KR102651002B1 - 인터페론-베타 변이체와 항체가 융합된 재조합 단백질 및 이를 포함하는 약학 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 아미노산 잔기가 치환된 인터페론-베타 변이체와 특정 항원에 결합하는 항체가 융합된 재조합 단백질, 폴리뉴클레오티드, 발현벡터 및 재조합 미생물, 상기 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 항암용 약학 조성물에 관한 것으로, 상기 재조합 단백질은 부위 특이적 변이를 통해 인터페론-베타의 물리적 특성이 개선되어 생물 활성 및 정제 효율이 향상되고 생산성이 높아질 수 있다. 이러한 재조합 단백질은 인터페론-베타의 기능 및 특정 항원에 결합하는 항체의 특성이 모두 발현하므로, 암 등의 표적치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

인터페론-베타 변이체와 항체가 융합된 재조합 단백질 및 이를 포함하는 약학 조성물{Recombinant protein fused with interferon-beta mutein and antibody, and pharmaceutical composition comprising the same}
본 발명은 아미노산 잔기가 치환된 인터페론-베타 변이체와 특정 항원에 결합하는 항체가 융합된 재조합 단백질, 폴리뉴클레오티드, 발현벡터 및 숙주세포, 상기 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 항암용 약학 조성물에 관한 것이다.
인터페론(interferon; IFN)은 면역에서 중요한 역할을 하는 주요 사이토카인(cytokine) 중 하나로, 강력한 항암 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 인터페론은 타입 Ⅰ (IFN-α 및 IFN-β), 타입 Ⅱ (IFN-γ), 타입 Ⅲ (IFN-λ)로 구분된다.
타입 Ⅰ 인터페론은 항바이러스, 항증식(antiproliferative) 효과를 나타내며, 종양 특이 항원(tumor specific antigen)을 인지하여 종양 세포를 제거하는 기능인 면역감시(cancer immunosurveillance)에도 필수적인 역할을 한다.
타입 Ⅰ 인터페론의 신호전달(signaling)은 인터페론 수용체의 활성에 의해 다수의 효소가 단계적으로 활성화되는 것으로, 이때 STAT1, STAT2 등의 전사 인자도 작용한다. 이러한 신호전달은 면역 시스템을 작동시키며, 안트라사이클린 등과 같은 화학치료제(chemotherapeutic), 사람 표피성장인자수용체(human epidermal growth factor receptor 2; HER2), 표피성장인자수용체(epidermal growth factor receptor; EGFR) 등과 같이 성장인자수용체(growth factor receptor)를 표적으로 하는 항체, 보조제(adjuvants) 투여, 종양세포붕괴성 바이러스치료(oncolytic virotherapy) 등 다양한 항암제에 대한 항암 효과를 나타내는데도 필수적이다. 특히, 트라스투주맙(Trastuzumab)은 HER2를 표적으로 하는 항체 암치료제로, MUC4의 과발현에 의해 치료 저항성을 가지게 된다. 이러한 저항성 기전에 관련된 신호 물질 중 하나인 pSTAT3는 두 개의 동일한 물질이 중합된 형태 (pSTAT3 homodimer)를 가지며, pSTAT1에 의해 억제되는 것으로 알려져 있다. 따라서 pSTAT1을 활성화시키는 타입 Ⅰ 인터페론을 트라스투주맙과 결합하였을 때 증가된 항암 효능을 기대할 수 있다.
인터페론-베타(IFN-β)는 세포 성장을 억제하는 효과가 인터페론-알파(IFN-α)에 비해 더 강력하다. 특히, 항암제와 함께 사용할 경우에는 인터페론-베타의 항증식 활성 범위 및 시너지 효과가 매우 우수하다. 그러나, 인터페론을 이용한 치료제는 세포 독성이 커 치료 대상자로부터 열 (80%), 근육통 (73%), 두통 (50%), 피로 (50%), 권태감 (50%) 등의 증상이 나타나는 것으로 알려져 있다. 또한, 인터페론-베타는 소수성이 강한 단백질로, 잘 응집되는 경향이 있어 생물 활성 및 생산성이 저하된다. 또한, 반감기가 짧아서 자주 투여해야 한다는 단점이 있다. 따라서, 인터페론을 이용한 치료제를 개발하기 위해서는 인터페론에 의한 한계를 최소화 시켜야 할 필요가 있다.
이에 따라, 본 발명자들은 부위 특이적 변이를 통해 인터페론의 물리적 특성을 변화시킴으로써 생산성이 향상되고 응집 현상이 감소된 돌연변이 인터페론-베타를 개발하였다. 이러한 인터페론-베타 변이체는 항체 암치료제와 융합되어 우수한 항암 효과를 나타내는 새로운 항암 치료제로 활용될 수 있다.
본 발명의 일 양상은 17번째 아미노산 잔기가 세린으로 치환되고, 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 인터페론-베타(IFN-β) 변이체; 및 상기 인터페론-베타 변이체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 상기 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 상기 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 상기 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 항암용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명의 다른 양상은
(a) 인터페론-베타 변이체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질을 발현하도록 형질전환된 숙주세포를 배양하는 단계; 및
(b) 배양된 숙주세포 또는 이의 배양물에서 인터페론-베타에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질을 분리 정제하는 단계를 포함하는
인터페론-베타 변이체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질의 제조에 있어서, 상기 인터페론-베타 변이체의 17번째 아미노산인 시스테인을 다른 아미노산으로 변형시킨 재조합 단백질을 발현하도록 숙주세포를 형질전환시킨 것을 특징으로 하는
상기 재조합 단백질의 생산 또는 분리정제시 단백질 안정성을 높이는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명은 17번째 아미노산 잔기가 세린으로 치환되고, 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 인터페론-베타(IFN-β) 변이체; 및 상기 인터페론-베타 변이체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질을 제공한다.
인터페론-베타는 5개의 알파 헬릭스를 가지고 있는 구형 단백질로서 크기가 22kDa 이며, 항바이러스 활성, 세포 성장 억제 또는 항증식 활성, 림프구 세포 독성 증대 활성, 면역 조절 활성, 표적 세포의 분화 유도 또는 억제 활성, 대식세포의 활성화 활성, 사이토카인 생성의 증가 활성, 세포독성 T 세포의 효과 증가 활성, 자연 살해 세포(natural killing cell)의 증가 활성 등 다양한 면역학적 활성으로 암, 자가 면역 장애, 바이러스 감염, HIV와 관련된 질병, C형 간염, 류마티스성 관절염 등에 치료에 효과가 있다는 보고가 있다. 그러나, 인터페론-베타는 강한 소수성 단백질로 응집 현상을 나타나며, 생물 활성 및 생산성이 낮고 반감기가 짧아 인터페론-베타의 활용에 제한점이 있었다. 따라서, 본 발명에서는 인터페론-베타의 유전자에 대해 부위 특이적 변이(site-directed mutagenesis)를 유도함으로써 변이가 일어나지 않은 야생형 인터페론-베타에 비해 물리적 특성을 개선된 인터페론-베타 변이체를 개발하였다.
상기 인터페론-베타 변이체(interferon beta mutein)는 17번째 시스테인(cysteine; C)이 세린(serine; S)으로 치환되고, 27번째 아르기닌(arginine; R)이 트레오닌(threonine; T)으로 치환됨으로써, 80번째 및 25번째 아미노산 잔기에 글리코실기(glycosyl group)를 포함하는 것을 특징으로 한다. 이때, 인터페론-베타 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이를 암호화하는 서열번호 2의 염기 서열로 표시되는 것일 수 있다. 이러한 인터페론-베타 변이체는 야생형 인터페론-베타의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 것으로, 인터페론-베타의 활성을 갖는다.
상기 항체는 단클론성 항체, 다클론성 항체, 다중특이성 항체 (예를 들면, 이중특이성 항체) 및 이의 단편을 포함한다. 완전한 항체는 전체적으로 Y 모양을 하며, 2개의 긴 중쇄(heavy chain; H)과 2개의 짧은 경쇄(light chain; L)로 구성된다. 각 중쇄와 경쇄는 서로 황화결합으로 연결되며, 항원과 반응하는 부위인 가변영역(variable region; V)와 효과기능을 발현하는 부위인 불변영역(constant region; C)로 구분된다. 가변영역에는 항원과 특이적인 결합을 형성할 수 있도록 가변영역의 구조를 결정하며 항체결합세기를 조절하는 상보성 결정 부위(complementarity-determining region; CDR)가 존재한다. 상기 항체의 단편은 항원과 반응하여 항원-결합 활성을 나타낼 수 있는 특정 부위를 나타내며, 일례로 Fab 단편 (파파인 소화에 의한 단편), Fab' 단편 (펩신 소화 및 부분적 환원에 의한 단편), F(ab')2 단편 (펩신 소화에 의한 단편), Facb(플라스민 소화에 의한 단편), Fd (펩신 소화, 부분적 환원 및 재응집에 의한 단편), scFv 단편(분자생물학 기법에 의한 단편) 등일 수 있다. 바람직하게는, 항체는 종양 특이 항원을 인지하는 항체 또는 이의 단편인 것으로, 암 등의 표적치료제로 사용 가능할 수 있다. 일례로는, 사람 표피성장인자수용체(HER-2)를 표적으로 하는 항체 치료제인 트라스투주맙(Trastuzumab), 표피성장인자수용체(EGFR)를 표적으로 하는 항체 치료제인 세툭시맙(Cetuximab), 암세포의 표면에 발현되는 PD-L1을 표적으로 하는 항체 치료제인 아테졸리주맙(Atezolizumab) 등일 수 있다. 이때, 트라스투주맙은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄로 구성될 수 있고, 세툭시맙은 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄로 구성될 수 있고, 아테졸리주맙은 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 8으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄로 구성될 수 있다.
상기 재조합 단백질은 인터페론-베타 변이체와 항체 또는 이의 단편이 펩티드 링커에 의해 연결되어 형성된 융합체 또는 복합체일 수 있다. 상기 펩티드 링커는 아미노산 또는 아미노산과 유사한 물질이 서로 펩티드 결합에 의해 둘 이상이 연결된 짧은 단편의 아미노산 또는 아미노산 유사체로 둘 이상의 별개의 물질을 서로 연결시켜 주는 역할을 하는 분자를 말한다. 이때, 글리신, 세린, 알라닌 등이 주요 구성 아미노산으로 이용되어 글리신-세린 링커, 글리신-세린-알라닌 링커 등을 사용할 수 있다. 이러한 링커는 항체의 중쇄 C-말단 또는 항체의 경쇄 C-말단에 연결되거나, 또는 항체의 경쇄 C-말단과 중쇄 C-말단에 링커의 N-말단이 연결될 수도 있다. 이때, 링커의 C-말단에는 인터페론 베타 변이체의 N-말단이 연결될 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예에 따르면, 본 발명은 상기 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(polynucleotide)를 제공한다.
폴리뉴클레오티드는 염기, 당, 인산의 세 가지 요소로 구성된 화학적 단량체인 뉴클레오티드가 다수의 인산에스테르 결합을 매개로 사슬 형태로 이어진 고분자 화합물로, 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체이다.
상기 폴리뉴클레오티드는 RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 또는 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열 등일 수 있으며, 상기 재조합 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함한다. 바람직하게는, 인터페론-베타 변이체와 트라스투주맙의 중쇄가 연결된 재조합 단백질을 암호화하는 서열번호 9로 표시되는 염기 서열이거나, 인터페론-베타 변이체와 세툭시맙의 중쇄가 연결된 재조합 단백질을 암호화하는 서열번호 10으로 표시되는 염기 서열이거나, 인터페론-베타 변이체와 아테졸리주맙의 중쇄가 연결된 재조합 단백질을 암호화하는 서열번호 11로 표시되는 염기서열일 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예에 따르면, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터(expression vector)를 제공한다.
발현벡터는 숙주 세포에서 인터페론-베타 변이체 및 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절 서열을 포함하는 유전자 제작물을 의미한다. 상기 "작동 가능하게 연결된(operably linked)"이란, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 상기 "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란, 특정한 숙주세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 이러한 발현벡터는 당업계에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조될 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결하는데 당업계에서 통상적으로 사용되는 효소 등을 사용될 수 있다.
상기 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서(enhancer)와 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한, 발현벡터는 발현벡터를 포함하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선별 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우에는 복제 원점을 포함하여 자가 복제하거나, 또는 숙주 DNA에 통합될 수 있다. 상기 발현벡터는 당업계에서 통상적으로 외부 유전자 발현에 사용 가능한 벡터를 제한없이 사용할 수 있으며, 일례로 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터 등일 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예에 따르면, 본 발명은 상기 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
숙주세포는 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 또는 바람직한 특정 방식으로 유전자 생성물을 진행시키는 것을 선택할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질의 해독 및 해독 후 프로세싱과 변형에 대한 특징적이고 특이적인 작용기전을 갖고 있다. 적합한 세포주 또는 숙주 시스템으로는 발현된 이종 단백질의 바람직한 변형 및 프로세싱을 제공하는 것을 선택할 수 있다. 효모에서의 발현은 생물학적 활성 생성물을 생산할 수 있다. 진핵세포에서의 발현은 폴리펩티드 또는 단백질을 구성하는 펩티드 사슬의 접힘(folding) 가능성을 증가시킬 수 있다.
상기 숙주세포는 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 당업계에 공지된 숙주세포를 제한없이 사용할 수 있으며, 일례로 E. coli JM109, E. coli BL21DE, E. coli DH5, E. coli RR1, E.coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110 등과 같은 대장균, 아그로박테리움 A4 등과 같은 아그로박테리움 속 균주, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 등과 같은 바실리(bacilli), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르게센스(Serratia marcescens) 등과 같은 장내 세균, 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주 등일 수 있다. 또한, 진핵세포에 발현벡터를 형질도입(transfection)할 경우에는 숙주세포로서 효모(Saccharomyces cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예를 들면, CHO(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN, MDCK 세포주) 등이 이용될 수 있다.
발현벡터의 도입은 당업계에서 통상적으로 사용 가능한 형질전환(transformation) 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 "형질전환"이란, 외부 DNA를 숙주 세포 내로 도입함으로써 DNA가 숙주 세포 내 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제가 가능하도록 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상이다. 상기 형질전환 방법은 CaCl2 침전법, CaCl2 방법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예에 따르면, 본 발명은 상기 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 항암용 약학 조성물을 제공한다.
상기 재조합 단백질은 물리적 특성이 개선된 인터페론-베타 변이체와 항체 또는 이의 단편이 결합된 구조로, 정제 효율과 생물 활성이 우수하며, 다양한 암세포주에 대한 면역조절 효능, 항암 효능, ADCC 효능 등이 있는 것으로 확인되었다. 따라서, 이러한 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물은 암 세포의 증식, 활성을 억제하는 효과를 나타내어 항암용 약학 조성물로서 활용 가능하다.
상기 조성물의 제형화 방법은 약제학적으로 통상으로 사용되는 부형제, 보조제, 무통화제, 등장화제, 보존제, 및 기타 약제학적으로 통상으로 허용되는 보조제와 혼합하고, 약제학적으로 통상으로 허용되는 제제 형태로 제제화하여 약학적 제제를 제조할 수 있다. 상기 제제의 형태는 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형이거나, 또는 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태일 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있고, 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다.
상기 조성물을 투여하는 방법은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서는 1일 0.001 내지 1,000 mg/kg으로 투여될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여하거나, 또는 수회 나누어 투여할 수 있다. 투여 경로는 모든 방식으로 가능하며, 일례로 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
아울러, 본 발명에서는 인터페론 베타의 R27T 변이체의 생산 및 분리/정제에서 인터페론-베타의 C17, 즉 17번째 아미노산인 시스테인이 변이체의 안정성에 중요한 역할을 하는 것을 확인하였고, 그 결과 17번째 아미노산을 다른 아미노산으로 변형하는 경우 생산, 분리, 정제, 더 나아가서는 보관, 유통시의 안정성에 영향을 준다.
따라서, 본 발명은
(a) 인터페론-베타 변이체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질을 발현하도록 형질전환된 숙주세포를 배양하는 단계; 및
(b) 배양된 숙주세포 또는 이의 배양물에서 인터페론-베타에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질을 분리 정제하는 단계를 포함하는
인터페론-베타 변이체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질의 제조에 있어서, 상기 인터페론-베타 변이체의 17번째 아미노산인 시스테인을 다른 아미노산으로 변형시킨 재조합 단백질을 발현하도록 숙주세포를 형질전환시킨 것을 특징으로 하는
상기 재조합 단백질의 생산 또는 분리정제시 단백질 안정성을 높이는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에서 인터페론-베타 변이체는 인터페론-베타의 R27T 변이체이며, C17을 추가적으로 다른 아미노산으로 변형을 하기 때문에, C17N, R27T의 이중 돌연변이체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질을 발현하게 된다. 이 때, N은 시스테인을 제외한 임의의 아미노산을 나타낸다.
바람직하게는 변형되는 다른 아미노산은 세린일 수 있다.
또한, 돌연변이체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질을 발현하는 숙주세포는 단백질 발현에 사용되는 포유동물 세포일 수 있으며, 바람직하게는 CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주가 이용될 수 있으며, 가장 바람직하게는 본 발명에서 숙주세포는 CHO 세포주일 수 있다.
본 발명에 따른 인터페론-베타 변이체와 항체 또는 이의 단편이 결합된 재조합 단백질은 부위 특이적 변이를 통해 인터페론-베타의 물리적 특성이 개선되어 생물 활성 및 정제 효율이 향상되고 생산성이 높아질 수 있다. 이러한 재조합 단백질은 인터페론-베타의 기능 및 특정 항원에 결합하는 항체의 특성이 모두 발현하므로, 암 등의 표적치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 인터페론-베타 변이체와 종양 표적화 항체가 결합된 융합단백질의 구조를 보여주는 모식도이다.
도 2는 친화성 크로마토그래피 정제 과정에서 항체-인터페론-베타 변이체 융합단백질의 정제 효율을 비교한 결과이다. (A) Trastuzumab-IFNβ, Trastuzumab-IFNβ-R27T 및 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 정제 효율을 각 실험별로 나타낸 그래프이다. (B) Trastuzumab-IFNβ, Trastuzumab-IFNβ-R27T 및 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 정제 반복 실험의 평균 수율을 비교한 그래프이다. (C) Cetuximab-IFNβ-R27T 및 Cetuximab-IFNβ-C17S-R27T의 정제 효율을 비교한 결과이다. (D) Atezolizumab-IFNβ-R27T 및 Atezolizumab-IFNβ-C17S-R27T의 정제 효율을 비교한 결과이다.
도 3은 정제한 항체-인터페론-베타 변이체 융합단백질의 단백질 응집 정도를 크기 배제 크로마토그래피로 분석하여 비교한 결과이다. (A) Trastuzumab-IFNβ, Trastuzumab-IFNβ-R27T 및 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 단백질 응집을 비교한 결과이다. (B) Cetuximab-IFNβ-R27T 및 Cetuximab-IFNβ-C17S-R27T의 단백질 응집을 비교한 결과이다. (C) Atezolizumab-IFNβ-R27T 및 Atezolizumab-IFNβ-C17S-R27T의 단백질 응집을 비교한 결과이다.
도 4는 MCF-7, MDA-MB231, NCI-N87 세 종류의 세포주를 이용하여 Trastuzumab, Trastuzumab-IFNβ-R27T 및 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 HER2 결합능을 유세포분석기로 분석한 결과이다.
도 5는 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 인터페론 신호 활성 능력을 분석한 결과이다. NCI-N87 세포주에 IFNβ-C17S-R27T와 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T을 각각 처리한 후 한 시간이 지난 뒤에 pSTAT1 발현량을 확인함으로써 인터페론-베타 신호 활성 정도를 측정한 결과이다.
도 6은 HER2 양성 암세포주인 HCC1954와 MDA-MB453 세포주에서 Control IgG, IFN-β, Trastuzumab 및 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 항체 의존성 세포 독성 효과를 비교 분석한 결과이다.
도 7은 HER2 발현량이 높은 세포주인 NCI-N87, HER2 발현량이 중간 수준의 세포주인 SNU1 및 SNU620, HER2 발현량이 낮은 세포주인 Hs746T 및 MKN45에서 Trastuzumab, T-DM1, IFNβ-R27T, Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T 각 물질의 직접적인 항증식 활성을 비교한 결과이다.
도 8은 CPE assay를 통해 Trastuzumab-IFNβ, Trastuzumab-IFNβ-R27T 및 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 항바이러스 활성을 정량적으로 측정하고 비교한 결과이다.
도 9는 HER2 양성 위암 세포주인 NCI-N87 세포를 누드마우스에 이종이식하여 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 종양표적능력을 Trastuzumab-IFNβ-R27T과 비교하여 확인한 것이다.
도 10은 HER2-양성 유방암 세포주인 HCC1954 세포를 누드마우스에 이종이식하여 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T 의 항암활성을 Trastuzumab-IFNβ-R27T과 비교하여 확인한 것이다. Trastuzumab-IFNβ-R27T는 10 mg/kg (mpk) 단일 농도를 사용하였으며, Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T는 1, 3, 10 mg/kg 세 농도에서 효능을 평가하였다.
이하, 첨부된 도면을 참조하며 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.
1. 재료 및 방법
1-1. 융합 단백질의 제조 설계
인터페론-베타 변이체와 결합된 항체를 일시적 또는 안정적으로 발현하는 세포주를 확립하기 위해, 발현벡터로 pCHO 1.0 (Life Technologies)을 사용하였다. 항체로 트라스투주맙(Trastuzumab), 세툭시맙(Cetuximab), 아테졸리주맙(Atezolizumab)을 사용하였고, 인터페론-베타(IFN-β)로 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 변이체(IFNβ-R27T) 또는 R27T에 추가로 17번째 아미노산 잔기가 세린으로 치환된 변이체(IFNβ-C17S-R27T)를 사용하였다.
항체의 중쇄(heavy chain) 부위에 링커와 인터페론-베타 변이체 R27T 또는 C17S-R27T가 결합되도록 클로닝 하였다. 이후, 전체 유전자의 3’ 말단 및 5’ 말단에 각각 제한효소 AvrII(CCTAGG) 절단 부위와 Bstz17I(GTATAC) 절단 부위 (Thermo Scientific, USA)를 삽입하여 중쇄의 최종 유전자를 확보하였다. 또한 항체의 경쇄(light chain)의 3' 말단 및 5 '말단에 각각 제한효소 EcoRV(GATATC) 절단 부위와 PacI(TTAATTAA)를 삽입하여 경쇄의 최종 유전자를 확보하였다. 중쇄 및 경쇄의 최종 유전자를 pCHO 1.0 벡터에 삽입하였다.
1-2. 포유동물 세포에서 융합 단백질 구성물의 발현
트라스투주맙, 트라스투주맙-인터페론-베타-R27T(Trastuzumab-IFNβ-R27T) 및 트라스투주맙-인터페론-베타-C17S-R27T(Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T)의 발현벡터를 FreeStyleTM MAX reagent (Thermo Scientific)를 사용하여 CHO-S 세포 (Thermo Scientific) 내로 형질도입 하였다. 세툭시맙과 아테졸리주맙 항체도 동일한 방식으로 형질도입 하였다. FreeStyleTM MAX reagent-DNA 복합체에 OptiPROTM SFM(Thermo Scientific)를 첨가한 혼합물을 플라스크에 담긴 CHO-S에 넣고서 습기가 있는 8% CO2 대기압의 조건에서 배양하였다. 형질도입 48시간 후 안정적으로 융합 단백질을 발현하는 세포주를 선별하였다. 푸로마이신(puromycin) 10 ~ 50 ㎍/mL 및 MTX 100 ~ 1,000 nM에 의한 2차 선별을 통해 세포를 분류하였다. 선택된 세포는 37℃에서 습기가 있는 8% CO2 대기압, 130 rpm의 조건으로 5일 또는 7일 동안 융합 단백질을 발현시키기 위해 포도당과 배양되었다.
1-3. 융합 단백질의 정제
CHO-S 세포에서 발현한 융합 단백질을 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography) 방법으로 정제하였다. CHO-S 배양액을 단백질 A 맙셀렉트 슈어 (Protein A Mabselect sure, Cytiva)가 충진된 컬럼에 통과시킨 뒤 평형 버퍼(equilibration buffer), 세척 버퍼(wash buffer), 용출 버퍼(elution buffer)를 순차적으로 가하여 정제된 단백질을 얻었다.
1-4. 단백질 응집 분석
물리적 특성을 측정하기 위해 응집 분석(FPLC-SEC)을 수행하였다. 충진된 크기배제 크로마토그래피 (Size exclusion chromatography) 컬럼인 하이로드 (HiLoad 16/600 Superdex 200 pg) 를 AKTA purifier (Cytiva) 에 연결한다. 최대 압력을 0.3Mpa로 설정한 후 친화성 크로마토그래피 (affinity chromatography)의 방법으로 정제한 시료를 1mg/mL로 농도를 맞춰 Sample loop길이의 50% 만큼 주입하였다. UV (280nm) 피크를 확인하여 단백질의 응집률을 확인하였다.
1-5. 세포주 및 배양 조건
사람 유방암 (human breast cancer) 세포주 (MCF-7, MDA-MB-231, HCC-1954, MDA-MB-453), 사람 위암 (human gastric cancer) 세포주 (SNU1, SNU620, Hs746T, MKN45)는 한국세포주은행 (KCLB, Seoul, South Korea)에서 구매하였다. 사람 위암 세포주 NCI-N87은 미국세포주은행 (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구매하였다. U937 세포주(iLite type I IFN assay ready cell, ATCC#CRL1593.2)는 Euro Diagnostica AB (Malmo, Sweden)에서 구매하였다.
MCF-7, MDA-MB-231, HCC-1954, MDA-MB453, NCI-N87, SNU1, SNU620, Hs746T, MKN45 및 U937 세포주는 10% FBS (HyClone, USA), 페니실린 100 units/mL 및 스트렙토마이신 100 ㎍/mL을 함유하는 RPMI-1640 (HyClone, USA) 배지를, Hs746T 세포주는 10% FBS (HyClone, USA), 페니실린 100 units/mL 및 스트렙토마이신 100 ㎍/mL을 함유하는 DMEM (HyClone, USA) 배지를 이용하여 배양하였다. 모든 세포주는 37℃에서 습기가 있는 5% CO2 대기압의 조건에서 배양하였다.
1-6. 유세포분석기를 통한 HER2 인지능 분석
MCF-7, MDA-MB-231, NCI-N87 세포주를 각각 EP tube에 모은 후 blocking buffer로 1시간동안 4℃에서 반응시키고, PBS로 2회 washing 하였다. 이후 Trastuzumab, Trastuzumab-IFNβ-R27T 및 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T를 1 ㎍ 을 반응시키고 PBS로 3회 washing 하였다. 이후 FITC가 결합된 anti-human IgG 2차 항체를 반응시키고 3회 washing 하였다. 항체와 반응한 세포를 CytoFlex (Beckman coulter, USA) 유세포분석기로 분석하였다.
1-7. Western blot을 통한 STAT1 단백질 인산화 분석
NCI-N87 세포에 IFN-β (5 ~ 200 pg/mL), IFNβ-C17S-R27T (5 ~ 200 pg/mL) 또는 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T (20 ~ 2,000 pg/mL)를 처리한 후 프로테아제 억제제(protease inhibitor) 혼합물 (Roche) 및 포스파타아제 억제제(phosphatase inhibitor) 혼합물 (Roche)을 추가한 RIPA 용해 버퍼 (150 mM NaCl, 1% 트립톤 X-100, 1% 소듐 디옥시콜레이트, 0.1% SDS, 50 mM Tris-HCl [pH 7.5], 2 mM EDTA 함유)를 이용하여 세포를 용해하였다. 용해된 세포를 4℃에서 20분 동안 배양하고 14,000 g에서 10분 동안 원심분리하였다. 상층액을 회수하여 제조사의 사용설명에 따라 BCA protein assay kit (Thermo Scientific)를 이용하여 단백질 농도를 측정하였다. 단백질 20 ㎍을 10% SDS-PAGE으로 분리하여 PVDF 막(polyvinyl difluoride membrane) (BioRad)에 옮겼다. PVDF 막을 TBS-Tween20 버퍼 (5% BSA 함유)로 차단하고 1차 항체와 4℃에서 밤새 배양하였다. 이후, 2차 항체와 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 여기서 사용된 1차 항체는 anti-pSTAT1, anti-STAT1 (Cell Signaling Technology) 또는 anti-β-actin (Santa Cruz Biotechnology)이고, 2차 항체는 anti-mouse IgG-HRP (ThermoFisher Scientific) 또는 anti-rabbit IgG-HRP (ThermoFisher Scientific) 이다. 단백질에 결합된 HRP를 Clarity Western ECL substrate (Bio-Rad)로 시각화하였다.
1-8. 항체 의존적 세포독성 활성 측정
표적세포 (target cell)인 HCC1954 또는 MDA-MB453 세포에 Control IgG (0.0001 ~ 100 nM), Trastuzumab (0.0001 ~ 100 nM), IFN-β (0.000001 ~ 1 nM), 또는 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T (0.0001 ~ 100 nM)를 처리하고 작동세포 (effector cell)와 공배양 하여 항체 의존성 세포독성 활성을 측정하였다. 작동세포는 항체 의존적인 세포독성을 유발하기위해 CD16a를 인위적으로 과발현한 자연살해세포 (NK cell) 세포주 NK-92MI-CD16a를 이용하였으며, 작동세포 대 표적세포의 비율 (E:T ratio)이 8:1이 되도록 하여 약물과 함께 4시간 반응 하였다. 표적세포의 세포독성은 제조사의 사용설명에 따라 젖산 탈수소 효소 (lactate dehydrogenase, LDH)의 방출을 측정하는 비방사성 세포독성 분석법 (Promega, USA)을 이용하여 측정하였다.
1-9. 항증식 활성 측정
Water-Soluble Tetrazolium (WST) colorimetric assay (Ez-Cytox; Daeil Lab Service)을 이용하여 항증식 활성을 측정하였다. NCI-N87, SNU1, SNU620, Hs746T 및 MKN45 세포를 96 well plate에 분주하고 Trastuzumab, T-DM1, IFNβ-R27T, 또는 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T 각각 농도별 (0.0001 ~ 100 nM)로 72시간 동안 처리하였다. 이후, 각 웰에 WST 10 ㎕를 첨가하여 4시간 동안 배양하고, 흡광도 측정기 (microplate reader, TECAN)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
1-10. 항바이러스 활성 측정
세포 변성 효과 분석 (cytopathic effect assay, CPE assay)을 이용하여 Trastuzumab-IFNβ, Trastuzumab-IFNβ-R27T 및 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 항바이러스 활성을 측정하였다. 세포 변성 효과를 측정하기 위해 A549 세포를 96웰 플레이트에 분주하고 각 약물을 농도별로 (0.78125 ~ 100 IU/mL) 처리하였다. 약물 처리 22시간 후 1000 TCID50/mL의 EMCV를 넣어주었다. 22시간 공배양한 다음 WST colorimetric assay를 이용하여 얻은 흡광도 값으로부터 세포 변성 효과를 측정하였다.
1-11. 약물의 종양 이행 실험
6 주령의 암컷의 누드 마우스의 피하를 통해 HER2-양성 위암 세포주인 NCI-N87을 주사하여 이종이식 하였다. 약물을 추적하기 위해 IgG-IFNβ-R27T, Trastuzumab-IFNβ-R27T, IgG-IFNβ-C17S-R27T, 또는 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T 약물에 형광표지인자 (CF750)을 결합하였다. 형성된 종양크기가 약 100 mm3이 되었을 때, 무작위로 3마리씩 할당하여 IgG-IFNβ-R27T, Trastuzumab-IFNβ-R27T, IgG-IFNβ-C17S-R27T, 또는 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T 을 100 ㎍/mice 투여하였다. 약물 투여 24시간 후 마우스를 마취한 후 소동물 광학 생체 영상분석기 (Ami HTX, Spectral Instruments Imaging)장비를 이용하여 약물의 생체 분포를 관찰하였다. 또한 생체 외 (Ex vivo) 분석을 위해 암이 이종이식된 마우스의 암, 간, 신장, 비장, 폐, 장을 분리하여 조직 간 약물 분포를 관찰하였다. 실험결과는 student T-test 분석을 하여 통계처리하였다.
1-12. 이종이식(xenograft) 동물실험
5 주령의 암컷의 누드 마우스의 피하를 통해 HER2-양성 유방암 세포주인 HCC1954를 주사하였다. 형성된 종양크기가 약 100 mm3이 되었을 때, 무작위로 5마리씩 할당하여 비히클과, Trastuzumab-IFNβ-R27T 또는 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T을 각 투여용량에 따라 1주일에 3회씩 3주간 투여하였다 (day 0). 종양은 캘리퍼스를 이용하여 일주일에 두 번 측정하여, (길이 X 넓이2)/2= 체적 (mm3)으로 계산하였다. 실험결과는 Two-way ANOVA 분석을 하여 통계처리하였다.
2. 결과
2-1. 융합 단백질의 정제 효율 비교
Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T, Trastuzumab-IFNβ-R27T 및 Trastuzumab-IFNβ를 발현하는 세포주를 이용하여 동일한 조건에서 발현 및 정제하였다. 형질도입한CHO-S 세포주를 37℃, 8% CO2에서 5일 동안 배양하였다. Cedex-bio (Roche)를 이용하여 세포 배양액 내 융합 단백질의 발현 농도를 측정한 뒤 AKTA instrument 시스템 및 protein A bead를 이용하여 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography) 방법으로 정제하였다.
그 결과, 도 2에서 보듯이 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 정제 효율은 약 92%로, 52%인 Trastuzumab-IFNβ 또는 54%인 Trastuzumab-IFNβ-R27T와 비교하여 크게 향상된 것을 확인할 수 있었다. 세툭시맙 항체와 아테졸리주맙 항체를 적용했을 때에도 IFNβ-C17S-R27T가 결합된 융합단백질의 정제 효율이 더 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.
2-2. 융합단백질의 단백질 응집 비율 비교
단백질 응집 문제는 물질의 활성과도 깊은 연관이 있으며, 환자에게서 면역원성을 유발할 수 있으므로 치료제 개발에서 중요하게 고려해야할 부분이다. 단백질 응집을 분석하기 위해 정제한 융합단백질을 FPLC-SEC 방법으로 비교 분석하였다.
그 결과, 도 3에서 보듯이 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 단백질 응집 비율은 약 8%로, 40%인 Trastuzumab-IFNβ-R27T 또는 85%인 Trastuzumab-IFNβ에 비해 크게 감소한 것을 확인할 수 있었다. 세툭시맙 항체와 아테졸리주맙 항체를 적용했을 때에도 IFNβ-C17S-R27T가 결합된 경우 단백질 응집 비율이 크게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
2-3. Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 세포 표면 HER2 항원 인지능 비교
Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 HER2항원 인지능을 Trastuzumab-IFNβ-R27T 및 Trastuzumab과 비교하였다. 각 물질을 HER2발현이 높은 NCI-N87 세포 또는 발현이 낮은 MCF-7, MDA-MB-231세포와 반응시킨 후 유세포분석기를 사용하여 형광 강도 피크의 이동에 의한 세포 표면의 HER2 항원 인지능을 분석하였다.
그 결과, 도 4에서 보듯이 아무 처리를 하지 않은 미처리군은 대조군으로 피크가 이동하지 않은 반면, Trastuzumab, Trastuzumab-IFNβ-R27T, 및 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T을 처리한 군은 HER2 발현 정도에 따라 형광 강도의 피크가 이동하였다. HER2 발현이 낮은 MCF-7 및 MDA-MB-231 세포주에서는 세가지 물질 모두 형광 강도가 약하게 증가하였으나, HER2 발현이 높은 NCI-N87 세포주에서는 형광 강도가 크게 증가하였다. 특히, 세가지 물질의 형광 피크가 차이가 없다는 점으로부터 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 HER2 항원 인지능은 Trastuzumab과 차이가 없음을 확인할 수 있었다.
2-4. Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 IFN 생물 활성
인터페론 활성은 타입 I IFN 수용체와 결합하여 하위 신호전달자인 STAT의 인산화 과정을 통해 일어난다. Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T에 의한 인터페론 활성을 확인하기 위해, NCI-N87 세포에 IFNβ-C17S-R27T 및 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T 를 각각 농도별(0.004 ~ 40 pM)로 1시간 처리한 후 Western Blot을 통해 STAT1 인산화와 STAT1및 β-actin의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 5에서 보듯이 STAT1 인산화의 신호는 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 처리 농도에 따라 향상되고, Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 활성 수준은 IFNβ-C17S-R27T와 유사한 것으로 나타났다.
2-5. Trastuzumab- IFNβ-C17S-R27T의 항체 의존적 세포독성
항체 의존적 세포독성은 Trastuzumab의 주요 항암 기전 중 하나이다. 항체가 표적세포에 결합하면 Trastuzumab의 Fc도메인과 결합할 수 있는 Fc 감마 수용체를 가지고 있는 NK세포의 활성화에 의해 암세포 사멸이 일어난다.
Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T은 Trastuzumab 포함하고 있기 때문에 Trastuzumab과 마찬가지로 항체 의존적 세포독성을 포함할 수 있다. 표적세포인 HER2 양성 암세포 (HCC1954, MDA-MB453)에 Control IgG, Trastuzumab, IFN-β, 및 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T를 각각 농도별로 처리하고, 작동세포인 NK세포 (NK-92MI-CD16a)와 8:1의 작동세포 대 표적세포 비율로 공배양한 후 항체 의존적 세포독성을 확인하였다.
그 결과, 도 6에서 보듯이 Contol IgG와 IFN-β 는 항체 의존적 세포독성을 거의 유발하지 않았으나, HER2를 표적하는 Trastuzumab과 이를 포함하는 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T은 동일한 수준의 항체 의존적 세포독성을 유발하였다.
Trastuzumab에 의해 유도되는 항체 의존적 세포독성 효과가 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T에서도 온전히 유지된다는 것을 확인할 수 있었다.
2-6. 암세포의 HER2 발현 정도와 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 암세포 증식 억제 효과
IFN-β는 수용체 결합을 통해 직접적으로 암세포의 증식을 억제하는 효과를 갖고 있다. Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 항증식능을 다양한 HER2 발현 수준을 갖는 위암세포주에서 평가하였다.
그 결과, 도 7에서 보듯이 Trastuzumab과 Trastuzumab을 기반으로 하는 항체-약물 접합체인 T-DM1은 오직 HER2 발현이 높은 NCI-N87 세포에서만 유의미한 항증식능을 보였다. 반면 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T은 HER2발현이 높은 세포주 뿐만 아니라, 발현이 중간 (SNU1, SNU620) 및 낮은 (Hs746T, MKN45) 위암 세포주에서도 유의미한 항증식능이 관찰되었다.
2-7. Trastuzumab- IFNβ-C17S-R27T의 항바이러스 활성
IFN이 포함된 물질의 활성을 평가할 때 가장 보편적인 분석 방법은 특정 바이러스에 의한 세포 변성 효과 (cytopathic effect, CPE)로부터 세포를 보호하는 항바이러스 활성을 측정하는 것이다. 따라서 CPE assay를 이용하여 Trastuzumab-IFNβ, Trastuzumab-IFNβ-R27T 및 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 IFN 활성을 정량적으로 측정하고 비교하였다.
그 결과, 도 8에서 보듯이 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T에 의한 항바이러스 활성 효과는 Trastuzumab-IFNβ-R27T 대비 약 3배 높은 효과를 나타냈으며, Trastuzumab-IFNβ는 실험한 농도 범위에서는 항바이러스 활성이 거의 나타나지 않았다.
2-8. Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 종양 표적능
동물 모델에서 각 융합단백질이 종양 특이적으로 이동하는 정도를 비교 분석 하였다.
그 결과, 도 9에서 보듯이 IgG 융합 단백질 대비 Trastuzumab 융합 단백질 군에서 유의미한 종양 표적 효과가 관찰되었다. 특히, Trastuzumab-IFNβ-R27T가 IgG-IFNβ-R27T 대비 2배 높은 종양 표적능 효과를 보인 반면, Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T는 IgG-IFNβ-C17S-R27T 대비 4배 이상 높은 종양 표적능 효과를 나타내었다. 또한 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 다른 장기 대비 종양으로 이행하는 비율은 Trastuzumab-IFNβ-R27T 보다 높음을 확인하였다.
2-9. Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T의 in vivo 항암 효능
융합단백질의 항암 효능을 확인하기 위해 종양 이종이식 모델 (Tumor xenograft model)을 구축한 이후 각 물질을 투여하고, 종양의 크기를 측정하였다.
그 결과, 도 10에서 보듯이 Trastuzumab-IFNβ-R27T 10 mpk 또는 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T 를 1, 3, 10 mpk 농도 별로 처리한 모든 군에서 vehicle 대비 유의미한 종양 억제 효과가 관찰되었다. Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T은 농도 의존적으로 종양의 부피가 감소하였으며, 10 mpk에서 일부 마우스에서 완전 관해 (1/5)가 관찰되었다. 또한 Trastuzumab-IFNβ-C17S-R27T 은 동일 농도 (10 mpk)에서 Trastuzumab-IFNβ-R27T 대비 종양 억제 효과가 더 우수함을 확인하였다.
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gctgcagaac atcttcgcca tcttccggca ggactcctcc 1620 tccaccggct ggaacgagac aatcgtggaa aatctgctgg ccaacgtgta ccaccagatc 1680 aaccacctga aaaccgtgct ggaagagaag ctggaaaaag aggacttcac ccggggcaag 1740 ctgatgtcct ccctgcacct gaagcggtac tacggccgga tcctgcacta cctgaaggcc 1800 aaagaatact cccactgcgc ctggaccatc gtgcgggtgg aaatcctgcg gaacttctac 1860 tttatcaacc ggctgaccgg ctacctgagg aactga 1896 <210> 10 <211> 1893 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence of Cetuximab-interferon beta mutein heavy chain <400> 10 caggtgcagc tgaagcagtc tggccctgga ctggtgcagc cttcccagtc cctgtccatc 60 acctgtaccg tgtccggctt ctccctgacc aactacggcg tgcactgggt gcgacagtct 120 ccaggcaagg gcctggaatg gctgggagtg atttggagcg gcggcaacac cgactacaac 180 acccctttca cctcccggct gagcatcaac aaggacaact ccaagtccca ggtgttcttc 240 aagatgaact ccctgcagtc caacgacacc gccatctact actgcgccag agccctgacc 300 tactatgact acgagttcgc ctactggggc cagggcaccc tcgtgacagt gtctgccgct 360 tctaccaagg gcccctccgt gtttcctctg gccccttcca gcaagtccac ctctggcgga 420 acagccgctc tgggctgcct cgtgaaggac tacttccccg agcccgtgac cgtgtcctgg 480 aattctggcg ctctgaccag cggagtgcac accttccctg ctgtgctgca gtcctccggc 540 ctgtactccc tgtcctccgt cgtgactgtg ccctccagct ctctgggcac ccagacctac 600 atctgcaacg tgaaccacaa gccctccaac accaaggtgg acaagaaggt ggaacccaag 660 tcctgcgaca agacccacac ctgtccccct tgtcctgccc ctgaactgct gggcggacct 720 tccgtgttcc tgttcccccc aaagcccaag gacaccctga tgatctcccg gacccccgaa 780 gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtcccac gaggaccctg aagtgaagtt caattggtac 840 gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccta gagaggaaca gtacaactcc 900 acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcatcagg actggctgaa cggcaaagag 960 tacaagtgca aggtgtccaa caaggccctg cctgccccca tcgaaaagac catctccaag 1020 gccaagggac agccccgcga gccccaggtg tacacactgc ctccatctcg ggacgagctg 1080 accaagaacc aggtgtccct gacctgtctc gtgaaaggct tctacccctc cgacattgcc 1140 gtggaatggg agtccaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg 1200 gactccgacg gctcattctt cctgtacagc aagctgacag tggacaagtc ccggtggcag 1260 cagggcaacg tgttctcctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 1320 aagtccctga gcctgagccc tggaaaaggc ggcggaggat ctggcggagg cggttctggt 1380 ggcggctctg gcatgtccta caacctgctg ggcttcctgc agcggtcctc caacttccag 1440 agccagaaac tgctgtggca gctgaatggc accctggaat actgcctgaa ggaccggatg 1500 aacttcgaca tccccgagga aatcaagcag ctgcagcagt tccagaaaga ggacgccgcc 1560 ctgacaatct acgagatgct gcagaacatc ttcgccatct tccggcagga ctcctcctcc 1620 accggctgga acgagacaat cgtggaaaat ctgctggcca acgtgtacca ccagatcaac 1680 cacctgaaaa ccgtgctgga agagaagctg gaaaaagagg acttcacccg gggcaagctg 1740 atgtcctccc tgcacctgaa gcggtactac ggccggatcc tgcactacct gaaggccaaa 1800 gaatactccc actgcgcctg gaccatcgtg cgggtggaaa tcctgcggaa cttctacttt 1860 atcaaccggc tgaccggcta cctgaggaac tga 1893 <210> 11 <211> 1890 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence of Atezolizumab-interferon beta mutein heavy chain <400> 11 gaggtgcagc tggttgaatc tggcggagga ttggttcagc ctggcggctc tctgagactg 60 tcttgtgccg cttccggctt taccttctcc gactcctgga tccactgggt ccgacaggca 120 cctggcaaag gactggaatg ggtcgcctgg atctctcctt acggcggctc tacctactac 180 gccgactctg tgaagggcag attcaccatc tccgccgaca cctccaagaa caccgcctac 240 ctgcagatga actccctgag agccgaggac accgccgtgt actactgtgc tagaaggcat 300 tggccaggcg gcttcgatta ttggggccag ggaacactgg tcaccgtgtc ctctgcttcc 360 accaagggac cctctgtgtt ccctctggct ccttccagca agtctacctc tggcggaaca 420 gctgctctgg gctgcctggt caaggactac tttcctgagc ctgtgaccgt gtcttggaac 480 tctggcgctc tgacatccgg cgtgcacacc tttccagctg tgctgcaatc cagcggcctg 540 tactctctgt cctccgtcgt gaccgtgcct tcttctagcc tgggcaccca gacctacatc 600 tgcaatgtga accacaagcc ttccaacacc aaggtggaca agaaggtgga acccaagtcc 660 tgcgacaaga cccacacctg tcctccatgt cctgctccag aactgctcgg cggaccttcc 720 gtgttcctgt ttcctccaaa gcctaaggac accctgatga tctctcggac ccctgaagtg 780 acctgcgtgg tggtggatgt gtctcacgag gatcccgaag tgaagttcaa ttggtacgtg 840 gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc aagcctagag aggaacagta cgcctccacc 900 tacagagtgg tgtccgtgct gacagtgctg caccaggatt ggctgaacgg caaagagtac 960 aagtgcaagg tgtccaacaa ggccctgcct gctcctatcg aaaagaccat ctccaaggcc 1020 aagggccagc ctcgagaacc ccaggtttac accctgcctc caagccggga agagatgacc 1080 aagaaccagg tgtccctgac ctgcctcgtg aagggcttct acccttccga cattgccgtg 1140 gaatgggaga gcaatggcca gccagagaac aactacaaga caacccctcc tgtgctggac 1200 tccgacggct cattcttcct gtactccaag ctgaccgtgg acaagtccag atggcagcag 1260 ggcaacgtgt tctcctgctc cgtgatgcac gaggccctgc acaatcacta cacccagaag 1320 tccctgtctc tgagcccagg caaaggcgga ggtggtagcg gcggaggcgg aagtggcggt 1380 ggatctggca tgtcttacaa cctgctgggc ttcctgcagc ggtcctccaa cttccagagc 1440 cagaaactgc tgtggcagct gaatggcacc ctggaatact gcctgaagga ccggatgaac 1500 ttcgacatcc ccgaggaaat caagcagctg cagcagttcc agaaagagga cgccgctctg 1560 accatctacg agatgctgca gaacatcttc gccatcttcc ggcaggactc ctcctctacc 1620 ggctggaacg agacaatcgt ggaaaatctg ctggccaacg tgtaccacca gatcaaccac 1680 ctgaaaaccg tgctggaaga gaagctggaa aaagaggact tcacccgggg caagctgatg 1740 tcctctctgc acctgaagcg gtactacggc cggatcctgc actacctgaa ggccaaagaa 1800 tactcccact gcgcctggac catcgtgcgc gtggaaatcc tgcggaactt ctacttcatc 1860 aaccggctga ccggctacct gagaaactga 1890

Claims (14)

17번째 아미노산 잔기가 세린으로 치환되고, 27번째 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환된 인터페론-베타 변이체; 및 상기 인터페론-베타 변이체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 인터페론-베타 변이체는 80번째 및 25번째 아미노산 잔기에 글리코실기를 포함하는 것인 재조합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 인터페론-베타 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것인 재조합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 트라스투주맙(Trastuzumab), 세툭시맙(Cetuximab) 및 아테졸리주맙(Atezolizumab)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 재조합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 인터페론-베타 변이체와 항체 또는 이의 단편이 펩티드 링커에 의해 연결된 것인 재조합 단백질.
제1항의 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
제6항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9, 10 또는 11의 염기 서열로 표시되는 것인 폴리뉴클레오티드.
제6항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
제8항의 발현벡터로 형질전환된 숙주세포.
제1항의 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 항암용 약학 조성물.
(a) 인터페론-베타의 R27T 변이체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질을 발현하도록 형질전환된 숙주세포를 배양하는 단계; 및
(b) 배양된 숙주세포 또는 이의 배양물에서 인터페론-베타에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질을 분리 정제하는 단계를 포함하는
인터페론-베타의 R27T 변이체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 단백질의 제조에 있어서, 상기 인터페론-베타의 R27T 변이체의 17번째 아미노산인 시스테인을 세린으로 변형시킨 재조합 단백질을 발현하도록 숙주세포를 형질전환시킨 것을 특징으로 하는
상기 재조합 단백질의 생산 또는 분리정제시 단백질 안정성을 높이는 방법.
삭제
삭제
제11항에 있어서, 상기 숙주세포는 포유동물 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
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