BR112013025225B1 - Preparação de conjugados de anticorpo de maitansinoide por processo de uma etapa - Google Patents

Abstract

PREPARAÇÃO DE CONJUGADOS DE ANTICORPO DE MAITANSINOIDE POR PROCESSO DE UMA ETAPA. A invenção fornece um processo de uma etapa para preparar um conjugado de agente de ligação à célula e agente citotóxico compreendendo contatar um agente de ligação à célula com um agente citotóxico para formar uma primeira mistura compreendendo o agente de ligação à célula e o agente citotóxico e contatar a primeira mistura compreendendo o agente de ligação à célula e o agente citotóxico com um reagente de reticulação bifuncional o qual fornece um ligante, em uma solução tendo um pH de cerca de 4 a cerca de 9 para fornecer uma segunda mistura compreendendo o conjugado de agente de ligação à célula e agente citotóxico, em que o agente de ligação à célula é quimicamente acoplado através do ligante ao agente citotóxico, agente citotóxico livre e subprodutos de reação. A segunda mistura é, então, opcionalmente submetida à purificação para fornecer um conjugado de agente de ligação à célula e agente citotóxico purificado.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido de patente reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório US 61/468.997, depositado em 29 de março de 2011, que é incorporado como referência.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DE MATERIAL SUBMETIDO ELETRONICAMENTE

Incorporados por referência na sua totalidade neste documento é uma listagem de sequência de nucleotídeos do ácido / amino legível por computador identificado como se segue: Um 9,233 Byte ASCII (texto) depositado em nome "710088SequenceListing.TXT”, criado em 3 de abril de 2013.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Conjugados de Anticorpo-Droga (ADC’s) que são úteis para o tratamento de câncer e outras doenças geralmente são compostos de três elementos distintos: um agente de ligação à célula; um ligante; e um agente citotóxico. O método convencional de conjugação de um agente de ligação à célula, como um anticorpo, à um agente citotóxico, emprega duas etapas de reação distintas com o anticorpo. Na primeira etapa de reação (a etapa de modificação), o anticorpo é reagido com um ligante heterobifuncional para produzir um anticoropo modificado por ligante. O produto de anticorpo modificado é, então, opcionalmente purificado a partir do ligante em excesso ou reagente de ligante hidrolisado. Na segunda etapa de reação (a etapa de conjugação), o anticorpo modificado por ligante é reagido com o agente citotóxico contendo um grupo reativo, como tiol, para gerar o conjugado de anticorpo-agente citotóxico, que é novamente purificado em etapa de purificação adicional.

Os processos que foram anteriormente descritos para fabricação dos conjugados de anticorpo-agente citotóxico são complexos porque são onerados com etapas que são problemáticas para realizar ou produzir imunoconjugados que são menos puros ou menos estáveis do que idealmente desejados. Assim, seria desejável modificar ou eliminar uma ou mais etapas de fabricação embora melhorando a qualidade de produto, tal como pureza e/ou estabilidade.

Em vista do anterior, há uma necessidade na técnica para desenvolver processos melhorados para preparação de conjugados de agente de ligação à célula-agente citotóxico que são de pureza substancialmente alta e podem ser preparados evitando etapas problemáticas e por redução de tempo e custo para o usuário. A invenção fornece dito um processo. Estas e outras vantagens da invenção, bem como características inventivas adicionais, serão aparentes a partir da invenção fornecida aqui.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção fornece um processo para preparar um conjugado de agente de ligação à célula e agente citotóxico compreendendo a etapa de contatar um agente de ligação à célula com um agente citotóxico para formar uma primeira mistura compreendendo o agente de ligação à célula e o agente citotóxico e, então, contatar a primeira mistura compreendendo o agente de ligação à célula e o agente citotóxico com um reagente de reticulação bifuncional compreendendo um ligante, em uma solução tendo um pH de cerca de 4 a cerca de 9 para fornecer uma mistura compreendendo (i) o conjugado de agente de ligação à célula e agente citotóxico, em que o agente de ligação à célula é quimicamente acoplado através do ligante ao agente citotóxico, (ii) agente citotóxico livre, e (iii) subprodutos de reação. O processo pode ainda compreender a etapa de purificação da mistura para fornecer um conjugado de agente de ligação à célula e agente citotóxico.

Os processos da presente invenção fornecem conjugado de agente de ligação à célula e agente citotóxico como alta pureza e/ou estabilidade. Para obter esta pureza alta e/ou estabilidade do conjugado, é essencial que o agente citotóxico seja contatado com o agente de ligação à célula primeiro, para formar uma mistura compreendendo o agente de ligação à célula e o agente citotóxico antes de a mistura ser contatada com um reagente de reticulação bifuncional.

A presente invenção ainda inclui um conjugado de agente de ligação à célula e agente citotóxico preparado de acordo com os processos descritos aqui.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A invenção fornece um processo de uma etapa para preparar um conjugado de agente de ligação à célula e um agente citotóxico. O processo compreende contatar um agente de ligação à célula (por exemplo, um anticorpo) com um agente citotóxico para formar uma primeira mistura compreendendo o agente de ligação à célula e o agente citotóxico e, então, contatar a primeira mistura compreendendo o agente de ligação à célula e o agente citotóxico com um reagente de reticulação bifuncional compreendendo um ligante, em uma solução tendo um pH de cerca de 4 a cerca de 9 para fornecer uma segunda mistura compreendendo o conjugado de agente de ligação à célula e agente citotóxico, agente citotóxico livre e subprodutos de reação, em que o agente de ligação à célula é quimicamente acoplado através do ligante ao agente citotóxico. A segunda mistura é, então, submetida à purificação para fornecer um conjugado de agente de ligação à célula e agente citotóxico purificado.

Em uma modalidade, o contato é realizado fornecendo o agente de ligação à célula, então, contatando o agente de ligação à célula com o agente citotóxico para formar uma primeira mistura compreendendo o agente de ligação à célula e o agente citotóxico e, então, contatando a primeira mistura compreendendo o agente de ligação à célula e o agente citotóxico com o reagente de reticulação bifuncional. Por exemplo, em uma modalidade, o agente de ligação à célula é fornecido em um vaso de reação, o agente citotóxico é adicionado ao vaso de reação (desse modo contatando o agente de ligação à célula) e, então, o reagente de reticulação bifuncional é adicionado à mistura compreendendo o agente de ligação à célula e o agente citotóxico (desse modo contatando a mistura compreendendo o agente de ligação à célula e o agente citotóxico). Em uma modalidade, o agente de ligação à célula é fornecido em um vaso de reação e o agente citotóxico é adicionado ao vaso de reação imediatamente após fornecer o agente de ligação à célula ao vaso. Em outra modalidade, o agente de ligação à célula é fornecido em um vaso de reação e o agente citotóxico é adicionado ao vaso de reação após um intervalo de tempo em seguida ao fornecimento do agente de ligação à célula ao vaso (por exemplo, cerca de 5 minutos, cerca de 10 minutos, cerca de 20 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 40 minutos, cerca de 50 minutos, cerca de 1 hora, cerca de 1 dia ou mais após fornecer o agente de ligação à célula ao espaço). O agente citotóxico pode ser adicionado rapidamente (ou seja, dentro de um intervalo de tempo curto, tal como cerca de 5 minutos, cerca de 10 minutos) ou lentamente (tal como usando uma bomba).

A mistura compreendendo o agente de ligação à célula e o agente citotóxico pode ser, então, contatada com o reagente de reticulação bifuncional ou imediatamente após contatar o agente de ligação à célula com o agente citotóxico ou em algum ponto mais tarde (por exemplo, cerca de 5 minutos a cerca de 8 horas ou mais) após contatar o agente de ligação à célula com o agente citotóxico. Por exemplo, em uma modalidade, o reagente de reticulação bifuncional é adicionado à mistura compreendendo o agente de ligação à célula e o agente citotóxico imediatamente após a adição do agente citotóxico ao vaso de reação compreendendo o agente de ligação à célula. Alternativamente, a mistura compreendendo o agente de ligação à célula e o agente citotóxico pode ser contatada com o reagente de reticulação bifuncional em cerca de 5 minutos, cerca de 10 minutos, cerca de minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 1 hora, cerca de 2 horas, cerca de 3 horas, cerca de 4 horas, cerca de 5 horas, cerca de 6 horas, cerca de 7 horas, cerca de 8 horas, ou mais após contatar o agente de ligação à célula com o agente citotóxico.

Em outra modalidade, o agente citotóxico e o agente bifuncional são adicionados por vários ciclos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ou mais ciclos). Por exemplo, a invenção fornece um processo compreendendo as etapas de: a) contatar um agente de ligação à célula com um agente citotóxico para formar uma primeira mistura compreendendo o agente de ligação à célula e o agente citotóxico; e, então, contatar a primeira mistura com um reagente de reticulação bifuncional compreendendo um ligante, em uma solução tendo um pH de cerca de 4 a cerca de 9 para fornecer uma segunda mistura compreendendo o conjugado de agente de ligação à célula e agente citotóxico, agente citotóxico livre, e subprodutos de reação, em que o agente de ligação à célula é quimicamente acoplado através do ligante ao agente citotóxico; b) contatar a segunda mistura com o agente citotóxico para formar uma terceira mistura; e, então, contatar a terceira mistura com o reagente de reticulação bifuncional em um pH de cerca de 4 a cerca de 9 para fornecer uma quarta mistura; e c) purificar a quarta mistura para fornecer o conjugado purificado de agente de ligação à célula e agente citotóxico. Em uma modalidade, a etapa b) é realizada após um intervalo de tempo (por exemplo, cerca de 1 hora, cerca de 2 horas, cerca de 3 horas ou mais) após a etapa a). Em outra modalidade, a etapa b) pode ser repetida várias vezes (por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou mais vezes) antes de a etapa c) ser realizada. A etapa adicional b) pode ser realizada após um intervalo de tempo (por exemplo, cerca de 1 hora, cerca de 2 horas, cerca de 3 horas ou mais) após a etapa inicial b).

Em outra modalidade, o reagente de reticulação bifuncional é adicionado antes da adição completa do agente citotóxico. Por exemplo, em uma modalidade, o agente citotóxico é adicionado ao agente de ligação à célula continuamente por um intervalo de tempo (por exemplo, mais do que cerca de 5 minutos, cerca de 10 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 1 hora, cerca de 2 horas, cerca de 3 horas, ou mais) para formar uma mistura compreendendo o agente de ligação à célula e o agente citotóxico. Antes da adição do agente citotóxico estar completa, o reagente de reticulação bifuncional é adicionado à mistura compreendendo o agente de ligação à célula e o agente citotóxico, contanto que a qualquer tempo o agente citotóxico esteja em excesso molar do reagente de reticulação bifuncional. Em uma modalidade, o reagente de reticulação bifuncional é adicionado continuamente por um intervalo de tempo (por exemplo, acima de cerca de 5 minutos, cerca de 10 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 1 hora, cerca de 2 horas, cerca de 3 horas, ou mais).

Após a mistura compreendendo o agente de ligação à célula e o agente citotóxico ser contatada com o reagente de reticulação bifuncional, a reação é deixada prosseguir por cerca de 1 hora, cerca de 2 horas, cerca de 3 horas, cerca de 4 horas, cerca de 5 horas, cerca de 6 horas, cerca de 7 horas, cerca de 8 horas, cerca de 9 horas, cerca de 10 horas, cerca de 11 horas, cerca de 12 horas, cerca de 13 horas, cerca de 14 horas, cerca de 15 horas, cerca de 16 horas, cerca de 17 horas, cerca de 18 horas, cerca de 19 horas, cerca de 20 horas, cerca de 21 horas, cerca de 22 horas, cerca de 23 horas, cerca de 24 horas, ou mais (por exemplo, cerca de 30 horas, cerca de 35 horas, cerca de 40 horas, cerca de 45 horas, ou cerca de 48 horas).

O contato do agente de ligação à célula com o agente citotóxico e, então, o reagente de reticulação bifuncional (ou seja, a etapa de reação) ocorre em uma solução tendo um pH de cerca de 4 a cerca de 9 (por exemplo, cerca de 4, cerca de 4,5, cerca de 5, cerca de 5,5, cerca de 6, cerca de 6,5, cerca de 7, cerca de 7,5, cerca de 8, cerca de 8,5, ou cerca de 9). Em uma modalidade, a etapa de reação ocorre em uma solução tendo um pH de cerca de 6 ou menos (por exemplo, cerca de 4 a cerca de 6, cerca de 4 a cerca de 5,5, ou cerca de 4,5 a cerca de 5,5).

Em outra modalidade, o processo inventivo compreende contatar um agente de ligação à célula com um agente citotóxico e, então, um reagente de reticulação bifuncional em uma solução tendo um pH de cerca de 6 ou maior (por exemplo, cerca de 6 a cerca de 9, cerca de 6 a cerca de 7, cerca de 7 a cerca de 9, cerca de 7 a cerca de 8,5, cerca de 7,5 a cerca de 8,5, cerca de 7,5 a cerca de 8,0, cerca de 8,0 a cerca de 9,0, ou cerca de 8,5 a cerca de 9,0). Por exemplo, o processo inventivo compreende contatar um agente de ligação à célula com um agente citotóxico e um reagente de reticulação bifuncional em uma solução tendo um pH de cerca de 6,0, cerca de 6,1, cerca de 6,2, cerca de 6,3, cerca de 6,4, cerca de 6,5, cerca de 6,6, cerca de 6,7, cerca de 6,8, cerca de 6,9, cerca de 7,0, cerca de 7,1, cerca de 7,2, cerca de 7,3, cerca de 7,4, cerca de 7,5, cerca de 7,6, cerca de 7,7, cerca de 7,8, cerca de 7,9, cerca de 8,0, cerca de 8,1, cerca de 8,2, cerca de 8,3, cerca de 8,4, cerca de 8,5, cerca de 8,6, cerca de 8,7, cerca de 8,8, cerca de 8,9, ou cerca de 9,0. Em uma modalidade específica, o processo inventivo compreende contatar um agente de ligação à célula com um agente citotóxico e um reagente de reticulação bifuncional em uma solução tendo um pH de cerca de 7,8 (por exemplo, um pH de 7,6 a 8,0 ou um pH de 7,7 a 7,9).

O processo inventivo compreende realizar a reação de uma etapa (ou seja, contatar um agente de ligação à célula com um agente citotóxico e, então, um reagente de reticulação bifuncional) em qualquer temperatura apropriada conhecida na técnica. Por exemplo, a reação de uma etapa pode ocorrer em cerca de 20°C ou menos (por exemplo, cerca de -10°C (desde que a solução seja impedida de congelar, por exemplo, pela presença de solvente orgânico usado para dissolver o agente citotóxico e o reagente de reticulação bifuncional) a cerca de 20°C, cerca de 0°C a cerca de 18°C, cerca de 4°C a cerca de 16°C), em temperatura ambiente (por exemplo, cerca de 20°C a cerca de 30°C ou cerca de 20°C a cerca de 25°C), ou em uma temperatura elevada (por exemplo, cerca de 30°C a cerca de 37°C). Em uma modalidade, o contato de um agente de ligação à célula com um agente citotóxico e um reagente de reticulação bifuncional ocorre em uma temperatura de cerca de 16°C a cerca de 24°C (por exemplo, cerca de 16°C, cerca de 17°C, cerca de 18°C, cerca de 19°C, cerca de 20°C, cerca de 21 °C, cerca de 22°C, cerca de 23°C, cerca de 24°C, ou cerca de 25°C).

Em outra modalidade, o contato de um agente de ligação à célula com um agente citotóxico e, então, um reagente de reticulação bifuncional ocorre em uma temperatura de cerca de 15°C ou menos (por exemplo, cerca de -10°C a cerca de 15°C, ou cerca de 0°C a cerca de 15°C). Com relação a isto, o processo inventivo compreende contatar um agente de ligação à célula com um agente citotóxico e, então, um reagente de reticulação bifuncional em uma temperatura de cerca de 15°C, cerca de 14°C, cerca de 13°C, cerca de 12°C, cerca de 11°C, cerca de 10°C, cerca de 9°C, cerca de 8°C, cerca de 7°C, cerca de 6°C, cerca de 5°C, cerca de 4°C, cerca de 3°C, cerca de 2°C, cerca de 1°C, cerca de 0°C, cerca de -1°C, cerca de -2°C, cerca de -3°C, cerca de -4°C, cerca de -5°C, cerca de -6°C, cerca de -7°C, cerca de -8°C, cerca de -9°C, ou cerca de -10°C, desde que a solução impedida de congelar, por exemplo, pela presença de solvente(s) orgânico(s) usado(s) para dissolver o reagente de reticulação bifuncional. Em uma modalidade, o processo inventivo compreende contatar um agente de ligação à célula com um agente citotóxico e, então, um reagente de reticulação bifuncional em uma temperatura de cerca de -10°C a cerca de 15°C, cerca de 0°C a cerca de 15°C, cerca de 0°C a cerca de 10°C, cerca de 0°C a cerca de 5°C, cerca de 5°C a cerca de 15°C, cerca de 10°C a cerca de 15°C, ou cerca de 5°C a cerca de 10°C. Em outra modalidade, o processo inventivo compreende contatar um agente de ligação à célula com um agente citotóxico e, então, um reagente de reticulação bifuncional em uma temperatura de cerca de 10°C (por exemplo, uma temperatura de 8°C a 12°C ou uma temperatura de 9°C a 11°C).

Em uma modalidade, o processo inventivo compreende contatar um agente de ligação à célula com um agente citotóxico e, então, um reagente de reticulação bifuncional em uma solução tendo a high pH (por exemplo, cerca de 7 ou maior) em uma temperatura baixa (por exemplo, cerca de 15°C ou menos). Por exemplo, em uma modalidade, o processo inventivo compreende contatar um agente de ligação à célula com um agente citotóxico e, então, um reagente de reticulação bifuncional em uma solução tendo um pH de cerca de 7,5 em uma temperatura de cerca de 15°C, em uma solução tendo um pH de cerca de 7,8 em uma temperatura de cerca de 10°C, em uma solução tendo a pH cerca de 8,2 em uma temperatura de cerca de 0°C, ou em uma solução tendo a pH cerca de 8,5 em uma temperatura de cerca de 0°C. Em outra modalidade, o processo inventivo compreende contatar um agente de ligação à célula com um agente citotóxico e, então, um reagente de reticulação bifuncional em uma solução tendo a pH de 7,0 a 8,5 (por exemplo, um pH de 7,5 a 8,0) em uma temperatura de 5°C a 15°C.

Em uma modalidade, o processo inventivo ainda compreende uma etapa de extinção para extinguir qualquer agente citotóxico não reagido e/ou reagente de reticulação bifuncional não reagido. A etapa de extinção é realizada antes da purificação do agente de ligação à célula e agente citotóxico. Por exemplo, o processo inventivo compreende (a) contatar um agente de ligação à célula com um agente citotóxico para formar uma mistura compreendendo o agente de ligação à célula e o agente citotóxico e, então, contatar a mistura compreendendo o agente de ligação à célula e o agente citotóxico com um reagente de reticulação bifuncional compreendendo um ligante, em uma solução tendo um pH de cerca de 4 a cerca de 9 para fornecer uma mistura compreendendo (i) o conjugado de agente de ligação à célula e agente citotóxico, em que o agente de ligação à célula é quimicamente acoplado através do ligante ao agente citotóxico, (ii) agente citotóxico livre, e (iii) subprodutos de reação, (b) extinguir a mistura preparada na etapa (a) para extinguir qualquer agente citotóxico não reagido e/ou reagente de reticulação bifuncional não reagido, e (c) purificar a mistura para fornecer um conjugado de agente de ligação à célula e agente citotóxico purificado.

Em uma modalidade, a mistura é extinta contatando a mistura com um reagente de extinção. Como usado aqui, “reagente de extinção” se refere a um reagente que reage com o agente citotóxico livre e/ou o reagente de reticulação bifuncional.

Em uma modalidade, reagentes de extinção maleimida ou haloacetamida, como ácido 4-maleimidobutírico, ácido 3-maleimidopropiônico, N-etilmaleimida, iodoacetamida, ou ácido iodoacetamidopropiônico, podem ser usados para garantir que qualquer grupo não reagido (como tiol) no agente citotóxico seja extinto. A etapa de extinção pode ajudar a impedir a dimerização do agente citotóxico, particular o agente citotóxico tendo um grupo tiol não reagido (como DM1). O agente citotóxico dimerizado pode ser difícil de remover. A etapa de extinção pode ainda minimizar qualquer reação de troca de tiol-dissulfeto indesejada com os grupos de dissulfeto de anticorpo nativo. Ao extinguir com reagentes de extinção polares carregados com tiol (como ácido 4- maleimidobutírico ou ácido 3-maleimidopropiônico), o agente citotóxico não reagido em excesso é convertido em um aduto polar, carregado, solúvel em água que pode ser facilmente separado de conjugado covalentemente ligado durante a etapa de purificação. Extinção com reagentes de extinção de tiol não polares e neutros pode ainda ser usada.

Em uma modalidade, a mistura é extinta ao contatar a mistura com um reagente de extinção que reage com o reagente de reticulação bifuncional não reagido. Por exemplo, nucleófílos podem ser adicionados à mistura a fim de extinguir qualquer reagente de reticulação bifuncional não reagido. O nucleoófílo preferencialmente é um nucleoófílo contendo grupo amino, como lisina, taurina e hidroxilamina.

Em uma modalidade preferencial, a reação (ou seja, contatar um agente de ligação à célula com um agente citotóxico e, então, um reagente de reticulação bifuncional) é deixada prosseguir até a conclusão antes de contatar a mistura com um reagente de extinção. Com relação a isto, o reagente de extinção é adicionado à mistura cerca de 1 hora a cerca de 48 horas (por exemplo, cerca de 1 hora, cerca de 2 horas, cerca de 3 horas, cerca de 4 horas, cerca de 5 horas, cerca de 6 horas, cerca de 7 horas, cerca de 8 horas, cerca de 9 horas, cerca de 10 horas, cerca de 11 horas, cerca de 12 horas, cerca de 13 horas, cerca de 14 horas, cerca de 15 horas, cerca de 16 horas, cerca de 17 horas, cerca de 18 horas, cerca de 19 horas, cerca de 20 horas, cerca de 21 horas, cerca de 22 horas, cerca de 23 horas, cerca de 24 horas, ou cerca de 25 horas a cerca de 48 horas) após a mistura compreendendo o agente de ligação à célula e o agente citotóxico ser contatada com o reagente de reticulação bifuncional.

O processo inventivo pode opcionalmente incluir a adição de sacarose à etapa de reação (ou seja, contatar um agente de ligação à célula com um agente citotóxico e um reagente de reticulação bifuncional) para aumentar a solubilidade e recuperação dos conjugados de agente de ligação à célula-agente citotóxico. Desejavelmente, sacarose é adicionada em uma concentração de cerca de 0,1% (p/v) a cerca de 20% (p/v) (por exemplo, cerca de 0,1% (p/v), 1% (p/v), 5% (p/v), 10% (p/v), 15% (p/v) ou 20% (p/v)). Preferencialmente, a sacarose é adicionada a uma concentração de cerca de 1% (p/v) a cerca de 10% (p/v) (por exemplo, cerca de 0,5% (p/v), cerca de 1% (p/v), cerca de 1,5% (p/v), cerca de 2% (p/v), cerca de 3% (p/v), cerca de 4% (p/v), cerca de 5% (p/v), cerca de 6% (p/v), cerca de 7% (p/v), cerca de 8% (p/v), cerca de 9% (p/v), cerca de 10% (p/v), ou cerca de 11% (p/v)). Além disso, a etapa de reação ainda pode compreender a adição de um agente tamponante. Qualquer agente tamponante conhecido na técnica pode ser usado. Agentes tamponantes apropriados incluem, por exemplo, um tampão de citrato, um tampão de acetato, um tampão de succinato, e um tampão de fosfato. Em uma modalidade, o agente tamponante é selecioando do grupo que consiste de HEPPSO (N-(2- hidroxietil)piperazina-N’-(ácido 2-hidroxipropanossulfônico)), POPSO (piperazina-1,4- bis-(ácido 2-hidroxi-propano-sulfônico) desidratado), HEPES (ácido 4-(2- hidroxietil)piperazina-l-etanossulfônico), HEPPS (EPPS) (ácido 4-(2- hidroxietil)piperazina-l-propanossulfônico), TES (Ácido N-[tris(hidroximetil)metil]-2- aminoetanossulfônico), e uma combinação dos mesmos.

Após a etapa de reação, o conjugado de agente de ligação à célula e agente citotóxico é submetido à uma etapa de purificação. Com relação a isto, o conjugado de agente de ligação à célula e agente citotóxico pode ser purificado a partir de outros componentes da mistura (por exemplo, agente citotóxico livre e subprodutos de reação) usando filtração de fluxo tangencial (TFF) a qual é um processo de filtração de fluxo tangencial baseado em membrana, cromatografia de não adsorção, cromatografia de adsorção, filtração de adsorção, precipitação seletiva, ou qualquer outro processo de purificação apropriado, bem como combinação dos mesmos. Em uma modalidade da invenção, o conjugado de agente de ligação à célula e agente citotóxico é purificado usando uma etapa de purificação simples (por exemplo, TFF). Preferencialmente, o conjugado é purificado e trocado na formulação apropriada usando uma etapa de purificação simples (por exemplo, TFF). Em outra modalidade da invenção, o conjugado de agente de ligação à célula e agente citotóxico é purificado usando duas etapas de purificação sequenciais. Por exemplo, o conjugado pode ser primeiro purificado por precipitação seletiva, filtração de adsorção, cromatografia de absorção ou cromatografia de não absorção, seguido por purificação com TFF. Um especialista na técnica irá apreciar que a purificação do conjugado de agente de ligação à célula e agente citotóxico permite o isolamento do conjugado estável compreendendo o agente de ligação à célula quimicamente acoplado ao agente citotóxico.

Quaisquer sistemas de TFF apropriados podem ser utilizados para a purificação, incluindo um sistema do tipo Pellicon (Millipore. Billerica, MA), um sistema Sartocon Cassete (Sartorius AG, Edgewood, NY) e um sistema do tipo Centrasette (Pall Corp., East Hills, NY). Qualquer resina de cromatografia de adsorção apropriada pode ser utilizada para a purificação. Resinas de cromatografia de adsorção preferenciais incluem cromatografia de hidroxiapatita, cromatografia de indução de carga hidrofóbica (HCIC), cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), cromatografia de troca iônica, cromatografia de troca iônica de modo misturado, cromatografia de afinidade de metal (IMAC), cromatografia de ligante corante, cromatografia de afinidade, cromatografia de fase reversa e combinações das mesmas. Exemplos de resinas de hidroxiapatita apropriadas incluem hidroxiapatita de cerâmica (CHT Tipo I e Tipo II, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), hidroxiapatita HA Ultrogel (Pall Corp., East Hills, NY) e fluorapatite cerâmica (CFT Tipo I e Tipo II, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Um exemplo de uma resina HCIC apropriada é resina Hypercel MEP (Pall Corp.. East Hills, NY). Exemplos de resinas HIC apropriadas incluem resinas Butil-Sepharose, Hexil-Sepharose, Fenil-Sepharose, e Octil Sepharose (todas da GE Healthcare, Piscataway, NJ), bem como resinas Macro-prep Metil e Macro-Prep t-Butil (Biorad Laboratories, Hercules, CA). Exemplos de resinas de troca iônica apropriadas incluem resinas SP-Sepharose, CM-Sepharose, e Q-Sepharose (todas da GE Healthcare. Piscataway, NJ) e resina Unosphere S (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Exemplos de trocadores iônicos de modo misturado incluem resina Bakerbond ABx (JT Baker, Phillipsburg NJ). Exemplos de resinas IMAC apropriadas incluem resina de Sepharose Quelante (GE Healthcare, Piscataway, NJ) e resina Profmity IMAC (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Exemplos de resinas de ligante de corante apropriadas incluem Blue Sepharose (GE Healthcare, Piscataway, NJ) e resina Affi-gel Blue (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Exemplos de resinas de afinidade apropriadas incluem resina Sepharose de Proteína A (por exemplo, MabSelect, GE Healthcare, Piscataway, NJ), onde o agente de ligação à célula é um anticorpo, e resinas de afinidade a lectina, por exemplo, resina Lentil Lectin Sepharose (GE Healthcare, Piscataway, NJ), onde o agente de ligação à célula contém sítios de ligação a lectina apropriados. Alternativamente, um anticorpo específico para o agente de ligação à célula pode ser usado. Dito anticorpo pode ser imobilizado em, por exemplo, resina Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare, Piscataway,NJ). Exemplos de resinas de fase reversa apropriadas incluem resinas C4, C8, e Cl8 (Grace Vydac, Hesperia, CA).

Qualquer resina de cromatografia de não adsorção apropriada pode ser utilizada para purificação. Exemplos de resinas de cromatografia de não adsorção apropriadas incluem, entre outras, SEPHADEX™ G-25, G-50, G-100, resinas SEPHACRYL™ (por exemplo, S-200 e S-300), resinas SUPERDEX™ (por exemplo, SUPERDEX™ 75 e SUPERDEX™ 200), resinas de BIO-GEL® (por exemplo, P-6, P-10, P-30, P-60 e P-100) e outras conhecidas pelos especialistas na técnica.

Em uma modalidade, o processo inventivo ainda compreende uma etapa de contenção para liberar os ligantes instavelmente ligados do agente de ligação à célula. A etapa de contenção compreende conter a mistura antes da purificação do conjugado de agente de ligação à célula-agente citotóxico (por exemplo, após a etapa de reação, entre a etapa de reação e a etapa de extinção, ou após a etapa de extinção). Por exemplo, o processo inventivo compreende (a) contatar um agente de ligação à célula com um agente citotóxico para formar uma mistura compreendendo o agente de ligação à célula e o agente citotóxico; e, então, contatar a mistura compreendendo o agente de ligação à célula e o agente citotóxico com um reagente de reticulação bifuncional que fornece um ligante, em uma solução tendo um pH de cerca de 4 a cerca de 9 para fornecer uma mistura compreendendo (i) o conjugado de agente de ligação à célula e agente citotóxico, em que o agente de ligação à célula é quimicamente acoplado através do ligante ao agente citotóxico, (ii) agente citotóxico livre, e (iii) subprodutos de reação, (b) conter a mistura preparada na etapa (a) para liberar os ligantes instavelmente ligados do agente de ligação à célula, e (c) purificar a mistura para fornecer um conjugado de agente de ligação à célula e agente citotóxico purificado.

Em outra modalidade, o processo inventivo compreende (a) contatar um agente de ligação à célula com um agente citotóxico para formar uma mistura compreendendo o agente de ligação à célula e o agente citotóxico; e, então, contatar a mistura compreendendo o agente de ligação à célula e o agente citotóxico com um reagente de reticulação bifuncional o qual fornece um ligante, em uma solução tendo um pH de cerca de 4 a cerca de 9, para fornecer uma mistura compreendendo (i) o conjugado de agente de ligação à célula e agente citotóxico, em que o agente de ligação à célula é quimicamente acoplado através do ligante ao agente citotóxico, (ii) agente citotóxico livre, e (iii) subprodutos de reação, (b) extinguir a mistura preparada na etapa (a) para extinguir qualquer agente citotóxico não reagido e/ou reagente de reticulação bifuncional não reagido, (c) conter a mistura preparada na etapa (b) para liberar os ligantes instavelmente ligados do agente de ligação à célula, e (d) purificar a mistura para fornecer um conjugado de agente de ligação à célula e agente citotóxico.

Altemativamente, a etapa de contenção pode ser realizada após a purificação do conjugado agente de ligação à célula-agente citotóxico seguida por uma etapa de purificação adicional.

Em uma modalidade preferencial, a reação (ou seja, contatar um agente de ligação à célula com um agente citotóxico e, então, um reagente de reticulação bifuncional) é deixada prosseguir até a conclusão antes da etapa de contenção. Com relação a isto, a etapa de contenção pode ser realizada cerca de 1 hora a cerca de 48 horas (por exemplo, cerca de 1 hora, cerca de 2 horas, cerca de 3 horas, cerca de 4 horas, cerca de 5 horas, cerca de 6 horas, cerca de 7 horas, cerca de 8 horas, cerca de 9 horas, cerca de 10 horas, cerca de 11 horas, cerca de 12 horas, cerca de 13 horas, cerca de 14 horas, cerca de 15 horas, cerca de 16 horas, cerca de 17 horas, cerca de 18 horas, cerca de 19 horas, cerca de 20 horas, cerca de 21 horas, cerca de 22 horas, cerca de 23 horas, cerca de 24 horas, ou cerca de 24 horas a cerca de 48 horas) após a mistura compreendendo o agente de ligação à célula e o agente citotóxico ser contatada com o reagente de reticulação bifuncional.

A etapa de contenção compreende manter a solução em uma temperatura apropriada (por exemplo, cerca de 0°C a cerca de 37°C) por um período apropriado de tempo (por exemplo, cerca de 1 hora a cerca de 1 semana, cerca de 1 hora a cerca de 24 horas, cerca de 1 hora a cerca de 8 horas, ou cerca de 1 hora a cerca de 4 horas) para liberar os ligantes instavelmente ligados do agente de ligação à célula enquanto não substancialmente liberando os ligantes instavelmente ligados do agente de ligação à célula. Em uma modalidade, a etapa de contenção compreende mantendo a solução em cerca de 20°C ou menos (por exemplo, cerca de 0°C a cerca de 18°C, cerca de 4°C a cerca de 16°C), em temperatura ambiente (por exemplo, cerca de 20°C a cerca de 30°C ou cerca de 20°C a cerca de 25°C), ou em uma temperatura elevada (por exemplo, cerca de 30°C a cerca de 37°C). Em uma modalidade, a etapa de contenção compreende manter a solução em uma temperatura de cerca de 16°C a cerca de 24°C (por exemplo, cerca de 15°C, cerca de 16°C, cerca de 17°C, cerca de 18°C, cerca de 19°C, cerca de 20°C, cerca de 21°C, cerca de 22°C, cerca de 23°C, cerca de 24°C, ou cerca de 25°C). Em outra modalidade, a etapa de contenção compreende manter a solução em uma temperatura de cerca de 2°C a cerca de 8°C (por exemplo, cerca de 0°C, cerca de 1°C, cerca de 2°C, cerca de 3°C, cerca de 4°C, cerca de 5°C, cerca de 6°C, cerca de 7°C, cerca de 8°C, cerca de 9°C, ou cerca de 10°C). Em outra modalidade, a etapa de contenção compreende manter a solução em uma temperatura de cerca de 37°C (por exemplo, cerca de 34°C, cerca de 35°C, cerca de 36°C, cerca de 37°C, cerca de 38°C, cerca de 39°C, ou cerca de 40°C).

A duração da etapa de contenção depende da temperatura e do pH em que é realizada a etapa de contenção. Por exemplo, a duração da etapa de contenção pode ser substancialmente reduzida, realizando a etapa de contenção em temperatura elevada, com a temperatura máxima limitada pela estabilidade do conjugado agente citotóxico-agente de ligação à célula. A etapa de contenção pode incluir manter a solução por cerca de 1 hora a cerca de 1 dia (por exemplo, cerca de 1 hora, cerca de 2 horas, cerca de 3 horas, cerca de 4 horas, cerca de 5 horas, cerca de 6 horas, cerca de 7 horas, cerca de 8 horas, cerca de 9 horas, cerca de 10 horas, cerca de 12 horas, cerca de 14 horas, cerca de 16 horas, cerca de 18 horas, cerca de 20 horas, cerca de 22 horas, ou cerca de 24 horas), cerca de 10 horas a cerca de 24 horas, cerca de 12 horas a cerca de 24 horas, cerca de 14 horas a cerca de 24 horas, cerca de 16 horas a cerca de 24 horas, cerca de 18 horas a cerca de 24 horas, cerca de 20 horas a cerca de 24 horas, cerca de 5 horas a cerca de 1 semana, cerca de 20 horas a cerca de 1 semana, cerca de 12 horas a cerca de 1 semana (por exemplo, cerca de 12 horas, cerca de 16 horas, cerca de 20 horas, cerca de 24 horas, cerca de 2 dias, cerca de 3 dias, cerca de 4 dias, cerca de 5 dias, cerca de 6 dias, ou cerca de 7 dias), ou cerca de 1 dia a cerca de 1 semana.

Em uma modalidade, a etapa de contenção compreende manter a solução em uma temperatura de cerca de 2°C a cerca de 8°C por um período de pelo menos cerca de 12 horas por até uma semana. Em outra modalidade, a etapa de contenção compreende manter a solução em uma temperatura de cerca de 2°C a cerca de 8°C durante a noite (por exemplo, cerca de 12 a cerca de 24 horas, preferencialmente cerca de 20 horas).

O valor de pH para a etapa de contenção preferencialmente é de cerca de 4 a cerca de 10. Em uma modalidade, o valor de pH para a etapa de contenção é de cerca de 4 ou mais, mas menos de cerca de 6 (por exemplo, 4 a 5,9) ou cerca de 5 ou mais, mas menos de cerca de 6 (por exemplo, 5 a 5,9). Em outra modalidade, os valores de pH para a etapa de contenção variam de 6 a cerca de 10 (por exemplo, cerca de 6,5 a cerca de 9, cerca de 6 a cerca de 8). Por exemplo, valores de pH para a etapa de contenção podem ser cerca de 6, cerca de 6,5, cerca de 7, cerca de 7,5, cerca de 8, cerca de 8,5, cerca de 9, cerca de 9,5, ou cerca de 10.

Em modalidades específicas, a etapa de contenção pode compreender incubar a mistura a 25°C em um pH de cerca de 6-7,5 for cerca de 12 horas a cerca de 1 semana, incubar a mistura a 4°C em um pH de cerca de 4,5-5,9 for cerca de 5 horas a cerca de 5 dias, ou incubar a mistura a 25°C em um pH de cerca de 4,5-5,9 for cerca de 5 horas a cerca de 1 dia.

A invenção fornece um processo para a preparação de composições de conjugados estáveis compostas por um agente de ligação à célula quimicamente acoplado a um agente citotóxico, no qual as composições são substancialmente isentas de conjugados instáveis. A este respeito, a invenção fornece um processo para a preparação de conjugado de agente de ligação à célula- agente citotóxico de substancialmente elevado grau de pureza e estabilidade. Ditas composições podem ser usadas para o tratamento de doenças devido ao elevado grau de pureza e estabilidade dos conjugados. Composições que incluem um agente de ligação à célula, como um anticorpo, quimicamente acoplado a um agente citotóxico, como um maitansinoide, são descritas em, por exemplo, Patente US 7.374.762, o ensinamento completo da qual é incorporado aqui por referência em sua totalidade. Em um aspecto da invenção, um conjugado de agente de ligação à célula-agente citotóxico de substancialmente alta pureza tem uma ou mais das seguintes características: (a) mais do que cerca de 90% (por exemplo, mais que ou igual a cerca de 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%), preferencialmente mais que cerca de 95%, de espécies conjugadas são monoméricas, (b) nível de ligante não conjugado na preparação de conjugado é menor que 10% (por exemplo, menor que ou igual a cerca de 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, ou 0%) (relativo ao ligante total), (c) menos que 10% das espécies conjugadas são reticuladas (por exemplo, menor que ou igual a cerca de 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, ou 0%), (d) nível de agente citotóxico livre na preparação de conjugado é menor que cerca de 2% (por exemplo, menor que ou igual a cerca de 1,5%, 1,4%, 1,3%, 1,2%, 1,1%, 1,0%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2%, 0,1%, ou 0%) (mol/mol relativo ao agente citotóxico total), e/ou (e) nenhum aumento substancial no nível de agente citotóxico livre no armazenamento (por exemplo, após cerca de 1 semana, cerca de 2 semanas, cerca de 3 semanas, cerca de 1 mês, cerca de 2 meses, cerca de 3 meses, cerca de 4 meses, cerca de 5 meses, cerca de 6 meses, cerca de 1 ano, cerca de 2 anos, cerca de 3 anos, cerca de 4 anos, ou cerca de 5 anos). “Aumento substancial” no nível de agente citotóxico livre significa que após certo tempo de armazenamento (por exemplo, cerca de 1 semana, cerca de 2 semanas, cerca de 3 semanas, cerca de 1 mês, cerca de 2 meses, cerca de 3 meses, cerca de 4 meses, cerca de 5 meses, cerca de 6 meses, cerca de 1 ano, cerca de 2 anos, cerca de 3 anos, cerca de 4 anos, ou cerca de 5 anos), o aumento no nível de agente citotóxico livro é menos do que cerca de 0,1%, cerca de 0,2%, cerca de 0,3%, cerca de 0,4%, cerca de 0,5%, cerca de 0,6%, cerca de 0,7%, cerca de 0,8%, cerca de 0,9%, cerca de 1,0%, cerca de 1,1%, cerca de 1,2%, cerca de 1,3%, cerca de 1,4%, cerca de 1,5%, cerca de 1,6%, cerca de 1,7%, cerca de 1,8%, cerca de 1,9%, cerca de 2,0%, cerca de 2,2%, cerca de 2,5%, cerca de 2,7%, cerca de 3,0%, cerca de 3,2%, cerca de 3,5%,cerca de 3,7%, ou cerca de 4,0%.

Como usado aqui, o termo “ligante não conjugado” refere-se ao agente de ligação à célula que está ligado covalentemente ao reagente de reticulação bifuncional, no qual o agente de ligação à célula não é covalentemente acoplado ao agente citotóxico através do ligante do reagente de reticulação bifuncional (ou seja, o "ligante não conjugado” pode ser representado por CBA-L, onde CBA representa o agente de ligação à célula e L representa o reagente de reticulação bifuncional. Em contraste, o conjugado de agente de ligação à célula-agente citotóxico pode ser representado por CBA-L-D, onde D representa o agente citotóxico).

Em uma modalidade, a relação molar média do agente citotóxico para o agente de ligação à célula no conjugado de agente de ligação à célula-agente citotóxico é de cerca de 1 a 10, cerca de 2 a cerca de 7, cerca de 3 a cerca de 5, cerca de 2,5 a cerca de 4,5 (por exemplo, cerca de 2,5, cerca de 2,6, cerca de 2,7, cerca de 2,8, cerca de 2,9, cerca de 3,0, cerca de 3,1, cerca de 3,3, cerca de 3,4, cerca de 3,5, cerca de 3,6, cerca de 3,7, cerca de 3,8, cerca de 3,9, cerca de 4,0, cerca de 4,1, cerca de 4,2, cerca de 4,3, cerca de 4,4, cerca de 4,5), cerca de 3,0 a cerca de 4,0, cerca de 3,2 a cerca de 4,2, ou cerca de 4,5 a 5,5 (por exemplo, cerca de 4,5, cerca de 4,6, cerca de 4,7, cerca de 4.8, cerca de 4,9, cerca de 5,0, cerca de 5,1, cerca de 5,2, cerca de 5,3, cerca de 5,4, ou cerca de 5,5).

A presente invenção fornece um processo mais eficiente para preparar composições de conjugados estáveis compreendendo um agente de ligação à célula quimicamente acoplado a um agente citotóxico. Em uma modalidade, em comparação aos processos tradicionais para preparar conjugados de um agente de ligação à célula e um agente citotóxico, menos quantidade do agente citotóxico é requerida para obter a mesma proporção molar do agente citotóxico ao agente de ligação à célula para os conjugados.

O agente de ligação à célula pode ser qualquer agente apropriado que se liga a uma célula, normalmente e preferencialmente uma célula animal (por exemplo, uma célula humana). O agente de ligação à célula preferencialmente é um peptídeo ou um polipeptídeo. Agentes de ligação à célula apropriados incluem, por exemplo, anticorpos (por exemplos, anticorpos monoclonais e fragmentos dos mesmos), interferons (por exemplo, alfa, beta, gama), linfocinas (por exemplo, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6), hormônios (por exemplo, insulina, TRH (hormônio liberador de tireotropina), MSH (homônio estimulante de melanócito), hormônios esteroides (como andrógenos ou estrógenos), fatores de crescimento e fatores estimulantes de colônia, como EGF, TGF-alfa, FGF, VEGF, G-CSF, M-CSF e GM-CSF (Burgess, Immunology Today 5: 155-158 (1984)), moléculas de transporte de nutriente (por exemplo, transferrina), vitaminas (por exemplo, folato) e qualquer outro agente ou moléculas que especificamente liga-se a uma molécula alvo na superfície de uma célula.

Onde o agente de ligação à célula é um anticorpo, este se liga a um antígeno que é um polipeptídeo ou um glicotopo e pode ser uma molécula transmembrana (por exemplo, receptor) ou um ligante, como um fator de crescimento. Antígenos exemplares incluem moléculas como renina; um hormônio de crescimento, incluindo o hormônio do crescimento humano e hormônio de crescimento bovino; fator liberador de hormônio do crescimento; hormônio da paratireoide; hormônio estimulante da tireoide; lipoproteínas; antitripsina alfa-1; cadeia A de insulina; cadeia B de insulina; proinsulina; hormônio folículo estimulante; calcitonina; hormônio luteinizante; glucagon; fatores coagulantes como fator vmc, fator IX, fator tecidual (TF) e fator de von Willebrand; fatores anticoagulantes como Proteína C; fator natriurético atrial; surfactante pulmonar; um ativador de plasminogênio, como uroquinase ou urina humana ou ativador de plasminogênio tipo de tecido (t-PA); bombesina; trombina; fator de crescimento hematopoiético; fator de necrose tumoral-alfa e -beta; encefaloquinase; RANTES (célula T normalmente expressa e segregada regulada por ativação); proteína inflamatória de macrófago humano (MIP-1-alfa); uma albumina de soro, como albumina de soro humano; substância inibidora Muelleriana; cadeia A de relaxina; cadeia B de relaxina; prorelaxina; peptídeo associado a gonadotropina de camundongo; uma proteína microbiana, como betalactamase; DNase; IgE; um antígeno associado a linfócito T citotóxico (CTLA), como o CTLA-4; inibina; ativina; fator de crescimento endotelial vascular (VEGF); receptores de hormônios ou fatores de crescimento; proteína A ou D; fatores reumatoides; um fator neutrófico, como fator neurotrófico derivado de osso (BDNF), neurotrofina-3, 4, 5 ou 6 (NT-3, NT4, NT-5, ou NT-6), ou um fator de crescimento de nervo, como o NGF-β; fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF); fator de crescimento fibroblástico como aFGF e bFGF; fator de crescimento epidérmico (EGF); fator de crescimento transformante (TGF) como TGF-alfa e TGF-beta, incluindo TGF-βl, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 ou TGF- β5; fator de crescimento tipo insulina I e II (IGF-I e IGF-II); des(l-3)-IGF-I (IGF-I cerebral), proteínas de ligação do fator de crescimento tipo insulina, EpCAM, GD3, FLT3, PSMA, PSCA, MUC1, MUC16, STEAP, CEA, TENB2, receptores de EphA, receptores de EphB, receptores de folato, FOLR1, mesotelina, cripto, alfavbeta6, integrinas, VEGF, VEGFR, EGFR, receptor de transferrina, IRTA1, IRTA2, IRTA3, IRTA4, IRTA5; proteínas CD como CD2, CD3, CD4, CD5 CD6, CD8, CD11, CD14, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD26, CD28, CD30, CD33, CD36, CD37, CD38, CD40, CD44, CD52, CD55, CD56, CD59, CD70, CD79, CD80. CD81, CD103, CD105, CD134, CD137, CD138, CD152 ou um anticorpo que se liga a um ou mais antígenos associados a tumor ou receptores de superfície divulgados na Publicação de Pedido de Patente US 2008/0171040 ou Publicação de Pedido de Patente US 2008/0305044 e estão incorporadas em sua totalidade como referência; eritropoietina; fatores osteoindutivos; imunotoxinas; uma proteína morfogenética de osso (BMP); um interferon, como interferon-alfa, beta, e gama; fatores estimulantes de colônia (CSFs), por exemplo, M-CSF, GM-CSF, e G-CSF; interleucinas (ILs), por exemplo, IL-1 a IL-10; superóxido dismutase; receptores de célula T; proteínas de superfície de membrana; fator acelerador de decaimento; antígeno virai, como por exemplo, uma porção do envelope do HIV; proteínas de transporte; receptores de homing; adressinas; proteínas regulatórias; integrinas, como CD 11a, CD 11b, CD 11c, CD18, uma ICAM, VLA-4 e VCAM; um antígeno associado a tumor, como receptor HER2, HER3 ou HER4; endoglina, c-Met, IGF1R, antígenos prostáticos, como PCA3, PSA, PSGR, NGEP, PSMA, PSCA, TMEFF2, e STEAP 1; LGR5, B7H4, e fragmentos de qualquer um dos polipeptídeos listados acima.

Adicionalmente, GM-CSF, que se liga às células mieloides, pode ser usado como um agente de ligação à célula para células doentes de leucemia mieloide aguda. IL-2 que liga a células T ativadas pode ser usado para prevenção da rejeição de transplante de enxerto, terapia e prevenção da doença do enxerto contra o hospedeiro e para o tratamento da leucemia aguda de células T. MSH, que se liga aos melanócitos, pode ser usado para o tratamento do melanoma, assim como anticorpos direcionados para melanomas. Acido fólico pode ser usado para atingir o receptor de folato expresso em tumores ovarianos e outros. Fator de crescimento epidérmico pode ser usado para direcionar aos cânceres escamosos como o de pulmão e cabeça e pescoço. Somatostatina pode ser usada para alvejar neuroblastomas e outros tipos de tumor.

Cânceres de mama e testículos podem com sucesso ser direcionados com estrogênio (ou análogos de estrogênio) ou androgênio (ou análogos de androgênio) respectivamente como agentes de ligação à célula.

O termo “anticorpo”, como usado aqui, refere-se a qualquer imunoglobulina, qualquer fragmento de imunoglobulina, como Fab, Fab’, F(ab’)2, dsFv, sFv, minibodies, diabodies, tribodies, tetrabodies (Parham, J. Immunol. 131: 2895-2902 (1983); Spring et al. ./. Immunol. 113: 470-478 (1974); Nisonoff et al. Arch. Biochem. Biophys. 89: 230-244 (1960), Kim et al, Mol. Cancer Ther., 7: 2486-2497 (2008), Carter, Nature Revs., 6: 343- 357 (2006)), ou quimera de imunoglobulina. que pode ligar-se a um antígeno na superfície de uma célula (por exemplo, que contém uma região determinante de complementariedade (CDR)). Qualquer anticorpo apropriado pode ser usado como o agente de ligação à célula. Um especialista na técnica apreciará que a seleção de um anticorpo apropriado dependerá da população celular a ser alvo. A este respeito, o tipo e o número de moléculas de superfície celular (ou seja, antígenos) que são seletivamente expressos em uma população celular específica (normalmente e preferencialmente uma população de células doentes) regerão a seleção de um anticorpo apropriado para uso na composição inventiva. Perfis de expressão de superfície celular são conhecidos para uma grande variedade de tipos celulars, incluindo os tipos celulars tumorais, ou, se desconhecida, podem ser determinadas utilizando técnicas de histoquímica e de biologia molecular de rotina.

O anticorpo pode ser policlonal ou monoclonal, mas é mais preferencialmente um anticorpo monoclonal. Como usado aqui, anticorpos “policlonais” referem-se a populações heterogêneas de moléculas de anticorpo, normalmente contidas no soro de animais imunizados. Anticorpos “monoclonais” referem-se a populações homogêneas de moléculas de anticorpos que são específicas para um antígeno particular. Anticorpos monoclonais são normalmente produzidos por um único clone de linfócitos B (“células B”). Anticorpos monoclonais podem ser obtidos usando uma variedade de técnicas conhecidas por especialistas na técnica, incluindo tecnologia de hibridomas padrão (ver, por exemplo, Kõhler e Milstein, Eur. J. Immunol, 5: 511-519 (1976), Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988). e C.A. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New York, NY (2001)). Brevemente, o método do hibridoma para produção de anticorpos monoclonais tipicamente envolve injetar qualquer animal apropriado, tipicamente e preferencialmente um camundongo, com um antígeno (por exemplo, um “imunógeno”). O animal é sacrificado subsequentemente, e células B isoladas de seu baço são fundidas com células de mieloma humanas. Uma célula híbrida é produzida (ou seja, um “hibridoma”), que se prolifera indefinidamente e continuamente secreta altos títulos de anticorpos com a especificidade desejada in vitro. Qualquer método apropriado conhecido na técnica pode ser usado para identificar as células de hibridoma que produzem um anticorpo com a especificidade desejada. Ditos métodos incluem, por exemplo, ensaio imunoenzimático (ELISA), análise de Western blot e radioimunoensaio. A população de hibridomas é projetada para isolar clones individuais, cada um dos quais secreta uma espécie única de anticorpo ao antígeno. Devido ao fato de que cada hibridoma é um clone derivado de fusão com uma única célula B, todas as moléculas de anticorpo que esta produz são idênticas em estrutura, incluindo o seu sítio de ligação ao antígeno e isotipo. Os anticorpos monoclonais também podem ser gerados usando outras técnicas apropriadas, incluindo a tecnologia de hibridoma-EBV (ver, por exemplo, Haskard e Archer, Immunol. Methods, 74(2): 361-67 (1984), e Roder et al, Methods Enzymol., 121:140-67 (1986)), sistemas de expressão com vetor bacteriófago (ver, por exemplo, Huse et al., Science, 246: 1275-81 (1989)), ou bibliotecas de exibição de fago compreendendo fragmentos de anticorpos, como Fab e scFv (região variável de cadeia simples) (ver, por exemplo, Patentes US 5,885,793 e 5,969,108 e Publicações de Pedido de Patente Internacional WO 92/01047 e WO 99/06587).

O anticorpo monoclonal pode ser isolado de ou produzido em qualquer animal apropriado, mas é preferencialmente produzido em um mamífero, mais preferencialmente um camundongo ou humano, e mais preferencialmente um humano. Métodos para produção de um anticorpo em camundongos são bem conhecidos por especialistas na técnica e são descritos aqui. Em relação a anticorpos humanos, um especialista na técnica irá apreciar que anticorpos policlonais podem ser isolados do soro de sujeitos humanos vacinados ou imunizados com um antígeno apropriado. Altemativamente, anticorpos humanos podem ser gerados através da adaptação de técnicas conhecidas para produção de anticorpos humanos em animais não humanos, como camundongos (ver, por exemplo, Patentes US 5,545,806, 5,569,825 e 5,714,352 e Publicação de Pedido de Patente US 2002/0197266 A1).

Embora sendo a escolha ideal para aplicações terapêuticas em humanos, anticorpos humanos, particularmente os anticorpos monoclonais humanos, normalmente são mais difíceis de serem gerados do que os anticorpos monoclonais de camundongo. Anticorpos monoclonais de camundongo, entretanto, induzem uma resposta de anticorpos do hospedeiro rápida quando administrados em seres humanos, que podem reduzir o potencial diagnóstico ou terapêutico do conjugado anticorpo-agente citotóxico. Para contornar estas complicações, um anticorpo monoclonal preferencialmente não é reconhecido como “estranho” pelo sistema imunológico humano.

Para este fim, a exibição de fagos pode ser usada para gerar o anticorpo. A este respeito, bibliotecas de fago codificando domínios variáveis (V) de anticorpos de ligação ao antígeno podem ser geradas usando técnicas de biologia molecular e técnicas de DNA recombinante (ver, por exemplo, Sambrook et al. (eds.), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001)). Fagos condificando uma região variável com uma especificidade desejada são selecionados para especifidade de ligação ao antígeno desejado, e um anticorpo humano completo é reconstituído compreendendo o domínio variável selecionado. Sequências de ácido nucleico codificando o anticorpo reconstituído são introduzidas em uma linhagem celular apropriada, como uma célula de mieloma usada para a produção de hibridoma, de modo que anticorpos humanos com as características dos anticorpos monoclonais são secretados pela célula (ver, por exemplo, Janeway et al., supra, Huse et al., supra e Patente US 6,265,150). Alternativamente, os anticorpos monoclonais podem ser gerados a partir de camundongos que são transgênicos para genes de imunoglobulina de cadeia pesada e leve humanos específicos. Ditos métodos são conhecidos na técnica e descritos em, por exemplo, Patentes US 5,545,806 e 5,569,825 e Janeway et al, supra.

Mais preferencialmente o anticorpo é um anticorpo humanizado. Como usado aqui, um anticorpo “humanizado” é um em que as regiões determinantes de complementaridade (CDR) de um anticorpo monoclonal de camundongo, que formam as alças de ligação do antígeno ao anticorpo, são enxertadas na estrutura de uma molécula de anticorpo humano. Devido a similaridade das estruturas de anticorpos de humanos e camundongos, é geralmente aceito na técnica que esta abordagem produz um anticorpo monoclonal que é antigenicamente idêntico a um anticorpo humano mas liga o mesmo antígeno como o anticorpo monoclonal de camundongo do qual foram derivadas as sequências de CDR. Métodos para a geração de anticorpos humanizados são bem conhecidos na técnica e são descritos em detalhes em, por exemplo, Janeway et al, supra, Patentes US 5,225,539, 5,585,089 e 5,693,761, Patente Europeia 0239400 BI e Patente do Reino Unido 2188638. Anticorpos humanizados também podem ser gerados usando a tecnologia de recapeamento de anticorpo descritos na Patente US 5,639.641 e Pedersen et al, J. Mol. Biol., 235: 959- 973 (1994). Embora o anticorpo empregado no conjugado da composição inventiva mais preferencialmente seja um anticorpo monoclonal humanizado, um anticorpo monoclonal humano e um anticorpo monoclonal de camundongo, como descrito acima, também estão dentro do escopo da invenção.

Fragmentos de anticorpos que têm pelo menos um sítio de ligação ao antígeno e, portanto, reconhecem e se ligam a pelo menos um antígeno ou receptores presentes na superfície de uma célula alvo, também estão dentro do escopo da invenção. A este respeito, a clivagem proteolítica de uma molécula de anticorpo intacta pode produzir uma variedade de fragmentos de anticorpos que mantém a capacidade de reconhecer e se ligar aos antígenos. Por exemplo, a digestão limitada de uma molécula de anticorpo com a protease papaína normalmente produz três fragmentos, dois dos quais são idênticos e são referidos como os fragmentos Fab, já que eles retêm a atividade de ligação ao antígeno da molécula de anticorpo parental. Clivagem de uma molécula de anticorpo com a enzima pepsina normalmente produz dois fragmentos de anticorpo, um dos quais mantém os dois braços de ligação ao antígeno da molécula do anticorpo e, portanto, é conhecido como o fragmento de F(ab’)2- Redução de um fragmento de F(ab’)2 com ditiotreitol ou mercaptoetilamina produz um fragmento referido como um fragmento Fab'. Um fragmento de região variável de cadeia simples (sFv) de fragmento de anticorpo, que consiste em um fragmento Fab truncado, compreendendo o domínio variável (V) de uma cadeia pesada do anticorpo ligado a um domínio V de uma cadeia leve de anticorpo através de um peptídeo sintético, pode ser gerado usando técnicas de tecnologia de DNA recombinante de rotina (ver, por exemplo, Janeway et al., supra). Da mesma forma, fragmentos da região variável estabilizados com dissulfeto (dsFv) podem ser preparados através de tecnologia de DNA recombinante (ver, por exemplo, Reiter et al., Protein Engineering, 7: 697-704 (1994)). Fragmentos de anticorpo no contexto da invenção, no entando, não estão limitados a estes tipos exemplares de fragmentos de anticorpo. Qualquer fragmento de anticorpo apropriado que reconhece e se liga a um receptor de superfície celular desejado ou antígeno pode ser empregado. Fragmentos de anticorpos são ainda descritos em, por exemplo, Parham, J. Immunol., 131: 2895-2902 (1983), Spring et al., J. Immunol., 113: 470-478 (1974), e Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys., 89: 230-244 (1960). Ligação antígeno-anticorpo pode ser analisada usando qualquer método apropriado, conhecido na técnica, como, por exemplo, radioimunoensaio (RIA), Western blot, ELISA, imunoprecipitação e ensaios de inibição competitiva (ver, por exemplo, Janeway et al., supra e Publicação de Pedido de Patente US 2002/0197266 Al).

Além disso, o anticorpo pode ser um anticorpo quimérico ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Por “quimérico” entende-se que o anticorpo compreende pelo menos duas imunoglobulinas, ou fragmentos das mesmas, obtidas ou derivadas de pelo menos duas espécies diferentes (por exemplo, duas imunoglobulinas diferentes, como uma região constante de imunoglobulina humana combinada com uma região variável murina). O anticorpo também pode ser um domínio de anticorpo (dAb) ou um fragmento ligante ao antígeno do mesmo, como, por exemplo, um anticorpo de camelídeos (ver, por exemplo, Desmyter et al., Nature Struct. Biol., 3: 752, (1996)), ou um anticorpo de tubarão, como, por exemplo, um receptor de antígeno novo (IgNAR) (ver, por exemplo, Greenberg et al., Nature, 374: 168 (1995), e Stanfield et al., Science, 305: 1770-1773 (2004)).

Qualquer anticorpo apropriado pode ser usado no contexto da invenção. Por exemplo, o anticorpo monoclonal J5 é um anticorpo IgG2a murino que é específico para Antígeno de Leucemia Linfoblástica Aguda Comum (CALLA) (Ritz et al., Nature, 283: 583-585 (1980)), e pode ser usado para direcionar células que expressam CALLA (por exemplo, células de leucemia linfoblástica aguda). O anticorpo monoclonal MY9 é um anticorpo IgGl murino que se liga especificamente ao antígeno CD33 (Griffin et al., Leukemia Res., 8: 521 (1984)), e pode ser usado para direcionar células que expressam CD33 (por exemplo, céulas de anemia mieloide aguda (AML)).

De forma semelhante, o anticorpo monoclonal anti-B4 (também referido como B4) é um anticorpo IgGl murino que se liga ao antígeno CD 19 em células B (Nadler et al., J. Immunol., 131: 244-250 (1983)), e pode ser usado para direcionar células B ou células doentes que expresam CD 19 (por exemplo, células de linfoma não Hodgkin e células de leucemia linfoblástica crônica). N901 é um anticorpo monoclonal murino que se liga ao antígeno CD56 (molécula de adesão celular neural) encontrado em células de origem neuroendócrina, incluindo tumor de pulmão de células pequenas, que pode ser usado no conjugado para direcionar drogas para células de origem neuroendócrina. Os anticorpos J5, MY9 e B4 preferencialmente são recapeados ou humanizados antes da sua utilização como parte do conjugado. Recapeamento ou humanização dos anticorpos é descrita em, por exemplo, Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 969-73 (1994).

Além disso, o anticorpo monoclonal C242 se liga ao antígeno CanAg (ver, por exemplo, Patente US 5,552,293) e pode ser usado para direcionar o conjugado para tumores expressando CanAg, como cânceres colorretal, pancreático, pulmonar de células não pequenas, gástrico. HuC242 é uma forma humanizada do anticorpo monoclonal C242 (ver, por exemplo, Patente US 5,552,293). Os hibridomas a partir dos quais HuC242 é produzido são depositados com identificação ECACC número 90012601. HuC242 pode ser preparado utilizando metodologia de enxerto de CDR (ver, por exemplo, Patentes US 5,585,089, 5,693,761 e 5,693,762) ou tecnologia de recapeamento (ver, por exemplo, Patente US 5,639,641). HuC242 pode ser usado para direcionar o conjugado para células tumorais, expressando o antígeno CanAg, como, por exemplo, células de cânceres colorretal, pancreático, pulmonar de células não pequenas e gástrico.

Para direcionar células de câncer ovariano e câncer de próstata, um anticorpo anti- MUC1 pode ser usado como o agente de ligação à célula no conjugado. Anticorpos anti- MUC1 incluem, por exemplo, anti-HMFG-2 (ver, por exemplo, Taylor-Papadimitriou et al, Int. J. Cancer, 28: 17-21 (1981)), hCTMOl (ver, por exemplo, van Hof et al., Cancer Res., 56: 5179-5185 (1996)), e DS6. Células de câncer de próstata podem também ser direcionadas com o conjugado através do uso de antígeno de membrana específico anti- próstata (PSMA), como o agente de ligação à célula, como J591 (ver, por exemplo, Liu et al, Cancer Res., 57: 3629-3634 (1997)). Além disso, células cancerígenas que expressam o antígeno Her2, como cânceres de mama, próstata e ovário, podem ser direcionadas com o conjugado através do uso de anticorpos anti-Her2, por exemplo, trastuzumabe, como agente de ligação à célula. Células que expressam o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) e variantes do mesmo, como o mutante de deleção do tipo III, EGFRvIII, podem ser direcionadas com o conjugado através do uso de anticorpos anti- EGFR. Anticorpos anti-EGFR são descritos em Pedidos de Patente Internacionais PCT/US1 1/058385 e PCT/US11/058378. Anticorpos anti-EGFRvIII são descritos nas Patentes US 7.736.644 e 7.628.986 e Publicações de Pedido US 2010/0111979, 2009/0240038. 2009/0175887, 2009/0156790 e 2009/0155282. Anticorpos anti-IGF-IR que se ligam ao receptor do fator de crescimento semelhante à insulina, como os descritos em Patente US 7.982.024, também podem ser usados no conjugado. Anticorpos que se ligam a CD27L, Cripto, CD138, CD38, EphA2. integrinas, CD37, folato, CD20, PSGR, NGEP, PSCA, TMEFF2, STEAP1, endoglina e Her3 também podem ser usados no conjugado.

Em uma modalidade, o anticorpo é selecionado do grupo que consiste em huN901, huMy9-6, huB4, huC242, um anticorpo anti-HER2 (por exemplo, trastuzumabe), bivatuzumabe, sibrotuzumabe, rituximabe, huDSó, anticorpos anti-mesotelina descritos no Pedido de Publicação de Patente Internacional WO 2010/124797 (como MF-T), anticorpos anti-cripto descrito em Publicação de Pedido de Patente US 2010/0093980 (como huB3F6), anticorpos anti-CD138 descritos em Publicação de Pedido de Patente US 2007/0183971 (como huB-B4), anticorpos anti-EGFR descritos em Pedidos de Patente Internacional PCT /US11/058385 e PCT/US1 1/058378 (como EGFR-7), anticorpos anti- EGFRvIII descritos nas Patentes US 7,736,644 e 7,628,986 e Publicações de Pedido de Patente US 2010/0111979, 2009/0240038, 2009/0175887, 2009/0156790 e 2009/0155282, anticorpos EphA2 humanizados descritos em Publicações de Pedido de Patente Internacional WO 2011/039721 e WO 2011/039724 (como 2H11R35R74); anticorpos anti- CD38 descritos em Publicação dc Pedido de Patente Internacional WO 2008/047242 (como hu38SB19), anticorpos anti-folato descritos em Publicação de Pedido de Patente Internacional WO 2011/106528 e Publicação de Pedido de Patente US 2012/0009181 (por exemplo, huMovl9), anticorpos anti-IGFlR descritos nas Patentes US 5,958,872, 6,596,743 e 7,982,024; anticorpos anti-CD37, descritos na Publicação de Pedido de Patente US 2011/0256153 (por exemplo, huCD37-3), anticorpos anti-integrina αvβ6 descritos na Publicação de Pedido US 2006/0127407 (por exemplo, CNTO95); e anticorpos anti-Her3 descritos em Publicação de Pedido de Patente Internacional WO 2012/019024.

Anticorpos particularmente preferenciais são os anticorpos monoclonais humanizados descritos aqui. Os exemplos incluem, entre outros, huN901, huMy9-6, huB4, huC242, um anticorpo monoclonal humanizado anti-Her2 (por exemplo, trastuzumabe), bivatuzumabe, sibrotuzumabe, CNTO95, huDS6 e rituximabe (ver, por exemplo, Patentes US 5,639,641 e 5,665,357, Pedido de Patente Provisório US 60/424,332 (que está relacionada com Patente US 7,557,189), Publicação de Pedido de Patente Internacional (PCT) WO 02/16401, Pedersen et al., supra, Roguska et al., supra, Liu et al., supra, Nadler et al., supra, Colomer et al., Cancer Invest., 19: 49-56 (2001), Heider et al., Eur. J. Cancer, 31 A: 2385-2391 (1995), Welt et al., J. Clin. Oncol., 12: 1193-1203 (1994), e Maloney et al., Blood, 90: 2188-2195 (1997)). Outros anticorpos monoclonais humanizados são conhecidos na técnica e podem ser usados em combinação com a invenção.

Em uma modalidade, o agente de ligação à célula é um anticorpo humanizado anti-folato ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a um receptor de folato humano 1, em que o anticorpo compreende: (a) uma cadeia pesada CDR1 compreendendo GYFMN (SEQ ID NO:1); uma cadeia pesada CDR.2 compreendendo RIHPYDGDTFYNQXaaiFXaaiXaaj (SEQ ID NO:2); e uma cadeia pesada CDR3 compreendendo YDGSRAMDY (SEQ ID NO:3); e (b) uma cadeia leve CDR1 compreendendo KASQSVSFAGTSLMH (SEQ 1D NO:4); uma cadeia leve CDR2 compreendendo RASNLEA (SEQ ID NO:5); e uma cadeia leve CDR3 compreendendo QQSREYPYT (SEQ ID NO:6); onde Xaaj é selecionado de K. H, Q e R; Xaa2 é selecionado de Q, H, N e R; Xaaa é selecionado de G, E, T, S, A e V. Preferencialmente, a sequência de cadeia pesada CDR2 compreende RIHPYDGDTFYNQKFQG (SEQ ID NO:7).

Em outra modalidade, o anticorpo anti-folato é um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente ao receptor de folato humano 1 compreendendo a cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de QVQLVQSGAEVVKPGASVK1SCKASGYTFTGYFMNWVKQSPGQSLEWIGR1HPYDG DTFYNQKFQGKATLTVDKSSNTAHMELLSLTSEDFA VYYCTRYDGSRAMDYWGQG TTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVH TFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTC PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP1EKTISKA KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK.TTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.(SEQ NO: 8 )

Em outra modalidade, o anticorpo anti-folato é um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo codificado pelo DNA de plasmídeo depositado com a ATCC em 7 de abril de 2010 e tendo depósitos ATCC N.° PTA-10772 e PTA-10773 ou 10774.

Em outra modalidade, o anticorpo anti-folato é um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo codificado pelo DNA de plasmídeo depositado com a ATCC em 7 de abril de 2010 e tendo depósitos ATCC N.° PTA-10772 e PTA-10773 ou 10774.

Em outra modalidade, o anticorpo anti-folato é um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo um domínio variável de cadeia pesada pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou 100% idêntico ao QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTGYFMNWVKQSPGQSLEWIGRIHPYD GDTFYNQKFQGKATLTVDKSSNTAHMELLSLTSEDFAVYYCTRYDGSRAMDYW GQGTTVTVSS (SEQ ID NO:9), e um domínio variável de cadeia leve pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou 100% idêntico ao DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASN LEAGVPDRFSGSGSKTDFTLNISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKR (SEQ ID NO: 10); ouDIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASN L EAGVPDRFSGSGSKTDFTLTISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKR (SEQ IDNO:11).

Embora o agente de ligação à célula, preferencialmente, é um anticorpo, o agente de ligação à célula também pode ser uma molécula não anticorpo. Moléculas não anticorpo apropriadas incluem, por exemplo, os interferons (por exemplo, interferon alfa, beta ou gama), linfocinas (por exemplo, interleucina 2 (IL-2), IL-3, IL-4 ou IL-6), hormônios (por exemplo, insulina), fatores de crescimento (por exemplo, EGF, TGF-alfa, FGF e VEGF), fatores estimulantes de colônia (por exemplo, G-CSF, M-CSF e GM-CSF (ver, por exemplo, Burgess, Immunology Today, 5: 155-158 (1984)), somatostatina, e transferrina (ver, por exemplo, O’Keefe et al., J. Biol. Chem., 260: 932-937 (1985)). Por exemplo, GM- CSF, que se liga a células mieloides como um agente de ligação à célula para direcionar células de leucemia mieloide aguda. Além disso, IL-2 que se liga a células T ativadas pode ser usada para prevenção da rejeição de transplante de enxerto, terapia e prevenção da doença do enxerto contra o hospedeiro e para o tratamento da leucemia aguda de célula T. Fator de crescimento epidérmico (EGF) pode ser usado para direcionar cânceres escamosos como câncer de pulmão e câncer de cabeça e pescoço. Somatostatina pode ser usada para direcionar células de neuroblastoma e outros tipos de células tumorais.

O conjugado pode incluir quaisquer agentes citotóxicos apropriados. Um “agente citotóxico”, como usado aqui, refere-se a qualquer composto que resulta na morte de uma célula, induz a morte celular ou diminui a viabilidade celular. Agentes citotóxicos apropriados incluem, por exemplo, maitansinoides e ansatomicinas conjugáveis (ver, por exemplo, Pedido de Patente Internacional PCT/US11/59131 depositado em 3 de novembro de 2011), taxoides, CC-1065 e análogos de CC-1065, e dolastatina e análogos de dolastatina. Em uma modalidade preferencial da invenção, o agente citotóxico é uma maitansinoide, incluindo maitansinol e análogos de maitansinol. Maitansinoides são compostos que inibem a formação de microtúbulos e são altamente tóxicos para células de mamíferos. Exemplos de análogos de maitansinol apropriados incluem aqueles que têm um anel aromático modificado e aqueles que têm modificações em outras posições. Ditos maitansinoides são descritos em, por exemplo, Patentes US 4.256.746, 4.294.757, 4.307.016, 4.313.946, 4.315.929, 4.322.348, 4.331.598, 4.361.650, 4.362.663, 4.364.866, 4.424.219, 4.371.533, 4.450.254, 5.475.092, 5.585.499, 5.846.545 e 6.333.410.

Exemplos de análogos de maitansinol tendo um anel aromático modificado incluem: (1) C-19-decloro (Patente US 4,256,746) (preparado pela redução de LAH de ansamitocina P2), (2) C-20-hidroxi (ou C-20-demetil) +/-C-19-decloro (Patentes US 4,361,650 e 4,307,016) (preparado por desmetilação usando Streptomyces ou Actinomyces ou decloração usando LAH) e (3) C-20-demetoxi, C-20-aciloxi (-OCOR), +/-decloro (Patente US 4,294,757) (preparado por acilação usando cloretos de acila).

Exemplos de análogos de maitansinol tendo modificações de posições diferentes de um anel aromático incluem: (1) C-9-SH (Patente US 4,424,219) (preparado pela reação de maitansinol com H2S ou P2S5), (2) C-14-alcoximetil (demetoxi/CH2OR) (Patente US 4,331,598), C-14-hidroximetil (3) ou aciloximetil (CH2OH ou CH2OAc) (Patente US 4,450,254) (preparada a partir de Nocardiá), (4) C-15-hidroxi/aciloxo (Patente US 4,364,866) (preparado pela conversão de maitansinol por Streptomyces}, (5) C-15-metoxi (Patentes US 4,313,946 e 4,315,929) (isolado de Trewia nudiflora), (6) C-18-N-demetil (Patentes US 4,362,663 e 4,322,348) (preparado pela desmetilação do maitansinol por Streptomyces} e (7) 4,5-deoxi (Patente US 4,371,533) (preparado por meio da redução de LAH/tricloreto de titânio de maitansinol).

Em uma modalidade preferencial da invenção, o conjugado utiliza o maitansinoide contendo tiol DM1, também conhecido como N2 -deacetil-N2 -(3-mercapto-l-oxopropil)- maitansina, como o agente citotóxico. A estrutura do DM1 é representada pela fórmula (I):

Em outra modalidade preferencial da invenção, o conjugado utiliza o maitansinoide contendo tiol DM4, também conhecido como N2 -deacetil-N2 -(4-metil-4-mercapto-l- oxopentilj-maitansina, como o agente citotóxico. A estrutura do DM4 é representada pela 5 fórmula (II):

Outros maitansinoides podem ser usados no contexto da invenção, incluindo, por exemplo, tiol e maitansinoides contendo dissulfeto tendo uma substituição mono ou dialquil no átomo de carbono contendo átomo de enxofre. Particularmente preferencial é 10 um maitansinoide tendo na posição C-3 (a) funcionalidade C-14 hidroximetil, C-15 hidroxi ou C-20 desmetil, e (b) uma cadeia lateral de aminoácido acilado com um grupo acil tendo um grupo sulfidrila impedido, no qual o átomo de carbono do grupo acil tendo a funcionalidade tiol tem um ou dois substituintes, ditos substituintes sendo CH3, C2H5, alquil ou alquenil linear ou ramificado tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquil ou alquenil cíclico tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenil, fenil substituído, ou radicais heterocíclicos aromáticos ou heterocicloalquil e ainda em que um dos substituintes pode ser H, e em que o grupo acil tem um comprimento de cadeia linear de pelo menos três átomos de carbono entre a funcionalidade carbonil e o átomo de enxofre.

Maitansinoides adicionais para uso no contexto da invenção incluem compostos representados pela fórmula (III): em que Y’ representa (CR7R8)l(CR9=C1o)p(C=C)qA0(CR5R6)mDu(CR|i=CR|2)r(C=C)sBt(CR3R4)nCR1R2S Z, em que R| e R2 são cada um independentemente CH3, C2H5, alquil ou alquenil linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquil ou alquenil ramificado ou cíclico tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenil, fenil substituído ou radicais heterocíclicos aromáticos ou heterocicloalquil, e em que R2 também pode ser H, em que A, B, D são cicloalquil ou cicloalquenil tendo 3-10 átomos de carbono, aril substituído ou simples, ou radicais heterocíclicos aromáticos ou heterocicloalquil, em que R3, R4, R5, Ré, R7, R8, R9, Ri0, RH, e R12 são cada um independentemente H, CH3, C2HS, alquil ou alquenil linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquil ou alquenil ramificado ou cíclico tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenil, fenil substituído ou aromático heterocíclico, ou radical heterocíclico, em que 1, m, n, o, p, q, r, s e t são cada um independentemente zero ou um inteiro de 1 a 5, contanto que pelo menos dois de 1, m, n, o, p, q, r, s e t não sejam zero ao mesmo tempo, e em que Z é H, SR ou COR, em que R é alquil ou alquenil linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquil ou alquenil ramificado ou cíclico tendo de 3 a 10 átomos de carbono, ou aril simples ou substituído ou aromáticos heterocíclicos ou radical heterocicloalquil.

Modalidades preferenciais da fórmula (III) incluem compostos de fórmula (III) em que (a) Ri é H, R2 é metil e Z é H, (b) Ri e R2 são metil e Z é H, (c) R| é H, R2 é metil e Z é -SCH3 e (d) Ri e R2 são metil e Z é -SCH3.

Ditos maitansinoides adicionais também incluem compostos representados pela fórmula (IV-L), (IV-D), ou (IV-D,L): em que Y representa (CR7R8)i(CR5R6)m(CR3R4)nCRiR2SZ, em que R, e R2 são cada um independentemente CH3, C2H5, alquil ou alquenil linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquil ou alquenil ramificado ou cíclico tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenil, fenil substituído, ou aromáticos heterocíclicos ou radical heterocicloalquil e em que R2 também pode ser H, em que R3, R4, R5, RÓ, R7, e Rs são cada um independentemente H, CH3, C2H5, alquil ou alquenil linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquil ou alquenil ramificado ou cíclico tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenil, fenil substituído, ou aromáticos heterocíclicos ou radical heterocicloalquil, em que 1, m e n são cada um independentemente um inteiro de 1 a 5, e além disso n pode ser zero, em que Z é H, SR ou COR, em que R é alquil ou alquenil linear ou ramificado tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquil ou alquenil cíclico tendo de 3 a 10 átomos de carbono, ou aril substituído ou simples ou aromáticos heterocíclicos ou radical heterocicloalquil, e em que May representa um maitansinoide que contém a cadeia lateral em C-3, C-14 hidroximetil, C-15 hidroxi, ou C-20 desmetil.

Modalidades preferenciais de fórmulas (IV-L), (IV-D) e (IV-D.L) incluem compostos de fórmulas (IV-L), (IV-D) e (IV-D,L) em que (a) R, é H, R2 é metil, R5, R6, R7, e Rg são cada um H, 1 e m são cada um 1, n é 0, e Z é H, (b) R| e R2 são metil, R5, Ré, R7, Rs são cada um H, 1 e m são 1, n é 0, e Z é H, (c) Ri é H, R2 é metil, R5, R6, R7 e Rs são cada um H, 1 e m são cada um 1, n é 0 e é Z -SCH3, ou (d) Ri e R2 são metil, R5, R6, R7, Rs são cada um H, 1 e m são 1, n é 0, e Z é -SCH3.

Preferencialmente o agente citotóxico é representado pela fórmula (IV-L).

Maitansinoides preferenciais adicionais também incluem compostos representados pela fórmula (V): em que Y representa (CR7R8)i(CR5R6)m(CR3R4)nCR|R2SZ, em que R| e R2 são cada um independentemente CH3, C2H5, alquil ou alquenil linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquil ou alquenil ramificado ou cíclico tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenil, fenil substituído, ou aromáticos heterocíclicos ou radical heterocicloalquil e em que R2 também pode ser H, em que R3, R4, R5, Ré, R7, e Rs são cada um independentemente H, CH3, C2H5, alquil ou alquenil linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquil ou alquenil ramificado ou cíclico tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenil, fenil substituído, ou aromáticos heterocíclicos ou radical heterocicloalquil, em que 1, m e n são cada um independentemente um inteiro de 1 a 5, e além disso n pode ser zero, e em que Z é H, SR ou COR, em que R é alquil ou alquenil linear ou ramificado tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquil ou alquenil cíclico ou ramificado tendo de 3 a 10 5 átomos de carbono, ou aril substituído ou simples ou aromáticos heterocíclicos ou radical heterocicloalquil.

Modalidades preferenciais da fórmula (V) incluem compostos de fórmula (V) em que (a) R| é H, R2 é metil, R5, R^, R7, e R8 são cada um H; 1 e m são cada um 1; n é 0; e Z é H, (b) R| e Ri são metil; R5, R*, R7, Rx são cada um H, 1 e m são 1; n é 0; e Z é H, (c) Ri é 10 H, R2 é metil, R5, R6. R7, Rx são cada um H, I e m são cada um 1, n é 0 e é Z -SCH3, ou (d) Ri e R2 são metil, Rs, R6. R7, Rx são cada um H, I e m são 1, n é 0 e Z é -SCH3.

Ainda maitansinoides preferenciais incluem compostos representados pela fórmula (VI-L), (VI-D), ou (VI-D,L): em que Y2 representa (CR7Rx)i(CR5R6)m(CR3R4)nR|R2SZ2, em que R| e R2 são cada um independentemente CH3, C2H5, alquil ou alquenil linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquil ou alquenil ramificado ou cíclico tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenil, fenil substituído, ou aromáticos heterocíclicos ou radical heterocicloalqui, e em que R2 também pode ser H, em que R3, R4, R5, Ré, R7, e Rx são cada um independentemente H, CH3, C2H5, alquil ou alquenil linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquil ou alquenil ramificado ou cíclico tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenil, fenil substituído, ou heterocíclicos aromáticos ou radical heterocicloalquil. em que 1, m e n são cada um independentemente um inteiro de 1 a 5, e além disso n 25 pode ser zero, em que Z2 é H, SR ou COR, onde R é alquil ou alquenil linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquil ou alquenil ramificado ou cíclico tendo de 3 a 10 átomos de carbono, ou aril substituído ou simples ou aromáticos heterocíclicos ou radical heterocicloalquil, e em que May é a estrutura de anel macrocíclico do maitansinoide.

Maitansinoides preferenciais adicionais também incluem compostos representados pela fórmula (VII): em que Yj’ representa (CR7R8)i(CR9=Cio)p(C=C)qA0(CR5R6)mDu(CR1|=CRi2)r(C=C)sBt(CR3R4)nCR1R2S Z2, em que Ri e R2 são cada um independentemente CH3, C2H5, alquil ou alquenil linear ou ramificado tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquil ou alquenil ramificado ou cíclico tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenil, fenil substituído ou radicais heterocíclicos aromáticos ou heterocicloalquil, e em que R2 também pode ser H, em que A, B e D cada um independentemente é cicloalquil ou cicloalquenil tendo 3 a 10 átomos de carbono, aril substituído ou simples, ou aromáticos heterocíclicos ou radical heterocicloalquil, em que R3, R4, R5, Ré, R7, Rg. R9. Rio, RH e R12 são cada um independentemente H, CH3, C2H5, alquil ou alquenil lineares tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquil ou alquenil ramificado ou cíclico tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenil, fenil substituído ou aromáticos heterocíclicos ou radical heterocicloalquil, em que I, m, n. 0, p, q, r, s e t são cada um independentemente zero ou um inteiro de 1 a 5, contanto que pelo menos dois de 1, m, n, o, p, q, r, s e t não sejam zero ao mesmo tempo, e em que Z2 éSR ou -COR. em que R é alquil ou alquenil linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquil ou alquenil ramificados ou cíclicos tendo de 3 a 10 átomos de carbono, ou aril simples ou substituído ou aromáticos heterocíclicos ou radical heterocicloalquil.

Modalidades preferenciais da fórmula (VII) incluem compostos de fórmula (VII), em que R| é H e é metil.

Além de maitansinoides, o agente citotóxico usado no conjugado pode ser um taxano ou derivado do mesmo. Taxanos são uma família de compostos que inclui paclitaxel (Taxol®), um produto natural citotóxico e docetaxel (Taxotere®), um derivado semissintético, que são ambos amplamente utilizados no tratamento do câncer. Taxanos são venenos do fuso mitótico que inibem a despolimerização da tubulina, resultando em morte celular. Embora docetaxel e paclitaxel sejam agentes úteis no tratamento do câncer, sua atividade antitumoral é limitada devido à sua toxicidade não específica para as células normais. Além disso, compostos como o paclitaxel e docetaxel por eles mesmos não são suficientemente potentes para serem usados em conjugados de agentes de ligação à célula.

Um taxano preferencial para uso na preparação de um conjugado citotóxico é o taxano de fórmula (VIII):

Métodos para síntese de taxanos que podem ser usados no contexto da invenção, juntamente com métodos para conjugação de taxanos com agentes de ligação à célula, como anticorpos, são descritos em detalhes em Patentes US 5.416.064, 5.475.092, 6.340.701, 6.372.738, 6.436.931, 6.596.757, 6.706.708, 6.716.821 e 7.390.898.

O citotóxico também pode ser CC-1065 ou um derivado do mesmo. CC-1065 é um potente antibiótico antitumoral isolado do caldo de cultura de Streptomyces zelensis. CC- 1065 é de cerca de 1000 vezes mais potente in vitro do que drogas anticâncer comumente usadas, como doxorrubicina, metotrexato e vincristina (Bhuyan et al., Cancer Res., 42: 3532-3537 (1982)). CC-1065 e seus análogos são divulgados nas Patentes US 5,585,499, 5,846,545, 6,340,701 e 6,372,738. A atividade citotóxica do CC-1065 foi correlacionada com sua atividade alquilante e sua atividade de ligação ao DNA ou intercalante de DNA. Estas duas atividades residem em partes separadas da molécula. Neste contexto, a atividade alquilante está contida na subunidade ciclopropapirroloindol (CPI) e a atividade de ligação ao DNA reside nas duas subunidades de pirroloindol de CC-1065.

Vários análogos de CC-1065 são conhecidos na técnica e também podem ser usados como o agente citotóxico no conjugado (ver, por exemplo, Warpehoski et al., J. Med. Chem., 31: 590-603 (1988)). Uma série de análogos de CC-1065 foi desenvoldida na qual a fração CPI é substituída por uma fração ciclopropabenzindol (CBI) (Boger et al., J. Org. Chem., 55: 5823-5833 (1990), e Boger et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1: 115-120 (1991)). Estes análogos de CC-1065 mantêm a alta potência in vitro da droga parental, sem causar toxicidade tardia em camundongos. Como CC-1065, estes compostos são agentes alquilantes que se ligam covalentemente ao sulco menor do DNA para causar a morte celular.

A eficácia terapêutica de análogos CC-1065 pode ser muito melhorada, alterando a distribuição in vivo através de liberação direcionada para um sítio do tumor, resultando em baixa toxicidade para os tecidos não alvo e, portanto, baixa toxicidade sistêmica. Para este fim, conjugados de análogos e derivados de CC-1065 com agentes de ligação à célula que especificamente direcionam às células do tumor foram gerados (ver, por exemplo, Patentes US 5.475.092, 5.585.499 e 5.846.545). Estes conjugados normalmente apresentam alta citotoxicidade específica para o alvo in vitro, e modelos de atividade antitumoral em transplante de tumor humano em camundongos (ver, por exemplo, Chari et al., Cancer Res., 55: 4079-4084(1995)).

Métodos para síntese de análogos de CC-1065 são descritos em detalhes em Patentes US 5.475.092, 5.585.499, 5.846.545, 6.534.660, 6.586.618, 6.756.397, e 7.329.760.

Drogas como o metotrexato, daunorrubicina, doxorrubicina, vincristina, vimblastina, melfalano, mitomicina C, clorambucil, análogos de caliqueamicina, tubulisina e análogos de tubulisina, duocarmicina e análogos de duocarmicina, dolastatina e análogos de dolastatina também podem ser usadas como o agente citotóxico da invenção. Compostos de doxarrubicina e daunorrubicina (ver, por exemplo, Patente US 6.630.579) também podem ser usados como o agente citotóxico.

Os conjugados de agente de ligação à célula e agente citotóxico podem ser preparados por métodos in vitro. Para ligar um agente citotóxico ao anticorpo, um grupo de ligação é usado. Grupos de ligação apropriados são bem conhecidos na técnica e incluem grupos dissulfeto, grupos lábeis ácidos, grupos fotolábeis, grupos peptidase lábeis e grupos esterase lábeis, bem como grupos de ligação não cliváveis. Por exemplo, o agente de ligação à célula pode ser quimicamente acoplado ao agente citotóxico através de ligações químicas selecionadas do grupo que consiste de ligações dissulfeto, ligações lábeis de ácido, ligações fotolábeis, ligações lábeis peptidase, ligações tioéter, e ligações lábeis esterase.

De acordo com a invenção, o agente de ligação à célula é ligado com o agente citotóxico através de um reagente de reticulação bifuncional. Como usado aqui, um "'reagente de reticulação bifuncional” refere-se a um reagente que possui dois grupos reativos; um dos quais é capaz de reagir com um agente de ligação à célula, enquanto o outro é capaz de reagir com o agente citotóxico para ligar o agente de ligação à célula com o agente citotóxico, formando assim um conjugado.

Qualquer reagente de reticulação bifuncional apropriado pode ser usado em conexão com a invenção, contanto que o reagente ligante forneça a retenção do terapêutico, por exemplo, características de citotoxicidade e direcionamento do agente citotóxico e do agente de ligação à célula, respectivamente, sem toxicidade indevida. Preferencialmente, a molécula ligante liga o agente citotóxico ao agente de ligação à célula através de ligações químicas (como descrito acima), de modo que o agente citotóxico e o agente de ligação à célula são quimicamente acoplados (por exemplo, ligados covalentemente) um ao outro.

Em uma modalidade, o reagente de reticulação bifuncional compreende ligantes não cliváveis. Um ligante não clivável é qualquer fração química que é capaz de ligar um agente citotóxico, como um maitansinoide, um taxano ou um análogo de CC-1065, a um agente de ligação à célula de forma estável, covalentemente. Assim, ligantes não cliváveis são substancialmente resistentes à clivagem induzida por ácido, clivagem induzida por luz, clivagem induzida pela peptidase, clivagem induzida por esterase e clivagem de ligação dissulfeto, em condições sob as quais o agente citotóxico ou o agente de ligação à célula permanece ativo.

Reagentes de reticulação apropriados que formam ligantes não cliváveis entre um agente citotóxico e o agente de ligação à célula são bem conhecidos na técnica. Em uma modalidade, o agente citotóxico está ligado ao agente de ligação à célula através de uma ligação tioéter. Exemplos de ligantes não cliváveis incluem ligantes tendo uma fração baseada em maleimido ou haloacetil para reação com o agente citotóxico. Ditos agentes de reticulação bifuncionais são bem conhecidos na técnica (ver Publicação de Pedido de Patente US 2010/0129314, 2009/0274713, 2008/0050310, 20050169933, e 2009/0274713, 2010/0129314, e aqueles disponíveis de Pierce Biotechnology Inc. P.O. Box 117, Rockland, IL 61105, EUA) e incluem, entre outros, N-succinimidil-4 (maleimidometil) ciclohexanocarboxilato (SMCC), N-succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-l- carboxi-(6-amidocaproato), que é uma “cadeia longa” análoga de SMCC (LC-SMCC), éster N-succinimidil de ácido K-maleimidoundecanóico (K.MUA), éster N-succinimidil de ácido y-maleimidobutírico (GMBS), éster N-hidroxisuccinimida de ácido ε- maleimidocapróico (EMCS), éster m-maleimidobenzoil-N-Hidroxisuccinimida (MBS), éster N-(a-maleimidoacetoxi)-succinimida (AMAS), succinimidil-6-(β- maleimidopropionamido)hexanoato (SMPH), N-succinimidil 4-(p-maleimidofenil)-butirato (SMPB), e N-(p-maleimidofenil)isocianato (PMPI). Reagentes de reticulação compreendendo uma fração baseada em haloacetil incluem N-succinimidil-4-(iodoacetil)- aminobenzoato (SIAB), N-succinimidil iodoacetato (SIA), N-succinimidil bromoacetato (SBA) e N-succinimidil 3-(bromoacetamido)propionato (SBAP), bis- maleimidopolietilenoglicol (BMPEO), BM(PEO)2, BM(PEO)j, éster N-(β- maleimidopropiloxi)succinimida (BMPS), ácido 5-maleimidovalérico NHS, HBVS, 4-(4- N-maleimidofenil)-ácido butírico hidrazida»HCl (MPBH), succinimidil-(4- vinilsulfonil)benzoato (SVSB), ditiobis-maleimidoetano (DTME), 1,4-bis- maleimidobutano (BMB), l,4-bismaleimidil-2,3-dihidroxibutano (BMDB), bis- maleimidohexano (BMH), bis-maleimidoetano (BMOE), sulfosuccimmidil 4-(N-metil- maleimido)ciclo-hexano-l-carboxilato (sulfo-SMCC), sulfosuccinimidil(4-iodo- acetil)aminobenzoato (sulfo-SIAB), éster m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-MBS), éster N-(y-maleimidobutriloxi)sulfosuccinimda (sulfo-GMBS), éster N-(ε- maleimidocaproiloxi)sulfosuccimida (sulfo-EMCS), éster N-(K-maleimidoundecanoiloxi)sulfosuccinimida (sulfo-KMUS) e sulfosuccimmidil 4-(p- maleimidofenil)butirato (sulfo-SMPB) CXl-1, sulfo-Mal e PEGn-Mal. Preferencialmente, o reagente de reticulação bifuncional é SMCC.

Em uma modalidade, o reagente de ligação é um ligante clivável. Exemplos de ligantes cliváveis apropriados incluem ligantes dissulfeto, ligantes lábeis a ácidos, ligantes fotolábeis, ligantes peptidase lábeis e ligantes esterase lábeis. Ligantes contendo dissulfeto são ligantes cliváveis através da troca de dissulfeto, que pode ocorrer em condições fisiológicas. Ligantes lábeis ácidos são ligantes cliváveis em pH ácido. Por exemplo, certos compartimentos intracelulares como endossomos e lisossomos, tem um pH ácido (pH 4-5) e fornecem condições apropriadas para decompor os ligantes lábeis a ácidos. Ligantes fotolábeis são úteis na superfície do corpo e em muitas cavidades do corpo que são acessíveis à luz. Além disso, a luz infravermelha pode penetrar o tecido. Ligantes lábeis a peptidase podem ser usados para decompor certos peptídeos dentro ou fora das células (ver, por exemplo, Trouet et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79: 626-629 (1982), e Umemoto et al., Int. J. Cancer, 43: 677-684 (1989)). Em uma modalidade, o ligante clivável é clivado sob condições suaves, por exemplo, condições dentro de uma célula sob atividade do agente citotóxico não é afetada.

Em outra modalidade, o agente citotóxico está ligado ao agente de ligação à célula através de uma ligação dissulfeto. A molécula ligante compreende um grupo químico reativo que pode reagir com o agente de ligação à célula. Grupos químicos reativos preferenciais para reação com o agente de ligação à célula são ésteres N-succinimidil e ésteres N-sulfosuccinimidil. Além disso, a molécula ligante compreende um grupo reativo químico, preferencialmente um grupo ditiopiridil, que pode reagir com o agente citotóxico para formar uma ligação dissulfeto. Reagentes de reticulação bifuncional que permitem a ligação do agente de ligação à célula com o agente citotóxico através de ligações dissulfeto são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, N-succinimidil-3-(2- piridilditio)propionato (SPDP) (ver, por exemplo, Carlsson et al., Biochem. J., 173: 723- 737 (1978)), N-succinimidil 4-(2-piridilditio)butanoato (SPDB) (ver, por exemplo Patente US 4.563.304), N-succinimidil 4-(2-piridilditio)pentanoato (SPP) (ver, por exemplo, CAS número de registro 341498-08-6), e N-succinimidil-4-(2-piridilditio)2-sulfobutanoato (sulfo-SPDB) (ver, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente US 2009/0274713). Outros reagentes de reticulação bifuncionais que podem ser usados para introduzir grupos dissulfeto são conhecidos na técnica e são descritos nas Patentes US 6.913.748, 6.716.821 e Publicações de Pedido de Patente US 2009/0274713 e 2010/0129314, todos os quais são incorporados aqui em sua totalidade como referência.

Outros reagentes de reticulação sem um átomo de enxofre que formam ligantes não cliváveis também podem ser usados no método inventivo. Ditos ligantes podem ser derivados de frações baseadas em ácidos dicarboxílicos. Frações baseadas em ácidos dicarboxílicos apropriadas incluem, entre outros, ácidos a,co-dicarboxílicos da fórmula geral (IX):em que X é um alquil linear ou ramificado, alquenil ou grupo alquenil tendo de 2 a 20 átomos de carbono, Y é um grupo cicloalquil ou cicloalquenil tendo de 3 a 10 átomos de carbono, Z é um grupo aromático substituído ou não substitituído carregando de 6 a 10 átomos de carbono, ou um grupo heterocíclico substituído ou não substitituído, em que o heteroátomo é selecionado a partir de N, O ou S, e em que 1, m, e n são cada um 0 ou 1, contanto que todos 1, m, e n não sejam zero ao mesmo tempo.

Muitos dos ligantes não cliváveis divulgados aqui são descritos em detalhes na Publicação de Pedido de Patente US 2005/0169933 Al.

Os exemplos a seguir ilustram ainda mais a invenção, mas, claro, não devem ser interpretados como alguma forma de limitar o seu âmbito.

Exemplo 1

Anticorpo CD37-3 humanizado foi reagido com o reagente de reticulação heterobifuncional SMCC e o maitansinoide DM1 usando um processo descrito anteriormente (por exemplo, patente US 5.208.020), bem como o processo de uma etapa que é objeto do presente pedido.

Para o processo descrito anteriormente, huCD37-3 (15 mg/mL) primeiro foi reagido com SMCC (6,5 vezes de excesso molar em relação à quantidade de anticorpo) para formar o anticorpo modificado. A reação de modificação foi realizada a 16° C em 50 mM tamnpão fosfato de sódio (pH 6,9) contendo 2 mM EDTA e 10% DMA para 90 minutos. A reação foi extinta com 1 M de acetato para ajustar o pH a 4,5 e o anticorpo modificado foi purificado usando uma coluna de resina Sephadex G-25F equilibrada e eluída em 20 mM acetato de sódio (pH 4,5) contendo 2 mM EDTA. Após a purificação, o anticorpo modificado (5 mg/mL)-foi reagido com o maitansinoide DM1 (6,8 vezes de excesso molar em relação à quantidade de anticorpo; 1,3 vezes em excesso em relação à quantidade medida de ligante no anticorpo) para formar o anticorpo conjugado. A reação de conjugação foi realizada a 20° C em 20 mM tampão de acetato de sódio (pH 5,0) contendo 2 mM EDTA e 5% DMA por aproximadamente 20 horas. A mistura de reação foi então purificada usando uma coluna de Resina Sephadex G-25F equilibrada e eluída em 10 mM succinato de sódio (pH 5,0).

Para o processo inventivo, huCD37-3 (2,5 mg/mL) foi misturado com DM1 (6,2 vezes de excesso molar em relação à quantidade de anticorpo) e, então, com SMCC (5,2 vezes de excesso molar em relação à quantidade de anticorpo). A reação foi realizada a 20°C em 50 mM EPPS [ácido 4-(2-Hidroxietil)-l-piperazinapropanossulfônico] tampão (pH 8,1) contendo 2 mM EDTA e 10% DMA por aproximadamente 4 horas. A reação foi extinta adicionando 1 M de acetato para ajustar o pH para 5,0. A mistura de reação foi então purificada mantida a 2 - 8°C por aproximadamente 20 horas. Após contenção, a mistura de reação foi filtrada por um filtro 0,2 μm PVDF e purificada e diafiltrada em 10 mM succinato de sódio (pH 5,0)-usando Filtração de Fluxo Tangencial (TFF).

Conjugado derivado de dois processos foi analisado por: espectroscopia UV para concentração e carregamento de agente citotóxico loading (Relação de Maitansinoide para Anticorpo, MAR); Espectrometria de massa para determinação de nível de ligante não conjugado; eletroforese SDS PAGE reduzido para determinação de nível de espécies não reduzíveis; SEC-HPLC para determinação de monômero conjugado; e estabilidade em armazenamento com relação ao monômero conjugado e liberação de maitansinoide livre.

Concentração e Relação de Maitansinoide para Anticorpo (MAR) foram detereminadas através de medição da absorbância do conjugado em 252 e 280 nm em um espectrofotômetro UV-VIS e usando os coeficientes de extinção molar do DM1 e anticorpo em dois comprimentos de onda para calcular a concentração molar de anticorpo e DM1.

O nível de ligante não conjugado dos conjugados foi analisado por espectrometria de massa: áreas de pico de espécies individuais de conjugado (incluindo conjugados com ou sem ligantes não conjugados) foram medidas; o nível de ligantes não conjugados foi calculado pela relação da soma das áreas que contêm ligantes não conjugados (ponderadas pelo número de ligantes) para a soma das áreas de todas as espécies de conjugado (também ponderadas pelo número de ligantes).

O nível de espécies não redutíveis dos conjugados foi analisado por eletroforese em gel SDS reduzida: áreas de pico de espécies de conjugado reduzidos individuais (incluindo cadeia leve reduzida, cadeia pesada reduzida, cadeias leves-leves reticuladas, cadeias leve- pesada reticuladas, etc.) foram medidas; o nível de espécies não redutíveis foi calculado pela relação da soma das áreas das espécies não redutíveis à soma das áreas de todas as espécies.

O nível de monômero dos conjugados foi analisado por HPLC de exclusão de tamanho: áreas de pico de monômero, dímero, agregados e espécies de baixo peso molecular foram medidas utilizando um detector de absorbância definido com o comprimento de onda de 252 nm ou 280 nm; o nível de monômero foi calculado pela relação da área para a área total de monômero.

A quantidade de maitansinoide livre presente no conjugado foi analisada por HPLC Dual Column (colunas HiSep e Cl8): áreas de pico de espécies de maitansinoide livre total (eluído no gradiente e identificados por comparação do tempo de eluição com padrões conhecidos) foram medidas utilizando um detector de absorbância definido com o comprimento de onda de 252 nm; a quantidade de maitansinoide livre foi calculada utilizando uma curva padrão gerada pelas áreas de pico de uma quantidade conhecida de padrões.

Como mostrado na Tabela 1 abaixo, conjugado fabricado usando o processo inventivo foi superior àquele fabricado usando o processo descrito anteriormente com relação ao ligante não conjugado, espécies não reduzíveis, e monômero de conjugado. Além disso, a estabilidade de conjugado preparado pelo processo inventivo foi significativamente superior com relação a liberação de maitansinoide livre após armazenamento por cinco meses a 4°C. Níveis de monômero de conjugados preparado por ambos os processos foram estáveis.Tabela 1. Comparação de propriedades chaves de conjugado CD37-3 fabricado pelo processo inventivo comprado ao processo anterior.

Os resultados dos experimentos refletidos neste exemplo demonstram processos melhorados para preparar conjugados de ligação à célula de agente-agente citotóxico que são de pureza substancialmente alta. Além das melhoras na pureza do conjugado e estabilidade de usando o processo inventivo, há ainda melhoras no tempo e conveniência de processamento, devido à eliminação de duas etapas de processamento (reação de modificação e purificação do anticorpo modificado).

Exemplo 2

Anticorpo de receptor de folato humanizado huMovl9 (ver Publicação de Pedido US 2012/0009181) foi reagido com o reagente de reticulação heterobifuncional sulfo- SPDB e o maitansinoide DM4 usando dois processos descritos anteriormente, bem como o processo melhorado que é objeto do presente pedido.

Para o Processo A anteriormente descrito (processo de duas etapas, por exemplo,Chari et al., US 5.208.020), anticorpo huMovl9 (20 mg/mL) primeiro foi reagido com sulfo-SPDB (5,7 vezes de excesso molar em relação à quantidade de anticorpo, dissolvido em DMA, dimetilacetamida) para formar o anticorpo modificado. A reação de modificação foi realizada a 20°C em 50 mM EPPS (ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-l- propanossulfônico) tampão (pH 8,1) contendo 5% DMA por 180 minutos. O anticorpo modificado foi purificado usando uma coluna de resina Sephadex G-25F equilibrada e eluída em 50 mM EPPS (pH 8,1) com 2 mM EDTA (Ácido etilenodiaminatetracético). Após purificação, o anticorpo modificado (5,0 mg/mL) foi reagido com o maitansinoide DM4 (Dissolvido em DMA; 9,7 vezes de excesso molar em relação à quantidade de anticorpo; 1,7 vezes em excesso em relação à quantidade medida de ligante no anticorpo) para formar o anticorpo conjugado. A reação de conjugação foi realizada em temperatura ambiente em 50 mM EPPS (pH 8,1) contendo 2 mM EDTA e 5% DMA por aproximadamente 18 horas. A mistura de reação foi, então, purificada usando uma coluna dc resina Sephadex G-25F equilibrada e eluída em 10 mM de succinato de sódio (pH 5,0).

Para o Processo B descrito anteriormente (processo em um pote, Dai et al., Patente US 7.811.572), anticorpo huMovl9 (10 mg/mL) primeiro foi reagido com sulfo-SPDB (4,9 vezes de excesso molar em relação à quantidade de anticorpo, dissolvido em DMA) para formar o anticorpo modificado. A reação de modificação foi realizada a 20°C em 50 mM de tampão EPPS (pH 7,5) contendo 2mM de EDTA e 10% de DMA por 60 minutos. O anticorpo modificado não foi purificado antes da reação de conjugação. Em vez disso, o anticorpo modificado não purificado foi reagido a 10 mg/mL com o maitansinoide DM4 (8,3 vezes de excesso molar em relação à quantidade de anticorpo, dissolvido em DMA) para formar o anticorpo conjugado. A reação de conjugação foi realizada em temperatura ambiente em 50mM de tampão EPPS (pH 7,5) contendo 2 mM de EDTA e 10% de DMA por aproximadamente 18 horas. A mistura de reação foi, então, purificada usando uma coluna de resina Sephadex G-25F equilibrada e eluída em 10 mM succinato de sódio (pH 5,0).

Para o processo inventivo no qual Sephadex G-25 foi usada (Processo C, processo de uma etapa) para purificar o conjugado, anticorpo huMovl9 (6,0 mg/mL) foi misturado com DM4 (9,7 vezes de excesso molar em relação à quantidade de anticorpo, dissolvido em DMA) e, então, sulfo-SPDB (5,7 vezes em excesso em relação à quantidade de anticorpo, dissolvido em DMA) foi adicionado. A reação foi realizada a 20°C em 50 mM de tampão EPPS (pH 8,1) contendo 2 mM de EDTA e 10% dc DMA por aproximadamente 20 horas. A mistura de reação foi, então, purificada usando uma coluna de resina Sephadex G-25F equilibrada e eluída em 10 mM de succinato de sódio (pH 5,0).

Para o processo inventivo no qual filtração de fluxo tangencial (TFF) (Processo D, processo de uma etapa) foi usada para purificar o conjugado, anticorpo huMovl9 (5,0 mg/mL) foi misturado com DM4 (10,2 vezes de excesso molar em relação à quantidade de anticorpo, dissolvido em DMA) e, então, com sulfo-SPDB (6,0 vezes em excesso em relação à quantidade de anticorpo, dissolvido em DMA). A reação foi realizada a 20°C em 50 mM de tampão EPPS (pH 8,5) contendo 2 mM de EDTA e 10% de DMA por aproximadamente 20 horas. A mistura de reação foi, então, purificada e diafiltrada usando um TFF em 10 mM succinato de sódio (pH 5,0).

Conjugado derivado dos dois processos diferentes foi analisado por: espectroscopia UV (para concentração e relação de maitansinoide para anticorpo, MAR); HPLC de fase reversa para determinação de Maitansinoide Livre; Espectrometria de Massa para determinação de nível de ligante não conjugado e perfil de distribuição de massa; eletroforese SDS PAGE reduzida para determinação de nível de espécies não redutíveis; eletroforese SDS PAGE não reduzida para determinação de nível de fragmentação; SEC- HPLC para determinação de monômero conjugado. Estabilidade em armazenamento foi avaliada com relação ao monômero conjugado e liberação de maitansinoide livre. Detalhes adicionais nas metodologias analíticas são fornecidos no Exemplo 1.

Como mostrado na Tabela 2 abaixo, conjugado fabricado usando o processo inventivo foi superior àquele fabricado usando os processos anteriormente descritos com relação a monômero. Conjugado fabricado usando o processo de um pote e processo de uma etapa em que a purificação final de conjugado foi realizada usando Sephadex G-25, Processos B e C, respectivamente, teve um nível mais alto de maitansinoide livre do que o conjugado fabricado usando o processo de duas etapas, Processo A. No entanto , quando um processo de purificação final diferente, TFF, foi usado (Processo D), o nível de maitansinoide livre foi muito baixo e comparável aquele observado com o processo de duas etapas, ambos após purificação inicial e após armazenamento a 4°C por seis semanas. Com relação a outros atributos importantes do conjugado (por exemplo, fragmentação, espécies não redutíveis, perfil de distribuição de massa e ligante não conjugado), conjugado fabricado usando o processo inventivo foi equivalente aquele fabricado pelos processos anteriormente descritos.Tabela 2. Comparação de propriedades chaves de conjugado huMovl9 fabricado pelo processo inventivo comparado aos processos anteriores

Os resultados dos experimentos refletidos neste exemplo demonstram processos melhorados para preparar conjugados de ligação à célula de agente-agente citotóxico 5 que são de pureza substancialmente alta. Além das melhoras em pureza e estabilidade de conjugado e de uso para o processo inventivo, há ainda melhoras no tempo e conveniência de processamento, devido à eliminação de duas etapas de processamento (reação de modificação e purificação do anticorpo modificado).

Exemplo 3

Este exemplo demonstra que o processo de uma etapa descrito aqui pode ser usado para preparar conjugados começando com uma variedade de ligantes e agentes citotóxicos maitansinoides.

Anticorpo huN901 humanizado foi misturado com Maitansinoide (DM1 ou DM4) e, então, com Ligante (Sulfo-SMCC, SMCC, SPDB, ou SPP). A reação foi realizda a 20°C em tampão fosfato 50 mM (pH 7,5) contendo 2 mM de EDTA e 10% de DMA por aproximadamente 20 a 24 horas. A mistura de reação foi, então, purificada usando uma coluna de resina Sephadex G25F equilibrada e eluída em 10 mM de succinato de sódio (pH 5,0).

Como mostrado na tabela 3 abaixo, a reação de uma etapa pode ser realizada em diferente ligante e combinações de maitansinoide e gerou conjugado com MAR e níveis de monômero bons.Tabela 3. Preparação de conjugados usando diferentes combinações de ligante e maitansinoide.

Todas as referências, inc uindo publicações, pedidos de patentes e patentes, citadas aqui são por meio deste incorporadas por referência na mesma medida como se cada referência fosse individualmente e especificamente indicada para ser incorporada por referência e fosse estabelecida em sua totalidade neste documento.

O uso dos termos “um” e “uma” e “o/a” e referentes semelhantes no contexto da descrição da invenção (especialmente no contexto das reivindicações seguintes) deve ser interpretado para cobrir tanto o singular quanto o plural, salvo se indicado de outra forma aqui ou claramente contrariado pelo contexto. Os termos “compreendendo”, “tendo” “incluindo” e “contendo” devem ser interpretados como termos abertos (ou seja, significando “incluindo, entre outros,”) salvo se indicado de outra forma. A menção de faixas de valores aqui destina-se apenas a servir como um método de atalho de se referir individualmente a cada valor separado caindo dentro da faixa, salvo indicação em contrário aqui, e cada valor separado é incorporado no relatório descritivo como se ele fosse individualmente mencionado aqui. Todos os métodos descritos aqui podem ser realizados em qualquer ordem apropriada salvo se indicado de outra forma aqui ou de outra forma claramente contrariada pelo contexto. O uso de todos e quaisquer exemplos, ou linguagem exemplar (por exemplo, “como”), fornecido aqui, destina-se apenas a melhor iluminar a invenção e não representa uma limitação no escopo da invenção salvo se reivindicado de outra forma. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser interpretada como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da invenção.

Modalidades preferenciais desta invenção são descritas aqui, incluindo o melhor modo conhecido para os inventores para realizar a invenção. Variações daquelas modalidades preferenciais podem se tornar aparentes aos especialistas na técnica ao ler a descrição anterior. Os inventores esperam que especialistas empreguem essas variações conforme apropriado e os inventores pretendem que a invenção seja praticada de outro modo que não o especifícamente descrito aqui. Assim, esta invenção inclui todas as modificações e equivalentes do objeto mencionado nas reivindicações apensas a este conforme permitido pela lei aplicável. Além disso, qualquer combinação dos elementos acima descritos em todas as variações possíveis dos mesmos é incluída pela invenção, salvo se indicado de outra forma aqui ou de outra maneira claramente contrariada pelo contexto.

Claims (27)

1. Processo para preparar um conjugado de anticorpo de maitansinoide caracterizado por compreender a etapa de: (a) contatar um anticorpo com um maitansinoide para formar uma primeira mistura compreendendo o anticorpo e o maitansinoide, então, contatar a primeira mistura com um reagente de reticulação bifuncional compreendendo um ligante em uma solução tendo um pH de 4 a 9 para fornecer uma segunda mistura compreendendo (i) o conjugado de anticorpo de maitansinoide, em que o anticorpo é quimicamente acoplado através do ligante ao maitansinoide, (ii) maitansinoide livre e (iii) subprodutos de reação.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionalmente a etapa de: (b) purificar a segunda mistura compreendendo o conjugado de anticorpo de maitansinoide para fornecer um conjugado de anticorpo de maitansinoide purificado.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a segunda mistura ser purificada submetendo a mistura a filtração de fluxo tangencial, precipitação seletiva, filtração de adsorção, cromatografia de adsorção, cromatografia de não adsorção, ou uma combinação das mesmas, para purificar o conjugado de anticorpo de maitansinoide do maitansinoide livre e de subprodutos de reação, preferencialmente a segunda mistura ser purificada submetendo a mistura à filtração de fluxo tangencial.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3,caracterizado por o contato na etapa (a) ser realizado fornecendo o anticorpo em um vaso de reação, adicionando o maitansinoide ao vaso de reação para formar a primeira mistura compreendendo o anticorpo e o maitansinoide e, então, adicionando o reagente de reticulação bifuncional à primeira mistura.

5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado por compreender adicionalmente conter a segunda mistura entre as etapas (a) a (b) para liberar os ligantes instavelmente ligados do anticorpo e/ou extinguir a segunda mistura entre as etapas (a) a (b) para extinguir qualquer maitansinoide que não reagiu e/ou reagente de reticulação bifuncional que não reagiu.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a segunda mistura ser mantida por 20 horas em uma temperatura de 2°C a 8°C.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a mistura ser extinta contatando a segunda mistura com a reagente de extinção que reage com o maitansinoide livre.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o processo compreender ainda a etapa de:(b) contatar a segunda mistura com o maitansinoide adicional para formar uma terceira mistura; e depois contatar a terceira mistura com reagente de reticulação bifuncional adicional a um pH de 4 a 9 para fornecer uma quarta mistura.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o processo compreender ainda a etapa de: (c) purificar a quarta mistura para fornecer um conjugado de anticorpo de maitansinoide purificado.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a etapa (b) ser repetida uma ou mais vezes antes da etapa (c) ser realizada.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por cada etapa repetida (b) ser realizada após uma ou mais horas após a etapa inicial (b).

12. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado por a quarta mistura ser purificada submetendo a mistura a filtração de fluxo tangencial, precipitação seletiva, filtração adsortiva, cromatografia adsortiva, cromatografia não absortiva ou uma combinação das mesmas, para purificar o conjugado de anticorpo de maitansinoide do maitansinoide livre e subprodutos da reação, preferencialmente a segunda mistura ser purificada submetendo a mistura a filtração de fluxo tangencial.

13. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 12, caracterizado por o contato na etapa (a) ser efetuado fornecendo o anticorpo em um recipiente de reação, adicionando o maitansinoide ao recipiente de reação para formar a primeira mistura compreendendo o anticorpo e o maitansinoide e, em seguida, adicionar o reagente de reticulação bifuncional à primeira mistura.

14. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 13, caracterizado por compreender ainda manter a quarta mistura entre as etapas (b) - (c) para liberar os ligantes ligados de forma instável ao anticorpo e/ou extinguir a quarta mistura entre as etapas (b) - (c) para extinguir qualquer maitansinoide não reagido e/ou reagente de reticulação bifuncional que não reagiu.

15. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a quarta mistura ser mantida por 20 horas a uma temperatura de 2°C a 8°C.

16. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a mistura ser extinta pelo contato da quarta mistura com um reagente de extinção que reage com o maitansinoide livre.

17. Processo, de acordo com a reivindicação 7 ou 16, caracterizado por o reagente de extinção ser selecionado do grupo que consiste em ácido 4-maleimidobutírico, ácido 3-maleimidopropiônico, N-etilmaleimida, iodoacetamida e ácido iodoacetamidopropiônico.

18. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado por o contato na etapa (a) ocorrer em uma solução possuindo um pH de 7 a 9.

19. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado por o contato na etapa (a) ocorrer em uma temperatura de 16°C a 24°C ou de 0°C a 15°C.

20. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado por o anticorpo ser um anticorpo monoclonal, preferencialmente um anticorpo monoclonal humanizado.

21. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado por o anticorpo ser selecionado do grupo que consiste em huN901, huMy9- 6, huB4, huC242, trastuzumabe, bivatuzumabe, sibrotuzumabe, CNTO95, huDS6, rituximabe, anti-Her2, anti-EGFR, anti-CD27L, anti-EGFRvIII, Cripto, anti-CD138, anti- CD38, anti-EphA2, anticorpo direcionado a integrina, anti-CD37, anti-folato, anti-Her3 e anti-IGFIR.

22. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado por o maitansinoide ser N2’-deacetil-N2’-(3-mercapto-1-oxopropil)- maitansina (DM1) ou N2’-deacetil-N2’-(4-metil-4-mercapto-1-oxopentil)-maitansina (DM4).

23. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado por o anticorpo ser quimicamente acoplado ao maitansinoide através de ligações químicas selecionadas do grupo que consiste em ligações dissulfeto, ligações lábeis de ácido, ligações fotolábeis, ligações lábeis peptidase, ligações tioéter e ligações lábeis esterase.

24. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado por o reagente de reticulação bifuncional compreender uma fração éster N- succinimidil, uma fração éster N-sulfosuccinimidil, uma fração baseada em maleimido ou uma fração baseada em haloacetil, preferencialmente o reagente de reticulação bifuncional ser selecionado do grupo que consiste em SPDP, SPP, SPDB, sulfo-SPDB, SMCC, PEG- mal, sulfo-Mal e CX1-1; em que PEG-Mal é:

25. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado por a solução na etapa (a) compreender sacarose e/ou um agente tamponante selecionado do grupo que consiste em um tampão de citrato, um tampão de acetato, um tampão de succinato e um tampão de fosfato, HEPPSO (N-(2- 10 hidroxietil)piperazina-N’-(ácido 2-hidroxipropanossulfônico)), POPSO (piperazina-1,4- bis-(ácido 2-hidroxi-propano-sulfônico) desidratado), HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanossulfônico), HEPPS (EPPS) (ácido 4-(2- hidroxietil)piperazina-1-propanossulfônico), TES (ácido N-[tris(hidroximetil)metil]-2- aminoetanossulfônico) e uma combinação dos mesmos.

26. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado por o maitansinoide ser DM1, o agente de reticulação bifuncional ser SMCC e o anticorpo ser o anticorpo huCD37-3.

27. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado por o maitansinoide ser DM1, o agente de reticulação bifuncional ser SMCC e o anticorpo ser trastuzumabe.