WO2021040064A1 - 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물 - Google Patents

백시니아 바이러스 및 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물 Download PDF

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    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising vaccinia virus and hydroxyurea as active ingredients.
  • Anti-cancer virus has excellent tumor-specific targeting ability, proliferation ability in cancer cells, and cancer cell killing ability, and a variety of clinical studies based on anti-cancer viruses are recently being conducted.
  • T-Vec talimogene laherparepvec
  • an anticancer virus based on the herpes simplex virus in the United States and Europe as a treatment for advanced melanoma.
  • vaccinia virus-based anticancer viruses after anticancer virus treatment, acute tumor necrosis, durable response, or complete response may appear, but sometimes tumor progression (progressive disease). ) Or early death, leading to unpredictable outcomes (pharmacodynamics variability).
  • Pexa-vec which is based on vaccinia virus, it is related to continuous systemic inflammatory response and organ dysfunction after anticancer virus treatment in a phase 1 clinical trial. Some patients died prematurely within a month.
  • transient flu symptoms (high fever) and hypotension after anti-cancer virus treatment are the most frequent adverse reactions of anti-cancer virus treatment.
  • the present inventors studied to enhance the anticancer effect of vaccinia virus used as an anticancer virus.
  • vaccinia virus and hydroxyurea are co-administered to an individual with cancer, when only the existing vaccinia virus is administered. It can be used safely by significantly reducing systemic inflammatory reactions.
  • vaccinia virus is administered systemically, when hydroxyurea is administered in combination, the present invention has been completed by confirming that the cancer cell-specific selectivity and proliferation ability are excellent.
  • an aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for treating cancer comprising vaccinia virus and hydroxyurea as active ingredients.
  • Another aspect of the present invention provides a method for treating cancer comprising administering vaccinia virus and hydroxyurea to an individual suffering from cancer.
  • Another aspect of the invention provides the use of a composition comprising vaccinia virus and hydroxyurea for preventing or treating cancer.
  • Another aspect of the present invention provides the use of a composition comprising vaccinia virus and hydroxyurea for preparing a medicament for preventing or treating cancer.
  • Another aspect of the present invention provides an anticancer adjuvant comprising hydroxyurea as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition for cancer treatment comprising vaccinia virus and hydroxyurea of the present invention as active ingredients has superior anticancer effect and safety compared to the case of administering only the existing vaccinia virus. Therefore, the pharmaceutical composition comprising the vaccinia virus and hydroxyurea of the present invention as active ingredients can be usefully used to treat cancer.
  • FIG. 2 is a diagram showing body weights measured on days 0, 3, 7, 10 and 14 after administration of wild-type vaccinia virus (WR) and HU to a mouse-renal cancer cell-embedded mouse (Renca).
  • WR wild-type vaccinia virus
  • Renca mouse-renal cancer cell-embedded mouse
  • Figure 4 is a mouse-renal cancer cell-embedded mice (Renca) after administration of recombinant vaccinia virus (WR VV tk- ) and HU (30 mg/kg), 0 days, 3 days, 7 days, 10 days and 14 It is a diagram measuring the size of the tumor on the first day.
  • VV_DD recombinant vaccinia virus
  • VVF vaccinia virus growth factor
  • Figure 6 shows the size of tumors on days 0, 5, 10, 12 and 15 after administration of recombinant vaccinia virus (WOTS-418) and HU to human-lung cancer cells (NCI-H460)-embedded mice. It is a figure which measured.
  • Fig. 7 is a diagram showing the survival rate after administration of recombinant vaccinia virus (WOTS-418) and HU to human-lung cancer cells (NCI-H460)-embedded mice.
  • Fig. 8 is a diagram showing the size of a tumor of a mouse after administration of a recombinant vaccinia virus (VV tk- ) and a human granulocyte colony stimulating factor (rhG-CSF) or HU to a mouse-renal cancer cell-embedded mouse (Renca). to be.
  • VV tk- recombinant vaccinia virus
  • rhG-CSF human granulocyte colony stimulating factor
  • Renca mouse-renal cancer cell-embedded mouse
  • Figure 9 is a mouse administered with a recombinant vaccinia virus (VV tk- ) and a human granulocyte colony stimulating factor (rhG-CSF) or HU-administered lymphocyte cells in the spleen isolated from a renal cancer cell-embedded mouse (Renca) to a new mouse. After that, the size of the tumor of a new mouse was measured.
  • VV tk- recombinant vaccinia virus
  • rhG-CSF human granulocyte colony stimulating factor
  • Fig. 10 is a diagram showing the size of a tumor of a mouse after administration of a recombinant vaccinia virus (OTS-412) and HU to a mouse-renal cancer cell-embedded mouse (Renca).
  • OTS-412 recombinant vaccinia virus
  • Renca mouse-renal cancer cell-embedded mouse
  • FIG. 11 shows the T lymphocytes isolated from mice administered with recombinant vaccinia virus (Wyeth VV tk- ) and HU-renal cancer cells-implanted mice (Renca) were administered to new mice, and then the tumor size of the new mice was measured. It is a drawing.
  • FIG. 12 is a diagram showing the size of a tumor of a new mouse after administration of splenocytes isolated from a mouse-kidney cancer cell-embedded mouse (Renca) to which recombinant vaccinia virus (Wyeth VV tk-) and HU was administered to a new mouse. It is a drawing.
  • FIG. 13 is a diagram showing the size of a tumor on day 22 after administration of a recombinant vaccinia virus (OTS-412) and HU to a mouse-renal cancer cell-embedded mouse (Renca).
  • OTS-412 recombinant vaccinia virus
  • Renca mouse-renal cancer cell-embedded mouse
  • FIG. 14 is a diagram illustrating the degree of proliferation of CD4+ T cells or CD8+ T cells in spleen tissue after administration of recombinant vaccinia virus (OTS-412) and HU to a mouse-kidney cancer cell-embedded mouse (Renca).
  • FIG. 15 is a diagram showing the degree of proliferation of CD4+ T cells and CD8+ T cells in blood and spleen after administration of recombinant vaccinia virus (OTS-412) and HU in mouse-breast cancer cell-embedded mice (4T1). to be.
  • Fig. 16 is a diagram showing the size of the left tumor after administration of the recombinant vaccinia virus (WR VV tk- ) and HU to the left tumor to the mouse breast cancer cell implantation mouse (4T1).
  • Fig. 17 is a diagram showing the size of the right tumor after administration of the recombinant vaccinia virus (WR VV tk- ) and HU to the left tumor to the mouse breast cancer cell implantation mouse (4T1).
  • FIG. 19 is a diagram illustrating the distribution of wild-type vaccinia virus in liver and kidney tissues after administration of wild-type vaccinia virus (WR) or wild-type vaccinia virus (WR) and HU to normal mice.
  • One aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising vaccinia virus and hydroxyurea as active ingredients.
  • Vaccinia virus and hydroxyurea contained in the pharmaceutical composition may be administered simultaneously, sequentially, or in reverse order. Specifically, the vaccinia virus and hydroxyurea may be administered simultaneously. In addition, the hydroxyurea may be administered first and then the vaccinia virus may be administered. Further, the vaccinia virus may be administered first and then the hydroxyurea may be administered. In addition, the hydroxyurea may be administered first, then the vaccinia virus, and then the hydroxyurea may be administered again.
  • the vaccinia virus is Western Reserve (WR), NYVAC (New York Vaccinia Virus), Wyeth (The New York City Board of Health; NYCBOH), LC16m8, Lister, Copenhagen, Tiantan ( Tian Tan), USSR, TashKent, Evans, IHD-J (International Health Division-J) or IHD-W (International Health Division-White) vaccinia virus strain, but limited thereto. It does not become.
  • Western Reserve species vaccinia virus and Wyeth species vaccinia virus were used.
  • the vaccinia virus may be a wild type vaccinia virus or a recombinant vaccinia virus.
  • the recombinant vaccinia virus may have a wild-type vaccinia virus gene deleted or a foreign gene inserted therein.
  • TK thymidine kinase
  • VVF vaccinia growth factor
  • WR53.5 F13.5L
  • F14.5 A56R, B18R, or a combination thereof
  • Genes related to virulence of a virus encoding any one selected from the group consisting of may be deleted.
  • the inserted foreign genes are HSV-TK (Herpes simplex virus thymidine kinase), mutated HSV-TK, GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), G-CSF (Granulocyte colony-stimulating factor), CD (cytosin deaminase), carboxyl esterase (carboxyl esterase) type 1, carboxyl esterase type 2, INF- ⁇ (Interferone beta), somatostatin receptor 2 (somatostatin receptor 2), and any one selected from the group consisting of a combination thereof It may be a gene that promotes the encoding immunity.
  • HSV-TK Herpes simplex virus thymidine kinase
  • mutated HSV-TK GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)
  • G-CSF Gramulocyte colony-stimulating factor
  • CD cytosin deaminase
  • carboxyl esterase
  • the recombinant vaccinia virus is Western Reserve (WR), NYVAC (New York Vaccinia Virus), Wyeth (The New York City Board of Health; NYCBOH), LC16m8, Lister, Copenhagen , Tian Tan, USSR, TashKent, Evans, International Health Division-J (IHD-J) or International Health Division-White (IHD-W) vaccinia virus species TK of vaccinia virus
  • the gene may have been deleted.
  • a recombinant vaccinia virus in which the TK gene of Western Reserve species vaccinia virus was deleted was used, which was designated as "WR VV tk-”.
  • a recombinant vaccinia virus in which the TK gene of the Wyeth species vaccinia virus was deleted was used, which was designated as "Wyeth VV tk-".
  • the recombinant vaccinia virus is Western Reserve, NYVAC, Wyeth, LC16m8, Lister, Copenhagen, Tiantan, USSR, Tashkent, Evans, IHD-J or IHD-W vaccinia virus species TK gene and VGF gene of vaccinia virus. May have come to fruition.
  • a recombinant vaccinia virus in which the TK gene and VGF gene of Western Reserve species vaccinia virus were deleted was used, and this was designated as "VV_DD".
  • the recombinant vaccinia virus is Western Reserve, NYVAC, Wyeth, LC16m8, Lister, Copenhagen, Tiantan, USSR, Tashkent, Evans, IHD-J or IHD-W vaccinia virus species
  • the TK gene of vaccinia virus is deleted, and , HSV-TK gene may be inserted.
  • the recombinant vaccinia virus is Western Reserve, NYVAC, Wyeth, LC16m8, Lister, Copenhagen, Tiantan, USSR, Tashkent, Evans, IHD-J or IHD-W vaccinia virus species
  • the TK gene of vaccinia virus is deleted.
  • the mutated HSV-TK gene may be inserted.
  • a recombinant vaccinia virus in which the TK gene of the Wyeth species vaccinia virus was deleted and the gene encoding the HSV-TK fragment (1-330 aa) of SEQ ID NO: 1 was inserted at the position was used. , It was named "OTS-412".
  • a recombinant vaccinia virus in which the TK gene of Western Reserve species vaccinia virus is deleted, and a gene encoding the HSV-TK variant of SEQ ID NO: 2 of the HSV-TK gene is inserted at that position. was used, and it was named "WOTS-418".
  • the recombinant vaccinia virus is Western Reserve, NYVAC, Wyeth, LC16m8, Lister, Copenhagen, Tiantan, USSR, Tashkent, Evans, IHD-J or IHD-W vaccinia virus species
  • the TK gene of vaccinia virus is deleted, and , GM-CSF gene may be inserted.
  • the recombinant vaccinia virus is Western Reserve, NYVAC, Wyeth, LC16m8, Lister, Copenhagen, Tiantan, USSR, Tashkent, Evans, IHD-J or IHD-W vaccinia virus species
  • the TK gene of vaccinia virus is deleted.
  • G-CSF gene may be inserted.
  • the recombinant vaccinia virus is Western Reserve, NYVAC, Wyeth, LC16m8, Lister, Copenhagen, Tiantan, USSR, Tashkent, Evans, IHD-J or IHD-W vaccinia virus species
  • the TK gene of vaccinia virus is deleted, and , CD (Cytosine deaminiase) gene may be inserted.
  • the recombinant vaccinia virus is Western Reserve, NYVAC, Wyeth, LC16m8, Lister, Copenhagen, Tiantan, USSR, Tashkent, Evans, IHD-J or IHD-W vaccinia virus species
  • the TK gene of vaccinia virus is deleted.
  • Somatostatin receptor 2 gene may be inserted.
  • the recombinant vaccinia virus is Western Reserve, NYVAC, Wyeth, LC16m8, Lister, Copenhagen, Tiantan, USSR, Tashkent, Evans, IHD-J or IHD-W vaccinia virus species
  • the TK gene of vaccinia virus is deleted, and , HSV-TK (Herpes simplex virus thymidine kinase), mutated HSV-TK, GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), G-CSF (Granulocyte colony-stimulating factor), CD (cytosin deaminase) or somatostatin receptor Any two or more genes selected from the group consisting of genes encoding 2 (somatostatin receptor 2) may be inserted.
  • HSV-TK Herpes simplex virus thymidine kinase
  • mutated HSV-TK mutated HSV-TK
  • GM-CSF granulocyte-macrophage colon
  • the recombinant vaccinia virus is Western Reserve, NYVAC, Wyeth, LC16m8, Lister, Copenhagen, Tiantan, USSR, Tashkent, Evans, IHD-J or IHD-W vaccinia virus species TK gene and VGF gene of vaccinia virus.
  • HSV-TK Herpes simplex virus thymidine kinase
  • mutated HSV-TK GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)
  • G-CSF Granulocyte colony-stimulating factor
  • CD cytosin deaminase
  • any one gene selected from the group consisting of a gene encoding somatostatin receptor 2 and a combination thereof may be inserted.
  • gene deletion used in the present invention means that a gene is partially deleted, all of a gene is deleted, or a foreign gene is inserted into the gene so that the gene is not expressed. When a part of the gene is deleted, some amino acids at the N-terminus or C-terminus of the expressed polypeptide may be deleted.
  • TK thymidine kinase
  • the term "TK (thymidine kinase)" used in the present invention is called thymidine kinase, and refers to an enzyme involved in the biosynthesis of nucleotides.
  • the TK is an enzyme used for both cell and viral nucleotide biosynthesis.
  • normal cells no longer divide, so TK does not exist, and even cells that divide rapidly like hair follicle cells do not have enough TK to be used by the virus.
  • the virus can proliferate only when the TK of the cancer cell is present, so that only cancer cells can be selectively killed.
  • VGF vaccinia growth factor
  • GM-CSF used in the present invention is a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor that is secreted by macrophages, T cells, mast cells, natural killer cells, endothelial cells and fibroblasts. It means the protein that becomes. GM-CSF stimulates stem cells to produce granulocytes (neutrophils, basophils, eosinophils) and monocytes. In addition, GM-CSF induces an immune response by rapidly increasing the number of macrophages.
  • the GM-CSF may be derived from human and may be a protein having the sequence of GenBank: AAA52578.1.
  • CD used in the present invention is called cytosine deaminase, and refers to an enzyme that hydrolyzes cytosine to contact a reaction between uracil and ammonia.
  • G-CSF used in the present invention is a granulocyte colony-stimulating factor, which is a cytokine produced by macrophages, fibroblasts, endothelial cells, etc. by stimulation by inflammation or endotoxin. Means.
  • the G-CSF promotes the production of neutrophils.
  • the G-CSF may be derived from human (rhGCSF), and may be a protein having a sequence of GenBank: AAA03056.1.
  • somatostatin receptor 2 used in the present invention means a protein encoded by the SSTR2 gene in humans.
  • the somatostatin receptor 2 is mainly expressed in tumors, and neuroendocrine tumor patients overexpressing somatostatin receptor 2 show an improved prognosis.
  • Somatostatin receptor 2 has the ability to stimulate apoptosis in many cells, including cancer cells.
  • hydroxyurea used in the present invention is a compound having the following formula.
  • the hydroxyurea may be included in the pharmaceutical composition in the form of a commercialized drug containing hydroxyurea.
  • the commercialized drug containing the hydroxyurea component may be Hydroxyurea®, Hydrea®, DroxiaTM, MylocelTM, Siklos® hydrin capsule, but is not limited thereto.
  • the hydroxyurea can be taken orally, and parenteral administration is also possible.
  • the dosage of the vaccinia virus depends on the condition and weight of the individual, the degree of the disease, the form of the drug, the route and duration of administration, and may be appropriately selected by a person skilled in the art.
  • Patients may be administered 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 18 virus particles, infectious viral units (TCID50), or plaque-forming units (pfu) of vaccinia virus.
  • TID50 infectious viral units
  • pfu plaque-forming units
  • the vaccinia virus may be administered at a dose of 1x10 5 to 1x10 10 pfu. More preferably, the vaccinia virus may be administered at a dose of 1 ⁇ 10 5 or more and less than 1 ⁇ 10 9 pfu. In one embodiment of the present invention, the vaccinia virus was administered at 1 ⁇ 10 5 or 1 ⁇ 10 7 pfu.
  • the hydroxyurea may be administered at a dose of 1 mg/kg/day to 100 mg/kg/day or 10 mg/kg/day to 90 mg/kg/day.
  • the dosage of hydroxyurea is 10 mg/kg/day to 90 mg/kg/day, 15 mg/kg/day to 80 mg/kg/day, 20 mg/kg/day to 70 mg/kg /day, 25 mg/kg/day to 65 mg/kg/day or 30 mg/kg/day to 60 mg/kg/day.
  • the hydroxyurea was administered at 30 mg/kg/day or 60 mg/kg/day.
  • it can be administered several times a day. Specifically, it may be administered once to 4 times a day, or once to 2 times a day.
  • the cancer may be solid cancer or blood cancer.
  • the blood cancer may be any one selected from the group consisting of lymphoma, acute leukemia, and multiple myeloma.
  • the solid cancer is lung cancer, colon cancer, prostate cancer, thyroid cancer, breast cancer, brain cancer, head and neck cancer, esophageal cancer, skin cancer, thymus cancer, gastric cancer, colon cancer, liver cancer, ovarian cancer, uterine cancer, bladder cancer, rectal cancer, gallbladder cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer and its It may be any one selected from the group consisting of a combination.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a physiologically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include suitable excipients and diluents commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions.
  • it may be formulated and used in the form of an injection according to a conventional method.
  • the pharmaceutical composition may include a sterilized aqueous solution, a non-aqueous solvent, a suspension, an emulsion, a freeze-dried preparation, a suppository, etc. as a preparation for parenteral administration.
  • a non-aqueous solvent and suspension propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like may be used.
  • a base for suppositories witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin paper, glycerogelatin, and the like may be used.
  • the route of administration, dosage, and frequency of administration of the pharmaceutical composition may be administered to the subject in various ways and amounts depending on the condition of the patient and the presence or absence of side effects, and the optimal administration method, dosage, and frequency of administration are appropriate for those skilled in the art. You can choose from a range.
  • the pharmaceutical composition may be administered in combination with other drugs or physiologically active substances known to have a therapeutic effect on the disease to be treated, or may be formulated in the form of a combination formulation with other drugs.
  • the pharmaceutical composition may be administered parenterally, intratumoral, intraperitoneal, sub-cutaneous, intra-dermal, intra-nodal, intra-arterial and intravenous It can be administered by a suitable method, such as intra-venous. Preferably, it may be intratumoral, intraperitoneal or intravenous administration. Meanwhile, the dosage of the pharmaceutical composition may be determined according to an administration schedule, dosage, and health status of a patient.
  • the pharmaceutical composition for cancer treatment may be characterized in that the cancer selectivity of the vaccinia virus is increased.
  • kits for preventing or treating cancer comprising a first composition containing vaccinia virus as an active ingredient and a second composition containing hydroxyurea as an active ingredient.
  • the vaccinia virus is as described above in the pharmaceutical composition.
  • the second composition containing hydroxyurea as an active ingredient may be a commercially available drug.
  • Commercialized drugs containing hydroxyurea as an active ingredient may be Hydroxyurea ® , Hydrea ® , DroxiaTM, MylocelTM, Siklos ® hydrin capsules.
  • the second composition can be taken orally, and parenteral administration is also possible.
  • the dosage of the vaccinia virus depends on the condition and weight of the individual, the degree of the disease, the form of the drug, the route and duration of administration, and may be appropriately selected by a person skilled in the art.
  • Patients may be administered 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 18 virus particles, infectious viral units (TCID50), or plaque-forming units (pfu) of vaccinia virus.
  • TID50 infectious viral units
  • pfu plaque-forming units
  • the vaccinia virus may be administered at a dose of 1x10 5 to 1x10 10 pfu. More preferably, the vaccinia virus may be administered in a dose of 1x10 5 to less than 1x10 9 pfu. In one embodiment of the present invention, the first composition was administered at 1x10 5 or 1x10 7 pfu.
  • the dosage of the second composition may be administered in a dose of 1 mg/kg/day to 100 mg/kg/day or 10 mg/kg/day to 90 mg/kg/day.
  • the dosage of the second composition is 10 mg/kg/day to 90 mg/kg/day, 15 mg/kg/day to 80 mg/kg/day, 20 mg/kg/day to 70 mg/kg /day, 25 mg/kg/day to 65 mg/kg/day or 30 mg/kg/day to 60 mg/kg/day.
  • the second composition was administered at 30 mg/kg/day or 60 mg/kg/day.
  • it can be administered several times a day. Specifically, it may be administered once to 4 times a day, or once to 2 times a day.
  • the cancer may be solid cancer or blood cancer.
  • the blood cancer may be any one selected from the group consisting of lymphoma, acute leukemia, and multiple myeloma.
  • the solid cancer is lung cancer, colon cancer, prostate cancer, thyroid cancer, breast cancer, brain cancer, head and neck cancer, esophageal cancer, skin cancer, thymus cancer, gastric cancer, colon cancer, liver cancer, ovarian cancer, uterine cancer, bladder cancer, rectal cancer, gallbladder cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer and its It may be any one selected from the group consisting of a combination.
  • the first composition and the second composition may further include a physiologically acceptable carrier.
  • the composition included in the kit of the present invention may further include suitable excipients and diluents commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions.
  • it may be formulated and used in the form of an injection according to a conventional method.
  • the first and second compositions are preparations for parenteral administration and may include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, suppositories, and the like.
  • aqueous solutions non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, suppositories, and the like.
  • non-aqueous solvent and suspension propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like may be used.
  • a base for suppositories witepsol, macrogol, tween61, cacao butter, laurin, glycerogelatin, and the like may be used.
  • the route of administration, dosage, and frequency of administration of the first composition and the second composition may be administered to the subject in various ways and amounts depending on the condition of the patient and the presence or absence of side effects, and the optimal administration method, dosage, and frequency of administration are A person skilled in the art can select it in an appropriate range.
  • the pharmaceutical composition may be administered in combination with other drugs or physiologically active substances known to have a therapeutic effect on the disease to be treated, or may be formulated in the form of a combination formulation with other drugs.
  • the second composition may be administered orally or parenterally. Specifically, the second composition may be administered parenterally, and may be administered intraperitoneal, intraarterial, or intra-venous.
  • the first composition may be administered parenterally, intratumoral, intraperitoneal, sub-cutaneous, intra-dermal, intra-nodal, intra-arterial and It can be administered by a suitable method, such as intra-venous. Preferably, it may be intratumoral, intraperitoneal or intravenous administration. Meanwhile, the dosage of the first composition and the second composition may be determined according to an administration schedule, dosage, and health status of the patient.
  • the first composition may be administered once to 10 times or 2 to 5 times, and may be administered to an individual at intervals of 7 to 30 days. Specifically, the first composition may be administered at intervals of 7 days, 14 days, 21 days or 30 days.
  • the second composition may be administered before or after administration of the first composition.
  • the second composition may be continuously administered once a day from 3 to 5 days before administration of the first composition, and within 24 hours or 24 hours after administration of the first composition, continuously for 9 to 28 days. It can be administered once a day.
  • the first composition was administered continuously once a day from 1 to 3 days before administration
  • the second composition was 1 for 13 days, 17 days, 18 days or 28 days after administration of the first composition. It was administered once a day.
  • Another aspect of the present invention provides a method of treating cancer comprising administering vaccinia virus and hydroxyurea to an individual suffering from cancer.
  • the vaccinia virus may be Western Reserve, NYVAC, Wyeth, LC16m8, Lister, Copenhagen, Tiantan, USSR, Tashkent, Evans, IHD-J or IHD-W vaccinia virus strain, but is not limited thereto. .
  • the vaccinia virus and hydroxyurea may be administered simultaneously, sequentially, or in reverse order. Specifically, the vaccinia virus and hydroxyurea may be administered simultaneously. In addition, the hydroxyurea may be administered first and then the vaccinia virus may be administered. Further, the vaccinia virus may be administered first and then the hydroxyurea may be administered. In addition, the hydroxyurea may be administered first, then the vaccinia virus, and then the hydroxyurea may be administered again.
  • the dosage of the vaccinia virus depends on the condition and weight of the individual, the degree of the disease, the form of the drug, the route and duration of administration, and may be appropriately selected by a person skilled in the art.
  • Patients may be administered 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 18 virus particles, infectious viral units (TCID50), or plaque-forming units (pfu) of vaccinia virus.
  • TID50 infectious viral units
  • pfu plaque-forming units
  • the vaccinia virus may be administered at a dose of 1x10 5 to 1x10 10 pfu. More preferably, the vaccinia virus may be administered at a dose of 1 ⁇ 10 5 or more and less than 1 ⁇ 10 9 pfu. In one embodiment of the present invention, the vaccinia virus was administered at 1 ⁇ 10 5 or 1 ⁇ 10 7 pfu.
  • the hydroxyurea may be administered at a dose of 1 mg/kg/day to 100 mg/kg/day or 10 mg/kg/day to 90 mg/kg/day.
  • the dosage of hydroxyurea is 10 mg/kg/day to 90 mg/kg/day, 15 mg/kg/day to 80 mg/kg/day, 20 mg/kg/day to 70 mg/kg /day, 25 mg/kg/day to 65 mg/kg/day or 30 mg/kg/day to 60 mg/kg/day.
  • the hydroxyurea was administered at 30 mg/kg/day or 60 mg/kg/day.
  • it can be administered several times a day. Specifically, it may be administered once to 4 times a day, or once to 2 times a day.
  • the vaccinia virus may be administered once to 10 times or 2 to 5 times, and may be administered to an individual at intervals of 7 to 30 days. Specifically, the vaccinia virus may be administered at intervals of 7 days, 14 days, 21 days or 30 days.
  • the hydroxyurea may be administered before, during or after vaccinia virus administration. Specifically, the hydroxyurea may be administered before or after vaccinia virus is administered.
  • the hydroxyurea may be continuously administered once a day from 3 to 5 days before vaccinia virus administration, and from 24 hours after vaccinia virus administration, it may be continuously administered once a day for 9 to 28 days. have.
  • hydroxyurea was continuously administered once a day from 1 to 3 days before vaccinia virus administration, and 1 for 13 days, 17 days, 18 days or 28 days after vaccinia virus administration. It was administered once a day.
  • the cancer may be solid cancer or blood cancer.
  • the blood cancer may be any one selected from the group consisting of lymphoma, acute leukemia, and multiple myeloma.
  • the solid cancer is lung cancer, colon cancer, prostate cancer, thyroid cancer, breast cancer, brain cancer, head and neck cancer, esophageal cancer, skin cancer, thymus cancer, gastric cancer, colon cancer, liver cancer, ovarian cancer, uterine cancer, bladder cancer, rectal cancer, gallbladder cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer and its It may be any one selected from the group consisting of a combination.
  • the hydroxyurea may be administered orally or parenterally. Specifically, the hydroxyurea may be administered parenterally, and may be administered intraperitoneal, intraarterial, or intra-venous.
  • the vaccinia virus and hydroxyurea can be administered parenterally, intratumoral, intraperitoneal, sub-cutaneous, intra-dermal, intra-nodal , Intra-arterial and intravenous (intra-venous), etc. may be administered by a suitable method. Preferably, it may be intratumoral, intraperitoneal or intravenous administration. Meanwhile, the dose of vaccinia virus and hydroxyurea may be determined according to an administration schedule, dose, and health status of a patient.
  • subject used in the present invention refers to a person suffering from cancer or a condition in which a disease can be alleviated, suppressed, or treated by administering the pharmaceutical composition of the present invention.
  • administration means introducing an effective amount of a substance into an individual by an appropriate method, and the route of administration of the vaccinia virus and hydroxyurea is administered through a general route capable of reaching the target tissue. Can be.
  • the vaccinia virus and hydroxyurea may be administered in combination with other drugs or physiologically active substances known to have therapeutic effects on the disease to be treated, or may be formulated in the form of a combination formulation with other drugs.
  • Another aspect of the invention provides the use of a composition comprising vaccinia virus and hydroxyurea for preventing or treating cancer.
  • Another aspect of the present invention provides the use of a composition comprising vaccinia virus and hydroxyurea for preparing a medicament for preventing or treating cancer.
  • an anticancer adjuvant comprising hydroxyurea as an active ingredient.
  • the hydroxyurea is the same as described above in the pharmaceutical composition.
  • the anticancer adjuvant may be used as an anticancer adjuvant for an anticancer agent containing vaccinia virus as an active ingredient.
  • the anticancer adjuvant may be characterized by improving, enhancing or increasing the anticancer activity of vaccinia virus.
  • the anticancer adjuvant may be characterized by increasing the cancer selectivity of vaccinia virus.
  • TK thymidine kinase
  • Wyeth species NYC Department of Health
  • Western Reserve species were purchased from the American Type Culture Collection (ATCC).
  • ATCC American Type Culture Collection
  • the TK site of the wild-type vaccinia virus was replaced with a shuttle plasmid having a firefly luciferase reporter (p7.5 promoter) gene or a shuttle plasmid having a GFP gene using a vector.
  • Hela cells In order to secure the recombinant virus, Hela cells (ATCC) were cultured in EMEM medium containing 4 ⁇ 10 5 cells/well conditions and 10% fetal calf serum in a 6-well plate. Then, the wild-type vaccinia virus was treated with 0.05 MOI, and after 2 hours, it was replaced with an EMEM medium containing 2% fetal calf serum. Thereafter, 4 ⁇ g of the linearized shuttle plasmid vector prepared in Preparation Example 1.1 was transfected using XfectTM polymer (Clonetech 631317, USA). After culturing for 4 hours, the cells were replaced with EMEM medium containing 2% fetal calf serum, and then cultured for an additional 72 hours.
  • sucrose cushion method sucrose cushion method
  • TK thymidine kinase
  • HSV-TK mutated thymidine kinase
  • TK thymidine kinase
  • HSV-TK mutated thymidine kinase
  • the TK site of the Western Reserve species wild-type vaccinia virus contains an enhanced green fluorescent protein (EGFP) gene.
  • EGFP enhanced green fluorescent protein
  • mice female, 10 weeks sold in Orient Bio (Busan) were implanted with a Renca cancer cell line (Korea Cell Line Bank) of 5 ⁇ 10 6 cells after an adaptation period of 2 days. After observing until the tumor size reached 50 mm 3 to 80 mm 3 , administration of wild-type vaccinia virus was started.
  • Renca cancer cell line Renca cancer cell line
  • Western Reserve species wild-type vaccinia virus WR
  • the group receiving saline intraperitoneally was set as the negative control group, and the group receiving wild-type vaccinia virus (WR, 1 ⁇ 10 5 pfu) was set as the positive control group.
  • a group receiving co-administration of wild-type vaccinia virus (WR, 1x10 5 pfu) and hydroxyurea (30 mg/kg) was set as an experimental group. Wild-type vaccinia virus was administered once intratumorally, and hydroxyurea was administered intraperitoneally 5 times/week, excluding the day of administration of wild-type vaccinia virus, from 1 day before wild-type vaccinia virus administration to 14 days after administration.
  • mice were measured on the 3rd, 7th, 10th and 14th days after administration of each drug to the negative control group, the positive control group, and the experimental group of Experimental Example 1.1. As a result, significant weight loss did not appear in all three groups (FIG. 2).
  • Balb/c mice female, 8 weeks sold in Orient Bio (Busan) were allografted with a Renca cancer cell line (Korea Cell Line Bank) of 5x10 6 cells after a week of adaptation period. After observing until the tumor size reached 100 mm 3 to 150 mm 3 , administration of the recombinant vaccinia virus was started. On the other hand, Western Reserve species-derived recombinant vaccinia virus (WR, VV tk- ) has a stronger proliferation power in an allograft model than Wyeth species-derived recombinant vaccinia virus.
  • WR Western Reserve species-derived recombinant vaccinia virus
  • the group receiving saline intraperitoneally was set as the negative control group, and the group receiving the recombinant vaccinia virus (WR VV tk- , 1 ⁇ 10 7 pfu) was set as the positive control group.
  • the group receiving the combined administration of the recombinant vaccinia virus and hydroxyurea was set as the experimental group.
  • Recombinant vaccinia virus was administered intraperitoneally twice, and hydroxyurea was administered intraperitoneally 6 times/week, excluding the day of administration of the recombinant vaccinia virus from 1 day before administration to 21 days after administration of the recombinant vaccinia virus.
  • tumor sizes were measured on the 0th, 3rd, 7th, 10th, 14th, 17th and 21st days. As a result, it was confirmed that the tumor size of the mice in the experimental group was significantly suppressed compared to the tumor size of the mice in the positive control group (FIG. 3).
  • mice female, 10 weeks sold in Orient Bio (Busan) were subjected to an adaptation period of 2 days, and then a Renca cancer cell line (Korea Cell Line Bank) of 5x10 6 cells was applied to the left thigh. I did. After observing until the tumor size reached 50 mm 3 to 150 mm 3 , administration of the recombinant vaccinia virus was started.
  • Renca cancer cell line Korea Cell Line Bank
  • the group receiving saline intraperitoneally was set as the negative control group, and the group receiving the recombinant vaccinia virus (WR VV tk- , 1 ⁇ 10 5 pfu) was set as the positive control group.
  • the group receiving the combined administration of the recombinant vaccinia virus and hydroxyurea (30 mg/kg) was set as the experimental group.
  • Recombinant vaccinia virus was administered once intratumorally, and hydroxyurea was administered intraperitoneally 6 times/week excluding the day of administration of the recombinant vaccinia virus from 1 day before administration to 14 days after administration of the recombinant vaccinia virus.
  • tumor sizes were measured on the 0th, 3rd, 7th, 10th and 14th days. As a result, it was confirmed that the tumor size of the mice in the experimental group was inhibited by about 25% of the tumor size of the mice in the positive control group (FIG. 4).
  • mice C57BL/6 mice (female, 7 weeks) sold in Koatech (Korea) were plated with a mouse melanoma cancer cell line (ATCC, B16F10) of 5 ⁇ 10 5 cells after an adaptation period of 2 days. After observing until the tumor size reached 50 mm 3 to 100 mm 3 , administration of the recombinant vaccinia virus (WR VV_DD) was started.
  • the recombinant vaccinia virus (WR VV_DD) is a double deletion of the thymidine kinase (TK) and vaccinia growth factor (VGF) portions of the Western Reserve species vaccinia virus, and its proliferation is limited in an allograft model.
  • the group receiving saline intraperitoneal administration was set as the negative control group, and the group receiving hydroxyurea (30 mg/kg) or recombinant vaccinia virus (VV_DD, 1 ⁇ 10 6 pfu) alone was set as the positive control group.
  • the group receiving the combination administration of the recombinant vaccinia virus and hydroxyurea (30 mg/kg) was set as the experimental group.
  • Recombinant vaccinia virus was administered intraperitoneally on days 0 and 5, and hydroxyurea was administered intraperitoneally 6 times/week, excluding the day of administration of recombinant vaccinia virus from 1 day before administration to 15 days after administration of recombinant vaccinia virus. was administered.
  • the size of the tumor was measured 1 day before administration of the drug to the mice in each group, 4 days and 7 days after administration. As a result, it was confirmed that the tumor size of the mice in the experimental group was significantly suppressed compared to the tumor size of the mice in the positive control group (FIG. 5). Through this, it was confirmed that a synergistic effect appears when the recombinant vaccinia virus (VV_DD) and hydroxyurea are co-administered.
  • mice Female, 7 weeks sold in Orient Bio (Busan) after a 2-day adaptation period, NCI-H460 human lung cancer cancer cell line with 5x10 6 cells (Korea Cell Line Bank) The xenograft was performed subcutaneously. After observing until the tumor size reached 100 mm 3 to 150 mm 3 , administration of the recombinant vaccinia virus (WOTS-418) was started. Meanwhile, Western Reserve species-derived recombinant vaccinia virus (WOTS-418) can be proliferated in human lung cancer cell line (NCI-H460) xenograft mice.
  • NCI-H460 human lung cancer cell line
  • the group receiving saline intraperitoneally was set as a control group, and the group receiving the recombinant vaccinia virus (WOTS-418, 1 ⁇ 10 7 pfu) and hydroxyurea (30 mg/kg) in combination was set as the experimental group.
  • Recombinant vaccinia virus was administered intraperitoneally once, and hydroxyurea was administered intraperitoneally 6 times/week, excluding the day of administration of the recombinant vaccinia virus from 1 day before administration to 15 days after administration of the recombinant vaccinia virus.
  • mice female, 7 weeks sold in Orient Bio (Busan) were subjected to an adaptation period of 2 days and then subcutaneously with a mouse colon cancer cell line (CT-26, Korea Cell Line Bank) with a number of 1x10 6 cells. Transplanted. After 7 days, administration of recombinant vaccinia virus (WOTS-418) and hydroxyurea was started. On the other hand, the recombinant vaccinia virus (WOTS-418) derived from Western Reserve species has a stronger proliferation power in an allograft model than the recombinant vaccinia virus derived from Wyeth species.
  • Recombinant vaccinia virus (WOTS-418, 1x10 7 pfu) was administered intraperitoneally, and recombinant vaccinia virus and hydroxyurea (30 mg/kg) were co-administered.
  • Recombinant vaccinia virus was administered intraperitoneally once, and hydroxyurea was administered intraperitoneally for 5 consecutive times from 1 day after administration of the recombinant vaccinia virus.
  • Balb/c mice female, 7 weeks sold in Orient Bio (Busan) were subjected to an adaptation period of 2 days and then allografted with Renca cancer cell line (Korea Cell Line Bank) of 5x10 6 cells. Performed. After observing until the tumor size reached 100 mm 3 to 150 mm 3 , administration of the recombinant vaccinia virus was started.
  • a group receiving saline intratumoral administration was set as a negative control group, and a group receiving recombinant vaccinia virus (Wyeth VV tk- , 1 ⁇ 10 7 pfu) was set as a positive control group.
  • recombinant vaccinia virus (Wyeth VV tk- , 1x10 7 pfu) and recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (Rh-G-CSF, 75 ⁇ g/kg) administered group and recombinant
  • the group receiving the virus (VV tk- , 1 ⁇ 10 7 pfu) and hydroxyurea (30 mg/kg) was set as the experimental group.
  • Recombinant vaccinia virus was administered intratumorally, and rh-G-CSF or hydroxyurea was administered intraperitoneally from 3 days before administration of the recombinant vaccinia virus to 5 times/week before sacrifice.
  • mice of each group of Experimental Example 7.1 were sacrificed on the 16th day after administration of the drug to measure the size of the tumor.
  • the positive control mice and mice in the experimental group receiving the combination administration of recombinant vaccinia virus and rh-G-CSF increased about 10 times from the initial tumor size. It was observed that the mice in the experimental group receiving the recombinant vaccinia virus and hydroxyurea co-administered increased the initial tumor size by about 8 times, and that the tumor size was most suppressed (FIG. 8).
  • each group of mice was sacrificed on the 16th day of Experimental Example 7.1, and then lymphocyte cells in the spleen were separated for each group. Thereafter, the isolated lymphocyte cells were injected into each new normal mouse, and cancer was implanted to observe the size of the tumor.
  • an allograft was performed with a Renca cancer cell line (Korea Cell Line Bank) of 5 ⁇ 10 6 cells, and the size of the tumor was measured on the 19th day.
  • mice injected with splenocytes collected from mice of the group receiving the combined administration of recombinant vaccinia virus and hydroxyurea were remarkably suppressed in mice injected with splenocytes collected from mice of the group receiving the combined administration of recombinant vaccinia virus and hydroxyurea.
  • tumor growth was not significantly suppressed in the mice injected with splenocytes collected from the remaining mice, respectively (FIG. 9).
  • immune cells such as cytotoxic T cells were formed in the group administered with the recombinant vaccinia virus and hydroxyurea in combination, as well as activating the adaptive immunity.
  • mice female, 7 weeks sold in Orient Bio (Busan) were allografted with a Renca cancer cell line (Korea Cell Line Bank) of 5x10 6 cells after a 7-day adaptation period. After observing until the tumor size reached 50 mm 3 to 100 mm 3 , recombinant vaccinia virus was administered. On the other hand, Wyeth species-derived recombinant vaccinia virus (Wyeth VV tk- ) hardly proliferates in a mouse renal cancer cell-embedded mouse model.
  • Wyeth species-derived recombinant vaccinia virus Wyeth species-derived recombinant vaccinia virus (Wyeth VV tk- ) hardly proliferates in a mouse renal cancer cell-embedded mouse model.
  • the group receiving saline intratumoral administration was set as the negative control group, and the group receiving only hydroxyurea (30 mg/kg) and the group receiving only recombinant vaccinia virus (Wyeth VV tk- , 1x10 7 pfu) were used as positive controls.
  • a group receiving co-administration of recombinant vaccinia virus (Wyeth VV tk- , 1 ⁇ 10 7 pfu) and hydroxyurea (30 mg/kg) was set as the experimental group.
  • Recombinant vaccinia virus was administered intratumorally, and hydroxyurea was administered intraperitoneally from 3 days before administration of the recombinant vaccinia virus to 5 times/week before sacrifice.
  • tumor sizes were measured on the 0th, 4th, 10th, 15th and 22nd days.
  • the tumor size of the positive control mice increased about 11 to 13 times compared to the initial tumor size.
  • the tumor size of the mice in the experimental group was increased by about 4 times compared to the size of the initial tumor (FIG. 10).
  • each group of mice was sacrificed on the 16th day of Example 8.1, and then splenocytes and cytotoxicity were performed for each group.
  • T lymphocyte (CD8+ T cell) cells were isolated. Then, the isolated splenocytes or cytotoxic T lymphocyte cells were injected into new normal mice, respectively, and cancer was implanted to observe the size of the tumor.
  • allograft was performed with a Renca cancer cell line (Korea Cell Line Bank) with a number of 5 ⁇ 10 6 cells, and tumor sizes were measured on days 7, 10, 14, 18 and 21.
  • mice female, 8 weeks sold in Orient Bio (Busan) were allografted with a Renca cancer cell line (Korea Cell Line Bank) of 5 ⁇ 10 6 cells after a 7-day adaptation period. The tumor was observed until the size of the tumor reached 100 mm 3 to 150 mm 3 , and then the recombinant vaccinia virus was administered.
  • Wyeth species-derived recombinant vaccinia virus Wyeth VV tk- ) hardly proliferates in a mouse renal cancer cell-embedded mouse model.
  • the group receiving saline intratumoral administration was used as the negative control group, and the group receiving the recombinant vaccinia virus (Wyeth VV tk- , 1 ⁇ 10 7 pfu) was set as the positive control group.
  • a group receiving the recombinant vaccinia virus (Wyeth VV tk- , 1 ⁇ 10 7 pfu) and hydroxyurea (30 mg/kg) was set as the experimental group.
  • Recombinant vaccinia virus was administered intratumorally, and hydroxyurea was administered intraperitoneally from 1 day before administration of recombinant vaccinia virus to 6 times/week before sacrifice.
  • the tumor was sacrificed on the 22nd day to measure the size of the tumor.
  • the tumor size of the positive control mice was suppressed by about 25% compared to the tumor size of the negative control mice.
  • the tumor size of the mice in the experimental group was suppressed by about 37.5% compared to that of the mice in the negative control group, and about 15% more than the tumor size in the mice in the positive control group (Fig. 13).
  • the distribution of immune cells in the tumor microenvironment was analyzed when the recombinant vaccinia virus and hydroxyurea were co-administered.
  • immunohistochemical staining using DAB Diaminobenzidine was performed. Specifically, the spleen of each group of mice was collected, the spleen tissue was cut to 0.4 ⁇ m, and dried. Thereafter, the tissue was washed with PBS and treated with bovine serum albumin (BSA), and primary antibodies (anti-CD3 antibody (Abcam), anti-CD4 antibody (BD Biosciences), anti-CD8 antibody (BD Biosciences)) were prepared. Diluted in a ratio of 1:50, the tissue was treated and reacted at 4°C overnight.
  • BSA bovine serum albumin
  • primary antibodies anti-CD3 antibody (Abcam), anti-CD4 antibody (BD Biosciences), anti-CD8 antibody (BD Biosciences)
  • mice 4T1(I)
  • mice female, 7 weeks sold in Orient Bio (Busan) were allografted with a 4T1 cancer cell line (Korea Cell Line Bank) of 1 ⁇ 10 6 cells after a 7-day adaptation period. The tumor was observed until the size of the tumor reached 100 mm 3 to 150 mm 3 , and then the recombinant vaccinia virus was administered.
  • Wyeth species-derived recombinant vaccinia virus OTS-412
  • the breast cancer cell line-embedded mouse is an animal model in which metastasis to the whole body including lung tissue progresses, and metastasis is generally evaluated by the number of nodules on the tumor surface.
  • the group receiving saline intratumoral administration was set as the negative control group, and the group receiving the recombinant vaccinia virus (OTS-412, 1 ⁇ 10 7 pfu) or hydroxyurea (30 mg/kg) was used as the positive control group.
  • a group that co-administered recombinant vaccinia virus and hydroxyurea was set as the experimental group.
  • Recombinant vaccinia virus was administered for the second time on day 7 after the first intratumoral administration. Hydroxyurea was administered intraperitoneally once a day, excluding the day of administration of the recombinant vaccinia virus from 3 days before administration of the recombinant vaccinia virus to 3 days before sacrifice.
  • mice of each group were sacrificed, blood and spleen were collected, and the distribution of immune cells in the blood and in the splenocytes was analyzed by flowcytometry. As a result, it was confirmed that the distribution of CD4+ T cells and CD8+ T cells that induce tumor immune responses in blood and spleen was highest in the experimental mice. In addition, it was confirmed that myeloid derived suppressor cells (MDSC), which have an immunosuppressive function, were significantly lower in the experimental group mice than in the negative and positive control mice (FIG. 15).
  • MDSC myeloid derived suppressor cells
  • mice Female, 10 weeks sold in Orient Bio (Busan) were subjected to an adaptation period of 2 days, and then a 4T1 cancer cell line (Korea Cell Line Bank) of 1x10 6 cells was placed on the left thigh. Two days later, the same number of 4T1 cancer cell lines were subcutaneously implanted on the right thigh. After observing until the size of the subcutaneous tumor on the left thigh reaches 50 mm 3 to 200 mm 3 , administration of the recombinant vaccinia virus was started.
  • 4T1 cancer cell line Korea Cell Line Bank
  • the group receiving saline intraperitoneally was set as the negative control group, and the group receiving the recombinant vaccinia virus (WR VV tk- , 1 ⁇ 10 5 pfu) was set as the positive control group.
  • the group receiving the combined administration of the recombinant vaccinia virus and hydroxyurea was set as the experimental group.
  • Recombinant vaccinia virus was administered once into the left tumor, and hydroxyurea was administered intraperitoneally 6 times/week, excluding the day of administration of the recombinant vaccinia virus from 1 day before administration to 14 days after administration of the recombinant vaccinia virus.
  • the size of tumors implanted subcutaneously on both thighs on the 0th, 3rd, 7th, 10th and 14th days after administration of the drug to the mice of each group was measured.
  • the size of the left tumor of the mice in the experimental group was inhibited by about 35% of the size of the left tumor of the mice in the positive control group (FIG. 16).
  • the size of the right tumor of the mice in the experimental group was inhibited by about 45% of the size of the right tumor of the positive control group (FIG. 17).
  • mice female, 8 weeks sold in Orient Bio (Busan) were allografted with a Renca cancer cell line (Korea Cell Line Bank) of 5x10 6 cells after a week of adaptation period. After observing until the tumor size reached 100 mm 3 to 150 mm 3 , administration of the recombinant vaccinia virus was started.
  • the Western Reserve species-derived recombinant vaccinia virus (WR VV tk- ) has a stronger proliferative power in an allograft model than the Wyeth species-derived recombinant vaccinia virus.
  • the group receiving saline intraperitoneally was set as the negative control group, and the group receiving the recombinant vaccinia virus (WR VV tk- , 1 ⁇ 10 7 pfu) was set as the positive control group.
  • the group receiving the combined administration of the recombinant vaccinia virus and hydroxyurea was set as the experimental group.
  • Recombinant vaccinia virus was administered intraperitoneally twice, and hydroxyurea was administered intraperitoneally 6 times/week, excluding the day of administration of the recombinant vaccinia virus from 1 day before administration to 21 days after administration of the recombinant vaccinia virus.
  • mice of each group were sacrificed on the 22nd day, tumors were isolated from the mice, and virus proliferation was compared through immunohistochemical staining using DAB (Diaminobenzidine). Specifically, the tumor tissue of each group of mice was collected, the tumor tissue was cut to 0.4 ⁇ m, and dried. Thereafter, the tissues were washed with PBS, treated with bovine serum albumin (BSA), and treated with a primary antibody (Cat No. ABIN1606294, Antibodies-Online) at a ratio of 1:50 to the tissues and treated overnight at 4°C. Reacted. The next day, after washing the tissue with PBS, a secondary antibody (Alexa 594, Cat no. A21205, Invitrogen) was reacted at room temperature for 30 minutes. After the tissue was washed with PBS again, the reaction was performed using an ABC kit (Dako), and H 2 O 2 was added to develop color, followed by a dehydration process and then encapsulated.
  • DAB Diaminobenzidine
  • mice Female, 7 weeks distributed from Orient Bio (Busan) were subjected to an adaptation period of 2 days, and then the administration of wild-type Western Reserve species vaccinia virus (WR) was started.
  • the wild-type Western Reserve species vaccinia virus has limited proliferation in syngeneic mice.
  • a group receiving wild-type western reserve species vaccinia virus (1x10 7 pfu) was set as a control group, and a group administered with wild-type western reserve species vaccinia virus and hydroxyurea (50 mg/kg) was set as an experimental group.
  • Wild-type vaccinia virus was administered once intranasal, and hydroxyurea was administered intraperitoneally 5 times/week from 1 day before wild-type vaccinia virus administration, excluding the day of wild-type vaccinia virus administration.
  • mice of the control group and the experimental group were sacrificed to separate kidney tissue and liver tissue, and immunohistochemical staining was performed. After making a paraffin block, deparaffinization was performed using xylene and ethyl alcohol. After going through an antigen retrieval using a decloaking chamber, a primary antibody (Cat no.ABIN1606294, Antibodies-Online) is attached and a FITC-labeled secondary antibody (Alexa 594, Cat no.A21205) is applied. , Invitrogen) was attached and observed using a fluorescence microscope.
  • a primary antibody Cat no.ABIN1606294, Antibodies-Online
  • a FITC-labeled secondary antibody Alexa 594, Cat no.A21205

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Abstract

본 발명은 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물은 기존의 백시니아 바이러스만을 투여하는 경우보다 항암효과 및 안전성이 우수하다. 따라서, 본 발명의 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 암을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

백시니아 바이러스 및 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물
본 발명은 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
항암바이러스(Oncolytic virus)는 종양 특이적인 표적 능력, 암세포에서의 증식능력 및 암세포 사멸능력이 우수하여, 최근 항암바이러스를 기반으로 하는 다양한 임상연구가 진행되고 있다. 2015년에는 미국과 유럽에서 헤르페스 심플렉스 바이러스를 기반으로 하는 항암바이러스인 티벡(talimogene laherparepvec, T-Vec)이 진행성 흑색종 치료제로 상업화에 성공하면서 항암바이러스 분야의 시대가 시작되었다.
최근 항암바이러스의 유용성은 그 자체로서의 효능을 넘어 종양 면역을 활성화시켜 다른 면역치료제와의 병용 치료제로써의 가능성도 보여주고 있다. 항암바이러스 개발 초기인 2000년도 까지는 바이러스의 암세포 특이적 증식을 통한 직접 사멸 효과가 상대적으로 더 중요하였다. 하지만, 이후의 임상연구에서는 직접적인 암세포 사멸 효과보다 종양면역의 활성화가 핵심적 기전임을 알게 되었고, 이를 이용하여 최근에는 항암바이러스를 면역관문억제제(immune checkpoint inhibitor) 등과 같은 면역치료제와 병용 투여하는 치료제가 개발되고 있다. 이는 항암바이러스가 면역이 억제되어 있는 종양미세환경을 면역치료가 적합한 종양미세환경으로 전환시켜주기 때문인 것으로 알려져 있다.
다수의 백시니아 바이러스 기반 항암바이러스의 임상연구에서 항암바이러스 치료 후, 급속한 종양 괴사(acute tumor necrosis), 지속적 반응(durable response) 또는 완치(complete response)가 나타나기도 하지만, 때로는 종양의 진행(progressive disease) 또는 조기사망(early death)과 같은 예측하기 어려운 결과(pharmacodynamics variability)로 이어지기도 한다. 실예로, 백시니아 바이러스를 기반으로 하는 펙사벡(Pexa-vec)의 경우 1상 임상시험에서 항암바이러스 치료 후 지속적인 전신성 염증반응(systemic inflammatory response) 및 주요 기관의 기능 부전(organ dysfunction)과 관련되어 한 달 이내에 조기에 사망한 환자들이 일부 있었다. 또한, 항암바이러스 치료 후 일시적인 독감 증상(고열)과 저혈압은 항암바이러스 치료의 가장 빈번한 이상반응이다.
따라서, 항암바이러스의 치료효과를 증진시키기 위해서는 암세포, 환자의 면역 상태 및 항암바이러스 사이의 상호작용에 대한 이해가 필요하며, 이를 바탕으로 임상적 효능을 높일 수 있는 기술에 대한 연구가 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 항암바이러스로 사용되는 백시니아 바이러스의 항암 효과를 증진시키기 위해 연구한 결과, 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아를 암이 발병된 개체에 병용 투여하는 경우 기존의 백시니아 바이러스만을 투여하는 경우보다 전신성 염증반응을 현저하게 감소시켜 안전하게 사용할 수 있다. 뿐만 아니라, 백시니아 바이러스를 전신 투여시, 히드록시유레아를 병용 투여할 경우, 암세포 특이적인 선택성 및 증식능이 우수한 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 측면은, 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 암이 발병된 개체에 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아를 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 암을 예방 또는 치료하기 위한 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 암의 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 항암보조제를 제공한다.
본 발명의 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물은 기존의 백시니아 바이러스만을 투여하는 경우보다 항암효과 및 안전성이 우수하다. 따라서, 본 발명의 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 암을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 마우스-신장암세포-식립 마우스(Renca I)에 야생형 백시니아 바이러스(Western Reserve Vaccinia Virus, WR) 및 히드록시유레아(HU)를 투여한 후, 0일, 3일, 7일, 10일 및 14일째에 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 2는 마우스-신장암세포-식립 마우스(Renca)에 야생형 백시니아 바이러스(WR) 및 HU를 투여한 후, 0일, 3일, 7일, 10일 및 14일째에 체중을 측정한 도면이다.
도 3은 마우스-신장암세포-식립 마우스(Renca)에 WR에서 TK 유전자를 제거한 재조합 백시니아 바이러스(WR VVtk-) 및 HU(60 mg/kg)를 투여한 후, 0일, 3일, 7일, 10일, 14일 17일 및 21일째에 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 4는 마우스-신장암세포-식립 마우스(Renca)에 재조합 백시니아 바이러스(WR VVtk-) 및 HU(30 mg/kg)를 투여한 후, 0일, 3일, 7일, 10일 및 14일째에 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 5는 마우스-흑색종-식립 마우스(B16F10)에서의 WR에서 TK 유전자 및 VGF(vaccinia virus growth factor) 유전자를 동시에 제거한 재조합 백시니아 바이러스(VV_DD) 및 HU를 투여하기 1일 전, 투여한 후, 4일 및 7일째에 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 6은 인간-폐암세포(NCI-H460)-식립 마우스에 재조합 백시니아 바이러스(WOTS-418) 및 HU를 투여한 후, 0일, 5일, 10일, 12일 및 15일째에 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 7은 인간-폐암세포(NCI-H460)-식립 마우스에 재조합 백시니아 바이러스(WOTS-418) 및 HU를 투여한 후, 생존율을 측정한 도면이다.
도 8은 마우스-신장암세포-식립 마우스(Renca)에 재조합 백시니아 바이러스(VVtk-)와 인간 과립구 콜로니 자극인자(rhG-CSF) 또는 HU를 투여한 후, 마우스의 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 9는 재조합 백시니아 바이러스(VVtk-)와 인간 과립구 콜로니 자극인자(rhG-CSF) 또는 HU를 투여한 마우스-신장암세포-식립 마우스(Renca)로부터 분리한 비장 내 림프구 세포를 새로운 마우스에 투여한 후, 새로운 마우스의 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 10은 마우스-신장암세포-식립 마우스(Renca)에 재조합 백시니아 바이러스(OTS-412) 및 HU를 투여한 후, 마우스의 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 11은 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VVtk-) 및 HU를 투여한 마우스-신장암세포-식립 마우스(Renca)로부터 분리한 T 림프구를 새로운 마우스에 투여한 후, 새로운 마우스의 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 12는 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VVtk-) 및 HU를 투여한 마우스-신장암세포-식립 마우스(Renca)로부터 분리한 비장세포를 새로운 마우스에 투여한 후, 새로운 마우스의 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 13은 마우스-신장암세포-식립 마우스(Renca)에 재조합 백시니아 바이러스(OTS-412) 및 HU를 투여한 후, 22일째에 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 14는 마우스-신장암세포-식립 마우스(Renca)에 재조합 백시니아 바이러스(OTS-412) 및 HU를 투여한 후, 비장조직 내 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 증식 정도를 관찰한 도면이다.
도 15는 마우스-유방암세포-식립 마우스(4T1)에서의 재조합 백시니아 바이러스(OTS-412) 및 HU를 투여한 후, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포가 혈액 및 비장에서의 증식정도를 측정한 도면이다.
도 16은 마우스 유방암세포 식립 마우스(4T1)에 재조합 백시니아 바이러스(WR VVtk-) 및 HU를 왼쪽 종양에 투여한 후, 왼쪽 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 17은 마우스 유방암세포 식립 마우스(4T1)에 재조합 백시니아 바이러스(WR VVtk-) 및 HU를 왼쪽 종양에 투여한 후, 오른쪽 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 18은 마우스-신장암세포-식립 마우스(Renca)에 재조합 백시니아 바이러스(WR VVtk-) 및 HU를 투여한 후, 22일째에 마우스 종양조직에서 재조합 백시니아 바이러스의 분포를 확인하기 위해 염색한 도면이다.
도 19는 정상 마우스에 야생형 백시니아 바이러스(WR) 또는 야생형 백시니아 바이러스(WR) 및 HU를 투여한 후, 간조직 및 신장조직에서 야생형 백시니아 바이러스의 분포를 확인한 도면이다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명의 일 측면은 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 약학 조성물에 포함된 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아는 동시, 순차적, 또는 역순으로 병용 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아는 동시에 투여될 수 있다. 또한, 상기 히드록시유레아를 먼저 투여한 후 상기 백시니아 바이러스를 투여할 수 있다. 나아가, 상기 백시니아 바이러스를 먼저 투여한 후 상기 히드록시유레아를 투여할 수 있다. 또한, 상기 히드록시유레아를 먼저 투여한 후 상기 백시니아 바이러스를 투여하고 다시 상기 히드록시유레아를 투여할 수 있다.
상기 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브(Western Reserve, WR), NYVAC(New York Vaccinia Virus), Wyeth(The New York City Board of Health; NYCBOH), LC16m8, 리스터(Lister), 코펜하겐(Copenhagen), 티안탄(Tian Tan), USSR, 타쉬켄트(TashKent), 에반스(Evans), IHD-J(International Health Division-J) 또는 IHD-W(International Health Division-White) 백시니아 바이러스 종(strain)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스와 Wyeth 종 백시니아 바이러스를 사용하였다.
상기 백시니아 바이러스는 야생형 백시니아 바이러스 또는 재조합 백시니아 바이러스일 수 있다. 구체적으로, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 야생형 백시니아 바이러스의 유전자가 결실되거나, 외래 유전자가 삽입된 것일 수 있다. 이때, 상기 야생형 백시니아 바이러스 유전자 중 티미딘 키나아제(thymidine kinase, TK), 백시니아 성장인자(vaccinia growth factor, VGF), WR53.5, F13.5L, F14.5, A56R, B18R 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 코딩하는 바이러스의 독성과 관련된 유전자가 결실될 수 있다.
또한, 상기 삽입되는 외래 유전자는 HSV-TK(Herpes simplex virus thymidine kinase), 변이된 HSV-TK, GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), G-CSF(Granulocyte colony-stimulating factor), CD(cytosin deaminase), 카르복실에스테라아제(carboxyl esterase) 1형 , 카르복실에스테라아제 2형, INF-β(Interferone beta), 소마토스타틴 수용체 2(somatostatin receptor 2) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 코딩하는 면역을 촉진시키는 유전자일 수 있다.
구체적으로, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브(Western Reserve, WR), NYVAC(New York Vaccinia Virus), Wyeth(The New York City Board of Health; NYCBOH), LC16m8, 리스터(Lister), 코펜하겐(Copenhagen), 티안탄(Tian Tan), USSR, 타쉬켄트(TashKent), 에반스(Evans), IHD-J(International Health Division-J) 또는 IHD-W(International Health Division-White) 백시니아 바이러스 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자가 결실된 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자를 결실시킨 재조합 백시니아 바이러스를 사용하였으며, 이를 "WR VVtk-" 로 명명하였다. 또한, 본 발명의 일 실시예에서는 Wyeth 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자를 결실시킨 재조합 백시니아 바이러스를 사용하였으며, 이를 "Wyeth VVtk-" 로 명명하였다.
또한, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브, NYVAC, Wyeth, LC16m8, 리스터, 코펜하겐, 티안탄, USSR, 타쉬켄트, 에반스, IHD-J 또는 IHD-W 백시니아 바이러스 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자 및 VGF 유전자가 결실된 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자 및 VGF 유전자를 결실시킨 재조합 백시니아 바이러스를 사용하였으며, 이를 "VV_DD" 로 명명하였다.
나아가, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브, NYVAC, Wyeth, LC16m8, 리스터, 코펜하겐, 티안탄, USSR, 타쉬켄트, 에반스, IHD-J 또는 IHD-W 백시니아 바이러스 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자가 결실되고, HSV-TK 유전자가 삽입된 것일 수 있다.
또한, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브, NYVAC, Wyeth, LC16m8, 리스터, 코펜하겐, 티안탄, USSR, 타쉬켄트, 에반스, IHD-J 또는 IHD-W 백시니아 바이러스 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자가 결실되고, 변이된 HSV-TK 유전자가 삽입된 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 Wyeth 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자가 결실되고, 그 위치에 서열번호 1의 HSV-TK 단편(1-330 aa)을 코딩하는 유전자가 삽입된 재조합 백시니아 바이러스를 사용하였으며, 이를 "OTS-412" 로 명명하였다. 또한, 본 발명의 일 실시예에서는 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자가 결실되고, 그 위치에 HSV-TK 유전자의 서열번호 2의 HSV-TK 변이체를 코딩하는 유전자가 삽입된 재조합 백시니아 바이러스를 사용하였으며, 이를 "WOTS-418" 로 명명하였다.
나아가, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브, NYVAC, Wyeth, LC16m8, 리스터, 코펜하겐, 티안탄, USSR, 타쉬켄트, 에반스, IHD-J 또는 IHD-W 백시니아 바이러스 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자가 결실되고, GM-CSF 유전자가 삽입된 것일 수 있다.
또한, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브, NYVAC, Wyeth, LC16m8, 리스터, 코펜하겐, 티안탄, USSR, 타쉬켄트, 에반스, IHD-J 또는 IHD-W 백시니아 바이러스 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자가 결실되고, G-CSF 유전자가 삽입된 것일 수 있다.
나아가, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브, NYVAC, Wyeth, LC16m8, 리스터, 코펜하겐, 티안탄, USSR, 타쉬켄트, 에반스, IHD-J 또는 IHD-W 백시니아 바이러스 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자가 결실되고, CD(Cytosine deaminiase) 유전자가 삽입된 것일 수 있다.
또한, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브, NYVAC, Wyeth, LC16m8, 리스터, 코펜하겐, 티안탄, USSR, 타쉬켄트, 에반스, IHD-J 또는 IHD-W 백시니아 바이러스 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자가 결실되고, 소마토스타틴 수용체 2 유전자가 삽입된 것일 수 있다.
나아가, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브, NYVAC, Wyeth, LC16m8, 리스터, 코펜하겐, 티안탄, USSR, 타쉬켄트, 에반스, IHD-J 또는 IHD-W 백시니아 바이러스 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자가 결실되고, HSV-TK(Herpes simplex virus thymidine kinase), 변이된 HSV-TK, GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), G-CSF(Granulocyte colony-stimulating factor), CD(cytosin deaminase) 또는 소마토스타틴 수용체 2(somatostatin receptor 2)를 코딩하는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 2개 이상의 유전자가 삽입된 것일 수 있다.
또한, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브, NYVAC, Wyeth, LC16m8, 리스터, 코펜하겐, 티안탄, USSR, 타쉬켄트, 에반스, IHD-J 또는 IHD-W 백시니아 바이러스 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자 및 VGF 유전자가 결실되고, HSV-TK(Herpes simplex virus thymidine kinase), 변이된 HSV-TK, GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), G-CSF(Granulocyte colony-stimulating factor), CD(cytosin deaminase) 또는 소마토스타틴 수용체 2(somatostatin receptor 2)를 코딩하는 유전자 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 유전자가 삽입된 것일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "유전자 결손" 이란, 유전자 일부 결실, 전부 결실, 또는 유전자 내부에 외래 유전자가 삽입되어 유전자가 발현되지 않는 것을 의미한다. 상기 유전자의 일부가 결실될 경우, 발현되는 폴레펩타이드의 N-말단 또는 C-말단의 일부 아미노산이 결실될 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "TK(thymidine kinase)" 란, 티미딘 키나아제로 불리며, 뉴클레오티드의 생합성에 관여하는 효소를 의미한다. 상기 TK는 세포 및 바이러스의 뉴클레오티드의 생합성에 모두 쓰이는 효소이다. 이때, 세포의 경우 정상세포는 더 이상 분열하지 않아 TK가 존재하지 않으며, 모근세포처럼 빠르게 분열하는 세포라 하더라도 TK의 양이 바이러스가 이용할 만큼 충분하지 않다. 이러한 점을 이용해 바이러스에서 TK 유전자를 결손시킴으로써 바이러스가 암세포의 TK가 존재하는 경우에만 증식할 수 있게함으로써, 암세포만을 선택적으로 사멸시킬 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "VGF(vaccinia growth factor)" 란, 상피 성장인자와 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드로서, 감염된 세포 주변의 세포 증식을 자극한다. 백시니아 바이러스는 증식 세포에서 더 잘 복제하기 때문에, 생체 내 바이러스 복제에 유리할 수 있다. 항암바이러스가 보다 암세포에서만 특이적으로 증식할 수 있도록 하기 위해, TK 유전자 이외에 추가적으로 VGF 유전자를 결실시킬 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "GM-CSF" 란, 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)로 대식세포, T세포, 비만 세포, 자연살해세포, 내피세포 및 섬유아세포에 의해 분비되는 단백질을 의미한다. GM-CSF는 줄기세포가 과립구(호중구, 호염기구, 호산구)과 단핵구를 생산하도록 자극한다. 또한, GM-CSF는 대식세포의 수를 급격히 늘려 면역반응을 유도한다. 상기 GM-CSF는 인간 유래일 수 있으며, GenBank: AAA52578.1의 서열을 가지는 단백질일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "CD" 란, 시토신데아미나아제로 불리며, 시토신을 가수 분해적으로 탈아미노하여 우라실과 암모니아로 하는 반응을 접촉하는 효소를 의미한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "G-CSF" 란, 과립구 콜로니 자극인자(Granulocyte colony-stimulating factor)로 염증이나 내독소(endotoxin)에 자극을 받아서 대식세포, 섬유모세포, 내피세포 등이 생산하는 사이토카인을 의미한다. 상기 G-CSF는 호중구의 생산을 촉진시킨다. 상기 G-CSF는 인간 유래일 수 있으며(rhGCSF), GenBank: AAA03056.1의 서열을 가지는 단백질일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "소마토스타틴 수용체 2" 란, 인간에서 SSTR2 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 의미한다. 상기 소마토스타틴 수용체 2는 주로 종양에서 발현되며, 소마토스타틴 수용체 2를 과발현하는 신경 내분비 종양 환자는 개선된 예후를 보인다. 소마토스타틴 수용체 2는 암세포를 포함한 많은 세포에서 아포토시스를 자극하는 능력을 가지고 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "히드록시유레아" 란, 하기 화학식을 갖는 화합물이다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2019010849-appb-I000001
상기 히드록시유레아의 정확한 기전은 밝혀져 있지 않으나, DNA 합성을 저해하는 항암제로 알려져 있다. 또한, 상기 히드록시유레아는 히드록시유레아를 포함하는 상업화된 약제의 형태로 약학 조성물에 포함될 수 있다. 상기 히드록시유레아 성분을 포함하는 상업화된 약제는 Hydroxyurea®, Hydrea®, Droxia TM, Mylocel TM, Siklos® 하이드린캡슐일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 히드록시유레아는 경구로 복용할 수 있으며, 비경구 투여도 가능하다.
상기 백시니아 바이러스의 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 환자에게 1x105 내지 1x1018의 바이러스 입자(virus particle), 감염능을 가지는 바이러스 단위(TCID50) 또는 플라크 형성 단위(pfu)의 백시니아 바이러스를 투여할 수 있다. 구체적으로는, 1x105, 2x105, 5x105, 1x106, 2x106, 5x106, 1x107, 2x107, 5x107, 1x108, 2x108, 5x108, 1x109, 2x109, 5x109, 1x1010, 5x1010, 1x1011, 5x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x1015, 1x1016, 1x1017 또는 그 이상의 바이러스 입자, 감염능을 가지는 바이러스 단위 또는 플라크 형성 단위의 백시니아 바이러스를 투여하는 것으로써, 상기 사이에 다양한 수 및 범위를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 백시니아 바이러스는 1x105 내지 1x1010 pfu 용량으로 투여될 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 백시니아 바이러스는 1x105 이상, 1x109 pfu 미만의 용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 상기 백시니아 바이러스를 1x105 또는 1x107 pfu로 투여하였다.
또한, 상기 히드록시유레아는 1 mg/kg/day 내지 100 mg/kg/day 또는 10 mg/kg/day 내지 90 mg/kg/day 용량으로 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 히드록시유레아의 투여량은 10 mg/kg/day 내지 90 mg/kg/day, 15 mg/kg/day 내지 80 mg/kg/day, 20 mg/kg/day 내지 70 mg/kg/day, 25 mg/kg/day 내지 65 mg/kg/day 또는 30 mg/kg/day 내지 60 mg/kg/day로 투여할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 상기 히드록시유레아를 30 mg/kg/day 또는 60 mg/kg/day 로 투여하였다. 투여량에 따라 하루에 여러 번 나누어 투여될 수 있다. 구체적으로, 1일 1회 내지 4회, 또는 1일 1회 내지 2회 나누어 투여될 수 있다.
상기 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있다. 구체적으로, 상기 혈액암은 림프종, 급성 백혈병 및 다발성 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 상기 고형암은 폐암, 대장암, 전립선암, 갑상선암, 유방암, 뇌암, 두경부암, 식도암, 피부암, 흉선암, 위암, 결장암, 간암, 난소암, 자궁암, 방광암, 직장암, 담낭암, 담도암, 췌장암 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 생리적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 통상의 방법에 따라 주사제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 비경구 투여를 위한 제제로서 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물의 투여경로, 투여량 및 투여횟수는 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여방법, 투여량 및 투여횟수는 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
상기 약학 조성물은 비경구적으로 투여될 수 있는데, 종양내(intratumoral), 복강내(intraperitoneal), 피하(sub-cutaneous), 피내(intra-dermal), 림프절내(intra-nodal), 동맥 내 및 정맥 내(intra-venous) 등에 적당한 방법에 의해서 투여될 수 있다. 바람직하게는, 종양 내 투여, 복강 투여 또는 정맥 투여 일 수 있다. 한편, 상기 약학 조성물의 투여량은 투여 스케줄, 투여량 및 환자의 건강 상태 등에 따라 결정될 수 있다.
상기 암 치료용 약학 조성물은 상기 백시니아 바이러스의 암 선택성이 증가된 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은, 백시니아 바이러스를 유효성분으로 포함하는 제1조성물 및 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 제2조성물을 포함하는 암 예방 또는 치료용 키트를 제공한다.
상기 백시니아 바이러스는 약학 조성물에서 상술한 바와 같다.
상기 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 제2조성물은 상업화된 약제일 수 있다. 상기 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 상업화된 약제는 Hydroxyurea®, Hydrea®, Droxia™, Mylocel™, Siklos® 하이드린캡슐일 수 있다. 상기 제2조성물은 경구로도 복용할 수 있으며, 비경구 투여도 가능하다.
상기 백시니아 바이러스의 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 환자에게 1x105 내지 1x1018의 바이러스 입자(virus particle), 감염능을 가지는 바이러스 단위(TCID50) 또는 플라크 형성 단위(pfu)의 백시니아 바이러스를 투여할 수 있다. 구체적으로는, 1x105, 2x105, 5x105, 1x106, 2x106, 5x106, 1x107, 2x107, 5x107, 1x108, 2x108, 5x108, 1x109, 2x109, 5x109, 1x1010, 5x1010, 1x1011, 5x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x1015, 1x1016, 1x1017 또는 그 이상의 바이러스 입자, 감염능을 가지는 바이러스 단위 또는 플라크 형성 단위의 백시니아 바이러스를 투여하는 것으로써, 상기 사이에 다양한 수 및 범위를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 백시니아 바이러스는 1x105 내지 1x1010 pfu 용량으로 투여될 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 백시니아 바이러스는 1x105 내지 1x109 pfu 미만의 용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 상기 제1조성물을 1x105 또는 1x107pfu로 투여하였다.
또한, 상기 제2조성물의 투여량은 1 mg/kg/day 내지 100 mg/kg/day 또는 10 mg/kg/day 내지 90 mg/kg/day 용량으로 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 제2조성물의 투여량은 10 mg/kg/day 내지 90 mg/kg/day, 15 mg/kg/day 내지 80 mg/kg/day, 20 mg/kg/day 내지 70 mg/kg/day, 25 mg/kg/day 내지 65 mg/kg/day 또는 30 mg/kg/day 내지 60 mg/kg/day 로 투여할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 상기 제2조성물을 30 mg/kg/day 또는 60 mg/kg/day로 투여하였다. 투여량에 따라 하루에 여러 번 나누어 투여될 수 있다. 구체적으로, 1일 1회 내지 4회, 또는 1일 1회 내지 2회 나누어 투여될 수 있다.
상기 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있다. 구체적으로, 상기 혈액암은 림프종, 급성 백혈병 및 다발성 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 상기 고형암은 폐암, 대장암, 전립선암, 갑상선암, 유방암, 뇌암, 두경부암, 식도암, 피부암, 흉선암, 위암, 결장암, 간암, 난소암, 자궁암, 방광암, 직장암, 담낭암, 담도암, 췌장암 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 제1조성물 및 제2조성물은 생리적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트에 포함되는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 통상의 방법에 따라 주사제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 제1조성물 및 제2조성물은 비경구 투여를 위한 제제로서 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 제1조성물 및 제2조성물의 투여경로, 투여량 및 투여횟수는 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여방법, 투여량 및 투여횟수는 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
상기 제2조성물은 경구 투여될 수 있으며, 비경구적으로 투여될 수 있다. 구체적으로 상기 제2조성물은 비경구적으로 투여될 수 있는데, 복강내(intraperitoneal), 동맥 내 또는 정맥 내(intra-venous) 투여될 수 있다.
상기 제1조성물은 비경구적으로 투여될 수 있는데, 종양내(intratumoral), 복강내(intraperitoneal), 피하(sub-cutaneous), 피내(intra-dermal), 림프절내(intra-nodal), 동맥 내 및 정맥 내(intra-venous) 등에 적당한 방법에 의해서 투여될 수 있다. 바람직하게는, 종양 내 투여, 복강 투여 또는 정맥 투여 일 수 있다. 한편, 상기 제1조성물 및 제2조성물의 투여량은 투여 스케줄, 투여량 및 환자의 건강 상태 등에 따라 결정될 수 있다.
또한, 상기 제1조성물은 1회 내지 10회 또는 2회 내지 5회 투여할 수 있으며, 7일 내지 30일 간격으로 개체에 투여할 수 있다. 구체적으로, 상기 제1조성물은 7일, 14일, 21일 또는 30일 간격으로 투여할 수 있다.
상기 제2조성물은 제1조성물을 투여하기 전 또는 투여한 후에 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 제2조성물은 제1조성물 투여 3일 내지 5일 전부터 1일 1회 연속적으로 투여할 수 있으며, 제1조성물 투여한 후 24시간 이내 또는 24시간 후부터, 9일 내지 28일 동안 연속적으로 1일 1회 투여할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 제1조성물 투여 전 1일 내지 3일 전부터 1일 1회 연속적으로 투여하였으며, 제1조성물 투여 후 13일, 17일, 18일 또는 28일 동안 제2조성물을 1일 1회 투여하였다.
본 발명의 또 다른 측면은 암이 발병된 개체에게 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아를 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법을 제공한다.
상기 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브, NYVAC, Wyeth, LC16m8, 리스터, 코펜하겐, 티안탄, USSR, 타쉬켄트, 에반스, IHD-J 또는 IHD-W 백시니아 바이러스 종(strain)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아는 동시, 순차적, 또는 역순으로 병용 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아는 동시에 투여될 수 있다. 또한, 상기 히드록시유레아를 먼저 투여한 후 상기 백시니아 바이러스를 투여할 수 있다. 나아가, 상기 백시니아 바이러스를 먼저 투여한 후 상기 히드록시유레아를 투여할 수 있다. 또한, 상기 히드록시유레아를 먼저 투여한 후 상기 백시니아 바이러스를 투여하고 다시 상기 히드록시유레아를 투여할 수 있다.
상기 백시니아 바이러스의 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 환자에게 1x105 내지 1x1018의 바이러스 입자(virus particle), 감염능을 가지는 바이러스 단위(TCID50) 또는 플라크 형성 단위(pfu)의 백시니아 바이러스를 투여할 수 있다. 구체적으로는, 1x105, 2x105, 5x105, 1x106, 2x106, 5x106, 1x107, 2x107, 5x107, 1x108, 2x108, 5x108, 1x109, 2x109, 5x109, 1x1010, 5x1010, 1x1011, 5x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x1015, 1x1016, 1x1017 또는 그 이상의 바이러스 입자, 감염능을 가지는 바이러스 단위 또는 플라크 형성 단위의 백시니아 바이러스를 투여하는 것으로써, 상기 사이에 다양한 수 및 범위를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 백시니아 바이러스는 1x105 내지 1x1010 pfu 용량으로 투여될 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 백시니아 바이러스는 1x105 이상, 1x109 pfu 미만의 용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 상기 백시니아 바이러스를 1x105 또는 1x107 pfu로 투여하였다.
또한, 상기 히드록시유레아는 1 mg/kg/day 내지 100 mg/kg/day 또는 10 mg/kg/day 내지 90 mg/kg/day 용량으로 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 히드록시유레아의 투여량은 10 mg/kg/day 내지 90 mg/kg/day, 15 mg/kg/day 내지 80 mg/kg/day, 20 mg/kg/day 내지 70 mg/kg/day, 25 mg/kg/day 내지 65 mg/kg/day 또는 30 mg/kg/day 내지 60 mg/kg/day로 투여할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 상기 히드록시유레아를 30 mg/kg/day 또는 60 mg/kg/day로 투여하였다. 투여량에 따라 하루에 여러 번 나누어 투여될 수 있다. 구체적으로, 1일 1회 내지 4회, 또는 1일 1회 내지 2회 나누어 투여될 수 있다.
또한, 상기 백시니아 바이러스는 1회 내지 10회 또는 2회 내지 5회 투여할 수 있으며, 7일 내지 30일 간격으로 개체에 투여할 수 있다. 구체적으로, 상기 백시니아 바이러스는 7일, 14일, 21일 또는 30일 간격으로 투여할 수 있다.
상기 히드록시유레아는 백시니아 바이러스 투여 전, 중 또는 후에 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 히드록시유레아는 백시니아 바이러스를 투여하기 전 또는 투여한 후에 투여될 수 있다. 상기 히드록시유레아는 백시니아 바이러스 투여 3일 내지 5일 전부터 1일 1회 연속적으로 투여할 수 있으며, 백시니아 바이러스 투여 후 24시간 후부터, 9일 내지 28일 동안 연속적으로 1일 1회 투여할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 히드록시유레아를 백시니아 바이러스 투여 전 1일 내지 3일 전부터 1일 1회 연속적으로 투여하였으며, 백시니아 바이러스 투여 후 13일, 17일, 18일 또는 28일 동안 1일 1회 투여하였다.
상기 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있다. 구체적으로, 상기 혈액암은 림프종, 급성 백혈병 및 다발성 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 상기 고형암은 폐암, 대장암, 전립선암, 갑상선암, 유방암, 뇌암, 두경부암, 식도암, 피부암, 흉선암, 위암, 결장암, 간암, 난소암, 자궁암, 방광암, 직장암, 담낭암, 담도암, 췌장암 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 히드록시유레아는 경구 투여될 수 있으며, 비경구적으로 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 히드록시유레아는 비경구적으로 투여될 수 있는데, 복강내(intraperitoneal), 동맥 내 또는 정맥 내(intra-venous) 투여될 수 있다.
상기 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아는 비경구적으로 투여될 수 있는데, 종양 내(intratumoral), 복강내(intraperitoneal), 피하(sub-cutaneous), 피내(intra-dermal), 림프절내(intra-nodal), 동맥 내 및 정맥 내(intra-venous) 등에 적당한 방법에 의해서 투여될 수 있다. 바람직하게는, 종양 내 투여, 복강 투여 또는 정맥 투여 일 수 있다. 한편, 상기 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아의 투여량은 투여 스케줄, 투여량 및 환자의 건강 상태 등에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "개체"란, 본 발명의 약학 조성물을 투여하여 질환이 경감, 억제 또는 치료될 수 있는 상태이거나 암을 앓고 있는 사람을 의미한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "투여"란, 적절한 방법으로 개체에 유효량의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아의 투여 경로는 목표 조직에 도달할 수 있는 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.
또한, 상기 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아는 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 암을 예방 또는 치료하기 위한 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 암 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 항암보조제를 제공한다. 이때, 상기 히드록시유레아는 약학 조성물에서 상술한 바와 동일하다. 또한, 상기 항암보조제는 백시니아 바이러스를 유효성분으로 포함하는 항암제의 항암보조제로서 사용되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 상기 항암보조제는 백시니아 바이러스의 항암활성을 개선, 향상 또는 증대시키는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 상기 항암보조제는 백시니아 바이러스의 암 선택성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예로 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 재조합 백시니아 바이러스 제조(Wyeth VV tk- , WR VV tk- )
제조예 1.1. 셔틀 플라스미드 벡터 제조
티미딘 키나아제(TK) 유전자가 결실된 재조합 백시니아 바이러스를 제조하기 위해, ATCC(American Type Culture Collection)에서 야생형 백시니아 바이러스 Wyeth 종(NYC Department of Health) 및 웨스턴 리저브 종을 구입하였다. 재조합을 위해 야생형 백시니아 바이러스의 TK 부위를 firefly luciferase reporter(p7.5 promoter) 유전자를 가진 셔틀 플라스미드 또는 GFP 유전자를 가진 셔틀 플라스미드를 벡터를 사용하여 치환하였다.
제조예 1.2. 재조합 백시니아 바이러스 제조
재조합 바이러스를 확보하기 위하여, Hela 세포(ATCC)를 6-웰 플레이트에 4x105 세포/웰 조건 및 10% 우태아 혈청이 포함된 EMEM 배지에 배양하였다. 그 후, 야생형 백시니아 바이러스 0.05 MOI를 처리하고, 2시간 후, 2% 우태아 혈청이 포함된 EMEM 배지로 교체하였다. 그 후, 상기 제조예 1.1에서 제작한 선형화시킨 셔틀 플라스미드 벡터 4 ㎍을 XfectTM polymer(Clonetech 631317, USA)를 이용하여 형질주입하였다. 4시간 배양 후, 세포를 2% 우태아 혈청이 포함된 EMEM 배지로 교체한 후 72시간 추가 배양하였다. 최종적으로, 감염된 세포를 회수한 다음 동결 및 해동을 3회 반복 후 초음파분쇄로 세포를 용해시키고, 수크로오스 쿠션 방법(sucrose cushion method)으로 분리된 재조합 백시니아 바이러스를 확보하였고 이를 Wyeth VVtk-, WR VVtk-로 명명하였다.
제조예 2. 재조합 백시니아 바이러스 제조(OTS-412)
티미딘 키나아제(TK) 유전자가 결실되고, 헤르페스 심플텍스 바이러스의 변이된 티미딘 키나아제(HSV-TK) 유전자를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스를 제조하기 위해, Wyeth 종 야생형 백시니아 바이러스의 TK 부위를 서열번호 1의 변이된 1형 HSV-TK 유전자(pSE/L promoter)와 firefly luciferase reporter(p7.5 promoter) 유전자를 합성하여 pUC57amp+ 플라스미드(Genewiz, USA)에 재조합하여 셔틀벡터로 사용하여 치환하였다. 상기 제조한 셔틀 벡터를 이용하여 상기 제조예 1.2와 동일한 방법으로 재조합 백시니아 바이러스를 확보하였고, 이를 OTS-412로 명명하였다.
제조예 3. 재조합 백시니아 바이러스 제조(WOTS-418)
티미딘 키나아제(TK) 유전자가 결실되고, 헤르페스 심플텍스 바이러스의 변이된 티미딘 키나아제(HSV-TK) 유전자를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스를 제조하기 위해, 웨스턴 리저브 종 야생형 백시니아 바이러스의 TK 부위를 서열번호 2의 변이된 1형 HSV-TK 유전자(pSE/L promoter)와 firefly luciferase reporter(p7.5 promoter) 유전자를 합성하여 pUC57amp+ 플라스미드(Genewiz, USA)에 재조합하여 셔틀벡터로 사용하여 치환하였다. 상기 제조한 셔틀 벡터를 이용하여 상기 제조예 1.2와 동일한 방법으로 재조합 백시니아 바이러스를 확보하였고, 이를 WOTS-418로 명명하였다.
제조예 4. 재조합 백시니아 바이러스 제조(WR VV_DD)
티미딘 키나아제(TK) 유전자 및 백시니아 성장인자(VGF) 유전자가 결실된 재조합 백시니아 바이러스를 제조하기 위해, 웨스턴 리저브 종 야생형 백시니아 바이러스의 TK 부위에 EGFP(enhanced green fluorescent protein) 유전자를 포함하는 셔틀플라스미드를 이용해 치환하고, VGF 유전자 부위에 lacZ 유전자를 포함하는 셔틀플라스미드를 이용해 치환하였다. 상기 EGFP 유전자를 포함하는 셔틀 플라스미드 및 lacZ 유전자를 포함하는 셔틀플라스미드를 이용하여 상기 제조예 1.2와 동일한 방법으로 재조합 백시니아 바이러스를 확보하였고, 이를 VV_DD로 명명하였다.
실험예 1. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 야생형 백시니아 바이러스(WR) 및 히드록시유레아의 항암치료 효과 확인: Renca(I)
실험예 1.1. 마우스 신장암세포 식립 마우스 제조 및 약물 투여
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 10주)를 2일의 적응기간을 거친 후에 5x106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)를 피하이식 하였다. 종양의 크기가 50 mm3 내지 80 mm3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 야생형 백시니아 바이러스 투여를 시작하였다. 한편, 웨스턴 리저브 종 야생형 백시니아 바이러스(WR)는 Wyeth 종 야생형 백시니아 바이러스에 비해 동종이식 모델에서 증식력이 더 강하다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 3개 그룹(n=6)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, 야생형 백시니아 바이러스(WR, 1x105 pfu)를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 야생형 백시니아 바이러스(WR, 1x105 pfu) 및 히드록시유레아(30 mg/kg)를 병용투여받은 그룹을 실험군으로 설정하였다. 야생형 백시니아 바이러스는 종양 내 1회 투여하였고, 히드록시유레아는 야생형 백시니아 바이러스 투여 1일 전부터 투여 후 14일까지 야생형 백시니아 바이러스를 투여하는 날을 제외하고 5회/주 복강 내 투여하였다.
실험예 1.2. 종양의 크기 변화 확인
실험예 1.1의 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 0일, 3일, 7일, 10일 및 14일째에 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과, 양성대조군 마우스의 종양의 크기도 음성대조군에 비해 억제되었으나, 실험군 마우스의 종양의 크기가 현저하게 억제되는 것을 확인하였다(도 1).
실험예 1.3. 체중 변화 확인
실험예 1.1의 음성대조군, 양성대조군 및 실험군에 각각의 약물을 투여한 후 3일, 7일, 10일 및 14일째에 마우스의 체중을 측정하였다. 그 결과, 세 군 모두 유의미한 체중 감소가 나타나지 않았다(도 2).
실험예 2. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(WR VV tk- ) 및 히드록시유레아의 항암치료 효과 확인: Renca(II)
실험예 2.1. 마우스 신장암세포 식립 마우스 제조 및 약물 투여
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 8주)를 일주일의 적응기간을 거친 후에 5x106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 100 mm3 내지 150 mm3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 재조합 백시니아 바이러스 투여를 시작하였다. 한편, 웨스턴 리저브 종 유래 재조합 백시니아 바이러스(WR, VVtk-)는 Wyeth 종 유래 재조합 백시니아 바이러스에 비해 동종이식 모델에서 증식력이 더 강하다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 3개 그룹(n=8)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, 재조합 백시니아 바이러스(WR VVtk-, 1x107 pfu)를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 상기 재조합 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아(60 mg/kg)를 병용투여받은 그룹을 실험군으로 설정하였다. 재조합 백시니아 바이러스는 복강 내 2회 투여하였고, 히드록시유레아는 재조합 백시니아 바이러스 투여 1일 전부터 투여 후 21일까지 재조합 백시니아 바이러스를 투여하는 날을 제외하고 6회/주 복강 내 투여하였다.
실험예 2.2. 종양의 크기 변화 확인
상기 실험예 2.1의 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 0일, 3일, 7일, 10일, 14일 17일 및 21일째에 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과, 실험군의 마우스의 종양의 크기가 양성대조군의 마우스의 종양의 크기에 비해 유의하게 억제되는 것을 확인하였다(도 3).
실험예 3. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(WR VV tk- ) 및 히드록시유레아의 항암치료 효과 확인: Renca(III)
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 10주)를 2일의 적응기간을 거친 후에 5x106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)를 왼쪽 넓적다리에 피하이식하였다. 종양의 크기가 50 mm3 내지 150 mm3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 재조합 백시니아 바이러스 투여를 시작하였다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 3개 그룹(n=6)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, 재조합 백시니아 바이러스(WR VVtk-, 1x105 pfu)를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 상기 재조합 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아(30 mg/kg)를 병용투여받은 그룹을 실험군으로 설정하였다. 재조합 백시니아 바이러스는 종양 내 1회 투여하였고, 히드록시유레아는 재조합 백시니아 바이러스 투여 1일 전부터 투여 후 14일까지 재조합 백시니아 바이러스를 투여하는 날을 제외하고 6회/주 복강 내 투여하였다.
상기 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 0일, 3일, 7일, 10일 및 14일째에 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과, 실험군 마우스의 종양의 크기가 양성대조군 마우스의 종양의 크기에 비해 약 25% 정도 성장이 억제되는 것을 확인하였다(도 4).
실험예 4. 마우스 흑색종 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(WR VV_DD) 및 히드록시유레아의 항암치료 효과 확인: B16F10
코어텍(Koatech, Korea)에서 분양 받은 C57BL/6 마우스(암컷, 7주)를 2일의 적응기간을 거친 후에 5x105 세포수의 마우스 흑색종 암세포주(ATCC, B16F10)를 피하이식 하였다. 종양의 크기가 50 mm3 내지 100 mm3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 재조합 백시니아 바이러스(WR VV_DD) 투여를 시작하였다. 상기 재조합 백시니아 바이러스(WR VV_DD)는 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스의 TK(thymidine kinase)와 VGF(vaccinia growth factor) 부분을 이중 결실시킨 것이며 동종이식 모델에서 증식이 제한적으로 가능하다.
상기 제작한 마우스 흑색종 식립 마우스를 4개 그룹(n=6)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, 히드록시유레아(30 mg/kg) 또는 재조합 백시니아 바이러스(VV_DD, 1x106 pfu)를 단독 투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 상기 재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아(30 mg/kg)를 병용투여받은 그룹을 실험군으로 설정하였다. 재조합 백시니아 바이러스는 0일 및 5일째에 복강 내 투여하였고, 히드록시유레아는 재조합 백시니아 바이러스 투여 1일전부터 투여 후 15일까지 재조합 백시니아 바이러스를 투여하는 날을 제외하고 6회/주 복강 내 투여하였다.
상기 각 군의 마우스에 약물을 투여하기 1일 전, 투여 후 4일 및 7일째에 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과, 실험군의 마우스의 종양의 크기가 양성대조군의 마우스의 종양의 크기에 비해 유의하게 억제되는 것을 확인하였다(도 5). 이를 통해, 재조합 백시니아 바이러스(VV_DD)와 히드록시유레아를 병용투여하는 경우 시너지 효과가 나타나는 것을 확인하였다.
실험예 5. 인간 폐암 세포주 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(WOTS-418) 및 및 히드록시유레아의 항암치료 효과 확인: NCI-H460
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c nu/nu 마우스(암컷, 7주)를 2일의 적응기간을 거친 후에 5x106 세포수의 NCI-H460 인간 폐암 암세포주(한국세포주은행)를 피하로 이종이식(xenograft)을 하였다. 종양의 크기가 100 mm3 내지 150 mm3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 재조합 백시니아 바이러스(WOTS-418) 투여를 시작하였다. 한편, 웨스턴 리저브 종 유래 재조합 백시니아 바이러스(WOTS-418)는 인간 폐암 세포주(NCI-H460) 이종이식 마우스에서 증식이 가능하다.
상기 제작한 인간 폐암 세포주 식립 마우스를 2개 그룹(n=4)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여받는 그룹을 대조군으로 설정하였으며, 상기 재조합 백시니아 바이러스(WOTS-418, 1x107 pfu)와 히드록시유레아(30 mg/kg)를 병용투여받은 그룹을 실험군으로 설정하였다. 재조합 백시니아 바이러스는 복강 내 1회 투여하였고, 히드록시유레아는 재조합 백시니아 바이러스 투여 1일 전부터 투여 후 15일까지 재조합 백시니아 바이러스를 투여하는 날을 제외하고 6회/주 복강 내 투여하였다.
상기 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 0일, 5일, 10일, 12일 및 15일째에 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과, 실험군 마우스의 종양의 크기가 대조군에 비해 약 40% 정도 억제되는 것을 확인하였다(도 6).
실험예 6. 마우스 대장암 세포주 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(WOTS-418) 및 히드록시유레아의 생존율 분석: CT-26
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 7주)를 2일의 적응기간을 거친 후에 1x106 세포수의 마우스 대장암 세포주(CT-26, 한국세포주은행)를 피하이식 하였다. 7일 뒤 재조합 백시니아 바이러스(WOTS-418) 및 히드록시유레아 투여를 시작하였다. 한편, 웨스턴 리저브 종 유래 재조합 백시니아 바이러스(WOTS-418)는 Wyeth 종 유래 재조합 백시니아 바이러스에 비해 동종이식 모델에서 증식력이 더 강하다.
상기 제작한 마우스 대장암 세포주 식립 마우스를 2개 그룹(n=12)으로 분류하였다. 재조합 백시니아 바이러스(WOTS-418, 1x107 pfu)를 복강 내 투여받은 그룹과 재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아(30 mg/kg)를 병용투여받은 그룹으로 분류하였다. 재조합 백시니아 바이러스는 복강 내 1회 투여하였고, 히드록시유레아는 재조합 백시니아 바이러스 투여 1일 후부터 5회 연속 복강 내 투여하였다.
상기 각 그룹의 마우스의 생존곡선을 분석한 결과, 재조합 백시니아 바이러스를 단독투여받은 그룹의 경우 25일 뒤 모든 마우스가 사망하였으나, 히드록시유레아와 재조합 백시니아 바이러스를 병용투여받은 마우스는 30% 이상 55일 이상 생존하였다(도 7). 이를 통해, 재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아를 병용투여하는 경우, 재조합 백시니아 바이러스만 투여하는 경우에 비해 안전성이 향상되는 것을 확인하였다.
실험예 7. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VV tk- ) 및 히드록시유레아(hydroxyurea)의 항암치료 효과 확인: Renca(IV)
실험예 7.1. 마우스 신장암세포 식립 마우스 제조 및 약물 투여
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 7주)를 2일의 적응기간을 거친 후에 5x106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식(allograft)을 수행하였다. 종양의 크기가 100 mm3 내지 150 mm3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 재조합 백시니아 바이러스 투여를 시작하였다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 4개 그룹(n=4)으로 분류하였다. 식염수를 종양 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VVtk-, 1x107 pfu)를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VVtk-, 1x107 pfu) 및 재조합형 인간 과립구 집단 자극 인자(Recombinant human granulocyte colony-stimulating factor, rh-G-CSF, 75 ㎍/kg)를 투여받는 그룹과 재조합 바이러스(VVtk-, 1x107 pfu)와 히드록시유레아(30 mg/kg)를 투여받는 그룹을 실험군으로 설정하였다. 재조합 백시니아 바이러스는 종양 내 투여하였으며, rh-G-CSF 또는 히드록시유레아는 재조합 백시니아 바이러스 투여 3일 전부터 희생시키기 전까지 5회/주 복강 내 투여하였다.
실험예 7.2. 종양의 크기 변화 확인
실험예 7.1의 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 16일째에 희생시켜 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과, 양성대조군 마우스와 재조합 백시니아 바이러스와 rh-G-CSF를 병용투여받은 실험군의 마우스는 초기 종양의 크기에서 약 10배 가까이 증가하였다. 재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아를 병용 투여받은 실험군 마우스는 초기 종양의 크기에서 약 8배 가까이 증가하였고, 종양의 크기가 가장 억제된 것을 관찰하였다(도 8).
실험예 7.3. CTL(Antigen-specific Cytotoxic T Lymphocyte) 활성화 확인
재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아를 병용투여할 경우, 종양 특이적인 항암효과가 형성되는지 확인하기 위해, 실험예 7.1의 16일째 각 그룹의 마우스를 희생시킨 뒤 그룹별로 비장 내 림프구 세포를 분리하였다. 그 후, 분리한 림프구 세포를 각각 새로운 정상 마우스에 주입하고 암을 식립하여 종양의 크기를 관찰하였다. 1주일 후, 5x106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식(allograft)을 수행하였으며, 19일째에 종양의 크기를 측정하였다.
그 결과, 재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아를 병용투여받은 군의 마우스로부터 채취한 비장세포를 주입한 마우스에서 종양의 성장이 현저하게 억제되었다. 반면, 나머지 군의 마우스로부터 채취한 비장세포를 각각 주입한 마우스에서는 종양의 성장이 유의미하게 억제되지 않았다(도 9). 이를 통해, 재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아를 병용투여한 그룹에서 세포독성 T세포와 같은 면역세포가 형성되었을 뿐만 아니라, 적응면역을 활성화 시키는 것을 확인하였다.
실험예 8. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VV tk- ) 및 히드록시유레아의 항암치료 효과 확인: Renca(V)
실험예 8.1. 마우스 신장암세포 식립 마우스 제조 및 약물 투여
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 7주)를 7일의 적응기간을 거친 후에 5x106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 50 mm3 내지 100 mm3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 재조합 백시니아 바이러스를 투여하였다. 한편, Wyeth 종 유래 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VVtk-)는 마우스 신장암세포-식립 마우스 모델에서 거의 증식하지 못한다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 4개 그룹(n=4)으로 분류하였다. 식염수를 종양 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, 히드록시유레아(30 mg/kg)만 투여받은 그룹과 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VVtk-, 1x107 pfu) 만 투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VVtk-, 1x107 pfu)와 히드록시유레아(30 mg/kg)를 병용투여받는 그룹을 실험군으로 설정하였다. 재조합 백시니아 바이러스는 종양 내 투여하였으며, 히드록시유레아는 재조합 백시니아 바이러스 투여 3일 전부터 희생시키기 전까지 5회/주 복강 내 투여하였다.
실험예 8.2. 종양의 크기 변화 확인
실험예 8.1의 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 0일, 4일, 10일 15일 및 22일째에 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과, 양성대조군 마우스의 종양의 크기는 초기 종양의 크기에 비해 약 11배 내지 13배 정도 증가하였다. 반면, 실험군 마우스의 종양의 크기는 초기 종양의 크기에 비해 약 4배 정도 증가 되었다(도 10).
실험예 8.3. CTL(tumor-specific Cytotoxic T Lymphocyte) 활성화 확인
재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아를 병용투여할 경우, 종양 특이적인 항암효과가 형성되는지 확인하기 위해, 실시예 8.1의 16일째 각 그룹의 마우스를 희생시킨 뒤 그룹별로 비장세포(splenocyte) 및 세포독성 T 림프구(CD8+ T cell)세포를 분리하였다. 그 후, 분리한 비장세포 또는 세포독성 T 림프구 세포를 각각 새로운 정상 마우스에 주입하고 암을 식립하여 종양의 크기를 관찰하였다. 1주일 후, 5x106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였으며, 7일, 10일, 14일, 18일 및 21일째에 종양의 크기를 측정하였다.
그 결과, 실험군 마우스로부터 채취한 비장세포 또는 T 림프구를 주입한 마우스에서 종양의 성장이 현저하게 억제되었다. 반면, 나머지 군의 마우스로부터 채취한 비장세포 또는 T 림프구를 주입한 마우스에서는 종양의 성장이 유의미하게 억제되지 않았다(도 11). 이를 통해, 재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아를 병용투여한 그룹에서 T 림프구뿐만 아니라 비장에서 형성된 다른 면역세포에 의해서도 항암 효능을 가진 적응면역이 활성화되는 것을 확인하였다(도 11 및 도 12).
실험예 9. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VV tk- ) 및 히드록시유레아의 항암치료 효과 확인: Renca(VI)
실험예 9.1. 마우스 신장암세포 식립 마우스 제조 및 약물 투여
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 8주)를 7일의 적응기간을 거친 후에 5x106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 100 mm3 내지 150 mm3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 재조합 백시니아 바이러스를 투여하였다. 한편, Wyeth 종 유래 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VVtk-)는 마우스 신장암세포-식립 마우스 모델에서 거의 증식하지 못한다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 3개 그룹(n=6)으로 분류하였다. 식염수를 종양 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 하였으며, 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VVtk-, 1x107 pfu)를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VVtk-, 1x107 pfu)와 히드록시유레아(30 mg/kg)를 투여받는 그룹을 실험군으로 설정하였다. 재조합 백시니아 바이러스는 종양 내 투여하였으며, 히드록시유레아는 재조합 백시니아 바이러스 투여 1일 전부터 희생시키기 전까지 6회/주 복강 내 투여하였다.
실험예 9.2. 종양의 크기 변화 확인
실험예 9.1의 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 22일째에 희생시켜 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과, 양성대조군 마우스의 종양의 크기가 음성대조군 마우스의 종양의 크기에 비해 약 25% 정도 억제되었다. 특히, 실험군 마우스의 종양의 크기는 음성대조군 마우스의 종양의 크기에 비해 약 37.5% 정도 억제되었으며, 양성대조군 마우스의 종양의 크기에 비해서는 약 15% 정도 더 억제되었다(도 13).
실험예 9.3. 비장조직 미세환경 확인
재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아를 병용투여하였을 때의 종양미세환경 내 면역세포의 분포를 분석하였다. 분석에는 DAB(Diaminobenzidine)를 이용한 면역조직화학염색을 수행하였다. 구체적으로, 각 군의 마우스의 비장을 채취하여 비장 조직을 0.4 ㎛로 자르고 건조시켰다. 그 후, PBS로 조직을 세척한 후 BSA(bovine serum albumin) 처리하고, 1차 항체(항-CD3 항체(Abcam), 항-CD4 항체(BD Biosciences), 항-CD8 항체(BD Biosciences))를 1:50 비율로 희석하여 조직에 처리하고 4℃ 온도에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 다음날, PBS로 조직을 세척한 후, 2차 항체(Dako)를 30분간 실온에서 반응시켰다. 다시 조직을 PBS로 세척한 후, ABC kit(Dako)를 이용하여 반응을 시킨 후 H2O2를 가하여 발색을 한 후 탈수(Dehydration) 과정을 거친 후 봉입하였다.
그 결과, 실험군 마우스의 종양 조직에서 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포가 더 많이 분포하는 것을 확인하였다(도 14). 이를 통해, 재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아를 병용투여하는 경우, 재조합 백시니아 바이러스만을 투여하였을 때 보다, 비장조직 내 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포가 더 분화 및 활성화되는 것을 확인하였다. 즉, 이는 재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아를 병용투여하는 경우가 재조합 백시니아 바이러스만을 투여하는 경우보다 적응면역을 더 잘 활성화시키는 것을 확인한 것이다.
실험예 10. 마우스 유방암세포 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(OTS-412) 및 히드록시유레아의 CTL(Antigen-specific Cytotoxic T Lymphocyte) 활성화 확인: 4T1(I)
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 7주)를 7일의 적응기간을 거친 후에 1x106 세포수의 4T1 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 100 mm3 내지 150 mm3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 재조합 백시니아 바이러스를 투여하였다. 한편, Wyeth 종 유래 재조합 백시니아 바이러스(OTS-412)는 유방암세포주-식립 마우스 모델에서 거의 증식하지 못한다. 또한, 유방암세포주 식립 마우스는 폐조직을 포함한 전신으로의 전이가 진행되는 동물모델이며, 일반적으로 종양 표면의 소결절(nodule)의 수로써 전이를 평가한다.
상기 제작한 마우스 유방암세포 식립 마우스를 4개 그룹으로 분류하였다(n=5). 식염수를 종양 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, 재조합 백시니아 바이러스(OTS-412, 1x107 pfu) 또는 히드록시유레아(30 mg/kg)를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 하였다. 재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아를 병용투여한 그룹을 실험군으로 설정하였다. 재조합 백시니아 바이러스는 종양 내 첫번째 투여한 뒤 7일째 두번째 투여하였다. 히드록시유레아는 재조합 백시니아 바이러스 투여 3일 전부터 희생시키기 3일 전까지 재조합 백시니아 바이러스를 투여하는 날을 제외하고 1일 1회 복강 내 투여하였다.
약물을 투여한 후 18일째에 각 군의 마우스를 희생시켜 혈액과 비장을 채취하여 혈중 면역세포와 비장세포 내 면역세포의 분포를 유동세포분석법(Flowcytometry)으로 분석하였다. 그 결과, 종양 면역반응을 유도하는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 혈액 및 비장에서의 분포가 실험군 마우스에서 가장 높게 나타나는 것을 확인하였다. 또한, 면역억제 기능을 하는 골수유래면역억제세포(Myeloid derived suppressor cells, MDSC)가 실험군 마우스에서 음성대조군 및 양성대조군 마우스에 비해 현저히 낮은 것을 확인하였다(도 15).
실험예 11. 마우스 유방암세포 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(WR VV tk- ) 및 히드록시유레아의 적응면역 증대 효과 확인: 4T1(II)
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 10주)를 2일의 적응기간을 거친 후에 1x106 세포수의 4T1 암세포주(한국세포주은행)를 왼쪽 넓적다리에 피하이식 하고, 이틀 뒤 오른쪽 넓적다리에 같은 수의 4T1 암세포주를 피하이식 하였다. 왼쪽 넓적다리에 피하이식한 종양의 크기가 50 mm3 내지 200 mm3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 재조합 백시니아 바이러스 투여를 시작하였다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 3개 그룹(n=6)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, 재조합 백시니아 바이러스(WR VVtk-, 1x105 pfu)를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 상기 재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아(90 mg/kg)를 병용투여받은 그룹을 실험군으로 설정하였다. 재조합 백시니아 바이러스는 왼쪽 종양 내 1회 투여하였고, 히드록시유레아는 재조합 백시니아 바이러스 투여 1일 전부터 투여 후 14일까지 재조합 백시니아 바이러스를 투여하는 날을 제외하고 6회/주 복강 내 투여하였다.
상기 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 0일, 3일, 7일, 10일 및 14일째에 양쪽 넓적다리에 피하이식한 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과, 실험군 마우스의 왼쪽 종양의 크기가 양성대조군 마우스의 왼쪽 종양의 크기에 비해 약 35% 정도 성장이 억제되는 것을 확인하였다(도 16). 또한, 실험군 마우스의 오른쪽 종양의 크기가 양성대조군의 오른쪽 종양의 크기에 비해 약 45% 정도 성장이 억제되는 것을 확인하였다(도 17). 이를 통해, 재조합 백시니아 바이러스 및 히도록시유레아의 병용투여시 주변의 종양에 미치는 효과를 확인한 것이다.
즉, 이는, 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아와 병용투여하여 종양을 국소 치료할 경우, 바이러스를 투여하지 않은 종양에도 항암효과가 나타나는 것을 확인한 것이다.
실험예 12. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(WR VV tk- ) 및 히드록시유레아 병용투여 시 암 선택성 증가 확인(I)
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 8주)를 일주일의 적응기간을 거친 후에 5x106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 100 mm3 내지 150 mm3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 재조합 백시니아 바이러스 투여를 시작하였다. 한편, 웨스턴 리저브 종 유래 재조합 백시니아 바이러스(WR VVtk-)는 Wyeth 종 유래 재조합 백시니아 바이러스에 비해 동종이식 모델에서 증식력이 더 강하다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 3개 그룹(n=8)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, 재조합 백시니아 바이러스(WR VVtk-, 1x107 pfu)를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 상기 재조합 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아(60 mg/kg)를 병용투여받은 그룹을 실험군으로 설정하였다. 재조합 백시니아 바이러스는 복강 내 2회 투여하였고, 히드록시유레아는 재조합 백시니아 바이러스 투여 1일 전부터 투여 후 21일까지 재조합 백시니아 바이러스를 투여하는 날을 제외하고 6회/주 복강 내 투여하였다.
상기 각 군의 마우스를 22일째에 희생시킨 후, 마우스에서 종양을 분리하여 DAB(Diaminobenzidine)를 이용한 면역조직화학염색을 통해 바이러스 증식을 비교하였다. 구체적으로, 각 군의 마우스의 종양조직을 채취하여 종양 조직을 0.4 ㎛로 자르고 건조시켰다. 그 후, PBS로 조직을 세척한 후 BSA(bovine serum albumin) 처리하고, 1차 항체(Cat no. ABIN1606294, Antibodies-Online)를 1:50 비율로 희석하여 조직에 처리하고 4℃ 온도에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 다음날, PBS로 조직을 세척한 후, 2차 항체(Alexa 594, Cat no. A21205, Invitrogen)를 30분간 실온에서 반응시켰다. 다시 조직을 PBS로 세척한 후, ABC kit(Dako)를 이용하여 반응을 시킨 후 H2O2를 가하여 발색을 한 후 탈수(Dehydration) 과정을 거친 후 봉입하였다.
그 결과, 실험군 마우스의 종양조직에서 재조합 백시니아 바이러스가 더 많이 분포하는 것을 확인하였다(도 18). 이를 통해, 재조합 백시니아 바이러스의 전신투여 시 히드록시유레아를 병용투여하게 되면 재조합 백시니아 바이러스의 종양 특이적 증식이 더 효과적인 것을 확인하였다.
실험예 13. 정상 마우스에서의 야생형 백시니아 바이러스(WR) 및 히드록시유레아(hydroxyurea) 병용투여 시 생존율 및 암 선택성 증가 확인(II)
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c nu/nu 마우스(암컷, 7주)를 2일의 적응기간을 거친 후에 야생형 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스(WR) 투여를 시작하였다. 한편, 야생형 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스는 동종(syngeneic)의 마우스에서 증식이 제한적이다.
상기 마우스를 2개 그룹(n=12)으로 분류하였다. 야생형 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스(1x107 pfu)을 투여받는 그룹을 대조군으로 설정하였으며, 야생형 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스와 히드록시유레아(50 mg/kg)를 병용투여한 그룹을 실험군으로 설정하였다. 야생형 백시니아 바이러스는 비강 내(intranasal) 1회 투여하였고, 히드록시유레아는 야생형 백시니아 바이러스 투여 1일 전부터 야생형 백시니아 바이러스를 투여하는 날을 제외하고 5회/주 복강 내 투여하였다.
8일째에 대조군 및 실험군의 마우스를 희생시켜 신장조직과 간조직을 분리하여 면역조직화학염색법을 수행하였다. 파라핀 블럭을 만든 뒤, 자일렌(xylene)과 에틸알콜(ethyl alcohol)을 이용해 탈파라핀화(deparaffinization)하였다. 디클로킹 챔버(decloaking chamber)를 이용해 항원복원과정(antigen retrieval)을 거친 후, 1차 항체(Cat no. ABIN1606294, Antibodies-Online)를 붙이고 FITC가 표지된 2차 항체(Alexa 594, Cat no. A21205, Invitrogen)를 붙인 뒤 형광현미경을 이용해 관찰하였다.
그 결과, 대조군 마우스의 간조직과 신장조직에 비해 실험군 마우스의 간조직과 신장조직에서 바이러스가 적게 분포 및 증식하는 것을 확인하였다(도 19).

Claims (24)

  1. 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브(Western Reserve, WR), NYVAC(New York Vaccinia Virus), Wyeth(The New York City Board of Health; NYCBOH), LC16m8, 리스터(Lister), 코펜하겐(Copenhagen), 티안탄(Tian Tan), USSR, 타쉬켄트(TashKent), 에반스(Evans), IHD-J(International Health Division-J) 또는 IHD-W(International Health Division-White) 백시니아 바이러스 종(strain)인 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 백시니아 바이러스가 야생형 백시니아 바이러스 또는 재조합 백시니아 바이러스인 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 재조합 백시니아 바이러스는 야생형 백시니아 바이러스 유전자 중 적어도 하나가 결실되거나, 외래 유전자가 삽입된 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 야생형 백시니아 바이러스의 유전자는 티미딘 키나아제(thymidine kinase) 유전자, 백시니아 성장인자(vaccinia growth factor) 유전자, F13.5L 유전자, F14.5 유전자, A56R 유전자, B18R 유전자 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  6. 제 4항에 있어서,
    상기 외래 유전자는 HSV-TK(Herpes simplex virus thymidine kinase), 변이 된 HSV-TK, GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), CD(cytosin deaminase), 카르복실에스테라아제(carboxyl esterase) 1형, 카르복실에스테라아제 2형, INF-β(Interferone beta), 소마토스타틴 수용체 2(somatostatin receptor 2) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 코딩하는 유전자인 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 암은 폐암, 대장암, 전립선암, 갑상선암, 유방암, 뇌암, 두경부암, 식도암, 피부암, 흉선암, 위암, 결장암, 간암, 난소암, 자궁암, 방광암, 직장암, 담낭암, 담도암, 췌장암 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 암 치료용 약학 조성물은 상기 백시니아 바이러스의 암 선택성이 증가된 것을 특징으로 하는 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  9. 백시니아 바이러스를 유효성분으로 포함하는 제1조성물 및 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 제2조성물을 포함하는 암 예방 또는 치료용 키트.
  10. 암이 발병된 개체에 히드록시유레아 및 백시니아 바이러스를 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 백시니아 바이러스 및 상기 히드록시유레아가 동시, 순차적, 또는 역순으로 병용 투여되는 것을 특징으로 하는, 암 치료방법.
  12. 제 10항에 있어서,
    상기 히드록시유레아가 백시니아 바이러스 투여 전, 중 또는 후에 투여되는 것인, 암 치료방법.
  13. 제 10항에 있어서,
    상기 히드록시유레아가 백시니아 바이러스 투여 3일 내지 5일 전, 백시니아 바이러스 투여 후, 1일 1회, 9일 내지 28일 동안 연속적으로 투여되는 것인, 암 치료방법.
  14. 제 10항에 있어서,
    상기 히드록시유레아가 10 mg/kg/day 내지 90 mg/kg/day 용량으로 투여되는 것인, 암 치료방법.
  15. 제 10항에 있어서,
    상기 백시니아 바이러스가 1x105 pfu 내지 1x1010 pfu 용량으로 투여되는 것인, 암 치료방법.
  16. 제 10항에 있어서,
    상기 백시니아 바이러스가 7일 내지 30일 간격으로 개체에 투여되는 것인, 암 치료방법.
  17. 제 10항에 있어서,
    상기 히드록시유레아가 종양 내, 복강 내 또는 정맥 내로 투여되는 것인, 암 치료방법.
  18. 제 10항에 있어서,
    상기 백시니아 바이러스가 종양 내, 복강 내 또는 정맥 내로 투여되는 것인, 암 치료방법.
  19. 암을 예방 또는 치료하기 위한 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아를 포함하는 조성물의 용도.
  20. 암의 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아를 포함하는 조성물의 용도.
  21. 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 항암보조제.
  22. 제 21항에 있어서,
    상기 항암보조제는 백시니아 바이러스를 유효성분으로 포함하는 항암제의 항암보조제로서 사용되는 것을 특징으로 하는 것인, 항암보조제.
  23. 제 21항에 있어서,
    상기 히드록시유레아는 백시니아 바이러스의 항암활성을 개선, 향상 또는 증대시키는 것을 특징으로 하는 것인, 항암보조제.
  24. 제 21항에 있어서,
    상기 항암보조제는 백시니아 바이러스의 암 선택성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 것인, 항암보조제.
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