CN113480639A - 抗体的Fc区变异体 - Google Patents

Abstract

通过使抗体Fc区环部位的至少一个氨基酸变异，与亲本多肽比较，成功地取得了稳定性提高的多肽。进一步将环部位的氨基酸变异多个组合，与亲本多肽比较，成功地得到了热稳定性提高、同时与FcγR的结合活性得以保持或增强的多肽；以及热稳定性提高、同时与FcγR的结合活性减少的多肽；还成功地得到了不仅热稳定性提高、同时调节了与FcγR的结合活性，而且使缔合物含量减少的多肽。

Description

抗体的Fc区变异体

本申请是国际申请日为2013年2月8日、国际申请号为PCT/JP2013/053011于2014年10月8日进入中国国家阶段、申请号201380018995.8、发明名称“抗体的Fc区变异体”的申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及来自天然的抗体Fc区的氨基酸序列发生变异得到的抗体Fc区、含有该Fc区的抗体、含有该抗体的药物组合物、以及它们的制造方法。

背景技术

抗体在血浆中的稳定性高，副作用也少，因此作为药物受到关注。其中有很多IgG型的抗体药物上市，目前也正在开发很多抗体药物(非专利文献1、非专利文献2)。

近年来，对抗体的Fc区导入人工氨基酸变异、增强抗体功能的研究活跃。具体来说，人们正对于提高药物动力学的Fc区、使发挥效应子功能的ADCC活性增强的Fc区、以及在中和抗体中使ADCC活性降低的Fc区进行研究(非专利文献3-6)。但是，已知这样的Fc区的变异对抗体的物性产生不良影响。例如有报道称：使ADCC活性增强的变异型Fc区中，热变性中点降低约20℃(非专利文献6)。还有报道指出：使ADCC活性降低的变异型Fc区的热变性中点降低约5℃，容易发生水解酶分解，容易在酸性条件下分解(非专利文献7-9)。还进一步报道：在使血中滞留性提高的变异型Fc区中，热稳定性或保存稳定性降低(专利文献1)。

总之，目前发现的变异型Fc区大多数伴随着功能的增强而丧失了作为抗体优点之一的良好稳定性。

作为提高稳定性的尝试，有人报道了实施CH2结构域的氨基酸变异、导入半胱氨酸的方法(非专利文献10)。通过半胱氨酸的导入形成新的二硫键，由此使热稳定性升高约10℃-20℃。但是该报告只对CH2结构域评价热稳定性，IgG形式下的热稳定性尚不明确。另外，随着新二硫键的形成，可以预想到异质性的增加。

如上所述，目前尚未报道有在活性和稳定性两方面均优异的Fc区。

以下给出与本申请的发明相关的现有技术文献信息。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2007/092772

专利文献2：WO2010/085682

非专利文献

非专利文献1：Monoclonal antibody successes in the clinic,Janice MReichert,Clark J Rosensweig,Laura B Faden&Matthew C Dewitz,NatureBiotechnology 23,1073-1078(2005)非专利文献2：Pavlou AK,Belsey MJ.,Thetherapeutic antibodies market to 2008.,Eur J Pharm Biopharm.2005Apr；59(3):389-96.非专利文献3：Hinton PR,Xiong JM,Johlfs MG,Tang MT,Keller S,TsurushitaN.,An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life.,JImmunol.2006Jan 1；176(1):346-56非专利文献4：Ghetie V,Popov S,Borvak J,Radu C,Matesoi D,Medesan C,Ober RJ,Ward ES.,Increasing the serum persistence of anIgG fragment by random mutagenesis.,Nat Biotechnol.1997Jul；15(7):637-40非专利文献5：Oganesyan V,Damschroder MM,Leach W,Wu H,Dall'Acqua WF.,Structuralcharacterization of a mutated,ADCC-enhanced human Fc fragment.,MolImmunol.2008Apr；45(7):1872-82非专利文献6：Oganesyan V,Gao C,Shirinian L,Wu H,Dall'Acqua WF.,Structural characterization of a human Fc fragment engineeredfor lack of effector functions.,Biol Crystallogr.2008Jun；64(Pt 6):700-4非专利文献7：Liu H,Bulseco GG,Sun J.,Effect of posttranslational modifications onthe thermal stability of a recombinant monoclonal antibody.,ImmunolLett.2006Aug；106(2):144-53非专利文献8：Gaza-Bulseco G,Liu H.,Fragmentation ofa recombinant monoclonal antibody at various pH.,Pharm Res.2008Aug；25(8):1881-90非专利文献9：Raju TS,Scallon BJ.,Glycosylation in the Fc domain of IgGincreases resistance to proteolytic cleavage by papain.,Biochem Biophys ResCommun.2006Mar；341(3):797-803非专利文献10：Gong R,Vu BK,Feng Y,Prieto DA,DybaMA,Walsh JD,Prabakaran P,Veenstra TD,Tarasov SG,Ishima R,Dimitrov DS.,Engineered human antibody constant domains with increased stability.,J BiolChem.2009Mar；284(21):14203-14210非专利文献11：Remmele RL Jr,Callahan WJ,Krishnan S,Zhou L,Bondarenko PV,Nichols AC,Kleemann GR,Pipes GD,Park S,FodorS,Kras E,Brems DN.,Active dimer of Epratuzumab provides insight into thecomplex nature of an antibody aggregate.,J Pharm Sci.2006Jan；95(1):126-45.非专利文献12：Rosenberg AS,Effects of Protein Aggregates:An ImmunologicPerspective.,AAPS J.2006Aug；8(3)；E501-E507。

发明内容

发明要解决的课题

本发明鉴于所述状况而完成，其目的在于：通过使抗体Fc区的氨基酸变异，提供使稳定性得到提高的多肽。

解决课题的方案

本发明人在制作变异型Fc区中，希望获得保持抗体的稳定性、同时使功能增强的Fc区，或者使随功能增强而降低的稳定性得到恢复的Fc区。

本发明人进行了深入的研究，结果成功获得了具有抗体的Fc区的多肽，通过使该Fc区的环部位的至少一个氨基酸变异，与亲本多肽比较，该多肽稳定性得到提高。

进一步将环部位的氨基酸变异多个组合，与亲本多肽比较，成功地得到了热稳定性提高、同时与FcγR的结合活性得以保持或增强的多肽；以及热稳定性提高、同时与FcγR的结合活性得到减少的多肽。并且成功地得到了不仅热稳定性提高、调节了与FcγR的结合活性，还使缔合物含量减少的多肽。

即，本发明涉及以下内容。

[1]多肽，该多肽具有抗体的Fc区，该Fc区环部位的至少一个氨基酸发生变异，与亲本多肽比较，该多肽稳定性提高。

[2][1]所述的多肽，其中，所述稳定性是以热变性中点(Tm)为指标进行评价或判断。

[3][1]或[2]所述的多肽，其中，在所述Fc区环部位的选自EU编号第234号、EU编号第235号、EU编号第236号、EU编号第237号、EU编号第238号、EU编号第239号、EU编号第247号、EU编号第250号、EU编号第265号、EU编号第266号、EU编号第267号、EU编号第268号、EU编号第269号、EU编号第270号、EU编号第271号、EU编号第295号、EU编号第296号、EU编号第298号、EU编号第300号、EU编号第307号、EU编号第309号、EU编号第315号、EU编号第324号、EU编号第325号、EU编号第326号、EU编号第327号、EU编号第329号、EU编号第330号、EU编号第333号、EU编号第335号、EU编号第337号、EU编号第360号、EU编号第385号、EU编号第386号、EU编号第387号、EU编号第389号、EU编号第428号和EU编号第433号的氨基酸部位导入至少一个以上的氨基酸突变。

[4][1]-[3]中任一项所述的多肽，该多肽与亲本多肽比较，与FcγR的结合活性还保持或增强。

[5][1]-[3]中任一项所述的多肽，该多肽与亲本多肽比较，与FcγR的结合活性还减小。

[6][1]-[5]中任一项所述的多肽，其中，在所述Fc区环部位的选自EU编号第234号、EU编号第235号、EU编号第239号、EU编号第266号、EU编号第267号、EU编号第268号、EU编号第269号、EU编号第270号、EU编号第295号、EU编号第296号、EU编号第298号、EU编号第300号、EU编号第324号、EU编号第325号、EU编号第326号和EU编号第330号的氨基酸部位导入至少一个以上的氨基酸突变。

[7][1]-[4]、[6]中任一项所述的多肽，其中，在所述Fc区环部位的选自EU编号第234号、EU编号第266号、EU编号第268号、EU编号第269号、EU编号第270号、EU编号第295号、EU编号第300号、EU编号第324号、EU编号第326号和EU编号第330号的氨基酸部位导入至少一个以上的氨基酸突变。

[8][1]-[4]、[6]、[7]中任一项所述的多肽，其中，所述Fc区环部位的氨基酸变异是至少一个以上选自下述置换的氨基酸变异：EU编号第234号的氨基酸置换为Ile、EU编号第266号的氨基酸置换为Ile、EU编号第268号的氨基酸置换为Gln、EU编号第269号的氨基酸置换为Asp、EU编号第270号的氨基酸置换为Glu、EU编号第295号的氨基酸置换为Met或Leu、EU编号第300号的氨基酸置换为Glu、EU编号第324号的氨基酸置换为His、EU编号第326号的氨基酸置换为Ser或Ala、以及EU编号第330号的氨基酸置换为His或Tyr。

[9][1]-[3]、[5]、[6]中任一项所述的多肽，其中，在所述Fc区环部位的选自EU编号第234号、EU编号第235号、EU编号第239号、EU编号第267号、EU编号第268号、EU编号第270号、EU编号第295号、EU编号第296号、EU编号第298号和EU编号第325号的氨基酸部位导入至少一个以上的氨基酸突变。

[10][1]-[3]、[5]、[6]、[9]中任一项所述的多肽，其中，所述Fc区环部位的氨基酸变异是至少一个以上选自下述置换的氨基酸变异：EU编号第234号的氨基酸置换为Lys或Arg、EU编号第235号的氨基酸置换为Lys或Arg、EU编号第239号的氨基酸置换为Lys、EU编号第267号的氨基酸置换为Pro、EU编号第268号的氨基酸置换为Met或Lys、EU编号第270号的氨基酸置换为Phe、EU编号第295号的氨基酸置换为Met、EU编号第296号的氨基酸置换为Gly、EU编号第298号的氨基酸置换为Gly、以及EU编号第325号的氨基酸置换为Gly、His或Met的任意一种。

[11][1]-[4]中任一项所述的多肽，其中，在所述Fc区环部位的选自EU编号第295号、EU编号第326号、以及EU编号第330号的氨基酸部位导入至少一个以上的氨基酸突变。

[12][1]-[4]、[11]中任一项所述的多肽，其中，所述Fc区环部位的氨基酸变异是至少一个以上选自下述置换的氨基酸变异：EU编号第295号的氨基酸置换为Met或Leu、EU编号第326号的氨基酸置换为Ser或Ala、以及EU编号第330号的氨基酸置换为His或Tyr。

[13][1]-[3]、[5]中任一项所述的多肽，其中，在所述Fc区环部位的选自EU编号第234号、EU编号第235号、EU编号第239号、EU编号第268号、EU编号第270号、EU编号第295号、EU编号第296号、EU编号第298号和EU编号第325号的氨基酸部位导入至少一个以上的氨基酸突变。

[14][1]-[3]、[5]、[13]中任一项所述的多肽，其中，所述Fc区环部位的氨基酸变异是至少一个以上选自下述置换的氨基酸变异：EU编号第234号的氨基酸置换为Lys、EU编号第235号的氨基酸置换为Lys或Arg、EU编号第239号的氨基酸置换为Lys或Ser、EU编号第268号的氨基酸置换为Lys或His、EU编号第270号的氨基酸置换为Phe或Asp、EU编号第295号的氨基酸置换为Met、EU编号第296号的氨基酸置换为Gly、EU编号第298号的氨基酸置换为Gly、以及EU编号第325号的氨基酸置换为His或Gly。

[15][1]-[3]、[5]中任一项所述的多肽，其中，在所述Fc区环部位的选自EU编号第234号、EU编号第235号、EU编号第239号、EU编号第268号、EU编号第270号、EU编号第295号、EU编号第296号、EU编号第298号和EU编号第325号的氨基酸序列中导入至少一个以上的氨基酸突变。

[16][1]-[3]、[5]、[15]中任一项所述的多肽，其中，所述Fc区环部位的氨基酸变异是至少一个以上选自下述置换的氨基酸变异：EU编号第234号的氨基酸置换为Lys、EU编号第235号的氨基酸置换为Lys或Arg、EU编号第239号的氨基酸置换为Lys、EU编号第268号的氨基酸置换为Lys、EU编号第270号的氨基酸置换为Phe、EU编号第295号的氨基酸置换为Met、EU编号第296号的氨基酸置换为Gly、EU编号第298号的氨基酸置换为Gly、以及EU编号第325号的氨基酸置换为His或Gly。

[17][1]-[3]、[5]中任一项所述的多肽，其中，在所述Fc区环部位的选自EU编号第234号、EU编号第235号、EU编号第239号、EU编号第295号、EU编号第296号、EU编号第298号和EU编号第325号的氨基酸序列中导入至少一个以上的氨基酸突变。

[18][1]-[3]、[5]、[17]中任一项所述的多肽，其中，所述Fc区环部位的氨基酸变异是至少一个以上选自下述置换的氨基酸变异：EU编号第234号的氨基酸置换为Lys、EU编号第235号的氨基酸置换为Lys或Arg、EU编号第239号的氨基酸置换为Lys、EU编号第295号的氨基酸置换为Met、EU编号第296号的氨基酸置换为Gly、EU编号第298号的氨基酸置换为Gly、以及EU编号第325号的氨基酸置换为His或Gly。

[19][1]-[3]、[5]中任一项所述的多肽，其中，在所述Fc区环部位的选自EU编号第234号、EU编号第235号、EU编号第268号、EU编号第270号、EU编号第295号、EU编号第296号、EU编号第298号和EU编号第325号的氨基酸部位导入至少一个以上的氨基酸突变。

[20][1]-[3]、[5]、[19]中任一项所述的多肽，其中，所述Fc区环部位的氨基酸变异是至少一个以上选自下述置换的氨基酸变异：EU编号第234号的氨基酸置换为Lys、EU编号第235号的氨基酸置换为Lys或Arg、EU编号第268号的氨基酸置换为Lys、EU编号第270号的氨基酸置换为Phe、EU编号第295号的氨基酸置换为Met、EU编号第296号的氨基酸置换为Gly、EU编号第298号的氨基酸置换为Gly、以及EU编号第325号的氨基酸置换为His或Gly。

[21][1]-[3]、[5]中任一项所述的多肽，其中，在所述Fc区环部位的氨基酸变异部位为在选自EU编号第234号、EU编号第235号、EU编号第295号、EU编号第296号、EU编号第298号和EU编号第325号的氨基酸部位导入至少一个以上的氨基酸突变。

[22][1]-[3]、[5]、[21]中任一项所述的多肽，其中，所述Fc区环部位的氨基酸变异是至少一个以上选自下述置换的氨基酸变异：EU编号第234号的氨基酸置换为Lys、EU编号第235号的氨基酸置换为Lys或Arg、EU编号第295号的氨基酸置换为Met、EU编号第296号的氨基酸置换为Gly、EU编号第298号的氨基酸置换为Gly、以及EU编号第325号的氨基酸置换为His或Gly。

[23][1]-[4]中任一项所述的多肽，其中，在所述Fc区环部位的选自EU编号第247号、EU编号第250号、EU编号第307号、EU编号第309号、EU编号第315号、EU编号第360号、EU编号第385号、EU编号第386号、EU编号第387号、EU编号第389号、EU编号第428号和EU编号第433号的氨基酸部位导入至少一个以上的氨基酸突变。

[24][1]-[4]、[23]中任一项所述的多肽，其中，所述Fc区环部位的氨基酸变异是至少一个以上选自下述置换的氨基酸变异：EU编号第247号的氨基酸置换为Val、EU编号第250号的氨基酸置换为Phe、Ile、Met、Val、Trp或Tyr的任意一种、EU编号第307号的氨基酸置换为Ala、Gln或Pro的任意一种、EU编号第309号的氨基酸置换为Ala、Arg或Pro的任意一种、EU编号第315号的氨基酸置换为Ala、EU编号第360号的氨基酸置换为His、EU编号第385号的氨基酸置换为Asp、EU编号第386号的氨基酸置换为Pro、EU编号第387号的氨基酸置换为Glu、EU编号第389号的氨基酸置换为Ser、EU编号第428号的氨基酸置换为His、Trp、Tyr或Phe的任意一种、以及EU编号第433号的氨基酸置换为Lys。

[25][1]-[3]、[5]中任一项所述的多肽，其中，在所述Fc区环部位的EU编号第298号或EU编号第309号的氨基酸部位导入至少一个以上的氨基酸突变。

[26][1]-[3]、[5]、[25]中任一项所述的多肽，其中，所述Fc区环部位的氨基酸变异是至少一个以上选自下述置换的氨基酸变异：EU编号第298号的氨基酸置换为Gly、和EU编号第309号的氨基酸置换为Asp。

[27]方法，该方法是在具有抗体Fc区的多肽中，通过在该Fc区的环部位加入至少一个氨基酸变异，使稳定性与亲本多肽比较提高。

[28][27]的方法，该方法是以热变性中点(Tm)为指标，评价或判断所述稳定性。

[29]多肽的制造方法，该多肽具有抗体的Fc区，该Fc区环部位的至少一个氨基酸发生变异，与亲本多肽比较稳定性提高；所述制造方法包含以下步骤：

(a)在具有抗体的Fc区的多肽中，在该Fc区的环部位加入至少一个氨基酸变异的步骤；

(b)对通过所述步骤(a)发生变异的多肽的稳定性进行测定的步骤；以及

(c)选择与亲本多肽比较、稳定性提高的多肽的步骤。

[30]多肽的制造方法，该多肽具有抗体的Fc区，该Fc区环部位的至少一个氨基酸发生变异，与亲本多肽比较稳定性提高；所述制造方法包含以下步骤：

(a)使编码该多肽的核酸发生变异，从而与亲本多肽比较，稳定性提高的步骤；

(b)向宿主细胞导入发生了该变异的核酸，进行培养，使其表达的步骤；

(c)从宿主细胞培养物中回收该多肽的步骤。

[31][27]-[30]中任一项所述的方法，其中，在所述Fc区环部位的选自EU编号第234号、EU编号第235号、EU编号第236号、EU编号第237号、EU编号第238号、EU编号第239号、EU编号第247号、EU编号第250号、EU编号第265号、EU编号第266号、EU编号第267号、EU编号第268号、EU编号第269号、EU编号第270号、EU编号第271号、EU编号第295号、EU编号第296号、EU编号第298号、EU编号第300号、EU编号第307号、EU编号第309号、EU编号第315号、EU编号第324号、EU编号第325号、EU编号第326号、EU编号第327号、EU编号第329号、EU编号第330号、EU编号第333号、EU编号第335号、EU编号第337号、EU编号第360号、EU编号第385号、EU编号第386号、EU编号第387号、EU编号第389号、EU编号第428号和EU编号第433号的氨基酸部位导入至少一个以上的氨基酸突变。

[32][27]-[31]中任一项所述的方法，该方法进一步包含进行变异，从而与亲本多肽比较，使与FcγR的结合活性保持或增强的步骤。

[33][27]-[31]中任一项所述的方法，该方法进一步包含进行变异，从而与亲本多肽比较，使与FcγR的结合活性减小的步骤。

[34][27]-[33]中任一项所述的方法，该方法是在所述Fc区环部位的选自EU编号第234号、EU编号第235号、EU编号第239号、EU编号第266号、EU编号第267号、EU编号第268号、EU编号第269号、EU编号第270号、EU编号第295号、EU编号第296号、EU编号第298号、EU编号第300号、EU编号第324号、EU编号第325号、EU编号第326号和EU编号第330号的氨基酸部位导入至少一个以上的氨基酸突变。

[35][27]-[32]、[34]中任一项所述的方法，其中，在所述Fc区环部位的选自EU编号第234号、EU编号第266号、EU编号第268号、EU编号第269号、EU编号第270号、EU编号第295号、EU编号第300号、EU编号第324号、EU编号第326号和EU编号第330号的氨基酸部位导入至少一个以上的氨基酸突变。

[36][27]-[32]、[34]、[35]中任一项所述的方法，其中，所述Fc区环部位的氨基酸变异是至少一个以上选自下述置换的氨基酸变异：EU编号第234号的氨基酸置换为Ile、EU编号第266号的氨基酸置换为Ile、EU编号第268号的氨基酸置换为Gln、EU编号第269号的氨基酸置换为Asp、EU编号第270号的氨基酸置换为Glu、EU编号第295号的氨基酸置换为Met或Leu、EU编号第300号的氨基酸置换为Glu、EU编号第324号的氨基酸置换为His、EU编号第326号的氨基酸置换为Ser或Ala、以及EU编号第330号的氨基酸置换为His或Tyr。

[37][27]-[31]、[33]、[34]中任一项所述的方法，其中，在所述Fc区环部位的选自EU编号第234号、EU编号第235号、EU编号第239号、EU编号第267号、EU编号第268号、EU编号第270号、EU编号第295号、EU编号第296号、EU编号第298号和EU编号第325号的氨基酸部位导入至少一个以上的氨基酸突变。

[38][27]-[31]、[33]、[34]、[37]中任一项所述的方法，其中，所述Fc区环部位的氨基酸变异是至少一个以上选自下述置换的氨基酸变异：EU编号第234号的氨基酸置换为Lys或Arg、EU编号第235号的氨基酸置换为Lys或Arg、EU编号第239号的氨基酸置换为Lys、EU编号第267号的氨基酸置换为Pro、EU编号第268号的氨基酸置换为Met或Lys、EU编号第270号的氨基酸置换为Phe、EU编号第295号的氨基酸置换为Met、EU编号第296号的氨基酸置换为Gly、EU编号第298号的氨基酸置换为Gly、以及EU编号第325号的氨基酸置换为Gly、His或Met的任意一种。

[39][27]-[32]中任一项所述的方法，其中，在所述Fc区环部位的选自EU编号第295号、EU编号第326号、以及EU编号第330号的氨基酸部位导入至少一个以上的氨基酸突变。

[40][27]-[32]、[39]中任一项所述的方法，其中，所述Fc区环部位的氨基酸变异是至少一个以上选自下述置换的氨基酸变异：EU编号第295号置换为Met或Leu、EU编号第326号置换为Ser或Ala、以及EU编号第330号置换为His或Tyr。

[41][27]-[31]、[33]中任一项所述的方法，其中，在所述Fc区环部位的选自EU编号第234号、EU编号第235号、EU编号第239号、EU编号第268号、EU编号第270号、EU编号第295号、EU编号第296号、EU编号第298号或EU编号第325号的氨基酸部位导入至少一个以上的氨基酸突变。

[42][27]-[31]、[33]、[41]中任一项所述的方法，其中，所述Fc区环部位的氨基酸变异是至少一个以上选自下述置换的氨基酸变异：EU编号第234号的氨基酸置换为Lys、EU编号第235号的氨基酸置换为Lys或Arg、EU编号第239号的氨基酸置换为Lys或Ser、EU编号第268号的氨基酸置换为Lys或His、EU编号第270号的氨基酸置换为Phe或Asp、EU编号第295号的氨基酸置换为Met、EU编号第296号的氨基酸置换为Gly、EU编号第298号的氨基酸置换为Gly、以及EU编号第325号的氨基酸置换为His或Gly。

[43][27]-[31]、[33]中任一项所述的方法，其中，在所述Fc区环部位的选自EU编号第234号、EU编号第235号、EU编号第239号、EU编号第268号、EU编号第270号、EU编号第295号、EU编号第296号、EU编号第298号和EU编号第325号的氨基酸部位导入至少一个以上的氨基酸突变。

[44][27]-[31]、[33]、[43]中任一项所述的方法，其中，所述Fc区环部位的氨基酸变异是至少一个以上选自下述置换的氨基酸变异：EU编号第234号的氨基酸置换为Lys、EU编号第235号的氨基酸置换为Lys或Arg、EU编号第239号的氨基酸置换为Lys、EU编号第268号的氨基酸置换为Lys、EU编号第270号的氨基酸置换为Phe、EU编号第295号的氨基酸置换为Met、EU编号第296号的氨基酸置换为Gly、EU编号第298号的氨基酸置换为Gly、以及EU编号第325号的氨基酸置换为His或Gly。

[45][27]-[31]、[33]中任一项所述的方法，其中，在所述Fc区环部位的选自EU编号第234号、EU编号第235号、EU编号第239号、EU编号第295号、EU编号第296号、EU编号第298号和EU编号第325号的氨基酸部位导入至少一个以上的氨基酸突变。

[46][27]-[31]、[33]、[45]中任一项所述的方法，其中，所述Fc区环部位的氨基酸变异是至少一个以上选自下述置换的氨基酸变异：EU编号第234号的氨基酸置换为Lys、EU编号第235号的氨基酸置换为Lys或Arg、EU编号第239号的氨基酸置换为Lys、EU编号第295号的氨基酸置换为Met、EU编号第296号的氨基酸置换为Gly、EU编号第298号的氨基酸置换为Gly、以及EU编号第325号的氨基酸置换为His或Gly。

[47][27]-[31]、[33]中任一项所述的方法，其中，在所述Fc区环部位的选自EU编号第234号、EU编号第235号、EU编号第268号、EU编号第270号、EU编号第295号、EU编号第296号、EU编号第298号和EU编号第325号的氨基酸部位导入至少一个以上的氨基酸突变。

[48][27]-[31]、[33]、[47]中任一项所述的方法，其中，所述Fc区环部位的氨基酸变异是至少一个以上选自下述置换的氨基酸变异：EU编号第234号的氨基酸置换为Lys、EU编号第235号的氨基酸置换为Lys或Arg、EU编号第268号的氨基酸置换为Lys、EU编号第270号的氨基酸置换为Phe、EU编号第295号的氨基酸置换为Met、EU编号第296号的氨基酸置换为Gly、EU编号第298号的氨基酸置换为Gly、以及EU编号第325号的氨基酸置换为His或Gly。

[49][27]-[31]、[33]中任一项所述的方法，其中，在所述Fc区环部位的选自EU编号第234号、EU编号第235号、EU编号第295号、EU编号第296号、EU编号第298号和EU编号第325号的氨基酸部位导入至少一个以上的氨基酸突变。

[50][27]-[31]、[33]、[49]中任一项所述的方法，其中，所述Fc区环部位的氨基酸变异是至少一个以上选自下述置换的氨基酸变异：EU编号第234号的氨基酸置换为Lys、EU编号第235号的氨基酸置换为Lys或Arg、EU编号第295号的氨基酸置换为Met、EU编号第296号的氨基酸置换为Gly、EU编号第298号的氨基酸置换为Gly、以及EU编号第325号的氨基酸置换为His或Gly。

[51][27]-[32]中任一项所述的方法，其中，在所述Fc区环部位的选自EU编号第247号、EU编号第250号、EU编号第307号、EU编号第309号、EU编号第315号、EU编号第360号、EU编号第385号、EU编号第386号、EU编号第387号、EU编号第389号、EU编号第428号和EU编号第433号的氨基酸部位导入至少一个以上的氨基酸突变。

[52][27]-[32]、[51]中任一项所述的方法，其中，所述Fc区环部位的氨基酸变异是至少一个以上选自下述置换的氨基酸变异：EU编号第247号的氨基酸置换为Val、EU编号第250号的氨基酸置换为Phe、Ile、Met、Val、Trp或Tyr的任意一种、EU编号第307号的氨基酸置换为Ala、Gln或Pro的任意一种、EU编号第309号的氨基酸置换为Ala、Arg或Pro的任意一种、EU编号第315号的氨基酸置换为Ala、EU编号第360号的氨基酸置换为His、EU编号第385号的氨基酸置换为Asp、EU编号第386号的氨基酸置换为Pro、EU编号第387号的氨基酸置换为Glu、EU编号第389号的氨基酸置换为Ser、EU编号第428号的氨基酸置换为His、Trp、Tyr或Phe的任意一种、以及EU编号第433号的氨基酸置换为Lys。

[53][27]-[31]、[33]中任一项所述的方法，其中，在所述Fc区环部位的EU编号第298号或EU编号第309号的氨基酸部位导入至少一个以上的氨基酸突变。

[54][27]-[31]、[33]、[53]中任一项所述的方法，其中，所述Fc区环部位的氨基酸变异是至少一个以上选自下述置换的氨基酸变异：EU编号第298号的氨基酸置换为Gly、和EU编号第309号的氨基酸置换为Asp。

[55][27]-[54]中任一项所述的方法，其中，所述变异是具有人IgG的Fc区的多肽中的变异。

[56]核酸，该核酸编码具有抗体Fc区的多肽，该多肽的Fc区的环部位的至少一个氨基酸发生变异，与亲本多肽比较，稳定性提高。

[57]载体，该载体含有[56]所述的核酸。

[58]宿主细胞，该宿主细胞通过[57]所述的载体转化。

[59]药物组合物，该药物组合物含有[1]-[26]中任一项所述的多肽、或根据[27]-[55]中任一项所述的方法制备的多肽。

[60]免疫炎症性疾病或癌症的治疗药或预防药，其含有[59]所述的药物组合物。

[61][60]所述的治疗药或预防药，其中，所述免疫炎症性疾病是类风湿性关节炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性大疱病、自身免疫性肾上腺皮质炎、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少性紫癜、巨红细胞性贫血、自身免疫性萎缩性胃炎、自身免疫性中性粒细胞减少、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性受体病、自身免疫性不孕、慢性活动性肝炎、肾小球肾炎、间质性肺纤维化、多发性硬化、柏哲德氏病、骨质疏松症、多发性骨髓瘤、葡萄膜炎、急性及慢性脊椎炎、痛风性关节炎、炎症性肠病、成人呼吸窘迫综合症(ARDS)、银屑病、克罗恩病、巴塞多氏病、幼年型糖尿病、阿狄森氏病、重症肌无力、晶状体性葡萄膜炎、系统性红斑狼疮、变态反应性鼻炎、变态反应性皮炎、溃疡性肠炎、过敏、哮喘、肌变性、恶病质、系统性硬皮病、局灶性硬皮病、干燥综合征、贝切特氏病、赖特综合征、1型和2型糖尿病、骨吸收疾病、移植物抗宿主反应、缺血再灌注损伤、动脉粥样硬化、脑外伤、多发性硬化、脑型疟疾、败血症、败血性休克、中毒性休克综合征、发热、以及染色导致的肌痛(malgias)、再生不良性贫血、溶血性贫血、突发性血小板减少、肺出血肾炎综合征、格林-巴利综合征、桥本病、天疱疮、IgA肾病、花粉症、抗磷脂抗体综合征、多发性肌炎、韦格纳肉芽肿、结节性动脉炎、混合性结缔组织病或纤维肌痛症。

[62][60]所述的治疗药或预防药，其中，癌症是胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、皮肤癌、消化道的癌症、肺癌、肝细胞癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、输卵管癌、阴道癌、肝癌、胆管癌、膀胱癌、尿道的癌症、甲状腺癌、肾上腺癌、肾癌、其它腺体组织癌症，脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤、血管肉瘤、纤维肉瘤、恶性外周神经瘤、胃肠间质瘤、韧带样瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或其它实体器官肿瘤。

[63]治疗或预防免疫炎症性疾病或癌症的方法，该方法包含将[1]-[26]中任一项所述的多肽、或根据[27]-[55]中任一项所述的方法制备的多肽给予对象的步骤。

[64][1]-[26]中任一项所述的多肽、或根据[27]-[55]中任一项所述的方法制备的多肽，该多肽在免疫炎症性疾病或癌症的治疗或预防中使用。

[65][1]-[26]中任一项所述的多肽、或根据[27]-[55]中任一项所述的方法制备的多肽在免疫炎症性疾病或癌症的治疗药或预防药的制造中的应用。

[66]制造免疫炎症性疾病或癌症的治疗药或预防药的方法，该方法包含使用[1]-[26]中任一项所述的多肽、或根据[27]-[55]中任一项所述的方法制备的多肽的步骤。

附图简述

图1是表示所制备的抗体的热变性中点(Tm)的图。

图2-1是将多个变异进行组合的TS20-TS27的缔合物含量测定的色谱图。

图2-2是将多个变异进行组合的TS28-TS39的缔合物含量测定的色谱图。

图2-3是将多个变异进行组合的TS40-TS43的缔合物含量测定的色谱图。

图3表示构成IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的Fc区的氨基酸残基与kabat的EU编号(本说明书中也称为EU索引(EU INDEX))的关系。

图4是表示Fc区B3(SEQ ID NO:16)的CH2结构域环部分的氨基酸变异位置(L234-S239、D265-P271、Q295、Y296、S298、Y300、S324-S337；网格状部分)的图。

实施发明的方案

本发明是对抗体Fc区的环部位导入氨基酸置换，由此提供与亲本多肽比较、具有稳定性提高的该Fc区的多肽。

本发明是对抗体Fc区的环部位导入氨基酸置换，由此进一步提供与亲本多肽比较、使具有该Fc区的多肽的稳定性提高的方法。本发明是对抗体Fc区的环部位导入氨基酸置换，由此进一步提供与亲本多肽比较、具有稳定性提高的该Fc区的多肽的制造方法。

本发明中的多肽是指通常具有10个氨基酸左右以上的长度的肽以及蛋白质。通常还可以是来自生物的多肽，但并没有特别限定，也可以是包含人工设计的序列的多肽。还可以是天然多肽或合成多肽、重组多肽等任意形式。多肽可以是抗体。本发明的多肽的优选例子可举出人IgG。使用人IgG作为抗体时，其恒定区的种类没有限定，可以使用IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等同种型(亚类)的人IgG。

本说明书中，“亲本多肽”是指作为本发明的具有抗体Fc区的多肽的制备基础或基准的多肽。即，可以是具有抗体Fc区，该Fc区中的至少一个氨基酸发生变异之前的多肽。本发明的亲本多肽例如可以是具有天然型IgG的Fc区的多肽，还可以是对天然型IgG施加本发明的氨基酸变异以外的变异得到的、具有IgG的Fc区的多肽。

天然型IgG是指包含与天然发现的IgG相同的氨基酸序列、属于实质上由免疫球蛋白γ基因编码的抗体的类的多肽。例如天然型人IgG是指天然型人IgG1、天然型人IgG2、天然型人IgG3、天然型人IgG4等。天然型IgG也包含由此自然产生的突变体等。

天然型IgG的Fc区是指包含与以天然发现的IgG为起源的Fc区相同的氨基酸序列的Fc区。天然型IgG的Fc区表示在图3(SEQ ID NO:11-14)中，例如是指以天然型人IgG1为起源的Fc区、以天然型人IgG2为起源的Fc区、以天然型人IgG3为起源的Fc区、以天然型人IgG4为起源的Fc区。天然型IgG的Fc区也包含由此自然产生的突变体等。

本发明的氨基酸位置根据Kabat规定(Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institute of Health,Bethesda,Md.,1987年和1991年)。本说明书中，抗体Fc区的氨基酸变异部位根据EU编号表示，该EU编号以Kabat的氨基酸位置为基准。

本发明中，将连接α螺旋或β片的部分称作环，对其长度或结构并没有规定。本发明中，将连接CH2结构域的β片和β片的部分称作环、环部位、环部分或环结构。本发明中可进行变异的具体的环部位的氨基酸位置选自EU编号第234号、EU编号第235号、EU编号第236号、EU编号第237号、EU编号第238号、EU编号第239号、EU编号第247号、EU编号第250号、EU编号第265号、EU编号第266号、EU编号第267号、EU编号第268号、EU编号第269号、EU编号第270号、EU编号第271号、EU编号第295号、EU编号第296号、EU编号第298号、EU编号第300号、EU编号第307号、EU编号第309号、EU编号第315号、EU编号第324号、EU编号第325号、EU编号第326号、EU编号第327号、EU编号第329号、EU编号第330号、EU编号第333号、EU编号第335号、EU编号第337号、EU编号第360号、EU编号第385号、EU编号第386号、EU编号第387号、EU编号第389号、EU编号第428号和EU编号第433号。

“Fc区”是指抗体分子中包含由铰链部或其一部分、CH2、CH3结构域形成的片段的区域。IgG类的Fc区是指按照Kabat的EU编号(本说明书中也称为EU索引)(参照图3)中例如由第226号半胱氨酸至C末端、或者第230号的脯氨酸至C末端，但并不限于此。

Fc区可适宜地通过将IgG1、IgG2、IgG3、IgG4单克隆抗体等用胃蛋白酶等蛋白质分解酶进行部分消化，然后将吸附于蛋白A柱上的流分再洗脱来取得。所述蛋白质分解酶只要是通过适当设定pH等的酶反应条件来消化全长抗体，限制性地产生Fab或F(ab′)2即可，没有特别限定，例如可例举胃蛋白酶或木瓜蛋白酶等。

本发明的多肽可举出：与亲本多肽比较、具有稳定性提高的Fc区的多肽。与亲本多肽比较、具有稳定性提高的Fc区的多肽的优选方案例如可举出：在该Fc区的环部位有至少一个氨基酸发生变异的多肽。

本发明提供抗体Fc区，其包含：对于抗体(例如人IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4))的Fc区的环部位，在该IgG的选自EU编号第234号、EU编号第235号、EU编号第236号、EU编号第237号、EU编号第238号、EU编号第239号、EU编号第247号、EU编号第250号、EU编号第265号、EU编号第266号、EU编号第267号、EU编号第268号、EU编号第269号、EU编号第270号、EU编号第271号、EU编号第295号、EU编号第296号、EU编号第298号、EU编号第300号、EU编号第307号、EU编号第309号、EU编号第315号、EU编号第324号、EU编号第325号、EU编号第326号、EU编号第327号、EU编号第329号、EU编号第330号、EU编号第333号、EU编号第335号、EU编号第337号、EU编号第360号、EU编号第385号、EU编号第386号、EU编号第387号、EU编号第389号、EU编号第428号和EU编号第433号的氨基酸部位导入至少一个以上的氨基酸变异的Fc区。例如通过对人IgG导入所述变异，可提供与亲本多肽比较、稳定性提高的多肽。

本发明进一步提供抗体Fc区，其包含：对于抗体(例如人IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4))的Fc区的环部位，在该IgG的选自EU编号第234号、EU编号第235号、EU编号第239号、EU编号第266号、EU编号第267号、EU编号第268号、EU编号第269号、EU编号第270号、EU编号第295号、EU编号第296号、EU编号第298号、EU编号第300号、EU编号第324号、EU编号第325号、EU编号第326号和EU编号第330号的氨基酸部位导入至少一个以上的氨基酸变异的Fc区。

本说明书中，“稳定性”是指例如多肽的热力学稳定性，但并不限于此。多肽的热力学稳定性例如可以以CH2区的热变性中点(Tm)等为指标进行评价或判断。即，本发明的多肽优选以热变性中点(Tm)为指标进行评价或判断。Tm可通过CD(圆二色性)、DSC(差示扫描量热法；差示扫描量热仪)、DSF(差示扫描荧光定量法)测定。

作为实施热稳定性评价时所采用的所述方法，在提供IgG形式的样品做测定时，可以独立评价CH2、CH3以及Fab三个区的热稳定性。Fc区的CH2和CH3中，CH2的热稳定性低，因此认为，提高CH2的热稳定性与Fc区的热稳定性提高相关。

另外，IgG具有高度受控的立体结构，各区的立体结构或物理学稳定性相互影响。即，导入某一区的变异也会对其它区产生影响，可能使IgG整体的立体结构或物理学稳定性变化。因此，在评价变异导入效果时，优选以IgG的形式实施评价。由于以上理由，本说明书是对以IgG的形式制备的变异抗体的CH2区的热稳定性进行评价。

CD是通过观测伴随着升温而出现的平均残基摩尔椭圆率(θ)的变化来计算Tm。CD的测定仪器例如可举出圆二色性分散仪(日本分光)。在一个适当的波长(例如208nm或222nm)下，一边使温度升高一边测定CD谱，在某一温度下θ升高，在之后的温度下则为恒定值。此时，将低温时的θ与高温时的θ的中点值的温度作为Tm。测定时例如可以使用用柠檬酸、Tris、磷酸溶液等制备的蛋白质溶液，可以以数百μg/mL的浓度用于测定。

DSC是通过观测伴随着升温而出现的热量变化来计算Tm。DSC的测定仪器可举出：MicroCal VP-DSC、MicroCal Capillary DSC(均由GE Healthcare制造)。在测定池中封入蛋白质溶液和缓冲液，一边使温度升高一边测定池之间的温度差，以某一温度为界限，会变化为吸热反应。以此时的温度作为Tm。测定时例如可使用用柠檬酸缓冲液、TBS、PBS、组氨酸缓冲液等制备的蛋白质溶液，可以以数十μg/mL至数百μg/mL的浓度用于测定。

DSF是使用与疏水性残基特异性结合的荧光试剂(例如SYPR Orange)，通过观测伴随着升温而出现的疏水性残基的暴露来计算Tm。将蛋白质溶液和荧光试剂以适当比例混合，通过RT-PCR装置使温度升高，同时测定荧光强度，在某一温度下可观测到荧光强度升高。以此时的温度作为Tm。DSF的测定仪器例如可举出：Rotor-Gene Q(QIAGEN)、CFX96实时PCR分析系统(Bio-Rad)。测定时例如可以使用用PBS、组氨酸缓冲液等制备的蛋白质溶液，可以以数十μg/mL至数百μg/mL的浓度用于测定。

本说明书中，多肽的稳定性提高是指例如与按照所述测定方法求出的、作为对照的亲本多肽的Fc区中CH2区的Tm比较，被检多肽的Fc区中CH2区的Tm提高0.1度以上，优选0.2度以上、0.3度以上、0.4度以上、0.5度以上、1度以上、2度以上、3度以上、4度以上、5度以上、10度以上、20度以上。

并且，本发明的多肽不仅是与亲本多肽比较、稳定性提高的多肽，还可以是与亲本多肽比较、具有与Fcγ受体(本说明书中也记载为Fcγ受体或FcγR)的结合活性保持或增强的Fc区的多肽。本发明中，作为与亲本多肽比较不仅稳定性提高，与亲本多肽比较、还具有与FcγR的结合活性保持或增强的Fc区的多肽，例如可举出具有后述实施例所示的TS1-TS8、TS20-TS27、TS44-TS50、TS52-TS55或TS57-TS67的任意一种所记载的氨基酸部位的多肽。

(TS1-TS8)

与亲本多肽比较、与FcγR的结合活性保持或增强的多肽例如可举出：在所述Fc区环部位中的选自EU编号第234号、EU编号第266号、EU编号第268号、EU编号第269号、EU编号第270号、EU编号第295号、EU编号第300号、EU编号第324号、EU编号第326号和EU编号第330号的氨基酸部位导入至少一个以上的氨基酸突变的多肽。

该方案的优选多肽可举出：所述Fc区环部位的氨基酸变异部位为EU编号第234号、EU编号第266号、EU编号第268号、EU编号第269号、EU编号第270号、EU编号第295号、EU编号第300号、EU编号第324号、EU编号第326号和EU编号第330号的多肽。

该方案中进一步优选的多肽可举出：所述Fc区环部位的氨基酸变异是选自EU编号第234号的氨基酸置换为Ile、EU编号第266号的氨基酸置换为Ile、EU编号第268号的氨基酸置换为Gln、EU编号第269号的氨基酸置换为Asp、EU编号第270号的氨基酸置换为Glu、EU编号第295号的氨基酸置换为Met或Leu、EU编号第300号的氨基酸置换为Glu、EU编号第324号的氨基酸置换为His、EU编号第326号的氨基酸置换为Ser或Ala、以及EU编号第330号的氨基酸置换为His或Tyr的至少一个以上的氨基酸变异的多肽。

该方案中进一步优选的多肽是：所述Fc区环部位的氨基酸变异是选自EU编号第234号的氨基酸置换为Ile、EU编号第266号的氨基酸置换为Ile、EU编号第268号的氨基酸置换为Gln、EU编号第269号的氨基酸置换为Asp、EU编号第270号的氨基酸置换为Glu、EU编号第295号的氨基酸置换为Met或Leu、EU编号第300号的氨基酸置换为Glu、EU编号第324号的氨基酸置换为His、EU编号第326号的氨基酸置换为Ser或Ala、以及EU编号第330号的氨基酸置换为His或Tyr的多肽。

(TS20-TS27)

与亲本多肽比较、与FcγR的结合活性保持或增强的多肽例如可举出：在所述Fc区环部位中的选自EU编号第295号、EU编号第326号和EU编号第330号的氨基酸部位导入至少一个以上的氨基酸突变的多肽。

该方案的优选多肽可举出：所述Fc区环部位的氨基酸变异部位为EU编号第295号、EU编号第326号和EU编号第330号的多肽。

该方案中进一步优选的多肽可举出：所述Fc区环部位的氨基酸变异是选自EU编号第295号的氨基酸置换为Met或Leu、EU编号第326号的氨基酸置换为Ser或Ala、以及EU编号第330号的氨基酸置换为His或Tyr的至少一个以上的氨基酸变异的多肽。

该方案中进一步优选的多肽是：所述Fc区环部位的氨基酸变异是选自EU编号第295号的氨基酸置换为Met或Leu、EU编号第326号的氨基酸置换为Ser或Ala、以及EU编号第330号的氨基酸置换为His或Tyr的多肽。

(TS44-TS50、TS52-TS55、TS57-TS67)

与亲本多肽比较、与FcγR的结合活性保持或增强的多肽例如可举出：在所述Fc区环部位中的选自EU编号第247号、EU编号第250号、EU编号第307号、EU编号第309号、EU编号第315号、EU编号第360号、EU编号第385号、EU编号第386号、EU编号第387号、EU编号第389号、EU编号第428号和EU编号第433号的氨基酸部位导入至少一个以上的氨基酸突变的多肽。

该方案的优选多肽可举出：所述Fc区环部位的氨基酸变异部位为EU编号第247号、EU编号第250号、EU编号第307号、EU编号第309号、EU编号第315号、EU编号第360号、EU编号第385号、EU编号第386号、EU编号第387号、EU编号第389号、EU编号第428号和EU编号第433号的多肽。

该方案中进一步优选的多肽可举出：所述Fc区环部位的氨基酸变异是选自EU编号第247号的氨基酸置换为Val、EU编号第250号的氨基酸置换为Phe、Ile、Met、Val、Trp或Tyr的任意一种、EU编号第307号的氨基酸置换为Ala、Gln或Pro的任意一种、EU编号第309号的氨基酸置换为Ala、Arg或Pro的任意一种、EU编号第315号的氨基酸置换为Ala、EU编号第360号的氨基酸置换为His、EU编号第385号的氨基酸置换为Asp、EU编号第386号的氨基酸置换为Pro、EU编号第387号的氨基酸置换为Glu、EU编号第389号的氨基酸置换为Ser、EU编号第428号的氨基酸置换为His、Trp、Tyr或Phe的任意一种、以及EU编号第433号的氨基酸置换为Lys的至少一个以上的氨基酸变异的多肽。

该方案中进一步优选的多肽为：所述Fc区环部位的氨基酸变异是EU编号第247号的氨基酸置换为Val、EU编号第250号的氨基酸置换为Phe、Ile、Met、Val、Trp或Tyr的任意一种、EU编号第307号的氨基酸置换为Ala、Gln或Pro的任意一种、EU编号第309号的氨基酸置换为Ala、Arg或Pro的任意一种、EU编号第315号的氨基酸置换为Ala、EU编号第360号的氨基酸置换为His、EU编号第385号的氨基酸置换为Asp、EU编号第386号的氨基酸置换为Pro、EU编号第387号的氨基酸置换为Glu、EU编号第389号的氨基酸置换为Ser、EU编号第428号的氨基酸置换为His、Trp、Tyr或Phe的任意一种、以及EU编号第433号的氨基酸置换为Lys的多肽。

例如该多肽为抗体时，可举出该抗体优选作为效应子功能重要的癌症抗体的应用。

并且，本发明的多肽还可以是，不仅与亲本多肽比较稳定性提高，而且与亲本多肽比较具有与Fcγ受体的结合活性减少的Fc区的多肽。本发明中，作为不仅与亲本多肽比较稳定性提高、而且与亲本多肽比较具有与FcγR的结合活性减少的Fc区的多肽，例如可举出具有后述实施例所示的TS9-TS19、TS28-TS43、TS51或TS56的氨基酸变异部位的多肽。

(TS9-TS19)

与亲本多肽比较、与FcγR的结合活性减少的多肽例如可举出：在所述Fc区环部位的选自EU编号第234号、EU编号第235号、EU编号第239号、EU编号第267号、EU编号第268号、EU编号第270号、EU编号第295号、EU编号第296号、EU编号第298号和EU编号第325号的氨基酸部位导入至少一个以上氨基酸突变的多肽。

该方案的优选多肽是：所述Fc区环部位的氨基酸变异部位为EU编号第234号、EU编号第235号、EU编号第239号、EU编号第267号、EU编号第268号、EU编号第270号、EU编号第295号、EU编号第296号、EU编号第298号和EU编号第325号的多肽。

该方案中进一步优选的多肽可举出：所述Fc区环部位的氨基酸变异是选自EU编号第234号的氨基酸置换为Lys或Arg、EU编号第235号的氨基酸置换为Lys或Arg、EU编号第239号的氨基酸置换为Lys、EU编号第267号的氨基酸置换为Pro、EU编号第268号的氨基酸置换为Met或Lys、EU编号第270号的氨基酸置换为Phe、EU编号第295号的氨基酸置换为Met、EU编号第296号的氨基酸置换为Gly、EU编号第298号的氨基酸置换为Gly、以及EU编号第325号的氨基酸置换为Gly、His或Met的任意一种的至少一个以上的氨基酸变异的多肽。

该方案中进一步优选的多肽是：所述Fc区环部位的氨基酸变异是EU编号第234号的氨基酸置换为Lys或Arg、EU编号第235号的氨基酸置换为Lys或Arg、EU编号第239号的氨基酸置换为Lys、EU编号第267号的氨基酸置换为Pro、EU编号第268号的氨基酸置换为Met或Lys、EU编号第270号的氨基酸置换为Phe、EU编号第295号的氨基酸置换为Met、EU编号第296号的氨基酸置换为Gly、EU编号第298号的氨基酸置换为Gly、以及EU编号第325号的氨基酸置换为Gly、His或Met的任意一种的多肽。

(TS28-TS34)

与亲本多肽比较、与FcγR的结合活性减少的多肽例如可举出：在所述Fc区环部位的选自EU编号第234号、EU编号第235号、EU编号第239号、EU编号第268号、EU编号第270号、EU编号第295号、EU编号第296号、EU编号第298号和EU编号第325号的氨基酸部位导入至少一个以上的氨基酸突变的多肽。

该方案的优选多肽是：所述Fc区环部位的氨基酸变异部位为EU编号第234号、EU编号第235号、EU编号第239号、EU编号第268号、EU编号第270号、EU编号第295号、EU编号第296号、EU编号第298号和EU编号第325号的多肽。

该方案中进一步优选的多肽可举出：所述Fc区环部位的氨基酸变异是选自EU编号第234号的氨基酸置换为Lys、EU编号第235号的氨基酸置换为Lys或Arg、EU编号第239号的氨基酸置换为Lys或Ser、EU编号第268号的氨基酸置换为Lys或His、EU编号第270号的氨基酸置换为Phe或Asp、EU编号第295号的氨基酸置换为Met、EU编号第296号的氨基酸置换为Gly、EU编号第298号的氨基酸置换为Gly、以及EU编号第325号的氨基酸置换为His或Gly的至少一个以上的氨基酸变异的多肽。

该方案中进一步优选的多肽是：所述Fc区环部位的氨基酸变异是EU编号第234号的氨基酸置换为Lys、EU编号第235号的氨基酸置换为Lys或Arg、EU编号第239号的氨基酸置换为Lys或Ser、EU编号第268号的氨基酸置换为Lys或His、EU编号第270号的氨基酸置换为Phe或Asp、EU编号第295号的氨基酸置换为Met、EU编号第296号的氨基酸置换为Gly、EU编号第298号的氨基酸置换为Gly、以及EU编号第325号的氨基酸置换为His或Gly的多肽。

(TS28、TS29、TS36、TS37)

与亲本多肽比较、与FcγR的结合活性减少的多肽例如可举出：在所述Fc区环部位的选自EU编号第234号、EU编号第235号、EU编号第239号、EU编号第268号、EU编号第270号、EU编号第295号、EU编号第296号、EU编号第298号和EU编号第325号的氨基酸部位导入至少一个以上的氨基酸突变的多肽。

该方案的优选多肽是：所述Fc区环部位的氨基酸变异部位为EU编号第234号、EU编号第235号、EU编号第239号、EU编号第268号、EU编号第270号、EU编号第295号、EU编号第296号、EU编号第298号和EU编号第325号的多肽。

该方案中进一步优选的多肽可举出：所述Fc区环部位的氨基酸变异是选自EU编号第234号的氨基酸置换为Lys、EU编号第235号的氨基酸置换为Lys或Arg、EU编号第239号的氨基酸置换为Lys、EU编号第268号的氨基酸置换为Lys、EU编号第270号的氨基酸置换为Phe、EU编号第295号的氨基酸置换为Met、EU编号第296号的氨基酸置换为Gly、EU编号第298号的氨基酸置换为Gly、以及EU编号第325号的氨基酸置换为His或Gly的至少一个以上的氨基酸变异的多肽。

该方案中进一步优选的多肽是：所述Fc区环部位的氨基酸变异是EU编号第234号的氨基酸置换为Lys、EU编号第235号的氨基酸置换为Lys或Arg、EU编号第239号的氨基酸置换为Lys、EU编号第268号的氨基酸置换为Lys、EU编号第270号的氨基酸置换为Phe、EU编号第295号的氨基酸置换为Met、EU编号第296号的氨基酸置换为Gly、EU编号第298号的氨基酸置换为Gly、以及EU编号第325号的氨基酸置换为His或Gly的多肽。

(TS30、TS31、TS38、TS39)

与亲本多肽比较、与FcγR的结合活性减少的多肽例如可举出：在所述Fc区环部位的选自EU编号第234号、EU编号第235号、EU编号第239号、EU编号第295号、EU编号第296号、EU编号第298号和EU编号第325号的氨基酸部位导入至少一个以上的氨基酸突变的多肽。

该方案的优选多肽是：所述Fc区环部位的氨基酸变异部位为EU编号第234号、EU编号第235号、EU编号第239号、EU编号第295号、EU编号第296号、EU编号第298号和EU编号第325号的多肽。

该方案中进一步优选的多肽可举出：所述Fc区环部位的氨基酸变异是选自EU编号第234号的氨基酸置换为Lys、EU编号第235号的氨基酸置换为Lys或Arg、EU编号第239号的氨基酸置换为Lys、EU编号第295号的氨基酸置换为Met、EU编号第296号的氨基酸置换为Gly、EU编号第298号的氨基酸置换为Gly、以及EU编号第325号的氨基酸置换为His或Gly的至少一个以上的氨基酸变异的多肽。

该方案中进一步优选的多肽是：所述Fc区环部位的氨基酸变异是EU编号第234号的氨基酸置换为Lys、EU编号第235号的氨基酸置换为Lys或Arg、EU编号第239号的氨基酸置换为Lys、EU编号第295号的氨基酸置换为Met、EU编号第296号的氨基酸置换为Gly、EU编号第298号的氨基酸置换为Gly、以及EU编号第325号的氨基酸置换为His或Gly的多肽。

(TS32、TS33、TS40、TS41)

与亲本多肽比较、与FcγR的结合活性减少的多肽例如可举出：在所述Fc区环部位的选自EU编号第234号、EU编号第235号、EU编号第268号、EU编号第270号、EU编号第295号、EU编号第296号、EU编号第298号和EU编号第325号的氨基酸部位导入至少一个以上的氨基酸突变的多肽。

该方案的优选多肽是：所述Fc区环部位的氨基酸变异部位为EU编号第234号、EU编号第235号、EU编号第268号、EU编号第270号、EU编号第295号、EU编号第296号、EU编号第298号和EU编号第325号的多肽。

该方案中进一步优选的多肽可举出：所述Fc区环部位的氨基酸变异是选自EU编号第234号的氨基酸置换为Lys、EU编号第235号的氨基酸置换为Lys或Arg、EU编号第268号的氨基酸置换为Lys、EU编号第270号的氨基酸置换为Phe、EU编号第295号的氨基酸置换为Met、EU编号第296号的氨基酸置换为Gly、EU编号第298号的氨基酸置换为Gly、以及EU编号第325号的氨基酸置换为His或Gly的至少一个以上的氨基酸变异的多肽。

该方案中进一步优选的多肽是：所述Fc区环部位的氨基酸变异是EU编号第234号的氨基酸置换为Lys、EU编号第235号的氨基酸置换为Lys或Arg、EU编号第268号的氨基酸置换为Lys、EU编号第270号的氨基酸置换为Phe、EU编号第295号的氨基酸置换为Met、EU编号第296号的氨基酸置换为Gly、EU编号第298号的氨基酸置换为Gly、以及EU编号第325号的氨基酸置换为His或Gly的多肽。

(TS34、TS35、TS42、TS43)

与亲本多肽比较、与FcγR的结合活性减少的多肽例如可举出：在所述Fc区环部位的选自EU编号第234号、EU编号第235号、EU编号第295号、EU编号第296号、EU编号第298号和EU编号第325号的氨基酸部位导入至少一个以上的氨基酸突变的多肽。

该方案的优选多肽是：所述Fc区环部位的氨基酸变异部位为EU编号第234号、EU编号第235号、EU编号第295号、EU编号第296号、EU编号第298号和EU编号第325号的多肽。

该方案中进一步优选的多肽可举出：所述Fc区环部位的氨基酸变异是选自EU编号第234号的氨基酸置换为Lys、EU编号第235号的氨基酸置换为Lys或Arg、EU编号第295号的氨基酸置换为Met、EU编号第296号的氨基酸置换为Gly、EU编号第298号的氨基酸置换为Gly、以及EU编号第325号的氨基酸置换为His或Gly的至少一个以上的氨基酸变异的多肽。

该方案中进一步优选的多肽是：所述Fc区环部位的氨基酸变异是EU编号第234号的氨基酸置换为Lys、EU编号第235号的氨基酸置换为Lys或Arg、EU编号第295号的氨基酸置换为Met、EU编号第296号的氨基酸置换为Gly、EU编号第298号的氨基酸置换为Gly、以及EU编号第325号的氨基酸置换为His或Gly的多肽。

(TS51、TS56)

与亲本多肽比较、与FcγR的结合活性减少的多肽例如可举出：在所述Fc区环部位的EU编号第298号和EU编号第309号的氨基酸部位导入至少一个以上的氨基酸突变的多肽。

该方案的优选多肽是：所述Fc区环部位的氨基酸变异为EU编号第298号、EU编号第309号的多肽。

该方案中进一步优选的多肽可举出：所述Fc区环部位的氨基酸变异是选自EU编号第298号的氨基酸置换为Gly和EU编号第309号的氨基酸置换为Asp的至少一个以上的氨基酸变异的多肽。

该方案中进一步优选的多肽可举出：所述Fc区环部位的氨基酸变异是EU编号第298号的氨基酸置换为Gly和EU编号第309号的氨基酸置换为Asp的多肽。

例如该多肽为抗体时，该抗体可优选举出作为中和抗体的应用。

Fcγ受体是指可与IgG1、IgG2、IgG3、IgG4单克隆抗体的Fc区结合的受体，也指实质上由Fcγ受体基因所编码的蛋白质家族的任意成员。对于人，该家族包含：含有同种型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc的FcγRI(CD64)；包含同种型FcγRIIa(包含同种异型H131(H型)和R131(R型))、FcγRIIb(包含FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc的FcγRII(CD32)；以及包含同种型FcγRIIIa(包含同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包含同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)的FcγRIII(CD16)；以及任何未发现的人FcγR类或FcγR同种型或同种异型，但并不限定于它们。本发明的FcγR中不仅是所述来自人的受体，也包含来自小鼠、大鼠、兔和猴的受体，但并不限于它们，可以来自任何生物。小鼠FcγR类也包含FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)和FcγRIII-2(CD16-2)、以及任何未发现的小鼠FcγR同种型或同种异型，但并不限于它们。本发明中的Fcγ受体的优选例子可举出：人FcγI(CD64)、FcγIIA(CD32)、FcγIIB(CD32)、FcγIIIA(CD16)和/或FcγIIIB(CD16)。

FcγRI的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记于SEQ ID NO:1(NM_000566.3)和2(NP_000557.1)，

FcγIIA的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记于SEQ ID NO:3(BC020823.1)和4(AAH20823.1)，FcγIIB的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记于SEQ ID NO:5(BC146678.1)和6(AAI46679.1)，FcγIIIA的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记于SEQ ID NO:7(BC033678.1)和8(AAH33678.1)，以及

FcγIIIB的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记于SEQ ID NO:9(BC128562.1)和10(AAI28563.1)(括号内表示RefSeq登记编号)。

另外，FcγRIIa存在FcγRIIa的第131号氨基酸置换为组氨酸(H型)或精氨酸(R型)的2种基因多态性。(J.Exp.Med,172,19-25,1990)。

本发明中，本发明的多肽或Fc区与各种FcγR的结合活性是否减少或者结合活性是否保持或增强，这例如可如本实施例所示进行判断。即，使用利用表面等离子体共振(SPR)现象的相互作用分析仪器BIACORE，将多肽(抗体)固定在传感芯片上，或者用蛋白A、抗原肽等将多肽(抗体)捕获在传感芯片上，将各种FcγR作为分析物流过，通过所得解离常数(KD)值降低或者增加来判断；或者将多肽(抗体)固定在传感芯片上，或者用蛋白A、抗原肽等将多肽(抗体)捕获在传感芯片上，将各种FcγR作为分析物流过，通过流过前后传感图谱值的变化量降低或者增加来判断。

具体来说，Fc区与Fcγ受体的结合活性除了通过ELISA或FACS(荧光激活细胞分选术)测定之外，还可通过ALPHA筛选(Amplified Luminescent Proximity HomogeneousAssay，放大发光邻近均相测定)或利用表面等离子体共振(SPR)现象的BIACORE法等测定(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010)。

ALPHA筛选是根据使用供体和受体两种珠的ALPHA技术、基于下述原理实施。与供体珠结合的分子与和受体珠结合的分子发生生物学相互作用，只在两种珠接近的状态时才可检测出发光信号。由激光激发的供体珠内的光敏剂将周边的氧转变为激发状态的单线态氧。单线态氧向供体珠周边扩散，如果到达接近的受体珠，则引发珠内的化学发光反应，最终释放光。与供体珠结合的分子和与受体珠结合的分子不发生相互作用时，供体珠所产生的单线态氧未到达受体珠，因此不引起化学发光反应。

例如，生物素标记的多肽缔合物与供体珠结合，用谷胱甘肽S转移酶(GST)标记的Fcγ受体与受体珠结合。在互相竞争的、具有突变Fc区的多肽缔合物不存在下，具有野生型Fc区的多肽缔合物与Fcγ受体相互作用，产生520-620nm的信号。未标记的、具有突变Fc区的多肽缔合物与具有野生型Fc区的多肽缔合物竞争在Fcγ受体间的相互作用。通过对竞争结果所表现出的荧光的减少进行定量，可以确定相对的结合亲和性。

使用Sulfo-NHS-生物素等将抗体等多肽缔合物进行生物素化，这是公知的。用GST对Fcγ受体进行标记的方法可适当采用以下方法等：将编码Fcγ受体的多核苷酸与编码GST的多核苷酸进行框内融合，将所得融合基因保持在可表达的载体上，在保有该载体的细胞等中表达，使用谷胱甘肽柱进行纯化。所得信号例如可使用GRAPHPAD PRISM(GraphPad公司，San Diego)等软件，使其拟合于利用非线性回归分析的单位点竞争(one-sitecompetition)模型来进行适当的分析。

将要观察相互作用的物质的一方(配体)固定于传感芯片的金薄膜上，照射光，使其自传感芯片的背面一侧，在金薄膜和玻璃的界面发生全反射，则反射光的一部分中形成反射强度降低的部分(SPR信号)。将要观察相互作用的物质的另一方(分析物)流过传感芯片的表面，分析物与配体结合，则被固定的配体分子的质量增加，传感芯片表面溶剂的折射率发生变化。由于该折射率的变化，SPR信号的位置发生位移(相反，如果结合解离，则信号的位置恢复)。Biacore系统是以所述位移量、即传感芯片表面的质量变化为纵轴，以质量随时间的变化作为测定数据表示(传感谱)。由传感谱求出在传感芯片表面捕获的分析物与配体的结合量。还由传感谱的曲线求出动力学：结合速率常数(ka)与解离速率常数(kd)，由该常数之比求出解离常数(KD)。BIACORE法也适合采用阻碍测定法。阻碍测定法的例子记载于Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010。

本发明中，与FcγR的结合活性减少的多肽是指：使亲本多肽、和亲本多肽的Fc区含有至少一个氨基酸变异的多肽(也称为多肽突变体)的量实质上相同，进行测定时，相对于至少一种FcγR，是以比亲本多肽实质上更弱的结合亲和性进行结合。

例如，在按照所述测定法测定的结合量中，以亲本多肽与各FcγR的结合量为100时，多肽突变体与各FcγR的结合量(以下称为结合量比)优选降低至80以下，还优选50以下、40以下、30以下、20以下，特别优选10以下、5以下、4以下、3以下、2以下、1以下、0.1以下。

本发明中，与FcγR的结合活性增强的多肽是指：使亲本多肽的量、和多肽突变体的量实质上相同，进行测定时，相对于至少一种FcγR，是以比亲本多肽实质上更强的结合亲和性与FcγR结合。

例如，在按照所述测定法测定的结合量中，以亲本多肽与各FcγR的结合量为100时，多肽突变体与各FcγR的结合量(以下称为结合量比)优选提高至120以上、150以上、200以上、300以上。

保持与FcγR的结合活性(得到保持)的多肽是指：使亲本多肽、和亲本多肽的Fc区含有至少一个氨基酸变异的多肽(也称为多肽突变体)的量实质上相同，进行测定时，与亲本多肽相比实质上没有变化、以同等的结合亲和性与FcγR结合。

例如，在按照所述测定法测定的结合量中，以亲本多肽与各FcγR的结合量为100时，多肽突变体与各FcγR的结合量(以下称为结合量比)优选为80以上且为120以下。

本发明对于本发明的含有所述变异的多肽(例如人IgG)，可以进一步对Fc区施加其它变异。

例如，对Fc区的其它变异可举出：对于人IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)，将EU编号第238号的Pro置换为Asp的变异和/或将EU编号第328号的Leu置换为Glu的变异。通过对人IgG导入将EU编号第238号的Pro置换为Asp的变异和/或将EU编号第328号的Leu置换为Glu的变异，可提供与亲本多肽比较、与FcγRI、FcγRIIIa和FcγRIIa的R型、H型的任意基因多态性的结合活性保持或减少、且与FcγRIIb的结合活性增强的多肽。

对于包含将EU编号第238号的Pro置换为Asp的变异和/或将EU编号第328号的Leu置换为Glu的变异的人IgG，可以进一步施加对Fc区的其它变异。这里，变异是指氨基酸的置换、缺失、附加、插入的任意一种或它们的组合。在这些变异的基础上也可以进一步含有附加性变异。附加性变异例如可从氨基酸的置换、缺失或修饰的任意一种或它们的组合中选择。例如，可以施加与FcγRI、FcγRIIa(H型)、FcγRIIa(R型)、FcγRIIIa的任意一种的结合活性进一步降低的变异。

其中，优选不降低与FcγRIIb的结合活性、只降低与FcγRI、FcγRIIa(H型)、FcγRIIa(R型)、FcγRIIIa的任意一种的结合活性的变异，作为这样的变异，优选的氨基酸置换例如可举出：EU编号第237号的Gly置换为Trp、EU编号第237号的Gly置换为Phe、EU编号第238号的Pro置换为Phe、EU编号第325号的Asn置换为Met、EU编号第267号的Ser置换为Ile、EU编号第328号的Leu置换为Asp、EU编号第267号的Ser置换为Val、EU编号第328号的Leu置换为Trp、EU编号第267号的Ser置换为Gln、EU编号第267号的Ser置换为Met、EU编号第236号的Gly置换为Asp、EU编号第327号的Ala置换为Asn、EU编号第325号的Asn置换为Ser、EU编号第235号的Leu置换为Tyr、EU编号第266号的Val置换为Met、EU编号第328号的Leu置换为Tyr、EU编号第235号的Leu置换为Trp、EU编号第235号的Leu置换为Phe、EU编号第239号的Ser置换为Gly、EU编号第327号的Ala置换为Glu、EU编号第327号的Ala置换为Gly、EU编号第238号的Pro置换为Leu、EU编号第239号的Ser置换为Leu、EU编号第328号的Leu置换为Thr、EU编号第328号的Leu置换为Ser、EU编号第328号的Leu置换为Met、EU编号第331号的Pro置换为Trp、EU编号第331号的Pro置换为Tyr、EU编号第331号的Pro置换为Phe、EU编号第327号的Ala置换为Asp、EU编号第328号的Leu置换为Phe的变异、EU编号第271号的Pro置换为Leu、EU编号第267号的Ser置换为Glu、EU编号第328号的Leu置换为Ala、EU编号第328号的Leu置换为Ile、EU编号第328号的Leu置换为Gln、EU编号第328号的Leu置换为Val、EU编号第326号的Lys置换为Trp、EU编号第334号的Lys置换为Arg、EU编号第268号的His置换为Gly、EU编号第268号的His置换为Asn、EU编号第324号的Ser置换为Val、EU编号第266号的Val置换为Leu、EU编号第271号的Pro置换为Gly、EU编号第332号的Ile置换为Phe、EU编号第324号的Ser置换为Ile、EU编号第333号的Glu置换为Pro、EU编号第300号的Tyr置换为Asp、EU编号第337号的Ser置换为Asp、EU编号第300号的Tyr置换为Gln、EU编号第335号的Thr置换为Asp、EU编号第239号的Ser置换为Asn、EU编号第326号的Lys置换为Leu、EU编号第326号的Lys置换为Ile、EU编号第239号的Ser置换为Glu、EU编号第326号的Lys置换为Phe、EU编号第326号的Lys置换为Val、EU编号第326号的Lys置换为Tyr、EU编号第267号的Ser置换为Asp、EU编号第326号的Lys置换为Pro、EU编号第326号的Lys置换为His的变异、EU编号第334号的Lys置换为Ala、EU编号第334号的Lys置换为Trp、EU编号第268号的His置换为Gln、EU编号第326号的Lys置换为Gln、EU编号第326号的Lys置换为Glu、EU编号第326号的Lys置换为Met、EU编号第266号的Val置换为Ile、EU编号第334号的Lys置换为Glu、EU编号第300号的Tyr置换为Glu、EU编号第334号的Lys置换为Met、EU编号第334号的Lys置换为Val、EU编号第334号的Lys置换为Thr、EU编号第334号的Lys置换为Ser、EU编号第334号的Lys置换为His、EU编号第334号的Lys置换为Phe、EU编号第334号的Lys置换为Gln、EU编号第334号的Lys置换为Pro、EU编号第334号的Lys置换为Tyr、EU编号第334号的Lys置换为Ile、EU编号第295号的Gln置换为Leu、EU编号第334号的Lys置换为Leu、EU编号第334号的Lys置换为Asn、EU编号第268号的His置换为Ala、EU编号第239号的Ser置换为Asp、EU编号第267号的Ser置换为Ala。

并且在这些变异中，优选不降低与FcγRIIb的结合活性、降低与FcγRIIa(R型)的结合活性的变异，作为这样的变异，优选的氨基酸置换例如可举出：EU编号第237号的Gly置换为Trp、EU编号第328号的Leu置换为Asp、EU编号第236号的Gly置换为Asp、EU编号第327号的Ala置换为Asn、EU编号第327号的Ala置换为Gly、EU编号第239号的Ser置换为Leu、EU编号第331号的Pro置换为Trp的变异、EU编号第331号的Pro置换为Tyr、EU编号第331号的Pro置换为Phe的变异、EU编号第271号的Pro置换为Leu、EU编号第328号的Leu置换为Gln、EU编号第300号的Tyr置换为Asp、EU编号第239号的Ser置换为Asn。

并且，对于含有EU编号第238号的Pro置换为Asp和/或EU编号第328号的Leu置换为Glu的人IgG，通过施加对Fc区的其它变异，可以施加与FcγRIIb的结合活性得到增强的变异。这些变异中，优选不增强与FcγRI、FcγRIIa(H型)、FcγRIIa(R型)、FcγRIIIa的任意一种的结合活性、只增强与FcγRIIb的结合活性的变异，作为这样的变异，优选的氨基酸置换例如可举出：EU编号第237号的Gly置换为Trp、EU编号第237号的Gly置换为Phe、EU编号第238号的Pro置换为Phe、EU编号第325号的Asn置换为Met、EU编号第267号的Ser置换为Ile、EU编号第328号的Leu置换为Asp、EU编号第267号的Ser置换为Val、EU编号第328号的Leu置换为Trp、EU编号第267号的Ser置换为Gln、EU编号第267号的Ser置换为Met、EU编号第236号的Gly置换为Asp、EU编号第327号的Ala置换为Asn、EU编号第325号的Asn置换为Ser、EU编号第235号的Leu置换为Tyr、EU编号第266号的Val置换为Met、EU编号第328号的Leu置换为Tyr、EU编号第235号的Leu置换为Trp、EU编号第235号的Leu置换为Phe、EU编号第239号的Ser置换为Gly、EU编号第327号的Ala置换为Glu、EU编号第327号的Ala置换为Gly、EU编号第238号的Pro置换为Leu、EU编号第239号的Ser置换为Leu、EU编号第328号的Leu置换为Thr、EU编号第328号的Leu置换为Ser、EU编号第328号的Leu置换为Met、EU编号第331号的Pro置换为Trp、EU编号第331号的Pro置换为Tyr、EU编号第331号的Pro置换为Phe、EU编号第327号的Ala置换为Asp、EU编号第328号的Leu置换为Phe、EU编号第271号的Pro置换为Leu、EU编号第267号的Ser置换为Glu、EU编号第328号的Leu置换为Ala、EU编号第328号的Leu置换为Ile、EU编号第328号的Leu置换为Gln、EU编号第328号的Leu置换为Val、EU编号第326号的Lys置换为Trp、EU编号第334号的Lys置换为Arg、EU编号第268号的His置换为Gly、EU编号第268号的His置换为Asn、EU编号第324号的Ser置换为Val、EU编号第266号的Val置换为Leu、EU编号第271号的Pro置换为Gly、EU编号第332号的Ile置换为Phe、EU编号第324号的Ser置换为Ile、EU编号第333号的Glu置换为Pro、EU编号第300号的Tyr置换为Asp、EU编号第337号的Ser置换为Asp、EU编号第300号的Tyr置换为Gln、EU编号第335号的Thr置换为Asp、EU编号第239号的Ser置换为Asn、EU编号第326号的Lys置换为Leu、EU编号第326号的Lys置换为Ile、EU编号第239号的Ser置换为Glu、EU编号第326号的Lys置换为Phe、EU编号第326号的Lys置换为Val、EU编号第326号的Lys置换为Tyr、EU编号第267号的Ser置换为Asp、EU编号第326号的Lys置换为Pro、EU编号第326号的Lys置换为His、EU编号第334号的Lys置换为Ala、EU编号第334号的Lys置换为Trp、EU编号第268号的His置换为Gln、EU编号第326号的Lys置换为Gln、EU编号第326号的Lys置换为Glu、EU编号第326号的Lys置换为Met、EU编号第266号的Val置换为Ile、EU编号第334号的Lys置换为Glu、EU编号第300号的Tyr置换为Glu、EU编号第334号的Lys置换为Met、EU编号第334号的Lys置换为Val、EU编号第334号的Lys置换为Thr、EU编号第334号的Lys置换为Ser、EU编号第334号的Lys置换为His、EU编号第334号的Lys置换为Phe、EU编号第334号的Lys置换为Gln、EU编号第334号的Lys置换为Pro、EU编号第334号的Lys置换为Tyr、EU编号第334号的Lys置换为Ile、EU编号第295号的Gln置换为Leu、EU编号第334号的Lys置换为Leu、EU编号第334号的Lys置换为Asn、EU编号第268号的His置换为Ala、EU编号第239号的Ser置换为Asp、EU编号第267号的Ser置换为Ala。

并且在这些变异中，优选不降低与FcγRIIb的结合活性、而降低与FcγRIIa(R型)的结合活性的变异，作为这样的变异，优选的氨基酸置换例如可举出：EU编号第237号的Gly置换为Trp、EU编号第328号的Leu置换为Asp、EU编号第236号的Gly置换为Asp、EU编号第327号的Ala置换为Asn、EU编号第327号的Ala置换为Gly、EU编号第239号的Ser置换为Leu、EU编号第331号的Pro置换为Trp、EU编号第331号的Pro置换为Tyr、EU编号第331号的Pro置换为Phe、EU编号第271号的Pro置换为Leu、EU编号第328号的Leu置换为Gln、EU编号第300号的Tyr置换为Asp、EU编号第239号的Ser置换为Asn。

还可以对抗体的Fc区部分施加例如提高与FcRn的结合活性的氨基酸置换(JImmunol.2006Jan 1；176(1):346-56、J Biol Chem.2006Aug 18；281(33):23514-24.、IntImmunol.2006Dec；18(12):1759-69.、Nat Biotechnol.2010Feb；28(2):157-9.、WO/2006/019447、WO/2006/053301、WO/2009/086320)、用于使抗体的异质性或稳定性提高的氨基酸置换(WO/2009/041613)。

本发明的氨基酸的变异中还可适当施加以下变异。

为了控制抗体的血浆中滞留性，可以将本发明的氨基酸的变异与用于改变抗体的等电点值(pI值)的氨基酸变异组合。关于恒定区的变异，例如可举出公知文献(J.Immunol.2006,176(1):346-356或Nat.Biotechnol.1997 15(7):637-640等)记载的EU编号第250号或第428号等的氨基酸的变异。可变区的变异可举出WO2007/114319或WO2009/041643所述的氨基酸的变异。变异的氨基酸优选为暴露于具有抗原结合活性的多肽的表面的氨基酸。例如，本发明的多肽具有重链恒定区时，可举出重链恒定区的氨基酸序列中EU编号第196号的氨基酸的置换。重链恒定区为IgG4时，例如通过将第196号的赖氨酸置换为谷氨酰胺，可以降低pI值，提高血浆中滞留性。血浆中滞留性也可通过改变与FcRn的结合力来控制。用于改变与FcRn的结合力的氨基酸变异例如可举出公知文献(The Journal ofBiological Chemistry vol.276,No.9 6591-6604,2001或Molecular Cell,Vol.7,867-877,2001)中所述的抗体重链恒定区的氨基酸的置换。

用于提高酸性条件下的稳定性的变异

例如本发明的多肽具有IgG4重链恒定区时，优选抑制酸性条件下IgG4的半分子化，保持稳定的4链结构(H2L2结构)。因此，优选将在4链结构的保持中发挥重要作用的EU编号第409号氨基酸精氨酸(Immunology 2002,105,9-19)置换为在酸性条件下也保持稳定的4链结构的IgG1型的赖氨酸。可以将这样的变异与本发明的氨基酸变异组合使用。

用于降低异质性的变异

可以将本发明的氨基酸的变异与WO2009/041613所述的方法组合。具体来说，例如本发明的多肽具有IgG1重链恒定区时，将使IgG1重链恒定区的C末端的2个氨基酸、即EU编号第446号的甘氨酸和第447号的赖氨酸缺失的变异与基于本发明实施例的氨基酸的变异组合，可实现异质性的降低。

用于抑制脱酰胺反应的变异

本发明的氨基酸的变异可以与用于抑制脱酰胺反应的氨基酸的变异组合。有报道称，脱酰胺反应特别容易在天冬酰胺(N)和甘氨酸(G)相邻接的部位(…NG…)发生(Geiger等人,J.Bio.Chem.1987；262:785-794)。本发明的多肽中存在天冬酰胺与甘氨酸相邻接的部位时，通过改变该氨基酸序列，可以抑制脱酰胺反应。具体来说，例如是将天冬酰胺和甘氨酸的任意一方或两者的氨基酸序列置换为其它的氨基酸。更具体来说，例如将天冬酰胺置换为天冬氨酸。

本发明的多肽的优选例子可举出IgG抗体。使用IgG抗体作为抗体时，其Fc区的种类没有限定，可以使用IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等的同种型(亚类)的IgG。本发明的IgG抗体优选人IgG，进一步优选人IgG1或人IgG4，人IgG1和人IgG4的重链Fc区的氨基酸序列是公知的。作为人IgG1Fc区，基因多态性产生的多个同种异型序列记载于Sequences of proteinsof immunological interest,NIH Publication No.91-3242，本发明中可以是其中任意一种。

<置换>

例如以对下述(a)-(c)的方面进行改变为目的，可以将氨基酸残基置换为其它氨基酸残基：

(a)片结构或者螺旋结构区中的多肽的主链结构，

(b)靶部位的电荷或疏水性，或

(c)侧链的大小。

氨基酸残基根据常规的侧链的特性，分类为以下组：

(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；

(2)中性亲水性：cys、ser、thr、asn、gln；

(3)酸性：asp、glu；

(4)碱性：his、lys、arg；

(5)对链的取向有影响的残基：gly、pro；以及

(6)芳族性：trp、tyr、phe。

这些各组内的氨基酸残基的置换被称为保守性置换，而与其它组之间的氨基酸残基的置换称为非保守性置换。本发明的置换可以是保守性置换也可以是非保守性置换，还可以是保守性置换与非保守性置换的组合。

氨基酸序列的变异通过本领域公知的各种方法制备。这些方法可通过位点特异性诱变法(Hashimoto-Gotoh,T,Mizuno,T,Ogasahara,Y和Nakagawa,M.(1995)Anoligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directedmutagenesis.Gene 152,271-275、Zoller,MJ和Smith,M.(1983)Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors.MethodsEnzymol.100,468-500、Kramer,W,Drutsa,V,Jansen,HW,Kramer,B,Pflugfelder,M和Fritz,HJ(1984)The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directedmutation construction.Nucleic Acids Res.12,9441-9456、Kramer W和Fritz HJ(1987)Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplexDNAMethods.Enzymol.154,350-367、Kunkel,TA(1985)Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U SA.82,488-492)、PCR突变法、盒式突变法等方法进行，但并不限于以上所述。

本发明的氨基酸的修饰包含翻译后的修饰。具体的翻译后修饰可以给出糖链的附加或缺失。例如在包含SEQ ID NO:11所述的氨基酸序列的IgG1 Fc区中，EU编号第297号的氨基酸残基可以是用糖链修饰。进行修饰的糖链结构没有限定。通常在真核细胞中表达的抗体是在Fc区含有糖链修饰。因此，在如下所述的细胞中表达的抗体通常可被一些糖链修饰。

·哺乳动物的抗体生成细胞

·用含有编码抗体的DNA的表达载体转化的真核细胞。

这里示出的真核细胞包含酵母或动物细胞。例如CHO细胞或HEK293H细胞是用于用含有编码抗体的DNA的表达载体转化的代表性的动物细胞。而本发明的Fc区也含有该位置没有糖链修饰的Fc区。Fc区未被糖链修饰的抗体可以是将编码抗体的基因在大肠杆菌等原核细胞中表达获得。

更具体来说，例如可以是在Fc区的糖链上附加唾液酸(MAbs.2010Sep-Oct；2(5):519-27.)。

<抗体>

本发明进一步提供具有上述任意所述的氨基酸序列发生变异的Fc区的抗体。

本发明中的“抗体”的术语是以最广泛的含义使用，只要显示所需生物学活性即可，也包含单克隆抗体(包含全长单克隆抗体)、多克隆抗体、抗体突变体、抗体片段、多特异性抗体(例如双特异性抗体(有时也称为双重特异性抗体))、嵌合抗体、人源化抗体等任何抗体。

关于本发明的抗体，其抗原的种类、抗体的来源等不受限定，可以是任何抗体。抗体的来源没有特别限定，可举出人抗体、小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体等。

制备抗体的方法是本领域技术人员熟知的，例如为单克隆抗体时可以通过杂交瘤法(Kohler和Milstein,Nature 256:495(1975))、重组法(美国专利第4,816,567号)制造。还可以由噬菌体抗体文库分离(Clackson等人.,Nature 352:624-628(1991)；Marks等人.,J.Mol.Biol.222:581-597(1991))。本发明中，单克隆抗体也包含人源化抗体或嵌合抗体。

作为获得抗体基因的方法，除所述之外，Bernasconi等人(Science(2002)298,2199-2202)或WO2008/081008所述的B细胞克隆(各抗体编码序列的鉴定和克隆、其分离以及用于各抗体(特别是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)制作的表达载体的构建中的使用等)的方法也可适当使用。

并且本发明的抗体的糖链也可以变异。糖链变异的抗体的例子例如可举出：糖基化修饰的抗体(WO99/54342等)、附加到糖链上的果糖缺失的抗体(WO00/61739、WO02/31140、WO2006/067847、WO2006/067913等)、具有具平分型GlcNAc的糖链的抗体(WO02/79255等)等。

人源化抗体也称为重构人抗体。具体来说，将人以外的动物、例如小鼠抗体的CDR移植到人抗体所得的人源化抗体等是公知的。用于获得人源化抗体的常规基因重组方法也已知。具体来说，作为将小鼠抗体的CDR移植到人FR上的方法，例如重叠延伸PCR(OverlapExtension PCR)是公知的。还可进一步设计在人的FR区移植小鼠CDR的可变区的氨基酸，进行其氨基酸的基因合成。受托进行基因合成的公司的例子可举出：ライフテクノロジー、GenScript等。

编码3个CDR与4个FR连接而成的抗体可变区的DNA、和编码人抗体Fc区的DNA框内融合，插入到表达载体中，由此可以制作人源化抗体表达用载体。将该重组载体导入宿主，建立重组细胞，然后培养该重组细胞，使编码该人源化抗体的DNA表达，由此，该人源化抗体在该培养细胞的培养物中产生(参照欧洲专利公开EP239400、国际公开WO1996/002576)。

重构人抗体的CDR可根据需要置换FR的氨基酸残基，以形成适当的抗原结合部位。例如可以应用将小鼠的CDR移植于人FR所采用的PCR法，向FR中导入氨基酸序列的突变。

可以以具有人抗体基因的所有组成成分的转基因动物(参照国际公开WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、WO1996/033735)作为免疫动物，通过DNA免疫获取所需的人抗体。

进一步已知使用人抗体文库，通过淘选取得人抗体的技术。例如人抗体的V区是以单链抗体(scFv)的形式、通过噬菌体展示法在噬菌体的表面表达。可选择表达与抗原结合的scFv的噬菌体。通过对所选择的噬菌体的基因进行分析，可以确定编码与抗原结合的人抗体的V区的DNA序列。确定了与抗原结合的scFv的DNA序列之后，将该V区序列与所需人抗体C区的序列框内融合，然后插入适当的表达载体中，由此可制作表达载体。将该表达载体导入以上所例举的适合的表达细胞中，使编码该人抗体的基因表达，由此可取得该人抗体。这些方法已经公知(参照国际公开WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、WO1995/015388)。

本说明书中，抗原没有特别限定，可以是任何抗原。抗原的例子例如可优选举出：配体(细胞因子、趋化因子等)、受体、癌抗原、MHC抗原、分化抗原、免疫球蛋白和含有免疫球蛋白作为一部分的免疫复合物。

细胞因子的例子可举出：白细胞介素1-18、集落刺激因子(G-CSF、M-CSF、GM-CSF等)、干扰素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ等)、生长因子(EGF、FGF、IGF、NGF、PDGF、TGF、HGF等)、肿瘤坏死因子(TNF-α、TNF-β)、淋巴毒素、红细胞生成素、瘦素、SCF、TPO、MCAF、BMP。

趋化因子的例子可举出：CCL1-CCL28等的CC趋化因子、CXCL1-CXCL17等的CXC趋化因子、XCL1-XCL2等C趋化因子、CX3CL1等的CX3C趋化因子。

受体的例子例如可举出：属于造血因子受体家族、细胞因子受体家族、酪氨酸激酶受体家族、丝氨酸/苏氨酸激酶型受体家族、TNF受体家族、G蛋白共轭型受体家族、GPI锚固型受体家族、酪氨酸磷酸酶型受体家族、粘附因子家族、激素受体家族等受体家族的受体等。这些属于受体家族的受体及其特征在多种文献、例如Cooke BA.,King RJB.,van derMolen HJ.ed.New Comprehesive Biochemistry Vol.18B"Hormones and their ActionsPart II"pp.1-46(1988)Elsevier Science Publishers BV.、Patthy(Cell(1990)61(1),13-14)、Ullrich等人(Cell(1990)61(2),203-212)、Massague(e上标有锐音符)(Cell(1992)69(6),1067-1070)、Miyajima等人(Annu.Rev.Immunol.(1992)10,295-331)、Taga等人(FASEB J.(1992)6,3387-3396)、Fantl等人(Annu.Rev.Biochem.(1993),62,453-481)、Smith等人(Cell(1994)76(6)959-962)、Flower DR.Biochim.Biophys.Acta,Flower(Biochim.Biophys.Acta(1999)1422(3)207-234)等中有述。

属于所述受体家族的具体受体例如可适当例举：人或小鼠红细胞生成素(EPO)受体(Blood(1990)76(1),31-35、Cell(1989)57(2),277-285)、人或小鼠粒细胞集落刺激因子(G-CSF)受体(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1990)87(22),8702-8706、mG-CSFR、Cell(1990)61(2),341-350)、人或小鼠血小板生成素(TPO)受体(Proc Natl Acad Sci U S A.(1992)89(12),5640-5644、EMBO J.(1993)12(7),2645-53)、人或小鼠胰岛素受体(Nature(1985)313(6005),756-761)、人或小鼠Flt-3配体受体(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1994)91(2),459-463)、人或小鼠血小板来源的生长因子(PDGF)受体(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1988)85(10)3435-3439)、人或小鼠干扰素(IFN)-α、β受体(Cell(1990)60(2),225-234.和Cell(1994)77(3),391-400)、人或小鼠瘦素受体、人或小鼠生长激素(GH)受体、人或小鼠白细胞介素(IL)-10受体、人或小鼠胰岛素样生长因子(IGF)-I受体、人或小鼠白血病抑制因子(LIF)受体、人或小鼠睫状神经营养因子(CNTF)受体等。

癌抗原是伴随细胞恶性化所表达的抗原，也称为肿瘤特异性抗原。细胞发生癌化时出现在细胞表面或蛋白质分子上的异常糖链也是癌抗原，也称为癌糖链抗原。癌抗原的例子例如可适当举出：作为所述受体，属于GPI锚固型受体家族，在以肝癌为代表的几种癌症中表达的GPC3(Int J Cancer.(2003)103(4),455-65)、在以肺癌为代表的多种癌症中表达的EpCAM(Proc Natl Acad Sci U S A.(1989)86(1),27-31)、CA19-9、CA15-3、唾液酸化SSEA-1(SLX)等。

MHC抗原主要分类为MHC I类抗原和MHC II类抗原，MHC I类抗原含有HLA-A、-B、-C、-E、-F、-G、-H，MHC II类抗原含有HLA-DR、-DQ、-DP。

分化抗原可包含CD1、CD2、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15s、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD23、CD25、CD28、CD29、CD30、CD32、CD33、CD34、CD35、CD38、CD40、CD41a、CD41b、CD42a、CD42b、CD43、CD44、CD45、CD45RO、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD51、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD64、CD69、CD71、CD73、CD95、CD102、CD106、CD122、CD126、CDw130。

免疫球蛋白包含IgA、IgM、IgD、IgG、IgE。免疫复合物至少包含免疫球蛋白的任意成分。

构成本发明的抗体的可变区可以是识别任意抗原的可变区。构成抗体可变区的氨基酸序列只要可保持其抗原结合活性即可，允许1或多个氨基酸残基的变异。使可变区的氨基酸序列变异时，对于发生变异的部位或发生变异的氨基酸数目没有特别限定。例如可以使存在于CDR和/或FR的氨基酸适当变异。对可变区的氨基酸进行变异时，优选可保持结合活性，但没有特别限定，例如与变异前比较，优选具有50％以上、优选80％以上、进一步优选100％以上的结合活性。另外，通过氨基酸变异结合活性可以升高，例如结合活性与变异前比较可以为2倍、5倍、10倍以上。

在抗原为可溶性抗原时，本发明的抗体的抗原结合活性值可以使用KD(解离常数)，抗原为膜抗原时，可使用表观KD(表观解离常数)。KD(解离常数)和表观KD(表观解离常数)可按照本领域技术人员公知的方法测定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、斯卡查德图(Scatchard plot)、流式细胞术等。

作为将本发明的抗体的抗原结合活性进行比较的其它指标，例如抗原为可溶性抗原时可以使用K_d(解离速率常数)，抗原为膜抗原时可以使用表观K_d(表观解离速率常数)。K_d(解离速率常数)和表观K_d(表观解离速率常数)可按照本领域公知的方法测定，例如可使Biacore(GE healthcare)、流式细胞术等。

本发明的抗体中，氨基酸序列的变异可以是氨基酸残基的置换、附加、缺失和修饰的至少一种。发生变异的部位或发生变异的氨基酸数目没有特别限定，通常为50个氨基酸以内，优选30个氨基酸以内，更优选10个氨基酸以内(例如5个氨基酸以内、3个氨基酸以内)。或者整个氨基酸序列中，允许例如20％以下、具体来说10％以下(例如10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％以下)的氨基酸残基的变异。即，含有与变异前的氨基酸序列优选具有80％以上、更优选90％以上(例如90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％以上)的同源性(同一性)的氨基酸序列的抗体也包含在本发明的抗体中。

例如可变区N末端的谷氨酰胺通过焦谷氨酰胺化而修饰为焦谷氨酸，这是本领域技术人员熟知的修饰。因此，本发明的抗体也包含：在其重链的N末端为谷氨酰胺时，其修饰为焦谷氨酸的可变区。

本发明的抗体的可变区可以是任意的序列，可以是小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体、山羊抗体、骆驼抗体、以及这些非人抗体进行人源化产生的人源化抗体、以及人抗体等任意来源的抗体的可变区。“人源化抗体”也称作重构人抗体，是将来自人以外的哺乳动物的抗体、例如小鼠抗体的互补决定区(CDR)移植到人抗体的CDR所得。鉴定CDR的方法为公知的(Kabat等人,Sequence of Proteins of Immunological Interest(1987),NationalInstitute of Health,Bethesda,Md.；Chothia等人,Nature(1989)342:877)。其常规基因重组方法也是公知的(参照欧洲专利申请公开号EP 125023号公报、WO96/02576号公报)。为了改善与抗原的结合、药物动力学、稳定性、抗原性，还可以向这些抗体的可变区导入各种氨基酸置换。本发明的抗体的可变区可在与抗原的结合中具有pH依赖性，因此与抗原反复结合(WO/2009/125825)。

抗体的轻链恒定区存在κ链和λ链型的恒定区，但也可以是任何轻链恒定区。并且本发明中，轻链恒定区可以是进行了氨基酸置换、缺失、附加和/或插入等变异的轻链恒定区。

本发明的抗体的重链Fc区例如可使用人IgG抗体的重链Fc区，优选人IgG1抗体、人IgG4抗体的重链Fc区。

本发明的多肽还可以与其它蛋白质、生理活性肽等结合，制成Fc融合蛋白分子。

其它蛋白质、生理活性肽例如可举出：受体、粘附分子、配体、酶，但并不限于它们。

本发明的Fc融合蛋白分子的优选例子可举出：在与靶标结合的受体蛋白中融合有Fc结构域的蛋白质，例如可举出：TNFR-Fc融合蛋白、IL1R-Fc融合蛋白、VEGFR-Fc融合蛋白、CTLA4-Fc融合蛋白等(Nat Med.2003Jan；9(1):47-52、BioDrugs.2006；20(3):151-60.)。与本发明的多肽融合的蛋白质只要与靶分子结合即可，可以是任何分子，例如可举出：scFv分子(WO2005/037989)、单结构域抗体分子(WO2004/058821、WO2003/002609)、抗体样分子(Current Opinion in Biotechnology 2006,17:653-658、Current Opinion inBiotechnology 2007,18:1-10、Current Opinion in Structural Biology 1997,7:463-469、Protein Science 2006,15:14-27)、例如DARPins(WO2002/020565)、Affibody(WO1995/001937)、Avimer(WO2004/044011、WO2005/040229)、Adnectin(WO2002/032925)等。抗体和Fc融合蛋白分子可以是与多种靶分子或表位结合的多重特异性抗体。

本发明的抗体也包含抗体的修饰物。抗体的修饰物的例子例如可举出与聚乙二醇(PEG)或细胞毒性物质等各种分子结合的抗体。这样的抗体修饰物可通过对本发明的抗体实施化学修饰获得。抗体的修饰方法在本领域已经建立。

本发明的抗体还可进一步为双重特异性抗体(bispecific antidoby)。双重特异性抗体是指在同一抗体分子内具有识别不同表位的可变区的抗体，该表位可以存在于不同分子中，也可以存在于同一分子中。

本发明的多肽可按照本领域技术人员公知的方法制造。例如抗体可按照以下方法制作，但并不限于此。

使编码抗体重链的DNA即编码Fc区中的1或多个氨基酸残基被置换为其它目标氨基酸所得的重链的DNA、以及编码抗体的轻链的DNA表达。编码Fc区中的1个或多个氨基酸残基被置换为其它目标氨基酸所得的重链的DNA例如可如下获得：获取编码天然型重链的DNA的Fc区部分，导入适当置换，使编码该Fc区中特定的氨基酸的密码子编码其它的目标氨基酸。

预先设计DNA，该DNA编码天然型重链的Fc区中的1个或多个氨基酸残基被置换为其它目标氨基酸所得的蛋白质，化学合成该DNA，由此可获得编码Fc区中的1个或多个氨基酸残基被置换为其它目标氨基酸所得的重链的DNA。氨基酸的置换部位、置换种类没有特别限定。也不限于置换，可以是缺失、附加、插入的任意一种或它们的组合。

编码Fc区中的1个或多个氨基酸残基被置换为其它目标氨基酸所得的重链的DNA可以分成部分DNA来制造。部分DNA的组合例如可举出：编码可变区的DNA和编码Fc区的DNA、或者编码Fab区的DNA和编码Fc区的DNA等，但并不限于这些组合。编码轻链的DNA也可以同样分成部分DNA来制造。

使所述DNA表达的方法可举出以下方法。例如，将编码重链可变区的DNA与编码重链Fc区的DNA一起掺入到表达载体中，构建重链表达载体。同样，将编码轻链可变区的DNA与编码轻链Fc区的DNA一起掺入到表达载体中，构建轻链表达载体。也可以将这些重链、轻链的基因掺入单一的载体中。

将编码目标抗体的DNA掺入到表达载体中时，是以在表达控制区例如增强子、启动子的控制下表达的方式掺入到表达载体中。接着，通过该表达载体转化宿主细胞，使抗体表达。此时，可以使用适当的宿主与表达载体的组合。

载体的例子可举出：M13系载体、pUC系载体、pBR322、pBLuescript、pCR-Script等。在目的为cDNA的亚克隆、切除时，除所述载体之外，例如也可以使用pGEM-T、pDIRECT、pT7等。

在生产本发明的多肽的目的中使用载体时，表达载体特别有用。例如宿主为JM109、DH5α、HB101、XL1-Blue等大肠杆菌时，表达载体具有可在大肠杆菌中高效率表达的启动子、例如lacZ启动子(Ward等人,Nature(1989)341,544-546；FASEB J.(1992)6,2422-2427，通过参照以整体结合到本说明书中)、araB启动子(Better等人,Science(1988)240,1041-1043，通过参照以整体结合到本说明书中)、或T7启动子等是不可缺少的。这样的载体除所述载体之外，还举出pGEX-5X-1(Pharmacia制造)、“QIAexpress系统”(QIAGEN制造)、pEGFP或pET(这种情况下，宿主优选为表达T7 RNA聚合酶的BL21)等。

载体也可以含有用于多肽分泌的信号序列。在大肠杆菌的周质中产生时，用于多肽分泌的信号序列可以使用pelB信号序列(Lei,S.P.等人J.Bacteriol.(1987)169,4397，通过参照以整体结合到本说明书中)。载体向宿主细胞的导入例如可采用脂转染法、磷酸钙法、DEAE-Dextran法进行。

除大肠杆菌表达载体之外，用于制造本发明的多肽的载体例如还可举出：来自哺乳动物的表达载体(例如pcDNA3(Invitrogen制造)、或pEGF-BOS(NucleicAcids.Res.1990,18(17),p5322，通过参照以整体结合到本说明书中)、pEF、pCDM8)、来自昆虫细胞的表达载体(例如“Bac-to-BAC baculovairus expression system(Bac-to-BAC杆状病毒表达系统)”(GIBCO BRL制造)、pBacPAK8)、来自植物的表达载体(例如pMH1、pMH2)、来自动物病毒的表达载体(例如pHSV、pMV、pAdexLcw)、来自反转录病毒的表达载体(例如pZIPneo)、来自酵母的表达载体(例如“Pichia Expression Kit(毕赤酵母表达试剂盒)”(Invitrogen制造)、pNV11、SP-Q01)、来自枯草杆菌的表达载体(例如pPL608、pKTH50)。

以在CHO细胞、COS细胞、NIH3T3细胞等动物细胞中表达为目的时，具有在细胞内表达所必需的启动子、例如SV40启动子(Mulligan等人,Nature(1979)277,108，通过参照以整体结合到本说明书中)、MMTV-LTR启动子、EF1α启动子(Mizushima等人,Nucleic AcidsRes.(1990)18,5322，通过参照以整体结合到本说明书中)、CAG启动子(Gene.(1991)108,193，通过参照以整体结合到本说明书中)、CMV启动子等是不可缺的，更优选具有用于筛选转化细胞的基因(例如可通过试剂(新霉素、G418等)判别的抗药性基因)。具有这样特性的载体例如可举出：pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等。

并且在目的是使基因稳定表达、且使细胞内的基因拷贝数扩增时，可举出：向核酸合成路径缺失的CHO细胞中导入具有与其互补的DHFR基因的载体(例如pCHOI等)，通过氨甲蝶呤(MTX)进行扩增的方法；在目的是使基因瞬时表达时，可举出：使用COS细胞，该细胞在染色体上具有表达SV40T抗原的基因，用具有SV40复制起点的载体(pcD等)转化的方法。复制起点还可以使用来自多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV)等的复制起点。并且为了在宿主细胞系内进行基因拷贝数扩增，表达载体可以含有氨基糖苷转移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等作为选择标志物。

抗体的回收例如可以是在培养转化的细胞后，通过从分子转化的细胞的胞内或培养液中分离来进行。抗体的分离、纯化可以将离心、硫铵分级分离、盐析、超滤、1q、FcRn、蛋白A、蛋白G柱、亲和柱层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法适当组合进行。

与亲本多肽比较，为了制作稳定性提高的多肽，本发明提供使该多肽变异的方法。即，本发明涉及在具有抗体Fc区的多肽中，通过在该Fc区的环部位加入至少一个氨基酸变异，使稳定性与亲本多肽比较提高的方法。本发明中优选使用热变性中点(Tm)作为评价或诊断稳定性的指标。

本发明还提供与亲本多肽比较、稳定性提高的多肽的制造方法。

作为本发明的制造方法的一个方案，提供例如具有抗体的Fc区、在该Fc区环部位的至少一个氨基酸发生变异、与亲本多肽比较稳定性提高的多肽的制造方法。

例如可举出包含以下步骤的制造方法：

(a)在具有抗体Fc区的多肽中，在该Fc区环部位加入至少一个氨基酸变异的步骤；

(b)对在上述步骤(a)中发生变异的多肽的稳定性进行测定的步骤；以及

(c)选择与亲本多肽比较、稳定性提高的多肽的步骤。

优选的方案可举出：具有抗体的Fc区、该Fc区环部位的至少一个氨基酸发生变异、与亲本多肽比较稳定性提高的多肽的制造方法，其包含以下步骤：

(a)使编码多肽的核酸发生变异，使得与该亲本多肽比较，稳定性提高的步骤；

(b)培养以向宿主细胞导入该核酸进行表达的步骤；

(c)从宿主细胞培养物中回收该多肽的步骤。

并且由该制造方法制造的多肽(抗体)以及Fc融合蛋白分子也包含在本发明中。

上述方法的优选方案例如是：使编码具有抗体(例如人IgG)Fc区的多肽的核酸发生变异，使得在该多肽中，在选自EU编号第234号、EU编号第235号、EU编号第236号、EU编号第237号、EU编号第238号、EU编号第239号、EU编号第247号、EU编号第250号、EU编号第265号、EU编号第266号、EU编号第267号、EU编号第268号、EU编号第269号、EU编号第270号、EU编号第271号、EU编号第295号、EU编号第296号、EU编号第298号、EU编号第300号、EU编号第307号、EU编号第309号、EU编号第315号、EU编号第324号、EU编号第325号、EU编号第326号、EU编号第327号、EU编号第329号、EU编号第330号、EU编号第333号、EU编号第335号、EU编号第337号、EU编号第360号、EU编号第385号、EU编号第386号、EU编号第387号、EU编号第389号、EU编号第428号和EU编号第433号的Fc区环部位的氨基酸部位中，至少一个以上的氨基酸发生变异。

在上述方法或制造方法(以下有时简称为“方法”)中，进一步优选使与FcγR的结合活性减少。与亲本多肽比较、保持或增强与FcγR的结合活性的变异中可以包含例如使后述实施例中所示的TS1-TS8、TS20-TS27、TS44-TS50、TS52-TS55、TS57-TS67的氨基酸变异部位变异的步骤。

或者在上述方法中，进一步优选保持或增强与FcγR的结合活性。与亲本多肽比较、与FcγR的结合活性减少的变异可包含例如使后述实施例中所示的TS9-19、TS28-43、TS51、TS56的氨基酸变异部位变异的步骤。

TS1-TS67的变异部位如上所述。

在所述方法中，例如优选进行具有抗体(例如人IgG)Fc区的多肽中的氨基酸变异。

本发明进一步提供编码多肽的核酸，该多肽是在具有抗体Fc区的多肽中的Fc区环部位的至少一个氨基酸发生变异、与亲本多肽比较稳定性得到提高的多肽。本发明的该核酸可以是DNA、RNA等任何形式。

本发明进一步提供含有上述本发明核酸的载体。载体的种类可根据载体所要导入的宿主细胞，由本领域技术人员适当选择，例如可使用上述载体。

本发明进一步涉及通过上述本发明的载体转化的宿主细胞。宿主细胞可以由本领域技术人员适当选择，例如可使用上述宿主细胞。

<药物组合物>

本发明提供含有本发明的多肽或Fc融合蛋白分子的药物组合物。

本发明的药物组合物除了本发明的所述多肽或Fc融合蛋白分子之外，还可以导入药学上可接受的载体，按照公知方法制成制剂。例如可以以与水或除此之外的药学上可接受的液体的无菌溶液或混悬液剂的注射剂形式非口服使用。例如，可以与药理学上可接受的载体或介质、具体来说与无菌水或生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、香味剂、赋形剂、溶媒、防腐剂、粘合剂等适当组合，以通常可接受的制药实践所要求的单位剂量形式进行混合，制成制剂。具体来说，载体可以举出：轻质硅酸酐、乳糖、结晶纤维素、甘露醇、淀粉、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素、聚乙烯基缩醛二乙基氨基乙酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸甘油三酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、砂糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐类等。这些制剂中的有效成分量使得可以得到所指示范围的适当的容量。

用于注射的无菌组合物可以使用注射用蒸馏水等溶媒，按照常规制剂实践进行配制。

注射用的水溶液例如可举出：生理盐水、含有葡萄糖或其它佐剂的等渗液例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化钠，也可以结合使用适当的溶解助剂例如醇、具体来说为乙醇、多元醇例如丙二醇、聚乙二醇，非离子性表面活性剂例如聚山梨醇酯80^(TM)、HCO-50。

油性液可举出芝麻油、大豆油，可以与作为溶解助剂的苯甲酸苄基酯、苄基醇结合使用。另外，也可以与缓冲剂例如磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液，止痛剂例如盐酸普鲁卡因，稳定剂例如苄基醇、苯酚，抗氧化剂配合。所制备的注射液通常填充于适当的安瓿瓶中。

给予优选非口服给予，给予剂型具体可举出注射剂型、经鼻给予剂型、经肺给予剂型、透皮给予型等。注射剂型的给予例子例如可举出：静脉内注射、肌内注射、腹腔内注射、皮下注射等，可以全身或局部给予。

还根据患者的年龄、症状适当选择给予方法。含有抗体或编码抗体的多核苷酸的药物组合物的给予量例如可以是每次每1kg体重在0.0001mg-1000mg的范围内选择。或者例如每位患者在0.001-100000mg/个体的范围内选择给予量，但未必限于这些数值。给予量、给予方法可根据患者的体重或年龄、症状等变动，本领域技术人员可适当选择。

本发明中，含有所述本发明的多肽的药物组合物例如可用作免疫炎症性疾病、癌症等的治疗药或预防药的有效成分。“免疫炎症性疾病”包含以下疾病，但并不只限于它们：类风湿性关节炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性大疱病、自身免疫性肾上腺皮质炎、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少性紫癜、巨红细胞性贫血、自身免疫性萎缩性胃炎、自身免疫性中性粒细胞减少、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性受体病、自身免疫性不孕、慢性活动性肝炎、肾小球肾炎、间质性肺纤维化、多发性硬化、柏哲德氏病、骨质疏松症、多发性骨髓瘤、葡萄膜炎、急性及慢性脊椎炎、痛风性关节炎、炎症性肠病、成人呼吸窘迫综合症(ARDS)、银屑病、克罗恩病、巴塞多氏病、幼年型糖尿病、阿狄森氏病、重症肌无力、晶状体性葡萄膜炎、系统性红斑狼疮、变态反应性鼻炎、变态反应性皮炎、溃疡性肠炎、过敏、哮喘、肌变性、恶病质、系统性硬皮病、局灶性硬皮病、干燥综合征、贝切特氏病、赖特综合征、1型和2型糖尿病、骨吸收疾病、移植物抗宿主反应、缺血再灌注损伤、动脉粥样硬化、脑外伤、多发性硬化、脑型疟疾、败血症、败血性休克、中毒性休克综合征、发热、以及染色导致的肌痛(malgias)、再生不良性贫血、溶血性贫血、突发性血小板减少、肺出血肾炎综合征、格林-巴利综合征、桥本病、天疱疮、IgA肾病、花粉症、抗磷脂抗体综合征、多发性肌炎、韦格纳肉芽肿、结节性动脉炎、混合性结缔组织病、纤维肌痛症。

本发明中，“癌症”是指以典型的未受控制的细胞增殖为特征的哺乳动物的生理学状态，或者所述生理学状态。本发明中，癌症的种类并没有特别限定，可举出以下。恶性肿瘤(上皮细胞癌)可举出：胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、皮肤癌、消化道的癌症、肺癌、肝细胞癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、输卵管癌、阴道癌、肝癌、胆管癌、膀胱癌、尿道的癌症、甲状腺癌、肾上腺癌、肾癌、或者其它腺体组织癌症。肉瘤(非上皮细胞癌)可举出：脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤、血管肉瘤、纤维肉瘤、恶性外周神经瘤、胃肠间质瘤、韧带样瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或其它实体器官肿瘤例如黑素瘤或脑肿瘤。

本说明书中使用的氨基酸的3字母标记与单字母标记的对应如下：

丙氨酸：Ala：A

精氨酸：Arg：R

天冬酰胺：Asn：N

天冬氨酸：Asp：D

半胱氨酸：Cys：C

谷氨酰胺：Gln：Q

谷氨酸：Glu：E

甘氨酸：Gly：G

组氨酸：His：H

异亮氨酸：Ile：I

亮氨酸：Leu：L

赖氨酸：Lys：K

甲硫氨酸：Met：M

苯丙氨酸：Phe：F

脯氨酸：Pro：P

丝氨酸：Ser：S

苏氨酸：Thr：T

色氨酸：Trp：W

酪氨酸：Tyr：Y

缬氨酸：Val：V。

本说明书中引用的所有现有技术文献均作为参照结合到本说明书中。

实施例

以下通过实施例进一步具体说明本发明，但本发明并不受这些实施例限定。本实施例中，在Fc区进行了变异的氨基酸部位是根据EU编号系统(参照Sequences of proteinsof immunological interest，NIH Publication No.91-3242)。

[实施例1]CH2结构域环区的变异导致的热稳定性提高

通常已知，β片结构容易由于氨基酸变异而产生结构变化，还容易由于变异而产生热稳定性降低(Biochemistry 1994；33：5510-5517、Nature 1994；367：660-663)。因此本发明尝试了使Fc区环部位进行变异来使热稳定性提高。

将Fc区B3(SEQ ID NO:16)的CH2结构域环部分—L234-S239、D265-P271、Q295、Y296、S298、Y300、S324-S337的氨基酸分别置换为除原有氨基酸和半胱氨酸之外的18种氨基酸，制备Fc突变体(图4)。将其称为Fc突变体。使用该Fc突变体制备抗GPC3抗体。按照参考实施例1的方法制备包含可变区GpH7(SEQ ID NO:17)作为H链、Fc突变体作为Fc区、可变区GpL16(SEQ ID NO:18)作为L链、恒定区k0(SEQ ID NO:19)的抗体(以下记为GpH7-Fc突变体/GpL16-k0)。

按照参考实施例2的方法，对所制备的抗体评价热变性中点(Tm)。以下如无特别限定，Tm是指在将IgG形式的样品供给测定时的CH2区的Tm。所得Tm的数据如图1所示。

未导入突变的B3(GpH7-B3/GpL16-k0：GpH7(SEQ ID NO:17)、B3(SEQ ID NO:16)、GpL16(SEQ ID NO:18)、k0(SEQ ID NO:19))的Tm约为68℃，显示比该值高的Tm的突变体汇总于表1-1和表1-2中。

[表1-1]

表1-2是表1-1的续表。

[表1-2]

[实施例2]热稳定性提高的新Fc区IgG1的制备和评价

根据实施例1的数据和结构信息(Nature 2000；406:267-273)，选择了几种被认为热稳定性提高效果特别优异的变异。将所选择的单独的变异或多个变异向抗GPC3抗体(GpH7-G1d/GpL16-k0：GpH7(SEQ ID NO:17)、G1d(SEQ ID NO:15)、GpL16(SEQ ID NO:18)、k0(SEQ ID NO:19)，抗IL6R抗体(MH0-G1d/ML0-k0：GpH7(SEQ ID NO:17)、G1d(SEQ ID NO:15)、ML0(SEQ ID NO:21)、k0(SEQ ID NO:19))的H链导入，制备表2所示的TS1-TS19(SEQ IDNO:26-44)。同时，为了评价导入二硫键导致的IgG形式的热稳定性改善效果，将现有论文中报道的m01以及m02变异(J Biol Chem.2009；284:14203-14210)导入抗IL6R的H链，制备TSm01和TSm02的变异体(SEQ ID NO:24、25)。各抗体的表达和纯化按照参考例1所示的方法实施。

[表2]

变异体名	变异部位	SEQ ID NO
			G1d	WT	15
TS01	L234I	26
			TS02	V266I/H268Q/E269D/D270E	27
TS03	Q295M	28
			TS04	Q295M/Y300E	29
TS05	Q295L	30
			TS06	K326S/A330H	31
TS07	K326S/S324H/A330H	32
			TS08	K326A/A330Y	33
TS09	L234K/L235K	34
			TS10	L234K/L235R	35
TS11	L234R/L235K	36
			TS12	L234R/L235R	37
TS13	S267P/H268M/D270F	38
			TS14	H268M/D270F	39
TS15	H268K/D270F	40
			TS16	Q295M/Y296G/S298G	41
TS17	S239K/N325G	42
			TS18	S239K/N325M	43
TS19	S239K/N325H	44
			TSm01	L242C/K334C	24
TSm02	V240C/K334C	25

使用所制备的抗体，按照参考例2所示的方法比较Tm。Tm的测定结果如表3所示。

[表3]

Tm(℃)

恒定区名	抗GPC3	抗IL6R
			TS1	69.5	70.5
TS2	69.8	70.7
			TS3	71.1	72.4
TS4	62.8	63.1
			TS5	70.1	71.4
TS6	70.4	71.6
			TS7	69.8	70.8
TS8	70.0	71.0
			TS9	n.t.	73.4
TS10	71.6	73.8
			TS11	71.8	73.7
TS12	71.9	73.9
			TS13	73.7	78.4
TS14	72.3	74.2
			TS15	72.5	75.3
TS16	73.5	80.0
			TS17	74.2	78.9
TS18	73.6	77.9
			TS19	73.7	78.6
B3	69.1	n.t.
			TSm01	n.t.	n.d.
TSm02	n.t.	74.5
			G1	69.4	70.4

本结果中，对未评价的检样标记为“n.t.”(未测试)，对难以检测Tm的检样标记“n.d.”(未检测)。

TS1-TS19的变异中，TS1-3以及TS5-19在H链序列为抗GPC3和抗IL6R的任意一种情况时均观察到Tm的提高。而TS4采用任意H链序列，其Tm均降低。导入到TS4中的Q295M变异单独可见约2℃的Tm提高效果(TS3)，如果同时导入Y300E变异，则可知Tm反而下降。根据结构信息，Q295和Y300在同一环上存在于配对的位置。Q295M的变异相对于Y300，可能使氨基酸侧链的相互作用增强。但是，如果同时导入Q295M和Y300E的变异，则推测氨基酸侧链之间的相互作用消失。

如上所述，可见除了结构上互相产生不良影响的变异之外，如果将Tm提高的变异彼此进行组合，则Tm进一步提高。由以上可知，基于结构信息的Tm提高的变异组合，除了这里所示的TS1-3、TS5-19之外还可以制备多个。

同时实施评价的TSm01和TSm02在现有论文(J Biol Chem.2009；284:14203-14210)中只表达CH2结构域，评价Tm，结果可见约10-20℃的Tm改善效果。但是在本研究中，在以IgG的形式实施Tm的评价时，在TSm01中检出多个热改性点，难以明确获得CH2结构域的热变性。由此暗示，TSm01在结构上为异质的可能性高。

另外TSm02与IgG1比较，Tm只升高约4℃。由此可知，导入二硫键带来的IgG形式的Tm提高效果小，而本发明人所发现的变异使Tm提高的效果高。

本研究中使用的抗GPC3抗体中，Fab的Tm为74.7℃。因此推测，对于向抗GPC3的H链导入变异得到的TS13-TS19，CH2和Fab的荧光位移曲线重叠，难以计算准确的Tm。由此可以认为，在对变异残基组合产生的更进一步的Tm提高效果进行评价时，不适合使用抗GPC3的H链，在以后的研究中使用了抗IL6R的H链。

[实施例3]新Fc区与人Fcγ受体结合的评价

对于抗体Fc区的变异，有人报道了使效应子功能的ADCC活性等功能增强的Fc区、或使效应子功能的ADCC活性等功能降低的Fc区。认为使效应子功能增强的抗体主要用于癌抗体，使效应子功能降低的抗体是用于中和抗体、恩利(Enbrel)、Orencis等的受体-Fc融合等，在各自的目的中分别使用是重要的。

已知本研究中进行了变异导入的CH2结构域参与了与对于效应子功能产生影响的几种人Fcγ受体(以下表示为hFcgRs)的相互作用。因此按照参考例3所示的方法，对使用实施例2中制备的抗IL6R的H链的TS1-TS19与HFcgRs的结合进行测定。测定结果是在以G1与各HFcgRs的结合为100时，计算各抗体与各hFcgRs的结合，汇总于表4。

[表4]

变异体名	hFcgRIa	hFcgRIIa(R)	hFcgRIIa(H)	hFcgRIIb	hFcgRIIIa(F)	hFcgRIIIa(V)
							TS1	96.5	67.0	76.8	61.5	62.4	83.5
TS2	98.3	67.3	123.0	61.6	159.0	130.0
							TS3	97.5	89.6	115.3	84.2	63.8	90.1
TS4	99.3	148.4	105.9	219.9	73.9	99.2
							TS5	97.3	128.8	142.1	157.5	86.6	106.1
TS6	100.8	122.7	120.3	142.2	103.0	90.6
							TS7	99.8	116.6	118.1	125.9	98.8	86.2
TS8	102.3	119.9	100.6	132.3	164.6	124.4
							TS9	-1.9	1.3	0.5	1.4	1.1	0.5
TS10	0.2	1.4	0.7	3.0	2.2	1.1
							TS11	-0.2	1.5	1.3	3.4	2.6	1.4
TS12	-1.0	0.6	0.9	2.8	1.6	1.1
							TS13	63.0	1.2	1.2	3.4	1.8	1.4
TS14	87.1	3.4	29.4	7.1	5.5	10.1
							TS15	80.8	4.5	30.6	9.1	5.9	10.1
TS16	96.8	25.3	15.9	21.7	13.8	28.9
							TS17	9.0	2.7	1.0	6.0	4.4	1.9
TS18	11.5	7.9	2.3	10.9	3.9	1.8
							TS19	10.7	3.5	2.3	8.1	3.8	4.2

该结果显示，TS1-TS8与hFcgRs的结合与G1的同等，但TS9-19与G1比较，与hFcgRs的结合弱。

[实施例4]将保持与hFcgRs的结合的变异进行组合的新Fc区的制备和评价

在导入以提高稳定性为目的的变异时，在效应子功能重要的癌抗体中，保持与hFcgRs的结合是重要的。实施例3中，将保持与hFcgRs的结合的TS1-TS8的变异进行组合，新制备表5所示的TS20-TS27的变异体(SEQ ID NO：45-52)。各抗体的表达和纯化按照参考例1所述的方法实施。所制备的抗体按照参考例2所示的方法评价Tm，结果如表6所示。

[表5]

变异体名	变异体部位	SEQ ID NO
			TS20	Q295M/K326S/A330H	45
TS21	Q295M/K326A/A330Y	46
			TS22	Q295L/K326S/A330H	47
TS23	Q295L/K326A/A330Y	48
			TS24	Q295M/K326S/A330Y	49
TS25	Q295M/K326A/A330H	50
			TS26	Q295L/K326S/A330Y	51
TS27	Q295L/K326A/A330H	52

[表6]

变异体名	Tm(℃)
		TS20	73.4
TS21	72.8
		TS22	72.3
TS23	71.7
		TS24	73.4
TS25	72.8
		TS26	72.2
TS27	71.7
		G1	70.4

进一步按照参考例3所述的方法测定与hFcgRs的结合。以G1与各hFcgRs的结合为100时，计算各抗体与各hFcgRs的结合，表示于表7中。

[表7]

变异体名	hFcgRIa	hFcgRIIa(R)	hFcgRIIa(H)	hFcgRIIb	hFcgRIIIa(F)	hFcgRIIIa(V)
							TS20	105.8	116.5	132.1	130.9	105.0	91.2
TS21	107.2	113.1	114.0	121.2	164.2	124.3
							TS22	107.7	152.7	157.2	231.9	138.2	107.4
TS23	109.0	152.9	144.7	226.2	219.6	136.7
							TS24	106.9	106.9	122.3	113.5	155.1	121.4
TS25	104.8	122.9	124.7	137.0	113.5	92.8
							TS26	106.8	145.3	151.5	208.4	204.4	134.0
TS27	106.3	157.8	151.1	241.5	147.6	108.7

通过将变异组合，在TS20-TS27的全部变异体中，在保持了与hFcgRs的结合能力的状态下，Tm提高。Tm改善效果最大的变异体是TS20和TS24，Tm比G1的提高约3℃。

[实施例5]将与hFcgRs的结合降低的变异进行组合的新Fc区的制备和评价

在导入以稳定性提高为目的的变异时，希望中和抗体中，效应子功能尽量降低。实施例3中，将与hFcgRs的结合降低的TS9-TS19的变异进行组合，新制备了表8所示的TS28-TS43的变异体(SEQ ID NO：53-68)。各抗体的表达和纯化按照参考例1所述的方法实施。制备的抗体按照参考例2所示的方法评价Tm，结果如表9所示。

[表8]

变异体名	变异体部位	SEQ ID NO
			TS28	L234K/L235K/S239K/H268K/D270F/Q295M/Y296G/S298G/N325G	53
TS29	L234K/L235K/S239K/H268K/D270F/Q295M/Y296G/S298G/N325H	54
			TS30	L234K/L235K/S239K/Q295M/Y296G/S298G/N325G	55
TS31	L234K/L235K/S239K/Q295M/Y296G/S298G/N325H	56
			TS32	L234K/L235K/H268K/D270F/Q295M/Y296G/S298G/N325G	57
TS33	L234K/L235K/H268K/D270F/Q295M/Y296G/S298G/N325H	58
			TS34	L234K/L235K/Q295M/Y296G/S298G/N325G	59
TS35	L234K/L235K/Q295M/Y296G/S298G/N325H	60
			TS36	L234K/L235R/S239K/H268K/D270F/Q295M/Y296G/S298G/N325G	61
TS37	L234K/L235R/S239K/H268K/D270F/Q295M/Y296G/S298G/N325H	62
			TS38	L234K/L235R/s239K/Q295M/Y296G/S298G/N325G	63
TS39	L234K/L235R/S239K/Q295M/Y296G/S298G/N325H	64
			TS40	L234K/L235R/H268K/D270F/Q295M/Y296G/S298G/N325G	65
TS41	L234K/L235R/H268K/D270F/Q295M/Y296G/S298G/N325H	66
			TS42	L234K/L235R/Q295M/Y296G/S298G/N325G	67
TS43	L234K/L235R/Q295M/Y296G/S298G/N325H	68

[表9]

变异体名	Tm(℃)
		TS28	85.8
TS29	84.6
		TS30	86.6
TS31	86.2
		TS32	84.9
TS33	83.5
		TS34	85.3
TS35	84.8
		TS36	86.0
TS37	85.0
		TS38	86.6
TS39	85.9
		TS40	85.1
TS41	83.8
		TS42	85.4
TS43	84.9
		G1	70.4

进一步按照参考例3所述的方法测定与hFcgRs的结合。以G1与各hFcgRs的结合为100时，计算各抗体与各hFcgRs的结合，表示在表10中。

[表10]

变异体名	hFcgRIa	hFcgRIIa(R)	hFcgRIIa(H)	hFcgRIIb	hFcgRIIIa(F)	hFcgRIIIa(V)
							TS28	5.8	1.9	1.7	7.2	3.8	1.7
TS29	5.1	2.1	0.7	7.2	4.2	1.6
							TS30	0.1	1.2	0.2	3.8	0.7	1.1
TS31	0.2	1.3	-0.5	3.6	1.9	1.2
							TS32	-0.5	0.9	1.0	1.5	0.8	0.9
TS33	-0.9	1.2	0.7	4.6	0.7	1.0
							TS34	-0.9	0.9	1.4	4.2	1.8	1.5
TS35	0.5	1.1	1.7	6.2	2.0	1.5
							TS36	-0.4	1.0	0.7	4.1	0.7	1.1
TS37	0.6	0.9	0.7	4.5	1.4	0.6
							TS38	0.3	2.3	1.7	5.8	2.9	0.9
TS39	0.0	1.5	1.0	2.5	2.4	0.8
							TS40	-1.8	1.2	0.7	0.3	0.5	1.0
TS41	0.2	1.2	1.4	4.2	2.4	1.0
							TS42	-0.2	1.3	1.6	6.9	2.5	1.3
TS43	-0.9	1.7	-0.1	6.2	2.7	1.1

通过将变异组合，在TS28-TS43的全部变异体中，Tm升高13℃以上，得到改善。此外，通过组合，也可见与FcgRs的结合能力大幅降低。

[实施例6]使热稳定性提高的新Fc区IgG1缔合物含量的评价

缔合物对于保存稳定性或免疫原性产生影响，因此，希望热稳定性提高的变异尽量不使缔合物含量增加。因此，按照参考例4所示的方法，对将多种变异进行组合得到的TS20-TS43、以及TSm01和TSm02的缔合物含量进行评价。测定的色谱图如图2所示，缔合物含量如表11所示。

[表11]

变异体名	缔合物量(％)
		TS20	1.73
TS21	1.70
		TS22	1.84
TS23	1.71
		TS24	1.66
TS25	1.45
		TS26	1.82
TS27	1.96
		TS28	2.00
TS29	3.03
		TS30	2.72
TS31	2.67
		TS32	2.08
TS33	3.77
		TS34	2.31
TS35	2.90
		TS36	1.86
TS37	1.69
		TS38	2.22
TS39	2.19
		TS40	1.53
TS41	2.49
		TS42	2.04
TS43	1.95
		TSm01	7.44
TSm02	4.11
		G1	1.49

保持了与hFcgRs的结合能力的TS20-TS27的缔合物含量与G1相比为相同程度，可知这些热稳定性提高的变异不会对缔合物含量有大的影响。而对于与hFcgRs的结合能力大幅降低的TS28-TS43的缔合物量，在TS29、33、35中稍有增加，但除此之外的变异体的缔合物量与G1相比为几乎相同程度。与此相对，导入二硫键的变异体TSm01和TSm02的缔合物含量分别为G1的约5倍以及约3倍，可见大幅增加。

由以上结果显示，本发明人在本研究中发现的变异是首次可保持物性、同时还可以使热稳定性提高的变异。

[实施例7]使热稳定性提高的新Fc区IgG1的制备和评价

以上可明确，通过向CH2结构域导入突变，Tm提高。因此，对于实施例1中未实施变异导入研究的区，也进行了是否有Tm提高的突变的研究，新制备了表12所示的TS44-TS67的变异体(SEQ ID NO：69-92)。各抗体的表达和纯化按照参考例1所述的方法实施，结果如表13所示。并且按照参考例3所述的方法测定与hFcgRs的结合。以G1与各hFcgRs的结合为100时，计算各抗体与各hFcgRs的结合，表示在表14中。

[表12]

变异体名	变异体部位	SEQ ID NO
			TS44	P247V	69
TS45	T250F	70
			TS46	T250I	71
TS47	T250M	72
			TS48	T250V	73
TS49	T250W	74
			TS50	T250Y	75
TS51	S298G	76
			TS52	T307A	77
TS53	T307Q	78
			TS54	T307P	79
TS55	L309A	80
			TS56	L309D	81
TS57	L309R	82
			TS58	L309P	83
TS59	N315A	84
			TS60	K360H	85
TS61	G385D/Q386P/N389S	86
			TS62	P387E	87
TS63	M428H	88
			TS64	M428W	89
TS65	M428Y	90
			TS66	M428F	91
TS67	H433K	92

[表13]

变异体名	Tm(℃)
		TS44	72.0
TS45	74.1
		TS46	73.9
TS47	69.3
		TS48	75.5
TS49	71.5
		TS50	75.1
TS51	73.5
		TS52	70.8
TS53	71.2
		TS54	74.1
TS55	71.4
		TS56	72.5
TS57	72.6
		TS58	68.3
TS59	71.8
		TS60	70.2
TS61	70.1
		TS62	72.0
TS63	69.3
		TS64	74.7
TS65	73.3
		TS66	72.8
TS67	70.3
		G1	70.4

[表14]

变异体名	hFcgRIa	hFcgRIIa(R)	hFcgRIIa(H)	hFcgRIIb	hFcgRIIIa(F)	hFcgRIIIa(V)
							TS44	101.3	103.4	110.2	112.6	92.0	102.9
TS45	104.9	125.1	119.3	150.2	62.8	84.7
							TS46	99.2	102.3	104.6	104.6	66.1	89.6
TS47	100.7	126.6	114.4	162.9	49.8	72.0
							TS48	101.5	111.3	108.4	113.2	66.0	89.4
T849	99.6	123.7	126.6	148.3	82.0	96.9
							TS50	101.5	136.6	129.3	169.4	83.5	98.9
TS51	99.2	55.8	27.4	40.8	36.0	58.9
							TS52	98.8	98.3	101.8	97.2	64.6	89.0
TS53	101.2	99.0	102.8	95.9	66.4	90.8
							TS54	102.7	103.3	103.5	102.3	66.8	90.6
TS55	99.2	101.4	104.1	106.4	70.2	90.5
							TS56	670	76.7	79.2	74.3	47.2	69.1
TS57	101.1	97.0	98.1	97.8	61.4	86.2
							TS58	96.4	68.7	82.2	70.4	41.5	61.2
TS59	101.8	99.1	100.0	99.0	73.4	96.1
							TS60	104.7	102.7	104.8	99.7	70.3	94.2
TS61	100.9	106.2	106.4	112.4	73.4	96.6
							TS62	101.3	99.7	101.8	95.6	68.9	91.7
TS63	98.6	102.1	102.2	108.5	71.7	90.3
							TS64	99.4	114.9	110.8	124.4	89.2	104.7
TS65	100.8	108.9	110.8	111.4	76.3	96.8
							TS66	103.2	111.5	112.9	114.6	78.8	99.2
TS67	99.0	99.7	103.1	97.7	66.0	91.7

本研究中，最大Tm提高效果的变异体是TS48，可见约5℃左右的提高，除此以外的变异体也显示Tm的提高。关于与hFcgRs的结合能力，TS51、TS56与hFcgRs的结合稍有降低，TS51、TS56以外的变异体与hFcgRs的结合得以保持。

[参考实施例1]抗体的表达载体的制备以及抗体的表达和纯化

氨基酸置换的导入使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)、PCR等或In fusion Advantage PCR cloning Kit(TAKARA)等，按照本领域技术人员公知的方法进行，构建表达载体。所得表达载体的碱基序列按照本领域技术人员公知的方法确定。将所制备的质粒瞬时导入来自人胚胎肾癌细胞的HEK293H株(Invitrogen)、或FreeStyle293细胞(Invitrogen)，进行抗体的表达。使用rProtein ASepharoseTM Fast Flow(GE Healthcare)，按照本领域公知的方法，由所得培养物上清液纯化抗体。纯化抗体浓度是使用分光光度计测定280nm下的吸光度，使用根据PACE法由所得值计算的吸光系数计算抗体浓度(Protein Science 1995；4：2411-2423)。

[参考实施例2]通过差示扫描型荧光定量法评价变异抗体的热变性中点(Tm)

在本研究中，使用采用了Rotor-Gene Q(QIAGEN)的差示扫描型荧光定量法，测定抗体的热变性中点(Tm)，由此评价热稳定性。已有报道称，本方法与使用熟知作为抗体热稳定性评价法的差示扫描量热仪的Tm评价显示良好的相关性(Journal of PharmaceuticalScience 2010；4:1707-1720)。

用PBS(Sigma)将5000倍浓度SYPRO orange(Molecular Probes)稀释，然后与抗体溶液混合，由此制备测定样品。将各20μl的各样品放置于测定用管中，将温度由30℃升温至99℃。升温0.4度，静置约6秒，然后在470nm(激发波长)/555nm(荧光波长)检测。

数据是使用Rotor-Gene Q Series Software(QIAGEN)，计算可见荧光位移的温度，以该值作为Tm。

[参考实施例3]与hFcgRs结合的评价

使用Biacore T100(GE Healthcare)，进行抗体与hFcgRs(hFcgRIa、hFcgRIIa(R)、hFcgRIIa(H)、hFcgRIIb、hFcgRIIIa(F)、hFcgRIIIa(V))的相互作用分析。运行缓冲液使用HBS-EP+(GE Healthcare)，测定温度为25℃。通过胺偶联法将蛋白A(Invitrogen)固定，将目标抗体捕获在其上。在捕获了抗体的位置，将用运行缓冲液稀释的hFcγR以流速30μL/分钟与之相互作用5分钟(对于hFcgRIa)，除此之外的hFcγR以流速5μL/分钟与之相互作用1分钟，测定与抗体的结合量，在抗体之间进行比较。hFcγR的结合量取决于被捕获的抗体的量，因此需校正FcgR的结合量，使各抗体的捕获量为：对于hFcgRIa为200RU(共振单元)，对于除此之外的hFcgRs为1000RU(共振单元)。还将10mM甘氨酸-HCl、pH1.5以流速30μL/分钟反应30秒，由此洗涤捕获在芯片上的抗体，使芯片再生以重复使用。

[参考实施例4]

通过使用Alliance system(Waters)的SEC分析来评价纯化抗体中缔合物含量。流动相使用含有300mM氯化钠的50mM磷酸缓冲液，pH7.0(伊势久)，分析柱使用G3000SW_XL(TOSOH)，在215nm的波长进行测定。使用Empower2(Waters)实施数据分析，将洗脱至相较于单体为高分子量一侧的成分一并作为缔合物，计算其含量。

产业实用性

在所报道的抗体Fc区变异体中，多数情况下是Fc区的稳定性降低。另外，对于抗体的Fc部位，效应子功能即与FcγR的结合是重要的。根据本发明，可以提供保持与FcγR的结合、稳定性高的Fc，或者降低与FcγR的结合、稳定性高的Fc区变异体。

Claims (4)

1.多肽在制备用于治疗或预防免疫炎症性疾病或癌症的药物中的用途，该多肽具有抗体的Fc区，其中该Fc区环部位的至少一个氨基酸被修饰，并且与亲本多肽比较，该多肽稳定性提高，

其中，将至少一个或多个氨基酸突变引入到所述Fc区环部位中选自由以下各项组成的组的氨基酸位置处：位置234(EU编号)、位置235(EU编号)、位置236(EU编号)、位置237(EU编号)、位置238(EU编号)、位置239(EU编号)、位置247(EU编号)、位置250(EU编号)、位置265(EU编号)、位置266(EU编号)、位置267(EU编号)、位置268(EU编号)、位置269(EU编号)、位置270(EU编号)、位置271(EU编号)、位置295(EU编号)、位置296(EU编号)、位置298(EU编号)、位置300(EU编号)、位置307(EU编号)、位置309(EU编号)、位置315(EU编号)、位置324(EU编号)、位置325(EU编号)、位置326(EU编号)、位置327(EU编号)、位置329(EU编号)、位置330(EU编号)、位置333(EU编号)、位置335(EU编号)、位置337(EU编号)、位置360(EU编号)、位置385(EU编号)、位置386(EU编号)、位置387(EU编号)、位置389(EU编号)、位置428(EU编号)和位置433(EU编号)。

2.方法，该方法是在具有抗体Fc区的多肽中，通过在该Fc区的环部位引入至少一个氨基酸修饰，使稳定性与亲本多肽比较提高，

其中，将至少一个或多个氨基酸突变引入到所述Fc区环部位中选自由以下各项组成的组的氨基酸位置处：位置234(EU编号)、位置235(EU编号)、位置236(EU编号)、位置237(EU编号)、位置238(EU编号)、位置239(EU编号)、位置247(EU编号)、位置250(EU编号)、位置265(EU编号)、位置266(EU编号)、位置267(EU编号)、位置268(EU编号)、位置269(EU编号)、位置270(EU编号)、位置271(EU编号)、位置295(EU编号)、位置296(EU编号)、位置298(EU编号)、位置300(EU编号)、位置307(EU编号)、位置309(EU编号)、位置315(EU编号)、位置324(EU编号)、位置325(EU编号)、位置326(EU编号)、位置327(EU编号)、位置329(EU编号)、位置330(EU编号)、位置333(EU编号)、位置335(EU编号)、位置337(EU编号)、位置360(EU编号)、位置385(EU编号)、位置386(EU编号)、位置387(EU编号)、位置389(EU编号)、位置428(EU编号)和位置433(EU编号)。

3.多肽的制造方法，该多肽具有抗体的Fc区，该Fc区环部位的至少一个氨基酸被修饰，与亲本多肽比较稳定性提高；所述制造方法包含以下步骤：

(a)在具有抗体的Fc区的多肽中，在该Fc区的环部位引入至少一个氨基酸修饰的步骤；

(b)对通过所述步骤(a)修饰的多肽的稳定性进行测定的步骤；以及

(c)选择与亲本多肽比较、稳定性提高的多肽的步骤，

其中，将至少一个或多个氨基酸突变引入到所述Fc区环部位中选自由以下各项组成的组的氨基酸位置处：位置234(EU编号)、位置235(EU编号)、位置236(EU编号)、位置237(EU编号)、位置238(EU编号)、位置239(EU编号)、位置247(EU编号)、位置250(EU编号)、位置265(EU编号)、位置266(EU编号)、位置267(EU编号)、位置268(EU编号)、位置269(EU编号)、位置270(EU编号)、位置271(EU编号)、位置295(EU编号)、位置296(EU编号)、位置298(EU编号)、位置300(EU编号)、位置307(EU编号)、位置309(EU编号)、位置315(EU编号)、位置324(EU编号)、位置325(EU编号)、位置326(EU编号)、位置327(EU编号)、位置329(EU编号)、位置330(EU编号)、位置333(EU编号)、位置335(EU编号)、位置337(EU编号)、位置360(EU编号)、位置385(EU编号)、位置386(EU编号)、位置387(EU编号)、位置389(EU编号)、位置428(EU编号)和位置433(EU编号)。

4.核酸，该核酸编码具有抗体Fc区的多肽，该多肽在Fc区的环部位中具有至少一个氨基酸修饰，并且与亲本多肽比较，稳定性提高，

其中，将至少一个或多个氨基酸突变引入到所述Fc区环部位中选自由以下各项组成的组的氨基酸位置处：位置234(EU编号)、位置235(EU编号)、位置236(EU编号)、位置237(EU编号)、位置238(EU编号)、位置239(EU编号)、位置247(EU编号)、位置250(EU编号)、位置265(EU编号)、位置266(EU编号)、位置267(EU编号)、位置268(EU编号)、位置269(EU编号)、位置270(EU编号)、位置271(EU编号)、位置295(EU编号)、位置296(EU编号)、位置298(EU编号)、位置300(EU编号)、位置307(EU编号)、位置309(EU编号)、位置315(EU编号)、位置324(EU编号)、位置325(EU编号)、位置326(EU编号)、位置327(EU编号)、位置329(EU编号)、位置330(EU编号)、位置333(EU编号)、位置335(EU编号)、位置337(EU编号)、位置360(EU编号)、位置385(EU编号)、位置386(EU编号)、位置387(EU编号)、位置389(EU编号)、位置428(EU编号)和位置433(EU编号)。

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