JP7397063B2 - 操作された二重特異性タンパク質 - Google Patents

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Description

トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）は、トランスフェリンのキャリアタンパク質であり、他の機能のなかでも、鉄の細胞内への取り込みに必要であり、細胞内の鉄濃度に応じて制御される。トランスフェリン受容体は、血液脳関門の内皮を含む内皮細胞上に発現し、様々ながん細胞及び炎症性細胞で高レベルで発現する。血液脳関門を通過する同族リガンドのトランスサイトーシスを媒介する受容体の１つである。したがって、トランスフェリン受容体は、細胞内へのエンドサイトーシスまたは細胞の反対側へのトランスサイトーシスのいずれかで、細胞内に薬剤を導入するための望ましい標的であり得る。
一態様において、改変されたＦｃポリペプチドを含有する二重特異性タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合するＦａｂのＦｄ部分にＮ末端で融合された第１のＦｃポリペプチドと、
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）にＮ末端で融合された第２のＦｃポリペプチドであって、第１及び第２のＦｃポリペプチドは、Ｆｃ二量体を形成する、第２のＦｃポリペプチドと、
（ｃ）Ｆｄ部分と対合して、第１の抗原に特異的に結合するＦａｂを形成する、軽鎖ポリペプチドと
を含み、
第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、改変されたＣＨ２ドメインまたは改変されたＣＨ３ドメイン（例えば、本明細書に記載されるいずれか）を含み、トランスフェリン受容体に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、第１の抗原及び第２の抗原は、同じ抗原である。いくつかの実施形態では、第１の抗原及び第２の抗原は、異なる抗原である。
いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、第１のリンカーを介して、ｓｃＦｖに融合される。いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、１～２０アミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、ＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）リンカー（配列番号３７１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（（Ｇ４Ｓ）２）リンカー（配列番号３７２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（（Ｇ４Ｓ）３）リンカー（配列番号３７３）、またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（（Ｇ４Ｓ）２－Ｇ４）リンカー（配列番号３８９）を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、第２のリンカーを介して接続されるＶＬ領域及びＶＨ領域を含み、ｓｃＦｖの配置は、ＶＬ領域－第２のリンカー－ＶＨ領域である。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、第２のリンカーを介して接続されるＶＬ領域及びＶＨ領域を含み、ｓｃＦｖの配置は、ＶＨ領域－第２のリンカー－ＶＬ領域である。いくつかの実施形態では、第２のリンカーは、１０～２５アミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、第２のリンカーは、（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号３７３）、ＲＴＶＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＲＴＶＡ（Ｇ４Ｓ）２）リンカー（配列番号４０１）、ＲＴＶＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＲＴＶＡ（Ｇ４Ｓ）３）リンカー（配列番号３７４）、ＡＳＴＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＡＳＴＫ（Ｇ４Ｓ）２）リンカー（配列番号４０２）、またはＡＳＴＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＡＳＴＫ（Ｇ４Ｓ）３）リンカー（配列番号３７５）を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、鎖間ジスルフィド架橋を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｋａｂａｔ可変ドメイン付番に従う位置ＶＨ４４及びＶＬ１００のそれぞれにシステインを含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、位置ＶＨ４４及びＶＬ１００のシステイン間のジスルフィド結合を含む。
いくつかの実施形態では、タンパク質は：
（ａ）第１の抗原に特異的に結合するＦａｂのＦｄ部分にＮ末端で融合され、第２の抗原に特異的に結合するＦａｂの重鎖可変領域または軽鎖可変領域にＣ末端で融合された、第１のポリペプチドと、
（ｂ）第１の抗原に特異的に結合するＦａｂのＦｄ部分にＮ末端で融合され、（ａ）に詳述される第１の重鎖可変領域または第１の軽鎖可変領域の他方にＣ末端で融合された、第２のＦｃポリペプチドであって、
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、第２の抗原に特異的に結合するＦｖフラグメントを一緒に形成し、第１及び第２のＦｃポリペプチドは、Ｆｃ二量体を形成する、第２のＦｃポリペプチドと、
（ｃ）（ａ）及び（ｂ）に詳述されるＦｄ部分のそれぞれと対合して、第１の抗原に特異的に結合するＦａｂを形成する、軽鎖ポリペプチドと
を含み、
第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、改変されたＣＨ２ドメインまたは改変されたＣＨ３ドメイン（例えば、本明細書に記載されるいずれか）を含み、トランスフェリン受容体に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、第１の抗原及び第２の抗原は、同じ抗原である。いくつかの実施形態では、第１の抗原及び第２の抗原は、異なる抗原である。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、Ｆｖフラグメントの重鎖可変領域に融合され、第２のＦｃポリペプチドは、Ｆｖフラグメントの軽鎖可変領域に融合される。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、Ｆｖフラグメントの軽鎖可変領域に融合され、第２のＦｃポリペプチドは、Ｆｖフラグメントの重鎖可変領域に融合される。いくつかの実施形態では、（ａ）及び（ｂ）に詳述されるＦｄ部分は、同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、第１のリンカーを介して、重鎖可変領域または軽鎖可変領域にＣ末端で融合される。いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、１～２０アミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、Ｇ４Ｓリンカー（配列番号３７１）、（Ｇ４Ｓ）２リンカー（配列番号３７２）、（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号３７３）、または（Ｇ４Ｓ）２－Ｇ４リンカー（配列番号３８９）を含む。
いくつかの実施形態では、タンパク質は：
（ａ）第１の抗原に特異的に結合するＦａｂのＦｄ部分にＮ末端で融合された第１のＦｃポリペプチドと、
（ｂ）第１の抗原に特異的に結合するＦａｂのＦｄ部分にＮ末端で融合された第２のＦｃポリペプチドであって、第１及び第２のＦｃポリペプチドは、Ｆｃ二量体を形成する、第２のＦｃポリペプチドと、
（ｃ）（ａ）及び（ｂ）に詳述されるＦｄ部分のそれぞれと対合して、第１の抗原に特異的に結合するＦａｂを形成する、軽鎖ポリペプチドと
を含み、
第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、第２の抗原に特異的に結合するｓｃＦｖにＣ末端で融合され、
第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、改変されたＣＨ２ドメインまたは改変されたＣＨ３ドメイン（例えば、本明細書に記載されるいずれか）を含み、トランスフェリン受容体に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、第１の抗原及び第２の抗原は、同じ抗原である。いくつかの実施形態では、第１の抗原及び第２の抗原は、異なる抗原である。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、第２の抗原に特異的に結合するｓｃＦｖにＣ末端で融合される。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、第２の抗原に特異的に結合するｓｃＦｖにＣ末端で融合される。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドのそれぞれは、第２の抗原に特異的に結合するｓｃＦｖにＣ末端で融合される。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドに融合されるｓｃＦｖは、同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、第１のリンカーを介して、ｓｃＦｖに融合される。いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、１～２０アミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、Ｇ４Ｓリンカー（配列番号３７１）、（Ｇ４Ｓ）２リンカー（配列番号３７２）、（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号３７３）、または（Ｇ４Ｓ）２－Ｇ４リンカー（配列番号３８９）を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、第２のリンカーを介して接続されるＶＬ領域及びＶＨ領域を含み、ｓｃＦｖの配置は、ＶＬ領域－第２のリンカー－ＶＨ領域である。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、第２のリンカーを介して接続されるＶＬ領域及びＶＨ領域を含み、ｓｃＦｖの配置は、ＶＨ領域－第２のリンカー－ＶＬ領域である。いくつかの実施形態では、第２のリンカーは、１０～２５アミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、第２のリンカーは、（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号３７３）、ＲＴＶＡ（Ｇ４Ｓ）２リンカー（配列番号４０１）、ＲＴＶＡ（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号３７４）、ＡＳＴＫ（Ｇ４Ｓ）２リンカー（配列番号４０２）、またはＡＳＴＫ（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号３７５）を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、鎖間ジスルフィド架橋を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｋａｂａｔ可変ドメイン付番に従う位置ＶＨ４４及びＶＬ１００のそれぞれにシステインを含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、位置ＶＨ４４及びＶＬ１００のシステイン間のジスルフィド結合を含む。いくつかの実施形態では、（ａ）及び（ｂ）に詳述されるＦｄ部分は、同一の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるタンパク質は、改変されたＣＨ３ドメインを含み、トランスフェリン受容体に特異的に結合する、第１のＦｃポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるタンパク質は、改変されたＣＨ３ドメインを含み、トランスフェリン受容体に特異的に結合する、第２のＦｃポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドの両方は、改変されたＣＨ３ドメインを含み、トランスフェリン受容体に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う３８０、３８４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、４１３、４１５、４１６、及び４２１を含むアミノ酸位置のセットにおいて１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、または１１個の置換を含む、改変されたＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、改変されたＣＨ３ドメインは、ＥＵ付番に従う位置３８０にＧｌｕ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、もしくはＧｌｎ；位置３８４にＬｅｕ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、もしくはＶａｌ；位置３８６にＬｅｕ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、もしくはＰｈｅ；位置３８７にＶａｌ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、もしくは酸性アミノ酸；位置３８８にＴｒｐ；位置３８９に脂肪族アミノ酸、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、もしくはＡｓｎ；位置３９０にＧｌｙ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、もしくはＴｈｒ；位置４１３に酸性アミノ酸、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、もしくはＨｉｓ；位置４１５にＧｌｕ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、もしくはＡｒｇ；位置４１６にＴｈｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、もしくは酸性アミノ酸；及び／または位置４２１に芳香族アミノ酸、Ｈｉｓ、もしくはＬｙｓを含む。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う３８４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、４１３、４１６、及び４２１からなる群から選択される位置に、少なくとも２つの置換を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、当該位置の少なくとも３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つに置換を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う３８０、３９１、３９２、及び４１５を含む位置に、１つ、２つ、３つ、または４つの置換を更に含む。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う４１４、４２４、及び４２６を含む位置に、１つ、２つ、または３つの置換を更に含む。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、位置３８８にＴｒｐを含む。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、位置４２１に芳香族アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、位置４２１の芳香族アミノ酸は、ＴｒｐまたはＰｈｅである。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、以下：
位置３８０がＴｒｐ、ＬｅｕまたはＧｌｕ；位置３８４がＴｙｒまたはＰｈｅ；位置３８６がＴｈｒ；位置３８７がＧｌｕ；位置３８８がＴｒｐ；位置３８９がＳｅｒ、Ａｌａ、ＶａｌまたはＡｓｎ；位置３９０がＳｅｒまたはＡｓｎ；位置４１３がＴｈｒまたはＳｅｒ；位置４１５がＧｌｕまたはＳｅｒ；位置４１６がＧｌｕ；及び位置４２１がＰｈｅ
から選択される少なくとも１つの位置を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、以下：
位置３８０がＴｒｐ、ＬｅｕまたはＧｌｕ；位置３８４がＴｙｒまたはＰｈｅ；位置３８６がＴｈｒ；位置３８７がＧｌｕ；位置３８８がＴｒｐ；位置３８９がＳｅｒ、Ａｌａ、ＶａｌまたはＡｓｎ；位置３９０がＳｅｒまたはＡｓｎ；位置４１３がＴｈｒまたはＳｅｒ；位置４１５がＧｌｕまたはＳｅｒ；位置４１６がＧｌｕ；及び位置４２１がＰｈｅ
から選択される２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個または１１個の位置を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、以下：
位置３８０がＴｒｐ、ＬｅｕまたはＧｌｕ；位置３８４がＴｙｒまたはＰｈｅ；位置３８６がＴｈｒ；位置３８７がＧｌｕ；位置３８８がＴｒｐ；位置３８９がＳｅｒ、Ａｌａ、ＶａｌまたはＡｓｎ；位置３９０がＳｅｒまたはＡｓｎ；位置４１３がＴｈｒまたはＳｅｒ；位置４１５がＧｌｕまたはＳｅｒ；位置４１６がＧｌｕ；及び位置４２１がＰｈｅ
の１１個の位置を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、配列番号４～２９、１０１～１６４、及び２３９～２５２のいずれか１つのアミノ酸１１１～２１７に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有するＣＨ３ドメインを有する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、配列番号４～２９、１０１～１６４、及び２３９～２５２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、配列番号４～２９、１０１～１６４、及び２３９～２５２のいずれか１つのＥＵインデックス位置３８０、３８４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、４１３、４１４、４１５、４１６、４２１、４２４及び４２６に対応する位置のうちの少なくとも５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、または１６個の残基は、欠失または置換されていない。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、トランスフェリン受容体のアピカルドメインに結合する。いくつかの実施形態では、タンパク質のトランスフェリン受容体への結合は、トランスフェリンのトランスフェリン受容体への結合を実質的に阻害しない。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドは、ヘテロ二量体化を促進する１つ以上の改変をそれぞれ含有する。いくつかの実施形態では、ＥＵ付番に従って、Ｆｃポリペプチドのうちの一方は、Ｔ３６６Ｗ置換を有し、他方のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換を有する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換を含有し、第２のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｗ置換を含有する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｗ置換を含有し、第２のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換を含有する。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ネイティブＦｃＲｎ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＦｃＲｎ結合を変化させる改変を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、エフェクター機能を低下させる１つ以上の改変を含む。いくつかの実施形態では、エフェクター機能を低下させる改変は、ＥＵ付番に従う位置２３４でのＡｌａ及び位置２３５でのＡｌａの置換である。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドの両方は、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、血清中半減期を延長する、ネイティブＦｃ配列に対する改変を含む。いくつかの実施形態では、改変は、ＥＵ付番に従う位置２５２でのＴｙｒ、位置２５４でのＴｈｒ、及び位置２５６でのＧｌｕの置換を含む。いくつかの実施形態では、改変は、ＥＵ付番に従う位置４２８でのＬｅｕ及び位置４３４でのＳｅｒの置換を含む。いくつかの実施形態では、改変は、ＥＵ付番に従う位置４３４でのＳｅｒまたはＡｌａの置換を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ置換を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドは、エフェクター機能を持たない。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、対応する野生型Ｆｃポリペプチドと比較して、少なくとも７５％、または少なくとも８０％、９０％、９２％、もしくは９５％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、対応する野生型Ｆｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドである。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または及び第２のＦｃポリペプチドは、配列番号１６５～２３８、２５３～３７０、及び３７７～３８８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
別の態様において、医薬組成物が提供される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書で開示されるタンパク質及び薬学的に許容される担体を含む。
更に別の態様において、単離されたポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書で開示されるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
また別の態様において、ベクター及び宿主細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ベクターは、ポリヌクレオチドを含み、本明細書で開示されるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ポリヌクレオチドを含み、本明細書で開示されるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
更に別の態様において、対象を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書で開示されるタンパク質または医薬組成物を対象に投与することを含む。
別の態様において、本開示は、非ヒトトランスジェニック動物であって、（ａ）（ｉ）配列番号３９２に対して少なくとも９０％の同一性を有するアピカルドメイン、及び（ｉｉ）当該動物のネイティブＴｆＲポリペプチドのトランスフェリン結合部位を含む、キメラＴｆＲポリペプチドをコードする核酸と、（ｂ）変異体微小管結合タンパク質Ｔａｕ（ＭＡＰＴ）遺伝子の導入遺伝子と、を含み、キメラＴｆＲポリペプチド及び／またはＴａｕタンパク質が当該動物の脳内で発現する、非ヒトトランスジェニック動物（例えば、哺乳動物）を提供する。
いくつかの実施形態では、アピカルドメインは、配列番号３９２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、アピカルドメインは、配列番号３９３、配列番号３９４、または配列番号３９５のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、キメラＴｆＲポリペプチドは、配列番号３９６に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、動物は、脳組織、肝組織、腎組織または肺組織中で、対応する同種の野生型動物の同じ組織におけるＴｆＲの発現レベルの２０％以内（例えば、１８％、１６％、１４％、１２％、１０％、８％、６％、または４％）のキメラＴｆＲポリペプチドのレベルを発現する。
いくつかの実施形態では、動物は、対応する同種の野生型動物における赤血球数、ヘモグロビンのレベル、またはヘマトクリットのレベルの２０％以内（例えば、１８％、１６％、１４％、１２％、１０％、８％、６％、または４％）の赤血球数、ヘモグロビンのレベル、またはヘマトクリットのレベルを含む。
いくつかの実施形態では、アピカルドメインをコードする核酸配列は、配列番号３９７に対して少なくとも９５％（例えば、９７％、９８％、または９９％）の同一性を有する核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、動物は、キメラＴｆＲポリペプチドをコードする核酸に関してホモ接合性またはヘテロ接合性である。
いくつかの実施形態では、キメラＴｆＲポリペプチドをコードする核酸は、動物のゲノム中の内因性ＴｆＲポリペプチドをコードする核酸を、例えば、内因性遺伝子座で、置き換える。
いくつかの実施形態では、変異体ＭＡＰＴ遺伝子は、変異体ヒトＴａｕタンパク質をコードする。
いくつかの実施形態では、変異体ヒトＴａｕタンパク質は、配列番号３９８の配列を基準として、アミノ酸置換Ｐ２７２Ｓを含む。
いくつかの実施形態では、動物は、マウスまたはラットなどのげっ歯類である。
［本発明１００１］
（ａ）第１の抗原に特異的に結合するＦａｂのＦｄ部分にＮ末端で融合された第１のＦｃポリペプチドと、
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）にＮ末端で融合された第２のＦｃポリペプチドであって、前記第１及び前記第２のＦｃポリペプチドは、Ｆｃ二量体を形成する、前記第２のＦｃポリペプチドと、
（ｃ）前記Ｆｄ部分と対合して、前記第１の抗原に特異的に結合するＦａｂを形成する、軽鎖ポリペプチドと
を含み、
前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドは、改変されたＣＨ３ドメインを含み、トランスフェリン受容体に特異的に結合する、
タンパク質。
［本発明１００２］
前記第１の抗原及び前記第２の抗原が、同じ抗原である、本発明１００１のタンパク質。
［本発明１００３］
前記第１の抗原及び前記第２の抗原が、異なる抗原である、本発明１００１のタンパク質。
［本発明１００４］
前記第２のＦｃポリペプチドが、第１のリンカーを介して前記ｓｃＦｖに融合される、本発明１００１～１００３のいずれかのタンパク質。
［本発明１００５］
前記第１のリンカーが、１～２０アミノ酸の長さを有する、本発明１００４のタンパク質。
［本発明１００６］
前記第１のリンカーが、ＧＧＧＧＳ（Ｇ ４ Ｓ）リンカー、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（（Ｇ ４ Ｓ） ２ ）リンカー、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（（Ｇ ４ Ｓ） ３ ）リンカー、またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（（Ｇ ４ Ｓ） ２ －Ｇ ４ ）リンカーを含む、本発明１００４または１００５のタンパク質。
［本発明１００７］
前記ｓｃＦｖが、第２のリンカーを介して接続されるＶＬ領域及びＶＨ領域を含み、前記ｓｃＦｖの配置が、ＶＬ領域－第２のリンカー－ＶＨ領域である、本発明１００１～１００６のいずれかのタンパク質。
［本発明１００８］
前記ｓｃＦｖが、第２のリンカーを介して接続されるＶＬ領域及びＶＨ領域を含み、前記ｓｃＦｖの配置が、ＶＨ領域－第２のリンカー－ＶＬ領域である、本発明１００１～１００６のいずれかのタンパク質。
［本発明１００９］
前記第２のリンカーが、１０～２５アミノ酸の長さを有する、本発明１００７または１００８のタンパク質。
［本発明１０１０］
前記第２のリンカーが、（Ｇ ４ Ｓ） ３ リンカー、ＲＴＶＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＲＴＶＡ（Ｇ ４ Ｓ） ２ ）リンカー、ＲＴＶＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＲＴＶＡ（Ｇ ４ Ｓ） ３ ）リンカー、ＡＳＴＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＡＳＴＫ（Ｇ ４ Ｓ） ２ ）リンカー、またはＡＳＴＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＡＳＴＫ（Ｇ ４ Ｓ） ３ ）リンカーを含む、本発明１００７～１００９のいずれかのタンパク質。
［本発明１０１１］
前記ｓｃＦｖが、鎖間ジスルフィド架橋を含む、本発明１００１～１０１０のいずれかのタンパク質。
［本発明１０１２］
前記ｓｃＦｖが、Ｋａｂａｔ可変ドメイン付番に従う位置ＶＨ４４及びＶＬ１００のそれぞれにシステインを含む、本発明１００１～１０１１のいずれかのタンパク質。
［本発明１０１３］
前記ｓｃＦｖが、位置ＶＨ４４及びＶＬ１００の前記システイン間のジスルフィド結合を含む、本発明１０１２のタンパク質。
［本発明１０１４］
（ａ）第１の抗原に特異的に結合するＦａｂのＦｄ部分にＮ末端で融合され、第２の抗原に特異的に結合するＦａｂの重鎖可変領域または軽鎖可変領域にＣ末端で融合された、第１のポリペプチドと、
（ｂ）第１の抗原に特異的に結合するＦａｂのＦｄ部分にＮ末端で融合され、（ａ）に詳述される第１の重鎖可変領域または第１の軽鎖可変領域の他方にＣ末端で融合された、第２のＦｃポリペプチドであって、
前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域は、第２の抗原に特異的に結合するＦｖフラグメントを一緒に形成し、前記第１及び前記第２のＦｃポリペプチドは、Ｆｃ二量体を形成する、前記第２のＦｃポリペプチドと、
（ｃ）（ａ）及び（ｂ）に詳述される前記Ｆｄ部分のそれぞれと対合して、前記第１の抗原に特異的に結合するＦａｂを形成する、軽鎖ポリペプチドと
を含み、
前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドは、改変されたＣＨ３ドメインを含み、トランスフェリン受容体に特異的に結合する、
タンパク質。
［本発明１０１５］
前記第１の抗原及び前記第２の抗原が、同じ抗原である、本発明１０１４のタンパク質。
［本発明１０１６］
前記第１の抗原及び前記第２の抗原が、異なる抗原である、本発明１０１４のタンパク質。
［本発明１０１７］
前記第１のＦｃポリペプチドが、前記Ｆｖフラグメントの前記重鎖可変領域に融合され、前記第２のＦｃポリペプチドが、前記Ｆｖフラグメントの前記軽鎖可変領域に融合される、本発明１０１４～１０１６のいずれかのタンパク質。
［本発明１０１８］
前記第１のＦｃポリペプチドが、前記Ｆｖフラグメントの前記軽鎖可変領域に融合され、前記第２のＦｃポリペプチドが、前記Ｆｖフラグメントの前記重鎖可変領域に融合される、本発明１０１４～１０１６のいずれかのタンパク質。
［本発明１０１９］
（ａ）及び（ｂ）に記載される前記Ｆｄ部分が、同一の配列を含む、本発明１０１４～１０１８のいずれかのタンパク質。
［本発明１０２０］
前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、第１のリンカーを介して、前記重鎖可変領域または前記軽鎖可変領域にＣ末端で融合される、本発明１０１４～１０１９のいずれかのタンパク質。
［本発明１０２１］
前記第１のリンカーが、１～２０アミノ酸の長さを有する、本発明１０２０のタンパク質。
［本発明１０２２］
前記第１のリンカーが、Ｇ ４ Ｓリンカー、（Ｇ ４ Ｓ） ２ リンカー、（Ｇ ４ Ｓ） ３ リンカー、または（Ｇ ４ Ｓ） ２ －Ｇ ４ リンカーを含む、本発明１０２０または１０２１のタンパク質。
［本発明１０２３］
（ａ）第１の抗原に特異的に結合するＦａｂのＦｄ部分にＮ末端で融合された第１のＦｃポリペプチドと、
（ｂ）第１の抗原に特異的に結合するＦａｂのＦｄ部分にＮ末端で融合された第２のＦｃポリペプチドであって、前記第１及び前記第２のＦｃポリペプチドは、Ｆｃ二量体を形成する、前記第２のＦｃポリペプチドと、
（ｃ）（ａ）及び（ｂ）に詳述される前記Ｆｄ部分のそれぞれと対合して、前記第１の抗原に特異的に結合するＦａｂを形成する、軽鎖ポリペプチドと
を含み、
前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドは、第２の抗原に特異的に結合するｓｃＦｖにＣ末端で融合され、
前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドは、改変されたＣＨ３ドメインを含み、トランスフェリン受容体に特異的に結合する、
タンパク質。
［本発明１０２４］
前記第１の抗原及び前記第２の抗原が、同じ抗原である、本発明１０２３のタンパク質。
［本発明１０２５］
前記第１の抗原及び前記第２の抗原が、異なる抗原である、本発明１０２３のタンパク質。
［本発明１０２６］
前記第１のＦｃポリペプチドが、前記第２の抗原に特異的に結合するｓｃＦｖにＣ末端で融合される、本発明１０２３～１０２５のいずれかのタンパク質。
［本発明１０２７］
前記第２のＦｃポリペプチドが、前記第２の抗原に特異的に結合するｓｃＦｖにＣ末端で融合される、本発明１０２３～１０２５のいずれかのタンパク質。
［本発明１０２８］
前記第１のＦｃポリペプチド及び前記第２のＦｃポリペプチドのそれぞれが、前記第２の抗原に特異的に結合するｓｃＦｖにＣ末端で融合される、本発明１０２３～１０２５のいずれかのタンパク質。
［本発明１０２９］
前記第１のＦｃポリペプチド及び前記第２のＦｃポリペプチドに融合されるｓｃＦｖが、同一の配列を含む、本発明１０２８のタンパク質。
［本発明１０３０］
前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、第１のリンカーを介して、ｓｃＦｖに融合される、本発明１０２３～１０２９のいずれかのタンパク質。
［本発明１０３１］
前記第１のリンカーが、１～２０アミノ酸の長さを有する、本発明１０３０のタンパク質。
［本発明１０３２］
前記第１のリンカーが、Ｇ ４ Ｓリンカー、（Ｇ ４ Ｓ） ２ リンカー、（Ｇ ４ Ｓ） ３ リンカー、または（Ｇ ４ Ｓ） ２ －Ｇ ４ リンカーを含む、本発明１０３１のタンパク質。
［本発明１０３３］
前記ｓｃＦｖが、第２のリンカーを介して接続されるＶＬ領域及びＶＨ領域を含み、前記ｓｃＦｖの配置が、ＶＬ領域－第２のリンカー－ＶＨ領域である、本発明１０２３～１０３２のいずれかのタンパク質。
［本発明１０３４］
前記ｓｃＦｖが、第２のリンカーを介して接続されるＶＬ領域及びＶＨ領域を含み、前記ｓｃＦｖの配置が、ＶＨ領域－第２のリンカー－ＶＬ領域である、本発明１０２３～１０３２のいずれかのタンパク質。
［本発明１０３５］
前記第２のリンカーが、１０～２５アミノ酸の長さを有する、本発明１０３３または１０３４のタンパク質。
［本発明１０３６］
前記第２のリンカーが、（Ｇ ４ Ｓ） ３ リンカー、ＲＴＶＡ（Ｇ ４ Ｓ） ２ リンカー、（ＲＴＶＡ（Ｇ ４ Ｓ） ３ ）リンカー、ＡＳＴＫ（Ｇ ４ Ｓ） ２ リンカー、またはＡＳＴＫ（Ｇ ４ Ｓ） ３ リンカーを含む、本発明１０３３～１０３５のいずれかのタンパク質。
［本発明１０３７］
前記ｓｃＦｖが、鎖間ジスルフィド架橋を含む、本発明１０２３～１０３６のいずれかのタンパク質。
［本発明１０３８］
前記ｓｃＦｖが、Ｋａｂａｔ可変ドメイン付番に従う位置ＶＨ４４及びＶＬ１００のそれぞれにシステインを含む、本発明１０２３～１０３７のいずれかのタンパク質。
［本発明１０３９］
前記ｓｃＦｖが、位置ＶＨ４４及びＶＬ１００の前記システイン間のジスルフィド結合を含む、本発明１０３８のタンパク質。
［本発明１０４０］
（ａ）及び（ｂ）に記載される前記Ｆｄ部分が、同一の配列を含む、本発明１０２３～１０３９のいずれかのタンパク質。
［本発明１０４１］
前記第１のＦｃポリペプチドが、改変されたＣＨ３ドメインを含み、トランスフェリン受容体に特異的に結合する、本発明１００１～１０４０のいずれかのタンパク質。
［本発明１０４２］
前記第２のＦｃポリペプチドが、改変されたＣＨ３ドメインを含み、トランスフェリン受容体に特異的に結合する、本発明１００１～１０４０のいずれかのタンパク質。
［本発明１０４３］
前記第１のＦｃポリペプチド及び前記第２のＦｃポリペプチドの両方が、改変されたＣＨ３ドメインを含み、トランスフェリン受容体に特異的に結合する、本発明１００１～１０４０のいずれかのタンパク質。
［本発明１０４４］
前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、ＥＵ付番に従う３８０、３８４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、４１３、４１５、４１６、及び４２１を含むアミノ酸位置のセットにおいて１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、または１１個の置換を含む、改変されたＣＨ３ドメインを含む、本発明１０４１～１０４３のいずれかのタンパク質。
［本発明１０４５］
前記改変されたＣＨ３ドメインが、ＥＵ付番に従う位置３８０にＧｌｕ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、もしくはＧｌｎ；位置３８４にＬｅｕ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、もしくはＶａｌ；位置３８６にＬｅｕ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、もしくはＰｈｅ；位置３８７にＶａｌ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、もしくは酸性アミノ酸；位置３８８にＴｒｐ；位置３８９に脂肪族アミノ酸、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、もしくはＡｓｎ；位置３９０にＧｌｙ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、もしくはＴｈｒ；位置４１３に酸性アミノ酸、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、もしくはＨｉｓ；位置４１５にＧｌｕ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、もしくはＡｒｇ；位置４１６にＴｈｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、もしくは酸性アミノ酸；及び／または位置４２１に芳香族アミノ酸、Ｈｉｓ、もしくはＬｙｓを含む、本発明１０４４のタンパク質。
［本発明１０４６］
前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、ＥＵ付番に従う３８４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、４１３、４１６、及び４２１からなる群から選択される位置に、少なくとも２つの置換を含む、本発明１０４１～１０４５のいずれかのタンパク質。
［本発明１０４７］
前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、前記位置の少なくとも３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つに置換を含む、本発明１０４６のタンパク質。
［本発明１０４８］
前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、ＥＵ付番に従う３８０、３９１、３９２、及び４１５を含む位置に、１つ、２つ、３つ、または４つの置換を更に含む、本発明１０４６または１０４７のタンパク質。
［本発明１０４９］
前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、ＥＵ付番に従う４１４、４２４、及び４２６を含む位置に、１つ、２つ、または３つの置換を更に含む、本発明１０４４～１０４８のいずれかのタンパク質。
［本発明１０５０］
前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、位置３８８にＴｒｐを含む、本発明１０４４～１０４９のいずれかのタンパク質。
［本発明１０５１］
前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、位置４２１に芳香族アミノ酸を含む、本発明１０４４～１０５０のいずれかのタンパク質。
［本発明１０５２］
位置４２１の前記芳香族アミノ酸が、ＴｒｐまたはＰｈｅである、本発明１０５１のタンパク質。
［本発明１０５３］
前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、以下：
位置３８０がＴｒｐ、ＬｅｕまたはＧｌｕ；位置３８４がＴｙｒまたはＰｈｅ；位置３８６がＴｈｒ；位置３８７がＧｌｕ；位置３８８がＴｒｐ；位置３８９がＳｅｒ、Ａｌａ、ＶａｌまたはＡｓｎ；位置３９０がＳｅｒまたはＡｓｎ；位置４１３がＴｈｒまたはＳｅｒ；位置４１５がＧｌｕまたはＳｅｒ；位置４１６がＧｌｕ；及び位置４２１がＰｈｅ
から選択される少なくとも１つの位置を含む、本発明１０４４～１０５２のいずれかのタンパク質。
［本発明１０５４］
前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、以下：
位置３８０がＴｒｐ、ＬｅｕまたはＧｌｕ；位置３８４がＴｙｒまたはＰｈｅ；位置３８６がＴｈｒ；位置３８７がＧｌｕ；位置３８８がＴｒｐ；位置３８９がＳｅｒ、Ａｌａ、ＶａｌまたはＡｓｎ；位置３９０がＳｅｒまたはＡｓｎ；位置４１３がＴｈｒまたはＳｅｒ；位置４１５がＧｌｕまたはＳｅｒ；位置４１６がＧｌｕ；及び位置４２１がＰｈｅ
から選択される２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個または１１個の位置を含む、本発明１０５３のタンパク質。
［本発明１０５５］
前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、以下：
位置３８０がＴｒｐ、ＬｅｕまたはＧｌｕ；位置３８４がＴｙｒまたはＰｈｅ；位置３８６がＴｈｒ；位置３８７がＧｌｕ；位置３８８がＴｒｐ；位置３８９がＳｅｒ、Ａｌａ、ＶａｌまたはＡｓｎ；位置３９０がＳｅｒまたはＡｓｎ；位置４１３がＴｈｒまたはＳｅｒ；位置４１５がＧｌｕまたはＳｅｒ；位置４１６がＧｌｕ；及び位置４２１がＰｈｅ
の１１個の位置を含む、本発明１０５４のタンパク質。
［本発明１０５６］
前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号４～２９、１０１～１６４、及び２３９～２５２のいずれか１つのアミノ酸１１１～２１７に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有するＣＨ３ドメインを有する、本発明１０５４または１０５５のタンパク質。
［本発明１０５７］
前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号４～２９、１０１～１６４、及び２３９～２５２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、本発明１０５６のタンパク質。
［本発明１０５８］
配列番号４～２９、１０１～１６４、及び２３９～２５２のいずれか１つのＥＵインデックス位置３８０、３８４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、４１３、４１４、４１５、４１６、４２１、４２４及び４２６に対応する位置のうちの少なくとも５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、または１６個の残基が、欠失または置換されていない、本発明１０５６のタンパク質。
［本発明１０５９］
前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、トランスフェリン受容体のアピカルドメインに結合する、本発明１０４１～１０５８のいずれかのタンパク質。
［本発明１０６０］
前記タンパク質の前記トランスフェリン受容体への前記結合が、トランスフェリンの前記トランスフェリン受容体への結合を実質的に阻害しない、本発明１０４１～１０５９のいずれかのタンパク質。
［本発明１０６１］
前記第１のＦｃポリペプチド及び前記第２のＦｃポリペプチドが、ヘテロ二量体化を促進する１つ以上の改変をそれぞれ含有する、本発明１０４１～１０６０のいずれかのタンパク質。
［本発明１０６２］
ＥＵ付番に従って、前記Ｆｃポリペプチドのうちの一方が、Ｔ３６６Ｗ置換を有し、他方のＦｃポリペプチドが、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換を有する、本発明１０６１のタンパク質。
［本発明１０６３］
前記第１のＦｃポリペプチドが、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換を含有し、前記第２のＦｃポリペプチドが、Ｔ３６６Ｗ置換を含有する、本発明１０６２のタンパク質。
［本発明１０６４］
前記第１のＦｃポリペプチドが、Ｔ３６６Ｗ置換を含有し、前記第２のＦｃポリペプチドが、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換を含有する、本発明１０６２のタンパク質。
［本発明１０６５］
前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、ネイティブＦｃＲｎ結合部位を含む、本発明１００１～１０６４のいずれかのタンパク質。
［本発明１０６６］
前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、ＦｃＲｎ結合を変化させる改変を含む、本発明１０４１～１０６４のいずれかのタンパク質。
［本発明１０６７］
前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、エフェクター機能を低下させる１つ以上の改変を含む、本発明１０４１～１０６６のいずれかのタンパク質。
［本発明１０６８］
エフェクター機能を低下させる前記改変が、ＥＵ付番に従う位置２３４でのＡｌａ及び位置２３５でのＡｌａの置換である、本発明１０６７のタンパク質。
［本発明１０６９］
前記第１のＦｃポリペプチド及び前記第２のＦｃポリペプチドの両方が、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換を含む、本発明１０６７のタンパク質。
［本発明１０７０］
前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、血清中半減期を延長する、ネイティブＦｃ配列に対する改変を含む、本発明１０４１～１０６９のいずれかのタンパク質。
［本発明１０７１］
前記改変が、ＥＵ付番に従う位置２５２でのＴｙｒ、位置２５４でのＴｈｒ、及び位置２５６でのＧｌｕの置換を含む、本発明１０７０のタンパク質。
［本発明１０７２］
前記改変が、ＥＵ付番に従う位置４２８でのＬｅｕ及び位置４３４でのＳｅｒの置換を含む、本発明１０７０のタンパク質。
［本発明１０７３］
前記改変が、ＥＵ付番に従う位置４３４でのＳｅｒまたはＡｌａの置換を含む、本発明１０７０のタンパク質。
［本発明１０７４］
前記第１のＦｃポリペプチド及び前記第２のＦｃポリペプチドが、エフェクター機能を持たない、本発明１０４１～１０７３のいずれかのタンパク質。
［本発明１０７５］
前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、対応する野生型Ｆｃポリペプチドと比較して、少なくとも７５％、または少なくとも８０％、９０％、９２％、もしくは９５％のアミノ酸配列同一性を有する、本発明１００１～１０７４のいずれかのタンパク質。
［本発明１０７６］
前記対応する野生型Ｆｃポリペプチドが、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドである、本発明１０７５のタンパク質。
［本発明１０７７］
前記第１のＦｃポリペプチド及び／または及び前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号１６５～２３８、２５３～３７０、及び３７７～３８８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、本発明１００１～１０７５のいずれかのタンパク質。
［本発明１０７８］
本発明１００１～１０７７のいずれかのタンパク質及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
［本発明１０７９］
本発明１００１～１０７７のいずれかのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
［本発明１０８０］
本発明１０７９のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
［本発明１０８１］
本発明１０７９のポリヌクレオチドまたは本発明１０８０のベクターを含む、宿主細胞。
［本発明１０８２］
対象を治療する方法であって、前記対象に、本発明１００１～１０７７のいずれかのタンパク質または本発明１０７８の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
［本発明１０８３］
非ヒトトランスジェニック動物であって、
（ａ）（ｉ）配列番号３９２に対して少なくとも９０％の同一性を有するアピカルドメイン、及び（ｉｉ）前記動物のネイティブＴｆＲポリペプチドのトランスフェリン結合部位を含む、キメラＴｆＲポリペプチドをコードする核酸と、
（ｂ）変異体微小管結合タンパク質Ｔａｕ（ＭＡＰＴ）遺伝子の導入遺伝子と
を含み、前記キメラＴｆＲポリペプチド及び／または前記Ｔａｕタンパク質が前記動物の脳内で発現する、
前記非ヒトトランスジェニック動物。
［本発明１０８４］
前記アピカルドメインが、配列番号３９２のアミノ酸配列を含む、本発明１０８３の動物。
［本発明１０８５］
前記アピカルドメインが、配列番号３９３、配列番号３９４、または配列番号３９５のアミノ酸配列を含む、本発明１０８３の動物。
［本発明１０８６］
前記キメラＴｆＲポリペプチドが、配列番号３９６に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、本発明１０８３～１０８５のいずれかの動物。
［本発明１０８７］
脳組織、肝組織、腎組織または肺組織中で、対応する同種の野生型動物の同じ組織におけるＴｆＲの発現レベルの２０％以内のキメラＴｆＲポリペプチドのレベルを発現する、本発明１０８３～１０８６のいずれかの動物。
［本発明１０８８］
対応する同種の野生型動物における赤血球数、ヘモグロビンのレベル、またはヘマトクリットのレベルの２０％以内の赤血球数、ヘモグロビンのレベル、またはヘマトクリットのレベルを含む、本発明１０８３～１０８７のいずれかの動物。
［本発明１０８９］
前記アピカルドメインをコードする前記核酸配列が、配列番号３９７に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含む、本発明１０８３～１０８８のいずれかの動物。
［本発明１０９０］
前記キメラＴｆＲポリペプチドをコードする前記核酸に関してホモ接合性またはヘテロ接合性である、本発明１０８３～１０８９のいずれかの動物。
［本発明１０９１］
前記キメラＴｆＲポリペプチドをコードする前記核酸が、前記動物に存在する内因性ＴｆＲポリペプチドをコードする核酸を置き換える、本発明１０８３～１０９０のいずれかの動物。
［本発明１０９２］
前記変異体ＭＡＰＴ遺伝子が、配列番号３９８の配列を基準としてアミノ酸置換Ｐ２７２Ｓを含む変異体ヒトＴａｕタンパク質をコードする、本発明１０８３～１０９１のいずれかの動物。
［本発明１０９３］
マウスまたはラットである、本発明１０８３～１０９２のいずれかの動物。
Ｆａｂ及びフレキシブルリンカーを介したｓｃＦｖにＮ末端で非対称に融合された、例示的な操作されたＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを示す。示されるように、Ｆａｂは、ＴｆＲ結合変異も含む対の片方のノブに融合され、ｓｃＦｖは、対のもう片方のホールに融合されているが、逆の配置も可能である。図は、出現順に、それぞれ配列番号３９０及び５７３を開示する。 Ｎ末端でＦａｂと融合され、Ｆｃの片方のそれぞれのＣ末端にフレキシブルリンカーを介して可変ドメインが融合された、例示的な操作されたＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを示す。示されるように、ＶＬは、ＴｆＲ結合変異も含む対の片方のノブに融合され、ＶＨは、対のもう片方のホールに融合されているが、逆の配置も可能である。図は、配列番号５７４を開示する。 Ｎ末端でＦａｂと、Ｃ末端でフレキシブルリンカーを介してｓｃＦｖと融合された、例示的な操作されたＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを示す。ｓｃＦｖが対の片方のホールに融合され、対のもう片方のノブがＴｆＲ結合変異を含むフォーマット。ただし、ｓｃＦｖがノブに融合している場合も可能である。図は、出現順に、それぞれ配列番号５７４及び３９０を開示する。 Ｎ末端でＦａｂと、Ｃ末端でフレキシブルリンカーを介してｓｃＦｖと融合された、例示的な操作されたＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを示す。ｓｃＦｖがノブ及びホールのＣ末端のそれぞれに融合しているフォーマット。 マウスにおけるＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含むＢＡＣＥ１／Ｔａｕ二重特異性タンパク質の薬物動態特性。ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド及び抗ＢＡＣＥ１対照（Ａｂ１５３）を含むＢＡＣＥ１／Ｔａｕ二重特異性タンパク質を１０ｍｇ／ｋｇで野生型マウスに投与し、その血漿中レベルを７日にわたって観察した。Ｆｃの捕捉及び検出を使用して血漿中の抗体レベルを定量し（Ａ）、各分子のクリアランス値（ＣＬ）を算出した（Ｂ）。 マウスにおけるＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含むＢＡＣＥ１／Ｔａｕ二重特異性タンパク質の薬物動態特性。ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド及び抗ＢＡＣＥ１対照（Ａｂ１５３）を含むＢＡＣＥ１／Ｔａｕ二重特異性タンパク質を１０ｍｇ／ｋｇで野生型マウスに投与し、その血漿中レベルを７日にわたって観察した。Ｆｃの捕捉及び検出を使用して血漿中の抗体レベルを定量し（Ａ）、各分子のクリアランス値（ＣＬ）を算出した（Ｂ）。 マウスにおけるＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含むＢＡＣＥ１／Ｔａｕ二重特異性タンパク質の薬物動態特性。ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド及び抗ＢＡＣＥ１対照（Ａｂ１５３）を含むＢＡＣＥ１／Ｔａｕ二重特異性タンパク質を１０ｍｇ／ｋｇで野生型マウスに投与し、その血漿中レベルを７日にわたって観察した。ＢＡＣＥ１ ｓｃＦｖ及びＣ末端Ｆｖがｉｎ ｖｉｖｏでインタクトのままであるかどうかを調べるために、Ｆｃ検出によるＢＡＣＥ１（Ｃ）及びＴａｕ（Ｅ）の親和性捕捉を使用した。ＢＡＣＥ１（Ｄ）及びＴａｕ（Ｆ）抗原捕捉の両方とＦｃ検出との間には強い相関があることから、これらの分子が薬物動態の時間全体にわたって、ほぼインタクトであることが示された。 マウスにおけるＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含むＢＡＣＥ１／Ｔａｕ二重特異性タンパク質の薬物動態特性。ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド及び抗ＢＡＣＥ１対照（Ａｂ１５３）を含むＢＡＣＥ１／Ｔａｕ二重特異性タンパク質を１０ｍｇ／ｋｇで野生型マウスに投与し、その血漿中レベルを７日にわたって観察した。ＢＡＣＥ１ ｓｃＦｖ及びＣ末端Ｆｖがｉｎ ｖｉｖｏでインタクトのままであるかどうかを調べるために、Ｆｃ検出によるＢＡＣＥ１（Ｃ）及びＴａｕ（Ｅ）の親和性捕捉を使用した。ＢＡＣＥ１（Ｄ）及びＴａｕ（Ｆ）抗原捕捉の両方とＦｃ検出との間には強い相関があることから、これらの分子が薬物動態の時間全体にわたって、ほぼインタクトであることが示された。 マウスにおけるＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含むＢＡＣＥ１／Ｔａｕ二重特異性タンパク質の薬物動態特性。ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド及び抗ＢＡＣＥ１対照（Ａｂ１５３）を含むＢＡＣＥ１／Ｔａｕ二重特異性タンパク質を１０ｍｇ／ｋｇで野生型マウスに投与し、その血漿中レベルを７日にわたって観察した。ＢＡＣＥ１ ｓｃＦｖ及びＣ末端Ｆｖがｉｎ ｖｉｖｏでインタクトのままであるかどうかを調べるために、Ｆｃ検出によるＢＡＣＥ１（Ｃ）及びＴａｕ（Ｅ）の親和性捕捉を使用した。ＢＡＣＥ１（Ｄ）及びＴａｕ（Ｆ）抗原捕捉の両方とＦｃ検出との間には強い相関があることから、これらの分子が薬物動態の時間全体にわたって、ほぼインタクトであることが示された。 マウスにおけるＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含むＢＡＣＥ１／Ｔａｕ二重特異性タンパク質の薬物動態特性。ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド及び抗ＢＡＣＥ１対照（Ａｂ１５３）を含むＢＡＣＥ１／Ｔａｕ二重特異性タンパク質を１０ｍｇ／ｋｇで野生型マウスに投与し、その血漿中レベルを７日にわたって観察した。ＢＡＣＥ１ ｓｃＦｖ及びＣ末端Ｆｖがｉｎ ｖｉｖｏでインタクトのままであるかどうかを調べるために、Ｆｃ検出によるＢＡＣＥ１（Ｃ）及びＴａｕ（Ｅ）の親和性捕捉を使用した。ＢＡＣＥ１（Ｄ）及びＴａｕ（Ｆ）抗原捕捉の両方とＦｃ検出との間には強い相関があることから、これらの分子が薬物動態の時間全体にわたって、ほぼインタクトであることが示された。 マウスにおけるＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含む追加のＢＡＣＥ１／Ｔａｕ二重特異性タンパク質の薬物動態特性。ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含むＢＡＣＥ１／Ｔａｕ二重特異性タンパク質及び抗ＲＳＶ陰性対照抗体（Ａｂ１２２）を１０ｍｇ／ｋｇで野生型マウスに投与し、その血漿中レベルを７日にわたって観察した。Ｆｃの捕捉及び検出を使用して血漿中の抗体レベルを定量し（Ａ）、各分子のクリアランス値（ＣＬ）を算出した（Ｂ）。ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含むＢＡＣＥ１／Ｔａｕ二重特異性タンパク質は全て、対照抗体の１．５～２倍以内及びＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含む対照抗Ｔａｕ抗体の１．５倍以内である許容可能なクリアランス値を有した。 マウスにおけるＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含む追加のＢＡＣＥ１／Ｔａｕ二重特異性タンパク質の薬物動態特性。ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含むＢＡＣＥ１／Ｔａｕ二重特異性タンパク質及び抗ＲＳＶ陰性対照抗体（Ａｂ１２２）を１０ｍｇ／ｋｇで野生型マウスに投与し、その血漿中レベルを７日にわたって観察した。Ｆｃの捕捉及び検出を使用して血漿中の抗体レベルを定量し（Ａ）、各分子のクリアランス値（ＣＬ）を算出した（Ｂ）。ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含むＢＡＣＥ１／Ｔａｕ二重特異性タンパク質は全て、対照抗体の１．５～２倍以内及びＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含む対照抗Ｔａｕ抗体の１．５倍以内である許容可能なクリアランス値を有した。 ヒトＴｆＲノックイン（ｈＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩ）マウスにおけるＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含む追加のＢＡＣＥ１／Ｔａｕ二重特異性タンパク質の薬物動態特性。ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含むＢＡＣＥ１／Ｔａｕ二重特異性タンパク質及び抗ＲＳＶ陰性対照抗体（Ａｂ１２２）を１０ｍｇ／ｋｇでｈＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスに投与し、その血漿中レベルを７日にわたって観察した。Ｆｃの捕捉及び検出を使用して血漿中の抗体レベルを定量し（Ａ）、各分子のクリアランス値（ＣＬ）を算出した（Ｂ）。二重特異性タンパク質は全て、ＴｆＲ結合及び標的を介したクリアランスに起因して、対照のＡｂ１２２または１Ｃ７よりも速いクリアランスを示した。ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含むＢＡＣＥ１／Ｔａｕ二重特異性タンパク質は全て、ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含む対照抗Ｔａｕ抗体の２倍以内である許容可能なクリアランス値を有した。 ヒトＴｆＲノックイン（ｈＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩ）マウスにおけるＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含む追加のＢＡＣＥ１／Ｔａｕ二重特異性タンパク質の薬物動態特性。ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含むＢＡＣＥ１／Ｔａｕ二重特異性タンパク質及び抗ＲＳＶ陰性対照抗体（Ａｂ１２２）を１０ｍｇ／ｋｇでｈＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスに投与し、その血漿中レベルを７日にわたって観察した。Ｆｃの捕捉及び検出を使用して血漿中の抗体レベルを定量し（Ａ）、各分子のクリアランス値（ＣＬ）を算出した（Ｂ）。二重特異性タンパク質は全て、ＴｆＲ結合及び標的を介したクリアランスに起因して、対照のＡｂ１２２または１Ｃ７よりも速いクリアランスを示した。ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含むＢＡＣＥ１／Ｔａｕ二重特異性タンパク質は全て、ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含む対照抗Ｔａｕ抗体の２倍以内である許容可能なクリアランス値を有した。 ＰＳ１９／ｈＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスにおけるＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含む追加のＢＡＣＥ１／Ｔａｕ二重特異性タンパク質の薬物動態特性。ＰＳ１９／ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスに指定の分子を５０ｍｇ／ｋｇで単回静脈内注射した後の様々な時点におけるコンストラクト２８、４６、及び６２の血漿及び脳中ｈｕＩｇＧ１濃度。特定の分子について、後半の時点で欠落しているポイントは、値が定量下限値を下回るからである。グラフは全て平均±ＳＥＭを表し、１グループにつきマウスｎ＝５である。 ＰＳ１９／ｈＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスにおけるＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含む追加のＢＡＣＥ１／Ｔａｕ二重特異性タンパク質の薬物動態特性。ＰＳ１９／ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスに指定の分子を５０ｍｇ／ｋｇで単回静脈内注射した後の様々な時点におけるコンストラクト２８、４６、及び６２の血漿及び脳中ｈｕＩｇＧ１濃度。特定の分子について、後半の時点で欠落しているポイントは、値が定量下限値を下回るからである。グラフは全て平均±ＳＥＭを表し、１グループにつきマウスｎ＝５である。 ＰＳ１９／ｈＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスにおけるＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含む追加のＢＡＣＥ１／Ｔａｕ二重特異性タンパク質の薬物動態特性。（Ａ）及び（Ｂ）のデータから得た投与後２４時間におけるコンストラクト２８、４６、及び６２の脳－血漿比及びクリアランス値。 ＰＳ１９／ｈＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスにおけるＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含む追加のＢＡＣＥ１／Ｔａｕ二重特異性タンパク質の薬物動態特性。コンストラクト６２及び７５～７７の血漿中ｈｕＩｇＧ１濃度。グラフは全て平均±ＳＥＭを表し、１グループにつきマウスｎ＝５である。 ＰＳ１９／ｈＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスにおけるＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含む追加のＢＡＣＥ１／Ｔａｕ二重特異性タンパク質の薬物動態特性。（Ｄ）のデータから得たコンストラクト６２及び７５～７７の血漿クリアランス値。 ＰＳ１９／ｈＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスにおけるＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含む追加のＢＡＣＥ１／Ｔａｕ二重特異性タンパク質の薬物動態特性。コンストラクト６２及び７５～７７の脳内ｈｕＩｇＧ１濃度。グラフは全て平均±ＳＥＭを表し、１グループにつきマウスｎ＝５である。 ＰＳ１９／ｈＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスにおけるＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含む追加のＢＡＣＥ１／Ｔａｕ二重特異性タンパク質の薬物動態特性。（Ｆ）のデータから得たコンストラクト６２及び７５～７７の脳内ｈｕＩｇＧ１濃度。 ＰＳ１９／ｈＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスにおけるＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含む追加のＢＡＣＥ１／Ｔａｕ二重特異性タンパク質の薬物動態特性。ＰＳ１９／ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスに指定の分子を５０ｍｇ／ｋｇで単回静脈内注射した後の投与１日後におけるコンストラクト６２及び７５～７７の脳－血漿比。グラフは全て平均±ＳＥＭを表し、１グループにつきマウスｎ＝５である。 ＰＳ１９／ｈＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスにおけるＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含む追加のＢＡＣＥ１／Ｔａｕ二重特異性タンパク質の薬物動態特性。ＰＳ１９／ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスに指定の分子を５０ｍｇ／ｋｇで単回静脈内注射した後の投与１日後におけるコンストラクト６２及び７５～７７の脳－血漿比。 ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含むＢＡＣＥ１／Ｔａｕ二重特異性タンパク質の代替構造は、セルベースアッセイで、Ａβを減少させる。ヒトＡβ４０は、ヒトＡＰＰを安定的に過剰発現するＣＨＯ細胞を指定の抗体で２４時間処理した培地から測定した。クローン３５．２３．４：１Ｃ７－１Ｃ７に融合させた２Ｈ８の全てのバージョンとインキュベーションすると、ヒトＡβが、未処理の対照と比較して、用量依存的に減少した。対照ＩｇＧ（Ａｂ１２２）は、Ａβ減少に影響を与えなかった。折れ線グラフは、平均±ＳＥＭを表し、ｎ＝２の独立した実験である。 ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含むＢＡＣＥ１／Ｔａｕ二重特異性タンパク質の代替構造は、セルベースアッセイで、Ａβを減少させる。（Ａ）の実験から得た未処理の対照と比較した細胞ＩＣ５０及びＡβ最大減少率。 ＰＳ１９／ｈＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスにおけるＡβ４０の定量化。ＰＳ１９／ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスに指定の分子を５０ｍｇ／ｋｇで単回静脈内注射した後の様々な時点におけるコンストラクト２８、４６、及び６２の脳及びＣＳＦ Ａβ４０。グラフは全て平均±ＳＥＭを表し、１グループにつきマウスｎ＝５である。 ＰＳ１９／ｈＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスにおけるＡβ４０の定量化。ＰＳ１９／ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスに指定の分子を５０ｍｇ／ｋｇで単回静脈内注射した後の様々な時点におけるコンストラクト２８、４６、及び６２の脳及びＣＳＦ Ａβ４０。グラフは全て平均±ＳＥＭを表し、１グループにつきマウスｎ＝５である。 ＰＳ１９／ｈＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスにおけるＡβ４０の定量化。（Ａ）及び（Ｂ）の実験から得たＣＳＦ及び脳における最大Ａβ４０濃度。 ＰＳ１９／ｈＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスにおけるＡβ４０の定量化。ＰＳ１９／ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスにおけるコンストラクト６２及び７５～７７の脳内Ａβ４０。グラフは全て平均±ＳＥＭを表し、１グループにつきマウスｎ＝５である。 ＰＳ１９／ｈＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスにおけるＡβ４０の定量化。コンストラクト６２及び７５～７７の脳Ａβ４０減少率。
Ｉ．序文
本発明者らは、改変されたＦｃポリペプチドを含有し、そのＦｃポリペプチドに非内因性ＴｆＲ結合部位が操作された、いくつかの二重特異性タンパク質フォーマットを開発した。本明細書に記載されるように、本発明者らは、Ｆｃ領域中のある特定のアミノ酸を改変して、Ｆｃポリペプチド中に、ＴｆＲに特異的な新しい結合部位を生成することができることを発見した。ＴｆＲが血液脳関門（ＢＢＢ）上に高度に発現しており、ＴｆＲが自然にトランスフェリンを血液から脳内へ移動させるという事実を利用すると、ＴｆＲ結合部位を含むようにＦｃポリペプチドを改変することは、二重特異性タンパク質がＢＢＢを通過して輸送されることを促進し得る。このアプローチは、２つの抗原に特異的に結合する二重特異性タンパク質の脳への取り込みを実質的に改善することができ、したがって、脳への送達が有利である障害及び疾患の治療に極めて有用である。一例として、２つの抗原に特異的に結合する能力を有し、改変されたＣＨ３ドメインを含みかつトランスフェリン受容体に特異的に結合するＦｃポリペプチドを有する、二重特異性タンパク質が提供される。
本明細書で開示されるように、本明細書に記載される二重特異性タンパク質は、軽鎖のミスペアリングまたはステアリングなく、概ね、単一の細胞内で生成することができる。これらのフォーマットはまた、タンパク質を一価または二価のいずれかで標的に結合させることもできる。いくつかの実施形態では、二重特異性タンパク質は、それぞれの標的抗原に一価で結合する。いくつかの実施形態では、二重特異性タンパク質は、一方の標的抗原に一価で結合し、他方の標的抗原に二価で結合する。いくつかの実施形態では、二重特異性タンパク質は、それぞれの標的抗原に二価で結合する。いくつかの実施形態では、第１の抗原及び第２の抗原は、同じ抗原である。いくつかの実施形態では、第１の抗原及び第２の抗原は、異なる抗原である。
ＩＩ．定義
本明細書で使用する場合、文脈上明らかに別途示されている場合を除き、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という単数形には、複数の指示対象が含まれる。したがって、例えば、「抗体」への言及は、任意選択により、２つ以上のかかる分子の組み合わせなどを含む。
本明細書で使用する場合、「約」及び「およそ」という用語は、数値または範囲で既定された量を修飾するために使用される場合、その数値及び当業者に公知の値からの合理的な差、例えば、±２０％、±１０％、または±５％は、詳述された値の意図する意味の範囲内であることを示す。
本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、その可変領域を介して抗原に特異的に結合し、免疫グロブリンフォールドを有するタンパク質を指す。この用語は、インタクトなポリクローナル抗体、インタクトなモノクローナル抗体、一本鎖抗体、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体、単一特異性抗体、一価抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体を包含する。「抗体」という用語はまた、本明細書で使用する場合、抗原結合特異性を保持する抗体フラグメントも含み、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び二価ｓｃＦｖを含むが、これらに限定されない。抗体は、カッパまたはラムダのいずれかに分類される軽鎖を含有し得る。抗体は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンに分類される重鎖を含有し得、これらはそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥという免疫グロブリンクラスを定義する。
例示的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は、四量体からなる。各四量体は、２つの同一ペアであるポリペプチド鎖から構成され、それぞれのペアは、１本の「軽」鎖（約２５ｋＤ）及び１本の「重」鎖（約５０～７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、抗原認識に主に関与する約１００～１１０個以上のアミノ酸の可変領域を定義する。「可変軽鎖」（ＶＬ）及び「可変重鎖」（ＶＨ）という用語は、それぞれこれらの軽鎖及び重鎖を指す。
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、生殖細胞系列可変（Ｖ）遺伝子、多様性（Ｄ）遺伝子、または連結（Ｊ）遺伝子に由来し（定常（Ｃμ及びＣδ）遺伝子断片には由来しない）、抗原に対する結合特異性を抗体に付与する、抗体重鎖または軽鎖中のドメインを指す。典型的に、抗体可変領域は、４つの保存された「フレームワーク」領域を含み、これらは、３つの超可変「相補性決定領域」の間にある。
「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」という用語は、軽鎖及び重鎖可変領域によって確立される４つのフレームワーク領域を分断する各鎖中の３つの超可変領域を指す。ＣＤＲは、抗原エピトープへの抗体の結合に主に関与する。各鎖のＣＤＲは、典型的に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と呼ばれ、Ｎ末端から順に番号が付けられ、また、典型的に、個々のＣＤＲが位置する鎖によって識別される。したがって、ＶＨ ＣＤＲ３またはＣＤＲ－Ｈ３は、それが見出される抗体の重鎖可変領域中に位置し、一方、ＶＬ ＣＤＲ１またはＣＤＲ－Ｌ１は、それが見出される抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ１である。
異なる軽鎖または重鎖の「フレームワーク領域」または「ＦＲ」は、種内で比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域は、構成要素である軽鎖及び重鎖のフレームワーク領域を合わせたものであり、ＣＤＲを三次元空間に配置させ整列させる機能を持つ。フレームワーク配列は、生殖細胞系列抗体遺伝子配列を含め、公共ＤＮＡデータベースまたは公開リファレンスから取得することができる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、ヒト配列及びマウス配列の生殖細胞系列可変遺伝子配列データベース「ＶＢＡＳＥ２」で確認することができる。
ＣＤＲ及びフレームワーク領域のアミノ酸配列は、当該技術分野においてよく知られている様々な定義、例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース（ＩＭＧＴ）、ＡｂＭ、及び観察された抗原接触（「Ｃｏｎｔａｃｔ」）を使用して決定することができる。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔの定義に従って決定される。ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６２：７３２－７４５（１９９６）を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、及び／またはＣｏｎｔａｃｔの各ＣＤＲ定義の組み合わせによって定義される。
「Ｆｄ部分」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＮ末端部分を指す。典型的に、Ｆｄ部分は、重鎖可変（ＶＨ）領域及び重鎖定常（ＣＨ１）領域を含む。
「Ｆａｂ」という用語は、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域、重鎖可変領域、及び重鎖ＣＨ１定常領域からなる抗原結合フラグメントを指す。
「単鎖可変フラグメント」または「ｓｃＦｖ」という用語は、ペプチドリンカーを介して一緒に連結される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域からなる抗原結合フラグメントを指す。ｓｃＦｖは、定常領域を欠く。
「Ｆｖフラグメント」という用語は、抗原に対する結合部位を一緒に形成する、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域からなる抗原結合フラグメントを指す。
「エピトープ」という用語は、分子、例えば、抗体のＣＤＲが特異的に結合する抗原の部分または領域を指し、数個のアミノ酸、または数個のアミノ酸の一部分、例えば、５個もしくは６個以上、例えば、２０個以上のアミノ酸の一部分、またはそれらのアミノ酸の一部分を含み得る。場合により、エピトープは、例えば、炭水化物、核酸、または脂質に由来する非タンパク質成分を含む。場合により、エピトープは、三次元部分である。したがって、例えば、標的がタンパク質である場合、エピトープは、連続するアミノ酸からなることもあれば（例えば、線状エピトープ）、タンパク質フォールディングによって近接した状態になるタンパク質の異なる部分のアミノ酸からなることもある（例えば、不連続または高次構造エピトープ）。
本明細書で使用する場合、「エピトープを認識する」という文言は、抗体に関して使用する場合、抗体のＣＤＲが、その抗原と、そのエピトープもしくはそのエピトープを含有する抗原の一部分で相互作用するか、または特異的に結合することを意味する。
「ヒト化抗体」は、ＣＤＲ以外の非ヒト免疫グロブリンに由来する配列を最小限で含有する非ヒト供給源（例えば、マウス）由来のキメラ免疫グロブリンである。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ（例えば、２つ）の可変ドメイン（複数可）を含み、そのＣＤＲ領域は、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に実質的に該当し、そのフレームワーク領域は、ヒト免疫グロブリン配列のフレームワーク領域に実質的に該当する。いくつかの場合では、ヒト免疫グロブリンのある特定のフレームワーク領域残基は、例えば、特異性、親和性、及び／または血清中半減期を改善するために、非ヒト種由来の対応する残基に置き換えることができる。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリン配列の少なくとも一部分を含み得る。抗体のヒト化の方法は、当該技術分野において知られている。
「ヒト抗体」または「完全ヒト抗体」は、ヒト重鎖配列及び軽鎖配列を有する抗体であり、典型的に、ヒト生殖細胞系列遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト細胞によって、ヒト抗体レパートリーを利用する非ヒト動物（例えば、ヒト抗体配列を発現するように遺伝子操作されたトランスジェニックマウス）によって、またはファージディスプレイプラットフォームによって産生される。
「特異的に結合する」という用語は、分子（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、または改変されたＦｃポリペプチド（またはその標的結合部分）が、サンプル中のエピトープまたは標的に対して、別のエピトープまたは非標的化合物（例えば、構造的に異なる抗原）に結合するよりも、大きい親和性、大きいアビディティ、及び／または長い時間、当該エピトープまたは標的に結合することを指す。いくつかの実施形態では、エピトープまたは標的に特異的に結合するＦａｂ、ｓｃＦｖ、または改変されたＦｃポリペプチド（またはその標的結合部分）は、他のエピトープまたは非標的化合物よりも、少なくとも５倍大きい親和性で、例えば、少なくとも６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍、またはその以上大きい親和性で、当該エピトープまたは標的に結合する、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、または改変されたＦｃポリペプチド（またはその標的結合部分）である。特定のエピトープまたは標的に関する、「特異的結合」、「特異的に結合する」、または「特異的である」という用語は、本明細書で使用する場合、例えば、その分子が結合するエピトープまたは標的に対する平衡解離定数ＫＤによって表すことができ、例えば、１０－４Ｍ以下、例えば、１０－５Ｍ、１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍ、または１０－１２Ｍである。当業者であれば、ある種に由来する標的に特異的に結合するＦａｂまたはｓｃＦｖは、その標的のオルソログにも特異的に結合することを認識するであろう。
「結合親和性」という用語は、本明細書中、２つの分子間、例えば、ＦａｂもしくはｓｃＦｖと抗原との間、または改変されたＦｃポリペプチド（またはその標的結合部分）と標的との間の非共有結合性相互作用の強さを指すために使用される。したがって、例えば、この用語は、特に指定のない限り、または文脈から明らかな場合を除き、ＦａｂもしくはｓｃＦｖと抗原との間、または改変されたＦｃポリペプチド（またはその標的結合部分）と標的との間の１：１の相互作用を指し得る。結合親和性は、平衡解離定数（ＫＤ）を測定することによって定量され得、これは、解離速度定数（ｋｄ、時間－１）を会合速度定数（ｋａ、時間－１Ｍ－１）で除したものを指す。ＫＤは、複合体形成及び解離のカイネティクスを、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システム；ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）などの結合平衡除外法；及びＢｉｏＬａｙｅｒ干渉法（例えば、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ｏｃｔｅｔプラットフォームの使用）を使用して測定することによって、決定することができる。本明細書で使用する場合、「結合親和性」は、正式な結合親和性、例えば、ＦａｂもしくはｓｃＦｖと抗原との間、または改変されたＦｃポリペプチド（またはその標的結合部分）と標的との間の１：１相互作用を反映する結合親和性だけではなく、ＫＤを計算して多価結合を反映し得る見かけの親和性も含み得る。
「トランスフェリン受容体」または「ＴｆＲ」は、本明細書で使用する場合、トランスフェリン受容体タンパク質１を指す。ヒトトランスフェリン受容体１ポリペプチド配列は、配列番号１００に記載される。他の種に由来するトランスフェリン受容体タンパク質１配列も知られている（例えば、チンパンジー：アクセッション番号ＸＰ＿００３３１０２３８．１、アカゲザル：ＮＰ＿００１２４４２３２．１、イヌ：ＮＰ＿００１００３１１１．１、ウシ：ＮＰ＿００１１９３５０６．１、マウス：ＮＰ＿０３５７６８．１、ラット：ＮＰ＿０７３２０３．１、及びニワトリ：ＮＰ＿９９０５８７．１）。「トランスフェリン受容体」という用語は、トランスフェリン受容体タンパク質１染色体遺伝子座にある遺伝子によってコードされる例示的な参照配列、例えば、ヒト配列のアレルバリアントも包含する。完全長のトランスフェリン受容体タンパク質には、短いＮ末端細胞内領域、膜貫通領域及び大きな細胞外ドメインが含まれる。細胞外ドメインは、プロテアーゼ様ドメイン、ヘリカルドメイン、及びアピカルドメインの３つのドメインを特徴とする。
本明細書で使用する場合、「Ｆｃポリペプチド」という用語は、構造ドメインとしてのＩｇフォールドを特徴とする、天然免疫グロブリン重鎖ポリペプチドのＣ末端領域を指す。Ｆｃポリペプチドは、少なくともＣＨ２ドメイン及び／またはＣＨ３ドメインを含む定常領域配列を含有し、ヒンジ領域の少なくとも一部を含有し得るが、可変領域は含有しない。
「改変されたＦｃポリペプチド」は、野生型免疫グロブリン重鎖Ｆｃポリペプチド配列と比較して、少なくとも１つの変異、例えば、置換、欠失または挿入を有するが、ネイティブＦｃポリペプチドの全体的なＩｇフォールドまたは構造を保持する、Ｆｃポリペプチドを指す。
本明細書で使用する場合、「ＦｃＲｎ」は、胎児性Ｆｃ受容体を指す。ＦｃポリペプチドのＦｃＲｎへの結合は、Ｆｃポリペプチドのクリアランスを低下させ、血清中半減期を延長する。ヒトＦｃＲｎタンパク質は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩタンパク質に類似した約５０ｋＤａのサイズのタンパク質と、約１５ｋＤａのサイズのβ２－ミクログロブリンとからなる、ヘテロ二量体である。
本明細書で使用する場合、「ＦｃＲｎ結合部位」は、ＦｃＲｎに結合するＦｃポリペプチドの領域を指す。ヒトＩｇＧでは、ＦｃＲｎ結合部位は、ＥＵインデックスを使用して付番した場合、Ｌ２５１、Ｍ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｒ２５５、Ｔ２５６、Ｍ４２８、Ｈ４３３、Ｎ４３４、Ｈ４３５、及びＹ４３６を含む。これらの位置は、配列番号１の位置２１～２６、１９８、及び２０３～２０６に対応する。
本明細書で使用する場合、「ネイティブＦｃＲｎ結合部位」は、ＦｃＲｎに結合し、かつＦｃＲｎに結合するネイティブＦｃポリペプチドの領域と同じアミノ酸配列を有する、Ｆｃポリペプチドの領域を指す。
本明細書で使用する場合、「ＣＨ３ドメイン」及び「ＣＨ２ドメイン」という用語は、免疫グロブリン定常領域ドメインポリペプチドを指す。本出願の目的のために、ＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＥＵ付番スキームに従って付番した位置３４１付近～位置４４７付近のアミノ酸セグメントを指し、ＣＨ２ドメインポリペプチドは、ＥＵ付番スキームに従って付番した位置２３１付近～位置３４０付近のアミノ酸セグメントを指し、ヒンジ領域配列を含まない。ＣＨ２ドメインポリペプチド及びＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＩＭＧＴ（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ）付番スキームによって付番される場合もあり、その場合、ＩＭＧＴ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃチャート付番（ＩＭＧＴウェブサイト）に従って、ＣＨ２ドメインの付番は１～１１０であり、ＣＨ３ドメインの付番は１～１０７である。ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインは、免疫グロブリンのＦｃ領域の一部である。Ｆｃ領域は、ＥＵ付番スキームに従って付番した位置２３１付近～位置４４７付近のアミノ酸セグメントを指すが、本明細書で使用する場合、抗体のヒンジ領域の少なくとも一部を含み得る。例示的なヒンジ領域配列は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号３７６）である。
「野生型」、「ネイティブ」及び「天然」という用語は、ＣＨ３ドメインまたはＣＨ２ドメインに関して使用する場合、自然に生じる配列を有するドメインを指す。
本明細書で使用する場合、「変異体」という用語は、変異体ポリペプチドまたは変異体ポリヌクレオチドに関して使用する場合、「バリアント」と互換的に使用される。所与の野生型ＣＨ３またはＣＨ２ドメイン参照配列に対するバリアントは、天然アレルバリアントを含み得る。「非天然」のＣＨ３又はＣＨ２ドメインは、天然の細胞には存在しないものであり、遺伝子改変によって、例えば、遺伝子工学技術又は変異導入技術を使用して作製された、ネイティブＣＨ３ドメイン又はＣＨ２ドメインポリヌクレオチド又はポリペプチドのバリアント又は変異体ドメインを指す。「バリアント」は、野生型に対して少なくとも１つのアミノ酸変異を含む、任意のドメインを含む。変異は、置換、挿入、及び欠失を含み得る。
「単離された」という用語は、核酸またはタンパク質に関して使用する場合、その核酸またはタンパク質が、自然の状態で付随する他の細胞構成成分を本質的に含まないことを示す。好ましくは、均一な状態にある。純度及び均一性は、典型的に、電気泳動（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、高速液体クロマトグラフィー）などの分析化学技術を使用して決定される。いくつかの実施形態では、単離された核酸またはタンパク質は、少なくとも８５％純粋、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、または少なくとも９９％純粋である。
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸及び合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣物を指す。天然は、遺伝コードによってコードされているアミノ酸だけでなく、それらのアミノ酸が後に修飾されたもの、例えば、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタミン酸、及びＯ－ホスホセリンもある。天然α－アミノ酸には、限定するものではないが、アラニン（Ａｌａ）、システイン（Ｃｙｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アルギニン（Ａｒｇ）、リジン（Ｌｙｓ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、プロリン（Ｐｒｏ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、バリン（Ｖａｌ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、及びそれらの組み合わせが含まれる。天然α－アミノ酸の立体異性体には、限定するものではないが、Ｄ－アラニン（Ｄ－Ａｌａ）、Ｄ－システイン（Ｄ－Ｃｙｓ）、Ｄ－アスパラギン酸（Ｄ－Ａｓｐ）、Ｄ－グルタミン酸（Ｄ－Ｇｌｕ）、Ｄ－フェニルアラニン（Ｄ－Ｐｈｅ）、Ｄ－ヒスチジン（Ｄ－Ｈｉｓ）、Ｄ－イソロイシン（Ｄ－Ｉｌｅ）、Ｄ－アルギニン（Ｄ－Ａｒｇ）、Ｄ－リジン（Ｄ－Ｌｙｓ）、Ｄ－ロイシン（Ｄ－Ｌｅｕ）、Ｄ－メチオニン（Ｄ－Ｍｅｔ）、Ｄ－アスパラギン（Ｄ－Ａｓｎ）、Ｄ－プロリン（Ｄ－Ｐｒｏ）、Ｄ－グルタミン（Ｄ－Ｇｌｎ）、Ｄ－セリン（Ｄ－Ｓｅｒ）、Ｄ－トレオニン（Ｄ－Ｔｈｒ）、Ｄ－バリン（Ｄ－Ｖａｌ）、Ｄ－トリプトファン（Ｄ－Ｔｒｐ）、Ｄ－チロシン（Ｄ－Ｔｙｒ）、及びそれらの組み合わせが含まれる。「アミノ酸類似体」は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合しているα炭素を有する化合物を指し、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。「アミノ酸模倣体」は、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様に機能する、化合物を指す。アミノ酸は、本明細書中、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨される、一般的に知られている三文字表記または一文字表記のいずれかで示され得る。
「ポリペプチド」及び「ペプチド」という用語は、本明細書において互換的に使用され、一本鎖のアミノ酸残基の重合体を指す。この用語は、天然アミノ酸重合体及び非天然アミノ酸重合体だけでなく、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工的な化学模倣体であるアミノ酸重合体にも適用される。アミノ酸重合体は、全てがＬ－アミノ酸のもの、全てがＤ－アミノ酸のもの、またはＬアミノ酸とＤアミノ酸の混合物を含み得る。
本明細書で使用する「タンパク質」という用語は、一本鎖ポリペプチドのポリペプチドまたは二量体（すなわち、２つ）または多量体（すなわち、３つ以上）のいずれかを指す。一本鎖ポリペプチドのタンパク質は、共有結合、例えば、ジスルフィド結合によって、または非共有結合性相互作用によって、結合され得る。
「リンカー」という用語は、本明細書で使用する場合、２つのペプチドまたはポリペプチド（例えば、ＦｃポリペプチドとｓｃＦｖとの間）を連結して（例えば、共有結合的に連結して）、ペプチドまたはポリペプチドを接続または融合する部分を指す。いくつかの実施形態では、リンカーは、化学的連結を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、１つ以上のアミノ酸残基の長さを有するペプチドを含む。ペプチドまたはポリペプチドを接続または融合させるのに好適なリンカーは、リンカーの長さ、疎水性、柔軟性、剛性、または開裂性などのリンカーの特性に基づいて選択することができる。
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、任意の長さのヌクレオチドの鎖を互換的に指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドもしくは塩基、及び／またはそれらの類似体、あるいはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによって鎖に組み込まれ得る任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えば、メチル化されたヌクレオチド及びそれらの類似体を含み得る。本明細書で企図されるポリヌクレオチドの例としては、一本鎖及び二本鎖のＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖のＲＮＡ、ならびに一本鎖及び二本鎖のＤＮＡ及びＲＮＡの混合物を有するハイブリッド分子が挙げられる。
「保存的置換」及び「保存的変異」という用語は、類似の特徴を有するものとして分類することができる別のアミノ酸を用いたアミノ酸の置換となる変更を指す。このように定義される保存的アミノ酸グループの分類の例としては、Ｇｌｕ（グルタミン酸またはＥ）、Ａｓｐ（アスパラギン酸またはＤ）、Ａｓｎ（アスパラギンまたはＮ）、Ｇｌｎ（グルタミンまたはＱ）、Ｌｙｓ（リジンまたはＫ）、Ａｒｇ（アルギニンまたはＲ）及びＨｉｓ（ヒスチジンまたはＨ）を含む「荷電／極性グループ」；Ｐｈｅ（フェニルアラニンまたはＦ）、Ｔｙｒ（チロシンまたはＹ）、Ｔｒｐ（トリプトファンまたはＷ）及び（ヒスチジンまたはＨ）を含む「芳香族グループ」；ならびにＧｌｙ（グリシンまたはＧ）、Ａｌａ（アラニンまたはＡ）、Ｖａｌ（バリンまたはＶ）、Ｌｅｕ（ロイシンまたはＬ）、Ｉｌｅ（イソロイシンまたはＩ）、Ｍｅｔ（メチオニンまたはＭ）、Ｓｅｒ（セリンまたはＳ）、Ｔｈｒ（トレオニンまたはＴ）及びＣｙｓ（システインまたはＣ）を含む「脂肪族グループ」を挙げることができる。各グループ内において、サブグループを同定することもできる。例えば、荷電または極性アミノ酸のグループは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓで構成される「正に荷電したサブグループ」、Ｇｌｕ及びＡｓｐで構成される「負に荷電したサブグループ」、ならびにＡｓｎ及びＧｌｎで構成される「極性サブグループ」を含むサブグループに細分することができる。別の例では、芳香族または環状のグループは、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ及びＴｒｐで構成される「窒素環サブグループ」、ならびにＰｈｅ及びＴｙｒで構成される「フェニルサブグループ」を含むサブグループに細分することができる。更なる別の例では、脂肪族グループは、サブグループ、例えば、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ及びＡｌａで構成される「脂肪族非極性サブグループ」、ならびにＭｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＣｙｓで構成される「脂肪族微極性サブグループ」に細分することができる。保存的変異の分類の例としては、前述のサブグループ内のアミノ酸のアミノ酸置換、例えば、限定されないが、正電荷を維持することができるような、Ａｒｇの代わりにＬｙｓまたはその逆の置換；負電荷を維持することができるような、Ａｓｐの代わりにＧｌｕまたはその逆の置換；遊離－ＯＨを維持することができるような、Ｔｈｒの代わりにＳｅｒまたはその逆の置換；及び遊離－ＮＨ２を維持することができるような、Ａｓｎの代わりにＧｌｎまたはその逆の置換が挙げられる。いくつかの実施形態では、疎水性アミノ酸は、疎水性を維持するために、例えば、活性部位の天然疎水性アミノ酸の代わりに使用される。
２つ以上のポリペプチド配列との関連における「同一」または「同一性」パーセントという用語は、配列比較アルゴリズムを使用して、または手動アラインメント及び目視確認により判定して、比較ウインドウまたは指定領域にわたって最大の一致を得るように比較及び整列させたとき、２つ以上の配列または部分配列が、同じであるか、特定領域にわたって、例えば、少なくとも６０％の同一性、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％以上同一である特定の割合のアミノ酸残基を有することを指す。
ポリペプチドの配列比較については、典型的に、ある１つのアミノ酸配列が、参照配列の役割を果たし、候補配列と比較される。アラインメントは、当業者に利用可能な様々な方法、例えば、視覚的アラインメントを使用して、または最大アラインメントを達成する既知のアルゴリズムを使用した公的に利用可能なソフトウェアを使用して、実施することができる。そのようなプログラムとしては、ＢＬＡＳＴプログラム、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．）またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）が挙げられる。アラインメントに利用される最大アラインメントを達成するためのパラメーターは、当業者によって決定され得る。本出願のためのポリペプチド配列の配列比較については、デフォルトパラメーターを用いて２つのタンパク質配列を整列させるＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの標準タンパク質ＢＬＡＳＴが使用される。
ポリペプチド配列中の所与のアミノ酸残基を同定する文脈で使用する場合、「～に対応する」、「～を参照して決定される」、または「～を参照して付番される」という用語は、所与のアミノ酸配列を参照配列に対して最大限アライメントして比較したときの、特定の参照配列の残基の位置を指す。したがって、例えば、改変されたＦｃポリペプチド中のアミノ酸残基は、当該残基を配列番号１に対して最適にアラインメントしたときに配列番号１のアミノ酸と一致する場合、配列番号１のアミノ酸に「対応する」。参照配列に対してアラインメントされるポリペプチドは、参照配列と同じ長さである必要はない。
「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用され、限定するものではないが、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（例えば、ラット、マウス、及びモルモット）、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、及び他の哺乳類種を含む、哺乳類を指す。一実施形態では、患者は、ヒトである。
「治療」、「治療すること」などの用語は、一般に、所望の薬理学的作用及び／または生理学的作用を得ることを意味するために本明細書で使用される。「治療すること」または「治療」は、疾患の治療または改善の奏功を示す任意の兆候を指し得、緩和、寛解、患者生存の改善、生存時間もしくは生存率の増大、症状の軽減、または疾患に対する患者の忍容性を高めること、変性もしくは衰退の速度を遅くすること、または患者の身体的もしくは精神的健康を改善することなどの任意の客観的または主観的パラメーターを含む。症状の治療または改善は、客観的または主観的パラメーターに基づくことができる。治療の効果は、治療を受けていない個体もしくは個体のプール、または治療前の同患者もしくは治療中の異なる時点における同患者と比較され得る。
「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、ヒトまたは動物における使用に生物学的または薬理学的に適合性のある非活性の薬剤成分、限定するものではないが、緩衝液、担体、または防腐剤などを指す。
本明細書で使用する場合、剤の「治療量」または「治療上有効な量」は、対象の疾患を治療する剤（例えば、本明細書に記載されるタンパク質のいずれか）の量である。
「投与する」という用語は、剤、化合物、または組成物を所望の生物学的作用部位に送達する方法を指す。これらの方法としては、局所送達、非経口送達、静脈内送達、皮内送達、筋肉内送達、髄腔内送達、結腸送達、直腸送達、または腹腔内送達が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、本明細書に記載されるタンパク質は、静脈内投与される。
ＩＩＩ．二重特異性タンパク質の構造
一態様では、２つの抗原に特異的に結合する能力を有する二重特異性タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、二重特異性タンパク質は、第１の抗原に特異的に結合する抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、またはｓｃＦｖ）及び第２の抗原に特異的に結合する抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、またはｓｃＦｖ）に融合されたＦｃポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性タンパク質のＦｃポリペプチドの一方または両方は、改変されたＦｃポリペプチドである（例えば、ＴｆＲ結合を促進する及び／またはＦｃポリペプチドのヘテロ二量体化を向上させるように改変される）。
いくつかの実施形態では、二重特異性タンパク質は、第１の抗原に一価で結合し、第２の抗原に一価で結合する。いくつかの実施形態では、二重特異性タンパク質は、第１の抗原に二価で結合し、第２の抗原に一価で結合する。いくつかの実施形態では、二重特異性タンパク質は、第１の抗原に一価で結合し、第２の抗原に二価で結合する。いくつかの実施形態では、二重特異性タンパク質は、第１の抗原に二価で結合し、第２の抗原に二価で結合する。
Ｆａｂ－Ｆｃポリペプチド／ｓｃＦｖ－Ｆｃポリペプチド
いくつかの実施形態では、二重特異性タンパク質は、第１の抗原に特異的に結合するＦａｂの一部分及び第２の抗原に特異的に結合するｓｃＦｖに融合されたＦｃポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｆａｂ及びｓｃＦｖは、ＦｃポリペプチドのＮ末端で融合される。いくつかの実施形態では、第１の抗原及び第２の抗原は、同じ抗原である。いくつかの実施形態では、第１の抗原及び第２の抗原は、異なる抗原である。
いくつかの実施形態では、二重特異性タンパク質は、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合するＦａｂのＦｄ部分にＮ末端で融合された第１のＦｃポリペプチドと、
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）にＮ末端で融合された第２のＦｃポリペプチドであって、第１及び第２のＦｃポリペプチドは、Ｆｃ二量体を形成する、第２のＦｃポリペプチドと、
（ｃ）Ｆｄ部分と対合して、第１の抗原に特異的に結合するＦａｂを形成する、軽鎖ポリペプチドと
を含み、
第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、改変されたＣＨ２ドメインまたは改変されたＣＨ３ドメインを含み、ＴｆＲに特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、改変されたＣＨ３ドメインを含み、ＴｆＲに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、改変されたＣＨ３ドメインを含み、ＴｆＲに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドの両方は、改変されたＣＨ３ドメインを含み、ＴｆＲに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＴｆＲ結合を促進する及び／またはヘテロ二量体化を向上させる改変を１つ以上含む。改変されたＦｃポリペプチドは、以下のセクションＩＶに更に記載される。いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドの一方は、配列番号１の配列を有するネイティブ（すなわち、野生型）免疫グロブリン重鎖Ｆｃポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、タンパク質は、第１の抗原に特異的に結合するＦａｂを含む。Ｆａｂは、ＦａｂのＦｄ部分の軽鎖との対合から形成され、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合される。
いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、第１のリンカーを介して、ｓｃＦｖにＮ末端で融合される。いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、約１～約５０アミノ酸、例えば、約１～約４０、約１～約３０、約１～約２５、約１～約２０、約１～約１５、約１～約１０、約２～約４０、約２～約３０、約２～約２０、約２～約１０、約５～約４０、約５～約３０、約５～約２５、または約５～約２０アミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸の長さを有する。
いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、フレキシブルリンカーを含む。いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、グリシン－セリンリンカーを含み、すなわち、リンカーは、グリシン及びセリン残基のストレッチから主にまたは完全に構成される。いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカー（配列番号３７１）（ＧＧＧＧＳ）ｎ （配列番号３７１）を含み、「ｎ」は、モチーフの繰り返し数を示す。いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、Ｇ４Ｓ（ＧＧＧＧＳ；配列番号３７１）リンカー、（Ｇ４Ｓ）２（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号３７２）リンカー、（Ｇ４Ｓ）３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号３７３）リンカー、または（Ｇ４Ｓ）２－Ｇ４リンカー（配列番号３８９）を含み、そこで改変は。いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、Ｇ４Ｓリンカー（配列番号３７１）を含む。いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、（Ｇ４Ｓ）２リンカー（配列番号３７２）を含む。いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号３７３）を含む。いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、（Ｇ４Ｓ）２－Ｇ４リンカー（配列番号３８９）を含む。
いくつかの実施形態では、第２の抗原に特異的に結合するｓｃＦｖは、第２の抗原に特異的に結合する抗体または抗体フラグメントに由来する重鎖可変（ＶＨ）領域配列及び軽鎖可変（ＶＬ）領域配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドに融合されるｓｃＦｖのＶＬ領域及びＶＨ領域の配置は、ＶＬ領域－ＶＨ領域である（すなわち、ＶＬ領域のほうがＶＨ領域よりも第２のＦｃポリペプチドに近い）。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドに融合されるｓｃＦｖのＶＬ領域及びＶＨ領域の配置は、ＶＨ領域－ＶＬ領域である（すなわち、ＶＨ領域のほうがＶＬ領域よりも第２のＦｃポリペプチドに近い）。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖのＶＬ領域及びＶＨ領域は、第２のリンカーを介して接続される。いくつかの実施形態では、第２のリンカーは、約１０～約２５アミノ酸、例えば、約１０～約２０、約１２～約２５、約１２～約２０、約１４～約２５、または約１４～約２０アミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、第２のリンカーは、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、第２のリンカーは、フレキシブルリンカーを含む。いくつかの実施形態では、第２のリンカーは、グリシン－セリンリンカー、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカー（配列番号３７１）を含む。いくつかの実施形態では、第２のリンカーは、（Ｇ４Ｓ）２リンカー（配列番号３７２）を含む。いくつかの実施形態では、第２のリンカーは、（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号３７３）を含む。いくつかの実施形態では、第２のリンカーは、（Ｇ４Ｓ）２－Ｇ４リンカー（配列番号３８９）を含む。いくつかの実施形態では、第２のリンカーは、ＲＴＶＡ（Ｇ４Ｓ）２（ＲＴＶＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号４０１）リンカー、（ＲＴＶＡ（Ｇ４Ｓ）３）リンカー（ＲＴＶＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号３９０）、ＡＳＴＫ（Ｇ４Ｓ）２（ＡＳＴＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号４０２）リンカー、またはＡＳＴＫ（Ｇ４Ｓ）３（ＡＳＴＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号３９１）リンカーを含む。
いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドに融合されるｓｃＦｖについて、そのＶＬ領域及びＶＨ領域は、第２のリンカーを介して接続され、ここで、ｓｃＦｖの配置は、ＶＬ領域－第２のリンカー－ＶＨ領域である（すなわち、ＶＬ領域のほうがＶＨ領域よりも第２のＦｃポリペプチドに近い）。いくつかの実施形態では、ＶＬ領域及びＶＨ領域は、第２のリンカーを介して接続され、ここで、ｓｃＦｖの配置は、ＶＨ領域－第２のリンカー－ＶＬ領域である（すなわち、ＶＨ領域のほうがＶＬ領域よりも第２のＦｃポリペプチドに近い）。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、ＶＨ領域及びＶＬ領域のシステイン残基間に１つ以上のジスルフィド架橋を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｋａｂａｔ可変ドメイン付番に従って付番した位置ＶＨ４４及びＶＬ１００のそれぞれにシステインを含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、位置ＶＨ４４及びＶＬ１００のシステイン間のジスルフィド結合を含む。
ｍＡｂ／Ｆｖ
いくつかの実施形態では、二重特異性タンパク質は、第１の抗原に特異的に結合するＦａｂに各Ｎ末端で融合され、第２の抗原に特異的に結合するＦａｂの重鎖可変領域または軽鎖可変領域にＣ末端で融合され、それにより、第１の抗原に二価で結合し、第２の抗原に一価で結合するタンパク質を形成する、Ｆｃポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原及び第２の抗原は、同じ抗原である。いくつかの実施形態では、第１の抗原及び第２の抗原は、異なる抗原である。
いくつかの実施形態では、二重特異性タンパク質は、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合するＦａｂのＦｄ部分にＮ末端で融合され、第２の抗原に特異的に結合するＦａｂの重鎖可変領域または軽鎖可変領域にＣ末端で融合された、第１のＦｃポリペプチドと、
（ｂ）第１の抗原に特異的に結合するＦａｂのＦｄ部分にＮ末端で融合され、（ａ）に詳述される重鎖可変領域または軽鎖可変領域の他方にＣ末端で融合された、第２のＦｃポリペプチドであって、
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、第２の抗原に特異的に結合するＦｖフラグメントを一緒に形成し、第１及び第２のＦｃポリペプチドは、Ｆｃ二量体を形成する、第２のＦｃポリペプチドと、
（ｃ）（ａ）及び（ｂ）に詳述されるＦｄ部分のそれぞれと対合して、第１の抗原に特異的に結合するＦａｂを形成する、軽鎖ポリペプチドと
を含み、
第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、改変されたＣＨ２ドメインまたは改変されたＣＨ３ドメインを含み、ＴｆＲに特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、改変されたＣＨ３ドメインを含み、ＴｆＲに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、改変されたＣＨ３ドメインを含み、ＴｆＲに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドの両方は、改変されたＣＨ３ドメインを含み、ＴｆＲに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＴｆＲ結合を促進する及び／またはヘテロ二量体化を向上させる改変を１つ以上含む。改変されたＦｃポリペプチドは、以下のセクションＩＶに更に記載される。いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドの一方は、配列番号１の配列を有するネイティブ（すなわち、野生型）免疫グロブリン重鎖Ｆｃポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、（ａ）に詳述されるＦｄ部分は、（ｂ）に詳述されるＦｄ部分と同一の重鎖ＣＤＲ配列を含む。いくつかの実施形態では、（ａ）に詳述されるＦｄ部分は、（ｂ）に詳述されるＦｄ部分と同一の重鎖可変領域配列を含む。いくつかの実施形態では、（ａ）に詳述されるＦｄ部分は、（ｂ）に詳述されるＦｄ部分と同一の配列を有する。
いくつかの実施形態では、（ａ）に詳述されるＦｄ部分と（ｃ）に詳述される軽鎖ポリペプチドとの対合から形成される、第１の抗原に特異的に結合するＦａｂは、（ｂ）に詳述されるＦｄ部分と（ｃ）に詳述される軽鎖ポリペプチドとの対合から形成される、第１の抗原に特異的に結合するＦａｂと同一である。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、Ｆｖフラグメントの重鎖可変領域に融合され、第２のＦｃポリペプチドは、Ｆｖフラグメントの軽鎖可変領域に融合される。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、Ｆｖフラグメントの軽鎖可変領域に融合され、第２のＦｃポリペプチドは、Ｆｖフラグメントの重鎖可変領域に融合される。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、第１のリンカーを介して、重鎖可変領域または軽鎖可変領域にＣ末端で融合される。いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、約１～約５０アミノ酸、例えば、約１～約４０、約１～約３０、約１～約２５、約１～約２０、約１～約１５、約１～約１０、約２～約４０、約２～約３０、約２～約２０、約２～約１０、約５～約４０、約５～約３０、約５～約２５、または約５～約２０アミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド上の第１のリンカーは、第２のＦｃポリペプチド上の第１のリンカーと同じである。
いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、フレキシブルリンカーを含む。いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、グリシン－セリンリンカー、例えば、Ｇ４Ｓリンカー（配列番号３７１）、（Ｇ４Ｓ）２リンカー（配列番号３７２）、（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号３７３）、または（Ｇ４Ｓ）２－Ｇ４リンカー（配列番号３８９）などの（Ｇ４Ｓ）ｎリンカー（配列番号３７１）を含む。いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、Ｇ４Ｓリンカー（配列番号３７１）を含む。いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、（Ｇ４Ｓ）２リンカー（配列番号３７２）を含む。いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号３７３）を含む。いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、（Ｇ４Ｓ）２－Ｇ４リンカー（配列番号３８９）を含む。
ｍＡｂ／ｓｃＦｖ
いくつかの実施形態では、二重特異性タンパク質は、第１の抗原に特異的に結合するＦａｂに各Ｎ末端で融合され、第２の抗原に特異的に結合するｓｃＦｖに一方または両方のＦｃポリペプチドのＣ末端で融合された、Ｆｃポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原及び第２の抗原は、同じ抗原である。いくつかの実施形態では、第１の抗原及び第２の抗原は、異なる抗原である。
いくつかの実施形態では、二重特異性タンパク質は、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合するＦａｂのＦｄ部分にＮ末端で融合された第１のＦｃポリペプチドと、
（ｂ）第１の抗原に特異的に結合するＦａｂのＦｄ部分にＮ末端で融合された第２のＦｃポリペプチドであって、第１及びＦｃポリペプチドは、Ｆｃ二量体を形成する、第２のＦｃポリペプチドと、
（ｃ）（ａ）及び（ｂ）に詳述されるＦｄ部分のそれぞれと対合して、第１の抗原に特異的に結合するＦａｂを形成する、軽鎖ポリペプチドと
を含み、
第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、第２の抗原に特異的に結合するｓｃＦｖにＣ末端で融合され、
第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、改変されたＣＨ２ドメインまたは改変されたＣＨ３ドメインを含み、ＴｆＲに特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、改変されたＣＨ３ドメインを含み、ＴｆＲに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、改変されたＣＨ３ドメインを含み、ＴｆＲに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドの両方は、改変されたＣＨ３ドメインを含み、ＴｆＲに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＴｆＲ結合を促進する及び／またはヘテロ二量体化を向上させる改変を１つ以上含む。改変されたＦｃポリペプチドは、以下のセクションＩＶに更に記載される。いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドの一方は、配列番号１の配列を有するネイティブ（すなわち、野生型）免疫グロブリン重鎖Ｆｃポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、（ａ）に詳述されるＦｄ部分は、（ｂ）に詳述されるＦｄ部分と同一の重鎖ＣＤＲ配列を含む。いくつかの実施形態では、（ａ）に詳述されるＦｄ部分は、（ｂ）に詳述されるＦｄ部分と同一の重鎖可変領域配列を含む。いくつかの実施形態では、（ａ）に詳述されるＦｄ部分は、（ｂ）に詳述されるＦｄ部分と同一の配列を有する。
いくつかの実施形態では、（ａ）に詳述されるＦｄ部分と（ｃ）に詳述される軽鎖ポリペプチドとの対合から形成される、第１の抗原に特異的に結合するＦａｂは、（ｂ）に詳述されるＦｄ部分と（ｃ）に詳述される軽鎖ポリペプチドとの対合から形成される、第１の抗原に特異的に結合するＦａｂと同一である。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、第２の抗原に特異的に結合するｓｃＦｖにＣ末端で融合される。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、第２の抗原に特異的に結合するｓｃＦｖにＣ末端で融合される。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドのそれぞれは、第２の抗原に特異的に結合するｓｃＦｖにＣ末端で融合される。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドに融合されるｓｃＦｖは、第２のＦｃポリペプチドに融合されるｓｃＦｖのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の配列同一性（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドに融合されるｓｃＦｖは、第２のＦｃポリペプチドに融合されるｓｃＦｖと同一のＣＤＲ（例えば、同一の重鎖ＣＤＲ及び同一の軽鎖ＣＤＲ）を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドに融合されるｓｃＦｖは、第２のＦｃポリペプチドに融合されるｓｃＦｖと同一の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドに融合されるｓｃＦｖは、第２のＦｃポリペプチドに融合されるｓｃＦｖと同一のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、第１のリンカーを介して、ｓｃＦｖに融合される。いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、約１～約５０アミノ酸、例えば、約１～約４０、約１～約３０、約１～約２５、約１～約２０、約１～約１５、約１～約１０、約２～約４０、約２～約３０、約２～約２０、約２～約１０、約５～約４０、約５～約３０、約５～約２５、または約５～約２０アミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸の長さを有する。
いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、フレキシブルリンカーを含む。いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、グリシン－セリンリンカー、例えば、Ｇ４Ｓリンカー（配列番号３７１）、（Ｇ４Ｓ）２リンカー（配列番号３７２）、（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号３７３）、または（Ｇ４Ｓ）２－Ｇ４リンカー（配列番号３８９）などの（Ｇ４Ｓ）ｎリンカー（配列番号３７１）を含む。いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、Ｇ４Ｓリンカー（配列番号３７１）を含む。いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、（Ｇ４Ｓ）２リンカー（配列番号３７２）を含む。いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号３７３）を含む。いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、（Ｇ４Ｓ）２－Ｇ４リンカー（配列番号３８９）を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドに融合されるｓｃＦｖは、第２の抗原に特異的に結合する抗体または抗体フラグメントに由来する重鎖可変（ＶＨ）領域配列及び軽鎖可変（ＶＬ）領域配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドに融合されるｓｃＦｖのＶＬ領域及びＶＨ領域の配置は、ＶＬ領域－ＶＨ領域である（すなわち、ＶＬ領域のほうがＶＨ領域よりも第２のＦｃポリペプチドに近い）。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドに融合されるｓｃＦｖのＶＬ領域及びＶＨ領域の配置は、ＶＨ領域－ＶＬ領域である（すなわち、ＶＨ領域のほうがＶＬ領域よりも第２のＦｃポリペプチドに近い）。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖのＶＬ領域及びＶＨ領域は、第２のリンカーを介して接続される。いくつかの実施形態では、第２のリンカーは、約１０～約２５アミノ酸、例えば、約１０～約２０、約１２～約２５、約１２～約２０、約１４～約２５、または約１４～約２０アミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、第２のリンカーは、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、第２のリンカーは、フレキシブルリンカーを含む。いくつかの実施形態では、第２のリンカーは、グリシン－セリンリンカー、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカー（配列番号３７１）を含む。いくつかの実施形態では、第２のリンカーは、（Ｇ４Ｓ）２リンカー（配列番号３７２）を含む。いくつかの実施形態では、第２のリンカーは、（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号３７３）を含む。いくつかの実施形態では、第２のリンカーは、（Ｇ４Ｓ）２－Ｇ４リンカー（配列番号３８９）を含む。いくつかの実施形態では、第２のリンカーは、ＲＴＶＡ（Ｇ４Ｓ）２リンカー（配列番号４０１）、ＲＴＶＡ（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号３７４）、ＡＳＴＫ（Ｇ４Ｓ）２リンカー（配列番号４０２）、またはＡＳＴＫ（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号３７５）を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドに融合されるｓｃＦｖについて、そのＶＬ領域及びＶＨ領域は、第２のリンカーを介して接続され、ここで、ｓｃＦｖの配置は、ＶＬ領域－第２のリンカー－ＶＨ領域である（すなわち、ＶＬ領域のほうがＶＨ領域よりも第２のＦｃポリペプチドに近い）。いくつかの実施形態では、ＶＬ領域及びＶＨ領域は、第２のリンカーを介して接続され、ここで、ｓｃＦｖの配置は、ＶＨ領域－第２のリンカー－ＶＬ領域である（すなわち、ＶＨ領域のほうがＶＬ領域よりも第２のＦｃポリペプチドに近い）。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドに融合されるｓｃＦｖは、ＶＨ領域及びＶＬ領域のシステイン残基間に１つ以上のジスルフィド架橋を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｋａｂａｔ可変ドメイン付番に従って付番した位置ＶＨ４４及びＶＬ１００のそれぞれにシステインを含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、位置ＶＨ４４及びＶＬ１００のシステイン間のジスルフィド結合を含む。
本明細書で開示される二重特異性タンパク質について、結合親和性、結合カイネティクス、及び交差反応性を分析するための方法は、当該技術分野において知られている。これらの方法としては、固相結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ）、免疫沈降法、表面プラズモン共鳴（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））、結合平衡除外法（例えば、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標））、フローサイトメトリー、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）、ＢｉｏＬａｙｅｒ干渉法（例えば、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ））、及びウェスタンブロット分析が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、結合親和性及び／または交差反応性を決定するために、ＥＬＩＳＡが使用される。ＥＬＩＳＡアッセイを実施するための方法は当該技術分野において公知であり、以下の実施例セクションにも記載されている。いくつかの実施形態では、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、結合親和性、結合カイネティクス及び／または交差反応性を測定する。いくつかの実施形態では、結合親和性、結合カイネティクス、及び／または交差反応性を決定するために、結合平衡除外法が使用される。いくつかの実施形態では、結合親和性、結合カイネティクス、及び／または交差反応性を決定するために、ＢｉｏＬａｙｅｒ干渉法アッセイが使用される。
ＩＶ．血液脳関門（ＢＢＢ）受容体結合のために改変されたＦＣポリペプチド
いくつかの態様において、第１の抗原及び第２の抗原に特異的に結合する二重特異性タンパク質は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過した輸送が可能である。そのようなタンパク質は、ＢＢＢ受容体に結合する、改変されたＦｃポリペプチドを含む。ＢＢＢ受容体は、ＢＢＢ内皮細胞だけでなく、他の種類の細胞及び組織にも発現する。いくつかの実施形態では、ＢＢＢ受容体は、ＴｆＲである。
いくつかの実施形態では、二重特異性タンパク質は、第１のＦｃポリペプチドと、任意選択により、第２のＦｃポリペプチドと、を含み、そのそれぞれは、独立して改変され得る。いくつかの実施形態では、改変により、二重特異性タンパク質がトランスフェリン受容体に特異的に結合することが可能になる。改変は、ＣＨ３ドメインまたはＣＨ２ドメインの表面に存在する特定のアミノ酸セットに導入することができる。いくつかの実施形態では、改変されたＣＨ３またはＣＨ２ドメインを含むＦｃポリペプチドを含む二重特異性タンパク質は、トランスフェリン受容体のアピカルドメイン中のエピトープに特異的に結合する。
様々なＦｃ改変において指定されるアミノ酸残基は、ＢＢＢ受容体、例えば、ＴｆＲに結合する改変されたＦｃポリペプチド中に導入されるものを含め、本明細書において、ＥＵインデックス付番を使用して付番される。任意のＦｃポリペプチド、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドは、本明細書に記載される１つ以上の位置に、改変、例えば、アミノ酸置換を有し得る。当業者であれば、他の免疫グロブリンアイソタイプ、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤなどのＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインが、本明細書に記載される改変（例えば、以下のセット（ｉ）～（ｖｉ）の改変）に対応するドメイン中のアミノ酸を同定することによって、同様に改変され得ることを理解している。改変はまた、他の種、例えば、非ヒト霊長類、サル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、ニワトリなどに由来する免疫グロブリンの対応するドメインに行うこともできる。
ＣＨ３ドメインに変異を含むＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド
いくつかの実施形態では、ＢＢＢ受容体結合活性に関して改変されるドメインは、ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインなどのヒトＩｇ ＣＨ３ドメインである。ＣＨ３ドメインは、任意のＩｇＧサブタイプ、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４に由来するものであり得る。ＩｇＧ１抗体との関連において、ＣＨ３ドメインは、ＥＵ付番スキームに従って付番した位置３４１付近～位置４４７付近のアミノ酸のセグメントを指す。
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変されたＦｃポリペプチドは、ＴｆＲのアピカルドメインに結合し、かつトランスフェリンのＴｆＲへの結合を遮断または別様に阻害することなく、ＴｆＲに結合し得る。いくつかの実施形態では、トランスフェリンのＴｆＲへの結合は、実質的に阻害されない。いくつかの実施形態では、トランスフェリンのＴｆＲへの結合は、約５０％未満（例えば、約４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満または５％未満）阻害される。いくつかの実施形態では、トランスフェリンのＴｆＲへの結合は、約２０％未満（例えば、約１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満または１％未満）阻害される。この結合特異性を示す例示的なＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＥＵ付番に従う位置３８４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、４１３、４１６、及び４２１にアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。
ＣＨ３トランスフェリン受容体結合セット（ｉ）：３８４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、４１３、４１６、及び４２１
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変されたＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う３８４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、４１３、４１６、及び４２１を含むアミノ酸位置のセット（「セットｉ」）に、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つ、典型的には５つ、６つ、７つ、８つ、または９つの置換を含む。これらの位置に導入され得る例示的な置換を表５に示す。
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変されたＦｃポリペプチドは、以下の置換、すなわち、位置３８４のＬｅｕ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、もしくはＶａｌ；位置３８６のＬｅｕ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、もしくはＰｒｏ；位置３８７のＶａｌ、Ｐｒｏ、もしくは酸性アミノ酸；位置３８８の芳香族アミノ酸、例えば、ＴｒｐもしくはＧｌｙ（例えば、Ｔｒｐ）；位置３８９のＶａｌ、Ｓｅｒ、もしくはＡｌａ；位置４１３の酸性アミノ酸、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、もしくはＰｒｏ；位置４１６のＴｈｒもしくは酸性アミノ酸；または位置４２１のＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、もしくはＰｈｅの置換を有する位置を少なくとも１つ含む。いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、セット内の位置のうちの１つ以上における特定のアミノ酸の保存的置換、例えば、同じ電荷の分類、疎水性の分類、側鎖の環構造の分類（例えば、芳香族アミノ酸）、またはサイズの分類、及び／または極性もしくは非極性の分類内のアミノ酸を含み得る。したがって、例えば、Ｉｌｅは、位置３８４、３８６、及び／または位置４１３に存在し得る。いくつかの実施形態では、位置３８７、４１３及び４１６の１つ、２つまたはそれぞれの位置における酸性アミノ酸は、Ｇｌｕである。他の実施形態では、位置３８７、４１３及び４１６の１つ、２つまたはそれぞれの酸性アミノ酸は、Ａｓｐである。いくつかの実施形態では、位置３８４、３８６、３８７、３８８、３８９、４１３、４１６、及び４２１の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つ全ては、本段落に規定されるアミノ酸置換を有する。
いくつかの実施形態では、セット（ｉ）に改変を有する改変されたＦｃポリペプチドは、位置３９０にネイティブのＡｓｎを含む。いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、位置３９０に、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＡｓｐを含む。いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、３８０、３９１、３９２、及び４１５を含む位置に、１つ、２つ、３つ、または４つの置換を更に含む。いくつかの実施形態では、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、またはＧｌｎは、位置３８０に存在し得る。いくつかの実施形態では、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＧｌｎまたはＰｈｅは、位置３９１に存在し得る。いくつかの実施形態では、Ｇｌｎ、ＰｈｅまたはＨｉｓは、位置３９２に存在し得る。いくつかの実施形態では、Ｇｌｕは、位置４１５に存在し得る。
特定の実施形態において、改変されたＦｃポリペプチドは、以下の位置、すなわち、位置３８０のＴｒｐ、Ｌｅｕ、もしくはＧｌｕ；位置３８４のＴｙｒもしくはＰｈｅ；位置３８６のＴｈｒ；位置３８７のＧｌｕ；位置３８８のＴｒｐ；位置３８９のＳｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、もしくはＡｓｎ；位置３９０のＳｅｒもしくはＡｓｎ；位置４１３のＴｈｒもしくはＳｅｒ；位置４１５のＧｌｕもしくはＳｅｒ；位置４１６のＧｌｕ；及び／または位置４２１のＰｈｅから選択される２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０個の位置を含む。いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、以下の１１個の全ての位置、すなわち、位置３８０のＴｒｐ、Ｌｅｕ、もしくはＧｌｕ；位置３８４のＴｙｒもしくはＰｈｅ；位置３８６のＴｈｒ；位置３８７のＧｌｕ；位置３８８のＴｒｐ；位置３８９のＳｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、もしくはＡｓｎ；位置３９０のＳｅｒもしくはＡｓｎ；位置４１３のＴｈｒもしくはＳｅｒ；位置４１５のＧｌｕもしくはＳｅｒ；位置４１６のＧｌｕ；及び／または位置４２１のＰｈｅを含む。
特定の実施形態において、改変されたＦｃポリペプチドは、位置３８４にＬｅｕもしくはＭｅｔ；位置３８６にＬｅｕ、Ｈｉｓ、もしくはＰｒｏ；位置３８７にＶａｌ；位置３８８にＴｒｐ；位置３８９にＶａｌもしくはＡｌａ；位置４１３にＰｒｏ；位置４１６にＴｈｒ；及び／または位置４２１にＴｒｐを含む。いくつかの実施形態では、改変されたＣＨ３ドメインポリペプチドは、位置３９１にＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、またはＰｈｅを更に含む。いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、位置３８０にＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、もしくはＧｌｎ及び／または位置３９２にＧｌｎ、Ｐｈｅ、もしくはＨｉｓを更に含む。いくつかの実施形態では、Ｔｒｐは、位置３８０に存在し、及び／またはＧｌｎは、位置３９２に存在する。いくつかの実施形態では、改変されたＣＨ３ドメインポリペプチドは、位置３８０にＴｒｐを含まない。
他の実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、位置３８４にＴｙｒ；位置３８６にＴｈｒ；位置３８７にＧｌｕもしくはＶａｌ；位置３８８にＴｒｐ；位置３８９にＳｅｒ；位置４１３にＳｅｒもしくはＴｈｒ；位置４１６にＧｌｕ；及び／または位置４２１にＰｈｅを含む。いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、位置３９０にネイティブのＡｓｎを含む。特定の実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、位置３８０にＴｒｐ、Ｔｙｒ、ＬｅｕもしくはＧｌｎ及び／または位置４１５にＧｌｕを更に含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、位置３８０にＴｒｐ及び／または位置４１５にＧｌｕを更に含む。
いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、以下の置換、すなわち、位置３８０のＴｒｐ；位置３８６のＴｈｒ；位置３８８のＴｒｐ；位置３８９のＶａｌ；位置４１３のＳｅｒもしくはＴｈｒ；位置４１５のＧｌｕ；及び／または位置４２１のＰｈｅのうちの１つ以上を含む。
追加の実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、以下：
位置４１４がＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、またはＰｒｏ；位置４２４がＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、またはＬｙｓ；及び位置４２６がＳｅｒ、Ｔｒｐ、またはＧｌｙ
から選択される１つ、２つ、または３つの位置を更に含む。
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号４～２９、１０１～１６４、及び２３９～２５２のいずれか１つのアミノ酸１１１～２１７に対して、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、そのように改変されたＣＨ３ドメインポリペプチドは、配列番号４～２９、１０１～１６４、及び２３９～２５２のいずれか１つのＥＵインデックス位置３８４～３９０及び／または４１３～４２１のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、そのように改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号４～２９、１０１～１６４、及び２３９～２５２のいずれか１つのＥＵインデックス位置３８０～３９０及び／または４１３～４２１のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号４～２９、１０１～１６４、及び２３９～２５２のいずれか１つのＥＵインデックス位置３８０～３９２及び／または４１３～４２６のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１１１～２１７に対して、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有する。ただし、同一性パーセントには、位置３８４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、４１３、４１６、及び４２１のセットは含まれない。
いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号４～２９、１０１～１６４、及び２３９～２５２のいずれか１つに対して、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有する。ただし、配列番号４～２９、１０１～１６４、及び２３９～２５２のいずれか１つの位置３８０、３８４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、４１３、４１４、４１５、４１６、４２１、４２４、及び４２６に対応する位置の少なくとも５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、または１６個は、欠失または置換されていない。
いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号４～２９、１０１～１６４、及び２３９～２５２のいずれか１つに対して、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有し、また、次の位置のうちの５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個または１６個、すなわち、位置３８０のＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、またはＧｌｕ；位置３８４のＬｅｕ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、またはＶａｌ；位置３８６のＬｅｕ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、またはＰｒｏ；位置３８７のＶａｌ、Ｐｒｏ、または酸性アミノ酸（例えば、Ｇｌｕ）；位置３８８の芳香族アミノ酸、例えば、Ｔｒｐ；位置３８９のＶａｌ、Ｓｅｒ、またはＡｌａ；位置３９０のＳｅｒまたはＡｓｎ；位置３９１のＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、またはＰｈｅ；位置３９２のＧｌｎ、Ｐｈｅ、またはＨｉｓ；位置４１３の酸性アミノ酸、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、またはＰｒｏ；位置４１４のＬｙｓ、Ａｒｇ、ＧｌｙまたはＰｒｏ；位置４１５のＧｌｕまたはＳｅｒ；位置４１６のＴｈｒまたは酸性アミノ酸；位置４２１のＴｒｐ、Ｔｙｒ、ＨｉｓまたはＰｈｅ；位置４２４のＳｅｒ、Ｔｈｒ、ＧｌｕまたはＬｙｓ；及び位置４２６のＳｅｒ、Ｔｒｐ、またはＧｌｙを含む。いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号４～２９、１０１～１６４、及び２３９～２５２のいずれか１つに対して、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有し、かつ位置３８０にＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、またはＧｌｕ；位置３８４にＬｅｕ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、またはＶａｌ；位置３８６にＬｅｕ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、またはＰｒｏ；位置３８７にＶａｌ、Ｐｒｏ、または酸性アミノ酸；位置３８８に芳香族アミノ酸、例えば、Ｔｒｐ；位置３８９にＶａｌ、Ｓｅｒ、またはＡｌａ；位置３９０にＳｅｒまたはＡｓｎ；位置３９１にＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、またはＰｈｅ；位置３９２にＧｌｎ、Ｐｈｅ、またはＨｉｓ；位置４１３に酸性アミノ酸（例えば、Ａｓｐ）、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、またはＰｒｏ；位置４１４にＬｙｓ、Ａｒｇ、ＧｌｙまたはＰｒｏ；位置４１５にＧｌｕまたはＳｅｒ；位置４１６にＴｈｒまたは酸性アミノ酸（例えば、Ｇｌｕ）；位置４２１にＴｒｐ、Ｔｙｒ、ＨｉｓまたはＰｈｅ；位置４２４にＳｅｒ、Ｔｈｒ、ＧｌｕまたはＬｙｓ；及び位置４２６にＳｅｒ、Ｔｒｐ、またはＧｌｙを含む、改変されたＣＨ３ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される二重特異性タンパク質は、配列番号４～２９、１０１～１６４、及び２３９～２５２のいずれか１つに対して、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有し、かつＣＨ３ドメイン中に以下の改変、すなわち、位置３８０のＧｌｕ；位置３８４のＴｙｒ；位置３８６のＴｈｒ；位置３８７のＧｌｕ；位置３８８のＴｒｐ；位置３８９のＶａｌまたはＳｅｒ；位置３９０のＡｓｎ；位置３９１のＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、またはＰｈｅ；位置３９２のＧｌｎ、Ｐｈｅ、またはＨｉｓ；位置４１３のＡｓｐ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒ；位置４１４のＬｙｓ；位置４１５のＧｌｕ；位置４１６のＧｌｕ；位置４２１のＰｈｅ；位置４２４のＳｅｒ；及び位置４２６のＳｅｒを含む、改変されたＦｃポリペプチドを含む。
ＣＨ３トランスフェリン受容体結合セット（ｉｉ）：３４５、３４６、３４７、３４９、４３７、４３８、４３９、及び４４０
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変されたＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う３４５、３４６、３４７、３４９、４３７、４３８、４３９、及び４４０を含むアミノ酸位置のセット（「セットｉｉ」）に、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つ、典型的には５つ、６つ、７つ、８つ、または９つの置換を含む。これらの位置に導入され得る例示的な置換を表６に示す。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、位置４３７にＧｌｙ、位置４３８にＰｈｅ、及び／または位置２１３にＡｓｐを含む。いくつかの実施形態では、Ｇｌｕは、位置４４０に存在する。特定の実施形態において、改変されたＣＨ３ドメインポリペプチドは、次の位置での少なくとも１つの置換、すなわち、位置３４５のＰｈｅもしくはＩｌｅ；位置３４６のＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、もしくはＬｙｓ；位置３４７のＴｙｒ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、もしくはＡｓｐ；位置３４９のＴｈｒもしくはＡｌａ；位置４３７のＧｌｙ；位置４３８のＰｈｅ；位置４３９のＨｉｓ Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、もしくはＰｈｅ；または位置４４０のＡｓｐを含む。いくつかの実施形態では、位置３４５、３４６、３４７、３４９、４３７、４３８、４３９、及び４４０の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つ全ては、本段落に規定される置換を有する。いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、セット内の位置のうちの１つ以上における特定のアミノ酸の保存的置換、例えば、同じ電荷の分類、疎水性の分類、側鎖の環構造の分類（例えば、芳香族アミノ酸）、またはサイズの分類、及び／または極性もしくは非極性の分類内のアミノ酸を含み得る。
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号３０～４６のいずれか１つのアミノ酸１１１～２１７に対して、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、そのように改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号３０～４６のいずれか１つのＥＵインデックス位置３４５～３４９及び／または４３７～４４０のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１１１～２１７に対して、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有する。ただし、同一性パーセントには、ＥＵ付番に従う位置３４５、３４６、３４７、３４９、４３７、４３８、４３９、及び４４０のセットは含まれない。いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号３０～４６のいずれか１つに記載されるＥＵインデックス位置３４５～３４９及び／または４３７～４４０のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号３０～４６のいずれか１つに対して、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有し、かつ位置３４５にＰｈｅもしくはＩｌｅ；位置３４６にＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、もしくはＬｙｓ；位置３４７にＴｙｒ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、もしくはＡｓｐ；位置３４９にＴｈｒもしくはＡｌａ；位置４３７にＧｌｙ；位置４３８にＰｈｅ；位置４３９にＨｉｓ Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、もしくはＰｈｅ；または位置４４０にＡｓｐを含む、改変されたＣＨ３ドメインを含む。
ＣＨ２ドメインに変異を含むＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド
いくつかの実施形態では、ＢＢＢ受容体結合活性のために改変されるドメインは、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインなどのヒトＩｇ ＣＨ２ドメインである。ＣＨ２ドメインは、任意のＩｇＧサブタイプ、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４に由来するものであり得る。ＩｇＧ１抗体との関連において、ＣＨ２ドメインは、ＥＵ付番スキームに従って付番した位置２３１付近～位置３４０付近のアミノ酸のセグメントを指す。
上記のように、本発明に従って改変され得るＣＨ２ドメインの残基のセットは、ＥＵ付番に従って付番される。任意のＣＨ２ドメイン、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインは、示される位置の残基に対応する残基の１つ以上のセットにおいて、改変、例えば、アミノ酸置換を有し得る。
一実施形態において、ＴｆＲに特異的に結合する改変されたＦｃポリペプチドは、トランスフェリン受容体のアピカルドメインのエピトープに結合する。改変されたＦｃポリペプチドは、トランスフェリンのその受容体への結合を遮断または別様に阻害することなく、ＴｆＲに結合し得る。いくつかの実施形態では、トランスフェリンのＴｆＲへの結合は、実質的に阻害されない。いくつかの実施形態では、トランスフェリンのＴｆＲへの結合は、約５０％未満（例えば、約４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満または５％未満）阻害される。いくつかの実施形態では、トランスフェリンのＴｆＲへの結合は、約２０％未満（例えば、約１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満または１％未満）阻害される。
ＣＨ２トランスフェリン受容体結合セット（ｉｉｉ）：２７４、２７６、２８３、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、及び２９０
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変されたＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う２７４、２７６、２８３、２８５、２８６、２８７、２８８、及び２９０を含むアミノ酸位置のセット（「セットｉｉｉ」）に、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つ、典型的には５つ、６つ、７つ、８つ、または９つの置換を含む。これらの位置に導入され得る例示的な置換を表１に示す。
いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、位置２８７にＧｌｕ及び／または位置２８８にＴｒｐを含む。いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、次の位置での少なくとも１つの置換、すなわち、位置２７４のＧｌｕ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、もしくはＴｒｐ；位置２７６のＩｌｅ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、もしくはＴｙｒ；位置２８３のＡｓｐ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ａｓｎ、もしくはＰｈｅ；位置２８５のＡｒｇ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、もしくはＧｌｙ；位置２８６のＴｙｒ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、もしくはＶａｌ；位置２８７のＧｌｕ；位置２８８のＴｒｐもしくはＴｙｒ；位置２８９のＧｌｎ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、もしくはＡｓｐ；または位置２９０のＬｅｕ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、もしくはＶａｌを含む。いくつかの実施形態では、位置２７４、２７６、２８３、２８５、２８６、２８７、２８８及び２９０の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたは９つ全ては、本段落に規定される置換を有する。いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、セット内の位置のうちの１つ以上における特定のアミノ酸の保存的置換、例えば、同じ電荷の分類、疎水性の分類、側鎖の環構造の分類（例えば、芳香族アミノ酸）、またはサイズの分類、及び／または極性もしくは非極性の分類内のアミノ酸を含み得る。
いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、位置２７４にＧｌｕ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｓｎ、もしくはＴｙｒ；位置２７６にＩｌｅ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、もしくはＴｙｒ；位置２８３にＡｓｐ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、もしくはＡｓｎ；位置２８５にＡｒｇ、Ｓｅｒ、もしくはＡｌａ；位置２８６にＴｙｒ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、もしくはＶａｌ；位置２８７にＧｌｕ；位置２８８にＴｒｐ；位置２８９にＧｌｎ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、もしくはＶａｌ；及び／または位置２９０にＬｅｕ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、もしくはＴｙｒを含む。いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、位置２８５にＡｒｇ；位置２８６にＴｙｒもしくはＴｒｐ；位置２８７にＧｌｕ；位置２８８にＴｒｐ；及び／または位置２９０にＡｒｇもしくはＴｒｐを含む。
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号４７～６２のいずれか１つのアミノ酸１～１１０に対して、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、そのように改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号４７～６２のいずれか１つのＥＵインデックス位置３７４～２７６及び／または２８３～２９０のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１～１１０に対して、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有する。ただし、同一性パーセントには、ＥＵ付番に従う位置２７４、２７６、２８３、２８５、２８６、２８７、２８８、及び２９０のセットは含まれない。いくつかの実施形態では、改変されたＣＨ２ドメインポリペプチドは、配列番号４７～６２のいずれか１つに記載されるＥＵインデックス位置３７４～２７６及び／または２８３～２９０のアミノ酸を含む。
更なる実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号４７～６２のいずれか１つに対して、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有し、かつ位置２７４にＧｌｕ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｓｎ、もしくはＴｙｒ；位置２７６にＩｌｅ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、もしくはＴｙｒ；位置２８３にＡｓｐ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、もしくはＡｓｎ；位置２８５にＡｒｇ、Ｓｅｒ、もしくはＡｌａ；位置２８６にＴｙｒ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、もしくはＶａｌ；位置２８７にＧｌｕ；位置２８８にＴｒｐ；位置２８９にＧｌｎ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、もしくはＶａｌ；及び／または位置２９０にＬｅｕ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、もしくはＴｙｒを含む、改変されたＣＨ２ドメインを含む。
ＣＨ２トランスフェリン受容体結合セット（ｉｖ）：２７４、２７６、２８３、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、及び２９０
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変されたＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２９５、２９７、２９８、及び２９９を含むアミノ酸位置のセット（「セットｉｖ」）に、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つ、典型的には５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０個の置換を含む。これらの位置に導入され得る例示的な置換を表２に示す。
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変されたＦｃポリペプチドは、位置２７０にＰｒｏ、位置２９５にＧｌｕ、及び／または位置２９７にＴｙｒを含む。いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、次の位置での少なくとも１つの置換、すなわち、位置２６６のＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、もしくはＡｓｐ；位置２６７のＧｌｎ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、もしくはＴｙｒ；位置２６８のＴｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、もしくはＬｅｕ；位置２６９のＰｒｏ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、もしくはＡｓｐ；位置２７０のＰｒｏ、Ｖａｌ、もしくはＰｈｅ；位置２７１のＴｒｐ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、もしくはＧｌｕ；位置２９５のＧｌｕ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、もしくはＴｒｐ；位置２９７のＴｙｒ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、もしくはＡｓｐ；位置２９８のＴｈｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、もしくはＶａｌ；または位置２９９のＴｙｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、もしくはＰｒｏを含む。いくつかの実施形態では、位置２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２９５、２９７、２９８及び２９９の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０個全ては、本段落に規定される置換を有する。いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、セット内の位置のうちの１つ以上における特定のアミノ酸の保存的置換、例えば、同じ電荷の分類、疎水性の分類、側鎖の環構造の分類（例えば、芳香族アミノ酸）、またはサイズの分類、及び／または極性もしくは非極性の分類内のアミノ酸を含み得る。
いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、位置２６６にＰｒｏ、Ｐｈｅ、もしくはＡｌａ；位置２６７にＧｌｎ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、もしくはＩｌｅ；位置２６８にＴｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、もしくはＴｒｐ；位置２６９にＰｒｏ、Ｖａｌ、もしくはＡｌａ；位置２７０にＰｒｏ；位置２７１にＴｒｐもしくはＧｌｎ；位置２９５にＧｌｕ；位置２９７にＴｙｒ；位置２９８にＴｈｒ、Ｈｉｓ、もしくはＧｌｎ；及び／または位置２９９にＴｙｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、もしくはＳｅｒを含む。
いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、位置２６６にＭｅｔ；位置２６７にＬｅｕもしくはＧｌｕ；位置２６８にＴｒｐ；位置２６９にＰｒｏ；位置２７０にＶａｌ；位置２７１にＴｈｒ；位置２９５にＶａｌもしくはＴｈｒ；位置１９７にＨｉｓ；位置１９８にＨｉｓ、Ａｒｇ、もしくはＡｓｎ；及び／または位置２９９にＰｒｏを含む。
いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、位置２６６にＡｓｐ；位置２６７にＡｓｐ；位置２６８にＬｅｕ；位置２６９にＴｈｒ；位置２７０にＰｈｅ；位置２７１にＧｌｎ；位置２９５にＶａｌもしくはＬｅｕ；位置２９７にＶａｌ；位置２９８にＴｈｒ；及び／または位置２９９にＰｒｏを含む。
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号６３～８５のいずれか１つのアミノ酸１～１１０に対して、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、そのように改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号６３～８５のいずれか１つに記載されるＥＵインデックス位置２６６～２７１及び／または２９５～２９９のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１～１１０に対して、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有する。ただし、同一性パーセントには、ＥＵ付番に従う位置２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２９５、２９７、２９８、及び２９９のセットは含まれない。いくつかの実施形態では、改変されたＣＨ２ドメインポリペプチドは、配列番号６３～８５のいずれか１つに記載されるＥＵインデックス位置２６６～２７１及び／または２９５～２９９のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号６３～８５のいずれか１つのアミノ酸３９～７２に対して、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ位置２６６にＰｒｏ、Ｐｈｅ、もしくはＡｌａ；位置２６７にＧｌｎ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、もしくはＩｌｅ；位置２６８にＴｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、もしくはＴｒｐ；位置２６９にＰｒｏ、Ｖａｌ、もしくはＡｌａ；位置２７０にＰｒｏ；位置２７１にＴｒｐもしくはＧｌｎ；位置２９５にＧｌｕ；位置２９７にＴｙｒ；位置２９８にＴｈｒ、Ｈｉｓ、もしくはＧｌｎ；及び／または位置２９９にＴｙｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、もしくはＳｅｒを含む、改変されたＣＨ２ドメインを含む。
ＣＨ２トランスフェリン受容体結合セット（ｖ）：２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２９２、２９３、２９４、２９６、及び３００
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変されたＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２９２、２９３、２９４、２９６、及び３００を含むアミノ酸位置のセット（「セットｖ」）に、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つ、典型的には５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０個の置換を含む。これらの位置に導入され得る例示的な置換を表３に示す。
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変されたＦｃポリペプチドは、次の位置での少なくとも１つの置換、すなわち、位置２６８のＶａｌもしくはＡｓｐ；位置２６９のＰｒｏ、Ｍｅｔ、もしくはＡｓｐ；位置２７０のＰｒｏもしくはＴｒｐ；位置２７１のＡｒｇ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、もしくはＴｈｒ；位置２７２のＭｅｔ、Ｔｙｒ、もしくはＴｒｐ；位置２９２のＬｅｕもしくはＴｒｐ；位置２９３のＴｈｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、もしくはＬｙｓ；位置２９４のＳｅｒ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、もしくはＬｅｕ；位置２９６のＨｉｓ、Ｌｅｕ、もしくはＰｒｏ；または位置３００のＶａｌもしくはＴｒｐを含む。いくつかの実施形態では、位置２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２９２、２９３、２９４、及び３００の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０個全ては、本段落に規定される置換を有する。いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、セット内の位置のうちの１つ以上における特定のアミノ酸の保存的置換、例えば、同じ電荷の分類、疎水性の分類、側鎖の環構造の分類（例えば、芳香族アミノ酸）、またはサイズの分類、及び／または極性もしくは非極性の分類内のアミノ酸を含み得る。
いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、位置２６８にＶａｌ；位置２６９にＰｒｏ；位置２７０にＰｒｏ；位置２７１にＡｒｇもしくはＴｒｐ；位置２７２にＭｅｔ；位置２９２にＬｅｕ；位置２９３にＴｈｒ；位置２９４にＳｅｒ；位置２９６にＨｉｓ；及び／または位置３００にＶａｌを含む。
いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、位置２６８にＡｓｐ；位置２６９にＭｅｔもしくはＡｓｐ；位置２７０にＴｒｐ；位置２７１にＧｌｕもしくはＴｈｒ；位置２７２にＴｙｒもしくはＴｒｐ；位置２９２にＴｒｐ；位置２９３にＶａｌ、Ｉｌｅ、もしくはＬｙｓ；位置２９４にＬｙｓ、Ａｌａ、もしくはＬｅｕ；位置２９６にＬｅｕもしくはＰｒｏ；及び／または位置３００にＴｒｐを含む。
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号８６～９０のいずれか１つのアミノ酸１～１１０に対して、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、そのように改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号８６～９０のいずれか１つに記載されるＥＵインデックス位置２６８～２７２及び／または２９２～３００のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１～１１０に対して、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有する。ただし、同一性パーセントには、ＥＵ付番に従う位置２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２９２、２９３、２９４、２９６、及び３００のセットは含まれない。いくつかの実施形態では、改変されたＣＨ２ドメインポリペプチドは、配列番号８６～９０のいずれか１つに記載されるＥＵインデックス位置２６８～２７２及び／または２９２～３００のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号８６～９０のいずれか１つのアミノ酸４１～７３に対して少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、かつ位置２６８にＶａｌもしくはＡｓｐ；位置２６９にＰｒｏ、Ｍｅｔ、もしくはＡｓｐ；位置２７０にＰｒｏもしくはＴｒｐ；位置２７１にＡｒｇ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、もしくはＴｈｒ；位置２７２にＭｅｔ、Ｔｙｒ、もしくはＴｒｐ；位置２９２にＬｅｕもしくはＴｒｐ；位置２９３にＴｈｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、もしくはＬｙｓ；位置２９４にＳｅｒ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、もしくはＬｅｕ；位置２９６にＨｉｓ、Ｌｅｕ、もしくはＰｒｏ；または位置３００にＶａｌもしくはＴｒｐを含む、改変されたＣＨ２ドメインを含む。
ＣＨ２トランスフェリン受容体結合セット（ｖｉ）：２７２、２７４、２７６、３２２、３２４、３２６、３２９、３３０、及び３３１
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変されたＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う２７２、２７４、２７６、３２２、３２４、３２６、３２９、３３０、及び３３１を含むアミノ酸位置のセット（「セットｖｉ」）に、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つ、典型的には５つ、６つ、７つ、８つ、または９つの置換を含む。これらの位置に導入され得る例示的な置換を表４に示す。
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変されたＦｃポリペプチドは、位置３３０にＴｒｐを含む。いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、次の位置での少なくとも１つの置換、すなわち、位置２７２のＴｒｐ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、もしくはＡｌａ；位置２７４のＴｒｐもしくはＧｌｙ；位置２７６のＴｙｒ、Ａｒｇ、もしくはＧｌｕ；位置３２２のＳｅｒ、Ａｒｇ、もしくはＧｌｎ；位置３２４のＶａｌ、Ｓｅｒ、もしくはＰｈｅ；位置３２６のＩｌｅ、Ｓｅｒ、もしくはＴｒｐ；位置３２９のＴｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、もしくはＡｓｐ；位置３３０のＴｒｐ；または位置３３１のＳｅｒ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、もしくはＶａｌを含む。いくつかの実施形態では、位置２７２、２７４、２７６、３２２、３２４、３２６、３２９、３３０及び３３１の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたは９つ全ては、本段落に規定される置換を有する。いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、セット内の位置のうちの１つ以上における特定のアミノ酸の保存的置換、例えば、同じ電荷の分類、疎水性の分類、側鎖の環構造の分類（例えば、芳香族アミノ酸）、またはサイズの分類、及び／または極性もしくは非極性の分類内のアミノ酸を含み得る。
いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、以下：
位置２７２がＴｒｐ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、またはＡｌａ；位置２７４がＴｒｐまたはＧｌｙ；位置２７６がＴｙｒ、Ａｒｇ、またはＧｌｕ；位置３２２がＳｅｒ、Ａｒｇ、またはＧｌｎ；位置３２４がＶａｌ、Ｓｅｒ、またはＰｈｅ；位置３２６がＩｌｅ、Ｓｅｒ、またはＴｒｐ；位置３２９がＴｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、またはＡｓｐ；位置３３０がＴｒｐ；及び位置３３１がＳｅｒ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、またはＶａｌ
から選択される２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つの位置を含む。いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、位置２７２にＶａｌもしくはＩｌｅ；位置２７４にＧｌｙ；位置２７６にＡｒｇ；位置３２２にＡｒｇ；位置３２４にＳｅｒ；位置３２６にＳｅｒ；位置３２９にＴｈｒ、Ｓｅｒ、もしくはＡｒｇ；位置３３０にＴｒｐ；及び／または位置３３１にＬｙｓもしくはＡｒｇを含む。
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号９１～９５のいずれか１つのアミノ酸１～１１０に対して、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、そのように改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号９１～９５のいずれか１つに記載されるＥＵインデックス位置２７２～２７６及び／または３２２～３３１のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸４～１１３に対して、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有する。ただし、同一性パーセントには、ＥＵ付番に従う位置２７２、２７４、２７６、３２２、３２４、３２６、３２９、３３０、及び３３１のセットは含まれない。いくつかの実施形態では、改変されたＣＨ２ドメインポリペプチドは、配列番号９１～９５のいずれか１つに記載されるＥＵインデックス位置２７２～２７６及び／または３２２～３３１のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、トランスフェリン受容体結合ポリペプチドは、配列番号９１～９５のいずれか１つに対して少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、位置２７２にＴｒｐ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、もしくはＡｌａ；位置２７４にＴｒｐもしくはＧｌｙ；位置２７６にＴｙｒ、Ａｒｇ、もしくはＧｌｕ；位置３２２にＳｅｒ、Ａｒｇ、もしくはＧｌｎ；位置３２４にＶａｌ、Ｓｅｒ、もしくはＰｈｅ；位置３２６にＩｌｅ、Ｓｅｒ、もしくはＴｒｐ；位置３２９にＴｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、もしくはＡｓｐ；位置３３０にＴｒｐ；または位置３３１にＳｅｒ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、もしくはＶａｌを含む、改変されたＣＨ２ドメインを含む。
追加のＦｃポリペプチド改変
いくつかの実施形態では、一方または両方のＦｃポリペプチドは、１つ以上の追加の改変を含有する。一方または両方のＦｃポリペプチドに導入され得る他の変異の非限定的な例としては、例えば、Ｆｃポリペプチドの血清中安定性及び／または半減期を高める変異、エフェクター機能を調節する変異、グリコシル化に影響を与える変異、ヒトにおける免疫原性を低下させる変異、及び／またはノブ及びホールによるヘテロ二量体化をもたらす変異が挙げられる。
いくつかの実施形態では、一方または両方のＦｃポリペプチドは、対応する野生型Ｆｃポリペプチド（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド）に対して、少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ヘテロ二量体の形成を促進し、ホモ二量体の形成を妨げる、ノブホール変異を含む。一般に、この改変は、第１のポリペプチドの界面に突起（「ノブ」）を導入し、第２のポリペプチドの界面に対応する空隙（「ホール」）を導入するものであり、ヘテロ二量体の形成が促進され、ホモ二量体の形成が妨げられるように、突起を空隙内に配置することができる。突起は、第１のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置換することにより構成される。突起と同一または同様のサイズの補完的なくぼみは、大きなアミノ酸側鎖をより小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置換することにより、第２のポリペプチドの界面に生成される。いくつかの実施形態では、そのような追加の変異は、ＢＢＢ受容体、例えば、ＴｆＲへのポリペプチドの結合に悪影響を及ぼさない、Ｆｃポリペプチド中の位置にある。
二量体化のためのノブホールアプローチの例示的な一実施形態では、二重特異性抗体に存在するＦｃポリペプチドのうちの一方の位置３６６（ＥＵ付番スキームに従う付番）は、ネイティブトレオニンの代わりにトリプトファンを含む。二重特異性タンパク質のもう一方のＦｃポリペプチドは、位置４０７（ＥＵ付番スキームに従う付番）にネイティブのチロシンの代わりにバリンを有する。もう一方のＦｃポリペプチドは、位置３６６（ＥＵ付番スキームに従う付番）のネイティブのトレオニンがセリンで置換されている置換、及び位置３６８（ＥＵ付番スキームに従う付番）のネイティブのロイシンがアラニンで置換されている置換を更に含み得る。したがって、二重特異性タンパク質のＦｃポリペプチドの一方は、Ｔ３６６Ｗノブ変異を有し、他方のＦｃポリペプチドは、典型的にＴ３６６Ｓ及びＬ３６８Ａのホール変異を伴う、Ｙ４０７Ｖ変異を有する。
いくつかの実施形態では、一方または両方のＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番スキームに従う位置２５１、２５２、２５４、２５５、２５６、３０７、３０８、３０９、３１１、３１２、３１４、３８５、３８６、３８７、３８９、４２８、４３３、４３４、または４３６のうちの１つ以上に改変を含む。いくつかの実施形態では、変異は、ＥＵ付番に従う位置２５５、２５４、及び２５６のうちの１つ、２つ、または３つに導入される。いくつかの実施形態では、変異は、ＥＵ付番に従うＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅである。したがって、一方または両方のＦｃポリペプチドは、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅ置換を有し得る。いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、変異Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅを更に含む。いくつかの実施形態では、変異は、ＥＵ付番スキームに従う位置４２８及び４３４のうちの１つまたは２つに導入される。いくつかの実施形態では、変異は、ＥＵ付番に従うＭ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ（「ＬＳ」）である。いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、Ｍ４２８Ｌの有無にかかわらず、変異Ｎ４３４Ｓを更に含む。いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う位置Ｔ３０７、Ｅ３８０、及びＮ４３４のうちの１つ、２つまたは３つ全てに置換を含む。いくつかの実施形態では、一方または両方のＦｃポリペプチドは、Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ置換を含む。いくつかの実施形態では、一方または両方のＦｃポリペプチドは、Ｎ４３４ＳまたはＮ４３４Ａ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異は、Ｔ３０７Ｑ及びＮ４３４Ａである。いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、変異Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、及び４３４Ａを含む。いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う位置Ｔ２５０及びＭ４２８に置換を含む。いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、変異Ｔ２５０Ｑ及びＭ４２８Ｌを含む。いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う位置Ｍ４２８及びＮ４３４に置換を含む。いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、置換Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを含む。いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、Ｎ４３４ＳまたはＮ４３４Ａ置換を含む。いくつかの実施形態では、ＴｆＲへの結合を促進する１つ以上の改変を含むＦｃポリペプチドは、ＬＳ置換を含まない。いくつかの実施形態では、ＴｆＲへの結合を促進する１つ以上の改変を含まないＦｃポリペプチドは、ＬＳ置換を含む。いくつかの実施形態では、ＴｆＲへの結合を促進する１つ以上の改変を含むＦｃポリペプチドは、ＬＳ置換を含まず、ＴｆＲへの結合を促進する１つ以上の改変を含まないＦｃポリペプチドは、ＬＳ置換を含む。いくつかの実施形態では、いずれのＦｃポリペプチドもＬＳ置換を含む。
いくつかの実施形態では、一方または両方のＦｃポリペプチドは、エフェクター機能を低下させる改変、すなわち、エフェクター機能を媒介するエフェクター細胞上に発現されるＦｃ受容体に結合すると、ある特定の生物学的機能を誘導する能力を低下させる改変を含み得る。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合と補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、及びＢ細胞活性化が挙げられるが、これらに限定されない。エフェクター機能は、抗体クラスによって変化し得る。例えば、ネイティブヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ３抗体は、免疫系細胞上に存在する適切なＦｃ受容体に結合すると、ＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性を惹起することができ、ネイティブヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４は、免疫系細胞上に存在する適切なＦｃ受容体に結合すると、ＡＤＣＰ機能を惹起することができる。
いくつかの実施形態では、一方または両方のＦｃポリペプチドは、ヘテロ二量体化のための他の改変を含有するように操作されてもよく、例えば、天然に荷電性であるＣＨ３－ＣＨ３界面内の接触残基の静電的操作または疎水性パッチの改変がある。
いくつかの実施形態では、一方または両方のＦｃポリペプチドは、エフェクター機能を調節する追加の改変を含み得る。
いくつかの実施形態では、一方または両方のＦｃポリペプチドは、エフェクター機能を低下させるまたは排除する改変を含み得る。エフェクター機能を低下させる例示的なＦｃポリペプチド変異としては、ＣＨ２ドメイン中、例えば、ＥＵ付番スキームに従う位置２３４及び２３５での置換が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、いくつかの実施形態では、一方または両方のＦｃポリペプチドは、位置２３４及び２３５にアラニン残基を含み得る。したがって、一方または両方のＦｃポリペプチドは、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（「ＬＡＬＡ」）置換を有し得る。いくつかの実施形態では、ＴｆＲへの結合を促進する１つ以上の改変を含むＦｃポリペプチドは、ＬＡＬＡ置換を更に含む。いくつかの実施形態では、ＴｆＲへの結合を促進する１つ以上の改変を含まないＦｃポリペプチドは、ＬＡＬＡ置換を含む。いくつかの実施形態では、いずれのＦｃポリペプチドもＬＡＬＡ置換を含む。
エフェクター機能を調節する追加のＦｃポリペプチド変異には、ＥＵ付番スキームに従う位置２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９での１つ以上の置換が含まれるが、これらに限定されない。例示的な置換としては、以下のものが挙げられ、すなわち、位置３２９は、プロリンが、グリシンまたはアルギニンで置換されるか、Ｆｃのプロリン３２９とＦｃγＲＩＩＩのトリプトファン残基Ｔｒｐ８７及びＴｒｐ１１０との間で形成されるＦｃ／Ｆｃγ受容体界面を破壊するのに十分な大きさのアミノ酸残基で置換される、変異を有し得る。追加の例示的な置換としては、ＥＵ付番スキームに従うＳ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ、及びＰ３３１Ｓが挙げられる。複数の置換が存在してもよく、例えば、ＥＵ付番スキームに従って、例えば、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；ＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ；ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域のＳ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅ；ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ及びＧ２３７Ａ；ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＧ２３７Ａ；ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域のＶ２３４Ａ及びＧ２３７Ａ；ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域のＬ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、及びＥ３１８Ａ；ならびにヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域のＳ２２８Ｐ及びＬ２３６Ｅが存在し得る。いくつかの実施形態では、一方または両方のＦｃポリペプチドは、ＡＤＣＣを調節する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、ＥＵ付番スキームに従う位置２９８、３３３、及び／または３３４での置換を有し得る。
いくつかの実施形態では、一方または両方のＦｃポリペプチドは、ＦｃポリペプチドからＣ末端リジンを除去する改変を含み得る。例えば、Ｃ末端でｓｃＦｖまたはＦｖに融合されたＦｃポリペプチドを含むポリペプチドについて、いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、Ｃ末端リジンを欠く。いくつかの実施形態では、ＦｃポリペプチドからＣ末端リジンを除去することで、Ｆｃポリペプチドに融合されたｓｃＦｖまたはＦｖのタンパク質分解性切断を低減または防止し得る。
例示的な改変されたＦｃポリペプチド
非限定的な例として、本明細書で開示される二重特異性タンパク質に存在する一方または両方のＦｃポリペプチドは、ノブ変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＴ３６６Ｗ）、ホール変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及び／またはＰ３２９Ｇ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ））、及び／または血清中安定性を高める変異（例えば、（ｉ）ＥＵ付番スキームに従って付番したＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅ、または（ｉｉ）ＥＵ付番を参照して付番したＭ４２８Ｌの有無にかかわらないＮ４３４Ｓ）を含む、追加の変異を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性タンパク質は、（ｉ）ＴｆＲ結合を促進する１つ以上の改変を含み、１つ以上の追加の改変（例えば、ノブ変異、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び／または血清中安定性を高める変異）を更に含む、第１のＦｃポリペプチドと、（ｉｉ）１つ以上の改変（例えば、ＴｆＲ結合を促進する変異、ノブ変異、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び／または血清中安定性を高める変異）を含む第２のＦｃポリペプチドと、を含む。
いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号１、４～９５、または１０１～３８８のいずれか１つの配列に対して、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有し、ノブ変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｗ）を含む。いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号１６７、１７９、１９１、２０３、２１５、２２７、２５３、２６５、２７７、２８９、または３８３のいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号１、４～９５、または１０１～３８８のいずれか１つの配列に対して、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有し、ノブ変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｗ）及びエフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及び／またはＰ３２９Ｇ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ））を含む。いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号１６８、１６９、１８０、１８１、１９２、１９３、２０４、２０５、２１６、２１７、２２８、２２９、２５４、２５５、２６６、２６７、２７８、２７９、２９０、２９１、または３８４のいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号１、４～９５、または１０１～３８８のいずれか１つの配列に対して、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有し、ノブ変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｗ）及び血清半減期を高める変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅ、またはＭ４２８Ｌの有無にかかわらないＮ４３４Ｓ）を含む。いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号１７０、１８２、１９４、２０６、２１８、２３０、２５６、２６８、２８０、２９２、３０２、３０９、３１６、３２３、３３０、３３７、３４４、３５１、３５８、３６５、３８５、または３８７のいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号１、４～９５、または１０１～３８８のいずれか１つの配列に対して、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有し、ノブ変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及び／またはＰ３２９Ｇ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ））、及び血清半減期を高める変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅ、またはＭ４２８Ｌの有無にかかわらないＮ４３４Ｓ）を含む。いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号１７１、１７２、１８３、１８４、１９５、１９６、２０７、２０８、２１９、２２０、２３１、２３２、２５７、２５８、２６９、２７０、２８１、２８２、２９３、２９４、３０３、３０４、３１０、３１１、３１７、３１８、３２４、３２５、３３１、３３２、３３８、３３９、３４５、３４６、３５２、３５３、３５９、３６０、３６６、３６７、３８６、または３８８のいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号１、４～９５、または１０１～３８８のいずれか１つの配列に対して、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有し、ホール変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ）を含む。いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号１７３、１８５、１９７、２０９、２２１、２３３、２５９、２７１、２８３、２９５、または３７７のいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号１、４～９５、または１０１～３８８のいずれか１つの配列に対して、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有し、ホール変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ）及びエフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及び／またはＰ３２９Ｇ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ））を含む。いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号１７４、１７５、１８６、１８７、１９８、１９９、２１０、２１１、２２２、２２３、２３４、２３５、２６０、２６１、２７２、２７３、２８４、２８５、２９６、２９７、または３７８のいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号１、４～９５、または１０１～３８８のいずれか１つの配列に対して、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有し、ホール変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ）及び血清半減期を高める変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅ、またはＭ４２８Ｌの有無にかかわらないＮ４３４Ｓ）を含む。いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号１７６、１８８、２００、２１２、２２４、２３６、２６２、２７４、２８６、２９８、３０５、３１２、３１９、３２６、３３３、３４０、３４７、３５４、３６１、３６８、３７９、または３８１のいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号１、４～９５、または１０１～３８８のいずれか１つの配列に対して、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有し、ホール変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及び／またはＰ３２９Ｇ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ））、及び血清半減期を高める変異（例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅ、またはＥＵ付番を参照した番号）を含む。いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号１７７、１７８、１８９、１９０、２０１、２０２、２１３、２１４、２２５、２２６、２３７、２３８、２６３、２６４、２７５、２７６、２８７、２８８、２９９、３００、３０６、３０７、３１３、３１４、３２０、３２１、３２７、３２８、３３４、３３５、３４１、３４２、３４８、３４９、３５５、３５６、３６２、３６３、３６９、３７０、３８０、または３８２のいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される二重特異性タンパク質（例えば、上記セクションＩＩＩに開示される構造を有する二重特異性タンパク質）は、（ｉ）配列番号配列番号４～９５、１０１～１６４、及び２３９～２５２のいずれか１つの配列を有するクローンのＴｆＲ結合部位を含み、ノブ変異（例えば、ＥＵ付番に従うＴ３６６Ｗ）、ＥＵ付番を参照して付番したＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ変異、ならびに任意選択でＥＵ付番を参照して付番したＭ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ変異を更に含む、第１のＦｃポリペプチドと、（ｉｉ）ホール変異（例えば、ＥＵ付番に従うＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ）ならびにＥＵ付番を参照して付番したＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ変異、ならびに任意選択でＥＵ付番を参照して付番したＭ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ変異を含む、第２のＦｃポリペプチドと、を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号１０５、配列番号１４５、または配列番号１４６の配列を有するクローンのＴｆＲ結合部位を含み、ノブ変異（例えば、Ｔ３６６Ｗ）、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ、ならびに任意選択でＭ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ変異を更に含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号１９２、２０４、２２８、３１６、３２４、または３３７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３７８または配列番号３８２のアミノ酸配列を含む。
Ｖ．二重特異性タンパク質の調製
本明細書に記載される二重特異性タンパク質の調製については、当該技術分野において知られている多くの技術を使用することができる。いくつかの実施形態では、目的の抗体（例えば、第１の抗原に結合する抗体または第２の抗原に結合する抗体）の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子は、細胞、例えば、ハイブリドーマからクローニングすることができる。モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子ライブラリーもまたハイブリドーマまたは形質細胞から作製することができる。あるいは、ファージディスプレイまたは酵母ディスプレイ技術を使用して、選択した抗原に特異的に結合する抗体及びＦａｂフラグメントを同定することができる。
二重特異性タンパク質は、原核生物及び真核生物の発現系を含む、任意の数の発現系を使用して産生することができる。いくつかの実施形態では、発現系は、ハイブリドーマまたはＣＨＯ細胞発現系などの哺乳動物細胞の発現系である。そのような系の多くは、市販の業者から広く入手可能である。いくつかの実施形態では、二重特異性タンパク質を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、単一ベクターを使用して、例えば、ジシストロニック発現単位で、または異なるプロモーターの制御下で、発現され得る。他の実施形態において、二重特異性タンパク質を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、別個のベクターを使用して発現され得る。
いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載される二重特異性タンパク質を含むポリペプチドのいずれかをコードする核酸配列を含む単離された核酸；そのような核酸を含むベクター；ならびに核酸の複製及び／または二重特異性タンパク質の発現に使用される核酸が導入された宿主細胞を提供する。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、単離されたポリヌクレオチド）は、本明細書で開示される二重特異性タンパク質（例えば、上記セクションＩＩＩに記載されているもの）を含むポリペプチドを含むポリヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、異種核酸、例えば、異種プロモーターに作動可能に連結される。
本開示の抗体、またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含有する好適なベクターには、クローニングベクター及び発現ベクターが含まれる。選択されるクローニングベクターは、使用が意図される宿主細胞に応じて変わり得るが、有用なクローニングベクターは、一般に、自己複製能を有し、特定の制限エンドヌクレアーゼの標的を１つ有し得、及び／またはベクターを含有するクローンの選択に使用することができるマーカーの遺伝子を保持し得る。例としては、プラスミド及び細菌ウイルス、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（例えば、ｐＢＳ ＳＫ＋）及びその誘導体、ｍｐｌ８、ｍｐｌ９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、ならびにｐＳＡ３及びｐＡＴ２８などのシャトルベクターが挙げられる。これらのクローニングベクター及び多くの他のクローニングベクターは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎなどの商業的供給業者から入手可能である。
発現ベクターは、一般に、本開示の核酸を含有する複製可能なポリヌクレオチドコンストラクトである。発現ベクターは、エピソームまたは染色体ＤＮＡの構成部分のいずれかとして、宿主細胞内で複製され得る。好適な発現ベクターとしては、プラスミド、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスのベクター、及び任意の他のベクターが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に記載されるポリヌクレオチドまたはベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞には、原核細胞または真核細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、原核細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはリンパ系細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ヒト細胞、例えば、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞である。
別の態様において、本明細書に記載される二重特異性タンパク質を製造する方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載される宿主細胞（例えば、本明細書に記載されるポリヌクレオチドまたはベクターを発現する宿主細胞）を、二重特異性タンパク質の発現に好適な条件下で培養することを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性タンパク質は、その後、宿主細胞（または宿主細胞培地）から回収される。いくつかの実施形態では、二重特異性タンパク質は、例えば、クロマトグラフィーによって、精製される。
ＶＩ．治療方法
別の態様において、本明細書に記載される２つの抗原に特異的に結合する能力を有する二重特異性タンパク質を使用する治療方法が提供される。いくつかの実施形態では、疾患を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態では、疾患に関連する１つ以上の生物学的活性を調節する方法が提供される。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドを含む二重特異性タンパク質は、改変されたＣＨ３ドメインを含み、トランスフェリン受容体に特異的に結合し、内皮、例えば、二重特異性タンパク質を血液脳関門を通過して輸送し、脳に取り込ませるために使用される。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される二重特異性タンパク質は、脳または中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患などの神経障害を治療するために使用され得る。例示的な疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭型認知症、血管性認知症、レビー小体型認知症、ピック病、原発性年齢関連タウオパチー、または進行性核上性麻痺が挙げられる。いくつかの実施形態では、疾患は、タウオパチー、プリオン病（ウシ海綿状脳症、スクレイピー、クロイツフェルト・ヤコブ症候群、クールー、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、慢性消耗病、及び致死性家族性不眠症など）、球麻痺、運動ニューロン疾患、または神経系ヘテロ変性障害（カナヴァン病、ハンチントン病、神経セロイドリポフスチン症、アレキサンダー病、トゥレット症候群、メンケス縮れ毛症候群、コケイン症候群、ハラーフォルデン・シュパッツ症候群、ラフォラ病、レット症候群、肝レンズ核変性症、レッシュ・ナイハン症候群、フリードライヒ失調症、脊髄性筋萎縮症、及びウンフェルリヒト・ルントボルグ症候群など）であり得る。いくつかの実施形態では、疾患は、脳卒中または多発性硬化症である。いくつかの実施形態では、患者は、無症候性であり得るが、脳またはＣＮＳの疾患に関連するマーカーを有する。いくつかの実施形態では、神経障害を治療するための薬剤の製造における、本明細書で開示される二重特異性タンパク質の使用が提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される二重特異性タンパク質は、がんの治療に使用される。特定の実施形態において、がんは、グリオーマ、多形膠芽腫、髄膜腫、星細胞腫、聴神経腫、軟骨腫、乏突起膠腫、髄芽腫、神経節膠腫、シュワン腫、神経線維腫、神経芽細胞腫、または硬膜外、髄内もしくは硬膜内腫瘍などのＣＮＳの原発性癌である。いくつかの実施形態では、がんは、固形腫瘍であり、あるいは、他の実施形態では、がんは、非固形腫瘍である。固形腫瘍がんには、中枢神経系の腫瘍、乳癌、前立腺癌、皮膚癌（基底細胞癌、細胞癌、扁平上皮癌及び黒色腫を含む）、子宮頸癌、子宮癌、肺癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、星細胞腫、グリオーマ、膵癌、中皮腫、胃癌、肝臓癌、結腸癌、直腸癌、腎芽細胞腫を含む腎臓癌、膀胱癌、食道癌、喉頭癌、耳下腺癌、胆道癌、子宮内膜癌、腺癌、小細胞癌、神経芽細胞腫、副腎皮質癌、上皮癌、類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、内分泌腺腫瘍、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、胚細胞腫瘍、肝芽腫、肝細胞癌、横紋筋肉腫を除く軟部肉腫、骨肉腫、末梢性原始神経外胚葉性腫瘍、網膜芽細胞腫、及び横紋筋肉腫が含まれる。いくつかの実施形態では、がんを治療するための薬剤の製造における、本明細書で開示される二重特異性タンパク質の使用が提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される二重特異性タンパク質は、自己免疫疾患または炎症性疾患の治療に使用され得る。そのような疾患の例としては、強直性脊椎炎、関節炎、変形性関節症、リウマチ様関節炎、乾癬性関節炎、喘息、強皮症、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、クローン病、大腸炎、潰瘍性大腸炎、皮膚炎、憩室炎、線維症、特発性肺線維症、線維筋痛症、肝炎、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、狼瘡、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、腎炎、多発性硬化症、及び潰瘍性大腸炎が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患または炎症性疾患を治療するための薬剤の製造における、本明細書で開示される二重特異性タンパク質の使用が提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される二重特異性タンパク質は、冠動脈疾患、心臓発作、異常な心臓のリズムまたは不整脈、心不全、心臓弁膜症、先天性心臓病、心筋疾患、心筋症、心膜疾患、大動脈疾患、マルファン症候群、血管疾患、及び血管疾患などの心血管疾患の治療に使用され得る。いくつかの実施形態では、心血管疾患を治療するための薬剤の製造における、本明細書で開示される二重特異性タンパク質の使用が提供される。
いくつかの実施形態では、方法は、１つ以上の追加の治療剤を対象に投与することを更に含む。例えば、脳または中枢神経系の疾患を治療するためのいくつかの実施形態では、方法は、神経保護剤、例えば、抗コリン作動薬、ドーパミン作動薬、グルタミン酸作動薬、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤、カンナビノイド、カスパーゼ阻害剤、メラトニン、抗炎症薬、ホルモン（例えば、エストロゲンまたはプロゲステロン）、ビタミンを対象に投与することを含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、神経障害の認知症状または行動症状の治療に使用する剤（例えば、抗うつ薬、ドーパミンアゴニスト、または抗精神病薬）を対象に投与することを含む。
本明細書で開示される二重特異性タンパク質は、治療上有効な量または用量で対象に投与される。例示的な投薬量としては、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５００ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの１日用量範囲が挙げられ、これらを使用することができる。しかしながら、投薬量は、選択された投与経路、組成物の配合、患者の応答、状態の重症度、対象の体重、及び処方医の判断を含む、いくつかの因子によって変動し得る。投薬量は、個々の患者の必要に応じて、経時的に増加または減少させることができる。いくつかの実施形態では、患者には、まず最初に低用量が投与され、次いで、患者が耐えられる有効な投薬量まで増量される。有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。
種々の実施形態において、本明細書で開示される二重特異性タンパク質は、非経口投与される。いくつかの実施形態では、二重特異性タンパク質は、静脈内投与される。静脈内投与は、例えば、約１０～約３０分間にわたる注入、または少なくとも１時間、２時間、もしくは３時間にわたる注入によるものであり得る。いくつかの実施形態では、二重特異性タンパク質は、静脈内ボーラスとして投与される。注入とボーラス投与の組み合わせが使用されてもよい。
いくつかの非経口的な実施形態では、二重特異性タンパク質は、腹膜内投与、皮下投与、皮内投与、または筋肉内投与される。いくつかの実施形態では、二重特異性タンパク質は、皮内投与または筋肉内投与される。いくつかの実施形態では、二重特異性タンパク質は、硬膜外投与などによる髄腔内投与、または側脳室内投与される。
他の実施形態において、二重特異性タンパク質は、経口投与、経肺投与、鼻腔内投与、眼球内投与、または局所投与によって投与され得る。経肺投与は、例えば、吸入器またはネブライザー、及びエアロゾル化剤を含む製剤の使用により、採用され得る。
ＶＩＩ．医薬組成物及びキット
別の態様では、２つの抗原に特異的に結合する能力を有する二重特異性タンパク質を含む医薬組成物及びキットが提供される。いくつかの実施形態では、二重特異性タンパク質は、上記のセクションＩＩＩに記載されている二重特異性タンパク質である。
医薬組成物
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載される二重特異性タンパク質（例えば、２つの抗原に特異的に結合する能力を有する二重特異性タンパク質）を含み、１つ以上の薬学的に許容される担体及び／または賦形剤を更に含む。製剤を調製するための指針は、当業者に知られている医薬調製物及び製剤についての多くの便覧に見出すことができる。
薬学的に許容される担体には、任意の溶媒、分散媒、またはコーティング剤が含まれるが、これらは、生理学的に適合性があり、好ましくは、活性物質の活性に干渉したり、またはその活性を別様に阻害しないものである。様々な薬学的に許容される賦形剤が当該技術分野においてよく知られている。
いくつかの実施形態では、担体は、静脈内、筋肉内、経口、腹腔内、髄腔内、経皮、局所、または皮下の投与に好適なものである。薬学的に許容される担体は、例えば、組成物の安定化または活性物質（複数可）の吸収の増加もしくは減少をもたらすように作用する、１つ以上の生理学的に許容される化合物（複数可）を含有し得る。生理学的に許容される化合物には、例えば、グルコース、スクロース、もしくはデキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸もしくはグルタチオンなどの抗酸化剤、キレート剤、低分子量タンパク質、活性物質のクリアランスもしくは加水分解を低減させる組成物、または賦形剤または他の安定剤及び／または緩衝液を挙げることができる。他の薬学的に許容される担体及びその配合は、当該技術分野においてよく知られている。
医薬組成物は、当業者に知られている方法で、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥の各プロセスによって、製造することができる。本明細書で開示される方法及び賦形剤は、単なる例示であり、決して限定するものではない。
経口投与について、本明細書で開示される二重特異性タンパク質は、当該技術分野においてよく知られている薬学的に許容される担体と組み合わせることによって製剤化することができる。化合物は、そのような担体により、治療される患者によって経口摂取される、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、乳剤、親油性及び親水性懸濁液、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤などとして製剤化することが可能になる。経口使用のための医薬調製物は、化合物を固体賦形剤とともに混合し、任意選択により、得られた混合物を粉砕し、所望により、好適な助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して、錠剤または糖衣丸コアを得ることで得ることができる。好適な賦形剤としては、例えば、充填剤、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などが挙げられる。所望される場合には、崩壊剤、例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩、例えば、アルギン酸ナトリウムが添加されてもよい。
本明細書で開示される二重特異性タンパク質は、注射によって、例えば、ボーラス注射または持続注入によって、非経口投与用に製剤化することができる。注射剤について、二重特異性タンパク質は、所望により、可溶化剤、等張化剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤及び防腐剤などの従来の添加剤とともに、水性溶媒または非水性溶媒中、例えば、植物性油または他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸エステルもしくはプロピレングリコール中で、化合物を溶解、懸濁または乳化することによって、調製物に製剤化することができる。いくつかの実施形態では、二重特異性タンパク質は、水溶液、好ましくは、生理学的に適合性のある緩衝液、例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理的食塩水緩衝液中で製剤化することができる。注射用製剤は、防腐剤が添加された単位剤形、例えば、アンプルまたは複数回用量の容器で提供することができる。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液または乳濁液などの形態を取ることができ、懸濁化剤、安定化剤及び／または分散剤などの製剤化用剤を含有し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される二重特異性タンパク質は、徐放性製剤、制御放出製剤、延長放出製剤、持効性製剤または遅延放出製剤、例えば、活性物質を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスでの送達用に調製される。様々な種類の徐放性材料が確立されており、当業者によく知られている。現在の延長放出製剤には、フィルムコーティング錠剤、多粒子またはペレット系、親水性材料または親油性材料を使用するマトリックス技術、及び細孔形成賦形剤を含むワックス系錠剤が含まれる。徐放性送達系は、その設計に応じて、数時間または数日にわたって、例えば、４、６、８、１０、１２、１６、２０、または２４時間以上にわたって、化合物を放出することができる。通常、徐放性製剤は、天然または合成ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの高分子ビニルピロリドン；カルボキシビニル親水性ポリマー；メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、及びヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの疎水性及び／または親水性ヒドロコロイド；ならびにカルボキシポリメチレンを使用して調製することができる。
典型的に、ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用するための医薬組成物は、無菌である。滅菌は、当該技術分野において知られている方法、例えば、加熱滅菌、蒸気滅菌、滅菌濾過、または放射線照射に従って実施することができる。
本開示の医薬組成物の投薬量及び所望の薬物濃度は、想定される具体的な用途に応じて異なり得る。適切な投薬量または投与経路の決定は、十分に当業者の技術範囲内である。好適な投薬量は、上記セクションＶＩにも記載されている。
キット
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法に従って使用するための本明細書に記載される二重特異性タンパク質（例えば、２つの抗原に特異的に結合する能力を有する二重特異性タンパク質）を含むキットが提供される。いくつかの実施形態では、キットは、神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病の治療、脳または中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患などの神経障害の予防または治療に使用するためのものである。
いくつかの実施形態では、キットは、１つ以上の追加の治療剤を更に含む。例えば、いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載される二重特異性タンパク質を含み、神経変性疾患の治療に使用するための１つ以上の追加の治療剤を更に含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載される方法を実施するための指図書（すなわち、プロトコール）を含む説明資料（例えば、神経変性疾患を治療するためのキットを使用するための説明書）を更に含む。説明資料は、典型的に、書面または印刷された資料を含むが、それらに限定されない。そのような説明書を記録し、エンドユーザーに伝達することができる任意の媒体が、本開示によって企図される。そのような媒体としては、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、磁気テープ、磁気カートリッジ、磁気チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ－ＲＯＭ）などが挙げられるが、これらに限定されない。そのような媒体には、そのような説明資料を提供するインターネットサイトへのアドレスが含まれ得る。
ＶＩＩＩ．トランスジェニック動物
更に、本開示はまた、非ヒトトランスジェニック動物であって、（ａ）（ｉ）配列番号３９２に対して少なくとも９０％の同一性を有するアピカルドメイン、及び（ｉｉ）当該動物のネイティブＴｆＲポリペプチドのトランスフェリン結合部位を含む、キメラＴｆＲポリペプチドをコードする核酸と、（ｂ）変異体微小管結合タンパク質Ｔａｕ（ＭＡＰＴ）遺伝子の導入遺伝子と、を含み、例えば、キメラＴｆＲポリペプチド及び／またはＴａｕタンパク質が当該動物の脳内で発現する、非ヒトトランスジェニック動物（例えば、マウスまたはラットなどのげっ歯類）を提供する。トランスフェリン受容体のキメラ形態は、非ヒト（例えば、マウス）哺乳動物のトランスフェリン結合部位、及びトランスフェリン結合部位を含有するドメインに対して異種であるアピカルドメインを含む。これらのキメラ受容体は、トランスジェニック動物で発現させることができ、特に、そのトランスフェリン結合部位は、トランスジェニック動物種に由来し、そのアピカルドメインは、霊長類（例えば、ヒトまたはサル）に由来する。キメラＴｆＲポリペプチドをコードする核酸は、動物のゲノム（例えば、内因性遺伝子座）に「ノックイン」することができ、これにより、動物は、内因性ＴｆＲポリペプチドの代わりに、キメラＴｆＲポリペプチドを発現することになる。キメラＴｆＲポリペプチドは、配列番号３９６に対して少なくとも９５％（例えば、９７％、９８％、または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。また、本明細書に記載されるのは、非ヒト哺乳動物のトランスフェリン結合部位、及び配列番号３９２に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を有するアピカルドメインを含む、キメラトランスフェリン受容体をコードするポリヌクレオチドである。アピカルドメインをコードする核酸配列は、配列番号３９７に対して少なくとも９５％（例えば、９７％、９８％、または９９％）の同一性を有する核酸配列を含み得る。トランスジェニック動物は、キメラＴｆＲポリペプチドをコードする核酸に関してホモ接合性またはヘテロ接合性である。更に、いくつかの実施形態では、変異体ＭＡＰＴ遺伝子は、変異体ヒトＴａｕタンパク質をコードする。例えば、変異体ヒトＴａｕタンパク質は、配列番号３９８の配列を基準として、アミノ酸置換Ｐ２７２Ｓを含む。
本開示はまた、そのようなキメラＴｆＲ及び変異体微小管結合タンパク質Ｔａｕ（ＭＡＰＴ）遺伝子の導入遺伝子を発現する、非ヒト、例えば、非霊長類のトランスジェニック動物（例えば、マウスまたはラットなどのげっ歯類）、ならびにヒトトランスフェリン受容体（ｈｕＴｆＲ）に結合することによってＢＢＢを通過することができるポリペプチドをｉｎ ｖｉｖｏでスクリーニングするための非ヒトトランスジェニック動物の使用を提供する。いくつかの実施形態では、非ヒトトランスジェニック動物は、ネイティブのトランスフェリン受容体（マウストランスフェリン受容体（ｍＴｆＲ）など）を含有し、そのアピカルドメインは、配列番号３９２に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を有するオルソロガスなアピカルドメインで置換されており、それにより、ネイティブのトランスフェリン結合部位及びトランスフェリン受容体をコードする配列の大部分、例えば、少なくとも７０％、または少なくとも７５％がインタクトのままとなる。したがって、この非ヒトトランスジェニック動物は、適切な鉄ホメオスタシスを維持する能力だけでなく、トランスフェリンに結合してそれを輸送する能力を含む、非ヒト動物の内在性トランスフェリン受容体のトランスフェリン結合機能性を最大限に保持する。その結果、トランスジェニック動物は健常であり、脳疾患を治療するための治療薬の発見及び開発に使用するのに好適である。
ＩＸ．実施例
本発明は、特定の実施例により、より詳細に記載される。以下の実施例は、例示のみを目的に提供されるものであり、いかなる形でも本発明を限定する意図はない。当業者であれば、本質的に同じ結果をもたらすように変更または改変することができる様々な重要でないパラメーターを容易に認識するであろう。使用される数字（例えば、量、温度など）に関して、正確さを確保するための努力がなされているが、いくらかの実験誤差及び偏差が存在する場合がある。本開示の実施には、特に指定のない限り、当該技術分野の範囲内にある、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術及び薬理学の従来の方法が用いられる。そのような技術は、文献に十分に説明されている。更に、ある特定のライブラリーに適用される操作に関する方法が、本明細書に記載される他のライブラリーにも適用され得ることは、当業者には明らかであるはずである。
実施例１．操作されたトランスフェリン受容体結合ポリペプチドの設計及び特徴付け
本実施例は、本発明のポリペプチドの設計、生成、及び特徴付けについて記載する。本実施例の目的のために、及びクローン配列で同じアミノ酸を比較する目的で、「保存された」変異とは、特定されたクローンの全てで生じた変異とみなされ（保存的アミノ酸置換ではない）、一方、「半保存された」変異は、５０％を超えるクローンで生じた変異である。
特に指定のない限り、本セクションにおけるアミノ酸残基の位置は、ヒトＩｇＧ１野生型Ｆｃ領域のＥＵインデックス付番に基づいて付番される。
ポリペプチドＦｃ領域ドメインライブラリーの設計
ポリペプチドＦｃ領域への新しい分子認識の導入は、ある特定の溶媒露出表面パッチを選択して変更し、選択したパッチのアミノ酸組成がランダム化によって変更された表面ディスプレイライブラリーを構築し、次いで、標準的な発現ディスプレイ技術を使用して表面提示された配列バリアントを所望の機能性についてスクリーニングすることによって、操作した。本明細書で使用する場合、「ランダム化」という用語は、部分的ランダム化だけでなく、予め定義されたヌクレオチドまたはアミノ酸の混合比での配列変更も含む。無作為化のために選択される典型的な表面露出パッチは、約６００～１５００Å２の間の面積を有し、約７～１５個のアミノ酸を含んだ。
クローンレジスター
本明細書に記載される方法に従って、以下のレジスターが設計及び生成された。本明細書で使用する場合、「レジスター」という用語は、連続した表面を形成する一連の表面露出アミノ酸残基であり、変更が可能であるもの（例えば、ペプチドコード遺伝子配列への変異の導入によって、レジスターに列挙される位置にアミノ酸の置換、挿入、及び／または欠失をもたらす）を指す。
ＣＨ２レジスターＡ２－セット（ｉｉｉ）
ＣＨ２Ａ２レジスター（表１）には、ＥＵ付番に従うアミノ酸位置２７４、２７６、２８３、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、及び２９０が含まれた。ＣＨ２Ａ２レジスターは、ベータシート、隣接するターン、及び後続のループに沿って表面が形成されるように設計した。ＦｃγＲ及びＦｃＲｎ結合部位の両方からは十分離れている。
ＣＨ２レジスターＣ－セット（ｉｖ）
ＣＨ２Ｃレジスター（表２）には、ＥＵ付番に従うアミノ酸位置２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２９５、２９７２、２９８、及び２９９が含まれた。ＣＨ２Ｃレジスターは、ヒンジに近く、ＣＨ２領域のＦｃγＲ結合部位に非常に近い一連のループに沿った溶媒露出残基を利用している。
ＣＨ２レジスターＤ－セット（ｖ）
ＣＨ２Ｄレジスター（表３）には、ＥＵ付番に従うアミノ酸位置２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２９２、２９３、２９４、２９６、及び３００が含まれた。４１、４２、４３、４４、４５、６５、６６、６７、６９、及び７３。ＣＨ２Ｄレジスターは、ＣＨ２Ｃと同様に、ＦｃγＲ結合部位に非常に近い、ＣＨ２領域の上部にある一連のループに沿った溶媒露出残基を利用している。ＣＨ２Ｃレジスター及びＣＨ２Ｄレジスターは、主に１つのループを共有しているが、結合に利用される２番目のループは異なる。
ＣＨ２レジスターＥ－セット（ｖｉ）
ＣＨ２Ｅ３レジスター（表４）には、ＥＵ付番に従うアミノ酸位置２７２、２７４、２７６、３２２、３２４、３２６、３２９、３３０、及び３３１が含まれた。４５、４７、４９、９５、９７、９９、１０２、１０３、及び１０４。ＣＨ２Ｅ３レジスター位置もＦｃγＲ結合部位に近いが、ＦｃγＲ結合部位近くのループに隣接するベータシート上の溶媒露出残基を、ループ残基のいくつかに加えて、利用している。
ＣＨ３レジスターＢ－セット（ｉｉ）
ＣＨ３Ｂレジスター（表５）には、ＥＵ付番に従うアミノ酸位置３４５、３４６、３４７、３４９、４３７、４３８、４３９、及び４４０が含まれた。１１８、１１９、１２０、１２２、２１０、２１１、２１２、及び２１３。ＣＨ３Ｂレジスターは、主に、２つの平行なベータシート上の溶媒露出残基と、ＣＨ３領域のＣ末端付近にある構造性の低いいくつかの残基で構成される。これは、ＦｃγＲ及びＦｃＲｎ結合部位から離れている。
ＣＨ３レジスターＣ－セット（ｉ）
ＣＨ３Ｃレジスター（表６）には、ＥＵ付番に従うアミノ酸位置３８４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、４１３、４１６、及び４２１が含まれた。ＣＨ３Ｃレジスター位置は、ＦｃγＲ及びＦｃＲｎ結合部位から離れた２つのループの表面露出残基を含めることによって、連続した表面を形成する。
（表１）ＣＨ２Ａ２レジスターの位置及び変異
Figure 0007397063000001
Figure 0007397063000002
（表２）ＣＨ２Ｃレジスターの位置及び変異
Figure 0007397063000003
Figure 0007397063000004
Figure 0007397063000005
（表３）ＣＨ２Ｄレジスターの位置及び変異
Figure 0007397063000006
（表４）ＣＨ２Ｅ３レジスターの位置及び変異
Figure 0007397063000007
（表５）ＣＨ３Ｂレジスターの位置及び変異
Figure 0007397063000008
Figure 0007397063000009
Figure 0007397063000010
（表６）ＣＨ３Ｃレジスターの位置及び変異
Figure 0007397063000011
Figure 0007397063000012
Figure 0007397063000013
ファージディスプレイライブラリーの生成
野生型ヒトＦｃ配列をコードするＤＮＡ鋳型を合成し、ファージミドベクターに組み込んだ。ファージミドベクターは、ｏｍｐＡまたはｐｅｌＢリーダー配列と、ｃ－Ｍｙｃ及び６ｘＨｉｓエピトープタグ（配列番号５７５）に融合したＦｃインサートと、アンバー終止コドンに続くＭ１３コートタンパク質ｐＩＩＩと、を含有した。
ランダム化の対応する位置に「ＮＮＫ」の３コドンを含有するプライマーを生成した。Ｎは、任意のＤＮＡ塩基（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ）であり、Ｋは、ＧまたはＴのいずれかである。あるいは、「ソフト」ランダム化のプライマーを使用し、各ランダム化位置に、７０％の野生型塩基と、１０％の他の３つの各塩基に対応する塩基の組み合わせを使用した。ランダム化領域に対応するＦｃ領域のフラグメントのＰＣＲ増幅を実施することによってライブラリーを生成し、次いで、ＳｆｉＩ制限部位を含有するエンドプライマーを使用して組み立て、次いで、ＳｆｉＩで消化し、ファージミドベクターにライゲートした。あるいは、これらのプライマーを使用して、Ｋｕｎｋｅｌ変異導入を実施した。Ｋｕｎｋｅｌ変異導入の実施方法は、当業者に知られている。ライゲーション産物またはＫｕｎｋｅｌ産物で、エレクトロコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞ＴＧ１株（Ｌｕｃｉｇｅｎ（登録商標）から入手）を形質転換した。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を回収した後、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージに感染させ、一晩成長させ、その後、ライブラリーファージを５％ＰＥＧ／ＮａＣｌで沈殿させ、１５％グリセロール／ＰＢＳに再懸濁し、使用まで凍結した。典型的なライブラリーのサイズは、約１０９～約１０１１形質転換細胞の範囲であった。Ｆｃ二量体は、ｐＩＩＩ融合Ｆｃと、ｐＩＩＩに結合していない可溶性Ｆｃとの間（後者は、ｐＩＩＩの前のアンバー終止コドンによって生成される）での対合を介して、ファージ上に提示された。
酵母ディスプレイライブラリーの生成
野生型ヒトＦｃ配列をコードするＤＮＡ鋳型を合成し、酵母ディスプレイベクターに組み込んだ。ＣＨ２及びＣＨ３ライブラリーについて、Ｆｃポリペプチドは、Ａｇａ２ｐ細胞壁タンパク質上に提示された。両ベクターは、Ｋｅｘ２切断配列を持つプレプロリーダーペプチド、及びＦｃの末端に融合したｃ－Ｍｙｃエピトープタグを含有していた。
酵母ディスプレイライブラリーは、ベクターに対して相同末端を含有するプライマーを用いてフラグメントの増幅を実施したことを除いて、ファージライブラリーについて記載した方法と同様の方法を使用して組み立てた。新たに調製したエレクトロコンピテント酵母（すなわち、ＥＢＹ１００株）に線状ベクター及び組み立てたライブラリーインサートをエレクトロポレーションで導入した。エレクトロポレーション法は当業者に公知である。ＳＤ－ＣＡＡ選択培地で回収した後、酵母をコンフルエントまで成長させ、２回分割し、次いで、ＳＧ－ＣＡＡ培地に移すことによって、タンパク質発現を誘導した。典型的なライブラリーのサイズは、約１０７～約１０９形質転換細胞の範囲であった。Ｆｃ二量体は、隣接して提示されたＦｃモノマーが対合することによって形成された。
ファージ選択の一般的方法
ファージ方法は、Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｂａｒｂａｓ，２００１）を採用した。更なるプロトコールの詳細は、その参考文献から得ることができる。
プレートソーティング法
ヒトＴｆＲ標的を、ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）マイクロタイタープレート上に（典型的にＰＢＳ中１～１０μｇ／ｍＬで２００μＬ）４℃で一晩コーティングした。全ての結合は、特に指定のない限り、室温で実施した。ファージライブラリーを各ウェルに加え、結合のために一晩インキュベートした。マイクロタイターウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で十分洗浄し、ウェルを、酸（典型的に５００ｍＭ ＫＣｌまたは１００ｍＭグリシンを含む５０ｍＭ ＨＣｌ（ｐＨ２．７））とともに３０分間インキュベートすることによって、結合したファージを溶出させた。溶出したファージを１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）で中和し、ＴＧ１細胞及びＭ１３／ＫＯ７ヘルパーファージを使用して増幅し、５０μｇ／ｍＬのカルベナシリン及び５０ｕｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する２ＹＴ培地中で３７℃で一晩成長させた。標的含有ウェルから溶出したファージの力価を、標的非含有ウェルから回収したファージの力価と比較して、濃縮を評価した。続いて、結合の際のインキュベーション時間を短縮し、洗浄時間及び洗浄回数を増加させることによって選択のストリンジェンシーを高めた。
ビーズソーティング法
ＮＨＳ－ＰＥＧ４－ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）から入手）を使用して、遊離アミンを介して、ヒトＴｆＲ標的をビオチン化した。ビオチン化反応には、３～５倍モル過剰のビオチン試薬をＰＢＳ中で使用した。Ｔｒｉｓで反応を停止し、次いで、ＰＢＳで十分に透析した。ビオチン化した標的を、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズ（すなわち、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから入手したＭ２８０－ストレプトアビジンビーズ）上に固定化した。ファージディスプレイライブラリーを、標的をコーティングしたビーズとともに、室温で１時間インキュベートした。次いで、結合していないファージを除去し、ビーズをＰＢＳＴで洗浄した。結合したファージを、５００ｍＭ ＫＣｌ（または０．１Ｍグリシン）を含有する５０ｍＭ ＨＣｌ（ｐＨ２．７）とともに３０分間インキュベートすることによって溶出させ、次いで、プレートソーティングについて上記したように中和し、増幅させた。
パニングを３～５ラウンド行った後、Ｆｃをファージ上に発現させること、またはＥ．ｃｏｌｉペリプラズム中に可溶的に発現させることのいずれかによって、単一クローンをスクリーニングした。そのような発現方法は、当業者に知られている。抗原または陰性対照をコーティングし、ブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートに、個々のファージ上清またはペリプラズム抽出物を曝露し、その後、ペリプラズム抽出物にはＨＲＰ結合ヤギ抗Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈから入手）、またはファージには抗Ｍ１３（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して検出し、次いで、ＴＭＢ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから入手）で発色させた。バックグラウンドのおよそ５倍を超えるＯＤ４５０値を有するウェルを陽性クローンとみなし、配列決定した後、いくつかのクローンを、可溶性Ｆｃフラグメントとして、またはＦａｂフラグメントに融合させるかのいずれかで、発現させた。
酵母選択の一般的方法
ビーズソーティング法（磁気標識細胞分離法（ＭＡＣＳ））
ＭＡＣＳ及びＦＡＣＳ 選択は、Ａｃｋｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．２００９ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２５（３），７７４に記載されているものと同様に実施した。ストレプトアビジン磁気ビーズ（例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒのＭ－２８０ストレプトアビジンビーズ）をビオチン化標的で標識し、酵母とともにインキュベートした（典型的に５～１０倍のライブラリー多様性）。結合していない酵母を除去し、ビーズを洗浄し、結合した酵母を選択培地で成長させ、その後の選択ラウンドに進んだ。
ビーズソーティング法（磁気標識細胞分離法（ＭＡＣＳ））
酵母を抗ｃ－Ｍｙｃ抗体で標識し、発現及びビオチン化標的をモニタリングした（濃度はソーティングラウンドに応じて異なる）。いくつかの実験では、相互作用のアビディティを高めるために、標的をストレプトアビジン－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７と予め混合した。他の実験では、ストレプトアビジン－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７との結合及び洗浄後に、ビオチン化標的を検出した。ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＩセルソーターを使用して、結合を有するシングレット酵母をソーティングした。ソーティングした酵母を選択培地で成長させ、次いで、その後の選択ラウンドに進んだ。
濃縮された酵母集団が得られたら、酵母をＳＤ－ＣＡＡ寒天培地プレートに播種し、単一コロニーを成長させ、発現を誘導し、次いで、上記のとおりに標識して、標的への結合性質を決定した。その後、陽性単一クローンの標的結合配列を決定し、その後、いくつかのクローンを、可溶性Ｆｃフラグメントとして、またはＦａｂフラグメントに融合させるかのいずれかで、発現させた。
スクリーニングの一般的方法
ＥＬＩＳＡによるスクリーニング
パニング産物からクローンを選択し、９６ウェルのディープウェルプレートの個々のウェルで成長させた。クローンは、自己誘導培地（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから入手）を使用してペリプラズム発現を誘導するか、またはヘルパーファージに感染させて個々のＦｃバリアントをファージ上にファージディスプレイさせるかのいずれかとした。培養物を一晩成長させ、遠心してＥ．ｃｏｌｉをペレット化した。ファージＥＬＩＳＡでは、ファージを含有する上清を直接使用した。ペリプラズム発現では、ペレットを２０％スクロース中に再懸濁し、続いて、水で４：１に希釈し、４℃で１時間振盪した。プレートを遠心して固形物をペレット化し、上清をＥＬＩＳＡに使用した。
ＥＬＩＳＡプレートを標的で、典型的に０．５ｍｇ／ｍＬで一晩コーティングし、次いで、１％ＢＳＡでブロッキングしてからファージまたはペリプラズム抽出物を加えた。１時間インキュベーションし、結合していないタンパク質を洗い流した後、ＨＲＰ結合二次抗体（すなわち、可溶性Ｆｃまたはファージ提示Ｆｃに対して、それぞれ抗Ｆｃまたは抗Ｍ１３）を加え、３０分間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、次いで、ＴＭＢ試薬で発色させ、２Ｎ硫酸で反応を停止した。プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ（登録商標））を使用して４５０ｎｍでの吸光度を定量し、適用可能な場合はＰｒｉｓｍソフトウェアを使用して、結合曲線をプロットした。試験クローンの吸光度シグナルを陰性対照（Ｆｃを含まないファージまたはパラプラズマ抽出物）と比較した。いくつかのアッセイでは、結合ステップ中に、可溶性ホロランスフェリンを、典型的にかなりのモル過剰（１０倍を超える過剰）で加えた。
フローサイトメトリーによるスクリーニング
Ｆｃバリアントポリペプチド（ファージ上で発現させたもの、ペリプラズム抽出物中で発現させたもの、またはＦａｂフラグメントへの融合体としての可溶的に発現させたもののいずれか）を９６ウェルＶ底プレート中の細胞（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ（ＰＢＳＡ）中１ウェルあたり約１００，０００細胞）に加え、４℃で１時間インキュベートした。その後、プレートを遠心し、培地を除去し、次いで、細胞をＰＢＳＡで１回洗浄した。細胞を二次抗体（ヤギ抗ヒト－ＩｇＧ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから入手））を含有するＰＢＳＡ中に再懸濁した。３０分後、プレートを遠心し、培地を除去し、細胞をＰＢＳＡで１～２回洗浄し、次いで、プレートをフローサイトメーター（すなわち、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩフローサイトメーター）で読み取った。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して各条件の中央蛍光値を算出し、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて結合曲線をプロットした。
ＣＨ２Ａ２クローンの生成及び特徴付け
トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に対するＣＨ２Ａ２ライブラリーによる選択
上述のように、ＣＨ２Ａ２に対するファージライブラリー及び酵母ライブラリーをパニングし、ＴｆＲに対してソーティングした。ヒトＴｆＲ及び／またはカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＴｆＲに結合するクローンは、４ラウンドのファージパニング後、上記の「ＥＬＩＳＡによるスクリーニング」というタイトルのセクションに記載されるように、ＥＬＩＳＡアッセイで特定した。代表的なクローンの配列は、２つのグループ、すなわち、１５個のユニークな配列を含有するグループ１（すなわち、配列番号４７～６１）及び１つのユニークな配列を含有するグループ２（すなわち、配列番号６２）に分類された。グループ１の配列は、位置２８７～２８８に保存されたＧｌｕ－Ｔｒｐモチーフを有した。他の位置にはどんな一致もみられなかったが、位置２８５はＡｒｇが多く、位置２８６はＴｒｐまたはＴｙｒが多かった。
ＣＨ２Ａ２クローンの特徴付け
個々のＣＨ２Ａ２バリアントをファージの表面上に発現させ、ヒトＴｆＲ、カニクイザルＴｆＲ、または無関係な対照への結合について、ＥＬＩＳＡによってアッセイした。Ｆｃの発現は、Ｃ末端のｃ－Ｍｙｃエピトープタグに結合する抗Ｍｙｃ抗体９Ｅ１０に対するＥＬＩＳＡによって確認した。４つの代表的なクローンであるＣＨ２Ａ２．５、ＣＨ２Ａ２．１、ＣＨ２Ａ２．４、及びＣＨ２Ａ２．１６のデータは、いずれも十分に発現しており、ヒトＴｆＲに結合するが、無関係な対照に結合したものはなかったことを示した。グループ１の３つのクローンもカニクイザルＴｆＲに結合し、一方、グループ２の１つのクローン（すなわち、クローン２Ａ２．１６）はヒトＴｆＲに特異的であった。
２つ目のアッセイでは、ファージの濃度を一定に保ち（すなわち、およそＥＣ５０）、ホロトランスフェリンまたはヒトＴｆＲのいずれかの可溶性競合物質を、濃度を変化させて、加えた。５μＭまでの濃度であれば、ホロトランスフェリンを添加しても、結合に明らかな影響はないことがわかった。逆に、可溶性ヒトＴｆＲは、表面に吸着したヒトＴｆＲへの結合に対して競合することができ、特有の相互作用を示した。
ＣＨ２Ａ２バリアントは、抗ＢＡＣＥ１可変領域配列を含有する発現ベクターにクローニングすることによって、抗ＢＡＣＥ１ ＦａｂフラグメントへのＦｃ融合体として発現される。２９３細胞またはＣＨＯ細胞で発現させた後、得られたＣＨ２Ａ２－Ｆａｂ融合体をプロテインＡ及びサイズ排除クロマトグラフィーによって精製し、次いで、結合について、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；すなわち、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）機器を使用）、バイオレイヤー干渉法（すなわち、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＲＥＤシステムの使用）、細胞結合（例えば、フローサイトメトリー）、及び本明細書に記載の他の方法を使用してアッセイした。更に、得られたポリペプチドＦａｂ融合体の安定性を熱融解、凍結融解、及び熱加速変性によって特徴付けた。
ＣＨ２Ａ２クローンの追加操作
ヒトＴｆＲ及びカニクイザルＴｆＲに対する最初のヒットの結合親和性を高めるために、２つの二次ライブラリーを構築した。第１のライブラリーは、グループ１のクローンに基づいて生成した。位置２８７～２８８の保存されたＥＷモチーフは、変化させず、位置２８５の半保存されたＲは、ソフトランダム化を使用して変異させた。他のライブラリー位置（すなわち、位置２７４、２７６、２８３、２８６、２８９、及び２９０）は、飽和変異導入によって変異させた。第２のライブラリーは、グループ２のクローンに基づいて構築した。このライブラリーは、元のＣＨ２Ａ２ライブラリー位置のソフトランダム化によって生成したものだが、鋳型として（野生型Ｆｃではなく）クローン２Ａ２．１６（配列番号６２）を使用した。どちらのライブラリーも、上記方法を使用して、ファージディスプレイ及び酵母ディスプレイ用に構築された。
上記方法を使用してライブラリーをスクリーニングし、ヒトＴｆＲに結合するいくつかのクローンをＥＬＩＳＡによって特定した（表１）。
ＣＨ２Ｃクローンの生成及び特徴付け
トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に対するＣＨ２Ｃライブラリーによる選択
上述のように、ＣＨ２Ｃに対するファージライブラリー及び酵母ライブラリーをパニングし、ＴｆＲに対してソーティングした。ヒトＴｆＲ及び／またはカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＴｆＲに結合するクローンは、４ラウンドのファージパニング後、上記の「ＥＬＩＳＡによるスクリーニング」というタイトルのセクションに記載されるように、ＥＬＩＳＡアッセイで特定し（すなわち、グループ１及び４クローン）、上記の「酵母選択の一般的方法」というタイトルのセクションに記載される酵母結合アッセイによって、４または５ラウンドの酵母ソーティング後、追加のクローンを特定した（すなわち、グループ２及び３クローン）。代表的なクローンの配列は、４つのグループ、すなわち、１６個のユニークな配列を含有するグループ１（すなわち、配列番号６３～７８）、４個のユニークな配列を含有するグループ２（すなわち、配列番号７９～８２）、２個のユニークな配列を含有するグループ３（すなわち、配列番号８３～８４）、及び１つの配列を含有するグループ４（すなわち、配列番号８５）に分類された（表２）。グループ１の配列は、位置２６６に半保存されたＰｒｏ、位置２６９に半保存されたＰｒｏ、位置２７０に保存されたＰｒｏ、位置２７１に半保存されたＴｒｐ、位置２９５に半保存されたＧｌｕ、位置２９７に保存されたＴｙｒを有し、他のライブラリー位置には、特有の傾向はなかった。グループ２の配列は、位置２６６に保存されたＭｅｔ、位置２６７に半保存されたＬ、位置２６９に保存されたＰｒｏ、位置２７０に保存されたＶａｌ、位置２７１に半保存されたＰｒｏ、位置２９５に半保存されたＴｈｒ、位置２９７に保存されたＨｉｓ、及び位置２９９に保存されたＰｒｏを有した。グループ３の２つの配列は、位置２９５のみが異なり、ＶａｌまたはＬｅｕのいずれかが存在した。グループ４は、配列番号８５に示される配列を含む単一のクローン（すなわち、ＣＨ２Ｃ．２３）で構成された。
ＣＨ２Ｃクローンの特徴付け
ＣＨ２Ｃバリアントは、抗ＢＡＣＥ１ベンチマーク可変領域配列を含有する発現ベクターにクローニングすることによって、ＦａｂフラグメントへのＦｃ融合体として発現された。２９３細胞またはＣＨＯ細胞で発現させた後、得られたポリペプチド－Ｆａｂ融合体をプロテインＡ及びサイズ排除クロマトグラフィーによって精製し、次いで、ヒトＴｆＲまたはカニクイザルＴｆＲへの結合についてアッセイした。グループ４のクローンＣＨ２Ｃ．２３は、ホロトランスフェリンと競合した。ヒトＴｆＲ及びカニクイザルＴｆＲに対する結合力価では、配列グループ１に属するクローンを試験した。他の配列グループの代表的なクローンは、ホロ－Ｔｆの存在下または非存在下における結合についてファージ上で試験し、クローンＣＨ２Ｃ．７は、バイオレイヤー干渉法（すなわち、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＲＥＤシステムの使用）によって、ホロトランスフェリンの存在下におけるヒトＴｆＲへの結合について試験した。ほとんどのクローンは、カニクイザルＴｆＲに対して、ある程度の交差反応性を示し、試験したクローンは、クローンＣＨ２Ｃ．２３を除き、ホロ－Ｔｆと競合しなかった。
ＣＨ２Ｄクローンの生成及び特徴付け
トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に対するＣＨ２Ｄライブラリーによる選択
上述のように、ＣＨ２Ｄに対するファージライブラリーをＴｆＲに対してパニングした。ヒトＴｆＲ及び／またはカニクイザルＴｆＲに結合するクローンは、上記の「ＥＬＩＳＡによるスクリーニング」というタイトルのセクションに記載されるように、ＥＬＩＳＡアッセイで特定した。５つのユニークなクローンが特定され、それぞれ２つ及び３つの配列の２つの配列ファミリーに分類された（表３）。配列グループ１（すなわち、クローンＣＨ２Ｄ．１（配列番号８６）及びＣＨ２Ｄ．２（配列番号８７））は、位置２６８～２７２に保存されたＶＰＰＸＭ（配列番号３９９）モチーフ、位置２９１～２９５にＳＬＴＳ（配列番号４００）モチーフ、及び位置３００にＶを有した。位置２６７の変異は設計に含まれておらず、ＰＣＲのエラーまたは組換えに起因するものと思われる。配列グループ２（すなわち、クローンＣＨ２Ｄ．３（配列番号８８）、ＣＨ２Ｄ．４（配列番号８９）、及びＣＨ２Ｄ．５（配列番号９０））は、位置２６８に保存されたＤ、位置２６９に半保存されたＤ、位置２７０に保存されたＷ、位置２７１に半保存されたＥ、位置２７２に保存された芳香族（ＷまたはＹ）、位置２９１～２９２に保存されたＰＷモチーフ、及び位置３００に保存されたＷを有した。
ＣＨ２Ｄクローンの特徴付け及び追加操作
ＣＨ２Ｄバリアントは、抗ＢＡＣＥ１可変領域配列を含有する発現ベクターにクローニングすることによって、ＦａｂフラグメントへのＦｃ融合体として発現された。２９３細胞またはＣＨＯ細胞で発現させた後、得られたポリペプチド－Ｆａｂ融合体をプロテインＡ及びサイズ排除クロマトグラフィーによって精製し、次いで、本明細書に前述される方法を使用して、ホロ－Ｔｆの存在下または非存在下におけるカニクイザルＴｆＲ及びヒトＴｆＲへの結合についてアッセイした。
ＣＨ２Ｅクローンの生成及び特徴付け
トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に対するＣＨ２Ｅ３ライブラリーによる選択
上述のように、ＣＨ２Ｅ３に対するファージライブラリーをＴｆＲに対してパニングした。ヒトＴｆＲ及び／またはカニクイザルＴｆＲに結合するクローンは、上記の「ＥＬＩＳＡによるスクリーニング」というタイトルのセクションに記載されるように、ＥＬＩＳＡアッセイで特定した。５つの配列から３つの配列グループを特定したが、グループのうちの２つは、それぞれ１つのユニークな配列のみで構成された（表４）。３つのユニークな配列（すなわち、クローンＣＨ２Ｅ３．２（配列番号９２）、ＣＨ２Ｅ３．３（配列番号９３）、及びＣＨ２Ｅ３．４（配列番号９４））を有する配列グループ２は、位置２７２に半保存されたＶａｌ、位置２７４に保存されたＧｌｙ、位置２７６に保存されたＡｒｇ、位置３２２に保存されたＡｒｇ、位置３２４及び３２６に保存されたＳｅｒ、位置３３０に保存されたＴｒｐ、及び位置３３１にＡｒｇまたはＬｙｓを有した。
ＣＨ２Ｅ３クローンの特徴付け及び追加操作
ＣＨ２Ｅ３バリアントは、抗ＢＡＣＥ１ベンチマーク可変領域配列を含有する発現ベクターにクローニングすることによって、Ｆａｂフラグメントへの融合体として発現された。２９３細胞またはＣＨＯ細胞で発現させた後、得られたポリペプチド－Ｆａｂ融合体をプロテインＡ及びサイズ排除クロマトグラフィーによって精製し、次いで、本明細書に前述される結合のための方法を使用して、ホロ－Ｔｆの存在下または非存在下におけるカニクイザルＴｆＲ及びヒトＴｆＲへの結合についてアッセイした。
ＣＨ３Ｂクローンの生成及び特徴付け
トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に対するＣＨ３Ｂライブラリーによる選択
上述のように、ＣＨ３Ｂに対するファージライブラリー及び酵母ライブラリーをパニングし、ＴｆＲに対してソーティングした。ヒトＴｆＲ及び／またはカニクイザルＴｆＲに結合するクローンは、４ラウンドのファージパニング後、上記の「ＥＬＩＳＡによるスクリーニング」というタイトルのセクションに記載されるように、ＥＬＩＳＡアッセイで特定し、上記の「酵母選択の一般的方法」というタイトルのセクションに記載される酵母結合アッセイによって、４または５ラウンドの酵母ソーティング後、追加のクローンを特定した。ファージ及び酵母の両方から特定された全ての１７クローン（すなわち、配列番号３０～４６）は、関連のある配列を有し、その配列は、位置３４５に半保存されたＰｈｅ、位置３４６に半保存された負荷電性ＡｓｐまたはＧｌｕ、位置３４９に半保存されたＴｈｒ、位置４３７に保存されたＧ、位置４３８に保存されたＰｈｅ、位置４３９に半保存されたＨｉｓ、及び位置４４０に保存されたＡｓｐを有した。いくつかのクローンは、Ｔ３５０Ｉ変異を有するが、ライブラリー設計で意図的に変異させた位置ではなく、おそらく、組換えまたはＰＣＲのエラーによって導入されたものと思われる。
ＣＨ３Ｂクローンの特徴付け
２つの代表的なクローンであるＣＨ３Ｂ．１１（配列番号４０）及びＣＨ３Ｂ．１２（配列番号４１）をファージの表面上に発現させ、ホロ－Ｔｆの存在下または非存在下におけるヒトＴｆＲ及びカニクイザルＴｆＲへの結合について試験した。どちらのクローンもホロ－Ｔｆの追加による影響を受けなかった。更に、ＣＨ３Ｂバリアントは、抗ＢＡＣＥ１可変領域配列を含有する発現ベクターにクローニングすることによって、Ｆａｂフラグメントへの融合体として発現された。２９３細胞またはＣＨＯ細胞で発現させた後、得られたポリペプチド－Ｆａｂ融合体をプロテインＡ及びサイズ排除クロマトグラフィーによって精製し、次いで、ヒトＴｆＲまたはカニクイザルＴｆＲへの結合についてアッセイした。全てが両方のオルソログに特異的な結合を示した。
ＣＨ３Ｂクローンの追加操作
追加のライブラリーの設計及びスクリーニングに関してＣＨ２Ａ２について上記したものと同様の追加操作方法を使用して、ＣＨ３Ｂクローンの親和性を改善した。特に、更なる多様性のために、パラトープ付近の４～７個の一連の残基パッチのいくつかを選択した。クローンＣＨ３Ｂ．１２（配列番号４１）を出発点として使用した。飽和（すなわち、ＮＮＫ）変異導入について選択された残基は、以下のとおりであった。
ＣＨ３Ｂ－パッチ１：アミノ酸位置３５４、３５５、３５６、３５８、３５９、３６０、及び３６１；
ＣＨ３Ｂ－パッチ２：アミノ酸位置３４８、４３３、４３４、及び４３６；
ＣＨ３Ｂ－パッチ３：アミノ酸位置３５２、４４１、４４４、４４５、４４６、及び４４７；
ＣＨ３Ｂ－パッチ４：アミノ酸位置３４２、３４４、３７０、４０１、及び４０３；ならびに
ＣＨ３Ｂ－パッチ５：アミノ酸位置３８２、３８４、３８５、４２０、４２１、及び４２２。
ライブラリーは、上記の「ファージディスプレイライブラリーの生成」及び「酵母ディスプレイライブラリーの生成」というタイトルのセクションに記載されるように、ＰＣＲ変異導入を使用して生成し、酵母及びファージに入れた。上記方法を使用してライブラリーをスクリーニングし、ヒトＴｆＲに結合するいくつかのクローンをＥＬＩＳＡによって特定した（表５）。
ＣＨ３Ｃクローンの生成及び特徴付け
トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に対するＣＨ３Ｃライブラリーによる選択
上述のように、ＣＨ３Ｃに対する酵母ライブラリーをパニングし、ＴｆＲに対してソーティングした。最初の３回のソーティングラウンドに対して、集団を濃縮するＦＡＣＳを実施した。更にソーティングを２ラウンド行った後、単一クローンの配列を決定し、４つのユニークな配列（すなわち、クローンＣＨ３Ｃ．１（配列番号４）、ＣＨ３Ｃ．２（配列番号５）、ＣＨ３Ｃ．３（配列番号６）、及びＣＨ３Ｃ．４（配列番号７））を特定した（表６）。これらの配列は、位置３８８に保存されたＴｒｐを有し、位置４２１は全て芳香族残基（すなわち、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＨｉｓ）を有した。他の位置には大きな多様性があった。
第１生成ＣＨ３Ｃクローンの特徴付け
ＣＨ３Ｃライブラリーから選択した４つのクローンを、ＣＨＯ細胞または２９３細胞で、ＦａｂフラグメントへのＦｃ融合体として発現させ、プロテインＡクロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーによって精製し、次いで、ホロ－Ｔｆの存在下または非存在下におけるカニクイザルＴｆＲ及びヒトＴｆＲに対する結合について、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。クローンは全てヒトＴｆＲに結合し、ホロ－Ｔｆを過剰に添加しても（５μＭ）、結合への影響はなかった。一方、これらのクローンは、カニクイザルＴｆＲにほとんど結合しなかった。クローンはまた、ヒトＴｆＲを内因的に発現する２９３Ｆ細胞への結合についても試験した。クローンは２９３Ｆ細胞に結合したが、総合的な結合は、親和性の高い陽性対照よりも実質的に弱かった。
次に、クローンＣＨ３Ｃ．３がＴｆＲ発現細胞に内在化できるかどうかを試験した。接着系ＨＥＫ２９３細胞を９６ウェルプレートで約８０％コンフルエントまで成長させ、培地を除去し、試料のＣＨ３Ｃ．３抗ＴｆＲベンチマーク陽性対照抗体（Ａｂ２０４）、抗ＢＡＣＥ１ベンチマーク陰性対照抗体（Ａｂ１０７）、及びヒトＩｇＧアイソタイプ対照（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈから入手）を１μＭ濃度で加えた。細胞を３７℃及び８％ＣＯ２濃度で３０分間インキュベートし、次いで、洗浄し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００で透過処理し、抗ヒトＩｇＧ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８二次抗体で染色した。更に洗浄した後、細胞をハイコンテント蛍光顕微鏡（すなわち、Ｏｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘ（商標）システム）で撮像し、１細胞あたりの斑点数を定量した。クローンＣＨ３Ｃ．３は、１μＭで、陽性抗ＴｆＲ対照と同様の内在化傾向を示し、一方、陰性対照は内在化を示さなかった。
ＣＨ３Ｃクローンの二次操作
ヒトＴｆＲに対する最初のＣＨ３Ｃヒットの親和性を改善し、また、カニクイザルＴｆＲへの結合導入を試みるために、追加のライブラリーを生成した。ソフトランダム化法を使用し、元の４つのヒットのそれぞれに基づいてソフト変異導入を導入するために、ＤＮＡオリゴを生成した。レジスター（ＷＥＳＸＧＸＸＸＸＸＹＫ（配列番号５２８））の第１の部分及びレジスター（ＴＶＸＫＳＸＷＱＱＧＸＶ（配列番号５２９））の第２の部分は、別個のフラグメントを介して構築したため、ソフトランダム化したレジスターは、ＰＣＲ増幅中にシャッフルされた（例えば、クローンＣＨ３Ｃ．１のレジスターの第１の部分は、クローンＣＨ３Ｃ．１、ＣＨ３Ｃ．２、ＣＨ３Ｃ．３、及びＣＨ３Ｃ．４のレジスターの第２の部分と混ざり合うなど）。フラグメントを全て混合し、次いで、表面発現及び選択のために酵母に導入した。
１ラウンドのＭＡＣＳ及び３ラウンドのＦＡＣＳを行った後、個々のクローンの配列を決定した（クローンＣＨ３Ｃ．１７（配列番号８）、ＣＨ３Ｃ．１８（配列番号９）、ＣＨ３Ｃ．２１（配列番号１０）、ＣＨ３Ｃ．２５（配列番号１１）、ＣＨ３Ｃ．３４（配列番号１２）、ＣＨ３Ｃ．３５（配列番号１３）、ＣＨ３Ｃ．４４（配列番号１４）、及びＣＨ３Ｃ．５１（配列番号１５））。選択したクローンは、２つの一般配列グループに分類された（表６）。グループ１のクローン（すなわち、クローンＣＨ３Ｃ．１８、ＣＨ３Ｃ．２１、ＣＨ３Ｃ．２５、及びＣＨ３Ｃ．３４）は、位置３８４に半保存されたＬｅｕ、位置３８６にＬｅｕまたはＨｉｓ、位置３８７及び３８９にそれぞれ保存されたＶａｌ及び半保存されたＶａｌ、ならびに位置４１３、４１６、及び４２１にそれぞれ半保存されたＰ－Ｔ－Ｗモチーフを有した。グループ２のクローンは、位置３８４に保存されたＴｙｒ、位置３８６～３９０にモチーフＴＸＷＳＸ（配列番号５３０）、ならびに位置４１３、４１６、及び４２１にそれぞれ保存されたモチーフＳ／Ｔ－Ｅ－Ｆを有した。クローンＣＨ３Ｃ．１８及びＣＨ３．３５は、各配列グループの代表的なメンバーとして、更なる試験に使用した。クローンＣＨ３Ｃ．５１は、そのレジスターの第１の部分がグループ１からのものであり、そのレジスターの第２の部分がグループ２からのものであることが認められた。
ソフト変異導入ライブラリーから得たＣＨ３Ｃクローンの結合特徴付け
ソフト変異導入ライブラリーから得たクローンをＦｃ－Ｆａｂ融合ポリペプチドとして再構成し、上記のように発現及び精製した。これらのバリアントは、最初のライブラリー選択から得られたトップクローン（ＣＨ３Ｃ．３）と比較して、ヒトＴｆＲに対するＥＬＩＳＡ結合が改善しており、ホロ－Ｔｆとも競合しなかった。ＥＣ５０値は、ホロ－Ｔｆの存在下または非存在による影響を、実験誤差を超えて認められるほど受けることはなかった。
とりわけ、クローンＣＨ３Ｃ．３５は、親和性の高い抗ＴｆＲ対照抗体Ａｂ２０４と同程度にヒトＴｆＲに結合した。ソフトランダム化ライブラリーから選択したクローンもまた２９３Ｆ細胞に対する細胞結合が改善した。同様の細胞結合アッセイで、細胞表面上に高レベルのヒトＴｆＲまたはカニクイザルＴｆＲを安定的に発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞への結合について、これらのクローンを試験した。ソフトランダム化ライブラリーから選択したクローンは、ヒトＴｆＲ及びカニクイザルＴｆＲを発現する細胞に結合したが、親のＣＨＯ－Ｋ１細胞には結合しなかった。大きさ及び結合のＥＣ５０値は、ヒトＴｆＲと比較してカニクイザルＴｆＲのほうが大幅に低かった。
エピトープマッピング
操作したＣＨ３Ｃ Ｆｃ領域がＴｆＲのアピカルドメインに結合したかどうかを決定するために、ＴｆＲアピカルドメイン（ヒト及びカニクイザルについてそれぞれ配列番号９６及び９７）をファージの表面上に発現させた。アピカルドメインの適切なフォールディング及びディスプレイを行うためには、ループの１つを切断し、配列を循環置換する必要があった。ファージ上に発現される配列は、ヒト及びカニクイザルについてそれぞれ配列番号９８及び９９と同定される。クローンＣＨ３Ｃ．１８及びＣＨ３Ｃ．３５をＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、続いて、前述のファージＥＬＩＳＡプロトコールを行った。簡潔に述べれば、１％ＰＢＳＡで洗浄及びブロッキングした後、提示されているファージの希釈液を加え、室温で１時間インキュベートした。その後、プレートを洗浄し、抗Ｍ１３－ＨＲＰを加え、更に洗浄した後、プレートをＴＭＢ基質で発色させ、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止した。本アッセイでは、ＣＨ３Ｃ．１８及びＣＨ３Ｃ．３５の両方がアピカルドメインに結合した。
カニクイザルＴｆＲへの結合は、ヒトＴｆＲへの結合よりもかなり弱いことが知られているので、カニクイザルとヒトのアピカルドメイン間での１つ以上のアミノ酸の違いが結合の違いの原因である可能性が高いと仮定された。したがって、ヒトＴｆＲアピカルドメインに一連の６個の点変異を施し、ヒト残基を対応するカニクイザル残基で置き換えた。これらの変異体をファージ上に提示させ、ファージ濃度をＯＤ２６８によって正規化し、ＣＨ３Ｃ．１８及びＣＨ３Ｃ．３５への結合をファージＥＬＩＳＡ滴定によって試験した。抗Ｍｙｃ抗体９Ｅ１０での捕捉により、全ての変異体で提示レベルが同様であることが示された。ヒトＴｆＲ変異への結合は、Ｒ４３５Ｇ変異の影響が強いことが明確に示されたことから、この残基がエピトープの重要な部分であり、この位置にあるカニクイザル残基が悪影響を与えていることが示唆される。ファージ提示されたカニクイザルアピカルドメイン上にＧ４３５Ｒ変異を施すと、この変異により、カニクイザルアピカルドメインへの結合が劇的に改善することが示された。これらの結果から、ＣＨ３ＣクローンがＴｆＲのアピカルドメインに結合することが示され、また、結合には位置４３５が重要であるのに対し、位置４７４、５１９、５９１、５９７、及び５９９は重要性があまり高くないことが示されている。
パラトープマッピング
Ｆｃドメインのどの残基がＴｆＲ結合に最も重要であるかを理解するために、一連の変異体ＣＨ３Ｃ．１８及びＣＨ３Ｃ．３５クローンを生成した。各変異体は、ＴｆＲ結合レジスターの変異の１つの位置を野生型に戻したものである。得られたバリアントをＣＨ３Ｃ Ｆｃ－Ｆａｂ融合体として組換え発現させ、ヒトＴｆＲまたはカニクイザルＴｆＲへの結合について試験した。ＣＨ３Ｃ．３５について、位置３８８及び４２１が結合に絶対的に重要であり、これらのいずれかを野生型に戻すと、ヒトＴｆＲへの結合は完全に失われた。驚くべきことに、位置３９０を野生型に戻すと、カニクイザルＴｆＲ結合が劇的に向上したが、ヒトへの結合にはほとんど影響しなかった。逆に、ＣＨ３Ｃ．１８では、残基３９０を野生型に戻してもほとんど影響はなかったが、このバリアントでは、位置４１６及び４２１を元に戻すと、ヒトＴｆＲへの結合が完全になくなった。両方のバリアントにおいて、他の単一の復帰変異は、ヒトＴｆＲ結合に中程度の（有害な）影響を与えたが、多くの場合、カニクイザルＴｆＲへの結合がなくなった。
カニクイザルＴｆＲへの結合を改善するための追加操作
カニクイザルＴｆＲに対するＣＨ３Ｃバリアントの親和性を更に高めるために、追加のライブラリーを調製した。これらのライブラリーは、理論的な多様性の観点から約１０７クローン未満になるように設計されたため、酵母表面ディスプレイを使用して、完全な多様性空間を探索することができた。４つのライブラリー設計を使用した。全てのライブラリーは、上記のとおり、ＮＮＫまたは他の縮重コドン位置を含む縮重オリゴを使用して生成し、オーバーラップＰＣＲによって増幅した。
第１のライブラリーは、ＣＨ３Ｃ．３５のような配列のコンセンサスに基づいた。ここで、位置３８４～３８８は、ＹＧＴＥＷ（配列番号５３１）に一定に保たれ、一方、位置３８９、３９０、４１３、４１６、及び４２１は、飽和変異導入を使用して変異させた。
第２のライブラリーは、ＣＨ３Ｃ．１８のような配列のコンセンサスに基づいた。ここで、位置３８４は、Ｌｅｕ及びＭｅｔに制限され、位置３８６は、Ｌｅｕ及びＨｉｓに制限され、位置３８７は、Ｖａｌに一定に保たれ、位置３８８は、Ｔｒｐ及びＧｌｙに制限され、位置３８９は、Ｖａｌ及びＡｌａに制限され、位置３９０は、完全にランダム化され、位置３９１は、レジスターに加えられて完全にランダム化され、位置４１３は、ソフトランダム化され、位置４１６は、完全にランダム化され、位置４２１は、芳香族アミノ酸及びＬｅｕに制限された。
第３のライブラリーは、ライブラリーに新しくランダム化した位置を加えた。ＣＨ３Ｃ．１８及びＣＨ３Ｃ．３５をそれぞれ出発レジスターとした２つのバージョンを生成し、次いで、追加の位置Ｅ１５３、Ｅ１５５、Ｙ１６４、Ｓ１８８、及びＱ１９２を飽和変異導入によってランダム化した。
第４のライブラリーは、ＣＨ３Ｃ．１８の特定の位置を一定にしたが、他の位置での変化は許容したもので、コンセンサスライブラリーよりも偏りが少ない。位置３８７、３８８、及び４１３は、固定され、位置３８４、３８６、３８９、３９０、及び４１６は、飽和変異導入によってランダム化され、位置４２１は、変異しているが、芳香族残基及びＬｅｕに制限された。
ライブラリーは、カニクイザルＴｆＲに対して４～５ラウンドで酵母で選択し、単一クローンの配列を決定し、上記のようにポリペプチド－Ｆａｂ融合体に変換した。カニクイザルＴｆＲ結合の最大濃縮は、第２のライブラリー（すなわち、ＣＨ３Ｃ．１８親の誘導体）から観察されたが、ｈｕＴｆＲ結合の若干の損失もあった。
ＣＨ３Ｃ変異クローンの結合特徴
精製したＣＨ３Ｃ Ｆｃ－Ｆａｂ融合バリアントと、ヒトＴｆＲまたはカニクイザルＴｆＲをプレート上にコーティングしたものを用いて、結合ＥＬＩＳＡを上記のとおり実施した。ＣＨ３Ｃ．１８成熟ライブラリーから得たバリアントであるＣＨ３Ｃ３．２－１、ＣＨ３Ｃ．３．２－５、及びＣＨ３Ｃ．３．２－１９は、ほぼ同等のＥＣ５０値でヒトＴｆＲ及びカニクイザルＴｆＲに結合したが、親クローンＣＨ３Ｃ．１８、及びＣＨ３Ｃ．３５は、ヒトＴｆＲへの結合がカニクイザルＴｆＲに対して１０倍を超える良好な結合を有した。
次に、新しいポリペプチドがヒト細胞及びサル細胞で内在化するかどうかを試験した。前述の「第１生成ＣＨ３Ｃクローンの特徴付け」というタイトルのセクションで記載されているプロトコールを使用して、ヒトＨＥＫ２９３細胞及びアカゲザルＬＬＣ－ＭＫ２細胞における内在化を試験した。ヒトＴｆＲ及びカニクイザルＴｆＲに同様に結合したバリアントであるＣＨ３Ｃ．３．２－５及びＣＨ３Ｃ．３．２－１９は、ＣＨ３Ｃ．３５と比較して、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞における内在化が大幅に改善した。
ＣＨ３Ｃクローンの追加操作
クローンＣＨ３Ｃ．１８及びＣＨ３Ｃ．３５を更に親和性成熟させる追加の操作には、直接的相互作用、第２シェル相互作用、または構造安定化を介して結合が増強される骨格（すなわち、非レジスター）位置に、追加の変異を加えることが含まれた。これは、「ＮＮＫウォーク」または「ＮＮＫパッチ」ライブラリーの生成及び選択により実現した。ＮＮＫウォークライブラリーには、パラトープ近傍の残基のＮＮＫ変異を個々に作製することが含まれた。ＦｃｇＲＩに結合するＦｃの構造（ＰＤＢ ＩＤ：４Ｗ４Ｏ）を調べることによって、元のライブラリーレジスターに近い４４個の残基を調査候補として特定した。具体的には、次の残基、すなわち、Ｋ２４８、Ｒ２５５、Ｑ３４２、Ｒ３４４、Ｅ３４５、Ｑ３４７、Ｔ３５９、Ｋ３６０、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｋ３７０、Ｅ３８０、Ｅ３８２、Ｓ３８３、Ｇ３８５、Ｙ３９１、Ｋ３９２、Ｔ３９３、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｓ４０３、Ｋ４０９、Ｌ４１０、Ｔ４１１、Ｖ４１２、Ｋ４１４、Ｓ４１５、Ｑ４１８、Ｑ４１９、Ｇ４２０、Ｖ４２２、Ｆ４２３、Ｓ４２４、Ｓ４２６、Ｑ４３８、Ｓ４４０、Ｓ４４２、Ｌ４４３、Ｓ４４４、Ｐ４４５８、Ｇ４４６、及びＫ４４７をＮＮＫ変異導入の対象とした。Ｋｕｎｋｅｌ変異導入を使用して４４個のシングルポイントＮＮＫライブラリーを生成し、産物をプールし、他の酵母ライブラリーについて記載したとおりに、エレクトロポレーションにより酵母に導入した。
これらのミニライブラリーの組み合わせ（それぞれ１つの位置に変異を有し、２０個のバリアントが生じる）により、より高い親和性結合が得られる任意の位置について、酵母表面ディスプレイの使用により選択された小ライブラリーを生成した。選択は、ＴｆＲアピカルドメインタンパク質を使用して、上記のとおりに実施した。ソーティングを３ラウンド行った後、濃縮酵母ライブラリーから得たクローンの配列を決定し、特定の点変異によりアピカルドメインタンパク質への結合が大幅に改善する、いくつかの「ホットスポット」位置を特定した。ＣＨ３Ｃ．３５について、これらの変異には、Ｅ３８０（Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、またはＧｌｎへの変異）及びＳ４１５（Ｇｌｕへの変異）が含まれた。ＣＨ３Ｃ．３５の単一変異体及び組み合わせ変異体の配列を配列番号２１～２３、１０１～１０６、及び１６２～１６４に記載する。ＣＨ３Ｃ．１８について、これらの変異には、Ｅ３８０（Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＬｅｕへの変異）及びＫ３９２（Ｇｌｎ、Ｐｈｅ、またはＨｉｓへの変異）が含まれた。ＣＨ３Ｃ．１８の単一変異体の配列を配列番号１０７～１１２に記載する。
Ｈ３Ｃ．３５の親和性を改善する追加の成熟ライブラリー
ＮＮＫウォークライブラリーの変異の組み合わせを特定するための追加のライブラリーを、その周辺にいくつかの更なる位置を加えながら、先の酵母ライブラリーについて記載したとおりに生成した。このライブラリーでは、ＹｘＴＥＷＳＳ（配列番号５３２）及びＴｘｘＥｘｘｘｘＦモチーフを一定に保ち、６つの位置Ｅ３８０、Ｋ３９２、Ｋ４１４、Ｓ４１５、Ｓ４２４、及びＳ４２６を完全にランダム化した。位置Ｅ３８０及びＳ４１５は、ＮＮＫウォークライブラリーの「ホットスポット」であることから、含めた。位置Ｋ３９２、Ｓ４２４、及びＳ４２６は、結合領域を位置付けし得るコアの一部を構成することから、含めた。一方、Ｋ４１４は、位置４１５に隣接していることから選択した。
このライブラリーを、カニクイザルＴｆＲアピカルドメインのみを用いて、前述したようにソーティングした。５ラウンド後に濃縮プールの配列を決定し、特定されたユニーククローンのＣＨ３領域の配列を配列番号１１３～１３０に記載する。
ＣＨ３Ｃ．３５．２１の元のレジスター及びホットスポット内の許容可能な多様性の探索
主な結合パラトープにおける許容可能な多様性の全体像を更に探索するために、次のライブラリーを設計した。採用されたアプローチは、ＮＮＫウォークライブラリーと同様であった。元のレジスター位置（３８４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、４１３、４１６、及び４２１）に２つのホットスポット（３８０及び４１５）を加えたそれぞれをＮＮＫコドンで個別にランダム化し、一連の単一位置飽和変異導入ライブラリーを酵母で生成した。加えて、各位置をそれぞれ野生型残基に戻し、これらの個々のクローンを酵母で提示させた。野生型残基に戻した場合でもＴｆＲへの実質的な結合を保持した位置は、位置３８０、３８９、３９０、及び４１５のみであることが確認された（いくらか残るものの大きく減少した結合は、４１３を野生型に戻したときに観察された）。
ヒトＴｆＲアピカルドメインに対する単一位置のＮＮＫライブラリーのソーティングを３ラウンド行い、上位約５％までの結合体を回収し、次いで、各ライブラリーから少なくとも１６個のクローンの配列を決定した。結果は、ＣＨ３Ｃ．３５クローンの場合、ヒトＴｆＲへの結合を大幅に減少させることなく、各位置のどのアミノ酸が許容され得るかを示している。概要を以下に示す。
位置３８０：Ｔｒｐ、ＬｅｕまたはＧｌｕ；
位置３８４：ＴｙｒまたはＰｈｅ；
位置３８６：Ｔｈｒのみ；
位置３８７：Ｇｌｕのみ；
位置３８８：Ｔｒｐのみ；
位置３８９：Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＶａｌ（野生型Ａｓｎ残基はある程度の結合を保持するように思われるが、ライブラリーソーティング後には出現しなかった）；
位置３９０：ＳｅｒまたはＡｓｎ；
位置４１３：ＴｈｒまたはＳｅｒ；
位置４１５：ＧｌｕまたはＳｅｒ；
位置４１６：Ｇｌｕのみ；及び
位置４２１：Ｐｈｅのみ。
上記残基は、クローンＣＨ３Ｃ．３５への置換を単一変化または組み合わせで行った場合、ＴｆＲアピカルドメインへの結合を保持するパラトープ多様性を表す。これらの位置に変異を有するクローンを表７に示す。これらのクローンのＣＨ３ドメインの配列を配列番号１０２～１０６、１２９、及び１３１～１６１に示す。
（表７）ＣＨ３Ｃ．３５．２１のレジスター及びホットスポット位置内の許容可能な多様性の探索
Figure 0007397063000014
一価ポリペプチド－Ｆａｂ融合体
一価ＴｆＲ結合ポリペプチド－Ｆａｂ融合体の生成
Ｆｃドメインは、自然にホモ二量体を形成するが、「ノブ・イン・ホール」として知られる一連の非対称変異により、２つのＦｃフラグメントの優先的なヘテロ二量体化をもたらすことができる。ここで、一方のＦｃユニットは、Ｔ３６６Ｗノブ変異を有し、他方のＦｃユニットは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖホール変異を有する。いくつかの実施形態では、本発明の改変されたＣＨ３ドメインは、位置３６６にＴｒｐを含む。いくつかの実施形態では、本発明の改変されたＣＨ３ドメインは、位置３６６にＳｅｒ、位置３６８にＡｌａ、及び位置４０７にＶａｌを含む。ヘテロ二量体のＴｆＲ結合ポリペプチドは、２９３細胞またはＣＨＯ細胞において、２つのプラスミド（すなわち、ノブ－Ｆｃ及びホール－Ｆｃ）の一過性コトランスフェクションによって発現させ、ポリペプチド－Ｆａｂ融合体は、３つのプラスミド（すなわち、ノブ－Ｆｃ－Ｆａｂ重鎖、ホール－Ｆｃ－Ｆａｂ重鎖、及び共通の軽鎖）の一過性コトランスフェクションによって発現させた。分泌されたヘテロ二量体のポリペプチドまたはポリペプチド－Ｆａｂ融合体の精製は、ホモ二量体の場合と同じように実施した（すなわち、プロテインＡに続けてサイズ排除を使用する２カラムでの精製、次いで、必要に応じて、濃度及び緩衝液交換）。質量分析または疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用して、形成されたヘテロ二量体対ホモ二量体（例えば、ノブ－ノブまたはホール－ホール対のＦｃ）の量を決定した。典型的な調製物では、ポリペプチドのうちの９５％超が、多くの場合では９８％超がヘテロ二量体であった。ヘテロ二量体のポリペプチド及びポリペプチド－Ｆａｂ融合体について、ＴｆＲ結合を付与する変異は「ノブ」変異を含んだが、非ＴｆＲ結合Ｆｃ領域は、特に指定のない限り、「ホール」領域とともに使用した。場合により、Ｆｃ特性を変更する追加の変異もこれらのコンストラクトに含めた。例えば、ＦｃγＲまたはＦｃＲｎ結合を改変するために、それぞれＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｎ４３４Ｓ、またはＮ４３４Ｓ／Ｍ４２８Ｌを含めた。
ＣＨ３Ｃ．モノＦｃポリペプチドの結合特徴
上記の手順に修正を加えて使用するＥＬＩＳＡで、一価のＣＨ３Ｃポリペプチドの結合を測定した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに、ストレプトアビジンをＰＢＳ中１μｇ／ｍＬで一晩コーティングした。洗浄後、プレートを１％ＢＳＡ含有ＰＢＳでブロッキングし、次いで、ビオチン化されたヒトＴｆＲまたはカニクイザルＴｆＲを１μｇ／ｍＬで加え、３０分間インキュベートした。追加の洗浄後、ポリペプチドを連続希釈でプレートに加え、１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、二次抗体（すなわち、抗カッパ－ＨＲＰ、１：５，０００）を３０分間加え、プレートを再度洗浄した。プレートをＴＭＢ基質で発色させ、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止し、次いで、４５０ｎｍでの吸光度をＢｉｏＴｅｋ（登録商標）プレートリーダーで読み取った。二価のＴｆＲ結合ポリペプチドと一価のＴｆＲ結合ポリペプチドを比較した。Ａｂ２０４を高親和性の抗ＴｆＲ対照抗体として使用した。
ヒトＴｆＲを内因的に発現する２９３Ｆ細胞、及びヒトＴｆＲまたはカニクイザルＴｆＲを安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ－Ｋ１細胞への結合について、追加の試験を実施した。
概して、一価ポリペプチドのヒトＴｆＲへの結合は、二価ポリペプチドと比較して実質的に減少したことが観察され、一価ポリペプチドのカニクイザル結合は、これらのアッセイでは弱すぎて検出されなかった。
次に、ＣＨ３Ｃポリペプチドの一価バージョンがヒトＴｆＲ発現ＨＥＫ２９３細胞で内在化できるかどうかを試験した。内在化アッセイについて上記されている方法を使用した。一価のペプチドも内在化することができたが、全体のシグナルは、おそらく結合親和性／アビディティが失われたことに起因して、それぞれの二価バージョンよりも弱かった。
バイオレイヤー干渉法によって測定されたＣＨ３Ｃポリペプチドの結合カイネティクス
バイオレイヤー干渉法の使用（すなわち、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＲＥＤシステムの使用）により、抗ＢＡＣＥ１ Ｆａｂに融合させたいくつかの一価及び二価のＣＨ３Ｃポリペプチドバリアントの結合カイネティクスを決定し、その二価の等価物と比較した。ＴｆＲをストレプトアビジンセンサー上に捕捉し、次いで、ＣＨ３Ｃポリペプチドを結合させ、洗浄した。センサーグラムを１：１結合モデルに当てはめた。二価ポリペプチドのＫＤ（ａｐｐ）値は、ＴｆＲ二量体への強力な結合を示した。
一価フォーマットに変換されたポリペプチドは、アビディティが失われたことに起因して、ＫＤ（ａｐｐ）値が著しく弱かった。ＥＬＩＳＡによって同様のヒトＴｆＲ及びカニクイザルＴｆＲ結合を有することが先に示されたクローンＣＨ３Ｃ．３．２－１、ＣＨ３Ｃ．３．２－５、及びＣＨ３Ｃ．３．２－１９もまた、ヒトＴｆＲ及びカニクイザルＴｆＲの間で極めて似通ったＫＤ（ａｐｐ）値を有した。これらのポリペプチドの一価フォーマットを試験する試みがなされたが、このアッセイにおける結合は弱すぎて動力学的パラメーターを算出できなかった。
実施例２．ＣＨ３Ｃ．３５．２１の単一アミノ酸置換
本実施例は、ＣＨ３Ｃ．３５．２１の単一アミノ酸変異体のライブラリーの構築について記載する。
方法
ＣＨ３Ｃ．３５．２１の単一アミノ酸置換をそれぞれ含有するＣＨ３Ｃ．３５．２１変異体のライブラリーを、Ｋｕｎｋｅｌ変異導入を使用して構築した（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８２（２）：４８８－９２，１９８５）。ＣＨ３Ｃ．３５．２１について、ＥＵ付番スキームに従って付番した位置Ｗ３８０、Ｙ３８４、Ｔ３８６、Ｅ３８７、Ｗ３８８、Ｓ３８９、Ｓ３９０、Ｋ３９２、Ｔ４１３、Ｋ４１４、Ｅ４１５、Ｅ４１６、Ｆ４２１、Ｓ４２４、及びＳ４２６のそれぞれを、縮重変異誘発性オリゴを使用して、コドンＮＮＫに個別に変異させた。ライブラリー中に元のＣＨ３Ｃ．３５．２１クローンを得ることがないように、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃをコードする一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）のＫｕｎｋｅｌ鋳型を使用した。２つの変異誘発性オリゴ（１つはＮＮＫを含み、もう１つはその他のＣＨ３Ｃ．３５．２１領域をコードする）を組み合わせて使用した。それにより、両方のオリゴが組み込まれると、ＣＨ３Ｃ．３５．２１アミノ酸配列が得られるが、所望のライブラリー位置にはＮＮＫコドンが含まれた。鋳型が野生型Ｆｃであるので、単一のオリゴ挿入またはオリゴ挿入なしではＴｆＲに結合しない。したがって、これらのコンストラクトは、いずれの解析からも簡単に除外された。同様に、ＮＮＫ位置から生じる終止コドンも排除した。ライブラリーをＥＢＹ１００酵母にトランスフェクトした。各ライブラリーから８つのコロニーの配列を決定して、ナイーブライブラリーが所望の位置のランダム化を含有することを確認した。
酵母ディスプレイ及びフローサイトメトリーによって測定した循環置換したＴｆＲアピカルドメイン結合集団の上位およそ１０％を、親和性を区別するのに最良の範囲をもたらすＴｆＲ濃度で回収した。各位置につき、１２個のクローンの配列を得た。明確に異なる集団を含むライブラリーについては、より明確に定義された高、中、低ゲートを用いて同じ実験を行った。それぞれ回収された集団につき、３６個のクローンの配列を決定した。更に、変異体の結合を、対応するアミノ酸位置に野生型残基を有する対応する変異体の結合と比較するために、同様の方法で変異誘発性オリゴを使用して、同じ位置のアミノ酸を野生型ＩｇＧ１残基に戻した。
表８は、ＣＨ３Ｃ．３５．２１変異体のライブラリーを示す。各変異体は、ＣＨ３Ｃ．３５．２１の単一アミノ酸置換を含有した。例えば、ある変異体は、Ｗ３８０Ｅを含有し得、残りの位置のアミノ酸は、ＣＨ３Ｃ．３５．２１のアミノ酸と同じである。表８に示される位置は、ＥＵ付番スキームに従って付番される。
（表８）ＣＨ３Ｃ．３５．２１単一アミノ酸変異体
Figure 0007397063000015
実施例３．ＣＨ３Ｃ．１８バリアントの生成
本実施例は、ＣＨ３Ｃ．１８バリアントの生成について記載する。
単一クローンを単離し、０．２％グルコースを添加したＳＧ－ＣＡＡ培地中で一晩成長させて、ＣＨ３Ｃ．１８バリアントの表面発現を一晩誘導した。各クローンについて、２００万細胞をＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。ビオチン化した標的、２５０ｎＭのヒトＴｆＲ、２５０ｎＭのカニクイザルＴｆＲ、または２５０ｎＭの無関係のビオチン化タンパク質により４℃で１時間、振盪しながら細胞を染色し、次いで、同じ緩衝液で２回洗浄した。細胞をニュートラアビジン－Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７（ＡＦ６４７）により４℃で３０分間染色し、次いで、再度２回洗浄した。抗ｃ－ｍｙｃ抗体と抗ニワトリ－Ａｌｅｘｆｌｕｏｒ４８８（ＡＦ４８８）二次抗体を使用して発現を測定した。細胞を再懸濁し、ＡＦ６４７及びＡＦ４８８の平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＢＤ ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩで測定した。ＭＦＩは、各集団のＴｆＲ結合集団について算出し、ヒトＴｆＲ、カニクイザルＴｆＲ、または対照結合とプロットした。
表９は、ＣＨ３Ｃ．１８バリアントのライブラリーを示す。各行は、各位置に指定のアミノ酸置換を含有するバリアントを示し、残りの位置のアミノ酸は、ＣＨ３Ｃ．１８ Ｆｃのアミノ酸と同じである。表９に示される位置は、ＥＵ付番スキームに従って付番される。
（表９）ＣＨ３Ｃ．１８バリアント
Figure 0007397063000016
Figure 0007397063000017
実施例４．ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含むＦａｂ－Ｆｃ／ｓｃＦｖ－Ｆｃ
本実施例は、２つの異なる標的化可変ドメイン（第１の抗原（ＢＡＣＥ１）を標的とする可変ドメイン及び第２の抗原（Ｔａｕ）を標的とする可変ドメイン）に融合されたＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含む、操作されたタンパク質の精製及び特徴付けについて記載する。タンパク質は、図１に示される非対称融合コンストラクトを作製することによって、軽鎖のミスペアリングまたはステアリングなく、単一細胞で生成することができる。これらのコンストラクトは、３つのポリペプチド鎖を含み、各鎖の同時組換え発現によって作製した。第１の鎖は、ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドであり、Ｆｃヘテロ二量体化のためのノブ変異、及びそのＮ末端でＦａｂのＦｄ部分に融合されたヒンジを含む。第２の鎖は、対応する軽鎖であり、対合して抗原標的１に対するＦａｂを形成する。第３の鎖は、Ｆｃポリペプチドであり、ヒンジ及びＮ末端フレキシブルリンカー（例えば、Ｇ４Ｓ（配列番号３７１）または（Ｇ４Ｓ）２ （配列番号３７２））及び抗原標的２に対するｓｃＦｖを含む。
この構造を持つポリペプチドをＴｆＲ結合Ｆｃ領域３Ｃ．３５．２３．４を使用して生成した。抗ＢＡＣＥ１ Ｆａｂに融合されたノブ変異は、抗Ｔａｕ抗体に対するｓｃＦｖに融合されたホールＦｃと対合する。抗Ｔａｕ ｓｃＦｖの４つのバージョンを生成した。Ｆｃへのリンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号３７１）またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３７２）で試験し、ドメインの順序は、ＶＬ－リンカー－ＶＨまたはＶＨ－リンカー－ＶＬのどちらかで試験した。前者の配置については、リンカーＲＴＶＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３７４）を使用し、後者の配置については、リンカーＡＳＴＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３７５）を使用した。同じ抗ＢＡＣＥ１軽鎖配列を全てのコンストラクトに使用した。全てのコンストラクトは、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）変異を組み込むことによって、エフェクター機能のないＦｃとして作製した。
３つの鎖のそれぞれに対応する遺伝子を発現ベクターにクローニングし、ベクターをＥｘｐｉＣＨＯ細胞にコトランスフェクトして一過性発現させ、次いで、プロテインＡクロマトグラフィーによって精製した。その後、Ｂｉａｃｏｒｅを使用して、第１の抗原（ＢＡＣＥ１）、第２の抗原（Ｔａｕ）、及びＴｆＲに結合する能力について、組換えポリペプチドを試験した。以下の表１０に示されるように、４つのバリアント全てがＴｆＲ及びＢＡＣＥ１に結合したが、バリアント２及び４のみがＴａｕに結合した。この結果は、ＶＬ－リンカー－ＶＨ配置がこのｓｃＦｖに好ましいことを示唆している。
（表１０）Ｆａｂ－Ｆｃ／ｓｃＦｖ－Ｆｃ構造を有する二重特異性タンパク質の結合カイネティクスの概要
Figure 0007397063000018
実施例５．ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドに融合されたＣ末端Ｆｖ
標的抗原結合を組み込むためには、ＴｆＲ結合変異及びノブ変異を含む１つのＦｃサブユニットと、ホール変異を含む第２のＦｃサブユニットとを含むＦｃポリペプチドを、両方の鎖のＣ末端にフレキシブルリンカーと、それに続く抗体に由来する可変ドメイン（一方のサブユニットにはＶＨ、もう一方にはＶＬ）を加えることによって、改変することができる。この構造の例示的な実施形態では、図２に示されるように、ＦｃドメインのＮ末端は、第２の抗原に結合するＦａｂに更に融合される。得られる構成は、ＴｆＲに結合し、１つの標的抗原に二価で結合し、第２の抗原に一価で結合する、４本鎖ポリペプチド（２つの異なる重鎖及び同じ軽鎖の２つのコピー）である。
抗Ｔａｕ抗体由来のＦａｂアームをＴｆＲ結合ポリペプチド３Ｃ．３５．２３．４のＮ末端に融合させることでＴａｕへの２価結合を可能にし、抗ＢＡＣＥ１抗体由来のＶＬ及びＶＨを２つのＦｃ鎖のＮ末端にリンカーを介してそれぞれ融合させた、本構造のポリペプチドを生成した。融合Ｆｖが２つの抗ＢＡＣＥ１抗体クローンの１つに由来すること、リンカーがＧＧＧＧＳ（配列番号３７１）またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３７２）のいずれかであること、ならびにＶＨ及びＶＬ融合体の配置（例えば、ＶＨが重鎖１にあり、重鎖２がＶＬにあるか、その逆）の３つのパラメーターを変化させて、合計で８つの分子を最初に生成した。
これらのコンストラクトは、３つのポリペプチド鎖を含み、各鎖の同時組換え発現によって作製した。第１の鎖は、抗Ｔａｕ Ｆａｂ由来のＦｄ領域にＮ末端で融合され、リンカーに続いて抗ＢＡＣＥ１ Ｆａｂ由来のＶＨまたはＶＬにＣ末端で融合された、ＴｆＲ結合変異３Ｃ．３５．２３．４及びノブ変異を含むＦｃポリペプチドである。第２の鎖は、抗Ｔａｕ Ｆａｂ由来のＦｄ領域にＮ末端で融合され、リンカーに続いて抗ＢＡＣＥ１ Ｆａｂ由来の別の可変ドメイン（ＶＨまたはＶＬ）にＣ末端で融合された、ホール変異を含むＦｃポリペプチドである。第３の鎖は、抗Ｔａｕ Ｆａｂに対応する軽鎖である。全ての重鎖は、標準的なＦｃ配列からＣ末端リジンが除去されており、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）変異を組み込むことによって、エフェクター機能のないＦｃとして作製した。
３つの鎖のそれぞれに対応する遺伝子を発現ベクターにクローニングし、ベクターをＥｘｐｉＣＨＯ細胞にコトランスフェクトして一過性発現させ、次いで、プロテインＡクロマトグラフィーによって精製した。以下の表１１に示されるように、Ｂｉａｃｏｒｅを使用して、ＢＡＣＥ１、Ｔａｕ、及びＴｆＲに結合する能力について、組換えポリペプチドを試験した。
（表１１）ｍＡｂ／Ｆｖ構造を有する二重特異性タンパク質の結合カイネティクスの概要
Figure 0007397063000019
実施例６．ＴｆＲ結合ペプチドへのＣ末端ｓｃＦｖ融合
第１の抗原に対するＦａｂとＮ末端で融合され、第２の抗原に対するｓｃＦｖ（複数可）とＣ末端で融合されたＴｆＲ結合ペプチド（重鎖ホールにのみ（図３Ａ）、またはノブ及びホール鎖の両方（図３Ｂ）のいずれか）を含むポリペプチドを、実施例１及び２に記載されるのと同様に生成した。ノブ変異に加えて、標的１に対するＮ末端Ｆｄを含み、標的２に対するＣ末端ｓｃＦｖを含んでも含まなくてもよいＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド、ホール変異に加えて、標的１に対するＮ末端Ｆｄ及び標的２に対するＣ末端ｓｃＦｖを含むＦｃポリペプチド、ならびに標的１に対する軽鎖の各コンストラクトについて３つの発現プラスミドを生成した。使用した可変ドメインは、抗ＢＡＣＥ１抗体及び抗Ｔａｕ抗体に由来するものであり、標的１であるＢＡＣＥ１及び標的２であるＴａｕまたはその逆の配置を生成した。
実施例７．二重特異性タンパク質の生成
図１、図２、図３Ａ、または図３Ｂに示されるような２つの異なる抗原（Ｔａｕ及びＢＡＣＥ１）を標的とする二重特異性タンパク質の構造を有する操作されたタンパク質を生成した。コンストラクトの構造及び配列の詳細を以下の表１２～１４に示す。全てのコンストラクトは、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）変異をＦｃポリペプチドに組み込むことによって、エフェクター機能のないものとして作製した。表１３のコンストラクトについて、全てのコンストラクトは、リンカーの直前のＣ末端リジンが重鎖１及び重鎖２の両方から除去された。表１４のコンストラクトについて、リンカーの直前のＣ末端リジン（「Ｌｙｓ４４７」）が重鎖２から除去されたもの（Ｃ末端ｓｃＦｖを１つ有するタンパク質の場合）、または重鎖１及び重鎖２の両方から除去されたもの（Ｃ末端ｓｃＦｖを２つ有するタンパク質の場合）であるいくつかのコンストラクトが生成された。表１３及び１４のコンストラクトについて、いくつかのコンストラクトは、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ（ＬＳ）変異をＦｃポリペプチドに組み込んで生成した。
（表１２）Ｆａｂ－Ｆｃ／ｓｃＦｖ－Ｆｃ構造を有する二重特異性タンパク質の配列
Figure 0007397063000020
（表１３）Ｃ末端にＦｖ構造を有する二重特異性タンパク質の配列
Figure 0007397063000021
Figure 0007397063000022
Figure 0007397063000023
（表１４）Ｃ末端にｓｃＦｖ構造を有する二重特異性タンパク質の配列
Figure 0007397063000024
Figure 0007397063000025
Figure 0007397063000026
Figure 0007397063000027
Figure 0007397063000028
実施例８．二重特異性タンパク質のＢｉａｃｏｒｅ評価
ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含むＢＡＣＥ１／Ｔａｕ二重特異性タンパク質のＢｉａｃｏｒｅ評価
ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含むＢＡＣＥ１／Ｔａｕ二重特異性タンパク質とその抗原との親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）８Ｋ機器を使用する表面プラズモン共鳴によって決定した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ、＃２９１４９６０４）上に、Ｈｕｍａｎ Ｆａｂ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ（ＧＥ、＃２８－９５８３－２５）を使用して、二重特異性タンパク質を捕捉させた。各抗原の３倍連続希釈液（ＢＡＣＥ１：３００、１００、３３．３、１１．１、０ｎＭ；Ｔａｕ：３０、１０、３．３、１．１、０．４ｎＭ）を３０μＬ／分の流速で注入した。捕捉されたＴｆＲ結合部位を含むＦｃポリペプチドへの抗原の結合を３００秒間モニタリングし、次いで、それらの解離をＨＢＳ－ＥＰ＋ランニング緩衝液中で６００秒以上モニタリングした。ブランクフローセルからのＲＵを差し引くことで結合応答を補正した。カイネティクス解析には、ｋｏｎ及びｋｏｆｆを同時にフィッティングさせる１：１Ｌａｎｇｕｉｒモデルを使用した。表１２～１４に開示される二重特異性タンパク質の結合データを以下の表１５～１７に示す。ＴｆＲ結合部位（クローン３５．２３．４）、ノブ・イントゥ・ホール、及びＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ置換を有する抗ＢＡＣＥ１／ＲＳＶ二重特異性タンパク質（「Ｃ１」）を対照として使用した。
ＴｆＲ結合のＢｉａｃｏｒｅ評価
組換えＴｆＲアピカルドメインに対する二重特異性タンパク質の親和性を、１Ｘ ＨＢＳ－ＥＰ＋ランニング緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ１００６６９）中、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）８Ｋ機器を使用する表面プラズモン共鳴によって決定した。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５センサーチップに抗ヒトＦａｂ（ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのヒトＦａｂ捕捉キット、２８９５８３２５）を固定化した。ＦａｂとＴｆＲ結合部位を含むＦｃポリペプチドとを含む融合タンパク質を各フローセル上に３０秒間捕捉させ、シングルサイクルカイネティクス方法を使用して、ヒトアピカルドメインの３倍連続希釈液（２、０．６６、０．２２、０．０７３、０．２４、及び０ｕＭ）を３０μＬ／分の流速で注入した。各試料を８０秒の会合及び３分の解離で解析した。各サイクル後、チップの再生を１０ｍＭ グリシン－ＨＣｌ（ｐＨ２．１）を使用して５０ｕｌ／分で３０秒間行った。参照フローセルからのＲＵを差し引くことで結合応答を補正した。定常状態の親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）８Ｋ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して、平衡状態での応答を濃度に対してフィッティングすることによって得た。組換えＴｆＲ外部ドメイン（ＥＣＤ）に対する二重特異性タンパク質の親和性を決定するために、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５センサーチップにストレプトアビジンを固定化した。０．５ｕｇ／ｍｌのビオチン化したヒトＴｆＲ ＥＣＤを各フローセル上に１０ｕｌ／分で４５秒間捕捉させ、ＨＢＳで緩衝液交換した二重特異性タンパク質の３倍連続希釈液を３０ｕｌ／分の流速で注入した。上記のシングルサイクルカイネティクスを使用して、各試料を解析した。表１２～１４に開示される二重特異性タンパク質の結合データを以下の表１５～１７に示す。Ｃ１を対照として使用した。
（表１５）Ｆａｂ－Ｆｃ／ｓｃＦｖ－Ｆｃ構造を有する二重特異性タンパク質のＢｉａｃｏｒｅ結合データ
Figure 0007397063000029
ＮＤ＝決定されず
（表１６）Ｃ末端にＦｃ構造を有する二重特異性タンパク質のＢｉａｃｏｒｅ結合データ
Figure 0007397063000030
ＮＤ＝決定されず
（表１７）Ｃ末端にｓｃＦｖ構造を有する二重特異性タンパク質のＢｉａｃｏｒｅ結合データ
Figure 0007397063000031
ＮＤ＝決定されず
実施例９．ＣＨＯ：ｈｕＡＰＰ細胞を使用したＢＡＣＥ１阻害の定量化
培養条件
ＣＨＯ：ｈｕＡＰＰＫＩ細胞はＧｅｎｓｃｒｉｐｔで生産され、これを１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ Ｆ８３１７）、１Ｘペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ １５１４０１２２）、及び１ｘ Ｇｅｎｅｃｔｉｎ（Ｇｉｂｃｏ １０１３１０２７）を含む５０％ＤＭＥＭ／５０％Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ、１１３２０）（本明細書において「ＣＨＯ培地」（「ＣＭ」）と呼ぶ）に維持した。
細胞培養処理
ＣＨＯ：ｈｕＡＰＰ細胞（継代番号４－１８）を様々な分子（全てヒトＩｇＧ骨格のキメラ分子）で処理した。分子をまずＣＭで希釈して１μＭまたは２μＭの開始濃度にし、次いで、１：２または１：４のいずれかに希釈して、各分子の用量反応を測定するための希釈系列を作製した。ＣＨＯ：ｈｕＡＰＰ細胞の培地を、実験分子または対照分子を含有する培地に完全に置き換えた。次いで、ＣＨＯ：ｈｕＡＰＰ細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２４時間保持した。２４時間後、ＨＴＦＲアッセイによるＡβ測定のために培地を回収した。
ＨＴＦＲによるＡβ定量化
ＣＨＯ：ｈｕＡＰＰ細胞と実験分子または対照分子の２４時間のインキュベーション後、１００μＬの培地を回収した。分子のインキュベーションはデュプリケートで実施し、Ａβ１－４０測定は技術的デュプリケートで行った。ヒトＡβ１－４０の測定は、Ｃｉｓｂｉｏ Ａβ１－４０キット（Ｃｉｓｂｉｏ＃６２Ｂ４０ＰＥＧ）に従って実施した。簡潔に述べれば、キットには、ＦＲＥＴのドナー及び受容体のペアとして機能する２つの抗Ａβ１－４０抗体が提供されており、一方の抗体は、Ｅｕ３＋－Ｃｒｙｐｔａｔｅ（ＦＲＥＴドナー）で標識され、もう一方は、ＸＬ－６６５（ＦＲＥＴ受容体）で標識されていた。両方の抗体を、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＯｐｔｉＰｌａｔｅ ３８４中、ＣＨＯ：ｈｕＡＰＰ培養物から回収した５μＬの培地とともに４℃で２４時間インキュベートした。次いで、プレートを読み取り、６６５ｎｍ／６２０ｎｍの比からＡβ１－４０濃度を算出した。
表１２～１４に開示されている二重特異性タンパク質の細胞ＢＡＣＥ１阻害データを以下の表１８～２０に示す。ＴｆＲ結合部位を有する抗ＢＡＣＥ１抗体（クローン３５．２３．４）（「Ｃ２」）、ＴｆＲ結合部位及びＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ置換を有する抗ＢＡＣＥ１／ＲＳＶ二重特異性タンパク質（クローン３５．２３．４）（「Ｃ３」）、及びＴｆＲ結合部位または他のＦｃ改変を欠いている非親和性成熟抗ＢＡＣＥ１（「Ｃ４」）を対照として使用した。
（表１８）Ｆａｂ－Ｆｃ／ｓｃＦｖ－Ｆｃ構造を有する二重特異性タンパク質の細胞ＢＡＣＥ１阻害
Figure 0007397063000032
（表１９）Ｃ末端Ｆｃ構造を有する二重特異性タンパク質の細胞ＢＡＣＥ１阻害
Figure 0007397063000033
ＮＡ＝該当なし
（表２０）Ｃ末端ｓｃＦｖ構造を有する二重特異性タンパク質の細胞ＢＡＣＥ１阻害
Figure 0007397063000034
実施例１０．ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを有するＢＡＣＥ－Ｔａｕ二重特異性タンパク質の薬物動態特性
本実施例は、マウスモデルを使用した、ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを有するＢＡＣＥ１－Ｔａｕ二重特異性タンパク質の薬物動態特性の特徴付けについて記載する。
野生型マウスのＰＫ評価
ｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態学（ＰＫ）評価のために、６～８週齢の雌の野生型Ｃ５７Ｂｌ６マウスに、Ｆａｂ－Ｆｃ／ｓｃＦｖ－Ｆｃ構造を有するＢＡＣＥ１－Ｔａｕ二重特異性タンパク質（表１２に記載されているコンストラクト１０）、Ｃ末端Ｆｖ構造を有するＢＡＣＥ１－Ｔａｕ二重特異性タンパク質（表１３に記載されているコンストラクト２０及び２４）、Ｃ末端ｓｃＦｖ構造と一方のＦｃポリペプチドに融合されたｓｃＦｖを有するＢＡＣＥ１－Ｔａｕ二重特異性タンパク質（表１４に記載されているコンストラクト４１、４５、及び４６）、Ｃ末端構造と各Ｆｃポリペプチドに融合されたｓｃＦｖを有するＢＡＣＥ１－Ｔａｕ二重特異性タンパク質（表１４に記載されているコンストラクト６２）、抗ＢＡＣＥ１対照抗体（Ａｂ１５３）、抗ＲＳＶ陰性対照抗体（Ａｂ１２２）、またはＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含む抗Ｔａｕ抗体（ＡＴＶ：Ｔａｕ）を１０ｍｇ／ｋｇで静脈内投与した。図４Ａまたは図５Ａに示される時点で、生体内血漿を顎下腺から採血した。血液は、ＥＤＴＡ血漿チューブに採取し、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心し、次いで、その後の解析のために血漿を分離した。
図４Ａ及び４Ｂは、ＢＡＣＥ１－Ｔａｕ Ｃ末端Ｆｖコンストラクト２０、ＢＡＣＥ１－Ｔａｕ Ｃ末端ｓｃＦｖコンストラクト４１及び４５、ならびに抗ＢＡＣＥ１対照抗体（Ａｂ１５３）の野生型マウスＰＫ評価からのデータを示す。図４Ｂに示されるように、ＢＡＣＥ１－Ｔａｕ二重特異性タンパク質のそれぞれは、対照抗ＢＡＣＥ１抗体よりも速いクリアランスを有した。
図５Ａ及び５Ｂは、ＢＡＣＥ１－Ｔａｕ Ｆａｂ－Ｆｃ／ｓｃＦｖ－Ｆｃコンストラクト１０、ＢＡＣＥ１－Ｔａｕ Ｃ末端Ｆｖコンストラクト２４、ＢＡＣＥ１－Ｔａｕ Ｃ末端ｓｃＦｖコンストラクト４６、ＢＡＣＥ１－Ｔａｕ Ｃ末端ｓｃＦｖコンストラクト６２、抗ＲＳＶ陰性対照抗体（Ａｂ１２２）、及びＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含む抗Ｔａｕ抗体（ＡＴＶ：Ｔａｕ）の野生型マウスＰＫ評価からのデータを示す。図５Ｂに示されるように、ＢＡＣＥ１－Ｔａｕ二重特異性タンパク質のそれぞれは、抗ＲＳＶ陰性対照抗体（Ａｂ１２２）の１．５～２倍以内及びＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含む対照抗Ｔａｕ抗体の１．５倍以内である許容可能なクリアランス値を有した。
ｈＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスのＰＫ評価
ヒトＴｆＲノックイン（ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩ）マウスもｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態学（ＰＫ）評価に使用した。そのようなモデルは、例えば、最大脳内濃度（Ｃｍａｘ）及び／または脳曝露を測定及び／または比較するために、例えば、Ｃｍａｘが増加したか及び／または脳曝露が延長したかを判断するために、使用することができる。ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用してマウスＴｆｒｃ遺伝子内のヒトＴｆｒｃアピカルドメインを発現するように作製された。得られるキメラＴｆＲは、内因性プロモーターの制御下でｉｎ ｖｉｖｏで発現させた。国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１８３０２号（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されているように、Ｃ５７Ｂｌ６マウスを使用し、単細胞胚への前核マイクロインジェクション、続いて、偽妊娠雌への胚移植を介して、ヒトアピカルＴｆＲノックインマウス系統を作製した。具体的には、Ｃａｓ９、シングルガイドＲＮＡ及びドナーＤＮＡを胚に導入した。ドナーＤＮＡは、マウスでの発現にコドン最適化されているヒトアピカルドメインコード配列を含んだ。アピカルドメインコード配列は、左右の相同アームに隣接した。ドナー配列は、アピカルドメインが４番目のマウスエクソンの後に挿入され、３’末端で９番目のマウスエクソンにすぐに隣接するように設計された。胚を受けた雌の子孫からのファウンダー雄を野生型雌と交配させて、Ｆ１ヘテロ接合性マウスを作製した。その後、Ｆ１世代ヘテロ接合性マウスの繁殖からホモ接合性マウスを作製した。
ＰＫ解析のために、６～８週齢の雌のｈＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスに、Ｃ末端Ｆｖ構造を有するＢＡＣＥ１－Ｔａｕ二重特異性タンパク質（表１３に記載されているコンストラクト２４）、Ｃ末端ｓｃＦｖ構造と一方のＦｃポリペプチドに融合されたｓｃＦｖを有するＢＡＣＥ１－Ｔａｕ二重特異性タンパク質（表１４に記載されているコンストラクト４６）、Ｃ末端ｓｃＦｖ構造と各Ｆｃポリペプチドに融合されたｓｃＦｖを有するＢＡＣＥ１－Ｔａｕ二重特異性タンパク質（表１４に記載されているコンストラクト６２）、抗ＲＳＶ陰性対照抗体（Ａｂ１２２）、抗Ｔａｕ１Ｃ７抗体（抗Ｔａｕ）、またはＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含む抗Ｔａｕ抗体（ＡＴＶ：Ｔａｕ）を１０ｍｇ／ｋｇで静脈内投与した。図６Ａに示される時点で、生体内血漿を顎下腺から採血した。血液は、ＥＤＴＡ血漿チューブに採取し、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心し、次いで、その後の解析のために血漿を分離した。
図６Ａ及び６Ｂに示されるように、ｈＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスモデルで試験したＢＡＣＥ１－Ｔａｕ二重特異性タンパク質のそれぞれは、ＴｆＲ結合及び標的を介したクリアランスに起因して、抗ＲＳＶ陰性対照抗体（Ａｂ１２２）または抗Ｔａｕ１Ｃ７抗体よりも速いクリアランスを示し、ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含む対照抗Ｔａｕ抗体の２倍以内の許容可能なクリアランス値を有した。
ＰＳ１９／ｈＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスのＰＫ評価
追加のコンストラクトの薬物動態特性もまたＰＳ１９／ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスでｉｎ ｖｉｖｏ評価した。ＰＳ１９マウスとＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスを交配させて、ＰＳ１９ ＨＥＭＩ（ヘミ接合性）ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＨＯＭ（ホモ接合性）マウスのコロニーを作製することによって、マウスＴｆｒｃ遺伝子内のヒトＴｆｒｃアピカルドメイン、及び配列番号３９８の配列を基準としてアミノ酸置換Ｐ２７２Ｓを含む変異体ヒトＴａｕタンパク質をコードする変異体Ｔａｕ遺伝子を発現する、ＰＳ１９／ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスを作製した。雄のＰＳ１９ ＨＥＭＩ ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩ ＨＯＭマウスを雌のＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＨＯＭマウスと交配させてコロニーを維持する。
ＰＳ１９／ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスに尾静脈を介して５０ｍｇ／ｋｇを１回全身投与した。ＰＢＳで灌流する前に、心臓穿刺により血液をＥＤＴＡ血漿チューブに採取し、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心した。次いで、その後のＰＫ／ＰＤ解析のために血漿を分離した。灌流後に脳を摘出し、半脳を分離し、組織重量の１０倍量の１％ＮＰ－４０ ＰＢＳ（ＰＫの場合）または５Ｍ ＧｕＨＣｌ（ＰＤの場合）中でホモジナイズした。
マウス血漿及び脳溶解物中の総抗体濃度は、一般的なヒトＩｇサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して定量した。３８４ウェルのＭａｘｉＳｏｒｐプレートを、１μｇ／ｍＬの抗ｈｕＦｃロバポリクローナル（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）で一晩コーティングした。希釈した血漿またはＮＰ－４０脳溶解物とインキュベーションした後、ＨＲＰに結合した抗ｈｕＦｃロバ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を検出試薬として加えた。３倍希釈を使用した２ｎＭから２．７ｐＭまでの各個々の分子の標準曲線を、５パラメーターロジスティック回帰を使用して当てはめた。コンストラクト２８、４６、６２、及び７５～７７の薬物動態特性を図７Ａ～７Ｉに示す。
ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡ、ＢＡＣＥ１抗原捕捉ＥＬＩＳＡ、及びＴａｕ抗原捕捉ＥＬＩＳＡ
マウス血漿中の抗体濃度は、抗ｈｕＦｃ、ＢＡＣＥ１抗原捕捉、及びＴａｕ抗原捕捉の３つのサンドイッチＥＬＩＳＡフォーマットを使用して定量した。３８４ウェルのＭａｘｉＳｏｒｐプレートを、１μｇ／ｍＬの抗ｈｕＦｃロバポリクローナル（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）、２μｇ／ｍＬのｈｕＢＡＣＥ１（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）、または１μｇ／ｍＬの組換えｈｕＴａｕのいずれかで一晩コーティングした。完全長（４４１アミノ酸）組換えｔａｕ（ｒ－ｔａｕ）は、ＣＥＰＴＥＲ Ｂｉｏｐａｒｔｎｅｒｓによって、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞で産生された。ｒ－ｔａｕは、元々Ｈｉｓ６－Ｓｍｔ３タグ（配列番号５７５として開示される「Ｈｉｓ６」）付きで産生されるが、これは精製中に切断され除去された。
希釈した血漿とインキュベーションした後、全てのＥＬＩＳＡフォーマットで、ＨＲＰに結合した抗ｈｕＦｃロバ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を検出試薬として使用した。４倍希釈を使用した４ｎＭから０．９７ｐＭまでの各個々の分子の標準曲線を、５パラメーターロジスティック回帰を用いて当てはめた。相関グラフはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで作成し、このソフトウェアを使用して線形回帰を用いてデータを当てはめ、ピアソン相関係数とともに傾きを算出した。図４Ａ及び４Ｂに示されるように、ＢＡＣＥ１（図４Ｃ及び４Ｄ）及びＴａｕ（図４Ｅ及び４Ｆ）抗原捕捉の両方とＦｃ検出との間には強い相関があることから、これらの分子が薬物動態の時間全体にわたって、ほぼインタクトであることが示された。
実施例１１．熱安定性
動的光散乱法（ＤＬＳ）の測定値は、ＤｙｎａＰｒｏ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ＩＩＩ（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって収集した。試料を１．０ｍｇ／ｍＬでｐＨ７．４のＰＢＳ中で調製し、温度を０．２５℃／分の速度で連続的に４０℃から８０℃まで上昇させた。各測定値を取得時間１秒で１０回のＤＬＳ取得で収集した。レーザー出力は、２０％に設定した。以下の表２１に示されるように、Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｖ７．８．２．１８を使用してデータを解析して、Ｔｏｎｓｅｔ及びＴａｇｇの値を決定した。
（表２１）熱安定性
Figure 0007397063000035
実施例１２．ＣＨＯ－ｈｕＡＰＰ細胞の抗体処理及びＥＬＩＳＡによるＡβ４０定量化
１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を１００μＬ／ウェルで含む組織培養処理済み９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉ Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ Ｓｕｒｆａｃｅ）に、ＣＨＯＫ１－ｈｕＡＰＰ細胞（１５，０００／ウェル）を播種した。播種後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で一晩回復させた。処理のために、まず、抗体を培地でそれぞれ１０００～０．０６ｎＭ（４倍希釈）及び１μＭに連続希釈した。培地を１００μＬの希釈処理液に置き換え、ウェルは、各条件につきデュプリケートとした。次いで、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２４時間保持した。２４時間の処理の後、Ａβ４０測定のために培地を回収した。ヒトＡβ１－４０（ヒトニューロン培養物由来）の測定は、Ｃｉｓｂｉｏ Ａβ１－４０ＥＬＩＳＡキット（Ｃｉｓｂｉｏ ＃６２Ｂ４０ＰＥＧ）に従って実施した。キットには、ＦＲＥＴのドナー及び受容体のペアとして機能する２つの抗Ａβ１－４０抗体が提供されており、一方の抗体は、Ｅｕ３＋－Ｃｒｙｐｔａｔｅ（ＦＲＥＴドナー）で標識され、もう一方は、ＸＬ－６６５（ＦＲＥＴ受容体）で標識されていた。両方の抗体を、ヒトニューロン培養物から回収し、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＯｐｔｉＰｌａｔｅ ３８４中に入れた５μＬの培地とともに４℃で２４時間インキュベートした。次いで、プレートを読み取り、Ａβ１－４０濃度を６６５ｎｍ／６２０ｎｍの比から算出した。
図８Ａ及び８Ｂに示されるように、クローン３５．２３．４：１Ｃ７－１Ｃ７に融合させた２Ｈ８の全てのバージョンは、未処理の対照と比較して、用量依存的にヒトＡβを減少させた。対照ＩｇＧ（Ａｂ１２２）は、Ａβ減少に影響を与えなかった。折れ線グラフは、平均±ＳＥＭを表し、ｎ＝２の独立した実験である。
実施例１３．ＰＳ１９／ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスにおけるＡβ４０の定量化
ＰＳ１９／ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスに尾静脈を介して５０ｍｇ／ｋｇを１回全身投与した。灌流後に脳を摘出し、半脳を分離し、組織重量の１０倍量の１％ＮＰ－４０ ＰＢＳ（ＰＫの場合）または５Ｍ ＧｕＨＣｌ（ＰＤの場合）中でホモジナイズした。
脳溶解物及びＣＳＦ中のマウスＡβ４０レベルを、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して測定した。３８４ウェルのＭａｘｉＳｏｒｐプレートを、Ａβ４０ペプチドのＣ末端に対して特異的なポリクローナル捕捉抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃ＡＢＮ２４０）で一晩コーティングした。カゼインで希釈したグアニジン脳溶解物をＥＬＩＳＡプレート上で更に１：２に希釈し、検出抗体であるビオチン化Ｍ３．２を同時に加えた。ＣＳＦを１：２０希釈で解析した。試料を４℃で一晩インキュベートした後、ストレプトアビジン－ＨＲＰ、続いてＴＭＢ基質を加えた。標準曲線（０．７８～５０ｐｇ／ｍＬ ｍｓＡβ４０）を、４パラメーターロジスティック回帰を使用して当てはめた。図９Ａ～９Ｅは、コンストラクト２８、４６、６２、７５、７６、または７７を静脈内注射した後のＰＳ１９／ｈＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスにおける脳及びＣＳＦ Ａβ４０の定量化を示す。コンストラクトは、未処理の対照と比較してヒトＡβを減少させた。対照ＩｇＧ（Ａｂ１２２）は、Ａβ減少に影響を与えなかった。
表（例えば、表９）に記載されている各クローンのアミノ酸置換は、不一致がある場合、配列表に記載される配列セットにみられるアミノ酸に対するそのクローンのレジスター位置のアミノ酸置換を示している。
本明細書に記載される実施例及び実施形態は、例示のみを目的にするものであり、それらを考慮した様々な変形または変更が当業者に想起され、本出願の趣旨及び範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれることを理解されたい。本明細書で引用されるアクセッション番号の配列は、参照により本明細書に援用される。
（表２２）略式的な配列表
Figure 0007397063000036
Figure 0007397063000037
Figure 0007397063000038
Figure 0007397063000039
Figure 0007397063000040
Figure 0007397063000041
Figure 0007397063000042
Figure 0007397063000043
Figure 0007397063000044
Figure 0007397063000045
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Figure 0007397063000047
Figure 0007397063000048
Figure 0007397063000049
Figure 0007397063000050
Figure 0007397063000051
Figure 0007397063000052
Figure 0007397063000053
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Figure 0007397063000056
Figure 0007397063000057
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Claims (28)

  1. （ａ）第１の抗原に特異的に結合するＦａｂのＦｄ部分にＮ末端で融合された第１のＦｃポリペプチドと、
    （ｂ）第２の抗原に特異的に結合する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）にＮ末端で融合された第２のＦｃポリペプチドであって、前記第１及び前記第２のＦｃポリペプチドは、Ｆｃ二量体を形成する、前記第２のＦｃポリペプチドと、
    （ｃ）前記Ｆｄ部分と対合して、前記第１の抗原に特異的に結合するＦａｂを形成する、軽鎖ポリペプチドと
    を含み、
    前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドは、トランスフェリン受容体に特異的に結合し、かつ
    前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドは、配列番号４～２９、１０１～１６４、及び２３９～２５２のいずれか１つのアミノ酸１１１～２１７に対して少なくとも９０％の同一性を有するＣＨ３ドメインを有する、
    タンパク質。
  2. （ａ）前記第１の抗原及び前記第２の抗原が、同じ抗原である、または
    （ｂ）前記第１の抗原及び前記第２の抗原が、異なる抗原である、
    請求項１に記載のタンパク質。
  3. 前記第２のＦｃポリペプチドが、第１のリンカーを介して前記ｓｃＦｖに融合される、
    請求項１または２に記載のタンパク質。
  4. （ａ）前記ｓｃＦｖが、第２のリンカーを介して接続されるＶＬ領域及びＶＨ領域を含み、前記ｓｃＦｖの配置が、ＶＬ領域－第２のリンカー－ＶＨ領域である、または
    （ｂ）前記ｓｃＦｖが、第２のリンカーを介して接続されるＶＬ領域及びＶＨ領域を含み、前記ｓｃＦｖの配置が、ＶＨ領域－第２のリンカー－ＶＬ領域である、
    請求項１～３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  5. （ａ）前記ｓｃＦｖが、鎖間ジスルフィド架橋を含む、かつ／または
    （ｂ）前記ｓｃＦｖが、Ｋａｂａｔ可変ドメイン付番に従う位置ＶＨ４４及びＶＬ１００のそれぞれにシステインを含み、前記ｓｃＦｖが、位置ＶＨ４４及びＶＬ１００の前記システイン間のジスルフィド結合を含む、
    請求項１～４のいずれか１項に記載のタンパク質。
  6. （ａ）第１の抗原に特異的に結合するＦａｂのＦｄ部分にＮ末端で融合され、第２の抗原に特異的に結合するＦａｂの重鎖可変領域または軽鎖可変領域にＣ末端で融合された、第１のＦｃポリペプチドと、
    （ｂ）第１の抗原に特異的に結合するＦａｂのＦｄ部分にＮ末端で融合され、（ａ）に詳述される前記重鎖可変領域または前記軽鎖可変領域の他方にＣ末端で融合された、第２のＦｃポリペプチドであって、
    前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域は、第２の抗原に特異的に結合するＦｖフラグメントを一緒に形成し、前記第１及び前記第２のＦｃポリペプチドは、Ｆｃ二量体を形成する、前記第２のＦｃポリペプチドと、
    （ｃ）（ａ）及び（ｂ）に詳述される前記Ｆｄ部分のそれぞれと対合して、前記第１の抗原に特異的に結合するＦａｂを形成する、軽鎖ポリペプチドと
    を含み、
    前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドは、トランスフェリン受容体に特異的に結合し、かつ
    前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドは、配列番号４～２９、１０１～１６４、及び２３９～２５２のいずれか１つのアミノ酸１１１～２１７に対して少なくとも９０％の同一性を有するＣＨ３ドメインを有する、
    タンパク質。
  7. （ａ）及び（ｂ）に記載される前記Ｆｄ部分が、同一の配列を含む、請求項６に記載のタンパク質。
  8. （ａ）前記第１の抗原及び前記第２の抗原が、同じ抗原である、または
    （ｂ）前記第１の抗原及び前記第２の抗原が、異なる抗原である、
    請求項６または７に記載のタンパク質。
  9. （ａ）前記第１のＦｃポリペプチドが、前記Ｆｖフラグメントの前記重鎖可変領域に融合され、前記第２のＦｃポリペプチドが、前記Ｆｖフラグメントの前記軽鎖可変領域に融合される、または
    （ｂ）前記第１のＦｃポリペプチドが、前記Ｆｖフラグメントの前記軽鎖可変領域に融合され、前記第２のＦｃポリペプチドが、前記Ｆｖフラグメントの前記重鎖可変領域に融合される、かつ／または
    （ｃ）前記第１のＦｃポリペプチド及び／もしくは前記第２のＦｃポリペプチドが、第１のリンカーを介して、前記重鎖可変領域もしくは前記軽鎖可変領域にＣ末端で融合される、
    請求項６～８のいずれか１項に記載のタンパク質。
  10. （ａ）第１の抗原に特異的に結合するＦａｂのＦｄ部分にＮ末端で融合された第１のＦｃポリペプチドと、
    （ｂ）第１の抗原に特異的に結合するＦａｂのＦｄ部分にＮ末端で融合された第２のＦｃポリペプチドであって、前記第１及び前記第２のＦｃポリペプチドは、Ｆｃ二量体を形成する、前記第２のＦｃポリペプチドと、
    （ｃ）（ａ）及び（ｂ）に詳述される前記Ｆｄ部分のそれぞれと対合して、前記第１の抗原に特異的に結合するＦａｂを形成する、軽鎖ポリペプチドと
    を含み、
    前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドは、第２の抗原に特異的に結合するｓｃＦｖにＣ末端で融合され、
    前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドは、トランスフェリン受容体に特異的に結合し、かつ
    前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドは、配列番号４～２９、１０１～１６４、及び２３９～２５２のいずれか１つのアミノ酸１１１～２１７に対して少なくとも９０％の同一性を有するＣＨ３ドメインを有する、
    タンパク質。
  11. （ａ）及び（ｂ）に記載される前記Ｆｄ部分が、同一の配列を含む、請求項１０に記載のタンパク質。
  12. （ａ）前記第１の抗原及び前記第２の抗原が、同じ抗原である、または
    （ｂ）前記第１の抗原及び前記第２の抗原が、異なる抗原である、
    請求項１０または１１に記載のタンパク質。
  13. （ａ）前記第１のＦｃポリペプチドが、前記第２の抗原に特異的に結合するｓｃＦｖにＣ末端で融合される、または
    （ｂ）前記第２のＦｃポリペプチドが、前記第２の抗原に特異的に結合するｓｃＦｖにＣ末端で融合される、または
    （ｃ）前記第１のＦｃポリペプチド及び前記第２のＦｃポリペプチドのそれぞれが、前記第２の抗原に特異的に結合するｓｃＦｖにＣ末端で融合される、
    請求項１０～１２のいずれか１項に記載のタンパク質。
  14. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、第１のリンカーを介して、ｓｃＦｖに融合される、
    請求項１０～１３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  15. （ａ）前記ｓｃＦｖが、第２のリンカーを介して接続されるＶＬ領域及びＶＨ領域を含み、前記ｓｃＦｖの配置が、ＶＬ領域－第２のリンカー－ＶＨ領域である、または
    （ｂ）前記ｓｃＦｖが、第２のリンカーを介して接続されるＶＬ領域及びＶＨ領域を含み、前記ｓｃＦｖの配置が、ＶＨ領域－第２のリンカー－ＶＬ領域である、
    請求項１０～１４のいずれか１項に記載のタンパク質。
  16. （ａ）前記ｓｃＦｖが、鎖間ジスルフィド架橋を含む、かつ／または
    （ｂ）前記ｓｃＦｖが、Ｋａｂａｔ可変ドメイン付番に従う位置ＶＨ４４及びＶＬ１００のそれぞれにシステインを含み、前記ｓｃＦｖが、位置ＶＨ４４及びＶＬ１００の前記システイン間のジスルフィド結合を含む、
    請求項１０～１５のいずれか１項に記載のタンパク質。
  17. （ａ）前記第１のＦｃポリペプチドが、トランスフェリン受容体に特異的に結合する、または
    （ｂ）前記第２のＦｃポリペプチドが、トランスフェリン受容体に特異的に結合する、または
    （ｃ）前記第１のＦｃポリペプチド及び前記第２のＦｃポリペプチドの両方が、トランスフェリン受容体に特異的に結合する、
    請求項１～１６のいずれか１項に記載のタンパク質。
  18. （ａ）前記第１のＦｃポリペプチド及び／もしくは前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号４～２９、１０１～１６４、及び２３９～２５２のいずれか１つのアミノ酸１１１～２１７に対して少なくとも９５％の同一性を有するＣＨ３ドメインを有する、または
    （ｂ）前記第１のＦｃポリペプチド及び／もしくは前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号４～２９、１０１～１６４、及び２３９～２５２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、
    請求項１～１７のいずれか１項に記載のタンパク質。
  19. （ａ）前記第１のＦｃポリペプチド及び／もしくは前記第２のＦｃポリペプチドが、トランスフェリン受容体のアピカルドメインに結合する、かつ／または
    （ｂ）前記タンパク質の前記トランスフェリン受容体への前記結合が、トランスフェリンの前記トランスフェリン受容体への結合を実質的に阻害しない、
    請求項１７または１８に記載のタンパク質。
  20. （ａ）前記第１のＦｃポリペプチド及び前記第２のＦｃポリペプチドが、ヘテロ二量体化を促進する１つ以上の改変をそれぞれ含有する、かつ／または
    （ｂ）前記第１のＦｃポリペプチド及び／もしくは前記第２のＦｃポリペプチドが、エフェクター機能を低下させる１つ以上の改変を含む、かつ／または
    （ｃ）前記第１のＦｃポリペプチド及び／もしくは前記第２のＦｃポリペプチドが、血清中半減期を延長する、ネイティブＦｃ配列に対する改変を含む、かつ／または
    （ｄ）前記第１のＦｃポリペプチド及び前記第２のＦｃポリペプチドが、エフェクター機能を持たない、
    請求項１７～１９のいずれか１項に記載のタンパク質。
  21. 前記第１のＦｃポリペプチド及び前記第２のＦｃポリペプチドが、ヘテロ二量体化を促進する１つ以上の改変をそれぞれ含有し、かつ
    （ａ）ＥＵ付番に従って、前記第１のＦｃポリペプチドが、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換を有し、前記第２のＦｃポリペプチドが、Ｔ３６６Ｗ置換を有するか、または
    （ｂ）ＥＵ付番に従って、前記第１のＦｃポリペプチドが、Ｔ３６６Ｗ置換を有し、前記第２のＦｃポリペプチドが、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換を有する、
    請求項２０に記載のタンパク質。
  22. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、エフェクター機能を低下させる１つ以上の改変を含み、かつ
    （ａ）エフェクター機能を低下させる前記改変が、ＥＵ付番に従う位置２３４でのＡｌａ及び位置２３５でのＡｌａの置換であるか、または
    （ｂ）前記第１のＦｃポリペプチド及び前記第２のＦｃポリペプチドの両方が、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換を含む、
    請求項２０または２１に記載のタンパク質。
  23. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、血清中半減期を延長する、ネイティブＦｃ配列に対する改変を含み、かつ
    （ａ）血清中半減期を延長する、ネイティブＦｃ配列に対する前記改変が、ＥＵ付番に従う位置２５２でのＴｙｒ、位置２５４でのＴｈｒ、及び位置２５６でのＧｌｕの置換を含むか、または
    （ｂ）血清中半減期を延長する、ネイティブＦｃ配列に対する前記改変が、ＥＵ付番に従う位置４２８でのＬｅｕ及び位置４３４でのＳｅｒの置換を含むか、または、
    （ｃ）血清中半減期を延長する、ネイティブＦｃ配列に対する前記改変が、ＥＵ付番に従う位置４３４でのＳｅｒもしくはＡｌａの置換を含む、
    請求項２０～２２のいずれか１項に記載のタンパク質。
  24. （ａ）前記第１のＦｃポリペプチド及び／もしくは前記第２のＦｃポリペプチドが、ネイティブＦｃＲｎ結合部位を含む、または
    （ｂ）前記第１のＦｃポリペプチド及び／もしくは前記第２のＦｃポリペプチドが、ＦｃＲｎ結合を変化させる改変を含む、
    請求項１～２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  25. （ａ）前記第１のＦｃポリペプチド及び／もしくは前記第２のＦｃポリペプチドが、対応する野生型Ｆｃポリペプチドと比較して、少なくとも９０％、９２％、もしくは９５％のアミノ酸配列同一性を有する、かつ／または
    （ｂ）前記第１のＦｃポリペプチド及び／もしくは前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号１６５～２３８、２５３～３７０、及び３７７～３８８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、
    請求項１～２４のいずれか１項に記載のタンパク質。
  26. 請求項１～２５のいずれか１項に記載のタンパク質及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
  27. 請求項１～２５のいずれか１項に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドを含むベクターもしくは宿主細胞。
  28. 対象を治療するための、請求項１～２５のいずれか１項に記載のタンパク質を含む医薬組成物または請求項２６に記載の医薬組成物。
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