WO2017095191A1 - 면역글로불린 fc가 융합된 인터루킨-7 융합 단백질을 포함하는 사람 파필로마바이러스 유래 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

면역글로불린 fc가 융합된 인터루킨-7 융합 단백질을 포함하는 사람 파필로마바이러스 유래 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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glycine
immunoglobulin
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amino acid
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강문철
최영우
최동훈
성영철
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주식회사 제넥신
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing or treating a human papillomavirus-derived disease of a fusion protein comprising interleukin-7.
  • Interleukin-7 (hereinafter 'IL-7') is an immunostimulatory cytokine that promotes immune responses through B-cell and T-cell media, particularly in the adaptive immune system. It is secreted mainly from stromal cells of the bone marrow and thymus, but is also produced in keratinocytes, dendritic cells, hepatocytes, neurons and epithelial cells (Heufler C et al., 1993, J. Exp. Med. 178 (3)). : 1109-14).
  • interleukin-7 activates immune functions through the survival and differentiation of T and B cells, the survival of lymphoid cells, and the promotion of natural killer (NK) cells. Important for the development of B cells. It combines with hepatocyte growth factor (HGF) to pre-pro-B cell growth-stimulating factor, a cofactor of the V (D) J rearrangement of T cell receptor beta (TCR ⁇ ). (Muegge K, 1993, Science 261 (5117): 93-5). In addition, interleukin-7 regulates lymph node development through lymphoid tissue inducer (LTi) cells and promotes expansion and survival of naive T cells or memory T cells. In addition, IL-7 is known to promote the secretion of IL-2 and interferon-gamma to enhance the immune response in humans.
  • HGF hepatocyte growth factor
  • TCR ⁇ T cell receptor beta
  • Papillomaviruses are DNA-based viruses with a diameter of 52-55 nm, which infect the skin or subcutaneous of humans and other animals.
  • Human papillomavirus (HPV) is usually transmitted through keratinocytes or mucous membranes of the skin.
  • HPVs human papillomaviruses
  • Warts develop in some HPVs, and some cause cancer-causable changes (precancerous lesions).
  • high-risk viruses such as human papilloma virus 16 (HPV 16) and human papillomavirus 18 (HPV 18) can cause cancers such as cervical cancer and testicular cancer.
  • Cervical cancer is the most common cancer death among women worldwide, and almost all cases are caused by infection with human papillomavirus (HPV).
  • HPV16 and HPV18 make up about 70-75% of cervical cancer patients.
  • Sustained proliferation of infected cells progresses to cervical intraepithelial neoplasia (CIN), a precancerous condition, which gradually worsens to invasive cancer.
  • CIN cervical intraepithelial neoplasia
  • HPV vaccines can effectively prevent HPV infection, but have no therapeutic effect on lesions after infection.
  • the most common treatment for CIN2 and CIN3 is resection, but this can lead to pregnancy-related complications, with a risk of relapse of about 10%.
  • the mortality rate due to cervical cancer is reported to be more than 50% even after treatment with general treatment.
  • the present invention provides a composition for the prevention or treatment of human papillomavirus-derived diseases.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating a human papillomavirus-derived disease.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin Fc region and an IL-7 fusion protein.
  • the present invention also provides a method for treating a human papillomavirus-derived disease by mucosally administering a pharmaceutical composition comprising the fusion protein.
  • the antigen-specific T cell number may be increased to prevent or treat human papillomavirus-derived diseases as well as to facilitate administration. . Therefore, it can be utilized as a new pharmaceutical composition that can replace the prevention of cervical cancer by the conventional HPV vaccine.
  • FIG. 1 is a schematic of the structure of F-7 fused IL-7.
  • FIG. 2A and 2B are bar graphs (FIG. 2A) and fluorescence images showing fluorescence intensity in various organs on days 1 and 7 after administration of Cy5.5 and IL-7-Fc-Cy5.5 to mucosal membranes, respectively. (FIG. 2B) (*, p ⁇ 0.05).
  • FIG. 3 is a diagram showing that IL-7-Fc migrates to serum through FcRn-mediated transcytosis after mouse intravaginal administration of PBS, rIL-7, and IL-7-Fc (*, p ⁇ 0.05 (rIL-7 vs IL-7-Fc)).
  • FIG. 4 shows a dot plot of T cells in cervical tissue, the number of CD4 and CD8 T cell numbers, and the number of CD62L low CD44 high subsets in CD4 and CD8 T cell numbers (**, p ⁇ 0.01) .
  • FIG. 5 shows the results of T cell recruitment according to the IL-7-Fc administration route.
  • T cells in cervical (CV) tissue were analyzed by flow cytometry to show the number of CD4 T cells and CD8 T cells (FIG. 5) (**, p ⁇ 0.01).
  • Figure 6 shows the results of observing the anticancer effect of IL-7-Fc administration.
  • a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of genital diseases comprising an interleukin-7 (IL-7) fusion protein to which the immunoglobulin Fc region is bound.
  • IL-7 interleukin-7
  • the genital disease may be a disease derived from human papillomavirus.
  • Human papillomavirus derived disease or "human papillomavirus infectious disease” means a disease caused by infection of human papillomavirus (HPV).
  • Human papillomavirus-derived diseases can be classified into CIN1, CIN2, CIN3, low grade squamous intraepithelial lesions (LSIL), high grade squamous intraepithelial lesions (HSIL), or cancer, depending on the extent of infection and lesion conditions.
  • LSIL low grade squamous intraepithelial lesions
  • HSIL high grade squamous intraepithelial lesions
  • interleukin-7 may be a protein having the same amino acid sequence as interleukin-7 derived from an animal or human body. Or a polypeptide or protein having similar activity to that of the protein derived from the living body. Specifically, the IL-7 may be a protein including an IL-7 protein or a fragment thereof. In addition, the IL-7 may be derived from humans, rats, mice, monkeys, cattle or sheep.
  • IL-7 includes a polypeptide consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6.
  • the IL-7 is about 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% of the sequence of SEQ ID NO: 1 , 97%, 98%, 99% or more may be the same.
  • human IL-7 may have an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (Genbank Accession No. P13232); Rat IL-7 may have an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (Genbank Accession No. P56478); Mouse IL-7 may have an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 (Genbank Accession No. P10168); The monkey IL-7 may have an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 (Genbank Accession No. NP — 001279008); Bovine IL-7 may have an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 (Genbank Accession No. P26895); Both IL-7 may have an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 (Genbank Accession No. Q28540).
  • the IL-7 protein or fragment thereof may comprise various modified proteins or peptides, ie variants.
  • the modification can be carried out by replacing, deleting or adding one or more proteins to wild type IL-7 that do not modify the function of IL-7.
  • These various proteins or peptides are 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% with wild type proteins. It may have a homology of%.
  • substitution of wild-type amino acid residues can be carried out by alanine or conservative amino acid, which does not affect or weaken the charge, polarity or hydrophobicity of the entire protein.
  • IL-7 protein is also used in the concept including “IL-7 protein” and fragments thereof.
  • protein protein
  • polypeptide and “peptide” can be used as interchangeable concepts unless otherwise indicated.
  • the IL-7 may be a modified IL-7 having the structure:
  • A is an oligopeptide consisting of 1 to 10 amino acid residues
  • IL-7 is a polypeptide having interleukin-7 or similar activity.
  • A may be directly connected to the N-terminus of the IL-7, or may be linked through a linker.
  • the A may increase the productivity of IL-7 and may be prepared according to the method disclosed in Korean Application No. 10-2016-0072769.
  • A may be linked to the N-terminus of IL-7.
  • A comprises 1 to 10 amino acids, preferably may be selected from the group consisting of methionine, glycine, serine and combinations thereof.
  • Methionine and glycine are not known to induce an immune response in the human body.
  • Various protein therapies produced from E. coli must include methionine at the N-terminus, but no immune side effects have been reported.
  • glycine is widely used in GS linker and is known to not induce an immune response in commercial products such as Dulaglutide.
  • the IL-7 may be an oligopeptide comprising 1 to 10 amino acids selected from the group consisting of methionine (Met, M), glycine (Gly, G) and combinations thereof. Preferably it may be an oligopeptide consisting of 1 to 5 amino acids.
  • A is methionine, glycine, methionine-methionine, glycine-glycine, glycine-glycine, methionine-glycine, glycine-methionine, and glycine-methionine.
  • methionine, methionine-methionine-methionine, methionine-methionine-glycine, methionine-glycine-methionine, glycine-methionine-methionine methionine-methionine, methionine-glycine-glycine, glycine-methionine-glycine, glycine-glycine-methionine, and glycine-glycine-glycine (glycine-glycine-glycine) can be represented by an amino acid sequence selected from the group consisting of.
  • the modified IL-7 may have any one amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 15 to 20.
  • the immunoglobulin Fc region may include an animal, human or modified immunoglobulin Fc region thereof.
  • the IL-7 may be linked to the N-terminus or C-terminus of the Fc region. It is known that IL-7 activity is present even when IL-7 is fused to the C-terminus of the Fc region (US8338575 B2). In this case, the IL-7 may be connected to the Fc region through a linker.
  • Fc region include heavy chain constant region 2 (CH2) and heavy chain constant region 3 (CH3) of immunoglobulin and include the variable chains of the heavy and light chains of immunoglobulin.
  • Region and light chain constant region 1 refer to proteins that do not comprise. It may further comprise a hinge region of the heavy chain constant region.
  • Hybrid Fc or hybrid Fc fragments are also referred to herein as "hFc” or "hyFc”.
  • Fc region of modified immunoglobulin” or “Fc region variant” means that some amino acids in the Fc region are substituted or prepared by combining different kinds of Fc regions.
  • Fc receptor-binding ability and / or complement and binding ability are modified so that antibody-dependent cytotoxicity (ADCC) or complement-dependent cytotoxicity (CDC) is weakened compared to wild-type Fc region.
  • the Fc region of the immunoglobulin can be selected from the group consisting of IgG1, IgG2, IgG3, IgD, IgG4 and combinations of these sequences.
  • the Fc region of the modified immunoglobulin comprises a CH2 domain and a CH3 domain in the N-terminal to C-terminal direction, wherein the CH2 domain comprises a portion of the amino acid residues of the human IgD and the CH2 domain of human IgG4,
  • the CH3 domain may comprise a portion of amino acid residues of the CH3 domain of human IgG4.
  • the Fc region variant may be modified to prevent cleavage at the hinge site.
  • the 144th and / or 145th amino acid of SEQ ID NO: 9 may be modified.
  • the 144th amino acid K of SEQ ID NO: 9 may be substituted with G or S, and the 145th amino acid E with G or S may be a variant.
  • the Fc region of the modified immunoglobulin comprises a CH2 domain and a CH3 domain in the N-terminal to C-terminal direction, wherein the CH2 domain comprises a portion of the amino acid residues of the human IgD and the CH2 domain of human IgG4,
  • the CH3 domain may comprise a portion of amino acid residues of the CH3 domain of human IgG4.
  • Fc region As used herein, the terms “Fc region”, “Fc fragment” or “Fc” include heavy chain constant region 2 (CH2) and heavy chain constant region 3 (CH3) of immunoglobulin and include the variable chains of the heavy and light chains of immunoglobulin. Region and light chain constant region 1 (CL1) refer to proteins that do not comprise. It may further comprise a hinge region of the heavy chain constant region. Hybrid Fc or hybrid Fc fragments are also referred to herein as "hFc” or “hyFc”.
  • Fc region variant as used herein means that some amino acids in the Fc region are substituted or prepared by combining different kinds of Fc regions. The Fc region variant may be modified to prevent cleavage at the hinge site.
  • the 144th and / or 145th amino acid of SEQ ID NO: 9 may be modified.
  • the 144th amino acid K of SEQ ID NO: 9 may be substituted with G or S
  • the 145th amino acid E with G or S may be a variant.
  • hFc can be represented by the following formula (I):
  • N ' is the N-terminus of the polypeptide and C' is the C-terminus of the polypeptide
  • p or q is an integer equal to 0 or 1
  • Z 1 is an amino acid sequence having 5 to 9 consecutive amino acid residues in the N-terminal direction from position 98 of amino acid residues at positions 90 to 98 of SEQ ID NO: 7,
  • Y is an amino acid sequence having 5 to 64 contiguous amino acid residues in the N-terminal direction from position 162 of amino acid residues at positions 99 to 162 of SEQ ID NO: 7,
  • Z2 is an amino acid sequence having 4 to 37 consecutive amino acid residues in the C-terminal direction from position 163 among amino acid residues at positions 163 to 199 of SEQ ID NO: 7,
  • Z3 is an amino acid sequence having 70 to 106 consecutive amino acid residues in the N-terminal direction from position 220 of amino acid residues at positions 115 to 220 of SEQ ID NO: 8,
  • Z 4 is an amino acid sequence having 80 to 107 amino acid sequences in the C-terminal direction from position 221 of amino acid residues at positions 221 to 327 of SEQ ID NO: 8.
  • Fc region or Fc region variant of the modified immunoglobulin can be represented by the following formula (I):
  • N ' is the N-terminus of the polypeptide and C' is the C-terminus of the polypeptide;
  • p is an integer of 0 or 1;
  • Z 1 is an amino acid sequence having 5 to 9 consecutive amino acid residues in the N-terminal direction from position 98 of amino acid residues at positions 90 to 98 of SEQ ID NO: 7,
  • Y is an amino acid sequence having 5 to 64 contiguous amino acid residues in the N-terminal direction from position 162 of amino acid residues at positions 99 to 162 of SEQ ID NO: 7,
  • Z2 is an amino acid sequence having 4 to 37 consecutive amino acid residues in the C-terminal direction from position 163 among amino acid residues at positions 163 to 199 of SEQ ID NO: 7,
  • Z3 is an amino acid sequence having 70 to 106 consecutive amino acid residues in the N-terminal direction from position 220 of amino acid residues at positions 115 to 220 of SEQ ID NO: 8, and
  • Z 4 is an amino acid sequence having 80 to 107 amino acid sequences in the C-terminal direction from position 221 of amino acid residues at positions 221 to 327 of SEQ ID NO: 8.
  • the Fc fragment of the present invention may be a natural sugar chain, an increased sugar chain compared to the natural form, a reduced sugar chain compared to the natural form, or a form in which the sugar chain is removed.
  • the increase, decrease or removal of immunoglobulin Fc sugar chains can be carried out by conventional methods known in the art such as chemical methods, enzymatic methods and genetic engineering methods using microorganisms.
  • the removal of sugar chains from the Fc fragment dramatically reduces the binding affinity of the primary complement component C1 to C1q, leads to a reduction or loss of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) or complement-dependent cytotoxicity (CDC), It does not induce unnecessary immune responses in vivo.
  • ADCC antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity
  • CDC complement-dependent cytotoxicity
  • immunoglobulin Fc fragments in deglycosylated or aglycosylated forms may be more suitable for the purposes of the present invention as carriers of drugs.
  • deglycosylation refers to the enzymatic removal of sugars from the Fc fragment
  • aglycosylation means that the Fc fragment is to a prokaryote, preferably E. coli . It means that it is produced in an unglycosylated form.
  • the Fc region of the modified immunoglobulin comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 (hFc01), SEQ ID NO: 10 (hFc02), SEQ ID NO: 11 (hFc03), SEQ ID NO: 12 (hFc04), or SEQ ID NO: 13 (hFc05). can do.
  • the Fc region of the modified immunoglobulin may comprise the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 (non-lytic mouse Fc).
  • the Fc region of the modified immunoglobulin may be that described in US Pat. No. 7,867,491, and the production of the Fc region of the modified immunoglobulin may be performed with reference to US Pat. No. 7,867,491. .
  • interleukin-7 fusion protein to which the immunoglobulin Fc region is bound may have an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 21 to 27.
  • the interleukin-7 fusion protein to which the immunoglobulin Fc region of the present invention is bound may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier can be any carrier as long as it is a non-toxic substance suitable for delivery to a patient. Distilled water, alcohols, fats, waxes and inert solids may be included as carriers. Pharmacologically acceptable adjuvants (buffers, dispersants) may also be included in the pharmaceutical composition.
  • a method of preventing or treating genital disease comprising administering to a subject an interleukin-7 (IL-7) fusion protein to which an immunoglobulin Fc region is bound and a pharmaceutically acceptable carrier. to provide.
  • IL-7 interleukin-7
  • the genital disease may be a human papillomavirus derived disease, for example cervical cancer.
  • the method of administration to the subject may be topical administration, preferably mucosal administration.
  • the composition of the present invention preferably comprises an aqueous or physiologically applicable portion of a bodily fluid suspension or solution.
  • the carrier or carrier is physiologically acceptable and therefore can be added to the composition and delivered to the patient, which does not adversely affect the electrolyte and / or volume balance of the patient.
  • bodily saline for the formulation may generally include saline. It may also include portions of suspensions or solutions that are viscous depending on the lesion or physiological condition.
  • the method for preventing or treating a disease using the fusion protein of the present invention or a composition comprising the same may include administering another drug or physiologically active substance having a prophylactic or therapeutic effect in combination with the protein or the composition of the present invention.
  • the route of administration, timing of administration, and dosage may be determined according to the type of disease, the disease state of the patient, the purpose of treatment or prevention, and other drugs or physiologically active substances used in combination.
  • the isolated nucleic acid molecule encoding the modified interleukin-7, or a fusion protein comprising the same may be encoded from a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 15 to 25.
  • the nucleic acid molecule may include a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 29 to 39.
  • the nucleic acid molecule may further include a signal sequence or a leader sequence.
  • C57BL / 6 female mice, 8-10 weeks of age, used in the examples below were purchased from The Jackson Laboratory (Bar Harbor, USA) and were bred to specific sterile conditions in an animal care facility at POSTECH.
  • the course of animal experiments was conducted according to the National Institutes of Health (NIH) guidelines for mouse experiments, and the protocol of the experiment was approved by the Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
  • IACUC Institutional Animal Care and Use Committee
  • 11-week-old Sprague-Dawley female rats were purchased from Charles River Laboratories (Raleigh, USA) and bred to specific sterile conditions at MPI Research's animal shelter. Animal testing was conducted in accordance with the provisions of the United States Department of Agriculture (USDA) Animal Welfare Act (9 CFR, parts 1-3).
  • USDA United States Department of Agriculture
  • Codon-optimized human IL-7 and granular leukocyte colony stimulating factor (G-CSF) genes were fused with hybrid Fc-fragments, respectively.
  • the schematic diagram of Fc-fused IL-7 is shown in FIG. 1.
  • Chinese hamster ovary (CHO) cells were stably transformed with plasmids encoding IL-7-Fc and G-CSF-Fc. Thereafter, IL-7-Fc and G-CSF-Fc were obtained from the cell lines of the cells.
  • Purified recombinant human IL-7 (rIL-7) was purchased from Biolegend (San Diego, USA) as a control.
  • estrus resting mice were administered subcutaneously with 3 mg of hydroxyprogesterone acetate (Depo-Provera, Pfizer). Mice were also anesthetized by injection of 100 mg / kg ketamine (Yuhan) and 10 mg / kg xylazine hydrochloride (Bayer) intraperitoneally with PBS. Thereafter, 10 ⁇ g of rIL-7, IL-7-Fc or G-CSF-FC were mixed with PBS and then applied (administered) onto the vaginal mucosal tissue using a micropipette.
  • IL-7-Fc was coupled with Cy-5.5 mono-reactive NHS ester.
  • the dissolved protein was desalted and concentrated using a centrifuge device (Merck Millipore), and the protein concentration of the dye labeled IL-7-Fc was measured using an anti-human IL-7 ELISA set (Southern Biotech).
  • Anesthetized mice were intravaginally administered Cy-5.5-bound IL-7-Fc (1 mg / kg) and Cy-5.5 with PBS at equal signal intensity. After 1 and 7 days of administration, the mice were euthanized and vaginal washed, and then each organ was obtained. The fluorescence signal intensity was then quantified on an IVIS Spectrum Machine (Caliper Life Science). Signal strength was measured quantitatively in the organ by measuring photons per second per centimeter squared per steradian (p / s / cm 2 / sr).
  • CV tissues were surgically cut using sterile techniques and the tissues were ground to obtain spleen cells.
  • CV tissues were minced and treated with 1 mg / ml collagenase D (Roche) and 0.5 mg / ml DNase (Sigma-Aldrich). Cells were delivered through 40- ⁇ m strainer (BD), washed and resuspended in RPMI-1640 with 10% FBS and antibiotics.
  • the cells used in the following examples were treated with CD16 / 32 (2.4G2), and the cells were stained with the following monoclonal antibody: CD4 (RM4-5 ), CD8 (53-6.7), CD44 (IM7), CD62L (MEL-14), CD11 b (M1 / 70), CD11c (N418), and MHCII (M5 / 114.15.2), available from eBioscience; CD3e (145-2C1) and TCR ⁇ (GL3) from BD; CXCR3 (CXCR3-173) from Biolegend; Provided by Live / Dead, Life technologies. All samples were analyzed using LSR Fortessa (BD) and FlowJo software (Tree Star).
  • Cy5.5-IL-7-Fc in cervical and vaginal (cervix / vagina, CV) tissues increased significantly on day 1 after administration and was observed until day 7 It became.
  • signal intensity in the CV tissues of Cy5.5-IL-7-Fc-administered mice was 6 and 4.5 times higher than the control (Cy5.5-administered mice) on days 1 and 7 after administration, respectively.
  • Fluorescent signals were also detected at high intensity in various cervical and vaginal proximal tissues (cervical-vaginal, uterine, ovarian and rectal) of Cy5.5-IL-7-Fc administered mice.
  • Cy5.5-IL-7-Fc-treated mice maintained high levels of fluorescence not only in the genital tissue but also in the liver, kidney, and spleen on the 7th day.
  • the results are shown in Table 1, Table 2 and FIG. The data in the table below are expressed as means ⁇ SEMs (*, p ⁇ 0.05).
  • topical administration of IL-7-Fc increased the number of CD4 and CD8 T cells.
  • This increase in genital T cells peaked on day 7 after IL-7-Fc administration and gradually decreased to near baseline on day 14.
  • the number of CD4 and CD8 T cells significantly increased by about 20-fold and 10-fold, respectively, compared to the basal level on day 7 after IL-7-Fc administration.
  • the number of CD44 high CD62L low reactor CD4 and CD8 T cells significantly increased at day 7, and over time the total CD4 and CD8 T cells decreased in a similar pattern.
  • the degree of CD4 and CD8 T cell accumulation in cervical and vaginal tissues was further increased by intravaginal administration than subcutaneous administration. Therefore, in order to induce CD4 and CD8 T cells specifically for cervical and vaginal tissues, it was found that it is effective to administer by intravaginal route directly related to cervical and vaginal tissues rather than systemic administration such as subcutaneous administration.
  • mice received 1 x 10 6 TC-1 / fluc cell line (cell line designed to express luciferase gene into TC-1 cell line expressing HPV16 E6, E7 gene) via intravaginal route It was.
  • estrus resting mice were administered subcutaneously with 3 mg of methoxyprogesterone acetate (Depo-Provera, Pfizer).
  • mice On the day of TC-1 / fluc cell line administration, the mice were anesthetized, vaginally administered with 10ul 20% nonoxynol-9 (USP) and 40ul 3% carboxymethyl cellulose (CMC) (Sigma-Aldrich) and anesthetized again 6 hours later.
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Abstract

본 발명은 면역글로불린 Fc 영역 및 IL-7 융합단백질을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 상기 면역글로불린 Fc 영역 및 IL-7을 포함하는 융합단백질을 국소 투여할 경우 신체 내에 강한 면역반응을 유도하여, 사람 파필로마바이러스 유래 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

Description

면역글로불린 FC가 융합된 인터루킨-7 융합 단백질을 포함하는 사람 파필로마바이러스 유래 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 발명은 인터루킨-7을 포함하는 융합 단백질의 사람 파필로마바이러스 유래 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 대한 것이다.
인터루킨-7 (이하, 'IL-7')은 B 세포와 T 세포를 매개로 면역 반응을 촉진시키는 면역촉진 사이토카인으로서 특히 적응 면역체계에서 중요한 역할을 한다. 주로 골수와 흉선의 스트로마세포(stromal cell)에서 분비되나, 각질세포, 수지상세포, 간세포, 신경세포 및 상피세포에서도 생산된다(Heufler C et al., 1993, J. Exp. Med. 178(3): 1109-14).
구체적으로, 인터루킨-7은 T 세포와 B 세포의 생존 및 분화, 임파상 세포(lymphoid cell)의 생존, 및 NK(natural killer) 세포의 활성 촉진 등을 통해 면역 기능을 활성화시키는데, 특히 T 세포와 B 세포의 발달에 중요하다. 이는 HGF(hepatocyte growth factor)와 결합하여 pre-pro-B 세포 성장-자극 인자(growth-stimulating factor), T세포 수용체 베타(TCRβ)의 V(D)J 재배 열(rearrangement)의 보조인자(cofactor)(Muegge K, 1993, Science 261 (5117):93-5)로서 작용한다. 또한, 인터루킨-7은 LTi(lymphoid tissue inducer) 세포를 통하여 림프절(lymph nodes) 발달을 조절하고, 나이브(naive) T 세포나 기억(memory) T 세포의 팽창 및 생존을 증진시킨다. 또한, IL-7은 IL-2 및 인터페론 감마(interferon-γ)의 분비를 촉진하여 인간의 면역 반응을 증진시키는 것으로 알려져 있다.
한편 파필로마바이러스(papillomavirus)는 직경이 52~55nm인 DNA 기반의 바이러스로서, 사람을 비롯한 여러 동물의 피부나 피하에 감염된다. 인간 유두종바이러스(HPV)는 보통 피부의 케라틴 세포나 점막을 통하여 감염된다. 지금까지 100여 종 이상의 인간 유두종바이러스(HPV)가 발견되었는데 대부분은 어떠한 징후를 나타내지 않지만, 일부의 경우, 사람에게 유두종(papilloma)을 발생시킬 수 있다. 일부 HPV에서는 사마귀가 발생하며, 일부는 암으로 발생가능한 변화(전암병변, precancerous lesions)를 일으킨다. 특히 인간 유두종 바이러스 16(HPV 16) 및 인간 유두종바이러스 18(HPV 18)과 같은 고위험군의 바이러스는 자궁경부암, 고환암과 같은 암을 발생시킬 수 있다.
자궁경부암은 전 세계 여성들의 암으로 인한 사망 중 가장 흔한 암으로써, 거의 모든 경우가 인간 유두종 바이러스 (Human papillomavirus, HPV)의 감염에 의해 발생된다. 이 바이러스 중에서도, HPV16 및 HPV18은 자궁경부암 환자의 약 70 내지 75%를 차지한다. 감염된 세포의 지속적인 증식은 전암 상태인 자궁경부 상피 내 종양 (Cervical intraepithelial neoplasia, CIN)으로 진행되고, 이는 점차 침습성 암으로 악화된다.
HPV 예방백신은 HPV 감염을 효과적으로 예방할 수 있지만, 이미 감염된 이후의 병변에 대한 치료효과는 없다. 따라서 현재 CIN2 및 CIN3의 가장 흔한 치료방법은 절제술이지만, 이는 임신관련 합병증을 유발시킬 수 있고, 약 10%의 재발 위험성이 있다. 또한, 일반적인 치료법으로 치료한 이후에도 자궁경부암으로 인한 사망률은 50%이상으로 보고되고 있다.
한편, 최근 면역증강을 유도하여 HPV 감염을 치료하기 위한 요법이 개발되고 있다. HPV16 E7의 항원을 포함하는 백신을 접종한 후, 톨형 수용체 (TLR) 작용제 7 및 9, 이미퀴모드 및 CpG를 국부 투여하는 경우, 생식기 내 E7-특이 CD8 T 세포의 축적유도 및 생식기 종양의 퇴화를 유도할 수 있음이 보고되었다(Soong R-S et al., 2014, Clin Cancer Res 20:5456-67). 그러나, 인간에서의 이미퀴모드 사용은 급작스럽고 심각한 국부 염증 및 궤양을 포함하는 부작용을 유도할 수 있고, CpG 투여는 단기적인 효능으로 인해 반복된 주사가 필요하다. 치료효과를 향상시키기 위해 동물 모델에서 백신 보조제로서 제공되는 IL-2 및 IL-15와 같은 사이토카인의 능력이 보고된바 있으나(Abraham E et al., 1992, J Immunol 149:3719-26), 이 역시 반복적인 주사가 필요하고, 특히 IL-2의 경우 모세혈관 누출 증후군(capillary leakage syndrom)과 같은 부작용이 우려된다.
따라서, HPV 감염에 의하여 유발되는 질환을 예방 및 치료하기 위한 효과적이고 비수술적인 치료요법의 개발이 여전히 요구되고 있는 실정이다.
본 발명은 사람 파필로마바이러스 유래 질환의 예방 또는 치료를 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 사람 파필로마바이러스 유래 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
이러한 문제를 해결하기 위하여, 본 발명은 면역글로불린 Fc 영역 및 IL-7 융합단백질을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 또한, 상기 융합단백질을 포함한 약학적 조성물을 점막 투여하여, 사람 파필로마바이러스 유래 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 면역글로불린 Fc 영역 및 IL-7을 포함하는 융합단백질을 점막투여할 경우, 항원-특이 T 세포 수를 증가시켜 사람 파필로마바이러스 유래 질환을 예방 또는 치료할 수 있을 뿐만 아니라 투여가 용이하다. 따라서, 종래의 HPV 예방백신에 의한 자궁경부암 예방을 대체할 수 있는 새로운 약학적 조성물로 활용될 수 있다.
도 1은 Fc가 융합된 IL-7의 구조를 도식화한 것이다.
도 2a 및 도 2b는 점막에 Cy5.5 및 IL-7-Fc-Cy5.5를 각각 투여한 이후 1일 및 7일 째 되는 날 다양한 기관에서 형광강도를 나타낸 막대 그래프 (도 2a) 및 형광이미지 (도 2b)이다 (*, p < 0.05).
도 3은 PBS, rIL-7, 및 IL-7-Fc를 마우스 질내 투여 이후, FcRn-매개 통과세포외배출(transcytosis)을 통해 IL-7-Fc가 혈청으로 이동함을 보여주는 그림이다 (*, p < 0.05 (rIL-7 vs IL-7-Fc)).
도 4는 자궁경부 조직 내 T 세포의 점도표(dot plot), CD4 및 CD8 T 세포 숫자의 수, CD4 및 CD8 T 세포 수 내 CD62LlowCD44high부분 집합의 수를 나타낸다 (**, p < 0.01).
도 5는 IL-7-Fc 투여 경로에 따른 T 세포 동원 결과를 나타낸 것이다. 질내 투여 7일째에, 자궁경부 (CV) 조직 내 T 세포를 유동세포분석법으로 분석하여, CD4 T 세포 및 CD8 T 세포의 수 (도 5)를 나타낸 것이다 (**, p < 0.01).
도 6은 IL-7-Fc 투여에 따른 항암효과를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
상기 목적을 달성하기 위한 일 측면으로, 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 인터루킨-7(IL-7) 융합 단백질을 포함하는 생식기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 생식기 질환은 사람 파필로마바이러스 유래 질환일 수 있다.
본 명세서에서 사용한 용어. “사람 파필로마바이러스 유래 질환” 또는 “사람 파필로마바이러스 감염 질환”은 사람 파필로마바이러스(HPV)의 감염에 의하여 유발되는 질환을 의미한다. 사람 파필로마바이러스 유래 질환은 감염정도나 병변의 상태 등에 따라 CIN1, CIN2, CIN3, LSIL(Low grade squamous intraepithelial lesion), HSIL(High grade squamous intraepithelial lesion) 또는 암 등으로 분류할 수 있다.
본 명세서에서 사용한 용어, "인터루킨-7"은 동물 또는 인체에서 유래한 인터루킨-7과 동일한 아미노산 서열을 가지는 단백질일 수 있다. 또는 상기 생체 내에서 유래한 단백질과 유사한 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 단백질일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-7은 IL-7 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 단백질일 수 있다. 또한, 상기 IL-7은 인간, 흰쥐, 생쥐, 원숭이, 소 또는 양에서 유래된 것일 수 있다.
상기 IL-7은 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 포함한다. 또한, 상기 IL-7은 서열번호 1 내지 서열번호 6 의 서열과 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 것일 수 있다.
구체적으로, 인간 IL-7은 서열번호 1(Genbank Accession No. P13232)로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있고; 흰쥐 IL-7은 서열번호 2(Genbank Accession No. P56478)로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있으며; 생쥐 IL-7은 서열번호 3(Genbank Accession No. P10168)로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있고; 원숭이 IL-7은 서열번호 4(Genbank Accession No. NP_001279008)로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있으며; 소 IL-7은 서열번호 5(Genbank Accession No. P26895)으로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있고; 양 IL-7은 서열번호 6(Genbank Accession No. Q28540)로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또한, IL-7 단백질 또는 이의 단편은 다양하게 변형된 단백질 또는 펩티드, 즉 변이체를 포함할 수 있다. 상기 변형은 IL-7의 기능을 변형시키지 않는, 야생형 IL-7에 하나 이상의 단백질을 치환, 결실 또는 추가하는 방법을 통하여 수행될 수 있다. 이러한 다양한 단백질 또는 펩티드는 야생형 단백질과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 상동성을 가질 수 있다.
통상, 야생형 아미노산 잔기의 치환은 알라닌이나, 전체 단백질의 전하, 극성 또는 소수성에 영향을 주지 않거나 약하게 주는 보존적 아미노산 치환(conservative amino acid)에 의해 수행될 수 있다.
명세서에 사용된 용어, "IL-7 단백질"은 "IL-7 단백질" 및 이의 단편을 포함하는 개념으로 사용되기도 한다. 용어 "단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"는, 별다른 설명이 없는 한, 상호 호환되는 개념으로 사용될 수 있다.
또한, 상기 IL-7은 하기의 구조를 갖는 변형된 IL-7일 수 있다:
A - IL-7
상기 A는 1 내지 10 개의 아미노산 잔기로 구성된 올리고펩티드이고,
상기 IL-7은 인터루킨-7 또는 이와 유사한 활성을 갖는 폴리펩티드이다.
이때, 상기 A는 상기 IL-7의 N-말단에 직접 연결되거나, 또는 링커를 통해 연결될 수 있다.
상기 A는 IL-7의 생산성을 증가시킬 수 있으며 대한민국 출원 10-2016-0072769 호에 공개된 방법에 따라 제조될 수 있다.
본 발명에서 상기 A는 IL-7의 N-말단에 연결될 수 있다. 상기 구조식에서 A는 1개 내지 10개의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 메티오닌, 글리신, 세린 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
메티오닌과 글리신은 인체에서 면역반응을 유도하지 않는 것으로 알려져 있다. E. coli로부터 생산되는 다양한 단백질 치료제들은 N-말단에 메티오닌이 반드시 포함되지만 이로 인한 면역 부작용은 보고된 바가 없다. 한편, 글리신은 GS linker에 널리 사용되고 있으며, 둘라글루타이드(Dulaglutide)와 같은 상용화된 제품에서도 면역반응을 유도하지 않는 것으로 알려져 있다.
일 실시양태에 따르면, 상기 IL-7은 메티오닌(Met, M), 글리신(Gly, G) 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1개 내지 10개의 아미노산을 포함한 올리고펩티드일 수 있다. 바람직하게는 1개 내지 5개의 아미노산으로 구성된 올리고펩티드일 수 있다. 예를 들어, 상기 A는 메티오닌(methionine), 글리신(glycine), 메티오닌-메티오닌(methionine-methionine), 글리신-글리신(glycine-glycine), 메티오닌-글리신(methionine-glycine), 글리신-메티오닌(glycine-methionine), 메티오닌-메티오닌-메티오닌(methionine-methionine-methionine), 메티오닌-메티오닌-글리신(methionine-methionine-glycine), 메티오닌-글리신-메티오닌(methionine-glycine-methionine), 글리신-메티오닌-메티오닌(glycine-methionine-methionine), 메티오닌-글리신-글리신(methionine-glycine-glycine), 글리신-메티오닌-글리신(glycine-methionine-glycine), 글리신-글리신-메티오닌(glycine-glycine-methionine), 및 글리신-글리신-글리신(glycine-glycine-glycine)으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시될 수 있다. 이때, 상기 변형된 IL-7은 서열번호 15 내지 20에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
한편, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 동물, 인간 또는 이의 변형된 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 것일 수 있다.
상기 IL-7은 Fc 영역의 N-말단 또는 C-말단에 연결될 수 있다. Fc 영역의 C-말단에 IL-7을 융합한 경우에도 IL-7 활성이 존재함이 알려져있다 (US8338575 B2). 이때, 상기 IL-7은 Fc영역과 링커를 통해 연결될 수도 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "Fc 영역", "Fc 단편" 또는 "Fc"란 면역글로불린의 중쇄 불변 영역 2(CH2) 및 중쇄 불변 영역 3(CH3)을 포함하며, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 및 경쇄 불변 영역 1(CL1)은 포함하지 않는 단백질을 말한다. 그것은 중쇄 불변 영역의 힌지 영역을 추가로 더 포함할 수 있다. 하이브리드 Fc 또는 하이브리드 Fc 단편은 본원에서 "hFc" 또는 "hyFc"로 지칭되기도 한다. 또한, 본원에서 사용된 용어 “변형된 면역글로불린의 Fc 영역" 또는 "Fc 영역 변이체"는 Fc 영역 중 일부 아미노산이 치환되거나, 서로 다른 종류의 Fc 영역을 조합하여 제조된 것을 의미한다. 바람직하게는, Fc 수용체와 결합력 및/또는 보체(complement)와 결합력이 변형되어 항체의존성세포독성(ADCC) 또는 보체의존성세포독성(CDC)이 야생형의 Fc 영역에 비하여 약화된 Fc 영역을 의미한다. 이때, 변형된 면역글로불린의 Fc 영역는 IgG1, IgG2, IgG3, IgD, IgG4 및 이들 서열의 조합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
특히, 상기 변형된 면역글로불린의 Fc 영역은 N-말단에서 C-말단 방향으로 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하며, 상기 CH2 도메인은 인간 IgD와 인간 IgG4의 CH2 도메인의 아미노산 잔기의 부분을 포함하며, 상기 CH3 도메인은 인간 IgG4의 CH3 도메인의 아미노산 잔기의 부분을 포함하는 것일 수 있다.
상기 Fc 영역 변이체는 힌지 부위에서 절단되는 것을 예방하기 위해 변형될 수 있다. 구체적으로, 서열번호 9의 144번째 아미노산 및/또는 145번째 아미노산이 변형될 수 있다. 바람직하게는 서열번호 9의 144번째 아미노산인 K를 G 또는 S로 치환하고, 145번째 아미노산인 E를 G 또는 S로 치환한 변이체일 수 있다.
특히, 상기 변형된 면역글로불린의 Fc 영역은 N-말단에서 C-말단 방향으로 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하며, 상기 CH2 도메인은 인간 IgD와 인간 IgG4의 CH2 도메인의 아미노산 잔기의 부분을 포함하며, 상기 CH3 도메인은 인간 IgG4의 CH3 도메인의 아미노산 잔기의 부분을 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "Fc 영역", "Fc 단편" 또는 "Fc"란 면역글로불린의 중쇄 불변 영역 2(CH2) 및 중쇄 불변 영역 3(CH3)을 포함하며, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 및 경쇄 불변 영역 1(CL1)은 포함하지 않는 단백질을 말한다. 그것은 중쇄 불변 영역의 힌지 영역을 더 포함할 수 있다. 하이브리드 Fc 또는 하이브리드 Fc 단편은 본원에서 "hFc" 또는 "hyFc"로 지칭되기도 한다. 또한, 본원에서 사용된 용어 "Fc 영역 변이체"는 Fc 영역 중 일부 아미노산이 치환되거나, 서로 다른 종류의 Fc 영역을 조합하여 제조된 것을 의미한다. 상기 Fc 영역 변이체는 힌지 부위에서 절단되는 것을 예방하기 위해 변형될 수 있다. 구체적으로, 서열번호 9의 144번째 아미노산 및/또는 145번째 아미노산이 변형될 수 있다. 바람직하게는 서열번호 9의 144번째 아미노산인 K를 G 또는 S로 치환하고, 145번째 아미노산인 E를 G 또는 S로 치환한 변이체일 수 있다.
또한, 상기 hFc는 다음과 같은 식 (I)으로 나타낼 수 있다:
[식 (I)]
N'-(Z1)p-(Y)q-Z2-Z3-Z4-C'
상기 식에서,
N'은 폴리펩티드의 N-말단이고 C'는 폴리펩티드의 C-말단이며,
p 또는 q는 0 또는 1인 정수이고,
Z1은 서열번호 7의 90 내지 98 위치의 아미노산 잔기 중 98 위치로부터 N-말단 방향으로 5 내지 9개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고,
Y는 서열번호 7의 99 내지 162 위치의 아미노산 잔기 중 162 위치로부터 N-말단 방향으로 5 내지 64개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고,
Z2는 서열번호 7의 163 내지 199 위치의 아미노산 잔기 중 163 위치로부터 C-말단 방향으로 4 내지 37개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고,
Z3는 서열번호 8의 115 내지 220 위치의 아미노산 잔기 중 220 위치로부터 N-말단 방향으로 70 내지 106개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고,
Z4는 서열번호 8의 221 내지 327 위치의 아미노산 잔기 중 221 위치로부터 C-말단 방향으로 80 내지 107개의 아미노산 서열을 가지는 아미노산 서열이다.
또한, 상기 변형된 면역글로불린의 Fc 영역 또는 Fc 영역 변이체는 다음과 같은 식 (I)으로 나타낼 수 있다:
[식 (I)]
N'-(Z1)p-Y-Z2-Z3-Z4-C'
상기 식에서,
N'은 폴리펩티드의 N-말단이고 C'는 폴리펩티드의 C-말단이고;
p는 0 또는 1인 정수이고; 및
Z1은 서열번호 7의 90 내지 98 위치의 아미노산 잔기 중 98 위치로부터 N-말단 방향으로 5 내지 9개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고,
Y는 서열번호 7의 99 내지 162 위치의 아미노산 잔기 중 162 위치로부터 N-말단 방향으로 5 내지 64개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고,
Z2는 서열번호 7의 163 내지 199 위치의 아미노산 잔기 중 163 위치로부터 C-말단 방향으로 4 내지 37개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고,
Z3는 서열번호 8의 115 내지 220 위치의 아미노산 잔기 중 220 위치로부터 N-말단 방향으로 70 내지 106개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고, 및
Z4는 서열번호 8의 221 내지 327 위치의 아미노산 잔기 중 221 위치로부터 C-말단 방향으로 80 내지 107개의 아미노산 서열을 가지는 아미노산 서열이다.
또한, 본 발명의 Fc 단편은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄, 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 화학적 방법, 효소적 방법 및 미생물을 사용한 유전공학적 엔지니어링 방법 등과 같은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 면역글로불린 Fc 당쇄의 증가, 감소 또는 제거가 수행될 수 있다. Fc 단편으로부터 당쇄의 제거는 1차 보체 구성요소 C1의 C1q에의 결합 친화력을 급격하게 감소시키고, ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) 또는 CDC(complement-dependent cytotoxicity)의 감소 또는 소실을 가져오며, 그로 인하여 생체 내의 불필요한 면역반응을 유도하지 않는다. 이런 점에서, 당쇄가 제거되거나(deglycosylated) 비당쇄화된(aglycosylated) 형태에서의 면역글로불린 Fc 단편은, 약물의 담체로서 본 발명의 목적에 더 적합할 수 있다. 여기에서 사용된 용어 "당쇄의 제거(deglycosylation)"는 Fc 단편으로부터 효소적으로 당이 제거됨을 의미하고, 용어 "비당쇄화(aglycosylation)"는 Fc 단편이 원핵 생물, 바람직하게는 E. coli에 의하여 당쇄화되지 않은(unglycosylated) 형태로 생성됨을 의미한다.
또한, 상기 변형된 면역글로불린의 Fc 영역은 서열번호 9(hFc01), 서열번호 10(hFc02), 서열번호 11(hFc03), 서열번호 12(hFc04) 또는 서열번호 13 (hFc05)의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 변형된 면역글로불린의 Fc 영역은 서열번호 14의 아미노산 서열(non-lytic mouse Fc)을 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 변형된 면역글로불린의 Fc 영역은 미국 특허 제7,867,491호에 기재된 것일 수 있으며, 상기 변형된 면역글로불린의 Fc 영역의 생산은 미국 특허 제7,867,491호에 기재된 바를 참조하여 수행될 수 있다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 인터루킨-7 융합 단백질은 서열번호 21 내지 27의 어느 하나의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
한편, 본 발명의 면역글로블린 Fc 영역이 결합된 인터루킨-7 융합단백질은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 환자에게 전달하기에 적절한 비-독성 물질이면 어떠한 담체라도 가능하다. 증류수, 알코올, 지방, 왁스 및 비활성 고체가 담체로 포함될 수 있다. 약물학적으로 허용되는 애쥬번트(완충제, 분산제) 또한 약물학적 조성물에 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면으로, 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 인터루킨-7(IL-7) 융합 단백질과 약학적으로 허용가능한 담체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 생식기 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 생식기 질환은 사람 파필로마바이러스 유래 질환일 수 있고, 예를 들어, 자궁경부암일 수 있다.
이때, 개체에 투여하는 방법은 국소 투여일 수 있으며, 바람직하게는 점막 투여일 수 있다. 본 발명의 조성물이 질내(intravaginal) 또는 에어로졸 투여와 같이 국소적으로 제공되는 경우, 조성물은 바람직하게는 수성이거나 생리학적으로 적용가능한 체액 현탁액 또는 용액의 부분을 포함하는 것이 바람직하다. 이에 따라, 담체 또는 운반체가 생리학적으로 허용가능하므로 조성물에 첨가하여 환자에게 전달될 수 있고, 이는 환자의 전해질 및/또는 부피 수가(balance)에 악영향을 끼치지 않는다. 따라서, 제제를 위한 체액 배질로서 일반적으로 생리식염수를 포함할 수 있다. 또한 병변 또는 생리적 상태에 따라 점성을 가지는 현탁액 또는 용액의 부분을 포함할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질, 혹은 이를 포함하는 조성물을 이용하여 질환을 예방 또는 치료하는 방법은 본 발명의 단백질 혹은 조성물과 병용하여 질환의 예방 또는 치료 효과를 갖는 다른 약물 혹은 생리학적 활성물질을 투여하는 것도 포함할 수 있는데, 병용 투여의 경로, 투여시기, 및 투여용량은 질병의 종류, 환자의 질병 상태, 치료 또는 예방의 목적, 및 병용되는 다른 약물 혹은 생리학적 활성물질에 따라 결정될 수 있다.
상기 변형된 인터루킨-7, 또는 이를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자는 서열번호 15 내지 25로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로부터 코딩되는 것일 수 있다. 상기 핵산 분자는 서열번호 29 내지 39로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한 상기 핵산 분자는 신호 서열 또는 리더 서열을 추가적으로 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 준비예 및 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 준비예 및 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
준비예 1. 실험 동물의 준비
하기 실시예에서 사용된 생후 8-10주의 C57BL/6 암컷 마우스는 The Jackson Laboratory (Bar Harbor, USA)에서 구입하였고, POSTECH의 동물 보호시설에서 특정한 무균상태로 사육하였다. 동물실험의 과정은 마우스 실험을 위한 National Institutes of Health (NIH) 가이드라인에 따라 실시하였고, 실험의 프로토콜은 Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)에 의해 승인되었다. 또한, 생후 11주 된 Sprague-Dawley 암컷 래트는 Charles River Laboratories (Raleigh, USA)에서 구입하였고, MPI 리서치의 동물 보호시설에서 특정한 무균상태로 사육하였다. 동물실험의 과정은 the United States Department of Agriculture (USDA) 동물 복지법의 규정에 따라 실시하였다 (9 CFR, parts 1-3).
준비예 2. Fc와 IL-7이 결합된 융합단백질의 준비와 처리 방법
코돈-최적화된 인간 IL-7 및 과립성 백혈구 집락자극인자 (G-CSF) 유전자를 각각 하이브리드 Fc-단편과 융합하였다. Fc-융합된 IL-7의 구조모식도는 도 1과 같다. 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에 IL-7-Fc 및 G-CSF-Fc를 암호화하는 플라스미드를 안정적으로 형질전환시켰다. 그 후, 상기 세포의 세포주로부터 IL-7-Fc 및 G-CSF-Fc를 수득하였다. 대조군으로서 정제된 재조합 인간 IL-7 (rIL-7)을 Biolegend (San Diego, USA)로부터 구입하였다.
투여 4일 전, 발정휴지기인 마우스에게 3 mg의 아세트산 메드록시프로게스테론 (Depo-Provera, Pfizer)를 피하 주사로 투여하였다. 또한, 100 mg/kg 케타민 (Yuhan) 및 10 mg/kg 자일라진 염화수소산염 (Bayer)를 PBS와 함께 복강 내로 주사하여 마우스를 마취시켰다. 그 후, 10 ㎍의 rIL-7, IL-7-Fc 또는 G-CSF-FC를 PBS와 섞은 후 마이크로피펫을 이용하여 질내 점막 조직 위에 도포(투여)하였다.
준비예 3. 생식기 내 형광-결합 IL-7- Fc의 동정
IL-7-Fc를 Cy-5.5 mono-reactive NHS ester와 결합시켰다. 녹여서 분리된 단백질을 원심 분리기 장치 (Merck Millipore)를 사용하여 탈염시켜 농축하였고, 염료 표지된 IL-7-Fc의 단백질 농도는 anti-human IL-7 ELISA set (Southern Biotech)를 사용하여 측정하였다. 마취상태의 마우스에 PBS와 함께 Cy-5.5-결합된 IL-7-Fc (1mg/kg) 및 Cy-5.5를 동등한 신호강도로 질내 투여하였다. 투여한 지 1일 및 7일 이후에 마우스를 안락사시키고 질 세척한 후, 각 장기를 수득하였다. 그 후, IVIS 스펙트럼 기계 (Caliper Life Science)에서 형광 신호 강도를 정량화하였다. 신호 강도는 photons per second per centimeter squared per steradian (p/s/cm2/sr)을 측정하며 장기 내에서 정량적으로 측정하였다.
준비예 4. 혈청 IL-7의 정량화
혈청 IL-7 농도를 측정하기 위해, IL-7-Fc 투여 전 및 투여 후 7일까지 혈액 샘플을 채취하였고, 인간 IL-7 ELISA set (Southern biotech)를 이용하여 측정하였다.
준비예 5. 반복 투여 독성 연구
IL-7-Fc 국소 투여 이후, 현미경을 이용한 조직병리학 분석을 위해, 4주 동안 (총 투약량 5) 일주일에 한 번, 래트들에 질내 투여로 0.8, 3, 8 mg/kg/dose의 IL-7-Fc를 투약하였다. 자궁 경부 및 질 조직을 절제한 후, 중화 포르말린으로 고정하였다. 고정된 조직들을 파라핀에 넣었고, 4 내지 6㎛ 두께로 절단하였으며, 헤마톡실린 및 에오신 (H&E, Sigma-Aldrich)으로 염색했다. 질 염증의 투여-의존 정도를 확인하기 위하여, 래트들을 각각의 용량 투여한 지 4시간 및 24시간 이후 및 매주 개별적으로 관찰하였다. 다음과 같은 점수 등급을 사용하여 구분하였다. 0 = 홍반이 없음, 1 = 아주 경미한 홍반 (거의 감지할 수 없음), 2 = 뚜렷한 홍반, 3 = 중간 정도의 홍반, 4 = 딱지를 형성하는 심각한 홍반 (붉은색).
준비예 6. 비장 세포 및 자궁경부 세포 분리
비장 및 CV 조직은 무균 기법을 사용하여 외과적으로 잘라내었고, 조직을 분쇄하여 비장 세포를 수득하였다. CV 세포 준비를 위해, CV 조직을 다진 후 1 mg/ml collagenase D (Roche) 및 0.5 mg/ml DNase (Sigma-Aldrich)를 처리하였다. 세포를 40-㎛ strainer (BD)를 통해 전달하였고, 씻어냈으며, 10% FBS 및 항생제를 포함한 RPMI-1640으로 재현탁하였다.
준비예 7. 유동 세포 분석법
면역글로불린이 Fc 수용체에 비-특이적 결합하는 것을 막기 위해 하기 실시예에서 사용한 세포들을 CD16/32 (2.4G2)를 처리하였고, 그 세포들을 다음의 단일 클론 항체로 염색하였다: CD4 (RM4-5), CD8 (53-6.7), CD44 (IM7), CD62L (MEL-14), CD11 b (M1/70), CD11c (N418), 및 MHCII (M5/114.15.2), eBioscience로부터 제공; CD3e (145-2C1) 및 TCRγδ (GL3), BD로부터 제공; CXCR3 (CXCR3-173), Biolegend로부터 제공; Live/Dead, Life technologies로부터 제공. 모든 샘플들은 LSR Fortessa (BD) 및 FlowJo software (Tree Star)를 이용하여 분석하였다.
준비예 8. 통계분석
두 실험 집단 사이에 통계적인 차이점을 평가하기 위해, two-tailed paired Student's t-test를 사용하였다. 체내에서 진행되는 종양 실험을 위해, 집단 사이에 생존율의 차이점을 Prism 5.0 software (GraphPad)를 사용하여 log-rank test로 평가하였다.
실시예 1. IL-7- Fc 융합 단백질의 투여방법 평가
C57BL/6 야생형 마우스 (n=3/group)에게 Cy-5.5 (Cy-5.5) 및 Cy-5.5 결합된-IL-7-Fc (Cy5.5-IL-7-Fc)를 질내 투여하였다. 그 결과를 도 2a 및 도 2b에 나타내었다.
도 2a 및 도 2b에 나타난 바와 같이, 자궁경부 및 질 (cervix/vagina, CV) 조직 내 Cy-5.5-IL-7-Fc의 강도는 투여 이후 1일 째 되는 날 크게 증가했고, 7일까지 관찰되었다. 특히, Cy5.5-IL-7-Fc 투여된 마우스의 CV 조직 내 신호강도는 투여 이후 1일 및 7일 째 되는 날에 대조군(Cy5.5 투여 마우스) 보다 각각 6배 및 4.5배 높았다. 또한, 형광신호는 Cy5.5-IL-7-Fc 투여된 마우스의 다양한 자궁경부 및 질 인접 조직 (자궁경부-질, 자궁, 난소 및 직장)에서 높은 강도로 감지되었다. 특히, Cy5.5-IL-7-Fc 투여된 마우스의 경우 7일 째 되는 날에도 생식기 조직뿐만 아니라 간, 신장, 비장 내에서도 형광발광의 높은 수준이 유지되었다.
실시예 2. 질내 투여된 IL-7- Fc의 체순환 가능성 확인
마우스(n=7/group)에 PBS, rIL-7 및 IL-7-Fc를 질내 투여하였으며, IL-7의 혈청 농도를 인간 IL-7 ELISA로 분석하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타난 바와 같이, rIL-7은 아니지만, IL-7-Fc 투여된 마우스는 PBS 대조군과 비교했을 때, 상당히 증가된 IL-7의 수준을 나타냈다.
이러한 결과를 통해, 점막 상피에서 Fc-융합 단백질이 도포 이후 생식기-상피장벽 통과세포외배출(transcytosis)을 가능하게 한다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3. IL-7- Fc의 국부적 투여 이후, 자궁경부 조직 내 백혈구 수의 변화 분석
희생되기 0, 3, 7, 14 및 21일 전, 마우스 (n=3/group)에게 IL-7-Fc를 질내 투여하였으며, 자궁경부 조직 내 백혈구의 수를 유동 세포 분석법을 이용하여 계산하였다 (표 1). 또한, 마우스 (n=6/group)에게 PBS, IL-7, IL-7-Fc, IFN-α2a-Fc 또는 G-CSF-Fc를 투여하였고, 7일 후, CV 조직 내 CD4 및 CD8 T 세포를 유동 세포 분석법으로 분석하였다. 그 결과를 하기 표 1, 표 2 및 도 4에 나타내었다. 하기 표 의 데이터는 means ± SEMs로 나타내었다 (*, p < 0.05).
[표 1]
Figure PCTKR2016014127-appb-I000001
[표 2]
Figure PCTKR2016014127-appb-I000002
상기 표 1 및 도 4에 나타낸 바와 같이, IL-7-Fc의 국소 투여는 CD4 및 CD8 T 세포의 수를 증가시켰다. 생식기 T 세포의 이러한 증가는 IL-7-Fc 투여 이후 7일 째 되는 날 최고조에 달했으며, 점차 감소하여 14일 째 되는 날에는 기저수준에 가까워졌다. 뿐만 아니라, CD4 및 CD8 T 세포 수는, IL-7-Fc 투여 이후 7일 째 되는 날 기저수준과 비교하였을 때, 각각 약 20배 및 10배로 유의적으로 증가하였다. 특히, CD44highCD62Llow 반응기 CD4 및 CD8 T 세포의 수는 7일 차에 유의적으로 증가하였고, 시간이 지나면서 전체 CD4 및 CD8 T 세포는 유사한 패턴으로 감소하였다.
또한 상기 표 2 및 도 4에 나타낸 바와 같이, IFN-α2a-Fc, G-CSF-Fc를 투여했을 경우에는 기저수준과 비교 혹은 대조군과 비교하였을 때 CD4 및 CD8 T 세포 수가 유의적으로 변화하지 않았다.
이러한 결과로부터 IL-7-Fc 질내 투여가 T 세포 및 DCs와 같은 면역세포의 국부 축적을 유도한다는 것을 알 수 있었다. 또한 다른 면역유도 물질에 비해 효과가 뛰어남을 확인하였다.
실시예 4. IL-7- Fc의 독성 평가
SD 래트에게 1, 8, 15, 22 및 29일 총 5번에 걸쳐, IL-7-Fc를 질내 투여 했다. 초기 투여 이후 33일 차에, 현미경으로 생식기 부분을 관찰하였다 (표 3A). Scoring 척도를 사용하여 투여 전, 투여 후 4시간째 및 투여 후 24시간째에 질 염증 지수를 기록하였다 (표 3B). 그 결과를 하기 표 3A 및 표 3B에 나타내었다.
[표 3A]
Figure PCTKR2016014127-appb-I000003
[표 3B]
Figure PCTKR2016014127-appb-I000004
상기 표 3A 및 표 3B에 나타난 바와 같이, 자궁경부 조직 (표 3A) 및 질(표 3B)의 염증 정도를 병리학적으로 평가한 결과, IL-7-Fc의 국소 투여가 생식기 내에서 심각한 염증을 유발하지 않으며 안전했음을 알 수 있었다.
실시예 5. IL-7- Fc의 투여경로와 자궁경부 및 질 조직 내 T 세포 유도와의 관련성 확인
마우스 (n=5/group)에게 피하 또는 질내의 경로를 통해 IL-7-Fc를 투여하고 준비예 6의 방법으로 자궁경부 및 질 조직 내의 T 세포의 분포를 확인하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 자궁경부 및 질 조직내의 CD4 및 CD8 T 세포 축적의 정도는 피하 투여보다 질내 투여에 의해 더 증가되었다. 따라서 자궁경부 및 질 조직에 특이적으로 CD4 및 CD8 T 세포를 유도하려면, 피하투여와 같은 전신성 투여보다는 자궁경부 및 질 조직과 직접적 연관이 있는 질내 경로로 투여하는 것이 효과적임을 알 수 있었다.
실시예 6. IL-7- Fc의 국부적 투여에 의한 TC -1/ fluc 모델을 이용한 항암 효능
HPV16 E6 및 HPV E7 항원을 발현하는 TC-1 종양세포주를 이용하여 치료 효능을 확인하였다. 마우스 (n=7 or 8/group)에 질내의 경로를 통해 1 x 106 TC-1/fluc 세포주 (HPV16 E6, E7 유전자를 발현하는 TC-1 세포주에 luciferase 유전자를 발현하도록 만든 세포주)를 투여하였다. TC-1/fluc 세포주 투여 4일 전, 발정휴지기인 마우스에게 3 mg의 아세트산 메드록시프로게스테론 (Depo-Provera, Pfizer)를 피하 주사로 투여하였다. TC-1/fluc 세포주 투여하는 날, 마우스를 마취하고 10ul 20% nonoxynol-9 (USP)와 40ul 3% carboxymethyl cellulose (CMC) (Sigma-Aldrich)를 혼합하여 질내 투여하고 6시간 뒤에 다시 마취를 하여 PBS를 이용하여 질내 세척이후 TC-1/fluc 세포주를 투여하였다.
TC-1/fluc 세포주 투여 이후, 1일, 8일, 15일에 각각 1ug IL-7-Fc를 질내 투여하고 8일, 15일에 in vivo Bioluminesence imaging을 통해 암이 진행되는 과정을 확인하였다. 20일째에 외관을 관찰하여 항암 효과를 관찰한 결과(도 6), IL-7-Fc 투여군에서 암세포의 발생 빈도가 현격히 감소하는 것을 확인하였다.

Claims (14)

  1. 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 인터루킨-7(IL-7) 융합 단백질을 포함하는 생식기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 IL-7은 상기 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단 또는 C-말단에 결합하는 것인, 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 IL-7은 하기의 구조를 갖는 변형된 IL-7인 것인, 약학적 조성물:
    A - IL-7
    상기 A는 1 내지 10 개의 아미노산 잔기로 구성된 올리고펩티드이고,
    상기 IL-7은 인터루킨-7(IL-7) 또는 이와 유사한 활성을 갖는 폴리펩티드이다.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 IL-7은 서열번호 1 내지 6으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 약학적 조성물.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 A는 methionine, glycine, methionine-methionine, glycine-glycine, methionine-glycine, glycine-methionine, methionine-methionine-methionine, methionine-methionine-glycine, methionine-glycine-methionine, glycine-methionine-methionine, methionine-glycine-glycine, glycine-methionine-glycine, glycine-glycine-methionine, methionine-methionine-methionine, 및 glycine-glycine-glycine로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 면역글로불린 Fc 영역은 동물, 인간 또는 이의 변형된 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 변형된 면역글로불린 Fc는 IgG1, IgG2, IgG3, IgD, IgG4 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 약학적 조성물.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 변형된 면역글로불린의 Fc 영역은 N-말단에서 C-말단 방향으로 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하며,
    상기 CH2 도메인이 인간 IgD와 인간 IgG4 CH2 도메인의 아미노산 잔기의 부분을 포함하고,
    상기 CH3 도메인이 인간 IgG4 CH3 도메인의 아미노산 잔기의 부분을 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 변형된 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 9 내지 14로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 약학적 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 생식기 질환은 사람 파필로마바이러스 유래 질환인, 약학적 조성물.
  11. 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 인터루킨-7(IL-7) 융합 단백질과 약학적으로 허용가능한 담체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 생식기 질환의 예방 또는 치료 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 생식기 질환은 사람 파필로마바이러스 유래 질환인, 생식기 질환의 예방 또는 치료 방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 투여는 국소 투여인 것인, 생식기 질환의 예방 또는 치료 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 국소 투여는 점막 투여인 것인, 생식기 질환의 예방 또는 치료 방법.
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