TWI835880B - 含有標識部－抗人類抗體Ｆａｂ片段複合體之醫藥組成物 - Google Patents

Abstract

本發明的課題為提供含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之安定的醫藥組成物等。 其解決手段為於含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之醫藥組成物中，摻合檸檬酸、磷酸、2-[4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸，或參羥基甲基胺基甲烷作為緩衝劑；摻合蔗糖或甘油作為安定化劑，及摻合非離子性界面活性劑，且將pH調整為6.5~7.5。藉此，可抑制保存標識部-抗人類抗體Fab片段複合體時之多聚體或不溶性微粒子的產生。

Description

含有標識部－抗人類抗體Ｆａｂ片段複合體之醫藥組成物

本發明係關於含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之安定的醫藥組成物。特別是本發明係關於含有標識部-抗人類CEACAM5抗體Fab片段複合體，或標識部-抗人類MUC1抗體Fab片段複合體之安定的醫藥組成物。又，本發明亦關於含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之醫藥組成物之製造方法，及安定地保存標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之方法。

因基因重組技術之發達，利用免疫球蛋白、單株抗體、人類型化抗體等之抗體作為醫藥品係成為可能。例如為了診斷、治療癌，係使用結合有抗癌劑或金屬放射性同位素、螢光色素等之抗體。又，已知使用了抗體的靶向(targeting)，係對腫瘤細胞之特異性高、副作用少。在如此的背景下，至今為止已開發有經金屬放射性同位素標識之單株抗體等(專利文獻1)。

另一方面，一般而言抗體係血中半衰期長，對體內投予後，欲達到獲得使癌可見化所足夠的訊號對背景比之腫瘤對血液比，需要4日~5日之長期間(Clin. Pharmacol. Ther.；2010；87：586-592)。又，抗體之Fc區域，會引起抗體依賴性細胞毒性(Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity：ADCC)或補體依賴性細胞毒性(Complement-Dependent Cytotoxicity：CDC)之藥理作用(Glycoconj. J.；2013；30：227-236、Curr. Opin. Biotechnol.；2002；13：609-614)。進一步地，由於抗體係在肝臟代謝，故與標的無關地，會於肝臟高度累積，但大腸癌之早期轉移係侷限在肝臟，因此要藉由抗體來檢測大腸癌之肝轉移的病灶係困難的(Clin. Pharmacol. Ther.；2010；87：586-592)。

相對於此，如Fab般經低分子化之重組抗體片段，由於組織滲透性高，因此容易到達病灶，可期待以使用大腸菌或酵母之表現系統的低成本來製造，具有血中半衰期短、經腎排泄之特徵，故期待作為診斷藥之利用(Nat. Biotechnol.；2005；23：1126-1136)。

在如此的背景下，以癌的診斷為目的，利用經配位了金屬放射性同位素之Fab片段複合體或結合有螢光色素之Fab片段係受到探討。

又，將抗體安定地保存的方法，至今為止有許多探討。例如專利文獻2中，記載對含有人類型化C4C1 Fab片段之製劑，添加非離子性界面活性劑、糖類，將pH調整至特定範圍藉以安定化之方法。又，專利文獻3中，記載對含有抗IL-1β之人類抗體的製劑，添加緩衝劑，將pH調整至特定範圍藉以安定化之方法。 [先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]日本特表2013-510093號公報 [專利文獻2]國際公開第00/66160號公報 [專利文獻3]日本特表2012-511540號公報

一價之Fab片段，分子量為約50kDa，較分子量約150kDa之抗體為小，經腎排泄，血中半衰期亦短。又，由於無Fc區域，故亦不會引起ADCC或CDC。由於如此的特長，相較於抗體，經配位了金屬放射性同位素之Fab片段或結合有螢光色素之Fab片段，被期待作為診斷藥而更為有效。

但是，結合有配位子或螢光色素之Fab片段，係有因保存時之熱壓力或光壓力，而容易生成多聚體或不溶性微粒子之課題，或於使用前之融解/攪拌過程中生成不溶性微粒子之課題。又，以安定化為目的而於保存溶液中摻合各種化合物時，產生配位效率或螢光退色等問題等亦受到顧慮。

本發明之課題，為提供可抑制保存時產生多聚體或不溶性微粒子的含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之醫藥組成物等。又，本發明之課題亦為提供使用配位子作為標識部時，可抑制金屬放射性同位素對配位子之配位效率降低的含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之醫藥組成物，或提供使用螢光色素作為標識部時，可抑制螢光色素之退色的含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之醫藥組成物。

本發明者等人，對於含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之醫藥組成物的處方重複深入探討之結果，發現藉由摻合檸檬酸、磷酸、2-[4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸，或參羥基甲基胺基甲烷作為緩衝劑，摻合蔗糖或甘油作為安定化劑，進一步摻合非離子性界面活性劑，而成為pH6.5~7.5之醫藥組成物，可抑制標識部-抗人類抗體Fab片段複合體保存時之多聚體或不溶性微粒子的產生，且亦可抑制金屬放射性同位素對配位子之配位效率降低或螢光色素之退色，而完成本發明。

亦即，本發明為提供標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之保存安定性優良，且亦可抑制對標識部之金屬配位效率或標識螢光色素之退色的含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之醫藥組成物者，於其一態樣中，本發明可如以下所述。

[1]一種醫藥組成物，其係含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體、緩衝劑、安定化劑，及非離子性界面活性劑，且pH為6.5~7.5之醫藥組成物，其中 緩衝劑為包含檸檬酸、磷酸、2-[4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸，或參羥基甲基胺基甲烷者， 安定化劑為包含蔗糖，或甘油者。 [2]如上述[1]之醫藥組成物，其中抗人類抗體Fab片段，為選自由以下之(a)及(b)： (a)含有包含由序列編號2之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的重鏈片段及包含由序列編號4之胺基酸編號1至112之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的輕鏈之抗人類CEACAM5抗體Fab片段；以及 (b)含有包含由序列編號2之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成且序列編號2之胺基酸編號1的麩胺酸被修飾為焦麩胺酸之重鏈可變區域的重鏈片段，及包含由序列編號4之胺基酸編號1至112之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的輕鏈之抗人類CEACAM5抗體Fab片段 所成之群的1者以上者， 標識部為下式(I)： [式中，波線表示對抗人類CEACAM5抗體Fab片段之結合，此處抗人類CEACAM5抗體Fab片段，係透過抗人類CEACAM5抗體Fab片段中之胺基，而與標識部末端之 C(=S)的碳原子結合]表示之基。 [3]如上述[2]之醫藥組成物，其中抗人類抗體Fab片段，為選自由以下之(a)及(b)： (a)含有由序列編號2所示之胺基酸序列所成之重鏈片段及由序列編號4所示之胺基酸序列所成之輕鏈的抗人類CEACAM5抗體Fab片段；以及 (b)含有由序列編號2所示之胺基酸序列所成且序列編號2之胺基酸編號1的麩胺酸被修飾為焦麩胺酸之重鏈片段，及由序列編號4所示之胺基酸序列所成之輕鏈的抗人類CEACAM5抗體Fab片段 所成之群的1者以上者。 [4]如上述[1]之醫藥組成物，其中抗人類抗體Fab片段，為選自由以下之(a)及(b)： (a)含有包含由序列編號12或序列編號14所示之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的重鏈片段及包含由序列編號16所示之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的輕鏈之抗人類MUC1抗體Fab片段；以及 (b)含有包含由序列編號12或序列編號14所示之胺基酸序列所成且序列編號12或序列編號14之胺基酸編號1的麩醯胺被修飾為焦麩胺酸之重鏈可變區域的重鏈片段，及包含由序列編號16所示之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的輕鏈之抗人類MUC1抗體Fab片段 所成之群的1者以上者， 標識部為下式(I)： [式中，波線表示對抗人類MUC1抗體Fab片段之結合，此處抗人類MUC1抗體Fab片段，係透過抗人類MUC1抗體Fab片段中之胺基，而與標識部末端之C(=S)的碳原子結合]表示之基。 [5]如上述[4]之醫藥組成物，其中抗人類抗體Fab片段，為選自由以下之(a)及(b)： (a)含有由序列編號6或序列編號8所示之胺基酸序列所成之重鏈片段及由序列編號10所示之胺基酸序列所成之輕鏈的抗人類MUC1抗體Fab片段；以及 (b)含有由序列編號6或序列編號8所示之胺基酸序列所成且序列編號6或序列編號8之胺基酸編號1的麩醯胺被修飾為焦麩胺酸之重鏈片段，及由序列編號10所示之胺基酸序列所成之輕鏈的抗人類MUC1抗體Fab片段 所成之群的1者以上者。 [6]如上述[1]~[5]中任一項之醫藥組成物，其中非離子性界面活性劑，為含有聚山梨醇酯80者。 [7]如上述[2]~[6]中任一項之醫藥組成物，其中標識部-抗人類抗體Fab片段複合體，進一步包含₈₉ Zr。 [8]如上述[7]之醫藥組成物，其係使用於大腸癌或大腸癌轉移之癌的診斷。 [9]如上述[7]之醫藥組成物，其係使用於乳癌或乳癌轉移之癌的診斷。 [10]如上述[1]之醫藥組成物，其中抗人類抗體Fab片段，為選自由以下之(a)及(b)： (a)含有包含由序列編號12或序列編號14所示之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的重鏈片段及包含由序列編號16所示之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的輕鏈之抗人類MUC1抗體Fab片段；以及 (b)含有包含由序列編號12或序列編號14所示之胺基酸序列所成且序列編號12或序列編號14之胺基酸編號1的麩醯胺被修飾為焦麩胺酸之重鏈可變區域的重鏈片段，及包含由序列編號16所示之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的輕鏈之抗人類MUC1抗體Fab片段、 所成之群的1者以上者， 標識部為下式(II)： [式中，波線表示對抗人類MUC1抗體Fab片段之結合，此處抗人類MUC1抗體Fab片段，係透過抗人類MUC1抗體Fab片段中之胺基，而與標識部末端之C(=O)的碳原子結合]表示之基。 [11]如上述[10]之醫藥組成物，其中抗人類抗體Fab片段，為選自由以下之(a)及(b)： (a)含有由序列編號6或序列編號8所示之胺基酸序列所成之重鏈片段及由序列編號10所示之胺基酸序列所成之輕鏈的抗人類MUC1抗體Fab片段；以及 (b)含有由序列編號6或序列編號8所示之胺基酸序列所成且序列編號6或序列編號8之胺基酸編號1的麩醯胺被修飾為焦麩胺酸之重鏈片段，及由序列編號10所示之胺基酸序列所成之輕鏈的抗人類MUC1抗體Fab片段， 所成之群的1者以上者。 [12]如上述[10]或[11]之醫藥組成物，其中非離子性界面活性劑，為含有聚山梨醇酯80者。 [13]如上述[10]~[12]中任一項之醫藥組成物，其係使用於乳癌或乳癌轉移之癌的診斷。 [14]如上述[13]之醫藥組成物，其係術中診斷藥。 [15]如上述[1]~[14]中任一項之醫藥組成物，其中緩衝劑之濃度為10~30mmol/L。 [16]如上述[1]~[15]中任一項之醫藥組成物，其中安定化劑之濃度為5~30w/v%。 [17]如上述[1]~[16]中任一項之醫藥組成物，其中非離子性界面活性劑之濃度為0.02~0.2w/v%。 [18]如上述[1]~[17]中任一項之醫藥組成物，其係溶液製劑、冷凍製劑，或冷凍乾燥製劑。 [19]一種含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之醫藥組成物之製造方法，其包含 (a)製造並摻合標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之步驟、 (b)摻合檸檬酸、磷酸、2-[4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸，或參羥基甲基胺基甲烷作為緩衝劑之步驟、 (c)摻合蔗糖，或甘油作為安定化劑之步驟、 (d)摻合非離子性界面活性劑之步驟，及 (e)將pH調整為6.5~7.5之步驟。 [20]一種安定地保存標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之方法，其包含 (a)對含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之溶液，摻合檸檬酸、磷酸、2-[4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸，或參羥基甲基胺基甲烷作為緩衝劑之步驟、 (b)對含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之溶液，摻合蔗糖，或甘油作為安定化劑之步驟、 (c)對含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之溶液，摻合非離子性界面活性劑之步驟，及 (d)將含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之溶液的pH調整為6.5~7.5之步驟。

本發明之醫藥組成物，可抑制標識部-抗人類抗體Fab片段複合體保存時之多聚體或不溶性微粒子的產生，且亦可抑制金屬放射性同位素對配位子之配位效率降低或螢光色素退色，因此就儲存、輸送，及使用時之安定性的觀點而言為有用。又，本發明之醫藥組成物，就安定性之觀點，為使用製藥學上容許之緩衝劑或醫藥品添加物者，就人類投予時之安全性的觀點而言亦為有用。

以下詳述本發明，但本發明不限定於此等。本說明書中只要無特別定義，則關聯本發明所用的科學用語及技術用語，具有為所屬技術領域中具有通常知識者一般所理解的意義。

1. 醫藥組成物 於其一態樣中，本發明係關於一種醫藥組成物，其係含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體、緩衝劑、安定化劑，及非離子性界面活性劑，且pH為6.5~7.5之醫藥組成物，其中前述緩衝劑為包含檸檬酸、磷酸、2-[4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸，或參羥基甲基胺基甲烷者，前述安定化劑為包含蔗糖，或甘油者。藉由成為前述醫藥組成物，可抑制標識部-抗人類抗體Fab片段複合體保存時之多聚體或不溶性微粒子的產生，且亦可抑制金屬放射性同位素對配位子之配位效率降低或螢光色素退色。因此，以本發明之醫藥組成物，可抑制標識部-抗人類抗體Fab片段複合體在儲存、輸送，及使用時之凝集等。

1-1. 抗人類抗體Fab片段 抗體分子之基本構造，係各類型共通地由分子量5萬~7萬之重鏈與2~3萬之輕鏈所構成。重鏈通常由包含約440個之胺基酸的多肽鏈所成，各類型係具有特徵性構造，對應於IgG、IgM、IgA、IgD、IgE而稱作γ、μ、α、δ、ε鏈。進一步地，於IgG係存在有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，分別稱為γ1、γ2、γ3、γ4。輕鏈通常由包含約220個之胺基酸的多肽鏈所成，已知有L型與K型2種，分別稱為λ、κ鏈。抗體分子之基本構造的胜肽構成，係由分別相同之2條重鏈及2條輕鏈，藉由雙硫鍵(S-S鍵)及非共價鍵而結合，分子量為15萬~19萬。2種輕鏈不管與何種重鏈均可成對。個別的抗體分子，常由相同輕鏈2條與相同重鏈2條所形成。

鏈內S-S鍵，於重鏈有四個(μ、ε鏈有五個)、於輕鏈有二個，每100~110個胺基酸殘基係成為一個環狀域(loop)，該立體構造在各環狀域間係類似，稱為構造單位或結構域(domain)。不管重鏈、輕鏈均位於N末端側之結構域，均為即使來自同種動物之同一類型(次類型)之標本，其胺基酸序列亦並非一定，稱為可變區域，各結構域分別稱為重鏈可變區域(V_H )及輕鏈可變區域(V_L )。較其更靠近C末端側之胺基酸序列，於各個類型或次類型係大致恆定，而稱為恆定區域，各結構域係分別以C_H1 、C_H2 、C_H3 或C_L 表示。

抗體與抗原之結合的特異性，係依由重鏈可變區域及輕鏈可變區域所構成的部分之胺基酸序列而定。另一方面，與補體或各種細胞之結合等生物學的活性，係反映各類型Ig之恆定區域構造的差異。重鏈與輕鏈之可變區域的可變性，已知係大致限定於不管於何種鏈均存在的3個小的超可變區域，此等區域稱為互補性決定區域(CDR；由N末端側起分別為CDR1、CDR2、CDR3)。可變區域之剩餘部分稱為框架區域(FR)，較為恆定。

抗體之重鏈恆定區域的C_H1 結構域與C_H2 結構域之間的區域稱為絞鏈(hinge)區域，該區域含有多量的脯胺酸殘基，包含連接2條重鏈之複數個鏈間S-S鍵。例如於人類之IgG1、IgG2、IgG3、IgG4之各絞鏈區域，係各自包含構成重鏈間之S-S鍵的2個、4個、11個、2個之半胱胺酸殘基。絞鏈區域為對木瓜酶或胃蛋白酶等之蛋白質分解酵素的感受性高之區域。將抗體以木瓜酶消化時，重鏈係於較絞鏈區域之重鏈間S-S鍵更靠近N末端側的位置被切斷，分解為2個Fab片段與1個Fc片段。Fab片段，係由輕鏈，與包含重鏈可變區域、C_H1 結構域與絞鏈區域之一部分的重鏈片段所構成。Fab片段包含可變區域，具有抗原結合活性。

本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類抗體Fab片段，於其一態樣中係抗人類CEACAM5抗體Fab片段。又，於其一態樣中，本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類抗體Fab片段，於其一態樣中係抗人類MUC1抗體Fab片段。

1-1-1. 抗人類CEACAM5抗體Fab片段 CEACAM5(Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5)為腫瘤標記之1者，於正常組織幾乎觀察不到表現，但在胎兒的消化道或大腸癌中有表現(BBA；1990；1032：177-189、Mol. Pathol.；1999；52：174-178)。又，已知CEACAM5於乳癌等亦有表現(Diagn. Cytopathol.；1993；9：377-382、Cancer Res.；1990；50：6987-6994、Histopathology；2000；37：530-535)。又，大腸癌患者中，相較於健康人而言，血中CEACAM5之濃度高(J. Exp. Med.；1965；121：439-462)、CEACAM5係使用作為腫瘤標記。於大腸癌患者之組織學的探討中，90%以上之組織有CEACAM5的高表現(British J. Cancer；2013；108：662-667)。

本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類CEACAM5抗體Fab片段中，包含具有以下特徵之Fab片段： 含有包含由序列編號2之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的重鏈片段及包含由序列編號4之胺基酸編號1至112之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的輕鏈之抗人類CEACAM5抗體Fab片段。

本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈恆定區域，係Igγ1、Igγ2、Igγ3或Igγ4等之任意恆定區域均可選擇。於1個實施形態中，本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈恆定區域，為人類Igγ1恆定區域。

本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈恆定區域，係Igλ或Igκ之任意恆定區域均可選擇。於1個實施形態中，本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈恆定區域，為人類Igκ恆定區域。

於1個實施形態中，本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類CEACAM5抗體Fab片段，為以下之Fab片段： 含有由序列編號2所示之胺基酸序列所成之重鏈片段及由序列編號4所示之胺基酸序列所成之輕鏈的抗人類CEACAM5抗體Fab片段。

包含Fab片段，使抗體於細胞表現時，已知抗體會受到轉譯後修飾。轉譯後修飾之例子，可列舉重鏈C末端之離胺酸被羧基胜肽酶切斷、將重鏈及輕鏈N末端之麩醯胺或麩胺酸以焦麩胺醯化修飾為焦麩胺酸、糖苷化、氧化、脫醯胺化、糖化等，於各種抗體中，已知會產生如此的轉譯後修飾(J. Pharm. Sci.；2008；97：2426-2447)。

本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類CEACAM5抗體Fab片段中，亦可包含藉由轉譯後修飾所產生之Fab片段。可藉由轉譯後修飾所產生的本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類CEACAM5抗體Fab片段之例子，可列舉重鏈N末端經焦麩胺醯化之抗人類CEACAM5抗體Fab片段。如此的N末端焦麩胺醯化所致的轉譯後修飾，於該領域中已知對抗體之活性不造成顯著影響(Anal. Biochem.；2006；348：24-39)。

於1個實施形態中，本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類CEACAM5抗體Fab片段，為具有下述特徵之抗人類CEACAM5抗體Fab片段： 含有包含由序列編號2之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成且序列編號2之胺基酸編號1的麩胺酸被修飾為焦麩胺酸之重鏈可變區域的重鏈片段，及包含由序列編號4之胺基酸編號1至112之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的輕鏈之抗人類CEACAM5抗體Fab片段。

於別的實施形態中，本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類CEACAM5抗體Fab片段，為具有下述特徵之抗人類CEACAM5抗體Fab片段： 含有由序列編號2所示之胺基酸序列所成且序列編號2之胺基酸編號1的麩胺酸被修飾為焦麩胺酸之重鏈片段，及由序列編號4所示之胺基酸序列所成之輕鏈的抗人類CEACAM5抗體Fab片段。

本發明之醫藥組成物中，亦包含具有以下特徵之抗人類CEACAM5抗體Fab片段： 含有包含含有由序列編號2之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號2之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號2之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3的重鏈可變區域之重鏈片段，以及包含含有由序列編號4之胺基酸編號24至38之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號4之胺基酸編號54至60之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號4之胺基酸編號93至101之胺基酸序列所成之CDR3的輕鏈可變區域之輕鏈的抗人類CEACAM5抗體Fab片段。

本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類CEACAM5抗體Fab片段，係結合於人類CEACAM5。測定所得抗人類CEACAM5抗體Fab片段對人類CEACAM5之結合活性的方法，係有以表面電漿子共振(Surface Plasmon Resonance；SPR)法所進行的解析或ELISA等之方法。使用以例如SPR法所進行的解析時，可藉由使用Biacore T200(GE Healthcare Japan公司)，於感測晶片上固相化Biotin CAPture Kit(GE Healthcare Japan公司)與經生物素化之人類CEACAM5，並添加經階段稀釋之Fab片段，來測定結合速度常數(ka)、解離速度常數(kd)，及解離常數(K_D )。

本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類CEACAM5抗體Fab片段，可基於本說明書所揭示之本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段及輕鏈的序列資訊，使用該領域中公知之方法，由所屬技術領域中具有通常知識者輕易地製作。本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類CEACAM5抗體Fab片段，並無特殊限定，例如可遵照後述之「4-4.抗人類抗體Fab片段之製造方法」所記載之方法來製造。

1-1-2. 抗人類MUC1抗體Fab片段 黏液素1(Mucin1：MUC1)，為於構成乳腺、氣管及消化道等之上皮組織的上皮細胞之內腔側表現的膜結合型糖蛋白質(Nat. Rev. Cancer；2004 Jan；4(1)：45-60)。MUC1係於乳癌或大腸癌等之癌細胞中過剩表現(Mod. Pathol.；2005 Oct；18(10)：1295-1304、Int. J. Oncol.；2000 Jan；16(1)：55-64)，MUC1有用於作為用以檢測癌病灶之標的分子(Nat. Rev. Cancer；2004 Jan；4(1)：45-60、Pathol. Res. Pract.；2010 Aug15；206(8)：585-589.)。

本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類MUC1抗體Fab片段，為具有以下特徵之Fab片段： 含有包含由序列編號12或序列編號14所示之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的重鏈片段及包含由序列編號16所示之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的輕鏈之抗人類MUC1抗體Fab片段。

於1個實施形態中，本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類MUC1抗體Fab片段，為含有包含由序列編號14所示之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的重鏈片段及包含由序列編號16所示之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的輕鏈之抗人類MUC1抗體Fab片段。

本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類MUC1抗體Fab片段之重鏈恆定區域，係Igγ1、Igγ2、Igγ3或Igγ4等之任意恆定區域均可選擇。於1個實施形態中，本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類MUC1抗體Fab片段之重鏈恆定區域，為人類Igγ1恆定區域。

本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類MUC1抗體Fab片段之輕鏈恆定區域，係Igλ或Igκ之任意恆定區域均可選擇。於1個實施形態中，本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類MUC1抗體Fab片段之輕鏈恆定區域，為人類Igκ恆定區域。

於1個實施形態中，本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類MUC1抗體Fab片段，為以下之Fab片段： 含有由序列編號6或序列編號8所示之胺基酸序列所成之重鏈片段及由序列編號10所示之胺基酸序列所成之輕鏈的抗人類MUC1抗體Fab片段。

於1個實施形態中，本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類MUC1抗體Fab片段，為含有由序列編號8所示之胺基酸序列所成之重鏈片段及由序列編號10所示之胺基酸序列所成之輕鏈的抗人類MUC1抗體Fab片段。

如前所述，包含Fab片段，使抗體於細胞表現時，已知抗體會受到轉譯後修飾。因此，本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類MUC1抗體Fab片段中，亦可包含藉由轉譯後修飾所產生的Fab片段。可藉由轉譯後修飾所產生的本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類MUC1抗體Fab片段之例子，可列舉重鏈N末端經焦麩胺醯化之抗人類MUC1抗體Fab片段。如此的N末端之焦麩胺醯化所致的轉譯後修飾，如前所述，於該領域已知不會對抗體活性造成影響。

於1個實施形態中，本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類MUC1抗體Fab片段，為具有下述特徵之抗人類MUC1抗體Fab片段： 含有包含由序列編號12或序列編號14所示之胺基酸序列所成且序列編號12或序列編號14之胺基酸編號1的麩醯胺被修飾為焦麩胺酸之重鏈可變區域的重鏈片段，及包含由序列編號16所示之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的輕鏈之抗人類MUC1抗體Fab片段。

於一實施形態中，本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類MUC1抗體Fab片段，為具有下述特徵之抗人類MUC1抗體Fab片段： 含有包含由序列編號14所示之胺基酸序列所成之且序列編號14之胺基酸編號1的麩醯胺被修飾為焦麩胺酸之重鏈可變區域的重鏈片段，及包含由序列編號16所示之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的輕鏈之抗人類MUC1抗體Fab片段。

於別的實施形態中，本發明之醫藥組成物中所含有的抗MUC1抗體Fab片段，為具有下述特徵之抗人類MUC1抗體Fab片段： 含有由序列編號6或序列編號8所示之胺基酸序列所成且序列編號6或序列編號8之胺基酸編號1的麩醯胺被修飾為焦麩胺酸之重鏈片段，及由序列編號10所示之胺基酸序列所成之輕鏈的抗人類MUC1抗體Fab片段。

於一實施形態中，本發明之醫藥組成物中所含有的抗MUC1抗體Fab片段，為具有下述特徵之抗人類MUC1抗體Fab片段： 含有由序列編號8所示之胺基酸序列所成且序列編號8之胺基酸編號1的麩醯胺被修飾為焦麩胺酸之重鏈片段，及由序列編號10所示之胺基酸序列所成之輕鏈的抗人類MUC1抗體Fab片段。

本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類MUC1抗體Fab片段，係結合於人類癌特異性的MUC1。測定所得之抗人類MUC1抗體Fab片段對人類癌特異性的MUC1之結合活性的方法，係有ELISA或FACS等之方法。例如使用ELISA時，係將人類癌特異性的MUC1陽性細胞(例如T-47D細胞)固定化於ELISA試驗盤，對其添加Fab片段進行反應後，使經辣根過氧化酶等標識之抗Igκ抗體等進行反應後，藉由使用檢測其活性的試藥(例如辣根過氧化酶標識時，係化學發光辣根過氧化酶基質)等之活性測定，鑑定二次抗體的結合。

本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類MUC1抗體Fab片段，可基於本說明書所揭示之本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類MUC1抗體Fab片段之重鏈片段及輕鏈的序列資訊，使用該領域公知之方法，由所屬技術領域中具有通常知識者輕易地製作。本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類MUC1抗體Fab片段，並無特殊限定，例如可遵照後述之「4-4.抗人類抗體Fab片段之製造方法」記載的方法來製造。

1-2. 標識部 1-2-1. 包含配位子之標識部 作為其一實施形態，本發明之醫藥組成物中所含有的標識部-抗人類抗體Fab片段複合體，係標識部為配位子及連結子之複合體。再者，本說明書中，「配位子」意指於複合體中，可與金屬形成鉗合錯合物之部分，其係由鉗合劑所構成之基。又，「所構成之基」，係指由鉗合劑去除質子，而具有鍵結部位之基，「鉗合劑」，係指可與金屬配位鍵結之化合物。

作為其一實施形態，本發明之醫藥組成物中所含有的標識部-抗人類抗體Fab片段複合體，其標識部為配位子及連結子時，作為構成配位子之鉗合劑，可列舉載鐵體與非載鐵體。作為又一態樣，可列舉MAG3(巰基乙醯基-甘胺醯基-甘胺醯基-甘胺酸，CAS編號：66516-09-4)，及其公知之反應性衍生物。載鐵體可列舉羥胺酸型、兒茶酚型，或混合配位子型。羥胺酸型載鐵體，例如可列舉含鐵色素、下式： 表示之去鐵胺(DFO)、鐮菌胺酸C(fusarinine C)、ornibactin、紅酵母酸(rhodotorulic acid)，及此等之公知之反應性衍生物。兒茶酚型載鐵體，例如可列舉腸桿菌素、嗜鐵素(bacillibactin)、弧菌素，及此等之公知之反應性衍生物。混合配位子型載鐵體，例如可列舉固氮菌素(azotobactin)、螢光鐵載體(pyoverdine)、耶爾森菌素(yersiniabactin)，及此等之公知之反應性衍生物。再者，上述載鐵體的情況，DFO可透過其反應性官能基-NH₂ 與連結子或Fab片段反應，DFO以外之載鐵體的情況，亦可透過羧基、羥基、胺基等之反應性官能基，以所屬技術領域中具有通常知識者通常使用之方法與連結子或Fab片段反應。

非載鐵體，可列舉DTPA(二乙三胺五乙酸，CAS編號：67-43-6)、DTPA-BMA(1,7-雙(甲基胺甲醯基甲基)-1,4,7-三氮雜庚烷-1,4,7-三乙酸，CAS編號：119895-95-3)、EOB-DTPA(乙氧基苄基DTPA、2-[[(2S)-2-[雙(羧基甲基)胺基]-3-(4-乙氧基苯基)丙基]-[2-[雙(羧基甲基)胺基]乙基]胺基]乙酸)、TTHA(三乙四胺六乙酸，CAS編號：869-52-3)、DO3A(1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7-三乙酸，CAS編號：217973-03-0)、HP-DO3A(10-(2-羥基丙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7-三乙酸，CAS編號：120041-08-9)、DOTA(1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸，CAS編號：60239-18-1)，及此等之公知之反應性衍生物。

本發明之醫藥組成物中所含有的標識部-抗人類抗體Fab片段複合體，當標識部為配位子及連結子時構成配位子的「鉗合劑」，較佳為DFO。

「連結子」，係指於抗人類抗體Fab片段與配位子之間製造距離之基。作為其一實施形態，本發明之醫藥組成物中所含有的標識部-抗人類抗體Fab片段複合體，其標識部為配位子及連結子時，於抗人類抗體Fab片段與配位子之間製造距離之連結子，可列舉下式： (以下表述為-C(=S)-NH-(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-)、 -CH₂ -(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-、-C(=O)-(C_1-20 伸烷基)-C(=O)-。此處「C_1-20 伸烷基」，係指直鏈或分支之碳數1~20之伸烷基。作為C_1-20 伸烷基之其一態樣，可列舉C_1-10 伸烷基、C_1-2 伸烷基。作為C_1-20 伸烷基之其一態樣，可列舉伸乙基。作為可用於形成連結子之試藥，可列舉HO-C(=O)-(C_1-20 伸烷基)-C(=O)-OH、琥珀酸、p-伸苯基二異硫氰酸酯等。

本發明之醫藥組成物中所含有的標識部-抗人類抗體Fab片段複合體，其標識部為配位子及連結子時之「連結子」，較佳為-C(=S)-NH-(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-。

本發明之醫藥組成物中所含有的標識部-抗人類抗體Fab片段複合體，其標識部為配位子及連結子時，可使形成配位子之鉗合劑與使抗人類抗體Fab片段與連結子反應而得的物質反應來製造。亦可使令連結子與形成配位子之鉗合劑反應而得的物質與抗人類抗體Fab片段反應來製造。反應例可列舉使令鉗合劑之胺基與連結子反應而得的物質，與抗人類抗體Fab片段之1個以上的胺基(例如N末端胺基或離胺酸側鏈之胺基)反應。標識部為配位子時，亦可使抗人類抗體Fab片段與形成配位子之鉗合劑反應來製造。反應例可列舉使鉗合劑與抗人類抗體Fab片段之1個以上的胺基(例如N末端胺基或離胺酸側鏈之胺基)反應。本發明之醫藥組成物中所含有的標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之製造，可使用對胺添加異硫氰酸酯來合成硫脲的反應，或對胺添加羧酸來合成醯胺的反應等。該反應可藉由應用所屬技術領域中具有通常知識者所公知之方法來進行。再者，亦可使用預先使配位子與連結子結合而得的化合物作為原料。使配位子與連結子結合而得的化合物之例子，可列舉以下之式表示之p-SCN-Bn-DFO(p-異硫氰基苯基胺基硫羰基取代之DFO，CAS編號：1222468-90-7)： 、p-異硫氰基苄基取代之DTPA(p-SCN-Bn-DTPA，CAS編號：102650-30-6)、p-異硫氰基苄基取代之DOTA(p-SCN-Bn-DOTA，CAS編號：127985-74-4)，及p-SCN-Bn-CHX-A”-DTPA ([(R)-2-胺基-3-(4-異硫氰酸酯苯基)丙基]-反-(S,S)-環己烷-1,2-二胺-五乙酸，CAS編號：157380-45-5)。

作為其一實施形態，本發明之醫藥組成物中所含有的標識部-抗人類抗體Fab片段複合體，係標識部為下式(I)表示之配位子及連結子的複合體： 式中，波線表示對抗人類抗體Fab片段之結合，此處抗人類抗體Fab片段，係透過抗人類抗體Fab片段中之胺基，與標識部末端之C(=S)的碳原子結合。

如前所述，本發明之醫藥組成物中所含有的標識部-抗人類抗體Fab片段複合體，其標識部為配位子及連結子時，構成配位子之鉗合劑可與金屬放射性同位素形成鉗合錯合物。本說明書中，金屬放射性同位素係指例如用於PET示蹤劑等者，可列舉₈₉ Zr、₅₁ Mn、₅₂ Fe、₆₀ Cu、₆₇ Ga、₆₈ Ga、₇₂ As、_99m Tc，或₁₁₁ In等，較佳為₈₉ Zr。亦即，本發明之醫藥組成物中所含有的標識部-抗人類抗體Fab片段複合體，可為不含金屬放射性同位素者、亦可為含有₈₉ Zr作為金屬放射性同位素者。

又，提供本發明之醫藥組成物時之態樣，能夠以不含金屬放射性同位素之態樣提供，且於正要使用前以金屬放射性同位素標識來使用，亦能夠以含有金屬放射性同位素之診斷用醫藥組成物的形態提供。例如使用短半衰期之金屬放射性同位素(例如₈₉ Zr(半衰期3.3日))時，較佳為以不含金屬放射性同位素之態樣提供，且於正要使用前以金屬放射性同位素標識。

1-2-2. 包含螢光色素之標識部 作為其一實施形態，本發明之醫藥組成物中所含有的標識部-抗人類抗體Fab片段複合體，其標識部為螢光色素時，螢光色素可使用通常用於光成像的於近紅外波長(650 ~1000nm)具有吸收極大值及發光極大值之色素。作為螢光色素之其一態樣，可列舉花青或靛青化合物。作為其一態樣，可列舉IRDye800CW(LI-COR公司)、Cy(Molecular Probe公司)、Alexa Fluor、BODIPY，及DyLight(Thermo Fisher Scientific公司)、CF790(Biotium公司)、DY (DYOMICS GMBH公司)、HiLyte Fluor680，及HiLyte Fluor750 (Anaspec公司)、PULSAR650，及QUASAR670(Biosearch Technologies公司)等。

本發明之醫藥組成物中所含有的標識部-抗人類抗體Fab片段複合體，其標識部為螢光色素時之螢光色素，較佳為下式表示之IRDye800CW(LI-COR Biosciences公司)： 。再者，上述螢光色素，可透過其羧基、羥基、胺基等，或以所屬技術領域中具有通常知識者通常使用之方法導入活性化基，與抗人類抗體Fab片段或結合於抗人類抗體Fab片段之連結子反應。作為經導入活性化基之螢光色素之其一態樣，可列舉經N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)基酯化之螢光色素。例如IRDye800CW之NHS酯係有市售，可利用該等。

作為其一實施形態，本發明之醫藥組成物中所含有的標識部-抗人類抗體Fab片段複合體，係標識部為下式(II)表示之螢光色素之複合體： 式中，波線表示對抗人類抗體Fab片段之結合，此處抗人類抗體Fab片段，係透過抗人類抗體Fab片段中之胺基，與標識部末端之C(=O)的碳原子結合。

醫藥組成物中所含有的標識部-抗人類抗體Fab片段複合體中，抗人類抗體Fab片段與標識部之結合，可藉由公知之手法，由所屬技術領域中具有通常知識者適當進行。例如可使標識部結合於抗人類抗體Fab片段之1個以上的胺基(例如N末端胺基或胺基酸側鏈之胺基)、1個以上的硫醇基(例如胺基酸側鏈之硫醇基)，或1個以上的羧基(例如C末端或胺基酸之側鏈之羧基)。作為一態樣，本發明之醫藥組成物中所含有的標識部-抗人類抗體Fab片段複合體，係標識部結合於抗人類抗體Fab片段之1個以上的胺基之複合體。

1-3. 標識部-抗人類抗體Fab片段複合體 本發明之醫藥組成物，為含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體者。於其一態樣中，本發明之醫藥組成物中所含有的標識部-抗人類抗體Fab片段複合體，為一種標識部-抗人類CEACAM5抗體Fab片段複合體，其中抗人類抗體Fab片段，為選自由以下之(a)及(b)： (a)含有包含由序列編號2之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的重鏈片段及包含由序列編號4之胺基酸編號1至112之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的輕鏈之抗人類CEACAM5抗體Fab片段；以及 (b)含有包含由序列編號2之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成且序列編號2之胺基酸編號1的麩胺酸被修飾為焦麩胺酸之重鏈可變區域的重鏈片段，及包含由序列編號4之胺基酸編號1至112之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的輕鏈之抗人類CEACAM5抗體Fab片段 所成之群的1者以上者， 前述標識部為下式(I)： [式中，波線表示對抗人類CEACAM5抗體Fab片段之結合，此處抗人類CEACAM5抗體Fab片段，係透過抗人類CEACAM5抗體Fab片段中之胺基，而與標識部末端之C(=S)的碳原子結合]表示之基。

於其一態樣中，標識部-抗人類抗體Fab片段複合體中所包含的抗人類CEACAM5抗體Fab片段，為選自由以下之(a)及(b)： (a)含有由序列編號2所示之胺基酸序列所成之重鏈片段及由序列編號4所示之胺基酸序列所成之輕鏈的抗人類CEACAM5抗體Fab片段；以及 (b)含有由序列編號2所示之胺基酸序列所成且序列編號2之胺基酸編號1的麩胺酸被修飾為焦麩胺酸之重鏈片段，及由序列編號4所示之胺基酸序列所成之輕鏈的抗人類CEACAM5抗體Fab片段， 所成之群的1者以上者。

又，於其一態樣中，本發明之醫藥組成物中所含有的標識部-抗人類抗體Fab片段複合體，為一種標識部-抗人類MUC1抗體Fab片段複合體，其中前述抗人類抗體Fab片段，為選自由以下之(a)及(b)： (a)含有包含由序列編號12或序列編號14所示之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的重鏈片段及包含由序列編號16所示之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的輕鏈之抗人類MUC1抗體Fab片段；以及 (b)含有包含由序列編號12或序列編號14所示之胺基酸序列所成且序列編號12或序列編號14之胺基酸編號1的麩醯胺被修飾為焦麩胺酸之重鏈可變區域的重鏈片段，及包含由序列編號16所示之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的輕鏈之抗人類MUC1抗體Fab片段 所成之群的1者以上者， 前述標識部為下式(I)： [式中，波線表示對抗人類MUC1抗體Fab片段之結合，此處抗人類MUC1抗體Fab片段，係透過抗人類MUC1抗體Fab片段中之胺基，而與標識部末端之C(=S)的碳原子結合]表示之基。

於其一態樣中，標識部-抗人類抗體Fab片段複合體中所包含的抗人類MUC1抗體Fab片段，為選自由以下之(a)及(b)： (a)含有由序列編號6或序列編號8所示之胺基酸序列所成之重鏈片段及由序列編號10所示之胺基酸序列所成之輕鏈的抗人類MUC1抗體Fab片段；以及 (b)含有由序列編號6或序列編號8所示之胺基酸序列所成且序列編號6或序列編號8之胺基酸編號1的麩醯胺被修飾為焦麩胺酸之重鏈片段，及由序列編號10所示之胺基酸序列所成之輕鏈的抗人類MUC1抗體Fab片段， 所成之群的1者以上者。

又，於其一態樣中，本發明之醫藥組成物中所含有的標識部-抗人類抗體Fab片段複合體，為一種標識部-抗人類MUC1抗體Fab片段複合體，其中前述抗人類抗體Fab片段，為選自由以下之(a)及(b)： (a)含有包含由序列編號12或序列編號14所示之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的重鏈片段及包含由序列編號16所示之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的輕鏈之抗人類MUC1抗體Fab片段；以及 (b)含有包含由序列編號12或序列編號14所示之胺基酸序列所成且序列編號12或序列編號14之胺基酸編號1的麩醯胺被修飾為焦麩胺酸之重鏈可變區域的重鏈片段，及包含由序列編號16所示之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的輕鏈之抗人類MUC1抗體Fab片段 所成之群的1者以上者， 前述標識部為下式(II)： [式中，波線表示對抗人類MUC1抗體Fab片段之結合，此處抗人類MUC1抗體Fab片段，係透過抗人類MUC1抗體Fab片段中之胺基，而與標識部末端之C(=O)的碳原子結合]表示之基。

於其一態樣中，標識部-抗人類抗體Fab片段複合體中所包含的抗人類MUC1抗體Fab片段，為選自由以下之(a)及(b)： (a)含有由序列編號6或序列編號8所示之胺基酸序列所成之重鏈片段及由序列編號10所示之胺基酸序列所成之輕鏈的抗人類MUC1抗體Fab片段；以及 (b)含有由序列編號6或序列編號8所示之胺基酸序列所成且序列編號6或序列編號8之胺基酸編號1的麩醯胺被修飾為焦麩胺酸之重鏈片段，及由序列編號10所示之胺基酸序列所成之輕鏈的抗人類MUC1抗體Fab片段， 所成之群的1者以上者。

本發明之醫藥組成物中所含有的標識部-抗人類CEACAM5抗體Fab片段複合體，為1個以上的標識部結合於抗人類CEACAM5抗體Fab片段之複合體。本發明之醫藥組成物中所含有的標識部-抗人類CEACAM5抗體Fab片段複合體，作為其一態樣，係與1~25個標識部結合、作為其一態樣係與1~23個標識部結合、作為其一態樣係與1~16個標識部結合、作為其一態樣係與1~11個標識部結合、作為其一態樣係與1~10個標識部結合、作為其一態樣係與1~9個標識部結合、作為其一態樣係與4~23個標識部結合、作為其一態樣係與4~16個標識部結合、作為其一態樣係與4~10個標識部結合、作為其一態樣係與4~9個標識部結合、作為其一態樣係與3~23個標識部結合、作為其一態樣係與3~16個標識部結合、作為其一態樣係與3~10個標識部結合、作為其一態樣係與3~9個標識部結合的抗人類CEACAM5抗體Fab片段。作為其一態樣，係進一步含有金屬之與1個以上的標識部結合之抗人類CEACAM5抗體Fab片段。

本發明之醫藥組成物中所含有的複合體，為包含1個以上的標識部，與抗人類MUC1抗體Fab片段之複合體。作為其一態樣，係與1~27個標識部結合、作為其一態樣，係與1~23個標識部結合、作為其一態樣係與1~15個標識部結合、作為其一態樣係與1~11個標識部結合、作為其一態樣係與1~9個標識部結合、作為其一態樣係與1~7個標識部結合、作為其一態樣係與1~5個標識部結合、進而作為其一態樣係與1~4個標識部結合的抗人類MUC1抗體Fab片段。作為其一態樣，係進一步含有金屬之與1個以上的標識部結合之抗人類MUC1抗體Fab片段。

再者，本發明之醫藥組成物中所含有的標識部-抗人類抗體Fab片段複合體，只要無特別記載，則亦包含游離體及其鹽。此處「其鹽」，依其複合體之取代基種類不同，係有形成酸加成鹽或與鹼之鹽的情況，係可形成該化合物及複合體之鹽。具體而言，可列舉與鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、磷酸等之無機酸；甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、馬來酸、乳酸、蘋果酸、杏仁酸、酒石酸、二苄醯基酒石酸、二甲苯甲醯基酒石酸、檸檬酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、p-甲苯磺酸、天門冬胺酸、麩胺酸等之有機酸之酸加成鹽；與鈉、鉀、鎂、鈣、鋁等之無機鹼；甲基胺、乙基胺、乙醇胺、離胺酸、鳥胺酸等之有機鹼之鹽；與乙醯基白胺酸等之各種胺基酸及胺基酸衍生物之鹽及銨鹽等。例如DFO可以去鐵胺甲磺酸鹽之形態存在、亦可以其他鹽的形態存在。

本發明之醫藥組成物中之標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之濃度，只要係發揮診斷上或治療上有效之作用的量則無特殊限制，較佳為1~100mg/mL、更佳為5~20mg/mL。

1-4. 緩衝劑 本發明之醫藥組成物中之緩衝劑，就維持pH於後述範圍，抑制對於金屬放射性同位素對配位子之配位效率的影響之觀點，可使用檸檬酸、磷酸、2-[4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸，或參羥基甲基胺基甲烷。又，本發明之醫藥組成物中之緩衝劑之濃度，雖依緩衝劑之種類與目標pH而變動，但較佳為10~30mmol/L。

於其一態樣中，本發明之醫藥組成物中之緩衝劑為檸檬酸，其濃度係10~30mmol/L、較佳為15~25mmol/L。又，於其一態樣中，本發明之醫藥組成物中之緩衝劑為磷酸，其濃度係10~30mmol/L、較佳為15~25mmol/L。

1-5. 安定化劑 本發明之醫藥組成物中之安定化劑，就抑制保存時之熱壓力、光壓力或振盪壓力等所致多聚體、酸性側電荷類似物，或不溶性微粒子的產生，並且亦抑制金屬放射性同位素對配位子之配位效率降低或螢光色素退色的觀點，可使用蔗糖或甘油。又，本發明之醫藥組成物中之安定化劑之濃度，雖依所使用之安定化劑的種類而變動，但較佳為5~30w/v%。

於其一態樣中，本發明之醫藥組成物中之安定化劑為蔗糖，其濃度為5~30w/v%、較佳為15~25w/v%。又，於其一態樣中，本發明之醫藥組成物中之緩衝劑為甘油，其濃度為5~30w/v%、較佳為15~25w/v%。

1-6. 非離子性界面活性劑 本發明之醫藥組成物中，可使用非離子性界面活性劑。本發明之醫藥組成物中，就抑制不溶性微粒子的產生，並且亦抑制金屬放射性同位素對配位子之配位效率降低或螢光色素退色之觀點，非離子性界面活性劑，可使用聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯60、泊洛沙姆(poloxamer)188。再者，聚山梨醇酯80，亦稱為聚氧乙烯(20)山梨醇酐油酸酯，其係山梨醇酐之羥基的一部分被油酸酯化者之聚氧乙烯醚，為具有相對於單油酸山梨醇酐1莫耳而言，約20莫耳之氧化伸乙基進行醚鍵結而得的構造者。又，本發明之醫藥組成物中之非離子性界面活性劑之濃度，雖依其種類而變動，但較佳為0.02~0.2w/v%。

於其一態樣中，本發明之醫藥組成物中之非離子性界面活性劑為聚山梨醇酯80，其濃度為0.02~0.2 w/v%、較佳為0.04~0.1w/v%。

1-7. pH 本發明之醫藥組成物中，就抑制保存時之熱壓力、光壓力或振盪壓力等所致的多聚體、酸性側電荷類似物，或不溶性微粒子的產生，並且亦抑制金屬放射性同位素對配位子之配位效率降低或螢光色素退色之觀點，pH係6.5~ 7.5、更佳為6.5~7.0。

於其一態樣中，本發明之醫藥組成物，較佳含有前述抗人類CEACAM5抗體Fab片段複合體或抗人類MUC1抗體Fab片段5~20mg/mL之濃度作為標識部-抗人類抗體Fab片段複合體，含有15~25mmol/L之檸檬酸作為緩衝劑，含有15~25w/v%之蔗糖作為安定化劑，含有0.04~ 0.1w/v%之聚山梨醇酯80作為非離子性界面活性劑，且pH為6.5~7.0。

1-8. 使用於診斷之醫藥組成物 本發明於其一態樣中，係關於含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之使用於診斷之醫藥組成物。本發明之醫藥組成物中所含有的標識部-抗人類抗體Fab片段複合體，包含配位子作為標識部時，藉由使金屬放射性同位素(例如₈₉ Zr)進行配位，而成為可檢測的複合體。又，本發明之醫藥組成物中所含有的標識部-抗人類抗體Fab片段複合體，包含螢光色素作為標識部時，該複合體為可檢測的複合體。此等之可檢測的複合體，可利用作為早期診斷藥、病期診斷藥或術中診斷藥(特別是癌的診斷藥)。術中診斷藥，意指於外科手術或內視鏡手術等之手術中，可特定出病變部，並檢查其性質之診斷藥。使用本發明之使用於診斷之醫藥組成物作為術中診斷藥時，該使用於診斷之醫藥組成物，例如係於手術之2~32小時前、作為其一態樣係6~24小時前、作為又其他態樣係2小時前對患者投予。

早期診斷藥意指，以於觀察不到病狀或病期的早期階段進行診斷為目的之診斷藥。例如在癌係意指於觀察不到病狀或於第0期或第1期之階段所用的診斷藥。

病期診斷藥意指可檢查病狀進行到何種程度之診斷藥。例如就癌而言，亦指可檢查其期別之診斷藥。

本發明之醫藥組成物含有標識部-抗人類CEACAM5抗體Fab片段複合體時，可使用於表現人類CEACAM5之癌的診斷。於其一態樣中，本發明之醫藥組成物含有標識部-抗人類CEACAM5抗體Fab片段複合體時，較佳使用於大腸癌、乳癌、肺癌、甲狀腺癌，或此等經轉移之癌的診斷；特佳使用於大腸癌或大腸癌轉移之癌的診斷。大腸癌轉移之癌並無特殊限定，例如可列舉轉移性肝癌。

本發明之醫藥組成物含有標識部-抗人類MUC1抗體Fab片段複合體時，可使用於表現人類MUC1之癌的診斷。於其一態樣中，本發明之醫藥組成物含有標識部-抗人類MUC1抗體Fab片段複合體時，可使用於乳癌、肺癌、大腸癌、膀胱癌、皮膚癌、甲狀腺癌、胃癌、胰臟癌、腎臟癌、卵巢癌，或子宮頸癌之診斷，特佳使用於乳癌或膀胱癌之診斷。

1-9. 醫藥組成物之劑型/添加物 本發明之醫藥組成物之劑型並無特殊限定，於其一態樣中，係液體製劑、冷凍製劑，或冷凍乾燥製劑。又，本發明之醫藥組成物，例如可使用作為注射劑或點滴用劑等之非經口劑，較佳為藉由靜脈內注射、對標的局部之肌肉內注射，或皮下注射等來投予。本發明之醫藥組成物中可檢測的標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之用量，雖依患者之年齡或體重、所使用之製劑劑型，或Fab片段之結合力價等而異，但例如患者之每單位體重，能夠以Fab片段之質量基準計，使用0.001mg/kg至100mg/kg左右。

本發明之醫藥組成物中，可依期望，適當添加懸浮劑、溶解輔助劑、等張化劑、保存劑、抗吸附劑、賦形劑、無痛化劑、含硫還原劑、抗氧化劑等之醫藥品添加物。 懸浮劑例如可列舉甲基纖維素、羥基乙基纖維素、阿拉伯膠、龍膠粉末、羧基甲基纖維素鈉、聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯等。 溶解輔助劑例如可列舉聚氧乙烯硬化蓖麻油、菸鹼醯胺、聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯、聚乙二醇、蓖麻油脂肪酸乙酯等。 等張化劑例如可列舉氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣等。 保存劑例如可列舉對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、山梨酸、酚、甲酚、氯甲酚、苯甲醇等。 抗吸附劑例如可列舉人類血清白蛋白、卵磷脂、葡聚糖、環氧乙烷/環氧丙烷共聚物、羥基丙基纖維素、甲基纖維素、聚氧乙烯硬化蓖麻油、聚乙二醇等。 賦形劑例如可列舉木糖醇等。 無痛化劑例如可列舉肌醇、利多卡因等。 含硫還原劑例如可列舉N-乙醯基半胱胺酸、N-乙醯基升半胱胺酸、硫辛酸、硫二乙二醇、硫乙醇胺、硫甘油、硫代山梨醇、硫代乙醇酸及其鹽、硫代硫酸鈉、麩胱甘肽、碳原子數1~7之硫代烷酸等之具有硫氫基(sulfhydryl)者等。 抗氧化劑例如可列舉異抗壞血酸、二丁基羥基甲苯、丁基羥基苯甲醚、α-生育酚、乙酸生育酚、L-抗壞血酸及其鹽、L-抗壞血酸棕櫚酸酯、L-抗壞血酸硬脂酸酯、亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、沒食子酸三戊酯、沒食子酸丙酯，或乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、焦磷酸鈉、偏磷酸鈉等之鉗合劑。

2. 使用於診斷之醫藥組成物之使用/診斷方法 又，本發明係關於一種標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之使用，其係用於製造使用於癌之早期診斷之醫藥組成物、使用於病期診斷之醫藥組成物或使用於術中診斷之醫藥組成物。於其一態樣中，本發明為一種含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之醫藥組成物，其係使用於癌之早期診斷、病期診斷或術中診斷。

本發明亦關於一種癌之診斷方法，其包含將含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之醫藥組成物，於手術前或手術中投予至對象。此處，「對象」係指必需接受該診斷之人類或其他哺乳動物，作為其一態樣，係必需接受該診斷之人類。前述診斷方法中之含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之本發明之醫藥組成物的有效量，雖依患者之年齡或體重、所使用之製劑劑型，或Fab片段之結合力價等而異，但例如患者之每單位體重，能夠以Fab片段之質量基準計，使用0.001mg/kg至100mg/kg左右。前述診斷方法中，含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之本發明之醫藥組成物，較佳為藉由對標的組織局部之肌肉內注射，或皮下注射等來投予。前述診斷方法中，於手術前投予本發明之醫藥組成物時，該複合體例如係於手術之2~48小時前、作為其一態樣係6~24小時前、作為又其他態樣係2小時前對患者投予。

於別的實施形態中，本發明亦關於一種標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之使用，其係用於製造本發明之醫藥組成物。

3. 含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之醫藥組成物之製造方法、安定地保存標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之方法 於其一態樣中，本發明係關於含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之醫藥組成物之製造方法。具體而言，於其一態樣中，本發明為一種含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之醫藥組成物之製造方法，其包含(a)製造並摻合標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之步驟、(b)摻合檸檬酸、磷酸、2-[4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸，或參羥基甲基胺基甲烷作為緩衝劑之步驟、(c)摻合蔗糖或甘油作為安定化劑之步驟、(d)摻合聚山梨醇酯80作為非離子性界面活性劑之步驟，及(e)將pH調整為6.5~7.5之步驟。再者，摻合的順序並無特殊限定。

又，於其一態樣中，本發明係關於安定地保存標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之方法。本說明書中「安定地保存」，係指抑制於標識部-抗人類抗體Fab片段複合體保存時的多聚體或不溶性微粒子的產生。又，於其一態樣中，本說明書中「安定地保存」，為亦包含抑制金屬放射性同位素對配位子之配位效率降低或螢光色素退色的概念。具體而言，於其一態樣中，本發明為一種安定地保存標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之方法，其包含(a)對含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之溶液，摻合檸檬酸、磷酸、2-[4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸，或參羥基甲基胺基甲烷作為緩衝劑之步驟、(b)對含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之溶液，摻合蔗糖或甘油作為安定化劑之步驟、(c)對含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之溶液，摻合聚山梨醇酯80作為非離子性界面活性劑之步驟，及(d)將含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之溶液的pH調整為6.5~7.5之步驟。再者，摻合之順序並無特殊限定。

前述之製造方法及安定地保存之方法中，關於抗人類抗體Fab片段或標識部之構造，或標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之構造等，係如前述「1.醫藥組成物」之項目所記載。又，關於緩衝劑、安定化劑及非離子性界面活性劑之濃度範圍或pH之範圍等，亦如前述「1.醫藥組成物」之項目所記載。又，前述步驟係以任意順序進行皆可。

又，前述製造方法及方法中，標識部-抗人類抗體Fab片段複合體包含配位子作為標識部時，於其一態樣中，可包含使金屬放射性同位素配位之步驟。再者，關於金屬放射性同位素之種類等，亦如前述「1.醫藥組成物」之項目所記載。

進一步地，前述之製造方法及方法中，於其一態樣中，可包含使其冷凍之步驟或冷凍乾燥之步驟。再者，關於冷凍方法或冷凍乾燥方法，可使用公知方法。

4. 標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之製造方法 4-1. 編碼抗人類抗體Fab片段之多核苷酸 本發明之醫藥組成物中所含有的複合體包含抗人類CEACAM5抗體Fab片段時，於其一態樣中，編碼抗人類抗體Fab片段之多核苷酸，包含含有編碼該抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸，及含有編碼該抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸。

於一實施形態中，前述編碼該抗人類CEACAM5抗體Fab片段之多核苷酸，為含有編碼包含由序列編號2之胺基酸編號1至121所示之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的重鏈片段之鹼基序列的多核苷酸，或含有編碼包含由序列編號4之胺基酸編號1至112所示之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸。

含有編碼包含由序列編號2之胺基酸編號1至121所示之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的重鏈片段之鹼基序列的多核苷酸，例如可列舉含有序列編號1之鹼基編號1至363之鹼基序列的多核苷酸。又，含有編碼包含由序列編號4之胺基酸編號1至112之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸，例如可列舉含有序列編號3之鹼基編號1至336之鹼基序列的多核苷酸。

較佳之實施形態中，前述編碼該抗人類CEACAM5抗體Fab片段之多核苷酸，為含有編碼由序列編號2所示之胺基酸序列所成之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸，或含有編碼由序列編號4所示之胺基酸序列所成之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸。

含有編碼由序列編號2所示之胺基酸序列所成之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸，例如可列舉含有序列編號1所示之鹼基序列的多核苷酸。含有編碼由序列編號4所示之胺基酸序列所成之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸，例如可列舉含有序列編號3所示之鹼基序列的多核苷酸。

本發明之醫藥組成物中所含有的複合體包含抗人類MUC1抗體Fab片段時，於其一態樣中，編碼抗人類抗體Fab片段之多核苷酸，包含含有編碼該抗人類MUC1抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸，及含有編碼該抗人類MUC1抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸。

於一態樣中，前述編碼該抗人類MUC1抗體Fab片段之多核苷酸，為含有編碼包含由序列編號12所示之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的重鏈片段之鹼基序列的多核苷酸，或含有編碼包含由序列編號14所示之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的重鏈片段之鹼基序列的多核苷酸。

含有編碼包含由序列編號12所示之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的重鏈片段之鹼基序列的多核苷酸，例如可列舉含有序列編號11所示之鹼基序列的多核苷酸。含有編碼包含由序列編號14所示之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的重鏈片段之鹼基序列的多核苷酸，例如可列舉含有序列編號13所示之鹼基序列的多核苷酸。

較佳之實施形態中，前述編碼該抗人類MUC1抗體Fab片段之多核苷酸，為含有編碼由序列編號6所示之胺基酸序列所成之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸，或含有編碼由序列編號8所示之胺基酸序列所成之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸。

含有編碼由序列編號6所示之胺基酸序列所成之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸，例如可列舉含有序列編號5所示之鹼基序列的多核苷酸。含有編碼由序列編號8所示之胺基酸序列所成之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸，例如可列舉含有序列編號7所示之鹼基序列的多核苷酸。

於一實施形態中，前述編碼該抗人類MUC1抗體Fab片段之多核苷酸，為含有編碼包含由序列編號16所示之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸。

含有編碼包含由序列編號16所示之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸，例如可列舉含有序列編號15所示之鹼基序列的多核苷酸。

較佳之實施形態中，前述編碼該抗人類MUC1抗體Fab片段之多核苷酸，為含有編碼由序列編號10所示之胺基酸序列所成之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸。

含有編碼由序列編號10所示之胺基酸序列所成之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸，例如可列舉含有序列編號9所示之鹼基序列的多核苷酸。

編碼本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類CEACAM5抗體Fab片段之多核苷酸，可基於根據前述抗人類CEACAM5抗體Fab片段或前述抗人類MUC1抗體Fab片段的重鏈片段及輕鏈之胺基酸序列所設計之鹼基序列，利用該技術領域中公知之基因合成方法來合成。如此的基因合成方法，可使用國際公開第90/07861號記載的抗體基因之合成方法等之所屬技術領域中具有通常知識者所公知的各種方法。

4-2. 編碼抗人類抗體Fab片段之多核苷酸的表現載體 編碼本發明之醫藥組成物中所含有的複合體中之抗人類CEACAM5抗體Fab片段的多核苷酸之表現載體，包含：包含含有編碼前述抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸的表現載體、包含含有編碼前述抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體，以及包含含有編碼前述抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸及含有編碼前述抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體。

較佳之表現載體，包含：包含含有編碼包含由序列編號2之胺基酸編號1至121所示之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的重鏈片段之鹼基序列的多核苷酸之表現載體、包含含有編碼包含由序列編號4之胺基酸編號1至112所示之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸之表現載體，以及包含含有編碼包含由序列編號2之胺基酸編號1至121所示之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的重鏈片段之鹼基序列的多核苷酸及含有編碼包含由序列編號4之胺基酸編號1至112所示之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸之表現載體。

更佳之編碼本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類CEACAM5抗體Fab片段之表現載體，包含：包含含有編碼由序列編號2所示之胺基酸序列所成之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸的表現載體、包含含有編碼由序列編號4所示之胺基酸序列所成之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體，以及包含含有編碼由序列編號2所示之胺基酸序列所成之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸及含有編碼由序列編號4所示之胺基酸序列所成之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體。

編碼本發明之醫藥組成物中所含有的複合體中之抗人類MUC1抗體Fab片段的多核苷酸之表現載體，包含：包含含有編碼前述抗人類MUC1抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸的表現載體、包含含有編碼前述抗人類MUC1抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體，以及包含含有編碼前述抗人類MUC1抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸及含有編碼前述抗人類MUC1抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體。

較佳之表現載體，包含：包含含有編碼由序列編號12或序列編號14所示之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸的表現載體、包含含有編碼由序列編號16所示之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸的表現載體，以及包含含有編碼由序列編號12或序列編號14所示之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸及含有編碼由序列編號16所示之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸的表現載體。

更佳之表現載體，包含：包含含有編碼由序列編號6或序列編號8所示之胺基酸序列所成之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸的表現載體、包含含有編碼由序列編號10所示之胺基酸序列所成之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體，以及包含含有編碼由序列編號6或序列編號8所示之胺基酸序列所成之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸及含有編碼由序列編號10所示之胺基酸序列所成之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體。

此等之表現載體，只要係可於原核細胞及/或真核細胞之各種宿主細胞中產生被前述多核苷酸編碼的多肽者則無特殊限制。如此的表現載體，例如可列舉質體載體、病毒載體(例如腺病毒、反轉錄病毒)等，較佳可使用pEE6.4或pEE12.4(Lonza公司)。

此等之表現載體，可含有啟動子，該啟動子與編碼本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類抗Fab片段之多核苷酸之重鏈片段及/或編碼輕鏈之基因連結為可發揮功能。用以於宿主細胞中表現本發明之醫藥組成物中所含有的Fab片段的啟動子，當宿主細胞為大腸桿菌屬菌時，例如可列舉Trp啟動子、lac啟動子、recA啟動子、λPL啟動子、lpp啟動子、tac啟動子等。於酵母中表現用之啟動子，例如可列舉PH05啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子等，於芽孢桿菌屬菌中表現用之啟動子，可列舉SL01啟動子、SP02啟動子、penP啟動子等。又，當宿主為哺乳動物細胞等之真核細胞時，可列舉CMV、RSV、SV40等之來自病毒的啟動子、反轉錄病毒之啟動子、肌動蛋白啟動子、EF(elongation factor)1α啟動子、熱休克啟動子等。

此等之表現載體，當使用細菌特別是大腸菌作為宿主細胞時，可進一步包含起始密碼子、終止密碼子、終止子(terminator)區域，及可複製單位。另一方面，使用酵母、動物細胞或昆蟲細胞作為宿主時，編碼本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類抗Fab片段之表現載體，可包含起始密碼子，及終止密碼子。又，此時，亦可包含增強子(enhancer)序列、編碼本發明之醫藥組成物中所含有的重鏈片段及/或輕鏈之基因的5’側及3’側之非轉譯區域、分泌訊息序列、剪接接合部、多腺苷酸化部位，或可複製單位等。又，亦可依目的，包含通常使用之選擇標記(例如四環黴素抗性基因、安比西林抗性基因、康黴素抗性基因、新黴素抗性基因、二氫葉酸還原酵素基因)。

4-3. 經表現載體轉形之宿主細胞 經編碼抗人類CEACAM5抗體Fab片段之多核苷酸的前述表現載體轉形之宿主細胞，包含經選自由以下(a)~(d)所成之群的表現載體轉形之宿主細胞。 (a)經包含含有編碼本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞； (b)經包含含有編碼本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞； (c)經包含含有編碼本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸及含有編碼本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞；以及 (d)經包含含有編碼本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸的表現載體及包含含有編碼本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞。

於1個實施形態中，經編碼抗人類CEACAM5抗體Fab片段之多核苷酸的前述表現載體轉形之宿主細胞，為選自由以下(a)~(d)所成之群的宿主細胞： (a)經包含含有編碼包含由序列編號2之胺基酸編號1至121所示之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的重鏈片段之鹼基序列的多核苷酸之表現載體轉形之宿主細胞； (b)經包含含有編碼包含由序列編號4之胺基酸編號1至112所示之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸之表現載體轉形之宿主細胞； (c)經包含含有編碼包含由序列編號2之胺基酸編號1至121所示之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的重鏈片段之鹼基序列的多核苷酸及含有編碼包含由序列編號4之胺基酸編號1至112所示之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸之表現載體轉形之宿主細胞；以及 (d)經包含含有編碼包含由序列編號2之胺基酸編號1至121所示之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的重鏈片段之鹼基序列的多核苷酸之表現載體及包含含有編碼包含由序列編號4之胺基酸編號1至112所示之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸之表現載體轉形之宿主細胞。

於1個實施形態中，經編碼抗人類CEACAM5抗體Fab片段之多核苷酸的前述表現載體轉形之宿主細胞，為選自由以下(a)~(d)所成之群的宿主細胞： (a)經包含含有編碼由序列編號2所示之胺基酸序列所成之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞； (b)經包含含有編碼由序列編號4所示之胺基酸序列所成之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞； (c)經包含含有編碼由序列編號2所示之胺基酸序列所成之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸及含有編碼由序列編號4所示之胺基酸序列所成之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞；以及 (d)經包含含有編碼由序列編號2所示之胺基酸序列所成之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸的表現載體及包含含有編碼由序列編號4所示之胺基酸序列所成之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞。

又，經編碼抗人類MUC1抗體Fab片段之多核苷酸的前述表現載體轉形之宿主細胞，包含經選自由以下(a)~(d)所成之群的表現載體轉形之宿主細胞。 (a)經包含含有編碼本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類MUC1抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞； (b)經包含含有編碼本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類MUC1抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞； (c)經包含含有編碼本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類MUC1抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸及含有編碼本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類MUC1抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞；以及 (d)經包含含有編碼本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類MUC1抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸的表現載體及包含含有編碼本發明之醫藥組成物中所含有的抗人類MUC1抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞。

於1個實施形態中，經編碼抗人類MUC1抗體Fab片段之多核苷酸的前述表現載體轉形之宿主細胞，為選自由以下(a)~(d)所成之群的宿主細胞： (a)經包含含有編碼包含由序列編號12或序列編號14所示之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的重鏈片段之鹼基序列的多核苷酸之表現載體轉形之宿主細胞； (b)經包含含有編碼包含由序列編號16所示之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸之表現載體轉形之宿主細胞； (c)經包含含有編碼包含由序列編號12或序列編號14所示之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的重鏈片段之鹼基序列的多核苷酸及含有編碼包含由序列編號16所示之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸之表現載體轉形之宿主細胞；以及 (d)經包含含有編碼包含由序列編號12或序列編號14所示之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的重鏈片段之鹼基序列的多核苷酸之表現載體及包含含有編碼包含由序列編號16所示之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸之表現載體轉形之宿主細胞。

於1個實施形態中，經編碼抗人類MUC1抗體Fab片段之多核苷酸的前述表現載體轉形之宿主細胞，為選自由以下(a)~(d)所成之群的宿主細胞： (a)經包含含有編碼由序列編號6或序列編號8所示之胺基酸序列所成之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞； (b)經包含含有編碼由序列編號10所示之胺基酸序列所成之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞； (c)經包含含有編碼由序列編號6或序列編號8所示之胺基酸序列所成之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸及含有編碼由序列編號10所示之胺基酸序列所成之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞；以及 (d)經包含含有編碼由序列編號6或序列編號8所示之胺基酸序列所成之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸的表現載體及包含含有編碼由序列編號10所示之胺基酸序列所成之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞。

所轉形之宿主細胞，只要係適合所使用之表現載體，可經該表現載體轉形而表現Fab片段者則無特殊限定，例示有本發明之技術領域中通常所使用的天然細胞或人工建立的細胞等各種細胞(例如細菌(大腸桿菌屬菌、芽孢桿菌屬菌)、酵母(酵母菌屬、畢赤酵母菌屬等)、動物細胞或昆蟲細胞(例如Sf9)等)、哺乳動物細胞株(例如CHOK1SV細胞、CHO-DG44細胞、293細胞等之培養細胞)。轉形本身例如可藉由磷酸鈣法、電穿孔法等公知方法進行。

4-4. 抗人類抗體Fab片段之製造方法 前述抗人類抗體Fab片段之製造方法，較佳為抗人類CEACAM5抗體Fab片段或抗人類MUC1抗體Fab片段之製造方法，包含培養經轉形之前述宿主細胞，使抗人類抗體Fab片段表現之步驟。

抗人類抗體Fab片段之製造方法中，經轉形之宿主細胞，可於營養培養基中培養。營養培養基，較佳含有經轉形之宿主細胞的生長所必需之如碳源、無機氮源或有機氮源之營養源。碳源例如例示有葡萄糖、葡聚糖、可溶性澱粉、蔗糖等，無機氮源或有機氮源例如例示有銨鹽類、硝酸鹽類、胺基酸、玉米浸液、蛋白腖、酪蛋白、肉萃取物、大豆粕、馬鈴薯萃取液等。又，亦可依期望，含有其他營養素(例如無機鹽(例如氯化鈣、磷酸二氫鈉、氯化鎂)、維生素類、抗生素(例如四環黴素、新黴素、安比西林、康黴素等)等)。

經轉形之宿主細胞的培養本身，係藉由公知方法進行。培養條件，例如溫度、培養基之pH及培養時間，係適當選擇。例如宿主為動物細胞時，培養基可使用含有約5~20%之胎牛血清的MEM培養基(Science；1952；122：501)、DMEM培養基(Virology；1959；8：396-397)、RPMI1640培養基(J. Am. Med.Assoc.；1967；199：519-524)、199培養基(Proc. Soc. Exp. Biol. Med.；1950；73：1-8)等。培養基之pH較佳為約6~8，培養通常於約30~ 40℃進行約15~336小時，亦可依需要進行通氣或攪拌。宿主為昆蟲細胞時，例如可列舉含有胎牛血清之Grace’s培養基(PNAS；1985；82：8404-8408)等，其pH較佳為約5~ 8。培養通常係於約20~40℃進行15~100小時，亦可依需要進行通氣或攪拌。宿主為細菌、放線菌、酵母、絲狀菌時，例如以含有上述營養源之液體培養基為適當。較佳為pH5~8之培養基。宿主為E. coli時，較佳之培養基例示有LB培養基、M9培養基(Miller等、Exp. Mol. Genet, Cold Spring Harbor Laboratory；1972：431)等。此時，培養可依需要在通氣、攪拌之下，通常於14~43℃，進行約3~24小時。宿主為Bacillus屬菌時，可依需要在通氣、攪拌之下，通常於30~40℃，進行約16~96小時。宿主為酵母時，培養基例如可列舉Burkholder最小培養基(PNAS；1980；77：4505-4508)，pH較期望為5~8。培養通常於約20~35℃進行約14~144小時，亦可依需要進行通氣或攪拌。

前述抗人類抗體Fab片段之製造方法，於培養經轉形之前述宿主細胞，使抗人類抗體Fab片段表現之步驟以外，可包含回收經表現之抗人類抗體Fab片段，較佳為單離、純化之步驟。單離、純化方法，例如可列舉鹽析、溶劑沈澱法等之利用溶解度之方法；透析、超微過濾、凝膠過濾、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳等利用分子量之差之方法；離子交換層析或羥基磷灰石層析等之利用荷電之方法；親和層析等之利用特異親和性之方法；逆相高速液體層析等之利用疏水性之差之方法；等電點電泳等之利用等電點之差之方法等。

4-5. 標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之製造方法 本發明之醫藥組成物中所含有的標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之製造方法，包含使前述抗人類抗體Fab片段與標識部共價鍵結之步驟。又，製造該複合體之方法，亦可包含培養經轉形之前述宿主細胞，使抗人類抗體Fab片段表現之步驟，及使該Fab片段與標識部共價鍵結之步驟。又，製造該複合體之方法，亦可包含培養經轉形之前述宿主細胞，使抗人類抗體Fab片段表現之步驟、回收經表現之該Fab片段之步驟，及使該Fab片段與標識部進行共價鍵結之步驟。所使用之連結子、配位子，或螢光色素等，可使用「1.醫藥組成物」之項目所記載者。

作為其一態樣，製造該複合體之方法，為包含培養經轉形之前述宿主細胞，使抗人類抗體Fab片段表現之步驟，及使該Fab片段與配位子透過連結子而結合之步驟之方法。作為其一態樣，製造該複合體之方法，為包含培養經轉形之前述宿主細胞，使抗人類抗體Fab片段表現之步驟、回收經表現之該Fab片段之步驟，及使該Fab片段與配位子透過連結子而結合之步驟之方法。

作為其一態樣，製造該複合體之方法，為包含培養經轉形之前述宿主細胞，使抗人類抗體Fab片段表現之步驟，及使該Fab片段i)與配位子透過連結子而結合或ii)與配位子直接進行共價鍵結之步驟之方法。作為其一態樣，製造該複合體之方法，培養經轉形之前述宿主細胞，使抗人類抗體Fab片段表現之步驟、回收經表現之該Fab片段之步驟，及使該Fab片段i)與配位子透過連結子而結合或ii)與配位子直接進行共價鍵結之步驟之方法。

作為其一態樣，製造該複合體之方法，為包含培養經轉形之前述宿主細胞，使抗人類抗體Fab片段表現之步驟，及使該Fab片段i)與螢光色素透過連結子而結合或ii)與螢光色素直接進行共價鍵結之步驟之方法。作為其一態樣，製造該複合體之方法，為包含培養經轉形之前述宿主細胞，使抗人類抗體Fab片段表現之步驟、回收經表現之該Fab片段之步驟，及使該Fab片段i)與螢光色素透過連結子而結合或ii)與螢光色素直接進行共價鍵結之步驟之方法。

關於本發明係已全體記載，為了進一步得到理解，於此提供用來參照的特定實施例。但是，此等係以例示為目的，並非限定本發明。 [實施例] 實驗1-1：抗人類CEACAM5抗體Fab片段之製作

參考文獻(Protein Eng. Des. Sel.；2004；17：481-489)記載之方法，將來自小鼠之抗人類CEACAM5抗體T84.66人類化後，使用根據文獻(Proteins：Structure, Function, and Bioinformatics；2014；82：1624-1635)所構築之人類化抗體之分子模式，設計具有期待即使結合有標識部亦不會減弱親和性之可變區域的抗體。

於前述抗體之重鏈片段基因(序列編號1)之5’側連結編碼訊息序列(MEWSWVFLFFLSVTTGVHS(序列編號17))之基因，將該重鏈片段基因插入於GS載體pEE6.4 (Lonza公司)。又，於抗體之輕鏈基因(序列編號3)之5’側連結編碼訊息序列(MSVPTQVLGLLLLWLTDARC(序列編號18))之基因，將該輕鏈基因插入於GS載體pEE12.4 (Lonza公司)。將分別插入有抗體之重鏈片段與輕鏈之基因的前述pEE載體以NotI與PvuI之限制酵素切斷，使用接合(ligation)用套組TAKARA Ligation Kit Ver2.1(Takara公司)進行接合，構築插入有重鏈片段與輕鏈兩基因的GS載體。

使用插入有前述之重鏈片段與輕鏈兩基因的GS載體，以臨時性表現及穩定性表現的2種方法進行抗體表現。就臨時性表現而言，係以Expi293 Expression Medium (Thermo Fisher Scintific公司)對培養至約300萬個/mL之Expi293F細胞(Thermo Fisher Scientific公司)，將插入有前述之重鏈片段與輕鏈兩基因的GS載體使用ExpiFectamine 293 Transfection Kit(Thermo Fisher Scientific公司)進行轉染，培養5~7日。將培養上清使用KappaSelect(GE Healthcare Japan公司)純化，得到Fab片段。就穩定性表現而言，係將插入有以PvuI成為直鏈的前述之重鏈片段與輕鏈兩基因的GS載體以使用Gene Pulser(Bio-Rad公司)之電穿孔法對CHOK1SV細胞(Lonza公司)轉染。轉染翌日添加甲硫胺酸磺醯亞胺(Methionine sulfoximine)，培養5~7日。對含有甲基纖維素之半固體培養基播種細胞，形成群落後使用ClonePix FL(Molecular Devices公司)取得Fab片段之表現量多的細胞。將該細胞之培養上清使用Capto L (GE Healthcare Japan公司)、Q Sepharose Fast Flow(GE Healthcare Japan公司)，及BioPro S75(YMC公司)純化，得到Fab片段。

將編碼所製作之抗人類CEACAM5抗體Fab片段(稱為PB009-1)之重鏈片段的鹼基序列示於序列編號1、被其所編碼之胺基酸序列示於序列編號2、編碼PB009-1之輕鏈的鹼基序列示於序列編號3、被其所編碼之胺基酸序列示於序列編號4。PB009-1之重鏈可變區域，係由序列編號2之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成，重鏈之CDR1、CDR2、CDR3，分別由序列編號2之胺基酸編號31至35、50至66、99至110之胺基酸序列所成。PB009-1之輕鏈可變區域，係由序列編號4之胺基酸編號1至112之胺基酸序列所成，輕鏈之CDR1、CDR2、CDR3，分別由序列編號4之胺基酸編號24至38、54至60、93至101之胺基酸序列所成。

再者，可變區域及CDR序列係遵照Kabat編號來決定(Kabat等；1991；Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th Ed.、United States PublicHealth Service、National Institute of Health、Bethesda)。

實驗1-2：抗人類CEACAM5抗體Fab片段之鉗合劑標識化 鉗合劑DFO對抗人類CEACAM5抗體Fab片段PB009-1之結合，係使用p-SCN-Bn-DFO(經p-異硫氰基苯基胺基硫羰基取代之DFO)(Macrocyclics公司)。對經磷酸緩衝生理食鹽水(pH7.4)調製為1mg/mL之Fab片段溶液，添加1/5量之0.1M碳酸鈉溶液(pH9.0)。對其添加p-SCN-Bn-DFO，使終濃度成為1mg/mL，於37℃反應1小時半。反應後，使用Amicon Ultra 3K-0.5mL離心式濾器(Merck Millipore公司)，純化DFO透過連結子(-C(=S)-NH-(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-)而結合的DFO-抗人類CEACAM5抗體Fab片段複合體(稱為PB009-2)。

對於PB009-2，以質譜分析確認由DFO所構成的配位子之結合數。將PB009-2使用MassPREP Micro Desalting Column(Waters公司)脫鹽，並使用SYNAPT G2質譜分析計(Waters公司)實施測定。其結果，確認到由DFO所構成的配位子至少3個至10個結合至1個PB009-1的分子。

實驗1-3：pH對DFO-抗人類CEACAM5抗體Fab片段複合體之安定化所造成的影響之探討(對多聚體生成及酸性側電荷類似物生成之影響) 對於含有PB009-2之液劑，評估pH對PB009-2之安定化所造成的影響。本試驗中，係對含有PB009-2之液劑，摻合緩衝劑及非離子性界面活性劑，使PB009-2之最終濃度成為10mg/mL，調製表1所示之試樣A-1~A-6。再者，pH係適量添加鹽酸或氫氧化鈉來調整。將各試樣以孔徑0.22 μm之濾器無菌過濾，各填充1.2mL至小玻璃瓶(3mL容量)，以橡皮塞封口後，蓋上鋁蓋旋緊來調製。

為了評估液劑之安定性，進行各試樣於正置狀態之熱安定性試驗。熱安定性試驗中，係基於以粒徑篩析層析法(SE-HPLC法)所測定之多聚體量，及以影像化毛細管等電點電泳法(icIEF法)所測定之酸性側電荷類似物量，評估25℃保管1週後之PB009-2之安定性。分析條件如以下所述。

[粒徑篩析層析法(SE-HPLC法)] SE-HPLC測定，係於HPLC系統連接G3000SWXL (TOSOH公司)，使具備20mmol/L磷酸/400mmol/L氯化鈉pH7.0之組成的移動相以0.5mL/分鐘之流量流過。以PB009-2換算，試樣係成為50μg之注入量(例：5mg/mL時為10 μL)。管柱溫度設為30℃、試樣溫度設為5℃，檢測係於UV 280 nm實施。

[影像化毛細管等電點電泳法(icIEF法)] icIEF測定係於iCE3系統連接cIEF Cartridge(Protein Simple公司)，進行測定。將由尿素、甲基纖維素、Pharmalyte3-10、pI標記5.12、pI標記9.77所成之樣品基質188μL，與經超純水稀釋為PB009-2濃度5mg/mL之樣品12μL予以混合，作為測定試樣。Prefocusing係以1500V實施1分鐘、Focusing係以3000V實施6分鐘。

SE-HPLC測定後，藉由自動分析法測定所檢測之多聚體之面積，求得多聚體之量(%)。就多聚體量(%)而言，係藉由自動分析法測定以SE-HPLC法所檢測的多聚體波峰之總面積，藉由除以包含主波峰之全部波峰面積總和，而作為百分率(%)來規定。此處主波峰，係指活性本體(未經多聚體化之PB009-2)之波峰。

藉由自動分析法測定以icIEF法所檢測的酸性側電荷類似物之面積，求得酸性側電荷類似物之量(%)。就酸性側電荷類似物量(%)而言，係藉由自動分析法測定以icIEF法所檢測的酸性側電荷類似物波峰之總面積，藉由除以包含主波峰之全部波峰面積總和，而作為百分率(%)來規定。此處主波峰，係指活性本體(未經類似物化之PB009-2)之波峰。

本實驗所得到之SE-HPLC法及icIEF法之評估結果示於表2。其結果，25℃保管1週後之SE-HPLC多聚體量(%)，當pH越低時越有增加傾向，於pH7.0附近為最小。又，25℃保管1週後之酸性側電荷類似物量(%)，當pH越低時越有減少傾向。綜合判斷以上結果，確認到就安定性之觀點，含有PB009-2之液劑的pH係以7.0附近為最適宜。

實驗1-4：安定化劑、非離子性界面活性劑對DFO-抗人類CEACAM5抗體Fab片段複合體之安定化所造成的影響之探討(對多聚體生成及酸性側電荷類似物生成之影響) 對於含有PB009-2之液劑，評估各種安定化劑或非離子性界面活性劑對PB009-2之安定性所造成的影響。本試驗中，對於含有PB009-2之液劑，摻合緩衝劑及添加劑，使PB009-2之最終濃度成為10mg/mL，調製表3所示之試樣B-1~B-10。再者，pH係適量添加鹽酸或氫氧化鈉來調整。將各試樣以孔徑0.22μm之濾器無菌過濾，各填充1.2 mL至小玻璃瓶(3mL容量)，以橡皮塞封口後，蓋上鋁蓋旋緊來調製。

為了評估液劑之安定性，進行各試樣於正置狀態之熱安定性試驗。熱安定性試驗中，係基於以SE-HPLC法所測定之多聚體量，及以icIEF法所測定之酸性側電荷類似物量，來評估25℃保管1週後之PB009-2之安定性。SE-HPLC法之實驗法係如以下所述。

[粒徑篩析層析法(SE-HPLC法)] SE-HPLC測定，係於HPLC系統連接AdvanceBio SEC 300A管柱(Agilent公司)，使具備20mmol/L磷酸/400mmol/L氯化鈉pH7.0之組成的移動相以0.5mL/分鐘之流量流過。以PB009-2換算，試樣係成為50μg之注入量(例：5mg/mL時為10μL)。管柱溫度設為30℃、試樣溫度設為5℃，檢測係於UV 280nm實施。

SE-HPLC測定後，藉由自動分析法測定所檢測的多聚體之面積，求得多聚體之量(%)。就多聚體量(%)而言，係藉由自動分析法測定以SE-HPLC法所檢測的多聚體波峰之總面積，藉由除以包含主波峰之全部波峰面積總和，而作為百分率(%)來規定。此處主波峰，係指活性本體(未經多聚體化之PB009-2)之波峰。

icIEF法之分析條件係與實驗1-3相同。

本實驗所得到之SE-HPLC法，及icIEF法之評估結果示於表4。首先，25℃保管1週後之SE-HPLC多聚體量(%)，於添加組胺酸、蔗糖，及甘油之試樣中有增加抑制傾向。又，25℃保管1週後之酸性側電荷類似物量(%)，於添加組胺酸、天門冬胺酸之試樣中觀察到增加。綜合判斷以上結果，確認到就安定性之觀點，作為含有PB009-2之液劑之安定化劑，以蔗糖或甘油較宜。

實驗1-5：界面活性劑對DFO-抗人類CEACAM5抗體Fab片段複合體之安定化所造成的影響之探討(對不溶性微粒子生成之影響) 對於含有10mg/mL PB009-2，且為20mmol/L檸檬酸、pH7.0之處方的液劑，調製含有0~0.6w/v%之範圍的界面活性劑聚山梨醇酯80之試樣(試樣No.C-1~C-7：參照表5)。再者，pH係適量添加鹽酸或氫氧化鈉來調整。將各試樣以孔徑0.22μm之濾器無菌過濾，各填充1.2mL至小玻璃瓶(3 mL容量)，以橡皮塞封口後，蓋上鋁蓋旋緊來調製。

對於各試樣，使用光遮蔽粒子計數法測定振盪後及冷凍融解後之不溶性微粒子數。振盪試驗係藉由將試樣以150rpm振盪24小時來進行。又，冷凍融解試驗係藉由實施共3次之將試樣於-80℃花費4小時以上冷凍，之後於5℃花費4小時以上融解之程序來進行。光遮蔽粒子計數法之分析條件如以下所述。

[光遮蔽粒子計數法] 將樣品0.2mL注入HIAC系統(Pacific Scientific公司)，實施測定試樣1mL中所包含的粒徑1.2μm以上之不溶性微粒子的粒子數。

本實驗所得到之光遮蔽粒子計數法之評估結果示於表6。其顯示出不溶性微粒子數雖因振盪及冷凍融解而增加，但藉由添加0.02w/v%以上之濃度的聚山梨醇酯80，其增加受到抑制。且確認到就抑制不溶性微粒子的生成之觀點，較期望對含有PB009-2之液劑添加0.05w/v%之聚山梨醇酯80。

實驗1-6：以DFO-抗人類CEACAM5抗體Fab片段複合體之安定化為目的之最佳pH選定 對於含有10mg/mL之PB009-2，且含有20mmol/L檸檬酸，或20mmol/L HEPES(2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine] ethanesulfonic acid)作為緩衝劑；含有10w/v%蔗糖作為安定化劑，及含有0.05w/v%聚山梨醇酯80作為非離子性界面活性劑之處方(試樣No.D-1~D-8)，於pH6.1~7.9之範圍調製試樣。再者，pH係適量添加鹽酸或氫氧化鈉來調整。將各試樣以孔徑0.22μm之濾器無菌過濾，各填充1.2mL至小玻璃瓶(3mL容量)，以橡皮塞封口後，蓋上鋁蓋旋緊來調製。之後，對於各試樣，基於以SE-HPLC法所測定之多聚體量，評估於正置狀態下25℃保管1週後之PB009-2之安定性。SE-HPLC法係與實驗1-4同樣地進行。

本實驗所得到之SE-HPLC法之評估結果示於表7。25℃保管1週後之SE-HPLC多聚體量(%)，於低pH及高pH試樣均有增加傾向，於pH6.7附近為最小。因此，得知pH6.7為最佳pH，且作為適切地維持最佳pH之緩衝劑，以20 mmol/L檸檬酸為特佳。

實驗1-7：以DFO-抗人類CEACAM5抗體Fab片段複合體之安定化為目的之安定化劑濃度的最佳化探討 對於含有10mg/mL之PB009-2，且20mmol/L檸檬酸、0.05w/v%聚山梨醇酯80、pH6.7之處方的液劑(試樣No.E-1~E-5)，調製含有0~20w/v%之範圍的蔗糖或甘油之試樣。試樣係調製為各處方組成後，以0.22μm之濾器無菌過濾，各填充1.2mL至小玻璃瓶(3mL容量)，以橡皮塞封口後，蓋上鋁蓋旋緊來調製。再者，依需要於緩衝液調製時添加鹽酸及/或氫氧化鈉作為pH調整劑，使成為特定之pH。之後、對於各試樣，基於以SE-HPLC法所測定之多聚體量來評估於正置狀態下25℃保管1週後之PB009-2之安定性。SE-HPLC法係與實驗1-4同樣地進行。

本實驗所得到之SE-HPLC法之評估結果示於表8。其結果，確認到25℃保管1週後，伴隨蔗糖或甘油之添加濃度增加，SE-HPLC多聚體量(%)之生成受到抑制。又，於蔗糖與甘油間，對安定性所造成的影響觀察不到差異。由以上結果，得知就滲透壓比之觀點，作為用於含有PB009-2之液劑的醫藥品添加劑，以10w/v%蔗糖為特佳。

實驗1-8：含有DFO-抗人類CEACAM5抗體Fab片段複合體之安定化溶液製劑中₈₉ Zr標識化的探討 評估於含有10mg/mL之PB009-2的下述表9記載之處方的液劑中，於-80℃保管後₈₉ Zr之標識效率。₈₉ Zr係以溶解於1M草酸水溶液之₈₉ Zr-Oxalate的形態來使用於國立大學法人岡山大學自然生命科學研究支援中心光/放射線資訊解析部門鹿田設施所製造者，將40μL之₈₉ Zr-Oxalate以20μL之2M碳酸鈉水溶液中和，以190μL之超純水稀釋。接著，添加含有0.05w/v%聚山梨醇酯80、10 w/v%蔗糖或30w/v%甘油，及20mmol/L檸檬酸之PB009-2 (10mg/mL)液劑150μL，於室溫反應30分鐘。藉由將所得之反應混合物使用Amicon Ultra -0.5mL離心式濾器(Merck Millipore公司)純化，得到目標之PB009-2之₈₉ Zr標識體。該₈₉ Zr-DFO-抗人類CEACAM5抗體Fab片段複合體稱為PB009-3。藉由將純化前後之PB009-3溶液以TLC(thin-layer chromatography)及SE-HPLC法測定，確認₈₉ Zr之反應率。分析條件如以下所述。

TLC係於TLC鋁片(Merck公司、1-05560-0001)少量塗佈樣品，使用0.1M EDTA溶液(pH7.0)作為展開液來實施。₈₉ Zr之反應率係如以下般算出。 (原點附近之放射線量a)/(全體之放射線量b)×100

[粒徑篩析層析法(SE-HPLC法)] SE-HPLC測定，係於HPLC系統連接G3000SWXL (TOSOH公司)，使具備20mmol/L磷酸/150mmol/L氯化鈉/5%乙腈pH7.0之組成的移動相以0.5mL/分鐘之流量流過。管柱溫度係30℃、檢測係以UV 280nm及RI來實施。

試驗之結果，所探討的所有之處方其反應率(純化前)均顯示90%左右的高值(表9)，比較UV檢測器及RI檢測器所觀察到之PB009-3之波峰與UV檢測器所觀察到之PB009-2之波峰，由於各自的保持時間為同等，故確認到DFO-抗人類CEACAM5抗體Fab片段複合體係被₈₉ Zr所標識。又，蔗糖處方及甘油處方均顯示出阻礙₈₉ Zr標識反應的顧慮為小。

實驗1-9：含有DFO-抗人類CEACAM5抗體Fab片段複合體之製劑中保管時之安定性的探討 對於含有PB009-2之液劑，摻合檸檬酸、蔗糖及聚山梨醇酯80，使PB009-2之最終濃度成為10mg/mL，調製表10所示之試樣F-1。再者，pH係適量添加鹽酸或氫氧化鈉來調整。又，將該試樣以孔徑0.22μm之濾器無菌過濾，各填充1.2mL至小玻璃瓶(3mL容量)，以橡皮塞封口後，蓋上鋁蓋旋緊來調製。

為了評估液劑之安定性，進行各試樣於正置狀態之保管安定性試驗。保管安定性試驗，係基於以SE-HPLC法所測定之多聚體量，來評估於-20℃或5℃保管1~6個月後之PB009-2之安定性。SE-HPLC法係與實驗1-4同樣地進行。

本實驗所得到之SE-HPLC法之評估結果示於表11。其結果，確認到於-20℃之保管，至少6個月之保管安定性是沒有問題的。且確認到於5℃之保管，至1個月為止的保管安定性係與同時期之於-20℃之保管安定性同等。

實驗2-1：抗人類MUC1抗體Fab片段之製作 製作稱為P10-1 Fab及P10-2 Fab之2種抗人類MUC1抗體Fab片段。P10-1 Fab及P10-2 Fab之重鏈可變區域及輕鏈可變區域之胺基酸序列，具體而言，係參考文獻(Front Biosci.；2008 Jan 1；13：1619-33)記載之方法，將來自小鼠之抗人類癌特異性的MUC1抗體即1B2抗體予以人類化後，使用根據文獻(Proteins；2014 Aug；82(8)：1624-35)所構築之人類化抗體之分子模式，設計期待親和性提高及即使結合有標識部親和性亦不會減弱之序列。

製作插入有於P10-1 Fab及P10-2 Fab之各重鏈片段基因(分別為序列編號5及序列編號7)之5’側連接編碼訊息序列(MEWSWVFLFFLSVTTGVHS(序列編號17))之基因所成之重鏈片段基因的GS載體pEE6.4(Lonza公司)。又，製作插入有於P10-1 Fab及P10-2 Fab共通之輕鏈基因(序列編號9)之5’側連接編碼訊息序列(MSVPTQVLGLLLLWLTDARC(序列編號18))之基因所成之輕鏈基因的GS載體pEE12.4 (Lonza公司)。

以臨時性表現之方法進行Fab片段的表現。對以Expi293 Expression Medium(Thermo Fisher Scientific公司)培養至約250萬個/mL之Expi293F細胞(Thermo Fisher Scientific公司)，使用ExpiFectamine 293 Transfection Kit (Thermo Fisher Scientific公司)將前述之重鏈片段及輕鏈之GS載體進行轉染，培養8日。表現後，將培養上清使用KappaSelect(GE Healthcare公司)進行純化，得到各Fab片段。

P10-1 Fab之重鏈片段之鹼基序列示於序列編號5、被其所編碼之胺基酸序列示於序列編號6。P10-1 Fab之重鏈可變區域之鹼基序列示於序列編號11、被其所編碼之胺基酸序列示於序列編號12。

P10-2 Fab之重鏈片段之鹼基序列示於序列編號7、被其所編碼之胺基酸序列示於序列編號8。P10-2 Fab之重鏈可變區域之鹼基序列示於序列編號13、被其所編碼之胺基酸序列示於序列編號14。

P10-1 Fab及P10-2 Fab之輕鏈係共通地，其鹼基序列示於序列編號9、被其所編碼之胺基酸序列示於序列編號10。P10-1 Fab及P10-2 Fab之輕鏈可變區域之鹼基序列示於序列編號15、被其所編碼之胺基酸序列示於序列編號16。

分析經純化之P10-2 Fab之胺基酸修飾的結果，指出了純化抗體之大部分，重鏈N末端之麩醯胺被修飾為焦麩胺酸。

實驗2-2：抗人類MUC1抗體Fab片段之鉗合劑標識化 鉗合劑DFO對抗人類MUC1抗體Fab片段P10-2之結合，係使用p-SCN-Bn-DFO(經p-異硫氰基苯基胺基硫羰基取代之DFO)(Macrocyclics公司)。對經磷酸緩衝生理食鹽水(pH7.4)調整為12.5mg/mL之Fab片段溶液，添加100mmol/L碳酸鈉溶液，使成為10mmol/L，調整為pH9.0。對其添加p-SCN-Bn-DFO，成為終濃度1mmol/L，於37℃反應2小時。由於p-SCN-Bn-DFO具有異硫氰酸酯基，因此與Fab片段之Lys迅速反應。將其以Amicon Ultra 10K-0.5mL離心式濾器回收，將DFO透過連結子(-C(=S)-NH-(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-)而結合的DFO-抗人類MUC1抗體Fab片段複合體(稱為PB010-3)進行純化。

實驗2-3：pH 對DFO-抗人類MUC1抗體Fab片段複合體之安定化所造成的影響之探討(對多聚體生成及不溶性微粒子生成之影響) 對於含有PB010-3之液劑，評估pH對PB010-3之安定化所造成的影響。本試驗中，係對含有PB010-3之液劑，摻合緩衝劑、安定化劑及非離子性界面活性劑，使PB010-3之最終濃度成為10mg/mL，來調製表12所示之試樣G-1~ G-6。pH係適量添加鹽酸或氫氧化鈉來調整。將各試樣以孔徑0.22μm之濾器無菌過濾，各填充1.2mL至小玻璃瓶(3 mL容量)，以橡皮塞封口後，蓋上鋁蓋旋緊來調製。

為了評估液劑之安定性，進行各試樣於正置狀態之熱安定性試驗。熱安定性試驗，係基於以粒徑篩析層析法(SE-HPLC法)所測定之多聚體量，及以光遮蔽粒子計數法所測定之不溶性微粒子數，來評估40℃保管1週後之PB010-3之安定性。分析條件如以下所述。

[SE-HPLC法] SE-HPLC測定，係於HPLC系統連接BioSep SEC s3000 (Phenomenex公司)，使用PBS(pH7.4)作為移動相，以0.5 mL/分鐘之流量流過。以PB010-3換算，試樣係成為20 μg之注入量(例：2mg/mL時為10μL)。管柱溫度設定為30℃、試樣溫度設定為10℃，檢測係於UV 280nm實施。

[光遮蔽粒子計數法] 將樣品0.2 mL注入HIAC系統(Pacific Scientific公司)，實施測定1.2μm以上之不溶性微粒子數。

藉由自動分析法測定以SE-HPLC法所檢測的多聚體之面積，求得多聚體之量(%)。就多聚體量而言，係藉由自動分析法測定以SE-HPLC法所檢測的多聚體波峰之面積，藉由除以包含主波峰之全部波峰面積總和，而作為百分率(%)來規定。此處主波峰，係指活性本體(未經多聚體化之PB010-3)之波峰。

本實驗所得到之SE-HPLC法、光遮蔽粒子計數法之評估結果示於表13。其結果，40℃保管1週後之SE-HPLC多聚體量(%)，當pH越高則越有增加傾向。又，40℃保管1週後之1.2μm以上之不溶性微粒子數，當pH越低則越有增加傾向。綜合判斷以上結果，確認到就安定性之觀點，含有PB010-3之液劑的pH係以6.5~7.0附近為最適宜。

實驗2-4：安定化劑、非離子性界面活性劑對DFO-抗人類MUC1抗體Fab片段複合體之安定化所造成的影響之探討(對多聚體生成及不溶性微粒子生成之影響) 對於含有PB010-3之液劑，評估各種安定化劑對PB010-3之安定性所造成的影響。本探討中，係對含有PB010-3之液劑，摻合緩衝劑、安定化劑及非離子性界面活性劑，使PB010-3之最終濃度成為10mg/mL，調製表14所示之試樣H-1~H-4。再者，pH係適量添加鹽酸或氫氧化鈉來調整。將各試樣以孔徑0.22μm之濾器無菌過濾，各填充1.2mL至小玻璃瓶(3mL容量)，以橡皮塞封口後，蓋上鋁蓋旋緊來調製。

為了評估液劑之安定性，係進行各試樣之保管試驗及振盪試驗。保管試驗係藉由將各試樣於5℃及-20℃條件下靜置保管來進行。又，振盪試驗係藉由將試樣以150rpm振盪24小時來進行。基於以粒徑篩析層析法(SE-HPLC法)所測定之多聚體量，及以光遮蔽粒子計數法所測定之不溶性微粒子數，來評估各試驗前後之PB010-3之安定性。 分析條件係與實驗2-3相同。

本實驗所得到之SE-HPLC法、光遮蔽粒子計數法之評估結果示於表15、表16。其結果，未添加聚山梨醇酯80之處方，及添加聚山梨醇酯80以外又添加蔗糖或甘油之處方中，即使於5℃或-20℃保管3個月，亦觀察到多聚體量之增加抑制效果。另一方面，未添加聚山梨醇酯80之處方中，於振盪試驗後，觀察到不溶性微粒子數之顯著增加。由以上結果，得知較期望於聚山梨醇酯80以外，再添加蔗糖或甘油之處方，進而就滲透壓比之觀點，作為用於含有PB010-3之液劑的醫藥品添加劑，係以10w/v%蔗糖為特佳。

實驗2-5：界面活性劑對DFO-抗人類MUC1抗體Fab片段複合體之安定化所造成的影響之探討(對不溶性微粒子生成之影響) 對於含有PB010-3之液劑，評估界面活性劑對PB010-3之安定性所造成的影響。本試驗中，係對含有PB010-3之液劑，摻合緩衝劑、安定化劑及非離子性界面活性劑，使PB010-3之最終濃度成為10mg/mL，調整pH以調製表17所示之試樣I-1~I-4。再者，pH係適量添加鹽酸或氫氧化鈉來調整。將各試樣以孔徑0.22μm之濾器無菌過濾，各填充1.2mL至小玻璃瓶(3mL容量)，以橡皮塞封口後，蓋上鋁蓋旋緊來調製。

為了評估液劑之安定性，係進行各試樣之振盪試驗及冷凍融解試驗。振盪試驗係將試樣以150rpm振盪24小時來進行。冷凍融解試驗，係實施共3次之將試樣於-80℃花費4小時以上冷凍，之後，於5℃花費4小時以上融解之程序來進行。然後，基於以光遮蔽粒子計數法所測定之不溶性微粒子數，來評估各試驗前後之PB010-3之安定性。分析條件係與實驗2-3相同。

本實驗所得到之光遮蔽粒子計數法之評估結果示於表18。其結果，確認到聚山梨醇酯80藉由成為0.02 w/v%以上之濃度，而具有振盪時及冷凍融解時之不溶性微粒子數增加抑制效果。

實驗2-6：含有DFO-抗人類MUC1抗體Fab片段複合體之安定化溶液製劑中的₈₉ Zr標識化之探討 於含有10mg/mL之PB010-3的下述表19記載處方之液劑中，評估-80℃保管後之₈₉ Zr之標識效率。₈₉ Zr係以溶解於1M草酸水溶液之₈₉ Zr-Oxalate的形態來使用於國立大學法人岡山大學自然生命科學研究支援中心 光/放射線資訊解析部門鹿田施設所製造者，將40μL之₈₉ Zr-Oxalate以20μL之2M碳酸鈉水溶液中和，以190μL之超純水稀釋。接著，添加含有0.05w/v%聚山梨醇酯80、10 w/v%蔗糖或30w/v%甘油，及20mmol/L檸檬酸之PB010-3 (10mg/mL)液劑150μL，於室溫反應60分鐘。藉由將所得之反應混合物，使用Amicon Ultra -0.5mL離心式濾器(Merck Millipore公司)純化，得到目標之PB010-3之₈₉ Zr標識體。該經₈₉ Zr標識之P10-2 Fab DFO(PB010-3)稱為PB010-4。藉由以TLC(thin-layer chromatography)及SE-HPLC法測定純化前後之PB010-4溶液，確認₈₉ Zr之反應率。TLC及SE-HPLC法之分析條件係與實驗1-8相同。

試驗之結果，所探討的所有之處方其反應率(純化前)均顯示90%左右的高值(表19)，比較UV檢測器及RI檢測器所觀察到之PB010-4之波峰與UV檢測器所觀察到之PB010-3之波峰，由於各自的保持時間為同等，故確認到PB010-3係被₈₉ Zr所標識。實施探討的處方，均顯示出阻礙₈₉ Zr標識反應之顧慮小。

實驗2-7：含有DFO-抗人類MUC1抗體Fab片段複合體之製劑在保管時之安定性的探討 對於含有PB010-3之液劑，評估冷藏及冷凍保管時之安定性。本試驗中，係對於含有PB010-3之液劑，摻合緩衝劑、安定化劑及非離子性界面活性劑，使PB010-3之最終濃度成為10mg/mL，基於表20調製試樣J-1。pH係適量添加鹽酸或氫氧化鈉來調整。將各試樣以孔徑0.22μm之濾器無菌過濾，各填充1.2mL至小玻璃瓶(3mL容量)，以橡皮塞封口後，蓋上鋁蓋旋緊來調製。

為了評估液劑之安定性，係將各試樣於5℃及-20℃條件下靜置保管。基於以SE-HPLC法所測定之多聚體量、以逆相層析法(RP-HPLC法)所測定之游離Fab體量(%)，及以光遮蔽粒子計數法所測定之不溶性微粒子數，評估保管後之PB010-3之安定性。分析條件如以下所述。

[SE-HPLC法] 係以與實驗2-3相同之條件實施。

[RP-HPLC法] RP-HPLC測定，係於HPLC系統連接Intrada WP-RP (Imtakt公司)，進行測定。於移動相A線路連接0.1%TFA、於移動相B線路連接0.1%TFA/乙腈，以下表所示之比例，以1.0mL/分鐘之流量流過。以PB010-3換算，試樣係成為20μg之注入量(例：1mg/mL時為20μL)，應用表21之RP-HPLC梯度程式。管柱溫度設定為60℃、試樣溫度設定為10℃，檢測係於UV 214nm實施。

藉由自動分析法測定以RP-HPLC法所檢測的多聚體之面積，求得游離Fab體量(%)。就游離Fab體量而言，係藉由自動分析法測定以RP-HPLC法所檢測的游離Fab片段之波峰之面積，藉由除以包含主波峰之全部波峰面積總和，而作為百分率(%)來規定。此處主波峰，係指活性本體之波峰。

[光遮蔽粒子計數法] 係以與實驗2-3相同之條件實施。

本實驗所得到之SE-HPLC法、RP-HPLC法、光遮蔽粒子計數法之評估結果示於表22。其結果，確認到至3個月為止之保管安定性係沒有問題的。

實驗3-1：抗人類MUC1抗體Fab片段之螢光標識化 對實驗2-1所調製之P10-2 Fab進行螢光色素之導入。具體而言，係對經磷酸緩衝生理食鹽水(pH7.4)調整為約1mg/mL之Fab片段溶液，添加1/10量之1M磷酸氫二鉀溶液(pH9)，調整為pH8.5。對其添加IRDye800CW NHS Ester (LI-COR Biosciences公司)，成為終濃度310.8μg/mL，於室溫及遮光下攪拌2小時。由於IRDye800CW NHS Ester具有N-羥基琥珀醯亞胺基，因此與Fab片段之Lys迅速反應。將其以Amicon Ultra 3K-0.5mL離心式濾器(Merck Millipore公司)回收，純化IRDye800CW-抗人類MUC1抗體Fab片段複合體(稱為PB010-2)。

實驗3-2：pH對IRDye800CW-抗人類MUC1抗體Fab片段複合體之安定化所造成的影響 對於含有PB010-2之液劑，評估pH對PB010-2之安定化所造成的影響。本試驗中，係將PB010-2之濃度設為10 mg/mL，基於表23來調製試樣K-1~K-5。pH係適量添加鹽酸或氫氧化鈉來調整。將各試樣以孔徑0.22μm之濾器無菌過濾，各填充1.2mL至小玻璃瓶(3mL容量)，以橡皮塞封口後，蓋上鋁蓋旋緊來調製。

為了評估液劑之安定性，進行各試樣於正置狀態之熱安定性試驗。熱安定性試驗，係由以粒徑篩析層析法(SE-HPLC法)所測定之多聚體量，及以微流成像(microflow imaging)法所測定之不溶性微粒子數，來評估40℃保管1週後之PB010-2之安定性。分析條件如以下所述。

[粒徑篩析層析法(SE-HPLC法)] SE-HPLC測定，係於HPLC系統連接G2000SWXL (TOSOH公司)，使具備20mmol/L磷酸/1000mmol/L氯化鈉pH7.0之組成的移動相以0.5mL/分鐘之流量流過。換算為PB010-2，試樣係成為50μg之注入量(例：5mg/mL時為10 μL)。管柱溫度設為30℃、試樣溫度設為5℃，檢測係於UV 280nm實施。

藉由自動分析法測定以SE-HPLC法所檢測的多聚體之面積，求得多聚體量(%)。就多聚體量而言，係藉由自動分析法測定以SE-HPLC法所檢測的多聚體波峰之面積，藉由除以包含主波峰之全部波峰面積總和，而作為百分率(%)來規定。此處主波峰，係指活性本體之波峰。

[微流成像法] 於微流成像系統(Protein Simple公司)注入樣品650 μL，實施測定試樣1mL中所含有的粒徑1.2μm以上之不溶性微粒子之粒子數。

本試驗所得到之SE-HPLC法、微流成像法之評估結果示於表24。其結果，40℃保管1週後之SE-HPLC多聚體，當pH越高，越有增加之傾向。又，40℃保管1週後之1.2μm以上的不溶性微粒子數，當pH越低越有增加之傾向。綜合判斷以上結果，可確認到pH6.5~7.5附近係最佳pH。

實驗3-3：安定化劑，或非離子性界面活性劑對IRDye800CW-抗人類MUC1抗體Fab片段複合體之安定化所造成的影響 對於含有PB010-2之液劑，評估各種安定化劑對PB010-2之安定性所造成的影響。本試驗中，係對於含有PB010-2之液劑，摻合緩衝劑及添加劑，使PB010-2之最終濃度成為10mg/mL，基於表25來調製試樣L-1~L-6。pH係適量添加鹽酸或氫氧化鈉來調整。將各試樣以孔徑0.22μm之濾器無菌過濾，各填充1.2mL至小玻璃瓶(3mL容量)，以橡皮塞封口後，蓋上鋁蓋旋緊來調製。

為了評估液劑之安定性，係進行各試樣之振盪試驗、冷凍融解試驗、熱安定性試驗，及光曝露試驗。振盪試驗係將試樣以150rpm振盪24小時來進行。冷凍融解試驗，係共實施3次將試樣於-80℃花費4小時以上冷凍，之後，於5℃花費4小時以上融解之程序來進行。熱安定性試驗，係將試樣於40℃保管2週來進行。光曝露試驗，係藉由將試樣於橫置狀態保管，並使用白色螢光燈照射96小時之1000lx之光來進行。然後，基於以粒徑篩析層析法(SE-HPLC法)所測定之多聚體量、以逆相層析法(RP-HPLC法)所測定之Dye Antibody Ratio，及以微流成像法所測定之不溶性微粒子數，來評估各試驗前後之PB010-2之安定性。分析條件如以下所述。

[粒徑篩析層析法(SE-HPLC法)] SE-HPLC測定，係於HPLC系統連接AdvanceBio SEC 300A(Agilent公司)，使具備20mmol/L磷酸/1000mmol/L氯化鈉pH7.0之組成的移動相以0.5mL/分鐘之流量流過。換算為PB010-2，試樣係成為50μg之注入量(例：5mg/mL時為10μL)。管柱溫度設定為30℃、試樣溫度設定為5℃，檢測係於UV 280nm實施。

藉由自動分析法測定以SE-HPLC法所檢測的多聚體之面積，求得多聚體量(%)。就多聚體量而言，係藉由自動分析法測定以SE-HPLC法所檢測的多聚體波峰之面積，藉由除以包含主波峰之全部波峰面積總和，而作為百分率(%)來規定。此處主波峰，係指活性本體之波峰。

[逆相層析法(RP-HPLC法)] RP-HPLC測定，係於HPLC系統連接Intrada WP-RP (Imtakt公司)，進行測定。於移動相A線路連接0.1%三氟乙酸/水、於移動相B線路連接0.1%三氟乙酸/乙腈，以1.0 mL/min之流速流過。換算為PB010-2，試樣係成為10μg之注入量(例：1mg/mL時為10μL)，應用表26之RP-HPLC梯度程式。分析時間係45分鐘、檢測係以UV波長280；780 nm來實施。管柱溫度設定為75℃、試樣溫度設定為5℃。

使用以RP-HPLC法所檢測的於UV波長780nm之波峰之總面積、於UV波長280nm之波峰之總面積、PB010-1之吸光係數(1.42 mL/mg･cm-1)、PB010-1之分子量(47527.43)及IRDye800CW之於PBS中之莫耳吸光係數(240000 mL/mmol･cm-1)，藉由應用於以下之計算式來求得Dye Antibody Ratio。

[微流成像法] 於微流成像系統(Protein Simple公司)注入樣品650 μL，實施測定試樣1mL中所含有的粒徑1.0μm以上之不溶性微粒子之粒子數。

本實驗所得到之SE-HPLC法、RP-HPLC法，及微流成像法之評估結果示於表27~29。於精胺酸添加處方及蔗糖添加處方中，觀察到40℃保管2週後之多聚體量的增加有被抑制之傾向。又，精胺酸添加處方中，於40℃保管2週後，觀察到Dye Antibody Ratio之降低。進一步地，於氯化鈉添加處方及添加劑無添加處方中，冷凍融解後之不溶性微粒子數，相較於其他處方而言，觀察到增加的傾向。綜合判斷以上結果，確認到就安定性之觀點，作為含有PB010-2之液劑之安定化劑及等張化劑，係以蔗糖較適宜。

實驗3-4：以IRDye800CW-抗人類MUC1抗體Fab片段複合體之安定化為目的之最佳pH選定 對於含有PB010-2之液劑，針對於以20mmol/L檸檬酸或20mmol/L磷酸為緩衝劑之處方(試樣No.M-1~M-10)，於pH6.6~7.4之範圍調製試樣。試樣之PB010-2最終濃度係10 mg/mL，依需要於緩衝液調製時添加鹽酸及/或氫氧化鈉作為pH調整劑，使成為特定之pH。將各試樣以0.22μm之濾器無菌過濾，各填充1.2mL至小玻璃瓶(3mL容量)，以橡皮塞封口後，蓋上鋁蓋旋緊來調製。基於以SE-HPLC法所測定之多聚體量及以RP-HPLC所測定之Dye Antibody Ratio來評估各試樣之振盪試驗、冷凍融解試驗、熱安定性試驗，及光曝露試驗後之安定性。再者，SE-HPLC法及RP-HPLC法係與實驗3-3同樣地測定。

結果示於表30~31。 就多聚體量及Dye Antibody Ratio之觀點，當pH越低，則越安定(高pH時因熱/光壓力而不安定)。另一方面，越接近pH6.0，則有溶解度降低導致微粒子生成的風險，故得知pH6.8為特佳。

實驗3-5：緩衝劑及界面活性劑對IRDye800CW-抗人類MUC1抗體Fab片段複合體之安定化所造成的影響 調製對含有PB010-2，且添加有20mmol/L檸檬酸(pH 6.8)或20mmol/L磷酸(pH6.8)、280mmol/L蔗糖之處方，添加0.05w/v%之界面活性劑聚山梨醇酯80的試樣與不添加的試樣(試樣No.N-1~N-4)。PB010-2之最終濃度係10mg/mL。試樣係調製為各處方組成後，以0.22μm之濾器無菌過濾，各填充1.2mL至小玻璃瓶(3mL容量)，以橡皮塞封口後，蓋上鋁蓋旋緊來調製。再者，依需要於緩衝液調製時添加鹽酸及/或氫氧化鈉作為pH調整劑，使成為特定之pH。

將試樣於-20℃或5℃保管1個月，又，熱安定性試驗，係於正置狀態，40℃保管2週或25℃保管1個月來進行。光曝露試驗係藉由將試樣於橫置狀態保管，使用白色螢光燈照射96小時之1000lx之光來進行。然後，基於以SE-HPLC法所測定之多聚體量、以微流成像法所測定之不溶性微粒子數，及以SE-HPLC法所測定之螢光強度、以Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay(ELISA)法所測定之抗原結合活性來評估各試驗前後之PB010-2之安定性。再者，SE-HPLC法及微流成像法係根據實驗3-3之方法測定。就螢光強度而言，係藉由將所檢測之主波峰之螢光強度代入下述式來評估。

[ELISA法] 將含有0.8nM之hMUC-1(PEPTIDE INSTITUTE公司)抗原的磷酸緩衝液添加至分析試驗盤，於2~8℃處理18小時後，使用含有20% Blocking One(Nacalai Tesque公司)及0.05w/v%之Tween-20的TRIS緩衝生理食鹽水(TBS)固定抗原。將PB010-2溶液於0~100000ng/mL之濃度範圍以含有5% Blocking One及0.05w/v%之Tween-20的TBS階段稀釋，添加於固定有抗原之試驗盤上。將試驗盤於25℃60分鐘培置(incubate)後，將稀釋為4000倍之goat anti-human Kappa-HRP(Southern Biotech公司)添加於試驗盤中。將試驗盤於25℃60分鐘培置後，實施洗淨3次。對試驗盤添加100 μL TMB+Substrate-Chromogen(Dako公司)後，於25℃20分鐘培置，添加1mol/L硫酸藉以使反應停止。之後，使用Spectra Max 190(Molecular Devices公司)評估450nm之UV吸收，藉以評估結合活性。再者，PB010-2標準品之活性設為100%，作為相對結合活性來算出。

結果示於表32~35。 於添加聚山梨醇酯80之處方中，熱安定性試驗及光曝露試驗後之不溶性微粒子的增加受到抑制，故得知作為非離子性界面活性劑，係以使用0.05w/v%聚山梨醇酯80為特佳。又，添加檸檬酸之處方中，相較於添加磷酸之處方而言，40℃保管後之多聚體增加傾向小，故得知作為緩衝劑，係以使用檸檬酸為特佳。又，於所有的處方及保管條件中，均未觀察到抗原結合活性及螢光強度之降低。

實驗3-6：含有IRDye800CW-抗人類MUC1抗體Fab片段複合體之製劑在保管時之安定性的探討 對使用20mmol/L檸檬酸調製為pH6.8之處方溶液，添加為PB010-2濃度10mg/mL、蔗糖濃度280mmol/L、聚山梨醇酯80濃度0.05w/v%，調製表36所示之處方，以0.22μm之濾器無菌過濾，各填充1.2mL於小玻璃瓶(3mL容量)。將試樣進行冷凍乾燥，以橡皮塞封口後，蓋上鋁蓋旋緊。之後，評估熱安定性試驗後或光曝露試驗後之PB010-2之安定性。

熱安定性試驗，係藉由將試樣於正置狀態，40℃保管2週來進行。光曝露試驗，係藉由將試樣於橫置狀態保管，使用白色螢光燈照射96小時之1000lx之光來進行。然後，基於以SE-HPLC法所測定之多聚體量及螢光強度，及以RP-HPLC法所測定之Dye Antibody Ratio，來評估各試驗前後之PB010-2之安定性。再者，SE-HPLC法及RP-HPLC法係根據實驗3-3來測定。又，螢光強度之評估係與實驗3-5同樣地測定。

結果示於表37~39，其顯示出藉由成為上述處方，即使40℃保管2週後、即使光曝露後，亦安定地維持PB010-2。

[序列表非關鍵詞文字]

序列編號1：編碼PB009-1 Fab重鏈片段之DNA之鹼基序列 序列編號2：PB009-1 Fab重鏈片段之胺基酸序列 序列編號3：編碼PB009-1 Fab輕鏈之DNA之鹼基序列 序列編號4：PB009-1 Fab輕鏈之胺基酸序列 序列編號5：編碼P10-1 Fab重鏈片段之DNA之鹼基序列 序列編號6：P10-1 Fab重鏈片段之胺基酸序列 序列編號7：編碼P10-2 Fab重鏈片段之DNA之鹼基序列 序列編號8：P10-2 Fab重鏈片段之胺基酸序列 序列編號9：編碼P10-1 Fab及P10-2 Fab輕鏈之DNA之鹼基序列 序列編號10：P10-1 Fab及P10-2 Fab輕鏈之胺基酸序列 序列編號11：編碼P10-1 Fab重鏈可變區域之DNA之鹼基序列 序列編號12：P10-1 Fab重鏈可變區域之胺基酸序列 序列編號13：編碼P10-2 Fab重鏈可變區域之DNA之鹼基序列 序列編號14：P10-2 Fab重鏈可變區域之胺基酸序列 序列編號15：編碼P10-1 Fab及P10-2 Fab輕鏈可變區域之DNA之鹼基序列 序列編號16：P10-1 Fab及P10-2 Fab輕鏈可變區域之胺基酸序列 序列編號17：用於PB009-1 Fab、P10-1 Fab及P10-2 Fab之重鏈訊息序列 序列編號18：用於PB009-1 Fab、P10-1 Fab及P10-2 Fab之輕鏈訊息序列 序列編號19：MUC1之細胞外結構域之串聯重複(tandem repeat)序列

Claims (26)

1. 一種醫藥組成物，其係含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體、緩衝劑、安定化劑，及非離子性界面活性劑，且pH為6.5~7.5之醫藥組成物，其中該抗人類抗體Fab片段，為選自由以下之(a)及(b)：(a)含有包含由序列編號2之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的重鏈片段及包含由序列編號4之胺基酸編號1至112之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的輕鏈之抗人類CEACAM5抗體Fab片段；以及(b)含有包含由序列編號2之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成且序列編號2之胺基酸編號1的麩胺酸被修飾為焦麩胺酸之重鏈可變區域的重鏈片段，及包含由序列編號4之胺基酸編號1至112之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的輕鏈之抗人類CEACAM5抗體Fab片段所成之群的1者以上者，標識部為下式(I)：

   

   [式中，波線表示對抗人類CEACAM5抗體Fab片段之結合，此處抗人類CEACAM5抗體Fab片段，係透過抗人類CEACAM5抗體Fab片段中之胺基，而與標識部末端之C(=S)的碳原子結合]表示之基，該緩衝劑為包含檸檬酸、磷酸、2-[4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸，或參羥基甲基胺基甲烷者，該安定化劑為包含蔗糖，或甘油者，及該非離子性界面活性劑，為含有聚山梨醇酯80者。
2. 如請求項1之醫藥組成物，其中該抗人類抗體Fab片段，為選自由以下之(a)及(b)：(a)含有由序列編號2所示之胺基酸序列所成之重鏈片段及由序列編號4所示之胺基酸序列所成之輕鏈的抗人類CEACAM5抗體Fab片段；以及(b)含有由序列編號2所示之胺基酸序列所成且序列編號2之胺基酸編號1的麩胺酸被修飾為焦麩胺酸之重鏈片 段，及由序列編號4所示之胺基酸序列所成之輕鏈的抗人類CEACAM5抗體Fab片段所成之群的1者以上者。
3. 一種醫藥組成物，其係含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體、緩衝劑、安定化劑，及非離子性界面活性劑，且pH為6.5~7.5之醫藥組成物，其中該抗人類抗體Fab片段，為選自由以下之(a)及(b)：(a)含有包含由序列編號12或序列編號14所示之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的重鏈片段及包含由序列編號16所示之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的輕鏈之抗人類MUC1抗體Fab片段；以及(b)含有包含由序列編號12或序列編號14所示之胺基酸序列所成且序列編號12或序列編號14之胺基酸編號1的麩醯胺被修飾為焦麩胺酸之重鏈可變區域的重鏈片段，及包含由序列編號16所示之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的輕鏈之抗人類MUC1抗體Fab片段所成之群的1者以上者，標識部為下式(I)：

   

   [式中，波線表示對抗人類MUC1抗體Fab片段之結合，此處抗人類MUC1抗體Fab片段，係透過抗人類MUC1抗體Fab片段中之胺基，而與標識部末端之C(=S)的碳原子結合]表示之基，該緩衝劑為包含檸檬酸、磷酸、2-[4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸，或參羥基甲基胺基甲烷者，該安定化劑為包含蔗糖，或甘油者，及該非離子性界面活性劑，為含有聚山梨醇酯80者。
4. 如請求項3之醫藥組成物，其中該抗人類抗體Fab片段，為選自由以下之(a)及(b)：(a)含有由序列編號6或序列編號8所示之胺基酸序列所成之重鏈片段及由序列編號10所示之胺基酸序列所成之輕鏈的抗人類MUC1抗體Fab片段；以及(b)含有由序列編號6或序列編號8所示之胺基酸序列所成且序列編號6或序列編號8之胺基酸編號1的麩醯胺被 修飾為焦麩胺酸之重鏈片段，及由序列編號10所示之胺基酸序列所成之輕鏈的抗人類MUC1抗體Fab片段所成之群的1者以上者。
5. 如請求項1~4中任一項之醫藥組成物，其中該緩衝劑之濃度為10~30mmol/L，該安定化劑之濃度為5~30w/v%，及該非離子性界面活性劑之濃度為0.02~0.2w/v%。
6. 如請求項5之醫藥組成物，其中該緩衝劑包含檸檬酸。
7. 如請求項2或4之醫藥組成物，其中該緩衝劑包含檸檬酸，該緩衝劑之濃度為10~30mmol/L，該安定化劑之濃度為5~30w/v%，及該非離子性界面活性劑之濃度為0.02~0.2w/v%。
8. 如請求項7之醫藥組成物，其中該標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之濃度為5~20mg/mL，pH之範圍為6.5~7.0，該緩衝劑之濃度為15~25mmol/L，及該非離子性界面活性劑之濃度為0.04~0.1w/v%。
9. 如請求項8之醫藥組成物，其中該安定化劑為蔗糖。
10. 如請求項9之醫藥組成物，其中 該標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之濃度為10mg/mL，該pH為6.7，該緩衝劑之濃度為20mmol/L，該安定化劑之濃度為10w/v%，及該非離子性界面活性劑之濃度為0.05w/v%。
11. 如請求項8之醫藥組成物，其中該安定化劑為甘油。
12. 如請求項11之醫藥組成物，其中該標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之濃度為10mg/mL，該pH為6.7，該緩衝劑之濃度為20mmol/L，該安定化劑之濃度為30w/v%，及該非離子性界面活性劑之濃度為0.05w/v%。
13. 如請求項1~4中任一項之醫藥組成物，其中標識部-抗人類抗體Fab片段複合體，進一步包含₈₉Zr。
14. 如請求項7之醫藥組成物，其中標識部-抗人類抗體Fab片段複合體，進一步包含₈₉Zr。
15. 如請求項13之醫藥組成物，其係使用於大腸癌或大腸癌轉移之癌的診斷。
16. 如請求項14之醫藥組成物，其係使用於大腸癌或大腸癌轉移之癌的診斷。
17. 如請求項13之醫藥組成物，其係使用於乳癌或乳癌轉移之癌的診斷。
18. 如請求項14之醫藥組成物，其係使用於乳癌或乳癌轉移之癌的診斷。
19. 如請求項1~4中任一項之醫藥組成物，其係溶液製劑、冷凍製劑，或冷凍乾燥製劑。
20. 如請求項7之醫藥組成物，其係溶液製劑、冷凍製劑，或冷凍乾燥製劑。
21. 一種如請求項1或2之醫藥組成物之製造方法，其包含(a)製造並摻合標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之步驟、(b)摻合檸檬酸、磷酸、2-[4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸，或參羥基甲基胺基甲烷作為緩衝劑之步驟、(c)摻合蔗糖，或甘油作為安定化劑之步驟、(d)摻合聚山梨醇酯80作為非離子性界面活性劑之步驟，及(e)將pH調整為6.5~7.5之步驟。
22. 一種如請求項3或4之醫藥組成物之製造方法，其包含(a)製造並摻合標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之步驟、(b)摻合檸檬酸、磷酸、2-[4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸，或參羥基甲基胺基甲烷作為緩衝劑之步驟、 (c)摻合蔗糖，或甘油作為安定化劑之步驟、(d)摻合聚山梨醇酯80作為非離子性界面活性劑之步驟，及(e)將pH調整為6.5~7.5之步驟。
23. 一種如請求項7之醫藥組成物之製造方法，其包含(a)製造並摻合標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之步驟、(b)摻合10~30mmol/L的檸檬酸作為緩衝劑之步驟、(c)摻合5~30w/v%的蔗糖或甘油作為安定化劑之步驟、(d)摻合0.02~0.2w/v%的聚山梨醇酯80作為非離子性界面活性劑之步驟，及(e)將pH調整為6.5~7.5之步驟。
24. 一種安定地保存包含在如請求項1或2之醫藥組成物中之標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之方法，其包含(a)對含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之溶液，摻合檸檬酸、磷酸、2-[4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸，或參羥基甲基胺基甲烷作為緩衝劑之步驟、(b)對含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之溶液，摻合蔗糖，或甘油作為安定化劑之步驟、(c)對含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之溶液，摻合聚山梨醇酯80作為非離子性界面活性劑之步驟，及 (d)將含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之溶液的pH調整為6.5~7.5之步驟。
25. 一種安定地保存包含在如請求項3或4之醫藥組成物中之標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之方法，其包含(a)對含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之溶液，摻合檸檬酸、磷酸、2-[4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸，或參羥基甲基胺基甲烷作為緩衝劑之步驟、(b)對含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之溶液，摻合蔗糖，或甘油作為安定化劑之步驟、(c)對含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之溶液，摻合聚山梨醇酯80作為非離子性界面活性劑之步驟，及(d)將含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之溶液的pH調整為6.5~7.5之步驟。
26. 一種安定地保存包含在如請求項7之醫藥組成物中之標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之方法，其包含(a)對含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之溶液，摻合10~30mmol/L的檸檬酸作為緩衝劑之步驟、(b)對含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之溶液，摻合5~30w/v%的蔗糖或甘油作為安定化劑之步驟、(c)對含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之溶液，摻合0.02~0.2w/v%的聚山梨醇酯80作為非離子性界面活性劑之步驟，及 (d)將含有標識部-抗人類抗體Fab片段複合體之溶液的pH調整為6.5~7.5之步驟。