TW202035440A - 新穎合理設計的蛋白質組合物 - Google Patents

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Abstract

提供涉及或來自於合理設計的融合蛋白組合物的新組合物和方法，將治療抗體與IL2突變體結合，可以增強抗腫瘤免疫力或去腫瘤相關免疫抑制，同時通過IL2直接啟動效應細胞而不啟動Treg 。該融合蛋白可以用於預防或治療癌症。

Description

新穎合理設計的蛋白質組合物
無
IL2
白細胞介素-2（IL2）是一種細胞激素，在免疫系統的休眠和啟動狀態中發揮核心作用。在休眠階段，IL2主要確保CD4+ Foxp3+ 調節T細胞（Treg s）的發育和存活。然而，在免疫反應中，其促進效應T細胞和記憶T細胞以及自然殺手（NK）細胞的增殖和擴增。它還增強這些細胞的效應功能。IL2由多種細胞（CD8+ T細胞、NK和NKT細胞、樹突狀細胞和肥大細胞）啟動分泌，但它主要來自於CD4+T細胞；並且它可以以自分泌或旁分泌方式作用。
三條多肽鏈參與構成IL2受體，當置於不同組合中時（表1），以不同親和力結合IL2。受體的生物學重要類型可以通過其對IL2的親和力進行區分：低親和力（僅CD25）、中親和力（βγ）和高親和力（αβγ）。CD122和普通γ鏈對於基於IL2結合的訊號傳遞是必要的，然而CD25增加受體親和力卻似乎不影響訊號傳遞。表 1 基於亞單位組合的IL2受體
亞單位 IL2 結合（ Kd ） IL2 訊號
CD25 (α)                       （低親和力） 10-8 M -
CD122 (
Figure 02_image002
)		 10-7 M -
γ（普通γ鏈） 不可檢測 -
αβ 10-10 M -
αγ 10-8 M -
βγ                                  （中親和力） 10-9 M +
αβγ                                （高親和力） 10-11 M +
IL2的不同功能主要是不同IL2受體亞單位在不同細胞類型上的不同表現的結果。在休眠的免疫細胞上，CD25主要局限在Treg s，其也表現其它IL2受體亞單位，因此使它們在休眠狀態時成為少量IL2的主要靶點。在效應T細胞上，CD25在近期啟動的T細胞上被上調，同時伴有CD122的量輕微升高，而普通γ鏈表現相對不變，導致在擴增階段對IL2升高的敏感性以及高依賴性。在免疫反應的後期階段，記憶CD8+T細胞和NK細胞表現非常大量的CD122和γ鏈，讓它們和Treg s競爭IL2。
考慮到IL2普通T細胞生長因子的功能，其作為癌症免疫療法已經用於臨床數十年。然而，考慮到受體的表現類型，需要高劑量IL2來充分啟動載有中親和力受體的效應T和NK細胞，以抵消其對載有高親和力受體的Treg 細胞的作用。另一個IL2施用的問題是其在血液中的半衰期小於30分鐘，因此需要持續輸注或反復注射以維持足夠高的滴度以產生治療效果。高劑量方案引起很多副作用，包括肺水腫（由於肺上皮細胞的CD25表現）、低血壓、血管滲漏綜合征等。此外，患者Treg 細胞擴增對抗腫瘤反應構成持續的威脅。
為了規避IL2治療的這些局限性，化學修飾，例如，PEG化被用於降低或改變IL2的受體選擇性以及延長其半衰期。另一種方法是使用特定抗IL2抗體與IL2形成複合物以達到對CD122表現細胞的優先標靶。但是，這兩種方式目前除面臨生產挑戰外，還面臨有限的臨床成功。或者，IL2的突變體優先結合CD122或不再結合CD25，允許效應T細胞更好地與Treg 細胞競爭IL2。然而，這些分子還是具有與野生型IL2一樣的短的半衰期，因此需要重複輸注。檢查點抗體
在正常生理狀況下，免疫檢查點是為維持自我耐受以及在免疫系統對感染反應以保護組織免受損害而演變來的分子途徑。腫瘤通過錯誤表現免疫檢查點蛋白來共同選擇這些途徑，形成免疫抑制環境並躲避免疫系統。在過去十年，阻斷CTLA-4和PD1/PDL1途徑的抗體顯示逆轉腫瘤相關免疫抑制，並證明在臨床上是極其成功的。但是，儘管它們具有前景，這些抗體只在一小部分患者中有效，原因目前尚不完全明確。因此，需要更好地瞭解預測生物標記物和可以與檢查點抗體聯用的療法。
本發明通過使用合理設計的融合蛋白組合物應對上述挑戰，該組合物可以增強抗腫瘤免疫力或去抑制腫瘤相關免疫抑制的同時通過IL2直接啟動效應細胞，而不啟動Treg 。本發明的融合蛋白包含免疫檢查點抗體的部分或全部，以及突變的白細胞介素2（IL2）多肽。本發明的融合蛋白可以單獨或者與（a）標靶至少另一種免疫抑制途徑的抗體；（b）化療、標靶治療或放射治療；（c）阻斷免疫抑制途徑的另一種機制，例如，核酸適配體或RNAi；或（d）另一種免疫治療藥物，例如，細胞激素、標靶治療等聯合，用於治療腫瘤。
在一方面，本發明提供了一種融合蛋白，結合免疫檢查點抗體（下文也稱為抗檢查點抗體或抗-CP抗體）和對高親和力受體選擇性更低的IL2突變體（或可稱為，中親和力受體選擇性突變體，MutIL2）。該融合蛋白由在重鏈的C端連接了MutIL2的完整的抗-CP抗體組成（圖1A）。這種方式將在重鏈的C端和MutIL2之間增加一個連接子序列。另外，該抗體Fc部分的存在，允許使用Fc新生受體途徑延長融合蛋白的半衰期幾個數量級。此外，腫瘤標靶抗體的存在將有助於優先遞送IL2進入腫瘤並減少全身副作用。
在一個特徵中，抗CP抗體是抗PDL1抗體。優選地，抗PDL1抗體有以下一個或多個特徵，可以增加融合蛋白的抗腫瘤能力：（a）以Kd>100 nM 將PDL1與純化的蛋白結合，同樣可以Kd >100 nM將PDL1與細胞表面表現的蛋白結合；（b）體外阻斷PDL1-PD1相互作用；和（c）在啟動的PBMC培養基中去PDL-1介導的效應T細胞抑制。
在一個實施方案中，抗PDL1抗體是沒有、減弱或增強ADCC和/或CDC功能的任何可獲得類型或Fc區任何已知突變形式的抗體。在一個優選的實施方案中，抗PDL1抗體是IgG1型抗體。在一些實施方案中，抗PDL1抗體包含一對重鏈可變區和輕鏈可變區，其各自對應的序列基本上由以下：（a）SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 6；（b）SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 12；或（c） SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 18組成。在一些實施方案中，抗PDL1抗體進一步包含第二對重鏈和輕鏈可變區，和第一對的重鏈和輕鏈可變區序列基本相同。在其它實施方案中，抗PDL1抗體包含一對重鏈和輕鏈，其各自對應的序列基本上由以下：（a）SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 5；（b）SEQ ID NO: 8和SEQ ID NO: 11；或（c）SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 17組成。
在一個特徵中，MutIL2有以下一個或兩個特徵，可以增加融合蛋白的抗腫瘤能力：（a）降低啟動CTLL2及人和小鼠Treg 的能力同時保留啟動效應T細胞或NK細胞的能力；和（b）相比野生型IL2，啟動Teff /Treg 的相對能力增加至10倍-1000倍以上。在進一步的實施方案中，MutIL2包含胺基酸序列，與選自由以下所組成之群組：SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57及其組合的胺基酸序列基本相同。
在一個特徵中，連接子序列是靈活的絲胺酸-甘胺酸連接子或其它已知的變體或連接子。在一個實施方案中，連接子序列是SEQ ID NO: 19。
在一個特徵中，融合蛋白包含：抗原結合部位和突變的白細胞介素2（IL2）多肽，其中抗原結合部位包含抗PDL1抗體的部分或全部，抗原結合部位包括一對重鏈和輕鏈，其各自相應的序列基本由以下：（a）SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 5；（b）SEQ ID NO: 8和SEQ ID NO: 11組成；突變的IL2多肽包括胺基酸序列，與選自由以下所組成之群組：SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 27的胺基酸序列基本相同；突變的IL2多肽連接於重鏈的C端。在一個特徵中，突變的IL2多肽通過包含SEQ ID NO: 19的連接子序列連接於重鏈的C端。
在另一個實施方案中，融合蛋白的另一種分子包含一個或多個突變的胺基酸，去除蛋白水解位點以提高產量。在另一個實施方案中，融合蛋白的另一種分子包含一個或多個突變的胺基酸，去除糖基化位點而不改變蛋白質功能以生成更均一的產品。在另一個實施方案中，融合蛋白的另一種分子包含可選的分泌序列代替自然分泌序列，以促進分泌。
在另一個方面，本發明提供一種融合蛋白，結合免疫檢查點抗體（抗CP抗體）和對高親和力受體選擇性較低的IL2突變體（或稱為，中親和力受體選擇性突變體，MutIL2），該融合蛋白是雙特異性設計，第一條臂對應抗CP抗體，和第二條臂由MutIL2組成融合在Fc部分（圖1B）。另外，該蛋白Fc部分的存在允許使用Fc新生受體途徑延長融合蛋白的半衰期幾個數量級。
在一個特徵中，抗CP抗體是抗PDL1抗體。優選地，抗PDL1抗體有以下一個或多個特徵，可以增加融合蛋白的抗腫瘤能力：（a）以Kd >100 nM將PDL1與純化蛋白結合，同樣可以Kd >100 nM將PDL1與細胞表面表現的蛋白結合；（b）阻斷體外PDL1-PD1相互作用；和（c）在啟動的PBMC培養基中，去PDL1介導的效應T細胞抑制。
在一個實施方案中，雙特異抗體是沒有、降低或增強ADCC和/或CDC功能的任何可獲得類型或Fc區任何已知突變形式的抗體。在一個優選的實施方案中，雙特異抗體是IgG1型抗體。在一些實施方案中，雙特異抗體的第一條臂包含一對重鏈可變區和輕鏈可變區，其各自對應的序列基本上由以下：（a）SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 6（b）SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 12；或（c）SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 18組成。在其它的實施方案中，抗PDL1抗體包含一對重鏈和輕鏈，其各自對應的序列基本上由以下：（a）SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 5；（b）SEQ ID NO: 8和SEQ ID NO: 11；或（c）SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 17組成。
在一個特徵中，MutIL2有以下一個或兩個特徵，可以增加融合蛋白的抗腫瘤能力：（a）降低啟動CTLL2及人和小鼠Treg 的能力，同時保留啟動效應T細胞或NK細胞的能力；和（b）相比野生型IL2，啟動Teff /Treg 的相對能力增加至10倍-1000倍以上。在進一步的實施方案中，MutIL2包含胺基酸序列，與選自由以下所組成之群組：SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57及其組合的胺基酸序列基本相同。
在另一個實施方案中，融合蛋白的另一種分子包含一個或多個突變的胺基酸，去除蛋白水解位點以提高產量。在另一個實施方案中，融合蛋白的另一種分子包含一個或多個突變的胺基酸，去除糖基化位點而不改變蛋白質功能以生成更均一的產品。在另一個實施方案中，融合蛋白的另一種分子包含可選的分泌序列代替自然分泌序列，以促進分泌。
在另一方面，本發明還提供一種融合蛋白，是一種多肽，由抗原結合多肽和對高親和力受體選擇性較低的IL2突變體（或稱為，中親和力受體選擇性突變體、MutIL2）（圖2）組成。例如，這種方式將在這兩個部分之間添加一個連接子序列。該多肽是一種更小的分子，可以在腫瘤標靶的細菌中表現。在一些實施方案中，該抗原結合多肽選自由抗CP scFv、配體或配體部分組成的組。在一些實施方案中，抗CP scFv是抗PDL1 scFv。在一些實施方案中，配體是PD1或CTLA4。在一些實施方案中，抗原結合多肽選自由免疫治療抗體組成的組，例如：抗GD2、抗TGFbeta、抗CD47、抗OX40、抗IBB或和本發明的MutIL2協同作用的免疫治療抗體。
在一個特徵中，MutIL2有以下一個或兩個特徵，可以增加融合蛋白的抗腫瘤能力：（a）降低啟動CTLL2及人和小鼠Treg 的能力同時保留啟動效應T細胞或NK細胞的能力；和（b）相比野生型IL2，啟動Teff /Treg 的相對能力增加至10倍-1000倍以上。在進一步的實施方案中，MutIL2包含胺基酸序列，與選自由以下所組成之群組：SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57及其組合的胺基酸序列基本相同。
在一個特徵中，連接子序列是靈活的絲胺酸-甘胺酸連接子或其它已知的變體或連接子。在一個實施方案中，連接子序列是SEQ ID NO: 19。
在另一個實施方案中，融合蛋白的另一種分子包含一個或多個突變的胺基酸，去除蛋白水解位點以提高產量。在另一個實施方案中，融合蛋白的另一種分子包含一個或多個突變的胺基酸，去除糖基化位點而不改變蛋白質功能以生成更均一的產品。在另一個實施方案中，融合蛋白的另一種分子包含可選的分泌序列替代自然分泌序列，以促進分泌。
在另一個方面，本發明提供一種基因工程蛋白，包含治療蛋白，例如，腫瘤標靶藥物，融合或連接中親和力受體選擇性的IL2多肽突變體。在一些實施方案中，該治療蛋白是治療抗體、腫瘤標靶抗體、腫瘤抗原結合多肽或腫瘤標靶寡核苷酸，例如，核酸適配體或小分子。在一些實施方案中，腫瘤標靶抗體是免疫檢查點抗體。在一些實施方案中，本發明提供一種基因工程蛋白，包含治療蛋白和突變的白細胞介素2（IL2）多肽。在一些實施方案中，治療蛋白是治療抗體或腫瘤抗原結合多肽。在一些實施方案中，腫瘤標靶抗體或治療抗體是抗PD-L1抗體、抗CD19抗體、抗MUC1抗體、抗CD22抗體、抗HER2抗體、抗CD20抗體、抗CD80抗體、抗BCMA抗體、抗EGFR抗體、或抗間皮素抗體。腫瘤標靶藥物可以幫助遞送IL2進入腫瘤並減少全身副作用。突變的IL2可以直接啟動效應細胞增強腫瘤標靶藥物的抗腫瘤活性。
在一個特徵中，MutIL2有以下一個或兩個特徵，可以增加融合蛋白的抗腫瘤能力：（a）降低啟動CTLL2及人和小鼠Treg 的能力，同時保留啟動效應T細胞或NK細胞的能力；和（b）相比野生型IL2，啟動Teff /Treg 的相對能力增加至10倍-1000倍以上。在進一步的實施方案中，MutIL2包含胺基酸序列，與選自由下列所組成之群組：SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57及其組合的胺基酸序列基本相同。
在另一個方面，本發明提供藥物組合物，包括上述任何融合蛋白。該藥物組合物進一步包括藥學上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑。
在一個相關的方面，本發明提供了一種用於治療有需要的受試者的病理狀況的方法，所述方法包括向所述受試者施用治療有效量的本發明公開的融合蛋白。該方法可以進一步包括施用第二種不同的治療抗體，抗至少一種指示所述狀況的細胞表面抗原。該治療的狀況可以是哺乳動物癌症、感染等等。
優選地，所治療的哺乳動物癌症的範圍選自由以下所組成之群組：卵巢癌、結腸癌、乳腺癌、肺癌、骨髓瘤、神經母細胞源性中樞神經系統腫瘤、單核球白血病、B細胞白血病、T細胞白血病、B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、肥大細胞腫瘤、黑色素瘤、膀胱癌、胃癌、肝癌、尿路上皮癌、皮膚癌、腎癌、頭頸部癌、胰腺癌以及上述癌症的組合。在一些實施方案中，所治療的哺乳動物癌症範圍選自由以下所組成之群組：黑色素瘤、肺癌、腎癌、頭頸部癌、胃癌、淋巴瘤、卵巢癌、結腸癌、乳腺癌、肺癌、骨髓瘤、腦瘤、白血病、淋巴瘤、膀胱癌、肝癌、尿道上皮癌、皮膚癌、胰腺癌以及上述癌症的組合。
在另一方面，本發明提供了一種用於預防性治療有需要的受試者的類似狀況的方法，所述方法包括向所述受試者施用預防有效量的本發明的藥物組合物。該方法可以進一步包括施用針對所述狀況的疫苗的步驟。在一個實施方案中，該狀況是癌症。
在另一方面，本發明提供了一種哺乳動物表現系統，產生上述融合蛋白。
實施例1
抗PDL1輕鏈（IgL）和融合MutIL2的抗PDL1重鏈（IgH）被轉殖入帶有兩個表現盒的單一真核生物表現載體- pCHO 1.0載體。其它類似的載體是可商購的。另外，這兩個基因可以轉殖在不同的載體上。根據生產商的推薦，該載體被轉染入Expi293細胞。蛋白質分泌入上清液，並使用HiTrap蛋白A柱，經標準流程，純化至>95%純。比較純化蛋白和野生型IL2，優先啟動Teff 細胞相比於Treg 細胞的能力。本申請中，使用抗PDL1抗體和特定MutIL2命名融合蛋白。例如，E1M1包含E1抗體和MutIL2 IL2M1。
實施例2
為測試蛋白結合細胞表面PDL1的能力，我們使用DLD1細胞表現轉基因表現的人PDL1。類似結果可以從其它細胞株的轉基因表現，或通過使用天然表現PDL1或經干擾素γ治療後誘導表現PDL1的細胞獲得。簡言之，在4°C，105 細胞以不同濃度的蛋白培養30分鐘。以PBS沖洗細胞，4°C下，以抗人IgG螢光抗體培養30分鐘。再次以PBS沖洗細胞並以FACS檢測結合。圖3顯示具有不同IL2突變的融合蛋白不影響它們的PDL1結合（表2）。表 2 IL2 融合蛋白與細胞表面 PDL1 結合的 EC50
  平均值（pM） SD
E1 1958 297
E1WT 2006 1236
E1M1 2444 782
E1M2 3204 1294
B2WT 1482 -
B2M1 688 -
B2M2 1427 -
類似地，為了測試抗體部分阻斷PD1-PDL1相互作用的能力，在兩種不同的ELISA形式中進行受體阻斷試驗-以生物素化的Fc-PDL1結合PD1包被的試驗板或以生物素化的Fc-PD1結合PDL1包被的試驗板。兩種試驗中，使用鏈黴親和素連接的辣根過氧化物酶檢測結合。表3顯示示例的PDL1抗體顯示出阻斷PD1-PDL1相互作用的高效力。表 3 抗 PDL1 抗體阻斷 PD1-PDL1 結合的 IC50
  PD1 包被 PDL1 包被
E1 1.26 nM 1.53 nM
B2 1.39 nM 0.80 nM
E3 92.74 nM 16.57 nM
實施例3
為了測試ADCC活性，我們使用了市售的ADCC套組（Promega），該套組依賴含Fc受體-反應螢光素酶基因的Jurkat細胞。將這些細胞和PDL1+ MDA-MB-231細胞共同培養，ADCC+抗體觸發Fc受體反應，可以作為螢光素酶活性測量。圖4顯示本發明的多種融合蛋白具有ADCC活性。
實施例4
為了測試突變蛋白在CTLL2細胞上結合IL2受體的能力，4°C 下，105 細胞和不同濃度的突變蛋白一起培養30分鐘。以PBS沖洗細胞，並在4°C 下，與抗人IgG螢光抗體培養30分鐘。再次以PBS沖洗細胞，並通過FACS檢測結合。圖5顯示，與具有野生型IL2的融合蛋白相比，具有不同IL2突變體的融合蛋白顯示與CTLL2細胞上高親和力IL2受體結合顯著降低。
實施例5
為了測試突變蛋白啟動CTLL2細胞（替代Treg 細胞）的能力，104 細胞在存在不同濃度的突變或野生型IL2融合蛋白下培養44小時。通過培育物與AlamarBlue培養1-4小時，並使用螢光板讀數器測量螢光強度，確定相對活細胞計數。圖6顯示，與具有野生型IL2的融合蛋白相比，具有不同IL2突變體的融合蛋白顯示，其促進CTLL2細胞增殖的能力降低超過100倍（表4）。對於包含任一種PDL1抗體的融合蛋白都是如此。野生型融合蛋白與重組IL2相當。表 4 IL2 融合蛋白促進 CTLL2 增殖的 EC50
  均值 （ pM ） SD
E1WT 29 6
E1M1 19520 707
E1M2 9753 3779
B2WT 88 6
B2M1 9901 5156
B2M2 3312 189
實施例6
為了檢測突變蛋白啟動多種小鼠T細胞亞組的能力，我們使用多種來源的細胞。根據生產商的建議，使用基於磁珠的幹細胞技術的細胞分離套組，將小鼠脾臟或淋巴結分離出CD4、CD8或調節T細胞。用全脾細胞進行小鼠NK細胞試驗。其它分離程式可商購。人T細胞亞組和NK細胞由商購，但可以使用和用於小鼠細胞的類似的套組，從PBMCs中分離出來。不同細胞種類和不同量的突變或野生型IL2融合蛋白培養。例如，2.5x104 – 105 小鼠T細胞用於小鼠T細胞試驗。對於小鼠NK細胞，則使用1-5 x 106 脾細胞。對於Treg 培養，細胞經試驗板結合抗CD3抗體啟動，並和小鼠IL2中和抗體培養。生長4天後，通過直接計數（伴有或不伴有死亡細胞的碘化丙啶排除）或使用FACS通過CFSE稀釋測量細胞增殖。另外，還評估細胞啟動標記物的表現，例如，小鼠CD8細胞的CD44。圖7顯示了，與野生型IL2融合蛋白相比，具有不同IL2突變體的融合蛋白顯示其啟動和促進Treg 細胞存活的能力顯著下降。圖8和表5顯示IL2突變體融合蛋白與野生型IL2融合蛋白在促進小鼠CD8+T細胞增殖的能力上是相當的。在兩個試驗中，野生型IL2融合蛋白均與重組IL2是相當的。
圖6、圖7和圖8指明，與野生型IL2融合蛋白相比，具有不同IL2突變體的融合蛋白，顯示其啟動Teff /Treg 的相關能力增加超過100倍。表 5 IL2 融合蛋白促進小鼠 CD8 T 細胞存活和增殖的 EC50
  均值 （ pM ） SD
E1WT 8095 1052
E1M1 7654 2348
E1M2 7947 1197
B2WT 5921 1461
B2M1 4875 1604
B2M2 7651 1969
實施例7
為了檢測突變蛋白啟動多種人T細胞亞組的能力，我們使用來自健康供體外周血的細胞。PBMCs經標準流程製備，並與重組IL2或不同IL2結合培養15分鐘。通過對合適的細胞標誌物染色並經FACS分析，評估在不同T細胞亞群上的IL2受體反應所觸發的Stat5磷酸化。圖9和圖10顯示，相比與野生型IL2融合蛋白，具有不同IL2突變體的融合蛋白顯示其啟動非Treg /Treg 的相關能力顯著升高（大約100倍）（資料同時總結於表6-8）。圖11顯示IL2突變體融合蛋白與野生型IL2融合蛋白誘導CD8+T細胞中Stat5磷酸化的能力相當（資料同時總結於表9）。對比與野生型IL2融合蛋白，具有不同IL2突變體的融合蛋白顯示其啟動CD8+T細胞/Treg CD4+的相關能力顯著升高（大約1000倍）（參見表10）。各試驗中，野生型IL2融合蛋白與重組IL2相當。這些資料顯示具有不同IL2突變體融合蛋白，其啟動人Treg 的能力降低，同時維持其啟動效應T細胞的能力，並且，顯示，相比野生型IL2融合蛋白，其啟動Teff /Treg 的相關能力增加100倍以上。表 6 IL2 融合蛋白在 Treg （ CD4+ CD25high ）細胞內對 Stat5 磷酸化的 EC50
  中位數 （ pM ） 範圍 （ pM ）
IL2 0.46 0.16 -0.9
E1WT 0.36 0.2-0.39
E1M1 148.9 108 - 184
E1M2 198.5 128 - 202
B2WT 0.25 0.07 - 0.3
B2M1 91.2 53  -148
B2M2 146.0 89 - 198
表 7 IL2 融合蛋白在非 Treg （ CD4+ CD25+ ）細胞內對 Stat5 磷酸化的 EC50
  中位數 （ pM ） 均值 （ pM ）
IL2 47.0 33-217
E1WT 34.9 23 -61
E1M1 198.1 152  - 336
E1M2 207.3 188  - 340
B2WT 27.7 14  - 36
B2M1 83.8 80  - 94
B2M2 141.0 119 – 145
表 8 各種 IL2 融合蛋白在非 Treg 和 Treg CD4+ 之間的 EC50 比率
  比率
IL2 102
E1WT 96
E1M1 1.3
E1M2 1.0
B2WT 111
B2M1 0.9
B2M2 1.0
表 9 IL2 融合蛋白在 CD8+ 細胞內對 Stat5 磷酸化的 EC50
  中位數 （ pM ） SD
IL2 1236 536
E1WT 258 92
E1M1 522 66
E1M2 520 199
B2WT 303 234
B2M1 342 221
B2M2 370 212
表 10 各種 IL2 融合蛋白在 CD8+ 細胞和 Treg CD4+ 之間的 EC50 比率
  比率
IL2 2686
E1WT 714
E1M1 4
E1M2 3
B2WT 1216
B2M1 4
B2M2 3
實施例8
對於PK研究，將測試融合蛋白，以0.1-10 mg/kg的劑量，通過尾靜脈，靜脈注射入雌性純合Tg32小鼠（6-8周齡），每組5只動物。多個時間點採血，並通過離心製備血清。通過ELISA夾心法測量融合蛋白量。滴度歸一化至注射後第一天。
圖12顯示了四種MutIL2融合蛋白的藥代動力學。這些融合蛋白的半衰期顯示在表11中。比所報導的重組IL2的半衰期顯著延長數小時。表 11 ：多種 MutIL2 融合蛋白的血清半衰期
  E1M1 E1M2 B2M1 B2M2
半衰期（天） 1.563 1.383 1.196 1.139
實施例9
對於小鼠PK和毒理學研究，將測試抗體以0.1-10 mg/kg的劑量，通過尾靜脈注射入野生型B6小鼠，並觀察數天免疫啟動和不良反應。多日採血評估T細胞和NK細胞區域的擴增。觀察結束時，犧牲小鼠，脾臟用類似的方式分析，肺臟和肝臟用來評估淋巴細胞浸潤和其它免疫反應。
圖13顯示，相對於CD4+ 細胞，NK和CD8+ T細胞區域有大量擴增。本發明的各種突變形式的IL2融合蛋白有區別地誘導CD8+T細胞和NK細胞相對於Treg 細胞優先增殖的能力表明了該融合蛋白在提高檢查點抗體抗腫瘤活性及其在癌症治療中臨床運用的極大潛力。
實施例10
為了檢測融合蛋白的腫瘤標靶，使用同源腫瘤（例如B6小鼠中的MC38）或表現人PDL1的同源腫瘤。典型地，1x106 腫瘤細胞經皮下移植，並讓其生長至達到100 mm2 。將融合蛋白以0.1-10 mg/kg注射入小鼠。在不同時間點獲取腫瘤組織和其它器官，通過ELISA夾心法或免疫組化法確定融合蛋白的累積量。或者，使用放射性標記蛋白並使用標準方法檢測。序列
構成本發明融合蛋白一部分的序列的實例列於下方。
阻斷PD1-PDL1相互作用的抗PDL1抗體的全長序列和可變區序列的實例描述如下。示例的DNA序列也描述如下。基於使用可替代密碼子的DNA序列其它變體在本發明中可供選擇。
PDL1 抗體
B2 重鏈
DNA序列（SEQ ID NO:1） ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTCGCGATTCTTAAGGGTGTCCAGTGCGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTTAGTGACTATGACATGATCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGAGTTCTTTGGTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAGCTTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGCGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
蛋白序列
全長（SEQ ID NO:2） MEFGLSWLFLVAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYDMIWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKEFFGAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
可變區（SEQ ID NO:3） EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYDMIWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKEFFGAFDIWGQGTMVTVSS
B2 輕鏈
DNA序列（SEQ ID NO:4） ATGACTTGGACCCCACTCCTCTTCCTCACCCTCCTCCTCCACTGCACAGGAAGCTTATCCTCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCGGTGGCCTTGGGACAGACAGTCACGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAATTACTATTATGCAAACTGGTTCCAGCTGAAGCCAGGGCAGGCCCCTGTACTTGTCCTCTTTGGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCTACTCGGGAAGCACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGATGACGCTGACTATTACTGTAATTCGCGGGACAGCGGTGGTAATCCTTGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTCAACCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCATGA
蛋白序列
全長（SEQ ID NO:5） MTWTPLLFLTLLLHCTGSLSSSELTQDPAVSVALGQTVTITCQGDSLNYYYANWFQLKPGQAPVLVLFGKNNRPSGIPDRFSGSYSGSTASLTITGAQAEDDADYYCNSRDSGGNPWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
可變區（SEQ ID NO:6） SSELTQDPAVSVALGQTVTITCQGDSLNYYYANWFQLKPGQAPVLVLFGKNNRPSGIPDRFSGSYSGSTASLTITGAQAEDDADYYCNSRDSGGNPWVFGGGTKLTVL
E1 重鏈
DNA序列（SEQ ID NO:7） ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTCGCGATTCTTAAGGGTGTCCAGTGCCAAATCCAGCTGGTACAATCTGGGGCTGAGGTGAAGATGCCTGGGGCCTCAGTGACGATTTCCTGCGAGGCGTCTGGATACAACTTCATCAGCTACTATATACACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATGGGATTCGTCGTCCCTAGTGGTGGTGCCGCAGGCTACACACAGAAGTTCCAGGGCAGACTCACCGTGACCAGGGACACGTCCACGAGCACAGTCTACATGGACCTGAACAGCCTGACATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGTGCGAGAAATGAGTGGTGGCTGGTTTGATTTCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCTTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGCGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
蛋白序列
全長（SEQ ID NO:8） MEFGLSWLFLVAILKGVQCQIQLVQSGAEVKMPGASVTISCEASGYNFISYYIHWVRQAPGQGLEWMGFVVPSGGAAGYTQKFQGRLTVTRDTSTSTVYMDLNSLTSDDTAVYYCVREMSGGWFDFWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
可變區（SEQ ID NO:9） SCEASGYNFISYYIHWVRQAPGQGLEWMGFVVPSGGAAGYTQKFQGRLTVTRDTSTSTVYMDLNSLTSDDTAVYYCVREMSGGWFDFWGQGTLVTVSS
E1 輕鏈
DNA序列（SEQ ID NO:10） ATGGACATGCGCGTGCCCGCCCAGCTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCGCGATGCGACATCGTGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGAAATGATTTAGGCTGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATAGTACTCCTCTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
蛋白序列
全長（SEQ ID NO:11） MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCDIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTPLTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
可變區（SEQ ID NO:12） DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTPLTFGPGTKVDIK
E3 重鏈
DNA序列（SEQ ID NO:13） ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTCGCGATTCTTAAGGGTGTCCAGTGCCAAATCCAGCTGGTACAATCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGTACAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCCGGAGGGGGAGCAGTGGCGGACAATAGTTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGCGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
蛋白序列
全長（SEQ ID NO:14） MEFGLSWLFLVAILKGVQCQIQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGGGAVADNSYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
可變區（SEQ ID NO:15） QIQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGGGAVADNSYWGQGTLVTVSS
E3 輕鏈
DNA序列（SEQ ID NO:16） ATGGACATGCGCGTGCCCGCCCAGCTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCGCGATGCGACATCCGGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGAAATGATTTAGGCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTACAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGCACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCTACAAGATTACAATTACCCTCGAACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
蛋白序列
全長（SEQ ID NO:17） MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCDIRMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDYNYPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
可變區（SEQ ID NO:18） DIRMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDYNYPRTFGQGTKVEIK
連接子的示例序列列於下方：
Ser-Gly 連接子
蛋白序列（SEQ ID NO:19） GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
（a）IL2WT（野生型IL2序列）；（b）IL2Del（20個胺基酸刪除）；以及（c）IL2M1-MNew（MutIL2：具有所需特徵的突變體、這些突變的組合也可以被使用）的示例序列列於下方：
IL2 突變體
IL2WT
DNA序列（SEQ ID NO:20） GGCGCCCCCACATCCTCCAGCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATCTGCTGCTGGATCTGCAGATGATTTTAAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACCCGGATGCTGACCTTCAAGTTCTACATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAGCATTTACAGTGTCTGGAGGAAGAGCTGAAGCCTTTAGAGGAAGTGCTCAATTTAGCCCAGTCCAAGAACTTCCATTTAAGGCCACGTGATTTAATCTCCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAGCTGAAGGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGAGCATCATCTCCACTTTAACCTGA
蛋白序列（SEQ ID NO:21） GAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
IL2Del
DNA序列（SEQ ID NO:22） GGCGCCCCCACATCCTCCAGCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATCTGCTGCTGGATCTGCAGATGATTTTAAACGGCATCAACGCCACCGAGCTGAAGCATTTACAGTGTCTGGAGGAAGAGCTGAAGCCTTTAGAGGAAGTGCTCAATTTAGCCCAGTCCAAGAACTTCCATTTAAGGCCACGTGATTTAATCTCCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAGCTGAAGGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGAGCATCATCTCCACTTTAACCTGA
蛋白序列（SEQ ID NO:23） GAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
IL2M1: F42K, Y45R
DNA序列（SEQ ID NO:24） GGCGCCCCCACATCCTCCAGCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATCTGCTGCTGGATCTGCAGATGATTTTAAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACCCGGATGCTGACCAAGAAGTTCCGCATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAGCATTTACAGTGTCTGGAGGAAGAGCTGAAGCCTTTAGAGGAAGTGCTCAATTTAGCCCAGTCCAAGAACTTCCATTTAAGGCCACGTGATTTAATCTCCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAGCTGAAGGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGAGCATCATCTCCACTTTAACCTGA
蛋白序列（SEQ ID NO:25） GAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTKKFRMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
IL2M2: F42A, Y45R
DNA序列（SEQ ID NO:26） GGCGCCCCCACATCCTCCAGCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATCTGCTGCTGGATCTGCAGATGATTTTAAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACCCGGATGCTGACCGCCAAGTTCCGCATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAGCATTTACAGTGTCTGGAGGAAGAGCTGAAGCCTTTAGAGGAAGTGCTCAATTTAGCCCAGTCCAAGAACTTCCATTTAAGGCCACGTGATTTAATCTCCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAGCTGAAGGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGAGCATCATCTCCACTTTAACCTGA
蛋白序列（SEQ ID NO:27） GAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFRMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
IL2M3: E62R
DNA序列（SEQ ID NO:28） GGCGCCCCCACATCCTCCAGCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATCTGCTGCTGGATCTGCAGATGATTTTAAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACCCGGATGCTGACCTTCAAGTTCTACATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAGCATTTACAGTGTCTGGAGGAAAGGCTGAAGCCTTTAGAGGAAGTGCTCAATTTAGCCCAGTCCAAGAACTTCCATTTAAGGCCACGTGATTTAATCTCCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAGCTGAAGGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGAGCATCATCTCCACTTTAACCTGA
蛋白序列（SEQ ID NO:29） GAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEERLKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
IL2M4: R38A, F42A
DNA序列（SEQ ID NO:30） GGCGCCCCCACATCCTCCAGCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATCTGCTGCTGGATCTGCAGATGATTTTAAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACCGCCATGCTGACCGCCAAGTTCTACATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAGCATTTACAGTGTCTGGAGGAAGAGCTGAAGCCTTTAGAGGAAGTGCTCAATTTAGCCCAGTCCAAGAACTTCCATTTAAGGCCACGTGATTTAATCTCCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAGCTGAAGGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGAGCATCATCTCCACTTTAACCTGA
蛋白序列（SEQ ID NO:31） GAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
IL2M5: R38A, F42A, Y45A, E62A, C125S
DNA序列（SEQ ID NO:32） GGAGCTCCTACCTCCTCCTCCACCAAGAAGACCCAGCTCCAGCTGGAACATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTAAACGGCATCAACAATTACAAGAACCCCAAGCTGACCGCCATGCTGACCGCCAAGTTTGCCATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAGCATTTACAGTGTTTAGAGGAGGCTTTAAAGCCTTTAGAGGAGGTGCTGAATTTAGCCCAGTCCAAGAACTTCCATTTAAGGCCCCGGGATTTAATCTCCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAACTGAAGGGCAGCGAGACCACCTTTATGAGCGAATACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGTCCATCATCTCCACTTTAACCTGA
蛋白序列（SEQ ID NO:33） GAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEALKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMSEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT
IL2M6: R38A, F42K
DNA序列（SEQ ID NO:34） GGCGCCCCCACATCCTCCAGCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATCTGCTGCTGGATCTGCAGATGATTTTAAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACCGCCATGCTGACCAAGAAGTTCTACATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAGCATTTACAGTGTCTGGAGGAAGAGCTGAAGCCTTTAGAGGAAGTGCTCAATTTAGCCCAGTCCAAGAACTTCCATTTAAGGCCACGTGATTTAATCTCCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAGCTGAAGGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGAGCATCATCTCCACTTTAACCTGA
蛋白序列（SEQ ID NO:35） GAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTKKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
IL2M7: R38A, F42A, E62R
DNA序列（SEQ ID NO:36） GGCGCCCCCACATCCTCCAGCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATCTGCTGCTGGATCTGCAGATGATTTTAAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACCGCCATGCTGACCGCCAAGTTCTACATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAGCATTTACAGTGTCTGGAGGAAAGGCTGAAGCCTTTAGAGGAAGTGCTCAATTTAGCCCAGTCCAAGAACTTCCATTTAAGGCCACGTGATTTAATCTCCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAGCTGAAGGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGAGCATCATCTCCACTTTAACCTGA
蛋白序列（SEQ ID NO:37） GAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEERLKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
IL2M8: F42K, Y45R, E62R
DNA序列（SEQ ID NO:38） GGCGCCCCCACATCCTCCAGCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATCTGCTGCTGGATCTGCAGATGATTTTAAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACCCGGATGCTGACCAAGAAGTTCCGCATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAGCATTTACAGTGTCTGGAGGAAAGGCTGAAGCCTTTAGAGGAAGTGCTCAATTTAGCCCAGTCCAAGAACTTCCATTTAAGGCCACGTGATTTAATCTCCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAGCTGAAGGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGAGCATCATCTCCACTTTAACCTGA
蛋白序列（SEQ ID NO:39） GAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTKKFRMPKKATELKHLQCLEERLKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
IL2M9: F42A, Y45R, E62R
DNA序列（SEQ ID NO:40） GGCGCCCCCACATCCTCCAGCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATCTGCTGCTGGATCTGCAGATGATTTTAAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACCCGGATGCTGACCGCCAAGTTCCGCATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAGCATTTACAGTGTCTGGAGGAAAGGCTGAAGCCTTTAGAGGAAGTGCTCAATTTAGCCCAGTCCAAGAACTTCCATTTAAGGCCACGTGATTTAATCTCCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAGCTGAAGGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGAGCATCATCTCCACTTTAACCTGA
蛋白序列（SEQ ID NO:41） GAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFRMPKKATELKHLQCLEERLKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
IL2M10: R38A, F42K, E62R
DNA序列（SEQ ID NO:42） GGCGCCCCCACATCCTCCAGCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATCTGCTGCTGGATCTGCAGATGATTTTAAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACCGCCATGCTGACCAAGAAGTTCTACATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAGCATTTACAGTGTCTGGAGGAAAGGCTGAAGCCTTTAGAGGAAGTGCTCAATTTAGCCCAGTCCAAGAACTTCCATTTAAGGCCACGTGATTTAATCTCCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAGCTGAAGGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGAGCATCATCTCCACTTTAACCTGA
蛋白序列（SEQ ID NO:43） GAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTKKFYMPKKATELKHLQCLEERLKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
IL2DelM3: Del, E62R
DNA序列（SEQ ID NO:44） GGCGCCCCCACATCCTCCAGCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATCTGCTGCTGGATCTGCAGATGATTTTAAACGGCATCAACGCCACCGAGCTGAAGCATTTACAGTGTCTGGAGGAAAGGCTGAAGCCTTTAGAGGAAGTGCTCAATTTAGCCCAGTCCAAGAACTTCCATTTAAGGCCACGTGATTTAATCTCCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAGCTGAAGGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGAGCATCATCTCCACTTTAACCTGA
蛋白序列（SEQ ID NO:45） GAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINATELKHLQCLEERLKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
IL2M3K: E62K
DNA序列（SEQ ID NO:46） GGCGCCCCCACATCCTCCAGCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATCTGCTGCTGGATCTGCAGATGATTTTAAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACCCGGATGCTGACCTTCAAGTTCTACATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAGCATTTACAGTGTCTGGAGGAAAAGCTGAAGCCTTTAGAGGAAGTGCTCAATTTAGCCCAGTCCAAGAACTTCCATTTAAGGCCACGTGATTTAATCTCCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAGCTGAAGGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGAGCATCATCTCCACTTTAACCTGA
蛋白序列（SEQ ID NO:47） GAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEKLKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
IL2M6K: R38A, F42K, E62K
DNA序列（SEQ ID NO:48） GGCGCCCCCACATCCTCCAGCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATCTGCTGCTGGATCTGCAGATGATTTTAAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACCGCCATGCTGACCAAGAAGTTCTACATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAGCATTTACAGTGTCTGGAGGAAAAGCTGAAGCCTTTAGAGGAAGTGCTCAATTTAGCCCAGTCCAAGAACTTCCATTTAAGGCCACGTGATTTAATCTCCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAGCTGAAGGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGAGCATCATCTCCACTTTAACCTGA
蛋白序列（SEQ ID NO:49） GAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTKKFYMPKKATELKHLQCLEEKLKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
IL2M7K: R38A, F42A, E62K
DNA序列（SEQ ID NO:50） GGCGCCCCCACATCCTCCAGCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATCTGCTGCTGGATCTGCAGATGATTTTAAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACCGCCATGCTGACCGCCAAGTTCTACATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAGCATTTACAGTGTCTGGAGGAAAAGCTGAAGCCTTTAGAGGAAGTGCTCAATTTAGCCCAGTCCAAGAACTTCCATTTAAGGCCACGTGATTTAATCTCCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAGCTGAAGGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGAGCATCATCTCCACTTTAACCTGA
蛋白序列（SEQ ID NO:51） GAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEKLKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
IL2M8K: F42K, Y45R, E62K
DNA序列（SEQ ID NO:52） GGCGCCCCCACATCCTCCAGCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATCTGCTGCTGGATCTGCAGATGATTTTAAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACCCGGATGCTGACCAAGAAGTTCCGCATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAGCATTTACAGTGTCTGGAGGAAAAGCTGAAGCCTTTAGAGGAAGTGCTCAATTTAGCCCAGTCCAAGAACTTCCATTTAAGGCCACGTGATTTAATCTCCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAGCTGAAGGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGAGCATCATCTCCACTTTAACCTGA
蛋白序列（SEQ ID NO:53） GAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTKKFRMPKKATELKHLQCLEEKLKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
IL2M9K: F42A, Y45R, E62K
DNA序列（SEQ ID NO:54） GGCGCCCCCACATCCTCCAGCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATCTGCTGCTGGATCTGCAGATGATTTTAAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACCCGGATGCTGACCGCCAAGTTCCGCATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAGCATTTACAGTGTCTGGAGGAAAAGCTGAAGCCTTTAGAGGAAGTGCTCAATTTAGCCCAGTCCAAGAACTTCCATTTAAGGCCACGTGATTTAATCTCCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAGCTGAAGGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGAGCATCATCTCCACTTTAACCTGA
蛋白序列（SEQ ID NO:55） GAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFRMPKKATELKHLQCLEEKLKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
IL2MNew: K35E R38A F42A E61K L72G
DNA序列（SEQ ID NO:56） GGCGCCCCCACATCCTCCAGCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATCTGCTGCTGGATCTGCAGATGATTTTAAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCGAGCTGACCGCCATGCTGACCGCCAAGTTCTACATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAGCATTTACAGTGTCTGGAGAAAGAGCTGAAGCCTTTAGAGGAAGTGCTCAATGGCGCCCAGTCCAAGAACTTCCATTTAAGGCCACGTGATTTAATCTCCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAGCTGAAGGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGAGCATCATCTCCACTTTAACCTGA
蛋白序列（SEQ ID NO:57） GAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPELTAMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEKELKPLEEVLNGAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
在不脫離本發明的範圍或精神的情況下，可以對本發明進行多種不同的修飾和變種，這些對本領域技術人員而言是顯而易見的。對本領域技術人員而言，參考本公開發明的說明書和實踐，本發明的其它實施方案是顯而易見的。說明書和實施例意在僅被認為是示例，以下的申請專利範圍會對本發明的真正的範圍和精神進行闡述。
貫穿本申請，為更全面地描述和本發明有關的現有技術的情況，參考了各種公開出版物、專利、和/或專利申請。這些公開出版物、專利、和/或專利申請的公開在本文中以其整體作為參考併入，就如同每一個單獨的公開、專利、和/或專利申請專門地、單個地被指出作為參考併入。
無
圖1A和1B示意地描述了本發明的融合蛋白設計。
圖2示意地描述了本發明的另一種融合蛋白設計。
圖3A和3B顯示了親代抗體對比野生型IL2融合蛋白和本發明突變型IL2融合蛋白，結合細胞表面PDL1的代表性資料。
圖4顯示了多種融合蛋白代表性的ADCC活性。
圖5顯示了野生型IL2融合蛋白對比本發明兩種突變型IL2融合蛋白，結合細胞表面三聚（高親和力）IL2受體的代表性資料。
圖6顯示了通過AlamarBlue試驗測量的，野生型IL2融合蛋白對比本發明多種突變型IL2融合蛋白，觸發和促進CTLL2細胞（替代Treg 細胞）增殖的能力的代表性資料。
圖7顯示了野生型IL2融合蛋白對比本發明多種突變型IL2融合蛋白支援小鼠Treg 細胞存活和啟動的能力的代表性資料。
圖8顯示了野生型IL2融合蛋白對比本發明多種突變型IL2融合蛋白促進小鼠CD8+T細胞（Teff 細胞示例）存活和增殖的能力的代表性資料。
圖9和10顯示了重組IL2和野生型IL2融合蛋白對比本發明多種突變型IL2融合蛋白誘導Treg 和非Treg CD4+ 細胞內Stat5磷酸化的能力的代表性資料。
圖11顯示了重組IL2和野生型IL2融合蛋白對比本發明多種突變型IL2融合蛋白誘導CD8+ 效應T細胞內Stat5磷酸化的能力的代表性資料。
圖12顯示了本發明多種突變型IL2融合蛋白的藥代動力學情況。
圖13顯示了本發明多種突變型IL2融合蛋白相對於Treg 細胞差異誘導CD8+ T細胞和NK細胞優先增殖的能力。 [發明詳述]
除非另有說明，技術術語根據常規用法使用。
如本發明中所使用的，「一個」或「一種」可以指一個或者多個。如本發明中所使用的，當與詞語「包含」結合使用時，詞語「一個」或「一種」可以指一個或多於一個。如本發明中所使用，「另一個」可以指至少第二個或更多。進一步地，除非上下文另有要求，單數術語包括複數，複數術語包括單數。
如本發明中所使用，不論是否明確指明，「大約」指數值，包括例如整數、分數和百分數。術語「大約」 通常指數值的範圍（例如，所述值的+/- 5%至10%），該數值範圍本領域的普通技術人員會認為等同於所述值（如，有同樣的功能或結果）。在一些情況下，術語「大約」包含的數值四捨五入到最接近的有效數字。除非另外指明，「大約」為所述值的+/-10%。
「抗原結合多肽」是指含有與抗原相結合的部分的多肽。抗原結合多肽的示例包括抗體、抗體片段（例如：抗體的抗原結合部分）、抗體衍生物以及抗體類似物。
本發明所使用的術語「基本上由……組成」或「基本相同」，是指，例如，與所選擇的胺基酸序列至少60%、或80%、或更優選地，85%、90%、95%、或甚至100%相同。
抗原結合多肽或蛋白可以具有，例如，天然產生的抗體（也被稱為「免疫球蛋白」）的結構。每個天然產生的抗體由兩對相同的多肽鏈組成，每對有一條「輕」鏈（大約25 kDa）和一條「重」鏈（大約50-70 kDa）。每個輕/重鏈對的可變區形成抗體-結合位點，這樣一個完整的抗體有兩個結合位點。
天然產生的抗體鏈的可變區具有相同的一般結構，即相對保守的骨架區（FR）由三個高度變異區也稱為互補決定區或CDRs連接。從N端到C端，輕鏈和重鏈都包含了FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4結構域。胺基酸在每個結構域的分配與Kabat等人在Sequences of Proteins of Immunological Interest , 5th Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH 出版號 91-3242, 1991中的定義一致。免疫球蛋白鏈上胺基酸的其它編號系統包括IMGT（國際ImMunoGeneTics資訊系統；Lefranc et al.,Dev. Comp. Immunol . 29:185-203; 2005）和AHo（Honegger and Pluckthun,J. Mol. Biol . 309(3):657-670; 2001）。可變區內，CDR1、CDR2和CDR3結構域是重要的，CDR3結構域最為重要。這些可以通過標準生物資訊學和誘變試驗識別。
抗體可以從血清或血漿等含有多種抗原特性免疫球蛋白的來源獲得。如果這些抗體經過親和純化，它們可以被富集為特定的抗原特性。這種抗體的富集製劑通常由少於約10%的對特定抗原具有特異性結合活性的抗體組成。這些製劑經過幾輪的親和純化，可以提高對抗原具有特異性結合活性的抗體的比例。以這種方式製備的抗體通常被稱為「單特異性」。單特異性抗體製劑可由約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或99.9%對特定抗原具有特異性結合活性的抗體組成。
本發明中使用的術語「抗體」或「Ab」（及它們的複數形式），廣泛地指任何由四條多肽鏈（兩條重（H）鏈和兩條輕（L）鏈）組成的免疫球蛋白（Ig）分子，或保留了Ig分子的基本的和特定的表位結合特性的任何其功能性片段、突變體、變體、衍生物或類似物。這些片段、突變體、變體、衍生物或類似物抗體形式是本領域已知的，主要包括Fab、F(ab'）、F(ab'）2 、Fv、單鏈抗體（scFv）、單域抗體（sdAbs）、互補決定區（CDR）片段、嵌合抗體、雙抗體、三抗體、四抗體以及包含至少一部分免疫球蛋白的多肽，該部分免疫球蛋白足以使特定抗原與該多肽相結合。抗體片段、衍生物和類似物可以通過重組DNA技術或者通過酶或化學裂解完整的抗體產生。
Fab片段是具有VL 、VH 、CL 和CH1 結構域的單價片段；F(ab')2 片段是二價片段，在鉸鏈區具有通過二硫鍵連接的兩個Fab片段；Fd片段具有VH 和CH1 結構域； Fv片段具有抗體單臂的VL 和VH 結構域；以及dAb片段具有VH 域、VL 域、或者VH 或VL 域的抗原結合片段（U.S. Pat. Nos. 6,846,634；6,696,245, US App. Pub. 20/0202512；2004/0202995；2004/0038291；2004/0009507；2003/0039958，及Ward et al.,Nature 341:544-546, 1989）。
單鏈抗體（scFv）是一種VL 和VH 區域通過連接子（例如：胺基酸殘基的合成序列）相連以形成連續蛋白鏈的抗體，該連接子足夠長，使蛋白鏈自我折疊，形成一個單價抗原結合位點（參見，例如：Bird et al., 1988,Science 242:423-26及Huston et al., 1988,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83）。雙抗體是包含兩條多肽鏈的二價抗體，其中每條多肽鏈包含由連接子連接的VH 和VL 結構域，該連接子很短，不能允許在同一條鏈上的兩個結構域配對，因此允許每個結構域與另一條多肽鏈上的互補結構域配對（參見，例如：Holliger et al., 1993,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48和Poljak et al., 1994,Structure 2:1121-23）。如果雙抗體的兩條多肽鏈是相同的，那麼它們配對產生的雙抗體將有兩個相同的抗原結合位點。具有不同序列的多肽鏈，可以用於製備具有兩個不同抗原結合位點的雙抗體。類似地，三抗體和四抗體是分別包含三條和四條多肽鏈的抗體，分別形成三個和四個抗原結合位點，抗原結合位點可以相同也可以不同。
利用上述Kabat et al.；上述Lefranc et al.和/或上述Honegger 和Pluckthun描述的系統，可以識別給定抗體的互補決定區（CDRs）和骨架區（FR）。一個或多個CDRs可以共價或非共價地併入到一個分子中，使其成為抗原結合蛋白。抗原結合多肽可以將CDR（s）作為一條較大多肽鏈的一部分併入，可以共價連接CDR（s）到另一條多肽鏈，也可以非共價地併入CDR（s）。CDRs允許抗原結合蛋白與特定的抗原特異性地結合。
融合蛋白可以有一個或多個結合位點。如果有多個結合位點，這些結合位點可以是彼此相同的或不同的。例如，天然產生的人類免疫球蛋白通常有兩個相同的結合位點，然而「雙特異性」或「雙功能」抗體有兩個不同的結合位點。
術語「人類抗體」或「人源化抗體」包含來源於人免疫球蛋白序列的具有一個或多個可變和恒定區的所有抗體。在一個實施方案中，所有的可變和恒定區都來源於人免疫球蛋白序列（完全人類或人源化抗體）。這些抗體可以通過多種方式製備，包括用目標抗原對小鼠進行免疫，該小鼠經基因修飾以表現源自人類重和/或輕鏈編碼基因的抗體。通過一個或多個胺基酸的替換、缺失和/或添加，人源化抗體具有與來源於非人類物種的抗體序列不同的序列，因此，在施用於人類受試者時，與非人類物種抗體相比，人源化抗體不太可能誘導免疫反應，和/或誘導程度較輕的免疫反應。在一個實施方案中，位於非人類物種抗體重和/或輕鏈的骨架區和恆定區的某些胺基酸經突變產生人源化抗體。在另一個實施方案中，人類抗體的恒定區融合到非人類物種的可變區。在另一個實施方案中，將非人類抗體的一個或多個CDR序列中的一個或多個胺基酸殘基進行改變，以減少非人類抗體在施用於人類受試者時可能的免疫原性，其中改變的胺基酸殘基對抗體與抗原的免疫特異性結合不是關鍵的，或者對胺基酸序列的改變是保守的改變，因此人源化抗體與抗原的結合不會明顯地比非人類抗體與抗原的結合差。如何製備人源化抗體的例子可以在美國專利U.S. Pat. Nos. 6,054,297, 5,886,152 和 5,877,293中找到。
活化的T細胞在其細胞表面表現PD1。PD-L1與PD1結合啟動PD1，抑制PD1+ T細胞。「中和抗體」或「抑制性抗體」是指阻斷PD1啟動的抗體，即採用本發明實施例中描述的試驗，過量的抗PD-L1抗體減少所述啟動量的至少約20%。在各實施方案中，抗原結合蛋白使PD1啟動量減少了至少30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%以及99.9%。
本領域普通技術人員遵循本說明書的教導以及使用本領域已知的技術可以容易地製備抗體的片段或類似物。片段或類似物優選的胺基和羧基端出現在功能域邊界附近。通過將核苷酸和/或胺基酸序列資料與公共或專用序列資料庫進行比較，可以確定結構和功能區域。電腦化對比方法可以用於識別序列基序或預測在其他已知結構和/或功能的蛋白質中出現的蛋白構形區。確定蛋白序列折疊成已知三維結構的方法是公知的。參見，Bowie et al., 1991,Science 253:164。
如果融合蛋白以100奈莫耳或更低的離解常數與抗原結合，則該融合蛋白「特異性地結合」抗原（例如，人PD-L1）。
「抗原結合域」、「抗原結合區」或「抗原結合位點」，是抗原結合蛋白的一部分，包含與抗原相互作用，有助於抗原結合蛋白對抗原的特異性和親和力的胺基酸殘基（或其它基團）。要使抗體特異性地結合抗原，抗體至少要包含至少其CDR域之一的一部分。
「表位」是指被抗原結合蛋白（例如，抗體）結合的分子的部分。表位可以包含該分子的非連續的部分（例如，在多肽中，在多肽一級序列中不連續的胺基酸殘基，但在多肽的三級和四級結構中，它們彼此足夠近以被抗原結合蛋白結合）。
如本發明所使用，術語「多聚核苷酸」、「寡核苷酸」及「核酸」在全文中互換使用，包括DNA分子（例如，cDNA或基因體DNA）、RNA分子（例如，mRNA）、利用核苷酸類似物生成的DNA或RNA類似物（例如，肽核酸和非天然產生的核苷酸類似物）及上述混合物。核酸分子可以是單鏈或者雙鏈的。在一個實施方案中，本發明中的核酸分子包含編碼融合蛋白、抗體、或其片段、衍生物、突變體或變體的連續開放閱讀框。
「載體」是一種核酸，可以用於將與之相連的另一個核酸引入細胞。一種載體是「質體」，指線形或環形雙鏈DNA分子，可以將附加的核酸片段連接到其中。另一種載體是病毒載體（例如，複製缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒），其中附加的DNA片段可以被引入病毒基因體。某些載體能夠在被引入的宿主細胞中自主複製（例如，包含細菌複製起點的細菌載體和游離型哺乳動物載體）。其它載體（例如，非游離型哺乳動物載體）在引入宿主細胞後被整合入宿主細胞的基因體中，從而與宿主基因體一起被複製。「表現載體」是一種可以指導所選多聚核苷酸表現的一種載體。
如果調控序列影響核苷酸序列的表現（例如，表現水平、時間或部位），則該核苷酸序列「可操作地連接」到調控序列。「調控序列」是一種核酸，其影響與之可操作地連接的核酸的表現（例如，表現水平、時間或部位）。例如，該調控序列可以直接在被調節的核酸上發揮作用，或通過一個或多個其它分子（例如，結合調控序列和/或核酸的多肽）的作用發揮作用。調控序列的例子包括啟動子、增強子和其它表現控制元件（例如，聚腺苷酸化訊號）。進一步的調控序列的例子描述於，例如，Goeddel, 1990, Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. and Baron et al., 1995,Nucleic Acids Res. 23:3605-06。
本發明使用的術語例如「治療的」，指治療、減緩、減輕確診的病理狀況或疾病的症狀、和/或阻止其進展的品質和能力。因此，治療蛋白或多肽是有上述品質或能力的物質。例如，假如患者顯示以下一個或多個：癌症細胞數量減少或完全消失、腫瘤體積減小、抑制或消滅癌症細胞浸潤周圍器官，包括癌症擴散入軟組織和骨骼、抑制或消滅腫瘤轉移、抑制或消滅腫瘤生長、減輕特定癌症相關的一個或多個症狀、發病率和致死率降低、生活品質提高，則受試者被本發明的方法成功地「治療」。
優選地，本發明的組合物所治療的廣譜哺乳動物癌症選自組合包括：卵巢癌、結腸癌、乳腺癌、肺癌、骨髓瘤、神經母細胞源性中樞神經系統腫瘤、單核球白血病、B細胞白血病、T細胞白血病、B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、肥大細胞腫瘤、黑色素瘤、膀胱癌、胃癌、肝癌、尿道上皮癌、皮膚癌、腎癌、頭頸部癌、胰腺癌及上述癌症的組合。更廣泛地，任何至少部分腫瘤細胞表現可檢測量的PD-L1的癌症都可以通過本發明的組合物治療。
本發明公開的融合蛋白或多肽可以使用本領域公知的任何標準方法製備。在一個實施例中，通過重組DNA的方法生產多肽，通過將編碼多肽的核酸序列（例如cDNA）插入到重組表現載體，並在促進表現的條件下表現DNA序列。
編碼任何一種本發明公開的多種融合蛋白或多肽的核酸可以經化學合成。可以選擇密碼子使用以促進細胞內表現。這種密碼子使用將取決於所選擇的細胞類型。針對大腸桿菌和其它細菌，以及哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞和昆蟲細胞，已經開發出專門的密碼子使用模式。參見，例如：Mayfield et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 2003 100(2):438-42； Sinclair et al.Protein Expr. Purif. 2002 (1):96-105；Connell N D.Curr. Opin. Biotechnol . 2001 12(5):446-9；Makrides et al.Microbiol. Rev . 1996 60(3):512-38和Sharp et al.Yeast . 1991 7(7):657-78。
核酸操縱的一般技術描述於，例如：Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2 ed., 1989，或F. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing and Wiley-Interscience: New York, 1987)以及定期更新中，在本發明中引用合併。編碼多肽的DNA可操作地連接於來自哺乳動物、病毒或昆蟲基因的適當轉錄或轉譯調節元件。這些調節元件包括轉錄啟動子、控制轉錄的可選操縱序列、編碼合適的mRNA核糖體結合位點的序列以及控制轉錄和轉譯終止的序列。通常由複製起點賦予的在宿主中複製的能力，以及便於識別轉化子的選擇基因也被併入。
重組DNA也可以包含任何類型的蛋白質標籤序列，這些序列可能有利於純化蛋白。蛋白質標籤的例子包括但不限於組胺酸標籤、FLAG標籤、myc標籤、HA標籤或GST標籤。用於細菌、真菌、酵母和哺乳動物細胞宿主的適當的選殖和表現載體可以在Cloning Vectors: A Laboratory Manual , (Elsevier, N.Y., 1985)中找到。
表現構築體通過適合於宿主細胞的方法引入宿主細胞。將核酸引入宿主細胞的各種方式為本領域公知，包括但不限於，電穿孔；使用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、葡聚糖或其它物質轉染；基因槍法；脂質轉染；以及感染（其中，載體為感染製劑）。適宜的宿主細胞包括原核細胞、酵母、哺乳動物細胞或細菌細胞。
本發明公開的蛋白也可以使用細胞轉譯系統生產。為此目的，編碼多肽的核酸必須經過修飾，使其能夠在體外轉錄產生mRNA，並允許在所使用的特定無細胞系統（真核的，如哺乳動物或酵母無細胞轉譯系統，或原核的，如細菌無細胞轉譯系統）中對mRNA進行無細胞轉譯。
本發明公開的雙特異性分子也可以使用細胞轉譯系統產生。為了生產便利，有多種方法通過在兩個重分子上使用互補突變確保異二聚體雙特異性分子優先地在細胞內產生。
本發明公開的融合蛋白或多肽也可以通過化學合成產生（例如，通過Solid Phase Peptide Synthesis , 2nd ed., 1984, The Pierce Chemical Co., Rockford, Ill中描述的方法）。蛋白質的修飾也可以通過化學合成產生。
融合蛋白的另一種分子在一個或多個胺基酸發生突變，以去除蛋白水解位點，提高產量。
融合蛋白的另一種分子在一個或多個胺基酸發生突變，以去除糖基化位點，而不改變該蛋白質功能以生成更均一的產品。
融合蛋白的另一種分子使用可選的分泌序列，替代天然抗體分泌序列，以促進分泌。
本文公開的融合蛋白或多肽可以通過蛋白質化學領域通常已知的蛋白質分離/純化方法進行純化。非限制性例子包括：萃取、重結晶、鹽析（例如，使用硫酸銨或硫酸鈉）、離心、透析、超濾、吸附層析、離子交換層析、疏水層析、正相層析、反相層析、凝膠過濾、凝膠滲透層析、親和層析、電泳、逆流分佈或上述任何組合。純化後，多肽可以交換到不同的緩衝物和/或通過任何本領域所公知的多種方法進行濃縮，包括但不限於過濾和透析。
純化的融合蛋白或多肽優選至少85%純，更優選至少95%純，最優選至少98%純。無論純度的確切數值是多少，多肽都經過充分地純化以作為藥物產品使用。多肽的 轉譯後修飾
在某些實施方案中，本發明的融合蛋白或多肽可以進一步包含轉譯後的修飾。示例性轉譯後蛋白修飾包括，磷酸化、乙醯化、甲基化、ADP-核糖化、泛素化、糖基化、羰基化、類泛素化、生物素化或添加多肽側鏈或疏水基團。因此，經修飾的可溶性多肽可能含有非胺基酸元素，例如類脂、多聚糖或單糖以及磷酸鹽。糖基化的一種優選形式是唾液酸化，其將一個或多個唾液酸基團連接到多肽上。唾液酸基團改善蛋白質的溶解性和血清半衰期，同時也降低蛋白質可能的免疫原性。參見Raju et al.Biochemistry . 2001 31; 40(30):8868-76。可以測試這些非胺基酸元素對多肽功能的影響，以瞭解其對PD-L1或PD-1功能的拮抗作用，例如其對血管生成或腫瘤生長的抑制作用。
在一個實施方案中，生物活性是指其結合PD-L1的能力，通過KD、kon 或koff 速率進行評估。在一個具體的實施方案中，與未PEG化的對應物相比，PEG化的多肽蛋白與人PD-L1的結合增加。在另一個實施方案中，生物活性指阻斷PD-L1/PD1相互作用。治療，疫苗 & 施用
本發明進一步提供了治療疾病或預先預防疾病的方法。優選的實施例為以細胞過度增生和持續感染為特徵的疾病。施用技術和劑量取決於特定多肽類型和治療的具體疾病。由於監管機構要求用於治療的蛋白試劑的熱原含量需為可接受的低水平，本發明的治療配方可與其它配方區分，因其基本上不含熱原，或至少包含不超過適當的監管機構（如美國 FDA）所確定的可接受水平的熱原。
本發明的藥物製劑可包含至少一種藥學上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑。包含於製劑中的賦形劑將有不同的用途，例如，取決於使用的基因構築體或效應細胞的種類以及施用方式。通常使用的賦形劑示例包括但不限於：鹽水、緩衝鹽水、葡萄糖、注射用水、甘油、乙醇及上述組合物、穩定劑、增溶劑和表面活性劑、緩衝液和防腐劑、強化劑、填充劑和潤滑劑。
在本發明的另一個實施方案中，本發明的藥物製劑施用於患者。示例性施用方式包括但不限於，靜脈注射。其它方式包括但不限於，瘤內、皮內、皮下（s.c.、s.q.、sub-Q、Hypo）、肌內（i.m.）、腹膜內（i.p.）、動脈內、髓內、心內、關節內（關節）、滑膜內（關節液區）、顱內、脊柱內以及鞘內（脊髓液）。用於胃腸外注射或輸注本製劑的任何已知的器械可以用於實現這些施用。如本發明中所使用，術語「治療（treat, treating, treatment）」具有其通常及慣用的含義，且包含以下一種或多種含義：阻滯、改善受試者疾病（例如腫瘤）症狀或降低其嚴重程度和/或頻率，和/或抑制受試者癌症細胞的生長、分裂、擴散或增殖，或癌症進展（例如：出現新的腫瘤）。治療是指，與未使用本發明方法的受試者相比，阻滯、改善、降低或抑制約5%至約100%。優選地，與未使用本發明方法的受試者相比，阻滯、改善、降低或抑制約100%、99%、95%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%或5%。
本發明還提供了一種套組，包含一個或多個容器，其中裝有大量編碼本發明融合蛋白或多肽的基因構築體，及藥學上可接受的賦形劑。該套組還可以包含使用說明。與套組相關聯的，還可以是管理藥品或生物製品生產、使用或銷售的政府機構規定格式的通知，該通知反映了生產、使用或銷售機構對人類用藥的批准。
無
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Claims (36)

  1. 一種融合蛋白，包含治療性蛋白連接突變的白細胞介素-2（IL2）多肽。
  2. 如請求項1所述的融合蛋白，其中治療性蛋白是一種治療性抗體，或一種腫瘤抗原結合多肽。
  3. 如請求項1所述的融合蛋白，其中突變的IL2多肽比野生型IL2對高親和力受體選擇性更低。
  4. 如請求項1所述的融合蛋白，包含免疫檢查點抗體的部分或全部，和突變的白細胞介素2（IL2）多肽。
  5. 如請求項4所述的融合蛋白，其中免疫檢查點抗體的部分或全部包含一對重鏈和一對輕鏈，其中突變的IL2多肽連接重鏈的C端。
  6. 如請求項5所述的融合蛋白，其中突變的IL2多肽通過連接子序列連接重鏈的C端。
  7. 如請求項4所述的融合蛋白，包含雙特異性設計的抗體類似物，其中第一條臂對應免疫檢查點抗體，第二條臂包含突變的IL2多肽融合在所述抗體類似物的Fc部分。
  8. 如請求項1所述的融合蛋白，其中融合蛋白由抗原結合多肽連接突變的IL2多肽組成。
  9. 如請求項8所述的融合蛋白，其中抗原結合多肽和突變的IL2多肽通過連接子序列連接。
  10. 如請求項8所述的融合蛋白，其中抗原結合多肽選自由以下所組成之群組：抗檢查點scFv、配體和配體的部分。
  11. 如請求項10所述的融合蛋白，其中抗檢查點scFv是抗PDL1 scFv，配體是PD1或CTLA4。
  12. 2、3、4或8中任一項所述的融合蛋白，其中突變的IL2多肽相比於野生型IL2具有如下一個或兩個特徵：（a）啟動CTLL2及人和小鼠Treg 的能力下降，同時保留啟動效應T細胞或NK細胞的能力；和（b）顯示顯著更高的選擇性能力以啟動Teff 相比於Treg 。
  13. 2、3、4或8中任一項所述的融合蛋白，其中突變的IL2多肽包含胺基酸序列，與選自由以下所組成之群組SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57及其組合的胺基酸序列基本相同。
  14. 5或7中任一項所述的融合蛋白，其中免疫檢查點抗體是抗PDL1抗體。
  15. 如請求項14所述的融合蛋白，其中抗PDL1抗體具有如下一個或多個特徵：（a）以Kd>100 nM將PDL1與純化蛋白和細胞表面表現的蛋白結合；（b）體外阻斷PDL1-PD1相互作用；和/或（c）在啟動的PBMC培養基中，去PDL1介導的效應T細胞抑制。
  16. 5或7中任一項所述的融合蛋白，其中免疫檢查點抗體是調節或增強ADCC和/或CDC功能的任何可獲得類型或Fc區任何已知突變形式的抗體。
  17. 5或7中任一項所述的融合蛋白，其中免疫檢查點抗體是IgG1型抗體。
  18. 如請求項5所述的融合蛋白，其中免疫檢查點抗體進一步包含第二對重和輕鏈可變區，與第一對的基本相同。
  19. 如請求項14所述的融合蛋白，其中抗PDL1抗體包含一對重鏈可變區和輕鏈可變區，其各自對應的序列基本上由以下對：（a）SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 6；（b）SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 12；或（c）SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 18組成。
  20. 如請求項14所述的融合蛋白，其中抗PDL1抗體包含一對重鏈和輕鏈，其各自對應的序列基本上由以下對：（a）SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 5；（b）SEQ ID NO: 8和SEQ ID NO: 11；或（c）SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 17組成。
  21. 如請求項6或9所述的融合蛋白，其中連接子序列是絲胺酸-甘胺酸連接子。
  22. 如請求項21所述的融合蛋白，其中連接子序列是SEQ ID NO: 19。
  23. 2、3、4或8中任一項所述的融合蛋白，其中，融合蛋白中一個或多個胺基酸位點引入突變以中斷至少一個蛋白水解位點。
  24. 2、3、4或8中任一項所述的融合蛋白，其中融合蛋白中一個或多個胺基酸位點引入突變以中斷至少一個糖基化位點。
  25. 2、3、4或8中任一項所述的融合蛋白，其中可選的分泌序列被引入融合蛋白以替換內源性分泌序列。
  26. 一種藥物組合物，包含如請求項1-25中任一項所述的融合蛋白，以及藥學上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑。
  27. 一種核酸分子，編碼如請求項1-25中任一項所述的融合蛋白，其中該核酸分子是DNA分子或RNA分子。
  28. 一種用於治療有需要的受試者的疾病的方法，所述方法包括向所述受試者施用治療有效量的如請求項26所述的藥物組合物。
  29. 一種用於治療有需要的受試者的疾病的方法，所述方法包括向所述受試者施用治療有效量的如請求項26所述的藥物組合物，聯合（a）標靶至少另一種免疫抑制途徑的抗體；（b）化療、標靶治療或放射治療；（c）阻斷免疫抑制途徑的另一種機制；或（d）另一種免疫治療藥物。
  30. 如請求項28-29中任一項所述的方法，其中所述疾病是哺乳動物癌症。
  31. 如請求項28-29中任一項所述的方法，其中所述癌症選自由以下所組成之群組：黑色素瘤、肺癌、腎癌、頭頸部癌、胃癌、淋巴瘤、卵巢癌、結腸癌、乳腺癌、肺癌、骨髓瘤、腦瘤、白血病、淋巴瘤、膀胱癌、肝癌、尿道上皮癌、皮膚癌、胰腺癌及其組合。
  32. 一種哺乳動物表現系統產生如請求項1-25中任一項所述的融合蛋白。
  33. 一種突變的IL2多肽，其相對於野生型IL2對高親和力受體選擇性更低。
  34. 如請求項33所述的突變的IL2多肽，其中突變的IL2多肽包含胺基酸序列，與選自由以下所組成之群組：SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57及其組合的序列基本相同。
  35. 一種融合蛋白，包含： 抗原結合部位，包含抗PDL1抗體的部分或整體，連接突變的白細胞介素2（IL2）多肽； 其中所述的抗原結合部位包含一對重鏈和輕鏈，其各自對應的序列基本上由以下對：（a）SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 5；（b）SEQ ID NO: 8和SEQ ID NO: 11組成； 其中，突變的IL2多肽包含胺基酸序列，與選自由以下所組成之群組：SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 27的序列基本相同；和 其中，突變的IL2多肽連接抗原結合部位重鏈的C端。
  36. 如請求項35所述的融合蛋白，其中突變的IL2多肽通過一個連接子序列連接重鏈的C端，所述連接子序列包含SEQ ID NO: 19。
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