WO2019132533A1 - 항-pd-l1 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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WO2019132533A1
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antibody
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light chain
variable region
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안성호
박미주
이은희
이신애
변상순
이혁준
김도윤
유진상
오근희
이원섭
유진산
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    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the present invention relates to an anti-PD-L1 antibody or an antigen-binding fragment thereof, a nucleic acid encoding the same, a vector comprising the nucleic acid, a cell transformed with the vector, a method for producing the antibody or antigen-binding fragment thereof, A pharmaceutical composition for preventing or treating a disease, and an antibody other than an antibody binding to PD-L1.
  • the physiological function of the immune system is to protect individuals from infectious pathogens and non-infectious organisms. Since cancer cells also express cancer specific antigen (Tumor antigen), they should be recognized as non-self and removed by the immune system. However, in many types of cancer, the immune system does not inhibit tumor growth and tends to deteriorate see. This is because cancer cells have various means for actively avoiding immune responses. Among them, immune checkpoints are attracting attention in recent field of tumor immunology.
  • Activation of T cells consists of two signals: MHC on antigen presenting cell (APC) and T cell receptor (TCR) on T cell bind to CD3 and ⁇ The activation signal is transmitted through the interaction of the chain. Independent of this, binding between the receptor on the T cell and the ligand on the APC is required, and the CD28 / CD80 interaction is a representative example.
  • CD80 on the surface of CD28 and APC (dendritic cells, macrophages, B cells, etc.) on T cells leads to protein expression such as anti-apoptotic protein, growth factor and cytokine in T cells , Resulting in activation through T cell proliferation and differentiation.
  • receptors / ligands with such functions exist in addition to CD28 / CD80, such as 4-1BB / 4-1BBL and OX40 / OX40-L, which are called co-stimulatory factors.
  • co-inhibitory factors include CTLA-4 / CD80, PD-1 / PD -L1, Galectin-9 / TIM-3, and the like.
  • the PD-1 / PD-L1 signaling system has been reported as a representative example of a co-inhibitory signal.
  • PD-1 is mainly expressed in activated CD4 + / CD8 + T cells and B cells, and is known to be mainly involved in late immune responses ( EMBO J. 11: 3887-95. 1992.).
  • cancer cells are also known to express PD-L1 and interact with T cells to inhibit immune activity and to exert a great influence on cancer immune avoidance ( Sci., Rep . 5: 13110. 2015.).
  • PD-1 inhibitor antibody Keytruda (ingredient name pembrolizumab), developed by Merck
  • the PD-L1 expression tumor proportion score was significantly increased to 10.3 months compared with 6.0 months of the conventional treatment (Keynote -024).
  • the present inventors have developed a novel anti-PD-L1 antibody different from the existing anti-PD-L1 antibody and have completed the present invention by improving the binding force and the function as an immunological anticancer agent through an optimization process .
  • Another object of the present invention is to provide a vector comprising the nucleic acid, a cell transformed with the vector, and a method for producing the same.
  • the heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 1 or 7 is the heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 1 or 7,
  • the heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 2 or 8 is the heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 2 or 8.
  • a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR3 selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 3, 9, 15, 16, 17, 18, 19, and
  • a light chain CDR1 of SEQ ID NO: 4 or 10 is A light chain CDR1 of SEQ ID NO: 4 or 10
  • a light chain CDR2 of SEQ ID NO: 5 or 11 A light chain CDR2 of SEQ ID NO: 5 or 11, and
  • a light chain variable region comprising a light chain CDR3 selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 6, 12, 13 and 14, or an antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention provides a nucleic acid encoding said antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention also provides a vector comprising said nucleic acid.
  • the present invention also provides a cell transformed with said vector.
  • the present invention also provides a method of producing the antibody or antigen-binding fragment thereof, comprising the steps of: (a) culturing the cell; And (b) recovering the antibody or antigen-binding fragment thereof from the cultured cells.
  • the present invention also provides a composition for treating tumors, comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method of preventing and treating tumors, comprising administering the antibody or antigen-binding fragment thereof to a tumor patient.
  • the present invention further provides the use of the antibody or antigen-binding fragment thereof for inhibiting the immune-evasion mechanism of PD-L1 and its use for the prevention or treatment of tumors.
  • the present invention further provides a composition for administration in combination with an antibody other than an antibody that binds to PD-L1 comprising the above antibody or antigen-binding fragment thereof, or an antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention also provides a method of preventing or treating a tumor comprising administering to the patient an antibody or an antigen-binding fragment thereof, together with an antibody other than an antibody that binds to PD-L1.
  • the invention further provides the use of the antibody or antigen-binding fragment thereof in combination with an antibody other than an antibody that binds to PD-L1 in tumor therapy.
  • FIG. 1 shows the result of confirming whether or not a CHO-K1 cell line overexpressing human or mouse PD-L1 was reacted with a single clone scFv phage.
  • FIG. 2 shows the results of evaluating the inhibitory effect of PD-1 / PD-L1 signal of each clone in the screening of anti-PD-L1 antibody.
  • FIG. 3 shows the results of SDS-PAGE under reducing conditions and non-reducing conditions for the products after the temporary expression and purification of the selected anti-PD-L1 antibody.
  • FIG. 4 shows ELISA results of evaluating the binding of the anti-PD-L1 antibody to human and mouse PD-L1.
  • FIG. 5 shows flow cytometric analysis evaluating the binding of the anti-PD-L1 antibody to human and mouse PD-L1 expressing cells.
  • Fig. 6 shows the results of evaluating the PD-1 / PD-L1 signal suppression effect of the anti-PD-L1 antibody that was expressed and purified.
  • Figure 7 shows the results of evaluating the anti-cancer efficacy of the anti-PD-L1 antibody selected in the MC38 tumor mouse model.
  • Fig. 8 shows the results of comparing the efficacy of PD-1 / PD-L1 signaling inhibition of an antibody clone in which the affinity was improved by performing antibody optimization with the optimized clone.
  • FIG. 9 shows the results of measuring the concentration dependency of the PD-1 / PD-L1 signal inhibitory effect of the selected optimized antibodies.
  • FIG. 10 shows flow cytometric analysis evaluating the binding of the selected optimized antibodies to human and mouse PD-L1 expressing cells.
  • the heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 1 or 7 is the heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 1 or 7,
  • the heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 2 or 8 is the heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 2 or 8.
  • a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR3 selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 3, 9, 15, 16, 17, 18,
  • a light chain CDR1 of SEQ ID NO: 4 or 10 is A light chain CDR1 of SEQ ID NO: 4 or 10
  • a light chain CDR2 of SEQ ID NO: 5 or 11 A light chain CDR2 of SEQ ID NO: 5 or 11, and
  • a light chain variable region comprising a light chain CDR3 selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 6, 12, 13, 14, or an antigen-binding fragment thereof.
  • antibody refers to an anti-PD-L1 antibody that specifically binds to PD-L1.
  • the scope of the present invention encompasses not only the complete antibody form specifically binding to PD-L1 but also antigen-binding fragments of the antibody molecule.
  • a complete antibody is a structure having two full-length light chains and two full-length heavy chains, each light chain being linked by a disulfide bond with a heavy chain.
  • the whole antibody includes subtypes of IgA, IgD, IgE, IgM and IgG, and in particular IgG includes IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4.
  • the heavy chain constant region has gamma (gamma), mu (mu), alpha (alpha), delta (delta) and epsilon (epsilon) types and subclasses gamma 1 (gamma 1), gamma 2 ), Gamma 4 (gamma 4), alpha 1 (alpha 1) and alpha 2 (alpha 2).
  • the constant region of the light chain has kappa (kappa) and lambda (lambda) types.
  • An antigen binding fragment or an antibody fragment of an antibody refers to a fragment having an antigen binding function and includes Fab, F (ab ') 2, F (ab') 2 and Fv.
  • Fabs in the antibody fragment have one antigen-binding site in a structure having a variable region of a light chain and a heavy chain, a constant region of a light chain, and a first constant region (CH1) of a heavy chain.
  • F (ab ') 2 is produced while the cysteine residue of the hinge region of the Fab' forms a disulfide bond.
  • Such an antibody fragment can be obtained using a protein hydrolyzing enzyme (for example, a full-length antibody can be cleaved with papain to obtain a Fab, and cleavage with pepsi to obtain F (ab ') 2) And can be produced using genetic recombination technology.
  • a protein hydrolyzing enzyme for example, a full-length antibody can be cleaved with papain to obtain a Fab, and cleavage with pepsi to obtain F (ab ') 2
  • F (ab ') 2 cleavage with pepsi
  • an antibody according to the invention is in the form of an Fv (e.g. scFv) or a complete antibody form.
  • the heavy chain constant region may be selected from any one of gamma (gamma), mu (mu), alpha (alpha), delta (delta) or epsilon (epsilon).
  • the constant regions are gamma 1 (IgG1), gamma 2 (IgG2), gamma 3 (IgG3), or gamma 4 (IgG4).
  • the light chain constant region may be kappa or lambda form.
  • variable region domain VH comprising an amino acid sequence with sufficient variable region sequence to confer specificity to an antigen and a full length heavy chain comprising three constant region domains CH1, CH2 and CH3 And fragments thereof.
  • light chain as used herein also refers to a full-length light chain comprising a variable region domain VL comprising an amino acid sequence having a sufficient variable region sequence to confer specificity to an antigen and a constant region domain CL and fragments thereof It means all.
  • the antibodies of the present invention can be used as monoclonal antibodies, multispecific antibodies, human antibodies, humanized antibodies, chimeric antibodies, scFv, Fab fragments, F (ab ') 2 fragments, disulfide-linked Fvs (sdFv) (Anti-Id) antibodies, or epitope-binding fragments of such antibodies, and the like.
  • the monoclonal antibody refers to an antibody obtained from a substantially homogeneous population of antibodies, i. E. The same except for possible naturally occurring mutations in which individual antibodies that occupy the population may be present in minor amounts. Monoclonal antibodies are highly specific and are directed against a single antigenic site. In contrast to conventional (polyclonal) antibody preparations that typically contain different antibodies directed against different determinants (epitopes), each monoclonal antibody is directed against a single determinant on the antigen.
  • Epitope means a protein determinant to which an antibody can specifically bind.
  • An epitope is usually composed of chemically active surface molecule groups, such as amino acids or sugar side chains, and generally has specific three dimensional structural features as well as specific charge characteristics. Stereo and non-stereogenic epitopes are distinguished in that in the presence of a denaturing solvent, the bond to the former is lost but not the latter.
  • the non-human (e.g., murine) antibody of the "humanized” form is a chimeric antibody containing minimal sequence derived from non-human immunoglobulin.
  • the humanized antibody is a non-human species (donor antibody), such as a mouse, rat, rabbit or non-human primate, having a desired specificity, affinity and ability to retain a residue from the hypervariable region of the recipient Of human immunoglobulin (acceptor antibody) with a residue from the hypervariable region of the human immunoglobulin.
  • human antibody means a molecule derived from human immunoglobulin, wherein the entire amino acid sequence constituting the antibody including the complementarity determining region and the structural region is composed of human immunoglobulin.
  • the other chain (s) may be derived from another species or may be derived from another antibody class or subgroup, such as a portion of the heavy chain and / or light chain derived from a particular species or identical or homologous to a corresponding sequence in an antibody belonging to a particular antibody class or subclass, Quot; chimeric "antibodies (immunoglobulins) identical or homologous to the corresponding sequences in antibodies belonging to the subclass as well as fragments of said antibodies exhibiting the desired biological activity.
  • an "antibody variable domain” refers to light and heavy chain portions of an antibody molecule comprising the amino acid sequences of complementarity determining regions (CDRs; ie, CDR1, CDR2, and CDR3) and the framework region (FR).
  • CDRs complementarity determining regions
  • FR framework region
  • VH refers to the variable domain of the heavy chain.
  • VL refers to the variable domain of the light chain.
  • a complement determining region refers to an amino acid residue of an antibody variable domain, which is an entity necessary for antigen binding.
  • Each variable domain typically has three CDR regions identified as CDR1, CDR2 and CDR3.
  • the anti-PD-L1 antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention may comprise, for example, a heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 1, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 2 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 3, A light chain variable region comprising light chain CDR1 of SEQ ID NO: 4, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 5 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 6,
  • a heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 1, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 2 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 3, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 4, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 5 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: A light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 1, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 2 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 3, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 4, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 5, and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 14 A light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 7, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 8 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 9, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 10, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 11 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: Light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 7, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 8 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 15, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 10, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 11 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: Light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 7, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 8 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 16, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 10, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 11 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: Light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 7, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 8 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 17, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 10, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 11 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: Light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 7, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 8 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 18, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 10, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 11, and light chain CDR3 of SEQ ID NO: Light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 7, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 8 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 19, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 10, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 11, and light chain CDR3 of SEQ ID NO: Light chain variable region.
  • the "framework region (FR)" is a variable domain residue other than a CDR residue.
  • Each variable domain typically has four FRs: FR1, FR2, FR3, and FR4.
  • Fv fragment is an antibody fragment that contains complete antibody recognition and binding sites. This region consists of a dimer that is tightly associated with one heavy chain variable domain and one light chain variable domain.
  • a “Fab” fragment contains the variable and constant domains of the light chain and the variable and first constant domain (CH1) of the heavy chain.
  • F (ab ') 2 antibody fragments generally comprise a pair of Fab' fragments covalently linked by a cysteine in the hinge region present at the Fab 'fragment C-terminus.
  • a “single chain Fv (scFv)" antibody fragment is a structure consisting of a single polypeptide chain comprising the VH and VL domains of the antibody.
  • a polypeptide linker that allows the scFv to form the desired structure for antigen binding can further be included between the VH domain and the VL domain.
  • the anti-PD-L1 antibody may comprise a short chain or a double chain. Functionally, the binding affinity of the anti-PD-L1 antibody is within the range of 10 -5 M to 10 -12 M.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to PD-L1 may comprise a heavy chain variable region selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 20, 24, 26, 27, 28, 29 and 30.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to PD-L1 may include a light chain variable region selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 21, 22, 23,
  • a heavy chain variable region of SEQ ID NO: 30 and a light chain variable region of SEQ ID NO: 25 are identical to each other.
  • Phage display is a technique for displaying a mutant polypeptide as a fusion protein with the phage, for example, at least part of the coat protein on the surface of the phage phage particle.
  • the usefulness of phage display is that large libraries of randomized protein variants can be targeted to quickly and efficiently classify sequences that bind to target antigens in high affinity. Displaying peptides and protein libraries on phages has been used to screen millions of polypeptides to identify polypeptides with specific binding properties.
  • Phage display technology has provided a powerful tool for generating and screening new proteins that bind to specific ligands (eg, antigens). Using phage display technology, large libraries of protein variants can be generated and sequences that bind with high affinity to target antigens can be quickly classified.
  • the nucleic acid encoding the mutant polypeptide is fused with a nucleic acid sequence encoding a viral coat protein, e. G., A gene III protein or a gene VIII protein.
  • a monophasic phage display system has been developed in which a nucleic acid sequence encoding a protein or polypeptide is fused with a nucleic acid sequence encoding a part of the gene III protein. In the 1-phage display system, the gene fusion is expressed at a low level and the wild-type gene III protein is also expressed, thereby maintaining the infectivity of the particles.
  • Phage display technology has several advantages over conventional hybridomas and recombinant methods for producing antibodies with the desired characteristics. This technique allows the generation of large antibody libraries with a variety of sequences in a short time without the use of animals. The production of hybridomas and the production of humanized antibodies may require several months of manufacturing time. In addition, since no immunity is required, the phage antibody library can generate antibodies against antigens that are toxic or have low antigenicity. Phage antibody libraries can also be used to generate and identify novel therapeutic antibodies.
  • Techniques for generating human antibodies from non-immunized humans, germline sequences, or sub-sensitized B cell Ig repertoires may be used, which are immunized using a phage display library.
  • Various lymphatic tissues can be used to prepare an undetected or non-immunogenic antigen-binding library.
  • the separation of high affinity antibodies from the library can depend on the size of the library, the production efficiency in bacterial cells and the variety of libraries.
  • the size of the library is reduced by inefficient folding of the antibody or antigen binding protein and inefficient production due to the presence of the stop codon.
  • Expression in bacterial cells can be inhibited when the antibody or antigen binding domain is not properly folded.
  • Expression can be improved by alternately mutating the residues at the surface of the variable / constant interface or the selected CDR residues.
  • the sequence of the framework region is one element to provide appropriate folding in the case of generating antibody phage libraries in bacterial cells.
  • CDR3 regions have been found to often participate in antigen binding.
  • the CDR3 region on the heavy chain varies considerably in terms of size, sequence and structural conformation, and thus various libraries can be prepared using the CDR3 region.
  • diversity can be generated by randomizing the CDR regions of the variable heavy and light chains using all 20 amino acids at each position.
  • the use of all 20 amino acids results in an increased variability in antibody sequences and an increased chance of identifying new antibodies.
  • the antibody or antibody fragment of the present invention may include, within the scope of specifically recognizing PD-L1, the sequence of the anti-PD-L1 antibody of the present invention described herein as well as biological equivalents thereof.
  • additional changes can be made to the amino acid sequence of the antibody to further improve the binding affinity and / or other biological properties of the antibody.
  • modifications include, for example, deletion, insertion and / or substitution of the amino acid sequence residues of the antibody.
  • amino acid variations are made based on the relative similarity of the amino acid side chain substituents, such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, and the like.
  • arginine, lysine and histidine are both positively charged residues; Alanine, glycine and serine have similar sizes; Phenylalanine, tryptophan and tyrosine have similar shapes.
  • arginine, lysine and histidine; Alanine, glycine and serine; And phenylalanine, tryptophan and tyrosine are biologically functional equivalents.
  • the antibody of the present invention or the nucleic acid molecule encoding the same is interpreted to include a sequence showing substantial identity with the sequence described in SEQ ID NO:
  • the above-mentioned substantial identity is determined by aligning the sequence of the present invention with any other sequence as much as possible and analyzing the aligned sequence using an algorithm commonly used in the art. Homology, most preferably at least 95% homology, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more homology. Alignment methods for sequence comparison are well known in the art.
  • BLAST The NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) is accessible from NBCI and can be used in conjunction with sequence analysis programs such as blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx on the Internet.
  • BLAST is available at www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.
  • a comparison of sequence homology using this program can be found at www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention can be 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% , 99%, or more homologous to the wild-type.
  • homology can be determined by sequence comparison and / or alignment by methods known in the art.
  • percent sequence homology of a nucleic acid or protein of the present invention can be determined using a sequence comparison algorithm (i.e., BLAST or BLAST 2.0), manual alignment, visual inspection.
  • the present invention relates to a nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof may be recombinantly produced by isolating the nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention.
  • the nucleic acid is isolated and inserted into a replicable vector for further cloning (amplification of DNA) or further expression. Based on this, the present invention relates to a vector comprising the nucleic acid from a different viewpoint.
  • Nucleic acid is meant to encompass both DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules. Nucleotides, which are basic building blocks in nucleic acids, include natural nucleotides as well as analogues in which sugar or base sites are modified . The sequence of the nucleic acid encoding the heavy and light chain variable regions of the present invention can be modified. Such modifications include addition, deletion, or non-conservative substitution or conservative substitution of nucleotides.
  • the DNA encoding the antibody may be readily isolated or synthesized using conventional molecular biology techniques (e.g., by using an oligonucleotide probe capable of specifically binding to the antibody and the DNA encoding the heavy and light chains) And can be inserted into an expression vector.
  • the term "vector” is used as a means for expressing a target gene in a host cell, and includes a viral vector such as a plasmid vector, a cosmid vector, a bacteriophage vector, an adenovirus vector, a retrovirus vector, And the like.
  • Components of the vector generally include, but are not limited to, one or more of the following: signal sequence, origin of replication, one or more antibiotic resistance marker genes, enhancer elements, promoter, transcription termination sequence.
  • the nucleic acid encoding the antibody is operatively linked, such as a promoter and a transcription termination sequence.
  • operatively linked is meant a functional linkage between a nucleic acid expression control sequence (e.g., an array of promoter, signal sequence or transcription factor binding site) and another nucleic acid sequence, / RTI > and / or < / RTI >
  • a nucleic acid expression control sequence e.g., an array of promoter, signal sequence or transcription factor binding site
  • a strong promoter capable of promoting transcription such as a tac promoter, lac promoter, lacUV5 promoter, lpp promoter, pL ⁇ promoter, pR ⁇ promoter, rac5 promoter, amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter, and T7 promoter
  • a ribosome binding site for initiation of translation such as a tac promoter, lac promoter, lacUV5 promoter, lpp promoter, pL ⁇ promoter, pR ⁇ promoter, rac5 promoter, amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter, and T7 promoter
  • a promoter derived from a genome of a mammalian cell for example, a metallothionein promoter, a beta-actin promoter, a human heterologous promoter and a human muscle creatine promoter
  • a promoter derived from an animal virus such as an adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus (CMV) promoter, HSV tk promoter, mouse breast tumor virus (MMTV) promoter, HIV LTR promoter
  • the promoter of Moloney virus promoter Epstein Barr virus (EBV) and the promoter of Roussacomavirus (RSV) and generally have a polyadenylation sequence as a transcription termination sequence.
  • the vector may be fused with another sequence to facilitate purification of the antibody expressed therefrom.
  • Fusion sequences include, for example, glutathione S-transferase (Pharmacia, USA), maltose binding protein (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) and 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA).
  • Such vectors include antibiotic resistance genes commonly used in the art as selectable markers and include, for example, the genes for ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, neomycin and tetracycline There is a resistance gene.
  • the present invention relates to a cell transformed with the above-mentioned vector.
  • the cell used to produce the antibody of the present invention may be a prokaryote, yeast or higher eukaryotic cell, but is not limited thereto.
  • Escherichia coli, Bacillus subtilus and Bacillus thuringiensis, Streptomyces, Pseudomonas (for example, Pseudomonas putida, Bacillus subtilis, Prokaryotic host cells such as Pseudomonas putida, Proteus mirabilis and Staphylococcus (for example, Staphylocus carnosus) can be used.
  • Examples of useful host cell lines are COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO / -DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, SP4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2 / 0, NS-0, TK4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5 , U20S, or HT1080, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a method for producing a cell, comprising: (a) culturing the cell; And (b) recovering the antibody or antigen-binding fragment thereof from the cultured cells.
  • the cells can be cultured in various media. Can be used as a culture medium without limitation in a commercially available medium. All other essential supplements known to those skilled in the art may be included in appropriate concentrations. Culturing conditions, such as temperature, pH, etc., have already been used with the selected host cells for expression, which will be apparent to those skilled in the art.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof may be recovered by, for example, removing impurities by centrifugation or ultrafiltration, and purifying the resultant by, for example, affinity chromatography or the like. Additional purification techniques may be used, such as anion or cation exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, hydroxyl apatite chromatography, and the like.
  • the present invention relates to a composition for preventing or treating tumor comprising the antibody as an active ingredient.
  • the antibody may be an IgG or a fragment containing a variable region, i.e., ScFv, Fab.
  • the heavy chain subtypes may also be IgG1, IgG2, IgG3, IgG4.
  • the present invention may also be a method of preventing or treating a tumor, comprising administering the antibody or antigen-binding fragment thereof to a tumor patient.
  • the present invention may further be a use for inhibiting the immune evasion mechanism of PD-L1 of the antibody or antigen-binding fragment thereof and for the prophylactic or therapeutic use of the tumor.
  • Tumors which are the diseases to which the composition is applied typically include tumors or cancers that respond to immunotherapy, and tumors or cancers that have not previously been implicated in immunotherapy.
  • tumors or cancers that are preferred for treatment include, but are not limited to, melanoma (e. G. Metastatic malignant melanoma), renal cancer (e. G., Clear cell carcinoma), prostate cancer (e. G., Hormone refractory & ), Pancreatic adenocarcinoma, breast cancer, colon cancer, lung cancer (e.g.
  • non-small cell lung cancer non-small cell lung cancer
  • esophageal cancer head and neck squamous cell carcinoma
  • liver cancer ovarian cancer
  • cervical cancer thyroid cancer
  • glioblastoma glioma
  • leukemia Includes other neoplastic carcinomas.
  • present invention includes refractory or relapsed cancers that can be treated using the antibodies of the invention.
  • the present invention relates to a composition for preventing or treating tumor comprising the antibody as an active ingredient.
  • the antibody may be an IgG or a fragment containing a variable region, i.e., ScFv, Fab.
  • the heavy chain subtypes may also be IgG1, IgG2, IgG3, IgG4.
  • Prevention means any act that inhibits the growth of or inhibits the growth of the tumor by administration of the composition according to the present invention
  • treatment means inhibiting tumor development, alleviating the tumor or removing the tumor.
  • an anti-cancer therapeutic agent other than the above antibody may be used in combination to effectively target tumor cells, increase anti-tumor T cell activity, and increase the immune response to target tumor cells.
  • tumor antigens including recombinant proteins, peptides and carbohydrate molecules
  • antigen-presenting cells such as tumor-derived antigens or nucleic acids Cells that have been transfected with a gene encoding an immunostimulatory cytokine (e.g., IL-2, IFN alpha 2, GM-CSF) and an immunostimulatory cytokine (including, for example, GM-CSF (VEGF, EGFR, Her2 / neu, VEGF receptors, other growth factor receptors, CD20, CD40), or other cancer therapeutic agents , Antibodies against CTLA-4, OX-40, 4-IBB, or ICOS, etc.).
  • an immunostimulatory cytokine e.g., IL-2, IFN alpha 2, GM-CSF
  • the present invention is a composition for administration in combination with an antibody other than PD-L1 antibody comprising the above antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the antibody other than the PD-L1 antibody may be, for example, the antibody mentioned above, for example, anti-VEGF, EGFR, Her2 / neu, VEGF receptor, other growth factor receptor, CD20, CD40, CTLA- , 4-IBB, or ICOS antibody.
  • the present invention also relates to a method of preventing or treating a tumor comprising administering to said patient an antibody or antigen-binding fragment thereof together with an antibody other than a PD-L1 antibody.
  • the present invention further relates to the use of the antibody or antigen-binding fragment thereof in combination with an antibody other than the PD-L1 antibody in the prevention or treatment of tumors.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof and an antibody other than the PD-L1 antibody may be administered simultaneously.
  • the antibody or an antigen-binding fragment thereof and the antibody other than the PD-L1 antibody may be separately administered at predetermined time intervals.
  • Antibodies other than PD-L1 antibodies may be administered separately before or after administration of the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the pharmaceutically acceptable carriers to be contained in the composition of the present invention are those conventionally used in the present invention and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate , Microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, syrup, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • the composition of the present invention may further contain lubricants, wetting agents, sweeteners, flavors, emulsifiers, suspending agents, preservatives, etc. in addition to the above components.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally.
  • parenteral administration intravenous injection, subcutaneous injection, muscle injection, intraperitoneal injection, endothelial administration, topical administration, intranasal administration, And the like.
  • the protein or peptide When administered orally, the protein or peptide is extinguished and the oral composition should be formulated to coat the active agent or protect it from degradation from above.
  • the pharmaceutical composition may be administered by any device capable of transferring the active agent to the target cell.
  • the appropriate dosage of the composition according to the present invention may vary depending on factors such as the formulation method, the manner of administration, the age, body weight, sex, pathological condition, food, administration time, route of administration, excretion rate and responsiveness of the patient, , A skilled physician can readily determine and prescribe dosages effective for the desired treatment or prophylaxis.
  • the daily dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is 0.0001-100 mg / kg.
  • the term "pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to prevent or treat cancer or an autoimmune disease.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated into a unit dose form by formulating it using a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method which can be easily carried out by a person having ordinary skill in the art to which the present invention belongs. Or by intrusion into a multi-dose container.
  • the formulations may be in the form of solutions, suspensions or emulsions in oils or aqueous media, or in the form of excipients, powders, suppositories, powders, granules, tablets or capsules, and may additionally contain dispersing or stabilizing agents.
  • the antibody library and library for screening antibodies binding to PD-L1 were prepared using a human naive scFv library such as Korean Patent Application No. 10-2008-0109417. A general bio-panning method was used, and human and mouse PD-L1 proteins were selectively used to screen for antibodies with human and mouse cross reactivity.
  • Human or mouse PD-L1-HisTag (# 10084-H08H / 50010-M08H, Sino Biological Inc. CN) was prepared at a concentration of 2 ⁇ g / ml, and 100 ⁇ l of each well was plated on a 96-well nickel- Thermo Fisher Scientific) and allowed to stand overnight at 4 < 0 > C for adsorption. The next day, the cells were washed three times with PBS, and then 200 ⁇ l of a 2% BSA-containing PBS solution was added and allowed to stand at room temperature for 2 hours.
  • XL-1 Blue infected with the PD-L1 binding phage at the final stage of bio-panning was plated on 2xYT-agar plates containing 34 ⁇ g / ml chloramphenicol and incubated at 37 ° C for 16 hours.
  • the resulting single colonies were randomly selected and taken in a 96-well deep well plate (Bioneer, KR) containing 200 ⁇ l of culture medium (2 ⁇ YT medium containing 34 ⁇ g / ml chloramphenicol) so that each clone can be distinguished. Lt; 0 > C overnight. This was used as a single clone of PD-L1 binding phage and glycerol was added thereto to a final concentration of 20%, followed by cryopreservation.
  • Example 2 Screening of scFv phage specifically binding to PD-L1 (ELISA / FACS)
  • a portion of the PD-L1-binding phage single-clone preservation solution was added to 200 ⁇ l of the new culture medium, followed by incubation at 37 ° C for 1-2 hours with shaking until reaching the logarithmic growth period. Then, M13 helper phage was added and the mixture was incubated at 37 ° C for 30 minutes Infected. Subsequently, the medium was replaced with a culture medium containing 70 / / ml kanamycin, 1 mM IPTG, 5 mM MgCl2, and cultured overnight at 30 ⁇ C with shaking. After centrifugation, the supernatant was taken and used for binding test and selection with a PD-L1-binding monoclonal phage containing culture.
  • HPD-L1 / CHO-K1, mPD-L1 / CHO-K1 which was established by introducing human and mouse PD-L1 gene into CHO-K1 cells. Each cell was maintained in culture, washed with PBS, and suspended in 5 mM EDTA to recover the cells by centrifugation. 4 ⁇ 10 6 cells / ml cell suspension was prepared using FACS-specific buffer (PBS containing 2% FBS and 0.05% sodium azide) and dispensed into a 96-well plate in an amount of 50 ⁇ l / well. 50 ⁇ ⁇ of the culture medium containing the monoclonal phage was added and reacted at room temperature for 1 hour.
  • FACS-specific buffer PBS containing 2% FBS and 0.05% sodium azide
  • FITC-conjugated anti-human PD-L1 antibody As a positive control, FITC-conjugated anti-human PD-L1 antibody (FITC-conjugated anti-human PD-L1 antibody: # 558065, BD Biosciences) and PE- conjugated anti- mouse PD- mouse PD-L1: # 558091, BD Biosciences). The analysis was performed using FACSCalibur of BD Bioscience Inc. The results are shown in FIG.
  • the Expi293F expression system kit (Thermo Fisher Scientific, US) was used.
  • the Expi293 cells contained in the kit were suspended and cultured on a 125 rpm orbital shaker under a 5% CO 2 environment at 37 ° C using a dedicated medium.
  • the cells were subcultured to 3 ⁇ 10 5 cells / ml every 3 days, and the number of cells was adjusted to 3 ⁇ 10 6 cells / ml when the expression vector was introduced.
  • Expifectamine a special reagent, was used.
  • a lipid-DNA complex containing 1 ⁇ g of expression vector DNA and 2.7 ⁇ l of Expifectamine per 1 ml of the cell suspension was prepared and added to the cell suspension. After 16-18 hours of introduction, Enhancer) 1/2 to induce expression. After incubation under the same conditions for 3-4 days, the supernatant containing IgG was taken by centrifugation.
  • Example 4 Screening for anti-PD-L1 antibodies by analyzing the inhibitory effect of PD-1 / PD-L1 signal
  • the degree of inhibition of the PD-1 / PD-L1 signaling system was evaluated to evaluate the function of the obtained antibodies.
  • IgG was transiently expressed on a 2-ml scale using the method described in Example 3, and the culture supernatant was taken for efficacy analysis.
  • the test was performed using a commercially available PD-1 / PD-L1 Blockade Bioassay (J1250, Promega Corp. US).
  • PD-L1-expressing CHO-K1 cells contained in the kit was thawed in growth medium (Ham's F-12 Medium containing 10% FBS) and 100 ⁇ l each was dispensed into a 96-well microplate. and it incubated overnight at% CO 2 environment.
  • 40 ⁇ l of the IgG temporary culture supernatant and 40 ⁇ l of PD-1 expression effector cell suspension (RPMI 1640 containing 1% FBS) adjusted to 20 ⁇ g / ml the following day were added to each well.
  • the obtained supernatant was injected into a Protein A column (GE Healthcare) to purify IgG through affinity chromatography.
  • the column was equilibrated with 20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, and 5 mM EDTA (pH 7.0), and the supernatant was then added and the solution was washed with 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.2% , Eluted with 50 mM NaCl, 0.1 M glycine-HCl (pH 3.5) and neutralized with 1 M Tris.
  • the eluted proteins were exchanged with PBS through dialysis using MWCO 10,000 spectra / por dialysis membrane (Spectrum Labs, US). Subsequently, the mixture was concentrated to the required concentration using Vivaspin (Satorius, DE), and the mixture was dispensed and stored at -80 ° C.
  • each antibody was treated with non-reducing and reducing LDS sample buffer (Non-reducing and Reducing LDS sample buffer: Thermo Fisher Scientific) and electrophoresed using a NuPAGE System (Thermo Fisher Scientific).
  • non-reducing and Reducing LDS sample buffer Thermo Fisher Scientific
  • electrophoresed using a NuPAGE System Thermo Fisher Scientific
  • ELISA and flow cytometry were used for binding specificity and binding constants were measured using Octet system (Pall Fortebio LLC, US).
  • HPD-L1 / CHO-K1, mPD-L1 / CHO-K1 by introducing human and mouse PD-L1 gene into CHO-K1 cells for flow cytometry.
  • Each cell was maintained in culture, washed with PBS, and suspended in 5 mM EDTA to recover the cells by centrifugation.
  • a 5 ⁇ 10 6 cells / ml cell suspension was prepared using FACS-specific buffer (PBS containing 2% FBS and 0.05% sodium azide) and dispensed at a rate of 100 ⁇ l per tube. 2 ⁇ g / ml of test antibody was added to each test tube in an amount of 100 ⁇ l, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C for 30 minutes to induce antibody-cell binding.
  • FITC-conjugated anti-human PD-L1 antibody As a positive control, FITC-conjugated anti-human PD-L1 antibody (FITC-conjugated anti-human PD-L1 antibody: # 558065, BD Biosciences) and PE- conjugated anti- PD-L1: # 558091, BD Biosciences).
  • the analysis was performed using FACSCalibur of BD Bioscience Inc. The results are shown in FIG.
  • the binding capacity of the selected anti-PD-L1 antibodies to human or mouse PD-L1 was measured using the Octet system (Fortebio Inc. US).
  • the binding constant (k a ), the dissociation rate constant (k dis ), and the binding constant (K D ) were measured by immobilizing the anti-PD-L1 antibody in the biosensor and measuring the binding kinetics by concentration of human or mouse PD- ) (Table 3).
  • Example 7 Analysis of inhibitory effect of anti-PD-L1 antibody on PD-1 / PD-L1 signal
  • the degree of inhibition of the PD-1 / PD-L1 signaling system was evaluated to evaluate the function of the obtained antibodies.
  • the test was carried out using PD-1 / PD-L1 Blockade Bioassay (J1250, Promega Corp. US) commercialized in the same manner as in Example 4.
  • PD-1 / PD-L1 Blockade Bioassay J1250, Promega Corp. US
  • 0.5 ml of PD-L1-expressing CHO-K1 cells contained in the kit was thawed in growth medium (Ham's F-12 Medium containing 10% FBS) and 100 ⁇ l each was dispensed into a 96-well microplate. and it incubated overnight at% CO 2 environment.
  • Example 8 In vivo antitumor effect assay
  • mice-derived colon cancer cell line (MC-38) was used to analyze antitumor effect of anti-PD-L1 antibody.
  • the MC-38 mouse colon cancer cell line was cultured at 37 ° C and 5% CO 2 .
  • Five week old SPF female C57BL / 6 mice (Koatech, KR) were obtained and purified for 1 week. Then, 200 ⁇ l of 5 ⁇ 10 6 cells / ml MC38 cell suspension was transplanted into the right armpit and chest wall subcutaneously Respectively.
  • Tumor size was calculated by the formula of length ⁇ width ⁇ height / 2 after measuring 3 directions using Vernier caliper.
  • Antibody optimization was performed to increase affinity of anti-PD-L1 antibody clone 1G1 and ME4.
  • a primer that introduces random mutations into the heavy chain CDR3 of ME1 and light chain CDR3 of 1G1 Respectively.
  • PCR was performed to obtain a light chain variable region of 1G1 and a heavy chain variable region encoding DNA fragment of ME4 into which the mutation was introduced.
  • This DNA fragment was substituted with the light chain variable region of the 1G1 scFv phage phagemid and the heavy chain variable region of the ME4 scFv phage phagemid to prepare the 1G1 light chain CDR3 mutant scFv phage library and the ME4 heavy chain CDR3 mutant scFv phage DNA library, respectively.
  • the mutant scFv phage DNA library was purified after phenol-chloroform purification and transformed into E. coli strain XL-1 Blue by electroporation. Transfection efficiency analysis and DNA sequence analysis showed that diversity was ensured. Then, the cells were cultured in a 500-ml scale to induce phage expression, and the 1G1 light chain CDR3 mutant scFv phage library and the ME4 heavy chain CDR3 mutant scFv phage library was constructed.
  • Biopanning was performed by the method described in Example 1 using each mutant scFv phage library. Then, in the selection process, the dissociation rate constant kdis of the scFv was measured as a quantitative evaluation index of the ability to maintain binding.
  • the amino acid sequences (Table 4, 5) and dissociation rate constant measurement results (Table 6) for seven selected optimized clones were shown.
  • Example 10 Analysis of inhibitory effect of PD-1 / PD-L1 signal of optimized anti-PD-L1 antibody
  • Each optimized scFv phage clone was converted to IgG form.
  • DNA cloning, production and purification for specific morphological transformation were carried out in the same manner as in Example 3 and Example 5.
  • the degree of inhibition of the PD-1 / PD-L1 signaling system was evaluated to evaluate the function of the obtained antibodies.
  • PD-1 / PD-L1 signaling inhibition was evaluated using the same method as in Example 4 (Fig. 8).
  • the cell binding capacity of the optimized anti-PD-L1 antibody was measured by flow cytometry.
  • the experiment was carried out in the same manner as in Example 6.
  • the bond dynamics were analyzed using Octet and the bond constants were calculated (Table 7). It was confirmed that the binding force to human and mouse PD-L1 greatly increased through optimization. In particular, it is considered that the increase in the binding force to the mouse PD-L1 is more favorable for the efficacy test in animal models.
  • the anti-PD-L1 antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention exhibits a desired binding force to PD-L1 and can be usefully used for the prevention or treatment of a desired tumor.
  • a therapeutic agent exhibiting higher efficacy than the existing anti-PD-L1 antibody, a single treatment method and a combined treatment method with other conventional therapeutic agents can be provided.

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Abstract

본 발명은 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법, 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물 및 PD-L1에 결합하는 항체 이외의 항체와의 병용투여용 조성물에 관한 것이다.

Description

항-PD-L1 항체 및 이의 용도
본 발명은 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환 된 세포, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법, 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 PD-L1에 결합하는 항체 이외의 항체와의 병용투여용 조성물에 관한 것이다.
면역체계의 생리적 기능은 감염성 병원균 등과 비 감염성 이물질로부터 개체를 보호하는 것이다. 암세포 또한 암 특이적 항원 (Tumor antigen)을 발현하기 때문에 비 자기 (Non-self)로 인식되어 면역체계에 의해 제거되어야 하나, 많은 종류의 암에서 면역체계가 종양 성장을 억제하지 못하고 악화되는 경향을 보인다. 이는 암세포가 면역 응답을 적극적으로 회피하기 위한 다양한 수단을 갖기 때문인데, 그 중 최근의 종양 면역학 분야에서 주목받고 있는 것이 면역체크포인트 (Immune Checkpoint)이다.
T세포의 활성화는 두 가지 신호로 이루어지는데, 일차적으로 항원제시세포 (APC; Antigen Presenting Cell) 상의 MHC와 T세포상의 T세포 수용체 (TCR; T-cell receptor)가 결합하여 TCR 복합체 내 CD3와 ζ사슬의 상호작용을 통해 활성화 신호를 전달한다. 이와는 독립적으로 T세포상의 수용체와 APC상의 리간드간의 결합이 필요한데, CD28/CD80 상호작용을 대표적 예로 들 수 있다. T세포상의 CD28과 APC(수지상 세포, 대식세포, B세포 등) 표면에 존재하는 CD80이 결합하면 T세포에서 항-세포 사멸 단백질 (anti-apoptotic protein), 성장인자 및 사이토카인 등 단백질 발현이 유도되고, 결과적으로 T세포의 증식과 분화를 통해 활성화를 유도한다. 이러한 기능을 갖는 수용체/리간드는 CD28/CD80 이외에도 4-1BB/4-1BBL, OX40/OX40-L 등 다수가 존재하며, 이들을 공동 자극 인자 (co-stimulatory factor)라 한다. 거꾸로 T세포상의 수용체와 APC상의 리간드가 결합함으로써 T세포의 활성을 억제하는 분자도 존재하는데, 이들을 공동 억제 인자 (co-inhibitory factor)라 하며, 대표적으로 CTLA-4/CD80, PD-1/PD-L1, Galectin-9/TIM-3 등이 알려져 있다. 이들을 통해 T세포는 면역 응답과 면역 관용을 조절하고 있다.
공동 억제 신호 (co-inhibitory signal)의 대표적 예로 PD-1/PD-L1 신호체계가 보고되어 있다. PD-1은 주로 활성화된 CD4+/CD8+ T세포와 B세포에서 발현되며, 후기의 면역 응답에 주로 관여하는 것으로 알려져 있다 (EMBO J. 11:3887-95. 1992.). PD-1과 그 리간드인 PD-L1/L2의 결합은 포스파타제 (phosphatase)의 일종인 SHP-2를 리쿠르트하여 T세포의 활성화와 관련된 단백질 및 인산화효소를 억제, T세포의 증식 및 인터페론-감마 (interferon-γ) 생산 등 세포독성 관련 활성을 억제한다 (J. Exp. Med. 209:1201-17. 2012.). 특히, 암세포 또한 PD-L1을 발현하여 T세포와 상호작용을 통해 면역 활성을 억제, 암의 면역 회피에 지대한 영향을 미치는 것으로 알려져 있다 (Sci. Rep. 5:13110. 2015.). 단적인 예로, 머크 (Merck)사에서 개발한 PD-1 억제 항체인 Keytruda (성분명 pembrolizumab)를 일차치료제로서 전이성 비소세포성 폐암 환자에 투여할 경우, 동반진단을 통해 PD-L1 발현 종양 비례 점수 (Tumor proportion score: TPS)가 50% 이상인 환자에만 투여하며, 그 경우 종양 억제 효능 지표인 평균 무진행 생존기간 (median Progression Free Survival)이 기존 치료제 6.0개월에 비해 10.3개월로 크게 증진된 것이 보고되었다 (Keynote-024). 그러나, 동일한 기전의 PD-1 억제 항체인 BMS사의 Opdivo (성분명 nivolumab)의 경우, PD-L1 발현 여부와 무관하게 환자를 선정, 임상시험을 진행하였으나, 효능을 보이지 못해 품목허가 획득에는 실패하였다. 이것은 PD-L1을 고발현 (TPS > 50%) 하는 환자가 약 30%에 불과하여 시험 대상 전체 환자 수 대비 효능을 보이는 환자 수가 적었기 때문으로 추측된다. 즉, PD-1/PD-L1 신호 억제를 통한 종양 성장 억제에는 종양의 PD-L1 발현이 필수적이라 할 수 있다.
이러한 내용을 바탕으로, 최근에는 PD-L1 억제 항체가 잇따라 허가를 받은 상황이다. Roche사의 Tecentriq (성분명 atezolizumab)이 First-in-Class로 현재 방광암 및 비소세포성 폐암에 대해 승인, 적응증을 확대해 가고 있고, 후발주자로서 Pfizer사의 Bavencio (성분명 avelumab) 및 Astrazeneca사의 Imfinzi (성분명 durvalumab) 또한 방광암을 시작으로 적응증을 확대 중에 있다.
이러한 기술적 배경을 바탕으로, 본 발명자들은 기존의 항-PD-L1 항체와 구별되는 신규 항-PD-L1 항체를 개발하였으며, 최적화 과정을 통해 결합력 및 면역 항암제로서의 기능을 향상시킴으로써 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 PD-L1에 대한 신규 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환 된 세포 및 이의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 종양 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 타 항체와 병용투여하기 위한 조성물을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
서열번호 1 또는 7의 중쇄 CDR1,
서열번호 2 또는 8의 중쇄 CDR2, 및
서열번호 3, 9, 15, 16, 17, 18, 19로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및
서열번호 4 또는 10의 경쇄 CDR1,
서열번호 5 또는 11의 경쇄 CDR2, 및
서열번호 6, 12, 13, 14로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, PD-L1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편을 제공한다.
본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공한다: (a) 상기 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 종양 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 종양 환자에 투여하는 단계를 포함하는 종양의 예방 및 치료방법을 제공한다. 본 발명은 더욱이, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 PD-L1의 면역회피 기전 억제 용도 및 이를 통한 종양의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명은 더욱이, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 PD-L1에 결합하는 항체 이외의 항체와의 병용 투여용 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 PD-L1에 결합하는 항체 이외의 항체와 함께 환자에 투여하는 단계를 포함하는 종양의 예방 또는 치료방법을 제공한다. 본 발명은 더욱이, 종양 치료에서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 PD-L1에 결합하는 항체 이외의 항체와 병용투여하기 위한 용도를 제공한다.
도 1은 인간 또는 마우스 PD-L1을 과발현시킨 CHO-K1 세포주에 단일클론 scFv 파지를 반응시켜 결합 여부를 확인한 결과이다.
도 2는 항-PD-L1 항체의 선별 과정에서 각 클론의 PD-1/PD-L1 신호 억제 효과를 평가한 결과이다.
도 3은 선별한 항-PD-L1 항체를 일시발현 및 정제 후 산물에 대한 환원조건 및 비환원조건에서의 SDS-PAGE 결과이다.
도 4는 일시발현 및 정제한 항-PD-L1 항체의 인간 및 마우스 PD-L1에 대한 결합을 평가한 ELISA 결과이다.
도 5는 일시발현 및 정제한 항-PD-L1 항체의 인간 및 마우스 PD-L1 발현 세포에 대한 결합을 평가한 유세포분석 결과이다.
도 6은 일시발현 및 정제한 항-PD-L1 항체의 PD-1/PD-L1 신호 억제 효과를 평가한 결과이다.
도 7은 MC38 종양 마우스 모델에서 선별된 항-PD-L1 항체의 항암 효능을 평가한 결과이다.
도 8은 항체 최적화를 수행하여 친화도를 개선한 항체 클론의 PD-1/PD-L1 신호 억제 효능을 최적화 전 클론과 비교한 결과이다.
도 9는 선별된 최적화 항체의 PD-1/PD-L1 신호 억제 효능의 농도의존성을 측정한 결과이다.
도 10은 선별된 최적화 항체의 인간 및 마우스 PD-L1 발현 세포에 대한 결합을 평가한 유세포분석 결과이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서,
서열번호 1 또는 7의 중쇄 CDR1,
서열번호 2 또는 8의 중쇄 CDR2, 및
서열번호 3, 9, 15, 16, 17, 18, 19로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역 및
서열번호 4 또는 10의 경쇄 CDR1,
서열번호 5 또는 11의 경쇄 CDR2, 및
서열번호 6, 12, 13, 14로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, PD-L1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "항체(antibody)"는 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항-PD-L1 항체를 의미한다. 본 발명의 범위에는 PD-L1에 특이적으로 결합하는 완전한 항체 형태 뿐 아니라, 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함된다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG의 아형(subtype)을 포함하며, 특히 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
항체의 항원 결합 단편 또는 항체 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge-region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 다이설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO88/001649, WO88/006630, WO88/07085, WO88/07086 및 WO88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 완전한 형태의 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩시으로 절단하면 F(ab')2를 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 이용하여 제작할 수 있다.
하나의 실시예에서, 본 발명에 따른 항체는 Fv 형태(예컨대, scFv)이거나, 완전한 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변영역은 감마1 (IgG1), 감마 2 (IgG2), 감마 3 (IgG3) 또는 감마 4 (IgG4)이다. 경쇄 불변영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어, "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
본 발명의 항체는 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, scFv, Fab 단편, F(ab')2 단편, 다이설파이드-결합 Fvs (sdFv) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 또는 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 단일클론 항체는 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득한 항체, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 지칭한다. 단일클론 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대항하여 유도된다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 통상의 (폴리클로날) 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다.
"에피토프(epitope)"는 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정부위(determinant)를 의미한다. 에피토프는 통상 화학적으로 활성인 표면 분자군, 예를 들어 아미노산 또는 당 측쇄로 구성되며, 일반적으로 특정한 3차원의 구조적 특징뿐만 아니라 특정한 전하 특성을 갖는다. 입체적 에피토프 및 비입체적 에피토프는 변성 용매의 존재하에서 전자에 대한 결합은 소실되지만 후자에 대해서는 소실되지 않는 점에서 구별된다.
상기 "인간화" 형태의 비-인간(예: 마우스) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 초가변영역으로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하고 있는 비-인간 종(공여자 항체), 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역으로부터의 잔기로 대체시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다.
상기 "인간 항체"는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서 상보성 결정영역, 구조 영역을 포함한 항체를 구성하는 아미노산 서열 전체가 인간의 면역글로불린으로 구성되어 있는 것을의미한다.
중쇄 및/또는 경쇄 일부가 특별한 종으로부터 유래되거나 특별한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 나머지 쇄(들)는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체(면역글로불린) 뿐 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 상기 항체의 단편이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 "항체 가변 도메인"은 상보성 결정 영역 (CDR; 즉 CDR1, CDR2, 및 CDR3) 및 골격 영역 (FR)의 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자의 경쇄 및 중쇄 부분을 지칭한다. VH는 중쇄의 가변 도메인을 지칭한다. VL은 경쇄의 가변 도메인을 지칭한다.
"상보성 결정 영역(complement determining region, CDR)"은 항원 결합을 위해 필요한 존재인, 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각 가변 도메인은 전형적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3로 확인된 3개의 CDR 영역을 갖는다.
본 발명에 따른 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합단편은 예를 들어, 서열번호 1의 중쇄 CDR 1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR 3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 1의 중쇄 CDR 1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR 3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2 및 서열번호 13의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 1의 중쇄 CDR 1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR 3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2 및 서열번호 14의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 8의 중쇄 CDR2 및 서열번호 9의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 10의 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 경쇄 CDR2 및 서열번호 12의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 8의 중쇄 CDR2 및 서열번호 15의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 10의 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 경쇄 CDR2 및 서열번호 12의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 8의 중쇄 CDR2 및 서열번호 16의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 10의 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 경쇄 CDR2 및 서열번호 12의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 8의 중쇄 CDR2 및 서열번호 17의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 10의 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 경쇄 CDR2 및 서열번호 12의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 8의 중쇄 CDR2 및 서열번호 18의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 10의 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 경쇄 CDR2 및 서열번호 12의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 8의 중쇄 CDR2 및 서열번호 19의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 10의 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 경쇄 CDR2 및 서열번호 12의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
"골격 영역(FR)"은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 각 가변 도메인은 전형적으로, FR1, FR2, FR3 및 FR4의 4개의 FR을 갖는다.
"Fv" 단편은 완전한 항체 인식 및 결합 부위를 함유하는 항체 단편이다. 이러한 영역은 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인이 단단하게 연합된 이량체로 이루어진다.
"Fab" 단편은 경쇄의 가변 및 불변 도메인과, 중쇄의 가변 및 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. F(ab')2 항체 단편은 일반적으로 Fab'단편 C-말단에 존재하는 힌지 영역의 시스테인에 의해 공유적으로 연결된 한 쌍의 Fab' 단편을 포함한다.
"단일쇄 Fv (scFv)" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄로 이루어진 구조체이다. scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 폴리펩티드 링커를 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 추가로 포함할 수 있다.
항-PD-L1 항체는 단쇄 또는 이중 쇄를 포함할 수 있다. 기능적으로, 항-PD-L1 항체의 결합 친화성은 10-5M 내지 10-12 M 범위 내에 있다. 예를 들어, 항-PD-L1 항체의 결합 친화성은 10-6 M 내지 10-12 M, 10-7 M 내지 10-12 M, 10-8 M 내지 10-12 M, 10-9 M 내지 10-12 M, 10-5 M 내지 10-11 M, 10-6 M 내지 10-11 M, 10-7 M 내지 10-11 M, 10-8 M 내지 10-11 M, 10-9 M 내지 10-11 M, 10-10 M 내지 10-11 M, 10-5 M 내지 10-10 M, 10-6 M 내지 10-10 M, 10-7 M 내지 10-10 M, 10-8 M 내지 10-10 M, 10-9 M 내지 10-10 M, 10-5 M 내지 10-9 M, 10-6 M 내지 10-9 M, 10-7 M 내지 10-9 M, 10-8 M 내지 10-9 M, 10-5 M 내지 10-8 M, 10-6 M 내지 10-8 M, 10-7 M 내지 10-8 M, 10-5 M 내지 10-7 M, 10-6 M 내지 10-7 M 또는 10-5 M 내지 10-6 M이다.
상기 PD-L1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 20, 24, 26, 27, 28, 29 및 30으로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 PD-L1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 21, 22, 23 및 25로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 구체적 실시예에서, 서열번호 20의 중쇄 가변영역 및 서열번호 21의 경쇄 가변영역;
서열번호 20의 중쇄 가변영역 및 서열번호 22의 경쇄 가변영역;
서열번호 20의 중쇄 가변영역 및 서열번호 23의 경쇄 가변영역;
서열번호 24의 중쇄 가변영역 및 서열번호 25의 경쇄 가변영역;
서열번호 26의 중쇄 가변영역 및 서열번호 25의 경쇄 가변영역;
서열번호 27의 중쇄 가변영역 및 서열번호 25의 경쇄 가변영역;
서열번호 28의 중쇄 가변영역 및 서열번호 25의 경쇄 가변영역;
서열번호 29의 중쇄 가변영역 및 서열번호 25의 경쇄 가변영역; 또는
서열번호 30의 중쇄 가변영역 및 서열번호 25의 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
"파지 디스플레이"는 변이체 폴리펩티드를 파지, 예를 들어 섬유상 파지 입자의 표면 상에 외피 단백질의 적어도 일부와의 융합 단백질로서 디스플레이하는 기술이다. 파지 디스플레이의 유용성은 무작위화 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 대상으로 하여, 표적 항원과 고 친화도로 결합하는 서열을 신속하고도 효율적으로 분류할 수 있다는 사실에 있다. 펩티드 및 단백질 라이브러리를 파지 상에 디스플레이하는 것은 특이적 결합 특성을 지닌 폴리펩티드를 알아보기 위해 수 백만개의 폴리펩티드를 스크리닝하는데 사용되어 왔다.
파지 디스플레이 기술은 특정 리간드(예: 항원)와 결합하는 신규 단백질을 생성 및 선별하기 위한 강력한 도구를 제공하였다. 파지 디스플레이 기술을 사용하여, 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 생성시키고, 표적 항원과 고 친화성으로 결합하는 서열을 신속하게 분류할 수 있다. 변이체 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 바이러스성 외피 단백질, 예를 들어 유전자 III 단백질 또는 유전자 VIII 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 융합시킨다. 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 유전자 III 단백질의 일부를 암호화하는 핵산 서열과 융합시킨 1가 파지 디스플레이 시스템이 개발되었다. 1가 파지 디스플레이 시스템에서는, 유전자 융합물이 저 수준으로 발현되고 야생형 유전자 III 단백질이 또한 발현되어 입자 감염성이 유지된다.
섬유상 파지 표면 상에서의 펩티드의 발현과 E. coli의 주변세포질에서의 기능성 항체 단편의 발현을 입증하는 것이 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 개발하는 데에 있어 중요하다. 항체 또는 항원 결합성 폴리펩티드의 라이브러리는 수 많은 방식, 예를 들어 무작위 DNA 서열을 삽입함으로써 단일 유전자를 변경시키는 방법 또는 관련 유전자 계열을 클로닝하는 방법으로 제조하였다. 라이브러리를 대상으로 하여, 목적하는 특징을 수반한 항체 또는 항원 결합성 단백질의 발현에 관하여 스크리닝할 수 있다.
파지 디스플레이 기술은 목적하는 특징을 지닌 항체를 제조하기 위한 통상적인 하이브리도마 및 재조합 방법에 비해 몇 가지 이점을 지니고 있다. 이러한 기술은 동물을 사용하지 않고서도 짧은 시간에 다양한 서열을 지닌 큰 항체 라이브러리를 생성시킬 수 있도록 한다. 하이브리도마의 제조나 인간화 항체의 제조는 수 개월의 제조기간을 필요로 할 수 있다. 또한, 면역이 전혀 요구되지 않기 때문에, 파지 항체 라이브러리는 독성이거나 항원성이 낮은 항원에 대해서도 항체를 생성시킬 수 있다. 파지 항체 라이브러리를 또한 사용하여 신규한 치료적 항체를 생성 및 확인할 수 있다.
파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 면역시킨, 비-면역시킨 인간, 생식세포계 서열, 또는 미감작 B 세포 Ig 레퍼토리 (repertory)로부터 인간 항체를 생성시키는 기술을 사용할 수 있다. 각종 림프계 조직을 사용하여, 미감작 또는 비면역 항원 결합성 라이브러리를 제조할 수 있다.
파지 디스플레이 라이브러리로부터 고친화성 항체를 확인 및 분리할 수 있는 기술은 치료용 신규 항체 분리에 중요하다. 라이브러리로부터 고친화성 항체를 분리하는 것은 라이브러리의 크기, 세균성 세포 중에서의 생산 효율 및 라이브러리의 다양성에 좌우될 수 있다. 라이브러리의 크기는 항체 또는 항원 결합성 단백질의 부적절한 폴딩과 정지 코돈의 존재로 인한 비효율적 생산에 의해 감소된다. 세균성 세포에서의 발현은 항체 또는 항원 결합성 도메인이 적절하게 폴딩되지 않는 경우에는 억제될 수 있다. 발현은 가변/불변 계면의 표면이나 선별된 CDR 잔기에서의 잔기를 교대로 돌연변이시킴으로써 개선시킬 수 있다. 골격 영역의 서열은 세균성 세포에서 항체 파지 라이브러리를 생성시키는 경우에 적절한 폴딩을 제공하기 위한 하나의 요소이다.
고 친화성 항체 분리에서 항체 또는 항원 결합성 단백질의 다양한 라이브러리를 생성시키는 것이 중요하다. CDR3 영역은 이들이 종종 항원 결합에 참여하는 것으로 밝혀졌다. 중쇄 상의 CDR3 영역은 크기, 서열 및 구조적 입체 형태 면에서 상당히 다양하므로, 이를 이용하여 다양한 라이브러리를 제조할 수 있다.
또한, 각 위치에서 20개 아미노산 모두를 사용하여 가변 중쇄 및 경쇄의 CDR 영역을 무작위화함으로써 다양성을 발생시킬 수 있다. 20개의 모든 아미노산을 사용하면 다양성이 큰 변이체 항체 서열이 생성되고 신규한 항체를 확인할 기회가 증가할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편은 PD-L1를 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서, 본 명세서에 기재된 본 발명의 항-PD-L1 항체의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)은 NBCI 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_ help.html에서 확인할 수 있다.
이에 기초하여, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 명세서에 기재된 명시된 서열 또는 전체와 비교하여 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다. 이러한 상동성은 당업계에 공지된 방법에 의한 서열 비교 및/또는 정렬에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 서열 비교 알고리즘(즉, BLAST 또는 BLAST 2.0), 수동 정렬, 육안 검사를 이용하여 본 발명의 핵산 또는 단백질의 퍼센트 서열 상동성을 결정할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 분리하여 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 재조합적으로 생산할 수 있다. 핵산을 분리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나(DNA의 증폭) 또는 추가로 발현시킨다. 이를 바탕으로, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
"핵산"은 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
상기 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 분자생물학적 수법을 사용하여 (예를 들어, 항체와 중쇄와 경쇄를 암호화하는 DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 올리코뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 분리 또는 합성할 수 있으며, 발현 벡터 내에 삽입할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다. 벡터의 성분으로는 일반적으로 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 항생제 내성 마커 유전자, 증강인자 요소, 프로모터, 전사 종결 서열. 항체를 코딩하는 핵산은 프로모터 및 전사 종결 서열 등과 같이 작동적으로 연결되어 있다.
"작동적으로 연결"은 핵산 발현조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 따라 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 또한, 예를 들어, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
경우에 따라서, 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.
상기 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 언급된 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다. 본 발명의 항체를 생성시키기 위해 사용된 세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilus 및 바실러스 투링기엔시스 (Bacillus thuringiensis)와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스미라빌리스(Proteus mirabilis) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주세포를 이용할 수 있다.
다만, 동물 세포에 대한 관심이 가장 크며, 유용한 숙주 세포주의 예는 COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S, 또는 HT1080일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법에 관한 것이다.
상기 세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배지 중 제한없이 배양 배지로서 사용할 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주 세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 회수는 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 불순물을 제거하고, 그 결과물을 예를 들어 친화 크로마토그래피 등을 이용하여 정제할 수 있다. 추가의 기타 정제 기술 예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 항체를 유효성분으로 포함하는 종양의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 상기 항체는 IgG 또는 가변영역을 포함한 단편 즉 ScFv, Fab일 수 있다. 또한 중쇄의 아형은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 일 수 있다.
본 발명은 예를 들어, (a) 본 발명에 따른 PD-L1에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 종양의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물일 수 있다. 본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 종양 환자에 투여하는 단계를 포함하는 종양의 예방 또는 치료방법일 수 있다. 본 발명은 더욱이, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 PD-L1의 면역회피 기전 억제 용도 및 이를 통한 종양의 예방 또는 치료 용도일 수 있다.
상기 조성물에 적용되는 질환인 종양은 전형적으로 면역치료요법에 반응하는 종양 또는 암, 및 지금까지 면역요법에 관련되지 않은 종양 또는 암을 포함한다. 치료용으로 바람직한 종양 또는 암의 비-제한적인 예는 흑색종(예를 들면, 전이성 악성 흑색종), 신장암(예를 들면, 투명세포암종), 전립선암(예를 들면, 호르몬 불응 전립선샘암종), 췌장샘암종, 유방암, 결장암, 폐암(예를 들면, 비-소세포 폐암), 식도암, 두경부편평세포암종, 간암, 난소암, 자궁경부암, 갑상샘암, 아교모세포종, 신경아교종, 백혈병, 림프종, 및 기타 신생물암종을 포함한다. 추가로, 본 발명은 본 발명의 항체를 사용하여 치료할 수 있는 불응 또는 재발암을 포함한다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 항체를 유효성분으로 포함하는 종양의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 상기 항체는 IgG 또는 가변영역을 포함한 단편 즉 ScFv, Fab일 수 있다. 또한 중쇄의 아형은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 일 수 있다.
"예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 종양의 성장을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 종양 발전의 억제, 종양의 경감 또는 종양의 제거를 의미한다.
경우에 따라서, 상기 항체 이외에 다른 항암 치료제를 병용함으로써 종양 세포를 효과적으로 표적화하고, 항-종양 T 세포 활성을 증가시켜, 종양 세포를 표적화하는 면역 반응을 증대시킬 수 있다. 기타 항-신생물제 또는 면역원성 제제[(예를 들면, 약화된 암 세포, 종양 항원(재조합 단백질, 펩타이드 및 탄수화물 분자를 포함함), 항원 전달 세포, 예를 들면, 종양 기원된 항원 또는 핵산으로 펄스된 가지세포, 면역 자극 사이토카인(예를 들면, IL-2, IFNα2, GM-CSF), 및 면역 자극 사이토카인을 암호화하는 유전자로 형질감염된 세포(예를 들면, GM-CSF를 포함하지만 이에 제한되지 않는다)]; 표준 암 치료요법(예를 들면, 화학 치료요법, 방사선치료요법 또는 수술); 또는 기타 항체(VEGF, EGFR, Her2/neu, VEGF 수용체, 기타 성장 인자 수용체, CD20, CD40, CTLA-4, OX-40, 4-IBB, 또는 ICOS 등에 대한 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다)와 함께 사용될 수 있다.
구체적으로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 PD-L1 항체 이외의 항체와의 병용 투여용 조성물이다. 상기 PD-L1 항체 이외의 항체는 예를 들어 앞서 언급한 기타 항체 예를 들어, 항-VEGF, EGFR, Her2/neu, VEGF 수용체, 기타 성장 인자 수용체, CD20, CD40, CTLA-4, OX-40, 4-IBB, 또는 ICOS 항체일 수 있다. 본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 PD-L1 항체 이외의 항체와 함께 환자에 투여하는 단계를 포함하는 종양의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다. 본 발명은 더욱이, 종양의 예방 또는 치료에서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 PD-L1 항체 이외의 항체와 병용투여하기 위한 용도에 관한 것이다.
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 PD-L1 항체 이외의 항체는 동시에 투여될 수 있다. 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 PD-L1 항체 이외의 항체는 일정 시간 간격을 두고 별도로 투여할 수도 있다. 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편 투여 전 또는 후 PD-L1 항체 이외의 항체가 별도로 투여될 수 있다.
상기 조성물은 상술한 본 발명의 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 기재를 생략한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여 등으로 투여할 수 있다.
경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 약제학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다. 본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 암 또는 자가면역질환의 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: PD-L1에 대한 바이오패닝
PD-L1에 결합하는 항체를 선별하기 위한 항체 라이브러리 및 라이브러리의 준비는 한국 특허출원 제10-2008-0109417호와 같은 인간 미감작 scFv (human naive scFv) 라이브러리를 사용하였다. 일반적인 바이오패닝 방법을 사용하였으며, 인간 및 마우스 교차반응성을 갖는 항체를 선별하기 위해 인간 및 마우스 PD-L1 단백질을 선택적으로 사용하였다.
인간 또는 마우스 PD-L1-HisTag (#10084-H08H/50010-M08H, Sino Biological Inc. CN)을 2 ㎍/ml의 농도로 조제하여 100 ㎕씩 96웰 니켈 코팅 플레이트 (Nickel coated plate: #15142, Thermo Fisher Scientific)의 각 웰에 첨가하였고, 4℃에서 하룻밤 정치하여 흡착시켰다. 다음날 PBS로 3회 세정 후, 200 ㎕의 2% BSA 함유 PBS 용액을 첨가하여 상온에서 2시간 정치하였다. PBS로 3회 세정 후 각 웰에 100 ㎕의 2% BSA 함유 파지 라이브러리 용액을 첨가, 실온에서 30분간 락킹 (rocking)하고 2시간 정치하여 라이브러리와 항원의 결합을 유도하였다. 상층액 제거 후 0.05% Tween-20 함유 PBS (이하 PBST)로 5회, PBS로 5회 세정하고, 100 ㎕의 100 mM 트리메틸아민 (trimethylamine) 용액을 첨가하여 PD-L1에 결합한 파지를 용출하였다. 10분 간 반응 시킨 다음, 50 ㎕의 1 M Tris-HCl (pH 7.5)를 첨가하여 중화시킨 후, 상등액을 10 ml의 생장기 대장균주 XL-1 Blue 배양액 (OD600=0.5)에 첨가, 혼합하여 37℃에서 30분간 감염시켰다. 원심분리 후 소량의 배지로 재현탁하여 1% 글루코스 (Glucose), 34 ㎍/ml 클로람페니콜 (Chloramphenicol) 함유 2xYT-Agar 플레이트에 도말하였다. 30℃에서 16시간 배양후 플레이트 상 모든 콜로니를 취하여 PD-L1 결합 파지 감염 XL-1 Blue를 확보하였다. 해당 XL-1 Blue 대장균의 배양 및 파지 생산 유도를 통해 파지를 증폭시킨 후, PEG-침전법을 이용하여 단리하였다. 해당 파지 용액은 이후 단계 바이오패닝의 라이브러리로서 사용하였으며, 인간 및 마우스 PD-L1의 선택적 사용 및 결합 엄격도 (stringency) 조절을 통해 목적으로 하는 결합 양상을 띠는 파지 클론을 확보하고자 하였다.
바이오패닝의 최종 단계의 PD-L1 결합 파지를 감염시킨 XL-1 Blue를 34 ㎍/ml 클로람페니콜 함유 2xYT-아가 플레이트에 도말하여 37℃에서 16시간 배양하였다. 형성된 싱글 콜로니를 무작위로 선별, 각각의 클론이 구별될 수 있도록 200 ㎕의 배양 배지(34 ㎍/ml 클로람페니콜 함유 2xYT 배지)를 넣은 96 딥 웰 플레이트 (deep well plate: Bioneer, KR)에 취한 후 37℃에서 하룻밤 진탕배양하였다. 이를 PD-L1 결합 파지 단일클론으로 하고, 최종농도 20% 되도록 글리세롤을 첨가하여 냉동보존하였다.
실시예 2: PD-L1에 특이적으로 결합하는 scFv 파지의 선별(ELISA/FACS)
PD-L1 결합 파지 단일클론 보존액의 일부를 새로운 배양 배지 200 ㎕ 에 첨가 후 37℃에서 1-2시간, 대수생장기에 도달할 때까지 진탕배양한 뒤, M13 헬퍼파지를 첨가하여 37℃에서 30분간 감염시켰다. 이후 70 ㎍/ml 카나마이신 (kanamycin), 1 mM IPTG, 5 mM MgCl2 함유 배양 배지로 교환하여 30℃에서 하룻밤 진탕배양하였다. 이를 원심분리 후 상등액을 취하여, PD-L1 결합 단일클론 파지 함유 배양액으로써 결합 시험 및 선별에 사용하였다.
96웰 이뮤노플레이트(Nunc, US)의 각 웰에 1 ㎍/ml의 His-tag된 인간 또는 마우스 PD-L1 단백질 (Sino Biological Inc. CN) 용액을 100 ㎕ 첨가 후 4℃에서 하룻밤 정치하여 흡착시켰다. 다음 날 0.05% Tween-20 함유 PBS (이하 PBST)로 3회 세정하고, 2% BSA/PBST 용액을 각 웰 당 200 ㎕ 첨가 후 상온에서 2시간 정치하여 블로킹하였다. PBST로 3회 세정 후, 50 ㎕의 4% BSA 함유 PBS와 50 ㎕ 의 단일클론 파지 함유 배양액을 각 웰에 첨가, 상온에서 1시간 결합시켰다. PBST로 3회 세정 후, 2%BSA 함유 PBST에 1/3000의 비율로 희석한 HRP-conjugated mouse anti-M13 monoclonal antibody (#27-9421-01, GE Healthcare, US) 용액 100 ㎕를 첨가하여 상온에서 1시간 반응시켰다. PBST로 3회 세정 후 100 ㎕의 TMB 기질 시약 (TMB substrate reagent: #555214, BD Biosciences, US)를 사용하여 발색시켰다. 발색 반응은 50 ㎕ 의 2N H2SO4를 첨가 하는 것으로 정지시켰으며, Sunrise 마이크로플레이트 리더(TECAN, CH)를 사용하여 특이적 흡광도 OD450-630을 측정하였다 (표 1).
Figure PCTKR2018016715-appb-T000001
유세포분석에는 CHO-K1세포에 인간 및 마우스 PD-L1 유전자를 도입하여 수립한 과발현 세포주를 사용하였다(hPD-L1/CHO-K1, mPD-L1/CHO-K1). 각 세포를 유지 배양 후 PBS로 세정, 5 mM EDTA를 첨가하여 세포를 부유시킨 후 원심분리를 통해 회수하였다. FACS 전용 버퍼 (2% FBS, 0.05% sodium azide 함유 PBS)를 사용하여 4 × 106 cells/ml 세포현탁액을 제조, 50 ㎕/well 되도록 96 딥 웰 플레이트에 분주하였다. 단일클론 파지 함유 배양액 50 ㎕를 첨가하여, 상온에서 1시간 반응시켰다. FACS 전용 버퍼 400 ㎕를 사용하여 세정한 후, 1/500의 비율로 희석한 마우스 항-M13 모노클로날 항체 (mouse anti-M13 monoclonal antibody) 용액을 100 ㎕ 첨가, 4℃에서 1시간 정치하였으며, 400 ㎕의 FACS 전용 버퍼로 세정 후 1/500의 비율로 희석한 PE-접합된 항-마우스 IgG 다클론 항체 (PE-conjugated anti-mouse IgG polyclonal antibody) 용액 100 ㎕를 첨가, 4℃에서 1시간 정치하여 형광 표지를 완료하였다. 세정 후, 200 ㎕의 FACS 전용 버퍼를 첨가하여 세포를 현탁하였으며, 각 세포를 유세포분석기 FACSCalibur (BD Biosciences, US)를 사용하여 분석하였다. 양성대조군으로는 FITC-접합된 항-인간 PD-L1 항체 (FITC-conjugated anti-human PD-L1 antibody: #558065, BD Biosciences) 및 PE-접합된 항-마우스 PD-L1 (PE-conjugated anti-mouse PD-L1: #558091, BD Biosciences)를 사용하여 형광표지 하였다. 분석에는 BD Bioscience사의 FACSCalibur를 이용하여 분석하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
실시예 3: 항-PD-L1 IgG 발현
선별한 scFv 파지의 IgG형태로의 전환은 분자생물학적 기법을 사용하여 수행하였다. 선별한 E. Coli 클론에서 파지미드 (Phagemid)를 추출, 제한효소 Sfi I (R0123, New England Biolabs, US)으로 이중절단하여 중쇄 가변영역 DNA 단편을 확보하였으며, 중쇄 불변영역을 포함하는 벡터 pIgGHD-6A6Hvy를 Sfi I 처리 후 가변영역 DNA 단편을 삽입하였다. 동일한 방법으로 파지미드를 제한효소 BstX I (R0113, New England Biolabs)으로 이중절단하여 경쇄 가변영역 DNA 단편을 확보하였고, 경쇄 불변 영역을 포함하는 pIgGLD-6A6Lgt 벡터를 BstX I으로 이중절단 후 가변영역 DNA 단편을 삽입하여 IgG 형태의 DNA 클로닝을 완료하였다.
IgG의 일시 발현은 Expi293F 발현 시스템 키트 (Expi293F expression system kit: Thermo Fisher Scientific, US)을 사용하였다. Kit에 포함된 Expi293 세포를 전용 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 환경 하에서 125 rpm 오비탈 쉐이커 상 부유배양 하였다. 3일마다 3 × 105 cells/ml 되도록 계대배양 하였으며, 발현 벡터 도입시에는 3 × 106 cells/ml 되도록 세포수를 조정 한 후 사용하였다. 유전자 도입은 전용 시약인 Expifectamine을 사용하였으며, 세포현탁액 1 ml 당 발현 벡터 DNA 1 ㎍과 Expifectamine 2.7 μl을 함유하는 Lipid-DNA 복합체를 제작, 세포현탁액에 첨가하였으며, 도입 16-18시간 후 인헨서 (Enhancer) 1/2를 첨가하여 발현을 유도하였다. 이후 동일 조건에서 3-4일간 배양 후 원심분리하여 IgG 함유 상등액을 취하였다.
실시예 4: PD-1/PD-L1 신호 억제 효과 분석을 통한 항-PD-L1 항체 선별
획득한 항체의 기능 평가를 위해 PD-1/PD-L1 신호전달 체계 억제 정도를 평가하였다. 일차적인 선별을 위해, 실시예 3에서 제시한 방법을 사용하여 2 ml 규모로 IgG를 일시발현 후, 배양 상등액을 취하여 효능 분석에 사용하였다.
해당 시험은 상용화된 PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay (J1250, Promega Corp. US)를 사용하여 수행하였다. 분석을 위하여 해당 키트에 포함되어 있는 PD-L1 발현 CHO-K1 세포 0.5 ml을 성장배지(10% FBS 함유 Ham's F-12 Medium)에 해동, 96웰 마이크로플레이트에 100 ㎕씩 분주하여 37℃, 5% CO2 환경에서 하룻밤 배양하였다. 다음날 20 ㎍/ml으로 농도를 조정한 IgG 일시발현 배양 상등액 40 ㎕과 PD-1 발현 이펙터 (Effector) 세포 현탁액 (1% FBS 함유 RPMI1640) 40 ㎕를 각 웰에 첨가 하였고, 6시간 배양 후 Bio-Glo reagent를 80 ㎕ 넣어 20분간 반응시켰다. 그 후 발광도 (Luminescence)를 Hidex chameleon 기기를 사용하여 측정하였다 (도 2). 측정한 발광도는 양성대조군으로 사용한 Atezolizumab 처리군을 100%로 표준화한 상대치로 표시하였다. 측정 결과 발광 양성으로 판별되는 클론 1G1 및 ME4에 대해 PD-1/PD-L1 신호 억제가 가능한 것으로 판단하였다. 1G1과 ME4의 각 CDR 서열을 아래 표 2에 나타내었다.
Figure PCTKR2018016715-appb-T000002
실시예 5: 항-PD-L1 항체의 정제
취득한 상등액을 Protein A 컬럼(GE Healthcare)에 주입하여 친화력 크로마토그래피를 통해 IgG를 정제하였다. 컬럼을 20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 7.0)으로 평형화 시킨 후 상등액을 주입, 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.2% polysorbate 20 (pH 7.0) 용액으로 세정한 후, 50 mM NaCl, 0.1 M glycine-HCl (pH 3.5)로 용출 후 1 M Tris로 중화하였다. 용출된 단백질은 MWCO 10,000 spectra/por dialysis membrane (Spectrum Labs, US)를 사용한 투석 과정을 통해 PBS로 용매를 교체하였다. 이후 Vivaspin (Satorius, DE)을 사용하여 필요 농도로 농축하여 분주 후 -80℃에서 보관하였다.
정제 후 각 항체는 비환원 및 환원 LDS 샘플 버퍼 (Non-reducing 및 Reducing LDS sample buffer: Thermo Fisher Scientific)에 처리하여 NuPAGE System (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 전기영동 하였다. 그 결과 50 kDa의 중쇄 및 25 kDa의 경쇄 사슬을 포함하는 총 분자량 약 150 kDa의 IgG를 획득하였다 (도 3).
실시예 6: 항-PD-L1 항체의 결합 특이성 분석
결합 특이성 분석에는 ELISA법과 유세포분석법을 사용하였으며, Octet system (Pall Fortebio LLC. US)을 사용하여 결합상수를 측정하였다.
96웰 이뮤노플레이트(Nunc, US)의 각 웰에 1 ㎍/ml의 His-tag 된 인간 또는 마우스 PD-L1 단백질 (Sino Biological Inc. CN) 용액을 100 ㎕ 첨가 후 4℃에서 하룻밤 정치하여 흡착시켰다. 다음 날 0.05% Tween-20 함유 PBS (이하 PBST)로 3회 세정하고, 2% BSA/PBST 용액을 각 웰 당 200 ㎕ 첨가 후 상온에서 2시간 정치하여 블로킹하였다. PBST로 3회 세정 후 1 ㎍/ml의 각 시험 항체 용액을 100 ㎕씩 첨가하여 상온에서 1시간 결합시킨 후, PBST로 3회 세정, 1:2000의 비율로 희석한 HRP-접합된 항-His 태그 모노클로날 항체 (HRP-conjugated anti-His tag monoclonal antibody: MAB050H, R&D systems, US)를 100 ㎕ 첨가하여 상온에서 1시간 반응시켜 결합을 유도하였으며, PBST로 3회 세정 후 100 ㎕의 TMB 기질 시약을 사용하여 발색시켰다. 발색 반응은 50 ㎕ 의 2N H2SO4를 첨가 하는 것으로 정지시켰으며, Sunrise 마이크로플레이트 리더(TECAN, CH)를 사용하여 특이적 흡광도 OD450-630을 측정하였다 (도 4).
유세포분석을 위해 CHO-K1세포에 인간 및 마우스 PD-L1 유전자를 도입하여 과발현 세포주를 수립하였다(hPD-L1/CHO-K1, mPD-L1/CHO-K1). 각 세포를 유지 배양 후 PBS로 세정, 5 mM EDTA를 첨가하여 세포를 부유시킨 후 원심분리를 통해 회수하였다. FACS 전용 버퍼 (2% FBS, 0.05% sodium azide 함유 PBS)를 사용하여 5 × 106 cells/ml 세포현탁액을 제조, 각 tube 당 100 ㎕씩 분주하였다. 2 ㎍/ml의 시험 항체를 각 시험관에 100 ㎕씩 첨가한 후 4℃에서 30분간 정치하여 항체와 세포의 결합을 유도하였다. 이후 2 ml의 FACS 버퍼를 사용하여 세정하였고, 100 ㎕의 2차 항체 희석액 (1/500, PE-conjugated anti-human IgG-Fc polyclonal antibody fragment, #A80-248PE, Bethyl Laboratories Inc. US)를 첨가 후 4℃에서 20분간 정치하여 형광표지 하였다. 2 ml의 FACS 버퍼로 세정 후 200 ㎕의 FACS 버퍼를 첨가하여 세포를 부유시켰다. 양성대조군으로는 FITC-접합된 항-인간 PD-L1 항체 (FITC-conjugated anti-human PD-L1 antibody: #558065, BD Biosciences) 및 PE-접합 항-마우스 PD-L1 (PE-conjugated anti-mouse PD-L1: #558091, BD Biosciences)를 사용하여 형광표지 하였다. 분석에는 BD Bioscience사의 FACSCalibur를 이용하여 분석하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
선별된 항-PD-L1 항체의 인간 또는 마우스 PD-L1에 대한 결합력을 Octet system (Fortebio Inc. US)를 사용하여 측정하였다. 이를 위하여 항-PD-L1 항체를 바이오센서에 고정화 하고, 인간 또는 마우스 PD-L1의 농도 별 결합 동역학을 측정하여 결합 속도 상수 (ka), 해리 속도 상수 (kdis) 및 결합 상수 (KD)를 산출하였다 (표 3).
Figure PCTKR2018016715-appb-T000003
실시예 7: 항-PD-L1 항체의 PD-1/PD-L1 신호 억제 효과 분석
획득한 항체의 기능 평가를 위해 PD-1/PD-L1 신호전달 체계 억제 정도를 평가하였다. 해당 시험은 실시예 4에서 제시한 방법과 동일하게 상용화된 PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay (J1250, Promega Corp. US)를 사용하여 수행하였다. 분석을 위하여 해당 키트에 포함되어 있는 PD-L1 발현 CHO-K1 세포 0.5 ml을 성장배지(10% FBS 함유 Ham's F-12 Medium)에 해동, 96웰 마이크로플레이트에 100 ㎕씩 분주하여 37℃, 5% CO2 환경에서 하룻밤 배양하였다. 다음날 배양액을 버린 후 10 ㎍/ml 의 각 항체 용액(Isotype control, Atezolizumab, 1G1, ME4) 40 ㎕과 PD-1 발현 이펙터(Effector) 세포를 분석 배지(1% FBS 함유 RPMI1640)에 부유시킨 세포 현탁액 40 ㎕를 각 웰에 첨가 하였고, 6시간 배양 후 Bio-Glo reagent를 80 ㎕ 넣어 20분간 반응시켰다. 그 후 발광도를 Hidex chameleon 기기를 사용하여 측정하였다 (도 6). 그 결과, IgG 형태의 항체 1G1 및 ME4가 정제 후에도 PD-1/PD-L1 억제 활성을 보유하는 것으로 판단되었다.
실시예 8: In vivo 항종양효과 분석
항-PD-L1 항체의 항종양효과를 분석하기 위하여 마우스 유래 결장암 세포주(MC-38)의 동종이식 모델을 이용하였다. MC-38 마우스 결장암 세포주는 37℃, 5% CO2 조건에서 유지배양 하였다. 5주령의 SPF 암컷 C57BL/6 마우스(Koatech, KR)를 입수, 1주일간 순화시킨 후 5 × 106 cells/ml 의 MC38 세포 현탁액을 마우스당 200 ㎕씩 우측 견갑부와 흉벽 사이의 액와 부위 피하에 이식하였다. 암세포 이식 후 41.4 mm3 크기로 종양이 형성 되었을 때부터 주 2회 Vehicle 대조군과 항-PD-L1 항체 ME4 및 Atezolizumab을 각 10 mg/kg를 투여함과 동시에 체중 및 종양 크기를 측정하였다. 종양 크기는 Vernier caliper를 이용하여 3방향을 측정한 후, length × width × height / 2의 계산식으로 산출하였다.
항-PD-L1 항체 ME4 투여군의 경우, 2일차, 5일차, 7일차에 각각 10.4%, 22.4%, 24.2%의 Vehicle 대조군 대비 통계적으로 유의미한 종양성제 억제 효과를 보였다. 대조약인 Atezolizumab의 경우, 2일차, 5일차, 7일차 및 9일차에 각각 29.2%, 35.8%, 29.6% 및 31.1%의 종양성장 억제효과를 보였다 (도 7). ME4 및 Atezolizuamb 처리군 모두에서 9일차 이후에 종양성장 억제효과의 감소를 보였으나, 이것은 인간 항체 투여에 의한 면역원성에 기인한 것으로 판단된다.
실시예 9: 친화도 증진을 위한 변이체 제작 및 선별
항-PD-L1 항체 클론 1G1과 ME4의 친화도 증진을 위해 항체 최적화를 수행하였다. 1G1과 ME4 각각의 원래 DNA 서열을 70% 보존하며 랜덤화(randomize)시키는 소프트-랜덤화(soft-randomization)법을 활용하여, 1G1의 경쇄 CDR3와 ME4의 중쇄 CDR3에 무작위 변이를 도입한 프라이머를 제작하였다. 이를 사용한 PCR을 통해 변이가 도입된 1G1의 경쇄 가변영역, ME4의 중쇄 가변영역 코딩 DNA 단편을 확보하였다. 이 DNA 단편을 각각 1G1 scFv 파지 파지미드의 경쇄 가변영역 및 ME4 scFv 파지 파지미드의 중쇄 가변영역과 치환하여, 1G1 경쇄 CDR3 변이체 scFv 파지 라이브러리와 ME4 중쇄 CDR3 변이체 scFv 파지 DNA 라이브러리를 각각 제작하였다.
변이체 scFv 파지 DNA 라이브러리를 페놀-클로로포름 정제 후 전기천공법을 사용하여 대장균주 XL-1 Blue에 형질전환 하였다. 형질전환 효율 분석 및, DNA 서열 분석을 통해 다양성이 확보된 것을 확인한 후, 500 ml 규모로 배양하여 파지 발현을 유도하고, PEG-침전법을 이용하여 1G1 경쇄 CDR3 변이체 scFv 파지 라이브러리 및 ME4 중쇄 CDR3 변이체 scFv 파지 라이브러리를 제작하였다.
각 변이체 scFv 파지 라이브러리를 사용하여 실시예 1에서 제시한 방법으로 바이오패닝을 실시하였다. 그 후 선별과정에서는 결합을 유지하는 능력의 정량적 평가지표로서 scFv의 해리 속도 상수 kdis를 측정하였다. 선별된 최적화 클론 7종에 대한 아미노산 서열(표 4, 5)과 해리 속도 상수 측정 결과(표 6)를 도시하였다.
Figure PCTKR2018016715-appb-T000004
Figure PCTKR2018016715-appb-T000005
Figure PCTKR2018016715-appb-I000001
Figure PCTKR2018016715-appb-T000006
실시예 10: 최적화된 항-PD-L1 항체의 PD-1/PD-L1 신호 억제 효과 분석
각 최적화 scFv 파지 클론을 IgG 형태로 변환하였다. 구체적인 형태 변환을 위한 DNA 클로닝 및 생산, 정제 방법은 실시예 3과 실시예 5에 제시한 것과 동일한 방법을 이용하였다. 획득한 항체의 기능 평가를 위해 PD-1/PD-L1 신호전달 체계 억제 정도를 평가하였다. 2 ml 규모로 일시발현한 최적화 IgG의 배양 상등액을 취하여 효능 분석에 사용하였다. 실시예 4와 동일한 방법을 사용하여 PD-1/PD-L1 신호 억제를 평가하였다 (도 8). 그 결과, ME4 유래 5개 클론은 모항체에 비해 향상된 PD-1/PD-L1 신호 억제 효능을 보이는 반면, 1G1 유래 2개 클론은 PD-1/PD-L1 신호를 억제하지만, 1G1의 효능과 큰 차이를 보이지 않았다.
특히, B10과 B12 IgG에 대해 생산 및 정제 후, PD-1/PD-L1 신호 억제 효과의 농도의존성을 분석하였다 (도 9). 그 결과, 두 항체 모두 농도의존적으로 PD-1/PD-L1 신호를 억제할 수 있음이 입증되었으며, 최대활성이 Atezolizumab에 비해 높은 것을 나타내었다.
실시예 10: 최적화된 항-PD-L1 항체의 물리화학적 특성 분석
최적화된 항-PD-L1 항체의 세포 결합 능력을 유세포분석을 통해 측정하였다. 실험은 실시예 6에서 제시한 방법과 동일한 방법으로 측정하였다. 도 10에서 알 수 있듯이, ME4.A2, ME4.A11, ME4.A12, ME4.B10, ME4.B12는 인간 및 마우스 PD-L1 모두에 결합 하는 것이 확인되었다. 그 결합의 강도를 평가하기 위해 Octet을 사용하여 결합 동역학을 분석하였으며, 결합 상수를 산출하였다 (표 7). 최적화를 통해 인간 및 마우스 PD-L1에 대한 결합력이 크게 상승한 것을 확인할 수 있었다. 특히, 마우스 PD-L1에 대한 결합력 상승은 동물 모델에서의 효능 시험에 보다 유리해 진 것으로 판단된다.
Figure PCTKR2018016715-appb-T000007
본 발명에 따른 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합단편은 PD-L1에 목적하는 결합력을 나타내며, 목적하는 종양의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명을 통해 기존의 항-PD-L1 항체보다 높은 효능을 보이는 치료제를 개발함으로써, 단독 치료법 및 타 기전의 기존 치료제와의 병용 치료법을 제공할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (10)

  1. 서열번호 1 또는 7의 중쇄 CDR1,
    서열번호 2 또는 8의 중쇄 CDR2, 및
    서열번호 3, 9, 15, 16, 17, 18, 19로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역 및
    서열번호 4 또는 10의 경쇄 CDR1,
    서열번호 5 또는 11의 경쇄 CDR2, 및
    서열번호 6, 12, 13, 14로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, PD-L1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  2. 제1항에 있어서,
    서열번호 1의 중쇄 CDR 1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR 3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
    서열번호 1의 중쇄 CDR 1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR 3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2 및 서열번호 13의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
    서열번호 1의 중쇄 CDR 1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR 3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2 및 서열번호 14의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
    서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 8의 중쇄 CDR2 및 서열번호 9의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 10의 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 경쇄 CDR2 및 서열번호 12의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역,
    서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 8의 중쇄 CDR2 및 서열번호 15의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 10의 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 경쇄 CDR2 및 서열번호 12의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역,
    서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 8의 중쇄 CDR2 및 서열번호 16의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 10의 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 경쇄 CDR2 및 서열번호 12의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역,
    서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 8의 중쇄 CDR2 및 서열번호 17의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 10의 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 경쇄 CDR2 및 서열번호 12의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역,
    서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 8의 중쇄 CDR2 및 서열번호 18의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 10의 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 경쇄 CDR2 및 서열번호 12의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역,
    서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 8의 중쇄 CDR2 및 서열번호 19의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 10의 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 경쇄 CDR2 및 서열번호 12의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 20, 24, 26, 27, 28, 29 및 30으로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  4. 제1항에 있어서, 서열번호 21, 22, 23 및 25로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합단편을 코딩하는 핵산.
  6. 제5항의 핵산을 포함하는 발현벡터.
  7. 제6항의 발현벡터로 형질전환된 세포.
  8. 다음 단계를 포함하는 PD-L1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법:
    (a) 제7항의 세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 이의 항원 결합단편을 회수하는 단계.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유요성분으로 포함하는 종양의 예방 또는 치료용 조성물.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유요성분으로 포함하는 종양의 예방 또는 치료용 조성물.제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 PD-L1에 결합하는 항체 이외의 항체와의 병용 투여용 조성물.
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