WO2021242002A1 - Lsp1 결핍 t 세포 - Google Patents

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WO2021242002A1
WO2021242002A1 PCT/KR2021/006538 KR2021006538W WO2021242002A1 WO 2021242002 A1 WO2021242002 A1 WO 2021242002A1 KR 2021006538 W KR2021006538 W KR 2021006538W WO 2021242002 A1 WO2021242002 A1 WO 2021242002A1
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lsp1
cells
pharmaceutical composition
cell
preventing
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김완욱
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이나은
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가톨릭대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to LSP1 (Leukocyte-specific protein 1) deficient T cell-based immune anticancer therapy.
  • LSP1 Leukocyte-specific protein 1
  • TIL tumor antigen-specific lymphocytes
  • Immune contexture consisting of the density, composition and functional state of tumor-infiltrating leukocytes (TIL), includes antibody (Ab)-based immunotherapy against programmed cell death protein 1 (PD-1). to determine tumor progression and efficacy of anti-tumor immunotherapy (Fridman WH, Zitvogel L, Sautes-Fridman C, et al . Nat Rev Clin Oncol 2017;14(12):717-34.).
  • PD-1 programmed cell death protein 1
  • Several studies have reported that a high density of T cells is positively correlated with favorable prognosis and survival in patients with various cancers, including colon cancer, non-small cell lung cancer, hepatocellular carcinoma, pancreatic cancer, gastric cancer and melanoma.
  • CAR-T cells chimeric antigen receptor (CAR)-T cells
  • CD19-targeted CAR-T cell therapy has shown significantly higher remission in patients with relapsed or refractory B-cell acute lymphoblastic leukemia and hematological malignancies including lymphoma.
  • TME immunosuppressive tumor milieu
  • Another object of the present invention is to provide a T cell in which the LSP1 gene is deleted.
  • Another object of the present invention is to provide an anticancer adjuvant.
  • Another object of the present invention is to provide a method for providing information for predicting the prognosis of cancer.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer caused by LSP1 overexpression, which includes an LSP1 inhibitor as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer caused by LSP1 overexpression, which includes T cells in which the LSP1 gene is deleted as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating cancer, comprising administering to a subject a pharmaceutical composition comprising an LSP1 (Leukocyte-specific protein 1) expression inhibitor as an active ingredient.
  • LSP1 Leukocyte-specific protein 1
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating cancer caused by LSP1 overexpression, comprising administering to a subject a pharmaceutical composition comprising an LSP1 inhibitor.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating cancer caused by LSP1 overexpression, comprising administering to an individual a pharmaceutical composition comprising T cells in which the LSP1 gene is deleted as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising an LSP1 expression inhibitor as an active ingredient.
  • the present invention provides a T cell in which the LSP1 gene is deleted.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising T cells in which the LSP1 gene is deleted as an active ingredient.
  • the present invention provides an anticancer adjuvant for enhancing anticancer drug activity comprising an LSP1 expression inhibitor or LSP1 gene-deleted T cell as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for providing information for predicting the prognosis of cancer.
  • the present invention provides a method for predicting an anticancer therapeutic effect.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer caused by LSP1 overexpression comprising an LSP1 inhibitor as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer caused by LSP1 overexpression, comprising T cells in which the LSP1 gene is deleted as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer, comprising administering to a subject a pharmaceutical composition comprising an LSP1 (Leukocyte-specific protein 1) expression inhibitor as an active ingredient.
  • LSP1 Leukocyte-specific protein 1
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer, comprising administering to an individual a pharmaceutical composition comprising LSP1 gene-deleted T cells as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer caused by LSP1 overexpression, comprising administering to a subject a pharmaceutical composition comprising an LSP1 inhibitor as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer caused by LSP1 overexpression, comprising administering to an individual a pharmaceutical composition comprising LSP1 gene-deleted T cells as an active ingredient.
  • LSP1 deficiency in T cells increases the number, distribution frequency, migration and invasion of T cells, and inhibits tumor growth and improves killing ability by increasing the production of anti-tumor cytokines. Therefore, there is an effect that it can be used as a target of T cell-based immune therapy.
  • 1a is a view confirming the growth change of melanoma in the tumor due to Lsp1 deficiency.
  • Figure 1b is a view confirming the change in the volume of melanoma in the tumor due to Lsp1 deficiency.
  • 1c is a view confirming the change in the weight of melanoma in the tumor due to Lsp1 deficiency.
  • Figure 1d is a diagram confirming the change in the number of TILs in the tumor caused by Lsp1 deficiency.
  • 1e is a diagram confirming the infiltration of CD4 + T cells in tumors caused by Lsp1 deficiency by immunohistochemical staining.
  • 1f is a diagram confirming the infiltration of CD8 + T cells in tumors caused by Lsp1 deficiency by immunohistochemical staining.
  • Figure 1g shows the quantification of CD4 + T cell infiltration in tumors caused by Lsp1 deficiency by immunohistochemical staining.
  • 1h shows the quantification of CD8 + T cell infiltration in tumors caused by Lsp1 deficiency by immunohistochemical staining.
  • Figure 2a is a diagram confirming the ratio of CD3-CD19 + B cells and CD3-NK 1.1 + NK cells in tumor-infiltrating CD45 + leukocytes derived from WT and Lsp1 KO mice.
  • 2B is a diagram confirming the distribution frequency of T reg cells (Foxp3 + regulatory T cells) in tumor-infiltrating CD4 + T cells derived from WT and Lsp1 KO mice.
  • FIG. 2c WT and Lsp1 KO in the mouse-derived distribution frequency, and Ly-6C low F4 / 80 high cells of the distribution frequency of CD11b + in CD45 + leukocytes, TAMs (Ly-6C low F4 / 80 high cells) in CD11b + M1
  • 3a is a schematic diagram of a method for preparing a T cell-specific Lsp1 overexpressing mouse.
  • Figure 3b is a qRT-PCR analysis of the Lsp1 mRNA expression level of CD4 + T cells in the spleen of T cell-specific Lsp1 overexpressing mice.
  • Figure 3c is a qRT-PCR analysis of the Lsp1 mRNA expression level of CD8 + T cells in the spleen of T cell-specific Lsp1 overexpressing mice.
  • 3D is a diagram confirming tumor growth in T cell-specific Lsp1 overexpressing mice.
  • Figure 3e is a diagram confirming the tumor volume of T cell-specific Lsp1 overexpression mice.
  • 3f is a diagram confirming the tumor weight of T cell-specific Lsp1 overexpressing mice.
  • 3G is a diagram confirming the T cells infiltrated into B16 melanoma in T cell-specific Lsp1 overexpressing mice by flow cytometry.
  • Figure 3h shows the quantification of T cells infiltrating B16 melanoma in T cell-specific Lsp1 overexpressing mice by flow cytometry analysis.
  • Figure 4a is a view confirming the ratio (%) of CD3-CD19 + B cells and CD3-NK 1.1 + NK cells in tumor-infiltrating CD45 + leukocytes derived from WT and Lsp1 Tg mice.
  • T reg cells Fexp3 + regulatory T cells
  • FIG. 4c WT and Lsp1 Tg in the mouse-derived distribution frequency, and Ly-6C low F4 / 80 high cells of the distribution frequency of CD11b + in CD45 + leukocytes, TAMs (Ly-6C low F4 / 80 high cells) in CD11b + M1
  • 5A is a diagram confirming LSP1 expression in T cells and its role in T cell migration by T cell migration analysis performed with splenic CD8 + T cells.
  • 5B is a diagram confirming LSP1 expression in T cells and its role in T cell migration by the expression level of LSP1 in tumor-infiltrating CD4 + T cells and CD8 + T cells.
  • FIG. 5c is a diagram confirming LSP1 expression in T cells and its role in T cell migration by increasing LSP1 expression in T cells stimulated with anti-CD3/CD28 Abs and IFN- ⁇ .
  • Figure 5d confirms the LSP1 expression in T cells and its role in T cell migration by increasing LSP1 expression in T cells stimulated with anti-CD3/CD28 Abs and IFN- ⁇ .
  • Figure 6a is a diagram showing a Venn diagram showing the overlap between the cytotoxicity-related gene and DEGs in Lsp1 KO T cells.
  • Figure 6b is a diagram showing NES (Normalized enrichment scores) of 10 GOBP terms (GOBP terms) related to the biological process of 'cytotoxicity' in Lsp1 KO T cells.
  • FIG. 6c Lsp1 KO T cells in the culture medium or anti -CD3 / 28 Abs Lsp1 KO the T cell-enriched "cell death" and stimulated - GSEA is a diagram showing a chart of "white blood cell mediated cytotoxicity.
  • 7A is a diagram illustrating quantification of the spleen weight of tumor-bearing WT and Lsp1 KO mice.
  • 7B is a diagram illustrating quantification of the number of cells in the spleen of tumor-bearing WT and Lsp1 KO mice.
  • 7c is a diagram confirming the composition of T cells in tumor-bearing WT and Lsp1 KO mouse spleens by flow cytometry.
  • 7D is a diagram confirming the expression of IL-2, TNF- ⁇ and IFN- ⁇ in tumor-bearing WT and Lsp1 KO mouse splenic CD4 + T cells by flow cytometry.
  • 7e is a diagram confirming the expression of IL-2, TNF- ⁇ and IFN- ⁇ in tumor-bearing WT and Lsp1 KO mouse splenic CD8 + T cells by flow cytometry.
  • Figure 8a is a view confirming the expression of TNF- ⁇ and IFN- ⁇ in tumor-infiltrating T cells of Lsp1 KO mice.
  • 8B is a diagram confirming the expression of TNF- ⁇ and IFN- ⁇ in tumor-infiltrating T cells of Lsp1 KO mice.
  • 8c is a diagram confirming the expression of TNF- ⁇ and IFN- ⁇ in tumor-infiltrating T cells of Lsp1 Tg mice.
  • 8D is a diagram confirming the expression of TNF- ⁇ and IFN- ⁇ in tumor-infiltrating T cells of Lsp1 Tg mice.
  • Figure 9a quantifies the spleen weight of WT and Lsp1 Tg mice inoculated with B16 melanoma.
  • Figure 9b shows the quantification of the number of cells in the spleen of WT and Lsp1 Tg mice inoculated with B16 melanoma.
  • Figure 9c is a view confirming the cells of the spleen of WT and Lsp1 Tg mice inoculated with B16 melanoma by flow cytometry.
  • 9D is a diagram confirming the distribution frequencies of IL-2, TNF- ⁇ and IFN- ⁇ in splenic CD4 + T cells of WT and Lsp1 Tg mice inoculated with B16 melanoma by flow cytometry analysis.
  • 9e is a diagram confirming the distribution frequencies of IL-2, TNF- ⁇ and IFN- ⁇ in splenic CD8 + T cells of WT and Lsp1 Tg mice inoculated with B16 melanoma by flow cytometry.
  • Fig. 10a is a confirmed delivery to the borrower Rag1 KO mice Lsp1 KO or Lsp1 Tg T cells in tumor progression by flow cytometry.
  • Figure 10b is a diagram confirming the transfer to the borrower Rag1 KO KO mice Lsp1 or Lsp1 Tg T cells in tumor progression.
  • Figure 10c is a schematic diagram of a process for confirming the anti-tumor effect enhancing effect of the anti-PD-1 antibody by Lsp1 deficiency in tumor progression.
  • Figure 10d confirms the anti-tumor effect enhancing effect of the anti-PD-1 antibody by Lsp1 deficiency in tumor progression.
  • 10E is a diagram showing the therapeutic significance of LSP1 deficiency.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising an LSP1 (Leukocyte-specific protein 1) expression inhibitor as an active ingredient.
  • LSP1 Leukocyte-specific protein 1
  • the expression inhibitor may be small interfering RNA (siRNA), small hairpin RNA (shRNA), miRNA, antisense oligonucleotide or nucleic acid aptamer.
  • siRNA small interfering RNA
  • shRNA small hairpin RNA
  • miRNA miRNA
  • antisense oligonucleotide or nucleic acid aptamer.
  • the expression inhibitor may be a T cell-specific LSP1 expression inhibitor.
  • a crRNA comprising a nuclease-deactivated Cas12a or Cas9 protein, a direct repeat (DR) and a protospacer complementary to the LSP1 gene ) may be included.
  • the cancer may be a solid cancer, brain tumor, melanoma, myeloma, non-small cell lung cancer, oral cancer, liver cancer, stomach cancer, colon cancer, breast cancer, lung cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head or neck cancer, cervical cancer, Ovarian cancer, colorectal cancer, small intestine cancer, rectal cancer, fallopian tube carcinoma, perianal cancer, endometrial carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, esophageal cancer, lymph adenocarcinoma, bladder cancer, gallbladder cancer, endocrine adenocarcinoma, thyroid cancer, Parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, prostate cancer, kidney or ureter cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, central nervous system tumor, spinal cord tumor, brainstem glioma and pituitary adenoma It may be any one or more.
  • composition of the present invention can increase the number and frequency of distribution of T cells.
  • the composition of the present invention is capable of increasing the infiltration of T cells into a tumor.
  • composition of the present invention can modulate the migration of T cells.
  • composition of the present invention is capable of inhibiting tumor growth.
  • composition of the present invention can increase TNF- ⁇ and IFN- ⁇ expression and secretion of T cells.
  • the T cell can be a helper T cell or a cytotoxic T cell
  • the helper T cell can be a CD4 + T cell
  • the cytotoxic T cell is a CD8 + T cell It may be a cell.
  • composition of the present invention may further comprise an immune checkpoint inhibitor, and the immune checkpoint inhibitor (immune checkpoint inhibitor) may be a PD-1 inhibitor or a CTLA-4 inhibitor, It may be an anti-PD-1 antibody.
  • the immune checkpoint inhibitor immunoreactive checkpoint inhibitor
  • the immune checkpoint inhibitor may be a PD-1 inhibitor or a CTLA-4 inhibitor, It may be an anti-PD-1 antibody.
  • composition of the present invention may be administered simultaneously, separately or sequentially with the immune checkpoint inhibitor.
  • the term “repression of expression” means to cause a decrease in expression (to mRNA) or translation (to protein) of a target gene, preferably by which the target gene expression becomes undetectable or insignificant. means to exist as
  • protospacer refers to a nucleic acid sequence that hybridizes with a target DNA.
  • hybridization refers to a reaction in which one or more nucleic acids react to form a complex, and the complex is stabilized through hydrogen bonding between bases of nucleic acid residues.
  • the term "expression” refers to the process by which a nucleic acid is transcribed from a DNA template (eg, into mRNA or other RNA transcript) and/or the process by which the transcribed mRNA is subsequently translated into a peptide, polypeptide or protein. refers to
  • composition for inhibiting gene expression of the present invention is in the form of a recombinant vector containing a DNA encoding a Cas12a protein or a Cas9 protein encoding a DNA cleavage activity inactivated (nuclease-deactivated) and a recombinant vector including a DNA encoding a crRNA cell.
  • a recombinant vector including a DNA encoding a crRNA cell.
  • introduced into an organism or introduced into a cell or organism in the form of a mixture or ribonucleic acid forming a complex comprising dCas12a protein or Cas9 protein and crRNA, or dCas12a protein or Cas9 protein, and a cell with a vector comprising crRNA together or introduced into an organism.
  • the specific sequence of the crRNA may be appropriately selected according to the type of dCas12a protein or Cas9 protein (derived microorganism).
  • the endonuclease such as dCas12a protein or Cas9 protein may be isolated from a microorganism or non-naturally occurring by a recombinant method or a synthetic method.
  • the endonuclease may further include an element commonly used for intranuclear delivery of cells at the N-terminus or C-terminus (or at the 5' end or 3' end of the nucleic acid molecule encoding it). , but not limited thereto.
  • the endonuclease protein may be used in the form of a purified protein, a DNA encoding the same, or a recombinant vector containing the DNA.
  • cancer and “tumor” may be used interchangeably.
  • the present invention relates to a T cell in which the LSP1 gene is deleted.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising a T cell in which the LSP1 gene is deleted as an active ingredient.
  • the T cell may be an activated T cell, and may be a CD45 + T cell.
  • the T cell may be a helper T cell or a cytotoxic T cell
  • the helper T cell may be a CD4 + T cell
  • the cytotoxic T cell may be a CD8 + It may be a T cell.
  • the T cell may be an LSP1-deleted chimeric antigen receptor (CAR)-T cell, and may include a CAR targeting a cancer cell antigen.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the CAR may comprise a cancer cell antigen-binding domain, a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain.
  • the expression and/or function of LSP1 in the T cell may be reduced or eliminated.
  • the T cell may be autologous to the subject.
  • composition of the present invention may further comprise an immune checkpoint inhibitor, and the immune checkpoint inhibitor may be a PD-1 inhibitor or a CTLA-4 inhibitor, and may be an anti-PD-1 antibody.
  • the immune checkpoint inhibitor may be a PD-1 inhibitor or a CTLA-4 inhibitor, and may be an anti-PD-1 antibody.
  • composition of the present invention may be administered simultaneously, separately or sequentially with the immune checkpoint inhibitor.
  • prevention refers to any action that inhibits or delays the occurrence, development, and recurrence of cancer by administration of the composition according to the present invention.
  • treatment refers to any action of improving or beneficially changing the symptoms of cancer and its complications by administering the composition according to the present invention.
  • Those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains with reference to the data presented by the Korean Medical Association, etc., know the exact standard of the disease for which the composition of the present application is effective, and can determine the degree of improvement, improvement and treatment will be.
  • the therapeutically effective amount of the composition of the present invention may vary depending on several factors, for example, the administration method, the target site, the condition of the individual, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount refers to an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment and not to cause side effects
  • the effective dose level is Health status, type of cancer, severity, drug activity, sensitivity to drug, administration method, administration time, administration route and excretion rate, treatment period, factors including drugs used in combination or concurrently, and other factors well known in the medical field can be determined according to
  • the composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered singly or multiple times. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with a minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition may be one or more formulations selected from the group comprising oral formulations, external preparations, suppositories, sterile injection solutions and sprays.
  • compositions of the present invention may also include carriers, diluents, excipients or combinations of two or more commonly used in biological agents.
  • a pharmaceutically acceptable carrier is not particularly limited as long as it is suitable for in vivo delivery of the composition, for example, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc.
  • Compounds described in , saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, and one or more of these components can be mixed and used, and if necessary, other antioxidants, buffers, bacteriostats, etc. Conventional additives may be added.
  • diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may be additionally added to form an injectable dosage form such as an aqueous solution, suspension, emulsion, etc., pills, capsules, granules or tablets.
  • injectable dosage form such as an aqueous solution, suspension, emulsion, etc., pills, capsules, granules or tablets.
  • it can be preferably formulated according to each disease or component using an appropriate method in the art or a method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990).
  • composition of the present invention may contain one or more active ingredients exhibiting the same or similar function.
  • the composition of the present invention comprises 0.0001 to 10% by weight of the protein, preferably 0.001 to 1% by weight, based on the total weight of the composition.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable additive, wherein the pharmaceutically acceptable additive includes starch, gelatinized starch, microcrystalline cellulose, lactose, povidone, colloidal silicon dioxide, calcium hydrogen phosphate. , lactose, mannitol, syrup, gum arabic, pregelatinized starch, corn starch, powdered cellulose, hydroxypropyl cellulose, Opadry, sodium starch glycolate, lead carnauba, synthetic aluminum silicate, stearic acid, magnesium stearate, aluminum stearate, Calcium stearate, sucrose, dextrose, sorbitol and talc and the like may be used.
  • the pharmaceutically acceptable additive according to the present invention is preferably included in an amount of 0.1 to 90 parts by weight based on the composition, but is not limited thereto.
  • composition of the present invention may be administered parenterally (eg, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) or orally, depending on the desired method, and oral administration is most preferred.
  • parenterally eg, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically
  • oral administration is most preferred.
  • the dosage varies according to the subject's body weight, age, sex, health status, diet, administration time, administration method, excretion rate, and severity of disease.
  • Liquid formulations for oral administration of the composition of the present invention include suspensions, internal solutions, emulsions, syrups, etc., and various excipients, such as wetting agents, sweetening agents, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin. and the like may be included.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, suppositories, and the like.
  • the present invention relates to an anticancer adjuvant for enhancing anticancer activity comprising an LSP1 expression inhibitor or LSP1 gene-deleted T cell as an active ingredient.
  • the anticancer agent is eribulin, carboplatin, cisplatin, halaven, 5-fluorouracil (5-FU), gleevec, vincristine ( Vincristine), Vinblastine, Vinorelvine, Paclitaxel, Docetaxel, Etoposide, Topotecan, Irinotecan, Dactinomycin, Dactinomycin It may be doxorubicin, daunorubicin, valrubicin, flutamide, gemcitabine, mitomycin, or bleomycin.
  • 5-FU 5-fluorouracil
  • gleevec gleevec
  • vincristine Vincristine
  • Vinblastine Vinorelvine
  • Paclitaxel Docetaxel
  • Etoposide Topotecan
  • Irinotecan Dactinomycin
  • Dactinomycin Dactinomycin It may be doxorubicin, daunorubicin, valrubicin, flut
  • composition of the present invention may further comprise an immune checkpoint inhibitor, and the immune checkpoint inhibitor may be a PD-1 inhibitor or a CTLA-4 inhibitor, and may be an anti-PD-1 antibody.
  • the immune checkpoint inhibitor may be a PD-1 inhibitor or a CTLA-4 inhibitor, and may be an anti-PD-1 antibody.
  • the present invention relates to a method for providing information for predicting diagnosis or prognosis of cancer, comprising determining the expression level of LSP1 in T cells isolated from a subject.
  • the term “diagnosis” as used herein refers to determining the susceptibility of an object to a particular disease or condition, determining whether an object currently has a particular disease or disorder, a particular disease or disorder Determining the prognosis of a subject with a disease (eg, identification of a pre-metastatic or metastatic cancer state, staging the cancer, or determining the responsiveness of the cancer to treatment), or therametrics (eg, monitoring the condition of the subject to provide information on treatment efficacy).
  • a disease eg, identification of a pre-metastatic or metastatic cancer state, staging the cancer, or determining the responsiveness of the cancer to treatment
  • therametrics eg, monitoring the condition of the subject to provide information on treatment efficacy
  • the present invention provides a method comprising the steps of: a) measuring the expression level of LSP1 in T cells isolated from a subject; b) performing an anti-cancer treatment; c) re-measuring the expression level of LSP1 in T cells isolated from the subject; and d) comparing the measured value of step a) with the measured value of step c). It relates to a method of predicting a prognosis for cancer treatment.
  • the measurement of the expression level can be determined by checking the expression level of mRNA or the level of a protein encoded by a gene.
  • the amount of mRNA can be confirmed using a primer pair or probe, and analysis methods for this include RT-PCR, competitive RT-PCR, real-time RT-PCR, and RNase protection. Assay (RNase protection assay, RPA), Northern blotting (Northern blotting), DNA chip, and the like, but is not limited thereto.
  • the amount of the protein encoded by the gene can be confirmed using an antibody that specifically binds to the protein, and analysis methods for this include Western blot, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), and radioimmunoassay.
  • RIA Radioimmunoassay
  • radioimmunodiffusion Ouchterlony immune diffusion method
  • rocket immunoelectrophoresis tissue immunostaining
  • Immunoprecipitation assay Complement Fixation Assay
  • FACS protein chip, etc., but is not limited thereto.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer caused by LSP1 overexpression comprising an LSP1 inhibitor as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer caused by LSP1 overexpression, comprising T cells in which the LSP1 gene is deleted as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer, comprising administering to a subject a pharmaceutical composition comprising an LSP1 (Leukocyte-specific protein 1) expression inhibitor as an active ingredient.
  • LSP1 Leukocyte-specific protein 1
  • the term “individual” refers to all animals, including humans, that have already or can develop cancer. By administering the expression inhibitor or the composition containing the cells of the present invention to an individual, the disease can be effectively prevented and treated.
  • the composition of the present invention can be used to treat a human suffering from various cancers or metastatic cancer.
  • the composition of the present invention can be used to treat mice or pigs that have developed various carcinomas or tumors.
  • the composition of the present invention may be administered in parallel with an existing anticancer agent or anticancer adjuvant.
  • composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level includes the type and severity of the subject, age, sex, type of virus infected, drug activity, sensitivity to drug, administration time, administration route, excretion rate, treatment duration, factors including concurrent drugs, and other factors well known in the medical field.
  • the composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. and may be administered single or multiple. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with a minimum amount without side effects, and can be easily determined by those skilled in the art.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer, comprising administering to an individual a pharmaceutical composition comprising LSP1 gene-deleted T cells as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer caused by LSP1 overexpression, comprising administering to a subject a pharmaceutical composition comprising an LSP1 inhibitor as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer caused by LSP1 overexpression, comprising administering to an individual a pharmaceutical composition comprising LSP1 gene-deleted T cells as an active ingredient.
  • V(mm3) D ⁇ d2 ⁇ 0.52
  • d (mm) vertical diameter of the smallest tumor.
  • TME tumor microenvironments
  • the tumor cell suspension was obtained by filtration through a 70 ⁇ m cell strainer, and TILs were isolated using a Ficoll-Hypaque (GE Healthcare, Chicago, IL) density gradient centrifuge. After washing the isolated single-cell suspension with PBS, flow cytometry was performed.
  • flow cytometry CD45 (30-F11, BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ), CD3 (145-2C11, Invitrogen, Carlsbad, CA), CD4 (GK1.5, Biolegend, San Diego, CA) and CD8 (53 -6.7, Biolegend), such as fluorochrome-labeled anti-mouse antibodies, surface staining was performed at 4 °C for 30 minutes.
  • CD8 + T cells and CD4 + T cells were immunohistochemically stained to confirm T cell infiltration in the tumor. Specifically, endogenous peroxidase was quenched by fixing 7 ⁇ m sections of OCT-embedded tumor tissue with cold acetone at -20°C for 10 minutes and incubating the sections in 0.3% H 2 O 2 for 30 minutes at room temperature, Tissues were blocked with 10% normal donkey serum for 1 hour at room temperature.
  • tissue sections were incubated with rat anti-mouse CD4 (1:1000, Biolegend) or rat anti-mouse CD8 (1:1000, Biolegend) Ab overnight at 4°C and each slide was washed 3 times with PBS and anti - Rat secondary Abs (1:100, Vector Laboratories, Burlingame, CA) were used for detection with the VECTASTAIN Elite ABC HRP kit (Vector Laboratories). Positive cells were detected using 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB; Vector Laboratories) and counterstained with hematoxylin.
  • DAB 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride
  • intratumoral NK1.1 + NK cells, CD19 + B cells, regulatory T cells (T reg cells: Foxp3 + CD4 + T cells) and the distribution frequency and number of tumor-associated macrophages (TAMs) were confirmed by flow cytometry in tumors of Lsp1 KO mice and WT mice.
  • TILs tumor-associated macrophages
  • Lsp1 -deficient mice create an anti-tumor immune environment by enhancing the infiltration of CD8 + T cells and enhancing the infiltration of pro-inflammatory M1-like TAMs compared to M2-like TAMs. .
  • transgenic mice overexpressing Lsp1 in T cells were constructed ( FIG. 3A ). Specifically, the cDNA of mouse Lsp1 was cloned into a leukocyte-specific expression cassette containing a human CD2 promoter, the construct was directly injected into the prokaryote of a fertilized egg, and the genomic DNA was analyzed by PCR to obtain a transgenic founder. was selected. Thereafter, total RNA was isolated from CD4 + and CD8 + T cells of the spleen using the RNeasy Mini kit (Qiagen, Hilden, Germany) and converted into cDNA using RevertAid Reverse Transcriptase (Thermo Fisher Scientific).
  • Lsp1 Tg mice were verified by analyzing and comparing them with WT mice.
  • CD4 + and CD8 + T cells expressed significantly more Lsp1 mRNA compared to WT mice.
  • Lsp1 Tg mice FIGS.
  • FIGS. 3B and C showed markedly accelerated tumor growth compared to WT mice for 3 weeks in contrast to Lsp1 KO mice ( FIG. 3D ).
  • Tumor volume and weight of Lsp1 Tg mice were also significantly higher than those of WT mice on day 14 of tumor inoculation ( FIGS. 3E and F ).
  • tumors were collected when the tumor volume of WT mice reached about 500 mm 3 and analyzed by flow cytometry to analyze the number and distribution frequency of TILs.
  • Murine CXCL9 and CXCL10 were diluted and placed in migration medium (RPMI1640 with 0.1% FBS), and 500,000 CD8 + T cells were dispensed into the migration medium of the upper chamber. After 4 hours of incubation at 37° C., the cells moved to the lower chamber were counted with a hemocytometer.
  • Lsp1 -deficient CD8 + T cells showed a significant chemotactic response to CXCL9 and CXCL10 than WT CD8 + T cells ( FIG. 5A ).
  • Lsp1 -overexpressing CD8 + T cells showed reduced chemotactic migration compared to WT and Lsp1 -deficient CD8 + T cells (FIG. 5A), confirming that LSP1 negatively regulates CD8 + T cell migration.
  • CD8 + T cell migration stimulated with 10% FBS showed no difference between the three types of CD8 + T cells (Fig. 5A) , suggesting that the regulation of CD8 + T cell migration of LSP1 is specific for CXCL9 and CXCL10. .
  • the expression level of LSP1 in TILs of B16 melanoma was confirmed by flow cytometry. Specifically, cells were isolated from the spleens of normal mice or tumor-bearing mice and prepared as single-cell suspensions. CD4 + T cells or CD8 + T cells were purified by magnetic separation using anti-CD4 or anti-CD8 beads (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany). To detect LSP1 expression in T cells, purified CD4 + T cells or CD8 + T cells were treated with recombinant IFN- ⁇ (10 ng/ml, R&D Systems), transforming growth factor (TGF- ⁇ ) in complete media.
  • IFN- ⁇ 10 ng/ml, R&D Systems
  • TGF- ⁇ transforming growth factor
  • Membranes were incubated with LSP1 (1:1000, Cell Signaling Technology) antibody or ⁇ -tubulin (1:1000, Abcam, Cambridge, UK) antibody and bands were visualized using an enhanced chemiluminescent detection system (Thermo fisher scientific).
  • the CD4 + T cells infiltrating the B16 melanoma showed a significantly higher LSP1 expression level than the splenic T cells of mice without tumors ( FIG. 5B ).
  • CD8 + T cells infiltrated into B16 melanoma also showed similar results, suggesting that high expression of LSP1 in T cells can be induced by B16 melanoma.
  • Lsp1 KO T cells (GSE75123) was analyzed compared to WT T cells, focusing on T cell-mediated cytotoxicity. Specifically, total RNA was isolated, reverse transcribed and amplified from splenic T cells of Lsp1 KO and WT mice stimulated with anti-CD3/CD28 Abs for 6 h, containing 62,976 probes for 24,241 annotated genes (GSE75123).
  • Lsp1 Tg mice checked the spleen weight and spleen cell number of WT mice, it was confirmed that the spleen weight and spleen cell number of Lsp1 Tg mice decreased compared to WT mice (FIGS. 9A and B).
  • Lsp1 KO T cells and Lsp1 Tg T cells had a similar CD4/CD8 ratio in CD3 + T cells ( FIG. 10A ), but after the borrowing transfer experiment, compared to Lsp1 -overexpressing T cells and vehicle alone, Lsp1 -deficient T cells more strongly inhibited tumor progression in Rag1 KO mice with borrowed transfer of B16 melanoma ( FIG. 10B ), demonstrating that Lsp1 deficiency in T cells specifically mediates anti-tumor effects.
  • Anti-PD-1 blockade an immune checkpoint inhibitor that has been used as immunotherapy for patients with various advanced cancers including melanoma, and the approach of the present invention have different anti-tumor mechanisms (suppressive immunity) gate block/T cell trafficking) , it was confirmed whether the anti-tumor effect caused by Lsp1 deficiency is affected by co-administration with anti-PD-1 Ab.
  • anti-PD-1 blocking therapy 5 ⁇ 10 5 B16 melanomas were inoculated subcutaneously into the right flank of WT mice and Lsp1 KO mice (day 0), followed by anti-PD at 3, 6, 9 and 12 days.
  • the tumor volume reached 1500 mm 3 in WT mice treated with isotype control Ab
  • the tumor volume was 1000 mm 3 in WT mice treated with anti-PD-1 Ab
  • anti-PD-1 Ab In treated Lsp1 KO mice, the tumor volume was 500 mm 3 ( FIG. 10D ). That is, treatment with anti-PD-1 Ab significantly reduced the growth of melanoma in WT mice, and in particular, anti-PD-1 blockade-treated Lsp1 KO mice had anti- The anti-tumor effect was more pronounced than that of WT mice with or without the PD-1 antibody ( FIG. 10D ), suggesting that the anti-tumor effect induced by Lsp1 deficiency was maintained regardless of the anti-PD-1 antibody treatment.

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Abstract

본 발명은 LSP1(Leukocyte-specific protein 1)의 결핍된 T 세포-기반 면역 항암 요법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, LSP1의 낙아웃에 의해 종양 성장, 종양의 부피 및 크기가 감소하였으며, T 세포에서의 LSP1 결핍이 T 세포의 수, 분포 빈도, 이동 및 침윤을 증가시키고, 항 종양 사이토카인의 생산을 증가시킴으로써 종양의 성장을 억제하고 살상능을 향상시키므로, 이를 T 세포-기반 면역 요법에 이용할 수 있다.

Description

LSP1 결핍 T 세포
본 발명은 LSP1(Leukocyte-specific protein 1)의 결핍된 T 세포-기반 면역 항암 요법에 관한 것이다.
의학 연구에서 수많은 진보에도 불구하고, 암은 문명세계를 통하여 사망의 주요 원인으로 남아있다. 수술, 방사선요법 및 일반화된 화학요법등과 같은 암 치료에 대한 비 특이적인 접근은 순환하며 천천히 자라는 고형암의 선택적인 군의 치료에서 성공적이었다. 그러나, 많은 고형 종양은 이런 접근에 상당한 내성이 있고, 그 경우에 예후(豫後)는 매우 나쁘다. 표준 치료는 세포절제술후에 방사선 요법 또는 화학요법을 포함하나, 완치가 어렵고, 재발이 많다. 이와 같은 암치료에 있어서 부상하는 분야는 면역요법이다. 일반원리는 치료받는 환자에게 특히 약성세포에 대하여 실제로 거부반응인 것을 배치하는 능력을 부여하는 것이다. 1. 다양한 종류의 자극된 자가세포를 사용하는 차용 면역요법(adoptive immunotherapy); 2. 동종이계 림프구의 전신전달; 3. 면역학적으로 반응성인 세포의 종양내 이식; 4. 전신-종양 특이적 면역반응을 발생시키는 먼 부위에서의 백신접종을 포함하는 수 많은 면역학적 전략이 개발중이다. 이들 가운데, 차용 면역요법으로 종양 항원-특이적 림프구의 차용 전달(adoptive transfer)이 유망한데, 지금까지 이들 시도는 말초 혈관으로부터의 단핵 세포 또는 신규 종양 피검체로부터의 종양 침윤 림프구(tumour infiltrating lymphocyte, TIL)에 주로 근거하였다. 최근 악성흑색종 환자의 치료 시도에서, 증식된 TIL의 자가 전달 치료 시도는 51%까지의 객관적 반응률을 보인다고 보고되었다. TIL 세포는 수가 적으며, 종양으로부터의 면역억제 메커니즘으로 인하여 자주 무력(anergic)하게 되므로 증식이 일어나는데 오랜 주기 (수 개월)가 걸린다.
종양 침윤 백혈구(tumor-infiltrating leukocytes, TIL)의 밀도, 조성 및 기능적 상태로 구성되는 면역구조(Immune contexture)는 PD-1(programmed cell death protein 1)에 대한 항체(Ab)-기반 면역요법을 포함하는 항-종양 면역요법의 종양 진행 및 효능을 결정한다 (Fridman WH, Zitvogel L, Sautes-Fridman C, et al. Nat Rev Clin Oncol 2017;14(12):717-34.). 여러 연구에서 고밀도의 T 세포가 결장암, 비소세포폐암, 간세포암, 췌장암, 위암 및 흑색종을 포함하는 다양한 암에 걸린 환자에서 유리한 예후 및 생존과 양의 상관관계가 있다고 보고했다. 따라서, 항원-활성화 된 T 세포, 특히 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)-T 세포를 사용한 차용 세포 전달은 항암 요법의 효능을 향상시키는 유망한 전략 중 하나로 떠오르고있다 (Lim WA, June CH. Cell 2017;168(4):724-40.). 예를 들어, CD19-표적화 CAR-T 세포 요법이 재발성 또는 난치성 B-세포 급성림프구성백혈병 및 림프종을 포함하는 혈액 악성 종양 환자에서 현저히 높은 차도를 나타냈다.
혈액 악성 종양에서의 성공에도 불구하고 CAR-T 세포 요법은 고형암에서는 항상 효과적이지 않았고 오히려 실망스러웠다. 이와 같은 T-세포 기반 암 면역요법의 주요 장애물 중 하나는 불충분한 T 세포의 종양 덩어리로의 트래피킹일 것이다. 임상 및 전임상 연구에서, 생체 외 확장 후 다량의 T 세포의 주입에도 불구하고 전달된 T 세포의 소량만이 종양 조직의 내부에 도달할 수 있다 (Slaney CY, Kershaw MH, Darcy PK. Cancer Res 2014;74(24):7168-74.). 어째서 T 세포의 트래피킹, 침윤 및 침투가 불충분한지는 아직 밝혀지지 않았지만, 고형 종양의 모양이 보다 섬유성이고 덜 침습적이어서 궁극적으로 면역억제성 종양 환경(TME)을 구축하기 때문일 수 있다. 따라서, 고형 종양에 대한 T-세포 기반 면역요법의 효과를 최대화하기 위해서는, 섬유성 및 면역억제성 TME를 파괴 또는 우회함으로써 종양 덩어리 내부에 면역적격성(immunocompetent) T 세포를 성공적으로 전달할 수 있는 방법을 개발할 필요가 있다.
본 발명의 목적은 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 LSP1 유전자가 결실된 T 세포를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 항암 보조제를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 암의 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 목적은 항암 치료 효과를 예측하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 LSP1 억제제를 유효성분으로 포함하는 LSP1 과발현에 의해 유발되는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 LSP1 유전자가 결실된 T 세포를 유효성분으로 포함하는 LSP1 과발현에 의해 유발되는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 LSP1(Leukocyte-specific protein 1) 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 LSP1 유전자가 결실된 T 세포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 LSP1 억제제를 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 LSP1 과발현에 의해 유발되는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 LSP1 유전자가 결실된 T 세포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 LSP1 과발현에 의해 유발되는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 LSP1 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 LSP1 유전자가 결실된 T 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 LSP1 유전자가 결실된 T 세포를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 LSP1 발현 억제제 또는 LSP1 유전자가 결실된 T 세포를 유효성분으로 포함하는 항암제 활성 증진을 위한 항암 보조제를 제공한다.
또한, 본 발명은 암의 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 항암 치료 효과를 예측하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 LSP1 억제제를 유효성분으로 포함하는 LSP1 과발현에 의해 유발되는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 LSP1 유전자가 결실된 T 세포를 유효성분으로 포함하는 LSP1 과발현에 의해 유발되는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 LSP1(Leukocyte-specific protein 1) 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 LSP1 유전자가 결실된 T 세포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 LSP1 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 LSP1 과발현에 의해 유발되는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 LSP1 유전자가 결실된 T 세포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 LSP1 과발현에 의해 유발되는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, LSP1의 낙아웃에 의해 종양 성장, 종양의 부피 및 크기가 감소한 것을 확인하였다. 또한, T 세포에서의 LSP1 결핍이 T 세포의 수, 분포 빈도, 이동 및 침윤을 증가시키고, 항 종양 사이토카인의 생산을 증가시킴으로써 종양의 성장을 억제하고 살상능을 향상시는 것을 확인하였다. 따라서, 이를 T 세포-기반 면역 요법의 표적으로 이용할 수 있는 효과가 있다.
도 1a는 Lsp1 결핍에 의한 종양에서의 흑색종 성장 변화를 확인한 도이다.
도 1b는 Lsp1 결핍에 의한 종양에서의 흑색종 부피 변화를 확인한 도이다.
도 1c는 Lsp1 결핍에 의한 종양에서의 흑색종 무게 변화를 확인한 도이다.
도 1d는 Lsp1 결핍에 의한 종양에서의 TILs 수의 변화를 확인한 도이다.
도 1e는 Lsp1 결핍에 의한 종양에서의 CD4+ T 세포의 침윤을 면역조직화학염색으로 확인한 도이다.
도 1f는 Lsp1 결핍에 의한 종양에서의 CD8+ T 세포의 침윤을 면역조직화학염색으로 확인한 도이다.
도 1g는 Lsp1 결핍에 의한 종양에서의 CD4+ T 세포의 침윤을 면역조직화학염색으로 확인하여 정량화한 것이다.
도 1h는 Lsp1 결핍에 의한 종양에서의 CD8+ T 세포의 침윤을 면역조직화학염색으로 확인하여 정량화한 것이다.
도 2a는 WT 및 Lsp1 KO 마우스 유래 종양-침윤성 CD45+ 백혈구에서 CD3-CD19+ B 세포 및 CD3-NK 1.1+ NK 세포의 비율을 확인한 도이다.
도 2b는 WT 및 Lsp1 KO 마우스 유래 종양-침윤 CD4+ T 세포에서 Treg 세포(Foxp3+ 조절 T 세포)의 분포 빈도를 확인한 도이다.
도 2c는 WT 및 Lsp1 KO 마우스 유래 CD45+ 백혈구에서 CD11b+의 분포 빈도, CD11b+에서 TAMs (Ly-6ClowF4/80high 세포)의 분포 빈도, 및 Ly-6ClowF4/80high 세포에서 M1-유사 TAMs (CD206lowMHCⅡhigh 세포) 또는 M2-유사 TAMs (CD206highMHCⅡlow 세포)의 분포 빈도를 확인한 도이다.
도 3a는 T 세포-특이적 Lsp1 과발현 마우스 제조방법을 도식화한 것이다.
도 3b는 T 세포-특이적 Lsp1 과발현 마우스의 비장에서 CD4+ T 세포의 Lsp1 mRNA 발현 수준을 qRT-PCR로 분석한 것이다.
도 3c는 T 세포-특이적 Lsp1 과발현 마우스의 비장에서 CD8+ T 세포의 Lsp1 mRNA 발현 수준을 qRT-PCR로 분석한 것이다.
도 3d는 T 세포-특이적 Lsp1 과발현 마우스의 종양 성장을 확인한 도이다.
도 3e는 T 세포-특이적 Lsp1 과발현 마우스의 종양 부피를 확인한 도이다.
도 3f는 T 세포-특이적 Lsp1 과발현 마우스의 종양 무게를 확인한 도이다.
도 3g는 T 세포-특이적 Lsp1 과발현 마우스에서 B16 흑색종에 침윤된 T 세포를 유세포 분석으로 확인한 도이다.
도 3h는 T 세포-특이적 Lsp1 과발현 마우스에서 B16 흑색종에 침윤된 T 세포를 유세포 분석으로 확인하여 정량화한 것이다.
도 4a는 WT 및 Lsp1 Tg 마우스 유래 종양-침윤성 CD45+ 백혈구에서 CD3-CD19+ B 세포 및 CD3-NK 1.1+ NK 세포의 비율(%)을 확인한 도이다.
도 4b는 WT 및 Lsp1 Tg 마우스 유래 종양-침윤 CD4+ T 세포에서 Treg 세포(Foxp3+ 조절 T 세포)의 분포 빈도를 확인한 도이다.
도 4c는 WT 및 Lsp1 Tg 마우스 유래 CD45+ 백혈구에서 CD11b+의 분포 빈도, CD11b+에서 TAMs (Ly-6ClowF4/80high 세포)의 분포 빈도, 및 Ly-6ClowF4/80high 세포에서 M1-유사 TAMs (CD206lowMHCⅡhigh 세포) 또는 M2-유사 TAMs (CD206highMHCⅡlow 세포)의 분포 빈도를 확인한 도이다.
도 5a는 T 세포에서의 LSP1 발현 및 이의 T 세포 이동에서의 역할을 비장 CD8+ T 세포로 수행한 T 세포 이동 분석으로 확인한 도이다.
도 5b는 T 세포에서의 LSP1 발현 및 이의 T 세포 이동에서의 역할을 종양-침윤 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포에서 LSP1의 발현 수준으로 확인한 도이다.
도 5c는 T 세포에서의 LSP1 발현 및 이의 T 세포 이동에서의 역할을 항-CD3/CD28 Abs 및 IFN-γ로 자극한 T 세포에서의 LSP1 발현 증가로 확인한 도이다.
도 5d는 T 세포에서의 LSP1 발현 및 이의 T 세포 이동에서의 역할을 항-CD3/CD28 Abs 및 IFN-γ로 자극한 T 세포에서의 LSP1 발현 증가로 확인한 것이다.
도 6a는 Lsp1 KO T 세포에서 세포독성 관련 유전자 및 DEGs 간의 오버랩을 도시한 벤다이어그램을 나타낸 도이다.
도 6b는 Lsp1 KO T 세포에서 '세포독성'의 생물학적 과정과 관련된 10 GOBP 용어(GOBP terms)의 NES(Normalized enrichment scores)를 나타낸 도이다.
도 6c는 Lsp1 KO T 세포에서 배지 또는 항-CD3/28 Abs로 자극된 Lsp1 KO T 세포가 풍부한 '세포 사멸' 및 '백혈구-매개 세포독성'의 GSEA 도표를 나타낸 도이다.
도 7a는 종양-보유 WT 및 Lsp1 KO 마우스의 비장 중량을 정량화한 도이다.
도 7b는 종양-보유 WT 및 Lsp1 KO 마우스의 비장에서의 세포수를 정량화한 도이다.
도 7c는 종양-보유 WT 및 Lsp1 KO 마우스 비장에서의 T 세포의 조성을 유세포 분석으로 확인한 도이다.
도 7d는 종양-보유 WT 및 Lsp1 KO 마우스 비장 CD4+ T 세포에서의 IL-2, TNF-α 및 IFN-γ 발현을 유세포 분석으로 확인한 도이다.
도 7e는 종양-보유 WT 및 Lsp1 KO 마우스 비장 CD8+ T 세포에서의 IL-2, TNF-α 및 IFN-γ 발현을 유세포 분석으로 확인한 도이다.
도 8a는 Lsp1 KO 마우스의 종양-침윤 T 세포에서의 TNF-α 및 IFN-γ 발현을 확인한 도이다.
도 8b는 Lsp1 KO 마우스의 종양-침윤 T 세포에서의 TNF-α 및 IFN-γ 발현을 확인한 도이다.
도 8c는 Lsp1 Tg 마우스의 종양-침윤 T 세포에서의 TNF-α 및 IFN-γ 발현을 확인한 도이다.
도 8d는 Lsp1 Tg 마우스의 종양-침윤 T 세포에서의 TNF-α 및 IFN-γ 발현을 확인한 도이다.
도 9a는 B16 흑색종이 접종된 WT 및 Lsp1 Tg 마우스의 비장 중량을 정량화한 것이다.
도 9b는 B16 흑색종이 접종된 WT 및 Lsp1 Tg 마우스의 비장의 세포수를 정량화한 것이다.
도 9c는 B16 흑색종이 접종된 WT 및 Lsp1 Tg 마우스의 비장의 세포를 유세포 분석으로 확인한 도이다.
도 9d는 B16 흑색종이 접종된 WT 및 Lsp1 Tg 마우스의 비장 CD4+ T 세포에서의 IL-2, TNF-α 및 IFN-γ의 분포 빈도를 유세포 분석으로 확인한 도이다.
도 9e는 B16 흑색종이 접종된 WT 및 Lsp1 Tg 마우스의 비장 CD8+ T 세포에서의 IL-2, TNF-α 및 IFN-γ의 분포 빈도를 유세포 분석으로 확인한 도이다.
도 10a은 종양 진행에서 Lsp1 KO 또는 Lsp1 Tg T 세포의 Rag1 KO 마우스로의 차용 전달을 유세포 분석으로 확인한 도이다.
도 10b는 종양 진행에서 Lsp1 KO 또는 Lsp1 Tg T 세포의 Rag1 KO 마우스로의 차용 전달을 확인한 도이다.
도 10c는 종양 진행에서 Lsp1 결핍에 의한 항-PD-1 항체의 항-종양 효과 강화 효과를 확인하기 위한 과정을 도식화한 것이다.
도 10d는 종양 진행에서 Lsp1 결핍에 의한 항-PD-1 항체의 항-종양 효과 강화 효과를 확인한 것이다.
도 10e는 LSP1 결핍의 치료적 의미를 나타낸 도이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
일 측면에서, 본 발명은 LSP1(Leukocyte-specific protein 1) 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 발현 억제제는 siRNA(small interfering RNA), shRNA(small hairpin RNA), miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 핵산 앱타머일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 발현 억제제는 T 세포-특이적 LSP1 발현 억제제일 수 있다.
일 구현예에서, DNA 절단 활성이 불활성화된(nuclease-deactivated) Cas12a 또는 Cas9 단백질, 반복적인 염기 서열(direct repeat, DR) 및 LSP1 유전자에 상보적인 프로토스페이서(protospacer)를 포함하는 crRNA(CRISPR RNA)를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 암은 고형암일 수 있으며, 뇌종양, 흑색종, 골수종, 비소세포성폐암, 구강암, 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 나팔관암종, 항문부근암, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 T 세포의 수 및 분포 빈도를 증가시킬 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 T 세포의 종양으로의 침윤을 증가시킬 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 T 세포의 이동을 조절할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 종양 성장을 억제할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 T 세포의 TNF-α 및 IFN-γ 발현 및 분비를 증가시킬 수 있다.
일 구현예에서, T 세포는 도움 T 세포(helper T cell) 또는 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell)일 수 있으며, 도움 T 세포는 CD4+ T 세포일 수 있고, 세포독성 T 세포는 CD8+ T 세포일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 면역체크포인트 억제제(immune checkpoint inhibitor)를 추가로 포함할 수 있으며, 면역체크포인트 억제제(면역 관문 억제제)는 PD-1 억제제 또는 CTLA-4 억제제일 수 있고, 항-PD-1 항체일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 면역체크포인트 억제제와 동시에(simultaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(sequential)으로 투여될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "발현 억제"란 표적 유전자의 (mRNA로의) 발현 또는 (단백질로의) 번역 저하를 야기하는 것을 의미하며, 바람직하게는 이에 의해 표적 유전자 발현이 탐지 불가능해지거나 무의미한 수준으로 존재하게 되는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "프로토스페이서"는 타겟 DNA와 혼성화되는 핵산 서열을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "혼성화"는 하나 이상의 핵산이 반응하여, 복합체를 형성하고, 이 복합체는 핵산 잔기의 염기 사이의 수소 결합을 통해 안정화되는 반응을 지칭한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "발현"은 핵산이 DNA 주형으로부터(예를 들어, mRNA 또는 기타 RNA 전사물로) 전사되는 과정 및/또는 이후에 전사된 mRNA가 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다.
본 발명의 유전자 발현 억제용 조성물은 DNA 절단 활성이 불활성화된(nuclease-deactivated) Cas12a 단백질 또는 Cas9 단백질을 암호화하는 DNA를 포함하는 재조합 벡터 및 crRNA를 암호화하는 DNA를 포함하는 재조합 벡터의 형태로 세포 또는 유기체에 도입되거나, dCas12a 단백질 또는 Cas9 단백질, 및 crRNA를 포함하는 혼합물 또는 이들이 복합체를 이루는 리보핵산단백질 형태로 세포 또는 유기체에 도입되거나, dCas12a 단백질 또는 Cas9 단백질, 및 crRNA를 함께 포함하는 벡터로 세포 또는 유기체에 도입될 수 있다.
본 발명에서, 상기 crRNA의 구체적 서열은 dCas12a 단백질 또는 Cas9 단백질의 종류(유래 미생물)에 따라서 적절히 선택할 수 있다.
본 발명에서, 상기 dCas12a 단백질 또는 Cas9 단백질 등의 엔도뉴클레아제는 미생물에서 분리된 것 또는 재조합적 방법 또는 합성적 방법으로 비자연적 생산된 것(non-naturally occurring)일 수 있다. 상기 엔도뉴클레아제는 세포의 핵 내 전달을 위하여 통상적으로 사용되는 요소를 N-말단 또는 C-말단(또는 이를 암호화하는 핵산 분자의 5' 말단 또는 3' 말단)에 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 엔도뉴클레아제 단백질은 정제된 단백질 형태로 사용되거나, 이를 암호화하는 DNA, 또는 상기 DNA를 포함하는 재조합 벡터의 형태로 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "암" 및 "종양"은 서로 혼용될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 LSP1 유전자가 결실된 T 세포에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 LSP1 유전자가 결실된 T 세포를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 T 세포는 활성화 T 세포일 수 있으며, CD45+ T 세포일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 T 세포는 도움 T 세포(helper T cell) 또는 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell)일 수 있으며, 도움 T 세포는 CD4+ T 세포일 수 있고, 세포독성 T 세포는 CD8+ T 세포일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 T 세포는 LSP1 결실된 CAR(chimeric antigen receptor)-T 세포일 수 있고, 암세포 항원을 표적으로 하는 CAR를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 CAR은 암세포 항원-결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 T 세포에서 LSP1의 발현 및/또는 기능이 감소되거나 또는 제거될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 T 세포는 대상체에 대해 자가일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 면역체크포인트 억제제를 추가로 포함할 수 있으며, 면역체크포인트 억제제는 PD-1 억제제 또는 CTLA-4 억제제일 수 있고, 항-PD-1 항체일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 면역체크포인트 억제제와 동시에(simultaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(sequential)으로 투여될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 암의 발생, 발달 및 재발을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 조성물의 투여로 암 및 이로 인한 합병증의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 본원의 조성물이 효과가 있는 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.
본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 개체의 상태 등에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 약학적조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체의 건강상태, 암의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여, 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 약제학적 조성물은 경구형 제형, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 및 분무제를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제형일 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 단백질을 0.0001 내지 10 중량 %로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량 %를 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 중량부 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 경구 투여 하는 것이 가장 바람직하다. 투여량은 개체의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명의 조성물의 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 통상적으로 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 다양한 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 함께 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다.
일 측면에서, 본 발명은 LSP1 발현 억제제 또는 LSP1 유전자가 결실된 T 세포를 유효성분으로 포함하는 항암제 활성 증진을 위한 항암 보조제에 관한 것이다.
일 구현예에서, 항암제는 에리불린(eribulin), 카보플라틴(carboplatin), 시스플라틴(cisplatin), 할라벤(Halaven), 5-플루오로우라실(5-FU), 글리벡(gleevec), 빈크리스틴(Vincristine), 빈블라스틴(Vinblastine), 비노렐빈(Vinorelvine), 파클리탁셀(Paclitaxel), 도세탁셀(Docetaxel), 에토포사이드(Etoposide), 토포테칸(Topotecan), 이리노테칸(Irinotecan), 닥티노마이신(Dactinomycin), 독소루비신(Doxorubicin), 다우노루비신(Daunorubicin), 발루비신(valrubicin), 플로타미드(flutamide), 젬시타빈(gemcitabine), 미토마이신(Mitomycin) 또는 블레오마이신(Bleomycin)일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 면역체크포인트 억제제를 추가로 포함할 수 있으며, 면역체크포인트 억제제는 PD-1 억제제 또는 CTLA-4 억제제일 수 있고, 항-PD-1 항체일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 대상으로부터 분리된 T 세포에서 LSP1의 발현 수준을 확인하는 것을 포함하는 암의 진단 또는 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서, 사용된 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 a) 대상으로부터 분리된 T 세포에서 LSP1의 발현 수준을 측정하는 단계; b) 항암 치료를 수행하는 단계; c) 대상으로부터 분리된 T 세포에서 LSP1의 발현 수준을 재측정하는 단계; 및 d) 상기 a) 단계의 측정값과 상기 c) 단계의 측정값을 비교하는 단계를 포함하는 항암 치료에 대한 예후를 예측하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 발현 수준 측정은 mRNA의 발현 수준 또는 유전자에 의해 코딩되는 단백질 수준을 확인함으로써 알 수 있다. mRNA의 양은 프라이머 쌍 또는 프로브를 이용하여 확인할 수 있으며, 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR (Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RNase protection assay, RPA), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 양은 상기 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있으며, 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 LSP1 억제제를 유효성분으로 포함하는 LSP1 과발현에 의해 유발되는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 LSP1 유전자가 결실된 T 세포를 유효성분으로 포함하는 LSP1 과발현에 의해 유발되는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 LSP1(Leukocyte-specific protein 1) 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "개체"란 암이 이미 발병되었거나 발병될 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다. 본 발명의 발현 억제제 또는 세포를 포함하는 조성물을 개체에 투여함으로써, 상기 질환을 효율적으로 예방 및 치료할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물로 다양한 암 또는 전이성 암이 발병한 인간을 치료할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물로 다양한 암종 또는 종양이 발병한 쥐 또는 돼지를 치료할 수 있다. 본 발명의 조성물은 기존의 항암제 또는 항암보조제와 병행하여 투여할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 용어 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체의 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또한, 본 발명은 LSP1 유전자가 결실된 T 세포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 LSP1 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 LSP1 과발현에 의해 유발되는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 LSP1 유전자가 결실된 T 세포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 LSP1 과발현에 의해 유발되는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. LSP1 억제에 의한 종양 성장 억제
1-1. . LSP1 억제에 의한 종양 성장 억제 효과
5Х105 개의 B16 흑색종(melanoma)을 PBS에 재부유시킨 뒤 8-12 주령 WT 마우스 및 Lsp1 KO 마우스 (Dr. Laurent Sabbagh, University of Montreal, Montreal, Quebec, Canada)의 우측 옆구리에 피하주사하고 2-3일마다 캘리퍼로 종양 부피를 측정하고 하기 수학식 1로 계산하여 3주 동안 종양의 성장을 확인하였다.
[수학식 1]
V(mm3) = D × d2 × 0.52
D (mm): 가장 큰 종양의 수직 직경; 및
d (mm): 가장 작은 종양의 수직 직경.
그 결과, WT 마우스에 비해 Lsp1 KO 마우스에서 종양 성장이 현저하게 감소되었다 (도 1A). 또한, 종양 접종 14일 후 Lsp1 KO 마우스에서 종양의 부피 및 중량이 WT 마우스에서보다 현저히 낮게 나타났다 (도 1B 및 1C).
1-2. LSP1 억제에 의한 T 세포의 종양 침윤 촉진 효과
상기의 흑색종을 갖는 마우스에서 Lsp1 결핍에 의해 영향을 받는 종양 미세환경(tumor microenvironments, TME)에서의 면역 구조(immune contexture)를 확인하기 위해, WT 마우스에서 평균 종양 부피가 약 700 mm3에 도달하였을 때 종양을 가지고 있는(tumor-bearing) WT 및 Lsp1 KO 마우스의 종양 침윤 백혈구(tumor-infiltrating leukocytes, TILs)를 유세포 분석하였다. 구체적으로, TILs를 분리하기 위해, WT 마우스의 평균 종양 부피가 500 또는 700 mm3에 달했을 때 WT 및 Lsp1 KO 마우스를 희생시키고 원발성 종양을 기계적으로 절제하고 분리하였다. 그 후 70 μm 세포 여과기로 여과하여 종양 세포 현탁액을 얻고, Ficoll-Hypaque (GE Healthcare, Chicago, IL) 밀도 구배 원심분리기를 이용하여 TILs를 분리하였다. 분리한 단일-세포 현탁액을 PBS로 제척한 뒤 유세포 분석을 수행하였다. 유세포 분석을 위해, CD45 (30-F11, BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ), CD3 (145-2C11, Invitrogen, Carlsbad, CA), CD4 (GK1.5, Biolegend, San Diego, CA) 및 CD8 (53-6.7, Biolegend)와 같은 플로오로크롬-표지된 항-마우스 항체들로 표면 염색을 30분 동안 4 ℃에서 수행하였다. 이 후, 세포를 FACS 버퍼에 재부유하고 DIVA 소프트웨어로 FACS CantoⅡ(BD Biosciences) 또는 LSR Fortessa (BD Biosciences)를 이용하여 유세포 분석하였고, 이를 통해 얻은 데이터는 FlowJo 소프트웨어 (FlowJo, LLC, Franklin Lakes, NJ)로 분석하였다. 그 결과, Lsp1 KO 마우스의 종양이 WT 마우스의 종양보다 현저히 많은 수의 침윤된 CD45+ 세포, CD3+, CD4+ 및 CD8+ T 세포를 가지는 것으로 나타났다 (도 1D). 이를 통해, Lsp1 KO 마우스에서 흑색종의 성장 감소가 T 세포의 구성보다는 증가된 세포수와 관련될 수 있음을 유추할 수 있다.
또한, CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포를 면역조직화학염색하여 종양에서의 T 세포의 침윤을 확인하였다. 구체적으로, OCT-임베딩된 종양 조직의 7 μm 절편을 차가운 아세톤으로 -20℃에서 10분 동안 고정하고 절편을 상온에서 30분 동안 0.3% H2O2에서 인큐베이션함으로써 내인성 퍼옥시다아제를 퀀칭한 뒤, 조직을 10% 정상 당나귀 혈청으로 상온에서 1 시간 동안 블로킹하였다. 그 후, 조직 절편을 랫 항-마우스 CD4 (1:1000, Biolegend) 또는 랫 항-마우스 CD8 (1:1000, Biolegend) Ab로 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하고 각 슬라이드를 PBS로 3회 세척하고 항-랫 이차 Ab (1:100, Vector Laboratories, Burlingame, CA)를 이용하여 VECTASTAIN Elite ABC HRP kit (Vector Laboratories)로 검출하였다. 양성 세포는 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB; Vector Laboratories)를 이용하여 검출하고 헤마톡실린으로 대조염색하였다. 이미지는 Pannoramic MIDI slide scanner (3DHISTECH)로 얻었으며, 염색 양성 세포를 마우스마다 상이한 두 개의 슬라이드, 각 슬라이드의 6개 필드에서 수동으로 계수하였다. 그 결과, CD4+ T 세포와 달리, CD8+ T 세포의 침윤이 WT 마우스보다 Lsp1-결핍 마우스에서 종양의 중심 및 가장자리 둘 다에서 현저히 높게 나타나 (도 1E 내지 1H), Lsp1 결핍이 CD8+ T 세포의 종양 중심으로의 침윤을 촉진하는 것을 확인할 수 있었다.
1-3. 면역 세포 집단 확인
TME를 구성하는 T 세포 외의 다른 면역 세포 집단에 대한 LSP1 억제에 의한 종양에서의 영향을 확인하기 위해, 종양 내 NK1.1+ NK 세포, CD19+ B 세포, 조절 T 세포 (Treg cells: Foxp3+ CD4+ T cells) 및 종양 관련 대식세포(tumor-associated macrophages , TAMs)의 분포 빈도 및 수를 Lsp1 KO 마우스 및 WT 마우스의 종양에서 유세포 분석으로 확인하였다.
그 결과, TILs의 절대수가 Lsp1 KO 마우스의 종양에서 현저히 많았음에도 불구하고 종양 내 NK1.1+ NK 세포 및 CD19+ B 세포의 분포 빈도에 차이가 없었으며 (도 2A), 조절 T 세포 (Treg cells: Foxp3+ CD4+ T cells)의 분포 빈도도 차이가 나타나지 않았다 (도 2B). 또한, CD11b+ 골수성 세포(myeloid cell)가 Lsp1 KO 및 WT 마우스에서 유사하게 나타난 반면, CD11b+Ly6ClowF4/80high 종양 관련 대식세포 (TAMs)의 분포 빈도는 WT 마우스에 비해 Lsp1 KO 마우스의 종양에서 현저히 감소하였다 (도 2C). 상기 결과를 통해 주목할만한 것은, Lsp1 KO 마우스의 종양에서 TAM들 중에 전-염증성 M1-유사 (CD206low MHCⅡhigh) TAMs가 현저히 증가했고, 항-염증성 M2-유사 (CD206high MHCⅡlow) TAMs가 현저히 감소한 것이다 (도 2C).
상기 결과들을 통해, Lsp1-결핍 마우스가 CD8+ T 세포의 침윤을 향상시키고, M2-유사 TAM에 비해 전-염증성 M1-유사 TAM의 침윤을 향상시킴으로써 항-종양 면역 환경을 조성하는 것을 알 수 있다.
실시예 2. LSP1 과발현에 의한 종양 성장 촉진
2-1. . LSP1 과발현에 의한 종양 성장 촉진 효과
종양 발달 동안 LSP1의 T 세포-특이적 효과를 확인하기 위해 T 세포에서 Lsp1를 과발현하는 형질전환(transgenic, Tg) 마우스를 제작하였다 (도 3A). 구체적으로, 마우스 Lsp1의 cDNA를 인간 CD2 프로모터를 포함하는 백혈구-특이적 발현 카세트에 클로닝하고, 컨스트럭트를 수정란의 원핵에 직접 주입하고 유전체 DNA를 PCR로 분석하여 형질전환 파운더(transgenic founder)를 선별하였다. 그 후, RNeasy Mini kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 이의 비장의 CD4+ 및 CD8+ T 세포로부터 총 RNA를 분리하고 RevertAid Reverse Transcriptase (Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 cDNA로 변환하였다. 그 후, SYBR Green PCR premix (Bio-Rad, Hercules, CA) 및 프라이머 (5'-CCAGCCCTTTGGCCTTAGAA-3' 및 5'-TGGAAATGGGCAAGGTTGGT-3')를 이용하여 CFX96 real-time PCR 시스템으로 Lsp1 mRNA의 발현 정도를 분석하여 WT 마우스와 비교함으로써 Lsp1 Tg 마우스를 검증하였다. 이렇게 제작한 Lsp1 Tg 마우스와 WT 마우스에 상기 실시예 1에서와 같이 흑색종을 피하 접종하고 종양의 성장 정도를 확인한 결과, WT 마우스에 비해 CD4+ 및 CD8+ T 세포가 Lsp1 mRNA를 현저히 많이 발현하는 Lsp1 Tg 마우스 (도 3B 및 C)가 Lsp1 KO 마우스와는 대조적으로 3주 동안 WT 마우스에 비해 현저히 종양 성장이 가속화되는 것으로 나타났다 (도 3D). Lsp1 Tg 마우스의 종양의 부피 및 중량 또한 종양 접종 14일차에 WT 마우스에 비해 현저히 높게 나타났다 (도 3E 및 F).
2-2. 면역 세포 집단 확인
Lsp1 Tg 마우스의 TME에서 면역 세포 집단을 평가하기 위해, WT 마우스의 종양 부피가 약 500 mm3에 도달할 때 종양을 수집하여 유세포 분석함으로써 TIL의 수 및 분포 빈도를 분석하였다.
그 결과, 종양-침윤 CD3+ T 세포 및 CD4+ T 세포의 분포 빈도가 WT 및 Lsp1 Tg 마우스 사이에 유사한 것으로 나타났으나, Lsp1 KO 마우스에서의 결과와는 반대로 CD8+ T 세포의 분포 빈도가 Lsp1 Tg 마우스에서 WT 마우스에 비해 감소하는 것으로 나타났다 (도 3G). 또한, 종양 내 CD45+ T 세포, CD3+ T 세포, 특히 CD8+ T 세포의 절대수가 WT 마우스에 비해 Lsp1 Tg 마우스에서 현저히 낮았다 (도 3H). 아울러, Lsp1 과발현이 T 세포에 특이적이기 때문에 종양 내 NK1.1+ NK 세포, CD19+ B 세포 및 CD11b+ 골수성 세포의 분포 빈도 차이는 나타나지 않았다 (도 4A 내지 C).
상기 결과들을 통해, T 세포에서 Lsp1의 특이적 과발현이 B16 흑색종의 성장을 향상시키고, 이는 TILs, 특히, CD8+ T 세포의 수 및 분포 빈도의 감소와 관련되어 있음을 알 수 있다.
실시예 3. LSP1의 T 세포 이동 조절
3-1. LSP1의 CD8 + T 세포 이동 억제
상기 실시예에서 유전적 Lsp1 억제(결핍)이 B16 흑색종에서 T 세포 침윤을 조절하였으므로, LSP1가 직접적으로 T 세포의 이동을 조절하는지 확인하기 위해, CD8+ T 세포를 종양 미세환경으로 트래피킹하고, 항-PD-1 요법 동안 TME에서 종양-특이적 T 세포 및 수지상 세포 사이의 상호 작용을 촉진하는 CXCL9 및 CXCL10에 LSP1가 응하여 CD8+ T 세포 이동을 조절하는지 확인하였다. 구체적으로, WT 및 Lsp1 KO CD8+ T 세포의 주화성(Chemotaxis)을 확인하기 위해 5 μm의 공극 크기를 가지는 Transwell 삽입물 (Corning Inc., Corning, NY)이 장착된 24-웰 플레이트의 하부 챔버에 뮤린 CXCL9 및 CXCL10 (R&D Systems, Minneapolis, MN)을 이동 배지 (0.1% FBS 포함 RPMI1640)에 희석하여 위치시키고, 50만 개의 CD8+ T 세포를 상부 챔버의 이동 배지에 분주하였다. 37℃에서 인큐베이션하고 4시간 후, 하부 챔버로 이동된 세포들을 헤모사이토미터(hemocytometer)로 계수하였다.
그 결과, Lsp1-결핍 CD8+ T 세포가 WT CD8+ T 세포보다 CXCL9 및 CXCL10에 현저한 화학주성반응(chemotactic response)을 보이는 것을 확인하였다 (도 5A). 반면, Lsp1-과발현 CD8+ T 세포는 WT 및 Lsp1-결핍 CD8+ T 세포에 비해 감소된 화학주성 이동을 나타내 (도 5A), LSP1이 CD8+ T 세포의 이동을 음성적으로 조절하는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 10% FBS로 자극된 CD8+ T 세포 이동은 CD8+ T 세포의 3 가지 유형 (도 5A) 간에 차이가 나타나지 않아, LSP1의 CD8+ T 세포 이동 조절이 CXCL9 및 CXCL10에 특이적임을 시사하였다.
3-2. TIL 및 LSP1의 병리적 관련성 확인
종양 조건에서 T 세포와 LSP1의 병리적 관련성을 확인하기 위해, B16 흑색종의 TILs에서 LSP1 발현 수준을 유세포 분석으로 확인하였다. 구체적으로, 정상 마우스 또는 종양-보유 마우스의 비장에서 세포를 분리하고 단일-세포 현탁액으로 준비하였다. CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포를 항-CD4 비드 또는 항-CD8 비드 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)를 이용하여 마그네틱 분리(magnetic separation)로 정제하였다. T 세포에서 LSP1 발현을 검출하기 위해, 정제한 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포를 완전배지(complete media)에서 재조합 IFN-γ (10 ng/ml, R&D Systems), TGF-β(transforming growth factor beta) (2 ng/ml, R&D Systems), IL-10(interleukin 10) (10 ng/ml, R&D Systems) 또는 항-마우스 CD3 Ab (1 μg/ml, 145-2C11, Invitrogen)와 함께 항-마우스 CD28 Ab (1 μg/ml, 37.51, Invitrogen)로 72시간 동안 자극시켰다. 배양된 세포들을 수거 및 염색하여 세포 내 LSP1 발현을 유세포 분석으로 검출하였다. 또한, 상기 T 세포들을 파쇄 버퍼로 파쇄한 뒤 12% SDS-PAGE 젤에서 전기영동하여 단백질들을 분리하고 PVDF 멤브레인에 트랜스퍼한 뒤 일렉트로블로팅하였다. 멤브레인들을 LSP1 (1:1000, Cell Signaling Technology) 항체 또는 β-tubulin (1:1000, Abcam, Cambridge, U.K.) 항체와 인큐베이션하고 enhanced chemiluminescent detection system (Thermo fisher scientific)을 이용하여 밴드를 시각화하였다.
LSP1 발현 수준을 확인한 결과, B16 흑색종에 침윤된 CD4+ T 세포는 종양이 없는 마우스의 비장 T 세포보다 LSP1의 발현 수준이 현저히 높게 나타났다 (도 5B). 또한, B16 흑색종에 침윤된 CD8+ T 세포도 유사한 결과를 나타내, T 세포에서 LSP1의 고발현이 B16 흑생종에 의해 유도될 수 있음을 알 수 있었다. 이와 같은 in vivo 종양 침윤 T 세포에서 LSP1 발현의 상향 조절이 어떻게 일어나는지 확인하기 위해, 어떤 종류의 종양-관련 자극이 LSP1 발현을 유도할 수 있는지 상기 유세포 분석을 통해 확인한 결과, 항-CD3/CD28 Abs 또는 전-염증 사이토카인인 IFN-γ로 T 세포를 자극하자 CD4+ 및 CD8+ T 세포 모두에서 LSP1 발현이 강하게 증가한 반면, TGF-β 및 항-염증 사이토카인인 IL-10는 LSP1 발현을 상향조절하지 못했다 (도 5C). 아울러, 이러한 T 세포 수용체 활성화 및 IFN-γ에 의한 LSP1 발현 증가를 웨스턴 블롯 분석으로도 확인하였다 (도 5D).
상기 실시예를 통해 T 세포에서 LSP1이 T 세포의 이동을 음성 조절하는 것을 확인한 것을 고려하면, 이와 같은 결과는 B16 흑색종이 TME 내의 T 세포에서 LSP1 발현을 상향조절함으로써 숙주의 T 세포의 항-종양 활성을 회피할 수 있음을 시사한다.
실시예 4. Lsp1 -결핍 T 세포의 세포 독성 증가
4-1. Lsp1 결핍에 의한 T 세포 세포독성 증가 확인
종양 성장에서 LSP1의 조절이 온전히 T 세포의 이동 조절에 의한 것인지 확인하기 위해, 종양 침윤 T 세포가 종양 성장을 억제하는 필수 단계인 T 세포의 세포 독성에 대한 LSP1의 영향을 확인하고자 하였다. 이를 위해, Lsp1 KO T 세포 (GSE75123)의 유전자 발현 프로파일을 T 세포-매개 세포 독성에 중점을 두어 WT T 세포와 비교 분석하였다. 구체적으로, 항-CD3/CD28 Abs로 6시간 동안 자극된 Lsp1 KO 및 WT 마우스의 비장 T 세포로부터 총 RNA를 분리하고 역전사 및 증폭한 뒤 24,241 개의 주석달린 유전자 (GSE75123)에 대한 62,976 개의 프로브가 포함된 어레이 칩 (SurePrint G3 Mouse GE 8x60K Microarray, Agilent)에 혼성화하였다. 정규화 후 각 유전자의 log2 fold 변화 값 및 P 값을 계산하였다. Lsp1 KO T 세포의 DEGs의 컷오프 값은 |fold change values| > 0.58였고 P values < 0.05였다. 또한, GSEA(Gene Set Enrichment Analysis)을 clusterProfiler (R package, ver.3.4.6)로 수행하였으며 GSEA 도표는 enrichrplot (R package)로 생성하였다. 아울러, Lsp1 KO T 세포에서의 DEGs와 세포독성-관련 유전자들 간의 오버랩의 유의성을 순열 검증(permutation test strategy)으로 결정하였다. 오버랩된 DEGs의 경헙적 P-값을 계산하기 위해 총 100,000 개의 무작위 치환 시료가 사용되었다.
그 결과, 세포독성 및 세포 사멸과 관련된 10 GOBP(Gene Ontology Biological Process) 용어를 대표하는 171 개의 유전자 중, 24 개의 유전자 (14%)가 Lsp1 KO T 세포의 DEGs(differentially expressed genes)와 유의하게 오버랩된 것으로 나타났다 (도 6A). 또한, GSEA(Gene Set Enrichment Analysis) 결과에서도 세포 사멸 및 백혈구 매개 세포독성의 생물학적 과정이 Lsp1 KO T 세포에서 증가한 반면 (도 6B 및 C), 세포 사멸의 음성 조절이 감소되었음 (도 6B)을 확인할 수 있었다. 이를 통해, T 세포에서 LSP1 결핍이 T 세포의 종양-사멸 세포독성의 증가와 연관되어 있음을 알 수 있다.
4-2. Lsp1 결핍에 의한 T 세포 세포독성 이펙터 기능 촉진 확인
Lsp1 결핍에 의해 T 세포의 세포독성 이펙터 기능이 촉진되는지 확인하기 위해, 대표적인 항-종양 이펙터 사이토카인인 IFN-γ및 TNF-α의 발현 수준을 WT 및 Lsp1 KO 마우스의 비장 및 종양-침윤 T 세포에서 유세포 분석 방법으로 측정하였다.
그 결과, 종양 보유 WT 및 Lsp1 KO 마우스 간에 비장 크기, 비장 세포 수, 및 비장 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포는 차이가 없었으며 (도 7A, B 및 C), 두 군의 비장에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포 중 TNF-α+ 및 IFN-γ+ 세포의 분포 빈도는 유사한 정도로 나타났다 (도 7D 및 E). 반면, 종양에서는 WT 마우스에 비해 Lsp1 KO 마우스의 침윤된 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 TNF-α+ 및 IFN-γ+ 세포의 분포 빈도가 현저히 높게 나타나 (도 8A 내지 도8D), Lsp1 결핍이 종양-침윤 T 세포에서 TNF-α+ 및 IFN-η+ 발현을 유도함으로써 항-종양 면역성을 증가시키는 것을 알 수 있었다.
4-3. Lsp1 과발현에 의한 T 세포 세포독성 이펙터 기능 저하 확인
Lsp1 Tg 마우스가 WT 마우스의 비장 중량 및 비장 세포수를 확인하였을 때, Lsp1 Tg 마우스의 비장 중량 및 비장 세포수가 WT 마우스와 비교하여 감소함을 확인하였다(도 9A 및 B).
또한, 상기 실시예와 반대로 Lsp1 Tg 마우스와 WT 마우스의 비장 및 종양-침윤 T 세포에서 IFN-γ 및 TNF-α의 발현 수준을 유세포 분석으로 확인한 결과, 종양 접종 후 WT 마우스에 비해 Lsp1 Tg 마우스에서 비장 CD4+ 및 CD8+ 세포의 TNF-α및/또는 IFN-γ+ 세포의 분포 빈도가 현저히 낮게 나타났다 (도 9C, D 및 E). 또한, 종양에서 Lsp1-과발현 CD4+ 및 CD8+ T 세포는 WT CD4+ 및 CD8+ T 세포에 비해 TNF-α+ 및/또는 IFN-γ+의 분포 빈도가 각각 현저히 감소된 것으로 나타났다 (도 9C, D 및 E). Lsp1 Tg 마우스의 비장 CD8+ T 세포가 WT 마우스보다 덜 팽창된 반면, Lsp1 Tg 마우스의 비장 CD4+ T 세포가 WT 마우스보다 더 팽창되었다 (도 9C). 이러한 결과들을 통해, T 세포에서 Lsp1가 과발현되면 침윤된 CD8+ T 세포를 현저히 감소시키고, CD8+ T 세포에 의한 TNF-α+ 및 IFN-γ+ 생산을 하향조절함으로써 흑색종의 성장을 촉진하는 것을 알 수 있다.
실시예 5. Lsp1 결핍에 의한 항-PD-1 항체의 항-종양 활성 강화 효과
5-1. Lsp1 -결핍의 T 세포에서의 항-종양 매개 효과
상기 결과들을 바탕으로 Lsp1-결핍 T 세포가 증가된 T 세포 트래피킹과 세포독성능에 의해 종양 성장을 더욱 효과적으로 억제한다고 가정하고, 성숙 T 세포 및 B 세포가 결핍된 Rag1 KO 마우스에서 Lsp1 KO 및 Lsp1 Tg T 세포를 이용한 차용 전달(adoptive transfer) 실험을 수행하여 이를 확인하였다. 구체적으로, Rag1 KO 마우스의 오른쪽 옆구리에 1Х105 개의 B16 흑색종을 피하 접종하고 하루 뒤, Pan T cell isolation kit (Miltenyi Biotec)를 이용하여 마그네틱 분리로 종양이 없는 Lsp1 KO 마우스 및 Lsp1 Tg 마우스의 바장으로부터 T 세포를 분리하였다. 비히클로서의 PBS 또는 Lsp1 KO 마우스 또는 Lsp1 Tg 마우스 유래 1Х107 개의 T 세포를 상기 B16 흑색종을 가진 Rag1 KO 마우스에 정맥 주사하였다. 종양 성장은 2일마다 기록되었다.
그 결과, 차용 전달 실험 전에는 Lsp1 KO T 세포 및 Lsp1 Tg T 세포가 CD3+ T 세포에서 유사한 CD4/CD8 비율을 가졌으나 (도 10A), 차용 전달 실험 후, Lsp1-과발현 T 세포 및 비히클 단독에 비해 Lsp1-결핍 T 세포가 B16 흑색종이 차용 전달된 Rag1 KO 마우스에서 종양 진행을 더욱 강하게 억제하였고 (도 10B), 이는 T 세포에서 Lsp1의 결핍이 항-종양 효과를 특이적으로 매개하는 것을 증명한다.
5-2. Lsp1 -결핍의 항-PD-1 항체와의 병용처리에 의한 효과 확인
흑색종을 포함한 다양한 진행된 암 환자에게 면역요법으로 사용되어 온 면역체크포인트 억제제인 항-PD-1 차단(Anti-PD-1 blockade)과 본 발명의 접근법이 서로 상이한 항-종양 메커니즘 (억제성 면역 관문의 차단/T 세포 트래피킹)을 가지므로, Lsp1 결핍에 의한 항-종양 효과가 항-PD-1 Ab와의 병용 투여에 의해 영향을 받는지를 확인하였다. 구체적으로, 항-PD-1 차단 요법을 위해, 5Х105 개의 B16 흑색종을 WT 마우스 및 Lsp1 KO 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 접종하고 (0일), 3, 6, 9 및 12일 뒤에 항-PD-1 항체 (RMP1-14, Bio X cell, Lebanon, NH) 또는 이의 아이소파입 대조군 항체인 랫 IgG2a 아이소타입 대조군 (2A3, Bio X cell)을 10 mg/kg로 복강 내 투여하였다 (도 10C).
그 결과, 아이소타입 대조군 Ab를 처리한 WT 마우스에서 종양 부피가 1500 mm3에 달했을 때, 항-PD-1 Ab를 처리한 WT 마우스에서 종양 부피가 1000 mm3이고, 항-PD-1 Ab를 처리한 Lsp1 KO 마우스에서 종양 부피가 500 mm3였다 (도 10D). 즉, 항-PD-1 Ab의 처리가 WT 마우스에서 흑색종의 성장을 현저하게 감소시켰으며, 특히, 항-PD-1 차단(anti-PD-1 blockade)이 처리된 Lsp1 KO 마우스가 항-PD-1항체가 있거나 없는 WT 마우스보다 항-종양 효과가 현저하게 나타나 (도 10D), Lsp1 결핍에 의한 항-종양 효과가 항- PD-1 항체 처리와 관계없이 유지되는 것을 알 수 있다.
이를 통해, T 세포에서 Lsp1의 유전적 제거(genetic ablation)가 흑색종에 대한 항-PD-1 Ab를 포함하는 면역 관문 억제제의 치료 효능을 향상시키는 유용한 전략임을 시사한다(도 10E).

Claims (20)

  1. LSP1(Leukocyte-specific protein 1) 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 발현 억제제는 siRNA(small interfering RNA), shRNA(small hairpin RNA), miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 핵산 앱타머인, 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, T 세포-특이적 LSP1 발현 억제제인, 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, DNA 절단 활성이 불활성화된(nuclease-deactivated) Cas12a 또는 Cas9 단백질, 반복적인 염기 서열(direct repeat, DR) 및 LSP1 유전자에 상보적인 프로토스페이서(protospacer)를 포함하는 crRNA(CRISPR RNA)를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 암은 고형암인, 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, T 세포의 수 및 분포 빈도를 증가시키는, 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  7. 제 1항에 있어서, T 세포의 종양으로의 침윤을 증가시키는, 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  8. 제 1항에 있어서, TNF-α 및 IFN-γ 발현 및 분비를 증가시키는, 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  9. 제 1항에 있어서, 면역체크포인트 억제제(immune checkpoint inhibitor)를 추가로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  10. LSP1 유전자가 결실된 T 세포를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  11. 제 10항에 있어서, T 세포는 LSP1 결실된 CAR(chimeric antigen receptor)-T 세포인, 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  12. 제 11항에 있어서, CAR은 암세포 항원-결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  13. 제 10항에 있어서, 면역체크포인트 억제제를 추가로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  14. 제 13항에 있어서, 면역체크포인트 억제제는 PD-1 억제제 또는 CTLA-4 억제제인, 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  15. LSP1 발현 억제제 또는 LSP1 유전자가 결실된 T 세포를 유효성분으로 포함하는 T 세포에서 LSP1가 과별현되어 유발되는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  16. LSP1 발현 억제제 또는 LSP1 유전자가 결실된 T 세포를 유효성분으로 포함하는 항암제 활성 증진을 위한 항암 보조제.
  17. 제 16항에 있어서, 면역체크포인트 억제제를 추가로 포함하는, 항암 보조제.
  18. 대상으로부터 분리된 T 세포에서 LSP1의 발현 수준을 확인하는 것을 포함하는 암의 진단 또는 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  19. LSP1(Leukocyte-specific protein 1) 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법.
  20. LSP1 유전자가 결실된 T 세포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법.
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