려져 있다. 혈액에서의 PSA 양이 증가하면 전립선암, 전립선비대증과 같은 전립선 질환의 발생을 표시한다. 혈액에서의 전립선-특이 항원은 여러 가지 형태로 존재하는데, 전립선암 진단에 주로 사용되는 PSA 형태는 전체 PSA(total PSA, 이하 "tPSA"라 한다)이다. 전립선암을 양성으로 판정하는 tPSA의 컷 오프(cut off)는 4ng/ml로 보는 것이 일반화 되어 있으 며 tPSA의 양이 10 ng/ml 이상이면 전립선암일 확률이 67%라는 보고가 있다 (Metthew B. Gretzer, European Urology Supplement 1(2002) 21-27).

그러나 혈중 tPSA는 전립선 암 뿐만 아니라 전립선 비대증이나 전립선염의 경우에도 증가하는 양상을 보이기 때문에 전립선 질환을 겪고 있는 환자를 구별하는데는 유용하지만 tPSA 수치만을 가지고 전립선 질환 환자중 전립선 암 환자를 구별해 내는데 있어서는 어려움이 있다. 특히, 혈중 tPSA 수치가 4ng/ml에서 10ng/ml 사이인 경우에는 전립선암과 전립선 비대증과의 구별이 매우 어려워 전립선암의 초기 진단이 어렵다.

최근 이러한 문제를 해결하기 위해, tPSA 이외에 단독형 PSA (free PSA, 이하 "fPSA"라 한다)의 양을 측정하여 tPSA 양 대비 fPSA 양의 비율을 계산하여 전립선 암 진단 특이도를 높여 전립선 비대증 환자와 구별하는 전립선암 진단 방법이 보고된 바 있다.(Ulf-Hakan Stenman, et als., Cancer Biology, 9 : 83-93, 1999 ; Carsten Stephan. et als., Cancer Epidemiology Biomarker & Prevention, 9 : 1133-1147, 2000). 또한, tPSA 양 대비 fPSA 양의 비율에 대한 컷 오프를 25 %로 선정할 경우 전립선암 환자를 전립선 비대증 환자로 오판할 확률이 1% 이내 라고 보고된 바 있으며(Curtis Mettlin, The Prostate (1999) 39 : 153-58), fPSA와 tPSA 간의 비를 구하여 전립선암 진단 특이도를 높이도록 고안된 ELISA 형태의 진단 키트가 개시된 바 있다 (Kim Pettersson, et al., Clin. Chem. 41/10 : 1480-1488, 1995).

그러나, 상기 종래의 ELISA 형태의 진단 키트는 ELISA Reader 및 Automation 장비와 같은 특수 장비 및 전문인력을 필요로 하므로 사용상의 제약이 있을 뿐 아니라, 복잡하고 오랜 시간이 걸린다는 문제점이 있다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술의 문제점을 해결하고자 연구를 거듭한 결과, 고상 면역크로마토그래피(Immunochromatography) 법을 응용하여 전체 전립선-특이 항원(total prostate-specific agntigen, tPSA) 및/또는 단독형 전립선-특이 항원(free prostate-specific agntigen, fPSA)의 양을 반정량적으로 측정할 수 있도록 진단 키트를 제조할 경우, 특이성과 민감도가 우수할 뿐만 아니라 간편하고 빠른 시간내에 전립선암 또는 전립선 비대증을 진단할 수 있다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 고상 면역크로마토그래피 법에 의해 tPSA의 양을 반정량적으로 측정할 수 있는 진단 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 고상 면역크로마토그래피 법에 의해 fPSA의 양을 반정량적으로 측정할 수 있는 진단 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 고상 면역크로마토그래피 법에 의해 tPSA와 fPSA의 양적인 비를 반정량적으로 측정할 수 있는 진단 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 고상 면역크로마토그래피 법에 의해 전립선암의 진단이 가능한 진단 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 고상 면역크로마토그래피 법에 의해 전립선 비대증의 진단이 가능한 진단 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 면역크로마토그래피(Immunochromatography) 법을 이용하여 혈액내의 전체 전립선-특이 항원(total prostate-specific agntigen, tPSA) 및/또는 단독형 전립선-특이 항원(free prostate-specific agntigen, fPSA)의 양을 면역크로마토그래피 상에서 반 정량적으로 각각 측정하거나 그의 양적인 비를 측정할 수 있는 진단 키트에 관한 것이다.

본 발명의 진단 키트는 tPSA와 결합할 수 있는 항체(항-tPSA-단일클론항체)를 포함하는 접합체 패드(conjugation pad)와 tPSA 또는 fPSA와 결합할 수 있는 항체(항-tPSA-단일클론항체 또는 항-fPSA-단일클론항체) 라인을 포함하는 멤브레인(membrane)으로 구성된 스트립을 포함한다.

본 발명자들은 tPSA 또는 fPSA를 검출하기 위하여 사용되는 항체를 선별하기 위하여 전립선-특이 항원을 마우스에 면역을 함으로써 고역가의 단일클론항체 11종을 확보하였다. ELISA 방법을 통하여 각각의 항체에 대한 에피토프 검색 결과 9종은 tPSA에 결합할 수 있는 항체이고, 나머지 2종은 fPSA에 특이적으로 결합하는 항체임을 발견하였다. 상기 항체들을 전립선암 진단 키트에 이용하기 위하여 항체간의 에피토프 검색을 실시하여 tPSA에 결합하는 항-tPSA-단일클론항체 및 fPSA에 결합하는 항-fPSA-단일클론항체를 선별하였다. 또한, 상기 tPSA 또는 fPSA를 검출하기 위한 항체는 공지된 방법(Endocrinology 119, 1887-1894(1986))에 기재된 단일클론항체-생산세포 제조방법에 따라 세포주를 얻은 후 이를 배양하여 사용할 수 있으며, 상업적으로 시판되는 항체를 사용할 수도 있다.

본 발명은 고상 면역크로마토그래피 법에 의해 tPSA의 양을 반정량적으로 측정할 수 있는 진단 키트를 제공한다.

본 발명의 tPSA 검출용 진단 키트는 i) 항-tPSA-단일클론항체-골드 결합체를 포함하는 접합체 패드, 및 ii) 항-tPSA-단일클론항체 라인 및 종료선을 포함하는 멤브레인으로 구성된다.

본 발명의 tPSA 검출용 진단 키트에는 tPSA를 검출할 수 있는 항체로서 2개의 항체가 사용되며, 그중 하나는 상기 접합체 패드상에 포함되고 다른 하나는 멤브레인상에 고정된다. 또한, 상기 2개의 항-tPSA-단일클론항체는 항원에 대한 민감도 및 정확도를 향상시키기 위하여 서로 다른 항체를 사용하는 것이 바람직하다.

상기와 같이 선별된 항-tPSA-단일클론항체 중 접합체 패드상에 포함되는 항체는 항원에 대한 결합성 또는 민감도를 증가시키기 위하여 골드 구형체(gold particle)와의 결합체 형태로 접합체 패드(conjugate pad)에 포함된다. 상기 항-tPSA-단일클론항체-골드 결합체는 대한민국 특허공개번호 제1999-0057486호에 공지된 방법을 응용하여 항체 등전점에 따른 항체의 골드 구형체에 대한 결합조건을 확립하고 상기 항체를 골드 구형체와 결합시켜 얻을 수 있다.

또한, 상기 접합체 패드(conjugate pad)의 소재로는 통상의 유리섬유(glassy fiber)를 전처리하여 사용할 수 있다. 상기 접합체 패드는 상기 멤브레인과 접착되어 스트립을 형성한다.

본 발명의 tPSA 검출용 진단 키트에 있어서, 상기 멤브레인 상에 고정되는 항-tPSA-단일클론항체는 tPSA의 양을 반 정량적으로 진단할 수 있도록 농도를 조절 하여 2개의 라인(제1 라인 및 제2 라인)으로 점적된다. 즉, 상기 멤브레인 상에서 항-tPSA-단일클론항체의 제1 라인은 0.9 ~ 1.1 mg/ml의 농도로 점적되는 것이 바람직하며, 4ng/ml 이상의 tPSA를 검출할 수 있다. 또한, 상기 항-tPSA-단일클론항체의 제2 라인은 0.4 ~ 0.6 mg/ml로 점적되는 것이 바람직하며, 10ng/ml 이상의 tPSA를 검출할 수 있다.

상기 항체 라인은 선(line) 또는 점(spot)의 형태로 점적될 수 있으며, 당업자의 필요에 따라 변경시킬 수 있다. 예를 들어, 점 형태는 일정한 원, 사각형 등의 형태를 가질 수 있으며, 상기 2개의 선 또는 점은 서로 겹치지 않도록 점적된다.

본 발명의 tPSA 검출용 진단 키트에 있어서, 상기 멤브레인은 상기 항-tPSA-단일클론항체 라인의 상단에 항-마우스 IgG-복합클론항체로 된 종료선을 더욱 포함한다.

본 발명의 tPSA 검출용 진단 키트에 있어서, 상기 접합체 패드는 마우스 항β-HCG-단일클론항체를 더욱 포함할 수 있다. 상기 마우스 항β-HCG 단일클론항체는 상기 항-tPSA-단일클론항체와 동일하게 골드 구형체와의 결합체 형태로 포함되며, 상기 항-tPSA-단일클론항체-골드 결합체와 상기 마우스 항β-HCG-단일클론항체-골드 결합체는 9:1의 비율로 상기 접합체 패드에 포함되는 것이 바람직하다. 상기 마우스 항β-HCG-단일클론항체는 반응의 최종 종결시 멤브레인 상에 고정되는 종료선의 항-마우스 IgG-복합클론항체와 결합함으로써 반응의 종료여부를 멤브레인 상에 색깔로 나타낼 수 있다.

또한, 본 발명은 고상 면역크로마토그래피 법에 의해 fPSA의 양을 반정량적으로 측정할 수 있는 진단 키트를 제공한다.

본 발명의 fPSA 검출용 진단 키트는 i) 항-tPSA-단일클론항체-골드 결합체를 포함하는 접합체 패드, 및 ii) 항-fPSA-단일클론항체 라인 및 종료선을 포함하는 멤브레인으로 구성된다.

본 발명의 fPSA 검출용 진단 키트에는 tPSA를 검출할 수 있는 항체와 fPSA를 검출할 수 있는 항체가 사용되며, 그 중 항-tPSA-단일클론항체는 상기 접합체 패드상에 포함되고 항-fPSA-단일클론항체는 멤브레인 상에 고정된다.

본 발명의 fPSA 검출용 진단 키트에 있어서, 상기 접합체 패드는 상기 tPSA 검출용 진단 키트에서 설명한 바와 동일한 방법으로 제조된다.

본 발명의 fPSA 검출용 진단 키트에 있어서, 상기 멤브레인 상에 고정되는 항-fPSA-단일클론항체는 fPSA의 양을 반 정량적으로 진단할 수 있도록 농도를 조절하여 2개의 라인(제1 라인 및 제2 라인)으로 점적된다. 즉, 상기 멤브레인에서 항-fPSA-단일클론항체의 제1 라인은 0.95 ~ 1.1 mg/ml의 농도로 점적되는 것이 바람직하며, 1ng/ml 이상의 fPSA를 검출할 수 있다. 또한, 상기 항-fPSA-단일클론항체의 제2 라인은 0.75 ~ 0.85 mg/ml로 점적되는 것이 바람직하며, 2.5ng/ml 이상의 fPSA를 검출할 수 있다.

상기 항체 라인은 선(line) 또는 점(spot)의 형태로 점적될 수 있으며, 당업자의 필요에 따라 변경시킬 수 있다. 예를 들어, 점 형태는 일정한 원, 사각형 등의 형태를 가질 수 있으며, 상기 2개의 선 또는 점은 서로 겹치지 않도록 점적된 다.

본 발명의 fPSA 검출용 진단 키트에 있어서, 상기 멤브레인은 상기 항-fPSA-단일클론항체 라인의 상단에 항-마우스 IgG-복합클론항체로 된 종료선을 더욱 포함한다.

본 발명의 fPSA 검출용 진단 키트에 있어서, 상기 접합체 패드는 마우스 항β-HCG-단일클론항체를 더욱 포함할 수 있다. 상기 마우스 항β-HCG 단일클론항체는 상기 항-tPSA-단일클론항체와 동일하게 골드 구형체와의 결합체 형태로 포함되며, 상기 항-tPSA-단일클론항체-골드 결합체와 상기 마우스 항β-HCG-단일클론항체-골드 결합체는 9:1의 비율로 상기 접합체 패드에 포함되는 것이 바람직하다. 상기 마우스 항β-HCG-단일클론항체는 반응의 최종 종결시 멤브레인 상에 고정되는 종료선의 항-마우스 IgG-복합클론항체와 결합함으로써 반응의 종료여부를 멤브레인 상에 색깔로 나타낼 수 있다.

또한, 본 발명은 고상 면역크로마토그래피 법에 의해 tPSA 및 fPSA의 양적인 비를 동시에 반정량적으로 측정할 수 있는 전립선암 또는 전립선 비대증 진단 키트를 제공한다.

본 발명의 전립선암 또는 전립선 비대증 진단 키트는 tPSA 검출용 스트립 및 fPSA 검출용 스트립을 포함하여 구성된다. 즉, 상기 tPSA 검출용 스트립은 i) 항-tPSA-단일클론항체-골드 결합체를 포함하는 접합체 패드, 및 ii) 항-tPSA-단일클론항체 라인 및 항-마우스 IgG-복합클론항체의 종료선을 포함하는 멤브레인으로 구성된다. 또한, 상기 fPSA 검출용 스트립은 i) 항-tPSA-단일클론항체-골드 결합체를 포함하는 접합체 패드, 및 ii) 항-fPSA-단일클론항체 라인 및 항-마우스 IgG 복합클론항체의 종료선을 포함하는 멤브레인으로 구성된다.

본 발명의 전립선암 또는 전립선 비대증 진단 키트에 있어서, 상기 tPSA 검출용 스트립 및 fPSA 검출용 스트립은 각각 상기 tPSA 검출용 진단 키트 및 fPSA 검출용 진단 키트에서 설명한 바와 동일한 방법에 따라 제조될 수 있다.

본 발명의 전립선암 또는 전립선 비대증 진단 키트에 있어서, 상기 tPSA 검출용 스트립의 멤브레인 상에 고정되는 항-tPSA-단일클론항체는 tPSA의 양을 반 정량적으로 진단할 수 있도록 농도를 조절하여 2개의 라인(제1 라인 및 제2 라인)으로 점적된다. 즉, 상기 멤브레인 상에서 항-tPSA-단일클론항체의 제1 라인은 0.9 ~ 1.1 mg/ml의 농도로 점적되는 것이 바람직하며, 4ng/ml 이상의 tPSA를 검출할 수 있다. 또한, 상기 항-tPSA-단일클론항체의 제2 라인은 0.4 ~ 0.6 mg/ml로 점적되는 것이 바람직하며, 10ng/ml 이상의 tPSA를 검출할 수 있다.

본 발명의 전립선암 또는 전립선 비대증 진단 키트에 있어서, 상기 fPSA 검출용 스트립의 멤브레인 상에 고정되는 항-fPSA-단일클론항체는 fPSA의 양을 반 정량적으로 진단할 수 있도록 농도를 조절하여 2개의 라인(제1 라인 및 제2 라인)으로 점적된다. 즉, 상기 멤브레인에서 항-fPSA-단일클론항체의 제1 라인은 0.95 ~ 1.1 mg/ml의 농도로 점적되는 것이 바람직하며, 1ng/ml 이상의 fPSA를 검출할 수 있다. 또한, 상기 항-fPSA-단일클론항체의 제2 라인은 0.75 ~ 0.85 mg/ml로 점적되는 것이 바람직하며, 2.5ng/ml 이상의 fPSA를 검출할 수 있다.

또한, 본 발명의 진단 키트는 혈액 샘플(시료)의 공급을 위하여 상기 접합체 패드의 하단에 교차되는 샘플 패드 또는 샘플 투입구를 더욱 포함할 수 있으며, 상기 샘플 패드 또는 샘플 투입구는 통상의 재질 및 형태를 가질 수 있다.

본 발명에 따른 고상 면역크로마토그래피 법을 이용한 진단 키트는 시료 중에 항원(즉, tPSA 또는 fPSA)이 존재하면, 당해 항원이 멤브레인을 따라 이동할 수 있는 유색의 골드 구형체에 결합된 항-tPSA-단일클론항체와 먼저 결합하여 멤브레인을 따라 이동하다가, 멤브레인에 공유 또는 비공유 결합으로 고정된 또다른 항체와 다른 부위에서 다시 결합함으로써 멤브레인 상에 고정되고, 이에 따라 멤브레인 상에 색이 출현하여 상기 색깔을 육안으로 판독하므로써 전립선암 또는 전립선 비대증을 진단할 수 있다.

상기와 같은 본 발명의 진단 키트를 구체적으로 예시하면 도 1 내지 도 4와 같으며, 본 발명의 진단 키트에 따른 측정결과를 구체적으로 예시하면 도 5 내지 도 8과 같다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 전립선암-특이 항원에 대한 단일클론항체의 개발

PSA(US Biological사, 미국)을 마우스에 면역시키고, 이들로부터 분리한 비장세포를 혈구암세포(SP2O-Ag14, ATCC CRL-1581)와 접합(fusion)시켜 다수의 혼성화 세포(hybridized cells)를 제조한 후, 이들을 배양하여 단일클론 항체를 생산하 는 11종의 클론을 얻었다. 이들 단일클론항체들을 ELISA 방법에 따라 전립선암-특이 항원에 대한 활성분석과 에피토프 분석을 수행하여 tPSA에 결합하는 항-tPSA-단일클론항체 및 fPSA 에 결합하는 항-fPSA-단일클론항체를 선별하였다.

실시예 2. 단일클론항체와 골드 구형체(gold particle)의 결합체 제조

실시예 1에서 선별한 항-tPSA-단일클론항체와 마우스 항β-HCG-단일클론항체를 아이소일렉트릭 포커싱(Isoelectric focusing)으로 등전점을 측정하였으며, 등전점은 각각 6.8-7.5, 6.4-6.8 이었다. 이들 각각의 항체를 1mg/ml 농도가 되도록 PBS 완충액에 희석하였다. 골드 구형체 용액은 λmax가 527.1 - 530.1 nm이고, Aλmax가 대략 1.132이고, 균일도가 25% 이상인 것을 사용하였다. 결합체를 제조하기 위하여 먼저 MOPS 완충액(pH 7.7)을 골드 구형체 용액의 1/10 부피만큼 가하고 3분간 교반하였다. 0.02% PVP-K10을 골드 구형체 용액의 1/100 부피만큼 가하고 15분간 교반하였다. 0.1 mg/ml 농도의 항-tPSA-단일클론항체를 골드 구형체 용액 10ml당 100㎍만큼 가하고 30분간 교반하였다. 5% BSA를 골드 구형체 용액의 1/10 부피만큼 가하고 50분간 교반하였다. 10,000 알피엠(r.p.m)에서 15분간 원심분리 후 상층액은 버리고 항-tPSA-단일클론항체-골드 결합체를 회수하였다. 2% BSA, 3 % Sucrose, 0.5 % PVP-K10, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)로 구성된 안정액을 넣어 Aλmax가 5.0이 되도록 재현탁 시켰다.

마우스 항β-HCG-단일클론항체-골드 결합체도 MOPS 완충액 대신에 MES 완충액(pH 6.7)을 사용한 것을 제외하고는 위와 동일한 방법에 따라 제조하였다.

얻어진 항-tPSA-단일클론항체-골드 결합체와 마우스 항β-HCG-단일클론항체-골드 결합체를 9 : 1로 혼합한 후 전처리된 유리섬유(glass fiber) 재질의 접합체 패드(conjugate pad; Milipore, SA3J644H8)에 고르게 퍼지게 적신 후 동결건조 시켰다.

실시예 3. tPSA 검출용 진단 키트의 제조

실시예 1에서 얻은 또다른 항-tPSA-단일클론항체를 나이트로셀룰로스 멤브레인에 혈액 중의 tPSA 농도가 4ng/ml, 10ng/ml의 양을 정량적으로 검출하도록 2개의 라인(제1 라인 및 제2 라인)으로 점적하였으며, 점적기(바이오닷사, 미국)를 이용하여 제1 라인은 0.9 ~ 1.1 mg/ml의 농도로 점적하였으며, 제2 라인은 0.4 ~ 0.6 mg/ml로 점적하였다. 또한, 멤브레인의 상단에 반응의 종료를 나타낼 수 있는 종료선으로서 항-마우스 IgG 복합클론항체를 점적하였다 (도 2 참조).

도 1에 도시된 바와 같이 멤브레인 하단에 실시예 2에서 제조한 접합체 패드가 겹치도록 접착시키고, 종이 등과 같은 재질의 흡수지를 접착시키고, 절단기(바이오닷사, 미국)로 절단하여 tPSA 검출용 스트립을 완성하였다.

상기에서 얻어진 tPSA 검출용 스트립을 샘플 투입구를 구비한 통상의 플라스틱 키트에 끼운 형태는 도 2와 같다.

실시예 4. fPSA 검출용 진단 키트의 제조

실시예 1에서 얻은 항-fPSA-단일클론항체를 나이트로셀룰로스 멤브레인에 혈 액 중의 fPSA 농도가 1ng/ml, 2.5ng/ml의 양을 정량적으로 검출하도록 2개의 라인(제1 라인 및 제2 라인)으로 점적하였으며, 점적기(바이오닷사, 미국)를 이용하여 제1 라인은 0.95 ~ 1.1 mg/ml의 농도로 점적하였으며, 제2 라인은 0.75 ~ 0.85 mg/ml로 점적하였다. 또한, 멤브레인의 상단에 반응의 종료를 나타낼 수 있는 종료선으로서 항-마우스 IgG 복합클론항체를 점적하였다 (도 3 참조).

얻어진 멤브레인상에 실시예 3의 방법과 동일한 방법으로 fPSA 검출용 스트립을 제조하였다.

상기에서 얻어진 fPSA 검출용 스트립을 샘플 투입구를 구비한 통상의 플라스틱 키트에 끼운 형태는 도 3과 같다.

실시예 5. 전립선암 진단 키트의 조립

실시예 3 및 실시예 4에서 각각 제조한 tPSA 검출용 스트립 및 fPSA 검출용 스트립을 도 4와 같이 2개의 스트립을 끼울 수 있도록 제작된 플라스틱에 각각 삽입하여 진단키트를 제조하였다 (도 4 참조).

실시예 6. tPSA에 대한 반응성

tPSA를 tPSA가 검출되지 않는 정상 여성의 혈청으로 희석하여 4 ng/ml, 10 ng/ml의 농도가 되도록 한 다음, 각각 100 ~ 150 ㎕의 혈청을 실시예 3에서 제조한 tPSA 검출용 스트립을 포함한 키트의 샘플 투입구에 투입하였다.

그 결과, 상기 키트는 4 ng/ml의 항원농도까지 15분 이내에 검출이 가능함을 확인하였으며, 또한 4 ng/ml tPSA 농도에서는 2개의 결과선 중 1개의 결과선만이 나타났고 10ng/ml tPSA 농도에서는 2개의 결과선이 모두 나타나 반정량적 측정이 가능하였다.

ELISA 방법(Golden Bridge International Inc.)으로 실험하여 tPSA 양이 4 ng/ml 미만으로 측정된 혈액 50종을 상기 키트로 분석한 결과 육안으로 보이는 결과선이 검출되지 않아 100% 특이도(비특이 반응 없음)를 보였다 (표 1 참조).

	ELISA 측정 tPSA 농도
	4 ng/ml 미만	4 ng/ml 이상	10 ng/ml 이상
결과선 1	-	+	+
결과선 2	-	-	+
종료선	+	+	+
판정	음성	양성 (4 ng/ml 이상)	양성 (10 ng/ml 이상)

* 멤브레인 상 유색밴드 출현시 "+"로 표시함

실시예 7. fPSA에 대한 반응성

fPSA를 fPSA가 검출되지 않는 정상 여성의 혈청으로 희석하여 1 ng/ml, 2.5 ng/ml의 농도가 되도록 한 다음, 각각 100 ~150 ㎕의 혈청을 실시예 4에서 제조한 fPSA 검출용 스트립을 포함한 키트의 샘플 투입구에 투입하였다.

그 결과, 상기 키트는 1 ng/ml의 항원농도까지 15분 이내에 검출이 가능함을 확인하였으며, 또한 1 ng/ml fPSA 농도에서는 2개의 결과선 중 1개의 결과선만이 나타났고 2.5 ng/ml fPSA 농도에서는 2개의 결과선이 모두 나타나 반정량적 측정이 가능하였다.

ELISA 방법(Golden Bridge International Inc.)으로 실험하여 fPSA 양이 1 ng/ml 미만으로 측정된 혈액 50종을 상기 키트로 분석한 결과 육안으로 보이는 결과선이 검출되지 않아 100% 특이도(비특이 반응 없음)를 보였다 (표 2 참조).

	ELISA 측정 fPSA 농도
	1 ng/ml 미만	1 ng/ml 이상	2.5 ng/ml 이상
결과선 1	-	+	+
결과선 2	-	-	+
종료선	+	+	+
판정	음성	양성 (1 ng/ml 이상)	양성 (2.5 ng/ml 이상)

* 멤브레인 상 유색밴드 출현시 "+"로 표시함

실시예 8. tPSA 및 fPSA 의 반 정량적 측정

tPSA 및 fPSA를 PSA가 검출되지 않는 정상 여성의 혈청으로 희석하여 tPSA 1∼20ng/ml의 농도에 fPSA 농도가 0.5∼10ng/ml의 범위로 포함되도록 혼합한 다음, 각각 200 ~ 300 ㎕의 혈청을 실시예 5에서 제조한 진트 키트의 샘플 투입구에 투입하였다.

그 결과, 상기 키트는 15분 이내에 tPSA 4ng/ml의 농도, fPSA 1ng/ml의 농도까지 동시에 검출이 가능함을 확인하였으며, 또한 4 ng/ml tPSA 농도에서는 2개의 결과선 중 1개의 결과선만이 나타났고 10ng/ml tPSA 농도에서는 2개의 결과선이 모두 나타났으며, 1 ng/ml fPSA 농도에서는 2개의 결과선 중 1개의 결과선만이, 2.5ng/ml fPSA 이상의 농도에서는 2개의 결과선 모두 나타나 tPSA와 fPSA 의 양을 동시에 반정량적 측정이 가능하였다 (표 3 및 도 5~8 참조).

		시료의 종류 (전립선암-특이 항원 희석 시료)
		1	2	3	4	5	6
tPSA 검출용 스트립	결과선 1	-	+	+	+	+	+
	결과선 2	-	-	-	-	+	+
fPSA 검출용 스트립	결과선 1	-	-	+	+	+	+
	결과선 2	-	-	-	+	-	+
종료선		+	+	+	+	+	+
판정	tPSA	4ng/ml 미만	4ng/ml 이상	4ng/ml 이상	4ng/ml 이상	10ng/ml 이상	10ng/ml 이상
	fPSA	1ng/ml 미만	1ng/ml 미만	1ng/ml 이상	2.5ng/ml 이상	1ng/ml 이상	2.5ng/ml 이상
	결과	정상	전립선암	전립선 비대증	전립선 비대증	전립선암	전립선암

* 멤브레인 상 유색밴드 출현시 "+"로 표시함

상기 표 3 또는 도 5 내지 도 8에 도시된 바와 같이, 종료선이 하나라도 안 나온 경우는 무효로 취급되며(도 5 참조), tPSA < 4 인 경우에는 fPSA의 값에 관계없이 정상으로 판정할 수 있으며(도 6 참조), 4 ≤tPSA < 10 이고 fPSA가 tPSA의 25% 이상이면 전립선 비대증으로 판정할 수 있으며, tPSA ≥10 이면 fPSA 값에 상관없이 전립선암으로 판정되며, 4 ≤tPSA < 10 이고 fPSA가 tPSA의 25% 이하이면 전립선암으로 판정할 수 있다.

본 발명의 진단 키트는 면역크로마토그래피법을 이용하여 tPSA 또는 fPSA를 각각 별도로 반정량적으로 진단할 수 있을 뿐 아니라, tPSA 및 fPSA를 동일한 키트 내에서 동시에 하나의 혈액 샘플을 사용하여 반정량적으로 빠른 시간내에 정확하게 진단할 수 있다. 따라서 tPSA만을 검출하는 종래의 진단 키트에 있어서의 문제점인 낮은 민감도 및 특이도의 문제를 효과적으로 해결할 수 있으며, 종래의 ELISA 법에 있어서의 문제점으로 지적될 수 있는 특수장비나 전문인력의 필요성도 없을 뿐 아니라, 간단하고 신속하게 전립선암을 전립선 비대증(및/또는 전립선염)과 구분하여 명확하게 진단할 수 있다.

Claims (9)

1. 삭제
2. 삭제
3. i) 전체 전립선-특이 항원(total prostate-specific sgntigen, tPSA)과 결합하는 항-tPSA-단일클론항체-골드 결합체를 포함하는 접합체 패드(conjugate pad); 및 ii) 단독형 전립선-특이 항원(free prostate-specific agntigen, fPSA)을 검출할 수 있는 항-fPSA-단일클론항체의 제1 및 제2 라인 및 항-마우스 IgG 복합클론항체의 종료선을 포함하는 멤브레인을 포함하는 fPSA 검출용 진단 키트.
4. 제3항에 있어서, 상기 항-fPSA-단일클론항체의 제1 라인의 농도는 0.95 mg/ml ~ 1.1 mg/ml이고, 제2 라인의 농도는 0.75 mg/ml ~ 0.85 mg/ml인 것을 특징 으로 하는 fPSA 검출용 진단 키트.
5. 고상 면역크로마토그래피(Immunochromatography) 법을 이용하여 혈액중의 전체 전립선-특이 항원(total prostate-specific agntigen, tPSA) 및 단독형 전립선-특이 항원(free prostate-specific agntigen, fPSA)의 양을 동시에 반정량적으로 측정가능한 tPSA 검출용 스트립 및 fPSA 검출용 스트립을 포함하는 전립선암 및 전립선 비대증 진단 키트.
6. 제5항에 있어서, 상기 tPSA 검출용 스트립은 i) 전체 전립선-특이 항원과 결합하는 항-tPSA-단일클론항체-골드 결합체를 포함하는 접합체 패드(conjugate pad); 및 ii) 전체 전립선-특이 항원을 검출할 수 있는 항-tPSA-단일클론항체의 제1 및 제2 라인 및 항-마우스 IgG 복합클론항체의 종료선을 포함하는 멤브레인을 포함하는 진단 키트.
7. 제6항에 있어서, 상기 항-tPSA-단일클론항체의 제1 라인의 농도는 0.9 mg/ml ~ 1.1 mg/ml이고, 제2 라인의 농도는 0.4 mg/ml ~ 0.6 mg/ml인 것을 특징으로 하는 tPSA 검출용 진단 키트.
8. 제5항에 있어서, 상기 fPSA 검출용 스트립은 i) 전체 전립선-특이 항원과 결합하는 항-tPSA-단일클론항체-골드 결합체를 포함하는 접합체 패드(conjugate pad); 및 ii) 단독형 전립선-특이 항원을 검출할 수 있는 항-fPSA-단일클론항체의 제1 및 제2 라인 및 항-마우스 IgG 복합클론항체의 종료선을 포함하는 멤브레인을 포함하는 fPSA 검출용 스트립을 포함하는 진단 키트.
9. 제8항에 있어서, 상기 항-fPSA-단일클론항체의 제1 라인의 농도는 0.95 mg/ml ~ 1.1 mg/ml이고, 제2 라인의 농도는 0.75 mg/ml ~ 0.85 mg/ml인 것을 특징으로 하는 fPSA 검출용 진단 키트.

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