JP2023537292A - SIRPα-Fc融合タンパク質 - Google Patents
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Abstract
本発明は、融合タンパク質技術分野に関し、具体的には、SIRPα-Fc融合タンパク質に関する。上記融合タンパク質は、SIRPα D1ドメイン変異体と、免疫グロブリンFc領域とを含む。本発明の融合タンパク質は、SIRPα-CD47シグナル経路関連疾患を治療する潜在力を有する。
Description
発明は、融合タンパク質に関し、具体的には、SIRPα-Fc融合タンパク質に関する。
貪食作用は、複数段階の一つの細胞過程であり、標的細胞認識、細胞貪食及びリソソーム消化を含み、標的細胞と貪食細胞(このような細胞は、腫瘍細胞の免疫モニタリングにおいて重要な役割を果たしている)の間の受容体-リガンド(即ちチェックポイント)相互
作用によって調節される。健康な正常組織や細胞にとっては、これらは、天然に抗貪食分子を発現する能力を持ち、それによって貪食細胞による除去を回避している。しかしながら、癌細胞も類似した機序を習得しており、そして正常細胞よりもこのような機序に依存している。しかしながら、癌細胞が免疫攻撃を避けるという経路についての認知に基づき、貪食作用を標的、調節するチェックポイント(貪食作用チェックポイントと略称し、例えばCD47-SIRPα)が癌免疫療法を開発する新しいアプローチが提供する可能性があると
科学者らは考えている。
作用によって調節される。健康な正常組織や細胞にとっては、これらは、天然に抗貪食分子を発現する能力を持ち、それによって貪食細胞による除去を回避している。しかしながら、癌細胞も類似した機序を習得しており、そして正常細胞よりもこのような機序に依存している。しかしながら、癌細胞が免疫攻撃を避けるという経路についての認知に基づき、貪食作用を標的、調節するチェックポイント(貪食作用チェックポイントと略称し、例えばCD47-SIRPα)が癌免疫療法を開発する新しいアプローチが提供する可能性があると
科学者らは考えている。
CD47を標的とするモノクローナル抗体は、マクロファージの貪食作用を増強することにより腫瘍細胞を除去することができ、関連モノクローナル抗体薬剤は、臨床開発段階にある。しかし、臨床結果も同様に、CD47モノクローナル抗体薬剤には、いくつかの顕著な毒性副作用が存在することを表明し、例えば、CD47モノクローナル抗体の使用は、患者の貧血を招くおそれがあり、ヒトの赤血球もCD47を高発現するからである。2019年4月に、可
溶性SIRPα-Fc融合タンパク質TTI-621を用いてCD47-SIRPα軸を遮断する療法は、Sezary
症候群(皮膚T細胞リンパ腫の変異体)患者において有望な早期臨床結果を示したが(参
考文献:Johnson L D, Banerjee S, Kruglov O, et al. Targeting CD47 in Sezary syn
drome with SIRPαFc[J]. Blood Advances, 2019, 3(7): 1145-1153.)、現在のSIRPα-Fc融合タンパク質は、まだ標的結合活性などの方面の局限性が存在する。
溶性SIRPα-Fc融合タンパク質TTI-621を用いてCD47-SIRPα軸を遮断する療法は、Sezary
症候群(皮膚T細胞リンパ腫の変異体)患者において有望な早期臨床結果を示したが(参
考文献:Johnson L D, Banerjee S, Kruglov O, et al. Targeting CD47 in Sezary syn
drome with SIRPαFc[J]. Blood Advances, 2019, 3(7): 1145-1153.)、現在のSIRPα-Fc融合タンパク質は、まだ標的結合活性などの方面の局限性が存在する。
そのため、本分野では、高親和性と低毒性副作用を有するSIRPα-Fc融合タンパク質の
開発が早急に求められている。
開発が早急に求められている。
本発明は、SIRPα D1ドメイン変異体と、免疫グロブリンFc領域とを含む高親和力SIRP
α-Fc融合タンパク質を提供することを目的とする。当該融合タンパク質は、リガンドCD47と高親和力で結合できる一方で、FcとFc受容体との結合活性を保留する。本発明は、上
記融合タンパク質をコードする核酸分子を提供することと、上記核酸分子を含む発現ベクターを提供することと、上記発現ベクターを含む宿主細胞を提供することと、上記融合タンパク質の調製方法を提供することと、上記融合タンパク質を含む薬物組成物を提供することと、腫瘍を治療するための薬剤の調製における上記融合タンパク質又は上記薬物組成物の使用を提供することとを更に目的とする。
α-Fc融合タンパク質を提供することを目的とする。当該融合タンパク質は、リガンドCD47と高親和力で結合できる一方で、FcとFc受容体との結合活性を保留する。本発明は、上
記融合タンパク質をコードする核酸分子を提供することと、上記核酸分子を含む発現ベクターを提供することと、上記発現ベクターを含む宿主細胞を提供することと、上記融合タンパク質の調製方法を提供することと、上記融合タンパク質を含む薬物組成物を提供することと、腫瘍を治療するための薬剤の調製における上記融合タンパク質又は上記薬物組成物の使用を提供することとを更に目的とする。
上記の目的を実現するために、本発明は、以下の技術的解決手段を提供する。
本発明の第一の様態によれば、SIRPα-Fc融合タンパク質を提供する。上記融合タンパ
ク質は、SIRPα D1ドメイン変異体と、免疫グロブリンFc領域とを含み、上記SIRPα D1ドメイン変異体は、SEQ ID NO:1に対して、H24N、V27L、I31L、E47Q、E70S、I81V、A84E、R114L、E2T及びE1欠失、L4V及びQ5K、A21T及びI22V、E65D及びS66A、F103I及びK104Qから
選ばれる少なくとも一組の突然変異を含む。
ク質は、SIRPα D1ドメイン変異体と、免疫グロブリンFc領域とを含み、上記SIRPα D1ドメイン変異体は、SEQ ID NO:1に対して、H24N、V27L、I31L、E47Q、E70S、I81V、A84E、R114L、E2T及びE1欠失、L4V及びQ5K、A21T及びI22V、E65D及びS66A、F103I及びK104Qから
選ばれる少なくとも一組の突然変異を含む。
好ましい一実施形態において、上記SIRPα D1ドメイン変異体は、SEQ ID NO:1に対して、I31Lと、H24N、V27L、E47Q、E70S、I81V、A84E、R114L、E2T及びE1欠失、L4V及びQ5K、A21T及びI22V、E65D及びS66A、F103I及びK104Qから付加的選ばれる少なくとも一組の突然変異とを含む。
好ましい一実施形態において、上記SIRPα D1ドメイン変異体は、SEQ ID NO:1に対して、少なくとも二組の突然変異を含む。
好ましい一実施形態において、上記SIRPα D1ドメイン変異体は、SEQ ID NO:1に対して、V27L、I31L二組の突然変異を含む。
好ましい一実施形態において、上記SIRPα D1ドメイン変異体は、SEQ ID NO:1に対して、少なくとも三組の突然変異を含む。
好ましい一実施形態において、上記SIRPα D1ドメイン変異体は、SEQ ID NO:1に対して、V27L、I31L、L4V及びQ5K三組の突然変異を含む。
好ましい一実施形態において、上記SIRPα D1ドメイン変異体は、SEQ ID NO:1に対して、少なくとも四組の突然変異を含む。
好ましい一実施形態において、上記SIRPα D1ドメイン変異体は、SEQ ID NO:1に対して、V27L、I31L、L4V及びQ5K、E2T及びE1欠失四組の突然変異を含む。
好ましい一実施形態において、上記SIRPα D1ドメイン変異体は、SEQ ID NO:1に対して、少なくとも五組の突然変異を含む。
好ましい一実施形態において、上記SIRPα D1ドメイン変異体は、SEQ ID NO:1に対して、V27L、I31L、L4V及びQ5K、E2T及びE1欠失、E65D及びS66A五組の突然変異を含むか、
又は、上記SIRPα D1ドメイン変異体は、SEQ ID NO:1に対して、V27L、I31L、E65D及びS66A、E47Q、E70S五組の突然変異を含む。
又は、上記SIRPα D1ドメイン変異体は、SEQ ID NO:1に対して、V27L、I31L、E65D及びS66A、E47Q、E70S五組の突然変異を含む。
好ましい一実施形態において、上記SIRPα D1ドメイン変異体は、SEQ ID NO:1に対して、少なくとも六組の突然変異を含む。
好ましい一実施形態において、上記SIRPα D1ドメイン変異体は、SEQ ID NO:1に対して、V27L、I31L、L4V及びQ5K、E2T及びE1欠失、E65D及びS66A、E47Q六組の突然変異を含む
。
。
好ましい一実施形態において、上記SIRPα D1ドメイン変異体は、SEQ ID NO:1に対して、少なくとも七組の突然変異を含む。
好ましい一実施形態において、上記SIRPα D1ドメイン変異体は、SEQ ID NO:1に対して、V27L、I31L、L4V及びQ5K、E2T及びE1欠失、E65D及びS66A、E47Q、E70S七組の突然変異
を含む。
を含む。
別の好ましい一例において、上記SIRPα D1ドメイン変異体は、SEQ ID NO:1に対して、V6、K53、H56、A66位置から選ばれる少なくとも一組の突然変異を更に含み、好ましくは
、V6とH56位置の二組の突然変異を更に含むか、又は、V6、H56、A66位置の三組の突然変
異を更に含むか、又は、V6、H56、A66、K53位置の四組の突然変異を更に含む。
、V6とH56位置の二組の突然変異を更に含むか、又は、V6、H56、A66位置の三組の突然変
異を更に含むか、又は、V6、H56、A66、K53位置の四組の突然変異を更に含む。
別の好ましい一例において、上記突然変異は、V6L、K53R、H56N、H56R、H56Q、A66L、A66T又はA66Gである。
別の好ましい一例において、上記SIRPα D1ドメイン変異体は、SEQ ID NO:1に対して、V6L、V27L、I31L、E65D及びS66A、E47Q、E70S六組の突然変異を含むか、又は、V6L、V27L、I31L、E65D及びS66A、E47Q、E70S、H56N七組の突然変異を含むか、又は、V6L、V27L、I31L、E65D及びS66A、E47Q、E70S、H56R七組の突然変異を含むか、又は、V6L、V27L、I31L、E65D及びS66A、E47Q、E70S、H56R、A66G八組の突然変異を含むか、又は、V6L、V27L、I31L、E65D及びS66A、E47Q、E70S、H56R、A66G、K53R九組の突然変異を含む。
好ましい一実施形態において、上記SIRPα D1ドメイン変異体のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:32~SEQ ID NO:39から選ばれる。
別の好ましい一例において、上記SIRPα D1ドメイン変異体のアミノ酸配列は、、SEQ ID NO:47~SEQ ID NO:51から選ばれる。
好ましい一実施形態において、上記免疫グロブリンFc領域は、ヒトIgG1-Fc領域、ヒトIgG2-Fc領域、ヒトIgG3-Fc領域又はヒトIgG4-Fc領域からなる群より選ばれる。
好ましい一実施形態において、上記免疫グロブリンFc領域は、CH2と、CH3ドメインと、を含み、好ましくは、重鎖CH1とCH2ドメインとの間のヒンジ領域を更に含む。
好ましい一実施形態において、上記ヒトIgG1-Fc領域は、SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列を含む。
別の好ましい一例において、上記ヒトIgG4-Fc領域は、SEQ ID NO:40に示されるアミノ
酸配列を含む。
酸配列を含む。
好ましい一実施形態において、上記SIRPα D1ドメイン変異体は、ペプチドリンカーを
介して免疫グロブリンFc領域のN末端又はC末端に連結される。
介して免疫グロブリンFc領域のN末端又はC末端に連結される。
好ましい一実施形態において、上記ペプチドリンカーは、SEQ ID NO:3に示されるアミ
ノ酸配列を含む。
ノ酸配列を含む。
当業者は、所望の融合タンパク質の自由度に応じてペプチドリンカーを選択することができ、他の選択的なペプチドリンカー形態としては、G、GS、SG、GGS、GSG、SGG、GGG、GGGS、SGGG、GGGGSGS、GGGGSGGS、GGGGSGGGGS、GGGGSGGGGSGGGGS、AKTTPKLEEGEFSEAR、AKTTPKLEEGEFSEARV、AKTTPKLGG、SAKTTPKLGG、SAKTTP、RADAAP、RADAAPTVS、RADAAAAGGPGS、SAKTTPKLEEGEFSEARV、ADAAP、ADAAPTVSIFPP、
TVAAP、TVAAPSVFIFPP、QPKAAP、QPKAAPSVTLFPP、AKTTPP、AKTTPPSVTPLAP、AKTTAPSVYPLAP、ASTKGP、ASTKGPSVFPLAP、GENKVEYAPALMALS、
GPAKELTPLKEAKVS、GHEAAAVMQVQYPASなどが挙げられる。
TVAAP、TVAAPSVFIFPP、QPKAAP、QPKAAPSVTLFPP、AKTTPP、AKTTPPSVTPLAP、AKTTAPSVYPLAP、ASTKGP、ASTKGPSVFPLAP、GENKVEYAPALMALS、
GPAKELTPLKEAKVS、GHEAAAVMQVQYPASなどが挙げられる。
好ましい一実施形態において、上記融合タンパク質のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、又はSEQ ID NO:45からなる群より選ばれる。
本発明の第二の態様によれば、上記融合タンパク質をコードする核酸分子を提供する。
好ましい一実施形態において、上記核酸分子の核酸配列は、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28又はSEQ ID NO:30からなら群より選ばれる。
上記融合タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸分子は、置換、欠失、変化又は挿入を適切に導入して核酸分子の同族体を提供することができることが当業者には明らかである。
本発明の第三の態様によれば、上記核酸分子を含有する発現ベクターを提供する。
本発明の第四の態様によれば、上記発現ベクターを含有する宿主細胞を提供する。
本発明の第五の態様によれば、融合タンパク質の調製方法を提供する。上記調製方法は、
a)発現条件下で、上記宿主細胞を培養することによって、SIRPα-Fc融合タンパク質を
発現させること、及び
b)ステップa)に記載の融合タンパク質を分離精製すること、を含む。
a)発現条件下で、上記宿主細胞を培養することによって、SIRPα-Fc融合タンパク質を
発現させること、及び
b)ステップa)に記載の融合タンパク質を分離精製すること、を含む。
本発明の第六の態様によれば、上記融合タンパク質の有効量、及び1種又は複数種の薬
学的に許容されるベクター、希釈剤又は賦形剤を含む薬物組成物を提供する。
学的に許容されるベクター、希釈剤又は賦形剤を含む薬物組成物を提供する。
本発明の第七の態様によれば、上記融合タンパク質、薬物組成物の、腫瘍を治療するための薬剤の調製における使用を提供する。上記腫瘍の腫瘍細胞は、CD47を発現する。
本発明によれば、上記腫瘍は、黒色腫、腎臓がん、前立腺がん、膵臓がん、乳がん、大腸がん、肺がん、食道がん、頭頸扁平上皮がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、甲状腺がん、膠芽細胞腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫又は胃がんからなら群より選ばれる。
好ましくは、上記黒色腫は、転移性悪性黒色腫であり、上記腎臓がんは、腎明細胞癌であり、上記前立腺がんは、ホルモン難治性前立腺がんであり、上記肺がんは、非小細胞肺がんである。
本発明の第八の態様によれば、上記融合タンパク質、薬物組成物を被験者に投与することを含む腫瘍を治療する方法を提供する。上記腫瘍の腫瘍細胞は、CD47を発現する。
別の好ましい一例において、上記腫瘍は、黒色腫、腎臓がん、前立腺がん、膵臓がん、乳がん、大腸がん、肺がん、食道がん、頭頸扁平上皮がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、甲状腺がん、膠芽細胞腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫又は胃がんからなる群より選ばれる。
本発明の第九の態様によれば、免疫複合体を提供した。上記免疫複合体は、
(a)上記融合タンパク質と、
(b)検出可能なマーカー、薬剤、毒素、サイトカイン、放射性核種、又は酵素からなる
群より選ばれる結合部と、を含む。
(a)上記融合タンパク質と、
(b)検出可能なマーカー、薬剤、毒素、サイトカイン、放射性核種、又は酵素からなる
群より選ばれる結合部と、を含む。
別の好ましい一例において、上記免疫複合体は、腫瘍を治療するための薬物組成物の調製に用いられる。
本発明の第十の態様によれば、SIRPα変異タンパク質を提供する。上記変異タンパク質は、SIRPα D1蛋白ドメイン変異体を含み、上記SIRPα D1ドメイン変異体は、SEQ ID NO:1に対して、H24N、V27L、I31L、E47Q、E70S、I81V、A84E、R114L、E2T及びE1欠失、L4V及びQ5K、A21T及びI22V、E65D及びS66A、F103I及びK104Q、V6L、K53R、H56N、H56R、H56Q、A66L、A66T又はA66Gからなる群より選ばれる一組又は複数組の突然変異を含む。
別の好ましい一例において、上記ドメイン変異体は、SEQ ID NO:1に対して、V6L、V27L、I31L、E65D及びS66A、E47Q、E70S六組の突然変異を含むか、又は、V6L、V27L、I31L、E65D及びS66A、E47Q、E70S、H56N七組の突然変異を含むか、又は、V6L、V27L、I31L、E65D及びS66A、E47Q、E70S、H56R七組の突然変異を含むか、又は、V6L、V27L、I31L、E65D及
びS66A、E47Q、E70S、H56R、A66G八組の突然変異を含むか、又は、V6L、V27L、I31L、E65D及びS66A、E47Q、E70S、H56R、A66G、K53R九組の突然変異を含む。
びS66A、E47Q、E70S、H56R、A66G八組の突然変異を含むか、又は、V6L、V27L、I31L、E65D及びS66A、E47Q、E70S、H56R、A66G、K53R九組の突然変異を含む。
別の好ましい一例において、上記SIRPα変異タンパク質は、変異したSIRPα D1蛋白ド
メイン変異体である。
メイン変異体である。
本発明の第十一の態様によれば、本発明の第十の態様に記載の変異タンパク質又はその融合タンパク質をコードする核酸分子を提供する。
本発明の第十二の態様によれば、本発明の第十一の態様に記載の核酸分子を含有する発現ベクターを提供する。
本発明の第十三の態様によれば、本発明の第十二の態様に記載の発現ベクターを含有する宿主細胞を提供する。
本発明の第十四の態様によれば、(i)本発明の第十の態様に記載の変異タンパク質又は
その融合タンパク質の有効量、及び(ii)1種又は複数種の薬学的に許容されるベクター、
希釈剤又は賦形剤を含む薬物組成物を提供する。
その融合タンパク質の有効量、及び(ii)1種又は複数種の薬学的に許容されるベクター、
希釈剤又は賦形剤を含む薬物組成物を提供する。
本発明の第十五の態様によれば、融合タンパク質を提供する。上記融合タンパク質は、(a)本発明の第十の態様に記載の突然変異タンパク質である第一のタンパク質エレメント
と、(b)エレメント(a)とが融合した第二のタンパク質エレメントとを含み、そのうち、第二のタンパク質エレメントは、SIRPαタンパク質に由来しない。
と、(b)エレメント(a)とが融合した第二のタンパク質エレメントとを含み、そのうち、第二のタンパク質エレメントは、SIRPαタンパク質に由来しない。
別の好ましい一例において、上記第二のタンパク質エレメントは、半減期を延長するためのタンパク質エレメント、又は別の活性を提供するためのタンパク質エレメントを含む。
本発明によれば、以下の有利な効果を奏する。即ち、本発明は、SIRPα D1ドメイン変
異体及び免疫グロブリンFc領域のSIRPα-Fc融合タンパク質を構築し、上記融合タンパク
質は、CD47に高親和性に結合することができ、タンパク質レベルにおいてリガンドCD47との相対親和力が野生型よりも明らかに高い。更に、本発明のSIRPα D1ドメイン変異体の
突然変異形態を組み合わせることにより、SIRPα-Fc融合タンパク質とリガンドCD47との
相対親和力が更に向上する。本発明の高親和力SIRPα-Fc融合タンパク質は、SIRPαとCD47との結合を効率的に遮断することができ、そしてより低い毒性副作用を有し、それによ
ってSIRPα-CD47シグナル経路関連疾患を治療する潜在力を有する。
異体及び免疫グロブリンFc領域のSIRPα-Fc融合タンパク質を構築し、上記融合タンパク
質は、CD47に高親和性に結合することができ、タンパク質レベルにおいてリガンドCD47との相対親和力が野生型よりも明らかに高い。更に、本発明のSIRPα D1ドメイン変異体の
突然変異形態を組み合わせることにより、SIRPα-Fc融合タンパク質とリガンドCD47との
相対親和力が更に向上する。本発明の高親和力SIRPα-Fc融合タンパク質は、SIRPαとCD47との結合を効率的に遮断することができ、そしてより低い毒性副作用を有し、それによ
ってSIRPα-CD47シグナル経路関連疾患を治療する潜在力を有する。
本発明者は鋭意検討した結果、大量のスクリーニングにより、CD47に高親和力に結合することができる一連のSIRPα-Fc融合タンパク質及びその変異体を得た。本発明の高親和
力SIRPα-Fc融合タンパク質は、SIRPとCD47との結合、特にSIRP10-Fc融合タンパク質を効率的に遮断することができ、CD47との親和力が最も高い。また、本発明のSIRPα-Fc融合
タンパク質は、効率的な遮断活性を有するとともに、低毒性副作用を有するため、より良い投与ウィンドウを有する。これに基づき、本発明を完成させた。
力SIRPα-Fc融合タンパク質は、SIRPとCD47との結合、特にSIRP10-Fc融合タンパク質を効率的に遮断することができ、CD47との親和力が最も高い。また、本発明のSIRPα-Fc融合
タンパク質は、効率的な遮断活性を有するとともに、低毒性副作用を有するため、より良い投与ウィンドウを有する。これに基づき、本発明を完成させた。
CD47とSIRPαタンパク質
CD47-SIRPα軸は、最初に見出されたものであり(参考文献:Seiffert M, Cant C, Chen Z, et al. Human signal-regulatory protein is expressed on normal, but not on subsets of leukemic myeloid cells and mediates cellular adhesion involving its counterreceptor CD47. Blood. 1999;94(11):3633‐3643.)、同時に、最も鋭意検討された貪食作用チェックポイントである。
CD47-SIRPα軸は、最初に見出されたものであり(参考文献:Seiffert M, Cant C, Chen Z, et al. Human signal-regulatory protein is expressed on normal, but not on subsets of leukemic myeloid cells and mediates cellular adhesion involving its counterreceptor CD47. Blood. 1999;94(11):3633‐3643.)、同時に、最も鋭意検討された貪食作用チェックポイントである。
SIRPαは、正式名称signal regulatory protein αで、SIRPファミリーの一番目のメンバーであり、20世紀90年代末に同定され、全てのタイプのマクロファージを含む髄細胞に発現している。SIRPは、いずれもN末端細胞外ドメイン、単一膜貫通ドメイン、及びC末端細胞内ドメインを含む。その膜貫通及び/又は細胞内ドメインの構造及びシグナル伝達に
おける潜在的な作用に基づいて、SIRPタンパク質は、少なくとも3種類のサブファミリー
サブタイプに分けられ、それぞれSIRPα、SIRPβ及びSIRPγと呼ばれる。SIRPαは、比較的長い細胞内ドメインを有し、チロシンに基づく免疫受容体阻害モチーフ(ITIM)を二つ含む。SIRPαは、CD47の細胞外受容体/リガンドとして決定され、CD47は、別の重要な細胞
表面免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。研究によると、SIRPαにおけるCD47の結合部位は、細胞外段のIgVドメインに位置することが示されている。大量の研
究によると、CD47は、正常細胞表面に広く発現し、マクロファージ表面のSIRPαと結合することにより、「私を食べないで」というシグナルを放出し、それによって健康細胞をマクロファージから「食べない」ことを保護することが確認されている。発見されて以来、SIRPα-CD47結合相互作用が複数種の重要な白血球機能(好中球と単核細胞遷移を含む)
において重要な役割を果たしていることが証明された。(参考文献:Liu Y, Tong Q, Zhou Y, et al. Functional Elements on SIRPα IgV domain Mediate Cell Surface Binding to CD47[J]. Journal of Molecular Biology, 2007, 365(3): 680-693.、Murata Y, Saito Y, Kotani T, et al. CD47‐signal regulatory protein α signaling system and its application to cancer immunotherapy[J]. Cancer Science, 2018, 109(8): 2349-2357.)。
おける潜在的な作用に基づいて、SIRPタンパク質は、少なくとも3種類のサブファミリー
サブタイプに分けられ、それぞれSIRPα、SIRPβ及びSIRPγと呼ばれる。SIRPαは、比較的長い細胞内ドメインを有し、チロシンに基づく免疫受容体阻害モチーフ(ITIM)を二つ含む。SIRPαは、CD47の細胞外受容体/リガンドとして決定され、CD47は、別の重要な細胞
表面免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。研究によると、SIRPαにおけるCD47の結合部位は、細胞外段のIgVドメインに位置することが示されている。大量の研
究によると、CD47は、正常細胞表面に広く発現し、マクロファージ表面のSIRPαと結合することにより、「私を食べないで」というシグナルを放出し、それによって健康細胞をマクロファージから「食べない」ことを保護することが確認されている。発見されて以来、SIRPα-CD47結合相互作用が複数種の重要な白血球機能(好中球と単核細胞遷移を含む)
において重要な役割を果たしていることが証明された。(参考文献:Liu Y, Tong Q, Zhou Y, et al. Functional Elements on SIRPα IgV domain Mediate Cell Surface Binding to CD47[J]. Journal of Molecular Biology, 2007, 365(3): 680-693.、Murata Y, Saito Y, Kotani T, et al. CD47‐signal regulatory protein α signaling system and its application to cancer immunotherapy[J]. Cancer Science, 2018, 109(8): 2349-2357.)。
用語
本発明において、用語「(Antibody、略称Ab)」と「免疫グロブリンG(Immunoglobulin G、略称IgG)」は、同じ構造的特徴を有するイソテトラグリカン-タンパク質であり、それは、2本の同じ軽鎖(L)及び2本の同じ重鎖(H)からなる。それぞれの軽鎖は、一つの共有ジスルフィド結合を介して重鎖に結合しているが、異なる免疫グロブリンアイソタイプ(isotype)の重鎖間のジスルフィド結合数は異なる。それぞれの重鎖と軽鎖に等間隔の鎖
内ジスルフィド結合もある。それぞれの重鎖の一端に可変領域(VH)があり、その後は定常領域であり、重鎖定常領域は、三つのドメインCH1、CH2、及びCH3からなる。それぞれの
軽鎖の一端に可変領域(VL)があり、他端に定常領域があり、軽鎖定常領域は、一つのドメインCLを含み、軽鎖の定常領域は、重鎖定常領域のCH1ドメインとペアリングし、軽鎖の
可変領域は、重鎖の可変領域とペアリングする。定常領域は、抗体と抗原との結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞が介在する細胞傷害作用(ADCC、antibody-dependent cell-mediate dcytotoxicity)への関与などの異なる効果機能を示す。重鎖定常領域は、IgG1
、IgG2、IgG3、IgG4サブタイプを含み、軽鎖定常領域は、κ(Kappa)又はλ(Lambda)を含
む。抗体の重鎖と軽鎖は、重鎖のCH1ドメインと軽鎖のCLドメインとの間のジスルフィド
結合を介して共有結合し、抗体の二本の重鎖は、ヒンジ領域間に形成されたポリペプチド間のジスルフィド結合を介して共有結合する。
本発明において、用語「(Antibody、略称Ab)」と「免疫グロブリンG(Immunoglobulin G、略称IgG)」は、同じ構造的特徴を有するイソテトラグリカン-タンパク質であり、それは、2本の同じ軽鎖(L)及び2本の同じ重鎖(H)からなる。それぞれの軽鎖は、一つの共有ジスルフィド結合を介して重鎖に結合しているが、異なる免疫グロブリンアイソタイプ(isotype)の重鎖間のジスルフィド結合数は異なる。それぞれの重鎖と軽鎖に等間隔の鎖
内ジスルフィド結合もある。それぞれの重鎖の一端に可変領域(VH)があり、その後は定常領域であり、重鎖定常領域は、三つのドメインCH1、CH2、及びCH3からなる。それぞれの
軽鎖の一端に可変領域(VL)があり、他端に定常領域があり、軽鎖定常領域は、一つのドメインCLを含み、軽鎖の定常領域は、重鎖定常領域のCH1ドメインとペアリングし、軽鎖の
可変領域は、重鎖の可変領域とペアリングする。定常領域は、抗体と抗原との結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞が介在する細胞傷害作用(ADCC、antibody-dependent cell-mediate dcytotoxicity)への関与などの異なる効果機能を示す。重鎖定常領域は、IgG1
、IgG2、IgG3、IgG4サブタイプを含み、軽鎖定常領域は、κ(Kappa)又はλ(Lambda)を含
む。抗体の重鎖と軽鎖は、重鎖のCH1ドメインと軽鎖のCLドメインとの間のジスルフィド
結合を介して共有結合し、抗体の二本の重鎖は、ヒンジ領域間に形成されたポリペプチド間のジスルフィド結合を介して共有結合する。
本発明において、「モノクローナル抗体(モノクローナル抗体)」という用語は、実質的に均一なグループから得られる抗体、即ち、少数の存在可能のある天然突然変異を除いて、当該グループに含まれる単一抗体が同じであることを意味する。モノクローナル抗体は、高特異的に単一抗原部位に対するものである。また、通常のポリクローナル抗体とは異なり(一般的には、異なる抗原決定基に対する異なる抗体を有する混合物である)、各モノクローナル抗体は、抗原における単一決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体の利点は、ハイブリドーマ培養によって合成することができ、他の免疫グロブリンによって汚染されないことである。「モノクローナル」という修飾語は、基本的に均一な抗体グループから得られる抗体の特性を示し、何れかの特定の方法によって抗体を調製する必要があると解釈すべきではない。
本発明において、「Fab」と「Fc」という用語は、パパイン酵素が抗体を二つの完全に
同じFab段及び一つのFc段に溶解することができることを意味する。Fab段は、抗体の重鎖のVHとCH1及び軽鎖のVLとCLドメインからなる。Fc段、即ち結晶化可能なフラグメント(fragment crystallizable、Fc)は、抗体のCH2とCH3ドメインからなる。Fc段は、抗原結合活性がなく、抗体がエフェクター分子又は細胞と相互作用する部位である。
同じFab段及び一つのFc段に溶解することができることを意味する。Fab段は、抗体の重鎖のVHとCH1及び軽鎖のVLとCLドメインからなる。Fc段、即ち結晶化可能なフラグメント(fragment crystallizable、Fc)は、抗体のCH2とCH3ドメインからなる。Fc段は、抗原結合活性がなく、抗体がエフェクター分子又は細胞と相互作用する部位である。
本発明において、「可変」という用語は、抗体中の可変領域のいくつかの部分が配列的に異なり、その特定抗原に対する様々な特定抗体の結合及び特異性を形成することを表す。しかしながら、可変性は、抗体可変領域全体に均一に分布していない。それは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のうちの相補性決定領域(complementarity-determining region
、CDR)又は超可変領域と呼ばれる三つのフラグメントに集中している。可変領域における比較的保守的な部分は、フレームワーク領域(frame region、FR)と呼ばれる。天然重鎖と軽鎖の可変領域には、それぞれ四つのFR領域が含まれており、それらは、実質的にβ-折
り畳み構造を呈し、結合リングを形成する三つのCDRによって連結され、部分β折り畳み
構造を形成することができる場合もある。それぞれの鎖におけるCDRは、FR領域によって
緊密に付け合わせ、、かつ別の鎖のCDRと共に抗体の抗原結合部位を形成する(Kabatら、NIH Publ.No.91-3242、巻I、647~669ページ(1991)参照)。
、CDR)又は超可変領域と呼ばれる三つのフラグメントに集中している。可変領域における比較的保守的な部分は、フレームワーク領域(frame region、FR)と呼ばれる。天然重鎖と軽鎖の可変領域には、それぞれ四つのFR領域が含まれており、それらは、実質的にβ-折
り畳み構造を呈し、結合リングを形成する三つのCDRによって連結され、部分β折り畳み
構造を形成することができる場合もある。それぞれの鎖におけるCDRは、FR領域によって
緊密に付け合わせ、、かつ別の鎖のCDRと共に抗体の抗原結合部位を形成する(Kabatら、NIH Publ.No.91-3242、巻I、647~669ページ(1991)参照)。
本明細書において、「フレームワーク領域」(FR)という用語は、CDR間に挿入されたア
ミノ酸配列、即ち、単一種において異なる免疫グロブリン間の比較的保守的な免疫グロブリンの軽鎖と重鎖可変領域の部分を意味する。免疫グロブリンの軽鎖と重鎖は、それぞれ四つのFRを有し、それぞれFR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L及びFR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-Hと呼ばれる。それに応じて、軽鎖可変ドメインは、(FR1-L)-(CDR1-L)-(FR2-L)-(CDR2-L)-(FR3-L)-(CDR3-L)-(FR4-L)と呼ばれてもよく、かつ重鎖可変ドメインは、(FR1-H)-(CDR1-H)-(FR2-H)-(CDR2-H)-(FR3-H)-(CDR3-H)-(FR4-H)と表されてもよい。好ましくは、本発明のFRは、ヒト抗体FR又はその誘導体であり、上記ヒト抗体FRの誘導体は、天然に存在するヒト抗体FRとほぼ同じ、即ち配列同一性が85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%に達す
る。
ミノ酸配列、即ち、単一種において異なる免疫グロブリン間の比較的保守的な免疫グロブリンの軽鎖と重鎖可変領域の部分を意味する。免疫グロブリンの軽鎖と重鎖は、それぞれ四つのFRを有し、それぞれFR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L及びFR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-Hと呼ばれる。それに応じて、軽鎖可変ドメインは、(FR1-L)-(CDR1-L)-(FR2-L)-(CDR2-L)-(FR3-L)-(CDR3-L)-(FR4-L)と呼ばれてもよく、かつ重鎖可変ドメインは、(FR1-H)-(CDR1-H)-(FR2-H)-(CDR2-H)-(FR3-H)-(CDR3-H)-(FR4-H)と表されてもよい。好ましくは、本発明のFRは、ヒト抗体FR又はその誘導体であり、上記ヒト抗体FRの誘導体は、天然に存在するヒト抗体FRとほぼ同じ、即ち配列同一性が85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%に達す
る。
CDRのアミノ酸配列を知ると、当業者は、フレームワーク領域FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L及び/又はFR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-Hを容易に決定することができる。
本明細書において、「ヒトフレームワーク領域」という用語は、天然に存在するヒト抗体のフレームワーク領域とほぼ同じである(約85%又はそれ以上、具体的には90%、95%、97%、99%又は100%)フレームワーク領域である。
融合タンパク質
本発明において、「融合タンパク質」という用語は、二つ以上の同一又は異なるポリペプチド配列の融合によって得られた新しいポリペプチド配列を意味する。「融合」という用語は、ペプチド結合によって直接結合されるか、又は一つ又は複数のリンカー(ペプチ
ドリンカー)を介して連結されることを意味する。「リンカー(ペプチドリンカー)」とい
う用語は、二つのポリペプチド配列を結合することができる短鎖ペプチドを意味し、一般に長さは1~30個のアミノ酸である。
本発明において、「融合タンパク質」という用語は、二つ以上の同一又は異なるポリペプチド配列の融合によって得られた新しいポリペプチド配列を意味する。「融合」という用語は、ペプチド結合によって直接結合されるか、又は一つ又は複数のリンカー(ペプチ
ドリンカー)を介して連結されることを意味する。「リンカー(ペプチドリンカー)」とい
う用語は、二つのポリペプチド配列を結合することができる短鎖ペプチドを意味し、一般に長さは1~30個のアミノ酸である。
本明細書において、「リンカー(linker)」又は「ペプチドリンカー」という用語は、免疫グロブリンドメインに挿入し、軽鎖と重鎖のドメインのために十分な可動性を提供して、交換二重可変領域免疫グロブリンに折り畳むように、免疫グロブリンドメインに挿入する一つ又は複数のアミノ酸残基を意味する。本発明において、好ましいペプチドリンカーは、SIRPα D1ドメイン変異体と免疫グロブリンFc領域のN末端又はC末端とを結合するペ
プチドリンカーを意味する。好ましくは、上記ペプチドリンカーは、フレキシブルペプチドリンカーである。適切なリンカーの例としては、モノグリシン(Gly)、又はセリン(Ser)残基が挙げられ、リンカーにおけるアミノ酸残基の標識と配列は、リンカーにおける実現必要な二次構造要素のタイプに応じて変化することができる。
プチドリンカーを意味する。好ましくは、上記ペプチドリンカーは、フレキシブルペプチドリンカーである。適切なリンカーの例としては、モノグリシン(Gly)、又はセリン(Ser)残基が挙げられ、リンカーにおけるアミノ酸残基の標識と配列は、リンカーにおける実現必要な二次構造要素のタイプに応じて変化することができる。
本発明において、「SIRPα D1ドメイン」という用語は、全長野生型SIRPαのN末端に位置してCD47への結合を介在するSIRPα膜遠位端の細胞外IgV様領域を意味する。
本発明において、「変異体」という用語は、野生型又は天然に存在するペプチドに対して、アミノ酸置換、欠失又は挿入を少なくとも一つ含むペプチドを意味する。
本発明において、「SIRPα-Fc融合タンパク質」という用語は、SIRPα D1ドメインと免疫グロブリンFc領域とが融合したタンパク質を意味し、上記SIRPα D1ドメインは、その
変異形態を含む。
変異形態を含む。
本発明において、「免疫グロブリンFc領域」という用語は、免疫グロブリン完全Fc領域及びその変異型、Fc領域フラグメント及びその変異型を含む。
本発明において、本発明の融合タンパク質は、その保存的変異体を更に含み、本発明の融合タンパク質のアミノ酸配列と比較して、最大10個、好ましくは最大8個、より好ましく
は最大5個、最適に最大3個のアミノ酸が性質類似又は近いアミノ酸で置換されてポリペプチドを形成することを意味する。これらの保存的変異ポリペプチドは、表Aによるアミノ
酸置換によって産生されることが最適である。
は最大5個、最適に最大3個のアミノ酸が性質類似又は近いアミノ酸で置換されてポリペプチドを形成することを意味する。これらの保存的変異ポリペプチドは、表Aによるアミノ
酸置換によって産生されることが最適である。
コーディング核酸と発現ベクター
本発明は、本発明の融合タンパク質又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド分子を更に提供する。本発明のポリヌクレオチドは、DNA形態又はRNA形態であってもよい。DNA形態としては、cDNA、ゲノムDNA又は人工合成のDNAが挙げられる。DNAは、一本鎖又は二本鎖であってもよい。DNAは、コード鎖又は非コード鎖であってもよい。
本発明は、本発明の融合タンパク質又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド分子を更に提供する。本発明のポリヌクレオチドは、DNA形態又はRNA形態であってもよい。DNA形態としては、cDNA、ゲノムDNA又は人工合成のDNAが挙げられる。DNAは、一本鎖又は二本鎖であってもよい。DNAは、コード鎖又は非コード鎖であってもよい。
本発明において、「発現ベクター」という用語は、適切な制御配列、例えばプロモーター、ターミネーター、エンハンサーなどを含む当分野の従来の発現ベクターを意味し、上記発現ベクターは、ウイルス又はプラスミドであってもよい。上記発現ベクターは、好ましくはpDR1、pcDNA3.4、pDHFR又はpTT5を含む。
関連する配列が一旦取得すると、関連する配列が組換え法を用いて大量に取得することができる。これは通常、ベクターにクローニングしてから、細胞に導入し、そして従来の方法で増殖後の宿主細胞から関連配列を単離する。
本発明は、上記適切なDNA配列及び適切なプロモーター又は制御配列を含むベクターに
も関する。これらのベクターは、タンパク質を発現することができるように、適切な宿主細胞を形質転換するために用いられることができる。本発明において、「宿主細胞」という用語は、当分野の従来の様々な宿主細胞であり、ベクターを安定的に自己複製させることができ、担持される核酸分子を効果的に発現させることができればよい。ここで、上記宿主細胞としては、原核発現細胞及び真核発現細胞が挙げられ、上記宿主細胞は、好ましくは、COS、CHO、NS0、sf9、sf21、DH5α、BL21(DE3)、TG1、BL21(DE3)、293E細胞又はHEK293F細胞を含む。
も関する。これらのベクターは、タンパク質を発現することができるように、適切な宿主細胞を形質転換するために用いられることができる。本発明において、「宿主細胞」という用語は、当分野の従来の様々な宿主細胞であり、ベクターを安定的に自己複製させることができ、担持される核酸分子を効果的に発現させることができればよい。ここで、上記宿主細胞としては、原核発現細胞及び真核発現細胞が挙げられ、上記宿主細胞は、好ましくは、COS、CHO、NS0、sf9、sf21、DH5α、BL21(DE3)、TG1、BL21(DE3)、293E細胞又はHEK293F細胞を含む。
薬物組成物と使用
本発明は、組成物を更に提供する。好ましくは、上記組成物は、薬物組成物であり、上記抗体又はその活性フラグメント又はその融合タンパク質、及び薬学的に許容されるベクターを含有する。一般的に、これらの物質を非毒性で、不活性で、かつ薬学的に許容される水性ベクター媒体に製剤化することができ、ここで、pHが製剤化される物質の特性及び治療症状対象によって変化することができるが、一般的に、pHは、約4~8、好ましくは約5~7である。製剤化された薬物組成物は、従来の経路で投与することができる。投与経路は、静脈注射、静脈点滴、皮下注射、局所注射、筋肉注射、腫瘍内注射、腹腔内注射(例
えば、腹膜内)、頭蓋内注射、又は腔内注射を含むが、これらに限定されない。
本発明は、組成物を更に提供する。好ましくは、上記組成物は、薬物組成物であり、上記抗体又はその活性フラグメント又はその融合タンパク質、及び薬学的に許容されるベクターを含有する。一般的に、これらの物質を非毒性で、不活性で、かつ薬学的に許容される水性ベクター媒体に製剤化することができ、ここで、pHが製剤化される物質の特性及び治療症状対象によって変化することができるが、一般的に、pHは、約4~8、好ましくは約5~7である。製剤化された薬物組成物は、従来の経路で投与することができる。投与経路は、静脈注射、静脈点滴、皮下注射、局所注射、筋肉注射、腫瘍内注射、腹腔内注射(例
えば、腹膜内)、頭蓋内注射、又は腔内注射を含むが、これらに限定されない。
本発明において、「薬物組成物」という用語は、本発明の融合タンパク質が、薬学的に許容されるベクターと共に薬剤製剤組成物を構成することによって、治療効果をより安定に発揮させることができ、これらの製剤が、本発明に開示された融合タンパク質のアミノ酸コア配列の配座完全性を保証するとともに、タンパク質の多官能基をその分解から保護することができることを意味する(凝集、脱アンモニア又は酸化を含むが、これらに限定
されない)。
されない)。
本発明の薬物組成物は、安全有効量(例えば、0.001~99wt%、好ましくは0.01~90wt%、より好ましくは0.1~80wt%)の本発明の上記融合タンパク質(又はそのコンジュゲート)及び
薬学的に許容されるベクター又は賦形剤を含む。このようなベクターは、塩水、緩衝液、グルコース、水、グリセリン、エタノール、及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。薬物製剤は、投与方式と合致しなければならない。本発明の薬物組成物は、針剤の形態に製造され、例えば生理食塩水又はグルコースと他の補剤とを含有する水溶液を用いて、従来の方法によって調製されることができる。針剤、溶液などの薬物組成物は、無菌条件下で製造されることが好ましい。有効成分の投与量は、治療有効量、例えば一日当たり約10マイクログラム/キログラム体重~約50ミリグラム/キログラム体重である。
薬学的に許容されるベクター又は賦形剤を含む。このようなベクターは、塩水、緩衝液、グルコース、水、グリセリン、エタノール、及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。薬物製剤は、投与方式と合致しなければならない。本発明の薬物組成物は、針剤の形態に製造され、例えば生理食塩水又はグルコースと他の補剤とを含有する水溶液を用いて、従来の方法によって調製されることができる。針剤、溶液などの薬物組成物は、無菌条件下で製造されることが好ましい。有効成分の投与量は、治療有効量、例えば一日当たり約10マイクログラム/キログラム体重~約50ミリグラム/キログラム体重である。
また、本発明の融合タンパク質は、他の治療剤と併せて用いることができる。
薬物組成物を投与する場合、安全有効量の融合タンパク質又はその免疫複合体を哺乳動物に投与することであり、ここで、安全有効量は、通常少なくとも約10マイクログラム/キログラム体重であり、多くの場合では、約50ミリグラム/キログラム体重を超えず、好ましくは、当該用量は、約10マイクログラム/キログラム体重~約10ミリグラム/キログラム体重である。もちろん、具体的な用量は、投与経路、患者の健康状況などの要素も考慮すべきであり、これらは、いずれも熟練医師の技能範囲内にある。
本発明のSIRPα-Fc融合タンパク質は、遮断活性を有するとともに良好な低毒性副作用
を有する。
を有する。
本発明において、「親和(能)力」又は「結合(能)力」という用語は、二つの分子間の結合相互作用の強度を意味する。
本発明において、「有効量」という用語は、本発明の薬物組成物を患者に投与した後、治療個体において所期効果を生じる量又は用量を意味し、当該所期効果は、個体病症の改善を含む。
本発明において、上記アミノ酸突然変異におけるアミノ酸残基の位置は、SEQ ID NO:1
に示されるアミノ酸配列を基準として決定される残基番号である。
に示されるアミノ酸配列を基準として決定される残基番号である。
以下、実験的な実施例により本発明を更に説明するが、それらは本発明を制限するものではない。実施例は、従来の方法又は当技術分野の従来の方法の詳細な説明、例えば、核酸分子の調製方法、ベクターとプラスミドを構築するための方法、タンパク質をコードする遺伝子をそのようなベクターとプラスミドに挿入する方法、又はプラスミドを宿主細胞に導入する方法、宿主細胞の培養方法などを含まず、このような方法は、当業者によく知られており、そしてSambrook, J., Fritsch,E.F.and Maniais,T.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd edition,Cold spring Harbor Laboratory Pressを含む
多くの出版物にも記載されている。以下の実施例において特定の条件が明記されていない実験方法は、通常、従来の条件に従うか、又は製造業者によって提案された条件に従う。
多くの出版物にも記載されている。以下の実施例において特定の条件が明記されていない実験方法は、通常、従来の条件に従うか、又は製造業者によって提案された条件に従う。
特に断りの無い限り、パーセントと部数は、重量パーセントと重量部数である。
以下の実施例において使用される実験材料と由来、及び実験試薬の調製方法についての説明は、以下のとおりである。特に示さない限り、いずれも市販で購入できる製品である。
実験材料:
HEK293F細胞:Thermo Fisher Scientificから購入された。
HEK293F細胞:Thermo Fisher Scientificから購入された。
pcDNA3.4:Thermo Fisher Scientificから購入された。
Daudi細胞株:ATCCから購入され、商品番号CCL-213TMである。
実験試薬:
炭酸ナトリウム緩衝液:1.59 g Na2CO3と2.93 g NaHCO3を1 L純水に溶解した。
炭酸ナトリウム緩衝液:1.59 g Na2CO3と2.93 g NaHCO3を1 L純水に溶解した。
リン酸塩緩衝液:PBSTと略す。処方は、KH2PO4 0.2 g、Na2HPO4・12H2O 2.9 g、NaCl 8.0 g、KCl 0.2 g、Tween-20 0.5 mLであり、1 Lまで純水を加えた。
発色液:発色基質A液:酢酸ナトリウム・三水和物13.6 g、クエン酸一水和物1.6 g、30%オキシドール0.3 mL、純水500 mL、発色基質B液:エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム0.2 g、クエン酸一水和物0.95 g、グリセリン50 mL、TMB 0.15 gを3 mL DMSOに溶解し、
純水500 mL、使用前、AとB液を同体積混合した。
純水500 mL、使用前、AとB液を同体積混合した。
停止液:2M硫酸溶液。 HRPで標識化した羊抗マウス二次抗体:Sigmaから購入され、商品番号SAB3701283であった。
RPMI-1640培地:The rmo Fishe r Scie ntificから購入された。
Free Style 293 Expression Medium:Thermo Fisher Scientificから購入された。
牛胎児血清:Thermo Fisher Scientificから購入された。
CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay:Promegaから購入され、商品番号G1780であった。
Propidium Iodide :Sigmaから購入され、商品番号81845-100MGである。
Annexin Vアポトーシス検出キット:BD Biosciencesから購入され、商品番号556570で
あった。
あった。
実験用機器
マイクロプレートリーダー:Molecular Devicesから購入され、型番SpectraMax 190で
あった。
マイクロプレートリーダー:Molecular Devicesから購入され、型番SpectraMax 190で
あった。
多機能マイクロプレートリーダー:Mole cular Devicesから購入され、型番SpectraMax M5であった。
CO2振動インキュベーター:INFORSから購入された。
以下の実施例で使用されたDNA配列は、特に示さない限り、いずれも上海生工生物工程
有限公司によって合成されたものであった。
有限公司によって合成されたものであった。
実施例1. 野生型ヒトSIRPα-Fc融合タンパク質とマウスSIRPα-Fc融合タンパク質との親
和力比較
1.1 野生型ヒトSIRPα-Fc融合タンパク質SIRP-Fc-IgG1の調製
ヒトSIRPαは、主にN端の一番目のドメインDomain 1(以下、SIRPα D1ドメインと略称する)を介してそのリガンドCD47に結合し、そしてD1ドメインが多型性を持つ(参考文献:Barclay A N. Signal regulatory protein alpha(SIRPα)/CD47 interaction and function[J]. Current Opinion in Immunology, 2009, 21(1): 47-52.)。本実施例では、ヒ
トSIRPα(NCBI登録番号CAA71403)のD1ドメインを使用し、そのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:1に示される。ヒトIgG1重鎖Fc段のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:2に示される。
組換えPCRにより、SEQ ID NO:1のDNAとヒトIgG1重鎖Fc段遺伝子を、GGGGSリンカーを介して結合した。その後、当該融合遺伝子をpcDNA3.4発現ベクターに構築し、PEIトランス
フェクション法により発現ベクターをHEK293F細胞に導入して融合蛋白を発現させ、HEK293F細胞をFree Style 293 Expression Mediumで培養した。トランスフェクション後のHEK293F細胞をCO2振動インキュベーターに置いて5日培養し、細胞上清を遠心収集し、Protein Aアフィニティークロマトグラフィーを用いて上清中の融合タンパク質を精製し、得られたタンパク質をSIRP-Fc-IgG1とし、その核酸とアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO:4とSEQ ID NO:5に示される。
和力比較
1.1 野生型ヒトSIRPα-Fc融合タンパク質SIRP-Fc-IgG1の調製
ヒトSIRPαは、主にN端の一番目のドメインDomain 1(以下、SIRPα D1ドメインと略称する)を介してそのリガンドCD47に結合し、そしてD1ドメインが多型性を持つ(参考文献:Barclay A N. Signal regulatory protein alpha(SIRPα)/CD47 interaction and function[J]. Current Opinion in Immunology, 2009, 21(1): 47-52.)。本実施例では、ヒ
トSIRPα(NCBI登録番号CAA71403)のD1ドメインを使用し、そのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:1に示される。ヒトIgG1重鎖Fc段のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:2に示される。
組換えPCRにより、SEQ ID NO:1のDNAとヒトIgG1重鎖Fc段遺伝子を、GGGGSリンカーを介して結合した。その後、当該融合遺伝子をpcDNA3.4発現ベクターに構築し、PEIトランス
フェクション法により発現ベクターをHEK293F細胞に導入して融合蛋白を発現させ、HEK293F細胞をFree Style 293 Expression Mediumで培養した。トランスフェクション後のHEK293F細胞をCO2振動インキュベーターに置いて5日培養し、細胞上清を遠心収集し、Protein Aアフィニティークロマトグラフィーを用いて上清中の融合タンパク質を精製し、得られたタンパク質をSIRP-Fc-IgG1とし、その核酸とアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO:4とSEQ ID NO:5に示される。
1.2 野生型マウスSIRPα-Fc融合タンパク質mSIRP-Fc-IgG1の調製
文献(参考文献:Kwong L S, Brown M H, Barclay A N, et al. Signal-regulatory protein α from the NOD mouse binds human CD47 with an exceptionally high affinity--implications for engraftment of human cells[J]. Immunology, 2014, 143(1): 61-67.)報告によると、ヒトのCD47に対するNOD野生型マウスのSIRPαは、特異的に高い親和
力を有し、NOD野生型マウスSIRPα D1ドメインのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:6に示され
る。
文献(参考文献:Kwong L S, Brown M H, Barclay A N, et al. Signal-regulatory protein α from the NOD mouse binds human CD47 with an exceptionally high affinity--implications for engraftment of human cells[J]. Immunology, 2014, 143(1): 61-67.)報告によると、ヒトのCD47に対するNOD野生型マウスのSIRPαは、特異的に高い親和
力を有し、NOD野生型マウスSIRPα D1ドメインのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:6に示され
る。
組換えPCRにより、SEQ ID NO:6のDNAとヒトIgG1重鎖Fc段遺伝子を、GGGGSリンカーを介して結合した後、当該融合遺伝子をpcDNA3.4発現ベクターに構築し、実施例1.1で記述さ
れた方法を用いて、タンパク質を発現精製し、得られた融合タンパク質をmSIRP-Fc-IgG1
とし、その核酸とアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO:7とSEQ ID NO:8に示される。
れた方法を用いて、タンパク質を発現精製し、得られた融合タンパク質をmSIRP-Fc-IgG1
とし、その核酸とアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO:7とSEQ ID NO:8に示される。
1.3 SIRPα-Fc融合タンパク質リガンドCD47-Hisの調製
CD47細胞外段のN端IgV様ドメイン配列の情報は、https://www.uniprot.org/uniprot/Q
08722)からのものであり、そのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:9に示される。
CD47細胞外段のN端IgV様ドメイン配列の情報は、https://www.uniprot.org/uniprot/Q
08722)からのものであり、そのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:9に示される。
組換えPCRにより、SEQ ID NO:9のDNAをリンカーとポリヒスチジンタグでコードするコ
ード配列に連結した後、当該融合遺伝子をpcDNA3.4発現ベクターに構築し、上記方法を用いて組換えタンパク質を発現し、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを用いて上清中の組換えタンパク質を精製し、得られたタンパク質をCD47-Hisとし、その核酸とアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO:10とSEQ ID NO:11に示される。
ード配列に連結した後、当該融合遺伝子をpcDNA3.4発現ベクターに構築し、上記方法を用いて組換えタンパク質を発現し、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを用いて上清中の組換えタンパク質を精製し、得られたタンパク質をCD47-Hisとし、その核酸とアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO:10とSEQ ID NO:11に示される。
1.4 ポジティブコントロール抗体の調製
1.4.1ポジティブコントロール抗体Magrolimabの調製
ポジティブコントロール抗体Magrolimab(抗CD47のモノクローナル抗体)の重鎖と軽鎖可変領域アミノ酸配列は、『WHO Drug Information, Vol. 32, No. 4, 2018』からのものであった。合成されたMagrolimab重鎖可変領域の遺伝子をヒトIgG1重鎖定常領域遺伝子に連結し、全長の重鎖遺伝子を得て、Magrolimab-HC-IgG1とした。Magrolimab軽鎖可変領域遺伝子をヒトKappa鎖定常領域遺伝子に連結し、全長の軽鎖遺伝子を得て、Magrolimab-LCとした。Magrolimab-HC-IgG1とMagrolimab-LC遺伝子を、それぞれpcDNA3.4発現ベクター
に構築し、実施例1.1で記述された方法を用いて抗体を発現・精製し、得られた抗体をMagrolimab-IgG1とし、その重鎖と軽鎖アミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO:12とSEQ ID NO:13に示される。
1.4.1ポジティブコントロール抗体Magrolimabの調製
ポジティブコントロール抗体Magrolimab(抗CD47のモノクローナル抗体)の重鎖と軽鎖可変領域アミノ酸配列は、『WHO Drug Information, Vol. 32, No. 4, 2018』からのものであった。合成されたMagrolimab重鎖可変領域の遺伝子をヒトIgG1重鎖定常領域遺伝子に連結し、全長の重鎖遺伝子を得て、Magrolimab-HC-IgG1とした。Magrolimab軽鎖可変領域遺伝子をヒトKappa鎖定常領域遺伝子に連結し、全長の軽鎖遺伝子を得て、Magrolimab-LCとした。Magrolimab-HC-IgG1とMagrolimab-LC遺伝子を、それぞれpcDNA3.4発現ベクター
に構築し、実施例1.1で記述された方法を用いて抗体を発現・精製し、得られた抗体をMagrolimab-IgG1とし、その重鎖と軽鎖アミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO:12とSEQ ID NO:13に示される。
1.4.2 ポジティブコントロール抗体Anti-CD47B-Huの調製
Anti-CD47B-Huは、別の抗ヒトCD47モノクローナル抗体であり、その重鎖可変領域アミ
ノ酸配列と軽鎖可変領域アミノ酸配列は、それぞれ中国特許出願202010357134.4に記載のSEQ ID NO:61とSEQ ID NO:62である。合成されたAnti-CD47B-Hu重鎖可変領域遺伝子をヒ
トIgG1重鎖定常領域遺伝子に連結し、全長の重鎖遺伝子を得て、Anti-CD47B-Hu-HC-IgG1
とし、Anti-CD47B-Hu軽鎖可変領域遺伝子をヒトKappa鎖定常領域遺伝子に連結し、全長の軽鎖遺伝子を得て、Anti-CD47B-Hu-LCとした。Anti-CD47B-Hu-HC-IgG1とAnti-CD47B-Hu-LC遺伝子をそれぞれpcDNA3.4発現ベクターに構築し、実施例1.1で記述された方法を用いて、抗体を発現精製し、得られた抗体をAnti-CD47B-Hu-IgG1とし、その重鎖と軽鎖アミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO:14とSEQ ID NO:15に示される。
Anti-CD47B-Huは、別の抗ヒトCD47モノクローナル抗体であり、その重鎖可変領域アミ
ノ酸配列と軽鎖可変領域アミノ酸配列は、それぞれ中国特許出願202010357134.4に記載のSEQ ID NO:61とSEQ ID NO:62である。合成されたAnti-CD47B-Hu重鎖可変領域遺伝子をヒ
トIgG1重鎖定常領域遺伝子に連結し、全長の重鎖遺伝子を得て、Anti-CD47B-Hu-HC-IgG1
とし、Anti-CD47B-Hu軽鎖可変領域遺伝子をヒトKappa鎖定常領域遺伝子に連結し、全長の軽鎖遺伝子を得て、Anti-CD47B-Hu-LCとした。Anti-CD47B-Hu-HC-IgG1とAnti-CD47B-Hu-LC遺伝子をそれぞれpcDNA3.4発現ベクターに構築し、実施例1.1で記述された方法を用いて、抗体を発現精製し、得られた抗体をAnti-CD47B-Hu-IgG1とし、その重鎖と軽鎖アミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO:14とSEQ ID NO:15に示される。
1.5 野生型ヒトSIRPα-Fc融合タンパク質とマウスSIRP-Fc融合タンパク質との相対親和力をELISAで検出する
CD47に対する実施例1.1で調製されたSIRP-Fc-IgG1、実施例1.2で調製されたmSIRP-Fc-IgG1、実施例1.4で調製されたMagrolimab-IgG1とAnti-CD47B-Hu-IgG1の相対親和力をELISAで検出した。方法説明は、以下のとおりである:実施例1.3で調製されたヒトCD47-Hisを
炭酸ナトリウム緩衝液で100 ng/mLに希釈し、その後100 μL各ウェルでプレートに加え
、室温で2時間インキュベートし、PBSTでプレートを洗浄し、各ウェルに1%ウシ血清アル
ブミン(Bovine Serum Albumin、BSA)を含有するPBSTを加えてブロッキングを行い、室温
で1時間インキュベートし、PBSTでプレートを二度洗浄し、段階希釈した抗体又は融合タ
ンパク質を加え、半時間インキュベートし、PBSTでプレートを二度洗浄し、適宜希釈し、HRPで標識化した羊抗ヒト(Fc-Specific)二次抗体を加え、半時間インキュベートし、プレートを洗浄した後、発色液を加えて発色を行い、停止液で発色反応を停止させ、マイクロプレートリーダーでOD450を読み取って、GraphPad Prism6でデータ分析を行い、プロットしてEC50を算出し、結果を図1に示す。
CD47に対する実施例1.1で調製されたSIRP-Fc-IgG1、実施例1.2で調製されたmSIRP-Fc-IgG1、実施例1.4で調製されたMagrolimab-IgG1とAnti-CD47B-Hu-IgG1の相対親和力をELISAで検出した。方法説明は、以下のとおりである:実施例1.3で調製されたヒトCD47-Hisを
炭酸ナトリウム緩衝液で100 ng/mLに希釈し、その後100 μL各ウェルでプレートに加え
、室温で2時間インキュベートし、PBSTでプレートを洗浄し、各ウェルに1%ウシ血清アル
ブミン(Bovine Serum Albumin、BSA)を含有するPBSTを加えてブロッキングを行い、室温
で1時間インキュベートし、PBSTでプレートを二度洗浄し、段階希釈した抗体又は融合タ
ンパク質を加え、半時間インキュベートし、PBSTでプレートを二度洗浄し、適宜希釈し、HRPで標識化した羊抗ヒト(Fc-Specific)二次抗体を加え、半時間インキュベートし、プレートを洗浄した後、発色液を加えて発色を行い、停止液で発色反応を停止させ、マイクロプレートリーダーでOD450を読み取って、GraphPad Prism6でデータ分析を行い、プロットしてEC50を算出し、結果を図1に示す。
図1に、mSIRP-Fc-IgG1、Magrolimab-IgG1及びAnti-CD47B-Hu-IgG1が、いずれも効果的
にCD47に結合することができ、EC50が、それぞれ0.1565 nM、0.1119 nM及び0.05584 nMであり、トッププラトー(top plateau)高さが、それぞれ0.3682、0.8359及び0.7946
であることを示している。この結果から、CD47に対するMagrolimab-IgG1とAnti-CD47B-Hu-IgG1の相対親和力が相当し、そして、CD47に対する両者の相対親和力がmSIRP-Fc-IgG1より有意に高かいことが示唆される。この条件で、SIRP-Fc-IgG1は、効果的にCD47に結合できない。
にCD47に結合することができ、EC50が、それぞれ0.1565 nM、0.1119 nM及び0.05584 nMであり、トッププラトー(top plateau)高さが、それぞれ0.3682、0.8359及び0.7946
であることを示している。この結果から、CD47に対するMagrolimab-IgG1とAnti-CD47B-Hu-IgG1の相対親和力が相当し、そして、CD47に対する両者の相対親和力がmSIRP-Fc-IgG1より有意に高かいことが示唆される。この条件で、SIRP-Fc-IgG1は、効果的にCD47に結合できない。
実施例2. SIRPα-Fc融合タンパク質突然変異体の調製と相対親和力スクリーニング
2.1 SIRPα-Fc融合タンパク質突然変異体の調製
BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)分析結果から、ヒトとNODマウスのSIRPα D1ドメインがアミノ酸配列上に多くの異なる点があり、単一アミノ酸が異なる位置もあり、いくつかの連続したアミノ酸が異なる位置もある(配列アラインメントを図2に示す)。SIRP-Fc-IgG1遺伝子に基づき、ヒトとマウスのSIRPα D1ドメインの異なる位置をそれぞれマウスの対応する位置のアミノ酸配列に突然変異させることによって、表2に示される一
連のSIRP-Fc-IgG1突然変異体を構築した。実施例1.1で記述された方法を用いて、これら
のSIRP-Fc-IgG1突然変異体を発現精製した。これらの突然変異の命名方法は、以下のとおりである:1番目のEが欠失され、同時に1番目のEがTに突然変異される場合、この突然変
異体をMutant-E1#+E1Tとし、4番目のLがVに突然変異され、同時に5番目のQがKに突然変異される場合、この突然変異をMutant-L4V+Q5Kとし、残りは、これによって類推する。
2.1 SIRPα-Fc融合タンパク質突然変異体の調製
BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)分析結果から、ヒトとNODマウスのSIRPα D1ドメインがアミノ酸配列上に多くの異なる点があり、単一アミノ酸が異なる位置もあり、いくつかの連続したアミノ酸が異なる位置もある(配列アラインメントを図2に示す)。SIRP-Fc-IgG1遺伝子に基づき、ヒトとマウスのSIRPα D1ドメインの異なる位置をそれぞれマウスの対応する位置のアミノ酸配列に突然変異させることによって、表2に示される一
連のSIRP-Fc-IgG1突然変異体を構築した。実施例1.1で記述された方法を用いて、これら
のSIRP-Fc-IgG1突然変異体を発現精製した。これらの突然変異の命名方法は、以下のとおりである:1番目のEが欠失され、同時に1番目のEがTに突然変異される場合、この突然変
異体をMutant-E1#+E1Tとし、4番目のLがVに突然変異され、同時に5番目のQがKに突然変異される場合、この突然変異をMutant-L4V+Q5Kとし、残りは、これによって類推する。
2.2 SIRPα-Fc融合タンパク質突然変異体の相対親和力をELISAで検出する
実施例1.5で記述されたELISA方法を用いて、CD47に対する調製されたSIRP-Fc-IgG1突然変異体の相対親和力を検出し、その実験結果を図3と表2に示す。
実施例1.5で記述されたELISA方法を用いて、CD47に対する調製されたSIRP-Fc-IgG1突然変異体の相対親和力を検出し、その実験結果を図3と表2に示す。
注:「#」は、欠失又は存在しないことを表し、E2Tは、2番目のEがTに突然変異されるこ
とを表し、他は、これによって類推する。「+」は、同時突然変異又は同時存在を表す。
とを表し、他は、これによって類推する。「+」は、同時突然変異又は同時存在を表す。
この実施例では、SIRP結合CD47に対する各点突然変異又は各グループ点突然変異の影響を詳細に解析した。図3と表2に、突然変異体M1、M2、M5、M6、M7、M8、M13、M16、M17、M20、M21、M23、M26の相対親和力が、SIRP-Fc-IgG1より明らかに高いことを示している(判断基準は、EC50が未満、かつトッププラトーがSIRP-Fc-IgG1より高く、EC50が相対親和力に反比例し、トッププラトーの高さが相対親和力に比例する)。
実施例3. SIRPα親和力を強化した突然変異組み合わせのスクリーニング
3.1 突然変異組み合わせを含有するSIRPα-Fc融合タンパク質突然変異体の調製
実施例2でスクリーニングされた突然変異体のうち、Mutant-I31Lの相対親和力が最も高く、Mutant-I31Lに加えて、実施例2でスクリーニングされた他の突然変異体の突然変異様式を導入し、表3に示されるような突然変異組み合わせを含有する突然変異体M27-M33を構築した。実施例1.1で記述された方法を用いて、これらの突然変異体を発現精製した。
3.1 突然変異組み合わせを含有するSIRPα-Fc融合タンパク質突然変異体の調製
実施例2でスクリーニングされた突然変異体のうち、Mutant-I31Lの相対親和力が最も高く、Mutant-I31Lに加えて、実施例2でスクリーニングされた他の突然変異体の突然変異様式を導入し、表3に示されるような突然変異組み合わせを含有する突然変異体M27-M33を構築した。実施例1.1で記述された方法を用いて、これらの突然変異体を発現精製した。
3.2 Daudi細胞に対する突然変異組み合わせを含有するSIRPα-Fc融合タンパク質突然変異体の結合能力をフローサイトメトリー法で検出する
Daudi細胞(ヒトリンパ腫細胞)表面CD47に対する調製されたSIRP-Fc-IgG1突然変異体
の結合能力をフローサイトメトリー法で検出した。実験方法は、以下のとおりである:Daudi細胞を計数した後、1%ウシ血清アルブミン(Fetal Bovine Serum、BSA)を含有するPBS
溶液で96ウェル丸底培養プレートに接種され、各ウェルに2E5個細胞/150 μLとし、上記96ウェルプレートにPBS溶液で段階希釈したSIRPα-Fc融合タンパク質突然変異体50 μLを加え、室温で1時間インキュベートし、その後、遠心して上清を捨て、更にPBSで細胞を二度洗浄し、FITCで標識化した羊抗ヒト(Fc-Specific)抗体(1% BSAを含有するPBSで1:1000に従って希釈したもの)を加え、室温で半時間インキュベートし、細胞を遠心洗浄した
後、フローサイトメーター(CytoFLEX Cytometer System、Beckman Coulterから購入されたもの)にてFITCチャンネルの平均蛍光強度(Mean Fluorescence Intensity、MFI)を検出し、実験データをフローサイトメーターの標準装備ソフトウェアで処理して平均蛍光強度を算出し、GraphPad Prism6を用いてデータ分析とプロット作成を行い、EC50を算出し、
実験結果を図4と表3に示す(図4では、IgG1 Isotype Controlとは、CD47に結合しない同
型対照抗体である)。
Daudi細胞(ヒトリンパ腫細胞)表面CD47に対する調製されたSIRP-Fc-IgG1突然変異体
の結合能力をフローサイトメトリー法で検出した。実験方法は、以下のとおりである:Daudi細胞を計数した後、1%ウシ血清アルブミン(Fetal Bovine Serum、BSA)を含有するPBS
溶液で96ウェル丸底培養プレートに接種され、各ウェルに2E5個細胞/150 μLとし、上記96ウェルプレートにPBS溶液で段階希釈したSIRPα-Fc融合タンパク質突然変異体50 μLを加え、室温で1時間インキュベートし、その後、遠心して上清を捨て、更にPBSで細胞を二度洗浄し、FITCで標識化した羊抗ヒト(Fc-Specific)抗体(1% BSAを含有するPBSで1:1000に従って希釈したもの)を加え、室温で半時間インキュベートし、細胞を遠心洗浄した
後、フローサイトメーター(CytoFLEX Cytometer System、Beckman Coulterから購入されたもの)にてFITCチャンネルの平均蛍光強度(Mean Fluorescence Intensity、MFI)を検出し、実験データをフローサイトメーターの標準装備ソフトウェアで処理して平均蛍光強度を算出し、GraphPad Prism6を用いてデータ分析とプロット作成を行い、EC50を算出し、
実験結果を図4と表3に示す(図4では、IgG1 Isotype Controlとは、CD47に結合しない同
型対照抗体である)。
図4と表3に、いくつかの部位突然変異の増加(例えばI31L、V27L、E65D+S66A、E47Q、E70S)が、SIRP-Fc-IgG1突然変異体のトッププラトーを増加させることができるか、又はそ
のEC50を小さくすることができ、突然変異増加後の突然変異体の細胞結合能力の増強を示唆している。L4V+Q5KとE1#+E2Tという二組の突然変異を増加させるのは、突然変異体親和力への影響が顕著ではなく、Daudi細胞に対するこの二組の突然変異を除去した突然変異
体M33の親和力は、M32にほぼ相当する。突然変異組み合せM27~M33のEC50(nM)は、いずれもM8より小さく、トッププラトー高さは、いずれもM8より大きく、M8より強化されたDaudi細胞に対する結合能力を示している。ここで、突然変異組み合わせM30~M33のEC50が、
いずれもAnti-CD47B-Hu-IgG1より小さく、かつトッププラトーが、Anti-CD47B-Hu-IgG1より明らかに高く、これら四つの突然変異体のDaudi細胞に対する結合能力は、Anti-CD47B-Hu-IgG1より明らかに強いことが説明されている。
のEC50を小さくすることができ、突然変異増加後の突然変異体の細胞結合能力の増強を示唆している。L4V+Q5KとE1#+E2Tという二組の突然変異を増加させるのは、突然変異体親和力への影響が顕著ではなく、Daudi細胞に対するこの二組の突然変異を除去した突然変異
体M33の親和力は、M32にほぼ相当する。突然変異組み合せM27~M33のEC50(nM)は、いずれもM8より小さく、トッププラトー高さは、いずれもM8より大きく、M8より強化されたDaudi細胞に対する結合能力を示している。ここで、突然変異組み合わせM30~M33のEC50が、
いずれもAnti-CD47B-Hu-IgG1より小さく、かつトッププラトーが、Anti-CD47B-Hu-IgG1より明らかに高く、これら四つの突然変異体のDaudi細胞に対する結合能力は、Anti-CD47B-Hu-IgG1より明らかに強いことが説明されている。
実施例4. SIRP突然変異体親和力を更に強化した突然変異体の調製とスクリーニング
4.1 SIRP突然変異体親和力を更に強化した突然変異体の調製
ここで、SIRP-Fc-IgG1における野生型SIRPをリンカー(GGGGS)によってヒトIgG4のFc端
に連結させ、産生された組換えタンパク質の名称をSIRP-IgG4とした。M33突然変異体(M33突然変異体に6つの突然変異部位を含有するため、次にSIRP6と呼ばれている)をリンカ
ー(GGGGS)によってヒトIgG4のFc端に連結させ、産生された組換えタンパク質の名称をSIRP6-IgG4とした。開示された結晶構造(参考文献:D Hatherley, Graham S C , Turner J , et al. Paired receptor specificity explained by structures of signal regulatory proteins alone and complexed with CD47.[J]. Mol. Cell, 2008, 31(2):266-277.)
に対して分析を行った結果から、V6、Q52、K53、H56及びA66などのアミノ酸残基がSIRPとCD47界面に位置しているか、又は近いことが発見され、これらは、SIRPとCD47との間の結合に非常に重要であると考えられる。ここで、本実施例では、SIRP6-IgG4に加えて、これらの部位に対して部位特異的変異導入を行い、一連の突然変異体(V6L、Q52E、Q52N、Q52R、K53R、H56N、H56Q、H56R、A66G、A66L及びA66T)を調製した。ここで、このような突
然変異の根拠は、それぞれのアミノ酸が、性質が近いか、又は体積が近いアミノ酸に突然変異することである。実施例1.1で記述された方法を用いて、これらの突然変異体を発現
精製した。ヒトIgG4のFc端アミノ酸配列は、SEQ ID NO:40に示される。
4.2 SIRP6突然変異体の相対親和力をELISAで検出する
実施例1.5で記述されたELISA方法を用いて、CD47に対する上記の調製されたSIRP6シリ
ーズ突然変異体の相対親和力を検出し、実験結果を図5と表4に示す。
4.1 SIRP突然変異体親和力を更に強化した突然変異体の調製
ここで、SIRP-Fc-IgG1における野生型SIRPをリンカー(GGGGS)によってヒトIgG4のFc端
に連結させ、産生された組換えタンパク質の名称をSIRP-IgG4とした。M33突然変異体(M33突然変異体に6つの突然変異部位を含有するため、次にSIRP6と呼ばれている)をリンカ
ー(GGGGS)によってヒトIgG4のFc端に連結させ、産生された組換えタンパク質の名称をSIRP6-IgG4とした。開示された結晶構造(参考文献:D Hatherley, Graham S C , Turner J , et al. Paired receptor specificity explained by structures of signal regulatory proteins alone and complexed with CD47.[J]. Mol. Cell, 2008, 31(2):266-277.)
に対して分析を行った結果から、V6、Q52、K53、H56及びA66などのアミノ酸残基がSIRPとCD47界面に位置しているか、又は近いことが発見され、これらは、SIRPとCD47との間の結合に非常に重要であると考えられる。ここで、本実施例では、SIRP6-IgG4に加えて、これらの部位に対して部位特異的変異導入を行い、一連の突然変異体(V6L、Q52E、Q52N、Q52R、K53R、H56N、H56Q、H56R、A66G、A66L及びA66T)を調製した。ここで、このような突
然変異の根拠は、それぞれのアミノ酸が、性質が近いか、又は体積が近いアミノ酸に突然変異することである。実施例1.1で記述された方法を用いて、これらの突然変異体を発現
精製した。ヒトIgG4のFc端アミノ酸配列は、SEQ ID NO:40に示される。
4.2 SIRP6突然変異体の相対親和力をELISAで検出する
実施例1.5で記述されたELISA方法を用いて、CD47に対する上記の調製されたSIRP6シリ
ーズ突然変異体の相対親和力を検出し、実験結果を図5と表4に示す。
ELISA結果から(図5と表4)、SIRP6-IgG4に比べて、V6L、K53R、H56N、H56R又はA66Gを有するSIRP6-IgG4突然変異体のトッププラトー(Top)の方がより高く、及び/又はEC50がよ
り小さく、これらの突然変異が、CD47に対するSIRP6-IgG4の結合能力を強化させることができることを示している。
り小さく、これらの突然変異が、CD47に対するSIRP6-IgG4の結合能力を強化させることができることを示している。
実施例5. SIRP6突然変異体親和力を更に強化した突然変異組み合わせのスクリーニング
5.1 突然変異組み合わせを含有するSIRP6突然変異体の調製
実施例4でスクリーニングされた突然変異体のうち、SIRP6-IgG4-V6LのTopが一番高く、SIRP6-IgG4-V6L(アミノ酸配列はSEQ ID NO:41に示される)に加えて、H56N又はH56R突然変異を更に導入し、産生された突然変異体をそれぞれSIRP6-IgG4-V6L+H56N(アミノ酸配
列はSEQ ID NO:42に示される)又はSIRP6-IgG4-V6L+H56R(アミノ酸配列はSEQ ID NO:43
に示される)とした。実施例1.1で記述された方法を用いて、これらの突然変異体を発現
精製した。
5.1 突然変異組み合わせを含有するSIRP6突然変異体の調製
実施例4でスクリーニングされた突然変異体のうち、SIRP6-IgG4-V6LのTopが一番高く、SIRP6-IgG4-V6L(アミノ酸配列はSEQ ID NO:41に示される)に加えて、H56N又はH56R突然変異を更に導入し、産生された突然変異体をそれぞれSIRP6-IgG4-V6L+H56N(アミノ酸配
列はSEQ ID NO:42に示される)又はSIRP6-IgG4-V6L+H56R(アミノ酸配列はSEQ ID NO:43
に示される)とした。実施例1.1で記述された方法を用いて、これらの突然変異体を発現
精製した。
5.2 突然変異組み合わせを含有するSIRP6突然変異体の相対親和力をELISAで検出する
実施例1.5で記述されたELISAを用いて、上記突然変異組み合わせを含有するSIRP突然変異体の相対親和力を検出した。
実施例1.5で記述されたELISAを用いて、上記突然変異組み合わせを含有するSIRP突然変異体の相対親和力を検出した。
ELISA結果から(図6と表5)、V6L+H56N組み合わせに比べて、V6L+H56R組み合わせを有
するSIRP6-IgG4突然変異体のトッププラトー(Top)の方がより高く、EC50がより小さく、H56R突然変異が、H56NよりもCD47に対するSIRP6-IgG4突然変異体の結合能力を効果的に増
加できることを示している。
するSIRP6-IgG4突然変異体のトッププラトー(Top)の方がより高く、EC50がより小さく、H56R突然変異が、H56NよりもCD47に対するSIRP6-IgG4突然変異体の結合能力を効果的に増
加できることを示している。
SIRP6-IgG4-V6L+H56Rに加えて、A66G突然変異を更に導入し、産生された突然変異体をSIRP6-IgG4-V6L+H56R+A66G(アミノ酸配列はSEQ ID NO:44に示される)とした。実施例1.1で記述された方法を用いて、これらの突然変異体を発現精製した。実施例1.5で記述され
たELISAを用いて、SIRP突然変異体の相対親和力を検出した。
たELISAを用いて、SIRP突然変異体の相対親和力を検出した。
ELISA結果から(図7と表6)、V6L+H56R組み合わせに比べて、V6L+H56R+A66G組み合わせを有するSIRP6-IgG4突然変異体のトッププラトー(Top)がより高く、EC50がより小さく、A66G突然変異が、CD47に対するSIRP6-IgG4-V6L+H56R突然変異体の結合能力を更に強化させることを示している。 SIRP6-IgG4-V6L+H56R+A66Gに加えて、K53R突然変異を更に導入し、産生された突然変異体をSIRP6-IgG4-V6L+H56R+A66G+K53R(アミノ酸配列はSEQ ID NO:45に示される)とした。実施例1.1で記述された方法を用いて、これらの突然変異体を発現精製した。実施例1.5で記述されたELISAを用いて、SIRP突然変異体の相対親和力を検出した。
ELISA結果から(図8と表7)、V6L+H56R+A66G組み合わせに比べて、V6L+H56R+A66G+K53R組み合わせを有するSIRP6-IgG4突然変異体のトッププラトー(Top)がより高く、EC50がよ
り小さく、K53R突然変異が、CD47に対するSIRP6-IgG4-V6L+H56R突然変異体の結合能力を
更に強化させることを示している。ここで、SIRP6-IgG4-V6L+H56R+A66G+K53RをSIRP10-IgG4とした。
り小さく、K53R突然変異が、CD47に対するSIRP6-IgG4-V6L+H56R突然変異体の結合能力を
更に強化させることを示している。ここで、SIRP6-IgG4-V6L+H56R+A66G+K53RをSIRP10-IgG4とした。
実施例6. SIRPシリーズ突然変異体親和力の比較
開示された文献(Engineered SIRPα Variants as Immunotherapeutic Adjuvants to Anticancer Antibodies[J]. Science, 2013, 341(6141):88-91.)から一つのSIRPの高親和力突然変異体CV1を見出し、それをリンカー(GGGGS)によってヒトIgG4のFc端に連結させ、産生された組換えタンパク質の名称をCV1-IgG4(アミノ酸配列はSEQ ID NO:46に示される)とした。実施例1.1で記述された方法を用いて、これらの突然変異体を発現精製した。
開示された文献(Engineered SIRPα Variants as Immunotherapeutic Adjuvants to Anticancer Antibodies[J]. Science, 2013, 341(6141):88-91.)から一つのSIRPの高親和力突然変異体CV1を見出し、それをリンカー(GGGGS)によってヒトIgG4のFc端に連結させ、産生された組換えタンパク質の名称をCV1-IgG4(アミノ酸配列はSEQ ID NO:46に示される)とした。実施例1.1で記述された方法を用いて、これらの突然変異体を発現精製した。
Biacore は、光学表面プラズモン共鳴(Surface Plasmon Resonance、SPRと略称する)原理に基づき、分子相互作用解析に用いられる一般的な方法である。ここで、Biacoreを
用いて、CD47細胞外端に対する上記SIRP突然変異体と抗CD47抗体の親和力を検出した。実験方法とステップについての説明は、以下のとおりである:HBS-EP+buffer(pH7.4、Cytivaから購入された。商品番号:BR-1006-69)でSIRP突然変異体又は抗CD47抗体を濃度1 μg/mLに希釈し、CD47-Hisを25 nM、12.5 nM、6.25 nM、3.125 nM、1.5625 nM、0.78125 nMに希釈して、ゼロ濃度を設定し、6M グアニジン塩酸塩溶液を再生緩衝液とし、Biacore 8K(GE Healthcareから購入された)にて、Sensor Chip Protein A(Cytivaから購入され
た。商品番号:29-1275-55)で抗体を捕集した後、CD47-Hisを分析物(Analyte)としてチ
ップに流れ、結合-解離曲線を得て、再生緩衝液でチップを再生させた後、次のサイクルを行い、Biacore 8K Evaluation Softwareを用いてデータに対して分析を行った。
用いて、CD47細胞外端に対する上記SIRP突然変異体と抗CD47抗体の親和力を検出した。実験方法とステップについての説明は、以下のとおりである:HBS-EP+buffer(pH7.4、Cytivaから購入された。商品番号:BR-1006-69)でSIRP突然変異体又は抗CD47抗体を濃度1 μg/mLに希釈し、CD47-Hisを25 nM、12.5 nM、6.25 nM、3.125 nM、1.5625 nM、0.78125 nMに希釈して、ゼロ濃度を設定し、6M グアニジン塩酸塩溶液を再生緩衝液とし、Biacore 8K(GE Healthcareから購入された)にて、Sensor Chip Protein A(Cytivaから購入され
た。商品番号:29-1275-55)で抗体を捕集した後、CD47-Hisを分析物(Analyte)としてチ
ップに流れ、結合-解離曲線を得て、再生緩衝液でチップを再生させた後、次のサイクルを行い、Biacore 8K Evaluation Softwareを用いてデータに対して分析を行った。
Biacore結果から(表8)、SIRP6-IgG4の親和力が野生型SIRP-IgG4よりも1桁高く、抗CD47モノクローナル抗体(Magrolimab-IgG1とAnti-CD47B-Hu-IgG1)の親和力にほぼ相当す
ることを示している。全ての突然変異体において、SIRP10-IgG4の親和力が最も高く、CV1-IgG4より高く、主にSIRP10-IgG4が最も遅い解離速度(kd最小)を有することに体現している。
ることを示している。全ての突然変異体において、SIRP10-IgG4の親和力が最も高く、CV1-IgG4より高く、主にSIRP10-IgG4が最も遅い解離速度(kd最小)を有することに体現している。
実施例7. 上記突然変異のADCCを測定する
SIRP突然変異体は、細胞表面のCD47に結合することができ、F段は、エフェクター細胞
(NK細胞など)表面のFc受容体に結合し、エフェクター細胞を介在して標的細胞を直接殺傷することができ、これが抗体依存性細胞が介在する細胞障害(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity、ADCC)である。この実施例では、上記突然変異体のADCC活性を
検出した。
SIRP突然変異体は、細胞表面のCD47に結合することができ、F段は、エフェクター細胞
(NK細胞など)表面のFc受容体に結合し、エフェクター細胞を介在して標的細胞を直接殺傷することができ、これが抗体依存性細胞が介在する細胞障害(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity、ADCC)である。この実施例では、上記突然変異体のADCC活性を
検出した。
具体的な方法は、以下のとおりである:RPMI-1640(Gibco、商品番号:11835-030)に2%の牛胎児血清を加え、当該培地にて標的細胞Daudiと、エフェクター細胞とするヒト末梢血単核細胞(PBMC)を1:25で均一に混合し、丸底96ウェルプレートに接種し、各ウェルに150μ細胞懸濁液を接種し、そして各ウェルに2×104個のDaudi細胞と5×105個のPBMCを
含有させ、段階希釈した抗体突然変異体50μLを加え、細胞インキュベーターに置いて一
夜インキュベートし、細胞培養上清50μLを取って新しい96ウェルプレートに導入し、各
ウェルに50μL CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(Promega、商品番号
:G1780)反応液を加え、半時間後、停止液を加えて反応を停止させ、SpectraMax 190で96ウェルプレートのOD490を読み取って、ADCCは、Promega推薦の公式によって計算する:
細胞毒性(%)=(実験-エフェクター細胞自発-標的細胞自発)/(標的細胞最大-標的
細胞自発)*100、そしてGraphPad Prism7でデータ分析とプロット作成を行い、EC50を算出した。
含有させ、段階希釈した抗体突然変異体50μLを加え、細胞インキュベーターに置いて一
夜インキュベートし、細胞培養上清50μLを取って新しい96ウェルプレートに導入し、各
ウェルに50μL CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(Promega、商品番号
:G1780)反応液を加え、半時間後、停止液を加えて反応を停止させ、SpectraMax 190で96ウェルプレートのOD490を読み取って、ADCCは、Promega推薦の公式によって計算する:
細胞毒性(%)=(実験-エフェクター細胞自発-標的細胞自発)/(標的細胞最大-標的
細胞自発)*100、そしてGraphPad Prism7でデータ分析とプロット作成を行い、EC50を算出した。
ここで、Topの意味は、曲線フィッティングによるADCCの最高程度である。その結果を
図9と表9に示すように、上記融合タンパク質と抗体において、SIRP6-IgG1突然変異体のEC50が一番小さく(0.0781 nM)、Topが一番高かった(52.51)ため、そのADCCが一番強かった
。IgG4 Isotype controlは、特定標的に結合しない対照抗体である。
図9と表9に示すように、上記融合タンパク質と抗体において、SIRP6-IgG1突然変異体のEC50が一番小さく(0.0781 nM)、Topが一番高かった(52.51)ため、そのADCCが一番強かった
。IgG4 Isotype controlは、特定標的に結合しない対照抗体である。
実施例8 上記突然変異のADCPを測定する
SIRP突然変異体は、細胞表面のCD47に結合することができ、Fc段は、エフェクター細胞(マクロファージなど)表面のFc受容体に結合し、エフェクター細胞を介在して標的細胞を貪食することができ、これが抗体依存性細胞貪食(Antibody-dependent cellular phagocytosis、ADCP)である。この実施例では、上記突然変異体のADCP活性を検出した。
SIRP突然変異体は、細胞表面のCD47に結合することができ、Fc段は、エフェクター細胞(マクロファージなど)表面のFc受容体に結合し、エフェクター細胞を介在して標的細胞を貪食することができ、これが抗体依存性細胞貪食(Antibody-dependent cellular phagocytosis、ADCP)である。この実施例では、上記突然変異体のADCP活性を検出した。
接着法で単球をヒトPBMCから分離し、RPMI-1640培地(10%牛胎児血清と50 ng/mL組換えヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子)にて単球を誘発してマクロファージに分化した。Daudi細胞又はJurkat細胞(ATCCから購入された)を遠心収集し、PBSで二度洗浄し、その後、CFSE(5(6)-カルボキシフルオレセインN-スクシンイミドエステル)で細胞
を染色した。誘発産生されたマクロファージをトリプシン-EDTAで処理し、脱着させた。
を染色した。誘発産生されたマクロファージをトリプシン-EDTAで処理し、脱着させた。
その後、上記二種類の細胞を比例に従って均一混合し、丸底96ウェルプレートに接種し、各ウェルに30万個のマクロファージと10万個Daudi細胞を存在させた。96ウェルプレート
に段階希釈した融合タンパク質又はモノクローナル抗体を加え、細胞インキュベーターに置いて3時間インキュベートした。96ウェルプレート中の細胞をPBSで洗浄した後、マクロファージをAPC Mouse Anti-Human CD11b(BD Biosciences、商品番号550019)で染色し、半時間染色した。細胞をパラホルムアルデヒドで固定した後、CytoFLEX Cytometer System(Beckman Coulter)を用いて、各ウェル細胞の蛍光分布と強度を測定した。Graphpad Prism 7でデータを整理分析し、プロット作成し、EC50を算出した。
に段階希釈した融合タンパク質又はモノクローナル抗体を加え、細胞インキュベーターに置いて3時間インキュベートした。96ウェルプレート中の細胞をPBSで洗浄した後、マクロファージをAPC Mouse Anti-Human CD11b(BD Biosciences、商品番号550019)で染色し、半時間染色した。細胞をパラホルムアルデヒドで固定した後、CytoFLEX Cytometer System(Beckman Coulter)を用いて、各ウェル細胞の蛍光分布と強度を測定した。Graphpad Prism 7でデータを整理分析し、プロット作成し、EC50を算出した。
ここで、Topの意味は、曲線フィッティングによるADCPの最高程度である。図10で使用
された標的細胞は、Daudiであり、図11で使用された標的細胞は、Jurkatであった。図10
に示されるように、SIRP6-IgG1、SIRP6-IgG4、Anti-CD47B-Hu-IgG1とMagrolimab-IgG1のADCPのEC50は、それぞれ0.067 nM、0.092 nM、0.019 nM及び0.018 nMであり、それらのTopは、それぞれ25.61、27.56、12.46及び12.49であった。SIRP6-IgG1とSIRP6-IgG4のEC50
がCD47B-Hu-IgG1とMagrolimab-IgG1に及ばないが、前両者のTopは、後両者よりも高かっ
た。これは、高濃度の場合、SIRP6-IgG1とSIRP6-IgG4のADCPは、抗CD47のモノクローナル抗体より明らかに高いことを示している。IgG4 Isotype controlは、特定標的に結合しない対照抗体である。
された標的細胞は、Daudiであり、図11で使用された標的細胞は、Jurkatであった。図10
に示されるように、SIRP6-IgG1、SIRP6-IgG4、Anti-CD47B-Hu-IgG1とMagrolimab-IgG1のADCPのEC50は、それぞれ0.067 nM、0.092 nM、0.019 nM及び0.018 nMであり、それらのTopは、それぞれ25.61、27.56、12.46及び12.49であった。SIRP6-IgG1とSIRP6-IgG4のEC50
がCD47B-Hu-IgG1とMagrolimab-IgG1に及ばないが、前両者のTopは、後両者よりも高かっ
た。これは、高濃度の場合、SIRP6-IgG1とSIRP6-IgG4のADCPは、抗CD47のモノクローナル抗体より明らかに高いことを示している。IgG4 Isotype controlは、特定標的に結合しない対照抗体である。
図11に示されるように、SIRP6-IgG1、SIRP6-IgG4とCV1-IgG4のADCPのEC50は、それぞれ0.14 nM、0.077 nM及び0.13 nMであり、それらのTopは、それぞれ47.8、40.7及び41.4であった。これらの結果から、これらの三種類の突然変異のADCP活性がほぼ相当であることを示している。そのうち、SIRP6-IgG4活性は、最良であった。
実施例9. マウス体内における上記突然変異体の抗腫瘍作用を評価する
尾静脈注射により、1匹あたりCB-17 SCIDマウス(維通利華から購入された)の体内に1×107個のDaudi細胞を接種し、そしてランダムに群分けし、群ごとに10匹のマウスとした。
尾静脈注射により、1匹あたりCB-17 SCIDマウス(維通利華から購入された)の体内に1×107個のDaudi細胞を接種し、そしてランダムに群分けし、群ごとに10匹のマウスとした。
ここで、Control群は、抗体を含まない溶媒、即ちリン酸塩緩衝液を注射した。SIRP6-IgG1とCV1-IgG1(CV1とヒトIgG1のFcとに連結される融合タンパク質)の投与用量は、いずれも20 mg/kgであった。各群のマウスの投与頻度は、週2回であり、投与方式は、腹腔注射
で計7回投与した。投与後、マウスの生存を毎日観察した。各群マウスに対してGraphpad Prism 7を用いてKaplan-Meier生存分析を行った。
で計7回投与した。投与後、マウスの生存を毎日観察した。各群マウスに対してGraphpad Prism 7を用いてKaplan-Meier生存分析を行った。
各群のマウスの生存曲線を図12に示す。分析の結果から分かるように、Control、SIRP6-IgG1とCV1-IgG1の生存期間中央値(Median survival)は、それぞれ20日、52日及び33日であった。70日目の実験終了時、SIRP6-IgG1治療群において、依然としてマウスが生存していた。
上記結果から、SIRP6-IgG1の体内抗腫瘍がCV1-IgG1より優れていることを示している。
実施例10. ヒト赤血球に対する上記突然変異体の凝集作用を評価する
ヒト血液循環系には、大量の赤血球が存在し、赤血球表面にCD47を発現する。臨床研究によると、CD47抗体は、一定の血液学的毒性が存在し、貧血を招くおそれがあることが分かった。この実施例では、ヒト赤血球に対するこれらの突然変異体の凝集作用を細胞イメージング法で評価した。 RPMI-1640(Gibco、商品番号:11835-030)に10%の牛胎児血清を加え、ヒト赤血球を当該培地に再度懸濁させ、6ウェル細胞培養プレートに接種し、細
胞密度を100万/mLとした。その後、各ウェル細胞にSIRP6-IgG1又はAnti-CD47B-Hu-IgG1を加え、両者の最終濃度も1 μg/mLであった。半時間後に、顕微イメージングシステム(OLYMPUS、IX53)を用いて赤血球の凝集状況を観察、記録した。
ヒト血液循環系には、大量の赤血球が存在し、赤血球表面にCD47を発現する。臨床研究によると、CD47抗体は、一定の血液学的毒性が存在し、貧血を招くおそれがあることが分かった。この実施例では、ヒト赤血球に対するこれらの突然変異体の凝集作用を細胞イメージング法で評価した。 RPMI-1640(Gibco、商品番号:11835-030)に10%の牛胎児血清を加え、ヒト赤血球を当該培地に再度懸濁させ、6ウェル細胞培養プレートに接種し、細
胞密度を100万/mLとした。その後、各ウェル細胞にSIRP6-IgG1又はAnti-CD47B-Hu-IgG1を加え、両者の最終濃度も1 μg/mLであった。半時間後に、顕微イメージングシステム(OLYMPUS、IX53)を用いて赤血球の凝集状況を観察、記録した。
図13におけるA図とB図は、それぞれSIRP6-IgG1とAnti-CD47B-Hu-IgG1が赤血球を処理した結果であった。図に示すように、SIRP6-IgG1添加後では、赤血球凝集はなかったが、Anti-CD47B-Hu-IgG1添加後では、赤血球凝集が顕著であった。
結果にあるように、本発明のSIRP6-IgG1は、より優れた低毒性副作用を有した。
Claims (45)
- SIRPα-Fc融合タンパク質であって、前記融合タンパク質は、SIRPαD1ドメイン変異体
と、免疫グロブリンFc領域と、を含み、前記SIRPαD1ドメイン変異体は、SEQ ID NO:1に
対して、H24N;V27L;I31L;E47Q;E70S;I81V;A84E;R114L;E2T及びE1欠失;L4V及びQ5K;A21T及びI22V;E65D及びS66A;及び、F103I及びK104Qから選ばれる少なくとも一組の突然変異を含む、
ことを特徴とするSIRPα-Fc融合タンパク質。 - 前記SIRPαD1ドメイン変異体は、SEQ ID NO:1に対して、I31Lと;H24N;V27L;E47Q;E70S;I81V;A84E;R114L;E2T及びE1欠失;L4V及びQ5K;A21T及びI22V;E65D及びS66A;
及び、F103I及びK104Qからなる群より付加的選ばれる少なくとも一組の突然変異とを含む、
ことを特徴とする請求項1に記載の融合タンパク質。 - 前記SIRPαD1ドメイン変異体は、SEQ ID NO:1に対して、少なくとも二組の突然変異を
含む、
ことを特徴とする請求項1又は2のいずれか1項に記載の融合タンパク質。 - 前記SIRPαD1ドメイン変異体は、SEQ ID NO:1に対して、V27L、I31Lの二組の突然変異
を含む、
ことを特徴とする請求項3に記載の融合タンパク質。 - 前記SIRPαD1ドメイン変異体は、SEQ ID NO:1に対して、少なくとも三組の突然変異を
含む、
ことを特徴とする請求項1又は2のいずれか1項に記載の融合タンパク質。 - 前記SIRPαD1ドメイン変異体は、SEQ ID NO:1に対して、V27L、I31L、L4V及びQ5Kの三
組の突然変異を含む、
ことを特徴とする請求項5に記載の融合タンパク質。 - 前記SIRPαD1ドメイン変異体は、SEQ ID NO:1に対して、少なくとも四組の突然変異を
含む、
ことを特徴とする請求項1又は2のいずれか1項に記載の融合タンパク質。 - 前記SIRPαD1ドメイン変異体は、SEQ ID NO:1に対して、V27L;I31L;L4V及びQ5K;E2T及びE1欠失の四組の突然変異を含む、
ことを特徴とする請求項7に記載の融合タンパク質。 - 前記SIRPαD1ドメイン変異体は、SEQ ID NO:1に対して、少なくとも五組の突然変異を
含む、
ことを特徴とする請求項1又は2のいずれか1項に記載の融合タンパク質。 - 前記SIRPαD1ドメイン変異体は、SEQ ID NO:1に対して、V27L;I31L;L4V及びQ5K;E2T及びE1欠失;E65D及びS66Aの五組の突然変異を含むか、
又は、前記SIRPαD1ドメイン変異体は、SEQ ID NO:1に対して、V27L;I31L;E65D及びS66A;E47Q;E70Sの五組の突然変異を含む、
ことを特徴とする請求項9に記載の融合タンパク質。 - 前記SIRPαD1ドメイン変異体は、SEQ ID NO:1に対して、少なくとも六組の突然変異を
含む、
ことを特徴とする請求項1又は2のいずれか1項に記載の融合タンパク質。 - 前記SIRPαD1ドメイン変異体は、SEQ ID NO:1に対して、V27L;I31L;L4V及びQ5K;E2T及びE1欠失;E65D及びS66A;E47Qの六組の突然変異を含む、
ことを特徴とする請求項11に記載の融合タンパク質。 - 前記SIRPαD1ドメイン変異体は、SEQ ID NO:1に対して、少なくとも七組の突然変異を
含む、
ことを特徴とする請求項1又は2のいずれか1項に記載の融合タンパク質。 - 前記SIRPαD1ドメイン変異体は、SEQ ID NO:1に対して、V27L;I31L;L4V及びQ5K;E2T及びE1欠失;E65D及びS66A;E47Q;E70Sの七組の突然変異を含む、
ことを特徴とする請求項13に記載の融合タンパク質。 - 前記SIRPαD1ドメイン変異体は、SEQ ID NO:1に対して、V6;K53;H56;A66位置から選ばれる少なくとも一組の突然変異を更に含み、好ましくは、V6とH56位置の二組の突然変
異を更に含むか、又は、V6、H56、A66位置の三組の突然変異を更に含むか、又は、V6、H56、A66、K53位置の四組の突然変異を更に含む、
ことを特徴とする請求項1~14のいずれか1項に記載の融合タンパク質。 - 前記突然変異は、V6L、K53R、H56N、H56R、H56Q、A66L、A66T又はA66Gである、
ことを特徴とする請求項15に記載の融合タンパク質。 - 前記SIRPαD1ドメイン変異体は、SEQ ID NO:1に対して、V6L;V27L;I31L;E65D及びS66A;E47Q;E70Sの六組の突然変異を含むか、又は、V6L;V27L;I31L;E65D及びS66A;E47Q;E70S;H56Nの七組の突然変異を含むか、又は、V6L;V27L;I31L;E65D及びS66A;E47Q;E70S;H56Rの七組の突然変異を含むか、又は、V6L;V27L;I31L;E65D及びS66A;E47Q
;E70S;H56R;A66Gの八組の突然変異を含むか、又は、V6L;V27L;I31L;E65D及びS66A
;E47Q;E70S;H56R;A66G;K53Rの九組の突然変異を含む、
ことを特徴とする請求項16に記載の融合タンパク質。 - 前記SIRPαD1ドメイン変異体のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:32~SEQ ID NO:39から選ばれる、
ことを特徴とする請求項1又は2のいずれか1項に記載の融合タンパク質。 - 前記SIRPαD1ドメイン変異体のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:47~SEQ ID NO:51から選ばれる、
ことを特徴とする請求項15に記載の融合タンパク質。 - 前記免疫グロブリンFc領域は、ヒトIgG1-Fc領域、ヒトIgG2-Fc領域、ヒトIgG3-Fc領域
又はヒトIgG4-Fc領域からなる群より選ばれる、
ことを特徴とする請求項1又は2のいずれか1項に記載の融合タンパク質。 - 前記免疫グロブリンFc領域は、ヒトIgG1-Fc領域、ヒトIgG2-Fc領域、ヒトIgG3-Fc領域
又はヒトIgG4-Fc領域からなる群より選ばれる、
ことを特徴とする請求項15に記載の融合タンパク質。 - 前記ヒトIgG1-Fc領域は、SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列を含む、
ことを特徴とする請求項20に記載の融合タンパク質。 - 前記ヒトIgG4-Fc領域は、SEQ ID NO:40に示されるアミノ酸配列を含む、
ことを特徴とする請求項21に記載の融合タンパク質。 - 前記SIRPαD1ドメイン変異体は、ペプチドリンカーを介して免疫グロブリンFc領域のN
末端又はC末端に連結される、
ことを特徴とする請求項1~23のいずれか1項に記載の融合タンパク質。 - 前記ペプチドリンカーは、SEQ ID NO:3に示されるアミノ酸配列を含む、
ことを特徴とする請求項24に記載の融合タンパク質。 - 前記融合タンパク質のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、又はSEQ ID NO:45からなる群より選ばれる、
ことを特徴とする請求項25に記載の融合タンパク質。 - 請求項1~26のいずれか1項に記載の融合タンパク質をコードする、
ことを特徴とする核酸分子。 - 前記核酸分子の核酸配列は、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28又はSEQ ID NO:30からなる群より選ばれる、
ことを特徴とする請求項27に記載の核酸分子。 - 請求項27又は28に記載の核酸分子を含有する、
ことを特徴とする発現ベクター。 - 請求項29に記載の発現ベクターを含有する、
ことを特徴とする宿主細胞。 - 請求項1~26のいずれか1項に記載の融合タンパク質の調製方法であって、前記調製方法は、
a)発現条件下で、請求項30に記載の宿主細胞を培養することによって、SIRPα-Fc融合
タンパク質を発現させるステップと、
b)ステップa)に記載の融合タンパク質を分離精製するステップと、を含む、
ことを特徴とする調製方法。 - 請求項1~26のいずれか1項に記載の融合タンパク質の有効量、及び1種又は複数種の薬
学的に許容されるベクター、希釈剤又は賦形剤を含む、
ことを特徴とする薬物組成物。 - 請求項1~26のいずれか1項に記載の融合タンパク質、又は請求項32に記載の薬物組成物の、腫瘍を治療するための薬剤の調製における使用であって、前記腫瘍の腫瘍細胞は、CD47を発現する、使用。
- 前記腫瘍は、黒色腫、腎臓がん、前立腺がん、膵臓がん、乳がん、大腸がん、肺がん、食道がん、頭頸扁平上皮がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、甲状腺がん、膠芽細胞腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫又は胃がんからなる群より選ばれる、
ことを特徴とする請求項33に記載の使用。 - 腫瘍を治療する方法であって、請求項1~26のいずれか1項に記載の融合タンパク質、又は請求項32に記載の薬物組成物を被験者に投与することを含み、前記腫瘍の腫瘍細胞は、CD47を発現する、
ことを特徴とする方法。 - 前記腫瘍は、黒色腫、腎臓がん、前立腺がん、膵臓がん、乳がん、大腸がん、肺がん、食道がん、頭頸扁平上皮がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、甲状腺がん、膠芽細胞腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫又は胃がんからなら群より選ばれる、
ことを特徴とする請求項35に記載の方法。 - 免疫複合体であって、前記免疫複合体は、
(a)請求項1~26のいずれか1項に記載の融合タンパク質と、
(b)検出可能なマーカー、薬剤、毒素、サイトカイン、放射性核種、又は酵素からなる
群より選ばれる結合部と、を含む、
ことを特徴とする免疫複合体。 - 腫瘍を治療するための薬物組成物の調製に用いられる、
ことを特徴とする請求項37に記載の免疫複合体の使用。 - SIRPα変異タンパク質であって、前記変異タンパク質は、SIRPα D1蛋白ドメイン変異
体を含み、前記SIRPαD1ドメイン変異体は、SEQ ID NO:1に対して、H24N、V27L、I31L、E47Q、E70S、I81V、A84E、R114L、E2T及びE1欠失、L4V及びQ5K、A21T及びI22V、E65D及びS66A、F103I及びK104Q、V6L、K53R、H56N、H56R、H56Q、A66L、A66T又はA66Gからなる群より選ばれる一組又は複数組の突然変異を含む、
ことを特徴とするSIRPα変異タンパク質。 - 前記ドメイン変異体は、SEQ ID NO:1に対して、V6L、V27L、I31L、E65D及びS66A、E47Q、E70S六組の突然変異を含むか、又は、V6L、V27L、I31L、E65D及びS66A、E47Q、E70S、H56N七組の突然変異を含むか、又は、V6L、V27L、I31L、E65D及びS66A、E47Q、E70S、H56R七組の突然変異を含むか、又は、V6L、V27L、I31L、E65D及びS66A、E47Q、E70S、H56R、A66G八組の突然変異を含むか、又は、V6L、V27L、I31L、E65D及びS66A、E47Q、E70S、H56R、A66G、K53R九組の突然変異を含む、
ことを特徴とする請求項39に記載のSIRPα変異タンパク質。 - 請求項39及び40のいずれか1項に記載の変異タンパク質又はその融合タンパク質をコー
ドする、
ことを特徴とする核酸分子。 - 請求項41に記載の核酸分子を含有する、
ことを特徴とする発現ベクター。 - 請求項42に記載の発現ベクターを含有する、
ことを特徴とする宿主細胞。 - 薬物組成物であって、
(i)請求項39又は40のいずれか1項に記載の変異タンパク質又はその融合タンパク質の有効量、及び(ii)1種又は複数種の薬学的に許容されるベクター、希釈剤又は賦形剤を含む
、
ことを特徴とする薬物組成物。 - 融合タンパク質であって、
前記融合タンパク質は、(a)請求項39及び40のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質である第一のタンパク質エレメントと、(b)エレメント(a)とが融合した第二のタンパク質エレメントと、を含み、そのうち、第二のタンパク質エレメントは、SIRPαタンパク質に由来しない、
ことを特徴とする融合タンパク質。
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