KR20170039706A - 항-pd-l1 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 PD-L1에 결합하는 항체들과 그의 항원-결합 단편들, 및 그러한 항체들과 항원-결합 단편들을 사용하는 방법에 관한 것이다. 예를 들면, 본 발명은 인간화된 항-PD-L1 항체들 및 그의 사용 방법들을 제공한다.

Description

항-PD-L1 항체{ANTI-PD-L1 ANTIBODIES}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 다음 국제 출원에 대한 우선권을 주장한다. PCT/CN2014/083715, 2014년 8월 5일자로 출원된 것으로, 모든 목적을 위해 그의 전문으로 본원에 참고로 인용된다.
발명의 분야
본 발명은 PD-L1에 결합하는 항체들과 그의 항원-결합 단편들, 및 그러한 항체들과 항원-결합 단편들을 사용하는 방법에 관한 것이다.
전자 파일로 제출된 텍스트 파일에 대한 설명
본 문서와 함께 전자 출원으로 제출된 텍스트 파일의 내용은 그의 전문으로 본원에 참조로 통합된다. 서열 목록의 컴퓨터 판독 가능한 형식 사본 (파일명: CRBI_007_01WO_SeqList_ST25.txt); 기록된 날짜: 2015년 8월 4일; 파일 크기 153 KB).
프로그래밍된 사멸 수용체 리간드 1 (PD-L1)은 프로그래밍된 사멸 수용체 1 (PD-1)의 리간드이다. PD-1은 주로 림프구 상에서 발현되고 2개의 리간드, PD-L1 및 PD-L2를 갖는다. PD-L2는 PD-L1만큼 일반적이지 않다. PD-L1은 또한 분화 클러스터 274 (CD274) 또는 B7 상동체 1 (B7-H1)로서 공지되어 있고, CD274 유전자에 의해 코딩되는 40kDa 타입 1 막횡단 단백질이다. PD-L1 및 PD-1 모두는 면역 글로불린 수퍼패밀리에 속하며, 2 개의 세포 외 Ig 도메인, N-말단 V 도메인 및 C-말단 불변 도메인으로 구성되어 있다. 프로그래밍된 사멸 1 (PD-1) 및 B7-1 (CD80)에 대한 PD-L1의 결합 인터페이스는 IgV-유사 도메인에 있다(Lin 등(2008) PNAS 105:3011-3016). PD-L1은 보존된 짧은 세포 내 꼬리 (약 30개의 아미노산)를 함유하지만, PD-1은 2개의 세포질 티로신-계 신호전달 모티프, 면역 수용체 티로신-계 저해 모티프 (ITIM) 및 면역 수용체 티로신-계 스위치 모티프 (ITSM)를 함유한다. T 세포 자극 후, PD-1은 그의 세포질 꼬리 내에서 ITSM 모티프에 대해 티로신 포스파타제 SHP-2를 모집하고, CD3 T 세포 신호전달 캐스케이드에 관여하는 CD3 제타, PKC 세타 및 ZAP70과 같은 효과기 분자들의 탈인산화를 유도한다 (Freeman 등(2000) J Exp Med 192:1027-34; Latchman, 등(2001) Nat Immunol 2:261-8; Carter 등(2002) Eur J Immunol 32:634-43).
PD-L1은 림프계 및 비림프성 조직에서 백혈구 및 비조혈(nonhematopoietic) 세포에 광범위하게 분포할뿐만 아니라 다양한 암세포에도 분포한다. 임상 데이터는 PD-L1의 높은 종양 발현이 증가된 종양 공격성 및 더 불량한 예후와 연관됨을 시사한다. PD-1/PD-L1 복합체의 형성은 억제 신호를 전송하고 T 세포 면역 반응을 부정적으로 조절하며; 그것은 TCR-매개 T 세포 활성화, 사이토카인 생산 및 T 세포 증식을 억제한다 (Fife 등(2011) Nature Immunology 10:1185-1193); 동족 항원-특이적 T 세포들에서 고갈 또는 아네르기를 유도한다 (Hofmeyer 등(2011) Journal of Biomedicine and Biotechnology 2011:1-9); Th1 세포들의 Foxp3+ 조절 T 세포들로의 분화를 촉진한다 (Armanath 등(2011) Science TransMed 3:1-13; Francisco 등(2009) J. Exp. Med. 206:3015-3029); 그리고 효과기 T 세포들의 아포토시스(apoptosis)를 유도한다. PD-L1 유전자의 파괴는 상향-조절된 T 세포 반응들 및 자기-반응성 T 세포들의 발생으로 유도된다 (Latchman 등(2004) PNAS 101:10691-10696). PD-1 또는 PD-L1의 항체 봉쇄는 증가된 항종양 면역으로 유도된다 (Iwai 등(2002) PNAS 99:12293-12297).
따라서, 면역 반응을 조절하는데 있어서 PD-1/PD-L1 경로에 대한 중요한 역할이 있다. PD-1/PD-L1 신호전달의 기능 장애는 암 및 바이러스 감염과 같은 질병의 개시 및 발달과 상관 관계가 있는 것으로 보인다. 녹아웃 동물들의 분석에 따라 PD-1/PD-L1이 주변 내성을 유도하고 조절하는데 주로 작용한다는 것을 이해하게 되었다. 따라서, PD-1/PD-L1 경로의 치료적 봉쇄는 백신 접종 (예방 또는 치료) 중에 면역 강화뿐만 아니라, 면역 내성을 극복하고 암 또는 감염의 치료에 도움이 될 수 있다. 당 업계에는 PD-1/PD-L1 경로를 차단하는 개선된 방법이 필요하다.
발명의 요약
일 측면에서, 본 발명은 프로그래밍된 사멸-1 리간드 1(PD-L1)에 결합하는 항체들 및 항원-결합 단편들을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 항체들 및 그의 항원-결합 단편들은 인간 PD-L1에 결합한다. 일부 구현예들에서, 상기 항체들 및 그의 항원-결합 단편들은 PD-L1에 결합하고 PD-1 및/또는 CD80의 PD-L1에 대한 결합을 봉쇄한다. 추가의 구현예들에서, 상기 항-PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 PD-L1에 결합하고 PD-L1/PD-1 또는 PD-L1/CD80 경로를 방해한다. 일 구현예에서, 상기 항체 또는 그의 단편은 쥣과 항체, 키메라 항체, 인간 항체 또는 인간화된 항체이다. 일 구현예에서, 상기 항-PD-L1 항체 또는 그의 단편은 단일 클론 항체, scFv, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)' 단편, 이중 특이적 항체, 면역 접합체, 또는 이들의 조합물이다.
일 구현예에서, 본 발명은 서열 번호들: 81-140로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 CDR를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 단편을 제공한다.
일 구현예에서, 항체 또는 그의 단편은 서열 번호들: 81, 87, 93, 99, 105, 111, 117, 123, 129, 및 135로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성, 적어도 81% 상동성, 적어도 82% 상동성, 적어도 83% 상동성, 적어도 84% 상동성, 적어도 85% 상동성, 적어도 86% 상동성, 적어도 87% 상동성, 적어도 88% 상동성, 적어도 89% 상동성, 적어도 90% 상동성, 적어도 91% 상동성, 적어도 92% 상동성, 적어도 93% 상동성, 적어도 94% 상동성, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 중쇄 CDR1 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 항체 또는 그의 단편은 서열 번호들: 82, 88, 94, 100, 106, 112, 118, 124, 130, 및 136로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성, 적어도 81% 상동성, 적어도 82% 상동성, 적어도 83% 상동성, 적어도 84% 상동성, 적어도 85% 상동성, 적어도 86% 상동성, 적어도 87% 상동성, 적어도 88% 상동성, 적어도 89% 상동성, 적어도 90% 상동성, 적어도 91% 상동성, 적어도 92% 상동성, 적어도 93% 상동성, 적어도 94% 상동성, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 중쇄 CDR2 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 항체 또는 그의 단편은 서열 번호들: 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 및 137로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성, 적어도 81% 상동성, 적어도 82% 상동성, 적어도 83% 상동성, 적어도 84% 상동성, 적어도 85% 상동성, 적어도 86% 상동성, 적어도 87% 상동성, 적어도 88% 상동성, 적어도 89% 상동성, 적어도 90% 상동성, 적어도 91% 상동성, 적어도 92% 상동성, 적어도 93% 상동성, 적어도 94% 상동성, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 중쇄 CDR3 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 항체 또는 그의 단편은 서열 번호들: 84, 90, 96, 102, 108, 114, 120, 126, 132, 및 138로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성, 적어도 81% 상동성, 적어도 82% 상동성, 적어도 83% 상동성, 적어도 84% 상동성, 적어도 85% 상동성, 적어도 86% 상동성, 적어도 87% 상동성, 적어도 88% 상동성, 적어도 89% 상동성, 적어도 90% 상동성, 적어도 91% 상동성, 적어도 92% 상동성, 적어도 93% 상동성, 적어도 94% 상동성, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 경쇄 CDR1 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 항체 또는 그의 단편은 서열 번호들: 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127, 133, 및 139로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성, 적어도 81% 상동성, 적어도 82% 상동성, 적어도 83% 상동성, 적어도 84% 상동성, 적어도 85% 상동성, 적어도 86% 상동성, 적어도 87% 상동성, 적어도 88% 상동성, 적어도 89% 상동성, 적어도 90% 상동성, 적어도 91% 상동성, 적어도 92% 상동성, 적어도 93% 상동성, 적어도 94% 상동성, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 경쇄 CDR2 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 항체 또는 그의 단편은 서열 번호들: 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128, 134, 및 140로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성, 적어도 81% 상동성, 적어도 82% 상동성, 적어도 83% 상동성, 적어도 84% 상동성, 적어도 85% 상동성, 적어도 86% 상동성, 적어도 87% 상동성, 적어도 88% 상동성, 적어도 89% 상동성, 적어도 90% 상동성, 적어도 91% 상동성, 적어도 92% 상동성, 적어도 93% 상동성, 적어도 94% 상동성, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 경쇄 CDR3 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 항체 또는 그의 단편은 서열 번호들: 81, 87, 93, 99, 105, 111, 117, 123, 129, 및 135로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 CDR1을 포함하고; 서열 번호들: 82, 88, 94, 100, 106, 112, 118, 124, 130, 및 136로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 CDR2를 포함하며; 서열 번호들: 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 및 137로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 CDR3을 포함하고; 서열 번호들: 84, 90, 96, 102, 108, 114, 120, 126, 132, 및 138로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 CDR1을 포함하며; 서열 번호들: 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127, 133, 및 139로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 CDR2를 포함하며 및 서열 번호들: 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128, 134, 및 140로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 CDR3을 포함한다.
일 구현예에서, 항체 또는 그의 단편은 PD-L1에 결합하고, 서열 번호들: 81, 82, 및 83, 각각에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성, 적어도 85% 상동성, 적어도 90% 상동성, 적어도 91% 상동성, 적어도 92% 상동성, 적어도 93% 상동성, 적어도 94% 상동성, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고; 그리고 서열 번호들: 84, 85, 및 86, 각각에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성, 적어도 85% 상동성, 적어도 90% 상동성, 적어도 91% 상동성, 적어도 92% 상동성, 적어도 93% 상동성, 적어도 94% 상동성, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 추가의 구현예에서, 항체 또는 그의 항체 단편은 서열 번호들: 81, 82, 및 83, 각각에 따른 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고, 그리고 서열 번호들: 84, 85, 및 86, 각각에 따른 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다.
일 구현예에서, 항체 또는 그의 단편은 PD-L1에 결합하고, 서열 번호들: 87, 88, 및 89, 각각에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성, 적어도 85% 상동성, 적어도 90% 상동성, 적어도 91% 상동성, 적어도 92% 상동성, 적어도 93% 상동성, 적어도 94% 상동성, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고; 그리고 서열 번호들: 90, 91, 및 92, 각각에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성, 적어도 85% 상동성, 적어도 90% 상동성, 적어도 91% 상동성, 적어도 92% 상동성, 적어도 93% 상동성, 적어도 94% 상동성, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 추가의 구현예에서, 항체 또는 그의 항체 단편은 서열 번호들: 87, 88, 및 89, 각각에 따른 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고, 그리고 서열 번호들: 90, 91, 및 92, 각각에 따른 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다.
일 구현예에서, 항체 또는 그의 단편은 PD-L1에 결합하고, 서열 번호들: 93, 94, 및 95, 각각에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성, 적어도 85% 상동성, 적어도 90% 상동성, 적어도 91% 상동성, 적어도 92% 상동성, 적어도 93% 상동성, 적어도 94% 상동성, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고; 그리고 서열 번호들: 96, 97, 및 98, 각각에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성, 적어도 85% 상동성, 적어도 90% 상동성, 적어도 91% 상동성, 적어도 92% 상동성, 적어도 93% 상동성, 적어도 94% 상동성, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 추가의 구현예에서, 항체 또는 그의 항체 단편은 서열 번호들: 93, 94, 및 95, 각각에 따른 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고, 그리고 서열 번호들: 96, 97, 및 98, 각각에 따른 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다.
일 구현예에서, 항체 또는 그의 단편은 PD-L1에 결합하고, 서열 번호들: 99, 100, 및 101, 각각에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성, 적어도 85% 상동성, 적어도 90% 상동성, 적어도 91% 상동성, 적어도 92% 상동성, 적어도 93% 상동성, 적어도 94% 상동성, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고; 그리고 서열 번호들: 102, 103, 및 104, 각각에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성, 적어도 85% 상동성, 적어도 90% 상동성, 적어도 91% 상동성, 적어도 92% 상동성, 적어도 93% 상동성, 적어도 94% 상동성, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 추가의 구현예에서, 항체 또는 그의 항체 단편은 서열 번호들: 99, 100, 및 101, 각각에 따른 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고, 그리고 서열 번호들: 102, 103, 및 104, 각각에 따른 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다.
일 구현예에서, 항체 또는 그의 단편은 PD-L1에 결합하고, 서열 번호들: 105, 106, 및 107, 각각에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성, 적어도 85% 상동성, 적어도 90% 상동성, 적어도 91% 상동성, 적어도 92% 상동성, 적어도 93% 상동성, 적어도 94% 상동성, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고; 그리고 서열 번호들: 108, 109, 및 110, 각각에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성, 적어도 85% 상동성, 적어도 90% 상동성, 적어도 91% 상동성, 적어도 92% 상동성, 적어도 93% 상동성, 적어도 94% 상동성, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 추가의 구현예에서, 항체 또는 그의 항체 단편은 서열 번호들: 105, 106, 및 107, 각각에 따른 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고, 그리고 서열 번호들: 108, 109, 및 110, 각각에 따른 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다.
일 구현예에서, 항체 또는 그의 단편은 PD-L1에 결합하고, 서열 번호들: 111, 112, 및 113, 각각에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성, 적어도 85% 상동성, 적어도 90% 상동성, 적어도 91% 상동성, 적어도 92% 상동성, 적어도 93% 상동성, 적어도 94% 상동성, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고; 그리고 서열 번호들: 114, 115, 및 116, 각각에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성, 적어도 85% 상동성, 적어도 90% 상동성, 적어도 91% 상동성, 적어도 92% 상동성, 적어도 93% 상동성, 적어도 94% 상동성, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 추가의 구현예에서, 항체 또는 그의 항체 단편은 서열 번호들: 111, 112, 및 113, 각각에 따른 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고, 그리고 서열 번호들: 114, 115, 및 116, 각각에 따른 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다.
일 구현예에서, 항체 또는 그의 단편은 PD-L1에 결합하고, 서열 번호들: 117, 118, 및 119, 각각에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성, 적어도 85% 상동성, 적어도 90% 상동성, 적어도 91% 상동성, 적어도 92% 상동성, 적어도 93% 상동성, 적어도 94% 상동성, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고; 그리고 서열 번호들: 120, 121, 및 122, 각각에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성, 적어도 85% 상동성, 적어도 90% 상동성, 적어도 91% 상동성, 적어도 92% 상동성, 적어도 93% 상동성, 적어도 94% 상동성, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 추가의 구현예에서, 항체 또는 그의 항체 단편은 서열 번호들: 117, 118, 및 119, 각각에 따른 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고, 그리고 서열 번호들: 120, 121, 및 122, 각각에 따른 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다.
일 구현예에서, 항체 또는 그의 단편은 PD-L1에 결합하고, 서열 번호들: 123, 124, 및 125, 각각에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성, 적어도 85% 상동성, 적어도 90% 상동성, 적어도 91% 상동성, 적어도 92% 상동성, 적어도 93% 상동성, 적어도 94% 상동성, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고; 그리고 서열 번호들: 126, 127, 및 128, 각각에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성, 적어도 85% 상동성, 적어도 90% 상동성, 적어도 91% 상동성, 적어도 92% 상동성, 적어도 93% 상동성, 적어도 94% 상동성, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 추가의 구현예에서, 항체 또는 그의 항체 단편은 서열 번호들: 123, 124, 및 125, 각각에 따른 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고, 그리고 서열 번호들: 126, 127, 및 128, 각각에 따른 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다.
일 구현예에서, 항체 또는 그의 단편은 PD-L1에 결합하고, 서열 번호들: 129, 130, 및 131, 각각에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성, 적어도 85% 상동성, 적어도 90% 상동성, 적어도 91% 상동성, 적어도 92% 상동성, 적어도 93% 상동성, 적어도 94% 상동성, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고; 및 서열 번호들: 132, 133, 및 134, 각각에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성, 적어도 85% 상동성, 적어도 90% 상동성, 적어도 91% 상동성, 적어도 92% 상동성, 적어도 93% 상동성, 적어도 94% 상동성, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 추가의 구현예에서, 항체 또는 그의 항체 단편은 서열 번호들: 129, 130, 및 131, 각각에 따른 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고, 및 서열 번호들: 132, 133, 및 134, 각각에 따른 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다.
일 구현예에서, 항체 또는 그의 단편은 PD-L1에 결합하고, 서열 번호들: 135, 136, 및 137, 각각에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성, 적어도 85% 상동성, 적어도 90% 상동성, 적어도 91% 상동성, 적어도 92% 상동성, 적어도 93% 상동성, 적어도 94% 상동성, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고; 및 서열 번호들: 138, 139, 및 140, 각각에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성, 적어도 85% 상동성, 적어도 90% 상동성, 적어도 91% 상동성, 적어도 92% 상동성, 적어도 93% 상동성, 적어도 94% 상동성, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 추가의 구현예에서, 항체 또는 그의 항체 단편은 서열 번호들: 135, 136, 및 137, 각각에 따른 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고, 및 서열 번호들: 138, 139, 및 140, 각각에 따른 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3한다.
일 구현예에서, 항체 또는 그의 단편은 PD-L1에 결합하고, 서열 번호들: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 및 46로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성, 적어도 85% 상동성, 적어도 90% 상동성, 적어도 91% 상동성, 적어도 92% 상동성, 적어도 93% 상동성, 적어도 94% 상동성, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고; 및 서열 번호들: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 및 48로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성, 적어도 85% 상동성, 적어도 90% 상동성, 적어도 91% 상동성, 적어도 92% 상동성, 적어도 93% 상동성, 적어도 94% 상동성, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 추가의 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 단편은 PD-L1에 결합하고, 서열 번호들: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 및 46로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 또는 그로 구성된 중쇄 가변 영역을 포함하고; 그리고 서열 번호들: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 및 48로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 또는 그로 구성된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 13C5, 5G9, 5G11, 8C6, 7B4, 4D1, 4A8, 8H4, 8H3, 및 15F1로 구성된 군으로부터 선택된 항체의 가변 중쇄 및 13C5, 5G9, 5G11, 8C6, 7B4, 4D1, 4A8, 8H4, 8H3, 및 15F1로 구성된 군으로부터 선택된 항체의 가변 경쇄를 포함하는 항-PD-L1 항체들을 제공한다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항체 또는 그의 단편을 제공한다: 서열 번호:2를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:4를 포함하는 경쇄 가변 영역; 서열 번호:6을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:8을 포함하는 경쇄 가변 영역; 서열 번호:10을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:12를 포함하는 경쇄 가변 영역; 서열 번호:14를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:16을 포함하는 경쇄 가변 영역; 서열 번호:18을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:20을 포함하는 경쇄 가변 영역; 서열 번호:22를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:24를 포함하는 경쇄 가변 영역; 서열 번호:26을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:28을 포함하는 경쇄 가변 영역; 서열 번호:30을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:32를 포함하는 경쇄 가변 영역; 서열 번호:34를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:36을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 서열 번호:38을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:40을 포함하는 경쇄 가변 영역.
일 구현예에서, 본 발명은 키메라 항-PD-L1 항체를 제공하는 것으로, 상기 항체는 서열 번호들: 50, 54, 58, 60, 64, 및 66로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성, 적어도 85% 상동성, 적어도 90% 상동성, 적어도 91% 상동성, 적어도 92% 상동성, 적어도 93% 상동성, 적어도 94% 상동성, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하고; 및 서열 번호들: 52, 56, 62 및 68로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성, 적어도 85% 상동성, 적어도 90% 상동성, 적어도 91% 상동성, 적어도 92% 상동성, 적어도 93% 상동성, 적어도 94% 상동성, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 인간화된 항-PD-L1 항체를 제공하는 것으로, 상기 항체는 서열 번호들: 42 및 46로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성, 적어도 85% 상동성, 적어도 90% 상동성, 적어도 91% 상동성, 적어도 92% 상동성, 적어도 93% 상동성, 적어도 94% 상동성, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 인간화된 항-PD-L1 항체를 제공하는 것으로, 상기 항체는 서열 번호들: 44 및 48로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성, 적어도 85% 상동성, 적어도 90% 상동성, 적어도 91% 상동성, 적어도 92% 상동성, 적어도 93% 상동성, 적어도 94% 상동성, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 인간화된 항-PD-L1 항체를 제공하는 것으로, 상기 항체는 서열 번호:42에 대해 적어도 80% 상동성, 적어도 85% 상동성, 적어도 90% 상동성, 적어도 91% 상동성, 적어도 92% 상동성, 적어도 93% 상동성, 적어도 94% 상동성, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고 서열 번호:44에 대해 적어도 80% 상동성, 적어도 85% 상동성, 적어도 90% 상동성, 적어도 91% 상동성, 적어도 92% 상동성, 적어도 93% 상동성, 적어도 94% 상동성, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 인간화된 항-PD-L1 항체를 제공하는 것으로, 상기 항체는 서열 번호:46에 대해 적어도 80% 상동성, 적어도 85% 상동성, 적어도 90% 상동성, 적어도 91% 상동성, 적어도 92% 상동성, 적어도 93% 상동성, 적어도 94% 상동성, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고 그리고 서열 번호:48에 대해 적어도 80% 상동성, 적어도 85% 상동성, 적어도 90% 상동성, 적어도 91% 상동성, 적어도 92% 상동성, 적어도 93% 상동성, 적어도 94% 상동성, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 인간화된 항-PD-L1 항체를 제공하는 것으로, 상기 항체는 서열 번호들: 70, 72, 76, 및 78로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성, 적어도 85% 상동성, 적어도 90% 상동성, 적어도 91% 상동성, 적어도 92% 상동성, 적어도 93% 상동성, 적어도 94% 상동성, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 완전 중쇄를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 인간화된 항-PD-L1 항체를 제공하는 것으로, 상기 항체는 서열 번호들: 74 및 80로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성, 적어도 85% 상동성, 적어도 90% 상동성, 적어도 91% 상동성, 적어도 92% 상동성, 적어도 93% 상동성, 적어도 94% 상동성, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 완전 경쇄를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 인간화된 항-PD-L1 항체를 제공하고, 상기 항체는 서열 번호:70에 따른 중쇄 및 서열 번호:74에 따른 경쇄를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 인간화된 항-PD-L1 항체를 제공하는 것으로, 상기 항체는 서열 번호:72에 따른 중쇄 및 서열 번호:74에 따른 경쇄를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 인간화된 항-PD-L1 항체를 제공하는 것으로, 상기 항체는 다음 서열 번:76호에 따른 중쇄 및 서열 번호:80에 따른 경쇄를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 인간화된 항-PD-L1 항체를 제공하는 것으로, 상기 항체는 서열 번호:78에 따른 중쇄 및 서열 번호:80에 따른 경쇄를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 본원에 제공된 임의의 예시적 항체들과 동일한 PD-L1 상의 에피토프에 결합하는 항-PD-L1 항체들 또는 그의 단편들을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 항체들 또는 그의 단편들은 PD-L1에 결합하기 위해 본원에 제공된 임의의 예시적 항체들과 경쟁한다. PD-L1에 대한 결합은 ELISA, 유량 세포 계측법, 표면 플라스몬 공명 (SPR) 분석, 또는 당 업계에 공지된 임의의 다른 방법에 의해 측정될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 약 10 nM 내지 약 0.01 nM의 결합 친화도 kD로 PD-L1에 결합하는 항-PD-L1 항체들 및 그의 단편들을 제공한다. 추가의 구현예에서, 본원에 제공된 항-PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 약 10 nM 내지 약 0.05 nM의 결합 친화도 kD로 PD-L1에 결합한다. 추가의 구현예에서, 본원에 제공된 항-PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 약 8 nM 내지 약 0.1 nM의 결합 친화도 kD로 PD-L1에 결합한다. 추가의 구현예에서, 본원에 제공된 항-PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 약 5nM 내지 약 0.2 nM의 결합 친화도 kD로 PD-L1에 결합한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 제공된 항-PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 약 10 nM 이하의 결합 친화도 kD로 PD-L1에 결합한다. 추가의 구현예에서, 본원에 제공된 항-PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 약 6nM 이하의 결합 친화도 kD로 PD-L1에 결합한다. 추가의 구현예에서, 본원에 제공된 항-PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 약 4nM 이하의 결합 친화도 kD로 PD-L1에 결합한다. 추가의 구현예에서, 본원에 제공된 항-PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 약 2 nM 이하의 결합 친화도 kD로 PD-L1에 결합한다. 추가의 구현예에서, 본원에 제공된 항-PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 약 1nM 이하의 결합 친화도 kD로 PD-L1에 결합한다. 추가의 구현예에서, 본원에 제공된 항-PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 약 0.75 nM 이하의 결합 친화도 kD로 PD-L1에 결합한다. 추가의 구현예에서, 본원에 제공된 항-PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 약 0.5 nM 이하의 결합 친화도 kD로 PD-L1에 결합한다. 추가의 구현예에서, 본원에 제공된 항-PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 약 0.25 nM 이하의 결합 친화도 kD로 PD-L1에 결합한다. 추가의 구현예에서, 본원에 제공된 항-PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 약 0.2 nM 이하의 결합 친화도 kD로 PD-L1에 결합한다. 추가의 구현예에서, 본원에 제공된 항-PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 약 0.15 nM 이하의 결합 친화도 kD로 PD-L1에 결합한다. 추가의 구현예에서, 본원에 제공된 항-PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 약 0.1 nM 이하의 결합 친화도 kD로 PD-L1에 결합한다. 추가의 구현예에서, 본원에 제공된 항-PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 약 0.075 nM 이하의 결합 친화도 kD로 PD-L1에 결합한다. 추가의 구현예에서, 본원에 제공된 항-PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 약 0.05 nM 이하의 결합 친화도 kD로 PD-L1에 결합한다. 추가의 구현예에서, 본원에 제공된 항-PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 약 0.025 nM 이하의 결합 친화도 kD로 PD-L1에 결합한다. 추가의 구현예에서, 본원에 제공된 항-PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 약 0.02 nM 이하의 결합 친화도 kD로 PD-L1에 결합한다. 추가의 구현예에서, 본원에 제공된 항-PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 약 0.015 nM 이하의 결합 친화도 kD로 PD-L1에 결합한다. 추가의 구현예에서, 본원에 제공된 항-PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 약 0.01 nM 이하의 결합 친화도 kD로 PD-L1에 결합한다. 일 구현예에서, 본원에 제공된 항-PD-L1 항체들 및 단편들의 결합 친화도 kD는 Biacore 분석에 의해 측정된다.
일 구현예에서, 본원에 제공된 항 PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 약 1 ng/mL 내지 약 2000 ng/mL의 PD-L1에 대한 결합 EC50을 갖는다. 추가의 구현예에서, 본원에 제공된 항 PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 약 1 ng/mL 내지 약 1500 ng/mL의 PD-L1에 대한 결합 EC50을 갖는다. 추가의 구현예에서, 본원에 제공된 항 PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 약 1 ng/mL 내지 약 1000 ng/mL의 PD-L1에 대한 결합 EC50을 갖는다. 추가의 구현예에서, 본원에 제공된 항 PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 약 2 ng/mL 내지 약 500 ng/mL의 PD-L1에 대한 결합 EC50을 갖는다. 추가의 구현예에서, 본원에 제공된 항 PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 약 2 ng/mL 내지 약 250 ng/mL의 PD-L1에 대한 결합 EC50을 갖는다. 추가의 구현예에서, 본원에 제공된 항 PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 약 5 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 PD-L1에 대한 결합 EC50을 갖는다. 추가의 구현예에서, 본원에 제공된 항 PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 약 5 ng/mL 내지 약 50 ng/mL의 PD-L1에 대한 결합 EC50을 갖는다. 일 구현예에서, 본원에 제공된 항 PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 약 500 ng/mL 이하, 약 400 ng/mL 이하, 약 300 ng/mL 이하, 약 250 ng/mL 이하, 약 200 ng/mL 이하, 약 150 ng/mL 이하, 약 100 ng/mL 이하, 약 75 ng/mL 이하, 약 60 ng/mL 이하, 약 50 ng/mL 이하, 약 40 ng/mL 이하, 또는 약 30 ng/mL 이하의 PD-L1에 대한 결합 EC50을 갖는다. 일 구현예에서, 본원에 제공된 항-PD-L1 항체들 및 단편들의 EC50은 ELISA또는 FACS에 의해 측정된다.
일 구현예에서, 본원에 제공된 항 PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 약 1 ng/mL 내지 약 1500 ng/mL의 IC50으로 PDL1/PD-1 결합을 억제한다. 추가의 구현예에서, 본원에 제공된 항 PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 약 2 ng/mL 내지 약 1200 ng/mL의 IC50으로 PDL1/PD-1 결합을 억제한다. 추가의 구현예에서, 본원에 제공된 항 PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 약 5 ng/mL 내지 약 500 ng/mL의 IC50으로 PDL1/PD-1 결합을 억제한다. 추가의 구현예에서, 본원에 제공된 항 PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 약 5 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 IC50으로 PDL1/PD-1 결합을 억제한다. 추가의 구현예에서, 본원에 제공된 항 PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 약 10 ng/mL 내지 약 50 ng/mL의 IC50으로 PDL1/PD-1 결합을 억제한다. 일 구현예에서, 본원에 제공된 항 PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 약 1200 ng/mL 이하, 약 1000 ng/mL 이하, 약 800 ng/mL 이하, 약 400 ng/mL 이하, 약 300 ng/mL 이하, 약 250 ng/mL 이하, 약 200 ng/mL 이하, 약 150 ng/mL 이하, 약 100 ng/mL 이하, 약 75 ng/mL 이하, 약 60 ng/mL 이하, 약 50 ng/mL 이하, 약 40 ng/mL 이하, 약 30 ng/mL 이하, 약 20 ng/mL 이하, 또는 약 10 ng/mL 이하의 IC50으로 PDL1/PD-1 결합을 억제한다. 일 구현예에서, 본원에 제공된 항-PD-L1 항체들 및 단편들의 IC50은 ELISA 또는 FACS에 의해 측정된다.
일 구현예에서, 본원에 제공된 항-PD-L1 항체는 하기를 갖는 인간화된 항체이다: 서열 번호:42에 따른 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열 번호:44에 따른 경쇄 가변 영역 아미노산; 또는 서열 번호:46에 따른 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열 번호:48에 따른 경쇄 가변 영역 아미노산 서열; 여기서 상기 항-PD-L1 항체는 ELISA또는 FACS에 의해 측정된 바와 같이 약 200ng/ml 이하 또는 약 150 ng/mL 이하 또는 약 100 ng/mL 이하 또는 약 80 ng/ml 이하 또는 약 60 ng/mL 이하 또는 약 50 ng/mL 이하의 PD-L1 결합 EC50을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 본원에 제공된 항-PD-L1 항체는 하기를 갖는 인간화된 항체이다: 서열 번호:42에 따른 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열 번호:44에 따른 경쇄 가변 영역 아미노산; 또는 서열 번호:46에 따른 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열 번호:48에 따른 경쇄 가변 영역 아미노산 서열; 여기서 항-PD-L1 항체는 ELISA또는 FACS에 의해 측정된 바, 약 1200 ng/mL 이하, 또는 약 1000 ng/mL 이하, 또는 약 800 ng/mL 이하, 또는 약 600 ng/mL 이하, 또는 약 500 ng/mL 이하, 또는 약 400 ng/mL 이하, 또는 약 300 ng/mL 이하, 또는 약 200 ng/mL 이하, 또는 약 100 ng/mL 이하, 또는 약 60 ng/mL 이하, 또는 약 30 ng/mL 이하, 또는 약 25 ng/mL 이하, 또는 약 20 ng/mL 이하, 또는 약 10 ng/mL 이하의 PDL1/PD-1 차단 IC50을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 본원에 제공된 항-PD-L1 항체는 하기를 갖는 인간화된 항체이다: 서열 번호:42에 따른 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열 번호:44에 따른 경쇄 가변 영역 아미노산; 또는 서열 번호:46에 따른 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열 번호:48에 따른 경쇄 가변 영역 아미노산 서열; 여기서 항-PD-L1 항체는 Biacore 분석에 의해 측정된 바, 약 10 nM 이하, 또는 약 5 nM 이하, 또는 약 2nM 이하, 또는 약 1 nM 이하, 또는 약 0.5 nM 이하, 또는 약 0.1 nM 이하, 또는 약 0.05nM 이하의 PD-L1에 대한 결합 친화도 kD를 갖는다. 일 구현예에서, 인간화된 항-PD-L1 항체는 약 2 nM의 PD-L1에 대한 결합 친화도 kD를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 인간화된 항-PD-L1 항체는 약 1 nM의 PD-L1에 대한 결합 친화도 kD를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 인간화된 항-PD-L1 항체는 약 0.5 nM의 PD-L1에 대한 결합 친화도 kD를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 인간화된 항-PD-L1 항체는 약 0.1 nM의 PD-L1에 대한 결합 친화도 kD를 갖는다.
일 구현예에서, 본원에 제공된 항-PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 PD-L1에 결합하고, PD-1/PD-L1 상호 작용을 방해하고, T 세포 활성화의 증가를 초래한다. 추가의 구현예에서, 항체들 및 그의 단편들은 PD-L1에 결합하고, T 세포 증식 및/또는 사이토카인 생산의 증가를 초래한다. 또 다른 구현예에서, 항체들 및 그의 단편들은 bind PD-L1에 결합하고, IL-2, IFNγ, TNF, IL-1, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, IL-13, IL-17, 및 GM-CSF로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 사이토카인의 증가를 초래한다. 따라서, 일 측면에서, 본 발명은 T 세포들 및 항원 제시 세포들을 항-PD-L1 항체 또는 그의 단편과 접촉시티는 것을 포함하는 면역 반응을 조절하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 본원에 제공된 항-PD-L1 항체들 및 단편들에 의한 면역 반응의 조절은 혼합 림프구 (MLR) 반응에서 측정될 수 있다. 일 구현예에서, 본원에 제공된 항-PD-L1 항체들은 MLR 내의 림프구들로부터 사이토카인 생산 레벨을 증가시킨다. 추가의 구현예에서, 항-PD-L1 항체들은 MLR에서 IL-2 생산 및/또는 IFNγ 생산 레벨을 증가시킨다. 또 다른 구현예에서, 항-PD-L1 항체들은 MLR에서 IL-2 생산 및 IFNγ 생산 레벨을 증가시킨다. 일 구현예에서, 항-PD-L1 항체들은 기억 T 세포 반응들을 향상시킨다. 추가의 구현예에서, 항-PD-L1 항체들은 기억 T 세포들로부터 IFNγ 생산의 증가에 의해 측정되는 바와 같이 기억 T 세포 반응들을 향상시킨다.
일 구현예에서, 본원에 제공된 항-PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 조절 T 세포 기능을 억제한다. 추가의 구현예에서, 항-PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 조절 T 세포들에 의한 효과기 T 세포들의 억제를 저해한다. 또 다른 구현예에서, 항-PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 조절 T 세포들의 존재 하에 T 세포들의 효과기 기능을 회복시킨다. 추가의 구현예에서, 항-PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 조절 T 세포들의 존재 하에 사이토카인을 증식 및/또는 생산하는 효과기 T 세포들의 능력을 회복시킨다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 시험관 내에서 또는 치료를 요하는 피험자에서 조절 T 세포들의 억제 효과를 저해하는 방법을 제공한다.
일 측면에서, PD-L1에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 단편이 제공되고, 여기서 상기 항체는 본원에서 13C5, 5G9, 5G11, 8C6, 7B4, 4D1, 4A8, 8H4, 8H3, 및 15F1로 명명된 하이브리도마들로 구성된 군으로부터 선택된 하이브리도마에 의해 생산된다. 따라서, 본 발명은 또한 본원에 기재된 항체를 생산하는 임의의 하이브리도마뿐만 아니라 하이브리도마들 13C5, 5G9, 5G11, 8C6, 7B4, 4D1, 4A8, 8H4, 8H3, 및 15F1을 포함한다. 본 발명은 또한 본원에 제공된 항체들 및 그의 단편들을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 단리된 폴리뉴클레오티드들을 포함하는 발현 벡터들, 및 그러한 발현 벡터들을 포함하는 숙주 세포들이 또한 본 발명에 포함된다.
일 구현예에서, 본 발명은 항-PD-L1 항체 면역 접합체들을 제공한다. 따라서, 본 발명은 PD-L1에 결합하는 항체 또는 그의 단편을 제공하는 것으로 치료제에 연결되거나 또는 접합된다. 항-PD-L1 항체에 연결되거나 또는 접합될 수 있는 치료제들은 세포 독성 약물들, 방사성 동위 원소들, 면역 조절제들, 또는 항체들을 포함할 수 있지만, 이들로만 제한되지 않는다.
일 측면에서, 본 발명은 본원에 제공되는 하나 이상의 항-PD-L1 항체 또는 그의 단편, 및 제약학상 허용되는 담체를 포함하는 조성물들을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 피험자에서 면역 반응을 조절하는 방법을 제공하는 것으로, 이 방법은 상기 피험자에게 치료 유효량의 본원에 제공된 항-PD-L1 항체 또는 그의 단편을 투여하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명은 치료를 요하는 피험자에서 질병 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 피험자에게 치료 유효량의 본원에 제공된 항-PD-L1 항체 또는 그의 단편을 투여하는 것을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 치료를 요하는 피험자에서 항-종양 반응들을 향상시키는 방법을 제공하는 것으로, 이 방법은 상기 피험자에게 치료 유효량의 본 발명의 항-PD-L1 항체 또는 그의 단편을 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 치료를 요하는 피험자에서 종양들을 감소시키거나 또는 종양 세포들의 성장을 억제하는 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 피험자에게 치료 유효량의 본 발명의 항-PD-L1 항체 또는 그의 단편을 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 치료를 요하는 피험자에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 피험자에게 치료 유효량의 본 발명의 항-PD-L1 항체 또는 그의 단편을 투여하는 것을 포함한다. 추가의 구현예에서, 상기 암은 림프종, 백혈병, 흑색종, 신경교종, 유방암, 폐암, 대장암, 골암, 난소암, 방광암, 신장암, 간암, 위암, 직장암, 고환암, 침샘암, 갑상선암, 흉선암, 상피암, 두경부암, 위암, 췌장암, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 본 발명은 치료를 요하는 피험자에게 감염성 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 피험자에게 치료 유효량의 본 발명의 항-PD-L1 항체 또는 그의 단편을 투여하는 것을 포함한다. 추가의 구현예에서, 감염성 질환은 칸디다증, 칸디다혈증, 아스페르길루스증, 연쇄상 구균성 폐렴, 연쇄상 구균성 피부 및 구강 인두증, 그램 음성 패혈증, 결핵, 단핵구증, 인플루엔자, 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory Syncytial Virus)에 의해 유발된 호흡기 질환, 말라리아, 주혈 흡충증(schistosomiasis) 및 트리파노모니아증(trypanosomiasis)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
도면의 간단한 설명
도 1a-d는 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 항체 농도의 범위에 걸쳐 PD-L1에 대한 쥣과 하이브리도마 항-PD-L1 항체들의 결합을 나타내는 그래프들의 세트이다. 하이브리도마 항체들 8H3-mIgG (m8H3), 15F1-mIgG (m15F1), 5G9-mIgG (m5G9), 및 4A8-mIgG (m4A8)의 결합은 도 1a에 나타낸다. 하이브리도마 항체들 5G11-mIgG (m5G11), 7B4-mIgG (m7B4), 4D1-mIgG (m4D1), 및 8H4-mIgG (m8H4)의 결합은 도 1b에 나타낸다. 하이브리도마 항체 8C6-mIgG (m8C6)의 결합은 도 1c에 나타낸다. 하이브리도마 항체 13C5-mIgG (m13C5)의 결합은 도 1d에 나타낸다. 도 1a-1d 각각에서, mIgG1의 결합은 음성 대조군으로서 나타낸다.
도 2a-c는 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 농도 범위에 걸쳐 PD-L1에 대한 키메라 항-PD-L1 항체들의 결합을 나타내는 그래프들의 세트이다. 키메라 항체들 ch5G11-hIgG4 및 ch5G11-hIgG1의 결합은 도 2a에 나타낸다. 키메라 항체들 ch13C5-hIgG4, ch13C5-hIgG1, 및 ch8H4-hIgG4의 결합은 도 2b에 나타낸다. 키메라 항체 ch8C6-hIgG4의 결합은 도 2c에 나타낸다. 도 2a-2c 각각에서, hIgG4의 결합은 음성 대조군으로서 나타낸다.
도 3a-b는 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 항체 농도의 범위에 걸쳐 PD-L1에 대한 인간화된 항-PD-L1 항체들의 결합을 나타내는 그래프들의 세트이다. 대조군 hIgG4 및 인간화된 항체들 hu5G11-hIgG1 및 hu5G11-hIgG4의 결합은 도 3a에 나타낸다. 대조군 hIgG4 및 인간화된 항체들 hu13C5-hIgG1 및 hu13C5-hIgG4의 결합은 도 3b에 나타낸다.
. 도 4a-c는 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 항체 농도의 범위에 걸쳐 하이브리도마 항-PD-L1 항체들에 의한 PD-1/PD-L1 상호 작용의 차단을 나타내는 그래프들의 세트이다. 대조군 mIgG1에 대해 비교되는 바와 같이 하이브리도마 항체들 13C5-mIgG (m13C5), 8C6-mIgG (m8C6), 5G9-mIgG (m5G9), 및 4A8-mIgG (m4A8)에 의한 PD-1/PD-L1 결합의 차단은 도 4a에 나타낸다. 대조군 mIgG1에 대해 비교되는 바와 같이 하이브리도마 항체들 5G11-mIgG (m5G11), 7B4-mIgG (m7B4), 4D1-mIgG (m4D1), 및 8H4-mIgG (m8H4)에 의한 PD-1/PD-L1 결합의 차단은 도 4b에 나타낸다. 대조군 mIgG1에 대해 비교되는 바와 같이 하이브리도마 항체들 8H3-mIgG (m8H3) 및 15F1-mIgG (m15F1)에 의한 PD-1/PD-L1 결합의 차단은 도 4c에 나타낸다.
도 5a-c는 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 항체 농도 범위에 걸쳐 키메라 항-PD-L1 항체들에 의한 PD-1/PD-L1 상호 작용의 차단을 나타내는 그래프들의 세트이다. 대조군 hIgG4에 대해 비교되는 바와 같이 키메라 항체들 ch5G11 hIgG4 및 ch5G11 hIgG1에 의한 PD-1/PD-L1 결합의 차단은 도 5a에 나타낸다. 대조군 hIgG4에 대해 비교되는 바와 같이 키메라 항체 ch8C6-hIgG4에 의한 PD-1/PD-L1 결합의 차단은 도 5b에 나타낸다. 대조군 hIgG4에 대해 비교되는 바와 같이 키메라 항체들 ch8H4-hIgG4, ch13C5-hIgG1, 및 ch13C5-hIgG4에 의한 PD-1/PD-L1 결합의 차단은 도 5c에 나타낸다.
도 6a-b는 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 항체 농도 범위에 걸쳐 인간화된 항-PD-L1 항체들에 의한 PD-1/PD-L1 상호 작용의 차단을 나타내는 그래프들의 세트이다. 대조군 hIgG4 및 인간화된 항체들 5G11-hIgG1 및 5G11-hIgG4에 의한 PD-1/PD-L1 결합의 차단은 도 6a에 나타낸다. 대조군 hIgG4 및 인간화된 항체들 13C5-hIgG1 및 13C5-hIgG4에 의한 PD-1/PD-L1 결합의 차단은 도 6b에 나타낸다.
도 7a 및 7b는 FACS에 의해 측정된 바와 같이 항체 농도 범위에 걸쳐 PD-L1에 의한 하이브리도마 항-PD-L1 항체들의 결합을 나타낸다. 대조군 항체 mIgG1에 대해 비교되는 바와 같이 하이브리도마 항체들 4A8, 15F1, 4D1, 13C5, 8H4, 및 8H3의 결합 (평균 형광 강도로 측정된 바와 같이)은 도 7a에 나타낸다. 대조군 항체 mIgG1에 대해 비교되는 바와 같이 하이브리도마 항체들 5G11, 8C6, 5G9, 또는 7B4의 결합 (평균 형광 강도로 측정된 바와 같이)은 도 7b에 나타낸다.
도 8은 FACS에 의해 측정된 바와 같이 항체 농도 범위에 걸쳐 PD-L1에 대한 키메라 항-PD-L1 항체들의 결합을 나타낸다. 대조군 항체 hIgG4, 및 키메라 항체들 ch13C5-hIgG1, ch5G11-hIgG1, 및 ch5G11-hIgG4의 결합이 도시된다.
도 9는 FACS에 의해 측정된 바와 같이 항체 농도 범위에 걸쳐 PD-L1에 대한 인간화된 항-PD-L1 항체들의 결합을 나타낸다. 대조군 항체 hIgG4 및 인간화된 항체들 hu13C5-hIgG1, hu13C5-hIgG4, hu5G11-hIgG1, 및 hu5G11-hIgG4의 결합이 도시된다.
. 도 10a 및 10b는 FACS에 의해 측정된 바와 같이 항체 농도 범위에 걸쳐 하이브리도마 항-PD-L1 항체들에 의한 PD-1/PD-L1 상호 작용의 차단을 보여준다. 대조군 항체 mIgG1 및 하이브리도마 항체들 m4D1, m5G11, m13C5, m7B4, 및 m8H4에 의한 PD-1/PD-L1 결합의 차단은 도 10a에 나타낸다. 대조군 항체 mIgG1 및 하이브리도마 항체들 m4A8, m5G9, m8C6, m8H3, 및 m15F1에 의한 PD-1/PD-L1 결합의 차단은 도 10b에 나타낸다.
도 11은 FACS에 의해 측정된 바와 같이, 대조군 항체 hIgG4또는 키메라 항-PD-L1 항체들 ch8C6-hIgG4, ch5G11-hIgG1, ch5G11-hIgG4, ch13C5-hIgG1, ch13C5-hIgG4, 또는 ch8H4-hIgG4의 농도 범위에 걸쳐 PD-1/PD-L1 상호 작용의 차단을 보여준다.
도 12는 FACS에 의해 측정된 바와 같이, 대조군 항체 hIgG4또는 인간화된 항체들 hu 13C5-hIgG1, hu13C5-hIgG4, hu5G11-hIgG1, 또는 hu5G11-hIgG4의 농도 범위에 걸쳐 PD-1/PD-L1 상호 작용의 차단을 보여준다.
도 13a는 상이한 농도의 하이브리도마 항-PD-L1 항체들에 반응하여 MLR에서 IL-2 (pg/mL) 생산을 나타내는 그래프이다. 도 13b은 상이한 농도의 하이브리도마 항-PD-L1 항체들에 반응하여 MLR에서 IFNγ (pg/mL) 생산을 나타내는 그래프이다. 도 13a 및 13b 모두에 대해, 시험된 항체들은 왼쪽에서 오른쪽으로 대조군 mIgG1, m8C6, m4D1, m5G11, m7B4, m8H4, m5G9, m13C5, m8H3, 및 m15F1이었다. T 세포 단독 및/또는 DC 단독 웰들은 또한 음성 대조군으로서 포함되었다. 도 13a 및 13b 모두에 대해 x-축 상에 나타낸 바와 같이, 각각의 항체는 20 μg/mL, 2 μg/mL, 0.2 μg/mL, 0.02 μg/mL, 및 0.002 μg/mL로 시험되었다.
도 14a는 상이한 농도의 키메라 항-PD-L1 항체들에 반응하여 MLR에서 IL-2 (pg/mL) 생산을 보여주는 그래프이다. 도 14b는 MLR에서 반응하여 상이한 농도의 키메라 항-PD-L1 항체들에 반응하여 MLR에서 IFNγ (pg/mL) 생산을 보여주는 그래프이다. 도 14a 및 14b 모두에 대해, 시험된 항체들은 왼쪽에서 오른쪽으로 대조군 hIgG4, 키메라 8C6-hIgG4, 키메라 8H4-hIgG4, 키메라 5G11-hIgG4, 및 키메라 13C5-hIgG1이었다. 도 14a 및 14b 모두에 대해 x-축 상에 나타낸 바와 같이, 각각의 항체는 20 μg/mL, 2 μg/mL, 0.2 μg/mL, 0.02 μg/mL, 및 0.002 μg/mL로 시험되었다.
도 15a는 상이한 농도의 인간화된 항-PD-L1 항체들에 반응하여 MLR에서 IL-2 (pg/mL) 생산을 보여주는 그래프이다. 도 15b는 상이한 농도의 인간화된 항-PD-L1 항체들에 반응하여 MLR에서 IFNγ (pg/mL) 생산을 보여주는 그래프이다. 도 15a 및 15b 모두에 대해, 시험된 항체들은 왼쪽에서 오른쪽으로 대조군 hIgG4, hu13C5-hIgG1, hu13C5-hIgG4, hu5G11-hIgG1, 및 hu5G11-hIgG4였다. 도 15a 및 15b 모두에 대해 x-축 상에 나타낸 바와 같이, 각각의 항체는 20 μg/mL, 2 μg/mL, 0.2 μg/mL, 0.02 μg/mL, 및 0.002 μg/mL로 시험되었다.
도 16은 CD4+ CD25+ Treg 세포들, CD4+CD25- T 세포들, 및 수지상 세포들을 갖는 동종 이형 MLR에서 IFNγ 생산 (pg/mL)의 Treg-매개 저해에 대한 키메라 (ch) 또는 인간화된 (hu) 항-PD-L1 항체들의 효과를 보여준다. 시험된 항체들은 왼쪽에서 오른쪽으로 대조군 hIgG4, ch13C5-hIgG1, ch13C5-hIgG4, hu13C5-hIgG1, hu13C5-hIgG4, ch5G11-hIgG1, ch5G11-hIgG4, hu5G11-hIgG1, 및 hu5G11-hIgG4.
도 17은 인간화된 항-PD-L1 항체 (hu13C5-hIgG1, hu13C5-hIgG4, hu5G11-hIgG1, 또는 hu5G11-hIgG4), 이소타입 대조군 (hIgG4) 항체의 존재 하에, 또는 어떠한 항체도 없이 자가 유래 DCs 및 항-CD3 항체에 의한 동시 자극에 반응하여 T 세포들로부터 IFN-γ 생산 (pg/mL)을 보여준다.
도 18a 및 18b는 IFN-γ 생산 (pg/mL)에 의해 측정된 바와 같이, 파상풍 독소에 의해 상기된 기억 T 세포 반응에 대한 인간화된 항-PD-L1 항체들의 효과를 보여준다. 음성 대조군 hIgG4 또는 인간화된 항체 hu13C5-hIgG1, hu13C5-hIgG4, hu5G11-hIgG1, 또는 hu5G11-hIgG4는 하기 농도들로 시험되었다: 20 μg/mL, 2 μg/mL, 0.2 μg/mL, 0.02 μg/mL, 및 0.002 μg/mL.
상세한 설명
PD1/PDL1 상호 작용은 SHP1 및 SHP2 포스파타제를 모집함으로써 T 세포 수용체 신호전달을 억제하고, 이는 TCR 신호전달로 방해받는다 (Chemnitz 등(2004) J. Immunol. 17:945-954). PD-L1은 PD1-발현 면역 효과기의 저해를 통해 종양 진행을 촉진할 뿐만 아니라, 일부 감염성 질환에서 세포-매개 면역을 조절할 수 있다 (Mueller 등(2010) J. Clin. Invest. 120:2508-2515). 더욱이, 동종 이형 효과기 T 세포 반응들은 이식편 거부 반응에서 PD-1 경로 조절에 민감하다 (Lee 등(2003) J. Immunol. 171:6929-6935). 따라서, PD-1의 PD-L1과의 상호 작용은 T 세포 활성화, 내성, 및 면역-매개 조직 손상에서 필수적이고 다양한 범위의 면역 조절 역할을 발휘한다. 그러나, 그 상호 작용은 PD-L1과 PD-1의 국부적 결합을 차단함으로써 역전될 수 있다 (Iwai 등(2002) Proc. Nat'l. Acad Sci. USA 99:12293-7; Brown 등(2003) J. Immunol. 170:1257-66).
PD-1은 효율적인 면역 파괴로부터 종양 세포들을 보호하는데 있어서 그의 역할 때문에 암의 성장 및 발달과 상관 관계를 갖는 것으로 밝혀졌다. 그의 리간드인 PD-L1은 다수의 마우스 및 인간 종양에 대한 유의한 발현을 나타내었고, 이는 면역 회피를 매개하는 것으로 가설된다 (Iwai, Y. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99:12293-12297 (2002); Strome S. E. 등, Cancer Res., 63:6501-6505 (2003); Dong 등(2002) Nat. Med. 8:787-9). 인간에서, PD-1의 (종양 침윤 림프구에 대한) 및/또는 PD-L1 (종양 세포들에 대한) 발현은 면역 조직 화학에 의해 평가된 다수의 원발 종양 생검에서 발견되었다. 그러한 조직들은 두경부의 종양뿐만 아니라 폐, 간, 난소, 자궁 경부, 피부, 결장, 신경교종, 방광, 유방, 신장, 식도, 위, 구강 편평 상피(oral squamous) 세포, 요로 상피(urothelial) 세포, 및 췌장의 암들을 포함한다 (Brown J. A. 등, J. Immunol. 170:1257-1266 (2003); Dong H. 등, Nat. Med. 8:793-800 (2002); Wintterle 등, Cancer Res. 63:7462-7467 (2003); Strome S. E. 등, Cancer Res., 63:6501 -6505 (2003); Thompson R.H. 등, Cancer Res. 66:3381-5(2006); Thompson 등, Clin. Cancer Res. 13:1757-61(2007); Nomi T. 등, Clin. Cancer Res. 13:2151-7.(2007)). 더 현저하게, 종양 세포들 상의 PD-1 리간드 발현은 여러 종양 유형에 걸쳐 암 환자들의 불량한 예후와 상관 관계가 있다 (OkaZaki 및 Honjo, Int. Immunol. 19:813-824 (2007)에서 검토됨).
PD-1과 PD-L1 사이의 상호 작용은 암 세포들에 의해 종양 침윤 림프구들의 감소, T-세포 수용체 매개 증식의 감소, 및 면역 회피를 초래하지만 (Dong 등(2003) J. Mol. Med. 81:281-7; Blank 등(2005) Cancer Immunol. Immunother. 54:3 07-3 14; Konishi 등(2004) Clin. Cancer Res. 10:5094-100), PD-1/PD-L1 상호 작용의 차단은 따라서 종양-특이적 T-세포 면역을 향샹시키고 면역계에 의한 종양 세포들의 제거에 도움이 되는 것으로 나타났다. 공격적 췌장암의 쥣과 모델에서, 예를 들면, Nomi T., 등(Clin. Cancer Res. 13:2151-2157, 2007)은 PD-1/PD-L1 차단의 치료 효능을 입증했다. PD-1 또는 PD-L1 유도된 항체의 투여는 종양 성장을 현저히 억제하였다. 항체 차단은 IFN-γ, 그랜자임 B 및 퍼포린을 포함하는 항-종양 효과기의 상향-조절을 초래하는 종양 내로 종양 반응성 CD8+ T 세포 침윤을 효과적으로 촉진시켰다. 또한, 저자들은 PDL1/PD-1 차단이 화학요법과 효과적으로 결합되어 시너지 효과를 나타낼 수 있음을 보여주었다. 마우스에서 편평 상피암 모델을 사용하는 또 다른 연구에서, PD-1 또는 PD-L1의 항체 차단은 종양 성장을 유의하게 억제하였다 (Tsushima F. 등, Oral Oncol. 42:268-274 (2006)).
더욱이, 쥣과 비만 세포종 세포주를 PD-L1로 형질 감염시키면 종양-특이적 CTL 클론과 동시-배양되었을 때 종양 세포들의 감소된 용해로 이어졌다. 용해는 항-PD-Ll mAb가 첨가되었을 때 복원되었다 (Iwai Y. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99:12293-12297 (2002)). 생체 내에서, PDl/PD-Ll 상호 작용을 차단하는 것은 마우스 종양 모델에서 입양 T 세포 전이 요법의 효능을 증가시키는 것으로 나타났다 (Strome S. E. 등, Cancer Res. 63:6501-6505 (2003)). 암 치료에서 PD-1의 역할에 대한 추가적인 증거는 PD-l 녹아웃 마우스에 의해 수행된 실험으로부터 나온다. PD-Ll 발현 골수종 세포들은 야생형 동물들에서만 성장 하였지만 (종양 성장 및 연관된 동물 사멸을 초래함), 결핍 마우스에서는 그렇지 않았다 (Iwai Y., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99:12293-12297(2002)). 인간 연구에서, R.M.Wong 등(Int.Immunol. 19:1223-1234 (2007))는 완전 인간 항-PD-l 항체를 사용하는 PD-l 차단은 백신 접종받은 개개인들로부터 백신 항원들 및 세포들을 사용하는 생체 외 자극 분석들에서 절대적 수치의 종양-특이적 CD8+ T 세포들 (CTLs)을 증강시킨 것을 보였다. 유사한 연구에서, PD-Ll의 항체 차단은 종양-연관된 항원-특이적 세포 독성 T 세포들의 증진된 세포 용해 활성을 초래하였고, 종양 특이적 TH 세포들에 의한 사이토카인 생산을 증가시켰다 (Blank C. 등, Int.J. Cancer 119:317-327 (2006)). 동일한 저자들은 PD-Ll 차단이 항-CTLA-4 차단과 함께 사용되었을 때 시험 관내에서 종양-특이적 T 세포 반응들을 증가시킨다는 것을 보여 주었다. 전반적으로, PD-l/PD-Ll 경로는 암 치료를 위한 항체 치료제 개발을 위한 목표이다. 항-PD-Ll 항체들은 또한 만성 바이러스 감염에 유용할 수 있다. 급성 바이러스 감염 후 발생된 기억 CD8+ T 세포들은 고도로 기능성이고, 보호 면역의 중요한 요소를 구성한다. 대조적으로, 만성 감염은 종종 바이러스 특이적 T-세포 반응의 기능적 손상 (고갈)의 정도를 변화시키는 것을 특징으로 하고, 이러한 결함은 숙주가 지속적인 병원균을 제거할 수 없는 주된 이유이다. 기능성 효과기 T 세포들은 먼저 감염 초기 단계 동안에 생성되지만, 만성 감염 과정에서 점차 기능을 상실한다. Barber 등(Barber 등, Nature 439:682-687 (2006))은 LCMV의 실험실 균주에 감염된 마우스들이 혈액 및 다른 조직들에서 높은 수준의 바이러스를 초래하는 만성 감염을 발달시켰다는 것을 보여주었다. 이들 마우스는 초기에 강력한 T 세포 반응을 보였지만, 결국 T 세포가 고갈되면서 감염되었다. 저자들은 만성적으로 감염된 마우스들에서 효과기 T 세포들의 수 및 기능의 감소가 PD-l과 PD-Ll 사이의 상호 작용을 차단하는 항체를 주사함으로써 역전될 수 있다는 것을 발견했다
일 측면에서, 본 발명은 프로그래밍된 사멸 리간드 1 (PD-L1)에 결합하는 항체들 또는 항원 결합 그의 단편들을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 항체들 또는 그의 단편들은 인간 PD-L1에 결합한다. 또 다른 구현예에서, 사기 항체들 또는 그의 단편들은 인간 및 사이노몰구스 PD-L1에 결합한다. 또 다른 구현예에서, 상기 항체들 또는 그의 단편들은 PD-L1과 T 세포들 상의 그의 수용체 PD-1의 상호 작용을 차단한다. 일 측면에서, 본 발명은 항-PD-L1 항체들 또는 그의 단편들을 제조하고 사용하는 방법, 및 제약 조성물을 포함하여 항-PD-L1 항체들 또는 그의 단편들을 포함하는 조성물들을 제공한다.
본원에 사용된 바의, 용어 "항체"는 적어도 하나의 항원 결합 도메인을 갖는 결합 단백질을 지칭한다. 본 발명의 항체들 및 그의 단편들은 전체 항체들 또는 그의 임의의 단편일 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체들 및 단편들은 면역 접합체뿐만 아니라 단일 클론 항체들 또는 그의 단편들 및 항체 변종들 또는 그의 단편들을 포함한다. 항체 단편들의 예는 Fab 단편들, Fab' 단편들, F(ab)' 단편들, Fv 단편들, 단리된 CDR 영역, 단쇄 Fv 분자들 (scFv), 및 당업계에 공지된 다른 항체 단편들을 포함한다. 항체들 및 그의 단편들은 또한 재조합 폴리펩티드, 융합 단백질, 및 이중-특이적 항체들을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 항-PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 이소타입일 수 있다. 용어 "이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 암호화되는 항체 클래스를 의미한다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 항-PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 IgG1 또는 IgG4 이소타입이다. 본 발명의 PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 마우스, 쥐, 토끼, 영장류, 라마, 및 인간을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는 임의의 종들로부터 유도될 수 있다. 상기 PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 키메라, 인간화된, 또는 완전 인간 항체들일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 항-PD-L1 항체들은 마우스로부터 유도되는 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 항체들이다. 따라서, 일 구현예에서, 상기 항-PD-L1 항체들은 쥣과 항체들이다. 또 다른 구현예에서, 상기 항-PD-L1 항체들은 키메라 항체들이다. 추가의 구현예에서, 상기 키메라 항체들은 마우스-인간 키메라 항체들이다. 또 다른 구현예에서, 상기 항체들은 인간화된 항체들이다. 추가의 구현예에서, 상기 항체들은 쥣과 항체들로부터 유도되고 인간화된다.
"키메라 항체"는 하나의 종들로부터 유도된 중쇄 가변 영역의 적어도 일부 및 경쇄 가변 영역의 적어도 일부; 및 다른 종들로부터 유도된 불변 영역의 적어도 일부를 갖는 항체이다. 예를 들면, 일 구현예에서, 키메라 항체는 쥣과 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함할 수 있다.
"인간화된 항체"는 비-인간 항체로부터 유도된 상보성 결정 영역 (CDR); 및 인간 항체로부터 유도된 불변 영역뿐만 아니라 골격 영역을 함유하는 항체이다. 예를 들면, 본원에 제공된 항-PD-L1 항체들은 하나 이상의 쥣과 항체들 및 인간 골격으로부터 유도된 CDR 및 불변 영역들을 포함할 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 본원에 제공된 인간화된 항체는 항체의 CDR가 유도되는 쥣과 항체와 동일한 PD-L1 상의 에피토프에 결합한다. 예시적인 인간화된 항체들이 본원에 제공된다. 본원에서 제공된 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 그의 변이체를 포함하는 추가의 항-PD-L1 항체들은 임의의 인간 골격 서열을 사용하여 생성될 수 있으며, 또한 본 발명에 포함된다. 일 구현예에서, 본 발명에 사용하기에 적합한 골격 서열들은 본원에 제공된 골격 서열들과 구조적으로 유사한 골격 서열들을 포함한다. 골격 영역들에서 추가 변형들은 본원에 제공된 항체들의 특성을 개선하기 위해 이루어질 수 있다. 그러한 추가의 골격 변형들은 화학적 변형들; 면역원성을 감소시키거나 또는 T 세포 에피토프를 제거하기 위한 점 돌연변이; 또는 원래 생식 계열 서열 내의 잔기로의 복귀 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, 그러한 변형들은 생식 계열 서열에 대한 복귀 돌연변이들을 포함하여, 본원에 예시된 돌연변이들에 대응하는 것들을 포함한다. 예를 들면, 일 구현예에서, 본원에 제공된 인간화된 항체들의 VH 및/또는 VL의 인간 골격 영역들에서 하나 이상의 아미노산은 부모 쥣과 항체에서 대응하는 아미노산으로 복귀 돌연변이된다. 일 실시예로써, 인간화된 5G11 및 인간화된 13C5의 VH 및 VL에 대해서와 같이, 상기 템플릿 인간 항체의 골격 아미노산의 여러 부위들은 마우스 5G11 및 13C5 항체들에서 대응하는 아미노산 서열들로 복귀 돌연변이되었다. 일 구현예에서, 경쇄 가변 영역의 위치 53 및/또는 60 및/또는 67에서 아미노산은 마우스 5G11 또는 13C5 경쇄 가변 영역에서 그 위치에서 발견된 대응하는 아미노산으로 복귀 돌연변이된다. 또 다른 구현예에서, 중쇄 가변 영역의 위치 24 및/또는 28 및/또는 30 및/또는 49 및/또는 73 및/또는 83 및/또는 94에서 아미노산은 마우스 5G11 또는 13C5 중쇄 가변 영역에서 그 위치에서 발견된 대응하는 아미노산으로 복귀 돌연변이된다. 일 구현예에서, 상기 인간화된 5G11 항체는 경쇄 가변 영역 (여기서 위치 60에서 아미노산은 Ser (S)에서 Asp (D)로 돌연변이되고, 위치 67에서 아미노산은 Ser (S)에서 Tyr (Y)로 돌연변이됨); 및 중쇄 가변 영역 (여기서, 위치 24에서 아미노산은 Phe (F)에서 Val (V)로 돌연변이되고, 위치 49에서 아미노산은 Ala (A)에서 Gly (G)로 돌연변이되고, 위치 73에서 아미노산은 Thr (T)에서 Asn (N)로 돌연변이되고, 위치 83에서 아미노산은 Thr (T)에서 Asn (N)로 돌연변이됨)을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 인간화된 13C5 항체는 경쇄 가변 영역 (여기서, 위치 53에서 아미노산은 Tyr (Y)에서 Lys (K)로 돌연변이됨); 및 중쇄 가변 영역 (여기서, 위치 28에서 아미노산은 Thr (T)에서 Ile (I)로 돌연변이되고, 위치 30에서 아미노산은 Ser (S)에서 Arg (R)로 돌연변이되고, 위치 49에서 아미노산은 Ser (S)에서 Ala (A)로 돌연변이되고, 위치 94에서 아미노산은 Tyr (Y)에서 Asp (D)로 돌연변이됨)을 포함한다. 추가의 또는 대안의 복귀 돌연변이들은 항체들의 특성을 향상시키기 위해 본원에 제공된 인간화된 항체들의 골격 영역에서 이루어질 수 있다. 본 발명은 또한 PD-L1에 결합하는 인간화된 항체들을 포함하고, 항체들의 특성들을 달리 향상시키는 다른 골격 변형들뿐만 아니라 임의의 적합한 골격 서열에 관하여 본원에 기재된 예시적인 변형들에 대응하는 골격 변형들을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 참조 항체 또는 다른 결합 단백질과 상대적인 분자 또는 폴리펩티드를 지칭하는데 사용될 때 용어 "유도된"은 참조 항체 또는 다른 결합 단백질과 동일한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 분자 또는 폴리펩티드를 의미한다.
본원에 개시된 상기 항체들 및 그의 항원-결합 단편들은 PD-L1에 대해 특이적이다. 일 구현예에서, 상기 항체들 및 그의 단편들은 인간 PD-L1에 대해 특이적이다. 일 구현예에서, 본원에 제공된 항체들 및 단편들은 인간 또는 영장류 PD-L1에 결합하지만, 임의의 다른 포유류로부터 PD-L1에 결합하지 않는다. 추가의 구현예에서, 상기 항체들 및 그의 단편들은 마우스 PD-L1에 결합하지 않는다. 용어 "인간 PD-L1," "hPD-L1", 및 "huPD-L1" 등은 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 인간 PD-L1 및 변이체들 또는 인간 PD-L1의 이소형들을 지칭한다. "대해 특이적"은 상기 항체들 및 그의 단편들이 임의의 다른 표적보다 더 큰 친화도로 PD-L1에 결합한다는 것을 의미한다. 본원에 사용된 바의, 용어 "EC50"은 항체의 50% 최대 반응인 유효 농도를 나타낸다. 본원에 사용된 바의, 용어 "IC50"은 항체의 50% 최대 반응인 억제 농도를 나타낸다. EC50 및 IC50 모두는 ELISA 또는 FACS 분석, 또는 당 업계에 공지된 임의의 다른 방법에 의해 측정될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 항-PD1 항체들 및 그의 단편들 또는 변이체들은 약 0.001 nM 내지 약 100 nM, 약 0.002 nM 내지 약 50 nM, 약 0.005 nM 내지 약 5 nM, 약 0.01 nM 내지 약 1 nM, 또는 약 0.05 nM 내지 약 0.1 nM의 범위의 PD-L1에 대한 결합 친화도 (KD)를 갖는다. 일 구현예에서, 상기 항체들 및 그의 단편들은 약 50 nM 이하, 약 25 nM 이하, 약 20 nM 이하, 약 15 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 8 nM 이하, 약 6 nM 이하, 약 5 nM 이하, 약 4 nM 이하, 약 3 nM 이하, 약 2 nM 이하, 약 1 nM 이하, 약 0.9 nM 이하, 약 0.8 nM 이하, 약 0.7 nM 이하, 약 0.6 nM 이하, 약 0.5 nM 이하, 약 0.4 nM 이하, 약 0.3 nM 이하, 약 0.2 nM 이하, 약 0.1 nM 이하, 약 0.09 nM 이하, 약 0.08 nM 이하, 약 0.07 nM 이하, 약 0.06 nM 이하, 약 0.05 nM 이하, 약 0.04 nM 이하, 약 0.03 nM 이하, 약 0.02 nM 이하, 약 0.01 nM 이하, 약 0.009 nM 이하, 약 0.008 nM 이하, 약 0.007 nM 이하, 약 0.006 nM 이하, 약 0.005 nM 이하, 약 0.004 nM 이하, 약 0.003 nM 이하, 약 0.002 nM 이하, 또는 약 0.001 nM 이하의 PD-L1에 대한 결합 친화도(KD)를 갖는다. 일 구현예에서, 상기 항체들 및 그의 단편들은 약 10 nM, 약 9 nM, 약 8 nM, 약 7 nM, 약 6 nM, 약 5 nM, 약 4 nM, 약 3 nM, 약 2 nM, 약 1 nM, 약 0.9 nM, 약 0.8 nM, 약 0.7 nM, 약 0.6 nM, 약 0.5 nM, 약 0.4 nM, 약 0.3 nM, 약 0.2 nM, 약 0.1 nM, 약 0.09 nM, 약 0.08 nM, 약 0.07 nM, 약 0.06 nM, 약 0.05 nM, 약 0.04 nM, 약 0.03 nM, 약 0.02 nM, 약 0.01 nM, 약 0.009 nM, 약 0.008 nM, 약 0.007 nM, 약 0.006 nM, 약 0.005 nM, 약 0.004 nM, 약 0.003 nM, 약 0.002 nM, 또는 약 0.001 nM의 PD-L1에 대한 결합 친화도 (KD)를 갖는다.
일 구현예에서, 본원에 제공된 항체들 및 단편들은 경쇄 및 중쇄를 포함하고, 그들 각각은 3개의 CDR 영역을 포함한다. 본 발명의 PD-L1 항체들에 대한 예시적인 중쇄 CDR 서열들 (HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3)은 하기 표 1에 제공된다. 본 발명의 PD-L1 항체들에 대한 예시적인 경쇄 CDR 서열들 (LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3)은 하기 표 2에 제공된다. 본 발명의 PD-L1 항체들에 대한 예시적인 가변 영역들 및 전장 중쇄 및 경쇄 서열들은 하기 표 3에 제공된다.
표 1. 중쇄 CDR 서열
Figure pct00001
Figure pct00002
표 2. 경쇄 CDR 서열
Figure pct00003
Figure pct00004
표 3.중쇄 및 경쇄 가변 영역 및 전장 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
일 구현예에서, 본 발명은 항체들 13C5, 5G9, 5G11, 8C6, 7B4, 4D1, 4A8, 8H4, 8H3, 및/또는 15F1의 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR를 포함하는 항-PD-L1 항체들을 제공한다. 당업자는 본원에 제공된 항체들의 중쇄 및 경쇄 CDR가 독립적으로 선택되거나, 또는 혼합되고 매칭되어 본원에 제공된 항체들로부터 임의의 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 및 임의의 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 항체 또는 그의 결합 단편을 형성할 것임을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명은 하기를 포함하는 항-PD-L1 항체들을 제공한다: 서열 번호들: 81, 87, 93, 99, 105, 111, 117, 123, 129, 및 135로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1; 서열 번호들: 82, 88, 94, 100, 106, 112, 118, 124, 130, 및 136로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 서열 번호들: 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 및 137로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3; 서열 번호들: 84, 90, 96, 102, 108, 114, 120, 126, 132, 및 138로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1; 서열 번호들: 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127, 133, 및 139로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및 다음 서열 번호들로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열: 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128, 134, 및 140을 포함하는 경쇄 CDR3. 일 구현예에서, 본 발명은 본원에 제공된 대응하는 경쇄 또는 중쇄 CDR1, CDR2, 또는 CDR3에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열들을 포함하는 중쇄 및 경쇄 CDR 영역을 포함하는 항-PD-L1 항체들을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 본원에 제공된 대응하는 경쇄 또는 중쇄 CDR1, CDR2, 또는 CDR3과 관련하여 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 갖는 아미노산 서열들을 포함하는 중쇄 및 경쇄 CDR 영역들을 포함하는 항-PD-L1 항체들을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 13C5, 5G9, 5G11, 8C6, 7B4, 4D1, 4A8, 8H4, 8H3, 및/또는 15F1로 구성된 군으로부터 선택된 항체의 가변 중쇄 및 13C5, 5G9, 5G11, 8C6, 7B4, 4D1, 4A8, 8H4, 8H3, 및/또는 15F1로 구성된 군으로부터 선택된 항체의 가변 경쇄를 포함하는 항-PD-L1 항체들을 제공한다. 일 구현예에서, 본원에 제공된 항체들 및 단편들은 서열 번호들: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 및 46로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 본원에 제공된 항체들 및 단편들은 서열 번호:2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 또는 그의 변이체에 따른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서, 상기 변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 치환 또는 결실, 또는 이들의 조합을 포함한다. 추가의 구현예에서, 상기 아미노산 치환은 보존적 치환이다.
일 구현예에서, 본원에 제공된 항체들 및 단편들은 서열 번호들: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 또는 48로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 본원에 제공된 항체들 및 단편들은 서열 번호:4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 또는 그의 변이체에 따른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서, 상기 변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상의 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실, 또는 이들의 조합을 포함한다. 추가의 구현예에서, 상기 아미노산 치환은 보존적 치환이다.
CDR 또는 가변 경쇄 또는 중쇄 영역에서 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입, 결실, 또는 그의 조합을 갖는 본원에 개시된 항-PD-L1 항체들은 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실을 갖지 않는 대응하는 항-PD-L1 항체의 생물학적 활성을 보유한다. 따라서, 본원에 제공된 변이체 항-PD-L1 항체들은 PD-L1에 대한 결합을 보유한다. 본원에 사용된 바의 백분율 상동성은 2개의 참조 서열들로 공유되는 동일한 아미노산 서열들의 수를 아미노산 위치의 총 수로 나누고, 100으로 곱한 것을 의미한다.
일부 구현예들에서, 본원에 제공된 항-PD-L1 항체들은 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 당업자는 보존적 아미노산 치환이 하나의 아미노산을 예를 들면, 유사한 측쇄와 같은 유사한 구조적 또는 화학적 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환하는 것임을 인식할 것이다. 예시적인 보존적 치환은 당업계에, 예를 들면, Watson 등에 기재되어 있고, Molecular Biology of the Gene, The Bengamin/Cummings Publication Company, 4th Ed.(1987).
당업자는 가변 경쇄 및 가변 중쇄들이 본원에 제공된 항체들로부터 독립적으로 선택될 수 있거나, 또는 혼합 및 매치될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명은 서열 번호들: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 및 46로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호들: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 및 48로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-PD-L1 항체들을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 본원에 개시된 예시적인 항체들 중의 임의의 하나와 동일한 에피토프에 결합하는 항체들을 제공한다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 PD-L1에 대한 결합을 위해 본원에 제공된 예시적인 항체들로 완성된 항체들을 제공한다.
본원에 제공된 항-PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 효과기 기능을 변경시키기 위한 Fc 영역 변형을 추가로 포함할 수 있다. Fc 변형은 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환일 수 있거나, 또는 화학적 변형일 수 있다. 예를 들면, Fc 영역 변형은 보체 결합을 증가 또는 감소시키거나, 항체-의존성 세포의 세포 독성을 증가 또는 감소시키거나, 또는 항체의 반감기를 증가 또는 감소시키도록 이루어질 수 있다. 일부 Fc 변형은 FcγRI, FcγRII, FcγRIII, 또는 FcRn과 같은 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화도를 증가 또는 감소시킨다. 다양한 Fc 변형은 당업계에, 예를 들면, Shields 등에 기재되어 있고, J Biol . Chem 276; 6591 (2001); Tai 등 Blood 119; 2074 (2012); Spiekermann 등J Exp . Med 196; 303 (2002); Moore 등 mAbs 2:2; 181 (2010); Medzihradsky Methods in Molecular Biology 446; 293 (2008); Mannan 등 Drug Metabolism and Disposition 35; 86 (2007); 및 Idusogie 등.J Immunol 164; 4178 (2000). 일부 구현예들에서, Fc 영역 글리코실화 패턴들이 변경된다. 다른 구현예들에서, Fc 영역은 페길화에 의해 변형된다 (예, 항체 또는 그의 단편을 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 반응시킴으로써.
일 구현예에서, 본원에 제공된 항체들 또는 그의 단편들은 항-PD-L1 항체 또는 그의 단편을 포함하는 면역 접합체들이고, 추가의 치료제, 세포 독성제, 면역 부착 분자, 및 조영제를 포함하는 군으로부터 선택된 제제를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 조영제는 방사성 표지, 효소, 형광 표지, 발광 표지, 생체 발광 표지, 자기 표지 및 비오틴으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예들에서, 조영제는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 방사성 표지이다: 3H, 14C, 35S, 62Cu, 64Cu, 89Zr, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho, 및 153Sm.일부 구현예들에서, 치료제 또는 세포 독성제는 화학 요법제, 면역 억제제, 면역-자극제, 항-대사 산물, 알킬화제, 항생제, 성장 인자, 사이토카인, 항-혈관 형성제, 항-유사 분열제, 안트라사이클린, 독소 및 아폽토시스제를 포함하는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예들에서, 결합 단백질은 작용제에 직접적으로 접합된다. 다른 구현예들에서, 결합 단백질은 링커를 통해 작용제에 접합된다. 적합한 링커는 본원에 개시된 아미노산 및 폴리펩티드 링커들을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는다. 링커들은 절단될 수 있거나 또는 절단될 수 없다.
일 구현예에서, 본 발명은 PD-L1에 대해 특이적인 이중 특이적 또는 다중 특이적 항체들 및 적어도 하나의 다른 항원 또는 에피토프를 제공한다. 본원에 제공된 항-PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 본원에 제공된 결합 분석들, 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 결합 분석을 사용하는 PD-L1에 대한 결합에 대해 시험될 수 있다.
달리 언급되지 않는 한, 본 발명의 실시는 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 당업계에 잘 공지되어 있고, 예를 들면, 다음 문헌 [Methods in Molecular Biology, Humana Press; Molecular Cloning]에 기재된 통상적인 분자 생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학 기법들을 사용한다: A Laboratory Manual, 2판 (Sambrook 등, 1989), Current Protocols in Immunology (J. E.Coliganet 등, eds., 1991); Immunobiology (C.A.Janeway 및 P.Travers, 1997); 항체들 (P.Finch, 1997); 항체들:실용적 접근법 (D.Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); 단일 클론 항체들:실용적 접근법 (P.Shepherd 및 C.Dean, eds., Oxford University Press, 2000); 파지 디스플레이:실험실 매뉴얼 (C.Barbas III 등, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001); 및 항체들 사용:실험실 매뉴얼 (E.Harlow 및 D.Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999).
일 측면에서 본 발명은 면역 반응을 증강, 자극 또는 유도하는 것에 반응성인 질환 또는 상태에 대해 환자를 치료하는 방법들을 제공한다. 본원에 사용된 바의, 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 치료적 치료 및 예방적 또는 방지적 조치 모두를 의미한다. 치료를 필요로 하는 피험자들은 이미 질병 또는 상태를 가지고 있는 피험자뿐만 아니라 질병 또는 상태를 발전시킬 수 있는 피험자를 포함하고, 피험자는 질병 또는 상태를 예방, 지연 또는 감소시켜야 한다. 본원에 사용된 바의, 용어 "피험자"는 설치류, 고양이과, 개과 및 영장류와 같은 포유류를 의미한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 피험자는 인간이다.
본원에 사용된 바의 용어 "치료 유효량"은 상기 피험자에게 치료 및/또는 예방적 이익을 제공하는데 필요한 화합물 또는 조성물의 양을 지칭한다.
일 측면에서, 항체들 및 항원 결합 그의 단편들은 충실성 또는 비충실성 종양들의 치료에 유용하다. 따라서, 일 측면에서, 본 발명은 암의 치료 방법들을 제공한다. 본원에 사용된 바의 "암"은 통상적으로 조절되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는 포유류의 생리 조건을 나타낸다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종(지방 육종, 골육종, 혈관 육종, 내피 육종, 평활근 육종, 척색종, 림프관 육종, 림프관 내피 육종, 횡문근 육종, 섬유 육종, 점액 육종, 연골 육종을 포함함), 신경 내분비 종양, 중피종, 윤활막종, 신경초종, 수막종, 선암, 흑색종, 및 백혈병 또는 림프성 악성 종양을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는다. 그러한 암의 더 구체적인 예는 두경부 암뿐만 아니라 편평 세포 암 (예, 상피 편평 세포 암), 호지킨 림프종; 비호지킨 림프종 (버킷 림프종, 소림프절 림프종/만성 림프구성 백혈병, 균상 식육종, 맨틀 세포 림프종, 여포성 림프종, 확산성 큰 B 세포 림프종, 주변 부위 림프종, 털있는 세포 백혈병 및 림프형질세포성 백혈병), B 세포 급성 림프구성 백혈병/림프종 및 T 세포 급성 림프구성 백혈병/림프종을 포함하는 림프구 전구체 세포들의 종양, 흉선종, 말초 T-세포 백혈병, 성인 T-세포 백혈병/T-세포 림프종 및 큰 과립 림프구성 백혈병을 포함하는 성숙한 T 및 NK 세포들의 종양, 랑게르한스 세포 조직구증, 성숙한 AML, 분화되지 않은 AML, 급성 전골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병 및 급성 단핵 세포 백혈병을 포함하는 급성 골수성 백혈병과 같은 골수 신생물, 골수 이형성 증후군, 및 만성 골수성 백혈병, B-세포 급성 림프구성 백혈병/림프종, T-세포 급성 림프구성 백혈병/림프종을 포함하는 만성 골수 증식성 질환, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암 및 폐의 편평 상피암을 포함하는 폐암, 소세포 폐암종, 복막의 암, 간세포 암, 위장관 암을 포함하는 위 또는 복부 암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 대장암, 직장암, 결장 직장암, 자궁 내막암 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 콩팥 또는 신장 암, 전립선 암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 고환암, 식도암, 담도계의 종양, 유잉(Ewing) 종양, 기저 세포 암종, 선암, 땀샘 암종, 피지선 암종, 유두상 암종, 유두 선암, 낭성 선암, 수질 암종, 기관지 암종, 신장 세포 암종, 간세포암, 담관 암종, 융모암, 정상피종, 배아 암종, 윌름스(Wilms) 종양, 고환 종양, 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상 세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종(pinealoma), 혈관 모세포종, 음향 신경종, 희소돌기 신경교종, 뇌수막종, 흑색종, 신경 모세포종, 망막 모세포종, 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 월데스트롬 (Waldenstrom) 거대 글로불린혈증, 골수이형성 질환, 중쇄 질환, 신경 내분비 종양, 신경초종 및 기타 암종을 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 제공된 항체들 및 그의 단편들은 감염성 병원체들에 의해 유발된 질병의 치료에 유용하다. 감염성 병원체들은 박테리아, 균류, 기생충 및 바이러스 제제를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 그러한 감염성 병원체들의 예는 다음을 포함한다: 포도상구균, 메티실린-내성 황색 포도상구균, 대장균, 연쇄상구균, 네이세리아세에과(neisseriaaceae), 구균, 장내 세균, 장구균, 반코마이신-내성 장내 구균, 크립토코커스, 히스토플라스마증, 아스페르길루스, 슈도모나스과 세균(pseudomonadaceae), 비브리오나세에과(vibrionaceae), 캄필로박터(campylobacter), 파스퇴렐라과(pasteurellaceae), 보르도테라(bordetella), 프란시 셀라(francisella), 브루셀라, 레지오넬라(legionellaceae), 박테로이데스과(bacteroidaceae), 그람-음성균, 클로스트리디움, 코리네박테리움, 프로피오니박테리움, 그람-양성균, 탄저병, 방광균, 방사균, 마이코박테리움(mycobacterium), 트레포네마(treponema), 보렐리아, 렙토스피라, 마이코플라스마, 우레아플라스마, 리케차, 클라미디아, 칸디다균, 전신성 진균증, 기회 감염성 진균증, 원생 동물문, 선충류, 흡충류, 촌충류, 아데노 바이러스, 헤르페스 바이러스 (예를 들면, 단순 포진 바이러스 및 엡스타인 바(Epstein Barr) 바이러스 및 포진 대상 포진 바이러스 포함함), 폭스 바이러스, 파보바 바이러스, 간염 바이러스 (예를 들면, B형 간염 바이러스 및 C형 간염 바이러스 포함함), 유두종 바이러스, 오르토믹소바이러스(orthomyxoviruses) (예를 들면, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 및 인플루엔자 C를 포함함), 파라믹소 바이러스, 코로나 바이러스, 피코나 바이러스, 레오 바이러스, 토가바이러스, 플라비 바이러스, 부니아 바이러스(bunyaviridae), 랩도바이러스, 로타 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 인간 면역 결핍 바이러스 및 레트로 바이러스.예시적인 감염성 질환은 칸디다증, 칸디다혈증, 아스페르길루스증, 연쇄상 구균성 폐렴, 연쇄상 구균성 피부 및 구강 인두증, 그램 음성 패혈증, 결핵, 단핵구증, 인플루엔자, 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory Syncytial Virus)에 의해 유발된 호흡기 질환, 말라리아, 주혈 흡충증(schistosomiasis) 및 트리파노모니아증(trypanosomiasis)을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는다.
일 구현예에서, 본원에 제공된 항체들 및 그의 단편들은 예를 들어 천식, 알레르기 또는 이식편 대 숙주 질환과 같은 T-헬퍼 유형 2 (Th2) T 세포들에 의해 매개되는 질환의 치료에 유용하다.
일 구현예에서, 본원에 제공된 항체들 및 그의 단편들은 치료를 요하는 피험자에서 면역 반응의 자극에 유용하다. 예를 들면, 일 구현예에서, 항-PD-L1 항체들 및 그의 단편들은 상기 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 목적으로 관심 항원과 함께 투여될 수 있다. 관심 항원은 바이러스 또는 박테리아와 같은 병원체와 관련된 항원일 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 항-PD-L1 항체 및 항원을 포함하는 백신을 제공하며, 여기서, 상기 백신은 항원-특이적 면역 반응을 유도한다.
일 구현예에서, 본원에 제공된 항-PD-L1 항체들은 조절 T 세포 기능을 조절한다. CD4+ CD25+ 조절 T 세포들은 효과기 T 세포 기능의 효과를 억제하거나 감소시키는 림프구이다. 용어 "조절 T 세포"및 "Treg"는 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다. 일 구현예에서, 본원에 제공된 항-PD-L1 항체들은 효과기 T 세포 사이토카인 생산에 대한 조절성 T 세포의 억제 효과를 방지하거나 역전시킨다. 예를 들면, 일 구현예에서, 본원에 제공된 항-PD-L1 항체들은 조절 T 세포들과 접촉하는 효과기 T 세포들에게 IFNγ 생산 능력을 회복시킨다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 항체들 및 그의 단편들은 상기 피험자에게 비경구, 피하, 근육 내, 정맥 내, 관절 내, 기관지 내, 복강 내, 캡슐 내, 연골 내, 강 내, 복 내, 소뇌 내, 뇌실 내, 결장 내, 자궁 내, 위 내, 간 내, 심근 내, 골 내, 골반 내, 심장주위 내, 복강 내, 늑막 내, 전립선 내, 폐 내, 직장 내, 신장 내, 망막 내, 척수 내, 정수 내, 흉막 내, 고관절 내, 자궁 내, 방광 내, 유리체강 내, 볼러스, 결막하, 질내, 직장, 협측, 설하, 비강 내, 종양 내 및 경피로부터 선택된 적어도 하나의 경로로 투여될 수 있다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 항체들 및 그의 단편들은 치료를 요하는 피험자에게 하나 이상의 추가의 치료제와 조합하여 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 항체들 및 그의 단편들은 상기 피험자에게 추가의 치료제를 투여하기 전, 투여하는 동안 및/또는 투여한 후에 피험자에게 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 추가의 치료제는 화학 요법제, 방사선 요법제, 사이토카인, 항체 또는 그의 단편, 또는 치료될 질병에 대해 지시된 임의의 기타 추가의 치료제이다. 일 구현예에서, 항-PD-L1 항체 및 추가의 치료제는 동시에 또는 순차적이던지 무관하게 함께 투여될 때 치료적 상승 작용을 나타낸다. 일 구현예에서, 항-PD-L1 항체 및 추가의 치료제는 별도의 제형들로 투여된다. 또 다른 구현예에서, 항-PD-L1 항체 및 추가의 치료제는 동일한 제형으로 투여된다. 일 구현예에서, 본원에 제공된 항-PD-L1 항체들 및 단편들은 하나 이상의 추가의 치료제의 면역 조절 효과를 증진시킨다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 추가의 치료제는 항-PD-L1 항체 또는 그의 단편의 효과를 증진시킨다.
본 발명은 단리된 항체들 및 항원 결합 그의 단편들, 및 그러한 항체들 및 단편들을 암호화한 핵산뿐만 아니라 그러한 단리된 항체들, 단편들, 및 핵산을 포함하는 조성물을 제공한다. 용어 "단리된"은 그의 자연 환경으로부터 분리된 관심있는 화합물 (예, 항체 또는 핵산)을 의미한다. 본 발명은 추가로 단리된 항체들 또는 그의 단편들, 또는 그러한 항체들 또는 단편들을 암호화하는 핵산을 포함하고, 추가로 하나 이상의 제약적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 제약적으로 허용 가능한 담체들은 예를 들어 부형제, 희석제, 캡슐화 물질, 충전제, 완충제 또는 다른 제제를 포함한다.
단수의 사용은 달리 명시되지 않는 한 복수를 포함한다. "일" 또는 "하나"라는 단어는 달리 명시되지 않는 한 "적어도 하나"를 의미한다. "또는"의 사용은 달리 명시되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. "적어도 하나"라는 어구의 의미는 "하나 이상"이라는 어구의 의미와 동일하다. 또한, "포함하는" 및 "포함한다" 및 "포함된"과 같은 다른 형태의 용어의 사용은 제한적이지 않다. 또한, "요소" 또는 "구성 요소"와 같은 용어는 달리 명시되지 않는 한 하나의 유닛을 포함하는 요소들 또는 구성 요소들 모두 및 하나 이상의 유닛을 포함하는 요소들 또는 구성 요소들을 포괄한다.
전술한 본 발명은 이해의 명료성을 목적으로 예시 및 예로써 약간 상세하게 설명되었지만, 본 발명의 교시에 비추어 특정 변화 및 변형이 첨부된 특허 청구 범위의 사상 또는 범위를 벗어나지 않으면서 본 발명에 대해 이루어질 수 있음이 당업자에게 명백하다. 하기 실시예들은 단지 예시로서 제공되는 것으로, 한정하기 위한 것이 아니다. 당업자들은 본질적으로 유사한 결과를 산출하기 위해 변화 또는 변형될 수 있는 다양한 중요하지 않은 매개 변수들을 쉽게 인식할 것이다.
실시예
실시예 1: hPD -L1 단일 클론 항체의 발생
hPD -L1- HisTag 및 hPD -L1-mFc에 의한 마우스의 예방 접종
인간 PD-L1에 대한 항체들을 생성하기 위해, 히스티딘 태그 (hPD-L1-HisTag, 서열 번호들: 143 및 144), 마우스 Fc (hPD-L1-mFc, 서열 번호들: 145 및 146) 및 인간 Fc 태그 (hPD-L1-hFc, 서열 번호: 147 및 148)와 융합된 hPD-L1의 세포외 도메인의 개방된 리딩 프레임을 암호화하는 cDNAs를 PCR에 의해 수득하고, 발현 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen CAT#:V-790), 각각으로 서브클론화되었다. 자유형 293 세포에서 일시적 발현 후, hPD-L1-HisTag는 NTA 칼럼 (GE healthcare healthcare)으로 정제하였고, hPD-L1-mFc 및 hPD-L1-hFc는 단백질 G 칼럼 (GE healthcare)으로 정제하였다.
BALB/cJ 마우스는 동일한 부피의 Freund의 완전/불완전 보조제로 유화된 재조합 hPD-L1-HisTag 단백질 (100μg/마우스)또는 hPD-L1-mFc로 6주 동안 2주마다 피하로 면역화되었다. 융합 3 일 전에, 마우스는 보조제 없이 항원을 정맥 내 주사하여 증강되었다. 면역화된 마우스로부터 얻은 비장 세포들 (1×108)은 PEG Hybri-Max에 의해 SP2/0 골수종 세포들 (1.5×107)과 융합되었다 (Sigma Inc., CAT#:7181). 융합 후, 세포들은 웰당 0.1 ml의 96-웰 플레이트에 분배시키고, 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 1 일째에, 세포들은 혈청 및 HAT + 2×메토트렉세이트를 함유하는 배지와 함께 웰당 추가의 0.1 ml를 첨가함으로써 공급되었다. 3일 및 7일째에, 각각의 웰로부터 0.1 ml의 배지를 0.1 ml의 신선한 HT 배지로 대체하였다. 선별은 전형적으로 9일 내지 14일 사이에 일어나고, 배양 상등액은 ELISA에 의해 hPD-L1-hFc와 반응하는 항체에 대해 시험하였다.
선택된 하이브리도마 세포를 클로닝하기 위해, 한계 희석을 4회 수행하였다. 하이브리도마 세포들은 10% 소 태아 혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 2% L-글루타민, 및 1% 조정된 NaHC03 용액을 함유하는 Dulbecco의 변형된 이글 배지 (GIBCO; Invitrogen Corporation, Carlsbad, Calif.)에서 배양되었다. 이어서, 선택된 하이브리도마 세포들은 무혈청 배양 배지에 적용시키고 항체를 단백질-G 컬럼 (GE healthcare)을 사용하여 상등액으로부터 정제하였다. PBS로 세척한 후, 결합된 항체들은 0.1M 글리신 pH3.0을 사용하여 용출시키고, 이어서 2.0M 트리스를 사용하여 pH 중화시켰다. 울트라-15 원심 분리 농축기들 (Amicon)은 완충액 교환 및 항체 농축을 위해 사용하였다.
실시예 2: 항-PD-L1 항체들 cDNA 서열 클로닝 및 인간화
면역 글로불린 cDNAs의 클로닝
RNeasy Mini Kit (Qiagen, CAT#:74104)에 의해 hPD-L1 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주에서 단리된 총 RNA를 제조사의 지시에 따라 SuperScript® II Reverse Transcriptase (Life Technology, CAT#:18064-14)에 의해 제1-가닥 cDNA를 합성하기 위한 템플릿으로서 사용하였다. 이어서, cDNA 생성물은 변성 마우스 IgG 프라이머드을 사용하여 50 μl 부피 반응 혼합물로 PCR에 적용되었다 (Kettleborough CA, 등, European Journal of Immunology 23:206-211 (1993), Strebe N, 등, Antibody Engineering 1:3-14 (2010)). 반응은 다음의 30 사이클을 갖는 S1000TM Thermal Cycler (Bio-Rad, CAT#:184-2000)에서 수행되었다: 변성을 위해 94 ℃, 1.5분 동안; 어니일링을 위해 50 ℃, 1분 동안; 및 합성을 위해 72 ℃, 1분 동안. 30 번째 사이클의 말기에, 반응 혼합물은 확장을 위해 72 ℃에서 7분 동안 항온 배양하였다.
PCR 혼합물은 0.5 μg/ml 에티듐 브로마이드를 함유하는 1% 아가로스/Tris-Borate 겔에서 전기 영동에 적용되었다. 예상되는 크기 (중쇄 및 경쇄에 대해서는 대략적으로 450 bp)를 갖는 DNA 단편들은 겔로부터 절제하고 정제하였다. 정제된 PCR 생성물 3 μl를 pMD-18T 벡터 (Takara, CAT#:D101A)로 클로닝하고, One Shot® TOP10 화학적으로 만족할만한 E. 콜라이 (Invitrogen, CAT#:C4040-03)로 형질 전환시켰다. 클론들은 보편적인 M13 포워드 및 리버스 프라이머들을 사용하여 콜로니 PCR에 의해 선별하였고, 각각의 반응으로부터 10개의 양성 클론들은 M13 포워드 및 M13 리버스 프라이머들을 사용하여 양 방향으로 DNA 시퀀싱을 위해 선택하였다.
항체들 m4A8의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열들 (서열 번호들: 25-28), m4D1 (서열 번호들: 21-24), m5G9 (서열 번호들: 5-8), m5G11 (서열 번호들: 9-12), m8C6 (서열 번호들: 13-16), m8H3 (서열 번호들: 33-36), m8H4 (서열 번호들: 29-32), m7B4 (서열 번호들: 17-20), m13C5 (서열 번호들: 1-4) 및 m15F1 (서열 번호들: 37-40)은 대응하는 하이브리도마 클론들로부터 증폭되었다. 이들 항체들은 PD-1에 대한 PD-L1 결합을 차단하는 것 등의 바람직한 기능을 나타내고, T 세포 활성화 및 사이토카인 방출을 증진시켰다.
키메라 5G11 및 13C5 항체의 구성 및 발현
8C6, 8H4, 5G11 및 13C5 키메라 경쇄들 (서열 번호들: 52, 56, 62, 및 68, 각각)은 마우스 VL 영역들의 PCR-클로닝된 cDNAs를 인간 카파 사슬 불변 영역, 각각에 링크시킴으로써 작제되었다. 8C6, 8H4, 5G11 및 13C5 키메라 중쇄들 (서열 번호들: 50 (8C6-IgG4), 54 (8H4-IgG4), 58 (5G11-IgG1), 60 (5G11-IgG4), 64 (13C5-IgG1), 및 66 (13C5-IgG4))는 마우스 VH 영역들의 PCR-클로닝된 cDNAs를 인간 IgG1 및 IgG4 불변 영역들에 링크함으로써 작제되었다. 마우스 cDNA 서열들의 5 '말단은 경쇄 및 중쇄 모두에 리더 서열을 부가하도록 고안된 PCR 프라이머들을 사용하여 변형시켰다.
자유형 293 세포들 (106/mL에서 200 mL)은 키메라 중쇄 및 경쇄 발현 플라스미드들 각각의 100μg으로 형질 감염시키고 6일 동안 배양하였다. 이어서, 상등액 내의 키메라 항체는 단백질-G 컬럼 (GE healthcare)으로 정제하였다. 키메라 항체의 PD-L1과의 결합은 ELISA 및 Biacore에 의해 측정되었고, 쥣과 부모 항체의 친화도와 비교할만한 친화도로 PD-L1에 결합하는 것으로 나타났다.
항체 인간화 디자인
5G11 및 13C5 항체들은 그래프트 접근법을 사용하여 인간화되었다 (예를 들면, U.S.특허번호 5,225,539 참조). 쥣과 항체 5G11 및 13C5의 경쇄 및 중쇄 가변 사슬 서열들은 Structural Bioinformatics (RCSB) 단백질 데이터뱅크에 대해 Research Collaboratory에서 이용 가능한 것들과 비교 하였다 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/igblast.cgi). 5G11 및 13C5의 모델은 각각 가장 높은 서열 상동성을 갖는 VH 및 VL 구조에 기초하여 생성되었다.
마우스 5G11 및 13C5 항체의 VH 및 VL에서 상보적 결정 영역들 (CDR)과 그라프트되는 템플릿 인간 항체들은 국제 면역 유전자 정보 시스템 웹 사이트를 검색함으로써 마우스 5G11 및 13C5 항체와 높은 서열 상동성을 갖는 인간 항체 생식 계열들로부터 선별되었다 (http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi). 5G11에 대해, 선택된 템플릿 인간 VH는 IGHV2-5*10과 IGHJ4*01의 조합이고, 선택된 템플릿 인간 VL은 IGKV1-33*01과 IGKJ2*01의 조합이었다. 13C5에 대해, 선택된 템플릿 인간 VH는 IGHV3-21*04와 IGHJ4*01의 조합이고, 선택된 템플릿 인간 VL은 IGKV7-3*01과 IGKJ2*01의 조합이었다.
상기 템플릿 인간 항체들의 CDR 아미노산 서열들은 하이브리도마 (마우스) 5G11 (서열 번호들 93-98) 및 13C5 (서열 번호들 81-86) 항체들의 CDR로 치환되었다. 상기-언급된 템플릿 인간 항체 VH 및 VL의 골격들은 마우스 5G11 및 13C5 항체의 VH 및 VL로부터 필요한 아미노산 서열들과 그라프트되어 기능성 인간화된 항체를 제공하였다. 5G11 및 13C5의 VH 및 VL에 대해, 상기 템플릿 인간 항체의 골격 아미노산의 몇몇 부위들은 마우스 5G11 및 13C5 항체의 상응하는 아미노산 서열들로 역 돌연변이되었다. 인간화된 5G11 항체의 경쇄 가변 영역에 대해, 위치 60에서 아미노산은 Ser (S)에서 Asp (D)로 돌연변이되고, 위치 67에서 아미노산은 Ser (S) 에서 Tyr (Y)로 돌연변이되고; 인간화된 5G11 항체의 중쇄 가변 영역에 대해, 위치 24에서 아미노산은 Phe (F)에서 Val (V)로 돌연변이되고, 위치 49에서 아미노산은 Ala (A)에서 Gly (G)로 돌연변이되고, 위치 73에서 아미노산 Thr (T)에서 Asn (N)로 돌연변이되고, 위치 83에서 아미노산은 Thr (T)에서 Asn (N)로 돌연변이된다. 인간화된 13C5의 경쇄 가변 영역에 대해, 위치 53에서 아미노산은 Tyr (Y)에서 Lys (K)로 돌연변이되고; 인간화된 13C5의 중쇄 가변 영역에 대해, 위치 28에서 아미노산은 Thr (T)에서 Ile (I)로 돌연변이되고, 위치 30에서 아미노산은 Ser (S)에서 Arg (R)로 돌연변이되고, 위치 49에서 아미노산은 Ser (S)에서 Ala (A)로 돌연변이되고, 위치 94에서 아미노산은 Tyr (Y)에서 Asp (D)로 돌연변이된다. 인간화된 5G11의 VH 및 VL의 아미노산 서열들은 서열 번호들: 42 및 44, 각각으로서 제공되고; 인간화된 5G11의 VH 및 VL을 암호화하는 DNA 서열들은 서열 번호들: 41 및 43, 각각으로서 제공된다. 인간화된 13C5의 VH 및 VL의 아미노산 서열들은 서열 번호들: 46 및 48, 각각으로서 제공된다); 인간화된 13C5의 VH 및 VL을 암호화하는 DNA 서열들은 서열 번호들: 45 및 47, 각각으로서 제공된다.
인간화된 항체들 5G11 및 13C5에 대한 완전 경쇄의 아미노산 서열들은 서열 번호들: 74 및 80, 각각으로서 제공된다. 전장 인간화된 5G11 및 13C5를 암호화하는 DNA 서열들은 서열 번호들: 73 및 79, 각각으로서 제공된다. 인간화된 5G11 및 13C5 항체들의 IgG1 및 IgG4 버전이 생산되었다. IgG1 불변 영역은 D265A 돌연변이를 수행한 한편 (Clynes R, 등, Nature Medicine 6:443-446 (2000)), IgG4 불변 영역은 F234A 및 L235A 이중 돌연변이를 갖는다 (Xu D, 등, Cellular Immunology 200:16-26 (2000)). 인간화된 항체 5G11-hIgG1의 전장 IgG1 중쇄에 대한 DNA 및 아미노산 서열들은 서열 번호들: 69 및 70, 각각으로서 제공된다. 인간화된 항체 5G11-hIgG4의 전장 IgG4 중쇄에 대한 DNA 및 아미노산 서열들은 서열 번호들: 71 및 72, 각각으로서 제공된다. 인간화된 항체 13C5-hIgG1의 전장 IgG1 중쇄에 대한 DNA 및 아미노산 서열들은 서열 번호:75 및 76, 각각들로서 제공된다. 인간화된 항체 13C5-hIgG4의 전장 IgG4 중쇄에 대한 DNA 및 아미노산 서열들은 서열 번호들: 77 및 78, 각각으로서 제공된다.
인간화된 5G11 및 13C5 항체의 구성 및 발현
인간화된 5G11 및 13C5 항체 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA는 합성되고 발현 벡터 pcDNA3.1으로 클로닝되었다 (Invitrogen, CAT:#V-790). 자유형 293 세포들 (106/mL에서 200 mL)은 인간화된 중쇄 및 경쇄 발현 플라스미드들 각각의 100μg으로 형질 감염시키고 6일 동안 배양하였다. 이어서, 상등액 내의 인간화된 항체는 단백질-G 컬럼 (GE healthcare)으로 정제하였다.
PD-L1과 PD-L1 항체들 사이의 결합 동역학은 Biacore 분석에 의해 측정되었고, 이는 Biacore 분석은 Biacore3000 기기 상에서 25 ℃에서 수행되었고 1 Hz의 데이터 수집 속도로 기록되었다. 다클론 토끼 항-마우스 IgG (GE, BR-1008-38)는 10 mM pH 5.0 아세트산 나트륨으로 희석하고, 아민 커플링 키트 (GE, BR10050)를 사용하여 약 15000RU까지 CM5 바이오센서 칩의 기준 및 실험 유동 세포들 상으로 고정되었다. 각각의 사이클의 시작 시에, 희석된 시험 항체 (1.5 μg/mL)를 캡쳐되도록 1분 동안 실험 유동 세포 위에 주입하였다. PD-L1 분석물 시리즈는 실행 완충액으로 100nM까지 이어서 동일한 완충액에서 2X 연속 희석에 의해 0.78nM까지 희석함으로써 제조하였다. 분석물들은 참조 및 실험 유동 세포들 상으로 3분 동안 30 μL/분의 유동 속도로 직렬로 주입되었다. 실행 완충액 (0.05% P20을 갖는 PBS)은 10분 동안 30 μL/분의 유동 속도로 흘러 넘치게 하였다. 각각의 사이클의 말기에, 바이오센서 표면은 10 mM pH1.7 글리신-HCl 완충액을 10 μL/분의 유동 속도로 3분 주입하여 재생되었다. 각각의 분석물 시료 주입 (즉, 각각의 사이클)을 위해, 실험 바이오센서 표면으로부터 수득된 결합 반응들은 기준 표면으로부터 기록된 반응들을 동시에 감산하고, 이어서 단일 참조된 실행 완충액 샘플로부터 반응들을 추가로 감산함으로써 이중 참조되었다. 결합 및 해리 속도 상수 (ka 및 kd)는 Biaevaluation 4.0 소프트웨어를 사용하여 Langmuir 모델 (1:1)에 전체 적정 계열의 이중-참조된 센서 그램을 맞춤으로써 동시에 결정되었다. 해리 상수, KD는 관계식 KD = kd/ka에 의해 결정된 속도 상수로부터 계산되었다. 항-PD-L1 항체들의 인간 PD-L1 및 사이노몰거스 PD-L1 (cyno-PD-L1)과의 결합 친화도는 표 4에 요약되었다.
표 4. 항-PD-L1 항체들의 PD-L1 결합 친화도
Figure pct00010
실시예 3: 항-PD-L1 항체들의 ELISA 계 결합 분석
ELISA 결합 분석은 인간 PD-L1-mFc (키메라 및 인간화된 항체 검출을 위해) 및 PD-L1-hFc 단백질 (하이브리도마 항체 검출을 위해)에 기초하여 수행하였다. 96-웰 플레이트 (Costar, Cat No: 9018)은 코팅 완충액 PBS (Hyclone, Cat No: SH30256.01B) 중의 2 μg/ml PD-L1-mFc (Crownbio) 100 μL로 4 ℃에서 철야 코팅하였다. 웰들을 흡인하고, 비-특이적 결합 부위들은 200 μL의 차단 완충액 (1% (w/v)의 소 혈청 알부민 (BSA, Roche, Cat No: 738328)을 갖는 PBS) 첨가하고 37 ℃에서 1시간 동안 항온 배양함으로써 차단하였다. 플레이트를 세척 완충액 (0.05% (v/v) Tween20 (Sigma, Cat No: P1379)을 갖는 PBS)으로 3회 세척한 후, 차단 완충액 (20 μg/mL에서 출발) 중의 하이브리도마 (도 1), 키메라 (도 2), 또는 인간화된 (도 3) 항-PD-L1 항체들의 1:10 연속 희석액의 100 μL/웰을 첨가하고 실온에서 1시간 동안 항온 배양하였다. 플레이트들을 세척하고 염소 항-마우스 IgG (H+L)의 100 μL/웰로 (Thermo, Cat No: 31432) 차단 완충액 중에서 60분 동안 항온 배양하였다. 플레이트들을 세척한 후, 기질 용액 TMB의 100 μL/웰 (eBioscience, Cat No: 00-4201-56)을 첨가하고 플레이트들을 실온에서 2분 동안 항온 배양하였다. 100 μL/웰의 정지 용액 (2N H2SO4)은 반응을 정지시키기 위해 첨가하였다. 비색계 신호들이 발달되고 450 nm에서 Auto Plate SpectraMax Plus를 사용하여 판독되었다 (공급 업체: Moleculer Devices; 모델: MNR0643; 소프트웨어: SoftMax Pro v5.4). 데이터는 GraphPad Prism 5를 사용하여 분석하였고 EC50을 계산하였다 (도 1-3; 표 5-7). 이들 데이터는 항-PD-L1 항체들 (하이브리도마, 키메라, 및 인간화된)이 ELISA에 의해 측정된 바와 같이, PD-L1에 결합하는 것을 입증하였다.
표 5. PD-L1과 항-PD-L1 하이브리도마 단일 클론 항체의 ELISA 계 결합 EC50
Figure pct00011
표 6. PD-L1과 항-PD-L1 키메라 항체의 ELISA 계 결합 EC50
Figure pct00012
표 7. PD-L1과 인간화된 항-PD-L1 항체의 ELISA 계 결합 EC50
Figure pct00013
ELISA 계 리간드 차단 분석은 인간 PD-1-hFc에 대한 비오티닐화된 인간 PD-L1-mFc의 결합을 차단하는 것을 통해 수행하였다. PD-1-hFc 항원 (Crownbio)을 PBS 완충액 (2ug/ml, 100ul/웰)에 현탁시키고 96 웰 플레이트 상에 코팅하였다 (Costar, Cat No: 9018) 4℃ 철야. 웰들을 흡인하고, 비-특이적 결합 부위들은 200 μL의 차단 완충액 (1% (w/v)의 소 혈청 알부민 (BSA, Roche, Cat No: 738328)을 갖는 PBS) 첨가하고 37 ℃에서 1시간 동안 항온 배양함으로써 차단하였다. 플레이트를 세척 완충액 (0.05% (v/v) Tween20 (Sigma, Cat No: P1379)을 갖는 PBS)으로 3회 세척한 후, 차단 완충액 (20 μg/mL에서 출발) 중의 하이브리도마 (도 4), 키메라 (도 5), 또는 인간화된 (도 6) 항-PD-L1 항체들의 100 μL/웰의 1:3 연속 희석액을 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 항온 배양하였다. 100 μl PDL-1-mFc-비오틴 (0.1μg/ml)을 다음으로 각각의 웰에 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 항온 배양하였다. 플레이트를 3회 세척한 후, 2차 항체 (Avidin HRP eBioscience cat No.:E07418-1632, 1:500, 100 μl/웰)을 첨가하고 37 ℃에서 0.5시간 동안 항온 배양하였다. 플레이트를 세척한 후, 100 μL/웰의 기질 용액 TMB (eBioscience, Cat No: 00-4201-56)을 첨가하고, 플레이트를 실온에서 3분 동안 항온 배양하였다. 100 μL/웰의 정지 용액 (2N H2SO4)은 반응을 정지시키기 위해 첨가하였다. 비색계 신호들이 발달되고 450 nm에서 Auto Plate SpectraMax Plus를 사용하여 판독되었다 (공급 업체: Moleculer Devices; 모델: MNR0643; 소프트웨어: SoftMax Pro v5.4). 데이터는 GraphPad Prism 5를 사용하여 분석하였고 IC50을 계산하였다 (도 4-6; 표 8-10). 이들 데이터는 항-PD-L1 항체들 (하이브리도마, 키메라, 및 인간화된)이 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 세포 표면 상의 PD-L1과 PD-1의 결합을 차단하는 것을 입증하였다.
표 8. 고체 표면 상의 PD-L1과 PD-1 결합을 억제하는 항-PD-L1 하이브리도마 단일 클론 항체의 IC50
Figure pct00014
표 9. 고체 표면 상의 PD-L1과 PD-1 결합을 억제하는 항-PD-L1 키메라 항체의 IC50
Figure pct00015
표 10. 고체 표면상의 PD-L1과 PD-1 결합을 억제하는 인간화된 항-PD-L1 항체의 IC50
Figure pct00016
실시예 4: 항-PD-L1 항체들의 세포-계 결합 분석
항-PD-L1 항체들의 세포 결합 분석은 PD-L1 (PD-L1-293T)을 안정하게 발현하는 293T 세포주에 대한 결합에 기초하여 수행되었다. 2x105 293T-PD-L1 세포들이 96-웰 배양 플레이트들의 각각의 웰에 첨가되었고, 표시된 항체 (1:5의 희석액으로 20μg/ml)와 함께 4 ℃에서 1시간 동안 항온 배양되었다. 세포들을 FACS 완충액으로 3회 세척한 후, 2차 항체 (PE 염소 항-마우스: 1:200; PE 마우스 항-인간: 1:10)을 세포들에 100μl/웰로 첨가하고, 4 ℃에서 40분 동안 항온 배양하였다. 세포들을 FACS 완충액으로 3회 세척하였고, FACS 배열에 의해 분석하였다. 하이브리도마 항체들의 결합은 도 7a 및 7b에 나타낸다. 키메라 항체들의 결합은 도 8에 나타낸다. 인간화된 항체들의 결합은 도 9에 나타낸다. 하이브리도마, 키메라, 및 인간화된 항체들에 대해 계산된 EC50은 하기 표 11, 12, 및 13, 각각에 나타낸다. 이들 데이터는 항-PD-L1 항체들 (하이브리도마, 키메라, 및 인간화된)이 FACS 분석에 의해 측정된 바와 같이 PD-L1에 결합하는 것을 입증하였다.
표 11. 세포 표면 상의 PD-L1에 의한 항-PD-L1 하이브리도마 단일 클론 항체의 EC50
Figure pct00017
표 12. 세포 표면 상의 PD-L1에 의한 항-PD-L1 키메라 항체의 EC50
Figure pct00018
표 13. 세포 표면 상의 PD-L1에 의한 인간화된 항-PD-L1 항체의 EC50
Figure pct00019
세포 표면 상의 PD-L1에 대한 PD-1 결합에 대한 항-PD-L1 항체의 효과가 또한 조사되었다. 간략하게, PD-L1-293T 세포들은 FACS 완충액 (3% 소 태아 혈청을 갖는 PBS)에 현탁되었다. 다양한 농도의 하이브리도마 (도 10), 키메라 (도 11), 또는 인간화된 (도 12) 항-PD-L1 항체들을 세포 현탁액에 첨가하고 4 ℃에서 60분 동안 96 웰 플레이트에서 항온 배양하였다. 이어서, 비오틴-표지된 PD-L1 단백질을 웰에 첨가하고 4 ℃에서 60분 동안 항온 배양하였다. 세포들을 PBS로 3회 세척하고, 마우스 항-비오틴 PE (Biolegend, cat# 409004)로 항온 배양하였다. 세포-연관된 형광 은 다음으로 FACS 배열을 사용하여 유량 세포 계측법 분석에 의해 검출되었다. PD-L1-293T에 의한 PD-1 결합에 대한 항-PD-L1 항체들의 효과는 염색의 평균 형광 강도 (MFI)로 측정하였다. 항-PD-L1 하이브리도마 항체들에 의한 PD-1 결합의 저해는 도 10a 및 10b에 나타낸다. 항-PD-L1 키메라 항체들에 의한 PD-1 결합의 저해는 도 11에 나타낸다. 항-PD-L1 인간화된 항체들에 의한 PD-1 결합의 저해는 도 12에 나타낸다. 하이브리도마 (표 14), 키메라 (표 15), 및 인간화된 (표 16) 항체들에 대해 계산된 IC50은 하기 표에 나타낸다. 이들 데이터는 항-PD-L1 항체들 (하이브리도마, 키메라, 및 인간화됨)이 FACS 분석에 의해 측정 된 바와 같이, 세포 표면 상의 PD-L1에 의한 PD-1의 결합을 차단할 수 있음을 입증했다.
표 14. 세포 표면 상의 PD-L1에 의한 PD-1 결합을 억제하는 항-PD-L1 하이브리도마 단일 클론 항체의 IC50
Figure pct00020
표 15. 세포 표면 상의 PD-L1에 의한 PD-1 결합을 억제하는 항-PD-L1 키메라 항체의 IC50
Figure pct00021
표 16. 세포 표면 상의 PD-L1에 의한 PD-1 결합을 억제하는 인간화된 항-PD-L1 항체의 IC50
Figure pct00022
실시예 5: 혼합된 림프구 반응에서 T 세포 활성화에 대한 항 PD-L1 항체들의 효과
혼합된 림프구 반응은 림프구 효과기 세포들에서 PD-L1/PD-1 경로를 차단하는데 있어서 쥣과 (도 13a, 13b), 키메라 (도 14a, 14b), 또는 인간화된 (도 15a, 15b) 항-PD-L1 항체들의 효과를 나타내기 위해 사용하였다. 분석에서 T 세포들은 인간화된 항-PD-L1 항체의 존재 또는 부재 하에 IFN-γ 및 IL-2 분비에 대해 시험하였다.
인간 CD4+ T-세포들은 인간 PBMC로부터 CD4+ 음성 선택 격리 키트 (Mitenyi Biotech, cat# 130-091-155)를 사용하여 정제하였다. 미성숙한 수지상 세포들 (DC)은 인간 PBMC로부터 단리된 단핵구들로부터 Mo-DC Generation Toolbox (Miltenyi, cat#130-093-568)를 사용하여 유래되었다. 세포들은 Mo-DC 분화 배지로 7일 동안 배양하였고, 이후에 Mo-Dc 성숙 배지로 2일 동안 성숙한 DC가 되도록 유도하였다. MLR을 설정하기 위해, 각각의 반응에 대해, 105 정제된 T-세포들 및 104 동종 이형 성숙 DC 세포들이 총 200 μl의 부피로 첨가되었다. 시험 항체는 도s 13a, 13b, 14a, 14b, 15a, 및 15b에 나타낸 바와 같이 상이한 농도로 분석하였다 (즉,20μg/mL, 2μg/mL, 0.2 μg/mL, 0.02 μg/mL, 및 0.002 μg/mL). 항체가 없거나 이소타입 대조군 항체가 음성 대조군으로서 사용되었다. 세포들은 5일 동안 37 ℃에서 배양하였다. 6 일째에, 배양 배지에서 IFN-γ 및 IL-2의 수준은 IL-2 ELISA kit (eBioscience) 및 hIFN-γ ELISA 키트 (R&D, cat#DY285)를 사용하여 측정하였다. 결과는 IL-2 분비에 대해 도 13a, 14a, 및 15a에 및 IFN-γ 분비에 대해 도 13b, 14b, 및 15b에 나타낸다. 연구 결과는 하이브리도마, 키메라, 및 인간화된 항-PD-L1 항체들이 T-세포 IFN-γ 및 IL-2 분비를 농도 의존 방식으로 촉진하였음을 나타냈다. 대조적으로, 이소타입 대조군 항체를 함유하는 배양물은 IFN-γ 및 IL-2 분비의 증가를 나타내지 않았다.
실시예 6: T 조절 세포들의 기능에 대한 항-PD-L1 항체의 효과
T 조절 세포들 (CD4+, CD25+)은 면역 반응을 억제하는 림프구들이다. MLR에서 T 효과기 세포들의 사이토카인 분비에 대한 T 조절 세포들의 효과는 키메라 또는 인간화된 항-PD-L1 항체들의 존재 또는 부재 하에서 시험하였다. T 조절 세포들 (CD4+ CD25+)은 PBMC로부터 조절 T 세포 격리 키트 (Miltenyi Biotec, cat#130-091-301)를 사용하여 정제하였다. 미성숙한 수지상 세포들 (DC)은 인간 PBMC로부터 단리된 단핵구들로부터 Mo-DC Generation Toolbox (Miltenyi, cat#130-093-568)를 사용하여 유래되었다. 세포들은 Mo-DC 분화 배지로 7일 동안 배양하였고, 이후에 Mo-Dc 성숙 배지로 2일 동안 성숙한 DC가 되도록 유도하였다. T 조절 세포들은 정제된 CD4+ CD25- T 세포들 및 동종 이형 수지상 세포들을 함유하는 혼합 림프구 반응 내로 CD4+ CD25- 대 T 조절 세포들의 4:1 비율로 첨가되었다. 예를 들면:반응에는 1x10^5세포들/웰의 CD4+CD25- 세포들, 1x10^4세포들/웰의 mDC, 및 0.25x10^5세포들/웰의 CD4+CD25+ 세포들이 첨가되었다. 항체를 각각의 반응에 10 μg/ml의 농도로 첨가하였다. 항체가 없거나 이소타입 대조군 항체가 음성 대조군으로서 사용되었다. 세포들은 5일 동안 37 ℃에서 배양하였다. 5 일째에, 50 μl 배지를 취하여 IL-2 및 IFN- γ 농도를 검출하였다. 각각의 웰을 50μl 배양 배지로 보충한 후, CTG (Promega, G7573)에 의한 세포 증식을 분석하기 전에 세포들을 또 다른 2 일간 배양하였다. 배양 배지에서 IFN-γ 및 IL-2의 수준은 hIFN-γ ELISA 키트 (R&D, cat#DY285) 및 IL-2 ELISA 키트 (eBioscience)를 사용하여 측정하였다. 도 16에 나타낸 바와 같이, 키메라 및 인간화된 항-PD-L1 항체들, ch-13C5-hIgG1, ch-13C5-hIgG4, hu-13C5-IgG1, hu-13C5-IgG4, ch-5G11-IgG1, ch-5G11-IgG4, hu-5G11-IgG1, 및 hu-5G11-IgG4는 CD4+CD25- T 효과기 세포들에 의한 IFN-γ의 분비에 대한 Treg 세포들의 억제 효과를 감소시킬 수 있고, 이는 항-PD-L1 항체들이 T 조절 세포들의 면역 억제 기능을 조절할 수 있음을 시사한다.
실시예 7: 자가 유래 T 세포 활성화에 대한 인간화된 항-PD-L1 항체의 효과
이 실시예에서, T 세포 활성화에 대한 항-PD-L1 항체에 의한 PD-1/PD-L1 경로 차단 효과를 조사하였다. 정제된 인간 CD4+ T 세포들 (Mitenyi Biotech, cat# 130-091-155)은 자가 유래 단핵구-유도 수지상 세포들 (DCs)의 존재 하에 1μg/ml 가용성 항-CD3 항체 (R&D, cat#MAB100)에 의해 활성화되었다. 적정된 항-PD-L1 항체의 존재 또는 부재 하에 3 일간 활성화시킨 후, 배양 배지를 수확하고 IFNγ의 농도를 ELISA로 측정하였다. 결과는 도 17에 나타내고 인간화된 항-PD-L1 항체들에 의한 의한 PD-L1 차단은 T 세포들에 의한 IFN-γ 분비를 증가시킨다는 것을 시사한다.
실시예 8: 파상풍 톡소이드 챌린지에 대한 인간 리콜 T 세포 반응은 인간화된 항-PD-L1 항체에 의해 강화된다
항원-특이적 T 세포 수용체 유발이 PD-1/PD-L1 경로를 항-PD-L1 항체들로 차단함으로써 조절되는지 여부를 조사하기 위해, 인간 T-세포 리콜 분석은 파상풍 톡소이드 (TT) 항원을 사용하여 건강한 TT 면역있는 공여자들의 혈액에 미리-존재하는 기억 T 세포들을 자극하기 위해 사용되었다. 이를 위해, 최근에 [<1 년] TT 면역있는 공여자들로부터 신선한 PBMC를 RPMI1640 (Invitrogen, cat# A10491-01)을 사용하여 4 x 10^5 세포들/웰로 96-웰 둥근 바닥 플레이트 (costar, cat#3799) 내로 플레이팅하고, 80 U/ml 페니실린, 80 g/ml 스트렙토마이신 및 30% 자가 유래 혈청으로 보충하고, 인간화된 5G11또는 13C5를 다양한 농도로 첨가하고, 0.1ug/ml SEB 및 1μg/ml TT (Astarte Biologies)로 자극하였다. 37 ℃, 5% CO2에서 7일간 공-배양 후, 상등액을 수확하고 IFN-γ의 농도를 측정하였다. 도 18a 및 18b는 두 명의 개별 공여자로부터 PBMC를 사용하는 분석 결과를 제공한다. 연구의 결과는 TT 항원 단독에 비해 항-PD-L1 항체에 의한 PD-L1 차단이 기억 T 세포들에 의한 증진된 IFN-γ 분비를 초래하였음을 입증한다.
요약하면, 인간화된 5G11 및 13C5 항체는 인간화 과정 중에 그들의 부모 항체들의 기능적 활성을 유지하였다.
<110> CB THERAPEUTICS, INC. <120> ANTI PD-L1 ANTIBODIES <130> 2017-FPA-7948 <150> PCT/CN2014/083715 <151> 2014-08-05 <160> 156 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 348 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 1 gaggtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cattttcaga agctatggca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccagagaaga ggctggagtg ggtcgcatcc attagtagtg gtggtagcac ctactatcca 180 gacagtgtga agggccgatt caccatctcc agagataatg ccaggaacat cttgtacctg 240 caaatgagca gtctgaggtc tgaggacacg gccatgtatg actgtgcaag aggctatgat 300 tcggggtttg cttattgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgaa 348 <210> 2 <211> 116 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 2 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Arg Ser Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Asp Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Tyr Asp Ser Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Glu 115 <210> 3 <211> 336 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 3 gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgttt ctctggggca gagggccacc 60 atctcatgca gggccagcca aagtgtcagt acttctagct ctagttttat gcactggtac 120 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatcaagt atgcatccaa cctagaatct 180 ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 cctgtggagg aggaggatac tgcaacatat tactgtcagc acagttggga gattccgtac 300 acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaacgg 336 <210> 4 <211> 112 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 4 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Ser Ser Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp 85 90 95 Glu Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 5 <211> 348 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 5 gaagtaaagt tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcaga agctatggca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccagagaaga ggctggagtg ggtcgcatcc attagtagtg gtggtaccac ctactatcca 180 gacagtgtga agggccgatt catcatctcc agagataatg ccaggaacat cctgtacctg 240 caaatgagca gtctgaggtc tgaggacacg gccatgtatt attgtgcaaa aggctatgat 300 tcggggtttg cttactgggg ccaagggact ctggtcattg tctctgca 348 <210> 6 <211> 116 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 6 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Gly Tyr Asp Ser Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Ile Val Ser Ala 115 <210> 7 <211> 333 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 7 gacattgtgc tgacacagtc tcctccttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60 atctcatgca gggccagcca aagtgtcagt acatctagtt ctagttatat gcactggtac 120 caacagaaac caggacagcc tcccaaactc ctcatcaagt atgcatccaa cctagaatct 180 ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 cctgtggagg aggaggatac tgcaacatat tactgtcagc acagttggga gattccgtac 300 acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa 333 <210> 8 <211> 111 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 8 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Ser Ser Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp 85 90 95 Glu Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 9 <211> 348 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 9 caggtgcagc tgaagcagtc aggacctggc ctagtgcagc cctcacagag cctgtccatc 60 acctgcacag tctctggttt ctcattaact acctatggtg tacactgggt tcgccagtct 120 ccaggaaagg gtctggaatg gctgggagtg atatggcgtg gtgtaaccac agactataat 180 gcagctttca tgtccagact gaccatcacc aaggacaatt ccaagagcca agttttcttt 240 aaaatgaaca gtctgcaagc taatgacaca gccatatatt actgtgccag actgggtttc 300 tatgctatgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctca 348 <210> 10 <211> 116 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 10 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Arg Gly Val Thr Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Leu Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 11 <211> 324 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 11 agtattgtga tgacccagac tcccaaattc ctgcttgtat cagcaggaga cagggttacc 60 ataacctgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtag cttggtacca gcagaagcca 120 gggcagtctc ctaaactgct gatatattat gcagccaatc gctacactgg agtccctgat 180 cgcttcactg gcagtggata tgggacggat ttcactttca ccatcagcat tgtgcaggct 240 gaagacctgg cagtttattt ctgtcagcag gattatacct ctccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggaaataaa acgg 324 <210> 12 <211> 107 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 12 Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 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Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Val Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Leu Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 15 <211> 321 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 15 agtattgtga tgacccagac tcccaaattc ctacttgtat cagcaggaga cagggttacc 60 ataacctgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtag gttggtacca acagaagcca 120 gggcagtctc ctaaactact gatatactat gcatccaatc gctactctgg agtccctgat 180 cgcttcactg gcagtggata tgggacggat ttcactttca ccatcagcac tgtgcaggct 240 gaagacctgg cagtttattt ctgtcaacaa gattatacct ctccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggaaataaa a 321 <210> 16 <211> 107 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 16 Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Thr Ser Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 17 <211> 357 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 17 gaggtgaagc tgttcgagtc tggaggtggc ctggtgcagc ctggaggatc cctgaaactc 60 tcctgtgtag cctcaggatt cgattttagt acatactgga tgcattgggt ccggcaggct 120 ccagggcaag ggctagaatg gattggacaa attaatccag atagcactac gataaactat 180 gcgccatctc taaaggatag attcatcatc tccagagaca acgccaaaaa tacgctgttc 240 ctgcaaatga gcaaagtgag atctgaggac actgcccttt attactgtgc aaaacccggg 300 gactatggtt acgactttga ctgctggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca 357 <210> 18 <211> 119 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 18 Glu Val Lys Leu Phe Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gln Ile Asn Pro Asp Ser Thr Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Gly Asp Tyr Gly Tyr Asp Phe Asp Cys Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 19 <211> 339 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 19 gatgttttga tgacccaaac tccactctac ctgcctgtca gtcttggaga tcaggcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gatcattgta catagtaatg caaacaccta tttagaatgg 120 ttcctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttccg 300 tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaacgg 339 <210> 20 <211> 112 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 20 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Tyr Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ile Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Ala Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 21 <211> 357 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 21 gaggtgcagc ttcaggagtc aggacctagc ctcgtgaaac cttctcagac tctgtccctc 60 acctgttctg tcactggcga ctccatcacc agtggttact ggaactggat ccggaaattc 120 ccagggaata aacttgagta catggggtac ataagctaca gtggtagcac ttactacaat 180 ccatctctca aaagtcgaat ctccatcact cgagacacat ccaagaacca gtactacctg 240 cagttgaatt ctgtgactac tgaggacaca gccacatatt actgtgcaag aagtctacta 300 tggttctcta cggggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357 <210> 22 <211> 119 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 22 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ser Leu Leu Trp Phe Ser Thr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 23 <211> 324 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 23 caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctcctgggga gaaggtcacc 60 ttgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tccagctact tgtactggaa ccagcagaag 120 ccaggatcct cccccaaagt ctggatttat aacacatcca acctggcttc tggagtccct 180 gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag 240 gctgaagatg ctgcctctta tttctgccat cagtggagaa gttacccacc cacgctcggt 300 gctgggacca agctggagct gaaa 324 <210> 24 <211> 108 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 24 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Tyr Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Val Trp 35 40 45 Ile Tyr Asn Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Ser Tyr Phe Cys His Gln Trp Arg Ser Tyr Pro 85 90 95 Pro Thr Leu Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 25 <211> 348 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 25 caggtgcagc tgaagcagtc aggacctggc ctagtgcagc cctcacagag cctgtccatc 60 acctgcacag tctctggttt ctcattaact agctatggtg tacactgggt tcgccagtct 120 ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagtg atatggagtg gtggaatcac agactataat 180 gcagctttca aatccagact gagcatcagc aaggacaatt ccaagagcca agttttcttt 240 aagatgaaca gtctgcaagc taatgacaca gccatatatt tctgtgccag actgggtttt 300 tatgctatgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctca 348 <210> 26 <211> 116 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 26 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Leu Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 27 <211> 318 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 27 caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60 atgacctgca gtgccaactc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc 120 acttccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat gggggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtaacc catggacgtt cggtggaggc 300 accaagctgg aaatcaaa 318 <210> 28 <211> 106 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 28 Gln Ile Val Leu Thr Gln 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Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Ala Arg Gln Ile Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Leu Gly Ser Val Gln 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Tyr Asp Ala Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Ser Val Ser Glu 115 <210> 31 <211> 333 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 31 gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60 atctcatgca gggccagcca aagtgtcagt acatctagct atagttatat gcactggtac 120 caacagaaac caggacagcc tcccaaactc ctcatcaagt atgcatccaa cctagaatct 180 ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 cctgtggagg aggaggatac tgcaacatat tactgtcaga acagttggga gattccgtac 300 acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa 333 <210> 32 <211> 111 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 32 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Ser Trp 85 90 95 Glu Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 33 <211> 351 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 33 gaggtgcagc ttcaggagtc aggacctagc ctcgtcaaac cttctcagac tctgtccctc 60 acctgttctg tcactggcga ctccatcacc agtggttact ggacctggat ccggaaattc 120 ccagggaata aacttgaata catgggatac ataagctaca ctggtagcac ttactacaat 180 ccatctctca aaagtcgaat ctccatctct cgagacacat ccaagagcca gtactacctg 240 cagttgaatt ctgtgactac tgaggacaca gccacatatt actgtgcaag acagagggat 300 tggttagggt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351 <210> 34 <211> 117 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 34 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Ile Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Tyr Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gln Arg Asp Trp Leu Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 35 <211> 339 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 35 gatattgtga tgacacagac tccatcctcc ctagctgtgt cacttggaga gaaggttact 60 atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtagca atcaaaagaa ctccttggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg acagtctcct aaactgctga tttactgggc atccaatagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtagctctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttatagctat 300 ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaa 339 <210> 36 <211> 113 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 36 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Gln Lys Asn Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Asn Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Ser Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys <210> 37 <211> 348 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 37 gaagagaagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cagtttcagt agttatggca tgtcttgggt tcgtcagact 120 ccagagaaga ggctggagtg ggtcgcatcc atcagtagtg gtggtagtat ctactatcca 180 gacagtgtga agggccgatt caccatctcc agagataatg ccaggaacat cctgtacctg 240 caaatgagca gtctgaggtc tgaggacacg gccatgtatt attgtgcaag 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cctgtggagg aggaggatac tgcaacatat tactgtcagc acagttggga gattccgtac 300 acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa 333 <210> 40 <211> 111 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 40 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Ser Tyr Ser Tyr Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp 85 90 95 Glu Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 41 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized 5G11 antibody heavy chain variable region sequence <400> 41 cagatcacac tgaaagaaag cggccctacc ctggtcaagc caactcagac cctgacactg 60 acttgcaccg tgtctgggtt ctctctgagt acatacggag tccactggat caggcagccc 120 cctggcaaag ctctggagtg gctgggagtg atttggcggg 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caactaatga gattttctac tgcactttta ggagattaga tcctgaggaa 600 aaccatacag ctgaattggt catcccagaa ctacctctgg cacatcctcc aaatgaaagg 660 catcatcacc accatcacta a 681 <210> 144 <211> 226 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 144 Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser 1 5 10 15 Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu 20 25 30 Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln 35 40 45 Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg 50 55 60 Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala 65 70 75 80 Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys 85 90 95 Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val 100 105 110 Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro 115 120 125 Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys 130 135 140 Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys 145 150 155 160 Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg 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atgtgaccag cacactgaga 540 atcaacacaa caactaatga gattttctac tgcactttta ggagattaga tcctgaggaa 600 aaccatacag ctgaattggt catcccagaa ctacctctgg cacatcctcc aaatgaaagg 660 ggtaccagat ctagaggctg caaaccctgt atctgcacag tgcccgaggt gagctccgtg 720 ttcatctttc cccccaagcc caaggacgtg ctgaccatca cactcacacc caaggtcacc 780 tgcgtggtcg tggacatctc caaggacgac cccgaagtcc agttcagctg gttcgtggac 840 gacgtggagg tgcacaccgc tcagacccaa cccagagagg agcagtttaa ctccaccttc 900 aggtccgtgt ccgagctccc catcatgcac caggactggc tgaatggcaa ggagttcaag 960 tgcagggtga actccgctgc tttccccgcc cccattgaga agaccatctc caagaccaag 1020 ggaaggccca aggcccccca ggtgtacacc attccccctc ccaaggagca gatggccaag 1080 gacaaggtgt ccctgacctg tatgatcacc gacttctttc ccgaggacat caccgtcgaa 1140 tggcagtgga acggccagcc cgccgagaac tataagaaca cccaacccat catggacacc 1200 gacggcagct acttcgtgta tagcaagctc aacgtgcaga agagcaactg ggaagccgga 1260 aataccttca cctgctccgt cctgcacgag ggcctgcaca accaccatac cgaaaagagc 1320 ctgagccaca gccccggaaa gtaa 1344 <210> 146 <211> 447 <212> 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tcctgaggaa 600 aaccatacag ctgaattggt catcccagaa ctacctctgg cacatcctcc aaatgaaagg 660 ggtaccagat ctagagagcc caaatcttct gacaaaactc acacatgccc accgtgccca 720 gcacctgaat tcgagggtgc accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 780 ctcatgatct cccggactcc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtaag ccacgaagac 840 cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 900 ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 960 caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccaacc 1020 cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 1080 ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 1140 ggcttctatc caagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1200 tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 1260 accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1320 gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa atga 1374 <210> 148 <211> 457 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human 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aaccatacag ctgaattggt catcccagaa ctacctctgg cgcttcctcc aaatgaaagg 660 catcatcacc accatcacta a 681 <210> 150 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyno-PD-L1-HisTag <400> 150 Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser 1 5 10 15 Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu 20 25 30 Thr Ser Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln 35 40 45 Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Asn Tyr Arg 50 55 60 Gln Arg Ala Gln Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala 65 70 75 80 Leu Arg Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys 85 90 95 Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val 100 105 110 Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro 115 120 125 Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys 130 135 140 Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys 145 150 155 160 Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Leu Asn 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aaaccatctc caaagccaaa 840 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 900 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc caagcgacat cgccgtggag 960 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1020 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1080 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1140 ctctccctgt ctccgggtaa atga 1164 <210> 156 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human PD-1-hFc sequence <400> 156 Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr 1 5 10 15 Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe 20 25 30 Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr 35 40 45 Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu 50 55 60 Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu 65 70 75 80 Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn 85 90 95 Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala 100 105 110 Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg 115 120 125 Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly 130 135 140 Gln Phe Gln Thr Leu Val Gly Thr Arg Ser Arg Glu Pro Lys Ser Ser 145 150 155 160 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly 165 170 175 Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 180 185 190 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 195 200 205 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 210 215 220

Claims (46)

  1. PD-L1에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 단편으로서, 상기 항체 또는 그의 단편은 서열 번호들: 81, 87, 93, 99, 105, 111, 117, 123, 129, 및 135로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 중쇄 CDR1 서열을 포함하고; 서열 번호들: 82, 88, 94, 100, 106, 112, 118, 124, 130, 및 136로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 중쇄 CDR2을 포함하며; 서열 번호들: 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 및 137 로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 중쇄 CDR3 서열을 포함하고; 서열 번호들: 84, 90, 96, 102, 108, 114, 120, 126, 132, 및 138로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 경쇄 CDR1 서열을 포함하며; 서열 번호들: 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127, 133, 및 139로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 경쇄 CDR2 서열을 포함하고; 그리고 서열 번호들: 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128, 134, 및 140로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 PD-L1에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 단편.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 단편은 서열 번호들: 81, 87, 93, 99, 105, 111, 117, 123, 129, 및 135로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 CDR1을 포함하고; 서열 번호들: 82, 88, 94, 100, 106, 112, 118, 124, 130, 및 136로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 CDR2를 포함하며; 서열 번호들: 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 및 137로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 CDR3을 포함하고; 서열 번호들: 84, 90, 96, 102, 108, 114, 120, 126, 132, 및 138로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 CDR1을 포함하며; 서열 번호들: 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127, 133, 및 139로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 CDR2를 포함하며; 그리고 서열 번호들: 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128, 134, 및 140로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 CDR3을 포함하는, 항체 또는 그의 단편.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 단편은 서열 번호들: 81, 82, 및 83, 각각에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고; 그리고 서열 번호들: 84, 85, 및 86, 각각에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는, 항체 또는 그의 단편.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 단편은 서열 번호들: 87, 88, 및 89, 각각에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고; 그리고 서열 번호들: 90, 91, 및 92, 각각에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 항체 또는 그의 단편.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 단편은 서열 번호들: 93, 94, 및 95, 각각에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고; 그리고 서열 번호들: 96, 97, 및 98, 각각에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는, 항체 또는 그의 단편.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 단편은 서열 번호들: 99, 100, 및 101, 각각에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고; 그리고 서열 번호들: 102, 103, 및 104, 각각에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는, 항체 또는 그의 단편.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 단편은 서열 번호들: 105, 106, 및 107, 각각에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 및 서열 번호들: 108, 109, 110, 각각에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는, 항체 또는 그의 단편.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 단편은 서열 번호들: 111, 112, 및 113, 각각에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고; 그리고 서열 번호들: 114, 115, 및 116, 각각에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는, 항체 또는 그의 단편.
  9. 청구항 1에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 단편은 서열 번호들: 117, 118, 및 119, 각각에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고; 그리고 서열 번호들: 120, 121, 및 122, 각각에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는, 항체 또는 그의 단편.
  10. 청구항 1에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 단편은 서열 번호들: 123, 124, 및 125, 각각에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고; 그리고 서열 번호들: 126, 127, 및 128, 각각에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는, 항체 또는 그의 단편.
  11. 청구항 1에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 단편은 서열 번호들: 129, 130, 및 131, 각각에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고; 그리고 서열 번호들: 132, 133, 및 134, 각각에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는, 항체 또는 그의 단편.
  12. 청구항 1에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 단편은 서열 번호들: 135, 136, 및 137, 각각에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고; 그리고 서열 번호들: 138, 139, 및 140, 각각에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는, 항체 또는 그의 단편.
  13. 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 단편은 키메라 또는 인간화된 것인, 단리된 항체 또는 그의 단편.
  14. PD-L1에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 단편으로서, 상기 항체 또는 그의 단편은 서열 번호들: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 및 46로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고; 그리고 서열 번호들: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 및 48로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, PD-L1에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 단편.
  15. 청구항 14에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 단편은 서열 번호들: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 및 46로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고; 그리고 서열 번호들: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 및 48로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 항체 또는 그의 단편.
  16. PD-L1에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 단편으로서, 상기 항체 또는 그의 단편은 서열 번호:42에 따른 중쇄 가변 영역을 포함하고, 그리고 서열 번호:44에 따른 경쇄 가변 영역을 포함하는, PD-L1에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 단편.
  17. PD-L1에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 단편으로서, 상기 항체 또는 그의 단편은 서열 번호:46에 따른 중쇄 가변 영역을 포함하고, 그리고 서열 번호:48에 따른 경쇄 가변 영역을 포함하는, PD-L1에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 단편.
  18. PD-L1에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 단편으로서, 상기 항체 또는 그의 단편은 서열 번호:70에 따른 중쇄를 포함하고, 그리고 서열 번호:74에 따른 경쇄를 포함하는, PD-L1에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 단편.
  19. PD-L1에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 단편으로서, 상기 항체 또는 그의 단편은 서열 번호:72에 따른 중쇄를 포함하고, 그리고 서열 번호:74에 따른 경쇄를 포함하는, PD-L1에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 단편.
  20. PD-L1에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 단편으로서, 상기 항체 또는 그의 단편은 서열 번호:76에 따른 중쇄를 포함하고, 그리고 서열 번호:80에 따른 경쇄를 포함하는, PD-L1에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 단편.
  21. PD-L1에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 단편으로서, 상기 항체 또는 그의 단편은 서열 번호:78에 따른 중쇄를 포함하고, 그리고 서열 번호:80에 따른 경쇄를 포함하는, PD-L1에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 단편.
  22. 단리된 항체 또는 그의 단편으로서, 상기 항체 또는 그의 단편은 청구항 1 내지 청구항 21 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 단편과 동일한 에피토프에 결합하는, 단리된 항체 또는 그의 단편.
  23. 단리된 항체 또는 그의 단편으로서, 상기 항체 또는 그의 단편은 PD-L1에 대한 결합에 대해 청구항 1 내지 청구항 21 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 단편과 경쟁하고, 상기 경쟁은 ELISA, 유량 세포 계측법, 또는 표면 플라스몬 공명 (SPR) 분석에 의해 측정되는, 단리된 항체 또는 그의 단편.
  24. 청구항 1 내지 청구항 21 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 단편은 단일 클론 항체, scFv, Fab 단편, Fab' 단편, 및 F(ab)' 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는, 단리된 항체 또는 그의 단편.
  25. 청구항 1 내지 청구항 21 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 단편은 치료제에 링크되거나 또는 접합되는, 항체 또는 그의 단편.
  26. 청구항 25에 있어서,
    상기 치료제는 세포 독성 약물, 방사성 동위 원소, 면역 조절제, 또는 항체인, 항체 또는 그의 단편.
  27. PD-L1에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 단편으로서, 상기 항체 또는 그의 단편은 약 10 nM 내지 약 0.01 nM의 PD-L1에 대한 친화도를 갖는, PD-L1에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 단편.
  28. 청구항 27에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 단편은 약 10 nM 이하의 PD-L1에 대한 친화도를 갖는, 단리된 항체 또는 그의 단편.
  29. 청구항 27에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 단편은 약 1.0 nM 이하의 PD-L1에 대한 친화도를 갖는, 단리된 항체 또는 그의 단편.
  30. PD-L1에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 단편으로서, 상기 항체는 약 5 ng/mL 내지 약 1000 ng/mL의 결합 EC50을 갖는, PD-L1에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 단편.
  31. PD-L1에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 단편으로서, 상기 항체는 PD-L1의 PD-1에 대한 결합을 차단하는, PD-L1에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 단편.
  32. 청구항 31에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 단편은 약 5 ng/mL 내지 약 1000 ng/mL의 IC50에서 PD-L1의 PD-1에 대한 결합을 차단하는, 단리된 항체 또는 그의 단편.
  33. PD-L1에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 단편으로서, 상기 항체 또는 그의 단편은 염증성 사이토카인 생산에 의해 측정된 바와 같이 T 세포 활성화를 증가시키는, PD-L1에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 단편.
  34. 청구항 28에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 단편은 IL-2 및 IFNγ의 T 세포 생산를 증가시키는, 단리된 항체 또는 그의 단편.
  35. PD-L1에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 단편으로서, 상기 항체 또는 그의 단편은 13C5, 5G9, 5G11, 8C6, 7B4, 4D1, 4A8, 8H4, 8H3, 및/또는 15F1로 구성된 군으로부터 선택된 하이브리도마에 의해 생산되는, PD-L1에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 단편.
  36. 청구항 1 내지 청구항 35 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 단편 및 제약학상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  37. 청구항 1 내지 청구항 35 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  38. 청구항 37에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  39. 청구항 38에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  40. 13C5, 5G9, 5G11, 8C6, 7B4, 4D1, 4A8, 8H4, 8H3, 및 15F1로 구성된 군으로부터 선택된 단리된 하이브리도마 세포주.
  41. T 세포 활성화를 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은 T 세포들을 청구항 1 내지 청구항 35 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 단편과 접촉시키는 것을 포함하는, T 세포 활성화를 증가시키는 방법.
  42. 피험자에서 종양을 감소시키거나 또는 종양 세포들의 성장을 억제하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 피험자에게 청구항 1 내지 청구항 35 중 어느 한 항에 따른 치료 유효량의 단리된 항체 또는 그의 단편을 투여하는 것을 포함하는, 종양을 감소시키거나 또는 종양 세포들의 성장을 억제하는 방법.
  43. 치료를 요하는 피험자에게 암을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 청구항 1 내지 청구항 35 중 어느 한 항에 따른 치료 유효량의 단리된 항체 또는 그의 단편을 상기 피험자에게 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료 방법.
  44. 청구항 43에 있어서,
    상기 암은 림프종, 백혈병, 흑색종, 신경교종, 유방암, 폐암, 대장암, 골암, 난소암, 방광암, 신장암, 간암, 위암, 직장암, 고환암, 침샘암, 갑상선암, 흉선암, 상피암, 두경부암, 위암, 췌장암, 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  45. 치료를 요하는 피험자에게 감염성 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 청구항 1 내지 청구항 35 중 어느 한 항에 따른 치료 유효량의 단리된 항체 또는 그의 단편을 상기 피험자에게 투여하는 것을 포함하는, 감염성 질환의 치료 방법.
  46. 청구항 45에 있어서,
    상기 감염성 질환은 칸디다증, 칸디다혈증, 아스페르길루스증, 연쇄상 구균성 폐렴, 연쇄상 구균성 피부 및 구강 인두증, 그램 음성 패혈증, 결핵, 단핵구증, 인플루엔자, 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory Syncytial Virus)에 의해 유발된 호흡기 질환, 말라리아, 주혈 흡충증(schistosomiasis) 및 트리파노모니아증(trypanosomiasis)으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
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