KR101838919B1 - 인간 인터페론-베타 변이체가 접합된 면역사이토카인 및 이의 제조방법 - Google Patents

인간 인터페론-베타 변이체가 접합된 면역사이토카인 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 인터페론-베타 변이체 및 항체 또는 그 단편이 접합된 면역사이토카인 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 상기 인간 인터페론-베타 변이체는 천연형 인터페론-베타와 비교해 그 활성 또는 기능이 우수하며, 본 발명에 따른 면역사이토카인은 그 생산성이 우수하다. 또한, 본 발명에 따른 면역사이토카인은 인터페론-베타의 기능 및 특정 항원에 결합하는 항체의 특성이 모두 발현되어 있어 다발성 경화증, 암 등의 표적치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

인간 인터페론-베타 변이체가 접합된 면역사이토카인 및 이의 제조방법{Immunocytokine conjugated with human interferon beta-mutein and method for preparing thereof}
본 발명은 인간 인터페론-베타 변이체가 접합된 면역사이토카인(immunocytokine) 및 이의 제조방법에 관한 발명으로, 보다 구체적으로는 천연형 인터페론-베타보다 활성 및 기능이 우수한 인터페론-베타 변이체와 항체가 결합된 면역사이토카인(immunocytokine) 및 이의 제조 방법에 관한 발명이다.
약제에 있어서 면역요법은 면역 시스템을 조절하여 예방 및/또는 치료 목표를 달성하기 위한 개념에 기초하는 다수의 치료 전략들을 나타낸다.
지난 수년간, 면역요법은 여러 병리상태들의 치료 또는 예방을 위해 사용되어왔다. 모노클로날 항체들을 생산하기 위한 세포 융합 기법이 개발된 이래, 다수의 모노클로날 항체들이 연구자들에 의해 제조되었다. 그 후, 인간 모노클로날 항체를 생산하기 위한 B 세포 하이브리도마 기법 및 EBV 하이브리도마 기법을 포함한 다른 기법들이 모노클로날 항체의 제조를 위해 개발되었다.
모노클로날 항체(Mab)는 거의 모든 에피토프를 표적으로 하기 위하여 개발될 수 있다. 특정 세포/분자에 대한 특이적인 인식 및 결합의 성질은 다양한 질환 상태들에 대한 진단 및 치료 시약으로서 Mab의 개발을 고무시켰다. 재조합 DNA 기법은 인간에게 투여하도록 키메라 또는 인간화 항체를 제조하는데 사용되었다. 현재,여러 모노클로날 항체들이 암, 감염성 질환, 면역 질환 등의 치료를 위해 예를 들어 RITUXAN®, HERCEPTIN®, AVASTIN® 등으로서 시판되고 이용된다.
모노클로날 항체는 표적화된 분자이며, 병리 조직과 같은 특이적 영역(세포, 조직 등) 내에 편재화될 수 있다. 이러한 성질에 의해, 병리 조직부위에서 특이적 분자를 표적화하려는 노력으로 다양한 물질(페이로드(payload))에 컨쥬게이션된 Mab의 개발이 또한 야기되었다. 이러한 물질(페이로드)은 톡신, 약물, 방사성핵종, 프로드럭 화합물 등일 수 있다. 이들 결합의 다수는 항체의 특정 제조, 번거롭고 변형되기 쉬울 수있는 과정과 함께 반응성 모이어티(페이로드)의 화학적 컨쥬게이션을 포함한다(US 4,671,958).
새로운 이들 분자들 중에서, 면역사이토카인은 특히 관심대상이다. 상기 면역사이토카인은 항체 및 사이토카킨을 포함하는 융합 단백질을 의미한다. 이러한 단백질은 항원-결합 능력 및 사이토카인 활성을 모두 보유한다.
사이토카인은 호르몬과 신경전달물질처럼 세포간 통신에 광범위하게 사용되는 시그널링 단백질 및 당단백질의 카테고리이다. 호르몬이 특이적 기관에 의해 혈액으로 분비되고, 신경전달물질이 신경 활성에 연관되는 것인 반면, 사이토카인은 기원 및 목적의 측면에서 더 다양한 화합물 군이다. 이는 광범위한 조혈 및 비-조혈 세포 유형들에 의해 생산되고, 근처의 세포에 대해 영향을 미치거나 유기체 전체에 걸쳐 영향을 미칠 수 있으며, 때로는 다른 화학물질의 존재에 강하게 의존한다. 사이토카인 패밀리는 질량이 8 내지 30 kDa이고 더 작은 수용성 단백질 및 당단백질로 주로 구성된다. 사이토카인은 선천 및 적응 면역 반응 모두의 기능화에 대해 중요하다. 종종 사이토카인은 병원균과 만난 면역 세포에 의해 분비되어, 더 많은 면역 세포들을 활성화시키고 모집하고 병원균에 대한 시스템 반응을 증가시키는 역할을 한다.
사이토카인 중에서, 인터페론(IFNs)은 사이토카인의 일종으로서 항 바이러스 활성을 나타내고, 세포 증식을 억제하며, 자연 면역 반응을 조절하는 기능을 갖는데, 이 중 인터페론-베타(interferon-beta; IFN-β)는 5개의 알파 헬릭스를 가지고있는 구형 단백질로서, 크기는 22 kD이며 당쇄를 제거하면 18 kD이 된다(Arduini 등 Protein Science 8: pp1867-1877, 1999).
인터페론-베타의 임상 적용에 관한 연구는 활발하게 진행 중에 있고, 특히 다발성 경화증(Multiple Sclerosis)에 대한 증상의 완화, 경감 또는 치료제로 각광을 받고 있다(Goodkin 등 Multiple sclerosis: Treatmentoptions for patients with relapsing-remitting and secondary progressive multiple sclerosis, 1999).
다발성 경화증 이외에도 인터페론-베타는 항바이러스 활성, 세포 성장 억제 또는 항 성장 활성, 림프구 세포 독성 증대 활성, 면역 조절 활성, 표적 세포의 분화 유도 또는 억제 활성, 대식세포의 활성화 활성, 사이토카인 생성의 증가 활성, 세포독성 T세포의 효과 증가 활성, 자연 살해 세포(natural killing cell)의 증가 활성 등의 다양한 면역학적 활성으로 암, 자가 면역 장애 및 바이러스 감염, HIV와 관련된 질병, C형 간염, 류마티스성 관절염 등에 치료 등의 효과가 있다는 보고가 있다(Pilling 등 European Journal of Immunology 29: pp 1041-1050, 1999, Young 등 Neurology 51: pp 682-689, 1998, Cirelli 등 1995 Major therapeutic uses ofinterferons. Clin Immunother 3: pp 27-87).
인간 인터페론-베타도 당단백질의 일종인데, 이러한 단백질에 연결된 당쇄 부분이 그 단백질의 활성에 중요한 역할을 한다. 따라서 당단백질의 경우 당쇄를 부가시키게 되면 그 활성이 증가하는 경우가 있을 수 있다.
전술한 바의 관점에서 당단백질인 인간 천연형 인터페론-베타에 당쇄를 도입시켜 그 활성이나 기능이 증가 또는 향상된 인간 인터페론-베타 변이체가 한국 등록특허 10-0781666호에 개시되어 있다.
이에, 천연형 인터페론-베타의 약리효과보다 우수한 효능을 나타내는 인간 인터페론-베타 변이체를 표적화 치료에 이용하기 위해 항체와 접합한 면역사이토카인에 대한 개발이 필요하며 이를 높은 수율로 얻을 수 있는 제조방법이 요구된다.
본 발명의 발명자들은, 인간 천연형 인터페론-베타에 당쇄를 도입시켜 그 활성이나 기능이 증가 또는 향상된 인간 인터페론-베타 변이체가 항체와 결합된 면역사이토카인을 발명하고, 이러한 면역사이토카인의 숙주세포에서의 발현량이 천연형 인터페론-베타와 항체가 결합된 면역사이토카인에 비해 현저히 향상되어 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 (a) 인간 인터페론-베타 변이체; 및 (b) 상기 인간 인터페론-베타 변이체에 직접 또는 간접적으로 결합된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 면역사이토카인(immunocytokine)으로서, 상기 인간 인터페론-베타 변이체는 (i) 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열 전체를 포함하는 폴리펩티드, (ii) 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드, (iii) 상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택되고 인간 인터페론-베타 활성을 지니는 폴리펩티드로서, N-연결형 당쇄를 포함하는 폴리펩티드인 면역사이토카인(immunocytokine)을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 면역사이토카인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 숙주 세포를 제공하는 단계, (b) 제공된 세포를 배양하는 단계 및 (c) 상기 세포 또는 배양 배지로부터 면역사이토카인을 회수함으로써 면역사이토카인을 제조하는 단계를 포함하는 면역사이토카인 제조방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 (a) 인간 인터페론-베타 변이체; 및 (b) 상기 인간 인터페론-베타 변이체에 직접 또는 간접적으로 결합된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 면역사이토카인(immunocytokine)으로서, 상기 인간 인터페론-베타 변이체는 (i) 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열 전체를 포함하는 폴리펩티드, (ii) 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드, (iii) 상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택되고 인간 인터페론-베타 활성을 지니는 폴리펩티드로서, N-연결형 당쇄를 포함하는 폴리펩티드인 면역사이토카인(immunocytokine)을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 면역사이토카인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 (a) 숙주 세포를 제공하는 단계, (b) 제공된 세포를 배양하는 단계 및 (c) 상기 세포 또는 배양 배지로부터 면역사이토카인을 회수함으로써 면역사이토카인을 제조하는 단계를 포함하는 면역사이토카인 제조방법을 제공하는 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
사이토카인의 치료 잠재력은 저농도에서도 일어나는 중증 부작용에 의해 종종 제한을 받으며, 이로써 표적 조직에 충분한 사이토카인 농도가 존재하지 못하게 한다. 이에, 사이토카인의 치료 잠재력을 증가시키고 정상 조직을 독성 효과로부터 보호하기 위해 항체를 사용하여 사이토카인을 표적화하고 이를 질병 부위에 전달하는 것이 면역사이토카인에 의해 가능하다.
본 발명에 따른 면역사이토카인(immunocytokine)은 인간 인터페론-베타의 변이체로, 천연형 인터페론-베타에 당쇄를 도입시켜 그 활성이나 기능이 증가 또는 향상된 사이토카인이다. 본 발명의 발명자들은 상기 인간 인터페론-베타 변이체를 항체와 결합하여 면역사이토카인의 형태로 다발성 경화증, 바이러스성 질환 등의 표적치료에 이용할 수 있다면, 천연형 인터페론-베타가 접합된 면역사이토카인과 비교해 치료효과가 우수할 수 있음에 착안하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 (a) 인간 인터페론-베타 변이체; 및 (b) 상기 인간 인터페론-베타 변이체에 직접 또는 간접적으로 결합된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 면역사이토카인으로서, 상기 인간 인터페론-베타 변이체는 (i) 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열 전체를 포함하는 폴리펩티드, (ii) 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드, (iii) 상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택되고 인간 인터페론-베타 활성을 지니는 폴리펩티드로서, N-연결형 당쇄를 포함하는 폴리펩티드인 면역사이토카인을 제공한다.
천연형 인간 인터페론-베타에 비하여 그 활성 또는 기능이 증가 또는 향상된 상기 인간 인터페론-베타 변이체는, 천연형 인간 인터페론-베타 또는 천연형 인간 인터페론-베타 변이체에서 그 아미노산 서열의 C-말단에 글리신-아스파라긴-이소루이신-트레오닌-발린 서열을 포함하고, 상기 부가 서열의 아스파라긴 잔기에 N-연결형 당쇄를 포함함을 특징으로 한다.
청구범위를 포함하는 본 명세서에서 상기 "천연형 인간 인터페론-베타 변이체"는 천연형 인간 인터페론-베타에서 유래된 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 지니면서 인간 인터페론-베타의 활성을 지니는 모든 폴리펩티드를 포함하는 의미이다.
상기에서 "인간 인터페론-베타의 활성"이란 인간 인터페론-베타가 지닌다고 알려진 활성 중에서 어떠한 폴리펩티드가 인간 인터페론-베타로 동정되기에 충분한 하나 이상의 활성으로 정의된다. 그러한 활성으로서는 이미 전술한 바의 다발성경화증에 대한 경감, 완화 또는 치료 활성, 항바이러스 활성, 세포 성장 억제 활성, 항 성장활성, 항 증식 활성, 림프구세포독성 증대 활성, 면역 조절 활성, 표적 세포의 분화 유도 또는 억제 활성, 사이토카인 생성의 증가 활성, 세포독성 T세포의 효과 증가 활성, 대식세포의 효과 증가 활성, 자연 살해 세포(natural killing cell)의 증가 활성, 암 예방 또는 치료 활성, 자가 면역 장애 예방 또는 치료 활성, 바이러스감염 예방 또는 치료 활성, HIV와 관련된 질병의 예방 또는 치료 활성, C형 간염 예방 또는 치료 활성, 류마티스성 관절염 예방 또는 치료 활성 등을 예시할 수 있다.
또한 상기에서 "천연형 인간 인터페론-베타에서 유래된 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 지니는 폴리펩티드"란 천연형 인간 인터페론-베타의 아미노산 서열인 서열번호 1의 아미노산 서열 전체 또는 그 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드이거나 이러한 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 폴리펩티드를 포함하는 의미이다.
여기서, 상기 "서열번호 1의 아미노산 서열 전체의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드"란 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 천연형 인간 인터페론-베타에 비하여 활성은 낮더라도 여전히 인간 인터페론-베타의 활성을 보유하는 서열번호 1의 아미노산 서열의 일부분을 포함하는 폴리펩티드로 정의되며, 상기 "서열번호 1에 개시된 아미노산 서열 전체 또는 그 실질적인 부분과 실질적으로 유사한 폴리펩티드"란 서열번호 1의 천연형 인간 인터페론-베타에 비하여 활성은 낮더라도 인간 인터페론-베타의 활성을 여전히 보유하면서 하나 이상의 치환된 아미노산을 포함하는 서열번호 1의 아미노산 서열 전체 또는 그 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드로 정의된다.
서열번호 1에 개시된 아미노산 서열 전체의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드로서 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에서 N-말단 부분 및/또는 C-말단 부분이 결실된 경우를 들 수 있고, 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열 전체 또는 그 실질적인 부분과 실질적으로 유사한 폴리펩티드로서 하나 이상의 아미노산이 치환되더라도 치환 전의 아미노산이 치환된 아미노산과 화학적으로 등가인 경우, 예컨대 소수성 아미노산인 알라닌이 다른 소수성 아미노산으로 치환된 경우, 특히 더 소수성인 아미노산, 예를 들면 발린, 류신 또는 이소류신으로 치환된 경우를 들 수 있다.
물론 경우에 따라서는, N-말단 부분, C-말단 부분, 또는 치환된 아미노산이 인간 인터페론-베타의 활성에 필수적인 모티프에 관여함으로써, N-말단 부분 및/또는 C-말단 부분이 결실된 폴리펩티드나 치환된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드가 인간 인터페론-베타의 활성을 나타내지 않는 경우가 있을 수 있겠지만, 그럼에도, 서열번호 1에서 유래한 위 폴리펩티드가 상기 예시된 활성들 중 하나 이상을 가지는가를 확인함을 통해서, 및/또는 그 밖에 본 발명의 출원시를 기준으로 당업계에 공지된 인간 인터페론-베타 동정과 관련된 방법을 통해서, 그러한 비활성의 폴리펩티드를 활성의 폴리펩티드와 구분하고 검출해내는 것은 당업자의 통상의 능력 범위 내에 속한다.
한편, 본 발명의 인간-인터페론 베타 변이체는 한국 등록특허 10-0781666호에 보다 상세하게 기재되어 있다.
본 발명에서의 항체는 광의로 사용되며, 단클론성 항체, 다클론성 항체, 다중특이성 항체(예를 들면, 이중특이성 항체), 및 항체 단편(목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 한)을 포함하나 이로 한정되지는 않는 다양한 항체 구조를 포함한다. 천연 항체는 다양한 구조를 갖는 분자이다. 예를 들면, 천연 IgG 항체는 여기서 다이설파이드-결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 이루어진, 약 150,000 달톤의 사량체 당단백질이다. N-말단에서 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 도메인(VH)에 이어서, 3개 또는 4개의 불변 도메인(CH1, CH2, CH3 및 선택적으로 CH4)을 갖는다. 유사하게, N-말단에서 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 도메인(VL)에 이어서, 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는, 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 2가지 유형중 하나로 지정될 수 있다.
본 발명에서의 항체는 인간 항체, 키메라 항체 및/또는 인간화 항체일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
상기 키메라 항체는 뮤린 면역글로불린의 가변 영역과 인간 면역글로불린의 보존 영역으로 구성되는 항체를 의미한다. 이러한 변형은 단순히 인간 항체의 보존 영역을 뮤린 보존 영역으로 치환시키는 것으로 구성되며, 이에 따라 약학적 용도에 대해 허용가능하도록 충분히 낮은 면역원성을 가질 수 있는 인간/뮤린 키메라를 생성한다.
상기 인간화 항체란 비-인간 상보성결정영역(CDR)을 갖는 항체의 서열을 변형시킴으로써 인간 항체 생식세포(germline)로부터 유래된 아미노산 서열로 (부분적으로 또는 전체적으로) 구성된 항체를 의미한다. 항체의 가변영역 및 CDR의 인간화는 당업계에 잘 알려져 있는 기법에 의해 수행된다. 이러한 항체는 Fc 의존적 이펙터 기능을 위해 필요하지만 항체에 대한 면역 반응을 훨씬 덜 유발시킬 것 같은 인간 보존 영역을 보유한다. 일례로서, 가변 영역의 프레임워크 영역은, 비-인간 CDR을 실질적으로 온전하게 남겨놓거나 또는 심지어 CDR을 인간 게놈으로부터 유래된 서열로 대체한 상응 인간 프레임워크 영역에 의해 치환된다(예컨대, 특허출원 US 2006/25885 참조). 전체(fully) 인간 항체는 인간 면역 시스템에 상응하도록 면역 시스템이 변형된 유전개질 마우스에서 생산된다. 인간화 항체는 또한 인간 프레임워크, 비-인간 항체의 하나 이상의 CDR을 포함하고, 존재하는 임의의 보존 영역이 인간 면역글로불린 보존 영역과 실질적으로 동일한, 즉 약 85% 또는 90% 이상이 동일한, 바람직하게는 95% 이상이 동일한, 항체를 나타낸다. 따라서, 인간화 항체의 모든 부분(아마도 CDR은 제외하고)은 하나 이상의 천연 인간 면역글로불린 서열의 상응하는 부분과 실질적으로 동일하다.
본 발명에서의 항체 단편은 항체 대응물(counterpart)과 동일한 항원과 반응할 수 있는 항체 단편을 나타낸다. 이러한 단편은 통상의 기술자에 의해 간단하게 동정될 수 있으며, 여기에는 일례로서 Fab 단편(예컨대, 파파인 소화에 의한 단편), Fab' 단편(예컨대, 펩신 소화 및 부분적 환원에 의한 단편), F(ab')2 단편(예컨대, 펩신 소화에 의한 단편), Facb(예컨대, 플라스민 소화에 의한 단편), Fd(예컨대, 펩신 소화, 부분적 환원 및 재응집에 의한 단편), 및 scFv(단쇄 Fv; 예컨대, 분자생물학 기법에 의한 단편) 단편이 포함된다. 상기 단편은 당업계에 알려져 있거나 및/또는 본원에 개시되어 있는 바와 같이, 효소 분할, 합성 또는 재조합 기법에 의해 생산될 수 있다.
본 발명에 따른 인간 인터페론-베타 변이체가 접합된 면역사이토카인은 항체 자체에서는 나타나지 않는 세포독성 및 pSTAT-1의 인산화를 유도하여 인터페론-베타 활성을 나타내는 것으로 확인되었다(실시예 3 및 4 참조).
본 발명은 또한 상기 항체 또는 이의 단편은 종양성 항원 및 다발성 경화증 특이적 항원을 포함하는 군에서 선택된 항원에 대한 항체 또는 이의 단편인 것을 특징으로 하는 면역사이토카인을 제공한다.
일정한 크기 이상으로 성장한 종양은 더 성장하거나 다른 부위로 전이하기 위해서 새로운 혈관을 형성할 필요가 있게 된다. 따라서 새로운 혈관의 형성과 관련된 분자들 및 신호전달체계는 항암치료에 있어서 중요한 치료 타켓이 될 수 있다. 한편, 인터페론-베타는 종양세포의 혈관신생 작용에 대한 저해작용을 함으로써 종양세포의 성장을 억제하는 것으로 보고되고 있다. 또한 인터페론-베타는 종양이 존재하는 부위의 주변 환경에서 선천성 또는 후천성 면역반응을 유도함으로써 종양세포의 사멸을 유도해 항암효과를 나타낼 수 있다.
이에, 본원발명에 따른 인간 인터페론-베타 변이체는 천연형 인터페론-베타와 비교하여 그 활성 및 기능이 향상되어 있기 때문에, 종양성 항원을 특이적으로 인식하는 항체와 결합된 면역사이토카인의 형태로써 암 환자의 타켓치료에 사용된다면 천연형 인터페론-베타가 접합된 면역사이토카인에 비해 더 우수한 치료효과를 나타낼 수 있다.
상기 종양성 항원은 면역 반응, 특히 T-세포 매개된 면역 반응을 이끌어내는 종양 세포에 의해 생산되는 단백질이다. 종양 항원은 당해 기술분야에 잘 알려져 있고, 예를 들면, 글리오마-관련된 항원, 암배아 항원(CEA), β-인간 융모성 생식샘자극호르몬, 알파태아단백질(AFP), 렉틴-반응성 AFP, 티로글로불린, RAGE-1, MN-CA IX, 인간 텔로머라제 역전사효소, RU1, RU2(AS), 장 카르복실 에스테라제, mut hsp70-2, M-CSF, 프로스타제, 전립선-특이적 항원(PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-1a, p53, 프로스테인, PSMA, Her2/neu, 서바이빈(survivin) 및 텔로머라제, 전립선-암종 종양 항원-1(PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중구 엘라스타제, 에프린B2, CD22, 인슐린 성장 인자(IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체 및 메소텔린을 포함한다.
본 발명에서 지칭된 종양성 항원의 유형은 또한 종양-특이적 항원(TSA) 또는 종양-관련된 항원(TAA)일 수 있다. TSA는 종양 세포에 대해 고유하고 신체의 다른 세포 상에서 발생하지 않는다. TAA 관련된 항원은 종양 세포에 대해 고유하지 않고 대신에 또한 항원에 대한 면역원성 내성 상태를 유도하지 못하는 조건 하에서 정상 세포 상에서 발현된다. 종양에 대한 항원의 발현은 면역 시스템이 항원에 대해 반응하게 하는 조건 하에서 발생할 수 있다. TAA는 면역 시스템이 비성숙하고 반응할 수 없는 경우 태아 발달 동안 정상 세포 상에서 발현되는 항원일 수 있거나 정상 세포 상에서 매우 낮은 수준으로 정상적으로 존재하지만 종양 세포 상에서 훨씬 높은 수준으로 발현되는 항원일 수 있다.
TSA 또는 TAA 항원의 비-제한적인 예로는 다음이 포함된다: MART-1/MelanA(MART-I), gp100(Pmel 17), 티로시나제, TRP-1, TRP-2와 같은 분화 항원 및 MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15와 같은 종양-특이적 다중계통 항원; CEA와 같은 과발현된 배아 항원; 과발현된 종양유전자 및 p53, Ras, HER-2/neu와 같은 돌연변이된 종양-억제 유전자; 염색체 전위로부터 초래된 고유 종양 항원; 예를 들면 BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; 및 바이러스 항원, 예를 들면 엡스타인 바 바이러스 항원 EBVA 및 인간 파필로마바이러스(HPV) 항원 E6 및 E7. 다른 큰, 단백질-기반 항원에는 TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, 베타-카테닌, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 알파-태아단백질, 베타-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3＼CA 27.29＼BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68＼P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733＼EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90＼Mac-2 결합성 단백질＼사이클로필린 C-관련된 단백질, TAAL6, TAG72, TLP, 및 TPS가 포함된다.
상기 종양성 항원을 특이적으로 인식하는 항체로는 예를 들어, HuM195 (예를 들어, Kossman 등, (1999) Clin. Cancer Res. 5: 2748-2755참조), CMA-676 (예를 들어, Sievers 등, (1999) Blood 93: 3678-3684 참조), AT13/5 (예를 들어, Ellis 등, (1995) J. Immunol. 155: 925-937 참조), HB7 , 트라스투주마브 (예를 들어, HERCEPTIN ; Fornier 등, (1999) Oncology (Huntingt) 13: 647-58), TAB-250 (Rosenblum 등, (1999) Clin. Cancer Res. 5: 865-874), BACH-250 (Id.), TA1 (Maier 등, (1991) CancerRes. 51: 5361-5369), 및 미국 특허 제 5,772,997 호; 제 5,770,195 호에 기술된 mAb (mAb 4D5; ATCC CRL10463); 및 미국 특허 제 5,677,171 호에 기술된 mAb, Mc5 (예를 들어, Peterson 등, (1997) Cancer Res. 57: 1103-1108;Ozzello 등, (1993) Breast Cancer Res. Treat. 25: 265-276 참조), hCTMO1 (예를 들어, Van YM 등,(1996) Cancer Res. 56: 5179-5185 참조) CC49 (예를 들어, Pavlinkova 등, (1999) Clin. Cancer Res. 5: 2613-2619 참조), B72.3 (예를 들어, Divgi 등,(1994) Nucl. Med. Biol. 21: 9-15 참조),마우스 모노클로날 항-HM1.24 IgG2a/κ, 인간화된 항-HM1.24 IgG1/κ항체 (예를 들어, Ono 등, (1999) Mol. Immuno. 36: 387-395 참조), 트라스투주마브 (예를 들어, HERCEPTIN , Fornier 등, (1999) Oncology (Huntingt) 13: 647-658 참조), TAB-250(Rosenblum 등,(l999) Clin. Cancer Res. 5: 865-874), BACH-250 (Id.), TA1 (예를 들어, Maier 등, (1991)Cancer Res. 51: 5361-5369 참조), 리툭시마브 (rituximab), 이브리투모마브 티욱세탄 (Ibritumomabtiuxetan), 및 토시투모마브 (tositumomab), AME-133v (Applied Molecular Evolution), 오크렐리주마브(Ocrelizumab) (Roche), 오파투무마브 (Ofatumumab) (Genmab), TRU-015 (Trubion) 및 IMMU-106(Immunomedics) 등 이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 상기 기술된 항체의 사용을 제한할 필요가 없고, 당업자에게 알려진 바와 같은 다른 그러한 항체는 본원에 기술된 조성물 및 방법에서 사용될 수 있다.
한편, IFN-β가 처음 다발성 경화증 치료제로 도입된 것은 항바이러스 효과를 얻기 위해서였지만, 이후 많은 연구를 통해 그 작용 기전이 밝혀지고 있다. 우선 IFN-β는 IFN-α에 의해 유도되는 HLA class II 분자의 활성화를 억제함으로써 항원 발현을 저해하고, T 세포의 활성화를 막는다. 또한 IFN-β는 co-stimulatory molecules을 비활성화시켜 T 세포의 활성화를 억제하며(28, 29), 자가반응성 T 세포가 자연사(apoptosis)하도록 유도하기도 한다. 뇌-혈관 장막(brain-blood barrier)에 대한 IFN-β의 효과는 T 세포가 혈관내피세포에 부착되는 것을 억제하고, 뇌로 들어가는 능력을 감소시키는 것으로 생각되며, 실제로 MRI 연구를 보면 IFN-β치료를 받은 약 90%의 다발성 경화증 환자에서 조영 증강 병변이 감소하였다는 보고가 있다.
이에, 본원발명에 따른 인간 인터페론-베타 변이체는 천연형 인터페론-베타와 비교하여 그 활성 및 기능이 향상되어 있기 때문에, 다발성 경화증 특이적 항원을 인식하는 항체와 결합된 면역사이토카인의 형태로써 타켓치료에 사용된다면 인터페론-베타 단독제제의 치료효과보다 더 우수한 효과를 나타낼 수 있다.
다발성 경화증 특이적 항원 및 항체는 예를 들어, CD20과 이를 인식하는 항체인 rituximab, CD52 와 이를 인식하는 단클론항체인 alemtuzumab 및 인터루킨-2의 알파 수용체와 이를 인식하는 daclizumab을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은아니다.
본 발명은 또한 상기 인간 인터페론-베타 변이체는 펩타이드 링커에 의해 상기 항체 또는 이의 단편에 결합되어 있는 면역사이토카인을 제공한다.
바람직한 한 구현예에 따르면, 상기 링커는 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역사이토카인을 제공한다.
본 발명의 면역사이토카인은 바람직하게는 인간 인터페론-베타 변이체와 항체 또는 그 단편의 폴리펩티드 사이에 삽입된 가요성 링커 서열을 포함할 수 있다. 상기 링커 서열은 상기 항체 또는 그 단편의 상기 인간 인터페론-베타 변이체에 대한 유효한 위치 결정을 허용하여 상기 두 도메인 모두의 작용 활성을 허용한다.
상기 링커는 천연 유래의 펩타이드 링커 또는 합성 유래의 펩타이드 링커를 의미한다. 상기 펩타이드 링커는 선형 아미노산 쇄로 구성되고, 이때 20종의 천연 발생 아미노산은 단량체 빌딩 블록이다. 링커는 반복적 아미노산 서열을 가질 수 있거나 천연 발생 폴리펩티드, 예컨대, 힌지 기능을 갖는 폴리펩티드의 서열을 가질 수 있다. 모든 펩타이드 링커가 핵산 분자에 의해 코딩될 수 있으므로 재조합적으로 발현될 수 있다. 링커는 그 자체가 펩타이드이기 때문에 인간 인터페론-베타 변이체와 항체 또는 그 단편은 펩타이드 결합을 통해 링커에 연결된다.
링커는 펩타이드 결합에 의해 함께 연결된 아미노산, 바람직하게는 펩타이드 결합에 의해 연결된 1 내지 20개의 아미노산으로 구성되며, 이때 아미노산은 20개의 천연 아미노산 중에서 선택된다. 이들 아미노산 중 하나 이상은 당해 분야의 숙련자에 의해 이해되는 바와 같이 글리코실화된다. 이에 제한되는 것은 아니지만 바람직하게는, 1 내지 20개의 아미노산은 글리신, 알라닌, 프롤린, 아스파라긴, 글루타민 및 리신 중에서 선택된다.
바람직하게는, gly-ser 링커, 예를 들어, (glyxsery)z 형, 예를 들어 (gly4ser)3 또는 (gly3ser2)3을 들 수 있으며, 보다 바람직하게는 GGGGS 또는 GGGGSGGGGSGGGSG 의 아미노산 서열로 표시되는 링커일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또한 상기 인간 인터페론-베타 변이체 폴리펩티드의 아미노산 서열은 상기 항체 또는 이의 단편의 아미노산 서열에 대해 중쇄 말단, 경쇄 말단 또는 중쇄 및 경쇄 말단 위치에 있는 것을 특징으로 하는 면역사이토카인을 제공한다.
상기 인간 인터페론-베타 변이체의 아미노산 서열은 항체 또는 이의 단편의 아미노산 서열에 대해 중쇄 말단, 경쇄 말단 또는 중쇄 및 경쇄 말단 위치에 있을 수 있고, 바람직하게는 항체 또는 이의 단편의 아미노산 서열에 대해 C-말단 위치에 있다.
본 발명은 또한 상기 면역사이토카인은 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역사이토카인을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 면역사이토카인을 인코딩하는 폴리튜클레오티드를 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 인간 인터페론-베타 변이체와 항체 또는 그 단편이 결합된 면역사이토카인의 펩타이드를 암호화 하는 것이면 제한 없이 사용될 수 있으며, DNA, cDNA 및 RNA 서열을 모두 포함한다. 바람직하게는, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖거나 또는 상기 아미노산 서열과 적어도 70% 이상의 상동성(homology)이 있는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 암호화 하는 물질을 말하며, 이는 천연에서 분리되거나 당업계의 공지된 유전공학적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
상기 벡터는 당업자들이 당업계에 알려진 어떠한 방법에 따라 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 벡터내로 삽입하여 적절한 전사/해독 조절서열을 이용하여 본 발명의 면역사이토카인을 발현하도록 제조된 발현벡터를 말한다.
본 발명에 따라 클로닝된 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 적절한 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. '작동가능하게 연결(operably linked)' 된다는 것은 상기 폴리뉴클레오타이드 서열이 발현 조절 서열에 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 것을 의미한다. 상기 '발현 조절 서열(expression control sequence)'이란 특정한 숙주세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴크레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리포좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 발현 벡터의 모벡터로 사용되는 벡터는 특별한 제한이 없으며, 이 발명이 속하는 기술분야에서 숙주세포로 사용되는 미생물에서의 발현을 위하여 통상적으로 사용되는 모든 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체 등이 사용 가능하다. 예컨대, 상기 플라스미드에는 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119, pET-22b(+)), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5) 및 효모 유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 등이 있으며, 상기 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 백시니아 바이러스와 같은 동물바이러스, 배큘로바이러스와 같은 곤충 바이러스 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또한 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
숙주 세포는 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 또는 바람직한 특정 방식으로 유전자 생성물을 진행시키는 것을 선택할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질의 해독 및 해독 후 프로세싱과 변형에 대한 특징적이고 특이적인 기작을 갖고 있다. 적합한 세포주 또는 숙주 시스템으로는 발현된 이종 단백질의 바람직한 변형 및 프로세싱을 제공하는 것을 선택할 수 있다. 효모에서의 발현은 생물학적 활성 생성물을 생산할 수 있다. 진핵 세포에서의 발현은 " 천연" 폴딩의 가능성을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21DE, E. coli DH5, E. coli RR1, E.coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110 등이 사용될 수 있으며, 또한 아그로박테리움 A4와 같은 아그로박테리움 속 균주, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실리(bacilli), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르게센스(Serratia marcescens)와 같은 또 다른 장내세균 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주가 숙주세포로서 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 이스트(Saccharomycecerevisiae), 곤충 세포 및 사람 세포(예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293,HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 등이 이용될 수 있다.
본 발명에서 숙주세포는 바람직하게는 CHO 세포주일 수 있다.
벡터를 숙주세포 내로 전달하여 숙주세포를 형질전환 시키는 방법은 공지의 방법이면 어떠한 것이든 가능하며 특별히 제한되지 아니한다. 예를 들어, 인산칼슘침전법(calcium phosphate precipitation), DEAE-dextran법, 전기천공법(electroporation), 직접 미세주입법(direct microinjection), DNA-로딩 리포좀(DNAloaded liposome)법, 리포펙타민-DNA복합체(liofectamine-DNA complex)법, 세포 음파분쇄법(cell sonication), 고속미세분사(high velocity microprojectile)를 이용한 유전자 폭격법(gene bombardment), 다양이온(polycation)법 및 수용체 매개 형질전이법(receptor-mediated transfection)에 의하여 형질전환 할 수 있다. 이 기술들 중 일부는 생체 내 또는 생체 외 사용을 위해 개량될 수 있다.
본 발명은 또한 (a) 숙주 세포를 제공하는 단계, (b) 제공된 세포를 배양하는 단계 및 (c) 상기 세포 또는 배양 배지로부터 면역사이토카인을 회수함으로써 면역사이토카인을 제조하는 단계를 포함하는 면역사이토카인 제조방법을 제공한다.
형질전환 미생물의 배양은 목적 단백질인 인간 인터페론-베타 변이체와 항체 또는 이의 단편이 결합된 면역사이토카인의 발현을 가능하게 하는 적절한 조건하에서 수행하며, 이러한 조건은 당업자에게 익히 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다. 형질전환 미생물은 통상적인 배양방법에 의해 대량으로 배양할 수 있다. 배양배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지를 사용할 수 있으며, 예를 들어, LB 배지(Luria-Bertani Broth)을 사용할 수 있다. 미생물의 배양은 통상의 미생물 배양 조건상에서 가능하며 예를 들어, 온도범위 15℃ 내지 45℃에서 10시간 내지 40시간 동안 배양할 수 있다. 배양액 중의 배양배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리(centrifugation) 또는 여과 (filtration)과정을 거칠 수 있으며 이러한 단계는 당업자가 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동(frozen)하거나 또는 냉동건조(lyophilized)하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다.
형질전환 미생물(또는 형질전환체)에서 발현시킨 단백질은 통상의 방식으로 정제될 수 있으며, 예를 들어, 염석(예를 들어 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 칼럼 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용시켜 본 발명의 면역사이토카인을 정제할 수 있다(Maniatis et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)).
본 발명의 인간 인터페론-베타 변이체가 접합된 면역사이토카인의 경우 인간 인터페론-베타가 접합된 면역사이토카인보다 현저히 우수한 효율로 면역사이토카인을 제조할 수 있다(실시예 2 참조).
본 발명의 인간 인터페론-베타 변이체 및 항체 또는 이의 단편을 포함하는 면역사이토카인은 인터페론-베타의 활성 및 항체의 특성을 동시에 나타내어 다발성 경화증 또는 암의 표적화 치료에 이용할 수 있으며, 본 발명에 따른 면역사이토카인은 천연형 인터페론-베타가 접합된 면역사이토카인과 비교해 우수한 효율로 생산될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 숙주세포에서 제조된 면역사이토카인의 발현량을 웨스턴-블롯을 통해 확인한 결과이다(1: 배양배지, 2: B12 중쇄-천연형 인터페론, 3: B12 중쇄-인터페론 변이체, 4: B12 경쇄-천연형 인터페론, 5: B12 경쇄-인터페론 변이체)
도 2는 숙주세포에서 제조된 면역사이토카인의 발현량을 BCA assay를 통해 확인한 결과이다(ACC#1: B12 중쇄-천연형 인터페론, ACC#2: B12 중쇄-인터페론 변이체, ACC#6: B12 경쇄-천연형 인터페론, ACC#7: B12 경쇄-인터페론 변이체).
도 3은 본 발명에 따른 인간 인터페론-베타 변이체와 B12항체가 결합된 면역사이토카인의 인터페론 활성을 STAT-1의 인산화 여부로 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 인간 인터페론-베타 변이체와 B12항체가 결합된 면역사이토카인을 세포에 24시간 처리한 후 세포독성을 통해 인터페론-베타 활성을 확인한 결과이다(Carbiferon: 인간 인터페론-베타 변이체, B12: B12 항체, ACC#2: 인간 인터페론-베타 변이체와 B12가 결합된 면역사이토카인).
도 5는 본 발명에 따른 인간 인터페론-베타 변이체와 B12항체가 결합된 면역사이토카인을 세포에 48시간 처리한 후 세포독성을 통해 인터페론-베타 활성을 확인한 결과이다(Carbiferon: 인간 인터페론-베타 변이체, B12: B12 항체, ACC#2: 인간 인터페론-베타 변이체와 B12가 결합된 면역사이토카인).
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
벡터 클로닝 및 숙주세포 형질전환
항체 중쇄와 인터페론-베타 변이체가 결합된 면역사이토카인(ACC #2) 과 항체 경쇄와 인터페론-베타 변이체가 결합된 면역사이토카인(ACC #7) 을 cloning 하기 위해, B12의 sequence를 이용하였다. B12 sequence의 중쇄와 경쇄에 각각 링커를 이용하여 인간 인터페론-베타 변이체 서열(서열번호 1에 개시된 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리튜클레오티드)을 삽입한 후 벡터로 합성하였다. 합성된 유전자를 각각에 맞는 제한 효소로 절단하여 보유하고 있는 IgG 발현 벡터에 라이게이션 시킨 후, sequencing 작업을 통해 최종적으로 ACC #2과 #7를 발현하는 벡터를 제작하였다. 클로닝이 완료 된 ACC#2, ACC#7 벡터는 transformation을 통하여 대량으로 추출한 뒤 형질전환에 사용하였다.
CHO-S cell은 3×105 cells/ml 밀도로 5 passage 이상 계대배양을 진행하며 형질전환을 준비하였다. 계대배양이 진행 된 후 세포의 생존률이 90% 이상으로 유지가 되면 5×105 cells/ml 밀도로 세포를 시딩하여 형질전환을 준비하였다. 세포 시딩을 하고 24시간 뒤 생존률(>95%)과 세포 밀도(1×106 cells/ml)를 확인 후 형질전환 용매를 이용하여 50ug DNA을 30ml 배양배지에서 배양중인 CHO-S cell에 형질전환 하였다.
<실시예 2>
숙주세포에서의 면역사이토카인 발현 확인
세포 형질전환 후 48 시간이 지나고, 농도 측정 (BCA assay) 및 웨스턴-블롯으로 ACC #2, #7의 발현양을 확인하였다.
BCA assay의 경우, 시약 A (Sodium carbonate, Bicinchoninic acid 등 포함)와 시약 B (4 % cupric sulfate 포함)를 50 : 1의 비율로 제조하여 standard 용액 (BSA 용액, 0~2000 ug/mL) 및 시료와 섞었다(10 ul의 sample과 200 ul의 reagent). 이 용액을 37 ℃에 30 분간 인큐베이션 한 후 562 nm에서 흡광도를 재어 농도를 계산하였다. 농도 계산에는 표준용액을 바탕으로 얻은 curve를 이용하였다.
웨스턴-블롯 실험은 다음과 같이 진행하였다. 우선, 배양한 각 배지를 모아 10 % SDS PAGE로 내렸다. 내린 gel을 PVDF membrane에 이동 한 다음, 5 % BSA 용액에 블로킹하고 1, 2차 항체를 붙였다. TBST 용액으로 세척까지 완료한 후에, 필름으로 membrane을 찍는다. Developer와 fixer로 필름의 이미지를 현상하였다.
그 결과, B12의 중쇄와 경쇄에 천연형 인간 인터페론이 접합된 면역사이토카인에 비해 인간 인터페론-베타 변이체가 접합된 면역사이토카인의 발현양이 많음을 알 수 있었다(도 1 및 2).
<실시예 3>
pSTAT-1의 인산화를 통한 면역사이토카인의 인터페론 활성 확인
본 발명에 따른 인간 인터페론-베타 변이체와 B12항가 접합된 면역사이토카인의 인터페론 기능을 확인하기 위하여 인터페론 혹은 항체-인터페론 접합체 처리에 따른 STAT-1의 인산화여부를 검증하였다.
6-well plate의 각 well에 3x105개의 OVCAR-3 세포를 분주한 뒤 24시간 동안 37. 5°C, 5% CO2 환경에서 배양하였다. 24시간 이후 세포 배양액을 제거하고 인간 인터페론-베타 변이체(carbiferon 600ng/ml, 인간 인터페론-베타 변이체와 B12 항체가 접합된 면역사이토카인(ACC) 600ng/ml 또는 1800ng/ml의 농도가 되도록 배양액에 희석하여 1시간 동안 처리하였다. 이 후 plate를 수거하여 각 well을 PBS로 3회 세척한 뒤 프로티아제 저해제와 포스파테이즈 저해제가 포함된 RIPA 버퍼 100μl를 처리하여 30분 동안 Ice 상에 두어 세포를 용해시켰다. 용해된 세포를 1.5ml 튜브에 담아 13000rpm, 4°C 조건으로 원심분리하여 상층액(용해물)만 수거한 뒤 새로운 튜브에 모았다. BCA정량법을 이용하여 용해물의 단백질 농도를 정량한 뒤 30μg의 용해물을 채취하여 5x sample buffer와 섞고, 100℃에서 10분간 끓여주어 단백질이 충분히 변성 되도록 유도하였다. 준비된 샘플을 마커(Marker)와 함께 10% SDS-PAGE 겔에 로딩하고 70 voltag로 30분, 120 voltage로 1시간 동안 내려주었다. 이후 겔을 조심스럽게 분리하여 3M 페이퍼 위에 두고 그 위에 PVDF(polyvinylidene difluoride) 막을 둔 뒤 다시 3M 페이퍼를 덮어주고 트랜스퍼 버퍼에 담가 100 볼트로 90분간 단백질 트랜스퍼를 진행하였다. 5%의 BSA가 포함된 Tris-buffered saline-Tween 20(TBS-T, 0.1% Tween20)에 막을 1시간 30분동안 블락킹 한 뒤 Anti-p-STAT1 항체의 경우 TBS-T에 1:1000으로 희석하여 준비하였고, anti-GAPDH항체의 경우 TBS-T에 1:3000으로 희석하여 준비하였다. 막을 항체 희석물에 담가 상온에서 2시간동안 흔들어주며 반응시켰다. 이 과정이 끝나면 10분 동안 3번씩 TBS-T로 닦아주고 상온에서 호스래디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase; HRP)가 결합된 이차 항체를 첨가하여 1시간 동안 반응하였다. 다시 한번 세척과정을 수행한 후, 밴드를 ECL 시약(enhanced chemiluminescence reagent, Intron을 처리한 뒤 필름에 현상하였다.
그 결과, 인간 인터페론-베타 변이체(carbiferon) 및 면역사이토카인 처리군에서 모두 pSTAT-1의 인산화가 나타나 인간 인터페론-베타 변이체(carbiferon)와 B12항체가 접합된 면역사이토카인에서 인터페론-베타의 활성이 그대로 나타남을 확인하였다(도 3).
<실시예 4>
세포독성실험 통한 면역사이토카인의 인터페론 활성 확인
본 발명에 따른 인간 인터페론-베타 변이체와 B12항가 접합된 면역사이토카인의 인터페론 기능을 확인하기 위하여 인터페론 혹은 항체-인터페론 접합체 처리에 따른 세포독성 여부를 확인하였다.
세포독성을 확인하기 위하여 96-well plate의 각 well에 1x104개의 OVCAR-3 세포를 분주한 뒤 24 시간 동안 37. 5°C, 5% CO2 환경에서 배양하였다. 24시간 이후 세포 배양액을 제거하고 인간 인터페론-베타 변이체(carbiferon), B12 항체 및 면역사이토카인을 10~10000ng/ml 농도로 처리한 뒤 24시간 혹은 48시간 동안 배양하였다. 24시간 혹은 48시간 배양한 뒤 배양액을 제거하고 PBS 워시를 2회 진행한 뒤 WST시약을 1:10으로 배양액에 섞어 각 well당 100μl씩 처리한 뒤 2시간 동안 37. 5°C, 5% CO2 환경에서 방치한 뒤 430nm파장에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, B12 항체만을 처리한 세포군에서는 세포독성이 나타나지 않았으나 인간 인터페론-베타 변이체 및 면역사이토카인을 처리한 세포군에서는 세포독성이 농도 의존적으로 나타나는 것으로 보아, 인간 인터페론-베타 변이체가 면역사이토카인의 형태로도 여전히 인터페론 활성을 나타냄을 확인하였다(도 4 및 5).
본 발명에 따른 인간 인터페론-베타 변이체가 접합된 면역사이토카인의 경우, 천연형 인터페론-베타보다 우수한 인터페론 활성 및 특정 항원을 인식하는 항체의 특성이 모두 나타난다는 점에서 다발성 경화증, 암 등의 질환에 대한 표적치료제로 사용될 수 있으며, 천연형 인터페론-베타가 접합된 면역사이토카인과 비교해 그 생산효율이 현저히 높다는 점에서 산업상 이용가능성이 우수하다.
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145 150 155 160 Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 165 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 2 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 3 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 <210> 4 <211> 627 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunocytokine 1 <400> 4 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Ser His Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Ala Arg Val Cys Thr Pro Lys Arg Cys Tyr Ser Tyr Asp 100 105 110 Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 125 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 130 135 140 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 165 170 175 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 180 185 190 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 195 200 205 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 210 215 220 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 225 230 235 240 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 245 250 255 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 260 265 270 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 275 280 285 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 290 295 300 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 305 310 315 320 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 325 330 335 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 340 345 350 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 355 360 365 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 370 375 380 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 385 390 395 400 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 405 410 415 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 420 425 430 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 435 440 445 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Ser Tyr 450 455 460 Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys 465 470 475 480 Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Thr Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg 485 490 495 Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln 500 505 510 Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe 515 520 525 Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile 530 535 540 Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys 545 550 555 560 Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys 565 570 575 Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His 580 585 590 Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg 595 600 605 Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr 610 615 620 Leu Arg Asn 625 <210> 5 <211> 386 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunocytokine 2 <400> 5 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ala Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asn Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 145 150 155 160 Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 180 185 190 Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205 Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Asn 210 215 220 Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu 225 230 235 240 Leu Trp Gln Leu Asn Gly Thr Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met 245 250 255 Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys 260 265 270 Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala 275 280 285 Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val 290 295 300 Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr 305 310 315 320 Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu 325 330 335 Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr 340 345 350 Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val 355 360 365 Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu 370 375 380 Arg Asn 385

Claims (10)

  1. (a) 서열번호 4의 463번째 내지 627번째 아미노산 서열을 포함하며, 천연형 인간 인터페론-베타의 27번째 아미노산에 대응되는 서열번호 4의 488번째 아미노산이 세린에서 트레오닌으로 치환된 인간 인터페론-베타 변이체; 및 (b) 상기 인간 인터페론-베타 변이체에 결합된 항체를 포함하는 면역사이토카인(immunocytokine)으로서,
    상기 인간 인터페론-베타 변이체는 인간 인터페론-베타 활성을 지니는 폴리펩티드로서, 천연형 인터페론-베타에 추가로 당쇄가 도입되어, N-연결형 당쇄를 포함하는 폴리펩티드인 면역사이토카인(immunocytokine).
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체는 종양성 항원에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 면역사이토카인.
  3. 제1항에 있어서, 상기 인간 인터페론-베타 변이체는 펩타이드 링커에 의해 상기 항체에 결합되어 있는 면역사이토카인.
  4. 제3항에 있어서, 상기 링커는 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역사이토카인.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 인터페론-베타 변이체 폴리펩티드의 아미노산 서열은 상기 항체의 아미노산 서열에 대해 중쇄 C-말단, 경쇄 C-말단 또는 중쇄 및 경쇄 C-말단에 있는 것을 특징으로 하는 면역사이토카인.
  6. 제1항에 있어서, 상기 면역사이토카인은 서열번호 4 또는 서열번호 5 의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역사이토카인.
  7. 제1항의 면역사이토카인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  8. 제7항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  9. 제8항의 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  10. (a) 제9항의 숙주 세포를 제공하는 단계;
    (b) 제공된 세포를 배양하는 단계; 및
    (c) 상기 세포 또는 배양 배지로부터 면역사이토카인을 회수함으로써 면역사이토카인을 제조하는 단계를 포함하는 면역사이토카인 제조방법.
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