BRPI0614100A2 - formulações de imunoconjugado lìquidas - Google Patents

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BRPI0614100A2
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immunoconjugate
polysorbate
antibody
histidine
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BRPI0614100-5A
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Wei Zhang
Michael S Flemming
Godfrey Amphlett
Hung-Wei Chih
Elizabeth Bartlett
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Immunogen Inc
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Abstract

FORMULAçõES DE IMUNOCONJUGADO LìQUIDAS. A presente invenção fornece uma formulação de imunoconjugado que é substancialmente livre de partículas, a formulação de imunoconiu- gado compreendendo: um imunoconjugado e um ou mais excipientes selecionados do grupo consistindo em: sacarose, polissorbato 20, polissorbato 80, ciclodextrina, dextrose, glicerol, polietileno glicol, manitol, cloreto de sódio, e um aminoácido, em que a formulação é uma solução aquosa tamponada tendo um pH de 4,5 a 7,6. A presente invenção também fornece uma formulação de imunoconjugado que é substancialmente livre de agregados, a formulação de imunoconjugado compreendendo: um imunoconjugado e um ou mais excipientes selecionados do grupo consistindo em histidina, sa- carose, glicina e cloreto de sódio, em que a formulação é uma solução aquosa tamponada tendo um pH de 4,5 a 7,6. A presente invenção também fornece uma formulação de imunoconjugado que é substancialmente livre tanto de partículas quanto de agregados.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "FORMULAÇÕES DE IMUNOCONJUGADO LÍQUIDAS".
Este pedido reivindica o benefício sob 35 U.S.C. §119(e) paraPedidos n°s: 60/704.902 depositado em 3 de agosto de 2005; 60/707.162depositado em 11 de agosto de 2005; 60/746.454 depositado em 4 de maiode 2006; e 60/746.456 depositado em 4 de maio de 2006, as descrições dosquais são cada qual aqui incorporadas por referência em suas totalidades.
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se aos métodos para a preparaçãode formulações estáveis de imunoconjugados, que são compostos farma-cêuticos que são constituídos de um anticorpo e uma ou várias moléculascovalentemente ligadas de um fármaco.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Os imunoconjugados são desenvolvidos como agentes altamen-te potentes e específicos para o tratamento de câncer e outras condições.Um imunoconjugado é composto de um anticorpo que especificamente re-conhece um antígeno de célula alvo, tal como um antígeno de célula de tu-mor, e uma ou várias moléculas covalentemente ligadas de um fármaco, par-ticularmente um fármaco citotóxico tal como um maitansinóide, um taxano,ou um análogo de CC-1065. Outro nome usado para tais imunoconjugados éconjugados de anticorpo-fármaco. Imunoconjugados são inativos durante acirculação, porém ligam-se às superfícies da célula alvo, e então eles sãointernalizados pelas células. Por mecanismos não ainda completamente en-tendidos, os fármacos são subseqüentemente liberados do anticorpo e po-dem exercer seus efeitos farmacológicos.
A liberação alvejada de fármacos citotóxicos para as células al-vo, tais como células que compõem o tecido de câncer, potencialmente me-lhora os índices terapêuticos dos fármacos citotóxicos. Tipicamente, fárma-cos citotóxicos usados como imunoconjugados são 100 a 1000 vezes maispotentes do que fármacos de quimioterapia convencional. Exemplos de taisimunoconjugados são descritos no Pedido de Patente Internacional (PCT)n°s WO 00/02587, 02/060955, e 02/092127; Patente dos Estados Unidosnos. 5.475.092, 6.340.701, 6.171.586, 6.706.708 B2, e 6.756.397 B2; e Charie outro, CancerRes., 52, 127-131 (1992).
Compostos farmacêuticos tais como imunoconjugados são ge-ralmente combinados com um ou mais veículos, excipientes, e/ou estabili-zantes farmaceuticamente aceitáveis para fornecer uma composição farma-cêutica que leva em conta a administração aos pacientes e a armazenageme transporte do composto farmacêutico. Semelhante a outros produtos far-macêuticas de proteína, os imunoconjugados são propensos à degradaçãotal como oxidação, desamidação, bem como formação de agregado e partí-cuia etc. (Manning e outro, Pharm. Res. 6, 903-918 (1989); Ahern e Man-ning, Stability of Protein Pharmaceuticals: Part A, Chemical and Physical pa-thways of Protein Degradation, Plenum, New York, (1992); e Cleland e outro,Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 10, 307-377 (1993)).
A formação de particular em produtos farmacêuticos de proteína,em particular, pode desestabilizar o composto farmacêutico, desse modotornando a formulação menos potente ou ainda prejudicial para uso clínico.Por exemplo, as partículas em formulações farmacêuticas injetadas podemcausar dano significante às veias ou estase venosa prolongada em pacien-tes. Além disso, a formação de agregado é a principal trilha de degradaçãode produtos farmacêuticos de proteína (Chari e outro, Pharm Res. 20, 1325-1336 (2003)), e pode levar a efeitos indesejáveis tais como imunogenicidade.
A conjugação de fármacos, especialmente fármacos citotóxicos,que são freqüentemente hidrofóbicos, moléculas pequenas, a anticorposmonoclonais hidrofílicos, introduz instabilidade adicional aos imunoconjuga-dos. Conferir as propriedades atributáveis ao componente de anticorpo deimunoconjugados é crucial para a geração de líquido estável ou formulaçõesfarmacêuticas liofilizadas. Para esta finalidade, WO 2004/004639 A2 e Pedi-do de Patente dos Estados Unidos ne 2004/0.241.174 A1 descrevem com-posições de imunoconjugados. Entretanto, estas composições não adequa-damente conferem formação de partícula e agregado nas composições far-macêuticas de imunoconjugados.Desse modo, permanence uma necessidade para composiçõesfarmacêuticas de imunoconjugados que são substancialmente livres de par-tículas e/ou agregados, e permanecem substancialmente livres de partículase/ou agregados durante armazenagem e transporte.
A presente invenção fornece composições farmacêuticas de i-munoconjugados que são substancialmente livres de partículas e/ou agre-gados e previnem a formação de partículas e/ou agregados durante arma-zenagem e/ou transporte. Métodos para uso das composições farmacêuticassão também fornecidos. Estas e outras vantagens da invenção, bem comocaracterísticas inventivas adicionais, tornar-se-ão evidentes a partir das des-crições da invenção fornecida aqui.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção é baseada na descoberta de que a forma-ção de partícula e agregado em composições farmacêuticas de imunoconju-gados pode ser inibida empregando-se certos excipientes. As novas formu-lações produzem maior estabilidade e vidas úteis substancialmente maislongas para os compostos farmacêuticos e fornecem garantia de segurançado paciente.
Um aspecto da presente invenção fornece uma formulação deimunoconjugado que é substancialmente livre de partículas, a formulação deimunoconjugado compreendendo: um imunoconjugado e um ou mais excipi-entes selecionados do grupo consistindo em: sacarose, polissorbato 20, po-lissorbato 80, ciclodextrina, dextrose, glicerol, polietileno glicol, manitol, clo-reto de sódio, e um aminoácido, em que a formulação é uma solução aquosatamponanda tendo um pH de 4,5 a 7,6.
Um segundo aspecto da presente invenção fornece uma formu-lação de imunoconjugado que é substancialmente livre de agregados, a for-mulação de imunoconjugado compreendendo: um imunoconjugado e um oumais excipientes selecionados do grupo consistindo em histidina, sacarose,glicina e cloreto de sódio, em que a formulação é uma solução aquosa tam-ponada tendo um pH de 4,5 a 7,6.
A presente invenção também fornece uma formulação de imu-noconjugado que é substancialmente livre tanto de partículas quanto de a-gregados.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção fornece composições farmacêuticas está-veis de imunoconjugados que são substancialmente livres de partículas e/ouagregados e permanecem substancialmente livres de partículas e/ou agre-gados durante um período prolongado de armazenagem e durante transpor-te. A presente invenção é baseada na descoberta de que a formação de par-tícula e/ou agregado em composições farmacêuticas de imunoconjugadospode ser inibida empregando-se certos excipientes. As novas formulaçõesproduzem maior estabilidade e vidas úteis substancialmente mais longaspara os compostos farmacêuticos e fornecem garantia de segurança do pa-ciente.
Tais formulações são preparadas por inclusão de um excipienteque inibe ou reduz a formação de partículas visíveis (maior do que 50 μιτι) esubvisíveis (maior do que 5 μηι). Como empregado aqui, uma composiçãoque é "substancialmente livre de partículas" passará pelo teste de US Phar-macopeia (USP) <788>, que requer que partículas com tamanho acima de10 μιτι devem estar abaixo de 6000 contas por recipiente e partículas comtamanho acima de 25 μηι devem estar abaixo de 600 contas por recipiente.Veja USP 28, Capítulo 788 "Particulate Matter in Injections," 2004, editadopor United States Pharmacopeia, Rockville, MD. Como empregado aqui,uma composição que é "substancialmente livre de agregados" permanecerálivre de agregados durante armazenagem e transporte de modo que o nívelde monômero de imunoconjugado permaneça acima de 95% durante todavida útil da composição.
Uma vida útil típica para as composições de imunoconjugado dapresente invenção é cerca de 1 a 5 anos, preferivelmente 1 a 4 anos, maispreferivelmente 2 a 4 anos, a 4°C.
Uma formulação de imunoconjugado da invenção que é subs-tancialmente livre de partículas compreende um imunoconjugado e um oumais excipientes selecionados do grupo consistindo em sacarose, polissor-bato 20, polissorbato 80, ciclodextrina, dextrose, glicerol, polietileno glicol,manitol, cloreto de sódio, e um aminoácido, em que a formulação é uma so-lução aquosa tamponada tendo um pH de 4,5 a 7,6. A formulação podecompreender um ou mais excipientes selecionados do grupo consistindo em:(i) 0,1 - 12% de sacarose, (ii) 0,005 - 1,0% de polissorbato 20, (iii) 0,5 - 2%de beta - ciclodextrina, (iv) 2 - 8% de glicerol, (v) 1 - 5% de PEG6000, (vi) 2 -8% de manitol, (vii) 0,005 - 1,0% de polissorbato 80, (viii) 5 - 20 mM de histi-dina, (ix) 100 - 300 mM de glicina, e (x) 50 - 300 mM de cloreto de sódio.
Em certas modalidades preferidas, a formulação da invençãoque é substancialmente livre de partículas preferivelmente compreende umou mais excipientes selecionados do grupo consistindo em: (i) 5 - 10% desacarose; (ii) 0,005 - 0,2 % de polissorbato 20; (iii) 0,5 - 1 % de beta - ciclo-dextrina; (iv) 2 - 5% de glicerol; (v) 2 - 3% de PEG6000; (vi) 3 - 5% de mani-tol; (vii) 0,005 - 0,2 % de polissorbato 80; (viii) 10 - 15 mM de histidina; (ix)130 - 250 mM de glicina, e (x) 100 - 200 mM de cloreto de sódio.
Em modalidades preferidas a solução aquosa tamponada podeconter um ou mais de histidina, succinato, citrato, fosfato, e acetato, e o pH épreferivelmente de 5,0 a 7,0. O pH da formulação é mais preferivelmente de5,0 a 6,0.
Em certas modalidades da invenção, o imunoconjugado da for-mulação compreende um anticorpo humanizado selecionado do grupo con-sistindo em huMy9-6, huC242, huN901, DS6, trastuzumab, bivatuzumab,sibrotuzumab, e rituximab; e/ou o imunoconjugado compreende um fármacocitotóxico selecionado do grupo consistindo em um maitansinóide, um taxa-no, e um CC-1065. A concentração de imunoconjugado na formulação in-ventiva pode variar entre cerca de 0,5 a 20,0 mg por ml. Preferivelmente, aconcentração de imunoconjugado é 0,5 a 10 mg por ml.
Uma formulação de imunoconjugado da invenção que é subs-tancialmente livre de agregados compreende: um imunoconjugado; e um oumais excipientes selecionados do grupo consistindo em histidina, sacarose,glicina e cloreto de sódio, em que a formulação é uma solução aquosa tam-ponada tendo um pH de 4,5 a 7,6. Preferivelmente, a formulação de imuno-conjugado compreende um ou mais excipientes selecionados de 5 - 200 mMde histidina, 100 - 200 mM de glicina, e 2 - 8% de sacarose.
Em certas modalidades preferidas, os excipientes são 5-100mM de histidina ou 100 - 150 mM de glicina, ou a formulação contém 2-8%de sacarose e 100 - 150 mM de glicina. Em certas outras modalidades prefe-ridas, a formulação contém 10 mM de histidina, 5% de sacarose e 130 mMde glicina.
Em modalidades preferidas a solução aquosa tamponada podeconter um ou mais de histidina, succinato, citrato, fosfato, e acetato, e o pH épreferivelmente de 5,0 a 7,0. O pH da formulação é mais preferivelmente de5,0 a 6,0,
Em outro aspecto da invenção, a formulação que é substancial-mente livre de agregados também compreende polissorbato 20 e/ou polis-sorbato 80, de modo que a formulação seja também substancialmente livrede partículas.
Em certas modalidades da invenção, o imunoconjugado da for-mulação compreende um anticorpo humanizado selecionado do grupo con-sistindo em huMy9-6, huC242, huN901, DS6, trastuzumab, bivatuzumab,sibrotuzumab, e rituximab; e/ou o imunoconjugado compreende um fármacocitotóxico selecionado do grupo consistindo em um maitansinóide, um taxa-no, e um CC-1065. A concentração de imunoconjugado na formulação in-ventiva pode variar entre cerca de 0,5 a 20,0 mg por ml. Preferivelmente, aconcentração de imunoconjugado é 0,5 a 10 mg por ml.
Em certas modalidades preferidas da invenção, a formulação deimunoconjugado é substancialmente livre tanto de agregados quanto de par-tículas. Por exemplo, a presente invenção fornece uma formulação de imu-noconjugado consistindo essencialmente de: imunoconjugado huN901-DM1em uma concentração de 0,5-10 mg/ml; 5-15 mM de histidina e/ou 5-15mM de succinato; 0,1 - 10 % de sacarose e/ou 100 - 300 mM de glicina;0,005 - 0,2% de polissorbato 80 e/ou 0,005 - 0,2% de polissorbato 20, emque a formulação é uma solução tamponada aquosa tendo um pH de 5 - 6.Ingredientes adicionais podem ser opcionalmente adicionados contanto quea formulação permaneça substancialmente livre tanto de agregados quantode partículas.
Em outro exemplo, uma formulação de imunoconjugado consisteessencialmente em: (a) imunoconjugado huC242-DM4 em uma concentra-ção de 0,5 - 10 mg/ml; 5-15 mM de histidina; 0,1 - 10 % de sacarose e/ou100 - 300 mM de glicina; 0,005 - 0,2% de polissorbato 80 e/ou 0,005 - 0,2%de polissorbato 20; em que a formulação é uma solução tamponada aquosatendo um pH de 5 - 6. Ingredientes adicionais podem ser opcionalmente adi-cionados, contanto que a formulação permaneça substancialmente livre tan-to de agregados quanto de partículas.
Geralmente, excipientes adequados que podem ser usados emconjunto com a presente invenção podem ser selecionados de uma varieda-de de categorias, incluindo porém não limitados a sais inorgânicos, ácidosorgânicos, sacarídeos, aminoácidos, polissorbatos, polietileno glicol e com-binações dos mesmos. Excipientes preferidos são selecionados do grupoconsistindo em sais inorgânicos, ácidos carboxílicos orgânicos, sacarídeos,aminoácidos, polissorbatos, polietileno glicol, albuminas, glicérol, e combina-ções dos mesmos.
Exemplos de sais inorgânicos adequados incluem porém nãosão limitados a cloreto de sódio, cloreto de cálcio, sulfato de magnésio, clo-reto de magnésio, sulfato de sódio, e combinações dos mesmos. Cloreto desódio é um excipiente preferido para uso na presente invenção.
Exemplos de ácidos carboxílicos orgânicos adequados incluem,porém não são limitados a ácido tartárico (que inclui ácido tartárico racêmi-co, ácido D-tartárico e ácido L-tartárico), ácido maléico, ácido acético, ácidocítrico, ácido sucínico, ácido glucurônico, e combinações dos mesmos. "Áci-do" como empregado aqui refere-se ao ácido e qualquer hidrato e sais dosmesmos, isto é, citratos e succinatos. Ácido succínico é um excipiente prefe-rido para uso na presente invenção.
Exemplos de sacarídeos adequados incluem porém não são li-mitados a sacarose, trealose, dextrose, manitol, ciclodextrina e combinaçõesdos mesmos. Sacarose e ciclodextrina são excipientes preferidos para usona presente invenção.
Exemplos de aminoácidos adequados incluem porém não sãolimitados a histidina, glicina, lisina, arginina e combinações dos mesmos.Histidina e glicina são excipientes preferidos para uso na presente invenção.
Exemplos de albuminas adequadas incluem albumina de sorohumano.
Exemplos de polietileno glicóis adequados são polietileno glicóiscom um peso molecular de cerca de 200 a 20.000 Da. Polietileno glicóis pre-feridos são PEG 4000, PEG 5000, PEG 6000, PEG 8000, e PEG 10000.
Exemplos de polissorbatos adequados são polissorbato 20(TWEEN-20®) e polissorbato 80.
Exemplos de ciclodextrinas adequadas são alfa-, beta-, e gama-ciclodextrina.
A partir dos ensinamentos desta invenção, alguém versado natécnica pode facilmente determinar os excipientes que melhor forneceriamuma formulação que fosse substancialmente livre de partículas e/ou agrega-dos, dado uma solução de imunoconjugado particular.
Preferivelmente, a tonicidade da formulação de imunoconjugadoé em torno daquela do sangue humano (isto é, isotônica).
Exemplos de agentes de tonificação adequados são sais, ami-noácidos, e açúcares. Sais preferíveis incluem sais de sódio monovalentes.Aminoácidos preferíveis incluem histidina, glicina, lisina e arginina. O maispreferido é glicina. Açúcares preferíveis incluem monossacarídeos, dissaca-rídeos, oligossacarídeos lineares, e oligossacarídeos cíclicos. Um dissacarí-deo preferido é sacarose. Quantidades adequadas de sais, sacarídeos, e/ouaminoácidos podem ser adicionadas à formulação inventiva para obter umatonicidade desejável.
O composto farmacêutico é um imunoconjugado constituído deum anticorpo que especificamente reconhece um antígeno de célula alvo, euma ou várias moléculas covalentemente ligadas de um fármaco citotóxico,tal como um maitansinóide, um taxano, ou um análogo de CC-1065.
O anticorpo pode ser específico para qualquer espécie de célula,porém geralmente alveja células que devem ser destruídas, tais como célu-las de tumor (particularmente células de tumor sólido), células infectadas porvírus, células infectadas por microorganismo, células infectadas por parasito,células auto-imunes (células que produzem auto-anticorpos), células ativa-das (aquelas envolvidas em rejeição de enxerto ou doença enxerto vs. hos-pedeiro), ou qualquer outro tipo de células doentes ou anormais.
Anticorpos podem ser de qualquer espécie atualmente conheci-da, ou que se tornou conhecida, e podem incluir qualquer imunoglobulina,qualquer fragmento de imunoglobulina, tal como Fab, F(ab')2, dsFv, sFv, dia-corpos, e triacorpos, ou quimera de imunoglobulina, que pode ligar-se a umantígeno na superfície de uma célula (por exemplo, que contém uma regiãode determinação de complementariedade (CDR)). Qualquer anticorpo ade-quado pode ser usado como o agente de ligação à célula. Alguém versadona técnica apreciará que a seleção de um anticorpo apropriado dependeráda população celular a ser alvejada. A este respeito, o tipo e número de mo-léculas de superfície celular (isto é, antígenos) que são seletivamente ex-pressas em uma população celular particular (tipicamente e preferivelmenteuma população celular doente) regularão a seleção de um anticorpo apropri-ado para uso na composição inventiva. Perfis de expressão de superfíciecelular são conhecidos para uma ampla variedade de tipos de célula, inclu-indo tipos de célula de tumor, ou, se desconhecidos, podem ser determina-dos empregando-se biologia molecular de via e técnicas histoquímicas.
O anticorpo pode ser policlonal ou monoclonal, porém é maispreferivelmente um anticorpo monoclonal. Como empregado aqui, anticorpos"policlonais" referem-se às populações heterogêneas de moléculas de anti-corpo, tipicamente contidas nos soros de animais imunizados. Anticorpos"monoclonais" referem-se às populações homogêneas de moléculas de anti-corpo que são específicas para um antígeno particular. Anticorpos monoclo-nais são tipicamente produzidos por um clone único de linfócitos B ("célulasB"). Anticorpos monoclonais podem ser obtidos empregando-se uma varie-dade de técnicas conhecidas por aqueles versados na técnica, incluindo tec-nologia de hibridoma padrão (veja, por exemplo, Kóhler e Milstein, Eur. J.Imunol., 5: 511-519 (1976), Harlow e Lane (eds.), Antibodies: A LaboratoryManual, CSH Press (1988), e C.A. Janeway e outro (eds.), Imunobiology, 5êEd., Garland Publishing, New York, NY (2001)). Em resumo, o método dehibridoma de produção de anticorpos monoclonais tipicamente envolve inje-ção de qualquer animal adequado, tipicamente e preferivelmente um ca-mundongo, com um antígeno (isto é, um "imunógeno"). O animal é subse-qüentemente sacrificado, e células B isoladas de seu baço são fundidas comcélulas de mieloma humano. Uma célula híbrida é produzida (isto é, um "hi-bridoma"), a qual prolifera indefinidamente e continuamente secreta eleva-dos títulos de um anticorpo com a especificidade desejada in vitro. Qualquermétodo apropriado conhecido na técnica pode ser usado para identificar cé-lulas de hibridoma que produzem um anticorpo com a especificidade deseja-da. Tais métodos incluem, por exemplo, ensaio imunossorvente ligado à en-zima (ELISA), análise Western blot, e rádio-imunoensaio. A população dehibridomas é peneirada para isolar clones individuais, cada um dos quaissecreta uma espécie de anticorpo simples para o antígeno. Porque cada hi-bridoma é um clone derivado da fusão com uma célula B simples, todas asmoléculas de anticorpo que ele produz são idênticas em estrutura, incluindoseu sítio de ligação de antígeno e isotipo. Anticorpos monoclonais tambémpodem ser gerados empregando-se outras técnicas adequadas incluindotecnologia EBV-hibridoma (veja, por exemplo, Haskard e Archer, J. Imunol.Methods, 74(2): 361-67 (1984), e Roder e outro, Methods Enzymol., 121:140-67 (1986)), sistemas de expressão de vetor bacteriófago (veja, por e-xemplo, Huse e outro, Science, 246:1275-81 (1989)), ou bibliotecas de exi-bição de fago compreendendo fragmentos de anticorpo, tais como Fab escFv (região variável de cadeia simples) (veja, por exemplo, Patente dosEstados Unidos nss 5.885.793 e 5.969.108, e Pedidos de Patente Interna-cional WO 92/01.047 e WO 99/06.587).
O anticorpo monoclonal pode ser isolado de ou produzido emqualquer animal adequado, porém é preferivelmente produzido em um ma-mífero, mais preferivelmente um camundongo ou ser humano, e mais prefe-rivelmente um ser humano. Métodos para produção de um anticorpo em ca-mundongos são bem conhecidos por aqueles versados na técnica e sãodescritos aqui. Com respeito aos anticorpos humanos, alguém versado natécnica apreciará que anticorpos policlonais podem ser isolados dos sorosde indivíduos humanos vacinados ou imunizados com um antígeno apropri-ado. Alternativamente, anticorpos humanos podem ser gerados por adapta-ção de técnicas conhecidas para produção de anticorpos humanos em ani-mais não humanos tais como camundongos (veja, por exemplo, Patente dosEstados Unidos n9s 5.545.806, 5.569.825, e 5.714.352, e Publicação de Pe-dido de Patente dos Estados Unidos n9. 2002/0.197.266 A1).
Ao mesmo tempo que sendo a escolha ideal para aplicaçõesterapêuticas em seres humanos, anticorpos humanos, particularmente anti-corpos monoclonais humanos, tipicamente são mais difíceis de gerar do queanticorpos monoclonais de camundongo. Anticorpos monoclonais de ca-mundongo, entretanto, induzem uma resposta de anticorpo em hospedeirorápida quando administrados a seres humanos, que pode reduzir o potencialterapêutico ou diagnóstico do conjugado anticorpo-fármaco. Para evitar es-tas complicações, um anticorpo monoclonal preferivelmente não é reconhe-cido como "estranho" pelo sistema imune humano.
Para esta finalidade, exibição de fago pode ser usada para geraro anticorpo. Neste respeito, bibliotecas de fago que codificam domínios devariável de ligação de antígeno (V) de anticorpos podem ser geradas em-pregando-se técnicas de DNA recombinante e biologia molecular padrão(veja, por exemplo, Sambrook e outro (eds.), Molecular Cloning, A Labora-tory Manual, 3§ Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(2001)). Fagos codificando uma região variável com a especificidade dese-jada são selecionados para ligação específica ao antígeno desejado, e umanticorpo humano completo é reconstituído compreendendo o domínio vari-ável selecionado. Seqüências de ácido nucléico codificando o anticorpo re-constituído são introduzidas em uma linhagem celular adequada, tal comouma célula de mieloma usada para produção de hibridoma, de modo queanticorpos humanos tendo as características de anticorpos monoclonais se-jam secretados pela célula (veja, por exemplo, Janeway e outro, supra, Husee outro, supra, e Patente dos Estados Unidos nQ. 6.265.150). Alternativa-mente, anticorpos monoclonais podem ser gerados de camundongos quesão transgênicos para genes de imunoglobulina de cadeia leve e pesadahumanos específicos. Tais métodos são conhecidos na técnica e descritosem, por exemplo, Patente dos Estados Unidos nQs 5.545.806 e 5.569.825, eJaneway e outro, supra.
Mais preferivelmente o anticorpo é um anticorpo humanizado.Como empregado aqui, um anticorpo "humanizado" é um em que as regiõesde determinação de complementariedade (CDR) de um anticorpo monoclo-nal de camundongo, que formam as alças de ligação de antígeno do anticor-po, são enxertadas na estrutura de uma molécula de anticorpo humano. De-vido à similaridade das estruturas de anticorpos de camundongo e sereshumanos, é geralmente aceito na técnica que este método produza um anti-corpo monoclonal que é antigenicamente idêntico a um anticorpo humano,porém liga-se ao mesmo antígeno como o anticorpo monoclonal de camun-dongo do qual as seqüências de CDR foram derivadas. Métodos para geraranticorpos humanizados são bem conhecidos na técnica e são descritos emdetalhes em, por exemplo, Janeway e outro, supra, Patente dos EstadosUnidos nes 5.225.539, 5.585.089 e 5.693.761, Patente Européia nQ0.239.400 B1, e Patente do Reino Unido nQ 2.188.638. Anticorpos humani-zados podem também ser gerados empregando-se a tecnologia de recape-amento de anticorpo descrita em Patente dos Estados Unidos nQ 5.639.641 ePedersen e outro, J. Moi Biol., 235:959-973 (1994). Ao mesmo tempo que oanticorpo empregado no imunoconjugado da composição inventiva mais pre-ferivelmente é um anticorpo monoclonal humanizado, um anticorpo mono-clonal humano e um anticorpo monoclonal de camundongo, como descritoacima, incluem-se também no escopo da invenção.
Fragmentos de anticorpo que têm pelo menos um sítio de liga-ção de antígeno, e desse modo reconhecem e ligam-se a pelo menos umantígeno ou receptor presente na superfície de uma célula alvo, também in-cluem-se no escopo da invenção. Neste respeito, clivagem proteolítica deuma molécula de anticorpo intacta pode produzir uma variedade de fragmen-tos de anticorpo que retêm a capacidade de reconhecer e ligar-se aos antí-genos. Por exemplo, digestão limitada de uma molécula de anticorpo com apapaína de protease tipicamente produz três fragmentos, dois dos quais sãoidênticos e são referidos como os fragmentos Fab, quando eles retêm a ati-vidade de ligação ao antígeno da molécula de anticorpo origem. Clivagem deuma molécula de anticorpo com a enzima pepsina normalmente produz doisfragmentos de anticorpo, um dos quais retém ambas as ramificações de li-gação de antígeno da molécula de anticorpo, e é desse modo referido comoo fragmento F(ab')2. Redução de um fragmento F(ab')2 com ditiotreitol oumercaptoetilamina produz um fragmento referido como um fragmento Fab'.
Um fragmento de anticorpo de fragmento de região variável de cadeia única(sFv), que consiste em um fragmento Fab truncado compreendendo o domí-nio variável (V) de uma cadeia pesada de anticorpo ligada a um domínio Vde uma cadeia de anticorpo leve por meio de um peptídeo sintético, pode sergerado empregando-se técnicas de tecnologia de DNA recombinante de via(veja, por exemplo, Janeway e outro, supra). Similarmente, fragmentos deregião variável estabilizada por dissulfeto (dsFv) podem ser preparados portecnologia de DNA recombinante (veja, por exemplo, Reiter e outro, ProteinEngineering, 7: 697-704 (1994)). Fragmentos de anticorpo no contexto dainvenção, entretanto, não são limitados a estes tipos exemplares de frag-mentos de anticorpo. Qualquer fragmento de anticorpo adequado que reco-nhece e liga-se a um receptor de superfície celular desejado ou antígenopode ser empregado. Fragmentos de anticorpo são também descritos em,por exemplo, Parham, J. Imunol., 131: 2895-2902 (1983), Spring e outro, J.Imunol., 113: 470-478 (1974), e Nisonoff e outro, Arch. Biochem. Biophys.,89: 230-244 (1960). Ligação anticorpo-antígeno pode ser ensaiada empre-gando-se qualquer método adequado conhecido na técnica, tal como, porexemplo, rádio-imunoensaio (RIA), ELISA, Western blot, imunoprecipitação,e ensaios de inibição competitivos (veja, por exemplo, Janeway e outro, su-pra, e Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos nQ2002/0.197.266 A1).
Além disso, o anticorpo pode ser um anticorpo quimérico ou umfragmento de ligação de antígeno do mesmo. Por "quimérico" entende-seque o anticorpo compreende pelo menos duas imunoglobulinas, ou fragmen-tos destas, obtidas ou derivadas de pelo menos duas espécies diferentes(por exemplo, duas imunoglobulinas diferentes, tais como uma região cons-tante de imunoglobulina humana combinada com uma região variável deimunoglobulina de murino). O anticorpo também pode ser um anticorpo dedomínio (dAb) ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, tal como,por exemplo, um anticorpo de camelid (veja, por exemplo, Desmyter e outro,Nature Struct. Biol., 3: 752, (1996)), ou um anticorpo de tubarão, tal como,por exemplo, um novo receptor de antígeno (IgNAR) (veja, por exemplo,Greenberg e outro, Nature, 374: 168 (1995), e Stanfield e outro, Science,305:1770-1773 (2004)).
Qualquer anticorpo adequado pode ser usado no contexto dainvenção. Por exemplo, o anticorpo monoclonal J5 é um anticorpo lgG2a demurino que é específico para Antígeno de Leucemia Linfoblástica AgudaComum (CALLA) (Ritz e outro, Nature, 283: 583-585 (1980)), e pode ser u-sado para alvejar células que expressam CALLA (por exemplo, células deleucemia linfoblástica aguda). O anticorpo monoclonal MY9 é um anticorpoIgGI de murino que se liga especificamente ao antígeno CD33 (Griffin e ou-tro, Leukemia Res., 8: 521 (1984)), e pode ser usado para alvejar célulasque expressam CD33 (por exemplo, células de leucemia mielógena aguda(AML)).
Similarmente, o anticorpo monoclonal anti-B4 (também referidocomo B4) é um anticorpo IgGI de murino que se liga ao antígeno CD19 emcélulas B (Nadler e outro, J. Imunol., 131:244-250 (1983)), e pode ser usadopara alvejar células B ou células doentes que expressam CD19 (por exem-plo, células de Iinfoma de não Hodgkin e células de leucemia linfoblásticacrônica). N901 é um anticorpo monoclonal de murino que se liga ao antígenoCD56 (molécula de adesão de célula neural) encontrado em células de ori-gem neuroendócrina, incluindo tumor de pulmão de célula pequena, que po-de ser usado no imunoconjugado para alvejar fármacos para as células deorigem neuroendócrina. Os anticorpos J5, MY9, e B4 preferivelmente sãorecapeados ou humanizados antes de seu uso como parte do imunoconju-gado. Recapeamento ou humanização de anticorpos é descrito em, por e-xemplo, Roguska e outro, Proc. Nati Acad. Sei. USA, 91:969-73 (1994).
Além disso, o anticorpo monoclonal C242 liga-se ao antígenoCanAg (veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos n9 5.552.293), e po-de ser usado para alvejar o imunoconjugado para tumores que expressamCanAg, tais como cânceres colorretal, pancreático, de pulmão de célula nãopequena, e gástrico. HuC242 é uma forma humanizada do anticorpo mono-clonal C242 (veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos nQ 5.552.293).O hibridoma do qual HuC242 é produzido é depositado com Número de i-dentificação ECACC 90012601. HuC242 pode ser preparado empregando-se metodologia de enxerto de CDR (veja, por exemplo, Patente dos EstadosUnidos n-s 5.585.089, 5.693.761, e 5.693.762) ou tecnologia de recapea-mento (veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos nõ 5.639.641).HuC242 pode ser usado para alvejar o imunoconjugado para células de tu-mor que expressam o antígeno CanAg, tal como, por exemplo, células decâncer colorretal, pancreático, de pulmão de célula não pequena, e gástrico.
Para alvejar células de câncer de ovário e câncer de próstata,um anticorpo anti-MUC1 pode ser usado como o agente de ligação à célulano imunoconjugado. Anticorpos anti-MUC1 incluem, por exemplo, anti-HMFG-2 (veja, por exemplo, Taylor-Papadimitriou e outro, Int. J. Câncer, 28:17-21 (1981)), hCTMOI (veja, por exemplo, van Hof e outro, Câncer Res.,56: 5179-5185 (1996)), e DS6. Células de câncer de próstata também po-dem ser alvejadas com o imunoconjugado empregando-se um antígeno demembrana específico antipróstata (PSMA) como o agente de ligação à célu-la, tal como J591 (veja, por exemplo, Liu e outro, Câncer Res., 57: 3629-3634 (1997)). Além disso, células de câncer que expressam o antígenoHer2, tais como cânceres de mama, próstata, e ovário, podem ser alvejadasempregando-se o anticorpo trastuzumab. Anticorpos anti-IGF-IR que se Ii-gam ao receptor de fator de crescimento similar à insulina também podemser usados no imunoconjugado.
Anticorpos particularmente preferidos são anticorpos monoclo-nais humanizados, exemplos dos quais incluem huN901, huMy9-6, huB4,huC242, DS6, trastuzumab, bivatuzumab, sibrotuzumab, e rituximab (veja,por exemplo, Patente dos Estados Unidos n9s 5.639.641 e 5.665.357; Publi-cação de Pedido de Patente dos Estados Unidos nQ 2005-0118183 A1, Pe-dido de Patente Internacional WO 02/16,401, Pedersen e outro, supra, Ro-guska e outro, supra, Liu e outro, supra, Nadler e outro, supra, Colomer eoutro, Câncer Invest., 19: 49-56 (2001), Heider e outro, Eur. J. Câncer, 31 A:2385-2391 (1995), Welt e outro, J. Clin. Oncol., 12:1193-1203 (1994), e Ma-loney e outro, Blood, 90:2188-2195 (1997)). Mais preferivelmente, o anticor-po é o anticorpo monoclonal humanizado huN901 ou o anticorpo monoclonalhumanizado huMy9-6. Outros anticorpos monoclonais humanizados são co-nhecidos na técnica e podem ser usados com relação à invenção.
O imunoconjugado pode compreender qualquer fármaco ade-quado, tipicamente um agente citotóxico. Um "agente citotóxico", como em-pregado aqui, refere-se a qualquer composto que resulta na morte de umacélula, induz morte celular, ou diminui a viabilidade celular. Agentes citotóxi-cos adequados incluem, por exemplo, maitansinóides e análogos de maitan-sinóide, taxóides, CC-1065 e análogos de CC-1065, e dolastatina e análogosde dolastatina. Em uma modalidade preferida da invenção, o agente citotóxi-co é um maitansinóide, incluindo maitansinol e análogos de maitansinol. Mai-tansinóides são compostos que inibem a formação de microtúbulo e são al-tamente tóxicos às células de mamífero. Exemplos de análogos de maitansi-nol adequados incluem aqueles tendo um anel aromático modificado e aque-les tendo modificações em outras posições. Tais maitansinóides são descri-tos em, por exemplo, Patente dos Estados Unidos nQs 4.256.746, 4.294.757,4.307.016, 4.313.946, 4.315.929, 4.322.348, 4.331.598, 4.361.650,4.362.663, 4.364.866, 4.424.219, 4.371.533, 4.450.254, 5.475.092,5.585.499, 5.846.545, e 6.333.410.
Exemplos de análogos de maitansinol tendo um anel aromáticomodificado incluem: (1) C 19-decloro (Patente dos Estados Unidos ne4.256.746) (preparado por redução de LAH de ansamitocina P2), (2) C-20-hidróxi (ou C-20-demetil) +/-C-19-decloro (Patente dos Estados Unidos nõs4.361.650 e 4.307.016) (preparado por desmetilação empregando-se Strep-tomyces ou Actinomyces ou desclorinação empregando-se LAH), e (3) C-20-demetóxi, C-20-acilóxi (-OCOR), +/-decloro (Patente dos Estados Unidos n94.294.757) (preparado por acilação empregando-se cloretos de acila).
Exemplos de análogos de maitansinol tendo modificações deposições diferentes de um anel aromático incluem: (1) C-9-SH (Patente dosEstados Unidos nQ 4.424.219) (preparado pela reação de maitansinol comH2S ou P2S5), (2) C-14-alcoximetila (demetóxi/CH2OR) (Patente dos EstadosUnidos nQ 4.331.598), (3) C-14-hidroximetila ou aciloximetila (CH2OH ouCH2OAc) (Patente dos Estados Unidos n- 4.450.254) (preparado de Nocar-dia), (4) C-15-hidróxi/acilóxi (Patente dos Estados Unidos n9 4.364.866)(preparado pela conversão de maitansinol por Streptomyces), (5) C-15-metóxi (Patente dos Estados Unidos n9s 4.313.946 e 4.315.929) (isolado deTrewia nudiflora), (6) C-18-N-demetila (Patente dos Estados Unidos n9s4.362.663 e 4.322.348) (preparado pela desmetilação de maitansinol porStreptomyces), e (7) 4,5-deóxi (Patente dos Estados Unidos n9 4.371.533)(preparado pela redução de tricloreto de titânio/LAH de maitansinol).
Em uma modalidade preferida da invenção, o imunoconjugadoutiliza o maitansinóide DM1 contendo tiol, também conhecido como N2'-deacetil-N2'-(3-mercapto-1-oxopropil)-maitansina, como o agente citotóxico.
Em outra modalidade preferida da invenção, o imunoconjugadoutiliza o maitansinóide DM4 contendo tiol, também conhecido como N-2'-deacetil-N-2'-(4-metil-4-mercapto-1-oxopentil)-maitansina, como o agentecitotóxico. A estrutura de DM4 é representada pela fórmula (II):
<formula>formula see original document page 19</formula>
Outras maitansinas podem ser usadas no contexto da invenção,incluindo, por exemplo, maitansinóides contendo tiol e dissulfeto transpor-tando uma substituição de mono ou dialquila no átomo de carbono transpor-tando o átomo de enxofre. Particularmente preferido é um maitansinóidetendo na posição C3, a funcionalidade de C14 hidroximetila, C15 hidróxi, ouC20 desmetila, uma cadeia lateral de aminoácido acilada com um grupo acilatransportando um grupo sulfidrila impedida, no qual o átomo de carbono dogrupo acila transportando a funcionalidade de tiol tem um ou dois substituin-tes, os referidos substituintes sendo CH3, C2H5, alquenila ou alquila linear ouramificada tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquenila ou alquila cíclicatendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída, ou radical hete-rocíclico ou aromático heterocíclico, e também no qual um dos substituintespode ser H1 e no qual o grupo acila tem um comprimento de cadeia linear depelo menos três átomos de carbono entre a funcionalidade de carbonila e oátomo de enxofre.
Maitansinas adicionais para uso no contexto da invenção inclu-em compostos representados pela fórmula (III):<formula>formula see original document page 20</formula>
em que Y' representa (CR7R8)I(CR9=CR10)P(CsC)qAr(CR5R6)mDu-(CR11=CR12)r(CsC)sB,(CR3R4)n-CR1 R2SZ1
em que R1 e R2 são cada qual independentemente alquenila oualquila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, preferivelmente CH3 ouC2H5, alquenila ou alquila cíclica ou ramificada tendo de 3 a 10 átomos decarbono, fenila, fenila substituída ou radical heterocíclico ou aromático hete-rocíclico, e em que R2 também pode ser H,
em que A, B, D são cicloalquila ou cicloalquenila tendo 3-10 á-tomos de carbono, arila substituída ou simples, ou radical heterocíclico, ouaromático heterocíclico,
em que R3, R4, Rs, R6, R7, Re, R9, R10, R11, e Ri2 são cada qualindependentemente H, alquenila ou alquila linear tendo de 1 a 10 átomos decarbono, preferivelmente CH3 ou C2H5, alquenila ou alquila cíclica ou ramifi-cada tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radicalheterocíclico, ou aromático heterocíclico,
em que I, m, n, o, p, q, r, s, t e u são cada qual independente-mente
zero ou um número inteiro de 1 a 5, contanto que pelo menosdois de I, m, n, o, p, q, r, s, u, e t não sejam zero ao mesmo tempo, e
em que Z é H, SR ou COR, em que R é alquenila ou alquila line-ar tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquenila ou alquila cíclica ou ramifi-cada tendo de 3 a 10 átomos de carbono, arila substituída ou simples ouradical heterocíclico, ou aromático heterocíclico.Modalidades preferidas de fórmula (III) incluem compostos defórmula (III) em que (a) Ri é metila, R2 é H e Z é H, (b) Ri e R2 são metila eZ é H, (c) Ri é metila, R2 é H, e Z é -SCH3, e (d) Ri e R2 são metila, e Z é -SCH3.
Tais maitansinas adicionais incluem compostos representadospela fórmula (IV-L), (IV-D), ou (IV-D1L):
<formula>formula see original document page 21</formula>
Em que Y representa(CR7R8)I(CR5R6)m(CR3R4)nCRiR2SZ,em que R1 e R2 são cada qual independentemente H, alquila linear, ou al-quenila tendo de 1 a 10 átomos de carbono, preferivelmente CH3 ou C2H5,alquenila ou alquila cíclica ou ramificada tendo de 3 a 10 átomos de carbono,fenila, fenila substituída, ou radical heterocíclico ou aromático heterocíclico,
em que R3, R4, R5, R6, R7, e R3 são cada qual independentemen-te H, alquenila ou alquila Iinear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, preferi-velmente CH3 ou C2H5, alquenila ou alquila cíclica ou ramificada tendo de 3 a10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída, ou radical heterocíclico ouaromático heterocíclico,
em que I, m, e η são cada qual independentemente um númerointeiro de 1 a 5, e além disso η pode ser zero,
em que Z é H, SR, ou COR em que R é metila, alquenila ou al-quila linear ou ramificada tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquenila oualquila cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, ou arila substituída ousimples ou radical heterocíclico ou aromático heterocíclico, e
em que May representa um maitansinóide que transporta a ca-deia lateral em C-3, C-14 hidroximetila, C-15 hidróxi, ou C-20 desmetila.
Modalidades preferidas de fórmulas (IV-L), (IV-D) e (IV-D1L) in-cluem compostos de fórmulas (IV-L), (IV-D) e (IV-D1L) em que (a) Ri é H, R2é metila, R5, R6, R7 , e R8 são cada qual H1Iem são cada qual 1, η é 0, e Zé H, (b) Ri e R2 são metila, R5, R6, R7, R8 são cada qual Η, I e m são 1, η é0, e Z é Η, (c) Ri é H1 R2 é metila, R5, Re. R7, e R8 são cada qual Η, I e msão cada qual 1, η é 0, e Z é -SCH3, ou (d) R1 e R2 são metila, R5, Re, R7, Resão cada qual HJem são 1, η é 0, e Z é -SCH3.
Preferivelmente o agente citotóxico é representado pela fórmula (IV-L).
Maitansinas preferidas adicionais também incluem compostosrepresentados pela fórmula (V):
<formula>formula see original document page 22</formula>
em que Y representa (CR7R8)I(CR5R6)m(CR3R4)nCRiR2SZ,
em que R1 e R2 são cada qual independentemente H, alquilalinear, ou alquenila tendo de 1 a 10 átomos de carbono, preferivelmente CH3ou C2H5, alquenila ou alquila cíclica ou ramificada tendo de 3 a 10 átomos decarbono, fenila, fenila substituída ou radical heterocíclico ou aromático hete-rocíclico, em que R3, R4, R5, Re, R7, e R8 são cada qual independentementeH, alquenila ou alquila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, preferivel-mente CH3 ou C2H5, alquenila ou alquila cíclica ou ramificada tendo de 3 a10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída, ou radical heterocíclico ouaromático heterocíclico,
em que l, m, e η são cada qual independentemente um númerointeiro de 1 a 5, e além disso η pode ser zero, e
em que Z é H, SR ou -COR, em que R é metila, alquenila ou al-quila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquenila ou alquila cíclicaou ramificada tendo de 3 a 10 átomos de carbono, ou arila substituída ousimples ou radical heterocíclico ou aromático heterocíclico.
Modalidades preferidas de fórmula (V) incluem compostos defórmula (V) em que (a) Ri é H1 R2 é metila, R5, R6, R7, e R8 são cada qual H;
l e m são cada qual 1; η é 0; e Z é H1 (b) Ri e R2 são metila; R5, R6, R7, Rssão cada qual Η, I e m são 1; η é 0; e Z é H, (c) Ri é H, R2 é metila, R5, R6,R7, e R8 são cada qual H1Iem são cada qual 1, η é 0, e Z é -SCH3, ou (d)R1 e R2 são metila, R5, R6, R7, Re são cada qual Η, I e m são 1, η é 0, e Z é -SCH3.
Ainda outras maitansinas preferidas incluem compostos repre-sentados pela fórmula (Vl-L), (Vl-D), ou (VI-D1L):
<formula>formula see original document page 23</formula>
em que Y2 representa (CR7R8)I(CR5R6)m(CR3R4)nCR1 R2SZ2,
em que Ri e R2 são cada qual independentemente alquenila oualquila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, preferivelmente CH3 ouC2H5, alquenila ou alquila cíclica ou ramificada tendo de 3 a 10 átomos decarbono, fenila, fenila substituída ou radical heterocíclico ou aromático hete-rocíclico, e em que R2 também pode ser H,
em que R3, R4, R5, R6, R7, e R8 são cada qual independentemen-te H, alquenila ou alquila cíclica linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono,preferivelmente CH3 ou C2H5, alquenila ou alquila cíclica ou ramificada tendode 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical heterocícli-co ou aromático heterocíclico,
em que I, m, e η são cada qual independentemente um númerointeiro de 1 a 5, e além disso η pode ser zero,
em que Z2 é SR ou COR, em que R é alquenila ou alquila lineartendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquenila ou alquila cíclica ou ramificadatendo de 3 a 10 átomos de carbono, ou arila substituída ou simples ou radi-cal heterocíclico ou aromático heterocíclico, eem que May é um maitansinóide.
Maitansinas preferidas adicionais incluem compostos represen-tados pela fórmula (VII):
<formula>formula see original document page 24</formula>
em que Y2· representa (CR7R8)i(CR9=CRio)p(C=C)qA0(CR5R6)mDu-(CR11=CR12)r(C=C)SBt(CR3R4)nCRiR2SZ2,
em que Ri e R2 são cada qual independentemente H, alquenilaou alquila linear ou ramificada tendo de 1 a 10 átomos de carbono, preferi-velmente CH3 ou C2H5, alquenila ou alquila cíclica tendo de 3 a 10 átomosde carbono, fenila, fenila substituída ou radical heterocíclico ou aromáticoheterocíclico, em que A, B, e D cada qual independentemente é cicloalquilaou cicloalquenila tendo 3 a 10 átomos de carbono, arila substituída ou sim-ples, ou radical heterocíclico ou aromático heterocíclico,
em que R3, R4, R5, R6, R7, Re, Rg, Rio, Rn, e Ri2 são cada qualindependentemente H, alquenila ou alquila linear tendo de 1 a 10 átomos decarbono, preferivelmente CH3 ou C2H5, alquenila ou alquila cíclica ou ramifi-cada tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radicalheterocíclico ou aromático heterocíclico,
em que I, m, n, o, p, q, r, s, t, e u são cada qual independente-mente zero ou um número inteiro de 1 a 5, contanto que pelo menos dois deI, m, n, o, p, q, r, s t, e u não sejam zero ao mesmo tempo, e
em que Z2 é SR ou -COR, em que R é alquenila ou alquila lineartendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquenila ou alquila cíclica ou ramificadatendo de 3 a 10 átomos de carbono, ou arila substituída ou simples ou radi-cal heterocíclico ou aromático heterocíclico.
Modalidades preferidas de fórmula (VII) incluem compostos defórmula (VII), em que Ri é metila e R2 é H.
Além dos maitansinóides, o agente citotóxico usado no imuno-conjugado pode ser um taxano ou derivado do mesmo. Taxanos são umafamília de compostos que inclui paclitaxel (Taxol®), um produto natural cito-tóxico, e docetaxel (Taxotere®), um derivado semi-sintético, que são ambosamplamente usados no tratamento de câncer. Taxanos são venenos de fusomitótico que inibem a despolimerização de tubulina, resultando em mortecelular. Ao mesmo tempo que docetaxel e paclitaxel são agentes úteis notratamento de câncer, sua atividade antitumor é limitada por causa de suatoxicidade não específica com relação às células normais. Além disso, com-postos tipo paclitaxel e docetaxel por si próprios não são suficientementepotentes para serem usados em imunoconjugados.
Um taxano preferido para uso na preparação de um imunocon-jugado citotóxico é o taxano de fórmula (VIII):
<formula>formula see original document page 25</formula>
Métodos para sintetizar taxanos que podem ser usados no con-texto da invenção, juntamente com métodos para conjugar taxanos aos a-gentes de ligação à célula tais como anticorpos, são descritos em detalhesna Patente dos Estados Unidos n9s 5.416.064, 5.475.092, 6.340.701,6.372.738, 6.436.931, 6.596.757, 6.706.708, e 6.716.821, e na Publicaçãode Pedido de Patente dos Estados Unidos n- 2004/0.024.049 A1.O agente citotóxico também pode ser CC-1065 ou um derivadodo mesmo. CC-1065 é um potente antibiótico anti-tumor isolado do caldo decultura de Streptomyces zelensis. CC-1065 é cerca de 1000 vezes mais po-tente in vitro do que fármacos anticâncer comumente usados, tais como do-xorrubicina, metotrexato, e vincristina (Bhuyan e outro, Câncer Res., 42:3532-3537 (1982)). CC-1065 e seus análogos são descritos na Patente dosEstados Unidos nQs 5.585.499, 5.846.545, 6.340.701, e 6.372.738. A potên-cia citotóxica de CC-1065 foi correlacionada com sua atividade de alquilaçãoe sua atividade de intercalação de DNA ou ligação de DNA. Estas duas ati-vidades residem em partes separadas da molécula. Neste respeito, a ativi-dade de alquilação está contida na subunidade de ciclopropapirroloindol(CPI) e a atividade de ligação de DNA reside nas duas subunidades de pirro-Ioindol de CC-1065.
Diversos análogos de CC-1065 são conhecidos na técnica etambém podem ser usados como o agente citotóxico no imunoconjugado(veja, por exemplo, Warpehoski e outro, J. Med. Chem., 31: 590-603 (1988)).Uma série de análogos de CC-1065 foi desenvolvida na qual a porção deCPI é substituída por uma porção de ciclopropabenzindol (CBI) (Boger e ou-tro, J. Org. Chem., 55: 5823-5833 (1990), e Boger e outro, Bioorg. Med.Chem. Lett., 1: 115-120 (1991)). Estes análogos de CC-1065 mantêm a ele-vada potência in vitro do fármaco de origem, sem causar toxicidade retarda-da em camundongos. Similar a CC-1065, estes compostos são agentes dealquilação que covalentemente ligam-se à menor ranhura de DNA para cau-sar morte celular.
A eficácia terapêutica de análogos de CC-1065 pode ser gran-demente melhorada alterando-se a distribuição in vivo através da liberaçãoalvejada para um sítio de tumor, resultando em toxicidade inferior aos teci-dos não marcados, e desse modo, toxicidade sistêmica inferior. Para estafinalidade, conjugados de análogos e derivados de CC-1065 com agentes deligação à célula que especificamente alvejam células de tumor foram gera-dos (veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos n9s 5.475.092,5.585.499, e 5.846.545). Estes conjugados tipicamente exibem citotoxicida-de específica ao alvo elevada in vitro, e atividade antitumor em modelos dexenoenxerto de tumor humano em camundongos (veja, por exemplo, Chari eoutro, CancerRes., 55: 4079-4084 (1995)).
Métodos para sintetizar análogos de CC-1065 são descritos emdetalhes na Patente dos Estados Unidos n5s 5.475.092, 5.585.499,5.846.545, 6.534.660, 6.586.618, e 6.756.397 e Publicação de Pedido dePatente dos Estados Unidos nQ 2003/0.195.365 A1.
Fármacos tais como metotrexato, daunorrubicina, doxorrubicina,vincristina, vinblastina, melfalan, mitomicina C, clorambucil, caliqueamicina,tubulisina e análogos de tubulisina, duocarmicina e análogos de duocarmici-na, dolastatina e análogos de dolastatina também podem ser usados no con-texto da invenção. Compostos de doxarrubicina e daunorrubicina (veja, porexemplo, Patente dos Estados Unidos nQ 6,630,579) podem também ser u-sados como o fármaco.
Os imunoconjugados podem ser preparados por métodos in vi-tro. A fim de ligar um fármaco ou pró-fármaco ao anticorpo, um grupo de li-gação é usado. Grupos de ligação adequados são bem conhecidos na técni-ca e incluem grupos dissulfeto, grupos lábeis de ácido, grupos fotolábeis,grupos lábeis de peptidase, e grupos lábeis de esterase. Grupos de ligaçãopreferidos são grupos dissulfeto. Por exemplo, imunoconjugados podem serconstruídos empregando-se uma reação de permuta de dissulfeto entre oanticorpo e o fármaco ou pró-fármaco. As moléculas de fármaco tambémpodem ser ligadas a um anticorpo através de uma molécula veículo interme-diária tal como albumina de soro.
O anticorpo pode ser modificado por reação com um reagentede reticulação bifuncional, desse modo resultando na ligação covalente deuma molécula Iigadora ao anticorpo. Como empregado aqui, um "reagentede reticulação bifuncional" é qualquer porção química que covalentementeliga um agente de ligação à célula a um fármaco, tais como os fármacosdescritos aqui. Em uma modalidade preferida da invenção, uma parcela daporção de ligação é fornecida pelo fármaco. Neste respeito, o fármaco com-preende uma porção de ligação que é parte de uma molécula Iigadora maiorque é usada para unir o anticorpo ao fármaco. Por exemplo, para formar omaitansinóide DM1, a cadeia lateral no grupo C-3 hidroxila de maitansina émodificado para ter um grupo sulfidrila livre (SH). Esta forma tiolada de mai-tansina pode reagir com um anticorpo modificado para formar um imunocon-jugado. Portanto, o ligante final é agrupado de dois componentes, um dosquais é fornecido pelo reagente de reticulação, enquanto o outro é fornecidopela cadeia lateral de DM1.
Qualquer reagente de reticulação bifuncional adequado pode serusado com relação à invenção, contanto que o reagente ligante provenha aretenção do produto terapêutico, por exemplo, citotoxicidade, e característi-cas de marcação do fármaco e do anticorpo, respectivamente. Preferivel-mente, a molécula ligadora une o fármaco ao anticorpo através de ligaçõesquímicas (como descrito acima), de modo que o fármaco e o anticorpo sejamquimicamente acoplados (por exemplo, covalentemente ligados) um ao ou-tro. Preferivelmente, o reagente de ligação é um ligante clivável. Mais prefe-rivelmente, o Iigante é clivado sob condições suaves, isto é, condições den-tro de uma célula sob as quais a atividade do fármaco não é afetada. Exem-plos de Iigantes cliváveis adequados incluem Iigantes de dissulfeto, Iiganteslábeis de ácido, Iigantes fotolábeis, Iigantes lábeis de peptidase, e Iiganteslábeis de esterase. Ligantes contendo dissulfeto são Iigantes cliváveis atra-vés de permuta de dissulfeto, que podem ocorrer sob condições fisiológicas.Ligantes lábeis de ácido são ligantes cliváveis em pH ácido. Por exemplo,certos compartimentos intracelulares, tais como endossomos e lisossomos,têm um pH acídico (pH 4-5), e fornecem condições adequadas para clivarligantes lábeis de ácido. Ligantes fotolábeis são úteis na superfície corporale em muitas cavidades do corpo que são acessíveis à luz. Além disso, luzinfravermelha pode penetrar no tecido. Ligantes lábeis de peptidase podemser usados para clivar certos peptídeos dentro ou fora das células (veja porexemplo, Trouet e outro, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79: 626-629 (1982), eUmemoto e outro, Int. J. Câncer, 43: 677-684 (1989)).
Preferivelmente, o fármaco é ligado a um anticorpo através deuma ligação de dissulfeto. A molécula Iigadora compreende um grupo quími-co reativo que pode reagir com o anticorpo. Grupos químicos reativos prefe-ridos para reação com o anticorpo são ésteres de N-succinimidila e ésteresde N-sulfossuccinimidila. Adicionalmente a molécula Iigadora compreendeum grupo químico reativo, preferivelmente um grupo ditiopiridila, que podereagir com o fármaco para formar uma ligação de dissulfeto. Moléculas Iiga-doras particularmente preferidas incluem, por exemplo, 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidila (SPDP) (veja, por exemplo, Carls-son e outro, Biochem. J., 173: 723-737 (1978)), 4-(2-piridilditio)butanoato deN-succinimidila (SPDB) (veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos nQ4.563.304), e 4-(2-piridilditio)pentanoato de N-succinimidila (SPP) (veja, porexemplo, número de Registro CAS 341498-08-6).
Ao mesmo tempo que Iigantes cliváveis preferivelmente são u-sados no método inventivo, um Iigante não clivável também pode ser usadopara gerar o imunoconjugado descrito acima. Um Iigante não clivável é qual-quer porção química que é capaz de ligar um fármaco, tal como um maitan-sinóide, um taxano, ou um análogo de CC-1065, a um agente de ligação àcélula, tal como um anticorpo, de uma maneira covalente, estável. Dessemodo, ligantes não cliváveis são substancialmente resistentes à clivageminduzida por ácido, clivagem induzida por luz, clivagem induzida por peptida-se, clivagem induzida por esterase, e clivagem de ligação de dissulfeto, emcondições sob as quais o fármaco ou o anticorpo permanece ativo.
Reagentes de reticulação adequados que formam Iigantes nãocliváveis entre um fármaco e um agente de ligação à célula são bem conhe-cidos na técnica. Exemplos de Iigantes não cliváveis incluem Iigantes tendouma porção de éster de N-succinimidila ou éster de N-sulfosuccinimidila parareação com o agente de ligação à célula, bem como uma porção com baseem maleimido ou haloacetila para reação com o fármaco. Reagentes de reti-culação compreendendo uma porção com base em maleimido incluem 4-(maleimidometil)cicloexanocarboxilato de N-succinimidila (SMCC), N-succinimidil-4-(N-maleimidometil)-cicloexano-1-carbóxi-(6-amidocaproato),que é um análogo de "cadeia longa" de SMCC (LC-SMCC), éster de N-succinimidila de ácido κ-maleimidoundecanóico (KMUA), éster de N-succinimidila de ácido γ-maleimidobutírico (GMBS), éster de N-hidroxissuccinimida de ácido ε-maleimidocapróico (EMCS)1 éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxissuccinimida (MBS), éster de N-(D-maleimidoacetóxi)-succinimida (AMAS), succinimidil-6-(B-maleimidopropionamido)hexanoato (SMPH), 4-(p-maleimidofenil)-butirato deN-succinimidila (SMPB), e N-(p-maleimidofenil)isocianato (PMPI). Reagentesde reticulação compreendendo uma porção com base em haloacetila inclu-em N-succinimidil-4-(iodoacetil)-aminobenzoato (SIAB)1 iodoacetato de N-succinimidila (SIA), bromoacetato de N-succinimidila (SBA), e 3-(bromoacetamido)propionato de N-succinimidila (SBAP).
Outros reagentes de reticulação que não têm um átomo de en-xofre que forma Iigantes não cliváveis podem também ser usados no métodoinventivo. Tais Iigantes podem ser derivados de porções com base em ácidodicarboxílico. Porções com base em ácido dicarboxílico adequadas incluem,porém não são limitadas a, ácidos α,ω-dicarboxílicos da fórmula geral (IX):
<formula>formula see original document page 48</formula>
em que X é um grupo alquila, alquenila, ou alquinila linear ou ramificado ten-do 2 a 20 átomos de carbono, Y é um grupo cicloalquila ou cicloalquenilatransportando 3 a 10 átomos de carbono, Z é um grupo aromático substituí-do ou não substituído transportando 6 a 10 átomos de carbono, ou um grupoheterocíclico substituído ou não substituído em que o heteroátomo é sele-cionado de Ν, O ou S, e em que I, m, e η são cada qual 0 ou 1, contanto queI, m, e η sejam todos não zero ao mesmo tempo.
Muitos dos Iigantes não cliváveis descritos aqui são descritos emdetalhes na Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos n- 2005-0169933 A1.
Alternativamente, como descrito na Patente dos Estados UnidosnQ 6.441.163 B1, o fármaco pode ser primeiro modificado para introduzir uméster reativo adequado para reagir com um anticorpo. Reação dos mesmosmaitansinóides contendo uma porção Iigadora ativada com um anticorpo for-nece outro método de produção de um conjugado anticorpo-maitansinóideclivável ou não clivável.
Processos para a fabricação de tais composições farmacêuticasenvolvem troca de tampão do produto farmacêutico de carga em tampão deformulação apropriado por cromatografia ou diafiltração e em seguida adiçãode excipientes apropriados em quantidade desejada, ou como solução oucomo sólido. Ajuste final da concentração de proteína e/ou pH pode tambémser realizado para obter a composição desejada.
Os imunoconjugados da invenção são administrados ao pacientena forma de uma formulação farmacêutica descrita neste pedido e um veícu-lo, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável portanto. Como em-pregado, "farmaceuticamente aceitável" refere-se àqueles agentes que sãoúteis no tratamento ou diagnóstico de mamíferos, preferivelmente ser huma-no. O modo preferido de administração é parenteralmente, particularmentepela via intravenosa, intramuscular, subcutânea, intraperitoneal, ou intralinfá-tica. Veja, por exemplo Remington1S Pharmaceutical Sciences, 16ã ed., 1980,Mack Publishing Company, editado por Osol e outros. Tais composições po-dem incluir proteínas, tais como proteínas de soro, por exemplo, albumina desoro humano, tampões ou substâncias de tamponamento tais como fosfatos,outros sais, ou eletrólitos, e similares. Diluentes adequados podem incluir,por exemplo, água estéril, salina isotônica, dextrose aquosa diluída, um ál-cool poliídrico ou misturas de tais álcoois, por exemplo, glicerina, propilenoglicol, polietileno glicol e similares. As formulações podem conter conservan-tes tais como álcool de fenetila, metil e propil parabenos, e similares. Se de-sejado, a formulação pode incluir 0,05 a cerca de 0,20 percentual por pesode um antioxidante.
A administração pode ser por meio de qualquer via conhecidaser eficaz pelo médico de experiência ordinária. Administração parenteral épreferida. Vias parenterais preferidas para administração das formulações dapresente invenção incluem intravenosa, intramuscular, subcutânea, intraperi-toneal, intra-arterial. Vias intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, e sub-cutânea de administração dos compostos usados na presente invenção sãovias parenterais mais preferidas de administração. Vias intravenosa, intrape-ritoneal, e subcutânea de administração das formulações da presente inven-ção são ainda mais altamente preferidas.
Administração por meio de certas vias parenterais pode envolverintrodução das formulações da presente invenção no corpo de um pacienteatravés de uma agulha ou um catéter. Opcionalmente, tal administração po-de ser propelida por uma seringa estéril ou algum outro dispositivo mecânicotal como um sistema de infusão contínua. Uma formulação fornecida pelapresente invenção pode ser administrada empregando-se uma seringa, inje-tar, bomba, ou qualquer outro dispositivo ou por gravidade reconhecido natécnica para administração parenteral. A formulação pode ser administradaparenteralmente, em formas de dosagem líquidas estéreis. Esta formulaçãopode ser administrada intravenosamente como uma infusão em bolus ourápida, que pode, além de seu efeito terapêutico, diagnóstico ou medicinaldesejado, causar a liberação de imunoconjugado.
Os imunoconjugados da invenção são eficazes durante umaampla faixa de dosagem dependendo de fatores tais como o estado da do-ença a ser tratada ou o efeito biológico a ser modificado, a maneira da qual oimunoconjugado é administrado, a idade, peso e condição do paciente bemcomo outros fatores a ser determinados pelo médico que está realizando otratamento. Desse modo, a quantidade administrada a qualquer determinadopaciente pode ser determinada em uma base individual.
A quantidade de uma formulação da presente invenção que éadministrada para tratar um paciente pode depender de vários fatores, entreos quais são inclusos, sem limitação, o sexo, peso e idade do paciente, acausa subjacente da condição ou doença a ser tratada, a via de administra-ção e biodisponibilidade, a persistência do imunoconjugado administrado nocorpo, a formulação, e a potência do imunoconjugado. Onde a administraçãoé intermitente, a quantidade por administração deve também levar em consi-deração o intervalo entre as doses, e a biodisponibilidade do imunoconjuga-do da formulação. A administração da formulação da presente invenção po-de ser contínua. Inclui-se na experiência ordinária do médico titular a dose etaxa de infusão ou freqüência de administração da formulação da presenteinvenção para obter o resultado clínico desejado.
A dosagem administrada, evidentemente, variará dependendodos fatores conhecidos tais como as características farmacodinâmicas doagente particular, e seu modo e via de administração; idade, saúde, e pesodo recipiente; natureza e extensão dos sintomas, tipo de tratamento simultâ-neo, freqüência de tratamento, e o efeito desejado. Usualmente uma dosa-gem diária de composto terapeuticamente significante pode ser cerca de 0,1a 100 miligramas por quilograma de peso corporal.
Formas de dosagem adequadas para administração interna con-têm de cerca de 1 miligrama a cerca de 500 miligramas de composto tera-peuticamente significante por unidade. Nestas composições farmacêuticas ocomposto terapeuticamente significante ordinariamente estará presente emuma quantidade de cerca de 0,05-2% por peso em uma formulação líquida e2-50% na formulação Iiofilizada antes da reconstituição baseada no pesototal da composição.
A presente invenção também provê um pó Iiofilizado da formula-ção descrita acima. Preferivelmente, a formulação Iiofilizada compreende umou mais componentes adicionais, tais como um agente de carga e/ou Iiopro-tetor. O pó Iiofilizado pode ser reconstituído com água para criar uma solu-ção reconstituída. A presente formulação pode ser Iiofilizada e reconstituídacomo descrito no Pedido de Patente dos Estados Unidos n9 2004/0.241.174A1, cuja descrição é por meio do mesmo incorporada por referência, e quedescreve formulações Iiofilizadas compreendendo imunoconjugados.
Antes da reconstituição da composição liofilizada, as quantida-25 des relativas de cada componente compreendendo a composição liofilizadainventiva podem ser descritas em termos de mg de excipiente (por exemplo,tampão, tensoativo, agente de carga, crioprotetor) por mg de conjugado.
Ao mesmo tempo que qualquer agente de tamponamento ade-quado descrito aqui pode ser empregado com relação à composição Iiofiliza-30 da inventiva, a composição liofilizada preferivelmente compreende um tam-pão de succinato de sódio. O agente de tamponamento pode estar presentena composição liofilizada inventiva em qualquer quantidade adequada. Emparticular, a composição Iiofilizada desejavelmente compreende cerca de 0,1mg a cerca de 2 mg do agente de tamponamento por mg do conjugado (porexemplo, cerca de 0,1 mg a cerca de 0,5 mg de agente de tamponamentopor mg do conjugado, cerca de 0,5 mg a cerca de 1 mg de agente de tam-ponamento por mg do conjugado, ou cerca de 1 mg a cerca de 2 mg de a-gente de tamponamento por mg do conjugado). Mais preferivelmente, acomposição liofilizada compreende cerca de 0,3 mg de tampão de succinatode sódio por mg do conjugado.
A composição liofilizada desejavelmente compreende cerca de0,005 mg a cerca de 0,1 mg de polissorbato por mg do conjugado, e preferi-velmente cerca de 0,005 mg a cerca de 0,01 mg de polissorbato por mg doconjugado, 0,01 mg a cerca de 0,05 mg de polissorbato por mg do conjuga-do, ou cerca de 0,05 mg de polissorbato a cerca de 0,1 mg de polissorbatopor mg do conjugado. Quando o polissorbato for polissorbato 20, a composi-ção liofilizada preferivelmente compreenderá cerca de 0,02 mg de polissor-bato 20 por mg do conjugado.
A fim de prevenir a degradação dos ingredientes ativos da com-posição durante congelamento e secagem, a composição liofilizada inventivatambém compreende um crioprotetor, preferivelmente um crioprotetor amor-fo. O termo "crioprotetor", como empregado aqui, refere-se a um excipienteque protege moléculas instáveis durante o congelamento. Crioprotetoresadequados para uso na composição Iiofilizada são conhecidos por aquelesversados na técnica, e incluem, por exemplo, glicerol, sulfóxido de dimetila(DMSO), polietileno glicol (PEG), dextrano, glicose, trealose, e sacarose.Mais preferivelmente, o crioprotetor é sacarose. O crioprotetor pode estarpresente na composição Iiofilizada inventiva em qualquer quantidade ade-quada. A composição Iiofilizada desejavelmente compreende cerca de 0,5mg a cerca de 5 mg, por exemplo, cerca de 0,5 mg a cerca de 2 mg do crio-protetor por mg do conjugado, cerca de 0,8 mg de crioprotetor por mg doconjugado, cerca de 2 mg de crioprotetor por mg do conjugado, ou cerca de4 mg de crioprotetor por mg do conjugado. Quando o crioprotetor for sacaro-se, a composição Iiofilizada preferivelmente compreenderá cerca de 0,5 mga cerca de 2 mg (por exemplo, cerca de 1 mg) de sacarose por mg do conjugado.
A composição Iiofilizada pode também conter um agente de car-ga, preferivelmente um agente de carga cristalizável. Agentes de carga tipi-camente são empregados na técnica para fornecer estrutura e peso à "mas-sa" produzida como um resultado de liofilização. Qualquer agente de cargaadequado conhecido na técnica pode ser empregado com relação à compo-sição Iiofilizada inventiva. Agentes de carga adequados incluem, por exem-plo, manitol, dextrano, e glicina. O agente de carga empregado na composi-ção inventiva mais preferivelmente é glicina. A composição Iiofilizada podeconter qualquer quantidade adequada do agente de carga, porém preferi-velmente a composição Iiofilizada compreende cerca de 2 mg a cerca de 20mg do agente de carga por mg do conjugado, e preferivelmente cerca de 2mg a cerca de 10 mg de agente de carga por mg do conjugado, cerca de 5mg a cerca de 10 mg de agente de carga por mg do conjugado, cerca de 10mg a cerca de 15 mg de agente de carga por mg do conjugado, ou cerca de15 mg a cerca de 20 mg de agente de carga por mg do conjugado. Quandoo agente de carga for glicina, a composição Iiofilizada preferivelmente com-preenderá cerca de 3,8 mg de glicina por mg do conjugado.
Desse modo, de acordo com a invenção, os conteúdos de umacomposição Iiofilizada que deve ser reconstituída para conter 5 mg/mL deconjugado (por exemplo, preferivelmente um conjugado compreendendohuN901 quimicamente acoplado a DM1) preferivelmente compreendem (i)cerca de 0,3 mg de tampão de succinato de sódio por mg do conjugado, (ii)cerca de 0,02 mg de polissorbato 20 por mg do conjugado, (iii) cerca de 1mg de sacarose por mg do conjugado, e (iv) cerca de 3,8 mg de glicina pormg do conjugado. Assim que reconstituída com água, uma tal composiçãoIiofilizada preferivelmente tem um pH de cerca de 5,5. Além disso, quando acomposição Iiofilizada for reconstituída com água, as descrições das concen-trações relativas dos excipientes mencionados acima com relação à formu-lação líquida são aplicáveis à composição Iiofilizada supracitada.
Métodos de liofilização são bem conhecidos na técnica e sãodescritos em, por exemplo, Wang, W., Int. J. Pharm., 203, 1-60 (2000). Porexemplo, a composição Iiofilizada inventiva pode ser produzida empregando-se um ciclo de liofilização compreendendo as seguintes etapas: (1) pré-resfriamento em uma temperatura de prateleira de 4°C e pressão de câmaraambiente durante 2,5 horas, (2) congelamento em uma temperatura de pra-teleira de -50°C e pressão de câmara ambiente durante 14 horas, (3) recris-talização de glicina em uma temperatura de prateleira de -20°C e pressão decâmara ambiente durante 6 horas, (4) recongelamento em uma temperaturade prateleira de -50°C e pressão de câmara ambiente durante 16 horas, (5)secagem primária em uma temperatura de prateleira de -13°C e 13,33 Pa(100 mTorr) de pressão durante 24 horas, (6) secagem secundária em umatemperatura de prateleira de 24°C e 13,33 Pa (100 mTorr) de pressão duran-te 10 horas, e (7) fase de interrupção em uma temperatura de prateleira de24°C e pressão de câmara ambiente. A composição liofilizada, entretanto,não é limitada às composições produzidas pelo método descrito acima. Defato, qualquer método de liofilização adequado pode ser empregado paraproduzir a composição liofilizada, e será evidente para aqueles versados natécnica que os parâmetros de liofilização escolhidos (por exemplo, temposde secagem) variarão dependendo de uma variedade de fatores, incluindo ovolume da solução a ser liofilizada.
Em outra modalidade, a presente invenção é direcionada a umestojo para preparação de uma formulação aquosa, cujo kit contém tanto umprimeiro recipiente contendo um pó Iiofilizado quanto um segundo recipientecontendo uma formulação aquosa compreendendo um estabilizante de re-constituição. A concentração do pó Iiofilizado na solução, o volume de solu-ção que é carregado em cada recipiente, e a capacidade dos recipientes sãotodos parâmetros interrelacionados que podem ser adequadamente modifi-cados, dependendo da concentração desejada de princípio ativo na unidadede dosagem final. Desse modo, estes parâmetros podem variar dentro deamplas faixas.
Todas as patentes, publicações, e outras referências citadas a-qui são expressamente incorporadas por referência em suas totalidades.A presente invenção é também descrita pelos seguintes exem-plos, que são ilustrativos do processo e não devem ser construídos comolimitantes da invenção. Os parâmetros do processo fornecidos abaixo podemser adotados e adaptados pela pessoa experiente para satisfazer a necessi-dade particular.
EXEMPLO 1
Este exemplo mostra o efeito dos seguintes excipientes de for-mulação sobre a aparência visual de amostras de conjugado MAb-DMI for-muladas.
Amostras de huN901-SPP-DM1 foram estabelecidas em 1,0mg/mL em 10 mM de tampão de fosfato pH 6,5 com 140 mM de NaCl comcada dos excipientes listados abaixo. Os excipientes foram adicionados dire-tamente à amostra de huN901-SPP-DM1 em uma base peso/peso % (pesodo excipiente / peso da solução). Imediatamente após a adição do excipien-te, as formulações foram filtradas, e testes de contagem de partícula e apa-rência foram realizados. As amostras foram em seguida armazenadas a 4°Cdurante o tempo do estudo, e foram testadas novamente em pontos de tem-po de 2 semanas e 1 mês. Quanto à aparência, as amostras foram testadasexaminando-se pelo menos 1,0 ml_ de solução em comparação com umabase branca quanto à claridade e em comparação com uma base preta sobluz branca quanto à presença ou ausência de partículas visíveis. Os resulta-dos são relatados como presença ou ausência de partículas visíveis. Partí-culas subvisíveis com o tamanho acima de 5 Gm foram também medidascom uma registradora de partícula HIAC calibrada para medir o tamanho dapartícula entre 2 e 100 μηι.Aparência:
<table>table see original document page 38</column></row><table>
* filtrado concisamente antes do ponto de tempo inicialContagem de partícula (contas > 5 Dm por mL):
<table>table see original document page 38</column></row><table>
Efeitos positivos de sacarose, TWEEN-20®, beta-ciclodextrina,dextrose, glicerol, manitol e polietileno glicol (PEG) foram observados.
EXEMPLO 2
Este exemplo mostra o efeito de aminoácidos sobre a estabilida-de de huN901-SPP-DM1 com respeito à agregação de conjugado.
Amostras de huN901-SPP-DM1 foram estabelecidas em 5,0mg/mL nos seguintes tampões e armazenadas a 2-8 e 25°C durante 12 me-ses. O conteúdo de agregado de conjugado foi testado com um ensaio cro-matográfico em pontos de tempo de 1, 3, 6 e 12 meses.
(1) 10 mM de fosfato de sódio, 140 mM de NaCI, pH 6,5.
(2) 10 mM de citrato de sódio, 135 mM de NaCI, 0,01 % de po-Iissorbato 20, pH 5,5.
(3) 10 mM de citrato de sódio, 130 mM de histidina, 0,01 % depolissorbato 20, pH 5,5.
(4) 10 mM de citrato de sódio, 110 mM de glicina, 80 mM deNaCI, 0,01 % de polissorbato 20, pH 5,5.
<table>table see original document page 39</column></row><table>
Exemplo 1 mostra que histidina melhora a formulação com refe-rência à prevenção de formação de agregado de conjugado. Glicina tambémtem benefícios.
EXEMPLO 3
Este exemplo mostra o efeito de histidina sobre a estabilidade doconjugado huMy9-6-SPDB-DM4 em termos de agregado de conjugado.
O conjugado huMy9-6-SPDB-DM4 foi formulado em 5,0 mg/mLem:
(1) 10 mM de citrato de sódio, 135 mM de NaCI, pH 5,5
(2) 150 mM de histidina/cloreto de histidina, pH 5,5
As amostras foram incubadas a 2-8°C e 25°C durante 6 meses,após o que elas foram testadas quanto ao agregado de conjugado por umensaio cromatográfico.
<table>table see original document page 39</column></row><table>Os dados mostram os efeitos benéficos de histidina sobre a pre-venção de formação de agregado.
EXEMPLO 4
Este exemplo mostra o efeito de agente de tamponamento, açú-car e aminoácido sobre a estabilidade de huC242-SPDB-DM4 com respeitoao agregado de conjugado.
Amostras de huC242-SPDB-DM4 em 5,0 mg/mL em:
(1) 10 mM de citrato de sódio, 135mM de NaCI1 pH 5,5
(2) 10 mM de citrato de sódio, 5% de sacarose, 130 mM de glici-na, 0,1% de polissorbato 80, pH 5,5
(3) 10 mM de histidina/cloreto de histidina, 5% de sacarose, 130mM de glicina, pH 5,5
Teste para conteúdos de agregado e monômero de conjugadoforam realizados em T0, e após 3 meses de armazenagem em 2-8°C e 25°C.
<table>table see original document page 40</column></row><table>
Os dados mostram que sacarose e glicina, juntos na combina-ção acima, melhoram a formulação com referência à proteção contra agre-gação de conjugado. A maior melhora é observada quando a combinação desacarose e glicina é usada com histidina.
EXEMPLO 5
Este exemplo mostra o efeito de várias formulações contendosacarose com e sem glicina sobre o conteúdo de agregado do conjugadohuN901 -SPP-DM1.
Amostras de huN901-SPP-DM1 em concentração de 5,0 mg/mLem cada das seguintes formulações líquidas foram testadas quanto aos con-teúdos de monômero e agregado.
(1)10 mM de citrato de sódio, 135 mM de NaCI, 0,01 % de po-lissorbato 20, pH 5,5(2) 10 mM de citrato de sódio, 60 mM de NaCI, 5 % de sacarose,pH 5,5
(3) 10 mM de citrato de sódio, 60 mM de NaCI, 0,01 % de polis-sorbato 20, 5 % de sacarose, pH 5,5
(4) 10 mM de fosfato de sódio, 140 mM de NaCI, pH 6,5
(5) 10 mM de succinato de sódio, 0,25 M de glicina, 0,01 % depolissorbato 20, 0,5 % de sacarose, pH 5,5
As amostras armazenadas a 25°C foram testadas quanto aosconteúdos de agregado em pontos de tempo de 3, 6 e 12 meses.
Formulação Agregado (%) 3 meses 6 meses 12 mesesComposição 1 6,7 7,3 8,2Composição 2 5,2 5,7 6,2Composição 3 5,6 5,4 6,5Composição 4 10,0 10,4 11,8Composição 5 4,4 4,7 4,4
Em todos os casos as formulações contendo sacarose têm con-teúdo de agregado inferior àquelas sem sacarose. A formulação contendoglicina (composição 5) teve a melhor estabilidade neste exemplo.
EXEMPLO 6
Este exemplo mostra o efeito de polissorbato 80 sobre a forma-ção de partícula induzida por agitação. Esta condição de estresse (agitação)é suposta imitar os estresses encontrados durante expedição e manuseio doconjugado líquido, quando oposta aos estresses encontrados durante arma-zenagem estática (que são tratados no Exemplo 1).
Amostras de huC242-SPDB-DM4 foram estabelecidas em 1mg/mL nos seguintes tampões e colocadas em frasconetes de vidro USPTipo 1 (5mL em um frasconete de 10mL) que foram selados com Flurotec®Stoppers. Os frasconetes foram agitados durante 48 horas em 100 rpm emtemperatura ambiente, empregando-se um Agitador Orbital Lab-Line.
(1)10 mM de citrato de sódio, 135 mM de cloreto de sódio, pH5,5
(2) 10 mM de histidina, 5% de sacarose, 130 mM de glicina, pH5,5
(3) 10 mM de histidina, 5% de sacarose, 130 mM de glicina,0,1% de polissorbato 80, pH 5,5
(4) 10 mM de histidina, 1% de sacarose, 250 mM de glicina, pH 5,5
(5) 10 mM de histidina, 1% de sacarose, 250 mM de glicina,0,1% de polissorbato 80, pH 5,5
(6) 10 mM de histidina, 280 mM de glicina, pH 5,5
(7) 10 mM de histidina, 280 mM de glicina, 0,1% de polissorbato80, pH5,5
(8) 10 mM de histidina, 10% de sacarose, pH 5,5
(9) 10 mM de histidina, 10% de sacarose, 0,1% de polissorbato80, pH 5,5
Após agitação durante 48 horas, todos os frascos foram visual-mente inspecionados. Aqueles que continham polissorbato 80 (Composições3, 5, 7 e 9) permaneceram claros, ao passo que todos aqueles que não con-tinham polissorbato 80 (1, 2, 4, 6 e 8) ficaram turvos. Estes dados demons-tram o efeito benéfico de polissorbato 80 na redução de partículas devido àagitação, tal como pode ser encontrado durante expedição e manuseio doconjugado líquido.

Claims (21)

1. Formulação de imunoconjugado líquida, caracterizada pelofato de que compreende:(a) um imunoconjugado, em que o imunoconjugado é um anti-corpo compreendendo um ou mais pró-fármacos citotóxicos ligados covalen-temente; e(b) um ou mais excipientes selecionados do grupo consistindoem sacarose, polissorbato 20, polissorbato 80, ciclodextrina, dextrose, glice-rol, polietileno glicol, manitol, e um aminoácido,em que a formulação não compreende cloreto de sódio; eem que a formulação é uma solução aquosa tamponada tendoum pH de 4,5 a 7,6.
2. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que a formulação compreende um ou mais excipientes selecio-nados do grupo consistindo em:pelo fato de que a formulação compreende um ou mais excipientes selecio-nados do grupo consistindo em:(i) 5 -10% de sacarose,(ii) 0,005 - 0,2 % de polissorbato 20,(i) 0,1 -12% de sacarose,(ii) 0,005 - 1,0% de polissorbato 20,(iii) 0,5 - 2% de beta-ciclodextrina,(iv) 2 - 8% de glicerol,(v) 1 - 5% de PEG6000,(vi) 2 - 8% de manitol,(vii) 0,005 - 1,0% de polissorbato 80,(viii) 5-20 mM de histidina, e(ix) 100 - 300 mM de glicina.
3. Formulação de acordo com a reivindicação 2, caracterizada(iii) 0,5 -1% de beta - ciclodextrina,(iv) 2 - 5% de glicerol,(v) 2 - 3% de PEG6000,(vi) 3 - 5% de manitol,(vii) 0,005 - 0,2 % de polissorbato 80,(viii) 10-15 mM de histidina, e(ix) 130 - 250 mM de glicina.
4. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que a solução aquosa tamponada contém um ou mais de histi-dina, succinato, citrato, fosfato, e acetato.
5. Formulação de acordo com a reivindicação 4, caracterizadapelo fato de que o pH é de 5,0 a 7,0.
6. Formulação de acordo com a reivindicação 5, caracterizadapelo fato de que o pH é de 5,0 a 6,0.
7. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o imunoconjugado compreende um anticorpo humanizadoselecionado do grupo consistindo em huMy9 - 6, huC242, huN901, DS6,trastuzumab, bivatuzumab, sibrotuzumab, e rituximab.
8. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o imunoconjugado compreende um fármaco citotóxico sele-cionado do grupo consistindo em um maitansinóide, um taxano, e um CC - 1065.
9. Formulação de imunoconjugado líquida, caracterizada pelofato de que compreende:(a) um imunoconjugado, em que o imunoconjugado é um anti-corpo compreendendo um ou mais pró-fármacos citotóxicos ligados covalen-temente; e(b) um ou mais excipientes selecionados do grupo consistindoem histidina, sacarose e glicina,em que a formulação não compreende cloreto de sódio; eem que a formulação é uma solução aquosa tamponada tendoum pH de 4,5 a 7,6.
10. Formulação de acordo com a reivindicação 9, caracterizadapelo fato de que a formulação compreende um ou mais excipientes selecio-nados de 5 - 200 mM de histidina, 100 - 200 mM de glicina, e 2 - 8% de sa-carose.
11. Formulação de acordo com a reivindicação 10, caracterizadapelo fato de que o excipiente é 5 - 100 mM de histidina ou 100 - 150 mM deglicina.
12. Formulação de acordo com a reivindicação 9, caracterizadapelo fato de que a formulação contém 2 - 8% de sacarose e 100 - 150 mMde glicina.
13. Formulação de acordo com a reivindicação 12, caracterizadapelo fato de que a formulação contém 10 mM de histidina, 5% de sacarose e-130 mM de glicina.
14. Formulação de acordo com a reivindicação 9, caracterizadapelo fato de que a solução aquosa tamponada contém um ou mais de histi-dina, succinato, citrato, fosfato, e acetato.
15. Formulação de acordo com a reivindicação 14, caracterizadapelo fato de que o pH é de 5,0 a 7,0.
16. Formulação de acordo com a reivindicação 15, caracterizadapelo fato de que o pH é de 5,0 a 6,0.
17. Formulação de acordo com a reivindicação 9, caracterizadapelo fato de que também compreende polissorbato 20 e/ou polissorbato 80.
18. Formulação de acordo com a reivindicação 9, caracterizadapelo fato de que o imunoconjugado compreende um anticorpo humanizadoselecionado do grupo consistindo em huMy9 - 6, huC242, huN901, DS6,trastuzumab, bivatuzumab, sibrotuzumab, e rituximab.
19. Formulação de acordo com a reivindicação 9, caracterizadapelo fato de que o imunoconjugado compreende um fármaco citotóxico sele-cionado do grupo consistindo em um maitansinóide, um taxano, e um CC -1065.
20. Formulação de imunoconjugado, caracterizada pelo fato deque consiste essencialmente em:(a) imunoconjugado huN901 - DM1 em uma concentração de 0,5-10 mg/ml;(b) 5 -15 mM de histidina e/ou 5-15 mM de succinato;(c) 0,1 -10 % de sacarose e/ou 100 - 300 mM de glicina;(d) 0,005 - 0,2% de polissorbato 80 e/ou 0,005 - 0,2% de polis-sorbato 20,em que a formulação é uma solução tamponada aquosa tendoum pH de 5 - 6, e em que DM1 não é N2'-deacetil-N2'-(3-mercapto-1-oxopropil)-maitansina, e em que a formulação não contém cloreto de sódio.
21. Formulação de imunoconjugado, caracterizada pelo fato deque consiste essencialmente em:(a) imunoconjugado huC242 - DM4 em uma concentração de 0,5-10 mg/ml;(b) 5 -15 mM de histidina;(c) 0,1 -10 % de sacarose e/ou 100 - 300 mM de glicina;(d) 0,005 - 0,2% de polissorbato 80 e/ou 0,005 - 0,2% de polis-sorbato 20;em que a formulação é uma solução tamponada aquosa tendo um pH de 5 - 6, e em que DM4 não é N2'-deacetil-N2'-(4-metil-4-mercapto-1-oxopropil)-maitansina, e em que a formulação não contém cloreto de sódio.
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