WO2021034098A1 - 사람 표피성장인자수용체 2 양성 암을 치료하기 위한 인터페론-베타 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인의 용도 - Google Patents

사람 표피성장인자수용체 2 양성 암을 치료하기 위한 인터페론-베타 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인의 용도 Download PDF

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beta
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cancer
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정해민
이지선
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(주)제노팜
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Definitions

  • the present invention relates to the use of a recombinant protein in which interferon-beta and human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) antibodies are fused to treat cancer, and more particularly, interferon or interferon-beta mutant and HER2 antibody.
  • HER2 human epidermal growth factor receptor 2
  • Interferon is one of the major cytokines that play an important role in immunity, and is known to have a strong anticancer effect. These interferons are classified into type I (IFN- ⁇ and IFN- ⁇ ), type II (IFN- ⁇ ), and type III (IFN- ⁇ ).
  • Type I interferon exhibits antiviral and antiproliferative effects, and plays an essential role in cancer immunosurveillance, a function of removing tumor cells by recognizing tumor specific antigens.
  • IFN- ⁇ is more potent than IFN- ⁇ in inhibiting cell growth.
  • the range of antiproliferative activity and synergistic effect of IFN- ⁇ are very excellent.
  • treatment using interferon is known to cause symptoms such as fever (80%), muscle pain (73%), headache (50%), fatigue (50%), and malaise (50%) from the subject due to high cytotoxicity. have.
  • trastuzumab is an antibody cancer treatment targeting human epidermal growth factor receptor 2 (HER2), and is used for the purpose of treating patients with HER2-positive cancer.
  • HER2 human epidermal growth factor receptor 2
  • trastuzumab alone does not have sufficient therapeutic effect, other antibody treatments targeting HER2, Pertuzumab, and chemotherapeutic are administered in combination.
  • HER2-positive cancer patients it is used only in some patients with a high expression level of HER2, and has limitations such as recurrence of cancer or resistance to HER2 treatment after treatment.
  • therapeutics used in the treatment of HER2-positive cancers such as trastuzumab and pertuzumab
  • trastuzumab and pertuzumab obtained clinical responses only in patients with malignant HER2-positive tumor cells with more than 1,000,000 HER2 receptors on the cell surface. It is prescribed to do. Patients with malignant HER2 positive tumor cells with more than 1,000,000 HER2 receptors on the cell surface are typically classified as HER2 IHC 3+.
  • Trastuzumab and Pertuzumab are prescribed to patients with HER2 expression level of IHC 2+ and HER2 gene amplification as a result of fluorescence in situ hybridization (FISH), that is, FISH positive determined by those skilled in the art.
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • Patients are classified by HER2 expression level using, for example, HercepTest TM and/or HER2 FISH (pharm Dx TM ) from Dako Denmark A/S or using the HERmark ® assay provided by Monogram Biosciences.
  • Patients with tumor cells with low HER2 expression levels i.e. patients with HER2 expression levels of IHC 1+ or IHC 2+ and FISH negative, typically do not show sufficient clinical response when administered trastuzumab and pertuzumab. Therefore, there is a limitation that trastuzumab and pertuzumab are prescribed only for limited patients.
  • the signaling of type I interferon is that a number of enzymes are stepwise activated by the activity of the interferon receptor, and transcription factors such as STAT1 and STAT2 also act.
  • Such signaling activates the immune system, and chemotherapeutic drugs such as anthracycline, human epidermal growth factor receptor 2 (HER2), epidermal growth factor receptor (EGFR), etc.
  • chemotherapeutic drugs such as anthracycline, human epidermal growth factor receptor 2 (HER2), epidermal growth factor receptor (EGFR), etc.
  • HER2 human epidermal growth factor receptor 2
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • it is essential to show anticancer effects against various anticancer drugs such as antibodies targeting growth factor receptors, administration of adjuvants, and oncolytic virotherapy.
  • pSTAT3 one of the signaling substances involved in the mechanism of treatment resistance of trastuzumab, has a polymerized form of two identical substances (pSTAT3 homodimer), and is known to be inhibited by pSTAT1. Therefore, when the type I interferon that activates pSTAT1 is combined with trastuzumab, increased anticancer efficacy can be expected.
  • the present inventors have developed a new therapeutic agent with increased efficacy compared to the existing HER2 antibody therapy by constructing a recombinant protein in which interferon-beta and HER2 target antibody are fused. Unlike conventional HER2 antibody treatments, this fusion protein treatment is effective even in patients with low HER2 expression levels, and has the effect of lowering the probability of recurrence of cancer, so it can be used as a new anticancer treatment.
  • One aspect of the present invention is an interferon-beta or interferon-beta variant of SEQ ID NO: 1 in which the 27th amino acid residue is substituted with threonine; And a recombinant protein comprising a HER2 target antibody or fragment thereof covalently linked directly or indirectly to the interferon-beta or interferon-beta variant as an active ingredient, a pharmaceutical for preventing or treating cancer having a HER2 expression level of IHC 1+ or higher It aims to provide a suitable composition.
  • Another aspect of the present invention is an interferon-beta or an interferon-beta variant of SEQ ID NO: 1 in which the 27th amino acid residue is substituted with threonine; And a recombinant protein comprising a HER2 target antibody or fragment thereof covalently linked directly or indirectly to the interferon-beta or interferon-beta variant, providing a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer having a HER2 expression level of IHC 1+ or higher. It aims to do.
  • Another aspect of the present invention is an interferon-beta or an interferon-beta variant of SEQ ID NO: 1 in which the 27th amino acid residue is substituted with threonine; And a recombinant protein comprising a HER2 target antibody or fragment thereof covalently linked directly or indirectly to the interferon-beta or interferon-beta variant, a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer having a HER2 expression level of IHC 1+ or higher It aims to provide.
  • Another aspect of the present invention is an interferon-beta variant of SEQ ID NO: 1 in which an interferon-beta or 27th amino acid residue is substituted with threonine for preparing a cancer therapeutic agent having a HER2 expression level of IHC 1+ or higher; And a HER2 target antibody or fragment thereof covalently linked directly or indirectly to the interferon-beta or interferon-beta variant.
  • interferon-beta or an interferon-beta variant of SEQ ID NO: 1 in which the 27th amino acid residue is substituted with threonine And administering an effective amount of a composition comprising as an active ingredient a recombinant protein comprising a HER2 target antibody or fragment thereof covalently linked directly or indirectly to the interferon-beta or interferon-beta variant as an active ingredient.
  • An object of the present invention is to provide a method for treating cancer in which the HER2 expression level is IHC 1+ or higher.
  • interferon-beta or an interferon-beta variant of SEQ ID NO: 1 in which the 27th amino acid residue is substituted with threonine is an object to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer consisting essentially of a HER2 target antibody or fragment thereof, the expression level of HER2 is IHC 1+ or higher.
  • Another aspect of the present invention is an interferon-beta variant of SEQ ID NO: 1 in which an interferon-beta or 27th amino acid residue is substituted with threonine for preparing a cancer therapeutic agent having a HER2 expression level of IHC 1+ or higher; And a composition comprising a HER2 target antibody or fragment thereof.
  • interferon-beta or an interferon-beta variant of SEQ ID NO: 1 in which the 27th amino acid residue is substituted with threonine And administering an effective amount of a composition comprising a HER2 target antibody or fragment thereof to an individual in need thereof, and an object thereof is to provide a method for treating cancer having a HER2 expression level of IHC 1+ or higher.
  • the present invention provides an interferon-beta or an interferon-beta variant of SEQ ID NO: 1 in which the 27th amino acid residue is substituted with threonine; And a recombinant protein comprising a HER2 target antibody or fragment thereof covalently linked directly or indirectly to the interferon-beta or interferon-beta variant as an active ingredient, a pharmaceutical for preventing or treating cancer having a HER2 expression level of IHC 1+ or higher Provide the appropriate composition.
  • the present invention provides an interferon-beta or an interferon-beta variant of SEQ ID NO: 1 in which the 27th amino acid residue is substituted with threonine; And a recombinant protein comprising a HER2 target antibody or fragment thereof covalently linked directly or indirectly to the interferon-beta or interferon-beta variant, providing a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer having a HER2 expression level of IHC 1+ or higher. do.
  • the present invention provides an interferon-beta or an interferon-beta variant of SEQ ID NO: 1 in which the 27th amino acid residue is substituted with threonine; And a recombinant protein comprising a HER2 target antibody or fragment thereof covalently linked directly or indirectly to the interferon-beta or interferon-beta variant, a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer having a HER2 expression level of IHC 1+ or higher Provides.
  • the present invention provides an interferon-beta or an interferon-beta variant of SEQ ID NO: 1 in which the 27th amino acid residue is substituted with threonine for preparing a cancer therapeutic agent having a HER2 expression level of IHC 1+ or higher. ; And it provides the use of a recombinant protein comprising a HER2 target antibody or fragment thereof covalently linked directly or indirectly to the interferon-beta or interferon-beta variant.
  • the present invention provides interferon-beta or an interferon-beta variant of SEQ ID NO: 1 in which the 27th amino acid residue is substituted with threonine; And administering an effective amount of a composition comprising as an active ingredient a recombinant protein comprising a HER2 target antibody or fragment thereof covalently linked directly or indirectly to the interferon-beta or interferon-beta variant as an active ingredient.
  • a method of treating cancer in which the HER2 expression level is IHC 1+ or higher.
  • the present invention provides interferon-beta or an interferon-beta variant of SEQ ID NO: 1 in which the 27th amino acid residue is substituted with threonine; And a HER2 target antibody or a fragment thereof as an active ingredient, an object of which is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer having a HER2 expression level of IHC 1+ or higher.
  • the present invention provides interferon-beta or an interferon-beta variant of SEQ ID NO: 1 in which the 27th amino acid residue is substituted with threonine; And a HER2 target antibody or fragment thereof, and an object thereof is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer having a HER2 expression level of IHC 1+ or higher.
  • the present invention provides interferon-beta or an interferon-beta variant of SEQ ID NO: 1 in which the 27th amino acid residue is substituted with threonine; And it is an object to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer consisting essentially of a HER2 target antibody or fragment thereof, the expression level of HER2 is IHC 1+ or higher.
  • the present invention provides an interferon-beta or an interferon-beta variant of SEQ ID NO: 1 in which the 27th amino acid residue is substituted with threonine for preparing a cancer therapeutic agent having a HER2 expression level of IHC 1+ or higher. ; And a composition comprising a HER2 target antibody or fragment thereof.
  • the present invention provides interferon-beta or an interferon-beta variant of SEQ ID NO: 1 in which the 27th amino acid residue is substituted with threonine; And administering an effective amount of a composition comprising a HER2 target antibody or fragment thereof to an individual in need thereof, and an object thereof is to provide a method for treating cancer having a HER2 expression level of IHC 1+ or higher.
  • Interferon-beta is a globular protein with 5 alpha helixes and is 22kDa in size, tt activity, cell growth inhibition or antiproliferative activity, lymphocyte cytotoxicity enhancing activity, immunomodulatory activity, inducing differentiation of target cells.
  • various immunological activities such as inhibitory activity, macrophage activation activity, cytokine production increase activity, cytotoxic T cell effect increase activity, natural killing cell increase activity, such as cancer, autoimmune disorder, virus There are reports that it is effective in treating infections, HIV-related diseases, hepatitis C, and rheumatoid arthritis.
  • interferon-beta is a strong hydrophobic protein and exhibits an aggregation phenomenon, and its use of interferon-beta is limited due to low biological activity and productivity and short half-life. Therefore, in the present invention, by inducing a site-directed mutagenesis for a recombinant protein conjugated with wild-type interferon-beta or a gene of interferon-beta, the amount of expression in cells compared to wild-type interferon-beta without mutation Recombinant proteins to which improved interferon-beta variants were conjugated were developed.
  • the interferon-beta mutant is characterized in that the 27 th arginine (R) is substituted with threonine (T), thereby including a glycosyl group at the 80 th and 25 th amino acid residues. do.
  • the interferon-beta variant may be represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 encoding the same.
  • These interferon-beta variants include all or part of the amino acid sequence of wild-type interferon-beta, and have interferon-beta activity.
  • Such antibodies include monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, multispecific antibodies (eg, bispecific antibodies) and fragments thereof.
  • Complete antibodies are entirely Y-shaped and consist of two long heavy chains (H) and two short light chains (L). Each heavy chain and light chain are linked to each other by a sulfiding bond, and are divided into a variable region (V), which is a site that reacts with an antigen, and a constant region (C), which is a site that expresses an effect function.
  • V variable region
  • C constant region
  • CDR complementarity-determining region
  • the fragment of the antibody represents a specific site capable of exhibiting antigen-binding activity by reacting with an antigen, for example, a Fab fragment (a fragment by papain digestion), a Fab' fragment (a fragment by pepsin digestion and partial reduction), F ( ab')2 fragment (fragment by pepsin digestion), Facb (fragment by plasmin digestion), Fd (fragment by pepsin digestion, partial reduction and reaggregation), scFv fragment (fragment by molecular biology technique), etc.
  • an antigen for example, a Fab fragment (a fragment by papain digestion), a Fab' fragment (a fragment by pepsin digestion and partial reduction), F ( ab')2 fragment (fragment by pepsin digestion), Facb (fragment by plasmin digestion), Fd (fragment by pepsin digestion, partial reduction and reaggregation), scFv fragment (fragment by molecular biology technique), etc.
  • the antibody is an antibody or fragment thereof that recognizes a
  • the recombinant protein is an interferon-beta or interferon-beta variant; And a fusion or complex formed by connecting the antibody or fragment thereof by a peptide linker.
  • the peptide linker refers to a molecule that connects two or more separate substances to each other by means of short fragments of amino acids or amino acid analogs in which two or more amino acids or amino acid-like substances are linked to each other by peptide bonds.
  • glycine, serine, alanine, and the like are used as major constituent amino acids, and thus a glycine-serine linker, a glycine-serine-alanine linker, and the like may be used.
  • Such a linker may be connected to the heavy chain C-terminus of the antibody or the light chain C-terminus of the antibody, or the N-terminus of the linker may be connected to the light chain C-terminus and the heavy chain C-terminus of the antibody.
  • the N-terminus of the interferon beta variant may be connected to the C-terminus of the linker.
  • the recombinant protein may be a protein represented by SEQ ID NO: 5 having an amino acid sequence in which an interferon-beta variant and a heavy chain of trastuzumab are linked.
  • Interferon-beta has the most potent effect of inhibiting the growth of cancer cells among several cytokines.
  • the treatment using interferon-beta alone acts on the entire body of cancer patients and exhibits various side effects, and from the subject to be treated, fever (80%), muscle pain (73%), headache (50%), fatigue (50%), It is known that symptoms such as boredom (50%) appear.
  • HER2 Human epidermal growth factor receptor 2
  • HER2 Human epidermal growth factor receptor 2
  • ADCC Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity
  • ISH in situ hybridization
  • FISH fluorescent in situ hybridization
  • CISH chromogenic in situ hybridization
  • PCR polymerase chain reaction
  • HER2 targeting antibody treatments for example, HER2 overexpressing cancer cells that are prescribed trastuzumab have a HER2 expression level of IHC 3+ or a HER2 expression level of IHC 2+ and fluorescence in situ hybridization (FISH).
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • composition provided by the present invention is characterized in that it is administered to a group of patients whose conventional HER2 target antibody therapeutics, such as trastuzumab, cannot be prescribed, or is difficult to expect a significant therapeutic effect even if prescribed to exert a therapeutic effect. .
  • the composition of the present invention may be characterized in that it is for the prevention or treatment of cancer having a HER2 expression level of IHC 1+ or higher.
  • the composition of the present invention may be characterized in that it is for the prevention or treatment of cancer, wherein the HER2 expression level is IHC 1+, or IHC 2+ in combination with negative FISH.
  • the composition of the present invention may be characterized in that it is for the prevention or treatment of breast cancer or gastric cancer having a HER2 expression level of IHC 1+ or higher.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated in various ways according to the route of administration by a method known in the art together with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • “Pharmacologically acceptable” refers to a non-toxic composition that is physiologically acceptable and, when administered to humans, does not inhibit the action of the active ingredient, and does not usually cause allergic reactions such as gastrointestinal disorders, dizziness or similar reactions.
  • the carrier includes all kinds of solvents, dispersion media, oil-in-water or water-in-oil emulsions, aqueous compositions, liposomes, microbeads and microsomes.
  • the route of administration may be administered orally or parenterally.
  • Parenteral administration methods include, but are not limited to, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, sublingual or rectal administration I can.
  • suitable carriers include sugars including lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol and maltitol, and starches including corn starch, wheat starch, rice starch and potato starch, cellulose, Fillers such as celluloses including methyl cellulose, sodium carboxymethylcellulose and hydroxypropylmethylcellulose, gelatin, and polyvinylpyrrolidone may be included. In addition, in some cases, cross-linked polyvinylpyrrolidone, agar, alginic acid or sodium alginate may be added as a disintegrant. Furthermore, the pharmaceutical composition may further include an anti-aggregating agent, a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, an emulsifying agent and a preservative.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated according to a method known in the art in the form of an injection, transdermal administration, and nasal inhalation together with a suitable parenteral carrier.
  • a suitable parenteral carrier In the case of such injections, they must be sterilized and protected from contamination by microorganisms such as bacteria and fungi.
  • suitable carriers for injections include, but are not limited to, water, ethanol, polyol (eg, glycerol, propylene glycol and liquid polyethylene glycol, etc.), a mixture thereof and/or a solvent or dispersion medium containing vegetable oil. I can.
  • suitable carriers include isotonic solutions such as Hanks' solution, Ringer's solution, phosphate buffered saline (PBS) containing triethanolamine or sterile water for injection, 10% ethanol, 40% propylene glycol and 5% dextrose. Etc. can be used.
  • PBS phosphate buffered saline
  • various antibacterial and antifungal agents such as paraben, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, thimerosal, and the like may be additionally included.
  • the injection may further include an isotonic agent such as sugar or sodium chloride in most cases.
  • transdermal administration means that the pharmaceutical composition is topically administered to the skin, so that an effective amount of the active ingredient contained in the pharmaceutical composition is delivered into the skin.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared in an injection form and administered by a method of lightly pricking the skin with a 30 gauge thin injection needle or directly applying it to the skin. These formulations are described in prescriptions generally known in pharmaceutical chemistry.
  • the compounds used according to the invention can be used in pressurized packs or with suitable propellants, for example dichlorofluoromethane, trichlorofluoromethane, dichlorotetrafluoroethane, carbon dioxide or other suitable gas. It can be conveniently delivered from a nebulizer in the form of an aerosol spray.
  • the dosage unit can be determined by providing a valve that delivers a metered amount.
  • gelatin capsules and cartridges for use in an inhaler or insufflator can be formulated to contain a powder mixture of the compound and a suitable powder base such as lactose or starch.
  • suitable powder base such as lactose or starch.
  • Other pharmaceutically acceptable carriers may refer to those known in the art.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention includes one or more buffers (e.g., saline or PBS), carbohythrate (e.g., glucose, mannose, sucrose or dextran), antioxidants, bacteriostatic agents, chelating agents (Eg, EDTA or glutathione), adjuvants (eg, aluminum hydroxide), suspending agents, thickening agents and/or preservatives may further be included.
  • buffers e.g., saline or PBS
  • carbohythrate e.g., glucose, mannose, sucrose or dextran
  • antioxidants e.g., bacteriostatic agents, chelating agents (Eg, EDTA or glutathione), adjuvants (eg, aluminum hydroxide), suspending agents, thickening agents and/or preservatives may further be included.
  • bacteriostatic agents e.g., chelating agents (Eg, EDTA or glutathione)
  • compositions of the present invention may be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal.
  • step b) selecting a patient with HER2-positive cancer having IHC 1+ or higher in step b);
  • trastzumab and Pertuzumab which are currently commercially available HER2 antibody treatments, are used to treat patients with HER2 positive breast cancer or gastric cancer.
  • Immunohistochemistry (IHC) was performed from cancer tissues of HER2 patients, and the expression level was very high (IHC 3+), or the expression level was medium (IHC 2+), and it was used only for patients with positive FISH results. This is because antibody treatments are ineffective in patients with low HER2 expression.
  • the HER2 antibody therapeutic agent and interferon-beta or interferon-beta variant fusion protein provided by the present invention are used to block HER2 signal transduction and ADCC, which are anticancer effects of the existing HER2 antibody therapeutic agents, while maintaining the interferon-beta or interferon-beta variant.
  • ADCC anticancer effects of the existing HER2 antibody therapeutic agents
  • the patient is selected based on the expression level of IHC 1+ or higher by performing IHC from the cancer tissue of the cancer patient.
  • step c) patients with IHC 2+ may be selected to further perform FISH analysis.
  • step d) can be performed for FISH-negative patients among IHC 2+ patients.
  • the present invention provides an interferon-beta or an interferon-beta variant of SEQ ID NO: 1 in which the 27th amino acid residue is substituted with threonine for preparing a cancer therapeutic agent having a HER2 expression level of IHC 1+ or higher; And it provides the use of a recombinant protein comprising a HER2 target antibody or fragment thereof covalently linked directly or indirectly to the interferon-beta or interferon-beta variant.
  • the present invention provides interferon-beta or an interferon-beta variant of SEQ ID NO: 1 in which the 27th amino acid residue is substituted with threonine; And administering an effective amount of a composition comprising as an active ingredient a recombinant protein comprising a HER2 target antibody or fragment thereof covalently linked directly or indirectly to the interferon-beta or interferon-beta variant as an active ingredient.
  • a method of treating cancer in which the HER2 expression level is IHC 1+ or higher.
  • the term'effective amount' of the present invention is an amount showing an effect of improving, treating, detecting, diagnosing, or inhibiting the progression of cancer with a HER2 expression level of IHC 1+ or higher when administered to an individual.
  • The'individual' may be an animal, preferably an animal including a mammal, especially a human, and may be a cell, tissue, organ, etc. derived from an animal. The individual may be a patient in need of the effect.
  • The'treatment' of the present invention refers generically to improving the symptoms of cancer or cancer with a HER2 expression level of IHC 1+ or higher, which cures, substantially prevents, or improves the condition of the HER2 positive cancer. It may include, and includes, but is not limited to, alleviating, curing, or preventing one symptom or most of the symptoms resulting from the disease.
  • the term “comprising” is used with the same meaning as “including” or “characterized by”, and in the composition or method according to the present invention, specifically mentioned It does not exclude additional components or method steps that have not been made.
  • the term “consisting of” means excluding additional elements, steps, or ingredients that are not separately described.
  • the term “essentially consisting of” means that, in the scope of a composition or method, it is possible to include substances or steps that do not substantially affect their basic properties in addition to the substances or steps described.
  • the present invention provides interferon-beta or an interferon-beta variant of SEQ ID NO: 1 in which the 27th amino acid residue is substituted with threonine; And it provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer comprising a HER2 target antibody or a fragment thereof as an active ingredient, HER2 expression level of IHC 1+ or higher.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention comprises interferon-beta or an interferon-beta variant of SEQ ID NO: 1 in which the 27th amino acid residue is substituted with threonine; And by co-administering the HER2 target antibody or fragment thereof, it acts to increase the effect of preventing and treating cancer with a HER2 expression level of IHC 1+ or higher.
  • the combined administration effect as described above is disclosed for the first time in the present invention.
  • the term'synergy' means that the effect generated when each component is administered in combination is greater than the sum of the effects generated when administered alone as a single component, as described in the literature. (Chou and Talalay, Adv. Enzyme. Regul., 22:27-55, 1984).
  • the term'administered in combination' means that two or more components are administered together to a subject. That each component is administered together means that each component can be administered sequentially at the same time or in any order or at different times in order to obtain the desired therapeutic effect.
  • each component may be administered simultaneously (simultaneously), separately (separately) or sequentially (sequentially).
  • each component included in the pharmaceutical composition of the present invention when it is in a single composition, it can be administered simultaneously, and when not in a single composition, one component and the other component are administered. It can be administered before, after and/or simultaneously with other ingredients.
  • the order of administration of the pharmaceutical composition according to the present invention that is, at what point, at which time, whether or not to be administered individually or sequentially may be determined by a doctor or an expert. The order of these administrations can depend on many factors.
  • the composition of the present invention may be characterized in that it is for the prevention or treatment of cancer having a HER2 expression level of IHC 1+ or higher.
  • the composition of the present invention may be characterized in that it is for the prevention or treatment of cancer in which the HER2 expression level is IHC 1+ or IHC 2+ in combination with negative FISH.
  • the composition of the present invention may be characterized in that it is for the prevention or treatment of breast cancer or gastric cancer having a HER2 expression level of IHC 1+ or higher.
  • the composition of the present invention may be characterized in that it is for the prevention or treatment of breast cancer or gastric cancer in which the HER2 expression level is IHC 1+ or IHC 2+ in combination with negative FISH.
  • the present invention also provides interferon-beta or an interferon-beta variant of SEQ ID NO: 1 in which the 27th amino acid residue is substituted with threonine for preparing a cancer therapeutic agent having a HER2 expression level of IHC 1+ or higher; And a HER2 target antibody or fragment thereof.
  • the recombinant protein in which an interferon-beta or interferon-beta variant according to the present invention and a HER2 target antibody or fragment thereof are bound may be used for the purpose of treating patients with HER2-positive cancer.
  • a greater number of patients can benefit from treatment than conventional HER2 antibody treatments.
  • Trastuzumab-IFN ⁇ mutein is a result of purification of Trastuzumab-IFN ⁇ mutein. This is the result of performing SDS-PAGE using affinity chromatography purified protein using a protein A bead column as a first step and purified protein subjected to ion exchange chromatography as a second step.
  • Figure 2 is a graph of the direct cytotoxicity results of Trastuzumab and Trastuzumab-IFN ⁇ mutein. After culturing NCI-N87 cells in a 96 well plate, after 72 hours after treatment with Trastuzumab or Trastuzumab-IFN ⁇ mutein by concentration, the percentage of living cells was confirmed through WST assay. Cytotoxicity was not observed in the group treated with Trastuzumab, but it was confirmed that only the group treated with Trastuzumab-IFN ⁇ mutein showed cytotoxic effect.
  • FIG. 3 is a graph of cytotoxicity results through indirect immune activation of Trastuzumab and Trastuzumab-IFN ⁇ mutein. After culturing NCI-N87 cells in a 96-well plate, Trastuzumab or Trastuzumab-IFN ⁇ mutein was treated with PBMC by concentration, and 48 hours later, the percentage of living cells was confirmed through WST assay.
  • FIG. 4A to 4C are the results of analyzing the HER2 binding ability of Trastuzumab and Trastuzumab-IFN ⁇ mutein by flow cytometry.
  • MCF-7 (Fig. 4a), MDA-MB-231 (Fig. 4b), NCI-N87 (Fig. 4c) three types of cell lines reacted with Trastuzumab or Trastuzumab-IFN ⁇ mutein, respectively, and the degree of HER2 binding of each protein by flow cytometry was confirmed.
  • FIG. 5 is a result of comparing the amount of HER2 expression by western blotting in breast cancer cell lines and gastric cancer cell lines. Each cell line was classified into HER2 Low expression, HER2 intermediate expression, and HER2 High expression according to the amount of HER2 expression.
  • 6A and 6B are direct cytotoxic results of Trastuzumab and Trastuzumab-IFN ⁇ mutein in gastric cancer cell lines. After culturing gastric cancer cell lines with different HER2 expression levels in a 96 well plate, after 72 hours after treatment with Trastuzumab or Trastuzumab-IFN ⁇ mutein at different concentrations, the percentage of living cells was confirmed through WST assay.
  • 7A and 7B are direct cytotoxic results of Trastuzumab and Trastuzumab-IFN ⁇ mutein in breast cancer cell lines. After culturing breast cancer cell lines with different HER2 expression levels in a 96-well plate, Trastuzumab or Trastuzumab-IFN ⁇ mutein was treated by concentration, and 72 hours later, the percentage of living cells was confirmed through WST assay.
  • 8A and 8B are cytotoxic results through indirect immune activation of Trastuzumab and Trastuzumab-IFN ⁇ mutein in gastric cancer cell lines. After culturing cell lines with different HER2 expression levels in a 96-well plate, each concentration of Trastuzumab or Trastuzumab-IFN ⁇ mutein was treated with PBMC, and 48 hours later, the percentage of living cells was confirmed through WST assay.
  • pCHO 1.0 (Life Technologies) was used as an expression vector.
  • Trastuzumab was used as an antibody, and a variant in which the 27th amino acid residue was substituted with threonine was used as interferon-beta.
  • the interferon-beta variant was bound to the heavy chain region of the antibody.
  • the linker was cloned into the heavy chain portion of the antibody, and interferon-beta variants were cloned thereto. Thereafter, a restriction enzyme AvrII (CCTAGG) cleavage site and a Bstz17I (GTATAC) cleavage site (Thermo Scientific, USA) were inserted into the 3′ and 5′ ends of the entire gene, respectively, to obtain the final gene of the heavy chain.
  • AvrII CCTAGG
  • GTATAC Bstz17I
  • trastuzumab-binding interferon-beta mutant Trastuzumab-IFN ⁇ mutein expression vector was transduced into CHO-S cells (Thermo Scientific) using FreeStyleTM MAX reagent (Thermo Scientific). A mixture of FreeStyleTM MAX reagent-DNA complex to which OptiPROTM SFM (Thermo Scientific) was added was added to CHO-S in a flask, and incubated under a humid atmosphere of 8% CO2 atmospheric pressure. Stable transduction for expression of the fusion protein was selected 48 hours after transduction. Cells were sorted through secondary screening with 10 to 50 ⁇ g/mL of puromycin and 100 to 1,000 nM of MTX. Selected cells were incubated with glucose to express the fusion protein for 14 days under conditions of 8% CO 2 atmospheric pressure, 130 rpm, humid, at 37°C.
  • the fusion protein expressed in CHO-S cells was purified by affinity chromatography and ion exchange chromatography. After passing the CHO-S culture solution through a column filled with Protein A Mabselect sure (GE Healthcare), the equilibration buffer, wash buffer, and elution buffer were sequentially added. Was added to obtain a purified protein. In the case of the ion exchange chromatography purification method, the fusion protein obtained by affinity chromatography purification was passed through a column filled with HiTrap Q FF (GE healthcare), and an elution buffer was added to obtain a purified protein.
  • HiTrap Q FF GE healthcare
  • NCI-N87 Human gastric carcinoma (NCI-N87) cell line, human breast cancer (MCF-7, MDA-MB-231) cell line was purchased from Korean Cell Line Bank (KCLB). .
  • NCI-N87, MDA-MB-231, and MCF-7 cells were recovered using cell dissociation buffer (Enzyme-Free, PBS-based) (Gibco) and then in cold PBS (containing 2% FBS). The activity was inhibited at 4°C for 1 hour. After washing the cells three times with PBS, 1 ⁇ g of Trastuzumab, Trastuzumab-IFN ⁇ mutein diluted with PBS and incubated at 4° C. for 30 minutes. The cells were washed 3 times with PBS and incubated with Gaot anti Human IgG FITC (Jackson) for 30 minutes at 4°C. Fluorescent antibodies were measured by Flow cytometry (CytoFLEX Flow Cytometer) (Beckman Coulter).
  • HRP horseradish peroxidase
  • NCI-N87 cells, SNU1 cells, SNU620 cells, Hs746T cells, and KATOIII cells were added to each well of 3.0 x 103 (100 ul) cells.
  • the culture was divided into a treatment group and a T-DM1 treatment group.
  • the trastuzumab treatment group, IFN ⁇ -R27T treatment group, trastuzumab-R27T treatment group, and T-DM1 treatment group were treated to a concentration of 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10, 100 nM, and cultured for 72 hours. .
  • trastuzumab treatment group The culture was divided into trastuzumab-R27T treatment group and IFN ⁇ treatment group. The next day, the trastuzumab treatment group, the trastuzumab-R27T treatment group, and the IFN ⁇ treatment group were treated to a concentration of 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10, 100 nM, and cultured for 72 hours.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • EZ-Cytox (Daeil Biotech) was added to each well, and reacted in an incubator for 4 hours. The absorbance was measured and compared at 450 nm using a Sunrise microplate reader (TEKAN).
  • TEKAN Sunrise microplate reader
  • Trastuzumab-IFN ⁇ mutein and a cell line expressing Trastuzumab were used and expressed and purified under the same conditions.
  • Expression conditions were CHO-S cell line was cultured for 10 days at 37 °C, 5% CO2.
  • the expression concentration of the fusion protein in the cell culture was measured using Cedex-bio (Roche), and purified by affinity chromatography using an AKTA instrument system and protein A bead. After that, the secondary purification was performed using ion exchange chromatography.
  • the direct cytotoxic efficacy of the fusion protein and the indirect anti-cancer efficacy through immune activation were measured through the WST assay method.
  • Trastuzumab-IFN ⁇ mutein showed direct cytotoxic effect on NCI-N87 cells, and Trastuzumab did not show cytotoxic effect. This means that the cytotoxic effect by blocking signal transduction of Trastuzumab is not significant.
  • Trastuzumab-IFN ⁇ mutein showed cytotoxic efficacy through the activation of immune cells against NCI-N87 cells, and showed superior cancer cytotoxic efficacy compared to Trastuzumab.
  • Western blot was performed to compare the expression levels of HER2 in breast cancer cell lines and gastric cancer cell lines.
  • the expression levels of HER2 of breast cancer cell lines HCC1954, BT-474, MDA-MB-231, BT-549 and gastric cancer cell lines NCI-N87, KATOIII, Hs746T, MKN74, HFE145, SNU1 and SNU620 were compared and classified into 3 types.
  • HER2 Low expression is MDA-MB231 cells and BT-549 cells among breast cancer cells, and HS746T cells and KATOIII cells among gastric cancer cells.
  • the HER2 intermediate expression is MDA-MB-453 cells among breast cancer cells, SNU1 cells among gastric cancer cells, and SNU620 cells.
  • HER2 High expression is BT-474 cells and HCC1954 cells among breast cancer cells, and NCI-N87 cells among gastric cancer cells.
  • the direct cytotoxicity of the fusion protein was measured against NCI-N87 cells with high HER2 expression, SNU1 cells with medium HER2 expression, SNU620 cells, Hs746T cells with low HER2 expression, and KATOIII cells.
  • Trastuzumab-IFN ⁇ mutein showed direct cytotoxic efficacy even for cells with medium HER2 expression and gastric cancer cells with low expression, and Trastuzumab did not show cytotoxic effects. .
  • Trastuzumab-IFN ⁇ mutein showed direct cytotoxic effects to cells with intermediate HER2 expression levels and breast cancer cells with low expression levels.
  • NCI-N87 cells with high HER2 expression levels were co-cultured with PBMCs, and Hs746T cells with low HER2 expression levels were co-cultured with PBMCs to compare PBMC-mediated cytotoxic effects. Indirect anticancer efficacy through immune activation was measured.
  • Trastuzumab-IFN ⁇ mutein showed cytotoxic efficacy through immune cell activity not only against NCI-N87 cells but also Hs746T cells with a low HER2 expression level, compared to Trastuzumab. It was confirmed that it shows cytotoxic efficacy.

Abstract

본 발명은 인터페론-베타와 HER2 항원에 결합하는 항체가 융합된 재조합 단백질을 HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 환자 치료 목적으로 사용하기 위한 용도에 관한 것이다. 상기 재조합 단백질은 환자에서 암 특이적인 항암 면역 작용을 통해 기존 항체치료제보다 뛰어난 효능을 보일 수 있으므로, 더 많은 암 환자에게 사용됨으로써 새로운 암 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

사람 표피성장인자수용체 2 양성 암을 치료하기 위한 인터페론-베타 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인의 용도
본 출원은 2019년 8월 19일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2019-0101351호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 인터페론-베타와 사람 표피성장인자수용체 2(human epidermal growth factor receptor 2; HER2) 항체가 융합된 재조합 단백질의 암 치료 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인터페론 또는 인터페론-베타 변이체와 HER2 항체가 융합된 재조합 단백질의 HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 치료 용도에 관한 것이다.
인터페론(interferon; IFN)은 면역에서 중요한 역할을 하는 주요 사이토카인(cytokine) 중 하나로, 강력한 항암 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 인터페론은 타입 I (IFN-α 및 IFN-β), 타입 II (IFN-γ), 타입 III (IFN-λ)로 구분된다.
타입 I 인터페론은 항바이러스, 항증식(antiproliferative) 효과를 나타내며, 종양 특이 항원(tumor specific antigen)을 인지하여 종양 세포를 제거하는 기능인 면역감시(cancer immunosurveillance)에도 필수적인 역할을 한다. 타입 I 인터페론 중에서도 IFN-β는 세포 성장을 억제하는 효과가 IFN-α에 비해 더 강력하다. 특히, 항암제와 함께 사용할 경우에는 IFN-β의 항증식 활성 범위 및 시너지 효과가 매우 우수하다. 그러나, 인터페론을 이용한 치료제는 세포 독성이 커 치료 대상자로부터 열 (80%), 근육통 (73%), 두통 (50%), 피로 (50%), 권태감 (50%) 등의 증상이 나타나는 것으로 알려져 있다.
트라스투주맙(Trastuzumab)은 사람 표피성장인자수용체 2(human epidermal growth factor receptor 2; HER2)를 표적으로 하는 항체 암치료제로, HER2 양성 암 환자를 치료하기 위한 목적으로 사용되고 있다. 그러나 트라스투주맙 단독 투여만으로는 치료 효과가 충분하지 않기 때문에, HER2를 표적으로 하는 다른 항체치료제인 퍼투주맙(Pertuzumab)과 화학치료제(Chemotherapeutic)을 병용 투여하고 있다. 또한 HER2 양성 암 환자 중에서도 HER2의 발현량이 높은 일부 환자군에서만 사용되고 있으며, 치료제 투여 이후 암이 재발하거나 HER2 치료제에 저항성을 생기기도 하는 등의 한계점이 있다.
구체적으로, 트라스투주맙 및 퍼투주맙(pertuzumab)과 같이 최근 HER2 양성인 암 치료에 사용되고 있는 치료제는 세포 표면에 1,000,000개 초과의 HER2 수용체를 가지는 악성의 HER2 양성인 종양세포를 갖는 환자에게만 임상적 반응을 획득하기 위해 처방된다. 세포 표면에 1,000,000개 초과의 HER2 수용체를 갖는 악성의 HER2 양성 종양세포를 갖는 환자는 전형적으로 HER2 IHC 3+로 분류된다. 또는, 트라스투주맙 및 퍼투주맙은 HER2의 발현 수준이 IHC 2+이면서 형광 인 시투 혼성화(Fluorescence in situ hybridization, FISH) 분석결과 HER2 유전자 증폭이 있는, 즉 당업자에 의해 FISH 양성으로 판정된 환자에게 처방이 될 수 있다.
환자들은, 예를 들어 Dako Denmark A/S에서 제공하는 HercepTest TM 및/또는 HER2 FISH(pharm Dx TM)를 이용하거나 Monogram Biosciences에서 제공하는 HERmark ® 어세이를 이용하여 HER2 발현 수준별로 분류된다. HER2 발현수준이 낮은 종양세포를 갖는 환자, 즉, HER2 발현 수준이 IHC 1+이거나, IHC 2+이면서 FISH 음성인 환자는 트라스투주맙 및 퍼투주맙을 투약하였을 때 전형적으로 충분한 임상적 반응을 보이지 않기 때문에, 트라스투주맙과 퍼투주맙은 제한된 환자에게만 처방이 된다는 한계가 있다.
한편, 타입 I 인터페론의 신호전달(signaling)은 인터페론 수용체의 활성에 의해 다수의 효소가 단계적으로 활성화되는 것으로, 이때 STAT1, STAT2 등의 전사 인자도 작용한다. 이러한 신호전달은 면역 시스템을 작동시키며, 안트라사이클린 등과 같은 화학치료제(chemotherapeutic), 사람 표피성장인자수용체 2(human epidermal growth factor receptor 2; HER2), 표피성장인자수용체(epidermal growth factor receptor; EGFR) 등과 같이 성장인자수용체(growth factor receptor)를 표적으로 하는 항체, 보조제(adjuvants) 투여, 종양세포붕괴성 바이러스치료(oncolytic virotherapy) 등 다양한 항암제에 대한 항암 효과를 나타내는데도 필수적이다. 특히, 트라스투주맙의 치료 저항성 기전에 관련된 신호 물질 중 하나인 pSTAT3는 두 개의 동일한 물질이 중합된 형태 (pSTAT3 homodimer)를 가지며, pSTAT1에 의해 억제되는 것으로 알려져 있다. 따라서 pSTAT1을 활성화시키는 타입 I 인터페론을 트라스투주맙과 결합하였을 때 증가된 항암 효능을 기대할 수 있다.
이에 따라, 본 발명자들은 인터페론-베타와 HER2 표적 항체가 융합된 재조합 단백질을 제작함으로써 기존 HER2 항체치료제와 비교하여 효능이 증가된 새로운 치료제를 개발하였다. 본 융합단백질 치료제는 기존 HER2 항체치료제와는 달리 HER2의 발현량이 낮은 환자에서도 효능을 보이며, 암이 재발할 확률을 낮추는 효과가 있으므로 새로운 항암 치료제로 활용될 수 있다.
본 발명의 일 양상은 인터페론-베타 또는 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 서열번호 1의 인터페론-베타 변이체; 및 상기 인터페론-베타 또는 인터페론-베타 변이체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 HER2 표적 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는, HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 일 양상은 인터페론-베타 또는 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 서열번호 1의 인터페론-베타 변이체; 및 상기 인터페론-베타 또는 인터페론-베타 변이체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 HER2 표적 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질로 이루어진, HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 일 양상은 인터페론-베타 또는 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 서열번호 1의 인터페론-베타 변이체; 및 상기 인터페론-베타 또는 인터페론-베타 변이체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 HER2 표적 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질로 필수적으로 이루어진, HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 일 양상은 HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 치료제를 제조하기 위한, 인터페론-베타 또는 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 서열번호 1의 인터페론-베타 변이체; 및 상기 인터페론-베타 또는 인터페론-베타 변이체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 HER2 표적 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 일 양상은 인터페론-베타 또는 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 서열번호 1의 인터페론-베타 변이체; 및 상기 인터페론-베타 또는 인터페론-베타 변이체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 HER2 표적 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 치료 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 일 양상은 인터페론-베타 또는 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 서열번호 1의 인터페론-베타 변이체; 및 HER2 표적 항체 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는, HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 일 양상은 인터페론-베타 또는 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 서열번호 1의 인터페론-베타 변이체; 및 HER2 표적 항체 또는 이의 단편으로 이루어진, HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 일 양상은 인터페론-베타 또는 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 서열번호 1의 인터페론-베타 변이체; 및 HER2 표적 항체 또는 이의 단편으로 필수적으로 이루어진, HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 일 양상은 HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 치료제를 제조하기 위한, 인터페론-베타 또는 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 서열번호 1의 인터페론-베타 변이체; 및 HER2 표적 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 일 양상은 인터페론-베타 또는 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 서열번호 1의 인터페론-베타 변이체; 및 HER2 표적 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 치료 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명은 인터페론-베타 또는 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 서열번호 1의 인터페론-베타 변이체; 및 상기 인터페론-베타 또는 인터페론-베타 변이체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 HER2 표적 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는, HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 일 구체예에 따르면, 본 발명은 인터페론-베타 또는 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 서열번호 1의 인터페론-베타 변이체; 및 상기 인터페론-베타 또는 인터페론-베타 변이체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 HER2 표적 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질로 이루어진, HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 일 구체예에 따르면, 본 발명은 인터페론-베타 또는 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 서열번호 1의 인터페론-베타 변이체; 및 상기 인터페론-베타 또는 인터페론-베타 변이체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 HER2 표적 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질로 필수적으로 이루어진, HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 구체예에 따르면, 본 발명은 HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 치료제를 제조하기 위한, 인터페론-베타 또는 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 서열번호 1의 인터페론-베타 변이체; 및 상기 인터페론-베타 또는 인터페론-베타 변이체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 HER2 표적 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 구체예에 따르면, 본 발명은 인터페론-베타 또는 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 서열번호 1의 인터페론-베타 변이체; 및 상기 인터페론-베타 또는 인터페론-베타 변이체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 HER2 표적 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 구체예에 따르면, 본 발명은 인터페론-베타 또는 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 서열번호 1의 인터페론-베타 변이체; 및 HER2 표적 항체 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는, HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 일 구체예에 따르면, 본 발명은 인터페론-베타 또는 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 서열번호 1의 인터페론-베타 변이체; 및 HER2 표적 항체 또는 이의 단편으로 이루어진, HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 일 구체예에 따르면, 본 발명은 인터페론-베타 또는 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 서열번호 1의 인터페론-베타 변이체; 및 HER2 표적 항체 또는 이의 단편으로 필수적으로 이루어진, HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 일 구체예에 따르면, 본 발명은 HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 치료제를 제조하기 위한, 인터페론-베타 또는 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 서열번호 1의 인터페론-베타 변이체; 및 HER2 표적 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 일 구체예에 따르면, 본 발명은 인터페론-베타 또는 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 서열번호 1의 인터페론-베타 변이체; 및 HER2 표적 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 치료 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
이하 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 인터페론-베타 또는 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 서열번호 1의 인터페론-베타 변이체; 및 상기 인터페론-베타 또는 인터페론-베타 변이체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 HER2 표적 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는, HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
인터페론-베타(IFN-β)는 5개의 알파 헬릭스를 가지고 있는 구형 단백질로서 크기가 22kDa 이며, tt 활성, 세포 성장 억제 또는 항증식 활성, 림프구 세포 독성 증대 활성, 면역 조절 활성, 표적 세포의 분화 유도 또는 억제 활성, 대식세포의 활성화 활성, 사이토카인 생성의 증가 활성, 세포독성 T 세포의 효과 증가 활성, 자연 살해 세포(natural killing cell)의 증가 활성 등 다양한 면역학적 활성으로 암, 자가 면역 장애, 바이러스 감염, HIV와 관련된 질병, C형 간염, 류마티스성 관절염 등에 치료에 효과가 있다는 보고가 있다. 그러나, 인터페론-베타는 강한 소수성 단백질로 응집 현상을 나타나며, 생물 활성 및 생산성이 낮고 반감기가 짧아 인터페론-베타의 활용에 제한점이 있었다. 따라서, 본 발명에서는 야생형의 인터페론-베타가 접합된 재조합 단백질 또는 인터페론-베타의 유전자에 대해 부위 특이적 변이(site-directed mutagenesis)를 유도함으로써 변이가 일어나지 않은 야생형 인터페론-베타에 비해 세포 내 발현량이 개선된 인터페론-베타 변이체가 접합된 재조합 단백질을 개발하였다.
상기 인터페론-베타 변이체(interferon beta mutein)는 27번째 아르기닌(arginine; R)이 트레오닌(threonine; T)으로 치환됨으로써, 80번째 및 25번째 아미노산 잔기에 글리코실기(glycosyl group)를 포함하는 것을 특징으로 한다. 이때, 인터페론-베타 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이를 암호화하는 서열번호 2의 염기 서열로 표시되는 것일 수 있다. 이러한 인터페론-베타 변이체는 야생형 인터페론-베타의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 것으로, 인터페론-베타의 활성을 갖는다.
상기 항체는 단클론성 항체, 다클론성 항체, 다중특이성 항체 (예를 들면, 이중특이성 항체) 및 이의 단편을 포함한다. 완전한 항체는 전체적으로 Y 모양을 하며, 2개의 긴 중쇄(heavy chain; H)과 2개의 짧은 경쇄(light chain; L)로 구성된다. 각 중쇄와 경쇄는 서로 황화결합으로 연결되며, 항원과 반응하는 부위인 가변영역(variable region; V)와 효과기능을 발현하는 부위인 불변영역(constant region; C)로 구분된다. 가변영역에는 항원과 특이적인 결합을 형성할 수 있도록 가변영역의 구조를 결정하며 항체결합세기를 조절하는 상보성 결정 부위(complementarity-determining region; CDR)가 존재한다. 상기 항체의 단편은 항원과 반응하여 항원-결합 활성을 나타낼 수 있는 특정 부위를 나타내며, 일례로 Fab 단편 (파파인 소화에 의한 단편), Fab' 단편 (펩신 소화 및 부분적 환원에 의한 단편), F(ab')2 단편 (펩신 소화에 의한 단편), Facb(플라스민 소화에 의한 단편), Fd (펩신 소화, 부분적 환원 및 재응집에 의한 단편), scFv 단편(분자생물학 기법에 의한 단편) 등일 수 있다. 바람직하게는, 항체는 종양 특이 항원을 인지하는 항체 또는 이의 단편인 것으로, 암 등의 표적치료제로 사용 가능할 수 있다. 일례로는, 사람 표피성장인자수용체 2(HER2)를 표적으로 하는 항체 치료제인 트라스투주맙 또는 퍼투주맙 일 수 있다. 이때, 트라스투주맙은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄로 구성될 수 있다.
상기 재조합 단백질은 인터페론-베타 또는 인터페론-베타 변이체; 및 항체 또는 이의 단편이 펩티드 링커에 의해 연결되어 형성된 융합체 또는 복합체일 수 있다. 상기 펩티드 링커는 아미노산 또는 아미노산과 유사한 물질이 서로 펩티드 결합에 의해 둘 이상이 연결된 짧은 단편의 아미노산 또는 아미노산 유사체로 둘 이상의 별개의 물질을 서로 연결시켜 주는 역할을 하는 분자를 말한다. 이때, 글리신, 세린, 알라닌 등이 주요 구성 아미노산으로 이용되어 글리신-세린 링커, 글리신-세린-알라닌 링커 등을 사용할 수 있다. 이러한 링커는 항체의 중쇄 C-말단 또는 항체의 경쇄 C-말단에 연결되거나, 또는 항체의 경쇄 C-말단과 중쇄 C-말단에 링커의 N-말단이 연결될 수도 있다. 이때, 링커의 C-말단에는 인터페론 베타 변이체의 N-말단이 연결될 수 있다. 상기 재조합 단백질은 인터페론-베타 변이체와 트라스투주맙의 중쇄가 연결된 아미노산 서열을 갖는 서열번호 5로 표시되는 단백질일 수 있다.
인터페론-베타는 여러 사이토카인 중에서도 암 세포의 성장을 억제하는 효과가 가장 강력하다. 그러나, 인터페론-베타를 단독으로 이용한 치료제는 암 환자의 전신에 작용하여 여러 부작용을 나타내며, 치료 대상자로부터 열 (80%), 근육통 (73%), 두통 (50%), 피로 (50%), 권태감 (50%) 등의 증상이 나타나는 것으로 알려져 있다.
사람 표피성장인자수용체 2(HER2)는 주로 유방암, 위암에서 과발현 되어있는 티로신 카이네이즈 수용체(Tyrosine Kinase Receptor)의 일종으로 크기가 185kDa 이며, 다양한 세포 내 신호전달체계를 활성화하여 세포 성장을 촉진하는 역할을 한다. 따라서 HER2의 활성을 특이적으로 억제하고, 항체 의존성 세포 독성(Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity, ADCC)을 통해 항암 효과를 나타내는 다양한 HER2 표적 항체치료제들이 개발되어 현재 환자들에게 사용되고 있다. 그러나 HER2 항체치료제 단독으로는 치료 효과가 충분하지 않기 때문에, HER2를 표적으로 하는 다른 항체치료제인 퍼투주맙(Pertuzumab)과 화학치료제(Chemotherapeutic)을 병용 투여하고 있다. 또한 HER2 양성 암 환자 중에서도 HER2의 발현량이 높은 일부 환자군에서만 항체치료제가 사용되고 있으며, 치료제 투여 이후 암이 재발하거나 기존 HER2 치료제에 저항성을 생기기도 하는 등의 한계점이 있다. 특히, 트라스투주맙의 치료 저항성 기전에 관련된 신호 물질 중 하나인 pSTAT3는 두 개의 동일한 물질이 중합된 형태 (pSTAT3 homodimer)를 가지며, pSTAT1에 의해 억제되는 것으로 알려져 있다. 따라서 pSTAT1을 활성화시키는 인터페론-베타를 트라스투주맙과 결합하였을 때 증가된 항암 효능을 기대할 수 있다.
한편, HER2 표적 항체치료제들, 예를 들어 트라스투주맙은 일반적으로 HER2 수용체가 과발현되어 있는 암 세포의 치료를 위해 처방된다. HER2 수용체 과발현을 갖는 암 세포는 동일한 조직 유형의 비암성 세포와 비교할 때 상당히 더 높은 수준의 HER2 수용체 단백질 또는 유전자를 갖는다. 이러한 과발현은 유전자 증폭에 의해서 또는 증가된 전사 또는 번역에 의해서 유발될 수 있다. HER2 수용체 과발현 또는 증폭은 (예를 들어, 면역조직화학 검정; IHC를 통해서) 세포의 표면 상에 존재하는 HER2 단백질의 증가된 수준을 평가함으로써 진단 또는 예후 검정으로 결정될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 예를 들어, 형광 인 시투 혼성화(FISH) 및 발색 인 시투 혼성화(CISH)를 비롯한 인 시투 혼성화(ISH), 서던 블롯팅 또는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기술, 예컨대, 정량 실시간 PCR(qRT-PCR)을 통해서, 세포 내의 HER2-암호화 핵산의 수준을 측정함으로 결정될 수 있다.
일반적으로, HER2 표적 항체치료제들, 예를 들어 트라스투주맙이 처방되는 HER2 과발현 암 세포는 HER2의 발현 수준이 IHC 3+이거나 또는, HER2의 발현 수준이 IHC 2+이면서 형광 인 시투 혼성화(FISH) 분석결과 HER2 유전자 증폭이 있는, 즉 당업자에 의해 FISH 양성(+)으로 판정된 환자에게 처방이 되고 있다.
본 발명이 제공하는 조성물은 종래 HER2 표적 항체치료제들, 예를 들어 트라스투주맙이 처방될 수 없는, 또는 처방되더라도 유의미한 치료학적 효능을 기대하기 어려운 환자군에게 투여되어 치료효과를 발휘하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 조성물은 HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 양태에서, 본 발명의 조성물은 HER2 발현 수준이 IHC 1+이거나, 또는 음성 FISH와 조합된 IHC 2+인 암 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 양태에서, 본 발명의 조성물은 HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 유방암 또는 위암 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 양태에서, 본 발명의 조성물은 HER2 발현 수준이 IHC 1+이거나, 또는 음성 FISH와 조합된 IHC 2+인 유방암 또는 위암 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법으로 투여경로에 따라 다양하게 제형화될 수 있다. "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다.
투여 경로로는 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 경구투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 경구투여용 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다. 경피투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 "경피투여"는 약학적 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학적 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하거나 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서에 기술되어 있다.
흡입투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물 및 락토오즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 당업계에 공지되어 있는 것을 참고로 할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 및/또는 보존제를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예에 따르면,
a) 환자로부터 암 조직을 수득하는 단계;
b) 상기 수득한 암 조직으로부터 면역조직화학염색법을 수행하는 단계;
c) 상기 b) 단계에서 IHC 1+ 이상인 HER2 양성 암 환자를 선별하는 단계; 및
d) 상기 IHC 1+ 이상인 HER2 양성 암 환자에게 인터페론-베타 또는 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 서열번호 1의 인터페론-베타 변이체; 및 상기 인터페론-베타 또는 인터페론-베타 변이체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 HER2 표적 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는, HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 치료방법을 제공한다.
현재 시판되고 있는 HER2 항체치료제인 트라스트주맙, 퍼투주맙은 HER2 양성 유방암 또는 위암 환자를 치료하기 위해 사용되고 있다. HER2 환자의 암 조직으로부터 면역조직염색법(Immunohistochemistry, IHC)를 수행하여 발현량이 매우 높거나 (IHC 3+), 또는 발현량이 중간 정도이면서 (IHC 2+) FISH 결과가 양성인 환자에 대해서만 사용되고 있는데, 이는 HER2 발현이 낮은 환자에서는 항체 치료제의 효과가 없기 때문이다.
본 발명이 제공하는 HER2 항체치료제와 인터페론-베타 또는 인터페론-베타 변이체 융합단백질은 기존 HER2 항체치료제가 가지고 있는 항암 효과인 HER2 신호 전달 차단과 ADCC는 그대로 유지하면서, 인터페론-베타 또는 인터페론-베타 변이체의 항암 효과 및 면역활성화 효과가 더해지므로 더욱 증가된 항암 효과를 나타낸다. 따라서 암 치료를 목적으로 상기 융합단백질을 투여할 HER2 양성 암 환자를 선별할 때에는 기존 HER2 항체치료제와는 다른 기준으로 선별해야 한다.
상기 HER2 표적 항체와 인터페론-베타 또는 인터페론-베타 변이체 융합단백질을 투여하기 위한 환자를 선별함에 있어, 암 환자의 암 조직으로부터 IHC를 수행하여 IHC 1+ 이상의 발현량을 기준으로 환자를 선별한다.
본 발명의 바람직한 일 양태에 따르면, 상기 c) 단계에서 IHC 1+인 환자를 선별한 후 상기 d) 단계를 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 양태에 따르면, 상기 c) 단계에서 IHC 2+인 환자들을 선별하여 FISH 분석을 추가로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다. 그 결과 IHC 2+인 환자들 중 FISH 음성인 환자를 대상으로 상기 d) 단계를 수행할 수 있다.
본 발명은 HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 치료제를 제조하기 위한, 인터페론-베타 또는 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 서열번호 1의 인터페론-베타 변이체; 및 상기 인터페론-베타 또는 인터페론-베타 변이체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 HER2 표적 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질의 용도를 제공한다.
본 발명은 인터페론-베타 또는 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 서열번호 1의 인터페론-베타 변이체; 및 상기 인터페론-베타 또는 인터페론-베타 변이체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 HER2 표적 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 '유효량'이란 개체에게 투여하였을 때, HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 의 개선, 치료, 검출, 진단 또는 HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 진행의 억제 또는 감소 효과를 나타내는 양을 말하며, 상기 '개체'란 동물, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며, 동물에서 유래한 세포, 조직, 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 상기 효과가 필요한 환자(patient) 일 수 있다.
본 발명의 상기 '치료'는 HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 또는 암으로 인한 증상을 개선시키는 것을 포괄적으로 지칭하고, 이는 상기 HER2 양성 암을 치유하거나, 실질적으로 예방하거나, 또는 상태를 개선시키는 것을 포함할 수 있으며, 상기 질환으로부터 비롯된 한 가지 증상 또는 대부분의 증상을 완화시키거나, 치유하거나 예방하는 것을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "을 포함하는(comprising)"이란 "함유하는(including)" 또는 "특징으로 하는(characterized by)"과 동일한 의미로 사용되며, 본 발명에 따른 조성물 또는 방법에 있어서, 구체적으로 언급되지 않은 추가적인 구성 성분 또는 방법의 단계 등을 배제하지 않는다. 또한 용어 "로 이루어지는(consisting of)"이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소, 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 "필수적으로 이루어지는(essentially consisting of)"이란 조성물 또는 방법의 범위에 있어서, 기재된 물질 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계 등을 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명은 인터페론-베타 또는 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 서열번호 1의 인터페론-베타 변이체; 및 HER2 표적 항체 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는, HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 인터페론-베타 또는 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 서열번호 1의 인터페론-베타 변이체; 및 HER2 표적 항체 또는 이의 단편을 병용 투여함으로써 HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 예방 및 치료 효과를 상승시키는 작용을 한다.
보다 상세하게는, 각각의 약물 단독으로는 암 치료 효과를 나타내지 못하는 환자군, 즉 HER2 발현 수준이 낮은 암 환자군에 인터페론-베타 또는 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 서열번호 1의 인터페론-베타 변이체; 및 HER2 표적 항체 또는 이의 단편을 병용투여함으로써 암 치료 효과에 현저한 상승작용이 나타날 수 있다. 상기와 같은, 병용 투여 효과는 본 발명에서 최초로 공개하는 것이다.
본 발명에서 '상승작용(synergy)'이라는 용어는 문헌에 기재된 바와 같이, 각 성분이 병용 투여될 때 발생되는 효과가, 단일 성분으로서 단독으로 투여될 때 발생되는 효과의 합보다 더 큰 것을 의미한다 (Chou and Talalay, Adv. Enzyme. Regul., 22:27-55, 1984).
본 발명에서 '병용 투여(administered in combination)'라는 용어는 두 가지 이상의 성분이 대상에 함께 투여되는 것을 의미한다. 각 성분이 함께 투여된다는 것은 원하는 치료 효과를 얻기 위해서, 각 성분을 동일한 시간에 또는 임의의 순서로 또는 상이한 시간에 순차적으로 투여될 수 있음을 의미한다.
인터페론-베타 또는 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 서열번호 1의 인터페론-베타 변이체; 및 HER2 표적 항체 또는 이의 단편을 따로 따로 제제화하여 개별적인 조성물(separate composition)의 형태로 병용투여 하는 경우에는 각각 공지의 방법에 준하여 제제를 조제할 수 있다.
인터페론-베타 또는 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 서열번호 1의 인터페론-베타 변이체; 및 HER2 표적 항체 또는 이의 단편을 단일 조성물(single composition)의 형태로 제제화하는 경우에도, 공지의 방법에 준하여 제제를 조제할 수 있다.
본 발명에 따른 인터페론-베타 또는 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 서열번호 1의 인터페론-베타 변이체; 및 HER2 표적 항체 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물에 있어서, 상기 각 성분은 동시에(simultaneously), 개별적(separately) 또는 순차적(sequentially)으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 약학적 조성물에 포함된 각 성분이 단일 조성물(single composition)로 되어 있는 경우에는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 조성물로 되어 있지 않을 경우에는 한 성분을, 다른 성분이 투여되기 전, 후 및/또는 다른 성분과 함께 동시에 투여될 수 있다. 상기 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 순서 즉, 어떤 것을 어느 시점에서, 동시에, 개별적 또는 순차적으로 투여할 것인지의 여부는 의사나 전문가에 의해 결정될 수 있다. 이러한 투여 순서는 많은 인자에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 상기 조성물은 HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 양태에서, 본 발명의 상기 조성물은 HER2 발현 수준이 IHC 1+이거나, 또는 음성 FISH와 조합된 IHC 2+인 암 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 양태에서, 본 발명의 상기 조성물은 HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 유방암 또는 위암 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 양태에서, 본 발명의 상기 조성물은 HER2 발현 수준이 IHC 1+이거나, 또는 음성 FISH와 조합된 IHC 2+인 유방암 또는 위암 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한 HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 치료제를 제조하기 위한, 인터페론-베타 또는 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 서열번호 1의 인터페론-베타 변이체; 및 HER2 표적 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 인터페론-베타 또는 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 서열번호 1의 인터페론-베타 변이체; 및 HER2 표적 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 인터페론-베타 또는 인터페론-베타 변이체와 HER2 표적 항체 또는 이의 단편이 결합된 재조합 단백질은 HER2 양성 암 환자를 치료하기 위한 목적으로 사용될 수 있다. 또한 상기 재조합 단백질을 투여할 HER2 양성 암 환자를 선별하는 방법을 제공함으로써, 기존의 HER2 항체치료제보다 더욱 많은 수의 환자가 치료 혜택을 볼 수 있다.
도 1은 Trastuzumab-IFNβ mutein의 정제 결과이다. 1단계로 단백질 A 비드 컬럼을 이용한 친화성 크로마토그래피 정제 단백질과, 2단계로 이온교환 크로마토그래피를 수행한 정제 단백질을 사용하여 SDS-PAGE를 수행한 결과이다.
도 2는 Trastuzumab과 Trastuzumab-IFNβ mutein의 직접적인 세포독성 결과 그래프이다. 96well plate에 NCI-N87 세포를 배양한 이후 Trastuzumab 또는 Trastuzumab-IFNβ mutein를 농도별로 처리한 이후 72시간이 지난 뒤 WST assay를 통해 살아있는 세포의 비율을 확인하였다. Trastuzumab을 처리한 군에서는 세포 독성이 나타나지 않았지만, Trastuzumab-IFNβ mutein을 처리한 그룹에서만 세포 독성 효과가 나타나는 것을 확인하였다.
도 3은 Trastuzumab과 Trastuzumab-IFNβ mutein의 간접적인 면역 활성화를 통한 세포독성 결과 그래프이다. 96well plate에 NCI-N87 세포를 배양한 이후 PBMC와 함께 Trastuzumab 또는 Trastuzumab-IFNβ mutein을 농도별로 처리한 이후 48시간이 지난 뒤 WST assay를 통해 살아있는 세포의 비율을 확인하였다.
도 4a 내지 4c는 Trastuzumab과 Trastuzumab-IFNβ mutein의 HER2 결합능을 flow cytometry로 분석한 결과이다. MCF-7 (도 4a), MDA-MB-231 (도 4b), NCI-N87 (도 4c) 세 종류의 세포주에 각각 Trastuzumab 또는 Trastuzumab-IFNβ mutein을 반응시킨 후 flow cytometry로 각 단백질의 HER2 결합 정도를 확인하였다.
도 5는 유방암 세포주 및 위암 세포주에서 western blotting으로 HER2 발현량을 비교한 결과이다. 각 세포주의 HER2 발현량에 따라 HER2 Low expression, HER2 intermediate expression, HER2 High expression으로 분류하였다.
도 6a 및 6b는 위암 세포주에서 Trastuzumab과 Trastuzumab-IFNβ mutein의 직접적인 세포독성 결과이다. 96well plate에 HER2 발현량이 상이한 위암 세포주를 배양한 이후 Trastuzumab 또는 Trastuzumab-IFNβ mutein를 농도별로 처리한 이후 72시간이 지난 뒤 WST assay를 통해 살아있는 세포의 비율을 확인하였다.
도 7a 및 7b는 유방암 세포주에서 Trastuzumab과 Trastuzumab-IFNβ mutein의 직접적인 세포독성 결과이다. 96well plate에 HER2 발현량이 상이한 유방암 세포주를 배양한 이후 Trastuzumab 또는 Trastuzumab-IFNβ mutein를 농도별로 처리한 이후 72시간이 지난 뒤 WST assay를 통해 살아있는 세포의 비율을 확인하였다.
도 8a 및 도 8b는 위암 세포주에서 Trastuzumab과 Trastuzumab-IFNβ mutein의 간접적인 면역 활성화를 통한 세포독성 결과이다. 96well plate에 HER2 발현량이 다른 세포주를 각각 배양한 이후 PBMC와 함께 Trastuzumab 또는 Trastuzumab-IFNβ mutein을 농도별로 처리한 이후 48시간이 지난 뒤 WST assay를 통해 살아있는 세포의 비율을 확인하였다.
이하, 첨부된 도면을 참조하며 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.
1. 재료 및 방법
1-1. 융합 단백질의 제조 설계
변이체와 결합된 항체를 일시적으로 발현하는 안정된 세포 및 세포주를 확립하기 위해, 발현벡터로 pCHO 1.0 (Life Technologies)를 사용하였다. 항체로 트라스투주맙(Trastuzumab)을 사용하였고, 인터페론-베타로 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 변이체를 사용하였다.
항체의 중쇄 부위에 인터페론-베타 변이체를 결합하였다. 항체의 중쇄(heavy chain) 부위에 링커를 클로닝하고, 여기에 각각 인터페론-베타 변이체를 클로닝하였다. 이후, 전체 유전자의 3’ 말단 및 5’ 말단에 각각 제한효소 AvrII(CCTAGG) 절단 부위와 Bstz17I(GTATAC) 절단 부위 (Thermo Scientific, USA) 를 삽입하여 중쇄의 최종 유전자를 확보하였다. 또한 항체의 경쇄(light chain)의 3'-말단 및 5'-말단에 각각 제한효소 EcoRV(GATATC) 절단 부위와 PacI(TTAATTAA)를 삽입하여 경쇄의 최종 유전자를 확보하였다. 중쇄 및 경쇄의 최종 유전자를 pCHO 1.0 벡터에 삽입하였다.
1-2. 포유동물 세포에서 융합 단백질 구성물의 발현
트라스투주맙, 트라스투주맙 결합 인터페론-베타 변이체 (Trastuzumab-IFNβ mutein) 발현벡터를 FreeStyleTM MAX reagent (Thermo Scientific)를 사용하여 CHO-S 세포 (Thermo Scientific) 내로 형질도입하였다. FreeStyleTM MAX reagent-DNA 복합체에 OptiPROTM SFM(Thermo Scientific)를 첨가한 혼합물을 플라스크에 담긴 CHO-S에 넣고서 습기가 있는 8% CO2 대기압의 조건에서 배양하였다. 형질도입 48시간 후 융합 단백질 발현을 위한 안정적인 형질도입을 선택하였다. 푸로마이신(puromycin) 10 ~ 50 μg/mL 및 MTX 100 ~ 1,000 nM에 의한 2차 선별을 통해 세포를 분류하였다. 선택된 세포는 37℃에서 습기가 있는 8% CO 2 대기압, 130 rpm의 조건으로 14일 동안 융합 단백질을 발현시키기 위해 포도당과 배양되었다.
1-3. 융합 단백질의 정제
CHO-S 세포에서 발현한 융합 단백질을 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)와 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography) 방법으로 정제하였다. CHO-S 배양액을 단백질 A 맙셀렉트 슈어 (Protein A Mabselect sure, GE Healthcare)가 충진된 컬럼에 통과시킨 뒤 평형 버퍼(equilibration buffer), 세척 버퍼(wash buffer), 용출 버퍼(elution buffer)를 순차적으로 가하여 정제된 단백질을 얻었다. 이온교환 크로마토그래피 정제 방법의 경우, 친화성 크로마토그래피 정제로 얻어진 융합 단백질을 하이트랩 큐 (HiTrap Q FF, GE healthcare)가 충진된 컬럼에 통과시킨 뒤 용출 버퍼를 가하여 정제된 단백질을 얻었다.
1-4. 세포주 및 배양 조건
사람 위암종(human gastric carcinoma) (NCI-N87) 세포주, 사람 유방암종(human breast cancer) (MCF-7, MDA-MB-231) 세포주는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB)에서 구매되었다.
NCI-N87 세포는 10% FBS (HyClone), 페니실린100 units/mL 및 스트렙토마이신100 μg/mL을 함유하는 RPMI-1640 (HyClone, USA) 배양배지를 이용하여, MCF-7 및 MDA-MB231 세포는 10% FBS (HyClone), 페니실린100 units/mL 및 스트렙토마이신100 μg/mL을 함유하는 DMEM (HyClone, USA) 배양배지를 이용하여 37℃에서 습기가 있는 5% CO 2 대기압의 조건으로 배양되었다.
1-5. 인터페론-베타의 직접적 세포독성 확인
96-well plate에 각 well당 NCI-N87 세포를 2.0 x 10 4 (200 ul) 개씩 대조군, IFNβ 처리군, trastuzumab 처리군, trastuzumab-IFNβ mutein 처리군으로 나누어 배양하였다. 다음 날, IFNβ (1, 5, 10 ng/ml), trastuzumab (15, 30, 60, 120 ng/ml), trastuzumab-IFNβ mutein (20, 40, 80, 160 ng/ml)을 각각 해당 농도가 되도록 처리하고, 72시간 동안 배양하였다. 이후 EZ-Cytox (대일바이오텍)를 각 well에 10 ul씩 첨가하고, 배양기에서 3시간동안 반응시켰다. SpectraMax iD3 multi-mode microplate reader (Molecular Device)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 비교하였다.
1-6. 인터페론-베타의 간접적 세포독성 확인
96-well plate에 각 well당 NCI-N87 세포를 2.0 x 10 4 (200 ul) 개씩 대조군, IFNβ 처리군, trastuzumab 처리군, trastuzumab-IFNβ mutein 처리군으로 나누어 배양하였다. 다음 날 말초 혈액 단핵 세포 (peripheral blood mononuclear cell, PBMC) (Zenbio)를 암세포와의 비율 20:1로 가해주고, IFNβ (100 ng/ml), trastuzumab (100, 350 ng/ml), trastuzumab-IFNβ mutein (100, 350 ng/ml)을 각각 해당 농도가 되도록 처리하고, 48시간 동안 배양하였다. 이후 EZ-Cytox (대일바이오텍)를 각 well에 10 ul씩 첨가하고, 배양기에서 3시간동안 반응시켰다. SpectraMax iD3 multi-mode microplate reader (Molecular Device)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 비교하였다.
1-7. 유세포 분석
HER2와 결합하는 항체의 능력을 측정하기 위해, 유세포 분석(Flow cytometry analysis)을 수행하였다. NCI-N87 및 MDA-MB-231, MCF-7 세포를 세포 분리 버퍼(cell dissociation buffer) (Enzyme-Free, PBS-based) (Gibco)를 이용하여 회수한 후 차가운 PBS (2% FBS 함유)로 4℃에서 1시간 동안 활성을 억제하였다. 세포를 PBS로 3회 세척한 후 PBS로 희석된 Trastuzumab, Trastuzumab-IFNβ mutein 1μg과 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 세포를 PBS로 3회 세척한 후 Gaot anti Human IgG FITC (Jackson)와 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 형광 항체를 Flow cytometry (CytoFLEX Flow Cytometer) (Beckman Coulter)로 측정하였다.
1-8. 암세포에서 endogenous HER2 발현 분석
유방암 세포주(HCC1954, BT-474, MDA-MB-231, BT-549)와 위암 세포주(NCI-N87, KATOIII, Hs746T, MKN74, HFE145, SNU1, SNU620)에서 HER2 발현량을 측정하기 위해, 웨스턴 블랏(western blotting)을 수행하였다.
1.0 x 10 6의 각 세포를 3일 간 배양한 후 세포를 모아 원심분리(1000rpm, 5분)를 하였고, 배양액을 제거한 뒤 용해용 완충용액 (lysis buffer)를 처리하여 세포를 용해시켰다. BCA정량법 (Thermo23227 Pierce BCA Protein Assay kit)을 이용하여 단백함량을 정량한 후 단백질 시료를 제작하였고, 100℃에서 5분간 끓여주어 단백질이 충분히 변형되도록 유도하였다. 준비된 샘플을 마커(marker)와 함께 Tricine SDS-PAGE 겔에 로딩하고 80v의 전압으로 1시간 30분간 전기영동을 실시하였다. 그 다음 겔을 분리하여 3M 페이퍼 위에 두고 그 위에 PVDF membrane을 둔 뒤 다시 3M 페이퍼를 덮어주고 1x transfer 버퍼에 침지하여 100v 전압으로 100분간 단백질을 transfer시켰다. Tris-buffered saline-Tween 20(TBS-T, 0.1% Tween20)에 BSA(bovine serum albumin) 또는 skim milk를 5% 넣어 membrane을 1시간 동안 상온에서 blocking하였다. PVDF membrane을 TBS-T로 2번 세척한 뒤, TBS-T에 침지하였다. 항-HER2 항체의 경우 TBS-T에 1:1000으로 희석하여 준비하였다. membrane을 항체 희석물에 침지하여 4　°C에서 하루 동안 반응시켰다. 다음날 10분동안 3번씩 TBS-T로 세척하고 상온에서 호스래디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase; HRP)가 결합된 이차항체를 첨가하여 1시간 동안 반응하였다. 다시 한번 세척 과정을 수행한 후, 밴드를 ECL 시약(enhancedchemiluminescence reagent, Intron)으로 확인하였다. 밴드의 강도는 C-DiGit(LI-COR, USA)을 이용하여 측정하였다.
1-9. 위암 세포주의 직접적 세포독성 확인
상기 1-5의 실험 방법과 동일한 방법으로 실험을 수행하였다.
96-well plate에 NCI-N87 세포, SNU1 세포, SNU620 세포, Hs746T 세포, KATOIII 세포를 각각 well 세포를 3.0 x 10³ (100 ul) 개씩 IFNβR27T 처리군, trastuzumab 처리군, trastuzumab-IFNβ mutein(trastuzumab-R27T) 처리군, T-DM1 처리군으로 나누어 배양하였다. 다음 날, trastuzumab 처리군, IFNβ-R27T 처리군, trastuzumab-R27T 처리군, T-DM1 처리군을 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10, 100 nM 농도가 되도록 처리하고, 72시간 동안 배양하였다. 이후 EZ-Cytox (대일바이오텍)를 각 well에 10 ul씩 첨가하고, 배양기에서 4시간동안 반응시켰다. Sunrise microplate reader (TEKAN)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 비교하였다.
1-10. 유방암 세포주의 직접적 세포독성 확인
상기 1-5의 실험 방법과 동일한 방법으로 실험을 수행하였다.
96-well plate에 BT-474 세포, SKBR3 세포, HCC1954 세포, MDA-MB-453세포, MDA-MB-231 세포, BT549 세포를 각각 well당 3.0 x 10³ (100 ul) 개씩 대조군, trastuzumab 처리군, trastuzumab-R27T 처리군, IFNβ 처리군으로 나누어 배양하였다. 다음 날, trastuzumab 처리군, trastuzumab-R27T 처리군, IFNβ 처리군을 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10, 100 nM 농도가 되도록 처리하고, 72시간 동안 배양하였다. 이후 EZ-Cytox (대일바이오텍)를 각 well에 10 ul씩 첨가하고, 배양기에서 4시간동안 반응시켰다. Sunrise microplate reader (TEKAN)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 비교하였다.
1-11. 위암 세포주의 간접적 세포독성 확인
96-well plate에 각 well당 N87 또는 Hs746T 세포를 1.0 x 10 4 (100 ul) 개씩 control IgG 대조군, trastuzumab 처리군, IFNβ-R27T 처리군, trastuzumab-IFNβ-R27T 처리군으로 나누어 배양하였다. 다음 날 말초 혈액 단핵 세포 (peripheral blood mononuclear cell, PBMC) (Zenbio)를 암세포와의 비율 1:1 또는 1:2로 가해주고, 0.5:1, 1:1, 2:1, 4:1 또는 8:1로 가해주고, control IgG, IFNβ-R27T, trastuzumab 또는 trastuzumab-IFNβ-R27T를 각각 0.1 nM 농도가 되도록 처리한 뒤 3일 동안 배양하였다. 이후 EZ-Cytox (대일바이오텍)를 각 well에 10 ul씩 첨가하고, 배양기에서 4시간 동안 반응시켰다. Sunrise microplate reader (TEKAN)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 비교하였다.
2. 결과
2-1. Trastuzumab-IFNβ mutein 융합 단백질의 발현 및 정제
Trastuzumab-IFNβ mutein 및 Trastuzumab을 발현하는 세포주를 이용하여 동일한 조건에서 발현 및 정제하였다. 발현 조건은 CHO-S 세포주를 37℃, 5% CO2에서 10일 동안 배양하였다. Cedex-bio (Roche)를 이용하여 세포 배양액 내 융합 단백질의 발현 농도를 측정하였고, AKTA instrument 시스템 및 protein A bead를 이용하여 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography) 방법으로 정제하였다. 이후 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography)를 이용하여 2차 정제하였다.
도 1을 참조하면, 두 단계의 정제 과정을 거쳐 생산된 Trastuzumab- IFNβ mutein의 중쇄와 경쇄 단백질이 해당 크기에서 발견되는 것을 확인할 수 있었다.
2-2. Trastuzumab-IFNβ mutein 융합 단백질의 항암 효능
WST assay 방법을 통해 융합단백질의 직접적인 세포 독성 효능과, 면역활성화를 통한 간접적인 항암 효능을 측정하였다.
도 2를 참조하면, Trastuzumab-IFNβ mutein은 NCI-N87 세포에 대해 직접적인 세포 독성 효능을 보였으며, Trastuzumab은 세포 독성 효능이 나타나지 않았다. 이는 Trastuzumab의 신호 전달 차단에 의한 세포 독성 효과가 크지 않다는 것을 의미한다.
도 3을 참조하면, Trastuzumab-IFNβ mutein은 NCI-N87 세포에 대해 면역세포의 활성을 통한 세포 독성 효능을 보였으며, Trastuzumab과 비교했을 때 더 우수한 암 세포 독성 효능을 보였다.
2-3. Trastuzumab-IFNβ mutein에 의한 HER2 표적화
HER2에 대한 결합능을 확인하기 위해, Flow cytometry 분석을 수행하였다.
도 4를 참조하면, HER2 발현량이 높은 세포주 (NCI-N87)에서 Trastuzumab과 Trastuzumab-IFNβ mutein의 HER2 결합능이 동일하게 나타나는 것을 확인하였다. 마찬가지로 HER2 발현량이 낮은 세포주 (MCF-7, MDA-MB-231)에서도 Trastuzumab과 Trastuzumab-IFNβ mutein의 HER2 결합능이 동일한 것을 확인하였다. 이를 통해 IFNβ mutein이 융합된 형태에서도 Trastuzumab의 HER2 결합능에는 차이가 없다는 것을 알 수 있었다.
2-4. 암 세포주의 endogenous HER2 발현량 분석
유방암 세포주와 위암 세포주에서 HER2 발현량을 비교하기 위하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. 유방암 세포주인HCC1954, BT-474, MDA-MB-231, BT-549와 위암 세포주인NCI-N87, KATOIII, Hs746T, MKN74, HFE145, SNU1, SNU620의 HER2 발현량을 비교하여 3가지로 분류하였다.
도 5에 나타낸 바와 같이, HER2 Low expression은 유방암 세포 중 MDA-MB231 세포, BT-549 세포이며, 위암 세포 중 HS746T 세포, KATOIII 세포이다. HER2 Intermediate expression은 유방암 세포 중 MDA-MB-453 세포, 위암 세포 중 SNU1 세포, SNU620 세포이다. HER2 High expression은 유방암 세포 중 BT-474 세포, HCC1954 세포이며, 위암 세포 중 NCI-N87 세포가 해당된다.
2-5. 유방암 세포주 및 위암 세포주에서 HER2 발현량에 따른 직접적 세포독성 효능
WST assay 방법을 통해 HER2 발현량이 높은 NCI-N87 세포, HER2 발현량이 중간인 SNU1 세포, SNU620 세포, HER2 발현량이 낮은 Hs746T 세포, KATOIII 세포에 대해 융합단백질의 직접적인 세포 독성 효능을 측정하였다.
도 6a 및 도 6b에 나타난 바와 같이, Trastuzumab-IFNβ mutein은 HER2 발현량이 중간인 세포와 발현량이 낮은 위암 세포에 대해서도 직접적인 세포 독성 효능이 나타나는 것을 확인하였으며, Trastuzumab은 세포 독성 효능이 나타나지 않는 것을 확인하였다.
또한 도 7a 및 도 7b에 나타난 바와 같이, Trastuzumab-IFNβ mutein은 HER2 발현량이 중간인 세포와 발현량이 낮은 유방암 세포에 대해서도 직접적인 세포 독성 효능이 나타나는 것을 보였다.
2-6. 위암 세포주에서HER2 발현량에 따른 간접적 세포독성 효능
HER2 발현량이 높은 NCI-N87 세포를 PBMC와 공동 배양하였고, HER2 발현량이 낮은 Hs746T 세포를 PBMC와 공동 배양하여, PBMC 매개된 세포독성 효과를 비교하였다. 면역활성화를 통한 간접적인 항암 효능을 측정하였다.
도 8a 및 도 8b에 나타난 바와 같이, Trastuzumab-IFNβ mutein은 NCI-N87 세포뿐만 아니라 HER2 발현량이 낮은 Hs746T 세포에 대해서도 면역세포의 활성을 통한 세포 독성 효능을 보였으며, Trastuzumab과 비교했을 때 더 우수한 암 세포 독성 효능을 나타내는 것을 확인하였다.
이에, Trastuzumab은 HER2 발현량이 매우 높은 경우에만 HER2 양성 암에 대한 치료 효과가 있는 반면, Trastuzumab-IFNβ mutein은 HER2 발현량이 낮은 경우에도 HER2 양성 암에 대한 치료 효과가 있다는 것을 알 수 있다.

Claims (14)

  1. 인터페론-베타; 및 상기 인터페론-베타에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 HER2 표적 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는, HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 인터페론-베타는 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 서열번호 1의 인터페론-베타의 변이체인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 트라스투주맙(Trastuzumab) 또는 퍼투주맙(Pertuzumab)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 재조합 단백질은 인터페론-베타와 항체 또는 이의 단편이 펩티드 링커에 의해 연결된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 암은 HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 유방암 또는 위암인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 암은 HER2 발현 수준이 IHC 1+, 또는 음성 FISH와 조합된 IHC 2+인 암인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  7. HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 치료제를 제조하기 위한, 인터페론-베타; 및 상기 인터페론-베타에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 HER2 표적 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질의 용도.
  8. 인터페론-베타; 및 상기 인터페론-베타에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 HER2 표적 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 치료 방법.
  9. 인터페론-베타; 및 HER2 표적 항체 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는, HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 인터페론-베타는 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 서열번호 1의 인터페론-베타의 변이체인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  11. 청구항 9에 있어서, 상기 인터페론-베타; 및 HER2 표적 항체 또는 이의 단편은 단일 조성물(single composition)의 형태이거나 또는 개별적인 조성물(separate composition)의 형태인 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 청구항 9에 있어서, 상기 인터페론-베타; 및 HER2 표적 항체 또는 이의 단편은 동시에(simutaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(sequential)으로 투여되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  13. HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 치료제를 제조하기 위한, 인터페론-베타; 및 HER2 표적 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물의 용도.
  14. 인터페론-베타; 및 HER2 표적 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 HER2 발현 수준이 IHC 1+ 이상인 암 치료 방법.
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