WO2021221470A1 - 인터페론-베타 변이체와 항체가 융합된 재조합 단백질 및 이를 포함하는 약학 조성물 - Google Patents

인터페론-베타 변이체와 항체가 융합된 재조합 단백질 및 이를 포함하는 약학 조성물 Download PDF

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이찬규
이지선
최준영
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Definitions

  • the present invention relates to a recombinant protein, a polynucleotide, an expression vector and a host cell in which an antibody binding to a specific antigen is fused with an interferon-beta variant substituted with an amino acid residue, and a pharmaceutical composition for anticancer comprising the recombinant protein as an active ingredient .
  • Interferon is one of the major cytokines that play an important role in immunity, and is known to have a strong anticancer effect. These interferons are classified into type I (IFN- ⁇ and IFN- ⁇ ), type II (IFN- ⁇ ), and type III (IFN- ⁇ ).
  • Type I interferon exhibits antiviral and antiproliferative effects, and also plays an essential role in cancer immunosurveillance, a function that removes tumor cells by recognizing tumor specific antigens.
  • Signaling of type I interferon is a stepwise activation of a number of enzymes by the activity of the interferon receptor, in which case transcription factors such as STAT1 and STAT2 also act.
  • Such signaling activates the immune system, and chemotherapeutic agents such as anthracyclines, human epidermal growth factor receptor 2 (HER2), epidermal growth factor receptor (EGFR), etc. It is also essential for showing anticancer effects on various anticancer drugs such as growth factor receptor-targeting antibodies, administration of adjuvants, and oncolytic virotherapy.
  • Trastuzumab is an antibody cancer treatment that targets HER2, and is resistant to treatment due to overexpression of MUC4.
  • pSTAT3 One of the signaling substances involved in this resistance mechanism, pSTAT3, has a polymerized form (pSTAT3 homodimer) of two identical substances, and is known to be inhibited by pSTAT1. Therefore, when type I interferon that activates pSTAT1 is combined with trastuzumab, increased anticancer efficacy can be expected.
  • Interferon-beta has a stronger cell growth inhibitory effect than interferon-alpha (IFN- ⁇ ).
  • interferon-alpha interferon-alpha
  • the antiproliferative activity range and synergistic effect of interferon-beta are very excellent.
  • the treatment using interferon has high cytotoxicity and symptoms such as fever (80%), myalgia (73%), headache (50%), fatigue (50%), malaise (50%), etc. have.
  • interferon-beta is a highly hydrophobic protein, and tends to aggregate well, resulting in reduced biological activity and productivity.
  • it has a short half-life, so it has a disadvantage that it needs to be administered frequently. Therefore, in order to develop a therapeutic agent using interferon, it is necessary to minimize the limitation caused by interferon.
  • the present inventors have developed a mutant interferon-beta with improved productivity and reduced aggregation by changing the physical properties of interferon through site-specific mutation. These interferon-beta variants can be used as new anticancer therapeutics that exhibit excellent anticancer effects by fusion with antibody cancer therapeutics.
  • One aspect of the present invention is an interferon-beta (IFN- ⁇ ) variant in which the 17th amino acid residue is substituted with serine and the 27th amino acid residue is substituted with threonine; And an object of the present invention is to provide a recombinant protein comprising an antibody or fragment thereof covalently linked directly or indirectly to the interferon-beta variant.
  • IFN- ⁇ interferon-beta
  • another aspect of the present invention aims to provide a polynucleotide encoding the recombinant protein.
  • another aspect of the present invention aims to provide an expression vector comprising the polynucleotide.
  • another aspect of the present invention aims to provide a host cell transformed with the expression vector.
  • another aspect of the present invention aims to provide an anticancer pharmaceutical composition comprising the recombinant protein as an active ingredient.
  • another aspect of the present invention aims to provide an anticancer pharmaceutical composition comprising the recombinant protein.
  • another aspect of the present invention aims to provide a pharmaceutical composition for anticancer essentially consisting of the recombinant protein.
  • a host cell to express the recombinant protein in which cysteine, the 17th amino acid of the interferon-beta mutant, is modified with another amino acid characterized by transforming
  • An object of the present invention is to provide a method for increasing protein stability during production or separation and purification of the recombinant protein.
  • another aspect of the present invention aims to provide the use of the recombinant protein for preparing an anticancer agent.
  • another aspect of the present invention aims to provide a method for treating cancer comprising administering to an individual in need thereof an effective amount of a composition comprising the recombinant protein.
  • the present invention provides an interferon-beta (IFN- ⁇ ) variant in which the 17th amino acid residue is substituted with serine and the 27th amino acid residue is substituted with threonine; And it provides a recombinant protein comprising an antibody or fragment thereof covalently linked directly or indirectly to the interferon-beta variant.
  • IFN- ⁇ interferon-beta
  • Interferon-beta is a globular protein having 5 alpha helices, the size of which is 22 kDa, and has antiviral activity, cell growth inhibition or antiproliferative activity, lymphocyte cytotoxicity enhancing activity, immunomodulatory activity, target cell differentiation induction or inhibitory activity, Cancer, autoimmune disorders, viral infection, HIV and other immunological activities such as macrophage activation activity, cytokine production increase activity, cytotoxic T cell effect increase activity, natural killing cell increase activity, etc. There are reports that it is effective in treating related diseases, hepatitis C, rheumatoid arthritis, etc.
  • interferon-beta is a strong hydrophobic protein and exhibits aggregation phenomenon, has low biological activity and productivity, and has a short half-life, thus limiting the utilization of interferon-beta. Therefore, in the present invention, by inducing site-directed mutagenesis for the interferon-beta gene, an interferon-beta mutant with improved physical properties compared to wild-type interferon-beta in which mutation did not occur was developed.
  • the interferon-beta mutant (interferon beta mutein)
  • the 17th cysteine (C) is substituted with serine (S)
  • the 27th arginine (R) is substituted with threonine (T)
  • 80 It is characterized in that it contains a glycosyl group at the th and 25th amino acid residues.
  • the interferon-beta variant may be one represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 encoding it.
  • Such interferon-beta variants include all or part of the amino acid sequence of wild-type interferon-beta, and have interferon-beta activity.
  • Such antibodies include monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, multispecific antibodies (eg, bispecific antibodies) and fragments thereof.
  • a complete antibody is generally Y-shaped and consists of two long heavy chains (H) and two short light chains (L). Each heavy chain and light chain are connected to each other by a sulfide bond, and are divided into a variable region (V), a region that reacts with an antigen, and a constant region (C), a region that expresses an effector function.
  • V variable region
  • C constant region
  • CDR complementarity-determining region
  • the fragment of the antibody represents a specific site capable of reacting with an antigen to exhibit antigen-binding activity, for example, a Fab fragment (a fragment by papain digestion), a Fab' fragment (a fragment by pepsin digestion and partial reduction), F ( ab')2 fragment (fragment by pepsin digestion), Facb (fragment by plasmin digestion), Fd (fragment by pepsin digestion, partial reduction and reaggregation), scFv fragment (fragment by molecular biology techniques), etc.
  • the antibody is an antibody or fragment thereof that recognizes a tumor-specific antigen, and may be used as a target therapeutic agent for cancer.
  • trastuzumab an antibody treatment targeting the human epidermal growth factor receptor (HER-2), Cetuximab, an antibody treatment targeting the epidermal growth factor receptor (EGFR), cancer cells
  • Atezolizumab an antibody therapeutic that targets PD-L1 expressed on the surface of
  • trastuzumab may be composed of a heavy chain having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a light chain having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4
  • cetuximab is a heavy chain having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 and a light chain having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6
  • atezolizumab may be composed of a heavy chain having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 and a light chain having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 .
  • the recombinant protein may be a fusion or complex formed by connecting an interferon-beta mutant and an antibody or fragment thereof by a peptide linker.
  • the peptide linker is a short amino acid or amino acid analog of two or more amino acids or amino acids-like substances linked to each other by a peptide bond, and refers to a molecule that serves to link two or more separate substances to each other.
  • glycine, serine, alanine, etc. are used as major constituent amino acids, so that a glycine-serine linker, a glycine-serine-alanine linker, etc. can be used.
  • Such a linker may be connected to the heavy chain C-terminus of the antibody or the light chain C-terminus of the antibody, or the light chain C-terminus and the heavy chain C-terminus of the antibody may be connected to the N-terminus of the linker.
  • the N-terminus of the interferon beta variant may be connected to the C-terminus of the linker.
  • the present invention provides a polynucleotide encoding the recombinant protein.
  • a polynucleotide is a high molecular compound in which nucleotides, a chemical monomer composed of three elements, a base, sugar, and phosphoric acid, are connected in a chain form through a number of phosphate ester bonds. It is a polymer.
  • the polynucleotide may be an RNA genome sequence, DNA (gDNA or cDNA), and an RNA sequence transcribed therefrom, and includes not only a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the recombinant protein, but also a sequence complementary to the sequence.
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9 encoding a recombinant protein in which the interferon-beta mutant and the heavy chain of trastuzumab are linked, or SEQ ID NO: It may be a nucleotide sequence represented by 10 or a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11 encoding a recombinant protein in which the interferon-beta mutant and the heavy chain of atezolizumab are linked.
  • the present invention provides an expression vector comprising the polynucleotide.
  • the expression vector is a vector capable of expressing a recombinant protein including an interferon-beta mutant and an antibody or fragment thereof in a host cell, and refers to a gene construct comprising a gene sequence operably linked to express a gene insert and an expression control sequence do.
  • the “operably linked” refers to a functional linkage between a nucleic acid expression control sequence and a nucleic acid sequence encoding a target protein to perform a general function.
  • expression control sequence expression control sequence
  • Such an expression vector may be prepared using a genetic recombination technique well known in the art, and enzymes commonly used in the art for site-specific DNA cleavage and ligation may be used.
  • the expression vector includes a signal sequence or leader sequence for membrane targeting or secretion in addition to expression control elements such as a promoter, an operator, a start codon, a stop codon, a polyadenylation signal, and an enhancer, and variously manufactured according to the purpose can be
  • the expression vector contains a selection marker for selecting a host cell containing the expression vector, and in the case of a replicable expression vector, it can self-replicate including an origin of replication, or can be integrated into host DNA.
  • the expression vector can be used without limitation, a vector that can be used for expression of an external gene conventionally in the art, for example, a plasmid vector, a cosmid vector, a viral vector, and the like.
  • the present invention provides a host cell transformed with the expression vector.
  • the host cell may choose to modulate the expression of the inserted sequence or to process the gene product in a particular desired manner.
  • Different host cells have characteristic and specific mechanisms of action for the translation and post-translational processing and modification of proteins.
  • Suitable cell lines or host systems can be selected that provide for the desired modification and processing of the expressed heterologous protein.
  • Expression in yeast can produce biologically active products.
  • Expression in eukaryotes can increase the folding potential of the peptide chains that make up the polypeptide or protein.
  • any host cell known in the art that can be continuously cloned and expressed in a stable manner may be used without limitation, for example, E. coli JM109, E. coli BL21DE, E. coli DH5, E. coli E. coli, such as RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, etc., Agrobacterium genus strains such as Agrobacterium A4, Bacilli such as Bacillus subtilis, etc. bacilli), Salmonella typhimurium, enteric bacteria such as Serratia marcescens, and various Pseudomonas genus strains.
  • yeast Sacharomyces cerevisiae
  • insect cells eg, human cells (eg, CHO (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN, MDCK cell lines) and the like)
  • human cells eg, CHO (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN, MDCK cell lines
  • transformation is a phenomenon in which a genetic change is artificially caused by introducing foreign DNA into a host cell so that DNA can be replicated as a factor of a chromosome in the host cell or by completion of chromosomal integration.
  • the transformation method is a CaCl 2 precipitation method, a CaCl 2 method using a reducing material such as DMSO (dimethyl sulfoxide), the Hanahan method to increase the efficiency, electroporation (electroporation), calcium phosphate precipitation method, protoplast fusion method, silicon carbide fiber agitation method, agrobacterium-mediated transformation method, transformation method using PEG, dextran sulfate, lipofectamine and drying/inhibition-mediated transformation method.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • electroporation electroporation
  • calcium phosphate precipitation method protoplast fusion method
  • silicon carbide fiber agitation method agrobacterium-mediated transformation method
  • transformation method using PEG dextran sulfate
  • lipofectamine lipofectamine
  • the present invention provides an anticancer pharmaceutical composition comprising the recombinant protein as an active ingredient.
  • the recombinant protein is a structure in which an interferon-beta variant with improved physical properties and an antibody or fragment thereof are combined, and has excellent purification efficiency and biological activity, and immunomodulatory efficacy against various cancer cell lines, anticancer efficacy, ADCC efficacy, etc. was confirmed to be Therefore, the composition comprising the recombinant protein as an active ingredient exhibits an effect of inhibiting the proliferation and activity of cancer cells, and thus can be utilized as a pharmaceutical composition for anticancer.
  • the method of formulating the composition is mixed with conventionally used excipients, adjuvants, analgesics, isotonic agents, preservatives, and other pharmaceutically acceptable adjuvants, and pharmaceutically acceptable formulations. It can be formulated to prepare a pharmaceutical preparation.
  • the formulation may be in the form of oral formulations such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, and aerosols, or external preparations, suppositories, and sterile injection solutions.
  • Solid preparations for oral administration may include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and liquid preparations for oral administration include suspensions, internal solutions, emulsions, syrups, and the like.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories.
  • the method of administering the composition varies depending on the condition and weight of the patient, the degree of disease, the drug form, the route of administration, and the duration, but may be appropriately selected by those skilled in the art. However, for a desirable effect, it may be administered at 0.001 to 1,000 mg/kg per day. Administration may be administered once a day, or divided into several administrations.
  • the route of administration is possible in any way, for example, it can be administered by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or intracerebroventricular injection.
  • C17 of interferon-beta that is, cysteine, which is the 17th amino acid
  • C17 of interferon-beta plays an important role in the stability of the mutant in the production and separation/purification of the R27T variant of interferon beta.
  • it affects the stability during production, separation, purification, and furthermore, storage and distribution.
  • a host cell to express the recombinant protein in which cysteine, the 17th amino acid of the interferon-beta mutant, is modified with another amino acid characterized by transforming
  • It provides a method for increasing protein stability during production or separation and purification of the recombinant protein.
  • the interferon-beta mutant is an interferon-beta R27T mutant, and since C17 is additionally modified with another amino acid, it includes an antibody or fragment thereof covalently linked directly or indirectly to a double mutant of C17N and R27T. to express a recombinant protein that In this case, N represents any amino acid except cysteine.
  • Another amino acid that is preferably modified may be serine.
  • the host cell expressing the recombinant protein comprising the antibody or fragment thereof covalently or directly or indirectly linked to the mutant may be a mammalian cell used for protein expression, preferably a CHO cell line (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN and MDCK cell lines may be used, and most preferably, the host cell in the present invention may be a CHO cell line.
  • CHO cell line Choinese hamster ovary
  • W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN and MDCK cell lines may be used, and most preferably, the host cell in the present invention may be a CHO cell line.
  • the present invention also provides the use of the recombinant protein for preparing an anticancer agent.
  • the present invention also provides a method for treating cancer comprising administering an effective amount of a composition comprising the recombinant protein to a subject in need thereof.
  • the 'effective amount' of the present invention refers to an amount that exhibits the effect of improving, treating, preventing, detecting, diagnosing, or inhibiting or reducing the disease when administered to an individual, and the 'individual' is an animal, preferably a mammal. It may be an animal, particularly an animal, including a human, and may be an animal-derived cell, tissue, organ, or the like. The subject may be a patient in need of the effect.
  • the 'treatment' of the present invention refers generically to ameliorating cancer or symptoms of cancer, which may include curing, substantially preventing, or ameliorating the condition of the disease. including, but not limited to, alleviating, curing or preventing symptoms or most symptoms.
  • the term 'comprising' is used in the same sense as 'including' or 'characterized by', and in the composition or method according to the present invention, it is specifically mentioned It does not exclude additional components or method steps that have not been performed.
  • the term 'consisting of' means excluding additional elements, steps, or ingredients that are not separately described.
  • the term 'essentially consisting of' means that, in the scope of the composition or method, it may include substances or steps that do not substantially affect the basic properties thereof in addition to the substances or steps described.
  • the physical properties of interferon-beta are improved through site-specific mutation, thereby improving biological activity and purification efficiency, and increasing productivity. Since these recombinant proteins express both the function of interferon-beta and the characteristics of an antibody binding to a specific antigen, it can be usefully used as a target therapeutic agent for cancer and the like.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the structure of a fusion protein in which an interferon-beta mutant and a tumor-targeting antibody are bound.
  • FIG. 2A to 2D are results comparing the purification efficiency of the antibody-interferon-beta mutant fusion protein during the affinity chromatography purification process.
  • FIG. 2a is a graph showing the purification efficiency of Trastuzumab-IFN ⁇ , Trastuzumab-IFN ⁇ -R27T and Trastuzumab-IFN ⁇ -C17S-R270T for each experiment.
  • FIG. 2b is a graph comparing the average yields of repeated purification experiments of Trastuzumab-IFN ⁇ , Trastuzumab-IFN ⁇ -R27T, and Trastuzumab-IFN ⁇ -C17S-R27T.
  • FIG. 2c is a result of comparing the purification efficiency of Cetuximab-IFN ⁇ -R27T and Cetuximab-IFN ⁇ -C17S-R27T.
  • FIG. 2d is a result of comparing the purification efficiency of Atezolizumab-IFN ⁇ -R27T and Atezolizumab-IFN ⁇ -C17S-R27T.
  • FIG. 3a to 3c are results of comparison of the protein aggregation degree of the purified antibody-interferon-beta mutant fusion protein analyzed by size exclusion chromatography.
  • FIG. 3a is a result of comparing protein aggregation of Trastuzumab-IFN ⁇ , Trastuzumab-IFN ⁇ -R27T, and Trastuzumab-IFN ⁇ -C17S-R27T.
  • FIG. 3B is a result of comparing protein aggregation of Cetuximab-IFN ⁇ -R27T and Cetuximab-IFN ⁇ -C17S-R27T.
  • FIG. 3c is a result of comparing protein aggregation of Atezolizumab-IFN ⁇ -R27T and Atezolizumab-IFN ⁇ -C17S-R27T.
  • 4A and 4B show the results of analyzing the HER2 binding capacity of Trastuzumab, Trastuzumab-IFN ⁇ -R27T, and Trastuzumab-IFN ⁇ -C17S-R27T using three cell lines MCF-7, MDA-MB231, and NCI-N87 by flow cytometry. .
  • 5 is a result of analyzing the interferon signaling activity of Trastuzumab-IFN ⁇ -C17S-R27T. This is the result of measuring the level of interferon-beta signaling activity by checking the expression level of pSTAT1 one hour after treatment with IFN ⁇ -C17S-R27T and Trastuzumab-IFN ⁇ -C17S-R27T in the NCI-N87 cell line, respectively.
  • FIG. 7A and 7B show Trastuzumab, T-DM1, IFN ⁇ -R27T, Trastuzumab- in cell lines with high HER2 expression levels, NCI-N87, cell lines with medium HER2 expression levels, SNU1 and SNU620, and cell lines with low HER2 expression levels, Hs746T and MKN45.
  • IFN ⁇ -C17S-R27T is the result of comparing the direct anti-proliferative activity of each material.
  • 8A and 8B are results of quantitative measurement and comparison of the antiviral activity of Trastuzumab-IFN ⁇ , Trastuzumab-IFN ⁇ -R27T, and Trastuzumab-IFN ⁇ -C17S-R27T through CPE assay.
  • 9A and 9B show the tumor targeting ability of Trastuzumab-IFN ⁇ -C17S-R27T compared to Trastuzumab-IFN ⁇ -R27T by xenografting NCI-N87 cells, a HER2-positive gastric cancer cell line, into nude mice.
  • Trastuzumab-IFN ⁇ -C17S-R27T shows the anticancer activity of Trastuzumab-IFN ⁇ -C17S-R27T compared to Trastuzumab-IFN ⁇ -R27T by xenografting HCC1954 cells, a HER2-positive breast cancer cell line, into nude mice.
  • Trastuzumab-IFN ⁇ -R27T was used at a single concentration of 10 mg/kg (mpk), and Trastuzumab-IFN ⁇ -C17S-R27T was evaluated for efficacy at three concentrations of 1, 3, and 10 mg/kg.
  • pCHO 1.0 (Life Technologies) was used as an expression vector. Trastuzumab, Cetuximab, and Atezolizumab were used as the antibody, and the mutant (IFN ⁇ -R27T) in which the 27th amino acid residue was substituted with threonine as interferon-beta (IFN- ⁇ ) Alternatively, a variant (IFN ⁇ -C17S-R27T) in which the 17th amino acid residue was substituted with serine in addition to R27T was used.
  • trastuzumab trastuzumab-interferon-beta-R27T
  • trastuzumab-IFN ⁇ -R27T trastuzumab-IFN ⁇ -C17S-R27T
  • FreeStyleTM MAX reagent Thermo). Scientific
  • Cetuximab and atezolizumab antibodies were also transduced in the same manner.
  • a mixture obtained by adding OptiPROTM SFM (Thermo Scientific) to the FreeStyleTM MAX reagent-DNA complex was placed in CHO-S in a flask, and incubated in a humidified 8% CO2 atmosphere at atmospheric pressure.
  • a cell line stably expressing the fusion protein was selected 48 hours after transduction. Cells were sorted through secondary selection with puromycin 10-50 ⁇ g/mL and MTX 100-1,000 nM. Selected cells were incubated with glucose to express the fusion protein for 5 or 7 days at 37° C. under humidified 8% CO 2 atmospheric pressure, 130 rpm.
  • the fusion protein expressed in CHO-S cells was purified by affinity chromatography. After passing the CHO-S culture medium through a column filled with Protein A Mabselect sure (Cytiva), equilibration buffer, wash buffer, and elution buffer were sequentially added. A purified protein was obtained.
  • FPLC-SEC Aggregation analysis
  • Human breast cancer cell lines MF-7, MDA-MB-231, HCC-1954, MDA-MB-453) and human gastric cancer cell lines (SNU1, SNU620, Hs746T, MKN45) are Korean cell lines It was purchased at a bank (KCLB, Seoul, South Korea).
  • the human gastric cancer cell line NCI-N87 was purchased from the American Cell Line Bank (ATCC, Manassas, VA, USA).
  • U937 cell line iLite type I IFN assay ready cell, ATCC#CRL1593.2 was purchased from Euro Diagnostica AB (Malmo, Sweden).
  • the MCF-7, MDA-MB-231, HCC-1954, MDA-MB453, NCI-N87, SNU1, SNU620, Hs746T, MKN45 and U937 cell lines contained 10% FBS (HyClone, USA), penicillin 100 units/mL and streptomycin.
  • Hs746T cell line DMEM (HyClone, USA) containing 10% FBS (HyClone, USA), penicillin 100 units/mL and streptomycin 100 ⁇ g/mL ) was cultured using the medium. All cell lines were cultured at 37° C. under humidified 5% CO 2 atmospheric pressure.
  • MCF-7, MDA-MB-231, and NCI-N87 cell lines were collected in an EP tube, respectively, and reacted with blocking buffer at 4°C for 1 hour, and washed twice with PBS. After that, 1 ug of Trastuzumab, Trastuzumab-IFN ⁇ -R27T and Trastuzumab-IFN ⁇ -C17S-R27T were reacted and washed 3 times with PBS. Then, FITC-conjugated anti-human IgG secondary antibody was reacted and washed 3 times. Cells reacted with the antibody were analyzed using a CytoFlex (Beckman coulter, USA) flow cytometer.
  • RIPA lysis buffer 150 mM NaCl, 1% tryptone X-100, 1% sodium deoxycholate, 0.1 % SDS, 50 mM Tris-HCl [pH 7.5], containing 2 mM EDTA was used to lyse the cells. Lysed cells were incubated at 4° C. for 20 min and centrifuged at 14,000 g for 10 min.
  • the supernatant was recovered and the protein concentration was measured using the BCA protein assay kit (Thermo Scientific) according to the manufacturer's instructions. 20 ug of protein was separated by 10% SDS-PAGE and transferred to a polyvinyl difluoride membrane (BioRad). The PVDF membrane was blocked with TBS-Tween20 buffer (containing 5% BSA) and incubated with primary antibody overnight at 4°C. Thereafter, the secondary antibody was incubated for 1 hour at room temperature.
  • the primary antibody used herein is anti-pSTAT1, anti-STAT1 (Cell Signaling Technology) or anti- ⁇ -actin (Santa Cruz Biotechnology), and the secondary antibody is anti-mouse IgG-HRP (ThermoFisher Scientific) or anti-rabbit IgG-HRP (ThermoFisher Scientific). HRP bound to the protein was visualized with Clarity Western ECL substrate (Bio-Rad).
  • Control IgG (0.0001 ⁇ 100 nM), Trastuzumab (0.0001 ⁇ 100 nM), IFN- ⁇ (0.000001 ⁇ 1 nM), or Trastuzumab-IFN ⁇ -C17S-R27T ( 0.0001 ⁇ 100 nM) and co-cultured with effector cells to measure antibody-dependent cytotoxic activity.
  • effector cells NK-92MI-CD16a, a natural killer cell (NK cell) cell line artificially overexpressing CD16a, was used to induce antibody-dependent cytotoxicity, and the ratio of effector cells to target cells (E:T ratio) was 8. 1: 1 and reacted with the drug for 4 hours.
  • the cytotoxicity of the target cells was measured using a non-radioactive cytotoxicity assay (Promega, USA) that measures the release of lactate dehydrogenase (LDH) according to the manufacturer's instructions.
  • LDH lactate dehydrogenase
  • WST Water-Soluble Tetrazolium
  • CPE assay cytopathic effect assay
  • A549 cells were dispensed in a 96-well plate, and each drug was treated by concentration (0.78125 ⁇ 100 IU/mL). After 22 hours of drug treatment, EMCV of 1000 TCID50/mL was added. After co-culture for 22 hours, the cytopathic effect was measured from the absorbance values obtained using WST colorimetric assay.
  • the HER2-positive gastric cancer cell line, NCI-N87 was injected subcutaneously into 6-week-old female nude mice and xenografted.
  • a fluorescent label (CF750) was bound to IgG-IFN ⁇ -R27T, Trastuzumab-IFN ⁇ -R27T, IgG-IFN ⁇ -C17S-R27T, or Trastuzumab-IFN ⁇ -C17S-R27T drug.
  • the formed tumor size reached about 100 mm 3 , randomly assigned to 3 mice and injected 100 ug/m mice were administered.
  • mice After 24 hours of drug administration, the mice were anesthetized, and the biodistribution of the drug was observed using a small animal optical bio-image analyzer (Ami HTX, Spectral Instruments Imaging).
  • Ami HTX Small Animal optical bio-image analyzer
  • cancer, liver, kidney, spleen, lung, and intestine were isolated from mice xenografted with cancer, and drug distribution between tissues was observed. Experimental results were statistically processed by student T-test analysis.
  • the formed tumor size reached about 100 mm 3
  • 5 animals were randomly assigned to each of the vehicle, and Trastuzumab-IFN ⁇ -R27T or Trastuzumab-IFN ⁇ -C17S-R27T was administered 3 times a week according to each dose for 3 weeks ( day 0).
  • Experimental results were statistically processed by two-way ANOVA analysis.
  • Cell lines expressing Trastuzumab-IFN ⁇ -C17S-R27T, Trastuzumab-IFN ⁇ -R27T and Trastuzumab-IFN ⁇ were used and expressed and purified under the same conditions.
  • the transduced CHO-S cell line was cultured at 37° C. and 8% CO 2 for 5 days. After measuring the expression concentration of the fusion protein in the cell culture medium using Cedex-bio (Roche), it was purified by affinity chromatography using an AKTA instrument system and protein A beads.
  • the purification efficiency of Trastuzumab-IFN ⁇ -C17S-R27T was about 92%, which was significantly improved compared to Trastuzumab-IFN ⁇ (52%) or Trastuzumab-IFN ⁇ -R27T (54%). there was. Even when the cetuximab antibody and the atezolizumab antibody were applied, it was confirmed that the purification efficiency of the IFN ⁇ -C17S-R27T-conjugated fusion protein was superior.
  • the problem of protein aggregation is closely related to the activity of the substance and can cause immunogenicity in patients, so it is an important consideration in the development of therapeutic agents.
  • the purified fusion protein was comparatively analyzed by FPLC-SEC method.
  • the protein aggregation rate of Trastuzumab-IFN ⁇ -C17S-R27T was about 8%, which was significantly reduced compared to Trastuzumab-IFN ⁇ -R27T which was 40% or Trastuzumab-IFN ⁇ which was 85%. there was. Even when the cetuximab antibody and the atezolizumab antibody were applied, it was confirmed that the protein aggregation ratio was significantly reduced when IFN ⁇ -C17S-R27T was bound.
  • HER2 antigen recognition ability of Trastuzumab-IFN ⁇ -C17S-R27T was compared with Trastuzumab-IFN ⁇ -R27T and Trastuzumab. After reacting each substance with NCI-N87 cells with high HER2 expression or MCF-7 or MDA-MB-231 cells with low expression, flow cytometry was used to analyze HER2 antigen recognition on the cell surface by shifting the fluorescence intensity peak. did.
  • the peak did not shift to the control group in the untreated group, whereas the group treated with Trastuzumab, Trastuzumab-IFN ⁇ -R27T, and Trastuzumab-IFN ⁇ -C17S-R27T was HER2
  • the peak of fluorescence intensity shifted according to the expression level. In the MCF-7 and MDA-MB-231 cell lines with low HER2 expression, the fluorescence intensity of all three substances was slightly increased, but the fluorescence intensity increased significantly in the NCI-N87 cell line with high HER2 expression.
  • Interferon activity occurs through the phosphorylation of STAT, a down-level signal messenger, by binding to the type I IFN receptor.
  • STAT a down-level signal messenger
  • NCI-N87 cells were treated with IFN ⁇ -C17S-R27T and Trastuzumab-IFN ⁇ -C17S-R27T at each concentration (0.004 ⁇ 40 pM) for 1 hour.
  • Western Blot was used to confirm STAT1 phosphorylation and expression of STAT1 and ⁇ -actin.
  • the signal of STAT1 phosphorylation was improved according to the treatment concentration of Trastuzumab-IFN ⁇ -C17S-R27T, and the activity level of Trastuzumab-IFN ⁇ -C17S-R27T was found to be similar to that of IFN ⁇ -C17S-R27T.
  • Antibody-dependent cytotoxicity is one of the main anticancer mechanisms of Trastuzumab.
  • cancer cell death occurs by activation of NK cells that have Fc gamma receptors capable of binding to the Fc domain of Trastuzumab.
  • Trastuzumab-IFN ⁇ -C17S-R27T contains Trastuzumab, it may contain antibody-dependent cytotoxicity like Trastuzumab.
  • Control IgG, Trastuzumab, IFN- ⁇ , and Trastuzumab-IFN ⁇ -C17S-R27T were treated to target HER2-positive cancer cells (HCC1954, MDA-MB453) at different concentrations, and effector cells, NK cells (NK-92MI-CD16a) Antibody-dependent cytotoxicity was confirmed after co-culture with and 8:1 effector to target cell ratio.
  • IFN- ⁇ has the effect of directly inhibiting the proliferation of cancer cells through receptor binding.
  • the antiproliferative ability of Trastuzumab-IFN ⁇ -C17S-R27T was evaluated in gastric cancer cell lines having various HER2 expression levels.
  • Trastuzumab and Trastuzumab-based antibody-drug conjugate T-DM1 showed significant antiproliferative activity only in NCI-N87 cells with high HER2 expression.
  • Trastuzumab-IFN ⁇ -C17S-R27T showed significant anti-proliferative activity not only in cell lines with high HER2 expression but also in medium (SNU1, SNU620) and low (Hs746T, MKN45) gastric cancer cell lines.
  • the most common assay method is to measure antiviral activity that protects cells from cytopathic effects (CPE) caused by specific viruses. Therefore, IFN activity of Trastuzumab-IFN ⁇ , Trastuzumab-IFN ⁇ -R27T and Trastuzumab-IFN ⁇ -C17S-R27T was quantitatively measured and compared using CPE assay.
  • the antiviral activity effect of Trastuzumab-IFN ⁇ -C17S-R27T was about 3 times higher than that of Trastuzumab-IFN ⁇ -R27T, and Trastuzumab-IFN ⁇ had an antiviral effect in the tested concentration range. Almost no viral activity was observed.
  • the degree of tumor-specific movement of each fusion protein in the animal model was compared and analyzed.
  • Trastuzumab - IFN ⁇ -R27T is an IgG-IFN ⁇ -R27T than twice the tumor target, whereas the performance effect, Trastuzumab-IFN ⁇ -C17S-R27T is more than four times compared to IgG-IFN ⁇ -C17S-R27T high tumor targeting performance effect indicated.
  • the rate of transition to tumors of Trastuzumab-IFN ⁇ -C17S-R27T compared to other organs was higher than that of Trastuzumab-IFN ⁇ -R27T.
  • each substance was administered, and the size of the tumor was measured.
  • the physical properties of interferon-beta are improved through site-specific mutation, thereby improving biological activity and purification efficiency, and increasing productivity. Since these recombinant proteins express both the function of interferon-beta and the characteristics of an antibody binding to a specific antigen, it can be usefully used as a target therapeutic agent for cancer and the like.

Abstract

본 발명은 아미노산 잔기가 치환된 인터페론-베타 변이체와 특정 항원에 결합하는 항체가 융합된 재조합 단백질, 폴리뉴클레오티드, 발현벡터 및 재조합 미생물, 상기 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 항암용 약학 조성물에 관한 것으로, 상기 재조합 단백질은 부위 특이적 변이를 통해 인터페론-베타의 물리적 특성이 개선되어 생물 활성 및 정제 효율이 향상되고 생산성이 높아질 수 있다.

Description

인터페론-베타 변이체와 항체가 융합된 재조합 단백질 및 이를 포함하는 약학 조성물
본 출원은 2020년 4월 29일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2020-0052911호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 아미노산 잔기가 치환된 인터페론-베타 변이체와 특정 항원에 결합하는 항체가 융합된 재조합 단백질, 폴리뉴클레오티드, 발현벡터 및 숙주세포, 상기 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 항암용 약학 조성물에 관한 것이다.
인터페론(interferon; IFN)은 면역에서 중요한 역할을 하는 주요 사이토카인(cytokine) 중 하나로, 강력한 항암 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 인터페론은 타입 Ⅰ (IFN-α 및 IFN-β), 타입 Ⅱ (IFN-γ), 타입 Ⅲ (IFN-λ)로 구분된다.
타입 Ⅰ 인터페론은 항바이러스, 항증식(antiproliferative) 효과를 나타내며, 종양 특이 항원(tumor specific antigen)을 인지하여 종양 세포를 제거하는 기능인 면역감시(cancer immunosurveillance)에도 필수적인 역할을 한다.
타입 I 인터페론의 신호전달(signaling)은 인터페론 수용체의 활성에 의해 다수의 효소가 단계적으로 활성화되는 것으로, 이때 STAT1, STAT2 등의 전사 인자도 작용한다. 이러한 신호전달은 면역 시스템을 작동시키며, 안트라사이클린 등과 같은 화학치료제(chemotherapeutic), 사람 표피성장인자수용체(human epidermal growth factor receptor 2; HER2), 표피성장인자수용체(epidermal growth factor receptor; EGFR) 등과 같이 성장인자수용체(growth factor receptor)를 표적으로 하는 항체, 보조제(adjuvants) 투여, 종양세포붕괴성 바이러스치료(oncolytic virotherapy) 등 다양한 항암제에 대한 항암 효과를 나타내는데도 필수적이다. 특히, 트라스투주맙(Trastuzumab)은 HER2를 표적으로 하는 항체 암치료제로, MUC4의 과발현에 의해 치료 저항성을 가지게 된다. 이러한 저항성 기전에 관련된 신호 물질 중 하나인 pSTAT3는 두 개의 동일한 물질이 중합된 형태 (pSTAT3 homodimer)를 가지며, pSTAT1에 의해 억제되는 것으로 알려져 있다. 따라서 pSTAT1을 활성화시키는 타입 I 인터페론을 트라스투주맙과 결합하였을 때 증가된 항암 효능을 기대할 수 있다.
인터페론-베타(IFN-β)는 세포 성장을 억제하는 효과가 인터페론-알파(IFN-α)에 비해 더 강력하다. 특히, 항암제와 함께 사용할 경우에는 인터페론-베타의 항증식 활성 범위 및 시너지 효과가 매우 우수하다. 그러나, 인터페론을 이용한 치료제는 세포 독성이 커 치료 대상자로부터 열 (80%), 근육통 (73%), 두통 (50%), 피로 (50%), 권태감 (50%) 등의 증상이 나타나는 것으로 알려져 있다. 또한, 인터페론-베타는 소수성이 강한 단백질로, 잘 응집되는 경향이 있어 생물 활성 및 생산성이 저하된다. 또한, 반감기가 짧아서 자주 투여해야 한다는 단점이 있다. 따라서, 인터페론을 이용한 치료제를 개발하기 위해서는 인터페론에 의한 한계를 최소화 시켜야 할 필요가 있다.
이에 따라, 본 발명자들은 부위 특이적 변이를 통해 인터페론의 물리적 특성을 변화시킴으로써 생산성이 향상되고 응집 현상이 감소된 돌연변이 인터페론-베타를 개발하였다. 이러한 인터페론-베타 변이체는 항체 암치료제와 융합되어 우수한 항암 효과를 나타내는 새로운 항암 치료제로 활용될 수 있다.
본 발명의 일 양상은 17번째 아미노산 잔기가 세린으로 치환되고, 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 인터페론-베타(IFN-β) 변이체; 및 상기 인터페론-베타 변이체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 상기 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 상기 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 상기 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 항암용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 상기 재조합 단백질로 이루어지는 항암용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 상기 재조합 단백질로 필수적으로 이루어지는 항암용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명의 다른 양상은
(a) 인터페론-베타 변이체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질을 발현하도록 형질전환된 숙주세포를 배양하는 단계; 및
(b) 배양된 숙주세포 또는 이의 배양물에서 인터페론-베타에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질을 분리 정제하는 단계를 포함하는
인터페론-베타 변이체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질의 제조에 있어서, 상기 인터페론-베타 변이체의 17번째 아미노산인 시스테인을 다른 아미노산으로 변형시킨 재조합 단백질을 발현하도록 숙주세포를 형질전환시킨 것을 특징으로 하는
상기 재조합 단백질의 생산 또는 분리정제시 단백질 안정성을 높이는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 항암용 제제를 제조하기 위한 상기 재조합 단백질의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 상기 재조합 단백질을 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명은 17번째 아미노산 잔기가 세린으로 치환되고, 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 인터페론-베타(IFN-β) 변이체; 및 상기 인터페론-베타 변이체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질을 제공한다.
인터페론-베타는 5개의 알파 헬릭스를 가지고 있는 구형 단백질로서 크기가 22kDa 이며, 항바이러스 활성, 세포 성장 억제 또는 항증식 활성, 림프구 세포 독성 증대 활성, 면역 조절 활성, 표적 세포의 분화 유도 또는 억제 활성, 대식세포의 활성화 활성, 사이토카인 생성의 증가 활성, 세포독성 T 세포의 효과 증가 활성, 자연 살해 세포(natural killing cell)의 증가 활성 등 다양한 면역학적 활성으로 암, 자가 면역 장애, 바이러스 감염, HIV와 관련된 질병, C형 간염, 류마티스성 관절염 등에 치료에 효과가 있다는 보고가 있다. 그러나, 인터페론-베타는 강한 소수성 단백질로 응집 현상을 나타나며, 생물 활성 및 생산성이 낮고 반감기가 짧아 인터페론-베타의 활용에 제한점이 있었다. 따라서, 본 발명에서는 인터페론-베타의 유전자에 대해 부위 특이적 변이(site-directed mutagenesis)를 유도함으로써 변이가 일어나지 않은 야생형 인터페론-베타에 비해 물리적 특성을 개선된 인터페론-베타 변이체를 개발하였다.
상기 인터페론-베타 변이체(interferon beta mutein)는 17번째 시스테인(cysteine; C)이 세린(serine; S)으로 치환되고, 27번째 아르기닌(arginine; R)이 트레오닌(threonine; T)으로 치환됨으로써, 80번째 및 25번째 아미노산 잔기에 글리코실기(glycosyl group)를 포함하는 것을 특징으로 한다. 이때, 인터페론-베타 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이를 암호화하는 서열번호 2의 염기 서열로 표시되는 것일 수 있다. 이러한 인터페론-베타 변이체는 야생형 인터페론-베타의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 것으로, 인터페론-베타의 활성을 갖는다.
상기 항체는 단클론성 항체, 다클론성 항체, 다중특이성 항체 (예를 들면, 이중특이성 항체) 및 이의 단편을 포함한다. 완전한 항체는 전체적으로 Y 모양을 하며, 2개의 긴 중쇄(heavy chain; H)과 2개의 짧은 경쇄(light chain; L)로 구성된다. 각 중쇄와 경쇄는 서로 황화결합으로 연결되며, 항원과 반응하는 부위인 가변영역(variable region; V)와 효과기능을 발현하는 부위인 불변영역(constant region; C)로 구분된다. 가변영역에는 항원과 특이적인 결합을 형성할 수 있도록 가변영역의 구조를 결정하며 항체결합세기를 조절하는 상보성 결정 부위(complementarity-determining region; CDR)가 존재한다. 상기 항체의 단편은 항원과 반응하여 항원-결합 활성을 나타낼 수 있는 특정 부위를 나타내며, 일례로 Fab 단편 (파파인 소화에 의한 단편), Fab' 단편 (펩신 소화 및 부분적 환원에 의한 단편), F(ab')2 단편 (펩신 소화에 의한 단편), Facb(플라스민 소화에 의한 단편), Fd (펩신 소화, 부분적 환원 및 재응집에 의한 단편), scFv 단편(분자생물학 기법에 의한 단편) 등일 수 있다. 바람직하게는, 항체는 종양 특이 항원을 인지하는 항체 또는 이의 단편인 것으로, 암 등의 표적치료제로 사용 가능할 수 있다. 일례로는, 사람 표피성장인자수용체(HER-2)를 표적으로 하는 항체 치료제인 트라스투주맙(Trastuzumab), 표피성장인자수용체(EGFR)를 표적으로 하는 항체 치료제인 세툭시맙(Cetuximab), 암세포의 표면에 발현되는 PD-L1을 표적으로 하는 항체 치료제인 아테졸리주맙(Atezolizumab) 등일 수 있다. 이때, 트라스투주맙은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄로 구성될 수 있고, 세툭시맙은 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄로 구성될 수 있고, 아테졸리주맙은 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 8으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄로 구성될 수 있다.
상기 재조합 단백질은 인터페론-베타 변이체와 항체 또는 이의 단편이 펩티드 링커에 의해 연결되어 형성된 융합체 또는 복합체일 수 있다. 상기 펩티드 링커는 아미노산 또는 아미노산과 유사한 물질이 서로 펩티드 결합에 의해 둘 이상이 연결된 짧은 단편의 아미노산 또는 아미노산 유사체로 둘 이상의 별개의 물질을 서로 연결시켜 주는 역할을 하는 분자를 말한다. 이때, 글리신, 세린, 알라닌 등이 주요 구성 아미노산으로 이용되어 글리신-세린 링커, 글리신-세린-알라닌 링커 등을 사용할 수 있다. 이러한 링커는 항체의 중쇄 C-말단 또는 항체의 경쇄 C-말단에 연결되거나, 또는 항체의 경쇄 C-말단과 중쇄 C-말단에 링커의 N-말단이 연결될 수도 있다. 이때, 링커의 C-말단에는 인터페론 베타 변이체의 N-말단이 연결될 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예에 따르면, 본 발명은 상기 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(polynucleotide)를 제공한다.
폴리뉴클레오티드는 염기, 당, 인산의 세 가지 요소로 구성된 화학적 단량체인 뉴클레오티드가 다수의 인산에스테르 결합을 매개로 사슬 형태로 이어진 고분자 화합물로, 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체이다.
상기 폴리뉴클레오티드는 RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 또는 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열 등일 수 있으며, 상기 재조합 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함한다. 바람직하게는, 인터페론-베타 변이체와 트라스투주맙의 중쇄가 연결된 재조합 단백질을 암호화하는 서열번호 9로 표시되는 염기 서열이거나, 인터페론-베타 변이체와 세툭시맙의 중쇄가 연결된 재조합 단백질을 암호화하는 서열번호 10으로 표시되는 염기 서열이거나, 인터페론-베타 변이체와 아테졸리주맙의 중쇄가 연결된 재조합 단백질을 암호화하는 서열번호 11로 표시되는 염기서열일 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예에 따르면, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터(expression vector)를 제공한다.
발현벡터는 숙주 세포에서 인터페론-베타 변이체 및 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절 서열을 포함하는 유전자 제작물을 의미한다. 상기 "작동 가능하게 연결된(operably linked)"이란, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 상기 "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란, 특정한 숙주세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 이러한 발현벡터는 당업계에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조될 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결하는데 당업계에서 통상적으로 사용되는 효소 등을 사용될 수 있다.
상기 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서(enhancer)와 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한, 발현벡터는 발현벡터를 포함하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선별 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우에는 복제 원점을 포함하여 자가 복제하거나, 또는 숙주 DNA에 통합될 수 있다. 상기 발현벡터는 당업계에서 통상적으로 외부 유전자 발현에 사용 가능한 벡터를 제한없이 사용할 수 있으며, 일례로 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터 등일 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예에 따르면, 본 발명은 상기 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
숙주세포는 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 또는 바람직한 특정 방식으로 유전자 생성물을 진행시키는 것을 선택할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질의 해독 및 해독 후 프로세싱과 변형에 대한 특징적이고 특이적인 작용기전을 갖고 있다. 적합한 세포주 또는 숙주 시스템으로는 발현된 이종 단백질의 바람직한 변형 및 프로세싱을 제공하는 것을 선택할 수 있다. 효모에서의 발현은 생물학적 활성 생성물을 생산할 수 있다. 진핵세포에서의 발현은 폴리펩티드 또는 단백질을 구성하는 펩티드 사슬의 접힘(folding) 가능성을 증가시킬 수 있다.
상기 숙주세포는 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 당업계에 공지된 숙주세포를 제한없이 사용할 수 있으며, 일례로 E. coli JM109, E. coli BL21DE, E. coli DH5, E. coli RR1, E.coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110 등과 같은 대장균, 아그로박테리움 A4 등과 같은 아그로박테리움 속 균주, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 등과 같은 바실리(bacilli), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르게센스(Serratia marcescens) 등과 같은 장내 세균, 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주 등일 수 있다. 또한, 진핵세포에 발현벡터를 형질도입(transfection)할 경우에는 숙주세포로서 효모(Saccharomyces cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예를 들면, CHO(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN, MDCK 세포주) 등이 이용될 수 있다.
발현벡터의 도입은 당업계에서 통상적으로 사용 가능한 형질전환(transformation) 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 "형질전환"이란, 외부 DNA를 숙주 세포 내로 도입함으로써 DNA가 숙주 세포 내 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제가 가능하도록 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상이다. 상기 형질전환 방법은 CaCl 2 침전법, CaCl 2 방법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예에 따르면, 본 발명은 상기 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 항암용 약학 조성물을 제공한다.
상기 재조합 단백질은 물리적 특성이 개선된 인터페론-베타 변이체와 항체 또는 이의 단편이 결합된 구조로, 정제 효율과 생물 활성이 우수하며, 다양한 암세포주에 대한 면역조절 효능, 항암 효능, ADCC 효능 등이 있는 것으로 확인되었다. 따라서, 이러한 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물은 암 세포의 증식, 활성을 억제하는 효과를 나타내어 항암용 약학 조성물로서 활용 가능하다.
상기 조성물의 제형화 방법은 약제학적으로 통상으로 사용되는 부형제, 보조제, 무통화제, 등장화제, 보존제, 및 기타 약제학적으로 통상으로 허용되는 보조제와 혼합하고, 약제학적으로 통상으로 허용되는 제제 형태로 제제화하여 약학적 제제를 제조할 수 있다. 상기 제제의 형태는 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형이거나, 또는 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태일 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있고, 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다.
상기 조성물을 투여하는 방법은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서는 1일 0.001 내지 1,000 mg/kg으로 투여될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여하거나, 또는 수회 나누어 투여할 수 있다. 투여 경로는 모든 방식으로 가능하며, 일례로 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
아울러, 본 발명에서는 인터페론 베타의 R27T 변이체의 생산 및 분리/정제에서 인터페론-베타의 C17, 즉 17번째 아미노산인 시스테인이 변이체의 안정성에 중요한 역할을 하는 것을 확인하였고, 그 결과 17번째 아미노산을 다른 아미노산으로 변형하는 경우 생산, 분리, 정제, 더 나아가서는 보관, 유통시의 안정성에 영향을 준다.
따라서, 본 발명은
(a) 인터페론-베타 변이체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질을 발현하도록 형질전환된 숙주세포를 배양하는 단계; 및
(b) 배양된 숙주세포 또는 이의 배양물에서 인터페론-베타에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질을 분리 정제하는 단계를 포함하는
인터페론-베타 변이체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질의 제조에 있어서, 상기 인터페론-베타 변이체의 17번째 아미노산인 시스테인을 다른 아미노산으로 변형시킨 재조합 단백질을 발현하도록 숙주세포를 형질전환시킨 것을 특징으로 하는
상기 재조합 단백질의 생산 또는 분리정제시 단백질 안정성을 높이는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에서 인터페론-베타 변이체는 인터페론-베타의 R27T 변이체이며, C17을 추가적으로 다른 아미노산으로 변형을 하기 때문에, C17N, R27T의 이중 돌연변이체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질을 발현하게 된다. 이 때, N은 시스테인을 제외한 임의의 아미노산을 나타낸다.
바람직하게는 변형되는 다른 아미노산은 세린일 수 있다.
또한, 돌연변이체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질을 발현하는 숙주세포는 단백질 발현에 사용되는 포유동물 세포일 수 있으며, 바람직하게는 CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주가 이용될 수 있으며, 가장 바람직하게는 본 발명에서 숙주세포는 CHO 세포주일 수 있다.
또한 본 발명은 항암용 제제를 제조하기 위한 상기 재조합 단백질의 용도를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 단백질을 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 ‘유효량’이란 개체에게 투여하였을 때, 암의 개선, 치료, 예방, 검출, 진단 또는 상기 질환의 억제 또는 감소 효과를 나타내는 양을 말하며, 상기 ‘개체’란 동물, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며, 동물에서 유래한 세포, 조직, 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 상기 효과가 필요한 환자(patient)일 수 있다.
본 발명의 상기 ‘치료’는 암 또는 암의 증상을 개선시키는 것을 포괄적으로 지칭하고, 이는 상기 질환을 치유하거나, 실질적으로 예방하거나, 또는 상태를 개선시키는 것을 포함할 수 있으며, 암으로부터 비롯된 한 가지 증상 또는 대부분의 증상을 완화시키거나, 치유하거나 예방하는 것을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 '을 포함하는(comprising)'이란 '함유하는(including)’또는 ‘특징으로 하는(characterized by)’과 동일한 의미로 사용되며, 본 발명에 따른 조성물 또는 방법에 있어서, 구체적으로 언급되지 않은 추가적인 구성 성분 또는 방법의 단계 등을 배제하지 않는다. 또한 용어 ‘로 이루어지는(consisting of)’이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소, 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 ‘필수적으로 이루어지는(essentially consisting of)’이란 조성물 또는 방법의 범위에 있어서, 기재된 물질 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계 등을 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 인터페론-베타 변이체와 항체 또는 이의 단편이 결합된 재조합 단백질은 부위 특이적 변이를 통해 인터페론-베타의 물리적 특성이 개선되어 생물 활성 및 정제 효율이 향상되고 생산성이 높아질 수 있다. 이러한 재조합 단백질은 인터페론-베타의 기능 및 특정 항원에 결합하는 항체의 특성이 모두 발현하므로, 암 등의 표적치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 인터페론-베타 변이체와 종양 표적화 항체가 결합된 융합단백질의 구조를 보여주는 모식도이다.
도 2a 내지 도 2d는 친화성 크로마토그래피 정제 과정에서 항체-인터페론-베타 변이체 융합단백질의 정제 효율을 비교한 결과이다. (도 2a) Trastuzumab-IFNβ, Trastuzumab-IFNβ-R27T 및 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R270T의 정제 효율을 각 실험별로 나타낸 그래프이다. (도 2b) Trastuzumab-IFNβ, Trastuzumab-IFNβ-R27T 및 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 정제 반복 실험의 평균 수율을 비교한 그래프이다. (도 2c) Cetuximab-IFNβ-R27T 및 Cetuximab-IFNβ-C17S-R27T의 정제 효율을 비교한 결과이다. (도 2d) Atezolizumab-IFNβ-R27T 및 Atezolizumab-IFNβ-C17S-R27T의 정제 효율을 비교한 결과이다.
도 3a 내지 도 3c는 정제한 항체-인터페론-베타 변이체 융합단백질의 단백질 응집 정도를 크기 배제 크로마토그래피로 분석하여 비교한 결과이다. (도 3a) Trastuzumab-IFNβ, Trastuzumab-IFNβ-R27T 및 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 단백질 응집을 비교한 결과이다. (도 3b) Cetuximab-IFNβ-R27T 및 Cetuximab-IFNβ-C17S-R27T의 단백질 응집을 비교한 결과이다. (도 3c) Atezolizumab-IFNβ-R27T 및 Atezolizumab-IFNβ-C17S-R27T의 단백질 응집을 비교한 결과이다.
도 4a 및 도 4b는 MCF-7, MDA-MB231, NCI-N87 세 종류의 세포주를 이용하여 Trastuzumab, Trastuzumab-IFNβ-R27T 및 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 HER2 결합능을 유세포분석기로 분석한 결과이다.
도 5는 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 인터페론 신호 활성 능력을 분석한 결과이다. NCI-N87 세포주에 IFNβ-C17S-R27T와 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T을 각각 처리한 후 한 시간이 지난 뒤에 pSTAT1 발현량을 확인함으로써 인터페론-베타 신호 활성 정도를 측정한 결과이다.
도 6은 HER2 양성 암세포주인 HCC1954와 MDA-MB453 세포주에서 Control IgG, IFN-β, Trastuzumab 및 Trastuzumab-IFNv-C17S-R27T의 항체 의존성 세포 독성 효과를 비교 분석한 결과이다.
도 7a 및 도 7b는 HER2 발현량이 높은 세포주인 NCI-N87, HER2 발현량이 중간 수준의 세포주인 SNU1 및 SNU620, HER2 발현량이 낮은 세포주인 Hs746T 및 MKN45에서 Trastuzumab, T-DM1, IFNβ-R27T, Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T 각 물질의 직접적인 항증식 활성을 비교한 결과이다.
도 8a 및 도 8b는 CPE assay를 통해 Trastuzumab-IFNβ, Trastuzumab-IFNβ-R27T 및 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 항바이러스 활성을 정량적으로 측정하고 비교한 결과이다.
도 9a 및 도 9b는 HER2 양성 위암 세포주인 NCI-N87 세포를 누드마우스에 이종이식하여 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 종양표적능력을 Trastuzumab-IFNβ-R27T과 비교하여 확인한 것이다.
도 10은 HER2-양성 유방암 세포주인 HCC1954 세포를 누드마우스에 이종이식하여 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T 의 항암활성을 Trastuzumab-IFNβ-R27T과 비교하여 확인한 것이다. Trastuzumab-IFNβ-R27T는 10 mg/kg (mpk) 단일 농도를 사용하였으며,　Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T는 1, 3, 10 mg/kg 세 농도에서 효능을 평가하였다.
이하, 첨부된 도면을 참조하며 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.
1. 재료 및 방법
1-1. 융합 단백질의 제조 설계
인터페론-베타 변이체와 결합된 항체를 일시적 또는 안정적으로 발현하는 세포주를 확립하기 위해, 발현벡터로 pCHO 1.0 (Life Technologies)을 사용하였다. 항체로 트라스투주맙(Trastuzumab), 세툭시맙(Cetuximab), 아테졸리주맙(Atezolizumab)을 사용하였고, 인터페론-베타(IFN-β)로 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 변이체(IFNβ-R27T) 또는 R27T에 추가로 17번째 아미노산 잔기가 세린으로 치환된 변이체(IFNβ-C17S-R27T)를 사용하였다.
항체의 중쇄(heavy chain) 부위에 링커와 인터페론-베타 변이체 R27T 또는 C17S-R27T가 결합되도록 클로닝 하였다. 이후, 전체 유전자의 3' 말단 및 5' 말단에 각각 제한효소 AvrII(CCTAGG) 절단 부위와 Bstz17I(GTATAC) 절단 부위 (Thermo Scientific, USA)를 삽입하여 중쇄의 최종 유전자를 확보하였다. 또한 항체의 경쇄(light chain)의 3' 말단 및 5 '말단에 각각 제한효소 EcoRV(GATATC) 절단 부위와 PacI(TTAATTAA)를 삽입하여 경쇄의 최종 유전자를 확보하였다. 중쇄 및 경쇄의 최종 유전자를 pCHO 1.0 벡터에 삽입하였다.
1-2. 포유동물 세포에서 융합 단백질 구성물의 발현
트라스투주맙, 트라스투주맙-인터페론-베타-R27T(Trastuzumab-IFNβ-R27T) 및 트라스투주맙-인터페론-베타-C17S-R27T(Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T)의 발현벡터를 FreeStyleTM MAX reagent (Thermo Scientific)를 사용하여 CHO-S 세포 (Thermo Scientific) 내로 형질도입 하였다. 세툭시맙과 아테졸리주맙 항체도 동일한 방식으로 형질도입 하였다. FreeStyleTM MAX reagent-DNA 복합체에 OptiPROTM SFM(Thermo Scientific)를 첨가한 혼합물을 플라스크에 담긴 CHO-S에 넣고서 습기가 있는 8% CO2 대기압의 조건에서 배양하였다. 형질도입 48시간 후 안정적으로 융합 단백질을 발현하는 세포주를 선별하였다. 푸로마이신(puromycin) 10 ~ 50 μg/mL 및 MTX 100 ~ 1,000 nM에 의한 2차 선별을 통해 세포를 분류하였다. 선택된 세포는 37℃에서 습기가 있는 8% CO 2 대기압, 130 rpm의 조건으로 5일 또는 7일 동안 융합 단백질을 발현시키기 위해 포도당과 배양되었다.
1-3. 융합 단백질의 정제
CHO-S 세포에서 발현한 융합 단백질을 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography) 방법으로 정제하였다. CHO-S 배양액을 단백질 A 맙셀렉트 슈어 (Protein A Mabselect sure, Cytiva)가 충진된 컬럼에 통과시킨 뒤 평형 버퍼(equilibration buffer), 세척 버퍼(wash buffer), 용출 버퍼(elution buffer)를 순차적으로 가하여 정제된 단백질을 얻었다.
1-4. 단백질 응집 분석
물리적 특성을 측정하기 위해 응집 분석(FPLC-SEC)을 수행하였다. 충진된 크기배제 크로마토그래피 (Size exclusion chromatography) 컬럼인 하이로드 (HiLoad 16/600 Superdex 200 pg) 를 AKTA purifier (Cytiva) 에 연결한다. 최대 압력을 0.3Mpa로 설정한 후 친화성 크로마토그래피 (affinity chromatography)의 방법으로 정제한 시료를 1mg/mL로 농도를 맞춰 Sample loop길이의 50% 만큼 주입하였다. UV (280nm) 피크를 확인하여 단백질의 응집률을 확인하였다.
1-5. 세포주 및 배양 조건
사람 유방암 (human breast cancer) 세포주 (MCF-7, MDA-MB-231, HCC-1954, MDA-MB-453), 사람 위암 (human gastric cancer) 세포주 (SNU1, SNU620, Hs746T, MKN45)는 한국세포주은행 (KCLB, Seoul, South Korea)에서 구매하였다. 사람 위암 세포주 NCI-N87은 미국세포주은행 (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구매하였다. U937 세포주(iLite type I IFN assay ready cell, ATCC#CRL1593.2)는 Euro Diagnostica AB (Malmo, Sweden)에서 구매하였다.
MCF-7, MDA-MB-231, HCC-1954, MDA-MB453, NCI-N87, SNU1, SNU620, Hs746T, MKN45 및 U937 세포주는 10% FBS (HyClone, USA), 페니실린100 units/mL 및 스트렙토마이신100 μg/mL을 함유하는 RPMI-1640 (HyClone, USA) 배지를, Hs746T 세포주는 10% FBS (HyClone, USA), 페니실린100 units/mL 및 스트렙토마이신100 μg/mL을 함유하는 DMEM (HyClone, USA) 배지를 이용하여 배양하였다. 모든 세포주는 37℃에서 습기가 있는 5% CO 2 대기압의 조건에서 배양하였다.
1-6. 유세포분석기를 통한 HER2 인지능 분석
MCF-7, MDA-MB-231, NCI-N87 세포주를 각각 EP tube에 모은 후 blocking buffer로 1시간동안 4℃에서 반응시키고, PBS로 2회 washing 하였다. 이후 Trastuzumab, Trastuzumab-IFNβ-R27T 및 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T를 1ug 을 반응시키고 PBS로 3회 washing 하였다. 이후 FITC가 결합된 anti-human IgG 2차 항체를 반응시키고 3회 washing 하였다. 항체와 반응한 세포를 CytoFlex (Beckman coulter, USA) 유세포분석기로 분석하였다.
1-7. Western blot을 통한 STAT1 단백질 인산화 분석
NCI-N87 세포에 IFN-β (5 ~ 200 pg/mL), IFNβ-C17S-R27T (5 ~ 200 pg/mL) 또는 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T (20 ~ 2,000 pg/mL)를 처리한 후 프로테아제 억제제(protease inhibitor) 혼합물 (Roche) 및 포스파타아제 억제제(phosphatase inhibitor) 혼합물 (Roche)을 추가한 RIPA 용해 버퍼 (150 mM NaCl, 1% 트립톤 X-100, 1% 소듐 디옥시콜레이트, 0.1% SDS, 50 mM Tris-HCl [pH 7.5], 2 mM EDTA 함유)를 이용하여 세포를 용해하였다. 용해된 세포를 4℃에서 20분 동안 배양하고 14,000 g에서 10분 동안 원심분리하였다. 상층액을 회수하여 제조사의 사용설명에 따라 BCA protein assay kit (Thermo Scientific)를 이용하여 단백질 농도를 측정하였다. 단백질 20 ug을 10% SDS-PAGE으로 분리하여 PVDF 막(polyvinyl difluoride membrane) (BioRad)에 옮겼다. PVDF 막을 TBS-Tween20 버퍼 (5% BSA 함유)로 차단하고 1차 항체와 4℃에서 밤새 배양하였다. 이후, 2차 항체와 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 여기서 사용된 1차 항체는 anti-pSTAT1, anti-STAT1 (Cell Signaling Technology) 또는 anti-β-actin (Santa Cruz Biotechnology)이고, 2차 항체는 anti-mouse IgG-HRP (ThermoFisher Scientific) 또는 anti-rabbit IgG-HRP (ThermoFisher Scientific) 이다. 단백질에 결합된 HRP를 Clarity Western ECL substrate (Bio-Rad)로 시각화하였다.
1-8. 항체 의존적 세포독성 활성 측정
표적세포 (target cell)인 HCC1954 또는 MDA-MB453 세포에 Control IgG (0.0001 ~ 100 nM), Trastuzumab (0.0001 ~ 100 nM), IFN-β (0.000001 ~ 1 nM), 또는 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T (0.0001 ~ 100 nM)를 처리하고 작동세포 (effector cell)와 공배양 하여 항체 의존성 세포독성 활성을 측정하였다. 작동세포는 항체 의존적인 세포독성을 유발하기위해 CD16a를 인위적으로 과발현한 자연살해세포 (NK cell) 세포주 NK-92MI-CD16a를 이용하였으며, 작동세포 대 표적세포의 비율 (E:T ratio)이 8:1이 되도록 하여 약물과 함께 4시간 반응 하였다. 표적세포의 세포독성은 제조사의 사용설명에 따라 젖산 탈수소 효소 (lactate dehydrogenase, LDH)의 방출을 측정하는 비방사성 세포독성 분석법 (Promega, USA)을 이용하여 측정하였다.
1-9. 항증식 활성 측정
Water-Soluble Tetrazolium (WST) colorimetric assay (Ez-Cytox; Daeil Lab Service)을 이용하여 항증식 활성을 측정하였다. NCI-N87, SNU1, SNU620, Hs746T 및 MKN45 세포를 96 well plate에 분주하고 Trastuzumab, T-DM1, IFNβ-R27T, 또는 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T 각각 농도별 (0.0001 ~ 100 nM)로 72시간 동안 처리하였다. 이후, 각 웰에 WST 10 ul를 첨가하여 4시간 동안 배양하고, 흡광도 측정기 (microplate reader, TECAN)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
1-10. 항바이러스 활성 측정
세포 변성 효과 분석 (cytopathic effect assay, CPE assay)을 이용하여 Trastuzumab-IFNβ, Trastuzumab-IFNβ-R27T 및 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 항바이러스 활성을 측정하였다. 세포 변성 효과를 측정하기 위해 A549 세포를 96웰 플레이트에 분주하고 각 약물을 농도별로 (0.78125 ~ 100 IU/mL) 처리하였다. 약물 처리 22시간 후 1000 TCID50/mL의 EMCV를 넣어주었다. 22시간 공배양한 다음 WST colorimetric assay를 이용하여 얻은 흡광도 값으로부터 세포 변성 효과를 측정하였다.
1-11. 약물의 종양 이행 실험
6 주령의 암컷의 누드 마우스의 피하를 통해 HER2-양성 위암 세포주인 NCI-N87을 주사하여 이종이식 하였다. 약물을 추적하기 위해 IgG-IFNβ-R27T, Trastuzumab-IFNβ-R27T, IgG-IFNβ-C17S-R27T, 또는 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T 약물에 형광표지인자 (CF750)을 결합하였다. 형성된 종양크기가 약 100 mm 3이 되었을 때, 무작위로 3마리씩 할당하여 IgG-IFNβ-R27T, Trastuzumab-IFNβ-R27T, IgG-IFNβ-C17S-R27T, 또는 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T 을 100 ug/mice 투여하였다. 약물 투여 24시간 후 마우스를 마취한 후 소동물 광학 생체 영상분석기 (Ami HTX, Spectral Instruments Imaging)장비를 이용하여 약물의 생체 분포를 관찰하였다. 또한 생체 외 (Ex vivo) 분석을 위해 암이 이종이식된 마우스의 암, 간, 신장, 비장, 폐, 장을 분리하여 조직 간 약물 분포를 관찰하였다. 실험결과는 student T-test 분석을 하여 통계처리하였다.
1-12. 이종이식(xenograft) 동물실험
5 주령의 암컷의 누드 마우스의 피하를 통해 HER2-양성 유방암 세포주인 HCC1954를 주사하였다. 형성된 종양크기가 약 100 mm 3이 되었을 때, 무작위로 5마리씩 할당하여 비히클과, Trastuzumab-IFNβ-R27T 또는 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T을 각 투여용량에 따라 1주일에 3회씩 3주간 투여하였다 (day 0). 종양은 캘리퍼스를 이용하여 일주일에 두 번 측정하여, (길이 X 넓이 2)/2= 체적 (mm 3)으로 계산하였다. 실험결과는 Two-way ANOVA 분석을 하여 통계처리하였다.
2. 결과
2-1. 융합 단백질의 정제 효율 비교
Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T, Trastuzumab-IFNβ-R27T 및 Trastuzumab-IFNβ를 발현하는 세포주를 이용하여 동일한 조건에서 발현 및 정제하였다. 형질도입한CHO-S 세포주를 37℃, 8% CO 2에서 5일 동안 배양하였다. Cedex-bio (Roche)를 이용하여 세포 배양액 내 융합 단백질의 발현 농도를 측정한 뒤 AKTA instrument 시스템 및 protein A bead를 이용하여 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography) 방법으로 정제하였다.
그 결과, 도 2a 내지 도 2d에서 보듯이 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 정제 효율은 약 92%로, 52%인 Trastuzumab-IFNβ 또는 54%인 Trastuzumab-IFNβ-R27T와 비교하여 크게 향상된 것을 확인할 수 있었다. 세툭시맙 항체와 아테졸리주맙 항체를 적용했을 때에도 IFNβ-C17S-R27T가 결합된 융합단백질의 정제 효율이 더 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.
2-2. 융합단백질의 단백질 응집 비율 비교
단백질 응집 문제는 물질의 활성과도 깊은 연관이 있으며, 환자에게서 면역원성을 유발할 수 있으므로 치료제 개발에서 중요하게 고려해야할 부분이다. 단백질 응집을 분석하기 위해 정제한 융합단백질을 FPLC-SEC 방법으로 비교 분석하였다.
그 결과, 도 3a 내지 도 3c에서 보듯이 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 단백질 응집 비율은 약 8%로, 40%인 Trastuzumab-IFNβ-R27T 또는 85%인 Trastuzumab-IFNβ에 비해 크게 감소한 것을 확인할 수 있었다. 세툭시맙 항체와 아테졸리주맙 항체를 적용했을 때에도 IFNβ-C17S-R27T가 결합된 경우 단백질 응집 비율이 크게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
2-3. Trastuzumab- IFNβ-C17S-R27T의 세포 표면 HER2 항원 인지능 비교
Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 HER2항원 인지능을 Trastuzumab-IFNβ-R27T 및 Trastuzumab과 비교하였다. 각 물질을 HER2발현이 높은 NCI-N87 세포 또는 발현이 낮은 MCF-7, MDA-MB-231세포와 반응시킨 후 유세포분석기를 사용하여 형광 강도 피크의 이동에 의한 세포 표면의 HER2 항원 인지능을 분석하였다.
그 결과, 도 4a 및 도 4b에서 보듯이 아무 처리를 하지 않은 미처리군은 대조군으로 피크가 이동하지 않은 반면, Trastuzumab, Trastuzumab-IFNβ-R27T, 및 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T을 처리한 군은 HER2 발현 정도에 따라 형광 강도의 피크가 이동하였다. HER2 발현이 낮은 MCF-7 및 MDA-MB-231 세포주에서는 세가지 물질 모두 형광 강도가 약하게 증가하였으나, HER2 발현이 높은 NCI-N87 세포주에서는 형광 강도가 크게 증가하였다. 특히, 세가지 물질의 형광 피크가 차이가 없다는 점으로부터 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 HER2 항원 인지능은 Trastuzumab과 차이가 없음을 확인할 수 있었다.
2-4. Trastuzumab- IFNβ-C17S-R27T의 IFN 생물 활성
인터페론 활성은 타입 I IFN 수용체와 결합하여 하위 신호전달자인 STAT의 인산화 과정을 통해 일어난다. Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T에 의한 인터페론 활성을 확인하기 위해, NCI-N87 세포에 IFNβ-C17S-R27T 및 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T 를 각각 농도별(0.004 ~ 40 pM)로 1시간 처리한 후 Western Blot을 통해 STAT1 인산화와 STAT1및 β-actin의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 5에서 보듯이STAT1 인산화의 신호는 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 처리 농도에 따라 향상되고, Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 활성 수준은 IFNβ-C17S-R27T와 유사한 것으로 나타났다.
2-5. Trastuzumab- IFNβ-C17S-R27T의 항체 의존적 세포독성
항체 의존적 세포독성은 Trastuzumab의 주요 항암 기전 중 하나이다. 항체가 표적세포에 결합하면 Trastuzumab의 Fc도메인과 결합할 수 있는 Fc 감마 수용체를 가지고 있는 NK세포의 활성화에 의해 암세포 사멸이 일어난다.
Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T은 Trastuzumab 포함하고 있기 때문에 Trastuzumab과 마찬가지로 항체 의존적 세포독성을 포함할 수 있다. 표적세포 인 HER2 양성 암세포 (HCC1954, MDA-MB453)에 Control IgG, Trastuzumab, IFN-β, 및 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T를 각각 농도별로 처리하고, 작동세포인 NK세포 (NK-92MI-CD16a)와 8:1의 작동세포 대 표적세포 비율로 공배양한 후 항체 의존적 세포독성을 확인하였다.
그 결과, 도 6에서 보듯이 Contol IgG와 IFN-β 는 항체 의존적 세포독성을 거의 유발하지 않았으나, HER2를 표적하는 Trastuzumab과 이를 포함하는 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T은 동일한 수준의 항체 의존적 세포독성을 유발하였다.
Trastuzumab에 의해 유도되는 항체 의존적 세포독성 효과가 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T에서도 온전히 유지된다는 것을 확인할 수 있었다.
2-6. 암세포의 HER2 발현 정도와 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 암세포 증식 억제 효과
IFN-β 은 수용체 결합을 통해 직접적으로 암세포의 증식을 억제하는 효과를 갖고 있다. Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 항증식능을 다양한 HER2 발현 수준을 갖는 위암세포주에서 평가하였다.
그 결과, 도 7a 및 도 7b에서 보듯이 Trastuzumab과 Trastuzumab을 기반으로 하는 항체-약물 접합체인 T-DM1은 오직 HER2 발현이 높은 NCI-N87 세포에서만 유의미한 항증식능을 보였다. 반면 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T은 HER2발현이 높은 세포주 뿐만 아니라, 발현이 중간 (SNU1, SNU620) 및 낮은 (Hs746T, MKN45) 위암 세포주에서도 유의미한 항증식능이 관찰되었다.
2-7. Trastuzumab- IFNβ-C17S-R27T의 항바이러스 활성
IFN이 포함된 물질의 활성을 평가할 때 가장 보편적인 분석 방법은 특정 바이러스에 의한 세포 변성 효과 (cytopathic effect, CPE)로부터 세포를 보호하는 항바이러스 활성을 측정하는 것이다. 따라서 CPE assay를 이용하여 Trastuzumab-IFNβ, Trastuzumab-IFNβ-R27T 및 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 IFN 활성을 정량적으로 측정하고 비교하였다.
그 결과, 도 8a 및 도 8b에서 보듯이 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T에 의한 항바이러스 활성 효과는 Trastuzumab-IFNβ-R27T 대비 약 3배 높은 효과를 나타냈으며, Trastuzumab-IFNβ는 실험한 농도 범위에서는 항바이러스 활성이 거의 나타나지 않았다.
2-8. Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 종양 표적능
동물 모델에서 각 융합단백질이 종양 특이적으로 이동하는 정도를 비교 분석 하였다.
그 결과, 도 9a 및 도 9b에서 보듯이 IgG 융합 단백질 대비 Trastuzumab 융합 단백질 군에서 유의미한 종양 표적 효과가 관찰되었다. 특히, Trastuzumab -IFNβ-R27T가 IgG-IFNβ-R27T 대비 2배 높은 종양 표적능 효과를 보인 반면, Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T는 IgG-IFNβ-C17S-R27T 대비 4배 이상 높은 종양 표적능 효과를 나타내었다. 또한 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 다른 장기 대비 종양으로 이행하는 비율은 Trastuzumab-IFNβ-R27T 보다 높음을 확인하였다.
2-9. Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 in vivo 항암 효능
융합단백질의 항암 효능을 확인하기 위해 종양 이종이식 모델 (Tumor xenograft model)을 구축한 이후 각 물질을 투여하고, 종양의 크기를 측정하였다.
그 결과, 도 10에서 보듯이 Trastuzumab-IFNβ-R27T 10 mpk 또는 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T 를 1, 3, 10 mpk 농도 별로 처리한 모든 군에서 vehicle 대비 유의미한 종양 억제 효과가 관찰되었다. Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T은 농도 의존적으로 종양의 부피가 감소하였으며, 10 mpk에서 일부 마우스에서 완전 관해 (1/5)가 관찰되었다. 또한 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T 은 동일 농도 (10 mpk)에서 Trastuzumab-IFN-R27T 대비 종양 억제 효과가 더 우수함을 확인하였다.
본 발명에 따른 인터페론-베타 변이체와 항체 또는 이의 단편이 결합된 재조합 단백질은 부위 특이적 변이를 통해 인터페론-베타의 물리적 특성이 개선되어 생물 활성 및 정제 효율이 향상되고 생산성이 높아질 수 있다. 이러한 재조합 단백질은 인터페론-베타의 기능 및 특정 항원에 결합하는 항체의 특성이 모두 발현하므로, 암 등의 표적치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (16)

17번째 아미노산 잔기가 세린으로 치환되고, 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 인터페론-베타 변이체; 및 상기 인터페론-베타 변이체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 인터페론-베타 변이체는 80번째 및 25번째 아미노산 잔기에 글리코실기를 포함하는 것인 재조합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 인터페론-베타 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것인 재조합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 트라스투주맙(Trastuzumab), 세툭시맙(Cetuximab) 및 아테졸리주맙(Atezolizumab)으로 이루어진 군에서 선택된 1종이 이상인 재조합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 인터페론-베타 변이체와 항체 또는 이의 단편이 펩티드 링커에 의해 연결된 것인 재조합 단백질.
제1항의 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
제6항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9, 10 또는 11의 염기 서열로 표시되는 것인 폴리뉴클레오티드.
제6항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
제8항의 발현벡터로 형질전환된 숙주세포.
제1항의 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 항암용 약학 조성물.
(a) 인터페론-베타 변이체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질을 발현하도록 형질전환된 숙주세포를 배양하는 단계; 및
(b) 배양된 숙주세포 또는 이의 배양물에서 인터페론-베타에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질을 분리 정제하는 단계를 포함하는
인터페론-베타 변이체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질의 제조에 있어서, 상기 인터페론-베타 변이체의 17번째 아미노산인 시스테인을 다른 아미노산으로 변형시킨 재조합 단백질을 발현하도록 숙주세포를 형질전환시킨 것을 특징으로 하는
상기 재조합 단백질의 생산 또는 분리정제시 단백질 안정성을 높이는 방법.
제11항에 있어서, 상기 인터페론-베타 변이체는 인터페론-베타의 R27T 변이체인 것을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 다른 아미노산은 세린인 것을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 숙주세포는 포유동물 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
항암용 제제를 제조하기 위한 제1항의 재조합 단백질의 용도.
제1항의 재조합 단백질을 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4019050A4 (en) * 2019-08-19 2023-11-08 GenoPharm Inc. USE OF IMMUNOCYTOKINE COMPRISING INTERFERON-BETA OR A VARIANT THEREOF FOR THE TREATMENT OF HUMAN EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR 2 POSITIVE CANCER

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4588585A (en) * 1982-10-19 1986-05-13 Cetus Corporation Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins
KR100781666B1 (ko) * 2004-11-02 2007-12-03 신영기 인간 인터페론-베타 변이체
JP2008508862A (ja) * 2004-06-28 2008-03-27 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング Ｆｃ−インターフェロン−β融合タンパク質
KR20160107070A (ko) * 2015-03-03 2016-09-13 에이비온 주식회사 인간 인터페론-베타 변이체가 접합된 면역사이토카인 및 이의 제조방법
KR20180025743A (ko) * 2016-09-01 2018-03-09 에이비온 주식회사 인간 인터페론-베타 변이체가 접합된 면역사이토카인 및 이의 제조방법
KR20200052911A (ko) 2018-11-02 2020-05-15 구글 엘엘씨 멀티 파트 영구 콘텐츠를 제공하기 위한 시스템 및 방법

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4588585A (en) * 1982-10-19 1986-05-13 Cetus Corporation Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins
JP2008508862A (ja) * 2004-06-28 2008-03-27 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング Ｆｃ−インターフェロン−β融合タンパク質
KR100781666B1 (ko) * 2004-11-02 2007-12-03 신영기 인간 인터페론-베타 변이체
KR20160107070A (ko) * 2015-03-03 2016-09-13 에이비온 주식회사 인간 인터페론-베타 변이체가 접합된 면역사이토카인 및 이의 제조방법
KR20180025743A (ko) * 2016-09-01 2018-03-09 에이비온 주식회사 인간 인터페론-베타 변이체가 접합된 면역사이토카인 및 이의 제조방법
KR20200052911A (ko) 2018-11-02 2020-05-15 구글 엘엘씨 멀티 파트 영구 콘텐츠를 제공하기 위한 시스템 및 방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KIM, TAE-EUN: "The study for interferon beta-1a-based anti-cancer therapeutics", PH.D. THESIS, 2017, Korea, pages 1 - 129, XP009531509 *
LEE CHAN GYU, KIM TAEEUN, HONG SUNGYOUL, CHU JONGWAN, KANG JU EUN, PARK HEE GEON, CHOI JUN YOUNG, SONG KYOUNG, RHA SUN YOUNG, LEE : "Antibody-Based Targeting of Interferon-Beta-1a Mutein in HER2-Positive Cancer Enhances Antitumor Effects Through Immune Responses and Direct Cell Killing", FRONTIERS IN PHARMACOLOGY, vol. 11, 8 January 2021 (2021-01-08), pages 608774, XP055862548, DOI: 10.3389/fphar.2020.608774 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4019050A4 (en) * 2019-08-19 2023-11-08 GenoPharm Inc. USE OF IMMUNOCYTOKINE COMPRISING INTERFERON-BETA OR A VARIANT THEREOF FOR THE TREATMENT OF HUMAN EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR 2 POSITIVE CANCER

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