WO2016140528A1 - 인간 인터페론-베타 변이체가 접합된 면역사이토카인 및 이의 제조방법 - Google Patents

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immunocytokine
human interferon
antibody
interferon
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김영덕
최준영
김태은
이용진
이주호
김영문
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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin

Definitions

  • the present invention relates to an immunocytokine conjugated with a human interferon-beta mutant and a method for preparing the same, and more specifically, an immunocytoprotein in which an interferon-beta mutant and an antibody are combined with superior activity and function than a native interferon-beta.
  • the present invention relates to a caine and a method for producing the same.
  • Mab as a diagnostic and therapeutic reagent for various disease states.
  • Recombinant DNA techniques have been used to prepare chimeric or humanized antibodies for administration to humans.
  • monoclonal antibodies are marketed and used, for example, as RITUXAN®, HERCEPTIN®, AVASTIN®, etc. for the treatment of cancer, infectious diseases, immune diseases, and the like.
  • Monoclonal antibodies are targeted molecules and can be localized within specific crop regions (cells, tissues, etc.), such as pathological tissue. Due to this property, it is specific at the pathological tissue site. Efforts to target molecules have also resulted in the development of Mabs conjugated to various substances (payloads).
  • Such materials can be roxine, drugs, radionuclides, prodrug compounds, and the like. Many of these bindings involve chemical conjugation of reactive moieties (payloads) with specific preparations of antibodies, processes that can be cumbersome and prone to modification (US 4,671,958).
  • immunocytokines are of particular interest.
  • the cotton histokinin means a fusion protein comprising an antibody and a cytokine. Such proteins possess both antigen-binding capacity and cytokine activity.
  • Cytokines are a category of signaling proteins and glycoproteins that are widely used for intercellular communication, such as hormones and neurotransmitters.
  • cytokines While hormones are secreted into the blood by specific organs and neurotransmitters are involved in neuronal activity, cytokines are a more diverse group of compounds in terms of origin and purpose. It is produced by a wide range of hematopoietic and non-hematopoietic cell types, can affect nearby cells or affect the entire organism, and is sometimes strongly dependent on the presence of other chemicals.
  • the cytokine family consists primarily of smaller water soluble proteins and glycoproteins with a mass of 8 to 30 kDa. Cytokines are important for the functionalization of both innate and degenerative immune responses. Often cytokines are secreted by immune cells that have met the pathogen, activating and recruiting more immune cells and increasing the system response to the pathogen.
  • interferon In cytokineosis, interferon (IFNs) is a type of cytokine that has antiviral activity, inhibits cell proliferation, and modulates the natural immune response
  • interferon-beta IFN- ⁇
  • IFN- ⁇ interferon-beta
  • Mult iple sclerosis Treatment opt ions for pat ients wi th re 1 aps i ng-r em i 11 i ng and secondary progressive mult iple sclerosis, 1999).
  • interferon-beta has antiviral activity, cell growth inhibition or anti growth activity, lymphocyte cytotoxicity activity, immunomodulatory activity, target cell differentiation or inhibition activity, macrophage activation activity, and increased cytokine production.
  • the activity may be increased when sugar chains are added.
  • human interferon-beta variants having increased activity or function by introducing sugar chains into human natural interferon-beta, a glycoprotein, have been disclosed in Korean Patent Publication No. 10-0781666. Therefore, in order to use the human interferon-beta mutant which shows the efficacy superior to the pharmacological effect of the natural type interferon-beta, it is necessary to develop the immunocytokine conjugated with the antibody and to obtain it in high yield. Is required.
  • the inventors of the present invention have invented immune cytokines in which human interferon-beta variants with increased or enhanced activity or function by introducing sugar chains into human native interferon-beta, and antibody-binding host cells of such immunocytokines. It was found that the expression level in E. coli was significantly improved compared to the immunocytokine conjugated with the native type interferon-beta and the antibody, thereby completing the present invention.
  • an object of the present invention to provide a method for the preparation of (a) human interferon-beta variants; And (b) the phosphorus An immunocytokine comprising an antibody or fragment thereof covalently linked to a hepatic interferon-beta variant directly or indirectly, wherein the human interferon-beta variant comprises (i) a polypeptide comprising the entire amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1; ii) a polypeptide comprising a substantial portion of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, (iii) a polypeptide selected from the group consisting of polypeptides substantially similar to the polypeptides of (a) or (b) and having human interferon-beta activity
  • an immunocytokine which is a polypeptide comprising an N-linked sugar chain.
  • Another object of the present invention is to provide a polynucleotide encoding the immunocytokine.
  • Another object of the invention is (a) a human interferon-beta variant; cloning a polynucleotide encoding a fusion polypeptide comprising (b) a peptide linker and (c) an antibody or fragment thereof into an expression vector;
  • the human interferon-beta variant is to provide a method for increasing the production of target specific human interferon-beta, characterized in that consisting of a peptide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 4.
  • Another object of the present invention is to provide a vector comprising the polynucleotide.
  • Another object of the present invention is to provide a host cell transformed with the vector.
  • Another object of the present invention is to prepare an immunocytokine by (a) providing a host cell, (b) culturing a provided cell, and (c) recovering an immunocytokineol from the cell or culture medium. It provides an immunocytokine manufacturing method comprising.
  • the present invention to achieve the above object is (a) a human interferon-beta variant; And (b) an immunocytokine comprising an antibody or fragment thereof covalently linked directly or indirectly to the human interferon-beta variant, wherein the human interferon-beta variant comprises (i) the entire amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1; A polypeptide comprising (i) a polypeptide comprising a substantial portion of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, (iii) a human interferon-beta selected from the group consisting of a polypeptide substantially similar to the polypeptide of (a) or (b) above As an active polypeptide, an immunocytokine which is a polypeptide comprising an N-linked sugar chain is provided.
  • a human interferon-beta variant cloning a polynucleotide encoding a fusion polypeptide comprising (b) a peptide linker and (c) an antibody or fragment thereof;
  • the human interferon-beta variant is to provide a method for increasing the production of target specific human interferon-beta, characterized in that consisting of a peptide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 4.
  • the present invention is to provide a polynucleotide encoding the immunocytokine.
  • the present invention is to provide a vector comprising the polynucleotide.
  • the present invention is to provide a host cell transformed with the vector.
  • the present invention provides a (a) providing a host cell It provides a method for producing an immune cytokine comprising the steps of (b) culturing the provided cells and (c) recovering the immunocytokines from the cells or culture medium.
  • a method for producing an immune cytokine comprising the steps of (b) culturing the provided cells and (c) recovering the immunocytokines from the cells or culture medium.
  • the present invention will be described in detail.
  • the therapeutic potential of cytokines is often limited by severe side effects that occur at low concentrations, thereby preventing the presence of striking cytokine concentrations in target tissues. Accordingly, it is possible by immunocytokines to target cytokines and deliver them to disease sites using antibodies to increase the therapeutic potential of cytokines and protect normal tissues from toxic effects.
  • the immunocytokine according to the present invention is a variant of human interferon-beta, and is a cytokine whose activity or function is increased or improved by introducing a sugar chain into a native interferon-beta.
  • the inventors of the present invention if the human interferon-beta variant is combined with an antibody and can be used for the target therapy of multiple sclerosis, viral diseases, etc. in the form of an immunocytokine, the natural interferon-beta 7 ⁇ conjugated immunocytokine and Compared to the present invention, the present invention has been completed.
  • the present invention provides a kit comprising (a) human interferon-beta variants; And (b) an immunocytokine comprising an antibody or fragment thereof covalently linked directly or indirectly to the human interferon-beta variant, wherein the human interferon-beta variant comprises (i) the entire amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1; A polypeptide comprising (i) a polypeptide comprising a substantial portion of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1; and (iii) a human interface selected from the group consisting of a polypeptide substantially similar to the polypeptide of ( a ) or (b) above.
  • an immunocytokine which is a polypeptide comprising an N-linked sugar chain.
  • the human interferon-beta variant increased or improved in activity or function as compared to the native human interferon-beta, wherein the glycine-asparagine at the C-terminus of its amino acid sequence in the native human interferon-beta or the native human interferon-beta variant.
  • An isoleucine-threonine-valine sequence, N-linked to an asparagine residue of said additional sequence It is characterized in that it comprises a type sugar chain.
  • the "natural human interferon-beta variant” includes all polypeptides having all or a portion of amino acid sequences derived from native human interferon-beta and having human interferon-beta activity. That means it.
  • the term "activity of human interferon-beta” as defined above is defined as one or more activities that are sufficient to identify any polypeptide as human interferon-beta among those known to have human interferon-beta. Such activities may include alleviation, alleviation or therapeutic activity against multiple sclerosis, antiviral activity, cell growth inhibitory activity, anti-growth activity, anti-proliferative activity, lymphocyte cytotoxicity activity, immunomodulatory activity, target cell as described above.
  • the "polypeptide having all or part of the amino acid sequence derived from natural human interferon-beta” includes the whole or substantially part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 which is the amino acid sequence of the natural human interferon-beta.
  • polypeptide or a polypeptide substantially similar to such a polypeptide wherein the "polypeptide comprising a substantial portion of the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 1" means a native human interferon having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • -A polypeptide comprising a portion of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, which has a dong or more activity compared to -beta, or which has a low activity but still retains the activity of human interferon-beta
  • SEQ ID NO: 1 All or a substantial portion of the amino acid sequence disclosed in Polypeptide substantially similar to 'human' having the same or more activity or lower activity than the native human interferon-beta of SEQ ID NO: 1 It is defined as a polypeptide comprising all or a substantial portion of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, which contains one or more substituted amino acids while still retaining the activity of interferon-beta.
  • the N-terminal portion, the C-terminal portion, or a substituted amino acid is involved in a motif essential for the activity of human interferon-beta, thereby depleting the N-terminal portion and / or C-terminal portion.
  • a polypeptide comprising a substituted amino acid does not exhibit the activity of human interferon-beta, but nevertheless, it is confirmed that the above polypeptide derived from SEQ ID NO: 1 has one or more of the above-exemplified activities.
  • / or other methods related to human interferon-beta identification known in the art based on the filing of the present invention it is possible to distinguish and detect such inactive polypeptides from the active polypeptides.
  • the human interferon-beta variant of the present invention comprises a glycine-aspara long-isoleucine-threonine-valine sequence at the C-terminus and an N-linked sugar chain at the position thereof, wherein the human interferon-beta active
  • the following arginine (R27) site of the polypeptide or wild-type interferon beta may be defined as either one which is mutated to threonine (R27T) or to serine (R27S), more preferably SEQ ID NO: 2 to sequence It means a polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of No. 4.
  • the human interferon-beta variant of the present invention comprises a glycine-asparagine-isorucin-threonine-valine sequence at the C-terminus thereof. It is to be understood as all polypeptides having human interferon-beta activity, including N-linked sugar chains in position.
  • the human interferon-beta variant of the present invention includes all glycine-aspara long-isoleucine-threonine-valine sequences at the C-terminus and all human human interferon-beta activities having an N-linked sugar chain therein. Defined as a polypeptide. More preferably, the 'human interferon-beta variant' of the present invention may be a mutein of interferon-beta having an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 2 to 4, and named by the present inventors carbiferon. It became. Carbiferon of the present invention takes the form of one to two sugar chains added to the natural interferon-beta.
  • arginine (R), which is amino acid 27, is replaced with threonine (T) or serine (S), or the native human interferon-beta
  • T threonine
  • S serine
  • a C-terminus is meant a polypeptide comprising a glycine-asparagine-isoleucine-threonine-valine (GNI-TV) sequence and having an N-linked sugar chain therein.
  • Human interferon-beta variants show enhanced or increased antiviral activity, cell growth inhibitory activity, immunomodulatory function, and half-life in vivo compared to native interferon-beta.
  • SEQ ID NO: 2 is an amino acid sequence of R27T which is an interferon ⁇ variant
  • SEQ ID NO: 3 is an interferon ⁇ variant R27S in which amino acid No. 27 of SEQ ID NO: 1 is substituted with S
  • SEQ ID NO: 4 is the amino acid sequence of the interferon ⁇ variant GNITV including the GNITV amino acid after the stop codon.
  • the SEQ ID NO: 1 to 4 includes the start codon at the ⁇ terminal, the protein of SEQ ID NO: 1 to 4 can be omitted when the linking with the other linker (linking the C terminal of the linker and the ⁇ terminal of the carbiferon).
  • Antibodies in the present invention are broadly used and include monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, polyspecific antibodies (eg, bispecific antibodies), and antibody fragments (as long as they exhibit the desired antigen-binding activity). It includes various antibody structures, including but not limited to. Natural antibodies are molecules with various structures. For example, a native IgG antibody is here a tetrameric glycoprotein of about 150,000 Daltons, consisting of two identical light chains and two identical heavy chains that are disulfide-bonded.
  • each heavy chain comprises a variable domain (VH), also called a variable heavy domain or heavy chain variable domain, followed by three or four constant domains (CHI, CH2, CH3 and optionally CH4).
  • VH variable domain
  • VL variable domain
  • CL constant light chain
  • the light chain of an antibody can be assigned to one of two types, called kappa ( ⁇ ) and lambda ( ⁇ ), based on the amino acid sequence of its constant domain.
  • Antibodies in the present invention may be, but are not limited to, human antibodies, chimeric antibodies and / or humanized antibodies.
  • the chimeric antibody refers to an antibody consisting of a variable region of murine immunoglobulin and a conserved region of human immunoglobulin. Such modifications simply consist of replacing the conserved region of the human antibody with a murine conserved region, thereby producing a human / murine chimera that can have an extremely low immunogenicity to be acceptable for pharmaceutical use.
  • the humanized antibody refers to an antibody composed (partially or entirely) of amino acid sequences derived from human antibody germ cells by modifying the sequence of the antibody having a non-human complementarity determining region (CDR). Humanization of variable regions and CDRs of antibodies is accomplished by techniques well known in the art.
  • Such antibodies have human conserved regions that are required for Fc dependent effector function but are likely to elicit much less immune responses to antibodies.
  • the framework regions of the variable regions are replaced by corresponding human framework regions that have left non-human CDRs substantially intact or even replaced CDRs with sequences derived from the human genome (eg, patent application US). 2006/25885).
  • Fully ly human antibodies should be directed to the human immune system Inverse systems are produced in modified genetically modified mice.
  • the humanized antibody also comprises one or more CDRs of a human framework, a non-human antibody, wherein any conserved region present is substantially identical to the human immunoglobulin conserved region, ie at least about 85% or 90% identical, preferably Denotes an antibody wherein at least 95% are identical.
  • Antibody fragments in the present invention represent antibody fragments capable of reacting with the same antigen as the antibody counterpart.
  • Such fragments can be simply identified by one skilled in the art, including, for example, Fab fragments (eg, fragments by papain digestion), Fab 'fragments (eg, fragments by pepsin digestion and partial reduction), F (ab ') 2 fragments (eg fragments by pepsin digestion), Facb (eg fragments by plasmin digestion), Fd (eg fragments by pepsin digestion, partial reduction and recirculation), and scFv (short chain Fv' For example, fragments by molecular biology techniques).
  • Such fragments may be produced by enzyme cleavage, synthetic or recombinant techniques, as known in the art and / or disclosed herein.
  • the immunocytokine conjugated with the human interferon-beta variant according to the present invention was shown to exhibit interferon-beta activity by inducing cytotoxicity and phosphorylation of pSTAT-1, which is not seen in the antibody itself (see Examples 3 and 4).
  • the present invention also provides an immunocytokine, characterized in that the antibody or fragment thereof is an antibody or fragment thereof against an antigen selected from the group comprising a tumorous antigen and multiple sclerosis specific antigen. Tumors that grow over a certain size will need to form new blood vessels to grow further or metastasize to other sites.
  • interferon-beta has been reported to inhibit tumor cell growth by inhibiting tumor cell angiogenesis.
  • interferon-beta may induce innate or acquired immune reflexes in the surrounding environment of the site where the tumor is present, thereby inducing tumor cell death and exerting an anticancer effect. Therefore, the human interferon ⁇ beta variant according to the present invention has improved activity and function compared to the native type interferon-beta, and thus forms a cancer in the form of an immunocytokine bound to an antibody that specifically recognizes a tumor antigen.
  • the native interferon-beta may have a better therapeutic effect compared to the conjugated immunocytokine.
  • the tumorous antigen is a protein produced by tumor cells that elicit immune responsiveness, especially T-cell mediated immune responses.
  • Tumor antigens are well known in the art and include, for example, glycoma-associated antigens, cancer embryonic antigens (CEA), ⁇ -human chorionic gonadotropin, alpha-fetoprotein (AFP), lectin-banner AFP , Tyroglobulin, RAGE-1, lia-CA IX, human telomerase reverse transcriptase, RU1, RU2CAS), intestinal carboxy esterase, mut hsp70-2, M-CSF, prostatase, prostate-specific antigen (PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-la, p53, prostein, PSMA, Her2 / neu, survivin and telomerase, prostate-carcinoma tumor antigen -l (PCTA-l ), MAGE, ELF2M, neutrophil elastase, ephrin B2, CD22, insulin growth factor (IGF) -I, IGF-I I, IGF-I receptor and mesothe
  • the type of neoplastic antigen referred to in the present invention may also be a tumor-specific antigen (TSA) or a tumor-associated antigen (TM).
  • TSA is specific for tumor cells and does not occur on other cells of the body.
  • TAA related antigens are expressed on normal cells under conditions that are not native to tumor cells and instead also do not elicit an immunogenic resistance state to the antigen. Expression of antigens on tumors can occur under conditions that cause the immune system to respond to antigens.
  • TAA may be an antigen expressed on normal cells during fetal development if the immune system is immature and unable to react or may be an antigen expressed normally at very low levels on normal cells but at much higher levels on tumor cells.
  • TSA or TAA antigens include: MART-1 / MelanA (MART-I), gplOO (Prael 17), tyrosinase, TRP-1, TRP-2, differentiation antigens and MAGE-1 Tumor-specific multiline antigens such as, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, pl5; Overexpressed embryonic antigens such as CEA; Overexpressed oncogenes and mutated tumor-suppressor genes such as p53, Ras, HER-2 / neu; Native tumor antigen resulting from chromosomal translocation; For example BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; And viral antigens such as Epstein Barr virus antigen EBVA and human papillomavirus (HPV) antigens E6 and E7.
  • MART-1 / MelanA MART-I
  • gplOO Prael 17
  • Antibodies that specifically recognize the tumorous antigen include, for example, HuM195 (see, eg, Kossman et al., (1999) Clin. Cancer Res. 5: 2748-2755), CMA-676 (eg, Sievers et al., (1999) Blood 93: 3678-3684), AT13 / 5 (see, for example, Ellis et al. (1995) J. I : unol. 155: 925-937), HB7, trastuzumab ( For example, HERCEPTIN; Fornier et al., (1999) Oncology (Huntingt) 13: 647-58, TAB-250 (Rosenblum et al., (1999) Clin. Cancer Res.
  • HuM195 see, eg, Kossman et al., (1999) Clin. Cancer Res. 5: 2748-2755
  • CMA-676 eg, Sievers et al., (1999) Blood 93: 3678-36
  • CC49 e.g. , Pavlinkova et al. (1999) Clin. Cancer Res. 5: 2613-2619
  • B72.3 see, eg, Divgi et al., (1994) Nucl. Med. Biol. 21: 9-15
  • mouse monocle Ronald anti-HM1.24 IgG2a / ⁇ mouse monocle Ronald anti-HM1.24 IgG2a / ⁇
  • humanized anti-HM1.24 IgGl / ⁇ antibody see, eg, Ono et al. (1999) Mol. Iol uno.
  • trastuz Mab see, eg, HERCEPTIN, Fornier et al., (1999) Oncology (Huntingt) 13: 647-658
  • TAB-250 Rosenblum et al., (1999) Clin. Cancer Res. 5: 865-874
  • BACH- 250 Id.
  • TA1 see, eg, Maier et al. (1991) Cancer Res.
  • rituximab ibri Momab Tiuxetane (Ibritumotnabtiuxetan), and tosi tumomab, AME-133v (Applied Molecular Evolution), Ocrelizumab (Roche), OfaUimumab (Genmab), TRU- 015 (Trubion) and IMMU-106 (Immunomedics) Included, but not limited to.
  • the present invention need not limit the use of the antibodies described above, and other such antibodies as known to those skilled in the art can be used in the compositions and methods described herein.
  • IFN- ⁇ was first introduced as a therapeutic agent for multiple sclerosis in order to obtain an antiviral effect, but many studies have revealed its mechanism of action.
  • IFN- ⁇ inhibits antigen expression by inhibiting the activation of HLA class II molecules induced by IFN- ⁇ and prevents the activation of T cells.
  • IFN- ⁇ also inactivates Co-st imul atory molecules to inhibit T cell activation (28, 29) and induces autoreactive T cells to apoptosi s.
  • the effect of IFN- ⁇ on the brain-blood barrier is thought to inhibit T cells from adhering to vascular endothelial cells and to reduce the ability to enter the brain.
  • the human interferon-beta variant according to the present invention has improved activity and function compared to the native interferon-beta, and thus targets the form of an immunocytokine bound to an antibody that recognizes multiple sclerosis specific antigens. If used for 3 ⁇ 4, it may be better than the therapeutic effect of interferon-beta alone.
  • Multiple sclerosis specific antigens and antibodies include, for example, CD20 and the anti-chain ri tuximab that recognizes it, CD52 and the alpha receptors of the monoclonal antibodies alemtuzumab and interleukin-2 that recognize it, and dacl i horrab that recognizes it. It is not limited to this.
  • the present invention also provides an immunocytokine wherein the human interferon-beta variant is bound to the antibody or fragment thereof by a peptide linker.
  • Peptide linkers are molecules in which amino acids or amino acid-like substances connect two or more separate substances to each other by short fragments of amino acids or amino acid analogs linked to each other by peptide bonds. Glycine, serine, alanine, etc.
  • Glycine-serine linker may be used as the constituent amino acid.
  • the linker is composed of any one of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 11 Or may include it.
  • the immunocytokines of the invention may preferably comprise a flexible linker sequence inserted between the human interferon-beta variant and the polypeptide of the antibody or fragment thereof.
  • the linker sequence allows for effective positioning of the human interferon-beta variant of the antibody or fragment thereof to allow for functional activity of both domains.
  • the linker means a peptide linker of natural origin or a peptide linker of synthetic origin.
  • the peptide linker consists of a linear amino acid chain, wherein the 20 naturally occurring amino acids are monomer building blocks.
  • the linker may have a repeating amino acid sequence or may have a sequence of naturally occurring polypeptides, such as a polypeptide having a hinge function. All peptide linkers can be encoded recombinantly because they can be encoded by nucleic acid molecules. Since the linker is itself a peptide, human interferon-beta variants and antibodies or fragments thereof are linked to the linker via peptide bonds.
  • the linker consists of amino acids linked together by peptide bonds, preferably 1-20 amino acids linked by peptide bonds, wherein the amino acids are selected from 20 natural amino acids.
  • Suitable linkers include, for example, cleavable linkers and noncleavable linkers. Cleavable linkers are typically easily cleaved under intracellular conditions. Suitable cleavable linkers include, for example, peptide linkers cleavable by intracellular proteases such as lysosomal proteases or endosomal proteases. The linker is linked to, for example, the N-terminus of the linker to the heavy chain C-terminus of the antibody.
  • Linkage of the antibody to the heavy chain C-terminus preferably results in expression of the antibody of the invention.
  • the nucleotide sequence encoding the linker sequence in the vector may be directly linked to the antibody expressed by the expression vector by concatenating the protein expression frame.
  • the linker may be linked to the light chain C-terminus of the antibody or to both the light chain C-terminus and the heavy chain C-terminus of the antibody.
  • the C-terminus of the linker is linked to the N-terminus of the interfertain beta variant of the invention.
  • the peptide linker of the present invention may be a peptide linker known in the art, but preferably may be a glycine-serine linker or a peptide linker comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 11.
  • a gly-ser linker for example, (Gly x Ser y ) z type (x is an integer of 1 to 5, y is an integer of 1 to 2, z is an integer of 1 to 6), eg For example, (gly 4 se ri ) 3 or (gly 3 ser 2 ) 3 It may be, and more preferably may be a linker represented by the amino acid sequence of GGGGS or GGGGSGGGGSGGGSG, but is not limited thereto.
  • the present invention also relates to an amino acid sequence of the human interferon-beta variant polypeptide, wherein the amino acid sequence of the antibody or fragment thereof is in the heavy chain C—terminal, light chain C-terminal or heavy and light chain C-terminal positions.
  • the amino acid sequence of the human interferon-beta variant may be at the heavy chain C-terminus, light chain C-terminus or heavy and light chain C-terminus positions relative to the amino acid sequence of the antibody or fragment thereof, preferably the amino acid of the antibody or fragment thereof At the C-terminal position relative to the sequence.
  • the present invention also provides an immunocytokine, characterized in that the immunocytokine comprises an amino acid sequence of one of the group consisting of SEQ ID NO: 12, 13, 15 or 17.
  • the present invention (a) human represented by any one of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 4 Interferon-beta variants; (b) a peptide linker represented by any one of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 11; And (c) an immunocytokine comprising the antibody or fragment thereof.
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding the immunocytokine.
  • the polynucleotide may be used without limitation as long as it encodes a peptide of the immunocytokine to which the human interferon-beta variant of the present invention and an antibody or fragment thereof are bound, and include all DNA, cDNA, and RNA sequences.
  • the polynucleotide refers to a substance having a amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or encoding a peptide having an amino acid sequence having at least 70% homology with the amino acid sequence. It can be isolated from nature or prepared by known genetic engineering methods in the art.
  • the invention also provides a vector comprising said polynucleotide.
  • the vector refers to an expression vector prepared by a person skilled in the art to express the immunocytokine of the present invention by inserting the polynucleotide of the present invention into the vector according to any method known in the art and using an appropriate transcription / translational regulatory sequence.
  • the polynucleotide sequence cloned according to the present invention may be operably linked to an appropriate expression control sequence, wherein the operably linked gene sequence and expression control sequence include a selection marker and a replication icat ion origin. It can be included in one expression vector.
  • 'Operably l inked' means that the polynucleotide sequence is linked in a manner that allows gene expression to an expression control sequence.
  • the expression control sequence refers to a DNA sequence that controls the expression of a polynucleotide sequence operably linked in a particular host cell.
  • Such regulatory sequences are selected from the group consisting of a promoter for conducting transcription, any operator sequence for regulating transcription, a sequence encoding a suitable mRNA liposome binding site, and a sequence controlling termination of transcription and translation It can include the above.
  • the vector used as the mother vector of the expression vector is not particularly limited, and any plasmid, virus or other medium commonly used for expression in a microorganism used as a host cell in the art to which the present invention belongs can be used. .
  • the plasmids include Escherichia coli-derived plasmids (pBR322, pBR325, pUC118 and PUC119, pET-22b (+)), Bacillus subtilis-derived plasmids (pUBllO and pTP5), and yeast-derived plasmids ( ⁇ 13, ⁇ 24 and YCp50).
  • the virus may be an animal virus such as a retrovirus, adenovirus or vaccinia virus, or a nasal virus such as baclovirus, but is not limited to 3 ⁇ 4.
  • the present invention also provides a host cell transformed with the vector. The host cell may choose to modulate the expression of the inserted sequence or to advance the gene product in a particular desired manner.
  • Different host cells have characteristic and specific mechanisms for the translation and post-translational processing and modification of proteins. Suitable cell lines or host systems can be chosen to provide the desired modification and processing of the expressed heterologous protein. Expression in yeast can produce biologically active products. Expression in eukaryotic cells can increase the likelihood of "natural" folding.
  • Host cells capable of stably and continuously cloning and expressing the vector of the present invention may use any host cell known in the art, for example, E. coli JM109, E. coli BL21DE, E. coli DH5, E coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, and the like, and also Agrobacterium sp.
  • strains such as Agrobacterium A4, Bacillus subtilis Other enterobacteria such as bacilli, Salmonel la typhi murium or Serratia marcescens and various Pseudomonas genus strains such as is may be used as host cells.
  • the host cell may be a yeast (Saccharomycecerevisiae), a stromal cell and a human cell (eg, a CH0 cell line). (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN and MDCK cell lines) and the like.
  • the host cell may be preferably a CH0 cell line.
  • the method of transforming the host cell by transferring the vector into the host cell may be any known method and is not particularly limited. For example, calcium phosphate precipitation, DEAE— dextran method, electroporation, direct microinjection, DNA—DNA loaded liposome method, lipofectamine—DNA Liofectamine-DNA complex, cell sonicat ion, gene bombardment using high velocity microprojectile, polycation. And receptor-mediated transfection. Some of these techniques can be refined for in vivo or ex vivo use.
  • the present invention also includes the steps of (a) providing a host cell, (b) culturing a provided cell, and (c) recovering an immunocytokine from said cell or culture medium to produce an immunocytokine. It provides a method for producing an immunocytokine. Cultivation of the transforming microorganism is carried out under appropriate conditions that allow for the expression of immunocytokines in which the target protein, human interferon-beta variant, and the antibody or fragment thereof is bound, is carried out according to methods well known to those skilled in the art. can do.
  • the transforming microorganism can be cultured in large quantities by conventional culture methods.
  • As the culture medium a medium consisting of a carbon source, a nitrogen source, vitamins, and minerals may be used.
  • LB medium Lia-Bertani Broth
  • Cultivation of microorganisms is possible under conventional microbial culture conditions and may be, for example, incubated for 10 to 40 hours in a temperature range of 15 ° C. to 45 ° C. Centrifugation or filtration may be performed to remove the culture medium in the culture and recover only the concentrated cells, which steps may be performed by those skilled in the art as needed.
  • the concentrated cells can be frozen or lyophilised according to conventional methods so as not to lose their activity.
  • Proteins expressed in the transforming microorganism can be purified in a conventional manner, using, for example, salting out (eg ammonium sulfate precipitation, sodium phosphate precipitation), solvent precipitation (acetone, ethanol, etc.). Protein fraction precipitation), dialysis, gel filtration, ion exchange, column chromatography such as reverse phase column chromatography, and ultrafiltration may be applied alone or in combination to purify the immunocytokines of the present invention.
  • salting out eg ammonium sulfate precipitation, sodium phosphate precipitation
  • solvent precipitation acetone, ethanol, etc.
  • Protein fraction precipitation dialysis
  • gel filtration ion exchange
  • column chromatography such as reverse phase column chromatography
  • ultrafiltration may be applied alone or in combination to purify the immunocytokines of the present invention.
  • immunocytokines conjugated with human interferon-beta variants of the present invention immunocytokines can be prepared with a significantly better efficiency than human interferon-beta conjugated immunocytokines (see Example 2). Meanwhile, the present invention is '
  • the human interferon-beta variant provides a method for increasing the production of target specific human interferon-beta, characterized in that consisting of a peptide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4.
  • target specific human interferon-beta may represent the immune cytokine of the present invention.
  • the immunocytokines comprising the human interferon-beta variants of the present invention and antibodies or fragments thereof exhibit the activity of interferon-beta and the properties of the antibodies in Hung Shi, which can be used for targeting ' treatment of multiple sclerosis or cancer, and according to the present invention.
  • Immune cytokines can be produced with superior efficiency compared to immunocytokines conjugated with native interferon-beta.
  • FIG. 1 is a result of confirming the expression level of the immunocytokine prepared in the host cell according to the present invention through Western-blot (1: culture medium, 2: B12 heavy chain-natural interferon, 3: B12 heavy chain-interferon variant) , 4: B12 light chain-natural interferon, 5: B12 light chain-interferon variant).
  • Figure 2 is a schematic diagram showing an immunocytokine conjugated human interferon-beta variants of the present invention.
  • Figure 3 shows the process of constructing pRBLX2-INF by inserting the gene sequence consisting of heavy chain -l inker-interferon in the pRBLX2 vector (left) and the gene sequence consisting of heavy chain -1 inker-interferon-beta variant in the pRBLX2 vector.
  • This is a schematic diagram showing the process (right) to insert pRBLX2-INF.
  • Figure 4 confirms the expression of the immunocytokine conjugated to the human interferon-beta variant of the present invention (right) and the immunocytokine conjugated to the human interferon-beta (left) by SDS-PAGE. At this time, each heavy and light chain is marked with ⁇ (lane 1 is a marker).
  • Figure 5 shows the protein expression of the immunocytokines conjugated with the human interferon-beta variant (lane 2) of the present invention and the immunocytokines conjugated with the control human interferon-beta (lane 1), respectively. Left) and anti-interferon antibodies (right) were identified via Western blot ol.
  • Figure 6 is the result of confirming the expression level of the immunocytokine prepared in the host cell by BCA assay (ACC # 1: B12 heavy chain-natural interferon, ACC # 2: B12 heavy chain-interferon stool Variant, ACC # 6: B12 light chain-natural interferon, ACC # 7: B12 light chain-interferon variant).
  • Figure 7 is the result of confirming whether the interferon activity of the immuno-satokine in which the human interferon-beta variant and the B12 antibody in accordance with the present invention is phosphorylated STAT-1.
  • 8 is a result of confirming the interferon-beta activity through cytotoxicity after treatment with cells for 24 hours to the immune cytokine conjugated to human interferon-beta variant and B12 antibody according to the present invention (Carbi feron: human interferon-beta Variant, B12: B12 antibody, ACC # 2: human interferon-beta variant and B12-coupled immunocytokine).
  • FIG. 9 is a result of confirming the interferon-beta activity through cytotoxicity after treating the cells with immune cytokines in which the human interferon-beta variant and the B12 antibody are combined for 48 hours according to the present invention
  • Carbi feron human interferon-beta Variant
  • B12 B12 antibody
  • ACC # 2 human interferon-beta variant and B12-coupled immunocytokine
  • Figure 10 shows a schematic diagram of an immunocytokine prepared by binding a human interferon-beta variant after binding the Rigid Hel ical linker to the ERBB2 antibody (A) and c-MET antibody (B).
  • CHO-S cells were transfected at least 5 passages at a density of 3X10 5 cells / ml to prepare for transformation. After passage, cell survival was maintained at 90% or more, and the cells were seeded at a density of 5 ⁇ 10 5 cells / ml to prepare for transformation. After 24 hours of cell seeding, the survival rate (> 9) and the cell density (1X106 eel ls / ml) were checked, and 50ug DNA was transformed into CHO-S cells incubated in 30ml culture medium using a transformation solvent. .
  • reagent A including sodium carbonate, Bicinchoninic acid, etc.
  • reagent B including 4% cupric sulfate
  • FIG. 5 shows a schematic diagram of the structure of the immunocytokine conjugated with human interferon-beta variants.
  • the linker represented by SEQ ID NO: 5 and the interferon-beta and interferon-beta variants were cloned into the heavy chain region of the antibody. Then, the restriction gene Avrl l (CCTAGG) cleavage site and the Bstzl7I (GTATAC) cleavage site were inserted at the 3'-end and 5'-end of the entire gene, respectively, to secure the final gene of the heavy chain. In addition, the final gene of the light chain was secured by inserting restriction enzyme EcoRV (GATATC) cleavage site and PacI (TTMTTAA) at the 3 '-and 5'-terminal ends of the light chain of the antibody. The process shown in Figure 3 is shown in a schematic diagram.
  • the prepared sample was loaded on a Tricine SDS-PAGE gel with a marker and subjected to electrophoresis for 1 hour and 30 minutes at a voltage of 130v. After that, the gel was carefully separated and immersed in the Coassie blue staning solut ion and shaken for 30 minutes for dyeing. After dyeing, the gel was transferred to Destaning buffer and shaken for 30 minutes to destain. Destaining was performed three times.
  • Interferon ⁇ antibody was prepared by diluting 1: 1000 in TBS-T, and anti-human IgG-HRP antibody was prepared by diluting 1: 3000 in TBS-T.
  • the membrane was immersed in an antibody dilution and reacted by shaking for 2 hours at room temperature. After this process, the mixture was wiped with TBS-T three times for 10 minutes, and reacted for 1 hour by adding a secondary antibody conjugated with horseradi sh peroxidase (HRP) at room temperature. After performing the washing process once again, the band was confirmed by ECL reagent (enhanced chemi luminescence reagent, Intron). The intensity of the band was measured using C-DiG (LI-C0R, USA).
  • lane 1 is an immunocytokine conjugated with human interferon-beta
  • lane 2 is an immunocytokine conjugated to the human interferon-beta variant.
  • Tr i c ine-SDS PAGE and Western blotting it was confirmed that the expression level of immunocytokine conjugated with human interferon-beta mutant was higher than that of human immuno-conjugated immunocytokine.
  • the culture was measured in Cedex bio (Roche, USA), respectively, for accurate comparison of expression levels.
  • the expression level of human interferon-beta conjugated immunocytokine was confirmed to be low at the concentration below the measurement range (10 mg / L or less), and the immunocytokine conjugated with human interferon-beta variant was about 32 mg / L. It was confirmed that the expression increased by at least three times.
  • 3xl0 5 0VCAR-3 cells were dispensed into each wel l of 6-wel l plate and incubated in 37.5 ° C., 5% C02 environment for 24 hours. After 24 hours, the cell cultures were removed and cultured to a concentration of 600 ng / ml of human interferon-beta mutant (600 ng / ml of human interferon-beta mutant and immunocytokine (ACC) conjugated with B12 antibody) or 1800 ng / ml. The plate was collected and treated for 1 hour, after which the plates were collected and washed three times with each wel of PBS, followed by RIPA buffer containing a protease inhibitor and a phosphatase inhibitor.
  • ⁇ was treated and placed on Ice for 30 minutes to lyse the cells.
  • the lysed cells were placed in a 1.5 ml tube and centrifuged at 13000 rpm and 4 ° C to collect only the supernatant (lysate) and collected in a new tube.
  • the protein concentration of the lysate was quantified using BCA quantification method, and 30yg lysate was collected, mixed with 5x sample buffer, and boiled at 10 (C for 10 minutes to induce protein denaturation.
  • the 3M paper was covered again, soaked in transfer buffer, and protein transfer was performed for 90 minutes at 100 volts. Blocked for 1 hour and 30 minutes in Tris-buffered saline-Tween 20 (TBS-T, 0.1% Tween20) containing 3 ⁇ 4 of BSA, and 1: 1000 in TBS-T for anti-p-STATl antibody
  • TBS-T Tris-buffered saline-Tween 20
  • the anti-GAPDH antibody was prepared by diluting 1: 3000 in TBS-T.
  • the membrane was immersed in antibody dilution and shaken at room temperature for 2 hours. After this procedure, the mixture was wiped with TBS-T three times for 10 minutes, and reacted for 1 hour by adding a secondary antibody bound to horseradish peroxidase (HRP) at room temperature. After washing again, the pu and band were treated with an ECL reagent (enhanced chemi luminescence reagent, Intron) and then developed on the film.
  • the cell cultures were removed and treated with human interferon-beta mutant (carbiferon), B12 antibody and immunocytokine at a concentration of 10-L0000ng / ml, followed by incubation for 24 hours or 48 hours. It was. After incubation for 24 hours or 48 hours, remove the culture medium, proceed with PBS wash twice, and mix WST reagent 1: 10 into the culture solution and treat ⁇ ⁇ ⁇ for each wel, followed by 37.5 ° C, After standing in a 5% C02 environment, absorbance at 430 nm was measured.
  • cytotoxicity was not found in the cell group treated with B12 antibody alone, but cytotoxicity was shown to be concentration dependent in the cell group treated with human interferon-beta and immunocytokines. It was also confirmed that it still exhibits interferon activity (FIGS. 8 and 9).
  • an immunocytokine conjugated with an interferon-beta variant was prepared as follows.
  • a Rigid Hel ical linker was coupled to a heavy chain region of an ERBB2 (Hercept in) antibody and a c-MET antibody.
  • An expression cassette was then prepared that binds human interferon-beta variants to express anti-c-Met immunocytokines (A) and anti-ERBB2 immunocytokines (B).
  • Clones were then cloned into pRBLX2, and each vector was trans-patterned into CH0-S cells, followed by incubation for 7 days. Recovery of transfect ions, cultures and expressions was performed as described in Example 4.
  • the expression levels of CH0-S cells were compared, the expression levels of the immunocytokines conjugated with the human interferon-beta conjugated to the c— Met antibody or the ERBB2 antibody and the immunocytokines conjugated with the human interferon-beta variant were compared.
  • the expression levels of immunocytokines conjugated with human interferon-beta variants were higher and that interferon activity was better.
  • the expression of the human interferon-beta variant of the present invention is very well compared to the wild type interferon beta.
  • immune cytokine beta variants are bonded-human interferon in accordance with the present invention. It can be used as a target therapeutic agent for diseases such as multiple sclerosis and cancer in that both the interferon activity superior to the native interferon-beta and the characteristics of the antibody that recognize a specific antigen are shown. Compared to the immunocytokine, the industrial efficiency is excellent because the production efficiency is significantly higher.

Abstract

본 발명은 인간 인터페론 -베타 변이체 및 항체 또는 그 단편이 접합된 면역사이토카인 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 상기 인간 인터페론-베타 변이체는 천연형 인터페론-베타와 비교해 그 활성 또는 기능이 우수하며, 본 발명에 따른 면역사이토카인은 그 생산성이 우수하다. 또한, 본 발명에 따른 면역사이토카인은 인터페론-베타의 기능 및 특정 항원에 결합하는 항체의 특성이 모두 발현되어 있어 다발성 경화증, 암 등의 표적치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
인간 인터페론 -베타 변이체가 접합된 면역사이토카인 및 이의 제조방법 【기술분야】
본 발명은 인간 인터페론 -베타 변이체가 접합된 면역사이토카인 및 이의 제 조방법에 관한 발명으로, 보다 구체적으로는 천연형 인터페론-베타보다 활성 및 기 능이 우수한 인터페론 -베타 변이체와 항체가 결합된 면역사이토카인 및 이의 제조 방법에 관한 발명이다.
【배경기술】
본 출원은 2015년 3월 3일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2015-0030037호 를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다. 약제에 있어서 면역요법은 면역 시스템을 조절하여 예방 및 /또는 치료 목표 를 달성하기 위한 개념에 기초하는 다수의 치료 전략들을 나타낸다. 지난 수년간， 면역요법은 여러 병리상태들의 치료 또는 예방을 위해 사용되 어왔다. 모노클로날 항체들을 생산하기 위한 세포 융합 기법이 개발된 이래， 다수 의 모노클로날 항체들아 연구자들에 의해 제조되었다. 그 후， 인간 모노클로날 항 체를 생산하기 위한 B 세포 하이브리도마 기법 및 EBV 하이브리도마 기법을 포함한 다른 기법들이 모노클로날 항체의 제조를 위해 개발되었다. 모노클로날 항체 (Mab)는 거의 모든 에피토프를 표적으로 하기 위하여 개발될 수 있다. 특정 세포 /분자에 대한 특이적인 인식 및 결합의 성질은 다양한 질환 상 태들에 대한 진단 및 치료 시약으로서 Mab의 개발을 고무시켰다. 재조합 DNA 기법 은 인간에게 투여하도록 키메라 또는 인간화 항체를 제조하는데 사용되었다. 현재， 여러 모노클로날 항체들이 암， 감염성 질환, 면역 질환 등의 치료를 위해 예를 들 어 RITUXAN® , HERCEPTIN® , AVASTIN®등으로서 시판되고 이용된다. 모노클로날 항체는 표적화된 분자이며， 병리 조직과 같은 특이작 영역 (세포， 조직 등) 내에 편재화될 수 있다. 이러한 성질에 의해, 병리 조직부위에서 특이적 분자를 표적화하려는 노력으로 다양한 물질 (페이로드 (payload))에 컨쥬게이션된 Mab의 개발이 또한 야기되었다. 이러한 물질 (페이로드)은 록신, 약물， 방사성핵종， 프로드럭 화합물ᅳ 등일 수 있다. 이들 결합의 다수는 항체의 특정 제조， 번거톱고 변형되기 쉬울 수있는 과정과 함께 반응성 모이어티 (페이로드)의 화학적 컨쥬게이 션을 포함한다 (US 4,671 ,958) . 새로운 이들 분자들 중에서， 면역사이토카인은 특히 관심대상이다. 상기 면 역사이토카인은 항체 및 사이토카인을 포함하는 융합 단백질을 의미한다. 이러한 단백질은 항원 -결합 능력 및 사이토카인 활성을 모두 보유한다. 사이토카인은 호르몬과 신경전달물질처럼 세포간 통신에 광범위하게 사용되 는 시그널링 단백질 및 당단백질의 카테고리이다. 호르몬이 특이적 기관에 의해 혈 액으로 분비되고， 신경전달물질이 신경 활성에 연관되는 것인 반면， 사이토카인은 기원 및 목적의 측면에서 더 다양한 화합물 군이다. 이는 광범위한 조혈 및 비-조 혈 세포 유형들에 의해 생산되고， 근처의 세포에 대해 영향을 미치거나 유기체 전 체에 걸쳐 영향을 미칠 수 있으며， 때로는 다른 화학물질의 존재에 강하게 의존한 다. 사이토카인 패밀리는 질량이 8 내지 30 kDa이고 더 작은 수용성 단백질 및 당 단백질로 주로 구성된다. 사이토카인은 선천 및 적웅 면역 반응 모두의 기능화에 대해 중요하다. 종종 사이토카인은 병원균과 만난 면역 세포에 의해 분비되어, 더 많은 면역 세포들을 활성화시키고 모집하고 병원균에 대한 시스템 반응을 증가시키 는 역할을 한다. 사이토카인 증에서， 인터페론 ( IFNs)은 사이토카인의 일종으로서 항 바이러스 활성을 나타내고, 세포 증식을 억제하며， 자연 면역 반응을 조절하는 기능을 갖는 데， 이 중 인터페론 -베타 ( interferon-beta; IFN-β )는 5개의 알파 헬릭스를 가지고 있는 구형 단백질로서， 크기는 22 kD이며 당쇄를 제거하면 18 kD이 된다 (Arduini 등 Protein Science 8： ppl867-1877, 1999) . 인터페론-베타의 임상 적용에 관한 연구는 활발하게 진행 증에 있고, 특히 다발성 경화증 (Mul t iple Sclerosis)에 대한 증상의 완화， 경감 또는 치료제로 각광 을 받고 있다 (Goodkin 등 Mult iple sclerosis : Treatment opt ions for pat ients wi th r e 1 aps i ng-r em i 11 i ng and secondary progressive mult iple sclerosis , 1999) . 다발성 경화증 이외에도 인터페론-베타는 항바이러스 활성， 세포 성장 억제 또는 항 성장 활성， 림프구 세포 독성 증대 활성, 면역 조절 활성, 표적 세포의 분 화 유도 또는 억제 활성， 대식세포의 활성화 활성， 사이토카인 생성의 증가 활성， 세포독성 T세포의 효과 증가 활성， 자연 살해 세포 (natural ki l l ing cel l )의 증가 활성 등의 다양한 면역학적 활성으로 암， 자가 면역 장애 및 바이러스 감염， HIV와 관련된 질병， C형 간염, 류마티스성 관절염 등에 치료 등의 효과가 있다는 보고가 있다 (Pi l l ing 등 European Journal of I議 unology 29： p 1041-1050 , 1999 , Young 등 Neurology 51： pp 682—689， 1998 , Ci rel l i 등 1995 Maj or therapeut i c uses of interferons . CI in I隱 unother 3 : pp 27-87) . 인간 인터페론-베타도 당단백질의 일종인데， 이러한 단백질에 연결된 당쇄 부분이 그 단백질의 활성에 중요한 역할을 한다. 따라서 당단백질의 경우 당쇄를 부가시키게 되면 그 활성이 증가하는 경우가 있을 수 있다. 전술한 바의 관점에서 당단백질인 인간 천연형 인터페론-베타에 당쇄를 도입 시켜 그 활성이나기능이 증가 또는 향상된 인간 인터페론 -베타 변이체가 한국 등 톡특허 10-0781666호에 개시되어 있다. 이에， 천연형 인터페론-베타의 약리효과보다 우수한 효능을 나타내는 인간 인터페론 -베타 변이체를 표적화 치료에 이용하기 위해 항체와 접합한 면역사이토카 인에 대한 개발이 필요하며 이를 높은 수율로 얻을 수 있는 제조방법이 요구된다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명의 발명자들은， 인간 천연형 인터페론-베타에 당쇄를 도입시켜 그 활 성이나 기능이 증가 또는 향상된 인간 인터페론 -베타 변이체가 항체와 결합된 면역 사이토카인을 발명하고， 이러한 면역사이토카인의 숙주세포에서의 발현량이 천연형 인터페론-베타와 항체가 결합된 면역사이토카인에 비해 현저히 향상되어 있음올 발 견하고 본 발명을 완성하게 되었다. 따라서， 본 발명의 목적은 (a) 인간 인터페론 -베타 변이체; 및 (b) 상기 인 간 인터페론 -베타 변이체에 직접 또는 간접적으로 공유 결합된 항체 또는 이의 단 편을 포함하는 면역사이토카인으로서, 상기 인간 인터페론 -베타 변이체는 ( i ) 서열 번호 1에 개시된 아미노산 서열 전체를 포함하는 폴리펩티드， ( i i ) 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드， ( i i i ) 상기 (a) 또 는 (b)의 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택되고 인간 인터페론 -베타 활성을 지니는 폴리펩티드로서， N-연결형 당쇄를 포함하는 폴 리펩티드인 면역사이토카인을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 면역사이토카인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 (a) 인간 인터페론 -베타 변이체; (b) 펩티드 링커 및 (c) 항체 또는 이의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오 티드를 발현 백터에 클로닝하는 단계;
(b) 상기 발현 백터를 숙주 세포에 클로닝하는 단계;
(c) 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(d) 상기 세포 또는 배양 배지로부터 상기 융합 폴리펩티드를 회수하는 단계 를 포함하며，
상기 인간 인터페론 -베타 변이체는 서열번호 2 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 펩티드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 타겟 특이적 인간 인터 페론-베타의 생산량 증가 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백터를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 백터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이 다. 본 발명의 다른 목적은 (a) 숙주 세포를 제공하는 단계， (b) 제공된 세포를 배양하는 단계 및 (c) 상기 세포 또는 배양 배지로부터 면역사이토카인올 회수함으 로써 면역사이토카인을 제조하는 단계를 포함하는 면역사이토카인 제조방법을 제공 하는 것이다. 【기술적 해결방법】
상기의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 (a) 인간 인터페론 -베타 변이체; 및 (b) 상기 인간 인터페론 -베타 변이체에 직접 또는 간접적으로 공유 결합된 항체 또는 이의 단편올 포함하는 면역사이토카인으로서， 상기 인간 인터페론 -베타 변이 체는 ( i ) 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열 전체를 포함하는 폴리펩티드， ( i i ) 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드, ( i i i ) 상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택되고 인간 인터페론 -베타 활성을 지니는 폴리펩티드로서， N-연결형 당 쇄를 포함하는 폴리펩티드인 면역사이토카인을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 (a) 인간 인터페론 -베타 변이체; (b) 펩티드 링커 및 (c) 항체 또는 이의 단편올 포함하는 융합 폴리펩티드를 암호화하 는 폴리뉴클레오티드를 발현 백터에 클로닝하는 단계;
(b) 상기 발현 백터를 숙주 세포에 클로닝하는 단계;
(c) 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(d) 상기 세포 또는 배양 배지로부터 상기 융합 폴리펩티드를 회수하는 단계 를 포함하며 ,
상기 인간 인터페론 -베타 변이체는 서열번호 2 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 펩티드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 타겟 특이적 인간 인터 페론-베타의 생산량 증가 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 면역사이토카인을 인 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백터를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 백터로 형질전환된 숙 주세포를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 (a) 숙주 세포를 제공하는 단계, (b) 제공된 세포를 배양하는 단계 및 (c) 상기 세포 또는 배양 배지로부터 면역사이토카인을 회수함으로써 면역사이토카인을 제조하는 단계를 포함하는 면역 사이토카인 제조방법을 제공하는 것이다. 이하 본 발명을 상세히 설명한다. 사이토카인의 치료 잠재력은 저농도에서도 일어나는 중증 부작용에 의해 종 종 제한을 받으며， 이로써 표적 조직에 층분한 사이토카인 농도가 존재하지 못하게 한다. 이에， 사이토카인의 치료 잠재력을 증가시키고 정상 조직을 독성 효과로부터 보호하기 위해 항체를 사용하여 사이토카인을 표적화하고 이를 질병 부위에 전달하 는 것이 면역사이토카인에 의해 가능하다. 본 발명에 따른 면역사이토카인은 인간 인터페론-베타의 변이체로， 천연형 인터페론-베타에 당쇄를 도입시켜 그 활성이나 기능이 증가 또는 향상된 사이토카 인이다. 본 발명의 발명자들은 상기 인간 인터페론 -베타 변이체를 항체와 결합하여 면역사이토카인의 형태로 다발성 경화증， 바이러스성 질환 등의 표적치료에 이용할 수 있다면， 천연형 인터페론 -베타 7} 접합된 면역사이토카인과 비교해 치료효과가 우수할 수 있음에 착안하여 본 발명을 완성하였다. 따라서， 본 발명은 (a) 인간 인터페론 -베타 변이체; 및 (b) 상기 인간 인터 페론 -베타 변이체에 직접 또는 간접적으로 공유 결합된 항체 또는 이의 단편을 포 함하는 면역사이토카인으로서， 상기 인간 인터페론—베타 변이체는 ( i ) 서열번호 1 에 개시된 아미노산 서열 전체를 포함하는 폴리펩티드， ( i i ) 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드， ( i i i ) 상기 (a) 또는 (b) 의 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택되고 인간 인 터페론 -베타 활성을 지니는 폴리펩티드로서， N-연결형 당쇄를 포함하는 폴리펩티드 인 면역사이토카인을 제공한다. 천연형 인간 인터페론-베타에 비하여 그 활성 또는 기능이 증가 또는 향상된 상기 인간 인터페론 -베타 변이체는， 천연형 인간 인터페론 -베타 또는 천연형 인간 인터페론 -베타 변이체에서 그 아미노산 서열의 C-말단에 글리신-아스파라긴-이소루 이신-트레오닌 -발린 서열을 포함하고， 상기 부가 서열의 아스파라긴 잔기에 N-연결 형 당쇄를 포함함을 특징으로 한다. 청구범위를 포함하는 본 명세서에서 상기 "천연형 인간 인터페론 -베타 변이 체"는 천연형 인간 인터페론-베타에서 유래된 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 지니면서 인간 인터페론-베타의 활성을 지니는 모든 폴리펩티드를 포함하는 의미이 다. 상기에서 "인간 인터페론-베타의 활성"이란 인간 인터페론-베타가 지닌다고 알려진 활성 중에서 어떠한 폴리펩티드가 인간 인터페론-베타로 동정되기에 층분한 하나 이상의 활성으로 정의된다 . 그러한 활성으로서는 이미 전술한 바의 다발성경 화증에 대한 경감， 완화 또는 치료 활성， 항바이러스 활성， 세포 성장 억제 활성， 항 성장활성， 항 증식 활성, 림프구세포독성 증대 활성， 면역 조절 활성， 표적 세 포의 분화 유도 또는 억제 활성, 사이토카인 생성의 증가 활성, 세포독성 T세포의 효과 증가 활성， 대식세포의 효과 증가 활성, 자연 살해 세포 (natural ki l l ing cel l )의 증가 활성， 암 예방 또는 치료 활성， 자가 면역 장애 예방 또는 치료 활 성， 바이러스감염 예방 또는 치료 활성， HIV와 관련된 질병의 예방 또는 치료 활 성， C형 간염 예방 또는 치료 활성， 류마티스성 관절염 예방 또는 치료 활성 등을 예시할 수 있다. 또한 상기에서 "천연형 인간 인터페론-베타에서 유래된 아미노산 서열의 전 부 또는 일부를 지니는 폴리펩티드' '란 천연형 인간 인터페론-베타의 아미노산 서열 인 서열번호 1의 아미노산 서열 전체 또는 그 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티 드이거나 이러한 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 폴리펩티드를 포함하는 의미이 다. 여기서， 상기 "서열번호 1의 아미노산 서열 전체의 실질적인 부분을 포함하 는 폴리펩티드"란 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 천연형 인간 인터페론 -베타 에 비하여 동둥 또는 그 이상의 활성을 가지거나， 활성은 낮더라도 여전히 인간 인 터페론-베타의 활성을 보유하는 서열번호 1의 아미노산 서열의 일부분을 포함하는 폴리펩티드로 정의되며， 상기 "서열번호 1에 개시된 아미노산 서열 전체 또는 그 실질적인 부분과 실질적으로 유사한 폴리펩티드' '란 서열번호 1의 천연형 인간 인터 페론-베타에 비하여 동등 또는 그 이상의 활성을 가지거나， 활성은 낮더라도 인간 인터페론-베타의 활성을 여전히 보유하면서 하나 이상의 치환된 아미노산을 포함하 는 서열번호 1의 아미노산 서열 전체 또는 그 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티 드로 정의된다. 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열 전체의 실질적인 부분을 포함하는 폴리 펩티드로서 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에서 N-말단 부분 및 /또는 C-말단 부분이 결실된 경우를 들 수 있고， 서열번호 1에 개시된 아미 노산 서열 전체 또는 그 실질적인 부분과 실질적으로 유사한 폴리펩티드로서 하나 이상의 아미노산이 치환되더라도 치환 전의 아미노산이 치환된 아미노산과 화학적 으로 등가인 경우， 예컨대 소수성 아미노산인 알라닌이 다른 소수성 아미노산으로 치환된 경우， 특히 더 소수성인 아미노산, 예를 들면 발린， 류신 또는 이소류신으 로 치환된 경우를 들 수 있다. 물론 경우에 따라서는， N-말단 부분, C-말단 부분， 또는 치환된 아미노산이 인간 인터페론-베타의 활성에 필수적인 모티프에 관여함으로써， N-말단 부분 및 /또 는 C-말단 부분이 결실된 폴리펩티드나 치환된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드가 인간 인터페론-베타의 활성을 나타내지 않는 경우가 있을 수 있겠지만， 그럼에도， 서열번호 1에서 유래한 위 폴리펩티드가 상기 예시된 활성들 중 하나 이상을 가지 는가를 확인함을 통해서, 및 /또는 그 밖에 본 발명의 출원시를 기준으로 당업계에 공지된 인간 인터페론 -베타 동정과 관련된 방법을 통해서， 그러한 비활성의 폴리펩 티드를 활성의 폴리펩티드와 구분하고 검출해내는 것은 당업자의 통상의 능력 범위 내에 속한다. 따라서, 본 발명의 인간 인터페론 -베타 변이체는 C-말단에 글리신-아스파라 긴-이소루신-트레오닌 -발린 서열을 포함하고 그 위치에 N-연결형 당쇄를 포함하면 서， 인간 인터페론 -베타 활성올 지니는 하기의 폴리펩티드 또는 야생형의 인터페론 베타의 27번 아르기닌 (R27)부위가 트레오닌으로 변이 (R27T)되거나 세린으로 변이 (R27S)된 것 중 하나로 정의되어 질 수 있으며， 보다 바람직하게는 서열번호 2 내 지 서열번호 4 중 어느 하나의 아미노산 서열올 포함하는 폴리펩티드를 의미한다.
(a) 서열번호 1에 개시된 아미노산서열 전체를 포함하는 폴리펩티드;
(b) 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩 티드; (c) 상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 폴리펩티드 그러므로, 본 발명의 인간 인터페론 -베타 변이체는 C-말단에 글리신-아스파 라긴-이소루이신-트레오닌 -발린 서열을 포함하면서 그 위치에 N-연결형 당쇄를 포 함하는， 인간 인터페론 -베타 활성을 지니는 모든 폴리펩티드로서 이해되어야 한다. 이처럼， 본 발명의 인간 인터페론 -베타 변이체는 C-말단에 글리신-아스파라 긴-이소루신-트레오닌 -발린 서열을 포함하면서 그 위치에 N-연결형 당쇄를 포함하 는 인간 인터페론 -베타 활성을 지니는 모든 폴리펩티드로 정의된다. 보다 바람직하게는 본 발명의 '인간 인터페론 -베타 변이체' 는 서열번호 2 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 인터페론-베타의 뮤테인 (mutein)일 수 있으며， 본 발명자들에 의해서 카비페론으로 명명되었다. 본 발명의 카비페론은 천연형 인터페론-베타에 당쇄가 1개 내지 2개가 추가된 형태를 취한다. 보다 바람 직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 천연형 인간 인터페론-베타에서 27번 아미노산인 아르기닌 (R)을 트레오닌 (T) 또는 세린 (S)으로 치환시키거나 그 천연형 인간 인터페론-베타의 C-말단에 글리신-아스파라긴-이소루신-트레오닌 -발린 (G-N-I- T-V) 서열을 포함하면서 그 위치에 N-연결형 당쇄를 포함하는 폴리펩티드를 의미한 다.
인간 인터페론 -베타 변이체는 천연형 인터페론-베타에 비하여 향상 또는 증 가된 항바이러스 활성， 세포 성장 억제 활성， 면역 조절 기능， 생체 내에서의 반감 기를 보인다.
상기 서열번호 2는 인터페론 β 변이체인 R27T의 아미노산 서열이며, 서열번 호 3은 서열번호 1의 27번 아미노산이 S로 치환된 인터페론 β 변이체 R27S이다. 또 한, 상기 서열번호 4는 종결코돈 뒤에 GNITV 아미노산을 포함하는 인터페론 β 변이 체 GNITV의 아미노산 서열이다. 상기 서열번호 1 내지 4는 Ν말단에 개시코돈 포함 하는데， 서열번호 1 내지 4의 단백질은 다른 링커와 연결될 때 (링커의 C말단과 카 비페론의 Ν말단이 연결) 생략될 수 있다. 즉， 서열번호 1 내지 4 단백질 개시코돈 의 염기서열 ATG또는 아미노산 서열 메티오닌은 생략될 수 있다. 한편, 상기 '인간 인터페론 -베타 변이체' 는 한국 등록특허 10-0781666호에 상세하게 기록되어 있다. 본 발명에서의 항체는 광의로 사용되며， 단클론성 항체, 다클론성 항체, 다 중특이성 항체 (예를 들면， 이중특이성 항체)， 및 항체 단편 (목적하는 항원 -결합 활 성을 나타내는 한)을 포함하나 이로 한정되지는 않는 다양한 항체 구조를 포함한 다. 천연 항체는 다양한 구조를 갖는 분자이다. 예를 들면， 천연 IgG 항체는 여기 서 다이설파이드-결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 이루어진， 약 150,000 달톤의 사량체 당단백질이다. N-말단에서 C-말단까지， 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 도메인 (VH)에 이어서， 3개 또는 4개의 불변 도메인 (CHI, CH2, CH3 및 선택적으로 CH4)을 갖는다. 유사하게， N-말단에서 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으 로도 불리는 가변 도메인 (VL)에 이어서， 불변 경쇄 (CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는， 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로， 카파 ( κ ) 및 람다 ( λ )로 불리는 2가지 유형중 하나로 지정될 수 있다. 본 발명에서의 항체는 인간 항체， 키메라 항체 및 /또는 인간화 항체일 수 있 으나 이에 제한되지는 않는다. 상기 키메라 항체는 뮤린 면역글로불린의 가변 영역과 인간 면역글로불린의 보존 영역으로 구성되는 항체를 의미한다. 이러한 변형은 단순히 인간 항체의 보존 영역을 뮤린 보존 영역으로 치환시키는 것으로 구성되며， 이에 따라 약학적 용도에 대해 허용가능하도록 층분히 낮은 면역원성을 가질 수 있는 인간 /뮤린 키메라를 생 성한다. 상기 인간화 항체란 비 -인간 상보성결정영역 (CDR)을 갖는 항체의 서열을 변 형시킴으로써 인간 항체 생식세포 (germl ine)로부터 유래된 아미노산 서열로 (부분 적으로 또는 전체적으로) 구성된 항체를 의미한다. 항체의 가변영역 및 CDR의 인간 화는 당업계에 잘 알려져 있는 기법에 의해 수행된다. 이러한 항체는 Fc 의존적 이 펙터 기능올 위해 필요하지만 항체에 대한 면역 반응을 훨씬 덜 유발시킬 것 같은 인간 보존 영역을 보유한다. 일례로서， 가변 영역의 프레임워크 영역은， 비 -인간 CDR을 실질적으로 온전하게 남겨놓거나 또는 심지어 CDR을 인간 게놈으로부터 유래 된 서열로 대체한 상응 인간 프레임워크 영역에 의해 치환된다 (예컨대， 특허출원 US 2006/25885 참조) . 전체 (ful ly) 인간 항체는 인간 면역 시스템에 상웅하도록 면 역 시스템이 변형된 유전개질 마우스에서 생산된다. 인간화 항체는 또한 인간 프레 임워크， 비 -인간 항체의 하나 이상의 CDR을 포함하고, 존재하는 임의의 보존 영역 이 인간 면역글로불린 보존 영역과 실질적으로 동일한, 즉 약 85% 또는 90% 이상이 동일한， 바람직하게는 95% 이상이 동일한, 항체를 나타낸다. 따라서， 인간화 항체 의 모든 부분 (아마도 CDR은 제외하고)은 하나 이상의 천연 인간 면역글로불린 서열 의 상웅하는 부분과 실질적으로 동일하다. 본 발명에서의 항체 단편은 항체 대응물 (counterpart )과 동일한 항원과 반응 할 수 있는 항체 단편을 나타낸다. 이러한 단편은 통상의 기술자에 의해 간단하게 동정될 수 있으며， 여기에는 일례로서 Fab 단편 (예컨대， 파파인 소화에 의한 단편 )， Fab ' 단편 (예컨대， 펩신 소화 및 부분적 환원에 의한 단편)， F(ab ' )2 단편 (예컨 대， 펩신 소화에 의한 단편)， Facb (예컨대， 플라스민 소화에 의한 단편)， Fd (예컨 대， 펩신 소화, 부분적 환원 및 재웅집에 의한 단편)， 및 scFv (단쇄 Fv; 예컨대， 분자생물학 기법에 의한 단편) 단편이 포함된다. 상기 단편은 당업계에 알려져 있 거나 및 /또는 본원에 개시되어 있는 바와 같이， 효소 분할， 합성 또는 재조합 기법 에 의해 생산될 수 있다. 본 발명에 따른 인간 인터페론 -베타 변이체가 접합된 면역사이토카인은 항체 자체에서는 나타나지 않는 세포독성 및 pSTAT-1의 인산화를 유도하여 인터페론-베 타 활성을 나타내는 것으로 확인되었다 (실시예 3 및 4 참조) . 본 발명은 또한 상기 항체 또는 이의 단편은 종양성 항원 및 다발성 경화증 특이적 항원을 포함하는 군에서 선택된 항원에 대한 항체 또는 이의 단편인 것을 특징으로 하는 면역사이토카인을 제공한다. 일정한 크기 이상으로 성장한 종양은 더 성장하거나 다른 부위로 전이하기 위해서 새로운 혈관을 형성할 필요가 있게 된다. 따라서 새로운 혈관의 형성과 관 련된 분자들 및 신호전달체계는 항암치료에 있어서 중요한 치료 타켓이 될 수 있 다. 한편， 인터페론-베타는 종양세포의 혈관신생 작용에 대한 저해작용을 함으로써 종양세포의 성장을 억제하는 것으로 보고되고 있다. 또한 인터페론-베타는 종양이 존재하는 부위의 주변 환경에서 선천성 또는 후천성 면역반옹을 유도함 ^로써 종양 세포의 사멸을 유도해 항암효과를 나타낼 수 있다. 이에, 본원발명에 따른 인간 인터페론ᅳ베타 변이체는 천연형 인터페론 -베타 와 비교하여 그 활성 및 기능이 향상되어 있기 때문에， 종양성 항원을 특이적으로 인식하는 항체와 결합된 면역사이토카인의 형태로써 암 환자의 타켓치료에 사용된 다면 천연형 인터페론-베타가 접합된 면역사이토카인에 비해 더 우수한 치료효과를 나타낼 수 있다. 상기 종양성 항원은 면역 반옹, 특히 T-세포 매개된 면역 반응을 이끌어내는 종양 세포에 의해 생산되는 단백질이다. 종양 항원은 당해 기술분야에 잘 알려져 있고， 예를 들면， 글리오마—관련된 항원， 암배아 항원 (CEA) , β -인간 융모성 생식 샘자극호르몬, 알파태아단백질 (AFP) , 렉틴-반웅성 AFP, 티로글로불린， RAGE-1 , 丽- CA IX， 인간 텔로머라제 역전사효소， RU1 , RU2CAS) , 장 카르복실 에스테라제， mut hsp70-2, M-CSF, 프로스타제， 전립선-특이적 항원 (PSA) , PAP, NY-ESO-1 , LAGE-la , p53, 프로스테인， PSMA, Her2/neu, 서바이빈 (survivin) 및 텔로머라제， 전립선-암 종 종양 항원 -l(PCTA-l) , MAGE, ELF2M, 호중구 엘라스타제， 에프린 B2, CD22, 인슐 린 성장 인자 ( IGF)-I , IGF-I I , IGF-I 수용체 및 메소텔린을 포함한다. 본 발명에서 지칭된 종양성 항원의 유형은 또한 종양-특이적 항원 (TSA) 또는 종양-관련된 항원 (TM)일 수 있다. TSA는 종양 세포에 대해 고유하고 신체의 다른 세포 상에서 발생하지 않는다. TAA 관련된 항원은 종양 세포에 대해 고유하지 않고 대신에 또한 항원에 대한 면역원성 내성 상태를 유도하지 못하는 조건 하에서 정상 세포 상에서 발현된다. 종양에 대한 항원의 발현은 면역 시스템이 항원에 대해 반 웅하게 하는 조건 하에서 발생할 수 있다. TAA는 면역 시스템이 비성숙하고 반웅할 수 없는 경우 태아 발달 동안 정상 세포 상에서 발현되는 항원일 수 있거나 정상 세포 상에서 매우 낮은 수준으로 정상적으로 존재하지만 종양 세포 상에서 훨씬 높 은 수준으로 발현되는 항원일 수 있다.
TSA 또는 TAA 항원의 비-제한적인 예로는 다음이 포함된다: MART- l/MelanA(MART-I ) , gplOO(Prael 17) , 티로시나제， TRP-1 , TRP-2와 같은 분화 항원 및 MAGE-l , MAGE-3, BAGE, GAGE-1 , GAGE-2, pl5와 같은 종양-특이적 다중계통 항 원; CEA와 같은 과발현된 배아 항원; 과발현된 종양유전자 및 p53, Ras , HER-2/neu 와 같은 돌연변이된 종양 -억제 유전자; 염색체 전위로부터 초래된 고유 종양 항원; 예를 들면 BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; 및 바이러스 항원, 예를 들면 엡스타인 바 바이러스 항원 EBVA 및 인간 파필로마바이러스 (HPV) 항원 E6 및 E7. 다른 큰, 단백질 -기반 항원에는 TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY- ESO, P185erbB2, P180erbB-3, c-met , nm— 23H1, PSA, TAG-72, CA 19-9， CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, 베타-카테닌， CDK4, Mum-1, p 15, p 16， 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 알파-태아단백질， 베타— HCG, BCA225, BTAA, CA 125， CA 15-3 \CA 27.29 \BCAA， CA 195， CA 242, CA-50, CAM43, CD68\P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733 \ EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, M0V18, NB/70K, NY-CO- 1, RCAS1 , SDCCAG16, TA-90\Mac-2 결합성 단백질 \사이클로필린 C-관련된 단백질， TAAL6, TAG72, TLP, 및 TPS가포함된다. 상기 종양성 항원을 특이적으로 인식하는항체로는 예를들어， HuM195 (예를 들어， Kossman 등, (1999) Clin. Cancer Res. 5: 2748-2755참조), CMA-676 (예를 들어， Sievers 등， (1999) Blood 93： 3678-3684 참조)， AT13/5 (예를 들어, Ellis 등, (1995) J. I画 unol. 155： 925-937 참조)， HB7 ， 트라스투주마브 (예를 들어, HERCEPTIN ； Fornier 등， (1999) Oncology (Huntingt) 13： 647-58), TAB-250 (Rosenblum 등, (1999) Clin. Cancer Res. 5： 865-874) , BACH-250 (Id.), TA1 (Maier 등， (1991) CancerRes . 51： 5361-5369) , 및 미국 특허 제 5,772,997 호; 제 5,770,195호에 기술된 mAb (mAb 4D5; ATCC CRL 10463)； 및 미국 특허 제 5 ,677， 171 호에 기술된 mAb, Mc5 (예를 들어， Peterson 등， (1997) Cancer Res. 57： 1103- 1108;0zzello 등, (1993) Breast Cancer Res. Treat . 25： 265-276 참조)， hCTMOl (예를 들어， Van YM등, (1996) Cancer Res. 56： 5179-5185 참조) CC49 (예를 들어， Pavlinkova등， (1999) Clin. Cancer Res. 5： 2613-2619 참조)， B72.3 (예를 들어， Divgi 등, (1994) Nucl. Med. Biol. 21： 9-15 참조)，마우스 모노클로날 항 -HM1.24 IgG2a/ κ , 인간화된 항 -HM1.24 IgGl/κ항체 (예를 들어， Ono 등， (1999) Mol. I瞧 uno. 36： 387-395 참조)， 트라스투주마브 (예를 들어， HERCEPTIN , Fornier 등， (1999) Oncology (Huntingt) 13: 647-658 참조), TAB-250 (Rosenblum 등， (1999) Clin. Cancer Res. 5： 865-874) , BACH-250 (Id.), TA1 (예를 들어， Maier 등， (1991)Cancer Res. 51： 5361-5369 참조)， 리룩시마브 (rituximab), 이브리투모마브 티욱세탄 (Ibritumotnabtiuxetan), 및 토시투모마브 (tosi tumomab)， AME-133v (Applied Molecular Evolution), 오크텔리주마브 (Ocrelizumab) (Roche), 오파투무 마브 (OfaUimumab) (Genmab) , TRU-015 (Trubion) 및 IMMU-106(Immunomedics) 등 이 포함되나， 이에 제한되지 않는다. 본 발명은 상기 기술된 항체의 사용을 제한할 필요가 없고， 당업자에게 알려 진 바와 같은 다른 그러한 항체는 본원에 기술된 조성물 및 방법에서 사용될 수 있 다. 한편， IFN-β가 처음 다발성 경화증 치료제로 도입된 것은 항바이러스 효과 를 얻기 위해서였지만， 이후 많은 연구를 통해 그 작용 기전이 밝혀지고 있다. 우 선 IFN-β는 IFN- α에 의해 유도되는 HLA class I I 분자의 활성화를 억제함으로써 항원 발현을 저해하고, T 세포의 활성화를 막는다. 또한 IFN— β는 Co— st imul atory molecules을 비활성화시켜 T 세포의 활성화를 억제하며 (28 , 29)， 자가반응성 T 세 포가 자연사 (apoptosi s)하도록 유도하기도 한다. 뇌 -혈관 장막 (brain-blood barrier)에 대한 IFN-β의 효과는 T 세포가 혈관내피세포에 부착되는 것을 억제하 고， 뇌로 들어가는 능력을 감소시키는 것으로 생각되며， 실제로 MRI 연구를 보면 IFN-β치료를 받은 약 90%의 다발성 경화증 환자에서 조영 증강 병변이 감소하였다 는 보고가 있다. 이에, 본원발명에 따른 인간 인터페론 -베타 변이체는 천연형 인터페론 -베타 와 비교하여 그 활성 및 기능이 향상되어 있기 때문에， 다발성 경화증 특이적 항원 을 인식하는 항체와 결합된 면역사이토카인의 형태로써 타켓치 ¾에 사용된다면 인 터페론 -베타 단독제제의 치료효과보다 더 우수한 효과를 나타낼 수 있다. 다발성 경화증 특이적 항원 및 항체는 예를 들어， CD20과 이를 인식하는 항 체인 r i tuximab , CD52 와 이를 인식하는 단클론항체인 alemtuzumab 및 인터루킨 -2 의 알파 수용체와 이를 인식하는 dacl i zumab을 들 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명은 또한 상기 인간 인터페론 -베타 변이체는 펩타이드 링커에 의해 상 기 항체 또는 이의 단편에 결합되어 있는 면역사이토카인을 제공한다. 펩타이드 링 커는 아미노산 또는 아미노산과 유사한 물질이 서로 펩타이드 결합에 의해서 둘 이 상이 연결된 짧은 단편의 아미노산 또는 아미노산 유사체로 둘 이상의 별개의 물질 을 서로 연결시켜 주는 역할을 하는 분자를 말한다. 글리신, 세린， 알라닌 등이 주 요 구성 아미노산으로 이용되어 글리신 -세린 링커， 글리신-세린-알라닌 링커 등을 사용할 수 있으며， 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 상기 링커는 서열번호 5 내지 서열번호 11의 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 포함할 수 있 다. 본 발명의 면역사이토카인은 바람직하게는 인간 인터페론 -베타 변이체와 항 체 또는 그 단편의 폴리펩티드 사이에 삽입된 가요성 링커 서열을 포함할 수 있다. 상기 링커 서열은 상기 항체 또는 그 단편의 상기 인간 인터페론 -베타 변이체에 대 한 유효한 위치 결정을 허용하여 상기 두 도메인 모두의 작용 활성을 허용한다. 상기 링커는 천연 유래의 펩타이드 링커 또는 합성 유래의 펩타이드 링커를 의미한다. 상기 펩타이드 링커는 선형 아미노산 쇄로 구성되고, 이때 20종의 천연 발생 아미노산은 단량체 빌딩 블록이다. 링커는 반복적 아미노산 서열을 가질 수 있거나 천연 발생 폴리펩티드, 예컨대， 힌지 기능을 갖는 폴리펩티드의 서열을 가 질 수 있다. 모든 펩타이드 링커가 핵산 분자에 의해 코딩될 수 있으므로 재조합적 으로 발현될 수 있다. 링커는 그 자체가 펩타이드이기 때문에 인간 인터페론 -베타 변이체와 항체 또는 그 단편은 펩타이드 결합을 통해 링커에 연결된다. 링커는 펩타이드 결합에 의해 함께 연결된 아미노산， 바람직하게는 펩타이 드 결합에 의해 연결된 1 내지 20개의 아미노산으로 구성되며， 이때 아미노산은 20 개의 천연 아미노산 중에서 선택된다. 이들 아미노산 중 하나 이상은 당해 분야의 숙련자에 의해 이해되는 바와 같이 글리코실화된다. 이에 제한되는 것은 아니지만 바람직하게는， 1 내지 20개의 아미노산은 글리신， 알라닌， 프를린， 아스파라긴， 글 루타민 및 리신 중에서 선택된다. 적합한 링커로는 예를 들어， 절단가능한 링커 및 절단불가능한 링커를 포함 한다. 절단가능한 링커는 전형적으로 세포내 조건하에서 쉽게 절단된다. 적합한 절 단가능한 링커로는 예를 들어， 세포내 프로테아제， 예컨대 리소좀 프로테아제 또는 엔도솜 프로테아제에 의해 절단가능한 펩티드 링커를 포함한다. 상기 링커는 예를 들어， 상기 항체의 중쇄 C-말단에 링커의 N-말단이 연결된 다. 항체의 중쇄 C-말단에의 연결은 바람직하게는 본 발명의 항체를 발현하는 발현 백터에 링커 서열을 코딩하는 염기서열이 단백질 발현 프레임이 일치되어 연결되어 발현백터에 의해서 발현되는 항체에 직접적으로 연결될 수 있다. 또한， 상기 링커 는 항체의 경쇄 C-말단에 연결되거나， 항체의 경쇄 C-말단과 중쇄 C-말단에 모두 연결될 수도 있다. 또한， 상기 링커의 C-말단에 본 발명의 인터페른 베타 변이체의 N말단이 연결된다. 본 발명의 펩타이드 링커는 당업계에 공지된 펩타이드 링커일 수 있으나, 바 람직하게는 글리신 -세린 링커 또는 서열번호 5 내지 서열번호 11의 아미노산 서열 을 포함하는 펩타이드 링커일 수 있다. 바람직하게는， gly-ser 링커， 예를 들어， (GlyxSery)z 형 (x는 1 내지 5의 정 수， y는 1 내지 2의 정수이며， z는 1 내지 6의 정수) , 예를 들어 (gly4seri)3 또는 (gly3ser2)3올 들 수 있으며， 보다 바람직하게는 GGGGS 또는 GGGGSGGGGSGGGSG 의 아 미노산서열로 표시되는 링커일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명은 또한 상기 인간 인터페론 -베타 변이체 폴리펩티드의 아미노산 서 열은 상기 항체 또는 이의 단편의 아미노산 서열에 대해 중쇄 C—말단， 경쇄 C-말단 또는 중쇄 및 경쇄 C-말단 위치에 있는 것을 특징으로 하는 면역사이토카인을 제공 한다. 상기 인간 인터페론 -베타 변이체의 아미노산 서열은 항체 또는 이의 단편의 아미노산 서열에 대해 중쇄 C-말단, 경쇄 C-말단 또는 중쇄 및 경쇄 C-말단 위치에 있을 수 있고， 바람직하게는 항체 또는 이의 단편의 아미노산 서열에 대해 C-말단 위치에 있다.
본 발명은 또한 상기 면역사이토카인은 서열번호 12， 13， 15 또는 17로 이루 어진 군 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역사이토카인 을 제공한다. 본 발명은 (a) 서열번호 2 내지 서열번호 4 중 어느 하나로 표시되는 인간 인터페론 -베타 변이체; (b) 서열번호 5 내지 서열번호 11 증 어느 하나로 표시되는 펩타이드 링커; 및 (c) 항체 또는 이의 단편을 포함하는 면역사이토카인을 제공한 다. 본 발명은 또한 상기 면역사이토카인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공 한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 인간 인터페론 -베타 변이체와 항체 또는 그 단편이 결합된 면역사이토카인의 펩타이드를 암호화 하는 것이면 제한없이 사용 될 수 있으며， DNA, cDNA 및 RNA 서열을 모두 포함한다. 바람직하게는， 상기 폴리 뉴클레오티드는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖거나 또는 상기 아미 노산 서열과 적어도 70% 이상의 상동성 (homology)이 있는 아미노산 서열을 갖는 펩 타이드를 암호화 하는 물질을 말하며， 이는 천연에서 분리되거나 당업계의 공지돤 유전공학적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백터를 제공한다. 상기 백터는 당업자들이 당업계에 알려진 어떠한 방법에 따라 본 발명의 폴 리뉴클레오티드를 백터내로 삽입하여 적절한 전사 /해독 조절서열을 이용하여 본 발 명의 면역사이토카인을 발현하도록 제조된 발현백터를 말한다. 본 발명에 따라 클로닝된 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 적절한 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열 과 발현 조절서열은 선택 마커 및 복제 개시점 (repl icat ion origin)을 같이 포함하 고 있는 하나의 발현 백터 내에 포함될 수 있다. '작동가능하게 연결 (operably l inked) ' 된다는 것은 상기 폴리뉴클레오타이드 서열이 발현 조절 서열에 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 것을 의미한다. 상기 '발현 조절 서열 (expression control sequence) '이란 특정한 숙주세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴크레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열올 의미한다. 그러한 조절 서열 은 전사를 실시하기 위한 프로모터 , 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서 열， 적합한 mRNA 리포좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조 절하는 서열 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할수 있다. 상기 발현 백터의 모백터로 사용되는 백터는 특별한 제한이 없으며， 이 발명 이 속하는 기술분야에서 숙주세포로 사용되는 미생물에서의 발현을 위하여 통상적 으로 사용되는 모든 플라스미드， 바이러스 또는 기타 매개체 등이 사용 가능하다. 예컨대, 상기 플라스미드에는 대장균 유래 플라스미드 (pBR322, pBR325, pUC118 및 PUC119, pET-22b(+)), 바실러스 서브틸리스 유래 폴라스미드 (pUBllO 및 pTP5) 및 효모 유래 플라스미드 (ΥΕρ13, ΥΕρ24 및 YCp50) 등이 있으며, 상기 바이러스는 레트 로바이러스， 아데노바이러스 또는 백시니아 바이러스와 같은 동물바이러스， 배클로 바이러스와 같은 곤층 바이러스 등이 사용될 수 있으나， 이에 제한되는 ¾은 아니 다. 본 발명은 또한 상기 백터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 숙주 세포는 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 또는 바람직한 특정 방식으로 유전자 생성물올 진행시키는 것을 선택할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질의 해독 및 해독 후 프로세싱과 변형에 대한 특징적이고 특이적인 기작을 갖고 있다. 적합한 세포주 또는 숙주 시스템으로는 발현된 이종 단백질의 바람직한 변형 및 프 로세싱을 제공하는 것을 선택할 수 있다. 효모에서의 발현은 생물학적 활성 생성물 을 생산할 수 있다. 진핵 세포에서의 발현은 " 천연" 폴딩의 가능성올 증가시킬 수 있다. 본 발명의 백터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21DE, E. coli DH5, E. coli RR1, E.coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110 등이 사용될 수 있으며， 또한 아그로박테리움 A4와 같은 아그로박테리움 속 균주， 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtil is)와 같 은 바실리 (bacilli), 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonel la typhi murium) 또는 세라티아 마르게센스 (Serratia marcescens)와 같은 또 다른 장내세균 및 다양한 슈도모나스 (Pseudomonas) 속 균주가 숙주세포로서 이용될 수 있다. 또한， 본 발명의 백터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주 세포로 서 , 이스트 (Saccharomycecerevisiae), 곤층 세포 및 사람 세포 (예컨대， CH0 세포주 (Chinese hamster ovary) , W138, BHK, COS-7, 293,HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포 주) 등이 이용될 수 있다. 본 발명에서 숙주세포는 바람직하게는 CH0 세포주일 수 있다. 백터를 숙주세포 내로 전달하여 숙주세포를 형질전환 시키는 방법은 공지의 방법이면 어떠한 것이든 가능하며 특별히 제한되지 아니한다. 예를 들어， 인산칼슘 침전법 (calcium phosphate precipitation) , DEAE— dextran법， 전기천공법 (electroporation), 직접 미세주입법 (direct microinjection), DNA—로딩 리포좀 (DNA loaded liposome)법, 리포펙타민— DNA복합체 (liofectamine-DNA complex)법, 세 포 음파분쇄법 (cell sonicat ion) , 고속미세분사 (high velocity microproject i le)를 이용한 유전자 폭격법 (gene bombardment), 다양이온 (polycation)법. 및 수용체 매개 형질전이법 (receptor— mediated transfection)에 의하여 형질전환 할 수 있다. 이 기술들 중 일부는 생체 내 또는 생체 외 사용을 위해 개량될 수 있다. 본 발명은 또한 (a) 숙주 세포를 제공하는 단계， (b) 제공된 세포를 배양하 는 단계 및 (c) 상기 세포 또는 배양 배지로부터 면역사이토카인을 회수함으로써 면역사이토카인을 제조하는 단계를 포함하는 면역사이토카인 제조방법을 제공한다. 형질전환 미생물의 배양은 목적 단백질인 인간 인터페론 -베타 변이체와 항체 또는 이의 단편이 결합된 면역사이토카인의 발현을 가능하게 하는 적절한 조건하에 서 수행하며， 이러한 조건은 당업자에게 익히 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다. 형질전환 미생물은 통상적인 배양방법에 의해 대량으로 배양할 수 있다. 배양배지 로는 탄소원， 질소원， 비타민 및 미네랄로 구성된 배지를 사용할 수 있으며， 예를 들어, LB 배지 (Luria-Bertani Broth)을 사용할 수 있다. 미생물의 배양은 통상의 미생물 배양 조건상에서 가능하며 예를 들어， 온도범위 15°C 내지 45°C에서 10시간 내지 40시간 동안 배양할 수 있다. 배양액 중의 배양배지를 제거하고 농축된 균체 만을 회수하기 위해 원심분리 (centrifugation) 또는 여과 (filtration)과정올 거칠 수 있으며 이러한 단계는 당업자가 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통 상적인 방법에 따라 냉동 (frozen)하거나 또는 넁동건조 (lyophi 1 ized)하여 그 활성 을 잃지 않도록 보존할 수 있다. 형질전환 미생물 (또는 형질전환체)에서 발현시킨 단백질은 통상의 방식으로 정제될 수 있으며， 예를 들어， 염석 (예를 들어 황산암모늄 침전， 인산나트륨 침전 )， 용매 침전 (아세톤， 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전)， 투석， 겔 여과, 이 온 교환， 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 칼럼 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용시켜 본 발명의 면역사이토카인을 정제할 수 있다
(Maniatis et al , Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor , N.Y. (1982)； Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 2d Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)； Deutscher , M. , Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)). 본 발명의 인간 인터페론 -베타 변이체가 접합된 면역사이토카인의 경우 인간 인터페론-베타가 접합된 면역사이토카인보다 현저히 우수한 효율로 면역사이토카인 을 제조할 수 있다 (실시예 2 참조). 한편， 본 발명은 '
(a) 인간 인터페론 -베타 변이체; (b) 펩티드 링커 및 (c) 항체 또는 이의 단 편을 포함하는 융합 폴리템티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현 백터에 클 로닝하는 단계 ;
(b) 상기 발현 백터를 숙주 세포에 클로닝하는 단계;
(c) 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(d) 상기 세포 또는 배양 배지로부터 상기 융합 폴리펩티드를 회수하는 단계 를 포함하며 ,
상기 인간 인터페론 -베타 변이체는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 펩티드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 타겟 특이적 인간 인터 페론-베타의 생산량 증가방법을 제공한다. 본 발명의 생산량 증가 방법의 각 구성요소에 대해서는 상기에서 기재한 바 와 같으며， 타겟 특이적 인간 인터페론-베타는 본 발명의 면역 사이토카인을 나타 낼 수 있다.
【유리한 효과】 본 발명의 인간 인터페론 -베타 변이체 및 항체 또는 이의 단편을 포함하는 면역사이토카인은 인터페론-베타의 활성 및 항체의 특성을 훙시에 나타내어 다발성 경화증 또는 암의 표적화'치료에 이용할 수 있으며， 본 발명에 따른 면역사이토카 인은 천연형 인터페론-베타가 접합된 면역사이토카인과 비교해 우수한 효율로 생산 될 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 본 발명에 따른 숙주세포에서 제조된 면역사이토카인의 발현량을 웨 스턴 -블롯을 통해 확인한 결과이다 (1 : 배양배지, 2: B12 중쇄-천연형 인터페론, 3 : B12 중쇄-인터페론 변이체， 4： B12 경쇄-천연형 인터페론， 5: B12 경쇄-인터페론 변이체) . 도 2는 본 발명의 인간 인터페론 -베타 변이체가 접합된 면역사이토카인을 나 타낸 모식도이다. 도 3은 pRBLX2 백터에 중쇄 -l inker-인터페론으로 구성된 유전자 염기서열을 삽입하여 pRBLX2-INF를 제작하는 과정 (왼쪽) 및 pRBLX2 백터에 중쇄 -1 inker-인터페 론 -베타 변이체으로 구성된 유전자 염기서열을 삽입하여 pRBLX2-INF를 제작하는 과 정 (오른쪽)을 나타낸 모식도이다. 도 4는 본 발명의 인간 인터페론 -베타 변이체가 접합된 면역사이토카인 (오른 쪽) 및 인간 인터페론-베타가 접합된 면역사이토카인 (왼쪽)의 발현을 SDS-PAGE로 확인한 것이다. 이 때， 각각의 중쇄 및 경쇄는 ^로 표시하였다 (1번 레인은 마커이 다) . 도 5는 본 발명의 인간 인터페론 -베타 변이체가 접합된 면역사이토카인 (2번 레인) 및 대조군 인간 인터페론-베타가 접합된 면역사이토카인 (1번 레인)의 단백질 발현을 각각 항 -인간 IgG 항체 (왼쪽) 및 항-인터페론 항체 (오른쪽)으로 웨스턴블롯 올 통해 확인한 것이다. 도 6은 숙주세포에서 제조된 면역사이토카인의 발현량을 BCA assay를 통해 확인한 결과이다 (ACC#1 : B12 중쇄-천연형 인터페론， ACC#2: B12 중쇄-인터페론 변 이체， ACC#6: B12 경쇄-천연형 인터페론， ACC#7: B12 경쇄-인터페론 변이체) . 도 7은 본 발명에 따른 인간 인터페론 -베타 변이체와 B12항체가 결합된 면역 사아토카인의 인터페론 활성을 STAT-1의 인산화 여부로 확인한 결과이다. 도 8은 본 발명에 따른 인간 인터페론 -베타 변이체와 B12항체가 결합된 면역 사이토카인을 세포에 24시간 처리한 후 세포독성을 통해 인터페론 -베타 활성을 확 인한 결과이다 (Carbi feron: 인간 인터페론 -베타 변이체， B12: B12 항체, ACC#2 : 인 간 인터페론 -베타 변이체와 B12가 결합된 면역사이토카인) . 도 9는 본 발명에 따른 인간 인터페론 -베타 변이체와 B12항체가 결합된 면역 사이토카인을 세포에 48시간 처리한 후 세포독성을 통해 인터페론 -베타 활성을 확 인한 결과이다 (Carbi feron: 인간 인터페론 -베타 변이체， B12 : B12 항체， ACC#2 : 인 간 인터페론 -베타 변이체와 B12가 결합된 면역사이토카인) . 도 10은 ERBB2(Hercept in)항체 (A) 및 c-MET 항체 (B)에 Rigid Hel ical링커를 결합한 뒤 인간 인터페론 -베타 변이체를 결합하여 제조한 면역사이토카인을 도식도 로 나타낸 것이다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
백터 클로닝 및 숙주세포 형질전환 항체 중쇄와 인터페론 -베타 변이체가 결합된 면역사이토카인 (ACC #2) 과 항 체 경쇄와 인터페론 -베타 변이체가 결합된 면역사이토카인 (ACC #7) 을 cloning 하 기 위해 B12의 sequence를 이용하였다. B12 sequence의 중쇄와 경쇄에 각각 링커 를 이용하여 인간 인터페론 -베타 변이체 서열을 삽입한 후 백터로 합성하였다. 합 성된 유전자를 각각에 맞는 제한 효소로 절단하여 보유하고 있는 IgG 발현 백터에 라이게이션 시킨 후, sequencing 작업을 통해 최종적으로 ACC#2과 #7를 발현하는 백터를 제작하였다. 클로닝이 완료 된 ACC#2, ACC#7 백터는 transformation올 통하 여 대량으로 추출한 뒤 형질전환에 사용하였다.
CHO-S cell은 3X105 cells/ml 밀도로 5 passage 이상 계대배양을 진행하며 형질전환을 준비하였다. 계대배양이 진행 된 후 세포의 생존를이 90% 이상으로 유 지가 되면 5X105 cells/ml 밀도로 세포를 시딩하여 형질전환을 준비하였다. 세포 시딩을 하고 24시간 뒤 생존률 (〉9 )과 세포 밀도 (1X106 eel ls/ml)를 확인 후 형 질전환 용매를 이용하여 50ug DNA을 30ml 배양배지에서 배양중인 CHO—S cell에 형 질전환 하였다.
<실시예 2>
숙주세포에서의 면역사이토카인 발현 확인 세포 형질전환 후 48 시간이 지나고， 농도 측정 (BCA assay) 및 웨스턴 -블롯 으로 ACC #2， #7의 발현양을 확인하였다.
BCA assay의 경우, 시약 A (Sodium carbonate, Bicinchoninic acid 등 포함) 와 시약 B (4 % cupric sulfate 포함)를 50 ： 1의 비율로 제조하여 standard 용액 (BSA 용액， 0~2000 ug/mL) 및 시료와 섞었다 (10 ul의 sample과 200 ul의 reagent). 이 용액을 37 °C에 30 분간 인큐베이션 한 후 562 nm에서 흡광도를 재어 농도를 계 산하였다. 농도 계산에는 표준용액을 바탕으로 얻은 curve를 이용하였다.
웨스턴 -블롯 실험은 다음과 같이 진행하였다. 우선， 배양한 각 배지를 모아 10 % SDS PAGE로 내렸다. 내린 gel을 PVDF membrane에 이동 한 다음, 5 % BSA 용액 에 블로킹하고 1， 2차 항체를 붙였다. TBST 용액으로 세척까지 완료한 후에， 필름 으로 membrane을 찍는다. Developer와 fixer로 필름의 이미지를 현상하였다.
그 결과， B12의 중쇄와 경쇄에 천연형 인간 인터페론이 접합된 면역사이토카 인에 비해 인간 인터페론 -베타 변이체가 접합된 면역사이토카인의 발현양이 많음을 알 수 있었다 (도 1).
<실시예 3>
면역사이토카? ΐ 제조 항체의 증쇄 (Heavy chain) 부위에 서열번호 5로 표시되는 링커를 삽입하고， 인터페론 -베타 또는 인터페론 -베타 변이체를 결합하도록 하였다. 도 2에 인간 인터 페론 -베타 변이체가 접합된 면역사이토카인의 구조를 모식도로 나타냈다.
항체의 중쇄 (heavy chain) 부위에 서열번호 5로 표시되는 링커 및 인터페론- 베타 및 인터페론 -베타 변이체를 클로닝하였다. 그 후 전체 유전자의 3' -말단 및 5' -말단에 각각 제한효소 Avrl l (CCTAGG) 절단 부위와 Bstzl7I (GTATAC) 절단 부위를 삽입하여 중쇄의 최종 유전자를 확보하였다. 또한 항체의 경쇄 ( l ight chain)의 3 ' - 말단 및 5' -말단에 각각 제한효소 EcoRV(GATATC) 절단 부위와 PacI (TTMTTAA)를 삽 입하여 경쇄의 최종 유전자를 확보하였다. 도 3에 제작하는 과정을 모식도로 나타 냈다.
<실시예 4>
면역사이토카인의 발현 확인 인간 인터페론-베타가 접합된 면역사이토카인과 인터페론 -베타 변이체가 접 합된 면역사아토카인의 발현을 확인하기 위하여 50 ug의 pRBLX2-INF 혹은 pRBLX2- CAF백터를 CH0-S 세포에 transfect ion 한 뒤 7일간 배양하면서 발현을 유도하였다. 7일 후 배양액을 회수하고， 원심분리 (8000rpn, 10분)를 하여 세포를 제거하였다. 세포가 제거된 배양액을 소량 채취하여 5x 샘플 버퍼와 섞고, 100°C에서 10분간 끓 여주어 단백질이 층분히 변형되도톡 유도하였다. 준비된 샘플을 마커 (Marker)와 함 께 Tricine SDS-PAGE 겔에 로딩하고 130v의 전압으로 1시간 30분간 전기영동을 실 시하였다. 이 후， 겔을 조심스럽게 분리한 뒤 쿠마시 블루 염색 솔루션 (comassie blue staning solut ion)에 담구고 30분간 흔들어주며 염색 해주었다. 염색이 끝난 뒤 겔을 탈염색 (Destaning) 버퍼로 옮겨서 30분간 흔들어주며 탈염색을 해주었다. 탈염색은 3번 반복하여 수행하였다.
보다 명확한 발현 양 비교를 위하여 항-인터페론 β 항체와 항 -인간 IgG-HRP 를 사용하여 웨스턴블로팅을 수행하였다. 상기와 동일한 방법으로 Tricine SDS- PAGE 수행한 후 겔을 조심스럽게 분라하여 3M 페이퍼 위에 두고 그 위에 PVDF( polyvinyl ! dene di f luoride) 막을 둔 뒤 다시 3M 페이퍼를 덮어주고 lx transfer 버퍼에 담가 100v 전압으로 70분간 단백질을 transfer시켰다. Tris- buffered sal ine-Tween 20(TBS-T, 0.1% Tween20)에 M를 넣어 막을 1시간 30분동안 상온에서 차단하였다. PVDF막을 TBS-T로 2번 씻어낸 뒤, TBS-T에 담가두었다. 항- 인터페론 β 항체의 경우 TBS-T에 1 : 1000으로 회석하여 준비하였고, 항 -인간 IgG- HRP 항체의 경우 TBS-T에 1 : 3000으로 희석하여 준비하였다. 막을 항체 희석물에 담 가 상온에서 2시간동안 흔들어주며 반응시켰다. 이 과정이 끝나면 10분 동안 3번씩 TBS-T로 닦아주고 상온에서 호스래디쉬 퍼옥시다아제 (horseradi sh peroxidase ; HRP)가 결합된 이차 항체를 첨가하여 1시간 동안 반웅하였다. 다시 한번 세척과정 을 수행한 후， 밴드를 ECL 시약 (enhanced chemi luminescence reagent , Intron)으로 확인하였다. 밴드의 강도는 C-DiG (LI-C0R, USA)을 이용하여 측정하였다.
• 그 결과， 도 4에 나타난 바와 같이 25 KDa 위치에서 경쇄가 관찰되었으며
70-100 KDa 사이에 인간 인터페론-베타가 접합된 면역사이토카인 흑은 인간 인터페 론 -베타 변이체가 접합된 면역사이토카인 복합체가 관찰되었다.
또한 도 5에서 레인 1은 인간 인터페론-베타가 접합된 면역사이토카인, 레인 2 는 인간 인터페론 -베타 변이체가 접합된 면역사이토카인이다. Tr i c ine-SDS PAGE 및 웨스턴블로팅 결과, 인간 인터페론-베타가 접합된 면역사이토카인 보다 인간 인터 페론 -베타 변이체가 접합된 면역사이토카인의 발현량이 높은 것을 확인 할 수 있었 다. 또한 정확한 발현량의 비교를 위하여 배양액을 각각 Cedex bio(Roche사， 미국) 에서 측정을 진행하였다. 그 결과 인간 인터페론-베타가 접합된 면역사이토카인은 농도가 측정 범위 이하 ( 10mg/L 이하)로 낮은 발현양이 확인 되었고， 인간 인터페론 -베타 변이체가 접합된 면역사이토카인은 약 32mg/L수준으로 최소 3배 이상으로 발 현량이 증가한 것을 확인하였다.
<실시예 5>
DSTAT-Ι의 인산화를 통한 면역사이토카인의 인터페론 활성 확인 본 발명에 따른 인간 인터페론 -베타 변이체와 B12항체가 접합된 면역사이토 카인의 인터페론 기능을 확인하기 위하여 인터페론 혹은 항체-인터페론 접합체 처 리에 따른 STAT-1의 인산화여부를 검증하였다.
6-wel l plate의 각 wel l에 3xl05개의 0VCAR-3 세포를 분주한 뒤 24시간 동 안 37. 5° C, 5% C02 환경에서 배양하였다. 24시간 이후 세포 배양액을 제거하고 인간 인터페론 -베타 변이체 (carbi feron 600ng/ml , 인간 인터페론 -베타 변이체와 B12 항체가 접합된 면역사이토카인 (ACC) 600ng/ml 또는 1800ng/ml의 농도가 되도록 배양액에 회석하여 1시간 동안 처리하였다. 이 후 plate를 수거하여 각 wel l을 PBS 로 3회 세척한 뒤 프로티아제 저해제와 포스파테이즈 저해제가 포함된 RIPA 버퍼 ΙΟΟμ Ι를 처리하여 30분 동안 Ice 상에 두어 세포를 용해시켰다. 용해된 세포를 1.5ml 튜브에 담아 13000rpm, 4° C 조건으로 원심분리하여 상층액 (용해물)만 수거 한 뒤 새로운 튜브에 모았다. BCA정량법을 이용하여 용해물의 단백질 농도를 정량 한 뒤 30yg의 용해물을 채취하여 5x sample buffer와 섞고， 10( C에서 10분간 끓 여주어 단백질이 층분히 변성 되도록 유도하였다. 준비된 샘플을 마커 (Marker)와 함께 10% SDS-PAGE 겔에 로딩하고 70 vol tag로 30분， 120 voltage로 1시간 동안 내 려주었다. 이후 겔을 조심스럽게 분리하여 3M 페이퍼 위에 두고 그 위에 PVDFCpolyvinylidene di fluoride) 막을 둔 뒤 다시 3M 페이퍼를 덮어주고 트랜스퍼 버퍼에 담가 100 볼트로 90분간 단백질 트랜스퍼를 진행하였다. ¾의 BSA가 포함된 Tris-buffered saline-Tween 20(TBS-T, 0.1% Tween20)에 막을 1시간 30분동안 블락 킹 한 뒤 Anti-p-STATl 항체의 경우 TBS-T에 1:1000으로 회석하여 준비하였고， anti-GAPDH항체의 경우 TBS-T에 1:3000으로 회석하여 준비하였다. 막을 항체 회석 물에 담가 상온에서 2시간동안 흔들어주며 반웅시켰다. 이 과정이 끝나면 10분 동 안 3번씩 TBS-T로 닦아주고 상온에서 호스래디쉬 퍼옥시다아제 (horseradish peroxidase; HRP)가 결합된 이차 항체를 첨가하여 1시간 동안 반웅하였다. 다시 한 번 세척과정을 수행한 푸， 밴드를 ECL 시약 (enhanced chemi luminescence reagent , Intron을 처리한 뒤 필름에 현상하였다.
그 결과, 인간 인터페론 -베타 변이체 (carbiferon) 및 면역사이토카인 처리군 에서 모두 pSTAT-1의 인산화가 나타나 인간 인터페론 -베타 변이체 (carbiferon)와 B12항체가 접합된 면역사이토카인에서 인터페론-베타의 활성이 그대로 나타남을 확 인하였다 (도 7).
<실시예 6>
세포독성실험 통한 면역사이토카인의 인터페론 활성 확인 본 발명에 따른 인간 인터페론 -베타 변이체와 B12항체가 접합된 면역사이토 카인의 인터페론 기능을 확인하기 위하여 인터페론 혹은 항체-인터페론 접합체 처 리에 따른 세포독성 여부를 확인하였다. 세포독성을 확인하기 위하여 96-well plate의 각 well에 1x10개의 0VCAR-3 세포를 분주한 뒤 24 시간 동안 37. 5° C, 5% C02 환경에서 배양하였다. 24시간 이 후 세포 배양액을 제거하고 인간 인터페론 -베타 변이체 (carbiferon), B12 항체 및 면역사이토카인을 10~L0000ng/ml 농도로 처리한 뒤 24시간 혹은 48시간 동안 배양 하였다. 24시간 혹은 48시간 배양한 뒤 배양액을 제거하고 PBS 워시를 2회 진행한 뒤 WST시약을 1 : 10으로 배양액에 섞어 각 wel l당 ΙΟΟ μ Ι씩 처리한 뒤 2시간 동안 37. 5° C, 5% C02 환경에서 방치한 뒤 430nm파장에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과 B12 항체만을 처리한 세포군에서는 세포독성이 나타나지 않았으나 인간 인터페론—베타 변이체 및 면역사이토카인을 처리한 세포군에서는 세포독성이 농도 의존적으로 나타나는 것으로 보아, 인간 인터페론 -베타 변이체가 면역사이토 카인의 형태로도 여전히 인터페론 활성을 나타냄을 확인하였다 (도 8 및 9) .
<실시예 7>
항체 중쇄와 인터페론 -베타 변이체가 결합된 면역사이토카 의 제조
B12 항체이외의 ERBB2(Hercept in) 항체와 C-MET 항체를 이용하여 인터페론- 베타 변이체를 결합한 면역사이토카인을 다음과 같이 제조하였다.
도 10에서 보듯이, ERBB2(Hercept in) 항체와 c-MET 항체의 중쇄 (heavy chain) 부위에 Rigid Hel ical 링커를 결합하였다. 그 뒤에 인간 인터페론 -베타 변 이체를 결합하여 항 -c-Met 면역사이토카인 (A)과 항 -ERBB2 면역사이토카인 (B)을 발 현하는 발현 카세트를 제조하였다. 이를 pRBLX2에 각각 클로닝한 다음 각 백터를 CH0-S 세포에 trans feet ion 한 뒤 7일간 배양하면서 발현을 유도하였다. transfect ion, 배양 및 발현물의 회수는 실시예 4에 기재된 바에 따라 수행하였다. 각 발현량을 CH0-S 세포를 이용하여 c— Met 항체 또는 ERBB2 항체에 인간 인 터페론-베타가 접합된 면역사이토카인과 인간 인터페론 -베타 변이체가 접합된 면역 사이토카인의 발현량을 비교하였을 때， 인간 인터페론-베타가 접합된 면역사이토카 인에 비하여 인간 인터페론 -베타 변이체가 접합된 면역사이토카인의 발현량이 더 많으며， 인터페론의 활성이 더 우수함을 확인할 수 있었다. 이를 통해, 본 발명의 인간 인터페론 -베타 변이체가 발현시 야생형의 인터페 론 베타에 비해서도 발현이 매우 잘 이루어지는 것을 확인할 수 있었다.
【산업상 이용가능성】 본 발명에 따른 인간 인터페론 -베타 변이체가 접합된 면역사이토카인의 경 우， .천연형 인터페론-베타보다 우수한 인터페론 활성 및 특정 항원을 인식하는 항 체의 특성이 모두 나타난다는 점에서 다발성 경화증， 암 등의 질환에 대한 표적치 료제로 사용될 수 있으며ᅳ 천연형 인터페론-베타가 접합된 면역사이토카인과 비교 해 그 생산효율이 현저히 높다는 점에서 산업상 이용가능성이 우수하다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1]
(a) 인간 인터페론 -베타 변이체; 및 (b) 상기 인간 인터페론 -베타 변이체에 직접 또는 간접적으로 공유 결합된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 면역사이토카 인으로서，
상기 인간 인터페론 -베타 변이체는 하기 (i), (ii) 및 (iii)로 이루어진 군 에서 선택되고 인간 인터페론 -베타 활성을 지니는 폴리펩티드로서, N-연결형 당쇄 를 포함하는 폴리펩티드인 면역사이토카인;
(i) 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열 전체를 포함하는 폴리펩티드;
(ii) 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리 펩티드;
(iii) 상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드와실질적으로 유사한 폴리펩티드.
【청구항 2]
계 1항에 있어서， 상가 항체 또는 이의 단편은 종양성 항원에 대한 항체 또는 이의 단편인 것을 특징으로 하는 면역사이토카인.
【청구항 3】
제 1항에 있어서, 상기 인간 인터페론 -베타 변이체는 펩타이드 링커에 의해 상기 항체 또는 미의 단편에 결합되어 있는 면역사이토카인.
【청구항 4]
제 3항에 있어서， 상기 링커는 서열번호 5내지 서열번호 11로 이루어진 군에 서 선택된 아미노산서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역사이토카인.
【청구항 5】
제 1항 내지 계 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 인터페론 -베타 변이체 폴리펩티드의 아미노산 서열은 상기 항체 또는 이의 단편의 아미노산 서열에 대해 중쇄 C-말단， 경쇄 C-말단 또는 중쇄 및 경쇄 C-말단에 있는 것을 특징으로 하는 면역사이토카인.
【청구항 6】 제 1항에 있어서， 상기 면역사이토카인은 서열번호 12， 13 , 15 또는 17로 이 루어진 군 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역사이토카 인.
【청구항 7]
(a) 서열번호 2 내지 서열번호 4 중 어느 하나로 표시되는 인간 인터페론-베 타 변이체;
(b) 서열번호 5 내지 서열번호 11 중 어느 하나로 표시되는 펩타이드 링커;
(c) 항체 또는 이의 단편을 포함하는 면역사이토카인.
【청구항 8】
제 1항의 면역사이토카인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
【청구항 9]
제 8항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백터.
【청구항 10】
제 9항의 백터로 형질전환된 숙주세포.
【청구항 11】
(a) 제 10항의 숙주 세포를 제공하는 단계;
(b) 제공된 세포를 배양하는 단계; 및
(c) 상기 세포 또는 배양 배지로부터 면역사이토카인을 회수함으로써 면역사 이토카인을 제조하는 단계를 포함하는 면역사이토카인 제조방법 .
【청구항 12】
(a) 인간 인터페론 -베타 변이체; (b) 펩티드 링커 및 (c) 항체 또는 이의 단 편을 포함하는 융합 폴리템티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현 백터에 클 로닝하는 단계 ;
(b) 상기 발현 백터를 숙주 세포에 클로닝하는 단계;
(c) 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (d) 상기 세포 또는 배양 배지로부터 상기 융합 폴리펩티드를 회수하는 단계 를 포함하며，
상기 인간 인터페론 -베타 변이체는 서열번호 2 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 펩티드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 타겟 특이적 인간 인터 페론-베타의 생산량 증가 방법 .
【청구항 13】
제 12항에 있어서, 상기 타겟 특이적 인간 인터페론-베타는 면역사이토카인인 것을 특징으로 하는 방법 .
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