JP2020530293A - 操作されたトランスフェリン受容体結合ポリペプチド - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2017年8月10日出願の米国特許仮出願第62/543,658号、2017年11月8日出願の米国特許仮出願第62/583,314号、及び2018年2月15日出願の国際特許出願第PCT/US2018/018371号に基づく優先権を主張するものであり、当該出願の開示内容をあらゆる目的でそれらの全容にわたって本明細書に参照により援用するものである。
タンパク質を操作して通常は結合しない標的に結合させるための様々な方法が開発されている。例えば、ライブラリーを作製して所望の結合活性または酵素活性によって操作されたタンパク質についてスクリーニングすることができる。
本発明者らは、トランスフェリン受容体(TfR)に結合可能なCH3ドメインを含むポリペプチドを開発した。これらのポリペプチドは、新規なTfR結合部位を生成するCH3ドメイン内の置換により操作されている。TfRは血液脳関門(BBB)で高度に発現し、TfRはトランスフェリンを血液から脳内に自然に移動させる。これらのポリペプチドはTfRに結合することから、これらのポリペプチドもまた、BBBを通過して輸送され得て、これらのポリペプチドを更に利用して、結合させた治療剤(例えば、治療ポリペプチド、Fabのような抗体可変領域、及び小分子など)をBBBを通過して輸送することができる。このアプローチは、治療剤の脳への取り込みを大幅に改善することができるため、脳への送達が効果的である障害及び疾病を治療するうえで極めて有用である。
(a)本明細書に記載されるポリペプチドを含む第1のFcポリペプチドと、
(b)(a)の第1のFcポリペプチドと二量体化することが可能な第2のFcポリペプチドと
を含む、Fcポリペプチド二量体またはその二量体フラグメントに関する。
(a)第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:134の配列を含み、かつ第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:355の配列を含むか、または、
(b)第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:134の配列を含み、かつ第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:356の配列を含むか、または、
(c)第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:260の配列を含み、かつ第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:355の配列を含むか、または、
(d)第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:260の配列を含み、かつ第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:356の配列を含むか、または、
(e)第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:140の配列を含み、かつ第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:352の配列を含むか、または、
(f)第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:140の配列を含み、かつ第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:353の配列を含みか、または、
(g)第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:263の配列を含み、かつ第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:352の配列を含むか、または、
(h)第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:263の配列を含み、かつ第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:353の配列を含む。
(a)第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:146の配列を含み、かつ第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:355の配列を含むか、または、
(b)第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:146の配列を含み、かつ第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:356の配列を含むか、または、
(c)第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:267の配列を含み、かつ第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:355の配列を含むか、または、
(d)第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:267の配列を含み、かつ第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:356の配列を含むか、または、
(e)第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:152の配列を含み、かつ第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:352の配列を含むか、または、
(f)第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:152の配列を含み、かつ第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:353の配列を含むか、または、
(g)第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:270の配列を含み、かつ第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:352の配列を含むか、または、
(h)第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:270の配列を含み、かつ第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:353の配列を含む。
(a)第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:233の配列を含み、かつ第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:355の配列を含むか、または、
(b)第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:233の配列を含み、かつ第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:356の配列を含むか、または、
(c)第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:309の配列を含み、かつ第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:355の配列を含むか、または、
(d)第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:309の配列を含み、かつ第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:356の配列を含むか、または、
(e)第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:239の配列を含み、かつ第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:352の配列を含むか、または、
(f)第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:239の配列を含み、かつ第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:353の配列を含むか、または、
(g)第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:312の配列を含み、かつ第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:352の配列を含むか、または、
(h)第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:312の配列を含み、かつ第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:353の配列を含む。
(a)第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:170の配列を含み、かつ第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:355の配列を含むか、または、
(b)第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:170の配列を含み、かつ第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:356の配列を含むか、または、
(c)第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:281の配列を含み、かつ第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:355の配列を含むか、または、
(d)第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:281の配列を含み、かつ第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:356の配列を含むか、または、
(e)第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:176の配列を含み、かつ第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:352の配列を含むか、または、
(f)第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:176の配列を含み、かつ第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:353の配列を含むか、または、
(g)第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:284の配列を含み、かつ第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:352の配列を含むか、または、
(h)第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:284の配列を含み、かつ第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:353の配列を含む。
(a)第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:122の配列を含み、かつ第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:355の配列を含むか、または、
(b)第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:122の配列を含み、かつ第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:356の配列を含むか、または、
(c)第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:253の配列を含み、かつ第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:355の配列を含むか、または、
(d)第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:253の配列を含み、かつ第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:356の配列を含むか、または、
(e)第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:128の配列を含み、かつ第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:352の配列を含むか、または、
(f)第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:128の配列を含み、かつ第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:353の配列を含むか、または、
(g)第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:256の配列を含み、かつ第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:352の配列を含むか、または、
(h)第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:256の配列を含み、かつ第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:353の配列を含む。
(a)抗原に結合することが可能な抗体可変領域、またはその抗原結合フラグメントと、
(b)本明細書に記載されるFcポリペプチド二量体と
を含む、Fcポリペプチド二量体−Fab融合タンパク質に関する。
I.序論
本明細書では、トランスフェリン受容体(TfR)に結合するポリペプチドを開示する。本発明は、Fc領域内の特定のアミノ酸を改変することでFcポリペプチド内にTfRに特異的な新規な結合部位を生成することができるという発見に一部基づいたものである。TfRは血液脳関門(BBB)で高度に発現し、また、TfRはトランスフェリンを血液から脳に自然に移動させるという事実を利用して、これらのポリペプチドを用いてBBBを通過して治療剤(例えば、治療ポリペプチド、Fabのような抗体可変領域、及び小分子)を輸送することができる。このアプローチは、治療剤の脳への取り込みを大幅に改善することができるため、脳への送達が効果的である障害及び疾病を治療するうえで極めて有用である。
本明細書で使用される単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、及び「その(the)」には、内容によってそうでない旨が明確に示されない限り、複数の指示対象が含まれる。したがって、例えば、「ポリペプチド」と言った場合、2つ以上のそのような分子を含み得る、といった具合である。
このセクションでは、トランスフェリン受容体に結合し、血液脳関門(BBB)を通過して輸送されることが可能な、本発明によるポリペプチドの作製について述べる。
いくつかの実施形態では、改変されるドメインはIgGのCH3ドメインのようなヒトIgのCH3ドメインである。CH3ドメインは、いずれのIgGのサブタイプ、すなわち、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4から得られるものであってもよい。IgG抗体との関連において、CH3ドメインとは、EU番号付けスキームに従って番号付けした場合に、約341位〜約447位までのアミノ酸のセグメントのことを指す。トランスフェリン受容体結合のための対応するアミノ酸位置の組を特定する目的でのCH3ドメイン内の位置は、特に指定されない限り、SEQ ID NO:3を基準として決められるか、またはSEQ ID NO:1のアミノ酸114〜220を基準として決められる。置換もまた、SEQ ID NO:1を基準として決められ、すなわち、あるアミノ酸は、SEQ ID NO:1の対応する位置のアミノ酸に対して置換であるとみなされる。SEQ ID NO:1は、部分的なヒンジ領域の配列であるPCPをアミノ酸1〜3として含んでいる。SEQ ID NO:1を基準としたCH3ドメイン内の位置の番号付けは、これらの最初の3個のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、本発明による改変CH3ドメインポリペプチドは、157位、159位、160位、161位、162位、163位、186位、189位、及び194位を含むアミノ酸位置の組に少なくとも3個または少なくとも4個、一般的には5個、6個、7個、8個、または9個の置換を含む。これらの位置に導入することができる例示的な置換を表1に示す。いくつかの実施形態では、161及び/または194位のアミノ酸は芳香族アミノ酸(例えば、Trp、Phe、またはTyr)である。いくつかの実施形態では、161位のアミノ酸はTrpである。いくつかの実施形態では、161位のアミノ酸はGlyである。いくつかの実施形態では、194位の芳香族アミノ酸はTrpまたはPheである。
本発明の改変CH3ドメインポリペプチドは、Fc領域の別のドメインと連結することができる。いくつかの実施形態では、本発明の改変CH3ドメインポリペプチドをCH2ドメインと連結することができるが、これは、天然に存在するCH2ドメイン、または通常はCH2ドメインのC末端にある変異体CH2ドメインであってよい。いくつかの実施形態では、CH2ドメインに連結された改変CH3ドメインを含むポリペプチドは、抗体の部分的または完全なヒンジ領域を更に含むことにより、改変CH3ドメインポリペプチドが、部分的または完全なヒンジ領域を有するFc領域の一部となるようなフォーマットを生じる。ヒンジ領域は、いずれの免疫グロブリンサブクラスまたはアイソタイプからのものであってもよい。例示的な免疫グロブリンのヒンジの1つとして、IgG1のヒンジ領域、例えば、ヒトIgG1ヒンジアミノ酸配列
などのIgGヒンジ領域がある。更なる実施形態では、ヒンジまたは部分的なヒンジ領域を有するFcフォーマットとすることができるポリペプチドを、別の部分、例えばFabフラグメントと更に連結することにより、トランスフェリン受容体と結合するFc−Fab融合体が作製される。いくつかの実施形態では、トランスフェリン受容体と結合するFc−Fab融合体は、改変CH3ドメインポリペプチド、ヒンジ領域、及びFabフラグメントを更に含む。このFabフラグメントは、対象となるあらゆる標的、例えば治療上の神経学的標的に対するものとすることができ、その場合、Fabは、改変CH3ドメインポリペプチドのトランスフェリン受容体との結合によって媒介される、血液脳関門を通過するトランスサイトーシスによって標的に送達される。
トランスフェリン受容体を結合してBBBを通過する輸送を開始するように改変された、本明細書で提供されるポリペプチドは、例えば、血清安定性を高めるため、エフェクター機能を調節するため、グリコシル化に影響を及ぼすため、ヒトにおける免疫原性を低下させるため、及び/または、ポリペプチドのノブ・アンド・ホール型のヘテロ二量化を可能とするためなど、更なる変異を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、改変CH3ドメインを含むFc領域はエフェクター機能を有し、すなわち、このFc領域は、エフェクター機能を媒介するエフェクター細胞で発現したFc受容体に結合する際に特定の生物学的機能を誘導する能力を有する。エフェクター細胞としては、これらに限定されるものではないが、単核球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、マスト細胞、血小板、B細胞、大顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、及び細胞傷害性T細胞が挙げられる。
本明細書に記載されるポリペプチド(例えば、クローンCH3C.35.20.1、CH3C.35.23.2、CH3C.35.23.3、CH3C.35.23.4、CH3C.35.21.17.2、CH3C.35.23、CH3C.35.21、CH3C.35.20.1.1、CH3C.23.2.1、及びCH3C.35.23.1.1のうちのいずれか1つ)は、ノブ変異(例えば、SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合のT139W)、ホール変異(例えば、SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合のT139S、L141A、及びY180V)、エフェクター機能を調節する変異(例えば、SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合のL7A、L8A、及び/またはP102G(例えば、L7A及びL8A))、及び/または血清安定性を高める変異(例えば、(i)SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合のM25Y、S27T、及びT29E、または(ii)SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合の、M201Lを伴うかまたは伴わないN207S)を含む更なる変異を含むことができる。
いくつかの実施形態では、クローンCH3C.35.20.1は、ノブ変異(例えば、SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合のT139W)、及びSEQ ID NO:109の配列との少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、または少なくとも95%の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異を有するクローンCH3C.35.20.1は、SEQ ID NO:109の配列を有する。
いくつかの実施形態では、クローンCH3C.35.23.2は、ノブ変異(例えば、SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合のT139W)、及びSEQ ID NO:121の配列との少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、または少なくとも95%の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異を有するクローンCH3C.35.23.2は、SEQ ID NO:121の配列を有する。
いくつかの実施形態では、クローンCH3C.35.23.3は、ノブ変異(例えば、SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合のT139W)、及びSEQ ID NO:133の配列との少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、または少なくとも95%の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異を有するクローンCH3C.35.23.3は、SEQ ID NO:133の配列を有する。
いくつかの実施形態では、クローンCH3C.35.23.4は、ノブ変異(例えば、SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合のT139W)、及びSEQ ID NO:145の配列との少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、または少なくとも95%の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異を有するクローンCH3C.35.23.4は、SEQ ID NO:145の配列を有する。
いくつかの実施形態では、クローンCH3C.35.21.17.2は、ノブ変異(例えば、SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合のT139W)、及びSEQ ID NO:157の配列との少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、または少なくとも95%の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異を有するクローンCH3C.35.21.17.2は、SEQ ID NO:157の配列を有する。
いくつかの実施形態では、クローンCH3C.35.23は、ノブ変異(例えば、SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合のT139W)、及びSEQ ID NO:169の配列との少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、または少なくとも95%の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異を有するクローンCH3C.35.23は、SEQ ID NO:169の配列を有する。
いくつかの実施形態では、クローンCH3C.35.21は、ノブ変異(例えば、SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合のT139W)、及びSEQ ID NO:196の配列との少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、または少なくとも95%の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異を有するクローンCH3C.35.21は、SEQ ID NO:196の配列を有する。
いくつかの実施形態では、クローンCH3C.35.20.1.1は、ノブ変異(例えば、SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合のT139W)、及びSEQ ID NO:208の配列との少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、または少なくとも95%の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異を有するクローンCH3C.35.20.1.1は、SEQ ID NO:208の配列を有する。
いくつかの実施形態では、クローンCH3C.35.23.2.1は、ノブ変異(例えば、SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合のT139W)、及びSEQ ID NO:220の配列との少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、または少なくとも95%の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異を有するクローンCH3C.35.23.2.1は、SEQ ID NO:220の配列を有する。
いくつかの実施形態では、クローンCH3C.35.23.1.1は、ノブ変異(例えば、SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合のT139W)、及びSEQ ID NO:232の配列との少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、または少なくとも95%の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異を有するクローンCH3C.35.23.1.1は、SEQ ID NO:232の配列を有する。
いくつかの実施形態では、本発明による改変CH3ドメインを含むトランスフェリン受容体結合ポリペプチドは、リンカーを介して薬剤(例えば、細胞内に内在化させようとする、及び/または血液脳関門のような内皮を通過してトランスサイトーシスさせようとする薬剤)と連結される。リンカーは、ポリペプチドに薬剤を連結するのに適したいずれのリンカーであってもよい。いくつかの実施形態では、連結は酵素によって切断可能なものである。特定の実施形態では、連結は中枢神経系に存在する酵素によって切断可能なものである。
本明細書に記載される改変トランスフェリン受容体結合ポリペプチドは、通常は組換え法を用いて調製される。したがって、いくつかの態様において、本発明は、本明細書に記載されるポリペプチドを含むポリペプチドのいずれかをコードする核酸配列を含む単離核酸、及び該ポリペプチドをコードする核酸を複製し、及び/または該ポリペプチドを発現させるために使用される核酸が導入された宿主細胞を提供するものである。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、真核細胞、例えばヒト細胞である。
本発明によるトランスフェリン受容体結合ポリペプチドは、多くの適応症で治療的に使用することができる。いくつかの実施形態では、トランスフェリン受容体結合ポリペプチドは、トランスフェリン受容体を発現する標的細胞型に治療剤を送達するために使用される。いくつかの実施形態では、トランスフェリン受容体結合ポリペプチドは、治療成分を、脳によって取り込まれるように例えば血液脳関門のような内皮を通過して輸送するために使用することができる。
別の態様では、本発明によるトランスフェリン受容体結合ポリペプチドを含む医薬組成物及びキットが提供される。
本発明で使用するための製剤を調製するためのガイダンスは、当業者には周知の医薬品及び製剤用の任意の数のハンドブックにみることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるトランスフェリン受容体結合ポリペプチドを含むキットが提供される。いくつかの実施形態では、キットは、脳または中枢神経系(CNS)の疾患などの神経疾患の予防または治療に使用される。
本発明を、特定の実施例によってより詳細に説明する。以下の実施例はあくまで例示の目的で示されるものにすぎず、本発明をいかなる形でも限定しようとするものではない。当業者には、実質的に同じ結果を生じるように変更または改変することができる様々な重要でないパラメータが容易に認識されよう。用いられる数値(例えば、量、温度など)に関して精度を確実とするべく努力に努めてはいるが、ある程度の実験的誤差及び偏差は存在し得る。本発明の実施では、特に断らない限りは、当該技術分野の技術の範囲内で、タンパク質化学、生化学、組換えDNA技術、及び薬理学の従来の方法を用いている。かかる技術は文献に充分な説明がなされている。更に、当業者には、特定のライブラリーに適用される操作の方法は、本明細書に記載される他のライブラリーにも適用できることが明らかなはずである。
トランスフェリン受容体(TfR)細胞外ドメイン(ECD)をコードするDNA(ヒト(SEQ ID NO:38)またはカニクイザル(SEQ ID NO:103)の残基121〜760)を、C末端の切断可能なHis及びAviタグを有する哺乳動物発現ベクターにクローニングした。このプラスミドをHEK293細胞にトランスフェクトし、発現させた。細胞外ドメインをNi−NTAクロマトグラフィーを用いて回収した上清から精製した後、サイズ排除クロマトグラフィーにより凝集タンパク質を除去した。収率は培養物1L当たり約5mgであった。タンパク質を10mM K3PO4(pH6.7)、100mM KCl、100mM NaCl、及び20%グリセロール中で保存し、−20℃で凍結した。
本実施例は、本明細書のポリペプチドの設計、作製、及び特性分析について述べる。本実施例の目的、及びクローン配列において同じであるアミノ酸同士を比較する目的で、「保存的」変異とは、特定されたクローンのすべてに生じるものとみなされる(保存的アミノ酸置換ではない)のに対し、「半保存的」変異とは、クローンの50%超において生じるものである。
改変を行うための特定の溶媒露出表面パッチを選択し、選択されたパッチのアミノ酸組成をランダム化によって変化させた表面ディスプレイライブラリーを構築し、次に標準的な発現ディスプレイ技術を用いて表面にディスプレイされた配列変異体を所望の機能性についてスクリーニングすることにより、新たな分子認識手段をポリペプチドFc領域に組み込んだ。本明細書で使用するところの「ランダム化」なる用語には、部分ランダム化及び所定のヌクレオチドまたはアミノ酸混合比での配列変化が含まれる。ランダム化を行うために選択される一般的な表面露出パッチは、約600〜1500平方Åの面積を有し、アミノ酸約7〜15個で構成されるものとした。
以下のレジスターは、本明細書に記載される方法に従って設計及び作製した。本明細書で使用するところの「レジスター」なる用語は、変化させることが可能な(例えば、レジスター内の列記された位置におけるアミノ酸の置換、挿入、及び/または欠失を生じるポリペプチドコーディング遺伝子配列への変異の導入により)連続表面を形成する一連の表面露出アミノ酸残基のことを指す。
CH3Cレジスター(表1)は、SEQ ID NO:1に記載されるヒトIgG1のFc領域のアミノ酸配列を基準として番号付けした場合にアミノ酸位置157、159、160、161、162、163、186、189、及び194を含むものであった。CH3Cレジスターの各位置は、いずれもFcγR及びFcRn結合部位から離れている2個のループの溶媒露出残基を含むことにより、連続表面を形成している。
野生型ヒトFc配列(SEQ ID NO:1)をコードする鋳型DNAを合成し、ファージミドベクターに組み込んだ。ファージミドベクターは、ompAまたはpelBリーダー配列、c−Myc及び6×Hisエピトープタグに融合されたFcインサート、ならびにアンバー終止コドンに続くM13コートタンパク質pIIIを含むものであった。
野生型ヒトFc配列をコードする鋳型DNAを合成し、酵母ディスプレイベクターに組み込んだ。CH3ライブラリーについて、FcポリペプチドをAga2p細胞壁タンパク質上にディスプレイさせた。いずれのベクターも、Kex2切断配列を有するプレプロリーダーペプチド、及びFcの末端に融合されたc−Mycエピトープタグを含んでいた。
ファージ法は、Phage Display:A Laboratory Manual(Barbas,2001)より採用した。更なるプロトコールの詳細は、この参照文献より入手することができる。
ヒトTfR標的をMaxiSorp(登録商標)マイクロタイタープレート(通常、1〜10μg/mLのPBS溶液を200μL)に4℃で一晩コーティングした。特に断らない限り、すべての結合は室温で行った。ファージライブラリーを各ウェルに加え、一晩インキュベートして結合を行った。マイクロタイターウェルを0.05%のTween(登録商標)20(PBST)を含むPBSでよく洗い、各ウェルを酸(通常、500mM KCl、または100mM グリシン、pH2.7を含む50mM HCl)と30分間インキュベートとすることにより結合したファージを溶出した。溶出されたファージを1M Tris(pH8)で中和し、TG1細胞及びM13/KO7ヘルパーファージを用いて増幅し、50μg/mLのカルベニシリン及び50μg/mLのカナマイシンを含んだ2YT培地中、37℃で一晩増殖させた。標的の入ったウェルから溶出されたファージの力価を、標的の入っていないウェルから回収されたファージの力価と比較して濃縮度を評価した。次に結合の際のインキュベーション時間を短縮し、洗浄時間及び洗浄の回数を増やすことによって選択のストリンジェンシーを高めた。
ヒトTfRの標的を、NHS−PEG4−ビオチン(Pierce(商標)より入手したもの)を用いて遊離アミンを介してビオチン化した。ビオチン化反応には、3〜5倍モル過剰のビオチン試薬をPBS中で用いた。反応をTrisで停止した後、PBS中に重点的に透析した。ビオチン化された標的をストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズ(すなわち、Thermo Fisherより入手したM280ストレプトアビジンビーズ)上に固定した。ファージディスプレイライブラリーを、標的をコーティングしたビーズと室温で1時間インキュベートした。この後、結合しなかったファージを除去し、ビーズをPBSTで洗浄した。結合したファージを、500mM KCl(または0.1Mグリシン、pH2.7)を含む50mM HClと30分間インキュベートすることにより溶出した後、プレート分取について上記に述べたように中和して、増殖させた。
ビーズ分取(磁気細胞分離(MACS))法
Ackerman,et al.2009 Biotechnol.Prog.25(3),774に記載されるのと同様にしてMACS及びFACS選択を行った。ストレプトアビジン磁気ビーズ(例えば、ThermoFisherより販売されるM−280ストレプトアビジンビーズ)を、ビオチン化標的で標識し、酵母とインキュベートした(通常5〜10×のライブラリー多様性)。結合しなかった酵母を除去し、ビーズを洗浄し、結合した酵母を選択培地中で増殖させ、後の選択のラウンド用に誘導した。
酵母を抗c−Myc抗体で標識して発現及びビオチン化標的(分取ラウンドに応じて濃度が変化する)を監視した。一部の実験では、標的をストレプトアビジン−Alexa Fluor(登録商標)647と予め混合して相互作用のアビディティーを高めた。他の実験では、結合後のビオチン化標的を検出し、ストレプトアビジン−Alexa Fluor(登録商標)647で洗浄した。結合を有するシングレットの酵母をFACS Aria III細胞分取装置を使用して分取した。分取した酵母を選択培地中で増殖させた後、後の選択ラウンド用に誘導した。
ELISAによるスクリーニング
クローンをパニングの結果産物から選択し、96ウェルディープウェルプレートの個々のウェル中で増殖させた。各クローンに自己誘導培地(EMD Milliporeより入手したもの)を用いてペリプラズムでの発現を誘導するか、またはファージ上に個々のFc変異体をファージディスプレイするためにヘルパーファージを感染させた。培地を一晩増殖させ、遠心して大腸菌をペレット化した。ファージELISAでは、ファージを含む上清を直接使用した。ペリプラズムでの発現では、ペレットを20%スクロースに再懸濁した後、水で4:1に希釈し、4℃で1時間振盪した。プレートを遠心して固形物をペレット化し、上清をELISAに使用した。
Fc変異体ポリペプチド(ファージ上で、ペリプラズム抽出物中で、またはFabフラグメントとの可溶性の融合体として発現させたもの)を、96ウェルV底プレート中で細胞に加え(PBS+1%BSA(PBSA)中、ウェル1個当たり約100,000細胞)、4℃で1時間インキュベートした。この後、各プレートを遠心し、培地を除去してから細胞をPBSAで1回洗浄した。二次抗体(ヤギ抗ヒトIgG−Alexa Fluor(登録商標)647(Thermo Fisherより入手したもの))を含むPBSA中に細胞を再懸濁した。30分後、プレートを遠心し、培地を除去し、細胞をPBSAで1〜2回洗浄した後、プレートをフローサイトメーター(すなわち、FACSCanto(商標)IIフローサイトメーター)で読み取った。FlowJoソフトウェアを使用して各条件について蛍光の中央値を計算し、結合曲線をPrismソフトウェアを用いてプロットした。
トランスフェリン受容体(TfR)に対するCH3Cライブラリーを用いた選択
CH3Cに対する酵母ライブラリーを上記に述べたようにTfRに対してパニングし、分取した。最初の3回の分取ラウンドの集団濃縮FACSプロットを図1に示す。更なる2ラウンドの分取後、1種類のクローンをシークエンシングし、4個の固有の配列(すなわち、クローンCH3C.1(SEQ ID NO:4)、CH3C.2(SEQ ID NO:5)、CH3C.3(SEQ ID NO:6)、及びCH3C.4(SEQ ID NO:7))を特定した。これらの配列は、161位に保存的Trpを有し、いずれも194位に芳香族残基(すなわち、Trp、Tyr、またはHis)を有していた。他の位置では高い多様性がみられた。
CH3Cライブラリーから選択した4種類のクローンを、CHOまたは293細胞でFabフラグメントとのFc融合体として発現させ、プロテインA及びサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した後、ELISAによりホロTfの存在下または非存在下でカニクイザル及びヒトTfRに対する結合についてスクリーニングした。図2に示されるように、各クローンはいずれもヒトTfRに結合し、結合は過剰量(5μM)のホロTfの添加によって影響されなかった。しかしながら、各クローンはカニクイザルTfRにはそれほど結合しなかった。ヒトTfRを内因性に発現する293F細胞に対する結合についてもクローンを試験した。図3は、各クローンは293F細胞に結合したものの、全体的な結合は高親和性のポジティブコントロールと比較して大幅に弱かったことを示している。
ヒトTfRに対する初期のCH3Cのヒットの親和性を改善し、カニクイザルTfRに対する結合を導入する試みとして更なるライブラリーを作製した。ソフトランダム化のアプローチを用い、DNAオリゴを作製して最初の4つのヒットのそれぞれに基づいてソフト突然変異誘発を導入した。レジスターの第1の部分
とレジスターの第2の部分
を別々のフラグメントにより構築することにより、ソフトランダム化された各レジスターをPCR増幅でシャッフルした(例えば、クローンCH3C.1からのレジスターの第1の部分が、クローンCH3C.1、CH3C.2、CH3C.3、及びCH3C.4からのレジスターの第2の部分と混合される、といった具合)。各フラグメントをすべて混合してから、表面発現及び選択を行うために酵母に導入した。
ソフト突然変異誘発ライブラリーからの各クローンをFc−Fab融合ポリペプチドとして再フォーマット化し、上記に述べたように発現させ、精製した。図7に示されるように、これらの変異体は、最初のライブラリーセレクションからの最も上のクローン(CH3C.3)と比較してヒトTfRに対する改善されたELISA結合を有し、また、ホロTfと競合もしなかった。下記表2に示されるEC50値は、ホロTfの存在または非存在によって実験の誤差の範囲を超えて大きく影響されなかった。
操作されたCH3C Fc領域がTfRのアピカルドメインに結合するかを調べるため、TfRアピカルドメイン(ヒト及びカニクイザルについてそれぞれSEQ ID NO:30及び31)をファージの表面で発現させた。アピカルドメインを適正にフォールディングしてディスプレイするには、ループの1つを短縮する必要があり、配列を環状に並び替える必要があった。ファージ上で発現された配列は、ヒト及びカニクイザルでそれぞれSEQ ID NO:32及び33として特定される。クローンCH3C.18及びCH3C.35をELISAプレートにコーティングし、上記に述べたファージELISAプロトコールに従った。要約すると、1%PBSAによる洗浄及びブロッキング後、ファージディスプレイの各希釈液を加え、室温で1時間インキュベートした。次いで各プレートを洗浄し、抗M13−HRPを加え、更なる洗浄後、各プレートをTMB基質で発色させ、2NのN2SO4でクエンチした。このアッセイではCH3C.18及びCH3C.35の両方ともアピカルドメインに結合した。
Fcドメイン内のどの残基がTfRへの結合に最も重要であるかを理解するため、各変異体のTfR結合レジスター内の1個の位置を野生型に復帰変異させた変異体CH3C.18及びCH3C.35の一連のクローンを作製した。得られた変異体を組換えによりCH3C Fc−Fab融合体として発現させ、ヒトまたはカニクイザルTfRに対する結合について試験した(図12)。CH3C.35では、161及び194位は結合に絶対的に重要であり、これらのいずれかの野生型への復帰変異はヒトTfRに対する結合を完全に消失させた。驚くべきことに、163位を野生型に復帰変異させることで、カニクイザルTfRへの結合が顕著に上昇したのに対して、ヒトへの結合に影響はほとんどなかった。これに対して、残基163の野生型への復帰変異はCH3C.18ではほとんど影響がなかったが、この変異体では189及び194位の復帰変異がヒトTfRへの結合を完全に消失させた。どちらの変異体においても、他の単一の復帰変異はヒトTfRへの結合に若干の(負の)影響を示したのに対して、多くの場合でカニクイザルTfRに対する結合は消失した。
カニクイザルTfRに対するCH3C変異体の親和性を更に高めるために更なるライブラリーを調製した。これらのライブラリーは、理論上の多様性に関しておよそ107種類よりも少ないクローンとなるように設計されており、酵母表面ディスプレイを用いて多様性空間全体を網羅することが可能なものであった。これらのライブラリーの設計を図13(A)〜(D)に示す。4つのライブラリーの設計を用い、すべてのライブラリーはNNKまたは他の縮重コドン位置で縮重オリゴを使用して作製し、上記に述べたようにオーバーラップPCRにより増幅した。
上記に述べたように、精製したCH3C Fc−Fab融合変異体と、プレートにコーティングしたヒトまたはカニクイザルTfRとの結合ELISAを行った。CH3C.18成熟ライブラリーからの変異体であるCH3C3.2−1、CH3C.3.2−5、及びCH3C.3.2−19がヒト及びカニクイザルTfRとおおよそ等しいEC50値で結合したのに対して、親クローンのCH3C.18及びCH3C.35は、カニクイザルTfRに対してヒトTfRに、10倍よりも高い結合を示した(図14)。
更なる親和性成熟クローンであるCH3C.18及びCH3C.35に対する更なる操作において、骨格(すなわちレジスター以外の)位置に更なる変異を加えて、直接的相互作用、第2水和殻相互作用、または構造的安定化を介して結合を向上させた。これは、「NNKウォーク」または「NNKパッチ」ライブラリーの作製、及びこれらのライブラリーからの選択を行うことによって実現された。NNKウォークライブラリーでは、パラトープの近傍の残基に1つずつNNK変異を導入した。FcgRIに結合したFc(PDB ID:4W4O)の構造をみることにより、図16に示されるように、元のライブラリーレジスターの近くの44個の残基が調査の候補として特定された。詳細には、以下の残基、すなわち、K21、R28、Q115、R117、E118、Q120、T132、K133、N134、Q135、S137、K143、E153、E155、S156、G158、Y164、K165、T166、D172、S173、D174、S176、K182、L183、T184、V185、K187、S188、Q191、Q192、G193、V195、F196、S197、S199、Q211、S213、S215、L216、S217、P218、G219、及びK220をNNK突然変異誘発の標的とした。Kunkel突然変異誘発を用いてこれらの44種類のシングルポイントNNKライブラリーを作製し、他の酵母ライブラリーについて上記に述べたように各産物をプールして電気穿孔法により酵母に導入した。
CH3Cパッチ1:アミノ酸位置:K21、R28、Y164、K165、及びT166;
CH3Cパッチ2:アミノ酸位置:Q115、R117、E118、Q120、及びK143;
CH3Cパッチ3:アミノ酸位置:T132、K133、N134、Q135、及びS137;
CH3Cパッチ4:アミノ酸位置:E153、E155、S156、及びG158;
CH3Cパッチ5:アミノ酸位置:D172、S173、D174、S176、及びK182;
CH3Cパッチ6:アミノ酸位置:L183、T184、V185、K187、及びS188;
CH3Cパッチ7:アミノ酸位置:Q191、Q192、G193、V195、及びF196;
CH3Cパッチ8:アミノ酸位置:S197、S199、Q211、S213、及びS215;ならびに
CH3Cパッチ9:アミノ酸位置:L216、S217、P218、G219、及びK220。
TfRアピカルドメインタンパク質を用い、上記に述べたように選択を行った。しかしながら、結合が向上したクローンは特定されなかった。
NNKウォークライブラリーから変異の組み合わせを特定する一方でこれらの周辺にいくつかの更なる位置を追加するための更なるライブラリーを、上記の酵母ライブラリーについて述べたように作製した。このライブラリーでは、YxTEWSS及びTxxExxxxFモチーフを一定に保ち、以下の6つの位置、すなわちE153、K165、K187、S188、S197、及びS199を完全にランダム化した。位置E153及びS188は、これらの位置がNNKウォークライブラリーにおいて「ホットスポット」であったことから含めた。位置K165、S197、及びS199は、これらの位置が結合領域の位置を決定し得るコアの部分を構成することから含め、K187は、188位に隣接していることから選択した。
次のライブラリーは、主要な結合パラトープ内の許容される多様性の全体像を調べるために設計した。用いたアプローチは、NNKウォークライブラリーと同様のものであった。元のレジスター位置(157、159、160、161、162、163、186、189、及び194)のそれぞれ、ならびに2個のホットスポット(153及び188)をNNKコドンで個々にランダム化することにより、酵母上で一連の単一位置飽和突然変異誘発ライブラリーを作製した。更に、それぞれの位置を個々に野生型残基に復帰変異させ、これらの個々のクローンを酵母上にディスプレイさせた。図18は、野生型復帰変異及び単一位置のNNKライブラリーと比較した親クローンCH3C.35.21の結合を示す。153、162、163、及び188位は、野生型残基に復帰変異させた際にTfRに対する相当の結合を維持した唯一の位置であった点が着目された(186位の野生型への復帰変異で若干の残留はあるものの大幅に消失した結合が認められた)。
位置153:Trp、Leu、またはGlu;
位置157:TyrまたはPhe;
位置159:Thrのみ;
位置160:Gluのみ;
位置161:Trpのみ;
位置162:Ser、Ala、またはVal(野生型のAsn残基は若干の結合を維持するようにみえたが、その後のライブラリー分取ではそのようにみえなかった点が着目された);
位置163:SerまたはAsn;
位置186:ThrまたはSer;
位置188:GluまたはSer;
位置189:Gluのみ;及び
位置194:Pheのみ。
一価のTfR結合ポリペプチド−Fab融合体の作製
Fcドメインは自然でホモ二量体を形成するが、一方のFc単位がT139Wのノブ変異(EU番号付けスキームを用いた場合に366位に相当)を有し、他方のFc単位がT139S、L141A、及びY180Vのホール変異(EU番号付けスキームを用いた場合にそれぞれ366、368、及び407位に相当)を有する「ノブ・イン・ホール」として知られる一連の非対称的変異によって2個のFcフラグメントの選択的ヘテロ二量体化を生じ得る。いくつかの実施形態では、本発明の改変CH3ドメインは、139位にTrpを含む。いくつかの実施形態では、本発明の改変CH3ドメインは、139位にSerを、141位にAlaを、180位にValを含む。ヘテロ二量体のTFR結合ポリペプチドを、2種類のプラスミド(すなわち、ノブFcとホールFc)の一過性の同時トランスフェクションにより293またはCHO細胞で発現させる一方で、ポリペプチド−Fab融合体を3種類のプラスミド(すなわち、ノブ−Fc−Fab重鎖、ホール−Fc−Fab−重鎖、及び一般的な軽鎖)の一過性の同時トランスフェクションにより発現させた。分泌されたヘテロ二量体ポリペプチドまたはポリペプチド−Fab融合体の精製を、ホモ二量体におけるのと同じように行った(すなわち、プロテインAを使用した2カラム精製に続いてサイズ排除クロマトグラフィーを行い、その後、必要に応じて濃縮及びバッファー交換を行う)。質量分析または疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて形成されたホモ二量体(例えば、ノブ−ノブ、またはホール−ホールで対合したFc)に対するヘテロ二量体の量を決定した。典型的な調製物では、ポリペプチドの95%超、しばしば98%超がヘテロ二量体であった。明確さのため、この方法で作製されたすべての一価TfR結合物(Fcホモ二量体)を、ZZがポリペプチドの名前であるものとし、「.一価」が一価のTfR結合を示すものとして「ZZ.一価」と命名した。特に断らない限り、ヘテロ二量体ポリペプチド及びポリペプチド−Fab融合体において、TfR結合を与える変異には「ノブ」変異が含まれたのに対して、TfRに結合しないFc領域は「ホール」領域とともに用いた。ある場合では、これらのコンストラクトには、L7A/L8A、M25Y/S27T/T29E、N207S、または改変されたFcγRもしくはFcRn結合に対してそれぞれN207S/M201Lなど、Fcの特性を変化させる更なる変異も含まれていた。
一価のCH3Cポリペプチドの結合を、上記に述べた方法の改法を用いてELISAで測定した。ストレプトアビジンをPBS中、1μg/mLで一晩、96ウェルELISAプレートにコーティングした。洗浄後、プレートをPBS中、1%BSAでブロッキングした後、ビオチン化したヒトまたはカニクイザルTfRを1μg/mLで加え、30分間インキュベートした。更に洗浄した後、ポリペプチドを各プレートに連続希釈で加え、1時間インキュベートした。各プレートを洗浄し、二次抗体(すなわち、抗κ−HRP、1:5000)を30分間加え、プレートを再び洗浄した。各プレートをTMB基質で発色させ、2N H2SO4でクエンチした後、BioTek(登録商標)プレートリーダーで450nmの吸光度を読み取った。結果を図19に示すが、これはスタンダード(すなわち、二価のTfR結合)と一価のTfR結合ポリペプチドとを直接比較したものである。Ab204は、高親和性の抗TfRコントロール抗体である。
結合速度論を、抗BACE1 Fabに融合されたいくつかの一価及び二価CH3Cポリペプチド変異体について測定し、バイオレイヤー干渉法を用いてそれらの二価の相当物と比較した(すなわち、Octet(登録商標)REDシステムを用いた)。TfRをストレプトアビジンセンサー上に捕捉し、次いでCH3Cポリペプチドを結合させて洗い流した。センサーグラムを1:1の結合モデルにフィッティングしたところ、二価ポリペプチドのKD(app)値は、TfR二量体に対する強い結合を示した。結果を、表5ならびに図22及び23に示す。
組換えTfRのアピカルドメインのクローン変異体の親和性をBiacore(商標)T200装置を使用して表面プラズモン共鳴により測定した。Biacore(商標)シリーズS CM5のセンサーチップを抗ヒトFabとともに固定化した(GE Healthcareより販売されるヒトFab捕捉キット)。5μg/mLのポリペプチド−Fab融合体を各フローセル上に1分間捕捉させ、ヒトまたはカニクイザルアピカルドメインの連続3倍希釈液を流速30μL/分で室温で注入した。各試料を45秒間の結合及び3分間の解離により分析した。それぞれの注入後、10mMグリシン−HCl(pH2.1)を用いてチップを再生した。結合応答を、無関連のIgGを同様の密度で捕捉させたフローセルからのRUを引くことによって補正した。Biacore(商標)T200 Evaluation Software v3.1.を用いて平衡状態の応答を濃度に対してフィッティングすることによって、安定状態の親和性を得た。
ForteBio(登録商標)ストレプトアビジンバイオセンサーを用いたForteBio(登録商標)Octet(登録商標)RED384装置を使用してFcRn結合アッセイを行った。ビオチン化した組換えBACE1をカイネティックバッファー(ForteBio(登録商標)より入手したもの)中で10μg/mLの濃度に希釈し、個々のバイオセンサー上に1分間捕捉させた。次にベースラインをカイネティックバッファー中で1分間、確立した。10μg/mLのポリペプチド−Fab融合体(抗BACE1 Fabアームを有するもの)を、1μMのヒトTfRのECDの存在下または非存在下でセンサーチップに結合させた。固定化したポリペプチド−Fab融合体に対する組換えヒトFcRn(pH5.5)の結合を、3分間の結合及び3分間の分離を行って分析した。
本実施例では、マウスの血漿中及び脳組織中での本発明のCH3C変異体ポリペプチドの薬物動態学的/薬力学的(PK/PD)特性分析について述べる。
ポリペプチド−Fab融合体はヒトTfRにのみ結合し、マウスTfRには結合しないことから、TfR媒介性クリアランスを有さないモデルにおけるインビボ安定性を示すために野生型マウスでいくつかのCH3C変異体の薬物動態学(PK)を試験した。研究計画を下記表7に示す。6〜8週齢のC57Bl6マウスに静脈内投与し、表7に示される時点において顎下瀉血により生存中瀉血が行われた。血液をEDTA血漿チューブに採取し、14,000rpmで5分間遠心した後、血漿を後の分析用に単離した。
下記表9の研究計画に従って野生型マウスで第2のPK研究を行った(すべてのポリペプチド−Fab融合体はAb153 Fabと融合させたもの)。
マウスTfrc遺伝子内でヒトTfrcアピカルドメインを発現するトランスジェニックマウスを、CRISPR/Cas9技術を用いて作製した。得られたキメラTfRを内因性プロモーターの制御下でインビボで発現させた。
表11の研究計画に示されるように、50mg/kgの抗BACE1抗体Ab153、抗TfR/BACE1二重特異性抗体Ab116、Ab153のFabと融合したCH3C.35.21.一価、またはAb153のFabと融合したCH3C.35.N153.二価のいずれかを、ホモ接合体hTfRアピカル+/+マウスに静脈内注射した。この研究では、すべてのFcはエフェクター機能を除去するようにLALAPG変異を有していた。
PK及び脳での取り込みに対するTfR結合親和性の影響を評価するため、Biacoreによって測定されるアピカルヒトTfRに対する結合親和性の異なる抗BACE1 Ab153及びTfR結合ポリペプチド融合体(CH3C.35.21:Ab153、CH3C.35.20:Ab153、CH3C.35:Ab153融合体)を作製した。ヒトTfRに対するCH3C.35.21:Ab153、CH3C.35.20:Ab153、CH3C.35:Ab153融合体の結合親和性はそれぞれ、100nM、170nM、及び620nMである。hTfRアピカル+/+マウスノックインマウスに、50mg/kgのAb153または各ポリペプチド−Fab融合体を全身投与し、血漿PK及び脳PKPDを投与の1、3、及び7日後に評価した。脳及び血漿PKPD分析を上記のセクションで述べたように行った。末梢組織でのTfRの発現により、CH3C.35.21:Ab153、CH3C.35.20:Ab153、及びCH3C.35:Ab153融合体は、Ab153単独と比較して血漿中のより速やかなクリアランスを示したが、これは、標的媒介性のクリアランスと一致し、インビボでのTfR結合を示すものである(図39(A))。印象的な点として、CH3C.35.21:Ab153、CH3C.35.20:Ab153、及びCH3C.35:Ab153融合体の脳内濃度は、Ab153と比較して有意に増大し、同じ時点におけるAb153がわずかに約3nMであったのと比較して投与後1日目に30nmよりも高い最大脳内濃度が得られた(図39(B))。CH3C.35.21:Ab153、CH3C.35.20:Ab153、及びCH3C.35:Ab153融合体の脳曝露の増大は、Ab153を投与したマウスにおけるAβ濃度と比較して、マウスの脳で約55〜60%低い内因性のマウスAβ濃度を生じた(図39(C))。CH3C.35.21:Ab153、CH3C.35.20:Ab153、及びCH3C.35:Ab153融合体の濃度が脳で高い状態に保たれた一方で、このようなより低い脳のAβ濃度は維持され、7日目までに曝露が低減された際にAb153で処置したマウスと同様の濃度に戻った。経時的な脳曝露の低下は、CH3C.35.21:Ab153、CH3C.35.20:Ab153、及びCH3C.35:Ab153融合体の末梢曝露の低下と相関しており、インビボでの明確なPK/PDの関係を示した(図39(A)と39(C)とを比較)。更に、全体の脳のTfR濃度は、この単回の高用量の投与後にAb153処理マウスとポリペプチド−Fab融合体処理マウスとで同等であり、脳におけるTfR発現に対して、ポリペプチド−Fab融合体の脳曝露の増加が有意な影響を及ぼさないことを示している(図39(D))。
本実施例では、CH3C.18とトランスフェリン受容体のアピカルドメイン(TfR−AD)との間の結合界面の結晶化及び分析について述べる。
ヒトトランスフェリン受容体のアピカルドメイン(TfR−AD)及び操作されたヒトFc(CH3C.18 Fc)を、Expi293細胞内で、細胞2.5×106個/mLの初期細胞密度で発現させた(それぞれSEQ ID NO:104及び105)。必要に応じて、200mL以上の体積中で発現を行った。グリコシル化阻害剤であるキフネンシンをトランスフェクションの20時間後に25μMの最終濃度で加えた。発現培養物を、細胞生存率が顕著に低下するトランスフェクションの3〜4日後に回収した。
発現させたTfR−AD及びCH3C.18 Fcを、それぞれプロテインA及びNi−NTA樹脂を用いて精製した後、Superdex200 26/60ゲル濾過カラムでサイズ排除クロマトグラフィーにかけた。以下のバッファーを使用した。
プロテインA洗浄バッファー:20mM Hepes pH7.4、100mM NaCl;
プロテインA溶出バッファー:30mMグリシン、pH2.5(溶出液を1M Tris、pH9.0の入ったチューブに回収して溶出液を直ちに中和した);
Ni−NTA洗浄バッファー:30mM TrispH8.0、10mMイミダゾール、及び200mM NaCl;
Ni−NTA溶出バッファー:30mM Tris pH8.0、200mM NaCl、及び250mMイミダゾール;ならびに
サイズ排除バッファー(SEC):30mM HEPES pH7.5、200mM NaCl、及び3%グリセロール。
精製したTfR−AD及びCH3C.18 Fcを過剰量のアピカルドメインと混合し、室温で1時間インキュベートし、上記に述べたSECバッファーを使用してSuperdex200 26/60ゲル濾過カラムでサイズ排除クロマトグラフィーを用いて複合体を精製した。サイジングによって、一方が複合体(保持容量=180ml)に対応し、他方が過剰のアピカルドメイン(保持容量=240ml)に対応した、2つの主要なピークが予想通り得られた。ピーク画分をクマシー染色したSDS−PAGEゲルによって分析した(図29)。
シッティングドロップ蒸気拡散法により、15℃及び室温(RT)で、8.5mg/mlのタンパク質濃度で複合体の初期結晶化スクリーニングを行った。25%PEG3350、0.1M Tris pH8.5、及び0.2M MgCl2を含む条件で細い針状の結晶のシャワーが観察された。これらの結晶を、20%PTG3350を用いた以外は同じ条件で種結晶として用いてマウントできるサイズの単一の細い針結晶を生成させた。
20%(v/v)エチレングリコールを添加した結晶化母液を用いて液体窒素中に直接浸漬することによって結晶をフラッシュ冷却した。Rayonix300高速検出器を用い、Advanced Photon Source(APS)のSER−CATのビームラインでX線強度のデータを収集した。結晶は3.6Åに回折し、2個の複合体分子が非対称単位中にある六角形の空間群P64に属した(表12)。データをHKL2000プログラムを使用してインデックス付けし、積分して、スケーリングした。2個の結晶から収集したデータをマージして3.6Åのデータを生成した。
複合体の結晶構造を、CH3C.18 Fcの二量体及びTfR−ADの単量体を初期探索モデルとして用いてPHASERによる分子置換により決定した。このモデルを、REFMACを用いて剛体精密化に続いて制限精密化を行って精密化した。結晶学的計算はすべて、CCP4プログラムスイートを用いて実行した(www.ccp4.ac.uk/)。グラフィックプログラムCOOTを使用して複合体の電子密度へのモデル構築を行った。複合体分子の電子密度は、特にCH3C.18 Fc−TfR−ADの界面において良好であった(2Fo−Fcマップを1.2シグマレベルに合わせた)。モデル構築及び精密化を繰り返し行った後、データの低い分解能及び無秩序化したCH2ドメインのため、高いR及びfreeRが認められた(R/freeR=0.30/0.39)。他の利用可能なFc構造に見られたCH2の無秩序は、CH2とCH3ドメインとの間の柔軟なエルボー角によるものであった。
CH3C.18 FcとTfR−ADとの結合界面が図30(A)及び図30(B)ならびに図31(A)及び31(B)に示されている。図32(A)及び図32(B)に示されるように、
CH3C.18のTrp154と、TfR−ADのArg208;
CH3C.18のGlu155と、TfR−ADのArg208;
CH3C.18のSer156と、TfR−ADのArg208及びLeu212;
CH3C.18のLeu157と、TfR−ADのSer199及びAsn215;
CH3C.18のHis159と、TfR−ADのLys188、Ser199、及びArg208;
CH3C.18のVal160と、TfR−ADのGly207及びArg208;
CH3C.18のTrp161と、TfR−ADのArg208、Val210、及びLeu212;
CH3C.18のAla162と、TfR−ADのArg208;
CH3C.18のVal163と、TfR−ADのLeu209;
CH3C.18のSer188と、TfR−ADのTyr211;
CH3C.18のThr189と、TfR−ADのTyr211及びLeu212;
CH3C.18のGln192と、TfR−ADのLys158及びGlu294;
CH3C.18のTrp194と、TfR−ADのLeu212、Val213、Glu214、及びAsn215;ならびに
CH3C.18のPhe196と、TfR−ADのArg208
の間で相互作用が認められた。更に、実施例2の「パラトープマッピング」と題したセクションで述べ、また、図32(A)及び図32(B)に示されるように、CH3Cレジスターの外側のいくつかの位置もTfRに対する結合に関与している。
本実施例では、CH3C.35とトランスフェリン受容体のアピカルドメイン(TfR−AD)との間の結合界面の結晶化及び分析について述べる。
ヒトトランスフェリン受容体のアピカルドメイン(TfR−AD)及び操作されたヒトFc(CH3C.35 Fc)を、CHO細胞内で、細胞2.5×106個/mLの初期細胞密度で発現させた(それぞれSEQ ID NO:104及び181)。必要に応じて、500mL以上の体積中で発現を行った。発現培養物を、細胞生存率が顕著に低下するトランスフェクションの3〜4日後に回収した。
発現させたTfR−AD及びCH3C.35 Fcを、それぞれプロテインA及びNi−NTA(Sigma)樹脂を用いて精製した後、Superdex200 26/60ゲル濾過カラムでサイズ排除クロマトグラフィーにかけた。以下のバッファーを使用した。
プロテインA溶出バッファー:30mMグリシン、pH2.5(溶出液を1M Tris、pH9.0の入ったチューブに回収して溶出液を直ちに中和した);
Ni−NTA溶出バッファー:30mM Tris pH8.0、200mM NaCl、及び250mMイミダゾール;ならびに
サイズ排除バッファー(SEC):30mM HEPES pH7.5、150mM NaCl、50mM KCl、3%グリセロール、及び0.01%アジ化ナトリウム。
精製したTfR−AD及びCH3C.35 Fcを過剰量のアピカルドメインと混合し、室温で1時間インキュベートし、上記に述べたSECバッファーを使用してSuperdex200 26/60ゲル濾過カラムでサイズ排除クロマトグラフィーを用いて複合体を精製した。
シッティングドロップ蒸気拡散法により、4℃、15℃、及び室温(RT)で、複合体の初期結晶化スクリーニングを行った。25%PEG3350、0.1M Bis−Tris pH6.5、及び0.2M LiSO4を含む条件で細い針状の結晶のシャワーが観察された。これらの結晶を、20%PTG3350を用いた以外は同じ条件で種結晶として用いて単一の細い針結晶を生成させ、シーディングを連続して4回繰り返してマウントできるサイズの結晶を生成させた。
20%(v/v)エチレングリコールを添加した結晶化母液を用いて液体窒素中に直接浸漬することによって結晶をフラッシュ冷却した。PILATUS検出器を用い、Diamond Light Source(DLS)のIO4ビームラインでX線強度のデータを収集した。5ミクロンのサイズのマイクロフォーカスビームをデータ収集に使用した。結晶は3.38Åに回折し、2個の複合体分子が非対称単位中にある六角形の空間群P64に属した(表13)。CCP4スイートプログラム(Xia2−XDS及びXSCALE)を使用してデータをインデックス付けし、積分して、スケーリングした。
複合体の結晶構造を、CH3C.35Fc−AD TfR複合体を探索モデルとして用いてPHASERによる分子置換により決定した。このモデルを、REFMACを用いて剛体精密化に続いて制限精密化を行って精密化した。結晶学的計算はすべて、CCP4プログラムスイートを用いて実行した。グラフィックプログラムCOOTを使用して複合体の電子密度へのモデル構築を行った。複合体分子の電子密度は、特にCH3C.35 Fc−TfR−ADの界面において良好であった。
CH3C.35 FcとTfR−ADとの結合界面が図34(A)〜34(C)に示されている。図34(A)は、3.4ÅにおけるCH3C.35 FcとTfR−ADとの複合体を示す。図34(B)は、CH3C.35 Fc内の残基W161がTfR−AD内の残基L209、L212、及びY211によって安定化されていることを示す。図34(C)は、CH3C.35 Fc内の残基E160とTfR−AD内の残基R208間の中心的結合相互作用としての塩橋を示す。この相互作用は、FcポリペプチドのヒトTfRに対する結合親和性(208位のArg)とカニクイザルTfRに対する結合親和性(208位のGly)との差を一部説明し得る。図35(A)は、CH3C.35 FcとTfR−ADとの複合体と、CH3C.18 FcとTfR−ADとの複合体(実施例6で述べたもの)とを重ね合わせた構造を示し、CH3C.18とCH3C.35との間で大きなFc骨格のコンフォメーション変化がみられないことを示している。図35(B)は、図35(A)の重ね合わせ構造の拡大図を示す。CH3C.35 Fc/TfR−AD複合体のTfR−AD内の残基206〜212は、CH3C.18 Fc/TfR−AD複合体のTfR−AD内の残基とは異なるコンフォメーションを取っていた。TfR−AD内の残基R208は、CH3C.18 Fc/TfR−AD複合体の表面内に埋もれているようにみえるが、CH3C.35 Fc/TfR−AD複合体では溶媒に露出しているようにみえる。更に、CH3C.35 Fc/TfR−AD複合体のTfR−ADの残基L209は、180°回転されて表面に結合しているようにみえるが、CH3C.18 Fc/TfR−AD複合体では表面から離れているようにみえる。
CH3C.35のThr159と、TfR−ADのGly207、Arg208、Lys188、及びLeu209;
CH3C.35のGlu160と、TfR−ADのArg208及びLeu209;
CH3C.35のSer162と、TfR−ADのArg208及びLeu209;
CH3C.35のSer156と、TfR−ADのLeu209;
CH3C.35のTrp161と、TfR−ADのLeu209、Tyr211、及びLeu212;
CH3C.35のGlu189と、TfR−ADのTyr211及びLeu212;
CH3C.35のPhe194と、TfR−ADのLeu212、Asn215、及びVal213;
CH3C.35のTyr157と、TfR−ADのLeu212、Asn215、及びSer199;
CH3C.35のGln192と、TfR−ADのVal213及びLys158;ならびに
CH3C.35のPhe196と、TfR−ADのVal213及びLeu212との間で相互作用が認められた。
本実施例では、カニクイザルにおける本発明のCH3C変異体ポリペプチドを含むFc−Fab融合体の薬物動態学的/薬力学的研究(PK/PD)特性分析について述べる。
Ab122(コントロールIgGとしての抗RSV抗体)、Ab153(抗BACE1抗体)、Ab210(抗TfR/BACE1二重特異性抗体)、または、Ab153のFabドメインに融合させたCH3C変異体ポリペプチドを含むFc−Fab融合ポリペプチドの単一の30mg/kg用量を、2〜4歳の雄のカニクイザルに静脈内投与して血漿中PK、血漿中PD(Aβ40)、及び脳脊髄液(CSF)中PD(Aβ40)を29日間にわたって評価した(n=4/群)。ベースラインを確立するため、投与前のCSF及び血液試料を投与7日前に各動物から採取した。投与後、CSFをIT−Lカテーテルにより、投与の12、24、48、72、及び96時間後に、また、試験日の8、11、15、18、22、25、及び29日目にPD分析用に採取した。血液試料を、血漿及び血清中PK用に投与の0.25、1、6、12、24、72時間後、また、試験日の8、11、15、18、22、25、及び29日目に採取した。
ヒトIgGのPKアッセイ
カニクイザル血清中の抗体またはFc−Fab融合ポリペプチドの濃度を、ヒトIgG特異的サンドイッチELISAを用いて定量した。384ウェルMaxiSorpプレートに、ヒトIgGのFcに特異的な抗体を一晩コーティングした。血清試料を1:100、1:1,000、1:10,000、及び1:100,000に希釈し、ブロッキングしたプレートに加えた。検出抗体は、ポリクローナル抗ヒトIgGサル吸収抗体とした。各抗体またはFc−Fab融合ポリペプチドに対して個々に標準曲線を作成し(48〜200000pg/mLのIgG)、アッセイの血清中の定量下限(LLOQ)は20ng/mLである。
カニクイザルCSF中の可溶性のAPPα/β濃度を、MesoScale Discovery(MSD)multiplexキット(MSD#K15120E)を使用して測定した。2種類の異なる抗体がsAPPαまたはsAPPβのいずれかを特異的に捕捉し、次に、両方の被検物質を、SULFOタグで標識した抗APPマウスモノクローナル抗体で検出した。カニクイザルのAβ40濃度を、MSD ultra−sensitiveキット(MSD#K151FTE)を使用して測定した。このアッセイではhuAβ特異的6E10抗体を捕捉分子として使用し、ペプチドのC末端に対して特異的な抗Aβ40抗体を検出分子として用いた。いずれのアッセイも製造者の指示に従って行った。要約すると、予めコーティングしたプレートをMSD Blocker Aで1時間ブロッキングした。CSF試料を1:5に希釈し、ブロッキングしたプレートに二つ組で加えた後、4℃で一晩インキュベートした。次に、それぞれの検出抗体を加え、各プレートをSector S600装置で読み取った。標準曲線として0.92〜3750pg/mLのhuAβ40及び0.1〜100ng/mLのsAPPα/βの両方を、4パラメータロジスティック回帰を用いてフィッティングした。このアッセイでは、Aβ40のLLOQは73pg/mLであり、sAPPα/βでは0.5ng/mLであった。
投与後最初の7日間からの中間の血漿PKは、Ab210及びCH3C.35.9:Ab153で、それらの末梢におけるTfRに対する結合のため、予想された標的媒介性クリアランスを示した(図37(A))。Ab153及びAb210抗体の両方、ならびにCH3C.35.9:Ab153は、コントロールIgGと比較して血漿中Aβ40の顕著で持続的な低下をもたらし(図37(B))、これら3種類の分子のすべてが同程度にインビボのBACE1活性を阻害する能力を有することが確認された。CSF中では、Ab210及びCH3C.35.9:Ab153の両方が、コントロールIgGと比較してCSF中のAβ40及びsAPPβ/sAPPα比を、それぞれ約70%及び約75%にまで低下させる能力を有した(図38(A)及び38(B))。TfRに結合しない抗BACE1抗体であるAb153は、コントロールIgGと比較してCSF中のAβ40及びsAPPβ/sAPPα比に与えた影響は最小であった。これらの結果は、CH3C変異体ポリペプチド(例えば、クローンCH3C.35.9)によるTfRへの結合が、CH3C変異体ポリペプチドを抗BACE1抗体のFabドメインに融合させたFc−Fab融合体(例えば、CH3C.35.9:Ab153)のCNS中への浸透量を高めることによってCSF中のAβ40及びsAPPβ/sAPPαの生成を阻害することを示すものである。
本実施例では、変異M201L及びN207SがCH3C.35と両立することについて述べる。
本実施例では、CH3C.35.21の1アミノ酸変異体のライブラリーの構築について述べる。
CH3C.35.21の1アミノ酸置換をそれぞれが有するCH3C.35.21変異体のライブラリーを、Kunkel突然変異誘発法(Kunkel,Proc Natl Acad Sci U S A.82(2):488−92,1985)を用いて構築した。SEQ ID NO:1に従って番号付けした、CH3C.35.21の位置W153、Y157、T159、E160、W161、S162、S163、K165、T186、K187、E188、E189、F194、S197、及びS199(EU番号付けスキームに従って番号付けしたW380、Y384、T386、E387、W388、S389、S390、K392、T413、K414、E415、E416、F421、S424、及びS426)のそれぞれを、個々に縮重変異原性オリゴを使用してNNKコドンに変異させた。ライブラリー中に元のCH3C.35.21クローンが得られないように野生型IgG1をコードした一本鎖DNA(ssDNA)Kunkel鋳型を使用した。2種類の変異原性オリゴ(一方がNNKを有し、他方が他のCH3C.35.21領域をコードしたもの)を組み合わせて使用することで、両方のオリゴが組み込まれた場合にCH3C.35.21のアミノ酸配列を生じるが、所望のライブラリー位置にNNKコドンが組み込まれるようにした。鋳型は野生型Fcであるため、1個のオリゴが挿入されるかまたはオリゴが挿入されない場合にはTfRに結合せず、したがって、これらのコンストラクトは分析から容易に除外された。同様にNNK位置から生じた終止コトンも除外された。ライブラリーをEBY100酵母にトランスフェクトした。各ライブラリーから8個のコロニーをシークエンシングして、ナイーブライブラリーが所望の位置のランダム化を確実に含むようにした。
本実施例では、CH3C.18変異体のライブラリーの構築について述べる。
Claims (111)
- トランスフェリン受容体に特異的に結合するポリペプチドであって、SEQ ID NO:83、84、191、43、及び82のうちのいずれか1つの配列との少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含み、SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に153位にGlu、157位にTyrまたはPhe、159位にThr、160位にGlu、161位にTrp、162位にVal、Ser、またはAla、163位にAsn、186位にThrまたはSer、188位にGlu、189位にGlu、及び194位にPheを含む、前記ポリペプチド。
- SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に139位にTrpを更に含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に7位にAla、8位にAla、及び139位にTrpを更に含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に7位にAla、8位にAla、139位にTrp、201位にLeu、及び207位にSerを更に含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に139位にSer、141位にAla、及び180位にValを更に含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に7位にAla、8位にAla、139位にSer、141位にAla、及び180位にValを更に含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に7位にAla、8位にAla、139位にSer、141位にAla、180位にVal、201位にLeu、及び207位にSerを更に含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:83の配列との少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含み、SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に153位にGlu、157位にTyr、159位にThr、160位にGlu、161位にTrp、162位にVal、163位にAsn、186位にThr、188位にGlu、189位にGlu、及び194位にPheを含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に139位にTrpを更に含む、請求項8に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:133の配列を含む、請求項9に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に7位にAla、8位にAla、及び139位にTrpを更に含む、請求項8に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:134の配列を含む、請求項11に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に7位にAla、8位にAla、139位にTrp、201位にLeu、及び207位にSerを更に含む、請求項8に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:260の配列を含む、請求項13に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に139位にSer、141位にAla、及び180位にValを更に含む、請求項8に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:139の配列を含む、請求項15に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に7位にAla、8位にAla、139位にSer、141位にAla、及び180位にValを更に含む、請求項8に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:140の配列を含む、請求項17に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に7位にAla、8位にAla、139位にSer、141位にAla、180位にVal、201位にLeu、及び207位にSerを更に含む、請求項8に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:263の配列を含む、請求項19に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:84の配列との少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含み、SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に153位にGlu、157位にTyr、159位にThr、160位にGlu、161位にTrp、162位にSer、163位にAsn、186位にSer、188位にGlu、189位にGlu、及び194位にPheを含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に139位にTrpを更に含む、請求項21に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:145の配列を含む、請求項22に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に7位にAla、8位にAla、及び139位にTrpを更に含む、請求項21に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:146の配列を含む、請求項24に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に7位にAla、8位にAla、139位にTrp、201位にLeu、及び207位にSerを更に含む、請求項21に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:267の配列を含む、請求項26に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に139位にSer、141位にAla、及び180位にValを更に含む、請求項21に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:151の配列を含む、請求項28に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に7位にAla、8位にAla、139位にSer、141位にAla、及び180位にValを更に含む、請求項21に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:152の配列を含む、請求項30に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に7位にAla、8位にAla、139位にSer、141位にAla、180位にVal、201位にLeu、及び207位にSerを更に含む、請求項21に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:270の配列を含む、請求項32に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:191の配列との少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含み、SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に153位にGlu、157位にPhe、159位にThr、160位にGlu、161位にTrp、162位にSer、163位にAsn、186位にSer、188位にGlu、189位にGlu、及び194位にPheを含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に139位にTrpを更に含む、請求項34に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:232の配列を含む、請求項35に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に7位にAla、8位にAla、及び139位にTrpを更に含む、請求項34に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:233の配列を含む、請求項37に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に7位にAla、8位にAla、139位にTrp、201位にLeu、及び207位にSerを更に含む、請求項34に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:309の配列を含む、請求項39に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に139位にSer、141位にAla、及び180位にValを更に含む、請求項34に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:238の配列を含む、請求項41に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に7位にAla、8位にAla、139位にSer、141位にAla、及び180位にValを更に含む、請求項34に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:239の配列を含む、請求項43に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に7位にAla、8位にAla、139位にSer、141位にAla、180位にVal、201位にLeu、及び207位にSerを更に含む、請求項34に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:312の配列を含む、請求項45に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:43の配列との少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含み、SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に153位にGlu、157位にTyr、159位にThr、160位にGlu、161位にTrp、162位にSer、163位にAsn、186位にThr、188位にGlu、189位にGlu、及び194位にPheを含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に139位にTrpを更に含む、請求項47に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:169の配列を含む、請求項48に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に7位にAla、8位にAla、及び139位にTrpを更に含む、請求項47に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:170の配列を含む、請求項50に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に7位にAla、8位にAla、139位にTrp、201位にLeu、及び207位にSerを更に含む、請求項47に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:281の配列を含む、請求項52に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に139位にSer、141位にAla、及び180位にValを更に含む、請求項47に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:175の配列を含む、請求項54に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に7位にAla、8位にAla、139位にSer、141位にAla、及び180位にValを更に含む、請求項47に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:176の配列を含む、請求項56に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に7位にAla、8位にAla、139位にSer、141位にAla、180位にVal、201位にLeu、及び207位にSerを更に含む、請求項47に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:284の配列を含む、請求項58に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:82の配列との少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含み、SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に153位にGlu、157位にTyr、159位にThr、160位にGlu、161位にTrp、162位にAla、163位にAsn、186位にThr、188位にGlu、189位にGlu、及び194位にPheを含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に139位にTrpを更に含む、請求項60に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:121の配列を含む、請求項61に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に7位にAla、8位にAla、及び139位にTrpを更に含む、請求項60に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:122の配列を含む、請求項63に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に7位にAla、8位にAla、139位にTrp、201位にLeu、及び207位にSerを更に含む、請求項60に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:253の配列を含む、請求項65に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に139位にSer、141位にAla、及び180位にValを更に含む、請求項60に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:127の配列を含む、請求項67に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に7位にAla、8位にAla、139位にSer、141位にAla、及び180位にValを更に含む、請求項60に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:128の配列を含む、請求項69に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:1を基準として番号付けした場合に7位にAla、8位にAla、139位にSer、141位にAla、180位にVal、201位にLeu、及び207位にSerを更に含む、請求項60に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:256の配列を含む、請求項71に記載のポリペプチド。
- 前記配列のアミノ末端の最初の3個のアミノ酸「PCP」を含まない、請求項1〜72のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:347の配列を含む、トランスフェリン受容体に特異的に結合するポリペプチド。
- SEQ ID NO:348の配列を含む、トランスフェリン受容体に特異的に結合するポリペプチド。
- 抗体重鎖可変領域を更に含む、請求項1〜75のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- N末端からC末端にかけて、抗体重鎖可変領域、CH1ドメイン、ヒンジ領域、及び請求項1〜75のいずれか1項に記載のポリペプチドを含む、ポリペプチド。
- (a)請求項1〜77のいずれか1項に記載のポリペプチドを含む第1のFcポリペプチドと、
(b)(a)の第1のFcポリペプチドと二量体化することが可能な第2のFcポリペプチドと
を含む、Fcポリペプチド二量体またはその二量体フラグメント。 - TfR結合について一価である、請求項78に記載のFcポリペプチド二量体。
- 前記第2のFcポリペプチドが、SEQ ID NO:351〜356のうちのいずれか1つの配列を含む、請求項78または79に記載のFcポリペプチド二量体。
- 前記第1のFcポリペプチドが、SEQ ID NO:133、134、及び260のうちのいずれか1つの配列を含み、前記第2のFcポリペプチドが、SEQ ID NO:354〜356のうちのいずれか1つの配列を含む、請求項78〜80のいずれか1項に記載のFcポリペプチド二量体。
- 前記第1のFcポリペプチドが、SEQ ID NO:145、146、及び267のうちのいずれか1つの配列を含み、前記第2のFcポリペプチドが、SEQ ID NO:354〜356のうちのいずれか1つの配列を含む、請求項78〜80のいずれか1項に記載のFcポリペプチド二量体。
- 前記第1のFcポリペプチドが、SEQ ID NO:232、233、及び309のうちのいずれか1つの配列を含み、前記第2のFcポリペプチドが、SEQ ID NO:354〜356のうちのいずれか1つの配列を含む、請求項78〜80のいずれか1項に記載のFcポリペプチド二量体。
- 前記第1のFcポリペプチドが、SEQ ID NO:169、170、及び281のうちのいずれか1つの配列を含み、前記第2のFcポリペプチドが、SEQ ID NO:354〜356のうちのいずれか1つの配列を含む、請求項78〜80のいずれか1項に記載のFcポリペプチド二量体。
- 前記第1のFcポリペプチドが、SEQ ID NO:121、122、及び253のうちのいずれか1つの配列を含み、前記第2のFcポリペプチドが、SEQ ID NO:354〜356のうちのいずれか1つの配列を含む、請求項78〜80のいずれか1項に記載のFcポリペプチド二量体。
- 前記第1のFcポリペプチドが、SEQ ID NO:139、140、及び263のうちのいずれか1つの配列を含み、前記第2のFcポリペプチドが、SEQ ID NO:351〜353のうちのいずれか1つの配列を含む、請求項78〜80のいずれか1項に記載のFcポリペプチド二量体。
- 前記第1のFcポリペプチドが、SEQ ID NO:151、152、及び270のうちのいずれか1つの配列を含み、前記第2のFcポリペプチドが、SEQ ID NO:351〜353のうちのいずれか1つの配列を含む、請求項78〜80のいずれか1項に記載のFcポリペプチド二量体。
- 前記第1のFcポリペプチドが、SEQ ID NO:238、239、及び312のうちのいずれか1つの配列を含み、前記第2のFcポリペプチドが、SEQ ID NO:351〜353のうちのいずれか1つの配列を含む、請求項78〜80のいずれか1項に記載のFcポリペプチド二量体。
- 前記第1のFcポリペプチドが、SEQ ID NO:175、176、及び284のうちのいずれか1つの配列を含み、前記第2のFcポリペプチドが、SEQ ID NO:351〜353のうちのいずれか1つの配列を含む、請求項78〜80のいずれか1項に記載のFcポリペプチド二量体。
- 前記第1のFcポリペプチドが、SEQ ID NO:127、128、及び256のうちのいずれか1つの配列を含み、前記第2のFcポリペプチドが、SEQ ID NO:351〜353のうちのいずれか1つの配列を含む、請求項78〜80のいずれか1項に記載のFcポリペプチド二量体。
- (a)前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:134の配列を含み、かつ前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:355の配列を含むか、または、
(b)前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:134の配列を含み、かつ前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:356の配列を含むか、または、
(c)前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:260の配列を含み、かつ前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:355の配列を含むか、または、
(d)前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:260の配列を含み、かつ前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:356の配列を含むか、または、
(e)前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:140の配列を含み、かつ前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:352の配列を含むか、または、
(f)前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:140の配列を含み、かつ前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:353の配列を含むか、または、
(g)前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:263の配列を含み、かつ前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:352の配列を含むか、または、
(h)前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:263の配列を含み、かつ前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:353の配列を含む、
請求項78〜80のいずれか1項に記載のFcポリペプチド二量体。 - (a)前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:146の配列を含み、かつ前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:355の配列を含むか、または、
(b)前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:146の配列を含み、かつ前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:356の配列を含むか、または、
(c)前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:267の配列を含み、かつ前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:355の配列を含むか、または、
(d)前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:267の配列を含み、かつ前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:356の配列を含むか、または、
(e)前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:152の配列を含み、かつ前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:352の配列を含むか、または、
(f)前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:152の配列を含み、かつ前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:353の配列を含むか、または、
(g)前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:270の配列を含み、かつ前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:352の配列を含むか、または、
(h)前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:270の配列を含み、かつ前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:353の配列を含む、
請求項78〜80のいずれか1項に記載のFcポリペプチド二量体。 - (a)前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:233の配列を含み、かつ前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:355の配列を含むか、または、
(b)前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:233の配列を含み、かつ前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:356の配列を含むか、または、
(c)前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:309の配列を含み、かつ前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:355の配列を含むか、または、
(d)前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:309の配列を含み、かつ前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:356の配列を含むか、または、
(e)前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:239の配列を含み、かつ前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:352の配列を含むか、または、
(f)前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:239の配列を含み、かつ前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:353の配列を含むか、または、
(g)前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:312の配列を含み、かつ前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:352の配列を含むか、または、
(h)前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:312の配列を含み、かつ前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:353の配列を含む、
請求項78〜80のいずれか1項に記載のFcポリペプチド二量体。 - (a)前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:170の配列を含み、かつ前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:355の配列を含むか、または、
(b)前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:170の配列を含み、かつ前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:356の配列を含むか、または、
(c)前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:281の配列を含み、かつ前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:355の配列を含むか、または、
(d)前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:281の配列を含み、かつ前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:356の配列を含むか、または、
(e)前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:176の配列を含み、かつ前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:352の配列を含むか、または、
(f)前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:176の配列を含み、かつ前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:353の配列を含むか、または、
(g)前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:284の配列を含み、かつ前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:352の配列を含むか、または、
(h)前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:284の配列を含み、かつ前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:353の配列を含む、
請求項78〜80のいずれか1項に記載のFcポリペプチド二量体。 - (a)前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:122の配列を含み、かつ前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:355の配列を含むか、または、
(b)前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:122の配列を含み、かつ前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:356の配列を含むか、または、
(c)前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:253の配列を含み、かつ前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:355の配列を含むか、または、
(d)前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:253の配列を含み、かつ前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:356の配列を含むか、または、
(e)前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:128の配列を含み、かつ前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:352の配列を含むか、または、
(f)前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:128の配列を含み、かつ前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:353の配列を含むか、または、
(g)前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:256の配列を含み、かつ前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:352の配列を含むか、または、
(h)前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:256の配列を含み、かつ前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:353の配列を含む、
請求項78〜80のいずれか1項に記載のFcポリペプチド二量体。 - 前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:347の配列を含み、前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:350の配列を含む、請求項78〜80のいずれか1項に記載のFcポリペプチド二量体。
- 前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:348の配列を含み、前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:349の配列を含む、請求項78〜80のいずれか1項に記載のFcポリペプチド二量体。
- TfR結合について二価である、請求項78に記載のFcポリペプチド二量体。
- 前記第2のFcポリペプチドが、SEQ ID NO:347または348の配列を含む、請求項98に記載のFcポリペプチド二量体。
- 前記第1のFcポリペプチドがSEQ ID NO:347の配列を含み、前記第2のFcポリペプチドがSEQ ID NO:348の配列を含む、請求項98または99に記載のFcポリペプチド二量体。
- 前記第1のFcポリペプチド及び第2のFcポリペプチドが、同じTfR結合部位を含む、請求項98〜100のいずれか1項に記載のFcポリペプチド二量体。
- (a)抗原に結合することが可能な抗体可変領域、またはその抗原結合フラグメントと、
(b)請求項78〜101のいずれか1項に記載のFcポリペプチド二量体と
を含む、Fcポリペプチド二量体−Fab融合タンパク質。 - 前記抗体可変領域がFabドメインの一部を形成する、請求項102に記載のFcポリペプチド二量体−Fab融合タンパク質。
- 前記抗体可変領域が、2つの抗体重鎖可変領域及び2つの抗体軽鎖可変領域、またはそれらのそれぞれのフラグメントを含む、請求項102または103に記載のFcポリペプチド二量体−Fab融合タンパク質。
- 請求項1〜77のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
- 請求項105に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項105に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
- トランスフェリン受容体に特異的に結合するポリペプチドを作製するための方法であって、請求項105に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが発現される条件下で宿主細胞を培養することを含む、前記方法。
- 請求項1〜77のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項78〜101のいずれか1項に記載のFcポリペプチド二量体、または請求項102〜104のいずれか1項に記載のFcポリペプチド二量体−Fab融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
- 内皮を通過して組成物をトランスサイトーシスさせるための方法であって、前記内皮を、請求項1〜77のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項78〜101のいずれか1項に記載のFcポリペプチド二量体、または請求項102〜104のいずれか1項に記載のFcポリペプチド二量体−Fab融合タンパク質を含む組成物と接触させることを含む、前記方法。
- 前記内皮が血液脳関門(BBB)である、請求項110に記載の方法。
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