KR101923199B1 - 펩스타틴 a를 함유하는 소변 내 en2 진단용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 펩스타틴 A를 함유하는 소변 내 EN2 진단용 조성물에 관한 것으로서, 상기 조성물을 이용하여 소변의 EN2 단백질의 안정성을 확보하여 EN2를 활용한 전립선암 또는 방광암에 대한 진단의 정확도를 높일 수 있다.
또한 본 발명에서 이러한 EN2 단백질을 검출하기 위해, 본 발명자들이 직접 제조했던 항체를 이용할 경우, EN2 단백질의 검출 민감도가 타항체를 사용하는 것보다 높을 뿐만 아니라 EN2 단백질이 소변 내에서 분해된 정도를 용이하게 확인할 수 있어, 채취된 소변 샘플이 전립선암 또는 방광암의 진단을 위해 유효한 시료인지도 쉽게 제시할 수 있다.

Description

펩스타틴 A를 함유하는 소변 내 EN2 진단용 조성물 {Composition comprising Pepstatin A for diagnosis of EN2 in urine}

본 발명은 펩스타틴 A를 함유하는 소변 내 EN2 진단용 조성물에 관한 것이다. 보다 더 자세하게는 본 발명은 소변 내 EN2 단백질의 안정성을 높여 EN2를 활용한 전립선암 또는 방광암 진단의 정확도를 높일 수 있는 소변 내 EN2 진단용 조성물에 관한 것이다.

전립선(prostate)은 방광 바로 밑, 직장 앞쪽에 있는 밤톨만 한 크기의 남성 생식기관으로, 정액의 일부를 만들어내고 저장하는 역할을 한다. 위로는 방광경부, 즉 방광에서 요도로 이행하는 부위와 인접해 앞쪽의 치골전립선인대에 고정되어 있고, 아래로는 비뇨생식격막에 의해 고정되어 있다. 전립선에서 발생하는 암의 대부분은 전립선 세포에서 발생하는 선암(샘세포의 암)이다. 종양 조직의 분화 정도와 세포의 특성 등에 따라 유형을 구분할 수 있다.

전립선암은 전세계적으로 가장 흔한 비뇨기계 종양 중 하나로서, 미국에서는 2016년에만 약 180,890명이 전립선암으로 새로이 진단되어 미국 내 전체 신규 종양진단의 10.7%를 차지하며, 유방암과 폐암에 이어 세 번째로 빈번하게 발병이 되는 종양이다. 2009년부터 2013년까지의 통계에 비추어 전세계 100,000명의 남성 중 129.4명이 전립선암을 가지고 있으며 전립선암의 사망률은 2016년 통계로 26,120명에 이른다. 또한 전립선암은 50세 이전에는 흔하지 않은 질환이나 50세를 넘게 되면 급격히 증가하는 양상을 보인다. 최근 평균 수명의 연장으로 국내에서도 노인 남성의 수가 급증하고 전립선암을 조기에 진단하여 전이가 발생하는 등으로 악화되지 않도록 지속적인 관리를 필요로 한다.

특히 사람 전립선암은 뼈로 전이되는 성향을 가지는 것으로 보이며, 안드로겐 의존성 상태로부터 안드로겐 내성 상태로 불가피하게 진행되어 환자의 사망률을 증가시킨다고 알려져 있다. 더욱이, 전립선암 치료를 받은 남성의 약 25%가 병이 재발하여 추가적인 치료를 필요로 하고 있고, 전립선암이 현재 미국에서 남자의 암 사망 원인 중 제2의 원인을 차지하고 있는 바, 이에 대한 조기진단 및 치료가 필요한 실정이다.

현재 사용되고 있는 전립선암 진단법 중 직접적인 방법으로는, 전립선을 직접 조영하거나 조직검사를 통한 진단법이 있다. 직접 조영하거나 조직검사를 통해 진단하는 경우에는, 초기에 전립선암의 발병 여부를 진단함에 어려움이 있는 바, 체외에서 진단할 수 있는 방법의 개발이 시급하다.

간접적인 전립선암 진단법으로는 PSA(prostate-specific antigen) 검사를 이용하여 체외에서 검진할 수 있는 진단법이 있다. 그러나 진단에 이용되는 PSA는 악성 전립선 상피 조직뿐만 아니라 정상 및 양성에서도 생성되어 전립선암 검출에 있어서의 가성 양성율을 높이는 결과를 가져왔다. 또한, 혈청 PSA 수준이 아주 높은 경우에는 효과적인 전립선암의 표준적 진단방법으로 이용할 수 있는 반면, PSA 혈청 수준이 2-10 ng/㎖의 수준인 경우와 같이 약하게 올라가는 경우에는 확실한 전립선암 진단을 할 수 없다. 상기와 같이 약하게 올라가는 경우에는 혈청 PSA는 BPH(benign prostatic hyperplasia), 전립선염 또는 기타 신체적 외상과 같은 비-종양 질병으로부터 유래할 수 있으므로 전립선암 진단을 위한 PSA 분석은 검출 특이성과 관련하여 문제점이 존재한다.

최근 보고와 연구들에서는 EN2(Engrailed-2)를 바이오마커로 하여 전립선암을 진단하는 방법들이 제시된 바 있는데, EN2는 종래 전립선암 진단에 사용되는 PSA(prostate specific antigen) 검사의 검출 특이성 문제를 해결할 수 있는 바이오마커(bio-marker)로 잘 알려져 있다. EN2 단백질은 세포 내에서 전사인자로서 작용하며, 전립선암 세포 내에서만 과다 발현되어 DNA 전사 조절 장애를 초래한다. 더욱이 전립선암 세포 내에서 EN2 발현이 증가할 경우, 소변으로 배설되는 EN2 단백질 양 역시 증가하는 바 체외분석에 적합하다. 이에 미국등록특허 제8460882호, 일본공개특허 제2012-532621호 또는 미국등록특허 제8722643호 등에서 EN2 단백질을 인식하는 진단용 조성물에 관한 기술이 개시되어 있고, 한국공개특허 제10-2016-0077788호에는 EN2에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머 등에 관한 기술이 개시되어 있다.

한편 EN2 단백질이 유방암 또는 방광암에서도 발현되는 것으로 확인된 바 있어, 유방암과 EN2 단백질과의 관련 연구도 활발하게 진행되고 있다(미국등록특허 제7358045호, 미국등록특허 제9624548호, [Oncogene, 2005, 24, 6890-6901].) 특히 방광암의 경우는 암의 진행 정도에 따른 비교에서 T2 이상에서 소변에서 EN2 검출이 많이 된다고 보고되었다(Eur J Cancer. 2013, 49(9):2214-2222).

전립선암이라는 조직 특성상 소변에서의 EN2 검출방법이 많은 다른 전립선암 진단 방법에 비해 비침습적이며 간편한 검사의 용이성으로 좋은 진단 방법으로 활용될 것이다. 이와 함께 소변에서의 EN2 단백질의 안정성 확보가 검사의 정확도에 주요한 요인이 될 것이다.

고환에서 생성되는 남성의 정액에는 보고된 바에 의하면 100여종 이상의 단백분해효소를 포함하고 있다. 이런 단백분해효소는 정액이 요도를 통하여 분비될 때 정자를 포함한 여러 단백질이 뭉쳐진 형태(clot)로 존재하다가 후에 정액에 포함된 단백질 분해효소에 의해 단백질이 분해되고 이에 정자는 운동성을 가지게 된다. 이러한 이유로 정액은 수많은 단백질분해효소를 가지고 있다. 이는 요도로 분비되기 때문에 남성의 소변에 여성에 비해 단백분해효소가 많이 포함되는 이유이다. 이러한 단백분해효소들은 실제 여러 전립선 관련 질환들의 신호 또는 바이오마커로도 보고되었다(Exp Mol Pathol., 2017, 103, 300-305. Mol Reprod Dev., 2013, 80(2), 80-101).

한편, 본 발명자들은 한국등록특허 제10-1777259호와 한국등록특허 제10-1777254호 등을 통해 EN2 항체를 이용한 전립선암 진단 관련 조성물에 관해 지속적으로 연구하던 중, EN2 단백질이 빠른 시간내에 소변 내의 단백분해효소의 작용을 통해 분해됨을 확인하여, 채취된지 불과 수시간 내에 검사를 실시할 경우에도 전립선암 또는 방광암의 진단이 잘 되지 않거나 실험결과가 유효하지 않음을 확인하였다.

또한 이렇게 시간이 흐른 후 소변 샘플을 분석할 경우, 다른 항체를 이용할 경우 본 발명자들이 제조한 항체를 이용할 경우 소변 내에서 분해된 EN2 단백질을 가장 민감하게 확인할 수 있음을 확인하였다.

이에 전립선암의 조기 진단 및 정확한 진단을 위해서는 소변 내 EN2 단백질의 분해를 효과적으로 억제하는 단백분해효소 및 본 발명자들의 항체를 적용하는 것이 바람직함을 입증함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.

미국등록특허 제8460882호 (발명의 명칭 : Cancer biomarkers, 출원인 : The University of Surrey, 등록일 : 2013.06.11) 미국등록특허 제9624548호 (발명의 명칭 : Methods for diagnosing cancer, 출원인 : The University of Surrey, 등록일 : 2017.04.18) 미국등록특허 제8722643호 (발명의 명칭 : Targeting EN2, PAX2, and/or DEFB1 for treatment of prostate conditions, 출원인 : Phigenix, Inc., 등록일 : 2014.05.13) 미국등록특허 제7358045호 (발명의 명칭 : Methods for determining a predisposition to develop breast adenocarcinoma or breast inflammatory carcinoma, 출원인 : INST RECH S CLINIQUES DE MONTR, 등록일 : 2008.04.15) 일본공개특허 제2012-532621호 (발명의 명칭 : 치료 펩티드, 폴리펩티드 및 핵산 배열, 출원인 : The University of Surrey, 공개일 : 2012.12.20) 한국공개특허 제10-2016-0077788호 (발명의 명칭 : EN2에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머 및 이의 용도, 출원인 : 포항공과대학교 산학협력단, 공개일 : 2016.07.04) 한국공개특허 제10-2009-0111307호 (발명의 명칭 : 전립선 특이적 전사물 및 전립선암의 치료 및 진단에 사용되는 이의 용도, 출원인 : 엑손히트 써라퓨틱스 에스에이, 공개일 : 2009.10.26) 한국등록특허 제10-1777259호 (발명의 명칭 : EN2 단백질을 특이적으로 인식하는 단클론 항체 또는 이를 함유하는 전립선암 진단용 조성물, 출원인 : 주식회사 무진메디, 등록일 : 2017.09.05) 한국등록특허 제10-1777254호 (발명의 명칭 : EN2 단백질을 특이적으로 인식하는 특정 항원으로부터 얻어진 단클론 항체 또는 이를 함유하는 전립선암 진단용 조성물, 출원인 : 주식회사 무진메디, 등록일 : 2017.09.05)

Martin NL et al., EN2 is a candidate oncogene in human breast cancer. Oncogene, 2005, 24, 6890-6901. Munoz D et al., Matrix metalloproteinase and heparin-stimulated serine proteinase activities in post-prostate massage urine of men with prostate cancer. Exp Mol Pathol., 2017, 103, 300-305. Laflamme BA and Wolfner MF, Identification and Function of Proteolysis Regulators in Seminal Fluid. Mol Reprod Dev., 2013, 80(2), 80-101. Richard Morgan et al., Expression of Engrailed-2 (EN2) protein in bladder cancer and its potential utility as a urinary diagnostic biomarker. Eur J Cancer. 2013, 49(9):2214-2222.

본 발명의 목적은 펩스타틴 A를 함유하는 소변 내 EN2 진단용 조성물을 제공하는 데에 있다. 보다 더 자세하게는 본 발명은 소변 내 EN2 단백질의 안정성을 높여 EN2를 활용한 전립선암 또는 방광암 진단의 정확도를 높일 수 있는 소변 내 EN2 진단용 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명은 펩스타틴 A를 함유하는 소변 내 EN2 진단용 조성물에 관한 것이다.

상기 조성물에는 항-EN2 항체가 포함될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 EN2 진단용 조성물이 포함된 전립선암 또는 방광암 진단제를 제공한다.

본 발명은 또 다른 양태에서 상기 EN2 진단용 조성물을 이용하는 소변 내 EN2 진단방법과 이를 활용한 전립선암 또는 방광암 진단방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한,

a) 펩스타틴 A; 및,

b) 항-EN2 항체로서,

서열번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역 및, 서열번호 5, 6 또는 7의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 단클론 항체,

또는, 수탁번호 KCLRF-BP-00404의 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 단클론 항체;

를 포함하는 소변 내 EN2 진단용 조성물을 제공할 수 있다.

이하 본 발명을 자세히 설명한다.

본 발명 조성물의 진단대상인 EN2 단백질은 하기의 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질은 포유류, 특히, 인간의 체내에서 발현되는 EN2 단백질에 관한 것이며, 하기의 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 한다.

서열번호 1 : NCBI Reference Sequence Accession No. NP_001418.2

본 발명의 조성물에 포함되는 상기 항-EN2 항체는 단클론 항체 또는 다클론 항체일 수 있으며, 바람직하게는 단클론 항체일 수 있으며, 더 바람직하게는 한국등록특허 제10-1777259호에 개시된 항체일 수 있다.

즉, EN2 인식을 위해 제조된 모든 항체의 사용이 가능하고, 이러한 EN2 항체를 이용하여도 펩스타틴 A를 통해 분해가 억제된 EN2를 인식할 수도 있기는 하지만, 한국등록특허 제10-1777259호의 항체를 사용할 때가 가장 항원-항체 반응성이 우수하다.

상기 한국등록특허 제10-1777259호의 항체는 더 자세하게는,

서열번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역; 및, 서열번호 5, 6 또는 7의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역;을 포함하는 것을 특징으로 하는 단클론 항체일 수 있다.

또는, 수탁번호 KCLRF-BP-00404의 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 것을 특징으로 하는 단클론 항체일 수 있다.

상기 단클론 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 EN2(Engrailed-2, Accession No. NP_001418.2) 단백질 또는 이의 재조합 단백질을 인식하며, 면역글로불린 G 타입인 것을 특징으로 한다.

하기의 서열번호 2~7의 아미노산 서열은 상기 단클론 항체를 구성하는 아미노산 서열이다.

서열번호 2 : EN2 단클론 항체의 가변중쇄 아미노산 서열

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서열번호 3 : EN2 단클론 항체의 가변중쇄 아미노산 서열

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서열번호 4 : EN2 단클론 항체의 가변중쇄 아미노산 서열

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서열번호 5 : EN2 단클론 항체의 가변경쇄 아미노산 서열

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서열번호 6 : EN2 단클론 항체의 가변경쇄 아미노산 서열

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서열번호 7 : EN2 단클론 항체의 가변경쇄 아미노산 서열

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본 발명의 소변 내 EN2 진단용 조성물에는 재조합 EN2 단백질이 더 포함될 수 있다. 상기 재조합 EN2 단백질은 하기 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

서열번호 8 : EN2 재조합 단백질

상기 EN2 재조합 단백질은 EN2 단백질(Accession No. NP_001418.2)의 발현 효율을 높이기 위해 T7 tag(두줄실선밑줄)를 포함하고 있으며 정제가 용이하도록 His tag(한줄실선밑줄)을 포함하고 있다. 또한 대장균을 활용한 대량 배양을 위하여 대장균 발현 벡터를 활용하여 유전자 재조합하였으며 이를 위하여 제한 효소 인식부위(restriction enzyme site - 점선밑줄)를 활용하여 제조할 수 있다.

본 발명에서 이용되는 상기 한국등록특허 제10-1777259호의 항체는 하기의 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 에피토프(epitope)를 인식하는 것을 특징으로 한다.

서열번호 9 : 항체가 인식하는 에피토프(epitope)

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또한, 본 발명은 상기 소변 내 EN2 진단용 조성물을 이용한 전립선암 또는 방광암의 진단방법을 제공한다.

상기 진단방법은, (1단계) 소변 시료를 채취하고 펩스타틴 A를 혼합하는 단계;

(2단계) 상기 1단계의 소변 시료와 펩스타틴 A가 혼합된 것에 항-EN2 항체를 접촉시켜 항원-항체 복합체를 형성하는 단계; 및,

(3단계) 상기 2단계에서 생성된 항원-항체 복합체를 정량 검출 및 분석하는 단계;를 포함할 수 있다.

상기 1단계의 항원-항체 복합체란 시료 내의 체단백질에 포함된 EN2 단백질과 항체의 특이적인 결합물을 의미한다. 즉, 상기 복합체에서 항원은 EN2 단백질을 의미한다.

즉, 상기 분석방법을 통하여 대조군의 항원-항체 복합체의 형성량과 전립선암 또는 방광암의 진행여부를 확인할 대상의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 전립선암 또는 방광암의 진행여부를 확인할 대상의 EN2 단백질 발현량을 판단하여 전립선암 또는 방광암을 직접적으로 진단할 수 있다.

상기 3단계에서 전립선암의 발생 유무 또는 진행여부를 확인할 대상의 시료의 EN2 함량은 재조합 EN2 단백질의 농도를 확인한 표준값을 통해 확인할 수 있다.

또는 전립선암의 발생 유무 또는 진행여부를 확인할 대상의 EN2 단백질 발현량은 전립선암 환자의 소변 EN2 단백질 농도 범위로 알려진 3.1~65.4 nM(Sci.Rep. 2013;3:2059)에 해당되는지를 통해 판단할 수 있으며, 방광암의 발생 유무 또는 진행여부를 확인할 대상의 EN2 단백질 발현량은 방광암 환자의 소변 EN2 단백질 농도 범위로 알려진 1.63 nM ~ 7.68 nM(Eur J Cancer. 2013,49(9):2214-2222)에 해당되는지를 통해 판단할 수 있다.

상기 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 신호 크기를 통하여 정량적으로 측정할 수 있다. 상기 검출 라벨은 효소, 형광물질, 리간드, 발광물질, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으나, 상기 기재된 물질로 제한되는 것은 아니다. 상기 검출 라벨로 효소를 사용하는 경우, 이용할 수 있는 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스터라아제, 글루코스옥시다아제, 헥소키나아제 등이 있으나, 상기 기재된 범위로 제한되지는 않는다. 상기 형광물질로는 플루오레신, 피코시아닌, 플루오레스카민 등이 있으나, 상기 기재된 물질로 제한되는 것은 아니다. 상기 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 발광물질로는 루시페린 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 미소입자로는 콜로이드, 금 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 레독스 분자로는 퀴논, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 방사선 동위원소에는 ³H, ¹⁴C 등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 진단방법은, 웨스턴 블롯(western blot), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), RIA(radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오크털로니면역확산법(ouchterlony immunodiffusion), 로켓면역전기영동법(rocket immunoelectrophoresis), 조직면역염색법(immunohistochemistry), 면역침전분석법(immunoprecipitation), 보체고정분석법(complement fixation assay), FACS(fluorescense activated cell sorter), 단백질 칩(protein chip) 등에 적용할 수 있으나, 기재된 방법에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 진단용 조성물을 이용할 있는 진단대상은 EN2 단백질이 체내에 생성되는 대상라면 모두 가능하며, 사람을 포함하는 모든 포유류에 대한 진단이 가능하다. 상기 포유류는 사람, 개, 고양이, 토끼, 소, 염소, 돼지, 말 등 어떤 종류의 포유류도 모두 적용 가능하다.

본 발명은 펩스타틴 A를 함유하는 소변 내 EN2 진단용 조성물에 관한 것으로서, 상기 조성물을 이용하여 소변의 EN2 단백질의 안정성을 확보하여 EN2를 활용한 전립선암 또는 방광암에 대한 진단의 정확도를 높일 수 있다.

또한 본 발명에서 이러한 EN2 단백질을 검출하기 위해, 본 발명자들이 직접 제조했던 항체를 이용할 경우, EN2 단백질의 검출 민감도가 타항체를 사용하는 것보다 높아 EN2 단백질이 소변 내에서 분해된 정도를 용이하게 확인할 수 있다.

도 1a는 homeobox protein engrailed-2(EN2)의 단백질을 대량 배양하기 위해 대장균 발현 벡터를 사용하여 cloning 한 것을 도식화한 것이다.
도 1b는 대장균 대량 배양 후 분리 정제된 재조합 EN2 단백질(rhEN2)을 SDS-PAGE로 확인한 결과의 사진이다.
도 2는 채취된 직후 및 4℃ 냉장보관 2주 후의 임상 소변 샘플 내의 EN2 함량을 ELISA로 확인한 결과를 나타내는 그래프로서, 일반인(비암환자)과 전립선 암환자 각 3명에 대한 실험값이다.
도 3a는 ELISA 방법으로 재조합 EN2 단백질(rhEN2)을 검출한 결과로서, 기존 ELISA 방식대로 카보네이트 버퍼(Carbonate buffer)를 단백질 용해/희석용 버퍼로 사용할 때와 남성의 소변 샘플을 용해/희석용 버퍼로 이용하여 실험을 수행하였을 때의 결과 값의 차이를 나타내는 그래프이다.
도 3b는 소변 내 EN2의 안정성을 확인하기 위해 남성의 소변 샘플에 재조합 EN2 단백질(rhEN2)을 넣고 상온에서 반응하였을 때 시간별 재조합 EN2 단백질을 확인한 웨스턴 블롯 결과를 나타내는 사진이다.
도 3c는 상온에서 소변 샘플과 5시간 반응하여 재조합 EN2 단백질(rhEN2)이 분해된 것을 확인한 웨스턴 블롯 결과를 나타내는 사진이다.
도 4는 재조합 EN2 단백질(rhEN2)과 각각의 단백분해효소를 남성(일반인 또는 전립선암환자)의 소변에 넣고 상온에서 5시간 반응하였을 때의 결과를 확인한 웨스턴 블롯 결과를 나타내는 사진이다.
도 5는 일반인 여성 소변 샘플 내의 재조합 EN2단백질(rhEN2)이 남성 소변 샘플에서처럼 분해되는지를 확인한 웨스턴 블롯 결과를 나타내는 사진이다.
도 6은 실시예 1-2의 항체와 시판 항체 2종에 대해 항체 민감도를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타내는 것으로서, 도 6a는 웨스턴 블롯 결과의 사진, 도 6b는 이 사진 결과를 각 샘플 대비 항체별로 단백질 발현 강도를 수치화한 것이다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<실시예 1. 재조합 EN2 단백질 및 EN2 항체의 준비>

실시예 1-1. 재조합 EN2 단백질

한국등록특허 제10-1777259호의 실시예 1-1에 개시된 방법으로 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 EN2 단백질을 제조하였다. 재조합 EN2 단백질의 제조를 위해 이용된 pET28b/EN2 plasmid는 도 1a에 개시하였고, 최종 대장균 대량 배양 후 분리 정제된 재조합 EN2 단백질(rhEN2)을 SDS-PAGE로 확인한 결과를 도 1b에 나타내었다.

실시예 1-2. EN2 항체

또한 한국등록특허 제10-1777259호의 실시예 2 내지 4에 개시된 수탁번호 KCLRF-BP-00404의 하이브리도마 세포주로부터 얻은 항체인 Anti-EN2(w)를 본 발명의 EN2 항체로서 준비하였다.

<실험예 1. 임상 샘플에서의 EN2 검출 (Indirect ELISA)>

임상샘플(소변 샘플)을 항원으로 하여 실험을 수행하였다. 임상샘플은 건강검진을 통해 전립선 암을 비롯하여 다른 암 증상이나 전립선염의 증상이 전혀 없는 일반인 3명, 전립선암환자 3명을 각각 대상으로 채취하였다(이하 일반인이란 같은 조건의 비암환자를 말함).

각각의 소변 샘플을 채취 즉시 또는 4℃에 냉장보관 후 각각 coating buffer(50 mM carbonate/bicarbonate buffer pH 9.2)에 5 ㎕씩 첨가하여 희석한 후, 96 well plate에 well당 100㎕씩 분주하여 상온에서 1시간 동안 가볍게 흔들어 coating하였다. 이 후 2% BSA가 포함된 TBS-T를 사용하여 상온에서 1시간 동안 blocking한 후 같은 buffer에 실시예 1-2에서 준비한 EN2 항체를 배율에 맞게 희석(0.5 ㎍/well)하여 plate well에 100 ㎕씩 분주하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 plate는 TBS-T로 3회 세척한 후 HRP가 conjugation되어 있는 Goat anti-mouse IgG 를 1:10,000 비율로 희석하여 plate well에 100 ㎕씩 분주하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 완료 후 3회 세척하고 TMB 용액을 plate well에 100 ㎕씩 분주하여 37℃에서 10분 반응 시킨 후 1N H₂SO₄ 100㎕/well을 넣어 반응을 종결시켰다. Microplate reader로 450nm에서 흡광도 값을 측정하였고, 이에 대한 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2를 참고하면, 전립선 암환자의 소변 샘플 모두 채취 직후에는 EN2 단백질이 높은 농도로 존재하는 것으로 확인되나, 2주 보관 후에는 같은 샘플임에도 EN2 단백질이 50~70% 감소된 것처럼 나타났다. 또한 일반인으로부터 얻은 채취 직후의 소변 샘플에 EN2가 극히 소량이어 잘 드러나지는 않지만 일반인 샘플에서도 채취 직후보다 EN2가 줄어들었음을 확인할 수 있다.

따라서 소변 채취 후 시간이 흘러 분석실험이 수행될 경우에는 전립선암의 발병 여부를 진단할 근거가 되는 EN2 정량이 정확하게 되지 않을 것으로 파악되었다.

<실험예 2. 남성 소변에서의 rhEN2 안정성 검증(Indirect ELISA)>

실시예 1-1에서 준비한 재조합 EN2 단백질(rhEN2)을 0, 0.312, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 ng/mL로 96 well plate에 코팅하였다. 이 때 coating buffer(Carbonate buffer)를 이용하여 재조합 EN2 단백질을 용해하여 희석하거나, 또는, 남성 소변을 이용하여 재조합 EN2 단백질을 용해하여 희석하였고, 각 희석된 시료들을 각각 100 ㎕ 얻고 1시간 동안 반응하여 96 well plate에 coating 하였다.

코팅 후 2% BSA가 포함된 TBS-T를 사용하여 상온에서 1시간 동안 blocking하고, 같은 buffer에 실시예 1-2의 EN2 항체를 배율에 맞게 희석(0.5 ㎍/well)하여 plate well에 100 ㎕씩 분주하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 plate는 TBS-T로 3회 세척한 후 HRP가 conjugation되어 있는 Goat anti-mouse IgG를 1:10,000 비율로 희석하여 plate well에 100 ㎕씩 분주하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 완료 후 3회 세척하고 TMB 용액을 plate well에 100 ㎕씩 분주하여 37℃에서 10분 반응 시킨 후 1N H₂SO₄ 100㎕/well을 넣어 반응을 종결시켰고, Microplate reader로 450nm에서 흡광도 값을 측정하였다.

이 결과는 도 3a에 나타냈으며 다른 조건은 모두 동일하고 재조합 EN2 단백질을 희석한 용매로서 소변과 carbonate buffer 차이만 있었을 뿐인 조건에서, 소변에 녹인 rhEN2 단백질 농도 그래프의 기울기가 감소되는 것을 확인하였다. 이를 통해, 소변 자체를 샘플로 사용하였을 경우에는 소변 내의 EN2 단백질이 ELISA 과정에서 항체와 결합하기까지의 과정에서도 단백질의 변화가 일어나고 있음을 예상할 수 있었다.

<실험예 3. 남성 소변에서의 rhEN2 안정성 검증(western blot)>

일반인 남성의 소변에 rhEN2를 20 ㎍/ 200 ㎕로 용해해 상온에서 각 시간별 반응 후 단백질들을 12% SDS-PAGE를 이용하여 분리하였다. PAGE를 통하여 분리된 단백질들은 PVDF 멤브레인으로 옮기고 각각의 EN2 항체를 5% skim milk/TBS-T(Tris- saline+Tween20)에 1:2000의 비율로 희석하여 4℃에서 하룻밤 동안 반응시키고, 다음날 TBS-T로 3번 세척한 후 홀스라다시 페록시다아제(HRP)가 접합된 항-mouse 항체를 5% skim milk/TBS-T에 1:2000의 비율로 희석하여 상온에서 2시간 반응시켰다. TBS-T로 3번 세척한 멤브레인은 ECL(enhanced chemiluminescence) 용액을 사용하여 2차 항체에 결합되어 있는 peroxidase의 기질인 luminol이 peroxidase에 의해 산화되면서 푸른색 빛을 내는 것을 LAS500을 통하여 검출하였다.

이에 대한 결과 중 3시간 이내의 샘플에 관한 결과를 도 3b에 나타내었는데(웨스턴 블롯 수행 결과 및 이 결과를 수치화한 그래프), 도 3b에 나타난 바와 같이 rhEN2 단백질이 상온에서 소변 내에 용해된 상태로 있을 때, 시간에 따라 EN2 단백질에 대한 검출 민감도가 감소되는 것을 확인할 수 있다.

또한 동일한 방법으로, 일반인 남자와 전립선 암환자의 소변 샘플을 채취하여 여기에 EN2 단백질을 10 ㎍/ 100 ㎕로 용해한 후, 이를 5시간 동안 반응하게 하고 웨스턴 블롯을 수행한 결과, 도 3c와 같이, 5시간 째의 샘플에서 EN2 단백질이 거의 분해된 상태임을 확인할 수 있었다(이하의 도면에서 rhEN2 샘플은 카보네이트 버퍼에 단백질을 넣어서 실험한 것임).

따라서, 소변이 배출되기 시작하면서 EN2 단백질이 소변 내에 존재하는 특정 단백분해효소와 반응하여 소변 내의 EN2 단백질에 대한 안정성이 저해되는 것으로 판단되었고, 이는 일반인의 소변과 전립선 암환자의 소변에서 모두 같은 경향을 나타내어 질환 유무 상관없이 소변 내의 EN2 단백질의 안정성이 높지 않다는 것도 알 수 있었으며, 소변 내에서 EN2 단백질이 시간이 흐름에 따라 분해되는 현상을 억제할 필요가 있음을 확인하였다.

<실험예 4. 단백분해효소 억제제를 통한 rhEN2단백질의 분해 저해 작용 확인>

일반인 남성의 소변에 재조합 EN2 단백질을 첨가하여 전립선암환자의 소변 샘플에 대한 모델로서 적용하였다. 이를 위해, 일반인 남성 소변에 rhEN2를 20 ㎍/ 200 ㎕로 용해한 것을 이용하였다. 또한 EN2 단백질에 대해 양성반응을 보이는 실제 전립선 암환자 소변도 실험에 적용하였다.

일반인 남성 소변에 재조합 EN2 단백질을 넣은 직후;

일반인 남성 소변에 재조합 EN2 단백질을 넣고 5시간 후;

전립선 암환자의 소변을 채취한 직후;

전립선 암환자의 소변을 채취한 뒤 5시간 후;

전립선 암환자의 소변을 채취하고 바로 각각의 단백분해효소 억제제를 넣고 5시간 후;

등의 조건으로 샘플을 분류하여 EN2의 분석을 위해 웨스턴 블롯을 실시하였다.

소변 시료 내의 단백질은 12% SDS-PAGE를 이용하여 분리하였다.

단백분해효소 억제제로는 Ser, Cys를 특이적으로 분해하는 단백분해효소를 억제하는 류펩틴(Leupeptin, 20 μM), Asp를 특이적으로 분해하는 단백분해효소를 억제하는 펩스타틴 A(Pepstatin A, 10 μM), Arg를 특이적으로 분해하는 단백분해효소를 억제하는 베스타틴(Bestatin, 50 μM)을 각각 전립선 암환자의 소변에 첨가하여 상온에서 반응하였다.

SDS-PAGE를 통하여 분리된 단백질들은 PVDF 멤브레인으로 옮기고 EN2 항체를 5% skim milk/TBS-T(Tris- saline+Tween20)에 1:2000의 비율로 희석하여 4℃에서 하룻밤 동안 반응시키고, 다음날 TBS-T로 3번 세척한 후 홀스라다시 페록시다아제(HRP)가 접합된 항-mouse 항체를 5% skim milk/TBS-T에 1:2000의 비율로 희석하여 상온에서 2시간 반응시켰다. TBS-T로 3번 세척한 멤브레인은 ECL(enhanced chemiluminescence) 용액을 사용하여 2차 항체에 결합되어 있는 peroxidase의 기질인 luminol이 peroxidase에 의해 산화되면서 푸른색 빛을 내는 것을 LAS500을 통하여 검출하였다.

이에 대한 결과는 도 4에 나타내었다. 그 결과, 단백분해효소 억제제를 사용하였을 때 펩스타틴 A(Pepstatin A)에서만 단백질이 분해되지 않는 것을 확인하였고, 이 결과를 통해 rhEN2 단백질이 상온에서 소변 상태로 반응하였을 때 Asp 특정 단백분해효소에 의해 rhEN2가 분해되는 것을 알 수 있었다.

<실험예 5. 여성 방광암 환자 소변에서의 EN2 검출>

실험예 4의 방법과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하되, 여성 방광암 환자에서도 EN2 검출이 가능한지를 측정하였다.

그 결과, 도 5에서와 같이 여성 방광암 환자의 소변 시료에서도 채취 5시간 째에 EN2 단백질이 거의 분해되어 검출되지 않음을 알 수 있어, 여성 방광암 진단 시에도, 방광암 환자의 소변 시료에 펩스타틴 A를 첨가할 필요가 있음을 확인할 수 있었다.

<실험예 6. 타 항체로 실험한 결과>

실험예 4의 방법과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하되, 실시예 1-2의 항체 외에도 시판 항-EN2 항체(Abnova, Santa Cruze)를 같은 배율로 희석하여 확인하였다. 이에, 도 6a의 결과와 같이, 통상적인 항-EN2 항체를 이용하여도 전립선암 또는 방광암의 진단이 가능한 것으로 확인되지만, 동일 농도로 loading된 재조합 EN2 단백질의 검출능이 실시예 1-2의 항체에서 가장 좋음을 알 수 있으며, 이 결과의 band intensity를 수치화한 결과인 도 6b에서처럼 그 검출 정도가 현저하게 우수함을 파악할 수 있다.

이상과 같이 본 발명은 전립선암 또는 방광암 진단 검사시 소변의 특정 단백분해효소 억제제를 포함함으로 EN2 단백질의 안정성을 확보함으로 전립선암 또는 방광암을 포함한 소변 내 EN2 검출에 대한 진단 정확도를 높이는 진단 조성물 또는 진단방법을 제공할 수 있다.

<110> Moogene Medi Co., Ltd. <120> Composition comprising Pepstatin A for diagnosis of EN2 in urine <130> P2018-0070 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 333 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Met Glu Glu Asn Asp Pro Lys Pro Gly Glu Ala Ala Ala Ala Val Glu 1 5 10 15 Gly Gln Arg Gln Pro Glu Ser Ser Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Ser Pro Gly Glu Ala Asp Thr Gly Arg Arg Arg Ala Leu 35 40 45 Met Leu Pro Ala Val Leu Gln Ala Pro Gly Asn His Gln His Pro His 50 55 60 Arg Ile Thr Asn Phe Phe Ile Asp Asn Ile Leu Arg Pro Glu Phe Gly 65 70 75 80 Arg Arg Lys Asp Ala Gly Thr Cys Cys Ala Gly Ala Gly Gly Gly Arg 85 90 95 Gly Gly Gly Ala Gly Gly Glu Gly Gly Ala Ser Gly Ala Glu Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Ala Gly Gly Ser Glu Gln Leu Leu Gly Ser Gly Ser Arg Glu 115 120 125 Pro Arg Gln Asn Pro Pro Cys Ala Pro Gly Ala Gly Gly Pro Leu Pro 130 135 140 Ala Ala Gly Ser Asp Ser Pro Gly Asp Gly Glu Gly Gly Ser Lys Thr 145 150 155 160 Leu Ser Leu His Gly Gly Ala Lys Lys Gly Gly Asp Pro Gly Gly Pro 165 170 175 Leu Asp Gly Ser Leu Lys Ala Arg Gly Leu Gly Gly Gly Asp Leu Ser 180 185 190 Val Ser Ser Asp Ser Asp Ser Ser Gln Ala Gly Ala Asn Leu Gly Ala 195 200 205 Gln Pro Met Leu Trp Pro Ala Trp Val Tyr Cys Thr Arg Tyr Ser Asp 210 215 220 Arg Pro Ser Ser Gly Pro Arg Ser Arg Lys Pro Lys Lys Lys Asn Pro 225 230 235 240 Asn Lys Glu Asp Lys Arg Pro Arg Thr Ala Phe Thr Ala Glu Gln Leu 245 250 255 Gln Arg Leu Lys Ala Glu Phe Gln Thr Asn Arg Tyr Leu Thr Glu Gln 260 265 270 Arg Arg Gln Ser Leu Ala Gln Glu Leu Ser Leu Asn Glu Ser Gln Ile 275 280 285 Lys Ile Trp Phe Gln Asn Lys Arg Ala Lys Ile Lys Lys Ala Thr Gly 290 295 300 Asn Lys Asn Thr Leu Ala Val His Leu Met Ala Gln Gly Leu Tyr Asn 305 310 315 320 His Ser Thr Thr Ala Lys Glu Gly Lys Ser Asp Ser Glu 325 330 <210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-antibody-EN2 <400> 2 Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr 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Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Glu Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg 100 105 <210> 8 <211> 390 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant EN2 <400> 8 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg 20 25 30 Asp Pro Val Pro Arg Arg Ser Ala Ala Ala Ile Ala Met Glu Glu Asn 35 40 45 Asp Pro Lys Pro Gly Glu Ala Ala Ala Ala Val Glu Gly Gln Arg Gln 50 55 60 Pro Glu Ser Ser Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser 65 70 75 80 Pro Gly Glu Ala Asp Thr Gly Arg Arg Arg Ala Leu Met Leu Pro Ala 85 90 95 Val Leu Gln Ala Pro Gly Asn His Gln His Pro His Arg Ile Thr Asn 100 105 110 Phe Phe Ile Asp Asn Ile Leu Arg Pro Glu Phe Gly Arg Arg Lys Asp 115 120 125 Ala Gly Thr Cys Cys Ala Gly Ala Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Ala 130 135 140 Gly Gly Glu Gly Gly Ala Ser Gly Ala Glu Gly Gly Gly Gly Ala Gly 145 150 155 160 Gly Ser Glu Gln Leu Leu Gly Ser Gly Ser Arg Glu Pro Arg Gln Asn 165 170 175 Pro Pro Cys Ala Pro Gly Ala Gly Gly Pro Leu Pro Ala Ala Gly Ser 180 185 190 Asp Ser Pro Gly Asp Gly Glu Gly Gly Ser Lys Thr Leu Ser Leu His 195 200 205 Gly Gly Ala Lys Lys Gly Gly Asp Pro Gly Gly Pro Leu Asp Gly Ser 210 215 220 Leu Lys Ala Arg Gly Leu Gly Gly Gly Asp Leu Ser Val Ser Ser Asp 225 230 235 240 Ser Asp Ser Ser Gln Ala Gly Ala Asn Leu Gly Ala Gln Pro Met Leu 245 250 255 Trp Pro Ala Trp Val Tyr Cys Thr Arg Tyr Ser Asp Arg Pro Ser Ser 260 265 270 Gly Pro Arg Ser Arg Lys Pro Lys Lys Lys Asn Pro Asn Lys Glu Asp 275 280 285 Lys Arg Pro Arg Thr Ala Phe Thr Ala Glu Gln Leu Gln Arg Leu Lys 290 295 300 Ala Glu Phe Gln Thr Asn Arg Tyr Leu Thr Glu Gln Arg Arg Gln Ser 305 310 315 320 Leu Ala Gln Glu Leu Ser Leu Asn Glu Ser Gln Ile Lys Ile Trp Phe 325 330 335 Gln Asn Lys Arg Ala Lys Ile Lys Lys Ala Thr Gly Asn Lys Asn Thr 340 345 350 Leu Ala Val His Leu Met Ala Gln Gly Leu Tyr Asn His Ser Thr Thr 355 360 365 Ala Lys Glu Gly Lys Ser Asp Ser Glu Thr Arg Thr Arg Pro Leu Glu 370 375 380 His His His His His His 385 390 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope-antibody-EN2 <400> 9 Asp Gly Glu Gly Gly Ser Lys Thr Leu Ser Leu His Gly Gly Ala 1 5 10 15

Claims (9)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. a) 펩스타틴 A; 및,
   b) 항-EN2 항체로서,
   서열번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역 및, 서열번호 5, 6 또는 7의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 단클론 항체,
   또는, 수탁번호 KCLRF-BP-00404의 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 단클론 항체;
   를 포함하는 것을 특징으로 하는 소변 내 EN2 진단용 조성물.
7. 제6항의 조성물이 포함되는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단제.
8. 삭제
9. 제6항의 조성물을 이용하는 것을 특징으로 하는 방광암 진단제.

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