KR20120041139A

KR20120041139A - 인간 인터루킨-1 수용체 길항제-하이브리드 Ｆｃ 융합단백질

Info

Publication number: KR20120041139A
Application number: KR1020110107194A
Authority: KR
Inventors: 조영규; 신혜정; 이운영; 장우익
Original assignee: 주식회사 한독약품
Priority date: 2010-10-20
Filing date: 2011-10-19
Publication date: 2012-04-30
Also published as: KR101333958B1; US20130217864A1; US8883134B2

Abstract

본 발명은 인간 인터루킨-1 수용체 길항제와 하이브리드 Fc 가 결합된 융합 단백질(fusion protein)에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 인간 인터루킨-1 수용체 길항제가 인간 면역글로불린 (immunoglobulin, Ig) 하이브리드(hybrid) Fc 프레그먼트(fragment)에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 융합 단백질을 제공한다. 상기 하이브리드 Fc 프레그먼트는 IgD 및 IgG4 를 포함한다. 또한 본 발명은 상기 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학적 조성물은 류마티스 관절염, 염증성 장질환(예를 들면 크론병, 궤양성 장질환), 건선, 당뇨병 등을 포함하는 자가면역질환의 치료를 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 융합단백질은 종래 자가면역질환 치료제에 비하여 우수한 효능을 유지하면서 부작용은 감소시킨 새로운 자가면역질환 치료제 개발에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

인간 인터루킨-1 수용체 길항제-하이브리드 Ｆｃ 융합단백질{Human Interleukin-1 receptor antagonist-hybrid Fc fusion protein}

본 발명은 인간 인터루킨-1 수용체 길항제와 하이브리드 Fc 가 결합된 융합 단백질(fusion protein)에 관한 것이다.

자가 면역성 염증 질환의 치료를 위해 자가 면역성 염증 환자들에서 많이 발현되는 TNF(tumor necrosis factor)-α, IL(interleukin, 인터루킨)-1, IL-6, RANKL (Receptor Activator for Nuclear Factor κ B Ligand) 등에 결합하는 다수의 단일클론 항체 또는 융합 단백질이 약물로서 개발되고 있다. 상기 약물들의 주요 목표 질환은 염증성 자가면역질환(inflammatory autoimmune disease)인 염증성 장질환(크론병 및 궤양성 장질환), 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis), 건선(psoriasis) 등을 포함한다.

현재 자가 면역성 염증 치료제 시장은 TNF 억제제가 주도하고 있다. 하지만 TNF 억제제는 중증 자가면역질환을 치료하기 힘들고, TNF 억제제로 치료하는 환자 중 기존 약물에 반응하지 않거나 유지되지 않고 있는 환자들이 점차 늘어나고 있으며 앞으로도 계속 증가할 것으로 예상되고 있다. 또한 TNF-α는 박테리아나 바이러스 감염에 대한 숙주 방어에서 중요한 역할을 하므로, TNF-α의 저해는 중증 감염, 기회감염 및 결핵의 재활성화와 같은 감염의 위험을 증가시킬 가능성이 있다. 따라서 TNF 억제제를 대체할 수 있는 새로운 기전의 자가 면역성 염증 치료제의 개발이 요구되고 있다.

한편, IL-1에 대한 수용체 길항체(IL-1 receptor antagonist, IL-1RA)는 자연적으로 우리 몸 안에 존재하는 IL-1 억제물질로서 IL-1이 IL-1 수용체에 결합하는 것을 경쟁적으로 방해하여 IL-1의 효과를 억제한다(Protein Engineering, Design & selection, Zoey L.Fredericks et al., 2004). 이와 관련하여 유전자재조합 인간 IL-1 수용체 길항제 (예를 들면 anakinra)가 개발되어 TNF-α 억제제에 반응을 하지 않는 류마티스 관절염 환자들에게서 좋은 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(Ann. Rheum. Dis., Bresnihan, 2002 ; J. Rheumatol., St. Clair, E.W., 2002). 하지만, anakinra는 미생물에서 발현하는데 따른 높은 면역원성과 6시간 내에 분해되는 짧은 반감기를 가져 하루에 한번 투여해야 한다는 큰 단점을 가지고 있다.

또한 항 IL-1 수용체-하이브리드 Fc 융합 단백질은 염증을 지속시키는데 중요한 역할을 하는 IL-1을 억제함으로써 효과적으로 자가면역질환을 치료할 것으로 기대되어 왔다. 하지만 종래의 Fc 융합 단백질 제조에는 IgG1 Fc 가 사용되며, 상기 IgG1 Fc 의 경우 항체의존 세포매개 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC) 및 보체 매개성 세포독성 (complement-dependent cytotoxicity, CDC)을 야기하고 이로 인해 타겟세포가 죽게 된다. 즉, agonistic 단백질 및 펩타이드가 결합하는 타겟세포가 죽게되어 결국 치료효과를 내지 못하게 되는 치명적인 문제가 발생할 수 있는 단점이 있다.

이에 더하여, 종래의 항체융합기술은 항체융합이 되면 구조적으로 두 개의 치료 단백질이 하나의 Fc에 결합함으로써 dimer를 형성하게 되고, 이로 인해 결합된 단백질 및 펩타이드 치료제의 활성이 감소되는 문제점을 가지고 있다.

본 발명자들은 새로운 hybrid Fc 기술을 도입하여 융합된 단백질이 FcRn에 의한 체내 반감기 증가 기능은 유지하면서 융합된 단백질 치료제의 활성을 최적화시키고, 아울러 원하지 않는 ADCC 및 CDC 기능은 제거시키고 항체 유도 가능성은 최소화시키는 장점을 보유하고 있음을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

이에, 본 발명자들은 항 IL-1 수용체-하이브리드 Fc 융합 단백질을 생산하여 우수한 자가면역질환 치료 항체 의약품을 개발하고자 한다.

본 발명은 인간 인터루킨-1 수용체 길항제가 인간 면역글로불린 (immunoglobulin, Ig) 하이브리드(hybrid) Fc 프레그먼트(fragment)에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 융합 단백질을 제공한다.

상기 본 발명의 일 구현예에서 상기 하이브리드 Fc 프레그먼트는 IgD 및 IgG4 를 포함한다.

또한 본 발명은 상기 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

상기 본 발명의 일 구현예에서 상기 약학적 조성물은 자가면역질환의 치료를 위해 사용된다. 상기 자가면역질환은 류마티스 관절염, 염증성 장질환(예를 들면 크론병, 궤양성 장질환), 건선, 당뇨병 등을 포함한다.

또한 본 발명은 인간 인터루킨-1 수용체 길항제-하이브리드 Fc 융합단백질을 인코딩하는, 서열목록 6의 염기서열을 포함하는 핵산분자를 제공한다.

또한 본 발명은 서열목록 7 의 아미노산 서열을 포함하는 인간 인터루킨-1 수용체 길항제-하이브리드 Fc 융합단백질을 제공한다.

본 발명의 항 IL-1 수용체-하이브리드 Fc 융합 단백질은 종래의 유전자재조합 인간 IL-1 수용체 길항제 및 항 IL-1 수용체형 Fc 융합 단백질에 비하여 체내 안정화 증진, 생체이용률 증진, 표적 지향성, 무독성, 및 비 면역원성 등의 기술적 장점을 가지고 있으며, 따라서 종래 자가면역질환 치료제에 비하여 우수한 효능을 유지하면서 부작용은 감소시킨 새로운 자가면역질환 치료제를 제공할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 인간 IL-1 수용체 길항체(IL-1 receptor antagonist, IL-1RA)를 인간 면역글로불린의 Fc 부분(hybrid Fc)에 융합한 형태를 모식도로 나타낸 것이다.
도 2는 항 IL-1 수용체-하이브리드 Fc 융합 단백질을 코딩하는 DNA를 벡터에 삽입하여 최종 구축된 재조합 플라스미드를 그림으로 나타낸 것이다.
도 3은 CHO DG44 세포에서 본 발명의 항 IL-1 수용체-하이브리드 Fc 융합 단백질이 발현된 것을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 항 IL-1 수용체-하이브리드 Fc 융합 단백질을 발현하는 선별된 세포들의 생산성을 나타낸 것이다.
도 5는 각각의 세포주에서 발현한 본 발명의 항 IL-1 수용체-하이브리드 Fc 융합 단백질을 정성 및 정량적으로 확인한 것이다.
도 6은 항체 친화성 컬럼 크로마토그래피의 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 7은 항체 친화성 컬럼 크로마토그래피를 진행한 후 peak로 확인된 분획의 단백질 샘플을 정성 및 정량적으로 확인한 결과를 나타낸 것으로서, 도 10a는 12% SDS-PAGE의 Reducing조건에서, 도 10b는 non reducing조건하에서 확인한 것이다.
도 8a는 음이온 교환수지 크로마토그래피의 크로마토그램을 나타낸 것이고, 도 8b는 음이온 교환수지 크로마토그래피를 진행한 후 peak로 확인된 분획의 단백질 샘플을 정성 및 정량적으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9a는 하이드록시아파타이트 컬럼 크로마토그래피의 크로마토그램을 나타낸 것이고, 도 9b는 하이드록시아파타이트 컬럼 크로마토그래피를 진행한 후, peak로 확인된 분획의 단백질 샘플을 정성 및 정량적으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10a는 비변성 전기영동, 10b는 Western blotting을 통한 항IL-1 수용체-하이브리드 Fc 융합 단백질의 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 등전 초점 전기영동을 통한 항IL-1 수용체-하이브리드 Fc 융합 단백질의 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 정제된 항IL-1 수용체-하이브리드 Fc 융합 단백질의 SE-HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 13은 정제된 본 발명의 항 IL-1 수용체-하이브리드 Fc 융합 단백질 또는 대조군인 항 IL-1 수용체에 IgG1 Fc를 융합한 단백질이 IL-1 수용체에 결합하는 결합값을 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 항 IL-1 수용체-하이브리드 Fc 융합 단백질이 사람의 T 세포 또는 말초혈액 단핵구 세포에서 면역 반응을 억제 하는 효과를 확인 한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 항 IL-1 수용체-하이브리드 Fc 융합 단백질 또는 대조군인 유럽에서 판매가 되고 있는 IL-1 수용체인 아나킨라 (anakinra)의 약물 동태학 값을 나타낸 것이다.
도 16 및 도 17은 세포에서 배지로 발현된 본 발명의 항 IL-1 수용체-하이브리드 Fc 융합 단백질이 세포내에서 hIL-1β를 차단하는 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명의 항 IL-1 수용체-하이브리드 Fc 융합 단백질 또는 대조군인 IL-1 수용체와 하이브리드 Fc 융합 단백질이 세포내에서 hIL-1β를 차단하는 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명의 항 IL-1 수용체-하이브리드 Fc 융합 단백질 또는 대조군인 유럽에서 판매가 되고 있는 IL-1 수용체인 아나킨라 (anakinra)가 세포내에서 hIL-1β를 차단하는 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명의 항 IL-1 수용체-하이브리드 Fc 융합 단백질 또는 대조군인 유럽에서 판매가 되고 있는 IL-1 수용체인 아나킨라 (anakinra)가 세포내에서 hIL-1β를 차단하여 염증 유발 사이토카인인 인터루킨-8을 차단하는 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 본 발명의 항 IL-1 수용체-하이브리드 Fc 융합 단백질 또는 대조군인 항 IL-1 수용체에 IgG1 Fc를 융합한 단백질이 세포내에서 hIL-1β를 차단하여 염증 유발 사이토카인인 인터루킨-8을 차단하는 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 콜라겐 유도 관절염 쥐 모델에서 본 발명의 항 IL-1 수용체-하이브리드 Fc 융합 단백질 또는 대조군인 유럽에서 판매가 되고 있는 IL-1 수용체인 아나킨라 (anakinra)가 다양한 농도에서 염증을 억제하는 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 항 IL-1 수용체-하이브리드 Fc 융합 단백질을 제공하며, 상기 융합 단백질은 인간 IL-1 수용체 길항체(IL-1 receptor antagonist, IL-1RA)를 인간 면역글로불린의 Fc 부분(hybrid Fc)에 융합한 형태로 구성된다(도 1 참조). 상기 인간 IL-1 수용체 길항체는 전체 유전자 서열이 포함되어 있는 단백질이며, 인간 IL-1 수용체 길항체는 링커를 통하여 hybrid Fc와 서로 결합될 수 있다. 링커 분자는 합성 링커 (synthetic linker)이다. 합성 링커는 Gly 및 Ser 잔기로 구성된 아미노산 잔기의 펩타이드일 수 있다. 하나의 구체적인 양태로서, 이러한 Gly-Ser 링커는 GGS 이다. 상기 hybrid Fc는 N-말단에서 C-말단 방향으로 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하며, 상기 힌지 영역은 적어도 인간 IgD 힌지 영역을 포함하고, CH2 도메인은 적어도 인간 IgD와 IgG4 CH2 도메인의 아미노산 잔기의 부분을 포함하며, 상기 CH3 도메인은 적어도 인간 IgG4 CH3 도메인의 아미노산 잔기의 부분을 포함한다.

IL-1은 TNF-α와 함께 자가 면역성 염증 질환의 발병 기전에서 염증 반응을 증폭시키는 중요한 염증성 매개물질이다. 또한 중성구를 염증 장소로 모이게 하고 대식세포를 활성화시키며 T 세포 및 B 세포의 성장과 분화를 촉진시키며, 아울러 세포외 기질을 분해시키는 각종 효소 분비 유도에 있어서도 중요한 역할을 한다. IL-1 수용체 길항체(IL-1 RA)는 자연적으로 우리 몸 안에 존재하는 IL-1 억제물질로서 IL-1이 IL-1 수용체에 결합하는 것을 경쟁적으로 방해하여 IL-1의 효과를 억제한다.

종래의 IL-1 RA 융합단백질의 제조에 있어서는 IgG1 Fc 부분이 사용되었다. 따라서 상술한 바와 같이, IgG1 Fc 로 인한 항체의존 세포매개 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC) 및 보체 매개성 세포독성 (complement-dependent cytotoxicity, CDC)을 야기시켜 타겟세포를 죽게하는 문제점이 있었다.

본 발명의 융합단백질은 IgG1 Fc 부분을 사용하지 아니하고 IgD 및 IgG4 Fc를 선별조합한 hybrid Fc 를 사용하였다. IgG 서브클래스(subclasses) 및 IgD 의 특성을 비교하여 표 1에 나타내었다.

[표 1]

본 발명의 hybrid Fc는 IgD가 가지는 힌지 부위의 유연성으로 인하여 효능이 증대되고 호중구 세포들이 가지고 있는 Fc의 결합 수용체인 FcγR와 결합하는 부위가 없어 이에 따른 부작용이 감소된다. IgG4는 보체-의존적 세포독성(CDC, complement-depent cytotoxicity)과 같은 효과기 기능을 가지고 있지 않기 때문에 의도되지 않은 면역 반응을 감소시킬 수 있으며 세포 내 재순환 (recycling)과 관련된 FcRn에 결합할 수 있는 능력이 가장 좋아 증가된 안정성 및 증가된 혈청 반감기를 보인다. 또한 생체 내 반감기와 관련하여, IgG1, IgG2, 및 IgG4는 21일의 긴 반감기를 가지는 반면, 다른 면역글로불린은 상대적으로 일주일 이하의 짧은 반감기를 가진다. 따라서 본 발명의 융합단백질은 상기 IgD 및 IgG4 Fc를 선별조합한 hybrid Fc 를 사용함으로써 자가면역질환에 대한 치료 효능은 증가시키고 부작용은 감소시키는 반면, 또한 그 반감기가 증가하는 효과를 나타낸다. 아울러, IgG1 Fc 부분을 사용하지 아니함으로써 ADCC, CDC를 유도하지 않게 되고 따라서 cytokine을 방해하는 데에도 적합할 것으로 기대된다. 또한 본 발명의 항 IL-1 수용체-하이브리드 Fc 융합 단백질은 E.coli에서 발현한 기존의 anakinra와는 달리 포유동물 세포인 CHO cell에서 발현함으로써 낮은 면역원성을 가진다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. hIL1 RA - hybrid Fc 융합 단백질을 인코딩하는 재조합 플라스미드의 구축

Gene cloning을 위한 hIL1 RA의 DNA는 코돈 최적화(codon optimization)를 한 뒤 여러 조각으로 유전자를 합성하여 sewing PCR 을 통해 hIL1 RA의 DNA 를 준비하였다. Hybrid Fc의 DNA는 제넥신으로부터 제공받아 hIL1RA의 DNA와 PCR을 수행하여 최종 항 IL-1 수용체-하이브리드 Fc 융합 단백질을 인코딩하는 전체 유전자 서열 DNA를 얻었다.

구체적으로, 유전자 구축을 위해 pAD15 vector를 사용하였으며 insert DNA와 vector를 각각 EcoRI과 XbaI 제한 효소로 잘라준 뒤 정제하여 깨끗한 DNA를 추출하였다. 이렇게 얻은 벡터와 삽입 DNA를 ligation을 통하여 pAD15 벡터에 삽입된 최종 product를 얻었다. 최종 product를 효율 좋은 DH5α competent cell에 삽입한 뒤 벡터 내에 있는 항생제 내성 유전자에 맞는 ampicillin 항생제를 첨가한 agar plate에 도말하여 colony를 선별한 뒤 시퀀싱을 하여 염기 서열을 확인하였다. 합성한 유전자 서열과 얻어진 최종 product의 염기 서열은 하기와 같다.

[합성 유전자 서열]

F-1 : gcc acc atg gag atc tgc agg ggc ctg agg tcc cac ctg atc acc ctg ctg ctg ttc ctg ttc cac tcc gag acc atc tgc agg ccc tcc ggc agg aag tcc tcc aag atg cag gcc

R-2 : gat ggg cac cac gtc gat ctt ctc ctc cag gtt cac gtt ggg gcc ctg cag gta gcc ggc cac cag ctg gtt gtt cct cag gta gaa ggt ctt ctg gtt cac gtc cca gat cct gaa ggc ctg cat ctt gga gga ctt

F-3 : aag atc gac gtg gtg ccc atc gag ccc cac gcc ctg ttc ctg ggc atc cac ggc ggc aag atg tgc ctg tcc tgc gtg aag tcc ggc gac gag acc agg ctg cag ctg gag gcc gtg aac atc acc gac ctg tcc gag aac agg aag

R-4 : gga cac ggg ctg gtc ggc ctc cat ggc ggt gca cag gaa cca gcc ggg gca ggc ggc gga ctc gaa gga ggt ggt ggg gcc gga gtc gga cct gat gaa ggc gaa cct ctt gtc ctg ctt cct att ctc gga cag gtc

F-5 : gcc gac cag ccc gtg tcc ctg acc aac atg ccc gac gag ggc gtg atg gtg acc aag ttc tac ttc cag gag gac gag ggc ggc tcc cgc aac acc ggc cgc ggc

하기 최종 product의 전체 유전자 서열(본 발명의 항 IL-1 수용체-하이브리드 Fc 융합 단백질을 코딩하는 핵산분자)을 얻기 위하여 사용된 상기의 합성 DNA는 hIL-1 RA을 코딩하는 유전자이며, 상기 합성 유전자 서열 F-1, R-2, F-3, R-4, F-5 를 서열목록 1-5(SEQ. ID. NOs: 1-5)로 각각 표시하였다.

[최종 product의 전체 유전자 서열]

atg gag atc tgc agg ggc ctg agg tcc cac ctg atc acc ctg ctg ctg ttc ctg ttc cac tcc gag acc atc tgc agg ccc tcc ggc agg aag tcc tcc aag atg cag gcc ttc agg atc tgg gac gtg aac cag aag acc ttc tac ctg agg aac aac cag ctg gtg gcc ggc tac ctg cag ggc ccc aac gtg aac ctg gag gag aag atc gac gtg gtg ccc atc gag ccc cac gcc ctg ttc ctg ggc atc cac ggc ggc aag atg tgc ctg tcc tgc gtg aag tcc ggc gac gag acc agg ctg cag ctg gag gcc gtg aac atc acc gac ctg tcc gag aat agg aag cag gac aag agg ttc gcc ttc atc agg tcc gac tcc ggc ccc acc acc tcc ttc gag tcc gcc gcc tgc ccc ggc tgg ttc ctg tgc acc gcc atg gag gcc gac cag ccc gtg tcc ctg acc aac atg ccc gac gag ggc gtg atg gtg acc aag ttc tac ttc cag gag gac gag ggc ggc tcc cgc aac acc ggc cgc ggc ggc gag gag aag aag aag gag aag gag aag gag gag cag gag gag cgc gag acc aag acc ccc gag tgc ccc agc cac acc cag ccc ctg ggc gtg ttc ctg ttc ccc ccc aag ccc aag gac acc ctg atg atc agc cgc acc ccc gag gtg acc tgc gtg gtc gtg gat gtg agc cag gaa gat ccc gaa gtg cag ttc aac tgg tac gtg gat ggc gtg gaa gtg cac aac gcc aag acc aag ccc aga gaa gag cag ttc aac tcc acc tac aga gtg gtg agc gtg ctg acc gtg ctg cac cag gac tgg ctg aac ggc aag gag tac aag tgc aag gtg tcc aac aaa ggc ctg ccc agc tcc atc gag aag acc atc agc aaa gcc aaa ggc cag ccc aga gaa ccc cag gtg tac acc ctg cct ccc agc cag gaa gag atg acc aag aac cag gtg tcc ctg acc tgc ctg gtg aaa ggc ttc tac ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gaa agc aac ggc cag ccc gag aac aat tac aag aca acc cct ccc gtg ctg gat agc gat ggc agc ttc ttt ctg tac agc aga ctg acc gtg gac aag agc aga tgg cag gaa ggc aac gtg ttc agc tgc agc gtg atg cac gaa gcc ctg cac aac cac tac acc cag aag agc ctg tcc ctg agc ctg ggc aag tga

상기 최종 product 의 전체 유전자 서열을 서열목록 6(SEQ. ID. NO:6)으로 표시하였으며, 본 발명의 항 IL-1 수용체-하이브리드 Fc 융합 단백질의 아미노산 서열을 서열목록 7(SEQ. ID. NO:7)로 표시하였다.

도 2는 최종 구축된 재조합 플라스미드를 그림으로 나타낸 것으로, pAD 15 벡터의 클로닝 사이트에 합성 및 PCR을 통해 얻어진 항 IL-1 수용체-하이브리드 Fc의 DNA를 삽입하여 6610bp 크기의 벡터를 제작하였다.

실시예 2. 융합 단백질 발현 세포주의 확립

(1) 형질도입

실시예 1의 클로닝을 통해 얻은 최종 벡터를 CHO DG44 포유동물 세포에 도입하여 융합 단백질을 발현시켰다.

구체적으로, 하루 전날 플레이트에 4×10⁵ 수의 세포를 분주하고 다음날 배지(Minimum Essential Medium Alpha)를 교체하였다. PEI (Polyethylenimine) 와 DNA를 Nitrogen/Phosphate 비율이 1:20이 되도록 섞은 후 실온에서 5~10분 배양한 다음 CHO DG44 포유동물 세포에 첨가하였다. 12시간 후 새 배지로 교체하였다.

(2) 발현 세포주 분별

Hypoxanthine (HT)를 이용하여 본 발명의 항 IL-1 수용체-하이브리드 Fc 융합 단백질을 발현하는 세포주를 분별하였다. Dihydrofolate reductase(DHFR) 유전자와 실시예 1에서 얻은 본 발명의 융합 단백질 유전자가 포함되어있는 벡터를 형질도입한 CHO DG44 cell에 24시간 후 HT가 포함되어 있지 않은 배지로 교체하였다. 콜로니가 형성될 때까지 3~4일 마다 배지를 교체한 후 각각의 콜로니를 분별하여 새 플레이트에 배양하였다.

도 3은 본 발명의 항 IL-1 수용체-하이브리드 Fc 융합 단백질이 세포에서 발현되는 것을 웨스턴블랏팅(westernblotting)으로 확인한 결과이다. 도 3에 나타난 바와 같이, 상기 융합 단백질을 코딩하는 벡터를 형질 도입하지 않은 세포의 배지 (lane 1)및 세포 용해물(lane 3)과 비교시, 상기 융합 단백질을 코딩하는 벡터를 형질 도입한 세포의 배지(lane 2) 및 세포 용해물(lane 4)의 경우, 상기 융합 단백질이 세포에서 정상적으로 발현되고 배지로 분비됨을 확인할 수 있다.

(3) 세포단위생산성 평가

본 발명의 항 IL-1 수용체-하이브리드 Fc 융합 단백질을 코딩하는 벡터가 형질 도입된 세포의 배지를 하루 전날 교체 한 뒤 24h 후 상기 단백질이 발현된 배지를 수집하고 세포 수를 세어놓았다 세포 단위 생산성 평가는 ELISA quantitation kit (Bethyl lab., Inc., E80-104)를 이용하여 측정하였다. 본 실험에서는 총 20 종류의 세포(주)를 사용하였으며, 임의적으로 1번에서 20번으로 numbering 하였다.

코팅 용액에 희석한 코팅 항체를 Nunc 96 well plate에 각각 100㎖씩 첨가하고 실온에서 1시간 배양하였다. 플레이트를 TBST (Tris-Buffered Saline Tween-20) 세척 용액으로 5번 세척 한 후 1% BSA (Bovine serum albumin)가 첨가된 블로킹 버퍼(blocking buffer)를 well당 200㎖씩 첨가하여 30분 동안 실온에서 blocking 하였다. 플레이트를 TBST 세척 용액으로 5번 세척한 후 500ng/ml~0ng/ml 까지 1/2씩 희석한 표준용액 또는 적절한 비율로 희석한 배지 샘플을 100㎖씩 첨가하였다. 실온에서 1시간 배양 후 TBST 세척 용액으로 5번 세척하고 1/100,000으로 희석한 HRP (horse radish peroxidase) 검출 항체(detection antibody)를 well당 100㎖씩 첨가한 뒤 실온에서 1시간 배양하였다. TBST 세척 용액으로 5번 세척하고 well당 100㎖씩 TMB 기질(substrate) 용액을 첨가하여 어두운 실온에서 15분 배양한 뒤 well당 100㎖의 반응 종료 용액을 첨가하여 반응을 종료시키고 450nm에서 plate reader로 흡광도를 측정하여 그 결과를 도 4에 나타내었다. 단위 생산성은 ELISA로부터 계산된 질량을 총 세포수로 나누어 pg/cell/day 값을 얻었다.

도 4에 나타난 바와 같이, HT를 이용하여 선별한 1~20번까지의 여러 세포주들은 다양한 pg/cell/day 값을 가지고 상기 융합 단백질을 발현함을 알 수 있다.

실시예 3. Western blotting 을 통한 발현 단백질 확인

발현된 단백질은 westernblotting을 통하여 검증하였다. E-tube에 발현된 단백질의 배지 샘플을 넣고 1X 만큼의 로딩염료(loading dye) 를 넣고 running tank에 12% SDS-PAGE gel을 장착하였다. 1X running buffer를 만들어 gel 안쪽에는 가득, 바깥은 1/3 가량 채우고 hamilton syringe로 sample을 comb에 loading 하여 전극을 연결시켜 전류를 흘려주었다. 80v~130V사이로 dye가 gel 끝에 머무를 때까지 running하였다. Blotting system (Invitrogen, iBlot gel transfer machine)을 사용하여 running된 SDA-PAGE gel의 단백질을 니트로 셀룰로오즈 막(nitro cellulose membrane)으로 transfer하였다. Transfer가 끝난 nitro cellulose membrane을 꺼내어 넓은 dish에 넣고, 잠길 수 있을 만큼의 blocking buffer (PBST+5% skim milk)를 사용하여 실온에서 1시간동안 rocker로 계속 흔들어 주었다. 1X PBST에 anti-hIL-1RA antibody가 0.2㎍/ml 되게 희석하여 nitro cellulose membrane에 넣고 실온에서 3시간 또는 4℃에서 overnight 하여 붙인 후 antibody를 제거하기 위해 1X PBST에서 10분씩 rocker에서 5번 세척하였다. HRP가 융합된 anti-rabbit 2차 항체(secondary antibody)를 1X PBST에 1:2000으로 희석하여 nitro cellulose membrane에 넣고 실온에서 1시간 흔들어 준 후 1X PBST에서 10분씩 rocker에서 5번 세척하여 antibody를 제거하였다. Nitro cellulose membrane를 exposer 카세트에 놓고 substrate가 골고루 적셔지게 뿌린 후 10분 이내에 chemiblotting이 가능한 gel doc. 카메라에 넣은 후 사진을 얻었으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 각각의 세포주에서 발현한 상기 융합 단백질은 이황화결합을 제거하였을 때 약 55kDa 정도의 분자량을 가지며, hIL1 RA와 비교시, hybrid Fc 결합으로 인해 30kDa 이상의 분자량이 증가되었음을 확인할 수 있다. 또한 농도 의존적으로 정확히 밴드의 두께와 진하기가 차이가 나는 것을 알 수 있다.

실시예 4. 정제 및 단백질 농축

(1) 항체 친화성 크로마토그래피를 이용한 정제

현탁 세포 생산으로 얻은 항 IL-1 수용체-하이브리드 Fc 융합 단백질을 0.2um의 기공 크기를 갖는 셀룰로오스 여과 막에 여과하여 불순물을 제거하고 여과된 세포는 컬럼에 로딩하기 전까지 4℃ 혹은 얼음 중에서 보관하여 준비하였다. Protein A 단백질이 표지되어 있는 항체 친화성 컬럼 레진의 종류 중 하나인 Mabselect Sure(GE)로 컬럼을 충진하고 이동상을 준비하였다. 먼저 컬럼을 평형시켜 주는 완충액(완충액 A) 0.1M 염화나트륨을 포함한 50mM 인산화나트륨 (pH8.0)을 준비하고 바인딩된 단백질을 산성 조건에서 용출시켜 줄 낮은 pH의 완충액(완충액 B) 0.1M 염화나트륨을 포함한 50mM 인산화나트륨 (pH3.0)을 준비하였다. 그리고 레진에서 덜 용출되어 나온 단백질을 강력하게 용출시키기 위한 0.5M 아르기닌(pH3.0), 0.1M 염화나트륨 용액(완충액C)과 마지막으로 CIP용으로 0.5N 수산화나트륨 용액(완충액D)을 준비하였다. 완충액 A부터 완충액 D까지 4가지 용액으로 크로마토그래피 (AKTA Purifier, GE healthcare) 시스템의 라인을 씻어준 후 20ml 부피로 충진되어 있는 항체 친화성 컬럼을 연결하고 레진을 10CV (컬럼부피)으로 평형 시켜주었다. UV 값이 평형이 된 것을 확인한 후에 미리 준비한 항 IL-1 수용체-하이브리드 Fc 융합 단백질을 FPLC에서 펌프 로딩으로 컬럼에 로딩하여 항체 친화성 크로마토그래피를 수행하였다. 완충액 B로 pH를 낮춰주어 바인딩 된 후 용출된 단백질은 3ml씩 분획하여 회수하였다. 분획하여 얻은 단백질은 12% SDS-PAGE(reducing) 상에서 50kda 위치에서 밴드를 포함한 것을 모으고 Bradford 단백질 정량방법을 이용하여 단백질 양을 측정하였다(도 6 및 도 7 참조).

도 6은 항체 친화성 컬럼 크로마토그래피의 크로마토그램을 나타낸 것으로, 완충액B로 pH를 낮춰 용출시켜 나온 융합 단백질의 peak가 분획 번호 30번부터 40번 사이에서 확인되었음을 보여준다. 도 7a는 항체 친화성 컬럼 크로마토그래피를 진행한 후 peak로 확인된 분획의 단백질 샘플을 정성 및 정량적으로 확인하기 위하여 12% 도데실황산나트륨 폴리아크릴 아미드 젤 전기영동(Sodium - Dodecyl-Sulfate Poly Acrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE)을 실시한 것으로, 로딩용액에서 보이는 50kDa의 위치의 융합단백질은 대부분 컬럼에 결합하여 용출되어 나온 피크(peak)의 분획에 존재하였으며 순도는 약 95% 이상으로 확인되었다. 도7b는 Fc 융합단백질의 경우 이황화 결합에 의한 다이머(dimer)를 형성하므로 다이머 분자량이 110kda이고 비환원 도데실황산나트륨 폴리아크릴 아미드 젤 전기영동 상에는 약 150kda에서 확인되었다.

(2) 음이온 교환 수지 크로마토그래피를 이용한 정제

항체 친화성 크로마토그래피를 통해 얻은 단백질 용액은 1M Tirs-HCl(pH8.0)용액으로 최종 50mM Tris-HCl (pH8.0)으로 맞춘 후 실온에 30분 가량 방치하여 바이러스를 비활성화시켰다. 음이온 교환 수지에 로딩하게 위해 50mM Tris-HCl(pH8.0)용액을 단백질 용액 부피의 2배 가량 더 첨가하여 염화나트륨 농도를 낮추어주었다. 음이온 교환 수지(Q HP, GE)에는 평형 완충액(완충액A)인 50mM Tris-HCl(pH8.0)과 용출 완충액(완충액B)50mM Tris-HCl (pH8.0), 1M 염화나트륨을 AKTA Purifier라인을 채워준 후 단백질 용액을 로딩하였다. 염화나트륨 농도 구배로 흘려주면서 항 IL-1 수용체-하이브리드 Fc 융합 단백질의 다이머와 멀티머를 분리하였다. 300mM 염화나트륨 농도 근처에서 나오는 peak(도8a의 peak1)가 주로 다이머 형태의 항 IL-1 수용체-하이브리드 Fc 융합 단백질이 존재하고 500mM 염화나트륨 이상 농도에서 용출되어 나오는 peak(도8a의 peak2)는 다이머 형태와 멀티머 형태가 함께 존재하는 불균일 혼합 (heterogeneous) 분획이다. 다이머 형태가 주로 존재하는 peak(도8a의 peak1)를 분리하여 정제한 것은 도 8b에서 보인 바와 같이 SDS-PAGE의 non reducing 조건 하에서 peak1과 peak2의 분획을 확인하였다(도 8 참조).

(3) 하이드록시아파타이트 컬럼 크로마토그래피를 이용한 정제

하이드록시아파타이트 컬럼(CHTTMCeramicHydorxyapatite,BIO-RAD)의 이동상은 컬럼 평형 완충액은 10mM 인산나트륨(pH6.5)로 하고 단백질 용출 완충액은 10mM 인산나트륨(pH6.5), 2M 염화나트륨과 500mM 인산 나트륨(pH6.5) 두 가지로 흘려 진행하였다. 음이온 교환 컬럼에서 분리된 다이머 분획을 평형 완충용액으로 단백질 용액 부피의 4배 가량 더 첨가하여 염화나트륨 용액을 5배 희석시켜 평형된 하이드록시아파타이트 컬럼에 로딩하였다. 염화나트륨 농도 구배로 흘려준 후 고농도의 인산나트륨 용액을 흘려주어 균일한 고순도의 항 IL-1 수용체-하이브리드 Fc 융합 단백질을 분리 정제하였다. 1M 염화나트륨 이하와 2M 염화나트륨 농도에서 각 peak로 용출되는데 다이머 형태가 고순도로 존재하는 1M 염화나트륨 이하에서 용출되는 peak1(도9a 참조)만 취하였다. 도 9b는 하이드록시아파타이트 컬럼에서 용출된 각 peak는 SDS-PAGE의 non reducing 조건 하에서 분획을 확인한 것으로, 각 분획을 모은 용액은 Bradford 단백질 정량방법을 이용하여 단백질 양을 측정하고 한외여과방식으로 단백질을 농축하였다.

실시예 5. hIL1 RA - hFC 융합단백질 단백질 특성 분석

크로마토그래피를 통하여 정제된 단백질의 특성을 확인하기 위하여 Native gel 전기영동, Western blot, 등전점 초점(Isoelectric focusing), 크기배재 HPLC (Size exclusion HPLC, SE-HPLC)를 진행하였다.

그 결과를 도 10 내지 도 12에 도시하였다. 도 10a에 나타난 바와 같이, 비변성 전기영동의 경우 10% Polyacrylamide gel을 사용했으며 단백질 분자량 마커(GE Healthcare, AmershamTM HMW Clibration Kit For Native Electrophoresis)의 150kda에 위치한 밴드가 항 IL-1 수용체-하이브리드 Fc 융합 단백질로 비변성 상태에서 다이머 형태를 보임을 확인하였다. 또한, 도 10b에 나타난 바와 같이, Western blotting에서는 anti-hIL-1RA antibody로 검출 시킨 결과 항 IL-1 수용체-하이브리드 Fc 융합 단백질을 정성적으로 확인할 수 있었다.

이론적인 항 IL-1 수용체-하이브리드 Fc 융합 단백질의 등전점은 6.01의 값을 가지고 있으며 도 11의 등전초점 전기영동에서 보여주는 바와 같이 정제 초기에는 pI5.3에서 6.0에 걸쳐 넓게 분포되어 있으나 정제가 진행됨에 따라 균일한 형태의 단백질로 정제됨을 확인되었다.

크기 배재(size exclusion) HPLC(Agilent)에 SEC 컬럼(G3000SWXL, 5micron, 7.8*300,TSK)에 이동상 50mM Sodium phosphate (pH7.5), 50mM NaCl을 흘려주면서 시료 20㎕를 로딩하면 도 12에서 보는 바와 같이 체류 시간(retention time)이 7.6분대에 한 개의 피크가 약 99.9%의 순도로 용출됨을 확인 할 수 있고 정제된 단백질이 고순도로 존재함을 SEC 컬럼을 통해 검증되었다.

실시예 6. 결합값 측정 및 비교

hIL-1RA와 IgG1 Fc를 융합한 단백질과 본 발명에서 발현된 hIL-1RA-hybrid Fc 융합 단백질이 hIL-1RI에 얼마나 결합이 잘 이루어 지는지를 비교하기 위하여 Biacore (GE healthcare) 기기를 이용하여 표면 플라즈마 공명 (surface plasmon resonance, SPR) 값을 측정하였다.

Biacore 기기에 CM5 칩을 장착하고 포스페이트 버퍼 살린 (Phosphate buffered saline, PBS) 용액을 흘려주었다. 그래프의 베이스 선이 일정하게 유지가 되는 지 확인 후 1-에틸-3-디메틸아미노프로필 카보디마이드 (1-ethyl3-(dimethylaminopropyl) carbodiimide, EDC) / N-하이드록시 숙시니마이드 (N-hydroxy succinimide, NHS)를 칩에 흘려주어 아민기를 활성화 시켰다. 다음 고정시키고자 하는 hIL-1RA와 IgG1 Fc를 융합한 단백질 또는 본 발명에서 발현된 hIL-1RA-hybrid Fc 융합 단백질을 칩에 주입하여 활성화된 아민기와 공유결합을 형성하게 하여 고정시킨 후 에탄올 아민으로 완전히 고정시켰다. 고정된 융합 단백질과 결합하는 hIL-1RI 단백질을 칩에 흘려주어 결합하는 정도를 공명 값 (resonance unit, RU)으로 확인한 후 프로그램을 사용하여 해리상수 (Kd)를 계산하였다.

그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 상기 발명의 항 IL-1 수용체-하이브리드 Fc 융합 단백질은 186pM의 해리 상수를 가지며 대조군은 1.02nM의 해리 상수를 가져 상기 발명에서 제조된 항 IL-1 수용체-하이브리드 Fc 융합 단백질이 대조군 보다 좋은 결합력을 가지는 것을 확인하였다.

실시예 7. 사람 세포에서의 항염증 효과 측정

본 발명에서 발현된 hIL-1RA-hybrid Fc 융합 단백질이 면역 반응을 억제하는 효과를 알아보기 위해 인간의 T 세포 증식 억제 측정과 염증성 사이토카인 분비량 측정을 실시하였다. T 세포 증식 억제는 혈액으로부터 PBMC를 분리한 후 RPMI-1640 배양액에 1×105 cells/ml의 농도로 세포를 희석하고 100 ng/ml 의 리포폴리사카라이드 (LPS) 또는, 1ug/ml의 anti-CD3 항체로 세포를 3일 동안 자극 하였다. 이 때 본 발명의 hIL1RA-hyFc 융합 단백질의 활성을 평가하기 위해 다양한 농도로 첨가하였다. 3일째 자극의 마지막 18시간 동안은 1mCi [3H]thymidine (NEN, Boston,MA)을 배양액에 추가 하였다. 배양 후 세포에 흡수되어 이용된 방사능 물질의 검출을 위해 나이트로셀룰로오즈 필터 막 (nitrocellulose filter membranes)에 세포를 흡착시키고 씻어준 후 필터에 남아 있는 방사능을 측정하였다.

염증성 사이토카인 분비량은 혈액으로부터 PBMC를 분리한 후 RPMI-1640 배양액에 1×106 cells/ml의 농도로 세포를 희석하고 100 ng/ml 의 LPS 로 자극하였다. 이때 본 발명의 hIL1RA-hyFc 융합 단백질을 다양한 농도로 첨가하였다. 48시간 후 배양액만 취한 후 인터루킨-17 암세포 사멸 인자-a, 핵인자 카파-B의 수용체 활성체 (RANKL), 혈관 내피세포 성장 인자 (VEGF)의 농도를 ELISA를 이용하여 정량하였다.

도 14는 본 발명의 항 IL-1 수용체-하이브리드 Fc 융합 단백질이 사람의 T 세포 또는 말초혈액 단핵구 세포에서 면역 반응을 억제 하는 효과를 확인 한 결과로, 음성 대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 배지만을 넣은 군을 넣은 군을 사용하였다. 도 14에서 알 수 있는 바와 같이, 상기 융합 단백질을 처리하였을 때 사람의 T 세포가 증식되는 것이 효과적으로 억제됨을 확인 하였으며 사람의 말초혈액 단핵구 세포에서도 염증 유발 사이토카인들과 골 파괴에 관여하는 사이토카인들을 억제하는 효과를 나타내었다.

실시예 8. 약물 동태학 측정

건강하고 여성인 생 후 6주가 지난 Balb/c 쥐에 허가 후 판매되고 있는 anakinra와 본 발명에서 발현된 단백질을 각각 5 mg/kg의 농도로 복강 투여 하였다. 투여 후 0, 0.05, 0.5, 2, 4, 6, 8, 24, 30, 48 시간 후에 혈액 샘플을 채취하여 혈중에 남아있는 anakinra 또는 본 발명에서 발현된 단백질의 농도를 측정하였다. 각 단백질의 농도는 ELISA를 이용하여 측정하였다. 코팅 용액에 희석한 Affinity purified Human IgG capture antibody (Bethyl Laboratories, Inc., A80-104A-6)코팅 항체를 Nunc 96 well plate에 각각 100㎕씩 첨가하고 실온에서 1h incubation 하였다. 플레이트를 TBST (Tris-Buffered Saline Tween-20) 세척 용액으로 5번 세척 한 후 1% BSA (Bovine serum albumin)가 첨가된 blocking buffer를 well당 200㎕씩 첨가하여 30분 동안 실온에서 blocking 하였다. Plate를 TBST 세척 용액으로 5번 세척 한 후 500pg/ml~0pg/ml 까지 1/2씩 희석한 표준용액 또는 적절한 비율로 희석한 혈액 샘플을 100㎕씩 첨가하였다. 실온에서 1h incubation 후 TBST 세척 용액으로 5번 세척하고 바이오틴이 부착된 anti-hIL-1RA polyclonal detection antibody를 희석하여 400ng/ml 농도로 만들고 100㎕씩 각 well에 넣고 20-25℃에서 1시간 incubation하였다. Plate를 TBST 세척 용액으로 5번 세척 한 후 Streptavidin HRP conjugated antibody를 1/50000으로 희석하여 각 well당 100㎕씩 넣고 20-25℃에서 1시간 incubation하였다. TBST 세척 용액으로 5번 세척하고 well당 100㎕씩 TMB substrate 용액을 첨가하여 어두운 실온에서 15분 incubation한 뒤 well당 100㎕의 반응 종료 용액을 첨가하여 반응을 종료시키고 450nm에서 plate reader로 흡광도를 측정하였다. 단백질의 농도는 ELISA로부터 계산된 양에 희석배율을 곱하여 ng/ml 값을 얻었다.

도 15는 본 발명의 항 IL-1 수용체-하이브리드 Fc 융합 단백질 또는 대조군인 유럽에서 판매가 되고 있는 IL-1 수용체인 아나킨라 (anakinra)의 약물 동태학 값을 나타낸 것으로, 도 15에서 알 수 있는 바와 같이, 상기 융합 단백질을 처리한 것이 아나킨라 대조군을 처리한 것보다 오랜 시간 혈액 내에 지속되고 있음이 확인되었다.

실시예 9. Luciferase assay

(1) 본 발명의 융합 단백질에 의한 hIL -1β의 세포 신호 전달 차단 효과

상기로부터 얻은 본 발명의 융합 단백질에 의한 hIL-1β의 세포 신호 전달 차단 효과를 보기 위해 luciferase assay를 실시하였다.

hIL-1β는 hIL-1 수용체 1과 결합하여 NFkB를 활성화시킴으로써 세포 신호를 전달한다. 이를 확인하기 위해 hIL-1 수용체 1을 발현하는 세포주에 NFkB 결합 부위를 가지는 luciferase 유전자가 삽입된 벡터를 형질전환한 뒤 hIL-1β를 처리하여 NFkB가 활성화 되어 luciferase 단백질을 발현시키는 것을 살펴보았다. 이때 IL-1 RA를 처리하면 IL-1 RA가 hIL-1 수용체 1에 결합하여 hIL-1β가 이 수용체에 결합하는 것을 차단하여 세포 내 신호 전달이 이루어지지 않아 luciferase 단백질이 발현되지 않는다. 따라서 이를 이용하여 상기 융합 단백질이 세포내에서 제대로 작용하여 그 효과를 나타내는 지 여부를 확인하는 실험을 수행하였다.

실험 전날 Nunc 48 well 플레이트에 HeLa cell을 2×10⁴ 수로 분주하여 놓았다. 다음날 NFkB 결합 부위와 firefly luciferase 유전자가 포함된 플라스미드와 결과값을 표준화 하기 위해 필요한 CMV 프로모터가 있는 renilla luciferase 유전자가 포함된 플라스미드를 함께 HeLa cell에 형질도입 하였다. 3시간 후 새 배지로 교체한 후 약 24시간 동안 안정화 시켰다. 형질 도입된 HeLa cell에 hIL-1β 단독 또는 hIL-1RA (R&D systems)와 발현 시킨 항 IL-1 수용체-하이브리드 Fc 융합 단백질을 농도별로 넣고 6시간 배양하였다. 6시간 후 배양된 세포로부터 배지를 제거하고 충분한 양의 PBS를 첨가하여 세척하였다. PBS를 완벽히 제거한 후 Dual-luciferase reporter assau sustem (promega, E1960)을 이용하여 매뉴얼대로 수행하여 발광값을 측정하였다.

도 16 및 도 17은 세포에서 배지로 발현된 상기 융합 단백질이 세포내에서 hIL-1β를 제대로 차단할 수 있는지와 그 효과 정도를 확인한 결과로써, 음성 대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 배지만을 넣은 군과 hIL1 RA만을 넣은 군을 사용하였고 양성 대조군으로는 hIL-1β를 넣은 군을 사용하여 비교하였다. 도 16에서 알 수 있는 바와 같이, 상기 융합 단백질을 발현하는 여러 세포주들로부터 얻어진 배지들을 hIL-1β와 같이 처리하였을 때 시중에서 판매되고 있는 hIL1 RA와 비슷하거나 더 좋은 세포 신호 차단 효과를 나타내었다. 또한 도 17에서 알 수 있는 바와 같이, 이러한 세포주들로부터 얻은 배지들을 농축하여 처리하였을 때 더욱 확실한 세포 신호 차단 효과를 나타내었다.

(2) anakinra 단백질 또는 hIL-1β와 결합하는 수용체인 hIL-1RI에 hybrid Fc를 융합한 단백질과 본 발명에서 발현된 단백질에 의한 hIL-1β의 세포 신호 전달 차단 효과 비교

기존의 판매되고 있는 anakinra 단백질 또는 hIL-1β와 결합하는 수용체인 hIL-1RI에 hybrid Fc를 융합한 단백질과 본 발명에서 발현된 단백질에 의한 hIL-1β의 세포 신호 전달 차단 효과를 비교하였다.

실험 전날 Nunc 48 well 플레이트에 HeLa cell을 2ⅹ10⁴수로 분주하여 놓았다. 다음날 NFkB 결합 부위와 firefly luciferase 유전자가 포함된 플라스미드와 결과값을 표준화 하기 위해 필요한 CMV 프로모터가 있는 renilla luciferase 유전자가 포함된 플라스미드를 함께 HeLa cell에 형질도입 하였다. 3시간 후 새 배지로 교체한 후 약 24시간 동안 안정화 시켰다. 형질 도입된 HeLa cell에 hIL-1β 단독 또는 기존의 판매되고 있는 anakinra 단백질 또는 hIL-1β와 결합하는 수용체인 hIL-1RI에 hybrid Fc를 융합한 단백질과 본 발명에서 발현시킨 단백질을 농도 별로 첨가한 후 6시간 배양하였다. 6시간 후 배양된 세포로부터 배지를 제거하고 충분한 양의 PBS를 첨가하여 세척하였다. PBS를 완벽히 제거한 후 Dual-luciferase reporter assay system (promega, E1960)을 이용하여 매뉴얼대로 수행하여 발광값을 측정하였다.

도 18 및 도 19는 상기 융합 단백질이 대조군인 IL-1 수용체와 하이브리드 Fc 융합 단백질 또는 시판되고 있는 항 IL-1 수용체인 아나킨라 보다 세포내에서 hIL-1β를 제대로 차단할 수 있는지와 그 효과 정도를 비교 확인한 결과로써, 도 18에서 알 수 있는 바와 같이, 상기 융합 단백질 또는 대조군인 IL-1 수용체와 하이브리드 Fc 융합 단백질을 hIL-1β와 같이 처리하였을 때 상기 융합 단백질이 대조군보다 더 좋은 세포 신호 차단 효과를 나타내었다. 또한 도 19에서도 상기 융합 단백질은 대조군인 시중에서 판매되고 있는 hIL-1 RA보다 더욱 확실한 세포 신호 차단 효과를 나타냄을 확인하였다.

실시예 10. 인터루킨-8 검출 ELISA

기존의 판매되고 있는 anakinra 단백질 또는 hIL1RA에 일반 IgG1 Fc를 융합한 단백질과 본 발명에서 발현된 단백질에 의한 인터루킨-8의 분비 차단 효과를 비교하기 위해 Interleukin-8 detection ELISA 를 실시하였다.

실험 전날 Nunc 48 well 플레이트에 HeLa cell을 2ⅹ10⁴수로 분주하여 놓았다. 다음날 새 배지로 교체한 후 HeLa cell에 hIL-1β 단독 또는 hIL-1β와 기존의 판매되고 있는 anakinra 단백질 또는 hIL1RA에 일반 IgG1 Fc를 융합한 단백질과 본 발명에서 발현 시킨 단백질을 농도 별로 첨가한 후 24시간 배양하였다. 24시간 후 배지를 수집하여 이 배지에 분비된 인터루킨-8의 양을 Duoset ELISA development quantitation kit (R&D systems., Inc., DY208)를 이용하여 측정하였다. 실험 하루 전날 코팅 용액에 희석한 코팅 항체를 Nunc 96 well plate에 각각 100㎕씩 첨가하고 실온에서 incubation 하였다. 다음날 플레이트를 TBST (Tris-Buffered Saline Tween-20) 세척 용액으로 3번 세척 한 후 1% BSA (Bovine serum albumin)가 첨가된 blocking buffer를 well당 300㎕씩 첨가하여 1h 동안 실온에서 blocking 하였다. Plate를 TBST 세척 용액으로 3번 세척 한 후 2000pg/ml~0pg/ml 까지 1/2씩 희석한 표준용액 또는 적절한 비율로 희석한 배지 샘플을 100㎕씩 첨가하였다. 실온에서 2h incubation 후 TBST 세척 용액으로 3번 세척하고 바이오틴이 부착된 anti-hIL-8 detection antibody를 well당 100㎕씩 첨가한 뒤 실온에서 2h incubation 하였다. TBST 세척 용액으로 3번 세척하고 바이오틴과 결합하는 스트렙타비딘 (Streptavidin)이 부착된 HRP antibody를 1/200으로 희석하여 well당 100㎕씩 넣고 빛이 들어가지 않는 곳에서 실온으로 20 min incubation하였다. TBST 세척 용액으로 3번 세척하고 TMB substrate 용액을 well당 100㎕씩 첨가하여 어두운 실온에서 20분 incubation한 뒤 well당 50㎕의 반응 종료 용액을 첨가하여 반응을 종료시키고 450nm에서 plate reader로 흡광도를 측정하였다. 인터루킨-8 단백질의 농도는 ELISA 결과로부터 계산된 양에 희석배율을 곱하여 ng/ml 값을 얻었다.

도 20 및 도 21은 상기 융합 단백질이 세포내에서 hIL-1β를 차단하여 염증 유발 사이토카인인 인터루킨-8을 차단하는 효과 정도를 인터루킨-8의 농도를 측정함으로써 확인한 결과로, 대조군으로는 시판되고 있는 IL-1 RA인 아나킨라 또는 IL-1RA와 면역글로불린1 (IgG1) Fc 융합 단백질을 사용하여 비교한 결과이다.

도 20에서 알 수 있는 바와 같이, 상기 융합 단백질은 hIL-1β와 같이 처리하였을 때 대조군인 시중에서 판매되고 있는 hIL1 RA보다 더 좋은 인터루킨-8 분비 차단 효과를 나타내었다. 또한 도 21에서도 상기 융합 단백질을 hIL-1β와 같이 처리하였을 때 대조군인 IL-1RA와 면역글로불린1 (IgG1) Fc 융합 단백질보다 더 좋은 인터루킨-8 분비 차단 효과를 나타냄을 확인하였다.

실시예 11. 콜라겐 유도 관절염 모델 쥐에서의 관절염 억제 효과 측정

콜라겐에 의해 유도되는 관절염을 위해 6주된 DBA-1 생쥐에 100mg bovine type II collagen (CII) 과 complete Freund’s adjuvant (CFA) (Arthrogen-CIA, Redmond,WA) 를 꼬리의 기조 부위에 피하 주사하였다. 이주 후 100 mg CII 과 incomplete Freund’s adjuvant (DIFCO, Detroit, MI) 를 생쥐의 뒷다리에 주사하였다. Anakinra와 본 발명에서 발현한 hIL1RA-hyFc 융합 단백질이 관절염 유도에 끼치는 영향을 보기 위하여 첫 번째 콜라젠 주입 후 둘째 주부터 격일간 4주 동안 다양한 농도의 Anakinra와 본 발명의 hIL1RA-hyFc 융합 단백질을 복강주사 하였다. 관절염의 평가는 첫 번째 주사 후 7주간 일주일에 3번씩 다른 두 연구자가 각각 4개의 다리를 다리당 0에서 4의 정도로 평가하여 합한 후 평균을 내었다.

도 22는 상기 융합 단백질이 콜라겐에 의해 유도되는 관절염을 가진 모델 쥐에서 농도별로 투여하였을 때 관절염을 억제하는 효과 정도를 점수를 평가함으로써 확인한 결과로, 음성 대조군으로는 아무것도 투여하지 않은 쥐 모델을 양성 대조군으로는 시판되고 있는 IL-1 RA인 아나킨라를 투여한 쥐를 사용하여 비교하였다.

도 22 (a)와 (b)에서 알 수 있는 바와 같이, 상기 융합 단백질을 투여한 쥐는 농도에 의존적으로 관절염이 억제되었고 또한 양성 대조군인 시중에서 판매되고 있는 hIL-1 RA보다 동일한 농도에서도 훨씬 더 좋은 관절염 억제 효과를 나타내었으며 대조군의 더 높은 농도를 투여한 쥐보다도 좋은 효과를 나타냄을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

<110> Handok Pharmaceuticals Co., Ltd. <120> Human Interleukin-1 receptor antagonist-hybrid Fc fusion protein <130> P20105031 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 117 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Part of DNA encoding hIL1 RA <400> 1 gccaccatgg agatctgcag gggcctgagg tcccacctga tcaccctgct gctgttcctg 60 ttccactccg agaccatctg caggccctcc ggcaggaagt cctccaagat gcaggcc 117 <210> 2 <211> 138 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Part of DNA encoding hIL1 RA <400> 2 gatgggcacc acgtcgatct tctcctccag gttcacgttg gggccctgca ggtagccggc 60 caccagctgg ttgttcctca ggtagaaggt cttctggttc acgtcccaga tcctgaaggc 120 ctgcatcttg gaggactt 138 <210> 3 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Part of DNA encoding hIL1 RA <400> 3 aagatcgacg tggtgcccat cgagccccac gccctgttcc tgggcatcca cggcggcaag 60 atgtgcctgt cctgcgtgaa gtccggcgac gagaccaggc tgcagctgga ggccgtgaac 120 atcaccgacc tgtccgagaa caggaag 147 <210> 4 <211> 138 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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Glu Asp 165 170 175 Glu Gly Gly Ser Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys 180 185 190 Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu 195 200 205 Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 210 215 220 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 225 230 235 240 Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 245 250 255 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 260 265 270 Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 275 280 285 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 290 295 300 Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 305 310 315 320 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met 325 330 335 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 340 345 350 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 355 360 365 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 370 375 380 Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val 385 390 395 400 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 405 410 415 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 420 425

Claims

인간 인터루킨-1 수용체 길항제가 인간 면역글로불린 하이브리드 Fc 프레그먼트에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
제 1항에 있어서,
상기 하이브리드 Fc 프레그먼트가 IgD 및 IgG4 를 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
인간 인터루킨-1 수용체 길항제-하이브리드 Fc 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물.
제 3항에 있어서,
상기 조성물은 자가면역질환의 치료를 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
인간 인터루킨-1 수용체 길항제-하이브리드 Fc 융합단백질을 인코딩하는, 서열목록 6의 염기서열을 포함하는 핵산분자.
서열목록 7 의 아미노산 서열을 포함하는 인간 인터루킨-1 수용체 길항제-하이브리드 Fc 융합단백질.