BR112021002730A2 - proteínas bispecíficas engenheiradas - Google Patents

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Do Jin KIM
Pascal Sanchez
Adam P. Silverman
Hai L. Tran
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Denali Therapeutics Inc.
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Abstract

PROTEÍNAS BIESPECÍFICAS ENGENHEIRADAS. Em um aspecto, são fornecidas proteínas biespecíficas com a capacidade de se ligar especificamente a dois antígenos e com um polipeptídeo Fc que compreende um domínio CH3 modificado e se liga especificamente a um receptor de transferrina.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROTEÍNAS BIESPECÍFICAS ENGENHEIRADAS".
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[001] O presente pedido contém uma Listagem de Sequência a qual foi apresentada eletronicamente em formato ASCII e é por meio deste incorporada por referência em sua totalidade. A referida cópia ASCII, criada em 30 de julho de 2020, é denominada 102342- 002210PC-1148934 SL.txt e é de 829.049 bytes de tamanho.
ANTECEDENTES
[002] O receptor de transferrina (TfR) é uma proteína transportadora da transferrina que, entre outras funções, é necessária para a importação de ferro na célula e é regulada em resposta à concentração intracelular de ferro. Os receptores de transferrina são expressos no endotélio, incluindo o endotélio da barreira hematoencefálica, e são expressos em níveis aumentados em várias células cancerígenas e inflamatórias. É um dos receptores que medeiam a transcitose de ligantes cognatos através da barreira hematoencefálica. Os receptores de transferrina podem, portanto, ser alvos desejáveis para a introdução de um agente em uma célula para endocitose na célula ou transcitose através da célula.
BREVE SUMÁRIO
[003] Em um aspecto, proteínas biespecíficas que contêm um polipeptídeo Fc modificado são fornecidas. Em algumas modalidades, uma proteína compreende: (a) um primeiro polipeptídeo Fc que é fundido no N- terminal a uma porção Fd de um Fab que se liga especificamente a um primeiro antígeno; (b) um segundo polipeptídeo Fc que é fundido no N- terminal a um fragmento variável de cadeia única (scFv) que se liga especificamente a um segundo antígeno, em que o primeiro e o segundo polipeptídeos Fc formam um dímero Fc; e (c) um polipeptídeo de cadeia leve que emparelha com a porção Fd para formar o Fab que se liga especificamente ao primeiro antígeno; em que o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende um domínio CH2 modificado ou domínio CH3 modificado (por exemplo, qualquer um no presente documento descrito) e se liga especificamente a um receptor de transferrina.
[004] Em algumas modalidades, o primeiro antígeno e o segundo antígeno são o mesmo antígeno. Em algumas modalidades, o primeiro antígeno e o segundo antígeno são antígenos diferentes.
[005] Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo Fc é fundido ao scFv por meio de um primeiro ligante. Em algumas modalidades, o primeiro ligante tem um comprimento de 1 a 20 aminoácidos. Em algumas modalidades, o primeiro ligante compreende um ligante GGGGS (G4S) (SEQ. ID Nº: 371), um ligante GGGGSGGGGS ((G4S)2) (SEQ ID Nº: 372), um ligante GGGGSGGGGSGGGGS ((G4S)3) (SEQ ID Nº: 373), ou um ligante GGGGSGGGGSGGGG ((G4S)2-G4) (SEQ ID Nº: 389).
[006] Em algumas modalidades, o scFv compreende uma região VL e uma região VH que estão conectadas por meio de um segundo ligante, em que a orientação do scFv é a região VL - segundo ligante - região VH. Em algumas modalidades, o scFv compreende uma região VL e uma região VH que estão conectadas por meio de um segundo ligante, em que a orientação do scFv é a região VH - segundo ligante - região VL. Em algumas modalidades, o segundo ligante tem um comprimento de 10 a 25 aminoácidos. Em algumas modalidades, o segundo ligante compreende um ligante (G4S)3 (SEQ ID Nº: 373), um ligante RTVAGGGGSGGGGS (RTVA(G4S)2) (SEQ ID Nº: 401), um ligante RTVAGGGGSGGGGSGGGGS (RTVA(G4S)3) (SEQ ID Nº: 374), um ligante ASTKGGGGSGGGGS (ASTK(G4S)2) (SEQ ID Nº: 402), ou um ligante ASTKGGGGSGGGGSGGGGS (ASTK(G4S)3) (SEQ ID Nº: 375). Em algumas modalidades, o scFv compreende uma ponte dissulfeto intercadeia. Em algumas modalidades, o scFv compreende uma cisteína em cada uma das posições VH44 e VL100, de acordo com a numeração de domínio variável de Kabat. Em algumas modalidades, o scFv compreende uma ligação dissulfeto entre as cisteínas nas posições VH44 e VL100.
[007] Em algumas modalidades, uma proteína compreende: (a) um primeiro polipeptídeo que é fundido no N-terminal a uma porção Fd de um Fab que se liga especificamente a um primeiro antígeno e é fundido no C-terminal a uma região variável da cadeia pesada ou uma região variável da cadeia leve de um Fab que se liga especificamente a um segundo antígeno; (b) um segundo polipeptídeo Fc que é fundido no N- terminal a uma porção Fd de um Fab que se liga especificamente a um primeiro antígeno e é fundido no C-terminal ao outro da primeira região variável da cadeia pesada ou primeira região variável da cadeia leve recitada em (a), em que a região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve juntas formam um fragmento Fv que se liga especificamente ao segundo antígeno, e em que o primeiro e o segundo polipeptídeos Fc formam um dímero Fc; e (c) um polipeptídeo de cadeia leve que emparelha com cada uma das porções Fd citadas em (a) e (b) para formar um Fab que se liga especificamente ao primeiro antígeno; em que o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende um domínio CH2 modificado ou domínio CH3 modificado (por exemplo, qualquer um no presente documento descrito) e se liga especificamente a um receptor de transferrina.
[008] Em algumas modalidades, o primeiro antígeno e o segundo antígeno são o mesmo antígeno. Em algumas modalidades, o primeiro antígeno e o segundo antígeno são antígenos diferentes.
[009] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc é fundido à região variável da cadeia pesada do fragmento Fv e o segundo polipeptídeo Fc é fundido à região variável da cadeia leve do fragmento Fv. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc é fundido à região variável da cadeia leve do fragmento Fv e o segundo polipeptídeo Fc é fundido à região variável da cadeia pesada do fragmento Fv. Em algumas modalidades, as porções Fd citadas em (a) e (b) compreendem sequências idênticas. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc é fundido no C-terminal à região variável da cadeia pesada ou região variável da cadeia leve através de um primeiro ligante. Em algumas modalidades, o primeiro ligante tem um comprimento de 1 a 20 aminoácidos. Em algumas modalidades, o primeiro ligante compreende um ligante G4S (SEQ ID Nº: 371), um ligante (G4S)2 (SEQ ID Nº: 372), um ligante (G4S)3 (SEQ ID Nº: 373), ou um ligante (G4S)2-G4 (SEQ ID Nº: 389).
[0010] Em algumas modalidades, uma proteína compreende: (a) um primeiro polipeptídeo Fc que é fundido no N- terminal a uma porção Fd de um Fab que se liga especificamente a um primeiro antígeno; (b) um segundo polipeptídeo Fc que é fundido no N- terminal a uma porção Fd de um Fab que se liga especificamente a um primeiro antígeno, e em que o primeiro e o segundo polipeptídeos Fc formam um dímero Fc; e (c) um polipeptídeo de cadeia leve que emparelha com cada uma das porções Fd citadas em (a) e (b) para formar um Fab que se liga especificamente ao primeiro antígeno;
em que o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc é fundido no C-terminal a um scFv que se liga especificamente a um segundo antígeno; e em que o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende um domínio CH2 modificado ou domínio CH3 modificado (por exemplo, qualquer um no presente documento descrito) e se liga especificamente a um receptor de transferrina.
[0011] Em algumas modalidades, o primeiro antígeno e o segundo antígeno são o mesmo antígeno. Em algumas modalidades, o primeiro antígeno e o segundo antígeno são antígenos diferentes.
[0012] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc é fundido no C-terminal a um scFv que se liga especificamente ao segundo antígeno. Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo Fc é fundido no C-terminal a um scFv que se liga especificamente ao segundo antígeno. Em algumas modalidades, cada um do primeiro polipeptídeo Fc e do segundo polipeptídeo Fc é fundido no C-terminal a um scFv que se liga especificamente ao segundo antígeno. Em algumas modalidades, os scFvs que são fundidos ao primeiro polipeptídeo Fc e ao segundo polipeptídeo Fc compreendem sequências idênticas. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc é fundido ao scFv por meio de um primeiro ligante. Em algumas modalidades, o primeiro ligante tem um comprimento de 1 a 20 aminoácidos. Em algumas modalidades, o primeiro ligante compreende um ligante G4S (SEQ ID Nº: 371), um ligante (G4S)2 (SEQ ID Nº: 372), um ligante (G4S)3 (SEQ ID Nº: 373), ou um ligante (G4S)2-G4(SEQ ID Nº: 389).
[0013] Em algumas modalidades, o scFv compreende uma região VL e uma região VH que estão conectadas por meio de um segundo ligante, em que a orientação do scFv é a região VL - segundo ligante - região VH. Em algumas modalidades, o scFv compreende uma região
VL e uma região VH que estão conectadas por meio de um segundo ligante, em que a orientação do scFv é a região VH - segundo ligante - região VL. Em algumas modalidades, o segundo ligante tem um comprimento de 10 a 25 aminoácidos. Em algumas modalidades, o segundo ligante compreende um ligante (G4S)3 (SEQ ID Nº: 373), um ligante RTVA(G4S)2 (SEQ ID Nº: 401), um ligante RTVA(G4S)3 (SEQ ID Nº: 374), um ligante ASTK(G4S)2 (SEQ ID Nº: 402), ou um ligante ASTK(G4S)3 (SEQ ID Nº: 375). Em algumas modalidades, o scFv compreende uma ponte dissulfeto intercadeia. Em algumas modalidades, o scFv compreende uma cisteína em cada uma das posições VH44 e VL100, de acordo com a numeração de domínio variável de Kabat. Em algumas modalidades, o scFv compreende uma ligação dissulfeto entre as cisteínas nas posições VH44 e VL100. Em algumas modalidades, as porções Fd citadas em (a) e (b) compreendem sequências idênticas.
[0014] Em algumas modalidades, uma proteína como no presente documento descrita compreende um primeiro polipeptídeo Fc que compreende um domínio CH3 modificado e se liga especificamente a um receptor de transferrina. Em algumas modalidades, uma proteína como no presente documento descrita compreende um segundo polipeptídeo Fc que compreende um domínio CH3 modificado e se liga especificamente a um receptor de transferrina. Em algumas modalidades, tanto o primeiro polipeptídeo Fc quanto o segundo polipeptídeo Fc compreendem um domínio CH3 modificado e se ligam especificamente a um receptor de transferrina.
[0015] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende um domínio CH3 modificado que compreende um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou onze substituições em um conjunto de posições de aminoácidos compreendendo 380, 384, 386, 387, 388, 389, 390, 413, 415, 416 e 421,
de acordo com a numeração EU. Em algumas modalidades, o domínio CH3 modificado compreende Glu, Leu, Ser, Val, Trp, Tyr ou Gln na posição 380; Leu, Tyr, Phe, Trp, Met, Pro ou Val na posição 384; Leu, Thr, His, Pro, Asn, Val ou Phe na posição 386; Val, Pro, Ile ou um aminoácido acídico na posição 387; Trp na posição 388; um aminoácido alifático, Gly, Ser, Thr ou Asn na posição 389; Gly, His, Gln, Leu, Lys, Val, Phe, Ser, Ala, Asp, Glu, Asn, Arg ou Thr na posição 390; um aminoácido acídico, Ala, Ser, Leu, Thr, Pro, Ile ou His na posição 413; Glu, Ser, Asp, Gly, Thr, Pro, Gln ou Arg na posição 415; Thr, Arg, Asn ou um aminoácido acídico na posição 416; e/ou um aminoácido aromático, His ou Lys na posição 421, de acordo com a numeração EU.
[0016] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende pelo menos duas substituições em posições selecionadas do grupo que consiste em 384, 386, 387, 388, 389, 390, 413, 416, e 421, de acordo com a numeração EU. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc inclui substituições para pelo menos três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou nove das posições. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende ainda uma, duas, três ou quatro substituições nas posições que compreendem 380, 391, 392 e 415, de acordo com a numeração EU.
[0017] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende ainda uma, duas ou três substituições nas posições que compreendem 414, 424 e 426, de acordo com a numeração EU.
[0018] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende Trp na posição 388.
[0019] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende um aminoácido aromático na posição 421. Em algumas modalidades, o aminoácido aromático na posição 421 é Trp ou Phe.
[0020] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende pelo menos uma posição selecionada do seguinte: a posição 380 é Trp, Leu ou Glu; a posição 384 é Tyr ou Phe; a posição 386 é Thr; a posição 387 é Glu; a posição 388 é Trp; a posição 389 é Ser, Ala, Val ou Asn; a posição 390 é Ser ou Asn; a posição 413 é Thr ou Ser; a posição 415 é Glu ou Ser; a posição 416 é Glu; e a posição 421 é Phe. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 posições selecionadas do seguinte: a posição 380 é Trp, Leu, ou Glu; a posição 384 é Tyr ou Phe; a posição 386 é Thr; a posição 387 é Glu; a posição 388 é Trp; a posição 389 é Ser, Ala, Val ou Asn; a posição 390 é Ser ou Asn; a posição 413 é Thr ou Ser; a posição 415 é Glu ou Ser; a posição 416 é Glu; e a posição 421 é Phe. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende 11 posições como se segue: a posição 380 é Trp, Leu ou Glu; a posição 384 é Tyr ou Phe; a posição 386 é Thr; a posição 387 é Glu; a posição 388 é Trp; a posição 389 é Ser, Ala, Val ou Asn; a posição 390 é Ser ou Asn; a posição 413 é Thr ou Ser; a posição 415 é Glu ou Ser; a posição 416 é Glu; e a posição 421 é Phe.
[0021] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc tem um domínio CH3 com pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com os aminoácidos 111-217 de qualquer um das SEQ ID Nºs: 4-29, 101-164 e 239-252. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID Nºs: 4-29, 101- 164 e 239-252. Em algumas modalidades, os resíduos de pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 das posições correspondentes às posições de índice EU 380, 384, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 413, 414, 415, 416, 421, 424 e 426 de qualquer uma das SEQ ID Nºs: 4- 29, 101-164 e 239-252 não são deletados ou substituídos.
[0022] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc se ligam ao domínio apical do receptor de transferrina. Em algumas modalidades, a ligação da proteína ao receptor da transferrina não inibe substancialmente a ligação da transferrina ao receptor da transferrina.
[0023] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e o segundo polipeptídeo Fc contêm, cada um, uma ou mais modificações que promovem a heterodimerização. Em algumas modalidades, um dos polipeptídeos Fc tem uma substituição T366W e outro polipeptídeo Fc tem substituições T366S, L368A e Y407V, de acordo com a numeração EU. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc contém as substituições T366S, L368A e Y407V e o segundo polipeptídeo Fc contém a substituição T366W. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc contém a substituição T366W e o segundo polipeptídeo Fc contém as substituições T366S, L368A e Y407V.
[0024] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende um sítio de ligação FcRn nativo. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende uma modificação que altera a ligação FcRn. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende uma ou mais modificações que reduzem a função efetora. Em algumas modalidades, as modificações que reduzem a função efetora são substituições de Ala na posição 234 e Ala na posição 235, de acordo com a numeração EU. Em algumas modalidades, tanto o primeiro polipeptídeo Fc quanto o segundo polipeptídeo Fc compreendem substituições L234A e L235A.
[0025] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende modificações em relação à sequência Fc nativa que estendem a meia-vida sérica. Em algumas modalidades, as modificações compreendem substituições de Tyr na posição 252, Thr na posição 254 e Glu na posição 256, de acordo com a numeração EU. Em algumas modalidades, as modificações compreendem substituições de Leu na posição 428 e Ser na posição 434, de acordo com a numeração EU. Em algumas modalidades, as modificações compreendem uma substituição de Ser ou Ala na posição 434, de acordo com a numeração EU. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende substituições M428L e N434S.
[0026] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e o segundo polipeptídeo Fc não têm função efetora.
[0027] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc tem uma identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 75%, ou pelo menos 80%, 90%, 92% ou 95%, em comparação com um polipeptídeo Fc de tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc de tipo selvagem correspondente é um polipeptídeo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 Fc humano. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou e o segundo polipeptídeo Fc compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID Nºs: 165-238, 253-370 e 377-388.
[0028] Em outro aspecto, são fornecidas composições farmacêuticas. Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica compreende uma proteína como no presente documento descrita e um transportador farmaceuticamente aceitável.
[0029] Em ainda outro aspecto, polinucleotídeos isolados são fornecidos. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína como no presente documento descrito.
[0030] Em ainda outro aspecto, vetores e células hospedeiras são fornecidos. Em algumas modalidades, um vetor compreende um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína como no presente documento descrito. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira compreende um polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína como no presente documento descrito.
[0031] Em ainda outro aspecto, são fornecidos métodos de tratamento de um sujeito. Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao sujeito uma proteína ou composição farmacêutica como descrito neste documento.
[0032] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece um animal transgênico não humano (por exemplo, um mamífero) compreende (a) um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo TfR quimérico compreendendo: (i) um domínio apical com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID Nº: 392 e (ii) o sítio de ligação à transferrina do polipeptídeo TfR nativo do animal, e (b) um transgene de um gene da proteína Tau associada a microtúbulos mutante (MAPT), em que o polipeptídeo TfR quimérico e/ou a proteína Tau é expressa no cérebro do animal.
[0033] Em algumas modalidades, o domínio apical compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 392. Em algumas modalidades, o domínio apical compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 393, SEQ ID Nº: 394 ou SEQ ID Nº: 395.
[0034] Em algumas modalidades, o polipeptídeo TfR quimérico compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID Nº: 396.
[0035] Em algumas modalidades, o animal expressa um nível do polipeptídeo TfR quimérico no cérebro, fígado, rim ou tecido pulmonar dentro de 20% (por exemplo, 18%, 16%, 14%, 12%, 10%, 8%, 6%, ou
4%) do nível de expressão de TfR no mesmo tecido de um animal de tipo selvagem correspondente da mesma espécie.
[0036] Em algumas modalidades, o animal compreende uma contagem de glóbulos vermelhos, nível de hemoglobina ou nível de hematócrito dentro de 20% (por exemplo, 18%, 16%, 14%, 12%, 10%, 8%, 6% ou 4%) da contagem de glóbulos vermelhos, nível de hemoglobina ou nível de hematócrito em um animal de tipo selvagem correspondente da mesma espécie.
[0037] Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico que codifica o domínio apical compreende uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 95% (por exemplo, 97%. 98% ou 99%) de identidade com a SEQ ID Nº: 397.
[0038] Em algumas modalidades, o animal é homozigoto ou heterozigoto para o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo TfR quimérico.
[0039] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo TfR quimérico substitui o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo TfR endógeno no genoma do aminal, por exemplo, no locus endógeno.
[0040] Em algumas modalidades, o gene MAPT mutante codifica uma proteína Tau humana mutante.
[0041] Em algumas modalidades, a proteína Tau humana mutante compreende a substituição de aminoácido P272S em relação à sequência de SEQ ID Nº: 398.
[0042] Em algumas modalidades, o animal é um roedor, como um camundongo ou um rato.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0043] FIGURA 1. Polipeptídeo Fc de ligação a TfR engenheirado exemplificativo fundido assimetricamente no N-terminal a um Fab e um scFv via ligantes flexíveis. Como mostrado, o Fab é fundido à metade do botão, que também compreende as mutações de ligação a TfR, enquanto o scFv é fundido à metade do furo, embora a orientação oposta seja possível. Figura 1 divulga SEQ ID Nºs: 390 e 573, respectivamente, em ordem de aparecimento.
[0044] FIGURA 2. Polipeptídeo Fc de ligação a TfR modelado exemplificativo fundido com Fabs N-terminal e domínios variáveis fundidos aos C-terminais de cada metade Fc por meio de ligantes flexíveis. Como mostrado, o VL é fundido à metade do botão, que também compreende as mutações de ligação a TfR, enquanto o VH é fundido à metade do furo, embora a orientação oposta seja possível. Figura divulga SEQ ID Nº: 574.
[0045] FIGURAS 3A e 3B. Polipeptídeo Fc de ligação a TfR projetado exemplificativo fundido com Fabs N-terminal e um scFv C- terminal por meio de um ligante flexível. (A) Formato em que o scFv é fundido à metade do furo, enquanto a metade do botão compreende as mutações de ligação a TfR, embora o scFv também possa ser fundido ao botão. A Figura divulga SEQ ID Nºs: 574 e 390, respectivamente, em ordem de aparecimento. (B) Formato em que um scFv é fundido a cada um dos C-terminais do botão e do furo.
[0046] FIGURAS 4A-4F. Propriedades farmacocinéticas em camundongos de proteínas biespecíficas BACE1/Tau compreendendo polipeptídeos Fc de ligação a TfR. As proteínas biespecíficas BACE1/Tau compreendendo polipeptídeos Fc de ligação a TfR e um controle anti-BACE1 (Ab153) foram dosadas a 10 mg/kg em camundongos de tipo selvagem e seus níveis foram monitorados no plasma ao longo de 7 dias. (A-B) A captura e detecção de Fc foram usadas para quantificar os níveis de anticorpos no plasma (A) e o valor de depuração (CL) para cada molécula foi calculado (B). (D-F) Para determinar se o scFv BACE1 e os Fvs C-terminais permanecem intactos in vivo, a captura de afinidade BACE1 (C) e Tau (E) com detecção de
Fc foi usada. Fortes correlações entre a captura do antígeno BACE1 (D) e Tau (F) com a detecção de Fc indicaram que as moléculas estão amplamente intactas ao longo do curso de tempo farmacocinético.
[0047] FIGURAS 5A e 5B. Propriedades farmacocinéticas em camundongos de proteínas biespecíficas BACE1/Tau adicionais compreendendo polipeptídeos Fc de ligação a TfR. As proteínas biespecíficas BACE1/Tau compreendendo polipeptídeos Fc de ligação a TfR e um anticorpo de controle negativo anti-RSV (Ab122) foram dosadas a 10 mg/kg em camundongos de tipo selvagem e seus níveis foram monitorados no plasma ao longo de 7 dias. A captura e detecção de Fc foram usadas para quantificar os níveis de anticorpos no plasma (A) e o valor de depuração (CL) para cada molécula foi calculado (B). Todas as proteínas biespecíficas BACE1/Tau compreendendo polipeptídeos Fc de ligação a TfR tinham valores de depuração aceitáveis dentro de 1,5-2 vezes do anticorpo de controle e dentro de 1,5 vezes de um anticorpo anti-Tau de controle compreendendo um polipeptídeo Fc de ligação a TfR.
[0048] FIGURAS 6A e 6B. Propriedades farmacocinéticas de proteínas biespecíficas BACE1/Tau adicionais compreendendo polipeptídeos Fc de ligação a TfR em camundongos knock-in para TfR humano (hTfRms/hu KI). As proteínas biespecíficas BACE1/Tau compreendendo polipeptídeos Fc de ligação a TfR e um anticorpo de controle negativo anti-RSV (Ab122) foram dosadas a 10 mg/kg em camundongos hTfRms/hu KI e seus níveis foram monitorados no plasma ao longo de 7 dias. A captura e detecção de Fc foram usadas para quantificar os níveis de anticorpos no plasma (A) e o valor de depuração (CL) para cada molécula foi calculado (B). Todas as proteínas biespecíficas exibiram depuração mais rápida do que o controle Ab122 ou 1C7 devido à ligação de TfR e depuração mediada pelo alvo. As proteínas biespecíficas BACE1/Tau compreendendo polipeptídeos Fc de ligação a TfR todas tinham valores de depuração aceitáveis dentro de duas vezes de um anticorpo anti-Tau de controle compreendendo um polipeptídeo Fc de ligação a TfR.
[0049] FIGURAS 7A-7I. Propriedades farmacocinéticas de proteínas biespecíficas BACE1/Tau adicionais compreendendo polipeptídeos Fc de ligação a TfR em camundongos PS19/hTfRms/hu KI. (A e B) Concentrações plasmáticas e cerebrais de huIgG1 dos construtos 28, 46 e 62 em camundongos PS19/TfRms/hu KI em vários pontos de tempo após uma única injeção intravenosa de 50 mg/kg das moléculas indicadas. Os pontos que faltam para pontos de tempo posteriores para certas moléculas são devido a valores abaixo do limite inferior de quantificação. (C) Razões cérebro-plasma dos construtos 28, 46 e 62 às 24 horas pós-dose e valores de depuração dos dados em (A) e (B). (D) Concentrações de huIgG1 no plasma dos construtos 62 e 75-
77. (E) Valores de depuração plasmática dos construtos 62 e 75-77 dos dados em (D). (F) Concentrações de huIgG1 no cérebro dos construtos 62 e 75-77. (G) Concentrações de huIgG1 no cérebro dos construtos 62 e 75-77 dos dados em (F). (H e I) Razões cérebro-plasma dos construtos 62 e 75-77 1 dia após a dose em camundongos PS19/TfRms/hu KI após uma única injeção intravenosa de 50 mg/kg das moléculas indicadas. Todos os gráficos representam a média ± SEM, n = 5 camundongos por grupo.
[0050] FIGURAS 8A e 8B. Arquiteturas alternativas de proteínas biespecíficas BACE1/Tau compreendendo polipeptídeos Fc de ligação a TfR reduzem Aβ em um ensaio baseado em células. (A) Aβ40 humano foi medido a partir do meio de células CHO superexpressando de forma estável a APP humana tratada com os anticorpos indicados por 24 horas. A incubação com todas as versões de 2H8 fundido com o Clone35.23.4: 1C7-1C7 reduziu o Aβ humano de uma forma dependente da dose em comparação com o controle não tratado. O controle IgG (Ab122) não teve efeito na redução de Aβ. Os gráficos de linha representam a média ± SEM, n = 2 experiências independentes. (B) IC50 celular e redução percentual máxima de Aβ em comparação com controles não tratados do experimento em (A).
[0051] FIGURAS 9A-9E. Quantificação de Aβ40 em camundongos PS19/hTfRms/hu KI. (A e B) Aβ40 de Cérebro e CSF dos construtos 28, 46 e 62 em camundongos PS19/TfRms/hu KI em vários pontos de tempo após uma única injeção intravenosa de 50 mg/kg das moléculas indicadas. (C) Concentrações máximas de Aβ40 em CSF e no cérebro de experimentos em (A) e (B). (D) Aβ40 do Cérebro dos construtos 62 e 75-77 em camundongos PS19/TfRms/hu KI. (E) Porcentagem de redução de Aβ40 do cérebro dos construtos 62 e 75-77. Todos os gráficos representam a média ± SEM, n = 5 camundongos por grupo.
DESCRIÇÃO DETALHADA I. INTRODUÇÃO
[0052] Nós desenvolvemos vários formatos de proteína biespecífica que contêm um polipeptídeo Fc modificado no qual um sítio de ligação de TfR não endógeno foi engenheirado. Como descrito neste documento, descobrimos que certos aminoácidos em uma região Fc podem ser modificados para gerar um novo sítio de ligação específico para TfR no polipeptídeo Fc. Tirando vantagem do fato de que TfR é altamente expresso na barreira hematoencefálica (BBB) e que TfR move naturalmente a transferrina do sangue para o cérebro, a modificação de um polipeptídeo Fc para incluir um local de ligação de TfR pode promover o transporte das proteínas biespecíficas em toda a BBB. Esta abordagem pode melhorar substancialmente a absorção pelo cérebro das proteínas biespecíficas que se ligam especificamente a dois antígenos e é, portanto, altamente útil para o tratamento de distúrbios e doenças em que a distribuição ao cérebro é vantajosa. Em um exemplo, são fornecidas proteínas biespecíficas com a capacidade de se ligar especificamente a dois antígenos e com um polipeptídeo Fc que compreende um domínio CH3 modificado e se liga especificamente a um receptor de transferrina.
[0053] Como descrito neste documento, as proteínas biespecíficas descritas neste documento geralmente podem ser geradas em uma única célula sem pareamento incorreto ou direcionamento da cadeia leve. Esses formatos também permitem que a proteína se ligue ao alvo de forma monovalente ou de forma bivalente. Em algumas modalidades, as proteínas biespecíficas se ligam a cada antígeno alvo de forma monovalente. Em algumas modalidades, as proteínas biespecíficas se ligam a um antígeno alvo de forma monovalente e a outro antígeno alvo de forma bivalente. Em algumas modalidades, as proteínas biespecíficas se ligam a cada antígeno alvo de forma bivalente. Em algumas modalidades, o primeiro antígeno e o segundo antígeno são o mesmo antígeno. Em algumas modalidades, o primeiro antígeno e o segundo antígeno são antígenos diferentes. II. DEFINIÇÕES
[0054] Como usado neste documento, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" incluem as formas do plural referentes, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "um anticorpo" inclui opcionalmente uma combinação de duas ou mais dessas moléculas e semelhantes.
[0055] Como usado neste documento, os termos "cerca de" e "aproximadamente", quando usados para modificar uma quantidade especificada em um valor numérico ou faixa indicam que o valor numérico, bem como desvios razoáveis do valor conhecido por um versado na técnica, por exemplo ± 20%, ± 10% ou ± 5%, estão dentro do significado pretendido do valor recitado.
[0056] Como usado neste documento, o termo "anticorpo" se refere a uma proteína com uma dobra de imunoglobulina que se liga especificamente a um antígeno por meio de suas regiões variáveis. O termo abrange anticorpos policlonais intactos, anticorpos monoclonais intactos, anticorpos de cadeia única, anticorpos multiespecíficos, tais como anticorpos biespecíficos, anticorpos monoespecíficos, anticorpos monovalentes, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados e anticorpos humanos. O termo "anticorpo", como utilizado neste documento, também inclui fragmentos de anticorpo que retêm a especificidade de ligação ao antígeno, incluindo, mas não se limitando a Fab, F(ab’)2, Fv, scFv, e scFv bivalente. Os anticorpos podem conter cadeias leves que são classificadas como kappa ou lambda. Os anticorpos podem conter cadeias pesadas que são classificadas como gama, mu, alfa, delta ou épsilon, que por sua vez definem as classes de imunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.
[0057] Uma unidade estrutural de imunoglobulina (anticorpo) exemplificativa compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto por dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, cada par tendo uma cadeia "leve" (cerca de 25 kD) e uma cadeia "pesada" (cerca de 50-70 kD). O N-terminal de cada cadeia define uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos principalmente responsável pelo reconhecimento do antígeno. Os termos "cadeia leve variável" (VL) e "cadeia pesada variável" (VH) referem-se a essas cadeias leve e pesada, respectivamente.
[0058] O termo "região variável" ou "domínio variável" refere-se a um domínio em uma cadeia pesada ou leve de anticorpo que é derivada de um gene de Variável (V) de linhagem germinativa, gene de Diversidade (D) ou gene de União (J) (e não derivado de um segmento de gene Constante (Cμ e Cδ)), e que dá a um anticorpo sua especificidade para a ligação a um antígeno. Normalmente, uma região variável de anticorpo compreende quatro regiões conservadas de
"estrutura" intercaladas com três "regiões determinantes de complementaridade" hipervariáveis.
[0059] O termo "região determinante de complementaridade" ou "CDR" refere-se às três regiões hipervariáveis em cada cadeia que interrompem as quatro regiões estruturais estabelecidas pelas regiões variáveis da cadeia leve e pesada. As CDRs são as principais responsáveis pela ligação de anticorpo a um epítopo de um antígeno. As CDRs de cada cadeia são tipicamente referidas como CDR1, CDR2 e CDR3, numeradas sequencialmente a partir do terminal N e também são tipicamente identificadas pela cadeia na qual a CDR específica está localizada. Assim, um VH CDR3 ou CDR-H3 está localizado na região variável da cadeia pesada do anticorpo em que é encontrado, enquanto um VL CDR1 ou CDR-L1 é a CDR1 da região variável da cadeia leve do anticorpo em que se encontra.
[0060] As "regiões estruturais" ou "FRs" de diferentes cadeias leves ou pesadas são relativamente conservadas dentro de uma espécie. A região estrutural de um anticorpo, ou seja, as regiões estruturais combinadas das cadeias leves e pesadas constituintes, servem para posicionar e alinhar as CDRs no espaço tridimensional. As sequências estruturais podem ser obtidas de bancos de dados públicos de DNA ou referências publicadas que incluem sequências de genes de anticorpos da linhagem germinativa. Por exemplo, sequências de DNA de linhagem germinativa para genes de região variável da cadeia leve e pesada humana podem ser encontradas no banco de dados de sequência de gene variável de linhagem germinativa "VBASE2" para sequências de humanos e camundongos.
[0061] As sequências de aminoácidos das CDRs e regiões estruturais podem ser determinadas usando várias definições bem conhecidas na técnica, por exemplo, Kabat, Chothia, banco de dados internacional ImMunoGeneTics (IMGT), AbM e contatos de antígenos observados ("Contato"). Em algumas modalidades, as CDRs são determinadas de acordo com a definição de contato. Ver, MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745 (1996). Em algumas modalidades, as CDRs são determinadas por uma combinação de definições de Kabat, Chothia e/ou CDR de contato.
[0062] O termo "porção Fd" refere-se a uma porção N-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Normalmente, uma porção Fd inclui a região variável da cadeia pesada (VH) e uma região constante da cadeia pesada (CH1).
[0063] O termo "Fab" se refere a um fragmento de ligação ao antígeno que consiste em uma região variável da cadeia leve, uma região constante da cadeia leve, uma região variável da cadeia pesada e uma região constante CH1 da cadeia pesada.
[0064] O termo "fragmento variável de cadeia única" ou "scFv" refere-se a um fragmento de ligação ao antígeno que consiste em uma região variável da cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve ligadas entre si por meio de um ligante de peptídeo. Um scFv carece de regiões constantes.
[0065] O termo "fragmento Fv" refere-se a um fragmento de ligação ao antígeno que consiste em uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve que, juntas, formam um sítio de ligação para um antígeno.
[0066] O termo "epítopo" refere-se à área ou região de um antígeno à qual uma molécula, por exemplo, as CDRs de um anticorpo, se liga especificamente e pode incluir alguns aminoácidos ou porções de alguns aminoácidos, por exemplo, 5 ou 6, ou mais, por exemplo, 20 ou mais aminoácidos, ou porções desses aminoácidos. Em alguns casos, o epítopo inclui componentes não proteicos, por exemplo, de um carboidrato, ácido nucleico ou lipídeo. Em alguns casos, o epítopo é uma fração tridimensional. Assim, por exemplo, onde o alvo é uma proteína, o epítopo pode ser composto de aminoácidos consecutivos (por exemplo, um epítopo linear), ou aminoácidos de diferentes partes da proteína que são colocados em proximidade pelo dobramento de proteína (por exemplo, um epítopo descontínuo ou conformacional).
[0067] Como utilizado neste documento, a frase "reconhece um epítopo", como usado com referência a um anticorpo, significa que as CDRs do anticorpo interagem com ou se ligam especificamente ao antígeno nesse epítopo ou uma porção do antígeno contendo esse epítopo.
[0068] Um "anticorpo humanizado" é uma imunoglobulina quimérica derivada de uma fonte não humana (por exemplo, murina) que contém sequências mínimas derivadas da imunoglobulina não humana fora das CDRs. Em geral, um anticorpo humanizado compreenderá pelo menos um (por exemplo, dois) domínio(s) variável(is), em que as regiões CDR correspondem substancialmente às da imunoglobulina não humana e as regiões estruturais correspondem substancialmente às de uma sequência de imunoglobulina humana. Em alguns casos, certos resíduos da região estrutural de uma imunoglobulina humana podem ser substituídos pelos resíduos correspondentes de uma espécie não humana para, por exemplo, melhorar a especificidade, afinidade e/ou meia-vida sérica. O anticorpo humanizado também pode compreender pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma sequência de imunoglobulina humana. Os métodos de humanização de anticorpos são conhecidos na técnica.
[0069] Um "anticorpo humano" ou um "anticorpo totalmente humano" é um anticorpo com sequências da cadeia pesada e da cadeia leve humanas, tipicamente derivadas de genes da linhagem germinativa humana. Em algumas modalidades, o anticorpo é produzido por uma célula humana, por um animal não humano que utiliza repertórios de anticorpos humanos (por exemplo, camundongos transgênicos que são geneticamente modificados para expressar sequências de anticorpos humanos) ou por plataformas de exibição de fago.
[0070] O termo "liga-se especificamente" refere-se a uma molécula (por exemplo, um Fab, um scFv ou um polipeptídeo Fc modificado (ou uma porção de ligação ao alvo do mesmo) que se liga a um epítopo ou alvo com maior afinidade, maior avidez e/ou maior duração para esse epítopo ou alvo em uma amostra do que se liga a outro epítopo ou composto não alvo (por exemplo, um antígeno estruturalmente diferente). Em algumas modalidades, um Fab, scFv ou polipeptídeo Fc modificado (ou uma porção de ligação ao alvo do mesmo) que se liga especificamente a um epítopo ou alvo é um Fab, scFv ou polipeptídeo Fc modificado (ou uma porção de ligação ao alvo do mesmo) que se liga ao epítopo ou alvo com afinidade pelo menos 5 vezes maior que outros epítopos ou compostos não alvo, por exemplo, pelo menos 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 25 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 1000 vezes, 10.000 vezes ou de afinidade maior. O termo "ligação específica", "liga-se especificamente a" ou "é específico para" um determinado epítopo ou alvo, como utilizado neste documento, pode ser exibido, por exemplo, por uma molécula com uma constante de dissociação de equilíbrio KD para o epítopo ou alvo ao qual se liga, por exemplo, 10-4 M ou menor, por exemplo, 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, ou 10-12 M. Será reconhecido por um versado na técnica que um Fab ou scFv que se liga especificamente a um alvo de uma espécie também pode se ligar especificamente a ortólogos desse alvo.
[0071] O termo "afinidade de ligação" é usado neste documento para se referir à força de uma interação não covalente entre duas moléculas, por exemplo, entre um Fab ou scFv e um antígeno, ou entre um polipeptídeo Fc modificado (ou uma porção de ligação ao alvo do mesmo) e um alvo. Assim, por exemplo, o termo pode referir-se a interações 1: 1 entre um Fab ou scFv e um antígeno ou entre um polipeptídeo Fc modificado (ou uma porção de ligação ao alvo do mesmo) e um alvo, a menos que indicado de outra forma ou claro do contexto. A afinidade de ligação pode ser quantificada medindo uma constante de dissociação de equilíbrio (KD), que se refere à constante de taxa de dissociação (kd, tempo-1) dividida pela constante de taxa de associação (ka, tempo-1 M-1). O KD pode ser determinado pela medição da cinética de formação e dissociação do complexo, por exemplo, usando métodos de ressonância de plasma de superfície (SPR), por exemplo, um sistema Biacore™; ensaios de exclusão cinética como KinExA®; e interferometria BioLayer (por exemplo, usando a plataforma ForteBio® Octet). Como utilizado neste documento, "afinidade de ligação" inclui não apenas afinidades de ligação formais, como aquelas que refletem interações 1:1 entre um Fab ou scFv e um antígeno ou entre um polipeptídeo Fc modificado (ou uma porção de ligação ao alvo do mesmo) e um alvo, mas também afinidades aparentes para as quais KD's são calculadas que podem refletir a ligação ávida.
[0072] Um "receptor de transferrina" ou "TfR", como utilizado neste documento, refere-se à proteína 1 do receptor de transferrina. A sequência polipeptídica do receptor 1 da transferrina humana é apresentada na SEQ ID Nº: 100. As sequências da proteína 1 do receptor de transferrina de outras espécies também são conhecidas (por exemplo, chimpanzé, número de acessão XP_003310238.1; macaco rhesus, NP_001244232.1; cachorro, NP_001003111.1; gado, NP_001193506.1; camundongo, NP_035768.1; rato, NP_073203.1; e frango, NP_990587.1). O termo "receptor de transferrina" também abrange variantes alélicas de sequências de referência exemplificativas, por exemplo, sequências humanas, que são codificadas por um gene em um locus cromossômico da proteína 1 do receptor de transferrina. A proteína do receptor de transferrina de comprimento total inclui uma região intracelular N-terminal curta, uma região transmembranar e um grande domínio extracelular. O domínio extracelular é caracterizado por três domínios: um domínio semelhante a protease, um domínio helicoidal e um domínio apical.
[0073] Como utilizado neste documento, o termo "polipeptídeo Fc" refere-se à região C-terminal de um polipeptídeo da cadeia pesada de imunoglobulina de ocorrência natural que é caracterizado por uma dobra de Ig como um domínio estrutural. Um polipeptídeo Fc contém sequências de região constante incluindo pelo menos o domínio CH2 e/ou o domínio CH3 e pode conter pelo menos parte da região de dobradiça, mas não contém uma região variável.
[0074] Um "polipeptídeo Fc modificado" refere-se a um polipeptídeo Fc que tem pelo menos uma mutação, por exemplo, uma substituição, deleção ou inserção, em comparação com uma sequência de polipeptídeo Fc da cadeia pesada de imunoglobulina de tipo selvagem, mas retém a dobra Ig geral ou estrutura do polipeptídeo Fc nativo.
[0075] Como utilizado neste documento, "FcRn" refere-se ao receptor Fc neonatal. A ligação de polipeptídeos Fc a FcRn reduz a depuração e aumenta a meia-vida sérica do polipeptídeo Fc. A proteína FcRn humana é um heterodímero que é composto por uma proteína de cerca de 50 kDa de tamanho que é semelhante a uma proteína de classe I de histocompatibilidade principal (MHC) e uma β2- microglobulina de cerca de 15 kDa de tamanho.
[0076] Como utilizado neste documento, o termo, um "sítio de ligação FcRn" refere-se à região de um polipeptídeo Fc que se liga a FcRn. Na IgG humana, o sítio de ligação FcRn, como numerado usando o índice EU, inclui L251, M252, I253, S254, R255, T256, M428, H433, N434, H435 e Y436. Estas posições correspondem às posições 21 a 26, 198 e 203 a 206 da SEQ ID Nº: 1.
[0077] Como utilizado neste documento, o termo, um "sítio de ligação FcRn nativo" refere-se a uma região de um polipeptídeo Fc que se liga a FcRn e que tem a mesma sequência de aminoácidos que a região de um polipeptídeo Fc de ocorrência natural que se liga a FcRn.
[0078] Como utilizado neste documento, os termos "domínio CH3" e "domínio CH2" referem-se a polipeptídeos de domínio da região constante de imunoglobulina. Para os fins deste pedido, um polipeptídeo de domínio CH3 refere-se ao segmento de aminoácidos de cerca da posição 341 a cerca da posição 447 como numerado de acordo com o esquema de numeração EU, e um polipeptídeo de domínio CH2 refere-se ao segmento de aminoácidos de cerca da posição 231 até cerca da posição 340 como numerada de acordo com o esquema de numeração EU e não inclui sequências de região de dobradiça. Os polipeptídeos de domínio CH2 e CH3 também podem ser numerados pelo esquema de numeração IMGT (ImMunoGeneTics) em que a numeração do domínio CH2 é 1-110 e a numeração do domínio CH3 é 1-107, de acordo com a numeração do gráfico IMGT Scientific (website IMGT). Os domínios CH2 e CH3 fazem parte da região Fc de uma imunoglobulina. Uma região Fc refere-se ao segmento de aminoácidos de cerca da posição 231 a cerca da posição 447 como numerado de acordo com o esquema de numeração EU, mas como usado no presente documento, pode incluir pelo menos uma parte de uma região de dobradiça de um anticorpo. Uma sequência ilustrativa da região de dobradiça é a sequência de dobradiça de IgG1 humana EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID Nº: 376).
[0079] Os termos "tipo selvagem", "nativo" e "de ocorrência natural", como usados com referência a um domínio CH3 ou CH2, referem-se a um domínio que tem uma sequência que ocorre na natureza.
[0080] Como usado neste documento, o termo "mutante", como usado com referência a um polipeptídeo mutante ou polinucleotídeo mutante, é usado indistintamente com "variante". Uma variante em relação a uma dada sequência de referência de domínio CH3 ou CH2 de tipo selvagem pode incluir variantes alélicas de ocorrência natural. Um domínio CH3 ou CH2 "não natural" refere-se a uma variante ou domínio mutante que não está presente em uma célula na natureza e que é produzido por modificação genética, por exemplo, usando tecnologia de engenharia genética ou técnicas de mutagênese, de um domínio CH3 nativo ou polinucleotídeo ou polipeptídeo de domínio CH2. Uma "variante" inclui qualquer domínio compreendendo pelo menos uma mutação de aminoácido em relação ao tipo selvagem. As mutações podem incluir substituições, inserções e deleções.
[0081] O termo "isolado", como usado com referência a um ácido nucleico ou proteína, denota que o ácido nucleico ou proteína é essencialmente livre de outros componentes celulares com os quais está associado no estado natural. De preferência, está em um estado homogêneo. Pureza e homogeneidade são normalmente determinadas usando técnicas de química analítica, como eletroforese (por exemplo, eletroforese em gel de poliacrilamida) ou cromatografia (por exemplo, cromatografia líquida de alto desempenho). Em algumas modalidades, um ácido nucleico ou proteína isolada é pelo menos 85% puro, pelo menos 90% puro, pelo menos 95% puro ou pelo menos 99% puro.
[0082] O termo "aminoácido" refere-se a aminoácidos sintéticos e naturais, bem como análogos e miméticos de aminoácidos que funcionam de maneira semelhante aos aminoácidos de ocorrência natural. De ocorrência natural são aqueles codificados pelo código genético, bem como os aminoácidos que são modificados posteriormente, por exemplo, hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato e O- fosfoserina. Os α-aminoácidos de ocorrência natural incluem, sem limitação, alanina (Ala), cisteína (Cys), ácido aspártico (Asp), ácido glutâmico (Glu), fenilalanina (Phe), glicina (Gly), histidina (His), isoleucina (Ile), arginina (Arg), lisina (Lys), leucina (Leu), metionina
(Met), asparagina (Asn), prolina (Pro), glutamina (Gln), serina (Ser), treonina (Thr), valina (Val), triptofano (Trp), tirosina (Tyr) e combinações dos mesmos. Os estereoisômeros de α-aminoácidos de ocorrência natural incluem, sem limitação, D-alanina (D-Ala), D-cisteína (D-Cys), ácido D-aspártico (D-Asp), ácido D-glutâmico (D-Glu), D-fenilalanina (D- Phe), D-histidina (D-His), D-isoleucina (D-Ile), D-arginina (D-Arg), D- lisina (D-Lys), D-leucina (D-Leu), D-metionina (D-Met), D-asparagina (D-Asn), D-prolina (D-Pro), D-glutamina (D-Gln), D-serina (D-Ser), D- treonina (D-Thr), D-valina (D-Val), D-triptofano (D-Trp), D-tirosina (D- Tyr) e combinações dos mesmos. "Análogos de aminoácidos" referem- se a compostos que possuem a mesma estrutura química básica que um aminoácido natural, isto é, um carbono α que está ligado a um hidrogênio, um grupo carboxil, um grupo amino e um grupo R, por exemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina e metil sulfônio. Tais análogos têm grupos R modificados (por exemplo, norleucina) ou estruturas peptídicas modificadas, mas retêm a mesma estrutura química básica que um aminoácido de ocorrência natural. "Miméticos de aminoácidos" referem-se a compostos químicos que possuem uma estrutura diferente da estrutura química geral de um aminoácido, mas que funcionam de maneira semelhante a um aminoácido de ocorrência natural. Os aminoácidos podem ser no presente documento referidos pelos seus símbolos de três letras vulgarmente conhecidos ou pelos símbolos de uma letra recomendados pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB.
[0083] Os termos "polipeptídeo" e "peptídeo" são usados indistintamente neste documento para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos em uma única cadeia. Os termos se aplicam a polímeros de aminoácidos nos quais um ou mais resíduos de aminoácidos são um mimético químico artificial de um aminoácido correspondente natural, bem como a polímeros de aminoácidos naturais e a um polímero de aminoácidos de ocorrência não natural. Os polímeros de aminoácidos podem compreender inteiramente L- aminoácidos, inteiramente D-aminoácidos ou uma mistura de L e D aminoácidos.
[0084] O termo "proteína", como utilizado neste documento, refere- se a um polipeptídeo ou dímero (isto é, dois) ou multímero (isto é, três ou mais) de polipeptídeos de cadeia simples. Os polipeptídeos de cadeia simples de uma proteína podem ser unidos por uma ligação covalente, por exemplo, uma ligação dissulfeto ou interações não covalentes.
[0085] O termo "ligante", como utilizado neste documento, refere-se a uma porção que liga (por exemplo, liga covalentemente) dois peptídeos ou polipeptídeos (por exemplo, entre um polipeptídeo Fc e um scFv) para conectar ou fundir os peptídeos ou polipeptídeos. Em algumas modalidades, um ligante compreende uma ligação química. Em algumas modalidades, um ligante compreende um peptídeo com um comprimento de um ou mais resíduos de aminoácidos. Os ligantes adequados para conectar ou fundir peptídeos ou polipeptídeos podem ser selecionados com base nas propriedades dos ligantes, tais como o comprimento, hidrofobicidade, flexibilidade, rigidez ou clivabilidade do ligante.
[0086] Os termos "polinucleotídeo" e "ácido nucleico" se referem indistintamente a cadeias de nucleotídeos de qualquer comprimento e incluem DNA e RNA. Os nucleotídeos podem ser desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos ou bases modificados e/ou seus análogos, ou qualquer substrato que pode ser incorporado em uma cadeia por DNA ou RNA polimerase. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e seus análogos. Exemplos de polinucleotídeos no presente documento contemplados incluem DNA de fita simples e dupla, RNA de fita simples e dupla e moléculas híbridas com misturas de DNA e RNA de fita simples e dupla.
[0087] Os termos "substituição conservativa" e "mutação conservadora" referem-se a uma alteração que resulta na substituição de um aminoácido por outro aminoácido que pode ser categorizado como tendo uma característica semelhante. Exemplos de categorias de grupos de aminoácidos conservadores definidos desta maneira podem incluir: um "grupo carregado/polar" incluindo Glu (Ácido glutâmico ou E), Asp (Ácido aspártico ou D), Asn (Asparagina ou N), Gln (Glutamina ou Q), Lys (Lisina ou K), Arg (Arginina ou R) e His (Histidina ou H); um "grupo aromático" incluindo Phe (Fenilalanina ou F), Tyr (Tirosina ou Y), Trp (Triptofano ou W) e (Histidina ou H); e um "grupo alifático" incluindo Gly (Glicina ou G), Ala (Alanina ou A), Val (Valina ou V), Leu (Leucina ou L), Ile (Isoleucina ou I), Met (Metionina ou M), Ser (Serina ou S), Thr (Treonina ou T) e Cys (Cisteína ou C). Dentro de cada grupo, os subgrupos também podem ser identificados. Por exemplo, o grupo de aminoácidos carregados ou polares pode ser subdividido em subgrupos, incluindo: um "subgrupo carregado positivamente" compreendendo Lys, Arg e His; um "subgrupo carregado negativamente" compreendendo Glu e Asp; e um "subgrupo polar" compreendendo Asn e Gln. Em outro exemplo, o grupo aromático ou cíclico pode ser subdividido em subgrupos, incluindo: um "subgrupo do anel de nitrogênio" compreendendo Pro, His e Trp; e um "subgrupo fenil" compreendendo Phe e Tyr. Em outro exemplo adicional, o grupo alifático pode ser subdividido em subgrupos, por exemplo, um "subgrupo alifático não polar" compreendendo Val, Leu, Gly e Ala; e um "subgrupo alifático ligeiramente polar" compreendendo Met, Ser, Thr e Cys. Exemplos de categorias de mutações conservativas incluem substituições de aminoácidos de aminoácidos dentro dos subgrupos acima, tais como, mas não se limitando a: Lys por Arg ou vice-versa, de modo que uma carga positiva possa ser mantida; Glu para Asp ou vice- versa, de modo que uma carga negativa possa ser mantida; Ser para Thr ou vice-versa, de modo que um -OH livre possa ser mantido; e Gln para Asn ou vice-versa, de modo que um -NH2 livre possa ser mantido. Em algumas modalidades, os aminoácidos hidrofóbicos são substituídos por aminoácidos hidrofóbicos de ocorrência natural, por exemplo, no sítio ativo, para preservar a hidrofobicidade.
[0088] Os termos "idêntico" ou porcentagem de "identidade", no contexto de duas ou mais sequências polipeptídicas, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são iguais ou têm uma porcentagem especificada de resíduos de aminoácidos, por exemplo, pelo menos 60% de identidade, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% ou mais, que são idênticos em uma região especificada quando comparados e alinhados para correspondência máxima em uma janela de comparação ou região designada, medida usando um algoritmo de comparação de sequência ou por alinhamento manual e inspeção visual.
[0089] Para comparação de sequência de polipeptídeos, normalmente uma sequência de aminoácidos atua como uma sequência de referência, à qual uma sequência candidata é comparada. O alinhamento pode ser realizado usando vários métodos disponíveis para um versado na técnica, por exemplo, alinhamento visual ou usando software disponível publicamente usando algoritmos conhecidos para atingir o alinhamento máximo. Esses programas incluem os programas BLAST, ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, Califórnia) ou Megalign (DNASTAR). Os parâmetros empregados para um alinhamento para atingir o alinhamento máximo podem ser determinados por um versado na técnica. Para comparação de sequências de sequências polipeptídicas para fins deste pedido, é usado o algoritmo BLASTP da proteína padrão BLAST para alinhar a sequência de duas proteínas com os parâmetros padrão.
[0090] Os termos "correspondendo a", "determinado com referência a" ou "numerado com referência a" quando usados no contexto da identificação de um determinado resíduo de aminoácido em uma sequência de polipeptídeo, refere-se à posição do resíduo de uma determinada sequência de referência quando a sequência de aminoácidos dada está alinhada ao máximo e comparada com a sequência de referência. Assim, por exemplo, um resíduo de aminoácido em um polipeptídeo Fc modificado "corresponde a" um aminoácido na SEQ ID Nº: 1, quando o resíduo se alinha com o aminoácido na SEQ ID Nº: 1 quando alinhado de forma otimizada com a SEQ ID Nº: 1 O polipeptídeo que está alinhado com a sequência de referência não precisa ter o mesmo comprimento que a sequência de referência.
[0091] Os termos "sujeito", "indivíduo" e "paciente", como usados indistintamente no presente documento, referem-se a um mamífero, incluindo, mas não se limitando a humanos, primatas não humanos, roedores (por exemplo, ratos, camundongos e porquinhos-da-índia), coelhos, vacas, porcos, cavalos e outras espécies de mamíferos. Numa modalidade, o paciente é humano.
[0092] Os termos "tratamento", "tratando" e semelhantes são usados neste documento para geralmente significar a obtenção de um efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado. "Tratar" ou "tratamento" pode referir-se a qualquer indício de sucesso no tratamento ou melhora de uma doença, incluindo qualquer parâmetro objetivo ou subjetivo, como redução, remissão, melhora na sobrevida do paciente, aumento no tempo ou taxa de sobrevida, diminuição dos sintomas ou tornando a doença mais tolerável para o paciente, diminuindo a taxa de degeneração ou declínio, ou melhorando o bem-estar físico ou mental do paciente. O tratamento ou melhora dos sintomas pode ser baseado em parâmetros objetivos ou subjetivos. O efeito do tratamento pode ser comparado a um indivíduo ou grupo de indivíduos que não estão recebendo o tratamento, ou ao mesmo paciente antes do tratamento ou em um momento diferente durante o tratamento.
[0093] O termo "excipiente farmaceuticamente aceitável" refere-se a um ingrediente farmacêutico não ativo que é biologicamente ou farmacologicamente compatível para uso em humanos ou animais, tal como, mas não limitado a um tampão, transportador ou conservante.
[0094] Tal como no presente documento utilizado, uma "quantidade terapêutica" ou "quantidade terapeuticamente eficaz" de um agente é uma quantidade do agente (por exemplo, qualquer uma das proteínas no presente documento descritas) que trata uma doença em um sujeito.
[0095] O termo "administrar" refere-se a um método de distribuição de agentes, compostos ou composições ao local desejado de ação biológica. Estes métodos incluem, mas não estão limitados a, distribuição tópica, distribuição parenteral, distribuição intravenosa, distribuição intradérmica, distribuição intramuscular, distribuição intratecal, distribuição colônica, distribuição retal ou distribuição intraperitoneal. Em uma modalidade, uma proteína como no presente documento descrita é administrada por via intravenosa. III. ARQUITETURAS DE PROTEÍNAS BIESPECÍFICAS
[0096] Em um aspecto, proteínas biespecíficas com a capacidade de se ligar especificamente a dois antígenos são fornecidas. Em algumas modalidades, a proteína biespecífica compreende polipeptídeos Fc que são fundidos a um fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, um Fab, Fv ou scFv) que se liga especificamente a um primeiro antígeno e a um fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, um Fab, Fv ou scFv) que se liga especificamente a um segundo antígeno. Em algumas modalidades, um ou ambos os polipeptídeos Fc da proteína biespecífica é um polipeptídeo Fc modificado (por exemplo, modificado para promover a ligação de TfR e/ou para intensificar a heterodimerização dos polipeptídeos Fc).
[0097] Em algumas modalidades, a proteína biespecífica se liga ao primeiro antígeno de forma monovalente e se liga ao segundo antígeno de forma monovalente. Em algumas modalidades, a proteína biespecífica se liga ao primeiro antígeno de forma bivalente e se liga ao segundo antígeno de forma monovalente. Em algumas modalidades, a proteína biespecífica se liga ao primeiro antígeno de forma monovalente e se liga ao segundo antígeno de forma bivalente. Em algumas modalidades, a proteína biespecífica se liga ao primeiro antígeno de forma bivalente e se liga ao segundo antígeno de forma bivalente. Polipeptídeo Fab-Fc/polipeptídeo scFv-Fc
[0098] Em algumas modalidades, uma proteína biespecífica compreende polipeptídeos Fc que são fundidos a uma porção de um Fab que se liga especificamente a um primeiro antígeno e um scFv que se liga especificamente a um segundo antígeno. Em algumas modalidades, o Fab e o scFv são fundidos nos N-terminais dos polipeptídeos Fc. Em algumas modalidades, o primeiro antígeno e o segundo antígeno são o mesmo antígeno. Em algumas modalidades, o primeiro antígeno e o segundo antígeno são antígenos diferentes.
[0099] Em algumas modalidades, a proteína biespecífica compreende: (a) um primeiro polipeptídeo Fc que é fundido no N- terminal a uma porção Fd de um Fab que se liga especificamente a um primeiro antígeno; (b) um segundo polipeptídeo Fc que é fundido no N- terminal a um fragmento variável de cadeia única (scFv) que se liga especificamente a um segundo antígeno, em que o primeiro e o segundo polipeptídeos Fc formam um dímero Fc; e
(c) um polipeptídeo de cadeia leve que emparelha com a porção Fd para formar o Fab que se liga especificamente ao primeiro antígeno; em que o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende um CH2 modificado ou domínio CH3 modificado e se liga especificamente a TfR.
[00100] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc compreende um domínio CH3 modificado e se liga especificamente a TfR. Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo Fc compreende um domínio CH3 modificado e se liga especificamente a TfR. Em algumas modalidades, tanto o primeiro polipeptídeo Fc quanto o segundo polipeptídeo Fc compreendem um domínio CH3 modificado e se ligam especificamente a TfR. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende uma ou mais modificações que promovem a ligação de TfR e/ou intensificam a heterodimerização. Os polipeptídeos Fc modificados são descritos adicionalmente na Seção IV abaixo. Em algumas modalidades, um dos polipeptídeos Fc é um polipeptídeo Fc da cadeia pesada de imunoglobulina nativa (isto é, tipo selvagem) tendo a sequência de SEQ ID Nº: 1.
[00101] Em algumas modalidades, a proteína compreende um Fab que se liga especificamente ao primeiro antígeno. O Fab é formado a partir do pareamento da porção Fd do Fab, que é fundida ao N-terminal do primeiro polipeptídeo Fc, com a cadeia leve.
[00102] Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo Fc é fundido no N-terminal ao scFv por meio de um primeiro ligante. Em algumas modalidades, o primeiro ligante tem um comprimento de cerca de 1 a cerca de 50 aminoácidos, por exemplo, de cerca de 1 a cerca de 40, de cerca de 1 a cerca de 30, de cerca de 1 a cerca de 25, de cerca de 1 a cerca de 20, de cerca de 1 a cerca de 15, de cerca de 1 a cerca de 10, de cerca de 2 a cerca de 40, de cerca de 2 a cerca de 30, de cerca de 2 a cerca de 20, de cerca de 2 a cerca de 10, de cerca de 5 a cerca de 40, de cerca de 5 a cerca de 30, de cerca de 5 a cerca de 25, ou de cerca de 5 a cerca de 20 aminoácidos. Em algumas modalidades, o primeiro ligante tem um comprimento de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 aminoácidos.
[00103] Em algumas modalidades, o primeiro ligante compreende um ligante flexível. Em algumas modalidades, o primeiro ligante compreende um ligante glicina-serina, isto é, um ligante que consiste principalmente em, ou inteiramente, em trechos de resíduos de glicina e serina. Em algumas modalidades, o primeiro ligante compreende um ligante (G4S)n (SEQ ID Nº: 371) (GGGGS)n (SEQ ID Nº: 371), em que "n" indica o número de repetições do motivo. Em algumas modalidades, o primeiro ligante compreende um ligante G4S (GGGGS; SEQ ID Nº: 371), um ligante (G4S)2 (GGGGSGGGGS; SEQ ID Nº: 372), um ligante (G4S)3 (GGGGSGGGGSGGGGS; SEQ ID Nº: 373), ou um ligante (G4S)2-G4 (GGGGSGGGGSGGGG; SEQ ID Nº: 389). Em algumas modalidades, o primeiro ligante compreende um ligante G4S (SEQ ID Nº: 371). Em algumas modalidades, o primeiro ligante compreende um ligante (G4S)2 (SEQ ID Nº: 372). Em algumas modalidades, o primeiro ligante compreende um ligante (G4S)3 (SEQ ID Nº: 373). Em algumas modalidades, o primeiro ligante compreende um ligante (G4S)2-G4 (SEQ ID Nº: 389).
[00104] Em algumas modalidades, o scFv que se liga especificamente ao segundo antígeno compreende uma sequência da região variável da cadeia pesada (VH) e uma sequência da região variável da cadeia leve (VL) de um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga especificamente ao segundo antígeno. Em algumas modalidades, a orientação da região VL e da região VH no scFv que é fundido ao segundo polipeptídeo Fc é a região VL - região VH (ou seja, a região VL está mais próxima do segundo polipeptídeo Fc do que a região VH). Em algumas modalidades, a orientação da região VL e da região VH no scFv que é fundido ao segundo polipeptídeo Fc é a região VH - região VL (isto é, a região VH está mais próxima do segundo polipeptídeo Fc do que a região VL).
[00105] Em algumas modalidades, a região VL e a região VH do scFv são conectadas por meio de um segundo ligante. Em algumas modalidades, o segundo ligante tem um comprimento de cerca de 10 a cerca de 25 aminoácidos, por exemplo, de cerca de 10 a cerca de 20, de cerca de 12 a cerca de 25, de cerca de 12 a cerca de 20, de cerca de 14 a cerca de 25, ou de cerca de 14 a cerca de 20 aminoácidos. Em algumas modalidades, o segundo ligante tem um comprimento de cerca de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 aminoácidos. Em algumas modalidades, o segundo ligante compreende um ligante flexível. Em algumas modalidades, o segundo ligante compreende um ligante glicina-serina, por exemplo, um ligante (G4S)n (SEQ ID Nº: 371). Em algumas modalidades, o segundo ligante compreende um ligante (G4S)2 (SEQ ID Nº: 372). Em algumas modalidades, o segundo ligante compreende um ligante (G4S)3 (SEQ ID Nº: 373). Em algumas modalidades, o segundo ligante compreende um ligante(G4S)2-G4 (SEQ ID Nº: 389). Em algumas modalidades, o segundo ligante compreende um ligante RTVA(G4S)2 (RTVAGGGGSGGGGS; SEQ ID Nº: 401), um ligante (RTVA(G4S)3) (RTVAGGGGSGGGGSGGGGS; SEQ ID Nº: 390), um ligante ASTK(G4S)2 (ASTKGGGGSGGGGS; SEQ ID Nº: 402), ou um ligante ASTK(G4S)3 (ASTKGGGGSGGGGSGGGGS; SEQ ID Nº: 391).
[00106] Em algumas modalidades, para o scFv que é fundido ao segundo polipeptídeo Fc, a região VL e a região VH são conectadas por meio de um segundo ligante, em que a orientação do scFv é a região VL - segundo ligante - região VH (isto é, a VL região está mais próxima do segundo polipeptídeo Fc do que a região VH). Em algumas modalidades, a região VL e a região VH são conectadas por meio de um segundo ligante, em que a orientação do scFv é a região VH - segundo ligante - região VL (isto é, a região VH está mais próxima do segundo polipeptídeo Fc do que a região VL).
[00107] Em algumas modalidades, o scFv compreende uma ou mais pontes dissulfeto entre resíduos de cisteína da região VH e da região VL. Em algumas modalidades, o scFv compreende uma cisteína em cada uma das posições VH44 e VL100, como numerado de acordo com a numeração de domínio variável de Kabat. Em algumas modalidades, o scFv compreende uma ligação dissulfeto entre as cisteínas nas posições VH44 e VL100. mAb/Fv
[00108] Em algumas modalidades, uma proteína biespecífica compreende polipeptídeos Fc que são fundidos em cada N-terminal a um Fab que se liga especificamente a um primeiro antígeno e no C- terminal a uma região variável de cadeia pesada ou uma região variável de cadeia leve de um Fab que se liga especificamente a um segundo antígeno, formando assim uma proteína que se liga ao primeiro antígeno de forma bivalente e ao segundo antígeno de forma monovalente. Em algumas modalidades, o primeiro antígeno e o segundo antígeno são o mesmo antígeno. Em algumas modalidades, o primeiro antígeno e o segundo antígeno são antígenos diferentes.
[00109] Em algumas modalidades, a proteína biespecífica compreende: (a) um primeiro polipeptídeo Fc que é fundido no N- terminal a uma porção Fd de um Fab que se liga especificamente a um primeiro antígeno e é fundido no C-terminal a uma região variável da cadeia pesada ou uma região variável da cadeia leve de um Fab que se liga especificamente a um segundo antígeno;
(b) um segundo polipeptídeo Fc que é fundido no N- terminal a uma porção Fd de um Fab que se liga especificamente a um primeiro antígeno e é fundido no C-terminal à outra de uma região variável da cadeia pesada ou região variável da cadeia leve recitada em (a), em que a região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve juntas formam um fragmento Fv que liga especificamente o segundo antígeno, e em que o primeiro e o segundo polipeptídeos Fc formam um dímero Fc; e (c) um polipeptídeo de cadeia leve que emparelha com cada uma das porções Fd citadas em (a) e (b) para formar um Fab que se liga especificamente ao primeiro antígeno; em que o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende um CH2 modificado ou domínio CH3 modificado e se liga especificamente a TfR.
[00110] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc compreende um domínio CH3 modificado e se liga especificamente a TfR. Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo Fc compreende um domínio CH3 modificado e se liga especificamente a TfR. Em algumas modalidades, tanto o primeiro polipeptídeo Fc quanto o segundo polipeptídeo Fc compreendem um domínio CH3 modificado e se ligam especificamente a TfR. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende uma ou mais modificações que promovem a ligação de TfR e/ou intensificam a heterodimerização. Os polipeptídeos Fc modificados são descritos adicionalmente na Seção IV abaixo. Em algumas modalidades, um dos polipeptídeos Fc é um polipeptídeo Fc da cadeia pesada de imunoglobulina nativa (isto é, tipo selvagem) tendo a sequência de SEQ ID Nº: 1.
[00111] Em algumas modalidades, a porção Fd recitada em (a)
compreende sequências CDR de cadeia pesada idênticas à porção Fd recitada em (b). Em algumas modalidades, a porção Fd recitada em (a) compreende uma sequência de região variável da cadeia pesada idêntica à porção Fd recitada em (b). Em algumas modalidades, a porção Fd recitada em (a) tem uma sequência idêntica à porção Fd recitada em (b).
[00112] Em algumas modalidades, o Fab que se liga especificamente ao primeiro antígeno que é formado a partir do pareamento da porção Fd recitada em (a) com o polipeptídeo da cadeia leve recitado em (c) é idêntico ao Fab que se liga especificamente ao primeiro antígeno que é formado a partir do pareamento da porção Fd recitada em (b) com o polipeptídeo da cadeia leve recitado em (c).
[00113] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc é fundido à região variável da cadeia pesada do fragmento Fv e o segundo polipeptídeo Fc é fundido à região variável da cadeia leve do fragmento Fv. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc é fundido à região variável da cadeia leve do fragmento Fv e o segundo polipeptídeo Fc é fundido à região variável da cadeia pesada do fragmento Fv.
[00114] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc é fundido no C-terminal à região variável da cadeia pesada ou região variável da cadeia leve através de um primeiro ligante. Em algumas modalidades, o primeiro ligante tem um comprimento de cerca de 1 a cerca de 50 aminoácidos, por exemplo, de cerca de 1 a cerca de 40, de cerca de 1 a cerca de 30, de cerca de 1 a cerca de 25, de cerca de 1 a cerca de 20, de cerca de 1 a cerca de 15, de cerca de 1 a cerca de 10, de cerca de 2 a cerca de 40, de cerca de 2 a cerca de 30, de cerca de 2 a cerca de 20, de cerca de 2 a cerca de 10, de cerca de 5 a cerca de 40, de cerca de 5 a cerca de 30, de cerca de 5 a cerca de 25, ou de cerca de 5 a cerca de 20 aminoácidos. Em algumas modalidades, o primeiro ligante tem um comprimento de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 aminoácidos. Em algumas modalidades, o primeiro ligante no primeiro polipeptídeo Fc é o mesmo que o primeiro ligante no segundo polipeptídeo Fc.
[00115] Em algumas modalidades, o primeiro ligante compreende um ligante flexível. Em algumas modalidades, o primeiro ligante compreende um ligante glicina-serina, por exemplo, um ligante (G4S)n (SEQ ID Nº: 371), como um ligante G4S (SEQ ID Nº: 371), um ligante (G4S)2 (SEQ ID Nº: 372), um ligante (G4S)3 (SEQ ID Nº: 373), ou um ligante (G4S)2-G4 (SEQ ID Nº: 389). Em algumas modalidades, o primeiro ligante compreende um ligante G4S (SEQ ID Nº: 371). Em algumas modalidades, o primeiro ligante compreende um ligante (G4S)2 (SEQ ID Nº: 372). Em algumas modalidades, o primeiro ligante compreende um ligante (G4S)3 (SEQ ID Nº: 373). Em algumas modalidades, o primeiro ligante compreende um ligante G4S)2-G4 (SEQ ID Nº: 389). mAb/scFv
[00116] Em algumas modalidades, uma proteína biespecífica compreende polipeptídeos Fc que são fundidos em cada N-terminal a um Fab que se liga especificamente a um primeiro antígeno e são fundidos no C-terminal de um ou ambos os polipeptídeos Fc a um scFv que se liga especificamente a um segundo antígeno. Em algumas modalidades, o primeiro antígeno e o segundo antígeno são o mesmo antígeno. Em algumas modalidades, o primeiro antígeno e o segundo antígeno são antígenos diferentes.
[00117] [0001] Em algumas modalidades, a proteína biespecífica compreende: (a) um primeiro polipeptídeo Fc que é fundido no N- terminal a uma porção Fd de um Fab que se liga especificamente a um primeiro antígeno;
(b) um segundo polipeptídeo Fc que é fundido no N- terminal a uma porção Fd de um Fab que se liga especificamente a um primeiro antígeno, em que o primeiro e polipeptídeos Fc formam um dímero Fc; e (c) um polipeptídeo de cadeia leve que emparelha com cada uma das porções Fd citadas em (a) e (b) para formar um Fab que se liga especificamente ao primeiro antígeno; em que o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc é fundido no C-terminal a um scFv que se liga especificamente a um segundo antígeno; em que o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende um CH2 modificado ou domínio CH3 modificado e se liga especificamente a TfR.
[00118] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc compreende um domínio CH3 modificado e se liga especificamente a TfR. Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo Fc compreende um domínio CH3 modificado e se liga especificamente a TfR. Em algumas modalidades, tanto o primeiro polipeptídeo Fc quanto o segundo polipeptídeo Fc compreendem um domínio CH3 modificado e se ligam especificamente a TfR. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende uma ou mais modificações que promovem a ligação de TfR e/ou intensificam a heterodimerização. Os polipeptídeos Fc modificados são descritos adicionalmente na Seção IV abaixo. Em algumas modalidades, um dos polipeptídeos Fc é um polipeptídeo Fc da cadeia pesada de imunoglobulina nativa (isto é, tipo selvagem) tendo a sequência de SEQ ID Nº: 1.
[00119] Em algumas modalidades, a porção Fd recitada em (a) compreende sequências CDR de cadeia pesada idênticas à porção Fd recitada em (b). Em algumas modalidades, a porção Fd recitada em (a)
compreende uma sequência de região variável da cadeia pesada idêntica à porção Fd recitada em (b). Em algumas modalidades, a porção Fd recitada em (a) tem uma sequência idêntica à porção Fd recitada em (b).
[00120] Em algumas modalidades, o Fab que se liga especificamente ao primeiro antígeno que é formado a partir do pareamento da porção Fd recitada em (a) com o polipeptídeo da cadeia leve recitado em (c) é idêntico ao Fab que se liga especificamente ao primeiro antígeno que é formado a partir do pareamento da porção Fd recitada em (b) com o polipeptídeo da cadeia leve recitado em (c).
[00121] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc é fundido no C-terminal a um scFv que se liga especificamente ao segundo antígeno. Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo Fc é fundido no C-terminal a um scFv que se liga especificamente ao segundo antígeno. Em algumas modalidades, cada um do primeiro polipeptídeo Fc e do segundo polipeptídeo Fc é fundido no C-terminal a um scFv que se liga especificamente ao segundo antígeno. Em algumas modalidades, o scFv que é fundido ao primeiro polipeptídeo Fc compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 75% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência) para a sequência de aminoácidos do scFv que é fundido ao segundo polipeptídeo Fc. Em algumas modalidades, o scFv que é fundido ao primeiro polipeptídeo Fc compreende CDRs idênticos (por exemplo, CDRs da cadeia pesada idênticos e CDRs da cadeia leve idênticos) como o scFv que é fundido ao segundo polipeptídeo Fc. Em algumas modalidades, o scFv que é fundido ao primeiro polipeptídeo Fc compreende a região variável da cadeia pesada idêntica e sequências da região variável da cadeia leve como o scFv que é fundido ao segundo polipeptídeo Fc. Em algumas modalidades, o scFv que é fundido ao primeiro polipeptídeo Fc tem uma sequência de aminoácidos idêntica ao scFv que é fundido ao segundo polipeptídeo Fc.
[00122] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc é fundido ao scFv por meio de um primeiro ligante. Em algumas modalidades, o primeiro ligante tem um comprimento de cerca de 1 a cerca de 50 aminoácidos, por exemplo, de cerca de 1 a cerca de 40, de cerca de 1 a cerca de 30, de cerca de 1 a cerca de 25, de cerca de 1 a cerca de 20, de cerca de 1 a cerca de 15, de cerca de 1 a cerca de 10, de cerca de 2 a cerca de 40, de cerca de 2 a cerca de 30, de cerca de 2 a cerca de 20, de cerca de 2 a cerca de 10, de cerca de 5 a cerca de 40, de cerca de 5 a cerca de 30, de cerca de 5 a cerca de 25, ou de cerca de 5 a cerca de 20 aminoácidos. Em algumas modalidades, o primeiro ligante tem um comprimento de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 aminoácidos.
[00123] Em algumas modalidades, o primeiro ligante compreende um ligante flexível. Em algumas modalidades, o primeiro ligante compreende um ligante glicina-serina, por exemplo, um ligante (G4S)n (SEQ ID Nº: 371), como um ligante G4S (SEQ ID Nº: 371), um ligante (G4S)2 (SEQ ID Nº: 372), um ligante (G4S)3 (SEQ ID Nº: 373), ou um ligante (G4S)2-G4 (SEQ ID Nº: 389). Em algumas modalidades, o primeiro ligante compreende um ligante G4S (SEQ ID Nº: 371). Em algumas modalidades, o primeiro ligante compreende um ligante (G4S)2 (SEQ ID Nº: 372). Em algumas modalidades, o primeiro ligante compreende um ligante (G4S)3 (SEQ ID Nº: 373). Em algumas modalidades, o primeiro ligante compreende um ligante G4S)2-G4 (SEQ ID Nº: 389).
[00124] Em algumas modalidades, o scFv que é fundido ao primeiro polipeptídeo Fc e/ou ao segundo polipeptídeo Fc compreende uma sequência da região variável da cadeia pesada (VH) e uma sequência da região variável da cadeia leve (VL) de um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga especificamente ao segundo antígeno. Em algumas modalidades, a orientação da região VL e da região VH no scFv que é fundido ao primeiro polipeptídeo Fc e/ou ao segundo polipeptídeo Fc é a região VL - região VH (ou seja, a região VL está mais próxima do segundo polipeptídeo Fc do que a região VH). Em algumas modalidades, a orientação da região VL e da região VH no scFv que é fundido ao primeiro polipeptídeo Fc e ao segundo polipeptídeo Fc é a região VH - região VL (isto é, a região VH está mais próxima do segundo polipeptídeo Fc do que a região VL).
[00125] Em algumas modalidades, a região VL e a região VH do scFv são conectadas por meio de um segundo ligante. Em algumas modalidades, o segundo ligante tem um comprimento de cerca de 10 a cerca de 25 aminoácidos, por exemplo, de cerca de 10 a cerca de 20, de cerca de 12 a cerca de 25, de cerca de 12 a cerca de 20, de cerca de 14 a cerca de 25, ou de cerca de 14 a cerca de 20 aminoácidos. Em algumas modalidades, o segundo ligante tem um comprimento de cerca de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 aminoácidos. Em algumas modalidades, o segundo ligante compreende um ligante flexível. Em algumas modalidades, o segundo ligante compreende um ligante glicina-serina, por exemplo, um ligante (G4S)n (SEQ ID Nº: 371). Em algumas modalidades, o segundo ligante compreende um ligante (G4S)2 (SEQ ID Nº: 372). Em algumas modalidades, o segundo ligante compreende um ligante (G4S)3 (SEQ ID Nº: 373). Em algumas modalidades, o segundo ligante compreende um ligante(G4S)2-G4 (SEQ ID Nº: 389). Em algumas modalidades, o segundo ligante compreende um ligante RTVA(G4S)2 (SEQ ID Nº: 401), um ligante RTVA(G4S)3 (SEQ ID Nº: 374), um ligante ASTK(G4S)2 (SEQ ID Nº: 402), ou m ligante ASTK(G4S)3 (SEQ ID Nº: 375).
[00126] Em algumas modalidades, para o scFv que é fundido ao primeiro polipeptídeo Fc e/ou ao segundo polipeptídeo Fc, a região VL e a região VH são conectadas por meio de um segundo ligante, em que a orientação do scFv é a região VL - segundo ligante - região VH (isto é, a VL região está mais próxima do segundo polipeptídeo Fc do que a região VH). Em algumas modalidades, a região VL e a região VH são conectadas por meio de um segundo ligante, em que a orientação do scFv é a região VH - segundo ligante - região VL (isto é, a região VH está mais próxima do segundo polipeptídeo Fc do que a região VL).
[00127] Em algumas modalidades, o scFv que é fundido ao primeiro polipeptídeo Fc e/ou ao segundo polipeptídeo Fc compreende uma ou mais pontes dissulfeto entre resíduos de cisteína da região VH e da região VL. Em algumas modalidades, o scFv compreende uma cisteína em cada uma das posições VH44 e VL100, como numerado de acordo com a numeração de domínio variável de Kabat. Em algumas modalidades, o scFv compreende uma ligação dissulfeto entre as cisteínas nas posições VH44 e VL100.
[00128] Para as proteínas biespecíficas no presente documento descritas, os métodos para analisar a afinidade de ligação, a cinética de ligação e a reatividade cruzada são conhecidos na técnica. Esses métodos incluem, mas não estão limitados a, ensaios de ligação em fase sólida (por exemplo, ensaio ELISA), imunoprecipitação, ressonância plasmônica de superfície (por exemplo, Biacore™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ)), ensaios de exclusão cinética (por exemplo, KinExA®), citometria de fluxo, classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), interferometria BioLayer (por exemplo, Octet® (FortéBio, Inc., Menlo Park, CA)) e análise de Western blot. Em algumas modalidades, o ELISA é usado para determinar a afinidade de ligação e/ou reatividade cruzada. Os métodos para a realização de ensaios ELISA são conhecidos na técnica e também são descritos na seção
Exemplo abaixo. Em algumas modalidades, a ressonância plasmônica de superfície (SPR) é usada para determinar a afinidade de ligação, cinética de ligação e/ou reatividade cruzada. Em algumas modalidades, os ensaios de exclusão cinética são usados para determinar a afinidade de ligação, cinética de ligação e/ou reatividade cruzada. Em algumas modalidades, os ensaios de interferometria BioLayer são usados para determinar a afinidade de ligação, cinética de ligação e/ou reatividade cruzada IV. POLIPEPTÍDEOS FC MODIFICADOS PARA LIGAÇÃO DO RECEPTOR DA BARREIRA SANGUÍNEA (BBB)
[00129] Em alguns aspectos, proteínas biespecíficas que se ligam especificamente a um primeiro antígeno e um segundo antígeno são capazes de ser transportadas através da barreira hematoencefálica (BBB). Essa proteína compreende um polipeptídeo Fc modificado que se liga a um receptor BBB. Os receptores BBB são expressos no endotélio BBB, bem como em outros tipos de células e tecidos. Em algumas modalidades, o receptor BBB é TfR.
[00130] Em algumas modalidades, uma proteína biespecífica compreende um primeiro polipeptídeo Fc e, opcionalmente, um segundo polipeptídeo Fc, cada um dos quais pode ser modificado de forma independente. Em algumas modalidades, as modificações permitem que a proteína biespecífica se ligue especificamente a um receptor de transferrina. As modificações podem ser introduzidas em conjuntos específicos de aminoácidos que estão presentes na superfície do domínio CH3 ou CH2. Em algumas modalidades, as proteínas biespecíficas compreendendo um polipeptídeo Fc compreendendo domínios CH3 ou CH2 modificados se ligam especificamente a um epítopo no domínio apical do receptor de transferrina.
[00131] Os resíduos de aminoácidos designados em várias modificações Fc, incluindo aqueles introduzidos em um polipeptídeo Fc modificado que se liga a um receptor BBB, por exemplo, TfR, são numerados no presente documento usando a numeração de índice EU. Qualquer polipeptídeo Fc, por exemplo, um polipeptídeo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 Fc, pode ter modificações, por exemplo, substituições de aminoácidos, em uma ou mais posições como descrito neste documento. Um versado na técnica entende que os domínios CH2 e CH3 de outros isótipos de imunoglobulina, por exemplo, IgM, IgA, IgE, IgD, etc. podem ser modificados de forma semelhante, identificando os aminoácidos nesses domínios que correspondem às modificações no presente documento descritas (por exemplo, as modificações nos conjuntos (i)-(vi) abaixo). As modificações também podem ser feitas nos domínios correspondentes de imunoglobulinas de outras espécies, por exemplo, primatas não humanos, macaco, camundongo, rato, coelho, cachorro, porco, galinha e semelhantes. Polipeptídeos Fc de ligação a TfR que compreendem mutações no domínio CH3
[00132] Em algumas modalidades, o domínio que é modificado para a atividade de ligação ao receptor BBB é um domínio Ig CH3 humano, como um domínio IgG1 CH3. O domínio CH3 pode ser de qualquer subtipo de IgG, isto é, de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. No contexto de anticorpos IgG1, um domínio CH3 refere-se ao segmento de aminoácidos de cerca da posição 341 a cerca da posição 447 como numerado de acordo com o esquema de numeração EU.
[00133] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a TfR se liga ao domínio apical de TfR e pode se ligar a TfR sem bloquear ou inibir de outra forma a ligação de transferrina a TfR. Em algumas modalidades, a ligação da transferrina a TfR não é substancialmente inibida. Em algumas modalidades, a ligação da transferrina a TfR é inibida em menos de cerca de 50% (por exemplo, menos de cerca de 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% ou 5%). Em algumas modalidades, a ligação da transferrina a TfR é inibida em menos de cerca de 20% (por exemplo, menos de cerca de 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1%). Polipeptídeos ilustrativos do domínio CH3 que exibem esta especificidade de ligação incluem polipeptídeos com substituições de aminoácidos nas posições 384, 386, 387, 388, 389, 390, 413, 416 e 421, de acordo com a numeração EU. Conjunto de ligação ao receptor de transferrina CH3 (i): 384, 386, 387, 388, 389, 390, 413, 416 e 421
[00134] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a TfR compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro, e normalmente cinco, seis, sete, oito ou nove substituições em um conjunto de aminoácidos que compreendem 384, 386, 387, 388, 389, 390, 413, 416 e 421, de acordo com a numeração EU ("conjunto i"). Substituições ilustrativas que podem ser introduzidas nessas posições são mostradas na Tabela 6.
[00135] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a TfR compreende pelo menos uma posição tendo uma substituição como a seguir: Leu, Tyr, Met ou Val na posição 384; Leu, Thr, His ou Pro na posição 386; Val, Pro ou um aminoácido acídico na posição 387; um aminoácido aromático, por exemplo,Trp ou Gly (por exemplo, Trp) na posição 388; Val, Ser ou Ala na posição 389; um aminoácido acídico, Ala, Ser, Leu, Thr ou Pro na posição 413; Thr ou um aminoácido acídico na posição 416; ou Trp, Tyr, His ou Phe na posição 421. Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado pode compreender uma substituição conservativa, por exemplo, um aminoácido no mesmo agrupamento de carga, agrupamento de hidrofobicidade, agrupamento de estrutura de anel de cadeia lateral (por exemplo, aminoácidos aromáticos) ou agrupamento de tamanho e/ou polar ou agrupamento não polar, de um aminoácido especificado em uma ou mais das posições no conjunto. Assim, por exemplo, Ile pode estar presente na posição 384, 386 e/ou na posição 413. Em algumas modalidades, o aminoácido acídico na posição um, dois ou cada uma das posições 387, 413 e 416 é Glu. Em outras modalidades, o aminoácido acídico em uma, duas ou cada uma das posições 387, 413 e 416 é Asp. Em algumas modalidades, duas, três, quatro cinco, seis, sete ou todas os oito das posições 384, 386, 387, 388, 389, 413, 416 e 421 têm uma substituição de aminoácido como especificado neste parágrafo.
[00136] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado com modificações no conjunto (i) compreende um Asn nativo na posição
390. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende Gly, His, Gln, Leu, Lys, Val, Phe, Ser, Ala ou Asp na posição 390. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende ainda uma, duas, três ou quatro substituições nas posições que compreendem 380, 391, 392 e 415. Em algumas modalidades, Trp, Tyr, Leu ou Gln podem estar presentes na posição 380. Em algumas modalidades, Ser, Thr, Gln ou Phe podem estar presentes na posição
391. Em algumas modalidades, Gln, Phe ou His podem estar presentes na posição 392. Em algumas modalidades, Glu pode estar presente na posição 415.
[00137] Em certas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez posições selecionadas das seguintes: Trp, Leu ou Glu na posição 380; Tyr ou Phe na posição 384; Thr na posição 386; Glu na posição 387; Trp na posição 388; Ser, Ala, Val ou Asn na posição 389; Ser ou Asn na posição 390; Thr ou Ser na posição 413; Glu ou Ser na posição 415; Glu na posição 416; e/ou Phe na posição 421. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende todas as onze posições como segue: Trp, Leu ou Glu na posição 380; Tyr ou Phe na posição 384; Thr na posição 386; Glu na posição 387; Trp na posição 388; Ser, Ala, Val ou Asn na posição 389; Ser ou Asn na posição 390; Thr ou Ser na posição 413; Glu ou Ser na posição 415; Glu na posição 416; e/ou Phe na posição 421.
[00138] Em certas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende Leu ou Met na posição 384; Leu, His ou Pro na posição 386; Val na posição 387; Trp na posição 388; Val ou Ala na posição 389; Pro na posição 413; Thr na posição 416; e/ou Trp na posição 421. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de domínio CH3 modificado compreende ainda Ser, Thr, Gln ou Phe na posição 391. Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado compreende ainda Trp, Tyr, Leu ou Gln na posição 380 e/ou Gln, Phe ou His na posição 392. Em algumas modalidades, Trp está presente na posição 380 e/ou Gln está presente na posição 392. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de domínio CH3 modificado não tem um Trp na posição
380.
[00139] Em outras modalidades, um polipeptídeo Fc modificado compreende Tyr na posição 384; Thr na posição 386; Glu ou Val e posição 387; Trp na posição 388; Ser na posição 389; Ser ou Thr na posição 413; Glu na posição 416; e/ou Phe na posição 421. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende um Asn nativo na posição 390. Em certas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende ainda Trp, Tyr, Leu ou Gln na posição 380; e/ou Glu na posição 415. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende ainda Trp na posição 380 e/ou Glu na posição 415.
[00140] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende uma ou mais das seguintes substituições: Trp na posição 380; Thr na posição 386; Trp na posição 388; Val na posição 389; Ser ou Thr na posição 413; Glu na posição 415; e/ou Phe na posição 421.
[00141] Em modalidades adicionais, o polipeptídeo Fc modificado compreende ainda uma, duas ou três posições selecionadas a partir das seguintes: a posição 414 é Lys, Arg, Gly ou Pro; a posição 424 é Ser, Thr, Glu ou Lys; e a posição 426 é Ser, Trp ou Gly.
[00142] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a TfR tem pelo menos 70% de identidade, pelo menos 75% de identidade, pelo menos 80% de identidade, pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade aos aminoácidos 111-217 de qualquer uma das SEQ ID Nºs: 4-29, 101-164 e 239-252. Em algumas modalidades, tal polipeptídeo de domínio CH3 modificado compreende os aminoácidos nas posições de índice EU 384-390 e/ou 413-421 de qualquer uma das SEQ ID Nºs: 4-29, 101-164 e 239-252. Em algumas modalidades, tal polipeptídeo Fc modificado compreende os aminoácidos nas posições de índice EU 380-390 e/ou 413-421 de qualquer uma das SEQ ID Nºs: 4-29, 101-164 e 239-252. Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado compreende os aminoácidos nas posições de índice EU 380-392 e/ou 413-426 de qualquer uma das SEQ ID Nºs: 4-29, 101-164 e 239-252.
[00143] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a TfR tem pelo menos 70% de identidade, pelo menos 75% de identidade, pelo menos 80% de identidade, pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade aos aminoácidos 111-217 de SEQ ID Nº: 1, com a condição de que a identidade percentual não inclua o conjunto de posições 384, 386, 387, 388, 389, 390, 413, 416 e 421.
[00144] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado tem pelo menos 70% de identidade, pelo menos 75% de identidade, pelo menos 80% de identidade, pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID Nºs: 4-29, 101-164 e 239-252, com a condição de que pelo menos cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze ou dezesseis das posições que correspondem às posições 380, 384, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 413, 414, 415, 416, 421, 424 e 426 de qualquer uma das SEQ ID Nºs: 4-29, 101-164 e 239-252 não sejam excluídas ou substituídas.
[00145] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado tem pelo menos 75% de identidade, pelo menos 80% de identidade, pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID Nºs: 4-29, 101- 164 e 239-252 e também compreende pelo menos cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze ou dezesseis das posições como segue: Trp, Tyr, Leu, Gln ou Glu na posição 380; Leu, Tyr, Met ou Val na posição 384; Leu, Thr, His ou Pro na posição 386; Val, Pro ou um aminoácido acídico (por exemplo, Glu) na posição 387; um aminoácido aromático, por exemplo, Trp, na posição 388; Val, Ser ou Ala na posição 389; Ser ou Asn na posição 390; Ser, Thr, Gln ou Phe na posição 391; Gln, Phe ou His na posição 392; um aminoácido acídico, Ala, Ser, Leu, Thr ou Pro na posição 413; Lys, Arg, Gly ou Pro na posição 414; Glu ou Ser na posição 415; Thr ou um aminoácido acídico na posição 416; Trp, Tyr, His ou Phe na posição 421; Ser, Thr, Glu ou Lys na posição 424; e Ser, Trp ou Gly na posição 426. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado tem pelo menos 75% de identidade, pelo menos 80% de identidade, pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID Nºs: 4-29, 101-164 e 239-252 e compreende um domínio CH3 modificado compreendendo Trp, Tyr, Leu, Gln ou Glu na posição 380; Leu, Tyr, Met ou Val na posição 384; Leu, Thr, His ou Pro na posição 386; Val, Pro ou um aminoácido acídico na posição 387; um aminoácido aromático, por exemplo,Trp, na posição 388; Val, Ser ou Ala na posição 389; Ser ou Asn na posição 390; Ser, Thr, Gln ou Phe na posição 391; Gln, Phe ou His na posição 392; um aminoácido acídico (por exemplo, Asp), Ala, Ser, Leu, Thr ou Pro na posição 413; Lys, Arg, Gly ou Pro na posição 414; Glu ou Ser na posição 415; Thr ou um aminoácido acídico (por exemplo, Glu) na posição 416; Trp, Tyr, His ou Phe na posição 421; Ser, Thr, Glu ou Lys na posição 424; e Ser, Trp ou Gly na posição 426.
[00146] Em algumas modalidades, uma proteína biespecífica, como descrito neste documento, compreende um polipeptídeo Fc modificado que tem pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID Nºs: 4-29, 101-164 e 239-252, e compreende as seguintes modificações no domínio CH3: Glu na posição 380; Tyr na posição 384; Thr na posição 386; Glu na posição 387; Trp na posição 388; Val ou Ser na posição 389; Asn na posição 390; Ser, Thr, Gln ou Phe na posição 391; Gln, Phe ou His na posição 392; Asp, Ser ou Thr na posição 413; Lys na posição 414; Glu na posição 415; Glu na posição 416; Phe na posição 421; Ser na posição 424; e Ser na posição 426. Conjunto de ligação do receptor de transferrina CH3 (ii): 345, 346, 347, 349, 437, 438, 439 e 440
[00147] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a TfR compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro, e normalmente cinco, seis, sete, oito ou nove substituições em um conjunto de aminoácidos que compreendem 345, 346, 347, 349, 437, 438, 439, e 440, de acordo com a numeração EU ("conjunto ii"). Substituições ilustrativas que podem ser introduzidas nessas posições são mostradas na Tabela 5.
[00148] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende Gly na posição 437; Phe na posição 438; e/ou Asp na posição 213. Em algumas modalidades, Glu está presente na posição
440. Em certas modalidades, um polipeptídeo de domínio CH3 modificado compreende pelo menos uma substituição em uma posição como a seguir: Phe ou Ile na posição 345; Asp, Glu, Gly, Ala ou Lys na posição 346; Tyr, Met, Leu, Ile ou Asp na posição 347; Thr ou Ala na posição 349; Gly na posição 437; Phe na posição 438; His Tyr, Ser ou Phe na posição 439; ou Asp na posição 440. Em algumas modalidades, dois, três, quatro, cinco, seis, sete ou todas as oito posições 345, 346, 347, 349, 437, 438, 439 e 440 têm uma substituição como especificado neste parágrafo. Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado pode compreender uma substituição conservativa, por exemplo, um aminoácido no mesmo agrupamento de carga, agrupamento de hidrofobicidade, agrupamento de estrutura de anel de cadeia lateral (por exemplo, aminoácidos aromáticos) ou agrupamento de tamanho e/ou polar ou agrupamento não polar, de um aminoácido especificado em uma ou mais das posições no conjunto.
[00149] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a TfR tem pelo menos 70% de identidade, pelo menos 75% de identidade, pelo menos 80% de identidade, pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade aos aminoácidos 111-217 de qualquer uma das SEQ ID Nºs: 30-46. Em algumas modalidades, tal polipeptídeo Fc modificado compreende os aminoácidos nas posições de índice EU 345-349 e/ou 437-440 de qualquer uma das SEQ ID Nºs: 30-46.
[00150] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a TfR tem pelo menos 70% de identidade, pelo menos 75% de identidade, pelo menos 80% de identidade, pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade aos aminoácidos 111-217 de SEQ ID Nº: 1,
com a condição de que a identidade percentual não inclua o conjunto de posições 345, 346, 347, 349, 437, 438, 439 e 440, de acordo com a numeração EU. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende os aminoácidos nas posições de índice EU 345-349 e/ou 437-440, como estabelecido em qualquer uma das SEQ ID Nºs: 30-46.
[00151] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a TfR tem pelo menos 70% de identidade, pelo menos 75% de identidade, pelo menos 80% de identidade, pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade a qualquer uma das SEQ ID Nºs: 30-46 e compreende um domínio CH3 modificado compreendendo Phe ou Ile na posição 345; Asp, Glu, Gly, Ala ou Lys na posição 346; Tyr, Met, Leu, Ile ou Asp na posição 347; Thr ou Ala na posição 349; Gly na posição 437; Phe na posição 438; His Tyr, Ser ou Phe na posição 439; ou Asp na posição 440. Polipeptídeos Fc de ligação a TfR que compreendem mutações no domínio CH2
[00152] Em algumas modalidades, o domínio que é modificado para a atividade de ligação ao receptor BBB é um domínio Ig CH2 humano, como um domínio IgG CH2. O domínio CH2 pode ser de qualquer subtipo de IgG, isto é, de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. No contexto de anticorpos IgG1, um domínio CH2 refere-se ao segmento de aminoácidos de cerca da posição 231 a cerca da posição 340 como numerado de acordo com o esquema de numeração EU.
[00153] Como indicado acima, os conjuntos de resíduos de um domínio CH2 que podem ser modificados de acordo com a invenção são numerados de acordo com a numeração EU. Qualquer domínio CH2, por exemplo, um domínio CH2 de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4, pode ter modificações, por exemplo, substituições de aminoácidos, em um ou mais conjuntos de resíduos que correspondem aos resíduos nas posições anotadas.
[00154] Em uma modalidade, um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a TfR se liga a um epítopo no domínio apical do receptor de transferrina. O polipeptídeo Fc modificado pode se ligar a TfR sem bloquear ou inibir de outra forma a ligação da transferrina ao receptor. Em algumas modalidades, a ligação da transferrina a TfR não é substancialmente inibida. Em algumas modalidades, a ligação da transferrina a TfR é inibida em menos de cerca de 50% (por exemplo, menos de cerca de 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% ou 5%). Em algumas modalidades, a ligação da transferrina a TfR é inibida em menos de cerca de 20% (por exemplo, menos de cerca de 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1%). Conjunto de ligação do receptor de transferrina CH2 (iii): 274, 276, 283, 285, 286, 287, 288, 289 e 290
[00155] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a TfR compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro, e normalmente cinco, seis, sete, oito ou nove substituições em um conjunto de aminoácidos que compreendem 274, 276, 283, 285, 286, 287, 288 e 290, de acordo com a numeração EU ("conjunto iii"). Substituições ilustrativas que podem ser introduzidas nessas posições são mostradas na Tabela 1.
[00156] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende Glu na posição 287 e/ou Trp na posição 288. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende pelo menos uma substituição na posição seguinte: Glu, Gly, Gln, Ser, Ala, Asn, Tyr ou Trp na posição 274; Ile, Val, Asp, Glu, Thr, Ala ou Tyr na posição 276; Asp, Pro, Met, Leu, Ala, Asn ou Phe na posição 283; Arg, Ser, Ala ou Gly na posição 285; Tyr, Trp, Arg ou Val na posição 286; Glu na posição 287; Trp ou Tyr na posição 288; Gln, Tyr, His, Ile, Phe, Val ou Asp na posição 289; ou Leu, Trp, Arg, Asn, Tyr ou Val na posição 290. Em algumas modalidades, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou todas as nove das posições 274, 276, 283, 285, 286, 287, 288 e 290 têm uma substituição como especificado neste parágrafo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado pode compreender uma substituição conservativa, por exemplo, um aminoácido no mesmo agrupamento de carga, agrupamento de hidrofobicidade, agrupamento de estrutura de anel de cadeia lateral (por exemplo, aminoácidos aromáticos) ou agrupamento de tamanho e/ou polar ou agrupamento não polar, de um aminoácido especificado em uma ou mais das posições no conjunto.
[00157] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende Glu, Gly, Gln, Ser, Ala, Asn ou Tyr na posição 274; Ile, Val, Asp, Glu, Thr, Ala ou Tyr na posição 276; Asp, Pro, Met, Leu, Ala ou Asn na posição 283; Arg, Ser ou Ala na posição 285; Tyr, Trp, Arg ou Val na posição 286; Glu na posição 287; Trp na posição 288; Gln, Tyr, His, Ile, Phe ou Val na posição 289; e/ou Leu, Trp, Arg, Asn ou Tyr na posição
290. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende Arg na posição 285; Tyr ou Trp na posição 286; Glu na posição 287; Trp na posição 288; e/ou Arg ou Trp na posição 290.
[00158] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a TfR tem pelo menos 70% de identidade, pelo menos 75% de identidade, pelo menos 80% de identidade, pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade aos aminoácidos 1-110 de qualquer uma das SEQ ID Nºs: 47-62. Em algumas modalidades, tal polipeptídeo Fc modificado compreende os aminoácidos nas posições de índice EU 374-276 e/ou 283-290 de qualquer uma das SEQ ID Nºs: 47-62.
[00159] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a TfR tem pelo menos 70% de identidade, pelo menos 75% de identidade, pelo menos 80% de identidade, pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade aos aminoácidos 1-110 de SEQ ID Nº: 1, com a condição de que a identidade percentual não inclua o conjunto de posições 274, 276, 283, 285, 286, 287, 288 e 290, de acordo com a numeração EU. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de domínio CH2 modificado compreende os aminoácidos nas posições de índice EU 374-276 e/ou 283-290, como estabelecido em qualquer uma das SEQ ID Nºs: 47-62.
[00160] Em modalidades adicionais, um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a TfR tem pelo menos 70% de identidade, pelo menos 75% de identidade, pelo menos 80% de identidade, pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade a qualquer uma das SEQ ID Nºs: 47-62 e compreende um domínio CH2 modificado compreendendo Glu, Gly, Gln, Ser, Ala, Asn ou Tyr na posição 274; Ile, Val, Asp, Glu, Thr, Ala ou Tyr na posição 276; Asp, Pro, Met, Leu, Ala ou Asn na posição 283; Arg, Ser ou Ala na posição 285; Tyr, Trp, Arg ou Val na posição 286; Glu na posição 287; Trp na posição 288; Gln, Tyr, His, Ile, Phe ou Val na posição 289; e/ou Leu, Trp, Arg, Asn ou Tyr na posição 290. Conjunto de ligação do receptor de transferrina CH2 (iv): 274, 276, 283, 285, 286, 287, 288, 289 e 290
[00161] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a TfR compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três, ou pelo menos quatro, e normalmente cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições em um conjunto de posições de aminoácidos compreendendo 266, 267, 268, 269, 270, 271, 295, 297, 298 e 299, de acordo com a numeração EU ("conjunto iv").
Substituições ilustrativas que podem ser introduzidas nessas posições são mostradas na Tabela 2.
[00162] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a TfR compreende Pro na posição 270, Glu na posição 295 e/ou Tyr na posição 297. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende pelo menos uma substituição na posição seguinte: Pro, Phe, Ala, Met ou Asp na posição 266; Gln, Pro, Arg, Lys, Ala, Ile, Leu, Glu, Asp ou Tyr na posição 267; Thr, Ser, Gly, Met, Val, Phe, Trp ou Leu na posição 268; Pro, Val, Ala, Thr ou Asp na posição 269; Pro, Val ou Phe na posição 270; Trp, Gln, Thr ou Glu na posição 271; Glu, Val, Thr, Leu ou Trp na posição 295; Tyr, His, Val ou Asp na posição 297; Thr, His, Gln, Arg, Asn ou Val na posição 298; ou Tyr, Asn, Asp, Ser ou Pro na posição 299. Em algumas modalidades, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou todas as dez das posições 266, 267, 268, 269, 270, 271, 295, 297, 298 e 299 têm uma substituição como especificado neste parágrafo. Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado pode compreender uma substituição conservativa, por exemplo, um aminoácido no mesmo agrupamento de carga, agrupamento de hidrofobicidade, agrupamento de estrutura de anel de cadeia lateral (por exemplo, aminoácidos aromáticos) ou agrupamento de tamanho e/ou polar ou agrupamento não polar, de um aminoácido especificado em uma ou mais das posições no conjunto.
[00163] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende Pro, Phe ou Ala na posição 266; Gln, Pro, Arg, Lys, Ala ou Ile na posição 267; Thr, Ser, Gly, Met, Val, Phe ou Trp na posição 268; Pro, Val ou Ala na posição 269; Pro na posição 270; Trp ou Gln na posição 271; Glu na posição 295; Tyr na posição 297; Thr, His ou Gln na posição 298; e/ou Tyr, Asn, Asp ou Ser na posição 299.
[00164] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende Met na posição 266; Leu ou Glu na posição 267; Trp na posição 268; Pro na posição 269; Val na posição 270; Thr na posição 271; Val ou Thr na posição 295; Seu na posição 197; His, Arg ou Asn na posição 198; e/ou Pro na posição 299.
[00165] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende Asp na posição 266; Asp na posição 267; Leu na posição 268; Thr na posição 269; Phe na posição 270; Gln na posição 271; Val ou Leu na posição 295; Val na posição 297; Thr na posição 298; e/ou Pro na posição 299.
[00166] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a TfR tem pelo menos 70% de identidade, pelo menos 75% de identidade, pelo menos 80% de identidade, pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade aos aminoácidos 1-110 de qualquer uma das SEQ ID Nºs: 63-85. Em algumas modalidades, tal polipeptídeo Fc modificado compreende os aminoácidos nas posições de índice EU 266-271 e/ou 295-299 como estabelecido em qualquer uma das SEQ ID Nºs: 63-85.
[00167] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a TfR tem pelo menos 70% de identidade, pelo menos 75% de identidade, pelo menos 80% de identidade, pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade aos aminoácidos 1-110 de SEQ ID Nº: 1, com a condição de que a identidade percentual não inclua o conjunto de posições 266, 267, 268, 269, 270, 271, 295, 297, 298, e 299, de acordo com a numeração EU. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de domínio CH2 modificado compreende os aminoácidos nas posições de índice EU 266-271 e/ou 295-299, como estabelecido em qualquer uma das SEQ ID Nºs: 63-85.
[00168] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a TfR compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade, pelo menos 80% de identidade, pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com aminoácidos 39-72 de qualquer uma das SEQ ID Nºs: 63-85 e compreende um domínio CH2 modificado compreendendo Pro, Phe ou Ala na posição 266; Gln, Pro, Arg, Lys, Ala ou Ile na posição 267; Thr, Ser, Gly, Met, Val, Phe ou Trp na posição 268; Pro, Val ou Ala na posição 269; Pro na posição 270; Trp ou Gln na posição 271; Glu na posição 295; Tyr na posição 297; Thr, His ou Gln na posição 298; e/ou Tyr, Asn, Asp ou Ser na posição
299. Conjunto de ligação do receptor de transferrina CH2 (v): 268, 269, 270, 271, 272, 292, 293, 294, 296 e 300
[00169] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a TfR compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três, ou pelo menos quatro, e normalmente cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições em um conjunto de posições de aminoácidos compreendendo 268, 269, 270, 271, 272, 292, 293, 294, 296, e 300, de acordo com a numeração EU ("conjunto v"). Substituições ilustrativas que podem ser introduzidas nessas posições são mostradas na Tabela 3.
[00170] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a TfR compreende pelo menos uma substituição em uma posição como a seguir: Val ou Asp na posição 268; Pro, Met ou Asp na posição 269; Pro ou Trp na posição 270; Arg, Trp, Glu ou Thr na posição 271; Met, Tyr ou Trp na posição 272; Leu ou Trp na posição 292; Thr, Val, Ile ou Lys na posição 293; Ser, Lys, Ala ou Leu na posição 294; His, Leu ou Pro na posição 296; ou Val ou Trp na posição 300. Em algumas modalidades, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou todas as dez das posições 268, 269, 270, 271, 272,
292, 293, 294, e 300 têm uma substituição como especificado neste parágrafo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado pode compreender uma substituição conservativa, por exemplo, um aminoácido no mesmo agrupamento de carga, agrupamento de hidrofobicidade, agrupamento de estrutura de anel de cadeia lateral (por exemplo, aminoácidos aromáticos) ou agrupamento de tamanho e/ou polar ou agrupamento não polar, de um aminoácido especificado em uma ou mais das posições no conjunto.
[00171] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende Val na posição 268; Pro na posição 269; Pro na posição 270; Arg ou Trp na posição 271; Met na posição 272; Leu na posição 292; Thr na posição 293; Ser na posição 294; His na posição 296; e/ou Val na posição 300.
[00172] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende Asp na posição 268; Met ou Asp na posição 269; Trp na posição 270; Glu ou Thr na posição 271; Tyr ou Trp na posição 272; Trp na posição 292; Val, Ile ou Lys na posição 293; Lys, Ala ou Leu na posição 294; Leu ou Pro na posição 296; e/ou Trp na posição 300.
[00173] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a TfR tem pelo menos 70% de identidade, pelo menos 75% de identidade, pelo menos 80% de identidade, pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade aos aminoácidos 1-110 de qualquer uma das SEQ ID Nºs: 86-90. Em algumas modalidades, tal polipeptídeo Fc modificado compreende os aminoácidos nas posições de índice EU 268-272 e/ou 292-300, como estabelecido em qualquer uma das SEQ ID Nºs: 86-90.
[00174] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a TfR tem pelo menos 70% de identidade, pelo menos 75% de identidade, pelo menos 80% de identidade, pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade aos aminoácidos 1-110 de SEQ ID Nº: 1, com a condição de que a identidade percentual não inclua o conjunto de posições 268, 269, 270, 271, 272, 292, 293, 294, 296, e 300, de acordo com a numeração EU. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de domínio CH2 modificado compreende os aminoácidos nas posições de índice EU 268-272 e/ou 292-300, como estabelecido em qualquer uma das SEQ ID Nºs: 86-90.
[00175] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a TfR compreende uma sequência com pelo menos 75% de identidade, pelo menos 80% de identidade, pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com aminoácidos 41-73 de qualquer uma das SEQ ID Nºs: 86-90 e compreende um domínio CH2 modificado compreendendo Val ou Asp na posição 268; Pro, Met ou Asp na posição 269; Pro ou Trp na posição 270; Arg, Trp, Glu ou Thr na posição 271; Met, Tyr ou Trp na posição 272; Leu ou Trp na posição 292; Thr, Val, Ile ou Lys na posição 293; Ser, Lys, Ala ou Leu na posição 294; His, Leu ou Pro na posição 296; ou Val ou Trp na posição 300. Conjunto de ligação ao receptor de transferrina CH2 (vi): 272, 274, 276, 322, 324, 326, 329, 330 e 331
[00176] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a TfR compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro, e normalmente cinco, seis, sete, oito ou nove substituições em um conjunto de aminoácidos que compreendem 272, 274, 276, 322, 324, 326, 329, 330, e 331, de acordo com a numeração EU ("conjunto vi"). Substituições ilustrativas que podem ser introduzidas nessas posições são mostradas na Tabela 4.
[00177] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a TfR compreende Trp na posição 330. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende pelo menos uma substituição na posição seguinte: Trp, Val, Ile ou Ala na posição 272; Trp ou Gly na posição 274; Tyr, Arg ou Glu na posição 276; Ser, Arg ou Gln na posição 322; Val, Ser ou Phe na posição 324; Ile, Ser ou Trp na posição 326; Trp, Thr, Ser, Arg ou Asp na posição 329; Trp na posição 330; ou Ser, Lys, Arg ou Val na posição 331. Em algumas modalidades, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou todas as nove das posições 272, 274, 276, 322, 324, 326, 329, 330 e 331 têm uma substituição como especificado neste parágrafo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado pode compreender uma substituição conservativa, por exemplo, um aminoácido no mesmo agrupamento de carga, agrupamento de hidrofobicidade, agrupamento de estrutura de anel de cadeia lateral (por exemplo, aminoácidos aromáticos) ou agrupamento de tamanho e/ou polar ou agrupamento não polar, de um aminoácido especificado em uma ou mais das posições no conjunto.
[00178] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou nove posições selecionadas das seguintes: a posição 272 é Trp, Val, Ile ou Ala; posição 274 é Trp ou Gly; posição 276 é Tyr, Arg ou Glu; a posição 322 é Ser, Arg ou Gln; a posição 324 é Val, Ser ou Phe; posição 326 é Ile, Ser ou Trp; a posição 329 é Trp, Thr, Ser, Arg ou Asp; posição 330 é Trp; e a posição 331 é Ser, Lys, Arg ou Val. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende Val ou Ile na posição 272; Gly na posição 274; Arg na posição 276; Arg na posição 322; Ser na posição 324; Ser na posição 326; Thr, Ser ou Arg na posição 329; Trp na posição 330; e/ou Lys ou Arg na posição 331.
[00179] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a TfR tem pelo menos 70% de identidade,
pelo menos 75% de identidade, pelo menos 80% de identidade, pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade aos aminoácidos 1-110 de qualquer uma das SEQ ID Nºs: 91-95. Em algumas modalidades, tal polipeptídeo Fc modificado compreende os aminoácidos nas posições de índice EU 272-276 e/ou 322-331, como estabelecido em qualquer uma das SEQ ID Nºs: 91-95.
[00180] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a TfR tem pelo menos 70% de identidade, pelo menos 75% de identidade, pelo menos 80% de identidade, pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade aos aminoácidos 4-113 de SEQ ID Nº: 1, com a condição de que a identidade percentual não inclua o conjunto de posições 272, 274, 276, 322, 324, 326, 329, 330, e 331, de acordo com a numeração EU. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de domínio CH2 modificado compreende os aminoácidos nas posições de índice EU 272-276 e/ou 322-331, como estabelecido em qualquer uma das SEQ ID Nºs: 91-95.
[00181] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de ligação ao receptor de transferrina compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade, pelo menos 80% de identidade, pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com qualquer um de SEQ ID Nºs: 91-95 e compreende um domínio CH2 modificado compreendendo Trp, Val, Ile ou Ala na posição 272; Trp ou Gly na posição 274; Tyr, Arg ou Glu na posição 276; Ser, Arg ou Gln na posição 322; Val, Ser ou Phe na posição 324; Ile, Ser ou Trp na posição 326; Trp, Thr, Ser, Arg ou Asp na posição 329; Trp na posição 330; ou Ser, Lys, Arg ou Val na posição 331. Modificações Adicionais do Polipeptídeo Fc
[00182] Em algumas modalidades, um ou ambos os polipeptídeos Fc contêm uma ou mais modificações adicionais. Exemplos não limitativos de outras mutações que podem ser introduzidas em um ou ambos os polipeptídeos Fc incluem, por exemplo, mutações para aumentar a estabilidade do soro e/ou meia-vida, para modular a função efetora, para influenciar a glicosilação, para reduzir a imunogenicidade em humanos, e/ou para fornecer heterodimerização de botão e furo dos polipeptídeos Fc.
[00183] Em algumas modalidades, um ou ambos os polipeptídeos Fc têm uma identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% para um polipeptídeo Fc de tipo selvagem correspondente (por exemplo, um polipeptídeo Fc IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humano).
[00184] Em algumas modalidades, os polipeptídeos Fc incluem mutações de botão e furo para promover a formação de heterodímero e impedir a formação de homodímero. Geralmente, as modificações introduzem uma protuberância ("botão") na interface de um primeiro polipeptídeo e uma cavidade correspondente ("furo") na interface de um segundo polipeptídeo, de modo que a protuberância pode ser posicionada na cavidade de modo a promover formação de heterodímero e, assim, impedir a formação de homodímero. As protuberâncias são construídas substituindo pequenas cadeias laterais de aminoácidos da interface do primeiro polipeptídeo por cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). Cavidades compensatórias de tamanho idêntico ou semelhante às protuberâncias são criadas na interface do segundo polipeptídeo, substituindo grandes cadeias laterais de aminoácidos por outras menores (por exemplo, alanina ou treonina). Em algumas modalidades, essas mutações adicionais estão em uma posição no polipeptídeo Fc que não tem um efeito negativo na ligação do polipeptídeo a um receptor BBB, por exemplo, TfR.
[00185] Em uma modalidade ilustrativa de uma abordagem de botão e furo para dimerização, a posição 366 (numerada de acordo com o esquema de numeração da EU) de um dos polipeptídeos Fc presentes no anticorpo biespecífico compreende um triptofano no lugar de uma treonina nativa. O outro polipeptídeo Fc da proteína biespecífica tem uma valina na posição 407 (numerada de acordo com o esquema de numeração EU) no lugar da tirosina nativa. O outro polipeptídeo Fc pode compreender ainda uma substituição em que a treonina nativa na posição 366 (numerada de acordo com o esquema de numeração EU) é substituída por uma serina e uma leucina nativa na posição 368 (numerada de acordo com o esquema de numeração EU) é substituída por uma alanina. Assim, um dos polipeptídeos Fc da proteína biespecífica tem a mutação de botão T366W e o outro polipeptídeo Fc tem a mutação Y407V, que é tipicamente acompanhada pelas mutações de furo T366S e L368A.
[00186] Em algumas modalidades, um ou ambos os polipeptídeos Fc compreendem uma modificação em uma ou mais das posições 251, 252, 254, 255, 256, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 385, 386, 387, 389, 428, 433, 434 ou 436, de acordo com o esquema de numeração EU. Em algumas modalidades, as mutações são introduzidas em uma, duas ou três das posições 255, 254 e 256 de acordo com a numeração EU. Em algumas modalidades, as mutações são M252Y, S254T e T256E de acordo com a numeração EU. Assim, um ou ambos os polipeptídeos Fc podem ter substituições M252Y, S254T e T256E. Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado compreende ainda as mutações M252Y, S254T e T256E. Em algumas modalidades, as mutações são introduzidas em uma ou duas das posições 428 e 434 de acordo com o esquema de numeração EU. Em algumas modalidades, as mutações são M428L e N434S ("LS") de acordo com a numeração EU. Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado compreende ainda a mutação N434S com ou sem M428L. Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado compreende uma substituição em uma, duas ou todas as três posições T307, E380 e N434 de acordo com a numeração EU. Em algumas modalidades, um ou ambos os polipeptídeos Fc compreendem substituições M428L e N434S. Em algumas modalidades, um ou ambos os polipeptídeos Fc compreendem uma substituição N434S ou N434A. Em algumas modalidades, as mutações são T307Q e N434A. Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado compreende mutações T307A, E380A e 434A. Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado compreende substituições nas posições T250 e M428 de acordo com a numeração EU. Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado compreende mutações T250Q e M428L. Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado compreende substituições nas posições M428 e N434 de acordo com a numeração EU. Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado compreende as substituições M428L e N434S. Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado compreende uma substituição N434S ou N434A. Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc que compreende uma ou mais modificações que promovem a ligação a TfR não compreende substituições LS. Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc que não compreende uma ou mais modificações que promovem a ligação a TfR compreende substituições LS. Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc que compreende uma ou mais modificações que promovem a ligação a TfR não compreende substituições LS e um polipeptídeo Fc que não compreende uma ou mais modificações que promovem a ligação a TfR compreende substituições LS. Em algumas modalidades, ambos os polipeptídeos Fc compreendem substituições LS.
[00187] Em algumas modalidades, um ou ambos os polipeptídeos Fc podem compreender modificações que reduzem a função efetora, isto é, tendo uma capacidade reduzida de induzir certas funções biológicas após a ligação a um receptor Fc expresso em uma célula efetora que medeia a função efetora. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem, mas não estão limitados a, ligação de C1q e citotoxicidade dependente do complemento (CDC), ligação ao receptor Fc, citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC), fagocitose mediada por células dependente de anticorpos (ADCP), infrarregulação de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de células B) e ativação de células B. As funções efetoras podem variar com a classe de anticorpos. Por exemplo, os anticorpos IgG1 e IgG3 humanos nativos podem desencadear atividades ADCC e CDC após a ligação a um receptor Fc apropriado presente em uma célula do sistema imunológico; e IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas nativas podem desencadear funções ADCP após a ligação ao receptor Fc apropriado presente em uma célula imune.
[00188] Em algumas modalidades, um ou ambos os polipeptídeos Fc também podem ser projetados para conter outras modificações para heterodimerização, por exemplo, engenharia eletrostática de resíduos de contato dentro de uma interface CH3-CH3 que são naturalmente carregados ou modificações de mancha hidrofóbicas.
[00189] Em algumas modalidades, um ou ambos os polipeptídeos Fc podem incluir modificações adicionais que modulam a função efetora.
[00190] Em algumas modalidades, um ou ambos os polipeptídeos Fc podem compreender modificações que reduzem ou eliminam a função efetora. Mutações polipeptídicas Fc ilustrativas que reduzem a função efetora incluem, mas não estão limitadas a, substituições em um domínio CH2, por exemplo, nas posições 234 e 235, de acordo com o esquema de numeração EU. Por exemplo, em algumas modalidades, um ou ambos os polipeptídeos Fc podem compreender resíduos de alanina nas posições 234 e 235. Assim, um ou ambos os polipeptídeos Fc podem ter substituições L234A e L235A ("LALA"). Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc que compreende uma ou mais modificações que promovem a ligação a TfR compreende ainda substituições de LALA. Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc que não compreende uma ou mais modificações que promovem a ligação a TfR compreende substituições LALA. Em algumas modalidades, ambos os polipeptídeos Fc compreendem substituições LALA.
[00191] Mutações polipeptídicas Fc adicionais que modulam uma função efetora incluem, mas não estão limitadas a, uma ou mais substituições nas posições 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329, de acordo com o esquema de numeração EU. As substituições ilustrativas incluem o seguinte: a posição 329 pode ter uma mutação em que prolina é substituída por uma glicina ou arginina ou um resíduo de aminoácido grande o suficiente para destruir a interface do receptor Fc/Fc que é formada entre a prolina 329 do Fc e os resíduos de triptofano Trp 87 e Trp 110 de FcRIII. Substituições ilustrativas adicionais incluem S228P, E233P, L235E, N297A, N297D e P331S, de acordo com o esquema de numeração EU. Múltiplas substituições também podem estar presentes, por exemplo, L234A e L235A de uma região Fc de IgG1 humana; L234A, L235A e P329G de uma região Fc de IgG1; S228P e L235E de uma região Fc de IgG4 humana; L234A e G237A de uma região Fc de IgG1 humana; L234A, L235A e G237A de uma região Fc de IgG1 humana; V234A e G237A de uma região Fc de IgG2 humana; L235A, G237A e E318A de uma região Fc de IgG4 humana; e S228P e L236E de uma região Fc de IgG4 humana, de acordo com o esquema de numeração EU. Em algumas modalidades, um ou ambos os polipeptídeos Fc podem ter uma ou mais substituições de aminoácidos que modulam ADCC, por exemplo, substituições nas posições 298, 333 e/ou 334, de acordo com o esquema de numeração EU.
[00192] Em algumas modalidades, um ou ambos os polipeptídeos Fc podem compreender uma modificação que remove a lisina C-terminal do polipeptídeo Fc. Por exemplo, para um polipeptídeo que compreende um polipeptídeo Fc que é fundido no C-terminal a um scFv ou um Fv, em algumas modalidades o polipeptídeo Fc carece de uma lisina C- terminal. Em algumas modalidades, a remoção de uma lisina C-terminal do polipeptídeo Fc pode reduzir ou prevenir a clivagem proteolítica de um scFv ou Fv que está fundido ao polipeptídeo Fc. Polipeptídeos Fc Modificados Ilustrativos
[00193] A título de exemplo não limitativo, um ou ambos os polipeptídeos Fc presentes em uma proteína biespecífica, como descrito neste documento, podem compreender mutações adicionais, incluindo uma mutação de botão (por exemplo, T366W como numerado de acordo com o esquema de numeração EU), mutações de furo (por exemplo, T366S, L368A e Y407V como numerado de acordo com o esquema de numeração EU), mutações que modulam a função efetora (por exemplo, L234A, L235A e/ou P329G (por exemplo, L234A e L235A) como numerado de acordo com o esquema de numeração EU), e/ou mutações que aumentam a estabilidade do soro (por exemplo, (i) M252Y, S254T e T256E como numerado de acordo com o esquema de numeração EU, ou (ii) N434S com ou sem M428L como numerado com referência à numeração EU). Em algumas modalidades, uma proteína biespecífica compreende (i) um primeiro polipeptídeo Fc que compreende uma ou mais modificações que promovem a ligação de TfR e compreende ainda uma ou mais modificações adicionais (por exemplo, uma mutação de botão, mutações de furo, mutações que modulam a função efetora, e/ou mutações que aumentam a estabilidade do soro) e (ii) um segundo polipeptídeo Fc que compreende uma ou mais modificações (por exemplo, mutações que promovem a ligação de TfR, uma mutação de botão, mutações de furo,
mutações que modulam a função efetora e/ou mutações que aumentam a estabilidade do soro).
[00194] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado tem pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs: 1, 4-95 ou 101-388 e compreende uma mutação de botão (por exemplo, T366W como numerado com referência à numeração EU). Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs: 167, 179, 191, 203, 215, 227, 253, 265, 277, 289 ou 383.
[00195] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado tem pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs: 1, 4-95 ou 101-388 e compreende uma mutação de botão (por exemplo, T366W como numerada com referência à numeração EU) e mutações que modulam a função efetora (por exemplo, L234A, L235A e/ou P329G (por exemplo, L234A e L235A) como numerada com referência à numeração EU). Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs: 168, 169, 180, 181, 192, 193, 204, 205, 216, 217, 228, 229, 254, 255, 266, 267, 278, 279, 290, 291 ou 384.
[00196] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado tem pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs: 1, 4-95 ou 101-388 e compreende uma mutação de botão (por exemplo, T366W como numerado com referência à numeração EU) e mutações que aumentam a meia-vida sérica (por exemplo, M252Y, S254T e T256E, ou N434S com ou sem M428L, como numerado com referência à numeração EU). Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID
Nºs: 170, 182, 194, 206, 218, 230, 256, 268, 280, 292, 302, 309, 316, 323, 330, 337, 344, 351, 358, 365, 385 ou 387.
[00197] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado tem pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs: 1, 4-95 ou 101-388 e compreende uma mutação de botão (por exemplo, T366W como numerado com referência à numeração EU), mutações que modulam a função efetora (por exemplo, L234A, L235A e/ou P329G (por exemplo, L234A e L235A) como numerado com referência à numeração EU) e mutações que aumentam a meia-vida sérica (por exemplo, M252Y, S254T e T256E, ou N434S com ou sem M428L, como numerado com referência à numeração EU). Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs: 171, 172, 183, 184, 195, 196, 207, 208, 219, 220, 231, 232, 257, 258, 269, 270, 281, 282, 293, 294, 303, 304, 310, 311, 317, 318, 324, 325, 331, 332, 338, 339, 345, 346, 352, 353, 359, 360, 366, 367, 386, ou 388.
[00198] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado tem pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs: 1, 4-95 ou 101-388 e compreende mutações de furo (por exemplo, T366S, L368A e Y407V como numerado com referência à numeração EU). Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs: 173, 185, 197, 209, 221, 233, 259, 271, 283, 295 ou 377.
[00199] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado tem pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs: 1, 4-95 ou 101-388 e compreende mutações de furo (por exemplo, T366S, L368A e Y407V como numerado com referência à numeração EU) e mutações que modulam a função efetora (por exemplo, L234A, L235A e/ou P329G (por exemplo, L234A e L235A) como numerado com referência à numeração EU) Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs: 174, 175, 186, 187, 198, 199, 210, 211, 222, 223, 234, 235, 260, 261, 272, 273, 284, 285, 296, 297 ou 378.
[00200] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado tem pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs: 1, 4-95 ou 101-388 e compreende mutações de furo (por exemplo, T366S, L368A e Y407V como numerado com referência à numeração EU) e mutações que aumentam a meia-vida sérica (por exemplo, M252Y, S254T e T256E, ou N434S com ou sem M428L, como numerado com referência a numeração EU). Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs: 176, 188, 200, 212, 224, 236, 262, 274, 286, 298, 305, 312, 319, 326, 333, 340, 347, 354, 361, 368, 379 ou 381.
[00201] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado tem pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs: 1, 4-95 ou 101-388 e compreende mutações de furo (por exemplo, T366S, L368A e Y407V como numerado com referência à numeração EU), mutações que modulam a função efetora (por exemplo, L234A, L235A e/ou P329G (por exemplo, L234A e L235A) como numerado com referência à numeração EU), e mutações que aumentam a meia-vida sérica (por exemplo, M252Y, S254T e T256E, ou como numerado com referência à numeração EU). Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs: 177, 178, 189, 190, 201, 202, 213, 214, 225, 226, 237, 238, 263, 264, 275, 276, 287, 288, 299, 300, 306, 307, 313, 314, 320,
321, 327, 328, 334, 335, 341, 342, 348, 349, 355, 356, 362, 363, 369, 370, 380 ou 382.
[00202] Em algumas modalidades, uma proteína biespecífica como descrita neste documento (por exemplo, uma proteína biespecífica tendo uma arquitetura descrita na Seção III acima) compreende (i) um primeiro polipeptídeo Fc que compreende o sítio de ligação de TfR de um clone tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs: SEQ ID Nºs: 4-95, 101-164 e 239-252 e compreende ainda uma mutação de botão (por exemplo, T366W de acordo com a numeração EU), mutações L234A e L235A numeradas com referência à numeração EU e, opcionalmente, M428L e mutações N434S numeradas com referência à numeração EU; e (ii) um segundo polipeptídeo Fc que compreende mutações de furo (por exemplo, T366S, L368A e Y407V de acordo com a numeração EU) e mutações L234A e L235A numeradas com referência à numeração EU e, opcionalmente, mutações M428L e N434S numeradas com referência para a numeração EU. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc compreende o sítio de ligação TfR de um clone com a sequência de SEQ ID Nº: 105, SEQ ID Nº: 145 ou SEQ ID Nº: 146 e compreende ainda uma mutação de botão (por exemplo, T366W), L234A e L235A e, opcionalmente, mutações M428L e N434S. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID Nºs: 192, 204, 228, 316, 324 ou 337. Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo Fc compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 378 ou SEQ ID Nº: 382. V. PREPARAÇÃO DE PROTEÍNAS BIESPECÍFICAS
[00203] Para preparar uma proteína biespecífica como no presente documento descrito, podem ser utilizadas muitas técnicas conhecidas na técnica. Em algumas modalidades, os genes que codificam as cadeias pesadas e leves de um anticorpo de interesse (por exemplo, um anticorpo que se liga a um primeiro antígeno ou um anticorpo que se liga a um segundo antígeno) podem ser clonados a partir de uma célula, por exemplo, a partir de um hibridoma. Bibliotecas de genes que codificam cadeias pesadas e leves de anticorpos monoclonais também podem ser feitas a partir de hibridoma ou células plasmáticas. Alternativamente, a tecnologia de exibição de fago ou levedura pode ser usada para identificar anticorpos e fragmentos Fab que se ligam especificamente a antígenos selecionados.
[00204] Proteínas biespecíficas podem ser produzidas usando qualquer número de sistemas de expressão, incluindo sistemas de expressão procarióticos e eucarióticos. Em algumas modalidades, o sistema de expressão é um sistema de expressão de células de mamífero, como um hibridoma ou um sistema de expressão de células CHO. Muitos desses sistemas estão amplamente disponíveis em fornecedores comerciais. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos que compreendem a proteína biespecífica podem ser expressos usando um único vetor, por exemplo, em uma unidade de expressão discistrônica ou sob o controle de diferentes promotores. Em outras modalidades, os polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos que compreendem a proteína biespecífica podem ser expressos usando vetores separados.
[00205] Em alguns aspectos, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que compreendem uma sequência de ácido nucleico que codifica qualquer um dos polipeptídeos que compreendem proteínas biespecíficas como no presente documento descrito; vetores compreendendo tais ácidos nucleicos; e células hospedeiras nas quais os ácidos nucleicos são introduzidos que são usados para replicar os ácidos nucleicos e/ou para expressar as proteínas biespecíficas.
[00206] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo (por exemplo, um polinucleotídeo isolado) compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polinucleotídeo compreendendo um polipeptídeo que compreende a proteína biespecífica como descrito neste documento (por exemplo, como descrito na Seção III acima). Em algumas modalidades, um polinucleotídeo como no presente documento descrito está operacionalmente ligado a um ácido nucleico heterólogo, por exemplo, um promotor heterólogo.
[00207] Os vetores adequados contendo polinucleotídeos que codificam anticorpos da presente divulgação, ou fragmentos dos mesmos, incluem vetores de clonagem e vetores de expressão. Embora o vetor de clonagem selecionado possa variar de acordo com a célula hospedeira que se pretende usar, os vetores de clonagem úteis geralmente têm a capacidade de se autorreplicar, podem possuir um único alvo para uma endonuclease de restrição particular e/ou podem transportar genes para um marcador que pode ser usado na seleção de clones contendo o vetor. Os exemplos incluem plasmídeos e vírus bacterianos, por exemplo, pUC18, pUC19, Bluescript (por exemplo, pBS SK+) e seus derivados, mpl8, mpl9, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, DNAs de fago e vetores de transporte, como pSA3 e pAT28. Estes e muitos outros vetores de clonagem estão disponíveis em fornecedores comerciais, como BioRad, Strategene e Invitrogen.
[00208] Os vetores de expressão geralmente são construtos polinucleotídicos replicáveis que contêm um ácido nucleico da presente divulgação. O vetor de expressão pode se replicar nas células hospedeiras como epissomas ou como parte integrante do DNA cromossômico. Os vetores de expressão adequados incluem, mas não estão limitados a plasmídeos, vetores virais, incluindo adenovírus, vírus adeno-associados, retrovírus e qualquer outro vetor.
[00209] As células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão de um polinucleotídeo ou vetor, como descrito neste documento, incluem células procarióticas ou eucarióticas. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é procariótica. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é eucariótica, por exemplo, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células linfoides. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula humana, por exemplo, uma célula de rim embrionário humano (HEK).
[00210] Em outro aspecto, são fornecidos métodos de produção de uma proteína biespecífica, como descrito neste documento. Em algumas modalidades, o método inclui cultivar uma célula hospedeira como no presente documento descrito (por exemplo, uma célula hospedeira que expressa um polinucleotídeo ou vetor como no presente documento descrito) sob condições adequadas para a expressão da proteína biespecífica. Em algumas modalidades, a proteína biespecífica é subsequentemente recuperada da célula hospedeira (ou meio de cultura da célula hospedeira). Em algumas modalidades, a proteína biespecífica é purificada, por exemplo, por cromatografia. VI. MÉTODOS TERAPÊUTICOS
[00211] Em outro aspecto, métodos terapêuticos usando proteínas biespecíficas com a capacidade de se ligar especificamente a dois antígenos, como descrito neste documento, são fornecidos. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos de tratamento de uma doença. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos de modulação de uma ou mais atividades biológicas associadas a uma doença.
[00212] Em algumas modalidades, uma proteína biespecífica compreendendo um primeiro polipeptídeo Fc e/ou um segundo polipeptídeo Fc compreende um domínio CH3 modificado e se liga especificamente a um receptor de transferrina é usado para transferir a proteína biespecífica através de um endotélio, por exemplo, a barreira hematoencefálica, para ser assumido pelo cérebro.
[00213] Em algumas modalidades, uma proteína biespecífica, como descrita neste documento, pode ser usada para tratar um distúrbio neurológico, como uma doença do cérebro ou do sistema nervoso central (CNS). Doenças ilustrativas incluem doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, demência frontotemporal, demência vascular, demência de corpos de Lewy, doença de Pick, tauopatia primária relacionada à idade ou paralisia supranuclear progressiva. Em algumas modalidades, a doença pode ser uma tauopatia, uma doença priônica (tal como encefalopatia espongiforme bovina, scrapie, síndrome de Creutzfeldt-Jakob, kuru, doença de Gerstmann-Straussler-Scheinker, doença debilitante crônica e insônia familiar fatal), paralisia bulbar, doença do neurônio motor ou distúrbios heterodegenerativos do sistema nervoso (como doença de Canavan, doença de Huntington, ceroide-lipofuscinose neuronal, doença de Alexander, síndrome de Tourette, síndrome do cabelo crespo de Menkes, síndrome de Cockayne, síndrome de Halervorden-Spatz, doença de lafora, síndrome de Rett, hepatolenticular degeneração, síndrome de Lesch-Nyhan, ataxia de Friedreich, atrofia muscular espinhal e síndrome de Unverricht-Lundborg). Em algumas modalidades, a doença é acidente vascular cerebral ou esclerose múltipla. Em algumas modalidades, o paciente pode ser assintomático, mas tem um marcador que está associado à doença do cérebro ou do CNS. Em algumas modalidades, é fornecido o uso de uma proteína biespecífica como descrito neste documento na fabricação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio neurológico.
[00214] Em algumas modalidades, uma proteína biespecífica como descrita neste documento é usada para o tratamento de câncer. Em certas modalidades, o câncer é um câncer primário do CNS, tal como glioma, glioblastoma multiforme, meningioma, astrocitoma, neuroma acústico, condroma, oligodendroglioma, meduloblastomas, ganglioglioma, Schwannoma, neurofibroma, neuroblastoma ou tumores extradurais, intramedulares ou intradurais. Em algumas modalidades, o câncer é um tumor sólido ou, em outras modalidades, o câncer é um tumor não sólido. Os cânceres de tumor sólido incluem tumores do sistema nervoso central, câncer de mama, câncer de próstata, câncer de pele (incluindo o carcinoma das células basais, carcinoma de células, carcinoma de células escamosas e melanoma), câncer de colo do útero, câncer uterino, câncer de pulmão, câncer de ovário, câncer testicular, câncer de tireoide, astrocitoma, glioma, câncer de pâncreas, mesotelioma, câncer gástrico, câncer de fígado, câncer de cólon, câncer retal, câncer renal incluindo nefroblastoma, câncer de bexiga, câncer de esôfago, câncer de laringe, câncer de glândula parótida, câncer do trato biliar, câncer endometrial, adenocarcinomas, carcinomas de pequenas células, neuroblastomas, carcinomas adrenocorticais, carcinomas epiteliais, tumores desmóides, tumores de células pequenas e redondas desmoplásico, tumores endócrinos, os tumores da família do sarcoma de Ewing, tumores de células germinativas, hepatoblastomas, carcinomas hepatocelulares, sarcomas de tecidos moles não sendo rabdomiossarcoma, osteossarcoma, tumores neuroectodérmicos primitivos periféricos, retinoblastomas e rabdomiossarcomas. Em algumas modalidades, é fornecido o uso de uma proteína biespecífica como descrito neste documento na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer.
[00215] Em algumas modalidades, uma proteína biespecífica como descrita neste documento pode ser usada no tratamento de uma doença autoimune ou inflamatória. Exemplos de tais doenças incluem, mas não estão limitados a, espondilite anquilosante, artrite, osteoartrite, artrite reumatóide, artrite psoriática, asma, esclerodermia, acidente vascular cerebral, aterosclerose, doença de Crohn, colite, colite ulcerativa, dermatite, diverticulite, fibrose pulmonar idiopática, fibromialgia, hepatite, síndrome do intestino irritável (IBS), lúpus, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), nefrite, esclerose múltipla e colite ulcerosa. Em algumas modalidades, é fornecido o uso de uma proteína biespecífica como descrito neste documento na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença autoimune ou inflamatória.
[00216] Em algumas modalidades, uma proteína biespecífica como descrita neste documento pode ser usada no tratamento de uma doença cardiovascular, como doença arterial coronariana, ataque cardíaco, ritmos cardíacos anormais ou arritmias, insuficiência cardíaca, doença valvar cardíaca, doença cardíaca congênita, doença do músculo cardíaco, cardiomiopatia, doença pericárdica, doença da aorta, síndrome de Marfan, doença vascular e doença dos vasos sanguíneos. Em algumas modalidades, é fornecido o uso de uma proteína biespecífica como descrito neste documento na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença cardiovascular.
[00217] Em algumas modalidades, o método compreende ainda administrar ao sujeito um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Por exemplo, em algumas modalidades para o tratamento de uma doença do cérebro ou do sistema nervoso central, o método pode compreender administrar ao sujeito um agente neuroprotetor, por exemplo, um agente anticolinérgico, um agente dopaminérgico, um agente glutamatérgico, um inibidor de histona desacetilase (HDAC), um canabinoide, um inibidor de caspase, melatonina, um agente anti-inflamatório, um hormônio (por exemplo, estrogênio ou progesterona) ou uma vitamina. Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao sujeito um agente para uso no tratamento de um sintoma cognitivo ou comportamental de um distúrbio neurológico (por exemplo, um antidepressivo, um agonista da dopamina ou um antipsicótico).
[00218] Uma proteína biespecífica como descrita neste documento é administrada a um sujeito em uma quantidade ou dose terapeuticamente eficaz. As dosagens ilustrativas incluem uma faixa de dose diária de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 500 mg/kg, ou cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 200 mg/kg, ou cerca de 1 mg/kg a cerca de 100 mg/kg, ou cerca de 10 mg/kg a cerca de 50 mg/kg. As dosagens, no entanto, podem ser variadas de acordo com vários fatores, incluindo a via de administração escolhida, a formulação da composição, a resposta do paciente, a gravidade da condição, o peso do sujeito e o julgamento do médico prescritor. A dosagem pode ser aumentada ou diminuída ao longo do tempo, como necessário para cada paciente. Em algumas modalidades, um paciente recebe inicialmente uma dose baixa, que é então aumentada para uma dosagem eficaz tolerável para o paciente. A determinação de uma quantidade eficaz está bem dentro da capacidade dos versados na técnica.
[00219] Em várias modalidades, uma proteína biespecífica, como descrita neste documento, é administrada por via parenteral. Em algumas modalidades, a proteína biespecífica é administrada por via intravenosa. A administração intravenosa pode ser por infusão, por exemplo, durante um período de cerca de 10 a cerca de 30 minutos, ou durante um período de pelo menos 1 hora, 2 horas ou 3 horas. Em algumas modalidades, a proteína biespecífica é administrada como um bolo intravenoso. Também podem ser utilizadas combinações de infusão e administração em bolus.
[00220] Em algumas modalidades parenterais, uma proteína biespecífica é administrada intraperiotnealmente, subcutaneamente, intradermicamente ou intramuscularmente. Em algumas modalidades, a proteína biespecífica é administrada intradermicamente ou intramuscularmente. Em algumas modalidades, a proteína biespecífica é administrada por via intratecal, tal como por administração epidural ou intracerebroventricular.
[00221] Em outras modalidades, a proteína biespecífica pode ser administrada por via oral, por administração pulmonar, administração intranasal, administração intraocular ou por administração tópica. A administração pulmonar também pode ser empregada, por exemplo, pelo uso de um inalador ou nebulizador, e formulação com um agente de formação de aerossóis. VII. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E KITS
[00222] Em outro aspecto, composições farmacêuticas e kits compreendendo uma proteína biespecífica com a capacidade de se ligar especificamente a dois antígenos são fornecidos. Em algumas modalidades, a proteína biespecífica é uma proteína biespecífica, como descrito na Seção III acima. Composições Farmacêuticas
[00223] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica compreende uma proteína biespecífica como descrito neste documento (por exemplo, uma proteína biespecífica com a capacidade de se ligar especificamente a dois antígenos) e compreende ainda um ou mais transportadores e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. A orientação para a preparação de formulações pode ser encontrada em qualquer número de manuais de preparação e formulação farmacêutica que são conhecidos pelos versados na técnica.
[00224] Um transportador farmaceuticamente aceitável inclui quaisquer solventes, meios de dispersão ou revestimentos que sejam fisiologicamente compatíveis e que, de preferência, não interfiram ou inibam a atividade do agente ativo. Vários excipientes farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na técnica.
[00225] Em algumas modalidades, o transportador é adequado para administração intravenosa, intramuscular, oral, intraperitoneal, intratecal, transdérmica, tópica ou subcutânea. Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis podem conter um ou mais compostos fisiologicamente aceitáveis que atuam, por exemplo, para estabilizar a composição ou para aumentar ou diminuir a absorção do(s) agente(s)
ativo(s). Os compostos fisiologicamente aceitáveis podem incluir, por exemplo, carboidratos, como glicose, sacarose ou dextranos, antioxidantes, como ácido ascórbico ou glutationa, agentes quelantes, proteínas de baixo peso molecular, composições que reduzem a depuração ou hidrólise dos agentes ativos, ou excipientes ou outros estabilizadores e/ou tampões. Outros transportadores farmaceuticamente aceitáveis e suas formulações são bem conhecidos na técnica.
[00226] As composições farmacêuticas podem ser fabricadas de uma maneira que seja conhecida pelos versados na técnica, por exemplo, por meio de processos convencionais de mistura, dissolução, granulação, fabricação de drageias, emulsificação, encapsulação, aprisionamento ou liofilização. Os métodos e excipientes descritos neste documento são meramente exemplificativos e não são de forma alguma limitativos.
[00227] Para administração oral, uma proteína biespecífica como descrita neste documento pode ser formulada combinando-a com transportadores farmaceuticamente aceitáveis que são bem conhecidos na técnica. Esses transportadores permitem que os compostos sejam formulados como comprimidos, pílulas, drageias, cápsulas, emulsões, suspensões lipofílicas e hidrofílicas, líquidos, géis, xaropes, pastas, suspensões e semelhantes, para ingestão oral por um paciente a ser tratado. As preparações farmacêuticas para uso oral podem ser obtidas misturando os compostos com um excipiente sólido, opcionalmente triturando uma mistura resultante e processando a mistura de grânulos, após adição de auxiliares adequados, se desejado, para obter comprimidos ou núcleos de drageias. Os excipientes adequados incluem, por exemplo, enchimentos, tais como açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol ou sorbitol; preparações de celulose, tais como, por exemplo, amido de milho, amido de trigo, amido de arroz,
amido de batata, gelatina, goma tragacanto, metil celulose, hidroxipropilmetil-celulose, carboximetilcelulose de sódio e/ou polivinilpirrolidona (PVP). Se desejado, podem ser adicionados agentes desintegrantes, tais como uma polivinilpirrolidona reticulada, ágar ou ácido algínico ou um sal do mesmo, tal como alginato de sódio.
[00228] Uma proteína biespecífica como descrita neste documento pode ser formulada para administração parenteral por injeção, por exemplo, por injeção em bolus ou infusão contínua. Para injeção, a proteína biespecífica pode ser formulada em preparações por dissolução, suspensão ou emulsificação em um solvente aquoso ou não aquoso, tal como óleos vegetais ou outros semelhantes, glicerídeos de ácido alifático sintético, ésteres de ácidos alifáticos superiores ou propileno glicol; e se desejado, com aditivos convencionais, tais como solubilizantes, agentes isotônicos, agentes de suspensão, agentes emulsionantes, estabilizantes e conservantes. Em algumas modalidades, as proteínas biespecíficas podem ser formuladas em soluções aquosas, de preferência em tampões fisiologicamente compatíveis, como solução de Hanks, solução de Ringer ou tampão salino fisiológico. As formulações para injeção podem ser apresentadas na forma de dosagem unitária, por exemplo, em ampolas ou em recipientes multidose, com um conservante adicionado. As composições podem tomar formas, tais como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes formuladores, tais como agentes de suspensão, estabilizantes e/ou dispersantes.
[00229] Em algumas modalidades, uma proteína biespecífica como descrita neste documento é preparada para distribuição em uma formulação de liberação sustentada, liberação controlada, liberação prolongada, liberação cronometrada ou liberação retardada, por exemplo, em matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o agente ativo. Vários tipos de materiais de liberação sustentada foram estabelecidos e são bem conhecidos pelos versados na técnica. As formulações de liberação estendida atuais incluem comprimidos revestidos por filme, sistemas multiparticulados ou de peletes, tecnologias de matriz usando materiais hidrofílicos ou lipofílicos e comprimidos à base de cera com excipientes formadores de poros. Os sistemas de distribuição de liberação sustentada podem, dependendo de seu projeto, liberar os compostos ao longo de horas ou dias, por exemplo, ao longo de 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20 ou 24 horas ou mais. Normalmente, as formulações de liberação sustentada podem ser preparadas usando polímeros de ocorrência natural ou sintéticos, por exemplo, vinil pirrolidonas poliméricas, tais como polivinil pirrolidona (PVP); polímeros hidrofílicos de carboxivinil; hidrocoloides hidrofóbicos e/ou hidrofílicos, tais como metilcelulose, etilcelulose, hidroxipropilcelulose e hidroxipropilmetilcelulose; e carboxipolimetileno.
[00230] Normalmente, uma composição farmacêutica para uso na administração in vivo é estéril. A esterilização pode ser realizada de acordo com métodos conhecidos na técnica, por exemplo, esterilização por calor, esterilização por vapor, filtração estéril ou irradiação.
[00231] As dosagens e a concentração de droga desejada de composições farmacêuticas da divulgação podem variar dependendo do uso particular previsto. A determinação da dosagem ou via de administração apropriada está bem ao alcance de um versado na técnica. As dosagens adequadas também são descritas na Seção VI acima. Kits
[00232] Em algumas modalidades, é fornecido um kit que compreende uma proteína biespecífica como descrito neste documento (por exemplo, uma proteína biespecífica com a capacidade de se ligar especificamente a dois antígenos) para uso de acordo com um método descrito neste documento. Em algumas modalidades, o kit é para uso no tratamento de uma doença neurodegenerativa, por exemplo, doença de Alzheimer. prevenir ou tratar um distúrbio neurológico, como uma doença do cérebro ou do sistema nervoso central (CNS).
[00233] Em algumas modalidades, o kit compreende ainda um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Por exemplo, em algumas modalidades, o kit compreende uma proteína biespecífica como no presente documento descrito e compreende ainda um ou mais agentes terapêuticos adicionais para uso no tratamento de uma doença neurodegenerativa. Em algumas modalidades, o kit compreende ainda materiais de instrução contendo instruções (ou seja, protocolos) para a prática dos métodos descritos neste documento (por exemplo, instruções para usar o kit para o tratamento de uma doença neurodegenerativa). Embora os materiais de instrução normalmente compreendam materiais escritos ou impressos, eles não se limitam a isso. Qualquer meio capaz de armazenar tais instruções e comunicá-las a um usuário final é contemplado por esta invenção. Essas mídias incluem, mas não estão limitadas a, mídia de armazenamento eletrônico (por exemplo, discos magnéticos, fitas, cartuchos, chips), mídia ótica (por exemplo, CD-ROM) e semelhantes. Essa mídia pode incluir endereços para sites da Internet que fornecem esses materiais de instrução. VIII. ANIMAIS TRANSGÊNICOS
[00234] Além disso, a divulgação também fornece animais transgênicos não humanos (por exemplo, um roedor, como um camundongo ou um rato) que compreende (a) um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo TfR quimérico compreendendo: (i) um domínio apical tendo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID Nº: 392 e (ii) o sítio de ligação da transferrina do polipeptídeo TfR nativo do animal, e (b) um transgene de um gene da proteína Tau associada ao microtúbulo mutante (MAPT), por exemplo, em que o polipeptídeo TfR quimérico e/ou a proteína Tau é expressa no cérebro do animal. As formas quiméricas do receptor de transferrina incluem um sítio de ligação à transferrina de mamífero não humano (por exemplo, camundongo) e um domínio apical que é heterólogo ao domínio que contém o sítio de ligação à transferrina. Estes receptores quiméricos podem ser expressos em animais transgênicos, particularmente onde o sítio de ligação da transferrina é derivado da espécie animal transgênica e onde o domínio apical é derivado de um primata (por exemplo, humano ou macaco). O ácido nucleico que codifica o polipeptídeo TfR quimérico pode ser "knocked-in" para o genoma do aminal (por exemplo, no locus endógeno), resultando no animal expressando o polipeptídeo TfR quimérico no lugar do polipeptídeo TfR endógeno. O polipeptídeo TfR quimérico pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% (por exemplo, 97%, 98% ou 99%) de identidade com a SEQ ID Nº: 396. Também é descrito no presente documento um polinucleotídeo que codifica um receptor de transferrina quimérico que compreende um sítio de ligação de transferrina de mamífero não humano e um domínio apical com uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 90%, 95% ou 98% idêntica à SEQ ID Nº: 392. A sequência de ácido nucleico que codifica o domínio apical pode compreender uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 95% (por exemplo, 97%, 98% ou 99%) de identidade com a SEQ ID Nº: 397. O animal transgênico pode ser homozigoto ou heterozigoto para o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo TfR quimérico. Além disso, em algumas modalidades, o gene MAPT mutante codifica uma proteína Tau humana mutante. Por exemplo, a proteína Tau humana mutante compreende a substituição de aminoácido P272S em relação à sequência de SEQ ID Nº: 398.
[00235] A divulgação também fornece um não humano, por exemplo,
não primata, animal transgênico (por exemplo, um roedor, como um camundongo ou um rato) que expressa tais TfRs quiméricos e um transgene de um gene de proteína Tau associado a microtúbulos mutantes (MAPT) e o uso do animal transgênico não humano para rastrear polipeptídeos que podem cruzar a BBB por ligação ao receptor de transferrina humano (huTfR) in vivo. Em algumas modalidades, o animal transgênico não humano contém um receptor de transferrina nativo (como um receptor de transferrina de camundongo (mTfR)), em que o domínio apical é substituído por um domínio apical ortólogo tendo uma sequência de aminoácidos de pelo menos 80%, 90 %, 95% ou 98% idêntica à SEQ ID Nº: 392, deixando assim o sítio de ligação da transferrina nativa e a maioria, por exemplo, pelo menos 70%, ou pelo menos 75%, da sequência que codifica o receptor da transferrina intacta. Este animal transgênico não humano retém assim ao máximo a funcionalidade de ligação à transferrina do receptor de transferrina endógeno do animal não humano, incluindo a capacidade de manter a homeostase de ferro adequada, bem como ligar e transportar a transferrina. Como resultado, o animal transgênico é saudável e adequado para uso na descoberta e desenvolvimento de terapêuticas para o tratamento de doenças cerebrais. IX. EXEMPLOS
[00236] A presente invenção será descrita com mais detalhes a título de exemplos específicos. Os seguintes exemplos são oferecidos para propósitos de ilustração somente e não se destinam a limitar a invenção de maneira alguma. Os versados na técnica irão reconhecer prontamente uma variedade de parâmetros não críticos que podem ser mudados ou modificados para render essencialmente os mesmos resultados. Esforços foram feitos para garantir a precisão com relação aos números usados (por exemplo, quantidades, temperaturas, etc.), mas alguns erros experimentais e desvios podem estar presentes. A prática da presente invenção empregará, a menos que indicado de outra forma, métodos convencionais de química de proteínas, bioquímica, técnicas de DNA recombinante e farmacologia, dentro dos conhecimentos da técnica. Tais técnicas são explicadas por completo na literatura. Além disso, deve ser evidente para um versado na técnica que os métodos de engenharia aplicados a certas bibliotecas também podem ser aplicados a outras bibliotecas no presente documento descritas. Exemplo 1. Projeto e Caracterização de Polipeptídeos de Ligação ao Receptor de Transferrina Projetados
[00237] Este exemplo descreve o projeto, geração e caracterização de polipeptídeos da presente invenção. Para os fins deste exemplo e comparando os aminoácidos que são iguais nas sequências de clones, uma mutação "conservada" é considerada aquela que ocorreu em todos os clones identificados (não uma substituição de aminoácido conservadora), enquanto uma "semi-conservada" é aquela que ocorre em > 50% dos clones.
[00238] A menos que indicado de outra forma, as posições dos resíduos de aminoácidos nesta seção são numeradas com base na numeração do índice EU para uma região Fc de tipo selvagem de IgG1 humana. Projeto de bibliotecas de domínio da região Fc de polipeptídeo
[00239] Novo reconhecimento molecular foi projetado em regiões Fc de polipeptídeo selecionando certos patches de superfície expostos a solvente para modificação, construindo bibliotecas de exibição de superfície em que a composição de aminoácidos do patch selecionado foi alterada por randomização e, em seguida, rastreando as variantes de sequência exibidas na superfície para a funcionalidade desejada usando técnicas de exibição de expressão padrão. Como usado neste documento, o termo "randomização" inclui randomização parcial, bem como alterações de sequência com nucleotídeos predefinidos ou razões de mistura de aminoácidos. Os patches típicos expostos à superfície selecionados para randomização tinham áreas entre cerca de 600 a 1500 Å2 e compreendiam cerca de 7 a 15 aminoácidos. Registros de Clones
[00240] Os seguintes registros foram projetados e gerados de acordo com os métodos descritos neste documento. Como utilizado neste documento, o termo "registro" refere-se a uma série de resíduos de aminoácidos expostos à superfície que formam uma superfície contígua que pode ser alterada (por exemplo, pela introdução de mutações nas sequências de genes codificadores de peptídeos para produzir substituições de aminoácidos, inserções e/ou deleções nas posições listadas nos registros). Registro CH2 A2 - Conjunto (iii)
[00241] O registro CH2A2 (Tabela 1) incluiu as posições de aminoácidos 274, 276, 283, 285, 286, 287, 288, 289 e 290, de acordo com a numeração EU. O registro CH2A2 foi projetado para formar uma superfície ao longo de uma folha beta, uma curva adjacente e uma alça seguinte. É bem removido de ambos os sítios de ligação FcγR e FcRn. Registro C CH2 - Conjunto (iv)
[00242] O registro CH2C (Tabela 2) incluiu as posições de aminoácidos 266, 267, 268, 269, 270, 271, 295, 2972, 298 e 299, de acordo com a numeração EU. O registro CH2C utiliza resíduos expostos ao solvente ao longo de uma série de alças perto da dobradiça e muito perto do sítio de ligação FcγR da região CH2. Registro D de CH2 - Conjunto (v)
[00243] O registro CH2D (Tabela 3) incluiu as posições de aminoácidos 268, 269, 270, 271, 272, 292, 293, 294, 296 e 300, de acordo com a numeração EU. 41, 42, 43, 44, 45, 65, 66, 67, 69 e 73. O registro CH2D, semelhante ao CH2C, utiliza resíduos expostos ao solvente ao longo de uma série de alças no topo da região CH2, muito perto do sítio de ligação FcγR. Os registros CH2C e CH2D compartilham amplamente uma alça e diferem na segunda alça utilizada para ligação. Registro CH2 E - Conjunto (vi)
[00244] O registro CH2E3 (Tabela 4) inclui as posições de aminoácidos 272, 274, 276, 322, 324, 326, 329, 330 e 331, de acordo com a numeração EU. 45, 47, 49, 95, 97, 99, 102, 103 e 104. As posições do registro CH2E3 também estão perto do sítio de ligação FcγR, mas utilizam resíduos expostos a solvente em folhas beta que são adjacentes às alças perto do sítio de ligação FcγR, além de alguns dos resíduos de alça. Registro B de CH3 - Conjunto (ii)
[00245] O registro CH3B (Tabela 5) incluiu as posições de aminoácidos 345, 346, 347, 349, 437, 438, 439 e 440, de acordo com a numeração EU. 118, 119, 120, 122, 210, 211, 212 e 213. O registro CH3B é amplamente composto de resíduos expostos a solvente em duas folhas beta paralelas, juntamente com vários resíduos menos estruturados perto do C-terminal da região CH3. Está distante dos sítios de ligação de FcγR e FcRn. Registro CH3 C - Conjunto (i)
[00246] O registro CH3C (Tabela 6) incluiu as posições de aminoácidos 384, 386, 387, 388, 389, 390, 413, 416 e 421, de acordo com a numeração EU. As posições de registro de CH3C formam uma superfície contígua incluindo resíduos expostos à superfície de duas alças, ambos distantes dos sítios de ligação FcγR e FcRn.
Tabela 1. Posições e mutações do registro CH2A2 Nome Grupo SEQ ID Sequência Seq. 274 275 276 … 283 284 285 286 287 288 289 290 Nº:
Tipo selvagem n/a K F N … E V H N A K T K 403
CH2A2.1 1 E F I … D V R Y E W Q L 404
CH2A2.2 1 G F V … P V S W E W Y W 405
CH2A2.3 1 Q F D … M V R R E W H R 406
CH2A2.4 1 S F E … P V R W E W Q W 407
CH2A2.5 1 A F T … P V R W E W Q N 408
CH2A2.6 1 N F D … L V R R E W H R 409
CH2A2.7 1 Q F V … A V R W E W I R 410
CH2A2.8 1 E F I … E V A W E W F W 411
CH2A2.9 1 G F A … N V R V E W Q Y 412
CH2A2.10 1 G F V … E V R R E W V R 413
CH2A2.11 1 S F D … L V R R E W Q R 414
CH2A2.12 1 E F T … D V R Y E W Y Y 415
CH2A2.13 1 Q F T … D V R Y E W V R 416
CH2A2.14 1 Q F Y … N V R R E W H R 417
CH2A2.15 1 Y F D … M V R R E W H R 406
CH2A2.16 2 W F E … F V G V A Y D V 418
Tabela 2. Posições e mutações do registro CH2C
SEQ SEQ Nome Grupo ID ID Sequência Seq. 266 267 268 269 270 271 Nº: … 295 296 297 298 299 Nº: Tipo V S H E D P … Q Y N S T selvagem n/a 419 438 CH2C.1 1 P Q T P P W 420 … E Y Y T Y 439 CH2C.2 1 P P S P P W 421 … E Y Y S N 440 CH2C.3 1 P Q T P P W 420 … E Y Y S N 440 CH2C.4 1 F R G P P W 422 … E Y Y H D 441 CH2C.5 1 P Q T V P W 423 … E Y Y S N 440 CH2C.6 1 P K M P P W 424 … E Y Y T Y 439 CH2C.7 1 P P V P P W 425 … E Y Y S N 440 CH2C.8 1 P A F P P W 426 … E Y Y Q N 442 CH2C.9 1 A I W P P W 427 … E Y Y S N 440 CH2C.10 1 P P V A P W 428 … E Y Y S S 443 CH2C.11 1 P Q M P P Q 429 … E Y Y S N 440 CH2C.12 1 P Q T A P W 430 … E Y Y T Y 439 CH2C.13 1 P Q T P P Q 431 … E Y Y S N 440 CH2C.14 1 P Q T P P W 420 … E Y Y T Y 439 CH2C.15 1 P R V P P W 432 … E Y Y Q N 442 CH2C.16 1 P S V P P W 433 … E Y Y S N 440 CH2C.17 2 M L W P V P 434 … V Y H R P 444 CH2C.18 2 M L W P V P 434 … T Y H N P 445 CH2C.19 2 M E W P V T 435 … T Y H H P 446 CH2C.20 2 M L W P V P 434 … T Y H H P 446 CH2C.21 3 D D L T F Q 436 … V Y V T P 447 CH2C.22 3 D D L T F Q 436 … L Y V T P 448 CH2C.23 4 A Y G D P E 437 … W Y D V P 449
Tabela 3. Posições e mutações do registro CH2D Nome Grupo SEQ SEQ 268 269 270 271 272 ID Nº: … 292 293 294 295 296 297 298 299 300 ID Nº: Sequência Seq.
Tipo n/a H E D P E … R E E Q Y N S T Y selvagem 450 456 CH2D.1 1 V P P R M 451 … L T S Q H N S T V 457 CH2D.2 1 V P P W M 452 … L T S Q H N S T V 457 CH2D.3 2 D M W E Y 453 … W V K Q L N S T W 458 CH2D.4 2 D D W T W 454 … W I A Q P N S T W 459 CH2D.5 2 D D W E W 455 … W K L Q L N S T W 460 Tabela 4. Posições e mutações do registro CH2E3 Nome Grupo SEQ SEQ Sequência Seq. 272 273 274 275 276 ID Nº: … 322 323 324 325 326 327 328 329 330 331 ID Nº: Tipo E V K F N … K V S N K A L P A P selvagem n/a 461 466 CH2E3.1 1 W V W F Y 462 … S V V N I A L W W S 467 CH2E3.2 2 V V G F R 463 … R V S N S A L T W K 468 CH2E3.3 2 V V G F R 463 … R V S N S A L S W R 469 CH2E3.4 2 I V G F R 464 … R V S N S A L R W R 470 CH2E3.5 3 A V G F E 465 … Q V F N W A L D W V 471 Tabela 5. Posições e mutações do registro CH3B Grupo SEQ ID SEQ ID Nome Sequência Seq. 345 346 347 348 349 Nº: … 437 438 439 440 Nº: Tipo selvagem n/a E P Q V Y 472 … T Q K S 487 CH3B.1 1 F D Y V T 473 … G F H D 488 CH3B.2 1 F D M V T 474 … G F H D 488 CH3B.3 1 F E Y V T 475 … G F H D 488 CH3B.4 1 F E M V T 476 … G F H D 488 CH3B.5 1 F E L V T 477 … G F H D 488 CH3B.6 1 F E I V T 478 … G F H D 488 CH3B.7 1 F D I V T 479 … G F H D 488 CH3B.8 1 F D Y V T 473 … G F H D 488 CH3B.9 1 F G M V T 480 … G F H D 488 CH3B.10 1 F A D V T 481 … G F Y D 489 CH3B.11 1 F G L V T 482 … G F H D 488 CH3B.12 1 F D Y V T 473 … G F S D 490 CH3B.13 1 I D Y V T 483 … G F S D 490 CH3B.14 1 F K D V T 484 … G F F D 491 CH3B.15 1 F D L V T 485 … G F Y D 489 CH3B.16 1 I D Y V T 483 … G F S D 490 CH3B.17 1 F E L V A 486 … G F H D 488
Tabela 6. Posições e mutações do registro CH3C Nome Grupo SEQ SEQ Sequência Seq. 384 385 386 387 388 389 390 391 ID Nº: … 413 414 415 416 417 418 419 420 421 ID Nº: Tipo N G Q P E N N Y … D K S R W Q Q G N selvagem n/a 492 516 CH3C.1 L G L V W V G Y 493 … A K S T W Q Q G W 517 CH3C.2 Y G T V W S H Y 494 … S K S E W Q Q G Y 518 CH3C.3 Y G T E W S Q Y 495 … E K S D W Q Q G H 519 CH3C.4 V G T P W A L Y 496 … L K S E W Q Q G W 520 CH3C.17 2 Y G T V W S K Y 497 … S K S E W Q Q G F 521 CH3C.18 1 L G H V W A V Y 498 … P K S T W Q Q G W 522 CH3C.21 1 L G L V W V G Y 493 … P K S T W Q Q G W 522 CH3C.25 1 M G H V W V G Y 499 … D K S T W Q Q G W 523 CH3C.34 1 L G L V W V F S 500 … P K S T W Q Q G W 522 CH3C.35 2 Y G T E W S S Y 501 … T K S E W Q Q G F 524 CH3C.44 2 Y G T E W S N Y 502 … S K S E W Q Q G F 521 CH3C.51 1/2 L G H V W V G Y 503 … S K S E W Q Q G W 525 CH3C.3.1-3 1 L G H V W V A T 504 … P K S T W Q Q G W 522 CH3C.3.1-9 1 L G P V W V H T 505 … P K S T W Q Q G W 522 CH3C.3.2-5 1 L G H V W V D Q 506 … P K S T W Q Q G W 522 CH3C.3.2-19 1 L G H V W V N Q 507 … P K S T W Q Q G W 522 CH3C.3.2-1 1 L G H V W V N F 508 … P K S T W Q Q G W 522 CH3C.3.4-1 W G F V W S T Y 509 P K S N W Q Q G F 526 CH3C.3.4-19 W G H V W S T Y 510 P K S N W Q Q G Y 527 CH3C.3.2-3 L G H V W V E Q 511 P K S T W Q Q G W 522 CH3C.3.2-14 L G H V W V G V 512 P K S T W Q Q G W 522 CH3C.3.2-24 L G H V W V H T 513 P K S T W Q Q G W 522 CH3C.3.4-26 W G T V W G T Y 514 P K S N W Q Q G Y 527 CH3C.3.2-17 L G H V W V G T 515 P K S T W Q Q G W 522 Geração de bibliotecas de exibição de fago
[00247] Um molde de DNA que codifica para a sequência Fc humana de tipo selvagem foi sintetizado e incorporado em um vetor fagemídeo. O vetor fagemídeo continha uma sequência líder ompA ou pelB, o inserto Fc fundido a marcadores de epítopo c-Myc e 6xHis (SEQ ID Nº: 575) e um códon de parada âmbar seguido pela proteína de revestimento de M13 pIII.
[00248] Iniciadores contendo tricódons "NNK" nas posições correspondentes para randomização foram gerados, onde N é qualquer base de DNA (isto é, A, C, G ou T) e K é G ou T. Alternativamente, os iniciadores para randomização "suave" foram usados, onde uma mistura de bases correspondendo a 70% da base do tipo selvagem e 10% de cada uma das outras três bases foi usada para cada posição de randomização. As bibliotecas foram geradas realizando a amplificação por PCR de fragmentos da região Fc correspondentes às regiões de randomização e, em seguida, montadas usando iniciadores finais contendo sítios de restrição de SfiI, depois digeridos com SfiI e ligados nos vetores fagemídeos. Alternativamente, os iniciadores foram usados para conduzir a mutagênese de Kunkel. Os métodos de realização da mutagênese de Kunkel serão conhecidos por aqueles versados na técnica. Os produtos ligados ou produtos Kunkel foram transformados em células eletrocompetentes de E. coli da cepa TG1 (obtidas de Lucigen®). As células de E. coli foram infectadas com fago auxiliar M13K07 após a recuperação e cultivadas durante a noite, após o que os fagos da biblioteca foram precipitados com 5% de PEG/NaCl, ressuspensos em 15% de glicerol em PBS e congelados até o uso. Os tamanhos de biblioteca típicos variaram de cerca de 109 a cerca de 1011 transformantes. Dímeros Fc foram exibidos no fago via emparelhamento entre Fc fundido com pIII e Fc solúvel não ligado a pIII (o último sendo gerado devido ao códon de parada âmbar antes de pIII). Geração de bibliotecas de exibição de levedura
[00249] Um molde de DNA que codifica para a sequência Fc humana de tipo selvagem foi sintetizado e incorporado em um vetor de exibição de levedura. Para as bibliotecas CH2 e CH3, os polipeptídeos Fc foram exibidos na proteína da parede celular Aga2p. Ambos os vetores continham peptídeos líderes prepro com uma sequência de clivagem Kex2 e um epítopo marcador c-Myc fundido ao terminal do Fc.
[00250] Bibliotecas de exibição de levedura foram montadas usando métodos semelhantes aos descritos para as bibliotecas de fagos, exceto que a amplificação de fragmentos foi realizada com iniciadores contendo extremidades homólogas para o vetor. Levedura eletrocompetente preparada de fresco (isto é, cepa EBY100) foi eletroporada com vetor linearizado e insertos de biblioteca montadas. Os métodos de eletroporação serão conhecidos por aqueles versados na técnica. Após a recuperação em meio SD-CAA seletivo, a levedura foi cultivada até confluência e dividida duas vezes, depois induzida para a expressão da proteína por transferência para meio SG-CAA. Os tamanhos de biblioteca típicos variaram de cerca de 107 a cerca de 109 transformantes. Dímeros Fc foram formados por emparelhamento de monômeros Fc exibidos de forma adjacente. Métodos Gerais para Seleção de Fago
[00251] Os métodos de fago foram adaptados de Phage Display: A Laboratory Manual (Barbas, 2001). Detalhes adicionais do protocolo podem ser obtidos nesta referência. Métodos de Classificação de Placas
[00252] O alvo de TfR humano foi revestido em placas de microtitulação MaxiSorp® (tipicamente 200 µL a 1-10 µg/mL em PBS) durante a noite a 4°C. Toda a ligação foi feita à temperatura ambiente a menos que especificado de outra forma. As bibliotecas de fago foram adicionadas a cada poço e incubadas durante a noite para ligação. Os poços de microtitulação foram lavados extensivamente com PBS contendo 0,05% de Tween® 20 (PBST) e os fagos ligados foram eluídos por incubação dos poços com ácido (tipicamente HCl 50 mM com KCl 500 mM, ou glicina 100 mM, pH 2,7) por 30 minutos. Os fagos eluídos foram neutralizados com 1 M Tris (pH 8) e amplificados usando células TG1 e fago auxiliar M13/KO7 e cultivados durante a noite a 37°C em meio 2YT contendo 50 µg/mL de carbenacilina e 50 ug/mL de Kanamicina. Os títulos do fago eluído de um poço contendo o alvo foram comparados aos títulos do fago recuperado de um poço sem alvo para avaliar o enriquecimento. O rigor da seleção foi aumentado diminuindo subsequentemente o tempo de incubação durante a ligação e aumentando o tempo de lavagem e o número de lavagens. Métodos de classificação de grânulos
[00253] O alvo de TfR humano foi biotinilado através de aminas livres usando NHS-PEG4-Biotina (obtido de Pierce™). Para reações de biotinilação, um excesso molar de 3 a 5 vezes de reagente de biotina foi usado em PBS. As reações foram extintas com Tris seguido por extensa diálise em PBS. O alvo biotinilado foi imobilizado em grânulos magnéticos revestidos com estreptavidina, (isto é, grânulos de M280- estreptavidina obtidas com Thermo Fisher). As bibliotecas de exibição de fago foram incubadas com os grânulos revestidos com o alvo à temperatura ambiente durante uma hora. Os fagos não ligados foram então removidos e os grânulos foram lavados com PBST. Os fagos ligados foram eluídos por incubação com HCl 50 mM contendo KCl 500 mM (ou glicina 0,1 M, pH 2,7) durante 30 minutos, e então neutralizados e propagados como descrito acima para separação de placas.
[00254] Após três a cinco rodadas de seleção, os clones únicos foram rastreados expressando Fc no fago ou solubamente no periplasma de E. coli. Tais métodos de expressão serão conhecidos por aqueles versados na técnica. Sobrenadantes de fago individuais ou extratos periplasmáticos foram expostos a placas de ELISA bloqueadas revestidas com alvo ou um controle negativo e foram posteriormente detectados usando anti-Fc de cabra conjugado com HRP (obtido de Jackson Immunoresearch) para extratos periplasmáticos ou anti-M13 (GE Healthcare) para fago, e então desenvolvido com o reagente TMB (obtido da Thermo Fisher). Os poços com os valores de OD450 maiores que cerca de 5 vezes sobre o fundo foram considerados clones positivos e sequenciados, após o que alguns clones foram expressos como um fragmento Fc solúvel ou fundidos com fragmentos Fab.
Métodos Gerais para Seleção de Levedura Métodos de classificação de grânulos (classificação magnética de células (MACS))
[00255] As seleções MACS e FACS foram realizadas de forma semelhante à descrita em Ackerman, et al. 2009 Biotechnol. Prog. 25(3),
774. Os grânulos magnéticos de estreptavidina (por exemplo, grânulos de estreptavidina M-280 de ThermoFisher) foram marcados com alvo biotinilado e incubadas com levedura (tipicamente 5-10x diversidade da biblioteca). A levedura não ligada foi removida, os grânulos foram lavados e a levedura ligada foi cultivada em meio seletivo e induzida para rodadas subsequentes de seleção. Métodos de classificação de grânulos (classificação magnética de células (MACS))
[00256] A levedura foi marcada com anticorpo anti-c-Myc para monitorar a expressão e o alvo biotinilado (a concentração variou dependendo da rodada de classificação). Em alguns experimentos, o alvo foi pré-misturado com estreptavidina-Alexa Fluor® 647 para intensificar a avidez da interação. Em outras experiências, o alvo biotinilado foi detectado após ligação e lavagem com estreptavidina- Alexa Fluor® 647. A levedura singuleto com ligação foi classificada usando um classificador de células FACS Aria III. As leveduras selecionadas foram cultivadas em meio seletivo e então induzidas para rodadas de seleção subsequentes.
[00257] Depois que uma população de levedura enriquecida foi alcançada, a levedura foi semeada em placas de ágar SD-CAA e colônias únicas foram cultivadas e induzidas para expressão, então marcadas como descrito acima para determinar sua propensão para se ligar ao alvo. Os clones únicos positivos foram subsequentemente sequenciados para o alvo de ligação, após o que alguns clones foram expressos como um fragmento Fc solúvel ou como fundidos com fragmentos Fab.
Métodos Gerais de Triagem Triagem por ELISA
[00258] Os clones foram selecionados de saídas de seleção e cultivados em poços individuais de placas de poços profundos de 96 poços. Os clones foram induzidos para expressão periplasmática usando meio de autoindução (obtido de EMD Millipore) ou infectados com fago auxiliar para exibição em fago das variantes Fc individuais no fago. As culturas foram cultivadas durante a noite e centrifugadas para peletizar E. coli. Para ELISA de fago, o sobrenadante contendo fago foi usado diretamente. Para a expressão periplasmática, os peletes foram ressuspensos em sacarose a 20%, seguido por diluição a 4:1 com água e agitados a 4C durante uma hora. As placas foram giradas para peletizar os sólidos e o sobrenadante foi usado no ELISA.
[00259] As placas de ELISA foram revestidas com o alvo, tipicamente a 0,5 mg/mL durante a noite, depois bloqueadas com BSA a 1% antes da adição de fago ou extratos periplasmáticos. Após uma incubação de uma hora e lavagem da proteína não ligada, o anticorpo secundário conjugado com HRP foi adicionado (isto é, anti-Fc ou anti-M13 para Fc solúvel ou Fc exibido no fago, respectivamente) e incubado por 30 minutos. As placas foram lavadas novamente e então desenvolvidas com reagente TMB e extintas com ácido sulfúrico 2N. A absorbância a 450 nm foi quantificada usando um leitor de placas (BioTek®) e as curvas de ligação foram traçadas usando o software Prism quando aplicável. O sinal de absorção para os clones testados foi comparado ao controle negativo (fago ou extrato paraplásmico sem Fc). Em alguns ensaios, a holo-transferrina solúvel foi adicionada durante a etapa de ligação, normalmente em excesso molar significativo (excesso de mais de 10 vezes). Triagem por Citometria de Fluxo
[00260] Polipeptídeos variantes Fc (expressos em fago, em extratos periplasmáticos ou solubamente como fusões a fragmentos Fab) foram adicionados às células em placas de fundo V de 96 poços (cerca de
100.000 células por poço em PBS + 1% BSA (PBSA)), e incubado a 4C por uma hora. As placas foram subsequentemente centrifugadas e o meio foi removido e, em seguida, as células foram lavadas uma vez com PBSA. As células foram ressuspensas em PBSA contendo anticorpo secundário (cabra anti-IgG humana-Alexa Fluor® 647 (obtido de Thermo Fisher)). Após 30 minutos, as placas foram giradas e o meio foi removido, as células foram lavadas 1-2 vezes com PBSA e, em seguida, as placas foram lidas em um citômetro de fluxo (isto é, um citômetro de fluxo FACSCanto™II). Os valores médios de fluorescência foram calculados para cada condição usando o software FlowJo e as curvas de ligação foram traçadas com o software Prism. Geração e caracterização de clones CH2A2 Seleções com biblioteca CH2A2 contra receptor de transferrina (TfR)
[00261] Bibliotecas de fagos e leveduras contra CH2A2 foram selecionadas e classificadas contra TfR como descrito acima. Os clones que se ligam a TfR humano e/ou cynomolgous (cyno) foram identificados em ensaios ELISA, como descrito na seção intitulada "Rastreio por ELISA" acima, após quatro rodadas de seleção de fago. As sequências de clones representativos caíram em dois grupos: grupo 1 contendo 15 sequências únicas (isto é, SEQ ID Nºs: 47-61) e grupo 2 contendo uma única sequência única (isto é, SEQ ID Nº: 62). As sequências do grupo 1 tinham um motivo Glu-Trp conservado nas posições 287-288. Nenhum consenso apareceu em quaisquer outras posições, embora a posição 285 favorecesse Arg e a posição 286 favorecesse Trp ou Tyr. Caracterização de clones CH2A2
[00262] Variantes individuais de CH2A2 foram expressas na superfície do fago e testadas quanto à ligação a TfR humano, TfR cyno ou um controle irrelevante por ELISA. A expressão de Fc foi confirmada por ELISA contra o anticorpo anti-Myc 9E10, que se ligou ao marcador de epítopo c-Myc C-terminal. Os dados para quatro clones representativos, CH2A2.5, CH2A2.1, CH2A2.4 e CH2A2.16, demonstraram que todos foram bem expressos e ligados ao TfR humano, enquanto nenhum se ligou ao controle irrelevante. Os três clones do grupo 1 também se ligaram a TfR cyno, enquanto o clone do grupo 2 (isto é, clone 2A2.16) foi específico para TfR humano.
[00263] Em um segundo ensaio, a concentração de fago foi mantida constante (isto é, na EC50aproximada) e uma concentração variável de um competidor solúvel, ou holo-transferrina ou TfR humano, foi adicionada. Verificou-se que a ligação não sofreu impacto apreciável pela adição de holo-transferrina em concentrações de até 5 µM. Por outro lado, o TfR humano solúvel pode competir pela ligação ao TfR humano adsorvido na superfície, indicando uma interação específica.
[00264] As variantes de CH2A2 são expressas como fusões Fc a fragmentos Fab anti-BACE1 por clonagem em um vetor de expressão contendo uma sequência de região variável anti-BACE1. Após a expressão em células 293 ou CHO, as fusões CH2A2-Fab resultantes foram purificadas por proteína A e cromatografia de exclusão de tamanho e, em seguida, testadas para ligação usando ELISAs, ressonância plasmônica de superfície (SPR; ou seja, usando um instrumento Biacore™), inferometria de biocamada (ou seja, usando um sistema Octet® RED), ligação celular (por exemplo, citometria de fluxo) e outros métodos no presente documento descritos. Além disso, as fusões polipeptídeo-Fab resultantes são caracterizadas quanto à estabilidade por fusão térmica, congelamento-descongelamento e desnaturação acelerada por calor. Engenharia adicional de clones CH2A2
[00265] Duas bibliotecas secundárias foram construídas para aumentar a afinidade de ligação dos resultados iniciais contra TfR humano e cyno. A primeira biblioteca foi gerada com base nos clones do grupo 1. O motivo EW conservado nas posições 287-288 foi mantido invariante, e o R semi-conservado na posição 285 foi mutado usando randomização suave. As outras posições da biblioteca (isto é, as posições 274, 276, 283, 286, 289 e 290) foram mutadas por mutagênese de saturação. A segunda biblioteca foi construída com base no clone do grupo 2. Esta biblioteca foi gerada por randomização suave das posições originais da biblioteca CH2A2, mas usou o clone 2A2.16 (SEQ ID Nº: 62) como o modelo (em vez de Fc de tipo selvagem). Ambas as bibliotecas foram construídas para exibição em fagos e leveduras usando métodos descritos acima.
[00266] As bibliotecas foram rastreadas usando métodos descritos acima e vários clones que se ligam a TfR humano por ELISA foram identificados (Tabela 1). Geração e caracterização de clones CH2C Seleções com biblioteca CH2C contra receptor de transferrina (TfR)
[00267] Bibliotecas de fagos e leveduras contra CH2C foram selecionadas e classificadas contra TfR como descrito acima. Os clones que se ligam a TfR humano e/ou cynomolgous (cyno) foram identificados em ensaios de ELISA, como descrito na seção intitulada "Triagem por ELISA" acima, após quatro rodadas de seleção de fago (isto é, clones do grupo 1 e 4), e clones adicionais foram identificados após quatro ou cinco rodadas de classificação de levedura (isto é, clones do grupo 2 e 3), por ensaios de ligação de levedura como descrito na seção intitulada "General Methods for Yeast Selection" acima. As sequências de clones representativos caíram em quatro grupos: grupo 1 contendo 16 sequências únicas (isto é, SEQ ID Nºs: 63- 78), grupo 2 contendo 4 sequências únicas (isto é, SEQ ID Nºs: 79-82), grupo 3 contendo duas únicas sequências (isto é, SEQ ID Nº: 83-84) e grupo 4 contendo uma única sequência (isto é, SEQ ID Nº: 85) (Tabela 2). As sequências do grupo 1 tinham um Pro semi-conservado na posição 266, um Pro semi-conservado na posição 269, um Pro conservado na posição 270, um Trp semi-conservado na posição 271, um Glu semi-conservado na posição 295, um Tyr conservado na posição 297, e pouca preferência específica em outras posições da biblioteca. As sequências do grupo 2 tinham um Met conservado na posição 266, um L semi-conservado na posição 267, um Pro conservado na posição 269, um Val conservado na posição 270, um Pro semi-conservado na posição 271, um Thr semiconservado na posição 295, um His conservado na posição 297 e um Pro conservado na posição 299. As duas sequências do grupo 3 diferiram apenas na posição 295, onde um Val ou Leu estava presente. O Grupo 4 consistia em um único clone (isto é, CH2C.23) com uma sequência como indicada na SEQ ID Nº: 85. Caracterização de clones CH2C
[00268] As variantes de CH2C foram expressas como fusões Fc a fragmentos Fab por clonagem em um vetor de expressão contendo uma sequência de região variável de referência anti-BACE1. Após a expressão em células 293 ou CHO, as fusões polipeptídeo-Fab resultantes foram purificadas por proteína A e cromatografia de exclusão de tamanho e, em seguida, testadas quanto à ligação a TfR humano ou cyno. O grupo 4 clone CH2C.23 competiu com a holo- transferrina. Os clones pertencentes ao grupo de sequência 1 foram testados em titulações de ligação contra TfR humano e cyno. Os clones representativos de outros grupos de sequência foram testados no fago quanto à ligação na presença ou ausência de holo-Tf e clone CH2C.7 foi testado quanto à ligação a TfR humano na presença de holo- transferrina por interferometria de biocamada (isto é, usando um sistema Octet® RED). A maioria dos clones mostrou alguma reatividade cruzada com TfR cyno, exceto para o clone CH2C.23, os clones que foram testados não competiram com holo-Tf. Geração e caracterização de clones CH2D Seleções com biblioteca CH2D contra receptor de transferrina (TfR)
[00269] Bibliotecas de fago contra CH2D foram selecionadas contra TfR como descrito acima. Os clones que se ligam a TfR humano e/ou cyno foram identificados em ensaios ELISA, como descrito na seção intitulada "Rastreio por ELISA" acima. Cinco clones únicos foram identificados, os quais foram agrupados em duas famílias de sequências de 2 e 3 sequências, respectivamente (Tabela 3). Grupo de sequência 1 (isto é, clones CH2D.1 (SEQ ID Nº: 86) e CH2D.2 (SEQ ID Nº: 87)) tinha um motivo VPPXM (SEQ ID Nº: 399) conservado nas posições 268-272, um motivo SLTS (SEQ ID Nº: 400) nas posições 291- 295 e V na posição 300. As mutações na posição 267 não foram incluídas no projeto e foram provavelmente devido a erro de PCR ou recombinação. Grupo de sequência 2 (isto é, clones CH2D.3 (SEQ ID Nº: 88), CH2D.4 (SEQ ID Nº: 89) e CH2D.5 (SEQ ID Nº: 90)) tinha um D conservado na posição 268, um D semi-conservado na posição 269, um W conservado na posição 270, um E semi-conservado na posição 271, um aromático conservado (W ou Y) na posição 272, um motivo PW conservado nas posições 291-292 e um W conservado na posição 300. Caracterização e engenharia adicional de clones CH2D
[00270] As variantes de CH2D foram expressas como fusões a fragmentos Fab por clonagem em um vetor de expressão contendo uma sequência de região variável anti-BACE1. Após a expressão em células 293 ou CHO, as fusões polipeptídeo-Fab resultantes foram purificadas por proteína A e cromatografia de exclusão de tamanho e, em seguida, testadas quanto à ligação a TfR cyno e humano na presença ou ausência de holo-Tf usando métodos previamente descritos neste documento.
Geração e Caracterização de Clones CH2E Seleções com biblioteca CH2E3 contra receptor de transferrina (TfR)
[00271] Bibliotecas de fago contra CH2E3 foram selecionadas contra TfR como descrito acima. Os clones que se ligam a TfR humano e/ou cyno foram identificados em ensaios ELISA, como descrito na seção intitulada "Rastreio por ELISA" acima. Três grupos de sequências foram identificados a partir de 5 sequências, embora dois dos grupos consistissem em apenas uma sequência única cada (Tabela 4). O grupo de sequência 2, que tinha 3 sequências únicas (isto é, clones CH2E3.2 (SEQ ID Nº: 92), CH2E3.3 (SEQ ID Nº: 93) e CH2E3.4 (SEQ ID Nº: 94)), teve um Val semi-conservado na posição 272, um Gly conservado na posição 274, um Arg conservado na posição 276, um Arg conservado na posição 322, um Ser conservado nas posições 324 e 326, um Trp conservado na posição 330 e um Arg ou Lys na posição 331. Caracterização e engenharia adicional de clones CH2E3
[00272] As variantes de CH2E3 foram expressas como fusões a fragmentos Fab por clonagem em um vetor de expressão contendo uma sequência de região variável de referência anti-BACE1. Após a expressão em células 293 ou CHO, as fusões polipeptídeo-Fab resultantes foram purificadas por proteína A e cromatografia de exclusão de tamanho e, em seguida, testadas quanto à ligação a TfR cyno e humano na presença ou ausência de holo-Tf usando métodos para ligação previamente descritos neste documento. Geração e Caracterização de Clones CH3B Seleções com biblioteca CH3B contra receptor de transferrina (TfR)
[00273] Bibliotecas de fagos e leveduras contra CH3B foram selecionadas e classificadas contra TfR como descrito acima. Os clones que se ligam a TfR humano e/ou cyno foram identificados em ensaios de ELISA, como descrito na seção intitulada "Rastreio por ELISA" acima, após quatro rodadas de seleção de fago, e clones adicionais foram identificados após quatro ou cinco rodadas de classificação de levedura, por ensaios de ligação de levedura como descrito na seção intitulada "General Methods for Yeast Selection" acima. Todos os 17 clones (isto é, SEQ ID Nºs: 30-46) identificados tanto do fago como da levedura tinham sequências relacionadas; as sequências tinham um Phe semi-conservado na posição 345, um Asp ou Glu carregado negativamente semi-conservado na posição 346, um Thr semi- conservado na posição 349, um G conservado na posição 437, um Phe conservado na posição 438, um His semi -conservado na posição 439 e um Asp conservado na posição 440. Vários clones tinham uma mutação T350I, que não era uma posição intencionalmente mutada no projeto da biblioteca, mas presumivelmente foi introduzida por recombinação ou erro de PCR. Caracterização de clones CH3B
[00274] Dois clones representativos, CH3B.11 (SEQ ID Nº: 40) e CH3B.12 (SEQ ID Nº: 41), foram expressos na superfície do fago e testados quanto à ligação a TfR humano e cyno na presença ou ausência de holo-Tf. Nenhum dos clones foi afetado pela adição de holo-Tf. Adicionalmente, as variantes de CH3B foram expressas como fusões a fragmentos Fab por clonagem em um vetor de expressão contendo uma sequência de região variável anti-BACE1. Após a expressão em células 293 ou CHO, as fusões polipeptídeo-Fab resultantes foram purificadas por proteína A e cromatografia de exclusão de tamanho e, em seguida, testadas quanto à ligação a TfR humano ou cyno. Todos mostraram ligação específica a ambos os ortólogos. Engenharia Adicional de Clones CH3B
[00275] Métodos de engenharia adicionais, semelhantes aos descritos acima para CH2A2 para o projeto e triagem de bibliotecas adicionais, foram usados para melhorar a afinidade de clones de CH3B.
Em particular, várias séries de quatro a sete manchas de resíduos perto do parátopo foram selecionadas para diversificação adicional. Clone CH3B.12 (SEQ ID Nº: 41) foi usado como ponto de partida; os resíduos selecionados para mutagênese de saturação (isto é, NNK) foram os seguintes:
[00276] CH3B-mancha1: posições de aminoácidos 354, 355, 356, 358, 359, 360 e 361;
[00277] CH3B-mancha2: posições de aminoácidos 348, 433, 434 e 436;
[00278] CH3B-mancha3: posições de aminoácidos 352, 441, 444, 445, 446 e 447;
[00279] CH3B-mancha4: posições de aminoácidos 342, 344, 370, 401 e 403; e
[00280] CH3B-mancha5: posições de aminoácidos 382, 384, 385, 420, 421 e 422.
[00281] As bibliotecas foram geradas usando mutagênese de PCR e colocadas em levedura e fago como descrito nas seções intituladas "Generation of Phage-Display Libraries" e "Generation of Yeast-Display Libraries" acima. As bibliotecas foram rastreadas usando métodos descritos acima e vários clones que se ligam a TfR humano por ELISA foram identificados (Tabela 5). Geração e caracterização de clones CH3C Seleções com biblioteca CH3C contra receptor de transferrina (TfR)
[00282] Bibliotecas de leveduras contra CH3C foram selecionadas e classificadas contra TfR como descrito acima. O FACS de enriquecimento da população foi realizado nas três primeiras rodadas de classificação. Após duas rodadas adicionais de classificação, clones únicos foram sequenciados e quatro sequências únicas (isto é, clones CH3C.1 (SEQ ID Nº: 4), CH3C.2 (SEQ ID Nº: 5), CH3C.3 (SEQ ID Nº: 6) e CH3C.4 (SEQ ID Nº: 7)) foram identificados (Tabela 6). Essas sequências tinham um Trp conservado na posição 388 e todas tinham um resíduo aromático (isto é, Trp, Tyr ou His) na posição 421. Havia muita diversidade em outras posições. Caracterização de Clones CH3C de Primeira Geração
[00283] Os quatro clones selecionados da biblioteca CH3C foram expressos como fusões Fc a fragmentos Fab em células CHO ou 293, e purificados por proteína A e cromatografia de exclusão de tamanho e, em seguida, rastreados para ligação a TfR cyno e humano na presença ou ausência de holo-Tf por ELISA. Todos os clones se ligaram a TfR humano e a ligação não foi afetada pela adição de excesso (5 µM) de holo-Tf. No entanto, os clones não se ligaram de forma apreciável a TfR cyno. Os clones também foram testados quanto à ligação a células 293F, que expressam endogenamente TfR humano. Enquanto os clones se ligaram a células 293F, a ligação geral foi substancialmente mais fraca do que o controle positivo de alta afinidade.
[00284] Em seguida, foi testado se o clone CH3C.3 pode internalizar em células que expressam TfR. Células HEK293 aderentes foram cultivadas em placas de 96 poços até cerca de 80% de confluência, o meio foi removido e as amostras foram adicionadas em concentrações de 1 µM: CH3C.3 anticorpo de controle positivo de referência anti-TfR (Ab204), anticorpo de controle negativo de referência anti-BACE1 (Ab107) e controle de isótipo IgG humana (obtido de Jackson Immunoresearch). As células foram incubadas a 37°C e concentração de 8% de CO2 por 30 minutos, depois lavadas, permeabilizadas com Triton™ X-100 0,1% e coradas com anticorpo secundário anti-IgG-Alexa Fluor® 488 humano. Após lavagem adicional, as células foram fotografadas em um microscópio de fluorescência de alto teor (isto é, um sistema Opera Phenix™), e o número de pontos por célula foi quantificado. A 1 µM, clone CH3C.3 mostraram uma propensão semelhante para internalização ao controle anti-TfR positivo, enquanto os controles negativos não apresentaram internalização.
Engenharia Secundária de Clones CH3C
[00285] Bibliotecas adicionais foram geradas para melhorar a afinidade dos resultados iniciais de CH3C contra TfR humano e para tentar introduzir ligação a TfR cyno. Uma abordagem de randomização suave foi usada, em que oligos de DNA foram gerados para introduzir mutagênese suave com base em cada um dos quatro resultados originais. A primeira porção do registro (WESXGXXXXXYK (SEQ ID Nº: 528)) e a segunda porção do registro (TVXKSXWQQGXV (SEQ ID Nº: 529)) foram construídas por meio de fragmentos separados, de modo que os registros aleatórios suaves foram embaralhados durante a amplificação de PCR (por exemplo, a primeira porção do registro do clone CH3C.1 foi misturado com a segunda porção do registro dos clones CH3C.1, CH3C.2, CH3C.3 e CH3C.4 e assim por diante). Os fragmentos foram todos misturados e então introduzidos na levedura para expressão de superfície e seleção.
[00286] Após uma rodada de MACS e três rodadas de FACS, os clones individuais foram sequenciados (clones CH3C.17 (SEQ ID Nº: 8), CH3C.18 (SEQ ID Nº: 9), CH3C.21 (SEQ ID Nº: 10), CH3C.25 (SEQ ID Nº: 11), CH3C.34 (SEQ ID Nº: 12), CH3C.35 (SEQ ID Nº: 13), CH3C.44 (SEQ ID Nº: 14), e CH3C.51 (SEQ ID Nº: 15)). Os clones selecionados caíram em dois grupos de sequência geral (Tabela 6). Clones do Grupo 1 (isto é, clones CH3C.18, CH3C.21, CH3C.25 e CH3C.34) tinha um Leu semi-conservado na posição 384, um Leu ou His na posição 386, um Val conservado e um Val semiconservado nas posições 387 e 389, respectivamente, e um motivo P-T-W semiconservado nas posições 413, 416, e 421, respectivamente. Os clones do grupo 2 tinham um Tyr conservado na posição 384, o motivo TXWSX (SEQ ID Nº: 530) nas posições 386-390 e o motivo conservado S/T-E-F nas posições 413, 416 e 421, respectivamente. Clones CH3C.18 e CH3.35 foram usados em estudos adicionais como membros representativos de cada grupo de sequência. Notou-se que o clone CH3C.51 tinha a primeira porção de seu registro do grupo 1 e a segunda porção de seu registro do grupo 2. Caracterização de ligação de clones CH3C da biblioteca de mutagênese suave
[00287] Os clones da biblioteca de mutagênese suave foram reformatados como polipeptídeos de fusão Fc-Fab e expressos e purificados como descrito acima. Estas variantes melhoraram a ligação ELISA a TfR humano em comparação com o clone superior das seleções iniciais da biblioteca (CH3C.3), e também não competiu com o holo-Tf. Os valores de EC50 não foram afetados de forma apreciável além da margem de erro do experimento pela presença ou ausência de holo-Tf.
[00288] Notavelmente, clone CH3C.35 ligou-se a TfR humano quase tão bem quanto ao anticorpo de controle anti-TfR de alta afinidade Ab204. Os clones selecionados da biblioteca de randomização suave também melhoraram a ligação celular a células 293F. Em um ensaio de ligação celular semelhante, esses clones foram testados quanto à ligação a células CHO-K1 que expressam de forma estável níveis elevados de TfR humano ou cyno em sua superfície. Os clones selecionados da biblioteca de randomização suave ligaram-se a células que expressam TfR humano, bem como TfR cyno, e não se ligaram às células parentais CHO-K1. A magnitude e os valores de EC50 de ligação foram substancialmente mais baixos para o TfR cyno em comparação com o TfR humano. Mapeamento de Epítopo
[00289] Para determinar se as regiões CH3C Fc engenheiradas ligadas ao domínio apical de TfR, o domínio apical de TfR (SEQ ID Nºs: 96 e 97 para humano e cyno, respectivamente) foi expresso na superfície do fago. Para dobrar e exibir adequadamente o domínio apical, uma das alças teve que ser truncada e a sequência permutada circularmente; as sequências expressas no fago são identificadas como SEQ ID Nºs: 98 e 99 para humano e cyno, respectivamente. Clones CH3C.18 e CH3C.35 foram revestidos em placas de ELISA e o protocolo de fago ELISA previamente descrito foi seguido. Resumidamente, após lavagem e bloqueio com PBSA a 1%, diluições de exibição de fago foram adicionadas e incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora. As placas foram subsequentemente lavadas e anti-M13-HRP foi adicionado, e após lavagem adicional as placas foram desenvolvidas com substrato TMB e extintas com 2N H2SO4. Ambos CH3C.18 e CH3C.35 ligado ao domínio apical neste ensaio.
[00290] Uma vez que a ligação ao TfR cyno era conhecida por ser muito mais fraca do que a ligação ao TfR humano, foi hipotetizado que uma ou mais das diferenças de aminoácidos entre os domínios cyno e apicais humanos eram provavelmente responsáveis pela diferença de ligação. Portanto, uma série de seis mutações pontuais foi feita no domínio apical de TfR humano, onde o resíduo humano foi substituído pelo resíduo cyno correspondente. Estes mutantes foram exibidos no fago e as concentrações do fago foram normalizadas por OD268 e ligação a CH3C.18 e CH3C.35 foi testado por titulação de ELISA de fago. A captura no anticorpo anti-Myc 9E10 mostrou que os níveis de exibição para todos os mutantes eram semelhantes. A ligação às mutações TfR humanas mostrou claramente um forte efeito da mutação R435G, o que sugeriu que este resíduo é uma parte chave do epítopo e é impactado negativamente pelo resíduo cyno nesta posição. A mutação G435R foi feita no domínio cyno apical exibido por fago e foi mostrado que esta mutação melhorou dramaticamente a ligação ao domínio cyno apical. Estes resultados mostram que os clones CH3C se ligaram ao domínio apical de TfR e que a posição 435 era importante para a ligação, enquanto as posições 474, 519, 591, 597 e 599 eram significativamente menos importantes.
Mapeamento de Parátopo
[00291] Para entender quais resíduos no domínio Fc eram mais críticos para a ligação de TfR, uma série de clones de CH3C.18 e CH3C.35 foi criada nos quais cada mutante tinha uma única posição no registro de ligação de TfR com mutação de volta para o tipo selvagem. As variantes resultantes foram expressas de forma recombinante como fusões CH3C Fc-Fab e testadas quanto à ligação a TfR humano ou cyno. Para CH3C.35, as posições 388 e 421 eram absolutamente críticas para a ligação; reversão de qualquer um destes para ligação completamente ablacionada de tipo selvagem a TfR humano. Surpreendentemente, a reversão da posição 390 para o tipo selvagem proporcionou um aumento dramático na ligação de TfR cyno, embora tenha pouco efeito na ligação humana. Por outro lado, a reversão do resíduo 390 para o tipo selvagem teve pouco efeito no CH3C.18, mas nesta variante a reversão das posições 416 e 421 aboliu completamente a ligação ao TfR humano. Em ambas as variantes, outras reversões simples tiveram impacto modesto (prejudicial) na ligação de TfR humano, enquanto em muitos casos a ligação a TfR cyno foi abolida. Engenharia adicional para melhorar a ligação ao TfR cyno
[00292] Bibliotecas adicionais foram preparadas para aumentar ainda mais a afinidade das variantes CH3C para TfR cyno. Essas bibliotecas foram projetadas para ter menos de cerca de 107 clones em termos de diversidade teórica, de modo que todo o espaço de diversidade pudesse ser explorado usando a exibição de superfície de levedura. Quatro projetos de biblioteca foram usados; todas as bibliotecas foram geradas usando oligos degenerados com NNK ou outras posições de códon degenerado, e amplificadas por PCR de sobreposição, como descrito acima.
[00293] A primeira biblioteca foi baseada no consenso de CH3C.Sequências semelhantes a 35. No presente documento, as posições 384-388 foram mantidas constantes como YGTEW (SEQ ID Nº: 531), enquanto as posições 389, 390, 413, 416 e 421 foram mutadas usando mutagênese de saturação.
[00294] A segunda biblioteca foi baseada no consenso de CH3C.Sequências semelhantes a 18. No presente documento, a posição 384 foi restrita a Leu e Met, a posição 386 foi restrita a Leu e His, a posição 387 foi mantida constante como Val, a posição 388 foi restrita a Trp e Gly, a posição 389 foi restrita a Val e Ala, a posição 390 foi totalmente randomizada, a posição 391 foi adicionada ao registro e totalmente randomizada, a posição 413 foi randomizada suave, a posição 416 foi totalmente randomizada e a posição 421 foi restrita a aminoácidos aromáticos e Leu.
[00295] A terceira biblioteca adicionou novas posições aleatórias à biblioteca. Duas versões foram geradas, cada uma com CH3C.18 e CH3C.35 como o registro inicial e, em seguida, as posições adicionais foram randomizadas por mutagênese de saturação: E153, E155, Y164, S188 e Q192.
[00296] A quarta biblioteca manteve certas posições constantes para CH3C.18, mas permitiu variação em outras posições, com menos viés do que a biblioteca de consenso. As posições 387, 388 e 413 foram fixadas e as posições 384, 386, 389, 390 e 416 foram randomizadas por mutagênese de saturação; a posição 421 foi mutada, mas restrita a resíduos aromáticos e Leu.
[00297] As bibliotecas foram selecionadas em levedura por quatro a cinco rodadas contra cynoTfR e clones únicos foram sequenciados e convertidos em fusões polipeptídeo-Fab, como descrito acima. O maior enriquecimento na ligação cynoTfR foi observado a partir da segunda biblioteca (isto é, derivados do CH3C.18 parental), embora também tenha havido alguma perda na ligação de huTfR.
Características de Ligação de Clones de Maturação CH3C
[00298] ELISAs de ligação foram conduzidos com variantes de fusão CH3C Fc-Fab purificadas com TfR humano ou cyno revestido na placa, como descrito acima. As variantes da biblioteca de maturação de CH3C.18, CH3C3.2-1, CH3C.3.2-5 e CH3C.3.2-19, ligaram-se a TfR humano e cyno com valores de EC50 equivalentes, enquanto o clone parental CH3C.18 e CH3C.35, teve uma ligação mais de 10 vezes melhor ao TfR humano versus cyno.
[00299] Em seguida, foi testado se os novos polipeptídeos internalizaram em células humanas e de macaco. Usando o protocolo descrito anteriormente na seção intitulada "Caracterização de clones CH3C de primeira geração", a internalização em células HEK293 humanas e células rhesus LLC-MK2 foi testada. As variantes que se ligam de forma semelhante a TfR humano e cyno, CH3C.3.2-5 e CH3C.3,2-19, melhoraram significativamente a internalização em células LLC-MK2 em comparação com CH3C.35. Engenharia adicional de clones CH3C
[00300] A engenharia adicional para afinidade adicional de clones CH3C maduros.18 e CH3C.35 envolveu a adição de mutações adicionais às posições de espinha dorsal (isto é, não registro) que intensificaram a ligação por meio de interações diretas, interações de segunda camada ou estabilização de estrutura. Isso foi obtido por meio da geração e seleção de uma biblioteca "caminhada NNK" ou "mancha NNK". A biblioteca de caminhada NNK envolveu fazer mutações NNK um a um de resíduos que estão próximos ao parátopo. Observando a estrutura de Fc ligado a FcgRI (PDB ID: 4W4O), 44 resíduos próximos ao registro da biblioteca original foram identificados como candidatos para interrogatório. Especificamente, os seguintes resíduos foram direcionados para mutagênese NNK: K248, R255, Q342, R344, E345, Q347, T359, K360, N361, Q362, S364, K370, E380, E382, S383, G385,
Y391, K392, T393, D399, S400, D401, S403, K409, L410, T411, V412, K414, S415, Q418, Q419, G420, V422, F423, S424, S426, Q438, S440, S442, L443, S444, P4458, G446 e K447. As 44 bibliotecas NNK de ponto único foram geradas usando mutagênese Kunkel e os produtos foram agrupados e introduzidos na levedura por meio de eletroporação, como descrito acima para outras bibliotecas de levedura.
[00301] A combinação dessas minibibliotecas (cada uma com uma posição mutada, resultando em 20 variantes) gerou uma pequena biblioteca que foi selecionada usando a exibição da superfície de levedura para quaisquer posições que levassem a uma ligação de maior afinidade. As seleções foram realizadas como descrito acima, usando proteínas de domínio apical TfR. Após três rodadas de classificação, os clones da biblioteca de levedura enriquecida foram sequenciados e várias posições de "pontos quentes" foram identificadas onde certas mutações pontuais melhoraram significativamente a ligação às proteínas do domínio apical. Para CH3C.35, essas mutações incluíram E380 (mutado para Trp, Tyr, Leu ou Gln) e S415 (mutado para Glu). As sequências dos CH3C.35 mutantes simples e de combinação são estabelecidos em SEQ ID Nºs: 21-23, 101-106 e 162-164. Para CH3C.18, essas mutações incluíram E380 (mutado para Trp, Tyr ou Leu) e K392 (mutado para Gln, Phe ou His). As sequências dos CH3C.18 mutantes simples são estabelecidos em SEQ ID Nºs: 107-112. Bibliotecas de maturação adicionais para melhorar a afinidade de CH3C.35
[00302] Uma biblioteca adicional para identificar combinações de mutações da biblioteca de caminhada NNK, enquanto adicionando várias posições adicionais na periferia destas, foi gerada como descrito para bibliotecas de levedura anteriores. Nesta biblioteca, os motivos YxTEWSS (SEQ ID Nº: 532) e TxxExxxxF foram mantidos constantes, e seis posições foram completamente randomizadas: E380, K392,
K414, S415, S424 e S426. As posições E380 e S415 foram incluídas porque eram "pontos quentes" na biblioteca de caminhada NNK. As posições K392, S424 e S426 foram incluídas porque fazem parte do núcleo que pode posicionar a região de ligação, enquanto K414 foi selecionada devido à sua adjacência à posição 415.
[00303] Esta biblioteca foi classificada, como descrito anteriormente, apenas com o domínio apical TfR cyno. O conjunto enriquecido foi sequenciado após cinco rodadas, e as sequências das regiões CH3 dos clones únicos identificados são apresentadas em SEQ ID Nºs: 113-130. Exploração de diversidade aceitável dentro do registro original e pontos críticos para CH3C.35.21
[00304] As próximas bibliotecas foram projetadas para explorar a totalidade da diversidade aceitável no principal parátopo de ligação. A abordagem adotada foi semelhante às bibliotecas de caminhada NNK. Cada uma das posições de registro originais (384, 386, 387, 388, 389, 390, 413, 416 e 421) mais os dois pontos quentes (380 e 415) foram randomizados individualmente com códons NNK para gerar uma série de bibliotecas de mutagênese de saturação em leveduras. Além disso, cada posição foi revertida individualmente para o resíduo de tipo selvagem e esses clones individuais foram exibidos na levedura. Notou- se que as posições 380, 389, 390 e 415 eram as únicas posições que retinham a ligação substancial ao TfR após a reversão para o resíduo de tipo selvagem (alguma ligação residual, mas muito diminuída foi observada para a reversão de 413 para o tipo selvagem).
[00305] As bibliotecas NNK de posição única foram classificadas por três rodadas contra o domínio apical de TfR humano para coletar os principais ~ 5% dos ligantes e, em seguida, pelo menos 16 clones foram sequenciados de cada biblioteca. Os resultados indicam quais aminoácidos em cada posição podem ser tolerados sem reduzir significativamente a ligação ao TfR humano, no contexto do clone
CH3C.35. Um sumário está abaixo:
[00306] Posição 380: Trp, Leu ou Glu;
[00307] Posição 384: Tyr ou Phe;
[00308] Posição 386: Thr apenas;
[00309] Posição 387: Glu apenas;
[00310] Posição 388: Trp apenas;
[00311] Posição 389: Ser, Ala ou Val (embora o resíduo Asn de tipo selvagem pareça reter alguma ligação, não apareceu após a classificação da biblioteca);
[00312] Posição 390: Ser ou Asn;
[00313] Posição 413: Thr ou Ser;
[00314] Posição 415: Glu ou Ser;
[00315] Posição 416: Glu apenas; e
[00316] Posição 421: Phe apenas.
[00317] Os resíduos acima, quando substituídos no clone CH3C.35 como mudanças únicas ou em combinações, representam a diversidade de parátopos que retém a ligação ao domínio apical de TfR. Os clones com mutações nestas posições são apresentados na Tabela 7 e as sequências dos domínios CH3 destes clones são apresentadas em SEQ ID Nºs: 102-106, 129 e 131-161.
Tabela 7. Exploração da diversidade aceitável dentro das posições de registro e ponto quente para CH3C.35.21
SEQ ID SEQ ID 378 379 380 381 382 383 384 385 386 387 388 389 390 391 392 411 412 413 414 415 416 417 418 419 420 421 422 423 Nº: Nº: Tipo selvagem A V E W E S N G Q P E N N Y K 533 T V D K S R W Q Q G N V F 564 CH3C.35.20.1 . . . . . . F . T E W S S . . 534 . . T . E E . . . . F . . 565 CH3C.35.20.2 . . . . . . Y . T E W A S . . 535 . . T . E E . . . . F . . 565 CH3C.35.20.3 . . . . . . Y . T E W V S . . 536 . . T . E E . . . . F . . 565 CH3C.35.20.4 . . . . . . Y . T E W S S . . 537 . . S . E E . . . . F . . 566 CH3C.35.20.5 . . . . . . F . T E W A S . . 538 . . T . E E . . . . F . . 565 CH3C.35.20.6 . . . . . . F . T E W V S . . 539 . . T . E E . . . . F . . 565 CH3C.35.21.a.1 . . W . . . F . T E W S S . . 540 . . T . E E . . . . F . . 565 120/234 CH3C.35.21.a.2 . . W . . . Y . T E W A S . . 541 . . T . E E . . . . F . . 565 CH3C.35.21.a.3 . . W . . . Y . T E W V S . . 542 . . T . E E . . . . F . . 565 CH3C.35.21.a.4 . . W . . . Y . T E W S S . . 543 . . S . E E . . . . F . . 566 CH3C.35.21.a.5 . . W . . . F . T E W A S . . 544 . . T . E E . . . . F . . 565 CH3C.35.21.a.6 . . W . . . F . T E W V S . . 545 . . T . E E . . . . F . . 565 CH3C.35.23.1 . . . . . . F . T E W S . . . 546 . . T . E E . . . . F . . 565 CH3C.35.23.2 . . . . . . Y . T E W A . . . 547 . . T . E E . . . . F . . 565 CH3C.35.23.3 . . . . . . Y . T E W V . . . 548 . . T . E E . . . . F . . 565 CH3C.35.23.4 . . . . . . Y . T E W S . . . 549 . . S . E E . . . . F . . 566 CH3C.35.23.5 . . . . . . F . T E W A . . . 550 . . T . E E . . . . F . . 565 CH3C.35.23.6 . . . . . . F . T E W V . . . 551 . . T . E E . . . . F . . 565 CH3C.35.24.1 . . W . . . F . T E W S . . . 552 . . T . E E . . . . F . . 565 CH3C.35.24.2 . . W . . . Y . T E W A . . . 553 . . T . E E . . . . F . . 565 CH3C.35.24.3 . . W . . . Y . T E W V . . . 554 . . T . E E . . . . F . . 565 CH3C.35.24.4 . . W . . . Y . T E W S . . . 555 . . S . E E . . . . F . . 566 CH3C.35.24.5 . . W . . . F . T E W A . . . 556 . . T . E E . . . . F . . 565
SEQ ID SEQ ID
378
379
380
381
382
383
384
385
386
387
388
389
390
391
392
411
412
413
414
415
416
417
418
419
420
421
422
423 Nº: Nº: Tipo selvagem A V E W E S N G Q P E N N Y K 533 T V D K S R W Q Q G N V F 564 CH3C.35.24.6 . . W . . . F . T E W V . . . 557 . . T . E E . . . . F . . 565
CH3C.35.21.17.1 . . L . . . F . T E W S S . . 558 . . T . E E . . . . F . . 565 CH3C.35.21.17.2 . . L . . . Y . T E W A S . . 559 . . T . E E . . . . F . . 565 CH3C.35.21.17.3 . . L . . . Y . T E W V S . . 560 . . T . E E . . . . F . . 565 CH3C.35.21.17.4 . . L . . . Y . T E W S S . . 561 . . S . E E . . . . F . . 566
CH3C.35.21.17.5 . . L . . . F . T E W A S . . 562 . . T . E E . . . . F . . 565
CH3C.35.21.17.6 . . L . . . F . T E W V S . . 563 . . T . E E . . . . F . . 565 CH3C.35.20 . . . . . . Y . T E W S S . . 537 . . T . E E . . . . F . . 565
121/234 CH3C.35.21 . . W . . . Y . T E W S S . . 543 . . T . E E . . . . F . . 565 CH3C.35.22 . . W . . . Y . T E W S . . . 555 . . T . . E . . . . F . . 567 CH3C.35.23 . . . . . . Y . T E W S . . . 549 . . T . E E . . . . F . . 565 CH3C.35.24 . . W . . . Y . T E W S . . . 555 . . T . E E . . . . F . . 565 CH3C.35.21.17 . . L . . . Y . T E W S S . . 561 . . T . E E . . . . F . . 565 CH3C.35.N390 . . . . . . Y . T E W S . . . 549 . . T . . E . . . . F . . 567
CH3C.35.20.1.1 . . . . . . F . T E W S S . . 534 . . S . E E . . . . F . . 566
CH3C.35.23.2.1 . . . . . . Y . T E W A . . . 547 . . S . . E . . . . F . . 568
CH3C.35.23.1.1 . . . . . . F . T E W S . . . 546 . . S . E E . . . . F . . 566
CH3C.35.S413 . . . . . . Y . T E W S S . . 537 . . S . . E . . . . F . . 568
CH3C.35.23.3.1 . . . . . . Y . T E W V . . . 548 . . S . E E . . . . F . . 566
CH3C.35.N390.1 . . . . . . Y . T E W S . . . 549 . . S . . E . . . . F . . 568
CH3C.35.23.6.1 . . . . . . F . T E W V . . . 551 . . S . E E . . . . F . . 566
Fusões Polipeptídeo Monovalente-Fab Geração de fusões monovalentes de polipeptídeo de ligação a TfR-Fab
[00318] Embora os domínios Fc formem naturalmente homodímeros, uma série de mutações assimétricas conhecidas como "botões nos furos" pode levar à heterodimerização preferencial de dois fragmentos Fc, onde uma unidade Fc tem a mutação do botão T366W e a outra unidade Fc tem o T366S, L368A e mutações de furo Y407V. Em algumas modalidades, um domínio CH3 modificado da invenção compreende um Trp na posição 366. Em algumas modalidades, um domínio CH3 modificado da invenção compreende um Ser na posição 366, um Ala na posição 368 e um Val na posição 407. Polipeptídeos heterodiméricos de ligação a TfR foram expressos em células 293 ou CHO por cotransfecção transitória de dois plasmídeos (isto é, um botão- Fc e um furo-Fc), enquanto as fusões polipeptídeo-Fab foram expressas por cotransfecção transitória de três plasmídeos (isto é, uma cadeia pesada de botão-Fc-Fab, uma cadeia pesada de buaco-Fc-Fab e uma cadeia leve comum). A purificação de polipeptídeos heterodiméricos secretados ou fusões polipeptídeo-Fab foi realizada de forma idêntica à dos homodímeros (isto é, uma purificação de duas colunas usando Proteína A seguida por exclusão por tamanho, e então concentração e troca de tampão se necessário). Espectrometria de massa ou cromatografia de interação hidrofóbica foi usada para determinar a quantidade de heterodímero versus homodímero (por exemplo, Fc's emparelhado botão-botão ou furo-furo) formado. De preparações típicas, mais de 95% dos polipeptídeos, e muitas vezes mais de 98%, eram heterodímeros. Para polipeptídeos heterodiméricos e fusões polipeptídeo-Fab, as mutações que conferiram ligação de TfR incluíram a mutação de "botão", enquanto uma região Fc de não ligação a TfR foi usada com a região de "furo", a menos que indicado de outra forma. Em alguns casos, mutações adicionais que alteram as propriedades de Fc também foram incluídas nestes construtos, como L234A/L235A, M252Y/S254T/T256E, N434S ou N434S/M428L para FcγR modificado ou ligação de FcRn, respectivamente. Caracterização de ligação de polipeptídeos CH3C.mono Fc
[00319] A ligação de polipeptídeos CH3C monovalentes foi medida em um ELISA usando uma modificação do procedimento descrito acima. A estreptavidina foi revestida em placas de ELISA de 96 poços durante a noite a 1 µg/mL em PBS. Após a lavagem, as placas foram bloqueadas com BSA a 1% em PBS e, em seguida, TfR humano ou cyno biotinilado foi adicionado a 1 µg/mL e incubado durante 30 minutos. Após lavagem adicional, os polipeptídeos foram adicionados às placas em diluições em série e incubados por uma hora. As placas foram lavadas e o anticorpo secundário (isto é, anti-kappa-HRP, 1: 5.000) foi adicionado por 30 minutos e as placas foram lavadas novamente. As placas foram desenvolvidas com substrato TMB e temperadas com 2N H2SO4 e, em seguida, a absorbância a 450 nm foi lida em um leitor de placas BioTek®. Os polipeptídeos de ligação a TfR bivalente e os polipeptídeos de ligação a TfR monovalente foram comparados. Ab204 foi usado como um anticorpo de controle anti-TfR de alta afinidade.
[00320] Testes adicionais foram realizados para ligação a células 293F, que expressam endogenamente TfR humano, bem como células CHO-K1 que foram transfectadas de forma estável com TfR humano ou TfR cyno.
[00321] Em geral, a ligação substancialmente reduzida a TfR humano para polipeptídeos monovalentes foi observada em comparação com polipeptídeos bivalentes e a ligação cyno foi muito fraca para ser detectada nestes ensaios para os polipeptídeos monovalentes.
[00322] Em seguida, foi testado se versões monovalentes de polipeptídeos CH3C poderiam ser internalizadas em células HEK293 que expressam TfR humano. Métodos descritos acima para ensaios de internalização foram usados. Os peptídeos monovalentes também podem internalizar, mas o sinal geral foi mais fraco do que para as respectivas versões bivalentes, presumivelmente devido à perda de afinidade/avidez de ligação. Cinética de ligação para polipeptídeos CH3C medida por inferometria de biocamada
[00323] A cinética de ligação foi determinada para várias variantes monovalentes e bivalentes do polipeptídeo CH3C, fundidos com Fabs anti-BACE1 e comparados com seus equivalentes bivalentes usando inferometria de biocamada (isto é, usando um sistema Octet® RED). TfR foi capturado em um sensor de estreptavidina, então os polipeptídeos CH3C foram ligados e lavados. Sensogramas foram ajustados a um modelo de ligação 1:1; o KD (app) para polipeptídeos bivalentes representou a ligação ávida ao dímero TfR.
[00324] Os polipeptídeos que foram convertidos para o formato monovalente tinham valores KD (app) significativamente mais fracos, devido à perda de avidez. Clones CH3C.3.2-1, CH3C.3.2-5 e CH3C.3.2- 19, que anteriormente mostraram ter ligação de TfR humano e cyno semelhante por ELISA, também tinham valores KD (app) muito semelhantes entre TfR humano e cyno. Foi feita uma tentativa de testar as formas monovalentes desses polipeptídeos, mas a ligação neste ensaio era muito fraca para calcular os parâmetros cinéticos. Exemplo 2. Substituição de um único aminoácido de CH3C.35.21
[00325] Este exemplo descreve a construção de uma biblioteca de mutantes de um único aminoácido de CH3C.35.21. Métodos
[00326] Uma biblioteca de mutantes de CH3C.35.21, cada uma contendo uma única substituição de aminoácido de CH3C.35.21 foi construída usando mutagênese Kunkel (Kunkel, Proc Natl Acad Sci U S
A. 82(2):488-92, 1985). Para CH3C.35.21, cada uma das posições W380, Y384, T386, E387, W388, S389, S390, K392, T413, K414, E415, E416, F421, S424 e S426, como numerado de acordo com o esquema de numeração EU, foram mutadas individualmente para o códon NNK usando oligos mutagênicos degenerados. Para evitar a obtenção do clone de CH3C.35.21 originalna biblioteca, o modelo de Kunkel de DNA de fita simples (ssDNA) que codifica um Fc de IgG1 de tipo selvagem foi usado. Dois oligos mutagênicos (um com um NNK e outro codificando a outra região CH3C.35.21) foram usados em combinação de modo que quando ambos os oligos foram incorporados produziram asequência de aminoácidos CH3C.35.21, mas com um códon NNK na posição desejada da biblioteca. Como o modelo é um Fc de tipo selvagem, uma única inserção de oligo ou nenhuma inserção de oligo não se ligará a TfR, portanto, esses construtos foram facilmente eliminados de qualquer análise. Da mesma forma, os códons de parada decorrentes da posição NNK foram excluídos. As bibliotecas foram transfectadas em levedura EBY100. Oito colônias foram sequenciadas de cada biblioteca para garantir que a biblioteca virgem contivesse a randomização da posição desejada.
[00327] Os cerca de 10% superiores da população ligada ao domínio apical de TfR permutada circularmente, medida por exibição de levedura e citometria de fluxo, foram coletados em uma concentração de TfR que fornece a melhor faixa para distinguir afinidades. As sequências foram obtidas para 12 clones para cada posição. Para bibliotecas com populações distintas, o mesmo experimento foi feito com portas altas, médias e baixas mais bem definidas. Havia 36 clones sequenciados para cada população coletada. Além disso, a fim de comparar a ligação de um mutante à ligação do mutante correspondente com o resíduo de tipo selvagem na posição de aminoácido correspondente, o aminoácido na mesma posição foi revertido de volta para o resíduo de IgG1 de tipo selvagem usando um oligo mutagênico em métodos semelhantes.
[00328] A Tabela 8 mostra a biblioteca de mutantes de CH3C.35.21. Cada mutante continha uma única substituição de aminoácido de CH3C.35.21 Por exemplo, um mutante pode conter W380E e os aminoácidos no resto das posições são iguais aos de CH3C.35.21 As posições mostradas na Tabela 8 são numeradas de acordo com o esquema de numeração da EU. Tabela 8. Mutantes de um único aminoácido de CH3C.35.21 Posição 380 384 386 387 388 389 390 413 415 416 421 424 426 "QPENN" Fc de tipo E N Q P E N N D S R N S S descrita como selvagem SEQ ID Nº: 569 "TEWSS" CH3C.35.21 W Y T E W S S T E E F S S descrita como SEQ ID Nº: 570
E Y T E W S S T S E F S S Resíduos L F N I A N H D R H T C encontrados com S M V P I R S G K W P afinidade na faixa: V P V T T T Y M <190nM a cerca W V V P W de ~500 nM Y W Q
R Exemplo 3. Geração de variantes de CH3C.18
[00329] Este exemplo descreve a geração de variantes de CH3C.18.
[00330] Os clones únicos foram isolados e cultivados durante a noite em meio SG-CAA suplementado com glicose a 0,2% durante a noite para induzir a expressão de superfície de variantes de CH3C.18. Para cada clone, dois milhões de células foram lavadas três vezes em PBS + BSA 0,5% a pH 7,4. As células foram coradas com alvo biotinilado, 250 nM de TfR humano, 250 nM de TfR cyno ou 250 nM de uma proteína biotinilada não relacionada por uma hora a 4°C com agitação, em seguida, lavadas duas vezes com o mesmo tampão. As células foram coradas com nuetravidin-Alexafluor647 (AF647) por 30 minutos a 4°C, depois lavadas duas vezes novamente. A expressão foi medida usando anticorpo anti-c-myc com anticorpo secundário anti-frango-Alexfluor488 (AF488). As células foram ressuspensas e a intensidade de fluorescência média (MFI) de AF647 e AF488 foi medida em um BD FACS CantoII. A MFI foi calculada para a população de ligação a TfR para cada população e representada graficamente com TfR humano, TfR cyno ou ligação de controle.
[00331] A Tabela 9 mostra a biblioteca de mutantes de CH3C.18. Cada linha representa uma variante que contém as substituições de aminoácidos indicadas em cada posição e os aminoácidos no resto das posições são iguais aos do CH3C.18 Fc. As posições mostradas na Tabela 9 são numeradas de acordo com o esquema de numeração da EU. Tabela 9. Variantes de CH3C.18. Posição 384 386 387 389 390 391 413 416 421 Fc de tipo selvagem N Q P N N Y D R N CH3C.4 (CH3C.18.1) V T P A L Y L E W CH3C.2 (CH3C.18.2) Y T V S H Y S E Y CH3C.3 (CH3C.18.3) Y T E S Q Y E D H CH3C.1 (CH3C.18.4) L L V V G Y A T W CH3C.18 (CH3C.18.1.18) L H V A V Y P T W CH3C.3.1-3 (CH3C.18.3.1-3) L H V V A T P T W CH3C.3.1-9 (CH3C.18.3.1-9) L P V V H T P T W CH3C.3.2-1 (CH3C.18.3.2-1) L H V V N F P T W CH3C.3.2-5 (CH3C.18.3.2-5) L H V V D Q P T W CH3C.3.2-19 (CH3C.18.3.2-19) L H V V N Q P T W CH3C.3.4-1 (CH3C.18.3.4-1) W F V S T Y P N F CH3C.3.4-19 (CH3C.18.3.4-19) W H V S T Y P N Y CH3C.3.2-3 (CH3C.18.3.2-3) L H V V E Q P T W CH3C.3.2-14 (CH3C.18.3.2-14) L H V V G V P T W CH3C.3.2-24 (CH3C.18.3.2-24) L H V V H T P T W CH3C.3.4-26 (CH3C.18.3.4-26) W T V G T Y P N Y CH3C.3.2-17 (CH3C.18.3.2-17) L H V V G T P T W
Exemplo 4. Fab-Fc/scFv-Fc com polipeptídeo Fc de ligação a TfR
[00332] Este exemplo descreve a geração e caracterização de uma proteína engenheirada compreendendo um polipeptídeo Fc de ligação a TfR que é fundido a dois domínios variáveis de direcionamento diferentes (um domínio variável que direciona um primeiro antígeno (BACE1) e um domínio variável que direciona um segundo antígeno (Tau)). A proteína pode ser gerada em uma única célula sem pareamento incorreto da cadeia leve ou direção, fazendo a construção de fusão assimétrica mostrada na FIGURA 1. Estes construtos compreendem três cadeias polipeptídicas e foram feitos através da expressão recombinante simultânea de cada cadeia. A primeira cadeia é um polipeptídeo Fc de ligação a TfR compreendendo uma mutação de botão para heterodimerização de Fc e uma dobradiça fundida em seu N-terminal com a porção Fd de um Fab. A segunda cadeia é a cadeia leve correspondente, que emparelha para formar um Fab contra o antígeno alvo 1. A terceira cadeia é um polipeptídeo Fc que compreende uma dobradiça e um ligante flexível N-terminal (por exemplo, G4S (SEQ ID Nº: 371) ou (G4S)2) (SEQ ID Nº: 372) e um scFv contra o antígeno alvo 2.
[00333] Os polipeptídeos com esta arquitetura foram gerados usando a região 3C de Fc de ligação a TfR.35.23.4 com uma mutação de botão fundida a um Fab anti-BACE1, emparelhado com um furo Fc fundido a um scFv para um anticorpo anti-Tau. Quatro versões do scFv anti-Tau foram geradas; o ligante para o Fc foi testado como GGGGS (SEQ ID Nº: 371) ou GGGGSGGGGS (SEQ ID Nº: 372), e a ordem dos domínios foi testada como VL-ligante-VH ou VH-ligante-VL. Para a primeira orientação, o ligante RTVAGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID Nº: 374) foi usado, e para a última orientação o ligante ASTKGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID Nº: 375) foi usado. A mesma sequência de cadeia leve anti-BACE1 foi usada para todos os construtos. Todos os construtos foram feitos como Fc's nulos de função efetora incorporando mutações L234A/L235A (LALA).
[00334] Os genes correspondentes a cada uma das três cadeias foram clonados em vetores de expressão, e os vetores foram cotransfectados em células ExpiCHO para expressão transiente e depois purificados por cromatografia com Proteína A. Os polipeptídeos recombinantes foram subsequentemente testados quanto à sua capacidade de envolver o primeiro antígeno (BACE1), o segundo antígeno (Tau) e TfR usando Biacore. Como indicado na Tabela 10 abaixo, todas as quatro variantes se ligam a TfR e BACE1, mas apenas as variantes 2 e 4 ligam Tau. Este resultado sugere que a orientação VL-ligante-VH é preferida para este scFv. Tabela 10. Resumo da cinética de ligação de proteínas biespecíficas com arquitetura Fab-Fc/scFv-Fc Variante Orientação Ligante SEQ ID Nº: TfR KD BACE1 KD Tau KD scFv (M) (M) (M) V1 VH-L-VL (G4S)2 372 7.0E-7 1.3E-10 Sem ligação V2 VL-L-VH (G4S)2 372 3.9E-7 6.3E-10 < E-10 V3 VH-L-VL G4S 371 9.9E-7 3.9E-10 Sem ligação V4 VL-L-VH G4S 371 3.9E-7 9.8E-10 < E-10 Exemplo 5. Fv C-Terminal fundido a polipeptídeos Fc de ligação a TfR
[00335] Para incorporar a ligação do antígeno alvo, um polipeptídeo Fc compreendendo uma subunidade Fc com mutações de ligação a TfR e uma mutação de botão e uma segunda subunidade Fc com uma mutação de furo pode ser modificado adicionando um ligante flexível ao terminal C de ambas as cadeias, seguido pelo domínios variáveis de um anticorpo (VH para uma subunidade e VL para a outra). Em uma modalidade exemplificativa desta arquitetura, os terminais N dos domínios Fc são ainda fundidos a um Fab que se liga a um segundo antígeno, como mostrado na FIGURA 2. A configuração resultante é um polipeptídeo de quatro cadeias (duas cadeias pesadas diferentes e duas cópias da mesma cadeia leve) que se liga a TfR, um antígeno alvo de forma bivalente e um segundo antígeno de forma monovalente.
[00336] Os polipeptídeos desta arquitetura foram gerados onde os braços Fab de um anticorpo anti-Tau foram fundidos ao terminal N do polipeptídeo de ligação a TfR 3C.35.23.4, permitindo assim a ligação bivalente a Tau, e VL e VH de um anticorpo anti-BACE1 foram respectivamente fundidos aos terminais N das duas cadeias Fc após um ligante. Um total de oito moléculas foram inicialmente geradas onde três parâmetros foram variados: os Fvs fundidos eram de um dos dois clones de anticorpo anti-BACE1, o ligante era GGGGS (SEQ ID Nº: 371) ou GGGGSGGGGS (SEQ ID Nº: 372), e a orientação das fusões VH e VL (por exemplo, ou VH estava na cadeia pesada 1 e VL estava na cadeia pesada 2, ou vice-versa).
[00337] Estes construtos compreendem três cadeias polipeptídicas e foram feitos através da expressão recombinante simultânea de cada cadeia. A primeira cadeia é um polipeptídeo Fc que compreende as mutações de ligação a TfR 3C.35.23.4 e uma mutação de botão, fundida no terminal N à região Fd de um Fab anti-Tau, e fundida no terminal C a um ligante seguido pelo VH ou VL de um Fab anti-BACE1. A segunda cadeia é um polipeptídeo Fc que compreende uma mutação de furo, fundido no terminal N com a região Fd de um Fab anti-Tau e fundido no terminal C a um ligante seguido pelo domínio variável alternativo (VH ou VL) do Fab anti-BACE1. A terceira cadeia é a cadeia leve correspondente ao Fab anti-Tau. Todas as cadeias pesadas tiveram a lisina C-terminal da sequência Fc canônica removida e foram feitas como Fc's nulos de função efetora incorporando mutações L234A/L235A (LALA).
[00338] Os genes correspondentes a cada uma das três cadeias foram clonados em vetores de expressão, e os vetores foram cotransfectados em células ExpiCHO para expressão transiente e depois purificados por cromatografia com Proteína A. Os polipeptídeos recombinantes foram testados quanto à sua capacidade de envolver o BACE1, Tau e TfR usando Biacore, como mostrado na Tabela 11 abaixo. Tabela 11. Resumo da cinética de ligação de proteínas biespecíficas com arquitetura mAb/Fv Variante Ct-VH ligado a Ligante SEQ ID Nº: TfR KD BACE1 KD Tau KD (botão ou furo) (M) (M) (M) V1 Furo G4S 371 5,1E-7 1,3E-8 <1,0E-10 V2 Botão G4S 371 4,3E-7 1,2E-8 <1,0E-10 V3 Furo (G4S)2 372 2,8E-7 4,0E-8 <1,0E-10 V4 Botão (G4S)2 372 3,7E-7 2,6E-8 <1,0E-10 V5 Furo G4S 371 3,2E-7 1,1E-8 <1,0E-10 V6 Botão G4S 371 Nd Nd <1,0E-10 V7 Furo (G4S)2 372 3,6E-7 2,1E-8 <1,0E-10 V8 Botão (G4S)2 372 2,9E-7 9,0E-9 <1,0E-10 Exemplo 6. Fusão de scFv C-Terminal a peptídeos de ligação a TfR
[00339] Polipeptídeos que compreendem peptídeos de ligação a TfR fundidos no N-terminal com Fabs contra um primeiro antígeno e no C- terminal com scFv (s) contra o segundo antígeno (seja no orifício da cadeia pesada apenas, FIGURA 3A, ou em ambas as cadeias de botão e furo, FIGURA 3B) foram gerados de forma semelhante à descrita nos Exemplos 1 e 2. Três plasmídeos de expressão foram gerados para cada construto: um polipeptídeo Fc de ligação a TfR compreendendo uma mutação de botão juntamente com Fd N-terminal contra o alvo 1 com ou sem um scFv C-terminal contra o alvo 2, um polipeptídeo Fc compreendendo uma mutaçãode furo juntamente com N-terminal Fd contra o alvo 1 e um scFv C-terminal contra o alvo 2 e uma cadeia leve contra o alvo 1. Os domínios variáveis usados foram derivados de anticorpos anti-BACE1 e um anticorpo anti-Tau; foram geradas orientações com BACE1 como alvo 1 e Tau como alvo 2 ou vice-versa. Exemplo 7. Geração de proteínas biespecíficas
[00340] Proteínas engenheiradas com a arquitetura de uma proteína biespecífica como mostrado na FIGURA 1, FIGURA 2, FIGURA 3A ou FIGURA 3B foram geradas para atingir dois antígenos diferentes (Tau e BACE1). Detalhes de arquitetura e sequência para os construtos são mostrados nas Tabelas 12-14 abaixo. Todas os construtos foram feitos como função efetora nula incorporando mutações L234A/L235A (LALA) nos polipeptídeos Fc. Para os construtos na Tabela 13, todas os construtos tinham a lisina C-terminal imediatamente anterior ao ligante removida tanto da cadeia pesada 1 quanto da cadeia pesada 2. Para os construtos na Tabela 14, alguns construtos foram gerados em que a lisina C-terminal imediatamente anterior ao ligante ("Lys447") foi removida da cadeia pesada 2 (para proteínas com um scFv C-terminal), ou de ambas a cadeia pesada 1 e cadeia pesada 2 (para proteínas com dois scFvs C-terminais). Para os construtos nas Tabelas 13 e 14, alguns construtos foram gerados que incorporaram mutações M428L/N434S (LS) nos polipeptídeos Fc.
Tabela 12. Sequências para proteínas biespecíficas com arquitetura Fab-Fc/scFv-Fc
Nº. do Fab Ligante SEQ ID Nº: Anticorpo de Ordem de Ligante scFv SEQ ID Nº: Dissulfeto Clone de construto scFv-CH2 scFv Domínio scFv ligação a scFv TfR
1 Anti-BACE1 G4S 371 Anti-Tau VL-VH RTVA(G4S)3 374 -- 35.23.4
2 Anti-BACE1 G4S 371 Anti-Tau VL-VH RTVA(G4S)3 374 H44-L100 35.23.4
3 Anti-BACE1 G4S 371 Anti-Tau VL-VH (G4S)3 373 -- 35.23.4
4 Anti-BACE1 G4S 371 Anti-Tau VL-VH (G4S)3 373 H44-L100 35.23.4
5 Anti-Tau G4S 371 Anti-BACE1 VL-VH RTVA(G4S)3 374 -- 35.23.4
6 Anti-Tau G4S 371 Anti-BACE1 VL-VH RTVA(G4S)3 374 H44-L100 35.23.4
7 Anti-Tau G4S 371 Anti-BACE1 VH-VL ASTK(G4S)3 375 -- 35.23.4
8 Anti-Tau G4S 371 Anti-BACE1 VH-VL ASTK(G4S)3 375 H44-L100 35.23.4
9 Anti-Tau G4S 371 Anti-BACE1 VL-VH RTVA(G4S)3 374 -- 35.23.4
10 Anti-Tau G4S 371 Anti-BACE1 VL-VH RTVA(G4S)3 374 H44-L100 35.23.4
11 Anti-Tau G4S 371 Anti-BACE1 VH-VL ASTK(G4S)3 375 -- 35.23.4
12 Anti-Tau G4S 371 Anti-BACE1 VH-VL ASTK(G4S)3 375 H44-L100 35.23.4
Tabela 13. Sequências para proteínas biespecíficas com arquitetura C- Terminal-Fv Nº. do Fab Fv (botão) Ligante SEQ ID Nº: Fv (furo) Ligante SEQ ID Nº: Dissulfeto Mutação de Clone de construto (botão) (furo) scFv extensão de ligação a meia-vida TfR
13 Anti-Tau Anti-BACE1 G4S 371 Anti-BACE1 G4S 371 -- -- 35.23.4
14 Anti-Tau Anti-BACE1 G4S 371 Anti-BACE1 G4S 371 -- -- 35.23.4
15 Anti-Tau Anti-BACE1 (G4S)2 372 Anti-BACE1 (G4S)2 372 -- -- 35.23.4
16 Anti-Tau Anti-BACE1 (G4S)2 372 Anti-BACE1 (G4S)2 372 -- -- 35.23.4
17 Anti-Tau Anti-BACE1 G4S 371 Anti-BACE1 G4S 371 -- -- 35.23.4
18 Anti-Tau Anti-BACE1 G4S 371 Anti-BACE1 G4S 371 -- -- 35.23.4
19 Anti-Tau Anti-BACE1 (G4S)2 372 Anti-BACE1 (G4S)2 372 -- -- 35.23.4
20 Anti-Tau Anti-BACE1 (G4S)2 372 Anti-BACE1 (G4S)2 372 -- -- 35.23.4
21 Anti-Tau Anti-BACE1 (G4S)2-G4 389 Anti-BACE1 (G4S)2-G4 389 -- -- 35.23.4
22 Anti-Tau Anti-BACE1 (G4S)2-G4 389 Anti-BACE1 (G4S)2-G4 389 H44-L100 -- 35.23.4
23 Anti-Tau Anti-BACE1 (G4S)2-G4 389 Anti-BACE1 (G4S)2-G4 389 -- -- 35.23.4
24 Anti-Tau Anti-BACE1 (G4S)2-G4 389 Anti-BACE1 (G4S)2-G4 389 H44-L100 -- 35.23.4
25 Anti-Tau Anti-BACE1 (G4S)3-G4 571 Anti-BACE1 (G4S)3-G4 571 -- -- 35.23.4
26 Anti-Tau Anti-BACE1 (G4S)3-G4 571 Anti-BACE1 (G4S)3-G4 571 H44-L100 -- 35.23.4
27 Anti-Tau Anti-BACE1 (G4S)3-G4 571 Anti-BACE1 (G4S)3-G4 571 -- -- 35.23.4
28 Anti-Tau Anti-BACE1 (G4S)3-G4 571 Anti-BACE1 (G4S)3-G4 571 H44-L100 -- 35.23.4
29 Anti-Tau Anti-BACE1 (G4S)2-G4 389 Anti-BACE1 G4S-G4 572 -- -- 35.23.4
30 Anti-Tau Anti-BACE1 (G4S)2-G4 389 Anti-BACE1 G4S-G4 572 H44-L100 -- 35.23.4
31 Anti-Tau Anti-BACE1 (G4S)2-G4 389 Anti-BACE1 G4S-G4 572 -- -- 35.23.4
32 Anti-Tau Anti-BACE1 (G4S)2-G4 389 Anti-BACE1 G4S-G4 572 H44-L100 -- 35.23.4
33 Anti-Tau Anti-BACE1 (G4S)2-G4 389 Anti-BACE1 (G4S)2-G4 389 H44-L100 -- 35.23
34 Anti-Tau Anti-BACE1 (G4S)2-G4 389 Anti-BACE1 (G4S)2-G4 389 H44-L100 -- 35.23.3
35 Anti-Tau Anti-BACE1 (G4S)2-G4 389 Anti-BACE1 (G4S)2-G4 389 H44-L100 LS 35.23.4
36 Anti-Tau Anti-BACE1 (G4S)2-G4 389 Anti-BACE1 (G4S)2-G4 389 H44-L100 LS 35.23
37 Anti-Tau Anti-BACE1 (G4S)2-G4 389 Anti-BACE1 (G4S)2-G4 389 H44-L100 LS 35.23.3
Tabela 14. Sequências para proteínas biespecíficas com arquitetura C- Terminal-scFv Nº Cons- Fab Ligante SEQ Anticorpo Ordem Ligante scFv SEQ ID scFv Mutação Lisina 447 TfR Clone truto CH3-scFv ID Nº: scFv domínio Nº: Dissulfeto Extensão Removida? de Ligação scFv Meia Vida proteínas tendo um C-Terminal scFv 38 Anti-Tau G4S 371 Anti-BACE1 VL-VH RTVA(G4S)3 374 -- -- Não 35.23.4 39 Anti-Tau (G4S)2 372 Anti-BACE1 VL-VH RTVA(G4S)3 374 -- -- Não 35.23.4 40 Anti-Tau G4S 371 Anti-BACE1 VL-VH RTVA(G4S)3 374 H44-L100 -- Não 35.23.4 41 Anti-Tau (G4S)2 372 Anti-BACE1 VL-VH RTVA(G4S)3 374 H44-L100 -- Não 35.23.4 42 Anti-Tau G4S 371 Anti-BACE1 VH-VL ASTK(G4S)3 375 -- -- Não 35.23.4 43 Anti-Tau (G4S)2 372 Anti-BACE1 VH-VL ASTK(G4S)3 375 -- -- Não 35.23.4 44 Anti-Tau G4S 371 Anti-BACE1 VH-VL ASTK(G4S)3 375 H44-L100 -- Não 35.23.4 45 Anti-Tau (G4S)2 372 Anti-BACE1 VH-VL ASTK(G4S)3 375 H44-L100 -- Não 35.23.4 46 Anti-Tau (G4S)2 372 Anti-BACE1 VL-VH RTVA(G4S)3 374 H44-L100 -- Sim 35.23.4 47 Anti-Tau (G4S)2 372 Anti-BACE1 VH-VL ASTK(G4S)3 375 H44-L100 -- Sim 35.23.4 48 Anti-Tau (G4S)2 372 Anti-BACE1 VL-VH RTVA(G4S)3 374 H44-L100 -- Sim 35.23.1.1 49 Anti-Tau (G4S)2 372 Anti-BACE1 VL-VH RTVA(G4S)3 374 H44-L100 -- Sim 35.23.3 50 Anti-Tau (G4S)2 372 Anti-BACE1 VL-VH RTVA(G4S)3 374 H44-L100 -- Sim 35.23 51 Anti-Tau (G4S)2 372 Anti-BACE1 VL-VH RTVA(G4S)3 374 H44-L100 -- Sim 35.23.3 52 Anti-Tau (G4S)2 372 Anti-BACE1 VL-VH RTVA(G4S)3 374 H44-L100 LS Sim 35.23.4 53 Anti-Tau (G4S)2 372 Anti-BACE1 VL-VH RTVA(G4S)3 374 H44-L100 LS Sim 35.23 54 Anti-Tau (G4S)2 372 Anti-BACE1 VL-VH RTVA(G4S)3 374 H44-L100 LS Sim 35.23.3 55 Anti-Tau (G4S)2 372 Anti-BACE1 VH-VL ASTK(G4S)3 375 H44-L100 -- Sim 35.23 56 Anti-Tau (G4S)2 372 Anti-BACE1 VH-VL ASTK(G4S)3 375 H44-L100 -- Sim 35.23.3 57 Anti-Tau (G4S)2 372 Anti-BACE1 VH-VL ASTK(G4S)3 375 H44-L100 LS Sim 35.23.4 58 Anti-Tau (G4S)2 372 Anti-BACE1 VH-VL ASTK(G4S)3 375 H44-L100 LS Sim 35.23 59 Anti-Tau (G4S)2 372 Anti-BACE1 VH-VL ASTK(G4S)3 375 H44-L100 LS Sim 35.23.3 proteínas tendo dois C-Terminal scFvs 60 Anti- (G4S)2 372 Anti-Tau VL-VH RTVA(G4S)3 374 -- -- Sim 35.23.4 BACE1 61 Anti- (G4S)2 372 Anti-Tau VL-VH RTVA(G4S)3 374 H44-L100 -- Sim 35.23.4 BACE1 62 Anti-Tau (G4S)2 372 Anti-BACE1 VL-VH RTVA(G4S)3 374 H44-L100 -- Sim 35.23.4 63 Anti-Tau (G4S)2 372 Anti-BACE1 VH-VL ASTK(G4S)3 375 H44-L100 -- 35.23.4 64 Anti-Tau (G4S)2 372 Anti-BACE1 VL-VH RTVA(G4S)3 374 H44-L100 -- Sim 35.23 65 Anti-Tau (G4S)2 372 Anti-BACE1 VL-VH RTVA(G4S)3 374 H44-L100 -- Sim 35.23.3 66 Anti-Tau (G4S)2 372 Anti-BACE1 VL-VH RTVA(G4S)3 374 H44-L100 LS Sim 35.23.4 67 Anti-Tau (G4S)2 372 Anti-BACE1 VL-VH RTVA(G4S)3 374 H44-L100 LS Sim 35.23 68 Anti-Tau (G4S)2 372 Anti-BACE1 VL-VH RTVA(G4S)3 374 H44-L100 LS Sim 35.23.3 69 Anti-Tau (G4S)2 372 Anti-BACE1 VH-VL ASTK(G4S)3 375 H44-L100 -- Sim 35.23.4 70 Anti-Tau (G4S)2 372 Anti-BACE1 VH-VL ASTK(G4S)3 375 H44-L100 -- Sim 35.23 71 Anti-Tau (G4S)2 372 Anti-BACE1 VH-VL ASTK(G4S)3 375 H44-L100 -- Sim 35.23.3 72 Anti-Tau (G4S)2 372 Anti-BACE1 VH-VL ASTK(G4S)3 375 H44-L100 LS Sim 35.23.4 73 Anti-Tau (G4S)2 372 Anti-BACE1 VH-VL ASTK(G4S)3 375 H44-L100 LS Sim 35.23 74 Anti-Tau (G4S)2 372 Anti-BACE1 VH-VL ASTK(G4S)3 375 H44-L100 LS Sim 35.23.3
Exemplo 8. Avaliação Biacore de Proteínas Biespecíficas Avaliação Biacore de proteínas biespecíficas BACE1/Tau compreendendo polipeptídeos Fc de ligação a TfR
[00341] As afinidades das proteínas biespecíficas BACE1/Tau compreendendo polipeptídeos Fc de ligação a TfR com seus antígenos foram determinadas por ressonância plasmônica de superfície usando um instrumento Biacore™ 8K. Proteínas biespecíficas foram capturadas usando Kit de captura de Fab Humano (GE, #28-9583-25) no chip sensor Biacore Series S CM5 (GE, # 29149604). Diluições em série de 3 vezes de cada antígeno (BACE1: 300, 100, 33,3, 11,1, 0 nM; Tau: 30, 10, 3,3, 1,1, 0,4 nM) foram injetadas a uma taxa de fluxo de 30 µL/min. A ligação dos antígenos ao polipeptídeo Fc capturado compreendendo um sítio de ligação de TfR foi monitorada por 300 segundos e, em seguida, sua dissociação foi monitorada por 600+ segundos em tampão de execução HBS-EP+. A resposta de ligação foi corrigida subtraindo o RU de uma célula de fluxo em branco. Um modelo Languir 1:1 de ajuste simultâneo de kon e koff foi usado para a análise cinética. Os dados de ligação para proteínas biespecíficas descritos nas Tabelas 12-14 são mostrados nas Tabelas 15-17 abaixo. Uma proteína biespecífica anti- BACE1/RSV com um sítio de ligação de TfR (Clone 35.23.4), botões em furos e substituições L234A/L235A ("C1") foi usada como um controle. Avaliação Biacore de Ligação TfR
[00342] A afinidade de proteínas biespecíficas para o domínio apical de TfR recombinante foi determinada por ressonância plasmônica de superfície usando um instrumento Biacore™8K em tampão de execução 1X HBS-EP+ (GE Healthcare, BR100669). Os chips sensores CM5 Biacore™ Series S foram imobilizados com Fab anti-humano (kit de captura de Fab humano da GE Healthcare, 28958325). Uma proteína de fusão compreendendo Fab e um polipeptídeo Fc compreendendo um sítio de ligação de TfR foi capturada por 30 segundos em cada célula de fluxo e diluições em série de 3 vezes do domínio apical humano (2, 0,66, 0,22, 0,073, 0,24 e 0 uM) foram injetadas a uma taxa de fluxo de 30 uL/min usando o método de cinética de ciclo único.
Cada amostra foi analisada com uma associação de 80 segundos e uma dissociação de 3 minutos.
Após cada ciclo, o chip foi regenerado usando 10 mM de glicina-HCl (pH 2,1) por 30 segundos a 50 ul/min.
A resposta de ligação foi corrigida subtraindo o RU de uma célula de fluxo de referência.
As afinidades de estado estacionário foram obtidas ajustando a resposta no equilíbrio contra a concentração usando o software de avaliação Biacore™ 8K.
Para determinar a afinidade das proteínas biespecíficas para o ectodomínio TfR recombinante (ECD), os chips sensores CM5 Biacore™ Series S foram imobilizados com estreptavidina.
O ECD de TfR humano de 0,5 ug/ml biotinilado foi capturado por 45 segundos em cada célula de fluxo a 10 ul/min, e diluições em série de 3 vezes de proteínas biespecíficas trocadas por tampão em HBS foram injetadas a uma taxa de fluxo de 30 ul/min.
Cada amostra foi analisada usando cinética de ciclo único, como descrito acima.
Os dados de ligação para proteínas biespecíficas descritos nas Tabelas 12-14 são mostrados nas Tabelas 15-17 abaixo.
C1 foi usado como controle.
Tabela 15. Dados de ligação Biacore para proteínas biespecíficas com arquitetura Fab-Fc/scFv-Fc
Construto # Tau KD (nM) hTfR SSA apical (nM)
1 1,8 370
2 1,6 390
3 ND ND
4 ND ND
BACE1 KD hTfR SSA apical Tau KD Construto # (nM) (nM) (pM)
C1 1,4 470 ND
5 ND ND ND
6 4,1 330 ND
7 ND ND ND
8 sem ligação 280 ND
9 2,4 350 ND
10 2,1 360 240
11 2,6 360 ND
12 2,7 360 ND ND = Não Determinado.
Tabela 16. Dados de ligação Biacore para proteínas biespecíficas com arquitetura C-Terminal-Fc
Construto BACE1 KD hTfR SSA apical (nM) # (nM) 13 13 510 14 12 430 15 40 280 16 4 370 17 11 320 18 ND ND 19 21 360 20 9 290 Construto BACE1 KD hTfR SSA apical Tau KD # (nM) (nM) (pM) C1 3,4 700 ND 21 8,9 470 ND 22 17 460 ND 23 11 ND ND 24 7,8 440 420 25 8 270 ND 26 5 ND ND 27 18 350 ND 28 26 210 ND 29 5,3 360 ND 30 4,6 450 ND 31 15 350 ND 32 20 340 ND ND = Não Determinado.
Tabela 17. Dados de ligação Biacore para proteínas biespecíficas com arquitetura C-Terminal-scFv BACE1 KD hTfR SSA Construto # (nM) apical (nM) C1 3,4 700 38 4,2 560 39 3,6 610 40 3,3 570 41 3,3 550 42 3,2 ND 43 10,6 600 44 5,9 460 45 4,3 520 BACE1 KD hTfR ECD Tau KD (pM) (nM) SSA (nM) 46 2,2 460 780 47 ND ND ND BACE1 KD hTfR SSA hTfR ECD Construto # (nM) apical (nM) SSA (nM) C1 1,1 520 380 48 1,5 460 1480 49 1,6 680 1540 BACE1 KD hTfR SSA hTfR ECD Tau KD Construto # (nM) apical (nM) SSA (nM) (pM) C1 1,1 520 380 ND 60 0,6 210 870 ND 61 ND ND ND ND 62 1,4 390 1490 240 63 4,4 250 1290 ND ND = Não Determinado.
Exemplo 9. Quantificação da inibição de BACE1 usando células CHO:huAPP Condições de cultura
[00343] CHO: células huAPP KI foram geradas em Genscript e mantidas em 50% DMEM/50% F12 (Gibco, 11320) com 10% de FBS (Sigma F8317), 1X penicilina/estreptomicina (Gibco 15140122) e 1x Genectina (Gibco 10131027) (referido neste documento como "mídia CHO" ("CM")). Tratamentos de cultura celular
[00344] Células CHO:huAPP (passagem# 4-18) foram tratadas com várias moléculas (todas as moléculas quiméricas em uma estrutura de IgG humana). As moléculas foram primeiro diluídas em CM para uma concentração inicial de 1 ou 2 µM e depois diluídas 1:2 ou 1:4 para gerar uma série de diluições para medir a resposta à dose de cada molécula. Meio de células CHO:huAPP foi inteiramente substituído por aquele contendo moléculas experimentais ou de controle. As células CHO:huAPP foram então mantidas a 37°C com 5% de CO2 durante 24 horas. Após 24 horas, os meios foram coletados para medição de Aβ por um ensaio HTFR. Quantificação de Aβ por HTFR
[00345] Após 24 horas de incubação de células CHO:huAPP com moléculas experimentais ou de controle, 100 µL de meio foram colhidos. As incubações das moléculas foram realizadas em duplicata e as medições de Aβ1-40 com duplicatas técnicas. As medições de Aβ1-40 humano foram conduzidas de acordo com o kit Cisbio Aβ1-40 (Cisbio #62B40PEG). Em resumo: o kit forneceu dois anticorpos anti-Aβ1-40 que atuam como um par de doador e receptor FRET: um anticorpo foi marcado com Eu3+-criptato (doador FRET) e o outro com XL-665 (receptor FRET). Ambos os anticorpos foram incubados com 5 µL de meio, colhido de culturas CHO:huAPP, em um PerkinElmer OptiPlate
384 por 24 horas a 4°C. A placa foi então lida e a concentração de Aβ1- 40 foi calculada a partir de uma razão de 665 nm/620 nm.
[00346] Os dados de inibição de BACE1 celular para proteínas biespecíficas descritos nas Tabelas 12-14 são mostrados nas Tabelas 18-20 abaixo. Um anticorpo anti-BACE1 tendo um sítio de ligação TfR (Clone 35.23.4) ("C2"), uma proteína biespecífica anti-BACE1/RSV tendo um sítio de ligação TfR (Clone 35.23.4) e substituições L234A/L235A ("C3"), e um anti-BACE1 amadurecido por não afinidade sem um sítio de ligação de TfR ou outras modificações Fc ("C4") foram usados como controles. Tabela 18. Inibição de BACE1 celular para proteínas biespecíficas com arquitetura Fab-Fc/scFv-Fc Inibição Concentração Construto IC50 de BACE1 máxima de para 50% de # celular (nM) BACE1 (%) inibição (nM) C2 35 69 99 6 6 58 42 9 18 70 37 10 8 62 35 11 3 63 14 12 11 67 27
Tabela 19. Inibição de BACE1 celular para proteínas biespecíficas com arquitetura C-Terminal-Fc Cons- IC50 de BACE1 Inibição máxima Concentração para truto # celular (nM) de BACE1 (%) 50% de inibição (nM) C3 58 67 157 14 481 35 NA 15 1215 NA NA 16 554 65 NA 17 673 71 1382 19 61 57 427 20 126 60 558
Cons- IC50 de BACE1 Inibição máxima Concentração para truto # celular (nM) de BACE1 (%) 50% de inibição (nM) C2 23 73 57 24 18,5 59 124 30 151 66 378 31 144 66 487 32
Cons- IC50 de BACE1 Inibição máxima Concentração para truto # celular (nM) de BACE1 (%) 50% de inibição (nM) C2 35 69 99 25 577 81 627 26 692 92 661 27 152 65 547 28 229 84 238 NA = Não aplicável
Tabela 20. Inibição de BACE1 celular para proteínas biespecíficas com arquitetura C-Terminal-scFv Cons- IC50 de BACE1 Inibição máxima de Concentração para 50% de truto # celular (nM) BACE1 (%) inibição (nM) C2 23 73 57 39 6 65 16 40 24 73 48 41 5 69 16 43 8 76 14 45 8 76 16 Cons- IC50 de BACE1 Inibição máxima de Concentração para 50% de truto # celular (nM) BACE1 (%) inibição (nM) C2 26 71 73 46 12 60 83 Cons- IC50 de BACE1 Inibição máxima de Concentração para 50% de truto # celular (nM) BACE1 (%) inibição (nM) C2 31 68 93 50 7 58 47 Cons- IC50 de BACE1 Inibição máxima de Concentração para 50% de truto # celular (nM) BACE1 (%) inibição (nM) C4 10 66 28 60 4 58 24 62 5 71 11 63 4 66 14 Exemplo 10. Propriedades farmacocinéticas de proteínas biespecíficas BACE-Tau com polipeptídeo Fc de ligação a TfR
[00347] Este exemplo descreve a caracterização de propriedades farmacocinéticas de proteínas biespecíficas BACE1-Tau com polipeptídeos Fc de ligação a TfR usando modelos de camundongo.
Avaliação PK de camundongo tipo selvagem
[00348] Para avaliação farmacocinética (PK) in vivo, camundongos C57Bl6 de tipo selvagem fêmeas de 6-8 semanas de idade foram administrados por via intravenosa a 10 mg/kg com uma proteína biespecífica BACE1-Tau tendo uma arquitetura Fab-Fc/scFv-Fc (construto 10 como descrito na Tabela 12), uma proteína biespecífica BACE1-Tau tendo uma arquitetura Fv C-terminal (construtos 20 e 24, como descrito na Tabela 13), uma proteína biespecífica BACE1-Tau tendo uma arquitetura scFv C-terminal com um scFv fundido a um polipeptídeo Fc (construtos 41, 45 e 46, como descrito na Tabela 14), uma proteína biespecífica BACE1-Tau tendo uma arquitetura C-terminal com um scFv fundido a cada polipeptídeo Fc (construto 62, como descrito na Tabela 14), um anticorpo de controle anti-BACE1 (Ab153), um anticorpo de controle negativo anti-RSV (Ab122) ou um anticorpo anti-Tau compreendendo um polipeptídeo Fc de ligação a TfR (ATV:Tau). O plasma em vida foi obtido por meio de sangramentos submandibulares nos pontos de tempo indicados na FIGURA 4A ou FIGURA 5A. O sangue foi coletado em tubos de plasma EDTA, centrifugados a 14.000 rpm por 5 minutos e, em seguida, o plasma foi isolado para análise subsequente.
[00349] FIGURAS 4A e 4B mostram os dados da avaliação de PK de camundongo de tipo selvagem do construto BACE1-Tau C-terminal Fv 20, BACE1-Tau C-terminal scFv construtos 41 e 45 e anticorpo de controle anti-BACE1 (Ab153). Como mostrado na FIGURA 4B, cada uma das proteínas biespecíficas BACE1-Tau teve eliminação mais rápida do que o anticorpo de controle anti-BACE1.
[00350] As FIGURAS 5A e 5B mostram os dados da avaliação de PK de camundongo de tipo selvagem do construto BACE1-Tau Fab- Fc/scFv-Fc 10, BACE1-Tau C-terminal Fv construto 24, BACE1-Tau C- terminal scFv construto 46, BACE1-Tau C-terminal scFv construto 62,
anticorpo de controle negativo anti-RSV (Ab122) e anticorpo anti-Tau compreendendo um polipeptídeo Fc de ligação a TfR (ATV:Tau). Como mostrado na FIGURA 5B, cada uma das proteínas biespecíficas BACE1-Tau tinha valores de depuração aceitáveis dentro de 1,5-2 vezes de um anticorpo de controle negativo anti-RSV (Ab122) e dentro de 1,5 vezes de um anticorpo anti-Tau de controle compreendendo um polipeptídeo Fc de ligação a TfR. Avaliação PK de camundongo hTfRms/hu KI
[00351] Camundongos knock-in para TfR humano (TfRms/hu KI) também foram usados para avaliação farmacocinética (PK) in vivo. Tal modelo pode ser usado, por exemplo, para medir e/ou comparar a concentração máxima do cérebro (Cmax) e/ou a exposição do cérebro, por exemplo, para determinar se a Cmax está aumentada e/ou a exposição do cérebro é prolongada. Camundongos TfRms/hu KI foram gerados usando tecnologia CRISPR/Cas9 para expressar o domínio apical de Tfrc humano dentro do gene de Tfrc murino; o TfR quimérico resultante foi expresso in vivo sob o controle do promotor endógeno. Como descrito no Pedido de Patente Internacional PCT/US2018/018302, que é incorporado por referência na sua totalidade neste documento, camundongos C57Bl6 foram usados para gerar um knock-in da linhagem de camundongo TfR apical humano por meio de microinjeção pronuclear em embriões de célula única, seguido por transferência de embrião para fêmeas pseudo grávidas. Especificamente, Cas9, RNAs de guia único e um DNA de doador foram introduzidos nos embriões. O DNA doador compreendia uma sequência codificadora do domínio apical humano que foi otimizada por códons para expressão em camundongos. A sequência de codificação do domínio apical foi flanqueada por um braço de homologia esquerdo e direito. A sequência doadora foi projetada de modo que o domínio apical fosse inserido após o quarto éxon de camundongo e fosse imediatamente flanqueado na extremidade 3' pelo nono éxon de camundongo. Um macho fundador da progênie da fêmea que recebeu os embriões foi cruzado com fêmeas do tipo selvagem para gerar camundongos heterozigotos F1. Camundongos homozigóticos foram subsequentemente gerados a partir da criação de camundongos heterozigóticos de geração F1.
[00352] Para análise de PK, camundongos hTfRms/hu KI fêmeas de 6- 8 semanas de idade foram administrados por via intravenosa a 10 mg/kg com uma proteína biespecífica BACE1-Tau tendo uma arquitetura Fv C- terminal (construto 24, como descrito na Tabela 13), proteína biespecífica BACE1-Tau tendo uma arquitetura scFv C-terminal com um scFv fundido a um polipeptídeo Fc (construção 46, como descrito na Tabela 14), uma proteína biespecífica BACE1-Tau tendo uma arquitetura scFv C-terminal com um scFv fundido a cada polipeptídeo Fc (construto 62, como descrito na Tabela 14), um anticorpo de controle negativo anti-RSV (Ab122), um anticorpo anti-Tau 1C7 (anti-Tau) ou um anticorpo anti-Tau compreendendo um polipeptídeo Fc de ligação a TfR (ATV:Tau). O plasma em vida foi obtido por meio de sangramentos submandibulares nos pontos de tempo indicados na FIGURA 6A. O sangue foi coletado em tubos de plasma EDTA, centrifugados a 14.000 rpm por 5 minutos e, em seguida, o plasma foi isolado para análise subsequente.
[00353] Como mostrado nas FIGURAS 6A e 6B, cada uma das proteínas biespecíficas BACE1-Tau testadas no modelo de camundongo hTfRms/hu KI exibiu depuração mais rápida do que o anticorpo de controle negativo anti-RSV (Ab122) ou anticorpo anti-Tau 1C7 devido à ligação de TfR e depuração mediada por alvo, e tinham valores de eliminação aceitáveis dentro de 2 vezes de um anticorpo de controle anti-Tau compreendendo um polipeptídeo Fc de ligação a TfR.
Avaliação PK de Camundongo PS19/hTfRms/hu KI
[00354] As propriedades farmacocinéticas de construtos adicionais também foram avaliadas in vivo em camundongos PS19/TfRms/hu KI. Camundongos PS19/TfRms/hu KI foram gerados para expressar o domínio apical Tfrc humano dentro do gene Tfrc murino e um gene Tau mutante que codifica uma proteína Tau humana mutante compreendendo a substituição de aminoácido P272S em relação à sequência de SEQ ID Nº: 398 por cruzamento os camundongos PS19 para os camundongos TfRms/hu KI para gerar uma colônia de camundongos PS19 HEMI (hemizigotos) TfRms/hu HOM (homozigotos). Camundongos PS19 HEMI TfRms/hu KI HOM machos são cruzados com camundongos TfRms/hu HOM fêmeas para manter a colônia.
[00355] Camundongos PS19/TfRms/hu KI foram administrados sistemicamente uma vez através da veia da cauda a 50 mg/kg. Antes da perfusão com PBS, o sangue foi coletado em tubos de plasma EDTA através de punção cardíaca e centrifugado a 14.000 rpm por 5 minutos. O plasma foi então isolado para análise PK/PD subsequente. Os cérebros foram extraídos após a perfusão e os hemicérebros foram isolados para homogeneização em 10x por peso de tecido de NP-40 a 1% em PBS (para PK) ou GuHCl 5 M (para PD).
[00356] As concentrações totais de anticorpos no plasma de camundongo e lisados cerebrais foram quantificadas usando um ELISA de sanduíche de Ig humana genérica. Uma placa MaxiSorp de 384 poços foi revestida durante a noite com policlonal de burro anti-huFc 1 µg/mL (Jackson Immunoresearch). Após a incubação com plasma diluído ou lisado de cérebro NP-40, um anticorpo de burro anti-huFc conjugado com HRP (Jackson Immunoresearch) foi adicionado como o reagente de detecção. As curvas padrão para cada molécula individual, de 2 nM a 2,7 pM usando diluições de 3 vezes, foram ajustadas usando uma regressão logística de cinco parâmetros. As propriedades farmacocinéticas dos construtos 28, 46, 62 e 75-77 são mostradas nas FIGURAS 7A-7I. ELISA de IgG humana, captura de antígeno BACE1 e ELISAs de captura de antígeno Tau
[00357] As concentrações de anticorpos no plasma de camundongo foram quantificadas usando três formatos de ELISA em sanduíche: anti- huFc, captura de antígeno BACE1 e captura de antígeno Tau. Uma placa MaxiSorp de 384 poços foi revestida durante a noite com 1 µg/mL de policlonal de burro anti-huFc (Jackson Immunoresearch), 2 µg/mL de huBACE1 (R&D Systems) ou 1 µg/mL de huTau recombinante. Tau (r- tau) recombinante de comprimento total (441 aminoácidos) foi produzida em células de E. coli BL21 (DE3) por CEPTER Biopartners. r-tau foi originalmente produzido com uma etiqueta His6-Smt3 ("His6" descrita como SEQ ID Nº: 575) que foi clivada e removida durante a purificação.
[00358] Após a incubação com plasma diluído, todos os formatos de ELISA usaram um anticorpo de burro anti-huFc conjugado com HRP (Jackson Immunoresearch) como reagente de detecção. As curvas padrão para cada molécula individual, de 4 nM a 0,97 pM usando diluições de 4 vezes, foram ajustadas usando uma regressão logística de cinco parâmetros. Os gráficos de correlação foram construídos no GraphPad Prism e o software usado para ajustar os dados usando regressão linear para calcular a inclinação junto com o coeficiente de correlação de Pearson. Como mostrado nas FIGURAS 4A e 4B, as fortes correlações entre a captura de antígeno BACE1 (FIGURAS 4C e 4D) e Tau (FIGURAS 4E e 4F) com a detecção de Fc indicaram que as moléculas estão amplamente intactas ao longo do curso de tempo farmacocinético. Exemplo 11. Estabilidade Térmica
[00359] As medições de espalhamento dinâmico de luz (DLS) foram coletadas por DynaPro Plate Reader III (Wyatt Technology). As amostras foram preparadas a 1,0 mg/mL em PBS a pH 7,4 e a temperatura foi continuamente elevada de 40°C a 80°C a uma taxa de 0,25°C/min. Cada medição foi coletada com 10 aquisições DLS com tempo de aquisição de 1 segundo. A potência do laser foi definida em 20%. Os dados foram analisados usando Dynamics V7.8.2.18 para determinar os valores Tonset e Tagg como mostrado na Tabela 21 abaixo. Tabela 21. Estabilidade térmica Construto T início (°C) T agg (°C) Construto 46 57,75 64,37 Construto 62 52,56 58,25 Construto 28 62,32 66,43 Clone35.23.4:1C7-1C7HCv2LCv8 63,11 66,10 Exemplo 12. Tratamento de anticorpos de células CHO-huAPP e quantificação de Aβ40 por ELISA
[00360] As células CHOK1-huAPP (15.000/poço) foram semeadas em placas de 96 poços tratadas com cultura de tecidos (Thermo Sci Nunclon Delta Surface) em 100 µL/poço de meio DMEM/F12 suplementado com 10% de FBS. Após o plaqueamento, as células se recuperaram durante a noite a 37°C com 5% de CO2. Para os tratamentos, os anticorpos foram primeiro diluídos em série em meio de 1000 a 0,06 nM (diluições de 4 vezes) e 1 µM, respectivamente. A mídia foi totalmente substituída por tratamento diluído de 100 µL com poços duplicados para cada condição. As células foram então mantidas a 37°C com 5% de CO2 durante 24 horas. Após o tratamento de 24 horas, o meio foi coletado para medição de Aβ40. As medições de Aβ1-40 humano (a partir de culturas de neurônios humanos) foram conduzidas de acordo com o kit Cisbio Aβ1-40 ELISA (Cisbio # 62B40PEG). O kit forneceu dois anticorpos anti-Aβ1-40 que atuam como um par de doador e receptor FRET: um anticorpo foi marcado com Eu3+-criptato (doador FRET) e o outro com XL-665 (receptor FRET). Ambos os anticorpos foram incubados com 5 µL de meio, colhidos de culturas de neurônios humanos e colocados em um PerkinElmer OptiPlate 384 por 24 horas a 4°C. A placa foi então lida e a concentração de Aβ1-40 foi calculada a partir de uma razão de 665 nm/620 nm.
[00361] Como mostrado nas FIGURAS 8A e 8B, todas as versões de 2H8 fundido com o Clone35.23.4: 1C7-1C7 reduziu o Aβ humano de uma forma dependente da dose em comparação com o controle não tratado. O controle IgG (Ab122) não teve efeito na redução de Aβ. Os gráficos de linha representam a média ± SEM, n = 2 experiências independentes. Exemplo 13. Quantificação de Aβ40 em camundongos PS19/TfRms/hu KI.
[00362] Camundongos PS19/TfRms/hu KI foram administrados sistemicamente uma vez através da veia da cauda a 50 mg/kg. Os cérebros foram extraídos após a perfusão e os hemicérebros foram isolados para homogeneização em 10x por peso de tecido de NP-40 a 1% em PBS (para PK) ou GuHCl 5 M (para PD).
[00363] Os níveis de Aβ40 de camundongo em lisado de cérebro e CSF foram medidos usando um ELISA em sanduíche. Uma placa MaxiSorp de 384 poços foi revestida durante a noite com um anticorpo de captura policlonal específico para o terminal C do peptídeo Aβ40 (Millipore # ABN240). Os lisados cerebrais de guanidina diluídos com caseína foram ainda diluídos 1:2 na placa ELISA e adicionados simultaneamente com o anticorpo de detecção, M3.2 biotinilado. CSF foi analisado a uma diluição de 1:20. As amostras foram incubadas durante a noite a 4°C antes da adição de estreptavidina-HRP seguida de substrato TMB. A curva padrão, 0,78 - 50 pg/mL msAβ40, foi ajustada usando uma regressão logística de quatro parâmetros. FIGURAS 9A- 9E mostram as quantificações de cérebro e CSF Aβ40 em camundongos PS19/hTfRms/hu KI após a injeção intravenosa do construto 28, 46, 62, 75, 76 ou 77. Os construtos reduziram o Aβ humano em comparação com o controle não tratado. O controle IgG (Ab122) não teve efeito na redução de Aβ.
[00364] As substituições de aminoácidos para cada clone descrito nas Tabelas (por exemplo, Tabela 9) ditam as substituições de aminoácidos nas posições de registro desse clone sobre os aminoácidos encontrados na sequência apresentada na Listagem de Sequências, em caso de discrepância.
[00365] Entende-se que os exemplos e modalidades no presente documento descritas são apenas para fins ilustrativos, e que várias modificações ou alterações a luz destas vão ser sugeridas para pessoas versadas na técnica e devem ser incluídas dentro do sentido e do alcance deste pedido e do escopo das reivindicações em anexo. As sequências dos números de acessão das sequências no presente documento citadas são no presente documento incorporadas por referência.
Tabela 22. Listagem de Sequência Informal
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Sequência Fc
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 1 humana de tipo
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS selvagem
DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV
DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Sequência de
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS domínio CH2,
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV 2 posições 231-
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 340 (numeração
K de índice EU) Sequência de GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI domínio CH3, 3 AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD posições 341- KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 447 (numeração de índice EU)
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone CH3C.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 4 (Clone
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.18.4)
DIAVEWESLGLVWVGYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV AKSTWQQGWVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone CH3C.2
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 5 (Clone
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.18.2)
DIAVEWESYGTVWSHYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV SKSEWQQGYVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone CH3C.3
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 6 (Clone
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.18.3)
DIAVEWESYGTEWSQYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV EKSDWQQGHVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone CH3C.4
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 7 (Clone
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.18.1)
DIAVEWESVGTPWALYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV LKSEWQQGWVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 8 Clone CH3C.17
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESYGTVWSKYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV SKSEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone CH3C.18
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 9 (Clone
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.18.1.18)
DIAVEWESLGHVWAVYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PKSTWQQGWVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 10 Clone CH3C.21
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESLGLVWVGYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PKSTWQQGWVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG 11 Clone CH3C.25
QPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESMGHVWVGYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKST WQQGWVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 12 Clone CH3C.34
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESLGLVWVFSKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PKSTWQQGWVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 13 Clone CH3C.35
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV TKSEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 14 Clone CH3C.44
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV SKSEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 15 Clone CH3C.51
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESLGHVWVGYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV SKSEWQQGWVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.3.1-3 16 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS (Clone DIAVEWESLGHVWVATKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV CH3C.18.3.1-3)
PKSTWQQGWVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.3.1-9 17 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS (Clone DIAVEWESLGPVWVHTKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV CH3C.18.3.1-9)
PKSTWQQGWVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.3.2-5 18 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS (Clone DIAVEWESLGHVWVDQKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV CH3C.18.3.2-5)
PKSTWQQGWVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.3.2-19
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 19 (Clone
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.18.3.2-
DIAVEWESLGHVWVNQKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV 19)
PKSTWQQGWVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.3.2-1 20 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS (Clone DIAVEWESLGHVWVNFKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV CH3C.18.3.2-1)
PKSTWQQGWVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG CH3C.18.E153 21
QPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV W WWESLGHVWAVYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPKS (CH3C.35.13)
TWQQGWVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 22 CH3C.18.K165
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS Q (CH3C.35.14)
DIAVEWESLGHVWAVYQTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PKSTWQQGWVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS CH3C.18.E153
VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP 23 W.
REPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVW K165Q
WESLGHVWAVYQTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPKST (CH3C.35.15)
WQQGWVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.E153 24
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS W DIAVWWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT (CH3C.35.19)
VTKSEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 25 CH3C.35.S188
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS E (CH3C.35.20)
DIAVEWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.E153
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 26 W.
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS S188E
DIAVWWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT (CH3C.35.21)
VTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 27 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.N163
DIAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV TKSEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 28 CH3C.35.K165
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS Q DIAVEWESYGTEWSSYQTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV TKSEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 29 CH3C.35.N163.
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS K165Q
DIAVEWESYGTEWSNYQTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV TKSEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 30 Clone CH3B.1
KGQPRFDYVTTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYGFHDLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 31 Clone CH3B.2
KGQPRFDMVTTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYGFHDLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 32 Clone CH3B.3
KGQPRFEYVTTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYGFHDLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 33 Clone CH3B.4
KGQPRFEMVTTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYGFHDLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 34 Clone CH3B.5
KGQPRFELVTTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYGFHDLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 35 Clone CH3B.6
KGQPRFEIVTTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYGFHDLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 36 Clone CH3B.7
KGQPRFDIVTTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYGFHDLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 37 Clone CH3B.8
KGQPRFDYVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYGFHDLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 38 Clone CH3B.9
KGQPRFGMVTTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYGFHDLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 39 Clone CH3B.10
KGQPRFADVTILPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYGFYDLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 40 Clone CH3B.11
KGQPRFGLVTTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYGFHDLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 41 Clone CH3B.12
KGQPRFDYVTTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYGFSDLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 42 Clone CH3B.13
KGQPRIDYVTTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYGFSDLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 43 Clone CH3B.14
KGQPRFKDVTILPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYGFFDLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 44 Clone CH3B.15
KGQPRFDLVTILPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYGFYDLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 45 Clone CH3B.16
KGQPRIDYVTTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYGFSDLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 46 Clone CH3B.17
KGQPRFELVATLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYGFHDLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVEFIWYVDGVDVRYEWQLPREEQYNSTYRVV
SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK 47 Clone CH2A2.1
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVGFVWYVDGVPVSWEWYWPREEQYNSTYRVV
SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ 48 Clone CH2A2.2
PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVQFDWYVDGVMVRREWHRPREEQYNSTYRVV
SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG 49 Clone CH2A2.3
QPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVSFEWYVDGVPVRWEWQWPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG 50 Clone CH2A2.4
QPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVAFTWYVDGVPVRWEWQNPREEQYNSTYRVV
SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ 51 Clone CH2A2.5
PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVNFDWYVDGVLVRREWHRPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 52 Clone CH2A2.6
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVQFVWYVDGVAVRWEWIRPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 53 Clone CH2A2.7
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVEFIWYVDGVEVAWEWFWPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 54 Clone CH2A2.8
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVGFAWYVDGVNVRVEWQYPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 55 Clone CH2A2.9
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVGFVWYVDGVEVRREWVRPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 56 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH2A2.10
DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVSFDWYVDGVLVRREWQRPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 57 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH2A2.11
DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVEFTWYVDGVDVRYEWYYPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 58 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH2A2.12
DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVQFTWYVDGVDVRYEWVRPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 59 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH2A2.13
DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVQFYWYVDGVNVRREWHRPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 60 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH2A2.14
DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVYFDWYVDGVMVRREWHRPREEQYNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG Clone 61 QPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA CH2A2.15
VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVWFEWYVDGVFVGVAYDVPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 62 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH2A2.16
DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDPQ TPPWEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEEYYTYYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 63 Clone CH2C.1
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDPP SPPWEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEEYYSNYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 64 Clone CH2C.2
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDPQ TPPWEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEEYYSNYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 65 Clone CH2C.3
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDFR GPPWEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEEYYHDYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 66 Clone CH2C.4
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDPQ TVPWEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEEYYSNYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 67 Clone CH2C.5
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDPK MPPWEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEEYYTYYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 68 Clone CH2C.6
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDPP VPPWEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEEYYSNYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 69 Clone CH2C.7
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDPA FPPWEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEEYYQNYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 70 Clone CH2C.8
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDAIW PPWEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEEYYSNYRVV
SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK 71 Clone CH2C.9
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDPP VAPWEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEEYYSSYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 72 Clone CH2C.10
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDPQ MPPQEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEEYYSNYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 73 Clone CH2C.11
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDPQ TAPWEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEEYYTYYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 74 Clone CH2C.12
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDPQ TPPQEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEEYYSNYRVV
SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK 75 Clone CH2C.13
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDPQ TPPWEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEEYYTYYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 76 Clone CH2C.14
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDPR VPPWEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEEYYQNYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 77 Clone CH2C.15
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDPS VPPWEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEEYYSNYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 78 Clone CH2C.16
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDML WPVPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEVYHRPYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 79 Clone CH2C.17
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDML WPVPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREETYHNPYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 80 Clone CH2C.18
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDME WPVTEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREETYHNPYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 81 Clone CH2C.19
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDML WPVPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREETYHHPYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 82 Clone CH2C.20
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDDD LTFQEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEVYVTPYRVV
SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK 83 Clone CH2C.21
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDDD LTFQEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREELYVTPYRVV
SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK 84 Clone CH2C.22
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDAY GDPEEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEWYDVPYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 85 Clone CH2C.23
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS VPPRMVKFNWYVDGVEVHNAKTKSLTSQHNSTVRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 86 Clone CH2D.1
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS VPPWMVKFNWYVDGVEVHNAKTKSLTSQHNSTVRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 87 Clone CH2D.2
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS DMWEYVKFNWYVDGVEVHNAKTKPWVKQLNSTWRVV
SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG 88 Clone CH2D.3
QPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS DDWTWVKFNWYVDGVEVHNAKTKPWIAQPNSTWRVV
SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG 89 Clone CH2D.4
QPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS DDWEWVKFNWYVDGVEVHNAKTKPWKLQLNSTWR
VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK 90 Clone CH2D.5
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPWVWFYWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCSVVNIALWWSIEKTISKA 91 Clone CH2E3.1
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPVVGFRWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCRVSNSALTWKIEKTISKA 92 Clone CH2E3.2
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPVVGFRWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCRVSNSALSWRIEKTISKA 93 Clone CH2E3.3
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPIVGFRWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV
SVLTVLHQDWLNGKEYKCRVSNSALRWRIEKTISKAK 94 Clone CH2E3.4
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPAVGFEWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS
VLTVLHQDWLNGKEYKCQVFNWALDWVIEKTISKAKGQ 95 Clone CH2E3.5
PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
NSVIIVDKNGRLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKLVH
ANFGTKKDFEDLYTPVNGSIVIVRAGKITFAEKVANAE Domínio apical 96 SLNAIGVLIYMDQTKFPIVNAELSFFGHAHLGTGDPYT TfR humano
PGFPSFNHTQFPPSRSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFG NMEGDCPSDWKTDSTCRMVTSESKNVKLTVS
NSVIIVDKNGGLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKLVH ANFGTKKDFEDLDSPVNGSIVIVRAGKITFAEKVANAE Domínio apical 97 SLNAIGVLIYMDQTKFPIVKADLSFFGHAHLGTGDPYT TfR PGFPSFNHTQFPPSQSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFG Cynomolgus
NMEGDCPSDWKTDSTCKMVTSENKSVKLTVS SSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGNMEGDCPSDWKTDST Domínio apical CRMVTSESKNVKLTVSNDSAQNSVIIVDKNGRLVYLV TfR humano 98 ENPGGYVAYSKAATVTGKLVHANFGTKKDFEDLYTP truncado em VNGSIVIVRAGKITFAEKVANAESLNAIGVLIYMDQTKF alça exibida no PIVNAELSGP fago Domínio apical
SSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGNMEGDCPSDWKTDST TfR
CKMVTSENKSVKLTVSNDSAQNSVIIVDKNGGLVYLV Cynomolgus 99 ENPGGYVAYSKAATVTGKLVHANFGTKKDFEDLDSP truncado em
VNGSIVIVRAGKITFAEKVANAESLNAIGVLIYMDQTKF alça exibida no
PIVKADLSGP fago
SEQ ID Sequência Descrição Nº
MMDQARSAFSNLFGGEPLSYTRFSLARQVDGDNSH VEMKLAVDEEENADNNTKANVTKPKRCSGSICYGTIA VIVFFLIGFMIGYLGYCKGVEPKTECERLAGTESPVRE EPGEDFPAARRLYWDDLKRKLSEKLDSTDFTGTIKLL NENSYVPREAGSQKDENLALYVENQFREFKLSKVWR DQHFVKIQVKDSAQNSVIIVDKNGRLVYLVENPGGYV AYSKAATVTGKLVHANFGTKKDFEDLYTPVNGSIVIVR AGKITFAEKVANAESLNAIGVLIYMDQTKFPIVNAELSF
FGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSRSSGLPNIPV Proteína 1
QTISRAAAEKLFGNMEGDCPSDWKTDSTCRMVTSES receptora de 100 KNVKLTVSNVLKEIKILNIFGVIKGFVEPDHYVVVGAQR transferrina
DAWGPGAAKSGVGTALLLKLAQMFSDMVLKDGFQP humana (TFR1)
SRSIIFASWSAGDFGSVGATEWLEGYLSSLHLKAFTYI NLDKAVLGTSNFKVSASPLLYTLIEKTMQNVKHPVTG QFLYQDSNWASKVEKLTLDNAAFPFLAYSGIPAVSFC FCEDTDYPYLGTTMDTYKELIERIPELNKVARAAAEVA GQFVIKLTHDVELNLDYERYNSQLLSFVRDLNQYRAD IKEMGLSLQWLYSARGDFFRATSRLTTDFGNAEKTD RFVMKKLNDRVMRVEYHFLSPYVSPKESPFRHVFWG SGSHTLPALLENLKLRKQNNGAFNETLFRNQLALATW TIQGAANALSGDVWDIDNEF APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 101 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.19
DIAVWWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VTKSEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 102 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.20
DIAVEWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 103 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.21
DIAVWWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 104 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.22
DIAVWWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VTKSEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 105 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.23
DIAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 106 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.24
DIAVWWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP Variante 107 REPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVW CH3C.18
WESLGHVWAVYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPKST WQQGWVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Variante 108 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.18
DIAVLWESLGHVWAVYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PKSTWQQGWVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Variante 109 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.18
DIAVYWESLGHVWAVYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PKSTWQQGWVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Variante 110 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.18
DIAVEWESLGHVWAVYQTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PKSTWQQGWVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Variante 111 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.18
DIAVEWESLGHVWAVYFTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PKSTWQQGWVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Variante 112 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.18
DIAVEWESLGHVWAVYHTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PKSTWQQGWVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 113 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.21.1
DIAVLWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV TKSEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 114 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.21.2
DIAVLWESYGTEWSSYRTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV TKSEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 115 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.21.3
DIAVLWESYGTEWSSYRTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV TREEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 116 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.21.4
DIAVLWESYGTEWSSYRTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV TGEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 117 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.21.5
DIAVLWESYGTEWSSYRTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV TREEWQQGFVFSCWVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 118 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.21.6
DIAVLWESYGTEWSSYRTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV TKEEWQQGFVFSCWVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 119 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.21.7
DIAVLWESYGTEWSSYRTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV TREEWQQGFVFTCWVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 120 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.21.8
DIAVLWESYGTEWSSYRTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV TREEWQQGFVFTCGVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 121 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.21.9
DIAVLWESYGTEWSSYRTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV TREEWQQGFVFECWVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 122 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.21.10
DIAVLWESYGTEWSSYRTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV TREEWQQGFVFKCWVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 123 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.21.11
DIAVLWESYGTEWSSYRTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV TPEEWQQGFVFKCWVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP Clone 124 REPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVW CH3C.35.21.12
WESYGTEWSSYRTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVTREE WQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG Clone 125 QPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV CH3C.35.21.13
WWESYGTEWSSYRTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVTGE EWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK Clone 126 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA CH3C.35.21.14
VWWESYGTEWSSYRTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVTR EEWQQGFVFTCWVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ Clone 127 PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV CH3C.35.21.15
WWESYGTEWSSYRTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVTGE EWQQGFVFTCWVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP Clone 128 REPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVW CH3C.35.21.16
WESYGTEWSSYRTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVTREE WQQGFVFTCGVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 129 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.21.17
DIAVLWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 130 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.21.18
DIAVLWESYGTEWSSYRTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 131 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.20.1
DIAVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 132 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.20.2
DIAVEWESYGTEWASYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 133 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.20.3
DIAVEWESYGTEWVSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 134 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.20.4
DIAVEWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV SKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 135 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.20.5
DIAVEWESFGTEWASYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 136 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.20.6
DIAVEWESFGTEWVSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 137 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C35.21.a.1
DIAVWWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 138 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.21.a.2
DIAVWWESYGTEWASYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 139 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.21.a.3
DIAVWWESYGTEWVSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG Clone 140 QPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV CH3C.35.21.a.4
WWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSKE EWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 141 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.21.a.5
DIAVWWESFGTEWASYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 142 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.21.a.6
DIAVWWESFGTEWVSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 143 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.23.1
DIAVEWESFGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 144 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.23.2
DIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 145 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.23.3
DIAVEWESYGTEWVNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 146 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.23.4
DIAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV SKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 147 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.23.5
DIAVEWESFGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 148 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.23.6
DIAVEWESFGTEWVNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 149 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.24.1
DIAVWWESFGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 150 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.24.2
DIAVWWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 151 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.24.3
DIAVWWESYGTEWVNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP Clone 152 REPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVW CH3C.35.24.4
WESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSKEE WQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 153 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.24.5
DIAVWWESFGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 154 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.24.6
DIAVWWESFGTEWVNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 155 CH3C.35.21.17.
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS 1
DIAVLWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 156 CH3C.35.21.17.
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS 2
DIAVLWESYGTEWASYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 157 CH3C.35.21.17.
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS 3
DIAVLWESYGTEWVSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 158 CH3C.35.21.17.
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS 4
DIAVLWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV SKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 159 CH3C.35.21.17.
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS 5
DIAVLWESFGTEWASYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 160 CH3C.35.21.17.
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS 6
DIAVLWESFGTEWVSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 161 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.N390
DIAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV TKSEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG Clone 162 QPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV CH3C.35.16
WWESLGHVWVNQKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPKS TWQQGWVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP Clone 163 REPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE CH3C.35.17
WESLGHVWVNQQTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPKST WQQGWVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK Clone 164 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA CH3C.35.18
VWWESLGHVWVNQQTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVP
KSTWQQGWVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Clone
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS CH3C.35.8
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV (Clone
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 165 CH3C.35.20
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS com
DIAVEWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV mutaçõesYTE e
TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK LALAPG)
SEQ ID Sequência Descrição Nº Clone
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS CH3C.35.9
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV (Clone
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 166 CH3C.35.21
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS com
DIAVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV mutaçõesYTE e
TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK LALAPG)
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.20.1 167 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS com mutação DIAVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV de botão
TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.20.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 168 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão e
DIAVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV LALA TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.20.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 169 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão e
DIAVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV LALAPG TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV Clone SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK CH3C.35.20.1 170 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSD com mutações IAVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVT de botão e YTE
KEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.20.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 171 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão, LALA
DIAVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV e YTE
TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.20.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 172 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão,
DIAVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV LALAPG e YTE
TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.20.1 173 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS com mutações DIAVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV de furo
TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.20.1 174 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS com mutações DIAVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV de furo e LALA
TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.20.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 175 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo e
DIAVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV LALAPG TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV Clone SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK CH3C.35.20.1 176 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDI com mutações AVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVT de furo e YTE
KEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.20.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 177 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo, LALA e
DIAVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV YTE TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.20.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 178 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo,
DIAVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV LALAPG e YTE
TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.23.2 179 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS com mutação DIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV de botão
TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.2
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 180 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão e
DIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV LALA TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.2
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 181 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão e
DIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV LALAPG TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV Clone SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK CH3C.35.23.2 182 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSD com mutações IAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVT de botão e YTE
KEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.2
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 183 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão, LALA
DIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV e YTE
TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.2
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 184 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão,
DIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV LALAPG e YTE
TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.23.2 185 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS com mutações DIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV de furo
TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.23.2 186 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS com mutações DIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV de furo e LALA
TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.2
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 187 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo e
DIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV LALAPG TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV Clone SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK CH3C.35.23.2 188 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDI com mutações AVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVT de furo e YTE
KEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.2
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 189 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo, LALA e
DIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV YTE TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.2
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 190 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo,
DIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV LALAPG e YTE
TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.23.3 191 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS com mutação DIAVEWESYGTEWVNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV de botão
TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.3
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 192 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão e
DIAVEWESYGTEWVNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV LALA TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.3
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 193 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão e
DIAVEWESYGTEWVNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV LALAPG TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV Clone SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK CH3C.35.23.3 194 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSD com mutações IAVEWESYGTEWVNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVT de botão e YTE
KEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.3
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 195 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão, LALA
DIAVEWESYGTEWVNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV e YTE
TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.3
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 196 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão,
DIAVEWESYGTEWVNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV LALAPG e YTE
TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.23.3 197 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS com mutações DIAVEWESYGTEWVNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV de furo
TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.23.3 198 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS com mutações DIAVEWESYGTEWVNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV de furo e LALA
TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.3
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 199 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo e
DIAVEWESYGTEWVNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV LALAPG TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV Clone SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK CH3C.35.23.3 200 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDI com mutações AVEWESYGTEWVNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVT de furo e YTE
KEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.3
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 201 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo LALA e
DIAVEWESYGTEWVNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV YTE TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.3
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 202 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo,
DIAVEWESYGTEWVNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV LALAPG e YTE
TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.23.4 203 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS com mutação DIAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV de botão
SKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.4
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 204 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão e
DIAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV LALA SKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.4
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 205 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão e
DIAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV LALAPG SKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV Clone SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK CH3C.35.23.4 206 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSD com mutações IAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVS de botão e YTE
KEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.4
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 207 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão, LALA
DIAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV e YTE
SKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.4
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 208 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão,
DIAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV LALAPG e YTE
SKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.23.4 209 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS com mutações DIAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV de furo
SKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.23.4 210 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS com mutações DIAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV de furo e LALA
SKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.4
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 211 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo e
DIAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV LALAPG SKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV Clone SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK CH3C.35.23.4 212 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDI com mutações AVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVS de furo e YTE
KEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.4
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 213 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo, LALA e
DIAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV YTE SKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.4
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 214 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo,
DIAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV LALAPG e YTE
SKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.21.17. 215 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS 2 com mutação DIAVLWESYGTEWASYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV de botão
TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.21.17.
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 216 2 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão e
DIAVLWESYGTEWASYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV LALA TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.21.17.
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 217 2 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão e
DIAVLWESYGTEWASYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV LALAPG TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV Clone SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK CH3C.35.21.17. 218 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSD 2 com mutações IAVLWESYGTEWASYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVT de botão e YTE
KEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.21.17.
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 219 2 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão, LALA
DIAVLWESYGTEWASYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV e YTE
TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.21.17.
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 220 2 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão,
DIAVLWESYGTEWASYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV LALAPG e YTE
TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.21.17. 221 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS 2 com mutações DIAVLWESYGTEWASYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV de buraco
TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.21.17. 222 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS 2 com mutações DIAVLWESYGTEWASYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV de furo e LALA
TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.21.17.
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 223 2 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo e
DIAVLWESYGTEWASYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV LALAPG TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV Clone SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK CH3C.35.21.17. 224 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDI 2 com mutações AVLWESYGTEWASYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVTK de furo e YTE
EEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.21.17.
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 225 2 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo, LALA e
DIAVLWESYGTEWASYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV YTE TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.21.17.
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 226 2 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo,
DIAVLWESYGTEWASYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV LALAPG e YTE
TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.23 227 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS com mutação DIAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV de botão
TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 228 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão e
DIAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV LALA TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 229 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão e
DIAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV LALAPG TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV Clone SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK CH3C.35.23 230 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSD com mutações IAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVT de botão e YTE
KEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 231 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão, LALA
DIAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV e YTE
TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 232 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão,
DIAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV LALAPG e YTE
TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.23 233 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS com mutações DIAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV de furo
TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.23 234 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS com mutações DIAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV de furo e LALA
TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 235 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo e
DIAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV LALAPG TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV Clone SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK CH3C.35.23 236 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDI com mutações AVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVT de furo e YTE
KEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 237 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo, LALA e
DIAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV YTE TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 238 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo,
DIAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV LALAPG e YTE
TKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS Clone
VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP 239 CH3C.18.3.4-1
REPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE (CH3C.3.4-1)
WESWGFVWSTYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPKSN WQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG CH3C.18.3.4-19 240 QPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV Variante EWESWGHVWSTYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPKS (CH3C.3.4-19)
NWQQGYVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.18.3.2-3 241 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS Variante DIAVEWESLGHVWVEQKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV (CH3C.3.2-3)
PKSTWQQGWVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.18.3.2-14 242 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS Variante DIAVEWESLGHVWVGVKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV (CH3C.3.2-14)
PKSTWQQGWVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.18.3.2-24 243 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS Variante DIAVEWESLGHVWVHTKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV (CH3C.3.2-24)
PKSTWQQGWVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS Clone VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP CH3C.18.3.4-26 244 REPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE Variante WESWGTVWGTYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPKSN (CH3C.3.4-26)
WQQGYVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.18.3.2-17 245 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS Variante DIAVEWESLGHVWVGTKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV (CH3C.3.2-17)
PKSTWQQGWVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 246 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.20.1.1
DIAVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV SKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 247 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.23.2.1
DIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV SKSEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 248 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.23.1.1
DIAVEWESFGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV SKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 249 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.S413
DIAVEWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV SKSEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 250 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.23.3.1
DIAVEWESYGTEWVNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV SKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 251 CH3C.35.N390.
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS 1
DIAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV SKSEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA Clone 252 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS CH3C.35.23.6.1
DIAVEWESFGTEWVNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV SKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.21 253 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS com mutação DIAVWWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT de botão
VTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.21
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 254 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão e
DIAVWWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT LALA VTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.21
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 255 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão e
DIAVWWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT LALAPG VTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV Clone SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK CH3C.35.21 256 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSD com mutações IAVWWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVT de botão e YTE
KEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.21
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 257 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão, LALA
DIAVWWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT e YTE
VTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.21
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 258 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão,
DIAVWWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT LALAPG e YTE
VTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.21 259 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS com mutações DIAVWWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLT de furo
VTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.21 260 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS com mutações DIAVWWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLT de furo e LALA
VTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.21
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 261 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo e
DIAVWWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLT LALAPG VTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV Clone SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK CH3C.35.21 262 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDI com mutações AVWWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVT de furo e YTE
KEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.21
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 263 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo, LALA e
DIAVWWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLT YTE VTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.21
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 264 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo,
DIAVWWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLT LALAPG e YTE
VTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.20.1.1 265 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS com mutação DIAVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV de botão
SKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.20.1.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 266 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão e
DIAVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV LALA SKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.20.1.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 267 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão e
DIAVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV LALAPG SKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV Clone SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK CH3C.35.20.1.1 268 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSD com mutações IAVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVS de botão e YTE
KEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.20.1.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 269 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão, LALA
DIAVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV e YTE
SKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.20.1.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 270 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão,
DIAVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV LALAPG e YTE
SKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.20.1.1 271 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS com mutações DIAVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV de furo
SKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.20.1.1 272 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS com mutações DIAVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV de furo e LALA
SKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.20.1.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 273 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo e
DIAVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV LALAPG SKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV Clone SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK CH3C.35.20.1.1 274 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDI com mutações AVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVS de furo e YTE
KEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.20.1.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 275 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo, LALA e
DIAVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV YTE SKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.20.1.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 276 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo,
DIAVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV LALAPG e YTE
SKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.23.2.1 277 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS com mutação DIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV de botão
SKSEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.2.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 278 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão e
DIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV LALA SKSEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.2.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 279 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão e
DIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV LALAPG SKSEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV Clone SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK CH3C.35.23.2.1 280 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSD com mutações IAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVS de botão e YTE
KSEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.2.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 281 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão, LALA
DIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV e YTE
SKSEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.2.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 282 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão,
DIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV LALAPG e YTE
SKSEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.23.2.1 283 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS com mutações DIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV de furo
SKSEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.23.2.1 284 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS com mutações DIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV de furo e LALA
SKSEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.2.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 285 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo e
DIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV LALAPG SKSEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV Clone SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK CH3C.35.23.2.1 286 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDI com mutações AVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVS de furo e YTE
KSEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.2.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 287 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo, LALA e
DIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV YTE SKSEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.2.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 288 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo,
DIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV LALAPG e YTE
SKSEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.23.1.1 289 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS com mutação DIAVEWESFGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV de botão
SKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.1.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 290 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão e
DIAVEWESFGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV LALA SKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.1.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 291 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão e
DIAVEWESFGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV LALAPG SKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV Clone SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK CH3C.35.23.1.1 292 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSD com mutações IAVEWESFGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVS de botão e YTE
KEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.1.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 293 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão, LALA
DIAVEWESFGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV e YTE
SKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.1.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 294 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão,
DIAVEWESFGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV LALAPG e YTE
SKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.23.1.1 295 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS com mutações DIAVEWESFGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV de furo
SKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.23.1.1 296 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS com mutações DIAVEWESFGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV de furo e LALA
SKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.1.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 297 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo e
DIAVEWESFGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV LALAPG SKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV Clone SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK CH3C.35.23.1.1 298 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDI com mutações AVEWESFGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVS de furo e YTE
KEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.1.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 299 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo, LALA e
DIAVEWESFGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV YTE SKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.1.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 300 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo,
DIAVEWESFGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV LALAPG e YTE
SKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.20.1 301 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS Mutações DIAVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV M428L e N434S
TKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.20.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 302 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão M428L
DIAVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV e N434S
TKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.20.1 VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA com mutações 303 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão, LALA DIAVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV e M428L e TKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK N434S APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.20.1 VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA com mutações 304 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão, DIAVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV LALAPG e TKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK M428L e N434S
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.20.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 305 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo M428L e
DIAVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV N434S
TKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.20.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 306 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo, LALA e
DIAVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV M428L e N434S
TKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.20.1 VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA com mutações 307 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo, DIAVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV LALAPG e TKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK M428L e N434S
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.23.2 308 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS com mutações DIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV M428L e N434S
TKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.2
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 309 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão M428L
DIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV e N434S
TKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.2 VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA com mutações 310 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão, LALA DIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV e M428L e TKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK N434S
SEQ ID Sequência Descrição Nº APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.2 VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA com mutações 311 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão, DIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV LALAPG e TKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK M428L e N434S
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.2
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 312 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo M428L e
DIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV N434S
TKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.2
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 313 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo, LALA e
DIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV M428L e N434S
TKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.2 VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA com mutações 314 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo, DIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV LALAPG e TKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK M428L e N434S
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.23.3 315 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS com mutações DIAVEWESYGTEWVNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV M428L e N434S
TKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.3
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 316 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão M428L
DIAVEWESYGTEWVNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV e N434S
TKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.3 VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA com mutações 317 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão, LALA DIAVEWESYGTEWVNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV e M428L e TKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK N434S APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.3 VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA com mutações 318 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão, DIAVEWESYGTEWVNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV LALAPG e TKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK M428L e N434S
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.3
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 319 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo M428L e
DIAVEWESYGTEWVNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV N434S
TKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.3
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 320 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo, LALA e
DIAVEWESYGTEWVNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV M428L e N434S
TKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.3 VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA com mutações 321 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo, DIAVEWESYGTEWVNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV LALAPG e TKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK M428L e N434S
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.23.4 322 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS com mutações DIAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV M428L e N434S
SKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.4
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 323 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão e
DIAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV M428L e N434S
SKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.4 VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA com mutações 324 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão, LALA DIAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV e M428L e SKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK N434S APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.4 VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA com mutações 325 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão, DIAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV LALAPG e SKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK M428L e N434S
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.4
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 326 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo e M428L
DIAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV e N434S
SKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.4
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 327 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo, LALA e
DIAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV M428L e N434S
SKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.4 VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA com mutações 328 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo, DIAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV LALAPG e SKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK M428L e N434S
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.21.17. 329 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS 2 com mutações DIAVLWESYGTEWASYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV M428L e N434S
TKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.21.17.
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 330 2 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão M428L
DIAVLWESYGTEWASYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV e N434S
TKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.21.17. VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 2 com mutações 331 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão, LALA DIAVLWESYGTEWASYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV e M428L e TKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK N434S APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.21.17. VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 2 com mutações 332 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão, DIAVLWESYGTEWASYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV LALAPG, e TKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK M428L e N434S
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.21.17.
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 333 2 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo M428L e
DIAVLWESYGTEWASYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV N434S
TKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.21.17.
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 334 2 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo, LALA e
DIAVLWESYGTEWASYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV M428L e N434S
TKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.21.17. VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA 2 com mutações 335 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo, DIAVLWESYGTEWASYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV LALAPG, e TKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK M428L e N434S
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.23 336 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS com mutações DIAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV M428L e N434S
TKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 337 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão e
DIAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV M428L e N434S
TKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23 VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA com mutações 338 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão, LALA DIAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV e M428L e TKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK N434S APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23 VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA com mutações 339 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão, DIAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV LALAPG e TKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK M428L e N434S
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 340 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo e M428L
DIAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV e N434S
TKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 341 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo, LALA e
DIAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV M428L e N434S
TKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23 VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA com mutações 342 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo, DIAVEWESYGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV LALAPG e TKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK M428L e N434S
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.21 343 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS com mutações DIAVWWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT M428L e N434S
VTKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.21
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 344 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão e
DIAVWWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT M428L e N434S
VTKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.21 VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA com mutações 345 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão, LALA DIAVWWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT e M428L e VTKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK N434S
SEQ ID Sequência Descrição Nº APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.21 VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA com mutações 346 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão, DIAVWWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT LALAPG e VTKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK M428L e N434S
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.21
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 347 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo e M428L
DIAVWWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLT e N434S
VTKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.21
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 348 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo, LALA e
DIAVWWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLT M428L e N434S
VTKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.21 VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA com mutações 349 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo, DIAVWWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLT LALAPG e VTKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK M428L e N434S
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.20.1.1 350 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS com mutações DIAVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV M428L e N434S
SKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.20.1.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 351 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão M428L
DIAVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV e N434S
SKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.20.1.1 VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA com mutações 352 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão, LALA DIAVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV e M428L e SKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK N434S APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.20.1.1 VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA com mutações 353 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão, DIAVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV LALAPG e SKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK M428L e N434S
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.20.1.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 354 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo M428L e
DIAVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV N434S
SKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.20.1.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 355 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo, LALA e
DIAVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV M428L e N434S
SKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.20.1.1 VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA com mutações 356 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo, DIAVEWESFGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV LALAPG e SKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK M428L e N434S
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.23.2.1 357 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS com mutações DIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV M428L e N434S
SKSEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.2.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 358 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão M428L
DIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV e N434S
SKSEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.2.1 VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA com mutações 359 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão, LALA DIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV e M428L e SKSEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK N434S APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.2.1 VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA com mutações 360 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão, DIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV LALAPG e SKSEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK M428L e N434S
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.2.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 361 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo M428L e
DIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV N434S
SKSEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.2.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 362 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo, LALA e
DIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV M428L e N434S
SKSEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.2.1 VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA com mutações 363 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo, DIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV LALAPG e SKSEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK M428L e N434S
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Clone VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA CH3C.35.23.1.1 364 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS com mutações DIAVEWESFGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV M428L e N434S
SKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.1.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 365 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão e
DIAVEWESFGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV M428L e N434S
SKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.1.1 VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA com mutações 366 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão, LALA, DIAVEWESFGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV e M428L e SKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK N434S APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.1.1 VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA com mutações 367 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão, DIAVEWESFGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV LALAPG e SKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK M428L e N434S
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.1.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 368 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo e M428L
DIAVEWESFGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV e N434S
SKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.1.1
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 369 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo, LALA e
DIAVEWESFGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV M428L e N434S
SKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Clone HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CH3C.35.23.1.1 VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA com mutações 370 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo, DIAVEWESFGTEWSNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV LALAPG e SKEEWQQGFVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK M428L e N434S
SEQ ID Sequência Descrição Nº Sequência de 371 GGGGS Ligante Sequência de 372 GGGGSGGGGS Ligante Sequência de 373 GGGGSGGGGSGGGGS Ligante Sequência de 374 RTVAGGGGSGGGGSGGGGS Ligante Sequência de 375 ASTKGGGGSGGGGSGGGGS Ligante Sequência de aminoácidos de 376 EPKSCDKTHTCPPCP dobradiça de IgG1 humana
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Sequência Fc
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 377 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo
DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Sequência Fc
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 378 com mutações
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo e LALA
DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSH
EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV Sequência Fc
SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK 379 com mutações
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDI de furo e YTE
AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Sequência Fc VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA com mutações 380 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo, LALA e
DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV YTE DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Sequência Fc VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA com mutações 381 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo e M428L DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV e N434S
DKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Sequência Fc VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA com mutações 382 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS de furo, LALA, e DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV M428L e N434S
DKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Sequência Fc
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 383 com mutação
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão
DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Sequência Fc VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA com mutações 384 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão e
DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV LALA DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSH
EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV Sequência Fc
SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK 385 com mutações
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSD de botão e YTE
IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Sequência Fc VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA com mutações 386 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botão, LALA DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV e YTE
DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV Sequência Fc VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA com mutações 387 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS de botãoe DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV M428L e N434S
DKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS Sequência Fc
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV com mutações
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA 388 de botão, LALA,
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS e M428L e
DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV N434S
DKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Sequência Descrição Nº Sequência de 389 GGGGSGGGGSGGGG Ligante Sequência de 390 RTVAGGGGSGGGGSGGGGS Ligante Sequência de 391 ASTKGGGGSGGGGSGGGGS Ligante Inserto de AQNSVIIVDKNGRLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKL domínio apical VHANFGTKKDFEDLYTPVNGSIVIVRAGKITFAEKVAN de proteína 392 AESLNAIGVLIYMDQTKFPIVNAELSFFGHAHLGTGDP receptora de YTPGFPSFNHTQFPPSRSSGLPNIPVQTISRAAAEKLF transferrina GNMEGDCPSDWKTDSTCRMVTSESKNVKLTVSN humana 1 (TFR1) Domínio apical de Macaca mulatta (macaco rhesus) TfR
AQNSVIIVDKNGGLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKL (NCBI
VHANFGTKKDFEDLDSPVNGSIVIVRAGKITFAEKVAN Reference 393 AESLNAIGVLIYMDQTKFPIVKADLSFFGHAHLGTGDP Sequence
YTPGFPSFNHTQFPPSQSSGLPNIPVQTISRAAAEKLF NP_001244232.
GNMEGDCPSDWKTDSTCKMVTSENKSVKLTVSN 1); tem 95% de identidade com o domínio apical do TfR humano nativo
SEQ ID Sequência Descrição Nº
Domínio apical do chimpanzé TfR (NCBI AQNSVIIVDKNGSLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKL Reference VHANFGTKKDFEDLHTPVNGSIVIVRAGKITFAEKVAN Sequence 394 AESLNAIGVLIYMDQTKFPIVNAELSFFGHAHLGTGDP XP_003310238. YTPGFPSFNHTQFPPSRSSGLPNIPVQTVSRAAAEKL 1); é 98% FGNMEGDCPSDWKTDSTCRMVTSESKNVKLTVSN idêntico ao domínio apical do TfR humano nativo
Domínio apical de Macaca fascicularis (macaco AQNSVIIVDKNGGLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKL cynomolgous) VHANFGTKKDFEDLDSPVNGSIVIVRAGKITFAEKVAN TfR (NCBI 395 AESLNAIGVLIYMDQTKFPIVKADLSFFGHAHLGTGDP Reference YTPGFPSFNHTQFPPSQSSGLPNIPVQTISRAAAEKLF Sequence GNMEGDCPSDWKTDSTCKMVTSENKSVKLTVSN XP_005545315) ; é 96% idêntico ao domínio apical do TfR humano nativo
SEQ ID Sequência Descrição Nº
Sequência polipeptídica quimérica TfR MMDQARSAFSNLFGGEPLSYTRFSLARQVDGDNSH expressa em VEMKLAADEEENADNNMKASVRKPKRFNGRLCFAAI camundongo ALVIFFLIGFMSGYLGYCKRVEQKEECVKLAETEETD transgênico (a KSETMETEDVPTSSRLYWADLKTLLSEKLNSIEFADTI porção em KQLSQNTYTPREAGSQKDESLAYYIENQFHEFKFSKV itálico WRDEHYVKIQVKSSAQNSVIIVDKNGRLVYLVENPG representa o GYVAYSKAATVTGKLVHANFGTKKDFEDLYTPVNGS domínio IVIVRAGKITFAEKVANAESLNAIGVLIYMDQTKFPIVN citoplasmático, AELSFFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSRSSG a porção em LPNIPVQTISRAAAEKLFGNMEGDCPSDWKTDSTCR negrito 396 MVTSESKNVKLTVSNVLKERRILNIFGVIKGYEEPDRY representa o VVVGAQRDALGAGVAAKSSVGTGLLLKLAQVFSDMIS domínio KDGFRPSRSIIFASWTAGDFGAVGATEWLEGYLSSLH transmembranar LKAFTYINLDKVVLGTSNFKVSASPLLYTLMGKIMQDV , a porção em KHPVDGKSLYRDSNWISKVEKLSFDNAAYPFLAYSGI cinza PAVSFCFCEDADYPYLGTRLDTYEALTQKVPQLNQM representa o VRTAAEVAGQLIIKLTHDVELNLDYEMYNSKLLSFMKD domínio LNQFKTDIRDMGLSLQWLYSARGDYFRATSRLTTDF extracelular e a HNAEKTNRFVMREINDRIMKVEYHFLSPYVSPRESPF porção em RHIFWGSGSHTLSALVENLKLRQKNITAFNETLFRNQ negrito e LALATWTIQGVANALSGDIWNIDNEF sublinhado representa o domínio apical)
SEQ ID Sequência Descrição Nº
GCTCAGAACTCCGTGATCATCGTGGATAAGAACGG CCGGCTGGTGTACCTGGTGGAGAACCCTGGCGGA TACGTGGCTTACTCTAAGGCCGCTACCGTGACAGG CAAGCTGGTGCACGCCAACTTCGGAACCAAGAAG GACTTTGAGGATCTGTACACACCAGTGAACGGCTC
TATCGTGATCGTGCGCGCTGGAAAGATCACCTTCG Sequência de
CCGAGAAGGTGGCTAACGCCGAGAGCCTGAACGC DNA do inserto
CATCGGCGTGCTGATCTACATGGATCAGACAAAGT 397 de domínio
TTCCCATCGTGAACGCTGAGCTGTCTTTCTTTGGAC apical humano
ACGCTCACCTGGGCACCGGAGACCCATACACACC CGGATTCCCTAGCTTTAACCACACCCAGTTCCCCC CTTCCAGGTCTAGCGGACTGCCAAACATCCCCGTG CAGACAATCAGCAGAGCCGCTGCCGAGAAGCTGTT TGGCAACATGGAGGGAGACTGCCCCTCCGATTGG AAGACCGACTCTACATGTAGGATGGTGACCTCCGA GTCAAAAAATGTCAAACTCACCGTGTCCAAT MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQD QEGDTDAGLKESPLQTPTEDGSEEPGSETSDAKSTP TAEAEEAGIGDTPSLEDEAAGHVTQARMVSKSKDGT
GSDDKKAKGADGKTKIATPRGAAPPGQKGQANATRI PAKTPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPG Tau humana de SRSRTPSLPTPPTREPKKVAVVRTPPKSPSSAKSRLQ comprimento 398 TAPVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKK total (Tau412; LDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYKPVDLSKV 1N4R)
TSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKI GSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKTDHGAEI VYKSPVVSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLA DEVSASLAKQGL

Claims (93)

REIVINDICAÇÕES
1. Proteína, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) um primeiro polipeptídeo Fc que é fundido no N-terminal a uma porção Fd de um Fab que se liga especificamente a um primeiro antígeno; (b) um segundo polipeptídeo Fc que é fundido no N- terminal a um fragmento variável de cadeia única (scFv) que se liga especificamente a um segundo antígeno, em que o primeiro e o segundo polipeptídeos Fc formam um dímero Fc; e (c) um polipeptídeo de cadeia leve que emparelha com a porção Fd para formar o Fab que se liga especificamente ao primeiro antígeno; em que o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende um domínio CH3 modificado e se liga especificamente a um receptor de transferrina.
2. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o primeiro antígeno e o segundo antígeno são o mesmo antígeno.
3. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o primeiro antígeno e o segundo antígeno são antígenos diferentes.
4. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o segundo polipeptídeo Fc é fundido ao scFv por meio de um primeiro ligante.
5. Proteína, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o primeiro ligante tem um comprimento de 1 a 20 aminoácidos.
6. Proteína, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizada pelo fato de que o primeiro ligante compreende um ligante GGGGS (G4S) (SEQ ID Nº: 371), um ligante GGGGSGGGGS ((G4S)2)
(SEQ ID Nº: 372), um ligante GGGGSGGGGSGGGGS ((G4S)3) (SEQ ID Nº: 373), ou um ligante GGGGSGGGGSGGGG ((G4S)2-G4) (SEQ ID Nº: 389).
7. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o scFv compreende uma região VL e uma região VH que estão conectadas por meio de um segundo ligante, em que a orientação do scFv é a região VL - segundo ligante - região VH.
8. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o scFv compreende uma região VL e uma região VH que estão conectadas por meio de um segundo ligante, em que a orientação do scFv é a região VH - segundo ligante - região VL.
9. Proteína, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizada pelo fato de que o segundo ligante tem um comprimento de 10 a 25 aminoácidos.
10. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizada pelo fato de que o segundo ligante compreende um ligante (G4S)3 (SEQ ID Nº: 373), um ligante RTVAGGGGSGGGGS (RTVA(G4S)2) (SEQ ID Nº: 401), um ligante RTVAGGGGSGGGGSGGGGS (RTVA(G4S)3) (SEQ ID Nº: 374), um ligante ASTKGGGGSGGGGS (ASTK(G4S)2) (SEQ ID Nº: 402), ou um ligante ASTKGGGGSGGGGSGGGGS (ASTK(G4S)3) (SEQ ID Nº: 375).
11. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o scFv compreende uma ponte dissulfeto intercadeia.
12. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que o scFv compreende uma cisteína em cada uma das posições VH44 e VL100, de acordo com a numeração de domínio variável de Kabat.
13. Proteína, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o scFv compreende uma ligação dissulfeto entre as cisteínas nas posições VH44 e VL100.
14. Proteína, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) um primeiro polipeptídeo que é fundido no N-terminal a uma porção Fd de um Fab que se liga especificamente a um primeiro antígeno e é fundido no C-terminal a uma região variável da cadeia pesada ou uma região variável da cadeia leve de um Fab que se liga especificamente a um segundo antígeno; (b) um segundo polipeptídeo Fc que é fundido no N- terminal a uma porção Fd de um Fab que se liga especificamente a um primeiro antígeno e é fundido no C-terminal ao outro da primeira região variável da cadeia pesada ou primeiro região variável da cadeia leve recitada em (a), em que a região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve juntas formam um fragmento Fv que se liga especificamente ao segundo antígeno, e em que o primeiro e o segundo polipeptídeos Fc formam um dímero Fc; e (c) um polipeptídeo de cadeia leve que emparelha com cada uma das porções Fd citadas em (a) e (b) para formar um Fab que se liga especificamente ao primeiro antígeno; em que o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende um domínio CH3 modificado e se liga especificamente a um receptor de transferrina.
15. Proteína, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o primeiro antígeno e o segundo antígeno são o mesmo antígeno.
16. Proteína, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o primeiro antígeno e o segundo antígeno são antígenos diferentes.
17. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizada pelo fato de que o primeiro polipeptídeo Fc é fundido à região variável da cadeia pesada do fragmento Fv e o segundo polipeptídeo Fc é fundido à região variável da cadeia leve do fragmento Fv.
18. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizada pelo fato de que o primeiro polipeptídeo Fc é fundido à região variável da cadeia leve do fragmento Fv e o segundo polipeptídeo Fc é fundido à região variável da cadeia pesada do fragmento Fv.
19. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 18, caracterizada pelo fato de que as porções Fd recitadas em (a) e (b) compreendem sequências idênticas.
20. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 19, caracterizada pelo fato de que o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc é fundido no C-terminal à região variável da cadeia pesada ou região variável da cadeia leve através de um primeiro ligante.
21. Proteína, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o primeiro ligante tem um comprimento de 1 a 20 aminoácidos.
22. Proteína, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizada pelo fato de que o primeiro ligante compreende um ligante G4S (SEQ ID Nº: 371), um ligante (G4S)2 (SEQ ID Nº: 372), um ligante (G4S)3 (SEQ ID Nº: 373), ou um ligante (G4S)2-G4 (SEQ ID Nº: 389).
23. Proteína, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) um primeiro polipeptídeo Fc que é fundido no N-terminal a uma porção Fd de um Fab que se liga especificamente a um primeiro antígeno; (b) um segundo polipeptídeo Fc que é fundido no N-
terminal a uma porção Fd de um Fab que se liga especificamente a um primeiro antígeno, e em que o primeiro e o segundo polipeptídeos Fc formam um dímero Fc; e (c) um polipeptídeo de cadeia leve que emparelha com cada uma das porções Fd citadas em (a) e (b) para formar um Fab que se liga especificamente ao primeiro antígeno; em que o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc é fundido no C-terminal a um scFv que se liga especificamente a um segundo antígeno; e em que o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende um domínio CH3 modificado e se liga especificamente a um receptor de transferrina.
24. Proteína, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que o primeiro antígeno e o segundo antígeno são o mesmo antígeno.
25. Proteína, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que o primeiro antígeno e o segundo antígeno são antígenos diferentes.
26. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 25, caracterizada pelo fato de que o primeiro polipeptídeo Fc é fundido no C-terminal a um scFv que se liga especificamente ao segundo antígeno.
27. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 25, caracterizada pelo fato de que o segundo polipeptídeo Fc é fundido no C-terminal a um scFv que se liga especificamente ao segundo antígeno.
28. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 25, caracterizada pelo fato de que cada um do primeiro polipeptídeo Fc e do segundo polipeptídeo Fc é fundido no C- terminal a um scFv que se liga especificamente ao segundo antígeno.
29. Proteína, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que os scFvs que são fundidos ao primeiro polipeptídeo Fc e ao segundo polipeptídeo Fc compreendem sequências idênticas.
30. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 29, caracterizada pelo fato de que o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc é fundido ao scFv por meio de um primeiro ligante.
31. Proteína, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que o primeiro ligante tem um comprimento de 1 a 20 aminoácidos.
32. Proteína, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que o primeiro ligante compreende um ligante G4S (SEQ ID Nº: 371), um ligante (G4S)2 (SEQ ID Nº: 372), um ligante (G4S)3 (SEQ ID Nº: 373), ou um ligante (G4S)2-G4 (SEQ ID Nº: 389).
33. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 32, caracterizada pelo fato de que o scFv compreende uma região VL e uma região VH que estão conectadas por meio de um segundo ligante, em que a orientação do scFv é a região VL - segundo ligante - região VH.
34. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 32, caracterizada pelo fato de que o scFv compreende uma região VL e uma região VH que estão conectadas por meio de um segundo ligante, em que a orientação do scFv é a região VH - segundo ligante - região VL.
35. Proteína, de acordo com a reivindicação 33 ou 34, caracterizada pelo fato de que o segundo ligante tem um comprimento de 10 a 25 aminoácidos.
36. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 35, caracterizada pelo fato de que o segundo ligante compreende um ligante (G4S)3 (SEQ ID Nº: 373), um ligante RTVA(G4S)2 (SEQ ID Nº: 401), um ligante (RTVA(G4S)3) (SEQ ID Nº: 374), um ligante ASTK(G4S)2 (SEQ ID Nº: 402), ou um ligante ASTK(G4S)3 (SEQ ID Nº: 375).
37. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 36, caracterizada pelo fato de que o scFv compreende uma ponte dissulfeto intercadeia.
38. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 37, caracterizada pelo fato de que o scFv compreende uma cisteína em cada uma das posições VH44 e VL100, de acordo com a numeração de domínio variável de Kabat.
39. Proteína, de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato de que o scFv compreende uma ligação dissulfeto entre as cisteínas nas posições VH44 e VL100.
40. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 39, caracterizada pelo fato de que as porções Fd recitadas em (a) e (b) compreendem sequências idênticas.
41. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 40, caracterizada pelo fato de que o primeiro polipeptídeo Fc compreende um domínio CH3 modificado e se liga especificamente a um receptor de transferrina.
42. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 40, caracterizada pelo fato de que o segundo polipeptídeo Fc compreende um domínio CH3 modificado e se liga especificamente a um receptor de transferrina.
43. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 40, caracterizada pelo fato de que tanto o primeiro polipeptídeo Fc quanto o segundo polipeptídeo Fc compreendem um domínio CH3 modificado e se ligam especificamente a um receptor de transferrina.
44. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 43, caracterizada pelo fato de que o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende um domínio CH3 modificado que compreende um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou onze substituições em um conjunto de posições de aminoácidos compreendendo 380, 384, 386, 387, 388, 389, 390, 413, 415, 416 e 421, de acordo com a numeração EU.
45. Proteína, de acordo com a reivindicação 44, caracterizada pelo fato de que o domínio CH3 modificado compreende Glu, Leu, Ser, Val, Trp, Tyr ou Gln na posição 380; Leu, Tyr, Phe, Trp, Met, Pro ou Val na posição 384; Leu, Thr, His, Pro, Asn, Val ou Phe na posição 386; Val, Pro, Ile ou um aminoácido acídico na posição 387; Trp na posição 388; um aminoácido alifático, Gly, Ser, Thr ou Asn na posição 389; Gly, His, Gln, Leu, Lys, Val, Phe, Ser, Ala, Asp, Glu, Asn, Arg ou Thr na posição 390; um aminoácido acídico, Ala, Ser, Leu, Thr, Pro, Ile ou His na posição 413; Glu, Ser, Asp, Gly, Thr, Pro, Gln ou Arg na posição 415; Thr, Arg, Asn ou um aminoácido acídico na posição 416; e/ou um aminoácido aromático, His ou Lys na posição 421, de acordo com a numeração EU.
46. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 45, caracterizada pelo fato de que o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende pelo menos duas substituições em posições selecionadas do grupo que consiste em 384, 386, 387, 388, 389, 390, 413, 416, e 421, de acordo com a numeração EU.
47. Proteína, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc inclui substituições para pelo menos três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou nove das posições.
48. Proteína, de acordo com a reivindicação 46 ou 47,
caracterizada pelo fato de que o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende ainda uma, duas, três ou quatro substituições nas posições que compreendem 380, 391, 392 e 415, de acordo com a numeração EU.
49. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 48, caracterizada pelo fato de que o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende ainda uma, duas ou três substituições nas posições que compreendem 414, 424 e 426, de acordo com a numeração EU.
50. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 49, caracterizada pelo fato de que o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende Trp na posição 388.
51. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 50, caracterizada pelo fato de que o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende um aminoácido aromático na posição 421.
52. Proteína, de acordo com a reivindicação 51, caracterizada pelo fato de que o aminoácido aromático na posição 421 é Trp ou Phe.
53. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 52, caracterizada pelo fato de que o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende pelo menos uma posição selecionada do seguinte: a posição 380 é Trp, Leu ou Glu; a posição 384 é Tyr ou Phe; a posição 386 é Thr; a posição 387 é Glu; a posição 388 é Trp; a posição 389 é Ser, Ala, Val ou Asn; a posição 390 é Ser ou Asn; a posição 413 é Thr ou Ser; a posição 415 é Glu ou Ser; a posição 416 é Glu; e a posição 421 é Phe.
54. Proteína, de acordo com a reivindicação 53, caracterizada pelo fato de que o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 posições selecionadas do seguinte: a posição 380 é Trp, Leu, ou Glu; a posição 384 é Tyr ou Phe; a posição 386 é Thr; a posição 387 é Glu; a posição 388 é Trp; a posição 389 é Ser, Ala, Val ou Asn; a posição 390 é Ser ou Asn; a posição 413 é Thr ou Ser; a posição 415 é Glu ou Ser; a posição 416 é Glu; e a posição 421 é Phe.
55. Proteína, de acordo com a reivindicação 54, caracterizada pelo fato de que o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende 11 posições como se segue: a posição 380 é Trp, Leu ou Glu; a posição 384 é Tyr ou Phe; a posição 386 é Thr; a posição 387 é Glu; a posição 388 é Trp; a posição 389 é Ser, Ala, Val ou Asn; a posição 390 é Ser ou Asn; a posição 413 é Thr ou Ser; a posição 415 é Glu ou Ser; a posição 416 é Glu; e a posição 421 é Phe.
56. Proteína, de acordo com a reivindicação 54 ou 55, caracterizada pelo fato de que o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc tem um domínio CH3 com pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com os aminoácidos 111-217 de qualquer um das SEQ ID Nºs: 4-29, 101-164 e 239-252.
57. Proteína, de acordo com a reivindicação 56, caracterizada pelo fato de que o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID Nºs: 4-29, 101-164 e 239-252.
58. Proteína, de acordo com a reivindicação 56, caracterizada pelo fato de que os resíduos de pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 das posições correspondentes às posições de índice EU 380, 384, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 413, 414, 415, 416, 421, 424 e 426 de qualquer uma das SEQ ID Nºs: 4-29, 101- 164 e 239-252 não são deletados ou substituídos.
59. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 58, caracterizada pelo fato de que o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc se liga ao domínio apical do receptor de transferrina.
60. Proteína de qualquer uma das reivindicações 41 a 59, caracterizada pelo fato de que a ligação da proteína ao receptor da transferrina não inibe substancialmente a ligação da transferrina ao receptor da transferrina.
61. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 60, caracterizada pelo fato de que o primeiro polipeptídeo Fc e o segundo polipeptídeo Fc contêm, cada um, uma ou mais modificações que promovem a heterodimerização.
62. Proteína, de acordo com a reivindicação 61, caracterizada pelo fato de que um dos polipeptídeos Fc tem uma substituição T366W e outro polipeptídeo Fc tem substituições T366S, L368A e Y407V, de acordo com a numeração EU.
63. Proteína, de acordo com a reivindicação 62, caracterizada pelo fato de que o primeiro polipeptídeo Fc contém as substituições T366S, L368A e Y407V e o segundo polipeptídeo Fc contém a substituição T366W.
64. Proteína, de acordo com a reivindicação 62, caracterizada pelo fato de que o primeiro polipeptídeo Fc contém a substituição T366W e o segundo polipeptídeo Fc contém as substituições T366S, L368A e Y407V.
65. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 64, caracterizada pelo fato de que o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende um sítio de ligação de FcRn nativo.
66. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 64, caracterizada pelo fato de que o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende uma modificação que altera a ligação FcRn.
67. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 66, caracterizada pelo fato de que o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende uma ou mais modificações que reduzem a função efetora.
68. Proteína, de acordo com a reivindicação 67, caracterizada pelo fato de que as modificações que reduzem a função efetora são substituições de Ala na posição 234 e Ala na posição 235, de acordo com a numeração EU.
69. Proteína, de acordo com a reivindicação 67, caracterizada pelo fato de que tanto o primeiro polipeptídeo Fc quanto o segundo polipeptídeo Fc compreendem substituições L234A e L235A.
70. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 69, caracterizada pelo fato de que o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende modificações em relação à sequência Fc nativa que estendem a meia- vida sérica.
71. Proteína, de acordo com a reivindicação 70, caracterizada pelo fato de que as modificações compreendem substituições de Tyr na posição 252, Thr na posição 254 e Glu na posição 256, de acordo com a numeração EU.
72. Proteína, de acordo com a reivindicação 70, caracterizada pelo fato de que as modificações compreendem substituições de Leu na posição 428 e Ser na posição 434, de acordo com a numeração EU.
73. Proteína, de acordo com a reivindicação 70, caracteri- zada pelo fato de que as modificações compreendem uma substituição de Ser ou Ala na posição 434, de acordo com a numeração EU.
74. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 73, caracterizada pelo fato de que o primeiro polipeptídeo Fc e o segundo polipeptídeo Fc não têm função efetora.
75. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 74, caracterizada pelo fato de que o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc tem uma identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 75%, ou pelo menos 80%, 90%, 92% ou 95%, em comparação com um polipeptídeo Fc de tipo selvagem correspondente.
76. Proteína, de acordo com a reivindicação 75, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo Fc de tipo selvagem correspondente é um polipeptídeo Fc IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humano.
77. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 75, caracterizada pelo fato de que o primeiro polipeptídeo Fc e/ou e o segundo polipeptídeo Fc compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID Nºs: 165-238, 253-370 e 377-388.
78. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende a proteína como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 77 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
79. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a proteína como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 77.
80. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 79.
81. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 79 ou o vetor como definido na reivindicação 80.
82. Método de tratamento de um indivíduo, o método, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo a proteína como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 77 ou a composição farmacêutica como definida na reivindicação 78.
83. Animal transgênico não humano, caracterizado pelo fato de que compreende (a) um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo TfR quimérico compreendendo: (i) um domínio apical com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID Nº: 392 e (ii) o sítio de ligação à transferrina do polipeptídeo TfR nativo do animal, e (b) um transgene de um gene da proteína Tau associada a microtúbulos mutante (MAPT), em que o polipeptídeo TfR quimérico e/ou a proteína Tau é expressa no cérebro do animal.
84. Animal, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que o domínio apical compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 392.
85. Animal, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que o domínio apical compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº: 393, SEQ ID Nº: 394 ou SEQ ID Nº: 395.
86. Animal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 85, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo TfR quimérico compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID Nº: 396.
87. Animal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 86, caracterizado pelo fato de que o animal expressa um nível do polipeptídeo TfR quimérico no cérebro, fígado, rim ou tecido pulmonar dentro de 20% do nível de expressão de TfR no mesmo tecido de um animal de tipo selvagem correspondente da mesma espécie.
88. Animal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 87, caracterizado pelo fato de que o animal compreende uma conta-gem de glóbulos vermelhos, nível de hemoglobina ou nível de hematócrito dentro de 20% da contagem de glóbulos vermelhos, nível de hemoglobina ou nível de hematócrito em um tipo animal da mesma espécie.
89. Animal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 88, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácido nucleico que codifica o domínio apical compreende uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID Nº: 397.
90. Animal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 89, caracterizado pelo fato de que o animal é homozigoto ou heterozigoto para o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo TfR quimérico.
91. Animal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 90, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo TfR quimérico substitui o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo TfR endógeno presente no animal.
92. Animal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 91, caracterizado pelo fato de que o gene MAPT mutante codifica uma proteína Tau humana mutante compreendendo a substituição de aminoácido P272S em relação à sequência de SEQ ID Nº: 398.
93. Animal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 92, caracterizado pelo fato de que o animal é um camundongo ou um rato.
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