JP2021500857A - 酵素補充療法用酵素を含む融合タンパク質 - Google Patents

酵素補充療法用酵素を含む融合タンパク質 Download PDF

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Abstract

本発明で提供するのは、酵素補充療法用酵素及びＦｃ領域を含む融合タンパク質、ならびにそのようなタンパク質を用いて、リソソーム蓄積障害を治療する方法である。本発明では、血液脳関門を越えて、薬剤を輸送する方法も提供する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１７年１０月２日に提出された米国特許仮出願第６２／５６６，８９８号、２０１７年１１月８日に提出された米国特許仮出願第６２／５８３，２７６号、２０１８年２月５日に提出された米国特許仮出願第６２／６２６，３６５号、２０１８年５月３０日に提出された米国特許仮出願第６２／６７８，１８３号及び２０１８年８月２２日に提出された米国特許仮出願第６２／７２１，３９６号（それらの開示内容は、参照により、あらゆる目的で、その全体が本明細書に援用される）に基づく優先権を主張するものである。
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出したとともに、参照により、その全体が本明細書に援用される配列表を含む。２０１８年９月２８日に作成した前記ＡＳＣＩＩコピーは、１０２３４２−０００３５０ＰＣ−１１０３９４９＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、５８０，４６４バイトのサイズである。
リソソーム蓄積障害（ＬＳＤ）は、リソソーム機能の異常に起因する比較的希少な遺伝性代謝疾患である。ＬＳＤは典型的には、リソソームにおける代謝産物の分解に関与する１つの酵素の欠損を原因とする。酵素活性の欠損により、代謝産物が蓄積すると、様々な器官系に影響が及び、重篤な症状が生じて早期に死亡し得る。ＬＳＤの大半では、進行性神経変性及び重度の認知機能障害から、てんかん性障害、行動障害及び精神障害までに及ぶ顕著な神経的要素も見られる。ＬＳＤにおいて欠損している酵素の組み換え型を用いて、ＬＳＤを治療できるが、血液脳関門（ＢＢＢ）を越えて組み換え酵素を送達するのは困難であるために、そのような療法には、脳に対する作用があまりない場合がある。
本発明で提供するのは、酵素補充療法（ＥＲＴ）用酵素を含む融合タンパク質、及びリソソーム蓄積障害（ＬＳＤ）を治療する目的で、そのタンパク質を使用する方法である。
いくつかの態様では、本発明で提供するのは、
（ａ）ＥＲＴ用酵素、ＥＲＴ用酵素バリアントまたはその触媒活性断片に連結されている第１のＦｃポリペプチド、及び
（ｂ）第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する第２のＦｃポリペプチド
を含むタンパク質である。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖及び／または軽鎖可変領域配列、あるいはそれらの抗原結合部分を含まない。
いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、ＩＤＳバリアントまたはその触媒活性断片である。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、配列番号９１、９２、１１４、２３０及び２３４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、配列番号９１、９２、１１４、２３０及び２３４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、Ｎ−スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）、ＳＧＳＨバリアントまたはその触媒活性断片である。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、配列番号１１９及び１２０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、配列番号１１９及び１２０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）、ＡＳＭバリアントまたはその触媒活性断片である。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、配列番号１２１、１２２及び１２３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、配列番号１２１、１２２及び１２３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、β−グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）、ＧＢＡバリアントまたはその触媒活性断片である。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、配列番号９３及び９４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、配列番号９３及び９４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、そのＥＲＴ用酵素、ＥＲＴ用酵素バリアントまたはその触媒活性断片に、ペプチド結合またはポリペプチドリンカーによって連結されている融合ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、そのポリペプチドリンカーは、フレキシブルポリペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、そのフレキシブルポリペプチドリンカーは、グリシンリッチリンカーである。いくつかの実施形態では、そのグリシンリッチリンカーは、Ｇ４Ｓ（配列番号２３９）または（Ｇ４Ｓ）２（配列番号２４０）である。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、化学架橋剤によっては、そのＥＲＴ用酵素、ＥＲＴ用酵素バリアントまたはその触媒活性断片に連結されておらず、例えば、その融合ポリペプチドは、非ペプチド結合または非ポリペプチドリンカーを含まない。
ある特定の実施形態では、その融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の順に、そのＥＲＴ用酵素、ＥＲＴ用酵素バリアントまたはその触媒活性断片、そのポリペプチドリンカー、及び第１のＦｃポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、その第２のＦｃポリペプチドは、そのＥＲＴ用酵素、ＥＲＴ用酵素バリアントまたはその触媒活性断片に連結されている。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、そのＥＲＴ用酵素、ＥＲＴ用酵素バリアントまたはその触媒活性断片に、ペプチド結合またはポリペプチドリンカーによって連結されている融合ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、そのポリペプチドリンカーは、フレキシブルポリペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、そのフレキシブルポリペプチドリンカーは、グリシンリッチリンカーである。いくつかの実施形態では、そのグリシンリッチリンカーは、Ｇ４Ｓ（配列番号２３９）または（Ｇ４Ｓ）２（配列番号２４０）である。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、化学架橋剤によっては、そのＥＲＴ用酵素、ＥＲＴ用酵素バリアントまたはその触媒活性断片に連結されておらず、例えば、その融合ポリペプチドは、非ペプチド結合または非ポリペプチドリンカーを含まない。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端及び／または第２のＦｃポリペプチドのＮ末端が、ＥＲＴ用酵素に連結されている。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端は、一方のＥＲＴ用酵素に連結されており、第２のＦｃポリペプチドのＮ末端は、もう一方のＥＲＴ用酵素に連結されている。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドのＣ末端及び／または第２のＦｃポリペプチドのＣ末端が、ＥＲＴ用酵素に連結されている。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドのＣ末端は、一方のＥＲＴ用酵素に連結されており、第２のＦｃポリペプチドのＣ末端は、もう一方のＥＲＴ用酵素に連結されている。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端は、一方のＥＲＴ用酵素に連結されており、第２のＦｃポリペプチドのＣ末端は、もう一方のＥＲＴ用酵素に連結されている。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドのＣ末端は、一方のＥＲＴ用酵素に連結されており、第２のＦｃポリペプチドのＮ末端は、もう一方のＥＲＴ用酵素に連結されている。
いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質は、１つのＥＲＴ用酵素を含み、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端またはＣ末端が、そのＥＲＴ用酵素に連結されている。いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質は、２つのＥＲＴ用酵素（例えば、きっかり２つのＥＲＴ用酵素）を含む。いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質は、きっかり１つまたはきっかり２つのＥＲＴ用酵素、酵素バリアントまたはその触媒活性断片を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、改変Ｆｃポリペプチドであり、及び／または第２のＦｃポリペプチドは、改変Ｆｃポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドはそれぞれ、ヘテロ二量化を促す改変を含む。いくつかの実施形態では、そのＦｃ二量体は、Ｆｃヘテロ二量体である。いくつかの実施形態では、ＥＵナンバリングによれば、そのＦｃポリペプチドのうちの一方は、Ｔ３６６Ｗという置換を有し、もう一方のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖという置換を有する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖという置換を含み、第２のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｗという置換を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＥＲＴ用酵素ＩＤＳに連結されており、配列番号１１７、２３２及び２３６のうちの１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｗという置換を含み、第２のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖという置換を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＥＲＴ用酵素ＩＤＳに連結されており、配列番号１１８、２３３及び２３７のうちの１つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、天然型ＦｃＲｎ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドは、エフェクター機能を有さない。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、エフェクター機能を低下させる改変を含む。いくつかの実施形態では、エフェクター機能を低下させる改変は、ＥＵナンバリングによれば、２３４位のＡｌａ及び２３５位のＡｌａへの置換である。いくつかの実施形態では、エフェクター機能を低下させる改変は、ＥＵナンバリングによれば、３２９位のＧｌｙへの置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＥＲＴ用酵素ＩＤＳに連結されており、配列番号１１５、２３１及び２３５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＥＲＴ用酵素ＳＧＳＨに連結されており、配列番号１４９、１５０、１５２及び１５３のうちの１つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、天然型Ｆｃ配列に対するアミノ酸変化であって、血清中半減期を延長するアミノ酸変化を含む。いくつかの実施形態では、そのアミノ酸変化は、ＥＵナンバリングによれば、２５２位のＴｙｒ、２５４位のＴｈｒ及び２５６位のＧｌｕへの置換を含む。あるいは、別の実施形態では、そのアミノ酸変化は、ＥＵナンバリングによれば、４２８位のＬｅｕ及び４３４位のＳｅｒへの置換を含む。あるいは、さらなる実施形態では、そのアミノ酸変化は、ＥＵナンバリングによれば、４３４位のＳｅｒまたはＡｌａへの置換を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＥＵナンバリングによれば、３８４位、３８６位、３８７位、３８８位、３８９位、３９０位、４１３位、４１６位及び４２１位からなる群から選択した位置の少なくとも２つの置換を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、それらの位置の少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個または９個の置換を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＥＵナンバリングによれば、３８０位、３９１位、３９２位及び４１５位を含む位置の１個、２個、３個または４個の置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＥＵナンバリングによれば、４１４位、４２４位及び４２６位を含む位置の１個、２個または３個の置換をさらに含む。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、３８８位にＴｒｐを含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、４２１位に芳香族アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、４２１位の芳香族アミノ酸は、ＴｒｐまたはＰｈｅである。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、Ｔｒｐ、ＬｅｕまたはＧｌｕである３８０位、ＴｙｒまたはＰｈｅである３８４位、Ｔｈｒである３８６位、Ｇｌｕである３８７位、Ｔｒｐである３８８位、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＶａｌまたはＡｓｎである３８９位、ＳｅｒまたはＡｓｎである３９０位、ＴｈｒまたはＳｅｒである４１３位、ＧｌｕまたはＳｅｒである４１５位、Ｇｌｕである４１６位、及びＰｈｅである４２１位から選択した少なくとも１つの位置を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、Ｔｒｐ、ＬｅｕまたはＧｌｕである３８０位、ＴｙｒまたはＰｈｅである３８４位、Ｔｈｒである３８６位、Ｇｌｕである３８７位、Ｔｒｐである３８８位、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＶａｌまたはＡｓｎである３８９位、ＳｅｒまたはＡｓｎである３９０位、ＴｈｒまたはＳｅｒである４１３位、ＧｌｕまたはＳｅｒである４１５位、Ｇｌｕである４１６位、及びＰｈｅである４２１位から選択した２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個または１１個の位置を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、Ｔｒｐ、ＬｅｕまたはＧｌｕである３８０位、ＴｙｒまたはＰｈｅである３８４位、Ｔｈｒである３８６位、Ｇｌｕである３８７位、Ｔｒｐである３８８位、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＶａｌまたはＡｓｎである３８９位、ＳｅｒまたはＡｓｎである３９０位、ＴｈｒまたはＳｅｒである４１３位、ＧｌｕまたはＳｅｒである４１５位、Ｇｌｕである４１６位、及びＰｈｅである４２１位という１１個の位置を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３４〜３８、５８、６０〜９０、１５１及び１５６〜２２９のうちのいずれか１つの１１１〜２１７位のアミノ酸と、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有するＣＨ３ドメインを有する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、配列番号１５６〜２２９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、配列番号３４〜３８、５８、６０〜９０、１５１及び１５６〜２２９のうちのいずれか１つの、ＥＵインデックスで３８０位、３８４位、３８６位、３８７位、３８８位、３８９位、３９０位、３９１位、３９２位、４１３位、４１４位、４１５位、４１６位、４２１位、４２４位及び４２６位に対応する位置の少なくとも５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個または１６個の残基は、欠失または置換されていない。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、配列番号１５７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、配列番号１６９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、配列番号１８１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、配列番号１９３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、配列番号２０５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、配列番号２１７のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号１１５のアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号２０５及び２２８のうちのいずれか１つ（例えば配列番号２２８）のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号１１５のアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号１６９及び２２９のうちのいずれか１つ（例えば配列番号２２９）のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号２３１のアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号２０５及び２２８のうちのいずれか１つ（例えば配列番号２２８）のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号２３１のアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号１６９及び２２９のうちのいずれか１つ（例えば配列番号２２９）のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号２３５のアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号２０５及び２２８のうちのいずれか１つ（例えば配列番号２２８）のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号２３５のアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号１６９及び２２９のうちのいずれか１つ（例えば配列番号２２９）のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＴｆＲのアピカルドメインに結合する。いくつかの実施形態では、そのタンパク質のＴｆＲへの結合によって、トランスフェリンのＴｆＲへの結合は実質的に阻害されない。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、対応する野生型Ｆｃポリペプチドに対するアミノ酸配列同一性が少なくとも７５％、または少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％もしくは９５％である。いくつかの実施形態では、その対応する野生型Ｆｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＦｃポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、ＥＲＴ用酵素の脳への取り込み（例えば、本明細書に記載されているような適切な動物モデルを用いる）は、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドの非存在下におけるＥＲＴ用酵素の取り込み、あるいは第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドへの改変であって、ＴｆＲへの結合をもたらす改変を行わなかった場合のＥＲＴ用酵素の取り込みよりも多い。いくつかの実施形態では、ＥＲＴ用酵素の脳への取り込みは、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドの非存在下におけるＥＲＴ用酵素の取り込みと比べて、あるいは第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドへの改変であって、ＴｆＲへの結合をもたらす改変を行わなかった場合のＥＲＴ用酵素の取り込みと比べて、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍または１００倍多い。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、血液脳関門（ＢＢＢ）受容体に結合するようには改変されておらず、第２のＦｃポリペプチドは、ＴｆＲに特異的に結合するように改変されている。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＴｆＲに特異的に結合するように改変されており、第２のＦｃポリペプチドは、ＢＢＢ受容体に結合するようには改変されていない。
いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質は、免疫グロブリン重鎖及び／または軽鎖可変領域配列、あるいはそれらの抗原結合部分を含まない。
いくつかの態様では、本発明で提供するのは、ＥＲＴ用酵素、ＥＲＴ用酵素バリアントまたはその触媒活性断片に連結されているＦｃポリペプチドを含むポリペプチドであって、そのＦｃポリペプチドが、別のＦｃポリペプチドとのヘテロ二量化を促す１つ以上の改変を含むポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、ＩＤＳ、ＩＤＳバリアントまたはその触媒活性断片である。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、配列番号９１、９２、１１４、２３０及び２３４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、配列番号９１、９２、１１４、２３０及び２３４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、ＳＧＳＨ、ＳＧＳＨバリアントまたはその触媒活性断片である。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、配列番号１１９及び１２０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、配列番号１１９及び１２０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、ＡＳＭ、ＡＳＭバリアントまたはその触媒活性断片である。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、配列番号１２１、１２２及び１２３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、配列番号１２１、１２２及び１２３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、ＧＢＡ、ＧＢＡバリアントまたはその触媒活性断片である。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、配列番号９３及び９４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、配列番号９３及び９４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、そのＦｃポリペプチドは、ＥＲＴ用酵素、ＥＲＴ用酵素バリアントまたはその触媒活性断片に、ペプチド結合またはポリペプチドリンカーによって連結されている融合ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、そのポリペプチドリンカーは、フレキシブルポリペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、そのフレキシブルポリペプチドリンカーは、グリシンリッチリンカーである。いくつかの実施形態では、そのグリシンリッチリンカーは、Ｇ４Ｓ（配列番号２３９）または（Ｇ４Ｓ）２（配列番号２４０）である。いくつかの実施形態では、そのＦｃポリペプチドは、化学架橋剤によっては、ＥＲＴ用酵素、ＥＲＴ用酵素バリアントまたはその触媒活性断片に連結されておらず、例えば、その融合ポリペプチドは、非ペプチド結合または非ポリペプチドリンカーを含まない。
ある特定の実施形態では、その融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の順に、ＥＲＴ用酵素、ＥＲＴ用酵素バリアントまたはその触媒活性断片、ポリペプチドリンカー、及び第１のＦｃポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、そのＦｃポリペプチドは、ＥＵナンバリングによれば、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖという置換を含む。いくつかの実施形態では、そのポリペプチドは、配列番号１１５、１１７、２３１、２３２、２３５及び２３６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、そのポリペプチドは、配列番号１４９及び１５０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｗという置換を含む。いくつかの実施形態では、そのポリペプチドは、配列番号１１８、２３３及び２３７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、そのポリペプチドは、配列番号１５２〜１５５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、そのポリペプチドは、もう一方のＦｃポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、そのもう一方のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｗという置換を含むか、またはＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖという置換を含み、ＥＲＴ用酵素−Ｆｃ融合ポリペプチドとＦｃ二量体を形成する。
いくつかの実施形態では、そのＦｃポリペプチドは、天然型ＦｃＲｎ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、そのＦｃポリペプチドは、エフェクター機能を有さない。いくつかの実施形態では、そのＦｃポリペプチドは、エフェクター機能を低下させる改変を含む。いくつかの実施形態では、エフェクター機能を低下させる改変は、ＥＵナンバリングによれば、２３４位のＡｌａ及び２３５位のＡｌａへの置換である。いくつかの実施形態では、エフェクター機能を低下させる改変は、ＥＵナンバリングによれば、３２９位のＧｌｙへの置換をさらに含む。
いくつかの実施形態では、そのＦｃポリペプチドは、天然型Ｆｃ配列に対するアミノ酸変化であって、血清中半減期を延長するアミノ酸変化を含む。いくつかの実施形態では、そのアミノ酸変化は、ＥＵナンバリングによれば、２５２位のＴｙｒ、２５４位のＴｈｒ及び２５６位のＧｌｕへの置換を含む。
いくつかの実施形態では、そのＦｃポリペプチドは、ＴｆＲに特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＦｃポリペプチドは、ＥＵナンバリングによれば、３８４位、３８６位、３８７位、３８８位、３８９位、３９０位、４１３位、４１６位及び４２１位からなる群から選択した位置の少なくとも２つの置換を含む。いくつかの実施形態では、そのＦｃポリペプチドは、それらの位置における少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個または９個の置換を含む。
いくつかの実施形態では、そのＦｃポリペプチドは、ＥＵナンバリングによれば、３８０位、３９１位、３９２位及び４１５位を含む位置における１個、２個、３個または４個の置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、そのＦｃポリペプチドは、ＥＵナンバリングによれば、４１４位、４２４位及び４２６位を含む位置における１個、２個または３個の置換をさらに含む。
いくつかの実施形態では、そのＦｃポリペプチドは、３８８位にＴｒｐを含む。いくつかの実施形態では、そのＦｃポリペプチドは、４２１位に芳香族アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、４２１位の芳香族アミノ酸は、ＴｒｐまたはＰｈｅである。
いくつかの実施形態では、そのＦｃポリペプチドは、Ｔｒｐ、ＬｅｕまたはＧｌｕである３８０位、ＴｙｒまたはＰｈｅである３８４位、Ｔｈｒである３８６位、Ｇｌｕである３８７位、Ｔｒｐである３８８位、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＶａｌまたはＡｓｎである３８９位、ＳｅｒまたはＡｓｎである３９０位、ＴｈｒまたはＳｅｒである４１３位、ＧｌｕまたはＳｅｒである４１５位、Ｇｌｕである４１６位、及びＰｈｅである４２１位から選択した少なくとも１つの位置を含む。
いくつかの実施形態では、そのＦｃポリペプチドは、Ｔｒｐ、ＬｅｕまたはＧｌｕである３８０位、ＴｙｒまたはＰｈｅである３８４位、Ｔｈｒである３８６位、Ｇｌｕである３８７位、Ｔｒｐである３８８位、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＶａｌまたはＡｓｎである３８９位、ＳｅｒまたはＡｓｎである３９０位、ＴｈｒまたはＳｅｒである４１３位、ＧｌｕまたはＳｅｒである４１５位、Ｇｌｕである４１６位、及びＰｈｅである４２１位から選択した２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個または１１個の位置を含む。
いくつかの実施形態では、そのＦｃポリペプチドは、Ｔｒｐ、ＬｅｕまたはＧｌｕである３８０位、ＴｙｒまたはＰｈｅである３８４位、Ｔｈｒである３８６位、Ｇｌｕである３８７位、Ｔｒｐである３８８位、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＶａｌまたはＡｓｎである３８９位、ＳｅｒまたはＡｓｎである３９０位、ＴｈｒまたはＳｅｒである４１３位、ＧｌｕまたはＳｅｒである４１５位、Ｇｌｕである４１６位、及びＰｈｅである４２１位という１１個の位置を含む。
いくつかの実施形態では、そのＦｃポリペプチドは、配列番号３４〜３８、５８及び６０〜９０のうちのいずれか１つの１１１〜２１７位のアミノ酸と、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有するＣＨ３ドメインを有する。いくつかの実施形態では、配列番号３４〜３８、５８及び６０〜９０のうちのいずれかの１つの、ＥＵインデックスで３８０位、３８４位、３８６位、３８７位、３８８位、３８９位、３９０位、３９１位、３９２位、４１３位、４１４位、４１５位、４１６位、４２１位、４２４位及び４２６位に対応する位置のうちの少なくとも５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個または１６個の残基は、欠失または置換されていない。
いくつかの実施形態では、そのＦｃポリペプチドは、ＴｆＲのアピカルドメインに結合する。いくつかの実施形態では、そのタンパク質のＴｆＲへの結合によって、トランスフェリンのＴｆＲへの結合は実質的に阻害されない。
いくつかの実施形態では、そのＦｃポリペプチドは、対応する野生型Ｆｃポリペプチドに対するアミノ酸配列同一性が少なくとも７５％、または少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％もしくは９５％である。いくつかの実施形態では、対応する野生型Ｆｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＦｃポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、そのＦｃポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖及び／または軽鎖可変領域配列、あるいはそれらの抗原結合部分を含まない。
いくつかの実施形態では、本発明で提供するのは、ＥＲＴ用酵素、ＥＲＴ用酵素バリアントまたはその触媒活性断片に連結されているＦｃポリペプチドを含むポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、そのＦｃポリペプチドが、別のＦｃポリペプチドとのヘテロ二量化を促す１つ以上の改変を含むポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本発明で提供するのは、そのポリヌクレオチドを含むベクターである。いくつかの実施形態では、本発明で提供するのは、そのポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞である。いくつかの実施形態では、その宿主細胞は、もう１つのＦｃポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、本発明で提供するのは、本明細書に記載されているポリペプチドの作製方法であって、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを発現させる条件で、宿主細胞を培養することを含む方法である。
いくつかの態様では、本発明で提供するのは、
（ａ）ＴｆＲに特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチドを含む第１のポリペプチド鎖、
（ｂ）Ｆｃポリペプチドを含む第２のポリペプチド鎖（第１及び第２のポリペプチド鎖は、Ｆｃ二量体を形成する）、ならびに
（ｃ）（ａ）の改変Ｆｃポリペプチドまたは（ｂ）のＦｃポリペプチドに連結されているＥＲＴ用酵素、ＥＲＴ用酵素バリアントまたはその触媒活性断片
を含むタンパク質である。
いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、ＩＤＳ、ＩＤＳバリアントまたはその触媒活性断片である。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、配列番号９１、９２、１１４、２３０及び２３４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、配列番号９１、９２、１１４、２３０及び２３４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、ＳＧＳＨ、ＳＧＳＨバリアントまたはその触媒活性断片である。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、配列番号１１９及び１２０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、配列番号１１９及び１２０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、ＡＳＭ、ＡＳＭバリアントまたはその触媒活性断片である。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、配列番号１２１、１２２及び１２３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、配列番号１２１、１２２及び１２３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、ＧＢＡ、ＧＢＡバリアントまたはその触媒活性断片である。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、配列番号９３及び９４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、配列番号９３及び９４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、（ａ）の改変Ｆｃポリペプチドに連結されている。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、（ｂ）のＦｃポリペプチドに連結されている。いくつかの実施形態では、（ｂ）のＦｃポリペプチドは、ＢＢＢ受容体に結合するようには改変されていない。いくつかの実施形態では、（ｂ）のＦｃポリペプチドは、ＴｆＲに特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、（ａ）の改変Ｆｃポリペプチドまたは（ｂ）のＦｃポリペプチドに、ペプチド結合またはポリペプチドリンカーによって連結（例えば融合）されて、融合ポリペプチドを形成している。いくつかの実施形態では、そのポリペプチドリンカーは、フレキシブルポリペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、そのフレキシブルポリペプチドリンカーは、グリシンリッチリンカーである。いくつかの実施形態では、そのグリシンリッチリンカーは、Ｇ４Ｓ（配列番号２３９）または（Ｇ４Ｓ）２（配列番号２４０）である。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、化学架橋剤によっては、（ａ）の改変Ｆｃポリペプチドまたは（ｂ）のＦｃポリペプチドに連結されておらず、例えば、その融合ポリペプチドは、非ペプチド結合または非ポリペプチドリンカーを含まない。
いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、（ａ）の改変ＦｃポリペプチドのＮ末端または（ｂ）のＦｃポリペプチドのＮ末端に連結されている。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、（ａ）の改変ＦｃポリペプチドのＣ末端または（ｂ）のＦｃポリペプチドのＣ末端に連結されている。
いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質は、２つのＥＲＴ用酵素を含む。いくつかの実施形態では、一方のＥＲＴ用酵素は、（ａ）の改変Ｆｃポリペプチドに連結されており、もう一方のＥＲＴ用酵素は、（ｂ）のＦｃポリペプチドに連結されている。いくつかの実施形態では、それらのＥＲＴ用酵素はいずれも、それぞれのＦｃポリペプチドのＮ末端に連結されているか、またはそれぞれのＦｃポリペプチドのＣ末端に連結されている。いくつかの実施形態では、一方のＥＲＴ用酵素は、（ａ）の改変ＦｃポリペプチドのＮ末端に連結されており、もう一方のＥＲＴ用酵素は、（ｂ）のＦｃポリペプチドのＣ末端に連結されている。いくつかの実施形態では、一方のＥＲＴ用酵素は、（ａ）の改変ＦｃポリペプチドのＣ末端に連結されており、もう一方のＥＲＴ用酵素は、（ｂ）のＦｃポリペプチドのＮ末端に連結されている。
いくつかの実施形態では、（ａ）及び（ｂ）のＦｃポリペプチドはそれぞれ、ヘテロ二量化を促す改変を含む。いくつかの実施形態では、ＥＵナンバリングによれば、Ｆｃポリペプチドの一方は、Ｔ３６６Ｗという置換を有し、もう一方のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖという置換を有する。いくつかの実施形態では、（ａ）の改変Ｆｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｗという置換を含み、（ｂ）のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖという置換を含む。いくつかの実施形態では、（ｂ）のＦｃポリペプチドは、ＥＲＴ用酵素ＩＤＳに連結されており、配列番号１１７、２３２及び２３６のうちの１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、（ａ）の改変Ｆｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖという置換を含み、（ｂ）のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｗという置換を含む。いくつかの実施形態では、（ｂ）のＦｃポリペプチドは、ＥＲＴ用酵素ＩＤＳに連結されており、配列番号１１８、２３３及び２３７のうちの１つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、（ａ）の改変Ｆｃポリペプチド及び／または（ｂ）のＦｃポリペプチドは、天然型ＦｃＲｎ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、（ａ）の改変Ｆｃポリペプチド及び（ｂ）のＦｃポリペプチドは、エフェクター機能を有さない。いくつかの実施形態では、（ａ）の改変Ｆｃポリペプチド及び／または（ｂ）のＦｃポリペプチドは、エフェクター機能を低下させる改変を含む。いくつかの実施形態では、エフェクター機能を低下させる改変は、ＥＵナンバリングによれば、２３４位のＡｌａ及び２３５位のＡｌａへの置換である。いくつかの実施形態では、エフェクター機能を低下させる改変は、ＥＵナンバリングによれば、３２９位のＧｌｙへの置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、（ｂ）のＦｃポリペプチドは、ＥＲＴ用酵素ＩＤＳに連結されており、配列番号１１５、２３１及び２３５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、（ｂ）のＦｃポリペプチドは、ＥＲＴ用酵素ＳＧＳＨに連結されており、配列番号１４９、１５０、１５２及び１５３のうちの１つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、（ａ）の改変Ｆｃポリペプチド及び／または（ｂ）のＦｃポリペプチドは、天然型Ｆｃ配列に対するアミノ酸変化であって、血清中半減期を延長するアミノ酸変化を含む。いくつかの実施形態では、そのアミノ酸変化は、ＥＵナンバリングによれば、２５２位のＴｙｒ、２５４位のＴｈｒ及び２５６位のＧｌｕへの置換を含む。
いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵナンバリングによれば、３８４位、３８６位、３８７位、３８８位、３８９位、３９０位、４１３位、４１６位及び４２１位からなる群から選択した位置における少なくとも２つの置換を含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、それらの位置における少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個または９個の置換を含む。
いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵナンバリングによれば、３８０位、３９１位、３９２位及び４１５位を含む位置における１個、２個、３個または４個の置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵナンバリングによれば、４１４位、４２４位及び４２６位を含む位置における１個、２個または３個の置換をさらに含む。
いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、３８８位にＴｒｐを含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、４２１位に芳香族アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、４２１位の芳香族アミノ酸は、ＴｒｐまたはＰｈｅである。
いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、Ｔｒｐ、ＬｅｕまたはＧｌｕである３８０位、ＴｙｒまたはＰｈｅである３８４位、Ｔｈｒである３８６位、Ｇｌｕである３８７位、Ｔｒｐである３８８位、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＶａｌまたはＡｓｎである３８９位、ＳｅｒまたはＡｓｎである３９０位、ＴｈｒまたはＳｅｒである４１３位、ＧｌｕまたはＳｅｒである４１５位、Ｇｌｕである４１６位、及びＰｈｅである４２１位から選択した少なくとも１つの位置を含む。
いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、Ｔｒｐ、ＬｅｕまたはＧｌｕである３８０位、ＴｙｒまたはＰｈｅである３８４位、Ｔｈｒである３８６位、Ｇｌｕである３８７位、Ｔｒｐである３８８位、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＶａｌまたはＡｓｎである３８９位、ＳｅｒまたはＡｓｎである３９０位、ＴｈｒまたはＳｅｒである４１３位、ＧｌｕまたはＳｅｒである４１５位、Ｇｌｕである４１６位、及びＰｈｅである４２１位から選択した２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個または１１個の位置を含む。
いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、Ｔｒｐ、ＬｅｕまたはＧｌｕである３８０位、ＴｙｒまたはＰｈｅである３８４位、Ｔｈｒである３８６位、Ｇｌｕである３８７位、Ｔｒｐである３８８位、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＶａｌまたはＡｓｎである３８９位、ＳｅｒまたはＡｓｎである３９０位、ＴｈｒまたはＳｅｒである４１３位、ＧｌｕまたはＳｅｒである４１５位、Ｇｌｕである４１６位、及びＰｈｅである４２１位という１１個の位置を含む。
いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号３４〜３８、５８、６０〜９０、１５１及び１５６〜２２９のうちのいずれか１つの１１１〜２１７位のアミノ酸と、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有するＣＨ３ドメインを有する。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１５６〜２２９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、配列番号３４〜３８、５８、６０〜９０、１５１及び１５６〜２２９のうちのいずれか１つの、ＥＵインデックスで３８０位、３８４位、３８６位、３８７位、３８８位、３８９位、３９０位、３９１位、３９２位、４１３位、４１４位、４１５位、４１６位、４２１位、４２４位及び４２６位に対応する位置の少なくとも５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個または１６個の残基は、欠失または置換されていない。
いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１５７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１６９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１８１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１９３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号２０５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号２１７のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２０５及び２２８のうちのいずれか１つ（例えば配列番号２２８）のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号１６９及び２２９のうちのいずれか１つ（例えば配列番号２２９）のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２０５及び２２８のうちのいずれか１つ（例えば配列番号２２８）のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２３１のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号１６９及び２２９のうちのいずれか１つ（例えば配列番号２２９）のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２３１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２０５及び２２８のうちのいずれか１つ（例えば配列番号２２８）のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２３５のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号１６９及び２２９のうちのいずれか１つ（例えば配列番号２２９）のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２３５のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、ＴｆＲのアピカルドメインに結合する。いくつかの実施形態では、そのタンパク質のＴｆＲへの結合によって、トランスフェリンのＴｆＲへの結合は実質的に阻害されない。
いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、対応する野生型Ｆｃポリペプチドに対するアミノ酸配列同一性が少なくとも７５％、または少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％もしくは９５％である。いくつかの実施形態では、その対応する野生型Ｆｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＦｃポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、ＥＲＴ用酵素の脳への取り込み（例えば、本明細書に記載されているような適切な動物モデルを用いる）は、本発明のＦｃポリペプチドの非存在下におけるＥＲＴ用酵素の取り込み、またはそのＦｃポリペプチドへの改変であって、ＴｆＲへの結合をもたらす改変を行わなかった場合のＥＲＴ用酵素の取り込みよりも多い。いくつかの実施形態では、ＥＲＴ用酵素の脳への取り込みは、本発明のＦｃポリペプチドの非存在下におけるＥＲＴ用酵素の取り込み、またはそのＦｃポリペプチドへの改変であって、ＴｆＲへの結合をもたらす改変を行わなかった場合のＥＲＴ用酵素の取り込みと比べて、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍または１００倍多い。
いくつかの態様では、本発明で提供するのは、ＬＳＤの治療方法であって、治療の必要な患者に、上記のようなタンパク質またはポリペプチドを投与することを含む方法である。いくつかの実施形態では、その方法は、その患者における毒性代謝産物の蓄積を低減し、例えば、患者の脳及び／または脳脊髄液（ＣＳＦ）内の毒性代謝産物を低減する。
関連する態様では、本発明で提供するのは、ＬＳＤ患者における毒性代謝産物の蓄積の低減方法であって、その患者に、上記のようなタンパク質またはポリペプチドを投与することを含む方法である。いくつかの実施形態では、その方法は、その患者の脳及び／またはＣＳＦ内の毒性代謝産物の蓄積を低減する。
いくつかの実施形態では、そのＬＳＤは、ハンター症候群であり、そのＥＲＴ用酵素は、ＩＤＳである。いくつかの実施形態では、その毒性代謝産物は、ヘパラン硫酸由来の二糖及び／またはデルマタン硫酸由来の二糖を含む。
いくつかの実施形態では、そのＬＳＤは、サンフィリポ症候群Ａであり、そのＥＲＴ用酵素は、ＳＧＳＨである。いくつかの実施形態では、その毒性代謝産物は、ヘパラン硫酸由来のオリゴ糖（例えば六糖）を含む。
いくつかの実施形態では、そのＬＳＤは、ニーマンピック病であり、そのＥＲＴ用酵素は、ＡＳＭである。いくつかの実施形態では、その毒性代謝産物は、スフィンゴミエリンを含む。
いくつかの実施形態では、そのＬＳＤは、ゴーシェ病またはパーキンソン病であり、そのＥＲＴ用酵素は、ＧＢＡである。いくつかの実施形態では、その毒性代謝産物は、グルコシルセラミドを含む。
いくつかの実施形態では、毒性代謝産物の総量は、本発明のタンパク質またはポリペプチドの非存在下における毒性代謝産物の総量と比べて、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％減少する。ＥＲＴ用酵素の活性及び基質の蓄積を測定するための例示的なアッセイは、本明細書に記載されている。
いくつかの態様では、本発明で提供するのは、上記のようなタンパク質またはポリペプチド及び製薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物である。
いくつかの態様では、本発明で提供するのは、基質の蓄積をモニタリングして、ＩＤＳ活性を評価する方法であって、
（ａ）上記のようなタンパク質またはポリペプチドを投与された対象に由来する細胞試料もしくは組織試料中の細胞、または流体試料中のマイクロベシクルを破壊して、マイクロベシクルを破壊して開いて、解析対象のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）溶液を得ることと、
（ｂ）そのＧＡＧ溶液を少なくとも１つのヘパリナーゼ（例えば、ヘパリナーゼＩ、ヘパリナーゼＩＩ及びヘパリナーゼＩＩＩ）、ならびにコンドロイチナーゼＢで消化して、ＧＡＧ由来の二糖を得ることと、
（ｃ）そのＧＡＧ由来の二糖を質量分析法（例えばＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって解析することと、
（ｄ）ヘパラン硫酸由来及び／またはデルマタン硫酸由来の二糖のレベルを求めることであって、ＩＤＳ活性が欠損しているコントロールと比べて、ヘパラン硫酸由来及び／またはデルマタン硫酸由来の二糖のレベルが低いことによって、そのコントロールと比べて、その試料中のＩＤＳ活性が上昇していることが示される、求めること
を含む方法である。
いくつかの実施形態では、細胞またはマイクロベシクルを破壊するステップは、少なくとも１回の凍結融解サイクル及び／または少なくとも１回の超音波処理ステップを含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、組織試料に由来するものであり、その方法は、少なくとも３回、４回または５回の凍結融解サイクルを含む。いくつかの実施形態では、その対象は、ＩＤＳ活性の欠損したマウスである。いくつかの実施形態では、その対象は、ヒト以外の霊長類動物である。いくつかの実施形態では、その対象は、ハンター症候群であるヒト患者である。
いくつかの実施形態では、ヘパラン硫酸由来及び／またはデルマタン硫酸由来の二糖のレベルは、ＩＤＳ活性が欠損しているコントロールにおけるヘパラン硫酸由来及び／またはデルマタン硫酸由来の二糖のレベルと比べて、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％低下する。いくつかの実施形態では、そのコントロールは、そのタンパク質またはポリペプチドを投与する前の対象から得た同じ種類の組織細胞の細胞試料または組織試料である。いくつかの実施形態では、そのコントロールは、ＩＤＳ活性が欠損していることが知られている同じ種類の組織細胞の細胞試料または組織試料である。いくつかの実施形態では、そのタンパク質またはポリペプチドは、コントロールにおけるＩＤＳ活性と比べて、試料におけるＩＤＳ活性を少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍または１００倍向上させる。
別の態様では、本発明で提供するのは、基質の蓄積をモニタリングして、ＳＧＳＨ活性を評価する方法であって、
（ａ）上記のようなタンパク質またはポリペプチドを投与された対象に由来する細胞試料もしくは組織試料中の細胞、または流体試料中のマイクロベシクルを破壊して、マイクロベシクルを破壊して開いて、解析対象のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）溶液を得ることと、
（ｂ）そのＧＡＧ溶液を少なくとも１つのヘパリナーゼで消化して、ＧＡＧ由来の二糖を得ることと、
（ｃ）そのＧＡＧ由来の二糖を質量分析法（例えばＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって解析することと、
（ｄ）ヘパラン硫酸由来の二糖のレベルを求めることであって、ＳＧＳＨ活性が欠損しているコントロールと比べて、ヘパラン硫酸由来の二糖のレベルが低いことによって、そのコントロールと比べて、その試料中のＳＧＳＨ活性が上昇していることが示される、求めること
を含む方法である。
いくつかの実施形態では、細胞またはマイクロベシクルを破壊するステップは、少なくとも１回の凍結融解サイクル及び／または少なくとも１回の超音波処理ステップを含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、組織試料に由来するものであり、その方法は、少なくとも３回、４回または５回の凍結融解サイクルを含む。いくつかの実施形態では、その対象は、ＳＧＳＨ活性の欠損したマウスである。いくつかの実施形態では、その対象は、ヒト以外の霊長類動物である。いくつかの実施形態では、その対象は、サンフィリポ症候群Ａであるヒト患者である。
いくつかの実施形態では、ヘパラン硫酸由来の二糖のレベルは、ＳＧＳＨ活性が欠損しているコントロールにおけるヘパラン硫酸由来の二糖のレベルと比べて、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％低下する。いくつかの実施形態では、そのコントロールは、そのタンパク質またはポリペプチドを投与する前の対象から得た同じ種類の組織細胞の細胞試料または組織試料である。いくつかの実施形態では、そのコントロールは、ＳＧＳＨ活性が欠損していることが知られている同じ種類の組織細胞の細胞試料または組織試料である。いくつかの実施形態では、そのタンパク質またはポリペプチドは、コントロールにおけるＳＧＳＨ活性と比べて、試料におけるＳＧＳＨ活性を少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍または１００倍向上させる。
別の態様では、本発明で提供するのは、哺乳動物のＢＢＢを越えて、薬剤を輸送する方法であって、約５０ｎＭ〜約２５０ｎＭの親和性でＴｆＲに結合するタンパク質に、そのＢＢＢを暴露させることを含み、そのタンパク質が、その薬剤に連結されており、そのＢＢＢを越えて、その連結された薬剤を輸送する方法である。いくつかの実施形態では、その哺乳動物の脳内のその薬剤の最高濃度（Ｃｍａｘ）が上昇する。いくつかの実施形態では、その薬剤は、ＬＳＤを治療するのに有用である。
さらに別の態様では、本発明で提供するのは、ＬＳＤの治療方法であって、約５０ｎＭ〜約２５０ｎＭの親和性で、ＴｆＲに結合するタンパク質を哺乳動物に投与することを含み、そのタンパク質が、ＬＳＤを治療するための薬剤に連結されており、それによって、その哺乳動物の脳をその薬剤に暴露させる方法である。いくつかの実施形態では、そのタンパク質は、そのタンパク質よりも弱い親和性でＴｆＲに結合する参照タンパク質に連結されている薬剤に比べて、脳内のその薬剤のＣｍａｘを上昇させる。いくつかの実施形態では、その参照タンパク質は、約６００ｎＭよりも弱い親和性で、ＴｆＲに結合する。
いくつかの実施形態では、そのＴｆＲは、霊長類動物ＴｆＲである。いくつかの実施形態では、その霊長類動物ＴｆＲは、ヒトＴｆＲである。いくつかの実施形態では、そのタンパク質は、ＴｆＲアピカルドメインに結合する。
いくつかの実施形態では、そのタンパク質は、約１００ｎＭ〜約２００ｎＭの親和性で、ＴｆＲに結合する。いくつかの実施形態では、そのタンパク質は、約１１０ｎＭ〜約１５０ｎＭの親和性で、ＴｆＲに結合する。
いくつかの実施形態では、その薬剤の治療上有効な濃度は、その哺乳動物におけるＬＳＤの１つ以上の症状を治療する濃度である。いくつかの実施形態では、その薬剤は、タンパク質補充療法剤である。いくつかの実施形態では、その薬剤またはタンパク質補充療法剤は、酵素である。
いくつかの実施形態では、その酵素は、本発明のタンパク質に連結されていると、その酵素が参照タンパク質に連結されている場合と比べて、ＬＳＤである哺乳動物の脳における毒性代謝産物の蓄積を低減する度合いが高くなる。いくつかの実施形態では、その酵素は、ＩＤＳであり、そのＬＳＤは、ハンター症候群である。いくつかの実施形態では、その毒性代謝産物は、ヘパラン硫酸由来の二糖及び／またはデルマタン硫酸由来の二糖を含む。いくつかの実施形態では、その酵素は、ＳＧＳＨであり、そのＬＳＤは、サンフィリポ症候群Ａである。いくつかの実施形態では、その酵素は、ＡＳＭであり、そのＬＳＤは、ニーマンピック病である。いくつかの実施形態では、その酵素は、ＧＢＡであり、そのＬＳＤは、ゴーシェ病である。
いくつかの実施形態では、その薬剤は、抗体可変領域を含む。いくつかの実施形態では、その薬剤は、抗体断片を含む。いくつかの実施形態では、その薬剤は、ＦａｂまたはｓｃＦｖを含む。
いくつかの実施形態では、そのタンパク質は、ＴｆＲと結合できる非天然型結合部位を含む改変Ｆｃポリペプチドである。いくつかの実施形態では、そのタンパク質は、ＴｆＲと特異的に結合する抗体可変領域を含む。いくつかの実施形態では、そのタンパク質は、抗体断片を含む。いくつかの実施形態では、そのタンパク質は、ＦａｂまたはｓｃＦｖを含む。
いくつかの実施形態では、その薬剤に連結されているそのタンパク質は、製薬学的に許容可能な担体の一部として投与する。
イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）酵素に連結されているＦｃポリペプチド、及びトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に結合する改変Ｆｃポリペプチドを含むＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質の精製及び解析結果を示している。 図１で解析したＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質に対する結合親和性アッセイの結果を示しており、その融合タンパク質がＴｆＲに結合することを証明している。 図１で解析したＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質のインビトロＩＤＳ活性を示すデータを示している。 ＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイを用いて評価したところ、ＩＤＳが欠損しているノックアウト細胞において、ヘパラン硫酸由来の二糖のレベルが上昇していたとともに、ＩＤＳノックアウト（ＫＯ）細胞におけるＩＤＳの発現によって、ノックアウト表現型がレスキューされることを示すデータを提供している。 Ａは、同じＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド（すなわちＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７）を含むＮ末端モノザイムまたはＣ末端モノザイムのいずれかとしてのＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質が、ＩＤＳ ＫＯ細胞におけるヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の蓄積を逆転させることを示している。Ｂは、Ｎ末端モノザイム（「ＥＴＶ：ＩＤＳ３５．２１．１７」）が、ＩＤＳに相当する細胞有効性を有することを示している。Ｃは、ＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質（「ＥＴＶ：ＩＤＳ」）またはＩＤＳで処置したＭＰＳ ＩＩ患者の線維芽細胞（ｎ＝８）において、Ｓ３５−硫酸標識タンパク質の蓄積が用量依存的に低減されたことが示されている。Ｄは、５ｍＭのＭ６Ｐの存在下または非存在下で、漸増濃度のＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質（「ＥＴＶ：ＩＤＳ」）またはＩＤＳで処置したＭＰＳ ＩＩ患者の線維芽細胞（ｎ＝３）におけるＳ３５標識タンパク質のＭ６ＰＲ依存的クリアランスの評価を示している。図５Ｃ〜５Ｄでは、「ＥＴＶ：ＩＤＳ」は、ＥＴＶ：ＩＤＳ３５．２３．２であり、グラフには、反復実験にわたる平均値±標準誤差が示されている。 Ａは、同じＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド（すなわちＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７）を含むＮ末端モノザイムまたはＣ末端モノザイムのいずれかとしてのＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質が、ＩＤＳ ＫＯ細胞におけるヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の蓄積を逆転させることを示している。Ｂは、Ｎ末端モノザイム（「ＥＴＶ：ＩＤＳ３５．２１．１７」）が、ＩＤＳに相当する細胞有効性を有することを示している。Ｃは、ＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質（「ＥＴＶ：ＩＤＳ」）またはＩＤＳで処置したＭＰＳ ＩＩ患者の線維芽細胞（ｎ＝８）において、Ｓ３５−硫酸標識タンパク質の蓄積が用量依存的に低減されたことが示されている。Ｄは、５ｍＭのＭ６Ｐの存在下または非存在下で、漸増濃度のＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質（「ＥＴＶ：ＩＤＳ」）またはＩＤＳで処置したＭＰＳ ＩＩ患者の線維芽細胞（ｎ＝３）におけるＳ３５標識タンパク質のＭ６ＰＲ依存的クリアランスの評価を示している。図５Ｃ〜５Ｄでは、「ＥＴＶ：ＩＤＳ」は、ＥＴＶ：ＩＤＳ３５．２３．２であり、グラフには、反復実験にわたる平均値±標準誤差が示されている。 ビヒクルを投与した野生型（ＷＴ）マウス、またはＩＤＳもしくはＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質（「ＥＴＶ：ＩＤＳ」）を投与したＩＤＳ ＫＯマウスに由来する血清中のヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸のレベルを経時的に示すデータを示している。「ＥＴＶ：ＩＤＳ」は、ＥＴＶ：ＩＤＳ３５．２１である。 ４０ｍｇ／ｋｇのＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質（「ＥＴＶ：ＩＤＳ」）または５．３ｍｇ／ｋｇのＩＤＳを１回静脈内注射で投与してから７日後に、ＩＤＳ ＫＯマウスに由来する末梢組織中の二糖Ｄ０ＳＯ、ＤＯＡ０及びＤ０ａ４の合計レベル（「総ｓＧＡＧレベル」という）を評価し、ビヒクルで処置したＩＤＳ ＫＯマウス及び野生型マウス（ＩＤＳ ＫＯ群は、ｎ＝８、野生型群は、ｎ＝３）と比較したものを示すデータを示している。データは、平均±標準誤差として示されており、ｐ値は、ダネットの多重比較検定を伴う一元ＡＮＯＶＡによるものであり、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１である。「ＥＴＶ：ＩＤＳ」は、ＥＴＶ：ＩＤＳ３５．２１である。 ＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質ＥＴＶ：ＩＤＳ３５．２１、またはＴｆＲへの結合をもたらす変異を有さないコントロールＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質（「ＩＤＳ：Ｆｃ」）を末梢投与した後のヒトＴｆＲノックイン（ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩ）マウスの脳内のＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質の濃度を示すデータを示している。 Ａは、ＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質ＥＴＶ：ＩＤＳ３５．２１．１７．２もしくはＥＴＶ：ＩＤＳ３５．２３．２、またはＴｆＲへの結合をもたらす変異を有さないコントロールＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質（「ＩＤＳ：Ｆｃ」）を末梢投与した後のＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスの脳内のＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質の濃度を示すデータを示している。Ｂは、５０ｍｇ／ｋｇの用量で１回静脈内注射した後のＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスにおけるＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質ＥＴＶ：ＩＤＳ３５．２１またはＩＤＳ：Ｆｃの肝臓中濃度を示すデータを示している（ｎ＝４〜５）。グラフには、平均±標準誤差が示されている。 Ａ〜Ｃは、ＥＴＶ：ＩＤＳが、ＩＤＳ ＫＯ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスの脳及び末梢組織内のＧＡＧを低減することを示している。実施例２に記載されているように、ＩＤＳ ＫＯ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスに、４０ｍｇ／ｋｇのＥＴＶ：ＩＤＳまたは１４．２ｍｇ／ｋｇのＩＤＳを単回静脈内注射によって投与したか、または週に１回の投与を４回行った。単回投与後のＩＤＳ ＫＯ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスにおいて、血清（Ａ）及び組織（Ｂ）中のＩＤＳの濃度を測定した。投与から２時間後の組織中ＰＫが示されている（ｎ＝４）。グラフには、平均±標準誤差が示されており、ｐ値は、独立ｔ検定解析によるものである。Ｃは、ＩＤＳ ＫＯ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスの脳、ＣＳＦ及び末梢組織内の二糖Ｄ０ＳＯ、ＤＯＡ０及びＤ０ａ４のレベル（「総ｓＧＡＧレベル」）であって、ＥＴＶ：ＩＤＳまたはＩＤＳを単回投与または複数回投与した後に測定し、ビヒクルで処置した場合及び野生型マウスと比較したレベルを示している（ＩＤＳ ＫＯ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩ群は、ｎ＝８であり、野生型群は、ｎ＝５である）。グラフには、平均±標準誤差が示されており、ｐ値は、ダネットの多重比較検定を伴う一元ＡＮＯＶＡによるものであり、＊＊はｐ＜０．０１であり、＊＊＊はｐ≦０．００１であり、＊＊＊＊はｐ≦０．０００１である。 Ａ〜Ｃは、ＥＴＶ：ＩＤＳが、ＩＤＳ ＫＯ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスの脳及び末梢組織内のＧＡＧを低減することを示している。実施例２に記載されているように、ＩＤＳ ＫＯ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスに、４０ｍｇ／ｋｇのＥＴＶ：ＩＤＳまたは１４．２ｍｇ／ｋｇのＩＤＳを単回静脈内注射によって投与したか、または週に１回の投与を４回行った。単回投与後のＩＤＳ ＫＯ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスにおいて、血清（Ａ）及び組織（Ｂ）中のＩＤＳの濃度を測定した。投与から２時間後の組織中ＰＫが示されている（ｎ＝４）。グラフには、平均±標準誤差が示されており、ｐ値は、独立ｔ検定解析によるものである。Ｃは、ＩＤＳ ＫＯ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスの脳、ＣＳＦ及び末梢組織内の二糖Ｄ０ＳＯ、ＤＯＡ０及びＤ０ａ４のレベル（「総ｓＧＡＧレベル」）であって、ＥＴＶ：ＩＤＳまたはＩＤＳを単回投与または複数回投与した後に測定し、ビヒクルで処置した場合及び野生型マウスと比較したレベルを示している（ＩＤＳ ＫＯ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩ群は、ｎ＝８であり、野生型群は、ｎ＝５である）。グラフには、平均±標準誤差が示されており、ｐ値は、ダネットの多重比較検定を伴う一元ＡＮＯＶＡによるものであり、＊＊はｐ＜０．０１であり、＊＊＊はｐ≦０．００１であり、＊＊＊＊はｐ≦０．０００１である。 ２つの酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）酵素に連結されているＦｃ領域を含むＡＳＭ−Ｆｃ融合タンパク質の精製及び解析結果を示している。 図１１で解析したＡＳＭ−Ｆｃ融合タンパク質のインビトロでのＡＳＭ活性を示すデータを示している。 イメージングベースのアッセイを用いて、図１１で解析したようなＡＳＭ−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＳＭ ＫＯ細胞におけるスフィンゴミエリンの蓄積を低減することを示すデータを示している。 ＬＣ−ＭＳ／ＭＳベースのアッセイを用いて、図１１で解析したようなＡＳＭ−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＳＭ ＫＯ細胞におけるスフィンゴミエリンの蓄積を低減することを示すデータを示している。 実施例６に記載されているＳＧＳＨ−Ｆｃ融合タンパク質のインビトロでのＮ−スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）活性を示すデータを示している。 ＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイを用いて評価したところ、ＳＧＳＨが欠損しているノックアウト（ＫＯ）細胞において、ヘパラン硫酸由来の二糖のレベルが上昇していたことを示すデータを示している。ｎ＝３〜４個の独立した細胞株であり、データは、平均±標準誤差として示されている。 図１５で解析したＳＧＳＨ−Ｆｃ融合タンパク質が、ＳＧＳＨ ＫＯ細胞におけるヘパラン硫酸の蓄積を逆転させることを示すデータを示している。 ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスにおける、操作されたＴｆＲ結合ポリペプチドのｈＴｆＲ親和性と脳暴露の経時的な関係を示している。点は、ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスにおいて５０ｍｇ／ｋｇを１回投与した後の、様々な操作されたＴｆＲ結合ポリペプチドの親和性バリアントの経時的な累積脳暴露（ＡＵＣ）を表している。投与からの様々な経過日数（１〜１０日の範囲）に、ポリペプチドの脳内濃度（ｈｕＩｇＧ１によって測定した）を算出した。データは、３回の独立した試験をまとめたものであり、各試験の各群のマウス数は、４〜５頭である。 ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスにおける、操作されたＴｆＲ結合ポリペプチドのｈＴｆＲ親和性と、最高脳内濃度の関係を示している。点は、５０ｍｇ／ｋｇの用量を１回投与してから１日目に測定した、様々なポリペプチド親和性バリアントの最高脳内濃度を表している。データは、３回の独立した試験をまとめたものであり、各試験の１群あたりのマウス数は、４〜５頭である。 ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスにおける、操作されたＴｆＲ結合ポリペプチドのｈＴｆＲ親和性と、ポリペプチドの血漿中濃度に対する脳内濃度の比率の関係を示している。点は、５０ｍｇ／ｋｇの用量を１回投与してから１日目に測定した、様々なポリペプチド親和性バリアントの血漿中濃度に対する最高脳内濃度の比率を表している。データは、３回の独立した試験をまとめたものであり、各試験の１群あたりのマウス数は、４〜５頭である。 抗ＢＡＣＥ１＿Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ３５．２１：Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ３５．２０：Ａｂ１５３またはＣＨ３Ｃ３５：Ａｂ１５３ポリペプチド融合物を５０ｍｇ／ｋｇ、１回全身注射した後のＴｆＲｍｓ／ｈｕノックイン（ＫＩ）マウスの血漿中のｈｕＩｇＧ１濃度を示している（平均±標準誤差、１群当たりｎ＝５）。 抗ＢＡＣＥ１＿Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ３５．２１：Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ３５．２０：Ａｂ１５３またはＣＨ３Ｃ３５：Ａｂ１５３ポリペプチド融合物を５０ｍｇ／ｋｇ、１回全身注射した後のＴｆＲｍｓ／ｈｕノックイン（ＫＩ）マウスの脳溶解液中のｈｕＩｇＧ１濃度を示している（平均±標準誤差、１群当たりｎ＝５）。 抗ＢＡＣＥ１＿Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ３５．２１：Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ３５．２０：Ａｂ１５３またはＣＨ３Ｃ３５：Ａｂ１５３ポリペプチド融合物を５０ｍｇ／ｋｇ、１回全身注射した後のＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスの脳溶解液中の内因性マウスＡβ濃度を示している（平均±標準誤差、１群当たりｎ＝５）。 抗ＢＡＣＥ１＿Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ３５．２１：Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ３５．２０：Ａｂ１５３またはＣＨ３Ｃ３５：Ａｂ１５３ポリペプチド融合物を５０ｍｇ／ｋｇ、１回全身注射した後のＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスの脳溶解液における脳内ＴｆＲタンパク質をウエスタンブロットによる定量した結果をアクチンに対して正規化したものを示している（平均±標準誤差、１群当たりｎ＝５）。
Ｉ．序論
我々は、Ｆｃポリペプチドに連結されている酵素補充療法（ＥＲＴ）用酵素を含む融合タンパク質を開発した。これらのタンパク質を用いて、リソソーム蓄積障害（ＬＳＤ）を治療できる。いくつかのケースでは、そのタンパク質は、二量体のＦｃポリペプチドを含み、それらのＦｃポリペプチド単量体のうちの１つは、ＥＲＴ用酵素に連結されている。それらのＦｃポリペプチドは、酵素の半減期を延長でき、いくつかのケースでは、そのタンパク質に追加の機能的特性を付与するように改変できる。本明細書には、血液脳関門（ＢＢＢ）を越えてＥＲＴ用酵素の送達を促す融合タンパク質も記載されている。これらのタンパク質は、二量体を形成するＦｃポリペプチド及び改変Ｆｃポリペプチド、ならびにそのＦｃ領域及び／または改変Ｆｃ領域に連結されているＥＲＴ用酵素を含む。その改変Ｆｃ領域は、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）のようなＢＢＢ受容体に特異的に結合できる。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、または野生型ＩＤＳ、例えば野生型ヒトＩＤＳの触媒活性バリアントもしくは断片である。別の実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、Ｎ−スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）、酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）、β−グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）、または野生型ＳＧＳＨ、ＡＳＭもしくはＧＢＡ、例えば、野生型ヒトＳＧＳＨ、ＡＳＭもしくはＧＢＡの触媒活性バリアントもしくは断片である。
我々は、疾患の治療のために、ＢＢＢを越えて、ＴｆＲ結合ポリペプチド及びタンパク質に連結されている療法剤を輸送する方法も開発した。我々は、ＢＢＢを越えて療法剤を輸送するのに所望のＴｆＲ結合親和性は、その療法剤の標的、及び疾患を治療する有効性をもたらす作用機序に依存することを発見した。特には、我々は、用いるポリペプチド及びタンパク質のＴｆＲ親和性が強いほど、Ｃｍａｘが上昇するが、クリアランスが速いことを発見した。
例えばＬＳＤなどの治療に使用できるタンパク質補充療法（ＩＤＳ（例えばハンター症候群の治療用）などのＥＲＴ用酵素の使用を含む）のようないくつかの療法では、投薬域全体にわたって、その療法剤の脳内Ｃｍａｘを高くすることが望ましい。細胞外濃度が高いほど、細胞内タンパク質濃度の上昇が促進されることになるからである。細胞内に送達されると、送達されたタンパク質の細胞内半減期は、血漿滞留時間よりも長い期間、持続される。加えて、Ｃｍａｘが高いことは、酵素補充に有益であり得る。酵素濃度が高いと、酵素による基質回転速度の上昇が促進され得るからである。脳内Ｃｍａｘを上昇させるには、ＴｆＲ親和性が５０〜２５０ｎＭの範囲であるポリペプチド及びタンパク質を使用するのが、特に有用である。
ＩＩ．定義
本明細書で使用する場合、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という単数形には、文脈上明らかに別段に示されていない限り、複数の指示対象が含まれる。したがって、例えば、「ポリペプチド」に言及している場合、そのような分子を２つ以上含み得るといった具合である。
本明細書で使用する場合、「約」及び「およそ」という用語は、数値または範囲で定められている量を修飾して用いられている場合には、その数値、及び当業者に知られている、その値からの妥当な偏差（例えば±２０％、±１０％または±５％）が、記載されている値の想定される意味の範囲内であることを示す。
「酵素補充療法用酵素」または「ＥＲＴ用酵素」とは、リソソーム蓄積障害において欠損している酵素を指す。「ＥＲＴ用酵素バリアント」とは、野生型ＥＲＴ用酵素の機能的バリアント（アレルバリアント及びスプライスバリアントを含む）またはその断片を指し、ＥＲＴ用酵素バリアントは、例えば同一の条件でアッセイしたときに、その対応する野生型ＥＲＴ用酵素またはその断片の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の活性を有する。ＥＲＴ用酵素の「触媒活性断片」とは、完全長ＥＲＴ用酵素またはそのバリアントの一部を指し、その触媒活性断片は、例えば同一の条件でアッセイしたときに、対応する完全長ＥＲＴ用酵素またはそのバリアントの少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の活性を有する。
「イズロン酸スルファターゼ」、「イズロン酸−２−スルファターゼ」または「ＩＤＳ」は、本明細書で使用する場合、グリコサミノグリカンであるヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸のリソソームでの分解に関与する酵素であるイズロン酸−２−スルファターゼ（ＥＣ３．１．６．１３）を指す。ＩＤＳの欠損は、ハンター症候群としても知られているムコ多糖症ＩＩ型と関連付けられている。「ＩＤＳ」という用語は、Ｆｃポリペプチドを含むタンパク質の成分として本明細書で使用する場合、触媒活性を有するとともに、野生型ＩＤＳの機能的バリアント（アレルバリアント及びスプライスバリアントを含む）またはその断片を包含する。ヒトＩＤＳアイソフォームＩの配列（カノニカル配列として定められているヒト配列である）は、ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ２２３０４で入手可能であり、Ｘｑ２８にあるヒトＩＤＳ遺伝子によってコードされる。その完全長配列は、配列番号９１として示されている。「成熟」ＩＤＳ配列は、本明細書で使用する場合、天然の完全長ポリペプチド鎖のシグナル配列及びプロペプチド配列が欠損しているポリペプチド鎖の形態を指す。成熟ヒトＩＤＳポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号９２として示されており、その完全長ヒト配列の３４〜５５０位のアミノ酸に対応する。「トランケート型」ＩＤＳ配列は、本明細書で使用する場合、その天然の完全長ポリペプチド鎖の触媒活性断片を指す。例示的なトランケート型ヒトＩＤＳポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１１４として示されており、その完全長ヒト配列の２６〜５５０位のアミノ酸に対応する。ヒトＩＤＳの構造は、充分に特徴付けがなされている。例示的な構造は、ＰＤＢアクセッションコード５ＦＱＬで入手可能である。その構造は、Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．８：１５７８６ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１５７８６，２０１７にも説明されている。ヒト以外の霊長類動物のＩＤＳ配列も、チンパンジー（ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｋ７ＢＫＶ４）及びアカゲザル（ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｈ９ＦＴＸ２）を含め、説明されている。マウスＩＤＳ配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号Ｑ０８８９０で入手可能である。ＩＤＳバリアントは、例えば同一の条件でアッセイしたときに、対応する野生型ＩＤＳまたはその断片の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の活性を有する。触媒活性ＩＤＳ断片は、例えば同一の条件でアッセイしたときに、対応する完全長ＩＤＳまたはそのバリアントの少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の活性を有する。
「スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ」、「Ｎ−スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ」または「ＳＧＳＨ」は、本明細書で使用する場合、ヘパラン硫酸のリソソームでの分解に関与する酵素であるＮ−スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＥＣ３．１０．１．１）を指す。この遺伝子内の変異は、ヘパラン硫酸の分解障害に起因するサンフィリポ症候群Ａ（リソソーム蓄積障害の一種のムコ多糖症ＩＩＩ型）と関連付けられている。「ＳＧＳＨ」という用語は、Ｆｃポリペプチドを含むタンパク質の成分として本明細書で使用する場合、触媒活性を有するとともに、野生型ＳＧＳＨの機能的バリアント（アレルバリアント及びスプライスバリアントを含む）またはその断片を包含する。ヒトＳＧＳＨの配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ５１６８８で入手可能であり、１７ｑ２５．３にあるヒトＳＧＳＨ遺伝子によってコードされる。その完全長配列は、配列番号１１９として示されている。「成熟」ＳＧＳＨ配列は、本明細書で使用する場合、その天然の完全長ポリペプチド鎖のシグナル配列が欠損しているポリペプチド鎖の形態を指す。成熟ヒトＳＧＳＨポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１２０として示されており、その完全長ヒト配列の２１〜５０２位のアミノ酸に対応する。「トランケート型」ＳＧＳＨ配列は、本明細書で使用する場合、その天然の完全長ポリペプチド鎖の触媒活性断片を指す。ヒトＳＧＳＨの構造は、充分に特徴付けがなされている。例示的な構造は、ＰＤＢアクセッションコード４ＭＨＸで入手可能である。ヒト以外の霊長類動物のＳＧＳＨ配列も、チンパンジー（ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｋ７Ｃ２１８）を含め、説明されている。マウスＳＧＳＨ配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号Ｑ９ＥＱ０８で入手可能である。ＳＧＳＨバリアントは、例えば同一の条件でアッセイしたときに、対応する野生型ＳＧＳＨまたはその断片の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の活性を有する。触媒活性ＳＧＳＨ断片は、例えば同一の条件でアッセイしたときに、対応する完全長ＳＧＳＨまたはそのバリアントの少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の活性を有する。
「酸性スフィンゴミエリナーゼ」、「スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ」または「ＡＳＭ」は、本明細書で使用する場合、スフィンゴミエリンをセラミドに変換するリソソーム酵素であるスフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ１（ＥＣ３．１．４．１２）を指す。ＡＳＭの欠損と関連付けられている疾患には、ニーマンピック病（例えば、Ａ型またはＢ型）がある。「ＡＳＭ」という用語は、Ｆｃポリペプチドを含むタンパク質の成分として本明細書で使用する場合、触媒活性を有するとともに、野生型ＡＳＭの機能的バリアント（アレルバリアント及びスプライスバリアントを含む）またはその断片を包含する。ヒトＡＳＭアイソフォーム１の配列（カノニカル配列として定められているヒト配列である）は、ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ１７４０５で入手可能であり、１１ｐ１５．４にあるヒトＳＭＰＤ１遺伝子によってコードされる。その完全長配列は、配列番号１２１として示されている。「成熟」ＡＳＭ配列は、本明細書で使用する場合、その天然の完全長ポリペプチド鎖のシグナル配列が欠損しているポリペプチド鎖の形態を指す。成熟ヒトＡＳＭポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１２２として示されており、その完全長ヒト配列の４７〜６２９位のアミノ酸に対応する。「トランケート型」ＡＳＭ配列は、本明細書で使用する場合、その天然の完全長ポリペプチド鎖の触媒活性断片を指す。例示的なトランケート型ヒトＡＳＭポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１２３として示されており、その完全長ヒト配列の４７〜６２０位のアミノ酸に対応する。ヒトＡＳＭの構造は、充分に特徴付けがなされている。例示的な構造は、ＰＤＢアクセッションコード５Ｉ８１で入手可能である。ヒト以外の霊長類動物のＡＳＭ配列も、チンパンジー（ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｈ２Ｑ３１９）を含め、説明されている。マウスＡＳＭ配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号Ｑ０４５１９で入手可能である。ＡＳＭバリアントは、例えば同一の条件でアッセイしたときに、対応する野生型ＡＳＭまたはその断片の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の活性を有する。触媒活性ＡＳＭ断片は、例えば同一の条件でアッセイしたときに、対応する完全長ＡＳＭまたはそのバリアントの少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の活性を有する。
「β−グルコセレブロシダーゼ」または「ＧＢＡ」は、グルコシルセラミダーゼ（ＥＣ３．２．１．４５）としても知られている。その用語は、本明細書で使用する場合、グルコシルセラミダーゼ活性を有するとともに、グルコシルセラミドのセラミド及びグルコースへの分解を触媒するリソソーム酵素を指す。ＧＢＡの欠損は、ゴーシェ病及びパーキンソン病と関連付けられている。「ＧＢＡ」という用語は、Ｆｃポリペプチドを含むタンパク質の成分として本明細書で使用する場合、触媒活性を有するとともに、野生型ＧＢＡの機能的バリアント（アレルバリアント及びスプライスバリアントを含む）またはその断片を包含する。ヒトＧＢＡロングアイソフォームの配列（カノニカル配列として定められている）は、ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ０４０６２−１で入手可能であり、１ｑ２２にあるヒトＧＢＡ遺伝子によってコードされる。その完全長配列は、配列番号９３として示されている。「成熟」ＧＢＡ配列は、本明細書で使用する場合、その天然の完全長ポリペプチド鎖のシグナル配列及びプロペプチド配列が欠損しているポリペプチド鎖の形態を指す。成熟ヒトＧＢＡポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号９４として示されており、その完全長ヒト配列の４０〜５３６位のアミノ酸に対応する。「トランケート型」ＧＢＡ配列は、本明細書で使用する場合、その天然の完全長ポリペプチド鎖の触媒活性断片を指す。ヒトＧＢＡの構造は、充分に特徴付けがなされている。ＧＢＡの結晶構造は、２０個近くが入手可能である。ヒト以外の霊長類動物のＧＢＡ配列も、チンパンジー（ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｑ９ＢＤＴ０）及びオランウータン（ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｑ５Ｒ８Ｅ３）を含め、説明されている。マウスＧＢＡ配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ１７４３９で入手可能である。ＧＢＡバリアントは、例えば同一の条件でアッセイしたときに、対応する野生型ＧＢＡまたはその断片の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の活性を有する。触媒活性ＧＢＡ断片は、例えば同一の条件でアッセイしたときに、対応する完全長ＧＢＡまたはそのバリアントの少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の活性を有する。
「トランスフェリン受容体」または「ＴｆＲ」は、本明細書で使用する場合、トランスフェリン受容体タンパク質１を指す。ヒトトランスフェリン受容体１のポリペプチド配列は、配列番号９６に示されている。他の種のトランスフェリン受容体タンパク質１の配列も知られている（例えば、チンパンジーは、アクセッション番号ＸＰ＿００３３１０２３８．１、アカゲザルは、ＮＰ＿００１２４４２３２．１、イヌは、ＮＰ＿００１００３１１１．１、ウシは、ＮＰ＿００１１９３５０６．１、マウスは、ＮＰ＿０３５７６８．１、ラットは、ＮＰ＿０７３２０３．１、ニワトリは、ＮＰ＿９９０５８７．１である）。「トランスフェリン受容体」という用語には、トランスフェリン受容体タンパク質１染色体座にある遺伝子によってコードされる例示的な参照配列、例えばヒト配列のアレルバリアントも含まれる。完全長トランスフェリン受容体タンパク質は、短いＮ末端細胞内領域、膜貫通領域、及び大きな細胞外ドメインを含む。その細胞外ドメインは、プロテアーゼ様ドメイン、ヘリカルドメイン及びアピカルドメインという３つのドメインによって特徴付けられている。ヒトトランスフェリン受容体１のアピカルドメイン配列は、配列番号２３８に示されている。
「融合タンパク質」または「［ＥＲＴ用酵素］−Ｆｃ融合タンパク質」は、本明細書で使用する場合、ＥＲＴ用酵素、ＥＲＴ用酵素バリアントまたはその触媒活性断片に連結（例えば融合）されている第１のＦｃポリペプチド（すなわち「［ＥＲＴ］−Ｆｃ融合ポリペプチド」）、及び第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドを含む二量体のタンパク質を指す。第２のＦｃポリペプチドも、ＥＲＴ用酵素、ＥＲＴ用酵素バリアントまたはその触媒活性断片に連結（例えば融合）されていてもよい。第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＥＲＴ用酵素、ＥＲＴ用酵素バリアントまたはその触媒活性断片に、ペプチド結合またはポリペプチドリンカーによって連結されていてよい。第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、もう一方のＦｃポリペプチドとのヘテロ二量化を促す１つ以上の改変を含む改変Ｆｃポリペプチドであってよい。第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、トランスフェリン受容体への結合をもたらす１つ以上の改変を含む改変Ｆｃポリペプチドであってよい。第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、エフェクター機能を低下させる１つ以上の改変を含む改変Ｆｃポリペプチドであってよい。第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、血清中半減期を延長する１つ以上の改変を含む改変Ｆｃポリペプチドであってよい。
「融合ポリペプチド」または「［ＥＲＴ用酵素］−Ｆｃ融合ポリペプチド」は、本明細書で使用する場合、ＥＲＴ用酵素、ＥＲＴ用酵素バリアントまたはその触媒活性断片に連結（例えば融合）されているＦｃポリペプチドを指す。そのＦｃポリペプチドは、ＥＲＴ用酵素、ＥＲＴ用酵素バリアントまたはそれの触媒活性断片に、ペプチド結合またはポリペプチドリンカーによって連結されていてよい。そのＦｃポリペプチドは、別のＦｃポリペプチドとのヘテロ二量化を促す１つ以上の改変を含む改変Ｆｃポリペプチドであってよい。そのＦｃポリペプチドは、トランスフェリン受容体への結合をもたらす１つ以上の改変を含む改変Ｆｃポリペプチドであってよい。そのＦｃポリペプチドは、エフェクター機能を低下させる１つ以上の改変を含む改変Ｆｃポリペプチドであってよい。そのＦｃポリペプチドは、血清中半減期を延長する１つ以上の改変を含む改変Ｆｃポリペプチドであってよい。
本明細書で使用する場合、「Ｆｃポリペプチド」という用語は、構造ドメインとしてのＩｇフォールドによって特徴付けられる天然の免疫グロブリン重鎖ポリペプチドのＣ末端領域を指す。Ｆｃポリペプチドは、少なくともＣＨ２ドメイン及び／またはＣＨ３ドメインを含む定常領域配列を含み、ヒンジ領域の少なくとも一部を含んでもよい。概して、Ｆｃポリペプチドは、可変領域を含まない。
「改変Ｆｃポリペプチド」とは、野生型免疫グロブリン重鎖Ｆｃポリペプチド配列と比べて、少なくとも１つの変異、例えば、置換、欠失または挿入を有するが、天然型ＦｃポリペプチドのＩｇフォールドまたは構造の全体を保持しているＦｃポリペプチドを指す。
「ＦｃＲｎ」という用語は、胎児性Ｆｃ受容体を指す。ＦｃポリペプチドがＦｃＲｎに結合すると、そのＦｃポリペプチドのクリアランスが低下し、血清中半減期が延長される。ヒトＦｃＲｎタンパク質は、主要組織適合遺伝子（ＭＨＣ）クラスＩタンパク質と同様の約５０ｋＤａのサイズのタンパク質、及び約１５ｋＤａのサイズのβ２−ミクログロブリンで構成されているヘテロ二量体である。
本明細書で使用する場合、「ＦｃＲｎ結合部位」とは、Ｆｃポリペプチドの領域のうち、ＦｃＲｎに結合する領域を指す。ヒトＩｇＧでは、ＦｃＲｎ結合部位は、ＥＵインデックスを用いて番号付けした場合、Ｔ２５０、Ｌ２５１、Ｍ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｒ２５５、Ｔ２５６、Ｔ３０７、Ｅ３８０、Ｍ４２８、Ｈ４３３、Ｎ４３４、Ｈ４３５及びＹ４３６を含む。これらの位置は、配列番号１の２０〜２６位、７７位、１５０位、１９８位及び２０３〜２０６位の位置に対応する。
本明細書で使用する場合、「天然型ＦｃＲｎ結合部位」とは、Ｆｃポリペプチドの領域のうち、ＦｃＲｎに結合するとともに、天然のＦｃポリペプチドの領域のうち、ＦｃＲｎに結合する領域と同じアミノ酸配列を有する領域を指す。
「ＣＨ３ドメイン」及び「ＣＨ２ドメイン」という用語は、本明細書で使用する場合、免疫グロブリンの定常領域ドメインのポリペプチドのことを指す。本願の目的においては、ＣＨ３ドメインポリペプチドとは、ＥＵに従って番号付けした場合、約３４１位〜約４４７位のアミノ酸セグメントを指し、ＣＨ２ドメインポリペプチドとは、ＥＵナンバリングスキームに従って番号付けした場合、約２３１位〜約３４０位のアミノ酸セグメントを指し、ヒンジ領域配列を含まない。ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインのポリペプチドは、ＩＭＧＴ（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ）ナンバリングスキームによって番号付けしてもよく、その場合、ＩＭＧＴ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｈａｒｔのナンバリング（ＩＭＧＴウェブサイト）によれば、ＣＨ２ドメインの番号は１〜１１０位であり、ＣＨ３ドメインの番号は１〜１０７位である。ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインは、免疫グロブリンのＦｃ領域の一部である。Ｆｃ領域とは、ＥＵナンバリングスキームに従って番号付けした場合、約２３１位〜約４４７位のアミノ酸セグメントを指すが、本明細書で使用する場合、抗体のヒンジ領域の少なくとも一部を含むことができる。例示的なヒンジ領域配列は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号９５）である。
「野生型」、「天然型」、及び「天然」という用語は、ＣＨ３及びＣＨ２ドメインに関しては、本明細書では、天然に存在する配列を有するドメインを指す目的で使用する。
本明細書で使用する場合、「変異体」という用語は、変異体ポリペプチドまたは変異体ポリヌクレオチドに関しては、「バリアント」と同義的に用いられている。所定の野生型ＣＨ３またはＣＨ２ドメインの参照配列に関しては、バリアントには、天然のアレルバリアントを含めることができる。「天然に存在しない」ＣＨ３またはＣＨ２ドメインとは、自然界では細胞内に存在せず、天然型ＣＨ３ドメインまたはＣＨ２ドメインのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの遺伝子改変（例えば、遺伝子操作技術または変異誘発法を用いた遺伝子改変）によって生成されるバリアントまたは変異体ドメインを指す。「バリアント」は、野生型に対するアミノ酸変異を少なくとも１つ含むいずれかのドメインを含む。変異としては、置換、挿入及び欠失を挙げてよい。
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸及び合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様の形で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指す。
天然アミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、ならびに後で修飾されるアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸塩及びＯ−ホスホセリン）である。「アミノ酸類似体」とは、天然アミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシ基、アミノ基、およびＲ基に結合しているα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このような類似体は、修飾されたＲ基（例えばノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。「アミノ酸模倣体」とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様の形で機能する化学化合物を指す。
天然のα−アミノ酸としては、アラニン（Ａｌａ）、システイン（Ｃｙｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アルギニン（Ａｒｇ）、リシン（Ｌｙｓ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、プロリン（Ｐｒｏ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、バリン（Ｖａｌ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限らない。天然α−アミノ酸の立体異性体としては、Ｄ−アラニン（Ｄ−Ａｌａ）、Ｄ−システイン（Ｄ−Ｃｙｓ）、Ｄ−アスパラギン酸（Ｄ−Ａｓｐ）、Ｄ−グルタミン酸（Ｄ−Ｇｌｕ）、Ｄ−フェニルアラニン（Ｄ−Ｐｈｅ）、Ｄ−ヒスチジン（Ｄ−Ｈｉｓ）、Ｄ−イソロイシン（Ｄ−Ｉｌｅ）、Ｄ−アルギニン（Ｄ−Ａｒｇ）、Ｄ−リシン（Ｄ−Ｌｙｓ）、Ｄ−ロイシン（Ｄ−Ｌｅｕ）、Ｄ−メチオニン（Ｄ−Ｍｅｔ）、Ｄ−アスパラギン（Ｄ−Ａｓｎ）、Ｄ−プロリン（Ｄ−Ｐｒｏ）、Ｄ−グルタミン（Ｄ−Ｇｌｎ）、Ｄ−セリン（Ｄ−Ｓｅｒ）、Ｄ−トレオニン（Ｄ−Ｔｈｒ）、Ｄ−バリン（Ｄ−Ｖａｌ）、Ｄ−トリプトファン（Ｄ−Ｔｒｐ）、Ｄ−チロシン（Ｄ−Ｔｙｒ）及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限らない。
アミノ酸は、本明細書では、一般的に知られている３文字表記、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨されている１文字表記のいずれかによって示されていることもある。
「ポリペプチド」及び「ペプチド」という用語は、本明細書では、一本鎖のアミノ酸残基ポリマーを指す目的で同義的に使用されている。これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマー及び非天然型のアミノ酸ポリマーに適用する。アミノ酸ポリマーは、Ｌ−アミノ酸のみ、Ｄ−アミノ酸のみ、またはＬアミノ酸及びＤアミノ酸の混合物を含み得る。
「タンパク質」という用語は、本明細書で使用する場合、ポリペプチド、または一本鎖ポリペプチドの二量体（すなわち２つ）もしくは多量体（すなわち３つ以上）のいずれかを指す。タンパク質の一本鎖ポリペプチドは、共有結合、例えばジスルフィド結合、または非共有結合性相互作用によって結合されていてよい。
「保存的置換」、「保存的変異」または「保存的改変バリアント」という用語は、あるアミノ酸が、同様の特徴を有するアミノ酸として分類できる別のアミノ酸に置換される変化を指す。このように定義される保存的アミノ酸グループの分類の例としては、Ｇｌｕ（グルタミン酸、すなわちＥ）、Ａｓｐ（アスパラギン酸、すなわちＤ）、Ａｓｎ（アスパラギン、すなわちＮ）、Ｇｌｎ（グルタミン、すなわちＱ）、Ｌｙｓ（リシン、すなわちＫ）、Ａｒｇ（アルギニン、すなわちＲ）及びＨｉｓ（ヒスチジン、すなわちＨ）を含む「荷電／極性グループ」、Ｐｈｅ（フェニルアラニン、すなわちＦ）、Ｔｙｒ（チロシン、すなわちＹ）、Ｔｒｐ（トリプトファン、すなわちＷ）及び（ヒスチジン、すなわちＨ）を含む「芳香族グループ」、ならびにＧｌｙ（グリシン、すなわちＧ）、Ａｌａ（アラニン、すなわちＡ）、Ｖａｌ（バリン、すなわちＶ）、Ｌｅｕ（ロイシン、すなわちＬ）、Ｉｌｅ（イソロイシン、すなわちＩ）、Ｍｅｔ（メチオニン、すなわちＭ）、Ｓｅｒ（セリン、すなわちＳ）、Ｔｈｒ（トレオニン、すなわちＴ）及びＣｙｓ（システイン、すなわちＣ）を含む「脂肪族グループ」を挙げることができる。各グループ内では、サブグループも特定できる。例えば、荷電または極性アミノ酸のグループは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓを含む「正電荷を持つサブグループ」、Ｇｌｕ及びＡｓｐを含む「負電荷を持つサブグループ」、ならびにＡｓｎ及びＧｌｎを含む「極性のサブグループ」を含むサブグループに細分できる。別の例では、芳香族または環状グループは、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ及びＴｒｐを含む「窒素環サブグループ」、ならびにＰｈｅ及びＴｙｒを含む「フェニルサブグループ」を含むサブグループに細分できる。別のさらなる例では、脂肪族のグループは、例えば、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ及びＡｌａを含む「脂肪族非極性サブグループ」、ならびにＭｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＣｙｓを含む「脂肪族弱極性サブグループ」というサブグループに細分できる。保存的変異の分類の例としては、上記のサブグループ内のアミノ酸へのアミノ酸置換が挙げられ、正電荷を維持できるようにする、ＬｙｓのＡｒｇへの置換またはＡｒｇのＬｙｓへの置換、負電荷を維持できるようにする、ＧｌｕのＡｓｐへの置換またはＡｓｐのＧｌｕへの置換、遊離−ＯＨを維持できるようにする、ＳｅｒのＴｈｒへの置換またはＴｈｒのＳｅｒへの置換、及び遊離−ＮＨ２を維持できるようにするＧｌｎのＡｓｎへの置換またはＡｓｎのＧｌｎへの置換などであるが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、疎水性を保持するために、例えば活性部位において、天然の疎水性アミノ酸を疎水性アミノ酸で置換する。
２つ以上のポリペプチド配列の関連では、「同一」または「同一性」％という用語は、配列比較アルゴリズムを用いるかまたはマニュアルアラインメント及び目視検査によって測定した場合、比較ウィンドウまたは所定の領域にわたって最大一致するように比較及びアラインメントしたときに、同じである２つ以上の配列またはサブ配列、あるいは所定の領域にわたって同一であるアミノ酸残基を所定の割合有する（例えば、同一性が少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％、またはそれ以上である）２つ以上の配列またはサブ配列を指す。
ポリペプチドの配列比較では、典型的には、１つのアミノ酸配列が、候補配列との比較対象となる参照配列としての役割を果たす。アラインメントは、当業者に利用可能な様々な方法、例えば、目視でのアラインメントを用いるか、または最大のアラインメントを得るための既知のアルゴリズムを使用する、公的に入手可能なソフトウェアを用いて行うことができる。このようなプログラムとしては、ＢＬＡＳＴプログラム、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．）またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）が挙げられる。当業者は、最大のアラインメントを得られるように、アラインメントの際に用いるパラメーターを定めることができる。本願の目的において、ポリペプチド配列の配列比較を行う際には、２つのタンパク質配列をアラインメントするためのＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのＳｔａｎｄａｒｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＬＡＳＴをデフォルトパラメーターで使用する。
「〜に対応する」、「〜を基準として求められた」または「〜を基準として番号付けされた」という用語は、ポリペプチド配列内の所定のアミノ酸残基の特定に関連して使用されている場合には、その所定のアミノ酸配列を所定の参照配列と最大限アラインメントして、その参照配列と比較したときのその参照配列の残基の位置を指す。したがって、例えば、改変Ｆｃポリペプチドにおけるアミノ酸残基を配列番号１のアミノ酸とアラインメントして、配列番号１に最適にアラインメントしたときに、そのアミノ酸残基は、配列番号１におけるアミノ酸「に対応する」。参照配列にアラインメントするポリペプチドは、その参照配列と同じ長さである必要はない。
「結合親和性」は、本明細書で使用する場合、２つの分子間、例えば、ポリペプチド上の１つの結合部位と、その部位と結合する標的、例えばトランスフェリン受容体の間の非共有結合性相互作用の強さを指す。したがって、例えば、この用語は、別段に示されていないか、または文脈から明らかではない限り、ポリペプチドとその標的の間の１：１の相互作用を指してよい。結合親和性は、平衡解離定数（ＫＤ）を測定することによって定量してよく、ＫＤとは、解離速度定数（ｋｄ、時間−１）を会合速度定数（ｋａ、時間−１Ｍ−１）で除したものを指す。ＫＤは、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システム、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）のような結合平衡除外アッセイ、及びバイオレイヤー干渉法（例えば、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ｏｃｔｅｔ（登録商標）プラットフォームを用いる）を用いて、複合体の形成及び解離の速度を測定することによって求めることができる。本明細書で使用する場合、「結合親和性」には、正式の結合親和性（ポリペプチドとその標的の間の１：１の相互作用を反映した結合親和性など）のみならず、強い結合を反映し得るＫＤが算出される見かけ上の親和性も含まれる。
本明細書で使用する場合、標的、例えばＴｆＲに「特異的に結合する」または「選択的に結合する」という用語は、本明細書に記載されているような操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドまたはＴｆＲ結合抗体に言及している場合、構造的に異なる標的に結合する際よりも高い親和性、高い結合活性及び／または長い期間で、その操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドまたはＴｆＲ結合抗体が標的に結合する結合反応を指す。典型的な実施形態では、本発明の操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドまたはＴｆＲ結合抗体は、同じ親和性アッセイ条件でアッセイした場合、特異的標的、例えばＴｆＲに対して、無関係な標的と比べて、少なくとも５倍、１０倍、５０倍、１００倍、１，０００倍、１０，０００倍またはそれを上回る親和性を有する。特定の標的（例えばＴｆＲ）「への特異的結合」、特定の標的（例えばＴｆＲ）に「特異的に結合する」または特定の標的（例えばＴｆＲ）「に対して特異的である」という用語は、本明細書で使用する場合、例えば、結合相手である標的に対する平衡解離定数ＫＤが例えば１０−４Ｍ以下、例えば、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍまたは１０−１２Ｍである分子に適用できる。いくつかの実施形態では、操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドまたはＴｆＲ結合抗体は、種間で保存されている（例えば、種間で構造的に保存されている）ＴｆＲ上のエピトープ、例えば、ヒト以外の霊長類動物とヒトの種間で保存されている（例えば、ヒト以外の霊長類動物とヒトの種間で構造的に保存されている）エピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドまたはＴｆＲ結合抗体は、ヒトＴｆＲのみに結合し得る。
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体の重鎖または軽鎖のドメインのうち、生殖細胞系列の可変部（Ｖ）遺伝子、多様性部（Ｄ）遺伝子または結合部（Ｊ）遺伝子に由来する（定常部（Ｃμ及びＣδ）遺伝子セグメントには由来しない）とともに、抗原に対する結合特異性を抗体に付与するドメインを指す。典型的には、抗体可変領域は、保存されている「フレームワーク」領域であって、３つの超可変「相補性決定領域」を挟み込んでいる「フレームワーク」領域を４つ含む。
「抗原結合部分」及び「抗原結合断片」という用語は、本明細書では同義的に用いられており、その可変領域を介して、抗原に特異的に結合する能力を保持している１つ以上の抗体断片を指す。抗原結合断片の例としては、Ｆａｂ断片（ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン及びＣＨ１ドメインからなる一価断片）、Ｆ（ａｂ’）２断片（ヒンジ領域のジスルフィド結合によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＶＬ（軽鎖可変領域）及びＶＨ（重鎖可変領域）が挙げられるが、これらに限らない。
「治療」、「治療すること」などの用語は、本明細書では、概して、所望の薬理作用及び／または生理作用を得ることを意味する目的で使用する。「治療すること」または「治療」とは、軽減、寛解、患者の生存の改善、生存期間もしくは生存率の向上、症状の軽減、その障害に対する患者の忍容性の向上、悪化もしくは衰弱の速度の低下、または患者の身体的もしくは精神的健康状態の改善といったいずれかの客観的または主観的なパラメーターを含め、リソソーム蓄積障害、例えば、ハンター症候群、サンフィリポ症候群Ａ、ニーマンピック病、ゴーシェ病またはパーキンソン病の治療の奏効または改善のいずれかの兆候を指してもよい。症状の治療または改善は、客観的または主観的なパラメーターに基づくことができる。治療の作用は、治療を受けていない個体もしくは個体群、または治療前もしくは治療中の異なる時点の同じ患者と比較できる。
「対象」、「個体」及び「患者」という用語は、本明細書では、哺乳動物（ヒト、ヒト以外の霊長類動物、齧歯類動物（例えば、ラット、マウス及びモルモット）、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ならびにその他の哺乳動物種が挙げられるが、これらに限らない）を指す目的で、同義的に使用する。一実施形態では、患者は、ヒトである。
「製薬学的に許容可能な賦形剤」という用語は、ヒトまたは動物での使用に、生物学的または薬理学的に適合する不活性医薬成分（緩衝剤、担体または保存剤などであるが、これらに限らない）を指す。
本明細書で使用する場合、薬剤の「治療量」、「治療上有効な量」または「治療上有効な濃度」は、対象（例えば哺乳動物）の疾患（例えばＬＳＤ）の兆候または症状を治療する薬剤量または薬剤濃度である。
「投与する」という用語は、所望の生物学的作用部位に薬剤、化合物または組成物を送達する方法を指す。これらの方法としては、局所送達、非経口送達、静脈内送達、皮内送達、筋肉内送達、髄腔内送達、結腸送達、直腸送達または腹腔内送達が挙げられるが、これらに限らない。一実施形態では、本明細書に記載されているポリペプチドは、静脈内投与する。
ＩＩＩ．酵素補充療法（ＥＲＴ）用酵素
リソソーム蓄積障害（ＬＳＤ）は、消化されないかまたは部分消化された巨大分子の蓄積によって特徴づけられる遺伝性代謝疾患であり、この蓄積によって最終的には、細胞機能障害及び臨床的異常が生じる。古典的には、ＬＳＤは、概してその蓄積物質によって分類されるリソソーム機能欠損として定義されており、スフィンゴリピドーシス、オリゴ糖症、ムコリピドーシス、ムコ多糖症、リポタンパク質蓄積障害、神経セロイドリポフスチン症などが挙げられる。これらの障害の分類は最近、巨大分子を蓄積させるタンパク質（リソソーム酵素の正常な翻訳後修飾に必須のタンパク質、または適切なリソソーム輸送に重要なタンパク質など）のその他の欠損または異常を含めるように拡大されている。
いくつかの態様では、本明細書に記載されている融合タンパク質は、（ｉ）改変（例えば、ヘテロ二量化を促す１つ以上の改変）を含んでよいか、または野生型ＦｃポリペプチドであってよいＦｃポリペプチド、及びＥＲＴ用酵素、ならびに（ｉｉ）改変（例えば、ヘテロ二量化を促す１つ以上の改変）を含んでよいか、または野生型ＦｃポリペプチドであってよいＦｃポリペプチド、及び任意にＥＲＴ用酵素を含む。いくつかの実施形態では、一方または両方のＦｃポリペプチドは、血液脳関門（ＢＢＢ）受容体、例えばトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）への結合をもたらす改変を含んでよい。そのＥＲＴ用酵素は、ＬＳＤにおいて欠損しているいずれかの酵素であってよい。その融合タンパク質に組み込まれているＥＲＴ用酵素は、触媒活性を有し、すなわち、ＬＳＤにおいて欠損している酵素活性を保持している。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、ハンター症候群において欠損しているイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）である。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、サンフィリポ症候群において欠損しているＮ−スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）である。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、ニーマンピック病において欠損している酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）である。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、ゴーシェ病及びパーキンソン病において欠損しているβ−グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）である。
いくつかの実施形態では、ＥＲＴ用酵素、及び任意に、ＢＢＢ受容体に結合する改変Ｆｃポリペプチド、例えばＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含む融合タンパク質は、野生型ＩＤＳの触媒活性断片またはバリアントを含む。いくつかの実施形態では、そのＩＤＳ酵素は、配列番号９１、９２、１１４、２３０及び２３４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＩＤＳタンパク質のバリアントまたは触媒活性断片である。いくつかの実施形態では、ＩＤＳ酵素の触媒活性バリアントまたは断片は、野生型ＩＤＳ酵素の活性の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれを上回る活性を有する。
いくつかの実施形態では、ＥＲＴ用酵素、及び任意に、ＢＢＢ受容体に結合する改変Ｆｃポリペプチド、例えばＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含む融合タンパク質は、野生型ＳＧＳＨの触媒活性断片またはバリアントを含む。いくつかの実施形態では、そのＳＧＳＨ酵素は、配列番号１１９及び１２０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＳＧＳＨタンパク質のバリアントまたは触媒活性断片である。いくつかの実施形態では、ＳＧＳＨ酵素の触媒活性バリアントまたは断片は、野生型ＳＧＳＨ酵素の活性の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれを上回る活性を有する。
いくつかの実施形態では、ＥＲＴ用酵素、及び任意に、ＢＢＢ受容体に結合する改変Ｆｃポリペプチド、例えばＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含む融合タンパク質は、野生型ＡＳＭの触媒活性断片またはバリアントを含む。いくつかの実施形態では、そのＡＳＭ酵素は、配列番号１２１、１２２及び１２３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＡＳＭタンパク質のバリアントまたは触媒活性断片である。いくつかの実施形態では、ＡＳＭ酵素の触媒活性バリアントまたは断片は、野生型ＡＳＭ酵素の活性の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれを上回る活性を有する。
いくつかの実施形態では、ＥＲＴ用酵素、及び任意に、ＢＢＢ受容体に結合する改変Ｆｃポリペプチド、例えばＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含む融合タンパク質は、野生型ＧＢＡの触媒活性断片またはバリアントを含む。いくつかの実施形態では、そのＧＢＡ酵素は、配列番号９３及び９４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＧＢＡタンパク質のバリアントまたは触媒活性断片である。いくつかの実施形態では、ＧＢＡ酵素の触媒活性バリアントまたは断片は、野生型ＧＢＡ酵素の活性の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれを上回る活性を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている融合タンパク質に存在するＥＲＴ用酵素、例えば、ＩＤＳ、ＳＧＳＨ、ＡＳＭもしくはＧＢＡ、またはその触媒活性バリアントもしくは断片は、ＦｃポリペプチドまたはＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドに連結しないときのその活性と比べて、少なくとも２５％の活性を保持している。いくつかの実施形態では、ＥＲＴ用酵素、またはその触媒活性バリアントもしくは断片は、ＦｃポリペプチドまたはＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドに連結しないときのその活性と比べて、少なくとも１０％、または少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％の活性を保持している。いくつかの実施形態では、ＥＲＴ用酵素、またはその触媒活性バリアントもしくは断片は、ＦｃポリペプチドまたはＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドに連結しないときのその活性と比べて、少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の活性を保持している。いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドに融合しても、そのＥＲＴ用酵素、例えば、ＩＤＳ、ＳＧＳＨ、ＡＳＭもしくはＧＢＡ、またはその触媒活性バリアントもしくは断片の活性は低下しない。いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドに融合しても、そのＥＲＴ用酵素の活性は低下しない。
ＩＶ．血液脳関門（ＢＢＢ）受容体に結合させるためのＦｃポリペプチドの改変
いくつかの態様では、本発明で提供するのは、血液脳関門（ＢＢＢ）を越えて輸送できる融合タンパク質である。このようなタンパク質は、ＢＢＢ受容体に結合する改変Ｆｃポリペプチドを含む。ＢＢＢ受容体は、ＢＢＢ内皮、ならびに他の種類の細胞及び組織で発現する。いくつかの実施形態では、そのＢＢＢ受容体は、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）である。
各種のＦｃ改変で示されているアミノ酸残基（ＢＢＢ受容体、例えばＴｆＲに結合する改変Ｆｃポリペプチドに導入されたアミノ酸残基を含む）は、本明細書では、ＥＵナンバリングを用いて番号付けされている。いずれのＦｃポリペプチド、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＦｃポリペプチドも、本明細書に記載されているような１つ以上の位置に、改変、例えばアミノ酸置換を有してよい。
本明細書に記載されている融合タンパク質に存在する改変Ｆｃポリペプチド（例えば、ヘテロ二量化及び／またはＢＢＢ受容体への結合を促す改変がなされたＦｃポリペプチド）は、天然型Ｆｃ領域配列またはその断片、例えば、少なくとも５０個のアミノ酸、１００個のアミノ酸またはこれを上回る長さの断片と、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、その天然型Ｆｃのアミノ酸配列は、配列番号１のＦｃ領域配列である。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１の１〜１１０位のアミノ酸、もしくは配列番号１の１１１〜２１７位のアミノ酸、またはその断片、例えば、少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも１００個のアミノ酸もしくはこれを上回る長さの断片と、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。
いくつかの実施形態では、改変（例えば、ヘテロ二量化及び／またはＢＢＢ受容体への結合を促す改変）がなされたＦｃポリペプチドは、天然型Ｆｃ領域のアミノ酸配列に対応する少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個以上のアミノ酸、または少なくとも１００個以上のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、天然型Ｆｃ領域のアミノ酸配列（配列番号１など）に対応する少なくとも２５個の連続したアミノ酸、少なくとも３０個、３５個、４０個もしくは４５個の連続したアミノ酸、５０個の連続したアミノ酸、少なくとも６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個もしくは９５個以上の連続したアミノ酸、または１００個以上の連続したアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、ＢＢＢ受容体結合活性のために改変されているドメインは、ヒトＩｇ ＣＨ３ドメイン（ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインなど）である。そのＣＨ３ドメインは、いずれかのＩｇＧサブタイプ、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４に由来するものであることができる。ＩｇＧ１抗体に関しては、ＣＨ３ドメインとは、ＥＵナンバリングスキームに従って番号付けした場合、約３４１位〜約４４７位のアミノ酸のセグメントを指す。
いくつかの実施形態では、ＢＢＢ受容体結合活性のために改変されているドメインは、ヒトＩｇ ＣＨ２ドメイン（ＩｇＧ ＣＨ２ドメインなど）である。そのＣＨ２ドメインは、いずれかのＩｇＧサブタイプ、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４に由来するものであることができる。ＩｇＧ１抗体に関しては、ＣＨ２ドメインとは、ＥＵナンバリングスキームに従って番号付けした場合、約２３１位〜約３４０位のアミノ酸のセグメントを指す。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている融合タンパク質に存在する改変（例えば、ＢＢＢ受容体に結合する）Ｆｃポリペプチドは、少なくとも１個、２個または３個の置換を含み、いくつかの実施形態では、ＥＵナンバリングスキームによれば、２６６位、２６７位、２６８位、２６９位、２７０位、２７１位、２９５位、２９７位、２９８位及び２９９位を含むアミノ酸位置における少なくとも４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の置換を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている融合タンパク質に存在する改変（例えば、ＢＢＢ受容体に結合する）Ｆｃポリペプチドは、少なくとも１個、２個または３個の置換を含み、いくつかの実施形態では、ＥＵナンバリングスキームによれば、２７４位、２７６位、２８３位、２８５位、２８６位、２８７位、２８８位、２８９位及び２９０位を含むアミノ酸位置における少なくとも４個、５個、６個、７個、８個または９個の置換を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている融合タンパク質に存在する改変（例えば、ＢＢＢ受容体に結合する）Ｆｃポリペプチドは、少なくとも１個、２個または３個の置換を含み、いくつかの実施形態では、ＥＵナンバリングスキームによれば、２６８位、２６９位、２７０位、２７１位、２７２位、２９２位、２９３位、２９４位、２９６位及び３００位を含むアミノ酸位置における少なくとも４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の置換を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている融合タンパク質に存在する改変（例えば、ＢＢＢ受容体に結合する）Ｆｃポリペプチドは、少なくとも１個、２個または３個の置換を含み、いくつかの実施形態では、ＥＵナンバリングスキームによれば、２７２位、２７４位、２７６位、３２２位、３２４位、３２６位、３２９位、３３０位及び３３１位を含むアミノ酸位置における少なくとも４個、５個、６個、７個、８個または９個の置換を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている融合タンパク質に存在する改変（例えば、ＢＢＢ受容体に結合する）Ｆｃポリペプチドは、少なくとも１個、２個または３個の置換を含み、いくつかの実施形態では、ＥＵナンバリングスキームによれば、３４５位、３４６位、３４７位、３４９位、４３７位、４３８位、４３９位及び４４０位を含むアミノ酸位置における少なくとも４個、５個、６個または７個の置換を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている融合タンパク質に存在する改変（例えば、ＢＢＢ受容体に結合する）Ｆｃポリペプチドは、少なくとも１個、２個または３個の置換を含み、いくつかの実施形態では、ＥＵナンバリングスキームによれば、３８４位、３８６位、３８７位、３８８位、３８９位、３９０位、４１３位、４１６位及び４２１位のアミノ酸位置における少なくとも４個、５個、６個、７個、８個または９個の置換を含む。
ＦｃＲｎ結合部位
ある特定の態様では、本明細書に記載されている融合タンパク質に存在する改変（例えば、ＢＢＢ受容体に結合する）ＦｃポリペプチドまたはＢＢＢ受容体に特異的に結合しないＦｃポリペプチドは、ＦｃＲｎ結合部位も含むことができる。いくつかの実施形態では、そのＦｃＲｎ結合部位は、Ｆｃポリペプチドまたはその断片内にある。
いくつかの実施形態では、そのＦｃＲｎ結合部位は、天然型ＦｃＲｎ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、そのＦｃＲｎ結合部位は、天然型ＦｃＲｎ結合部位のアミノ酸配列に対するアミノ酸変化を含まない。いくつかの実施形態では、その天然型ＦｃＲｎ結合部位は、ＩｇＧ結合部位、例えば、ヒトＩｇＧ結合部位である。いくつかの実施形態では、そのＦｃＲｎ結合部位は、ＦｃＲｎへの結合を変化させる改変を含む。
いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合部位は、変異、例えば置換されている１つ以上のアミノ酸残基を有し、その変異（複数可）によって、血清中半減期が延長されるか、または血清中半減期が実質的に短縮されない（すなわち、同じ条件でアッセイした場合に、その変異位置に野生型残基を有する対応物の改変Ｆｃポリペプチドと比べて、血清中半減期の短縮が、２５％以下である）。いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合部位は、ＥＵナンバリングスキームによれば、２５０〜２５６位、３０７位、３８０位、４２８位及び４３３〜４３６位に、置換されているアミノ酸残基を１つ以上有する。
いくつかの実施形態では、その改変ポリペプチドの血清中半減期を延長するように、ＦｃＲｎ結合部位またはＦｃＲｎ結合部位の近くの１つ以上の残基が、天然型ヒトＩｇＧ配列に対して変異されている。いくつかの実施形態では、変異が、２５２位、２５４位及び２５６位のうちの１つ、２つまたは３つに導入されている。いくつかの実施形態では、その変異は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅである。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅという変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵナンバリングスキームによれば、Ｔ３０７、Ｅ３８０及びＮ４３４という位置のうちの１つ、２つまたは３つすべてに、置換を含む。いくつかの実施形態では、その変異は、Ｔ３０７Ｑ及びＮ４３４Ａである。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ及びＮ４３４Ａという変異を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵナンバリングスキームによれば、Ｔ２５０及びＭ４２８の位置に、置換を含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、Ｔ２５０Ｑ及び／またはＭ４２８Ｌという変異を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵナンバリングスキームによれば、Ｍ４２８及びＮ４３４の位置に、置換を含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓという変異を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、Ｎ４３４ＳまたはＮ４３４Ａという変異を含む。
Ｖ．トランスフェリン受容体結合ＦＣポリペプチド
この節では、本明細書に記載されている改変Ｆｃポリペプチドであって、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に結合するとともに、血液脳関門（ＢＢＢ）を越えて輸送できる改変Ｆｃポリペプチドの作製について記載する。
ＣＨ３ドメインに変異を含むＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチドは、ＣＨ３ドメインに置換を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＴｆＲ結合活性のために改変されているヒトＩｇ ＣＨ３ドメイン（ＩｇＧ ＣＨ３ドメインなど）を含む。そのＣＨ３ドメインは、いずれかのＩｇＧサブタイプ、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４に由来するものであることができる。ＩｇＧ抗体に関しては、ＣＨ３ドメインとは、ＥＵナンバリングスキームに従って番号付けした場合、約３４１位〜約４４７のアミノ酸のセグメントを指す。
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチドは、ＴｆＲのアピカルドメインに結合し、トランスフェリンのＴｆＲへの結合をブロックしたり、または別段に阻害したりすることなく、ＴｆＲに結合し得る。いくつかの実施形態では、トランスフェリンのＴｆＲへの結合は、実質的に阻害されない。いくつかの実施形態では、トランスフェリンのＴｆＲへの結合が阻害されるのは、約５０％未満（例えば、約４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満または５％未満）である。いくつかの実施形態では、トランスフェリンのＴｆＲへの結合が阻害されるのは、約２０％未満（例えば、約１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満または１％未満）である。
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵナンバリングスキームによれば、３８４位、３８６位、３８７位、３８８位、３８９位、３９０位、４１３位、４１６位及び４２１位の位置に、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個または９個の置換を含む。これらの位置に導入し得る例示的な置換は、表４及び５に示されている。いくつかの実施形態では、３８８位及び／または４２１位のアミノ酸は、芳香族アミノ酸、例えば、Ｔｒｐ、ＰｈｅまたはＴｙｒである。いくつかの実施形態では、３８８位のアミノ酸は、Ｔｒｐである。いくつかの実施形態では、４２１位の芳香族アミノ酸は、ＴｒｐまたはＰｈｅである。
いくつかの実施形態では、３８４位のＬｅｕ、Ｔｙｒ、ＭｅｔもしくはＶａｌ、３８６位のＬｅｕ、Ｔｈｒ、ＨｉｓもしくはＰｒｏ、３８７位のＶａｌ、Ｐｒｏもしくは酸性アミノ酸、３８８位の芳香族アミノ酸、例えばＴｒｐ、３８９位のＶａｌ、ＳｅｒもしくはＡｌａ、４１３位の酸性アミノ酸、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＴｈｒもしくはＰｒｏ、４１６位のＴｈｒもしくは酸性アミノ酸、または４２１位のＴｒｐ、Ｔｙｒ、ＨｉｓもしくはＰｈｅのように、少なくとも１つの位置が置換されている。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、上記の組の中の位置のうちの１つ以上に、所定のアミノ酸の保存的置換、例えば、同じ荷電グループ、同じ疎水性グループ、同じ側鎖環構造グループ（例えば芳香族アミノ酸）もしくは同じサイズグループ及び／または同じ極性もしくは非極性グループ内のアミノ酸を含み得る。したがって、例えば、３８４位、３８６位及び／または４１３位に、Ｉｌｅが存在し得る。いくつかの実施形態では、３８７位、４１３位及び４１６位の１個、２個またはそれぞれの位置の酸性アミノ酸は、Ｇｌｕである。別の実施形態では、３８７位、４１３位及び４１６位の１個、２個またはそれぞれの位置の酸性アミノ酸は、Ａｓｐである。いくつかの実施形態では、３８４位、３８６位、３８７位、３８８位、３８９位、４１３位、４１６位及び４２１位のうちの２個、３個、４個、５個、６個、７個または８個すべては、この段落に定められているように、アミノ酸置換を有する。
いくつかの実施形態では、上記の２つの段落に記載されているように改変されているＦｃポリペプチドは、３９０位に天然型Ａｓｎを含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、３９０位にＧｌｙ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＡｓｐを含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵナンバリングスキームによれば、３８０位、３９１位、３９２位及び４１５位を含む位置における１個、２個、３個または４個の置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、３８０位に、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ＬｅｕまたはＧｌｎが存在し得る。いくつかの実施形態では、３９１位に、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＧｌｎまたはＰｈｅが存在し得る。いくつかの実施形態では、３９２位に、Ｇｌｎ、ＰｈｅまたはＨｉｓが存在し得る。いくつかの実施形態では、４１５位に、Ｇｌｕが存在し得る。
ある特定の実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、Ｔｒｐ、ＬｅｕもしくはＧｌｕである３８０位、ＴｙｒもしくはＰｈｅである３８４位、Ｔｈｒである３８６位、Ｇｌｕである３８７位、Ｔｒｐである３８８位、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＶａｌもしくはＡｓｎである３８９位、ＳｅｒもしくはＡｓｎである３９０位、ＴｈｒもしくはＳｅｒである４１３位、ＧｌｕもしくはＳｅｒである４１５位、Ｇｌｕである４１６位、及び／またはＰｈｅである４２１位から選択した２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個または１１個の位置を含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、Ｔｒｐ、ＬｅｕもしくはＧｌｕである３８０位、ＴｙｒもしくはＰｈｅである３８４位、Ｔｈｒである３８６位、Ｇｌｕである３８７位、Ｔｒｐである３８８位、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＶａｌもしくはＡｓｎである３８９位、ＳｅｒもしくはＡｓｎである３９０位、ＴｈｒもしくはＳｅｒである４１３位、ＧｌｕもしくはＳｅｒである４１５位、Ｇｌｕである４１６位及び／またはＰｈｅである４２１位という１１個すべてを含む。
ある特定の実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、３８４位にＬｅｕもしくはＭｅｔ、３８６位にＬｅｕ、ＨｉｓもしくはＰｒｏ、３８７位にＶａｌ、３８８位にＴｒｐ、３８９位にＶａｌもしくはＡｌａ、４１３位にＰｒｏ、４１６位にＴｈｒ、及び／または４２１位にＴｒｐを含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、３９１位に、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＧｌｎまたはＰｈｅをさらに含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、３８０位にＴｒｐ、Ｔｙｒ、ＬｅｕもしくはＧｌｎ及び／または３９２位にＧｌｎ、ＰｈｅもしくはＨｉｓをさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｔｒｐが３８０位に存在し、及び／またはＧｌｎが３９２位に存在する。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、３８０位にＴｒｐを有さない。
別の実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、３８４位にＴｙｒ、３８６位にＴｈｒ、３８７位にＧｌｕまたはＶａｌ、３８８位にＴｒｐ、３８９位にＳｅｒ、４１３位にＳｅｒもしくはＴｈｒ、４１６位にＧｌｕ、及び／または４２１位にＰｈｅを含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、３９０位に天然型Ａｓｎを含む。ある特定の実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、３８０位にＴｒｐ、Ｔｙｒ、ＬｅｕもしくはＧｌｎ、及び／または４１５位にＧｌｕをさらに含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、３８０位にＴｒｐ及び／または４１５位にＧｌｕをさらに含む。
追加の実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵナンバリングスキームによれば、４１４位、４２４位及び４２６位を含む位置における１個、２個または３個の置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、４１４位は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＧｌｙもしくはＰｒｏであり、４２４位は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＧｌｕもしくはＬｙｓであり、及び／または４２６位は、Ｓｅｒ、ＴｒｐもしくはＧｌｙである。
いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵナンバリングスキームによれば、３８０位のＴｒｐ、３８６位のＴｈｒ、３８８位のＴｒｐ、３８９位のＶａｌ、４１３位のＴｈｒもしくはＳｅｒ、４１５位のＧｌｕ、及び／または４２１位のＰｈｅという置換のうちの１つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号４〜９０、９７〜１００及び１０５〜１０８（例えば、配列番号３４〜３８、５８及び６０〜９０）のうちのいずれか１つの１１１〜２１７位のアミノ酸と、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号４〜９０、９７〜１００及び１０５〜１０８（例えば、配列番号３４〜３８、５８及び６０〜９０）のうちのいずれか１つと、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号４〜９０、９７〜１００及び１０５〜１０８（例えば、配列番号３４〜３８、５８及び６０〜９０）のうちのいずれか１つの、ＥＵインデックスで３８４〜３９０位及び／または４１３〜４２１位のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、４〜９０、９７〜１００及び１０５〜１０８（例えば、配列番号３４〜３８、５８及び６０〜９０）のうちのいずれか１つの、ＥＵインデックスで３８０〜３９０位及び／または４１３〜４２１位のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号４〜９０、９７〜１００及び１０５〜１０８（例えば、配列番号３４〜３８、５８及び６０〜９０）のうちのいずれか１つの、ＥＵインデックスで３８０〜３９２位及び／または４１３〜４２６位のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号４〜９０、９７〜１００及び１０５〜１０８（例えば、配列番号３４〜３８、５８及び６０〜９０）のうちのいずれか１つと、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有し、ＥＵインデックスに従って番号付けした場合、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、ＧｌｎまたはＧｌｕである３８０位、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、ＭｅｔまたはＶａｌである３８４位、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、ＨｉｓまたはＰｒｏである３８６位、Ｖａｌ、Ｐｒｏまたは酸性アミノ酸である３８７位、芳香族アミノ酸、例えばＴｒｐである３８８位、Ｖａｌ、ＳｅｒまたはＡｌａである３８９位、ＳｅｒまたはＡｓｎである３９０位、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＧｌｎまたはＰｈｅである３９１位、Ｇｌｎ、ＰｈｅまたはＨｉｓである３９２位、酸性アミノ酸、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＴｈｒまたはＰｒｏである４１３位、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＧｌｙまたはＰｒｏである４１４位、ＧｌｕまたはＳｅｒである４１５位、Ｔｈｒまたは酸性アミノ酸である４１６位、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ＨｉｓまたはＰｈｅである４２１位、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＧｌｕまたはＬｙｓである４２４位、及びＳｅｒ、ＴｒｐまたはＧｌｙである４２６位という位置のうちの少なくとも５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個または１６個をさらに含む。
いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号３４〜３８、５８及び６０〜９０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号３４〜３８、５８及び６０〜９０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むが、１個、２個または３個のアミノ酸が置換されている。
いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、下記のＶＩ節に記載されている変異のような追加の変異を含み、その変異としては、ノブ変異（例えば、ＥＵナンバリングを基準にして番号付けした場合のＴ３６６Ｗ）、ホール変異（例えば、ＥＵナンバリングを基準にして番号付けした場合のＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵナンバリングを基準にして番号付けした場合のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び／またはＰ３２９Ｇ（例えばＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ））、及び／または血清中安定性もしくは血清中半減期を向上させる変異（例えば、（ｉ）ＥＵナンバリングを基準にして番号付けした場合のＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、もしくは（ｉｉ）ＥＵナンバリングスキームに従って番号付けした場合の、Ｍ４２８Ｌを伴うかもしくは伴わないＮ４３４Ｓ）が挙げられるが、これらに限らない。例示として、配列番号１５６〜２２９に、これらの追加の変異のうちの１つ以上を含む変異をＣＨ３ドメインに有する改変Ｆｃポリペプチドの非限定的な例（例えば、ＣＨ３Ｃ．３５．２０．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．２、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．３、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．４、ＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２及びＣＨ３Ｃ．３５．２３というクローン）が示されている。
いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、ノブ変異（例えば、ＥＵナンバリングを基準にして番号付けした場合のＴ３６６Ｗ）を含み、配列番号１５６、１６８、１８０、１９２、２０４及び２１６のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１５６、１６８、１８０、１９２、２０４及び２１６のうちのいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、ノブ変異（例えば、ＥＵナンバリングを基準にして番号付けした場合のＴ３６６Ｗ）、ならびにエフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵナンバリングを基準にして番号付けした場合のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ，及び／またはＰ３２９Ｇ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ））を含み、配列番号１５７、１５８、１６９、１７０、１８１、１８２、１９３、１９４、２０５、２０６、２１７、２１８、２２８及び２２９のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１５７、１５８、１６９、１７０、１８１、１８２、１９３、１９４、２０５、２０６、２１７及び２１８のうちのいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、ノブ変異（例えば、ＥＵナンバリングを基準にして番号付けした場合のＴ３６６Ｗ）、ならびに血清中安定性または血清中半減期を向上させる変異（例えば、（ｉ）ＥＵナンバリングを基準にして番号付けした場合のＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、または（ｉｉ）ＥＵナンバリングスキームに従って番号付けした場合の、Ｍ４２８Ｌを伴うかもしくは伴わないＮ４３４Ｓ）を含み、配列番号１５９、１７１、１８３、１９５、２０７及び２１９のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１５９、１７１、１８３、１９５、２０７及び２１９のうちのいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、ノブ変異（例えば、ＥＵナンバリングを基準にして番号付けした場合のＴ３６６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵナンバリングを基準にして番号付けした場合のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び／またはＰ３２９Ｇ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ））、ならびに血清中安定性または血清中半減期を向上させる変異（例えば、（ｉ）ＥＵナンバリングを基準にして番号付けした場合のＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、または（ｉｉ）ＥＵナンバリングスキームに従って番号付けした場合の、Ｍ４２８Ｌを伴うかもしくは伴わないＮ４３４Ｓ）を含み、配列番号１６０、１６１、１７２、１７３、１８４、１８５、１９６、１９７、２０８、２０９、２２０及び２２１のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１６０、１６１、１７２、１７３、１８４、１８５、１９６、１９７、２０８、２０９、２２０及び２２１のうちのいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、ホール変異（例えば、ＥＵナンバリングを基準にして番号付けした場合のＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）を含み、配列番号１６２、１７４、１８６、１９８、２１０及び２２２のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１６２、１７４、１８６、１９８、２１０及び２２２のうちのいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、ホール変異（例えば、ＥＵナンバリングを基準にして番号付けした場合のＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）、ならびにエフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵナンバリングを基準にして番号付けした場合のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び／またはＰ３２９Ｇ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ））を含み、配列番号１６３、１６４、１７５、１７６、１８７、１８８、１９９、２００、２１１、２１２、２２３及び２２４のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１６３、１６４、１７５、１７６、１８７、１８８、１９９、２００、２１１、２１２、２２３及び２２４のうちのいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、ホール変異（例えば、ＥＵナンバリングを基準にして番号付けした場合のＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）、ならびに血清中安定性または血清中半減期を向上させる変異（例えば、（ｉ）ＥＵナンバリングを基準にして番号付けした場合のＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、または（ｉｉ）ＥＵナンバリングスキームに従って番号付けした場合の、Ｍ４２８Ｌを伴うかもしくは伴わないＮ４３４Ｓ）を含み、配列番号１６５、１７７、１８９、２０１、２１３及び２２５のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１６５、１７７、１８９、２０１、２１３及び２２５のうちのいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、ホール変異（例えば、ＥＵナンバリングを基準にして番号付けした場合のＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵナンバリングを基準にして番号付けした場合のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及び／またはＰ３２９Ｇ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ））、ならびに血清中安定性または血清中半減期を向上させる変異（例えば、（ｉ）ＥＵナンバリングを基準にして番号付けした場合のＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、または（ｉｉ）ＥＵナンバリングスキームに従って番号付けした場合の、Ｍ４２８Ｌを伴うかもしくは伴わないＮ４３４Ｓ）を含み、配列番号１６６、１６７、１７８、１７９、１９０、１９１、２０２、２０３、２１４、２１５、２２６及び２２７のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１６６、１６７、１７８、１７９、１９０、１９１、２０２、２０３、２１４、２１５、２２６及び２２７のうちのいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵナンバリングスキームによれば、３４５位、３４６位、３４７位、３４９位、４３７位、４３８位、４３９位及び４４０位に、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個または８個の置換を含む。例示的な改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１２４〜１２８に示されている。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、４３７位にＧｌｙ、４３８位にＰｈｅ及び／または４４０位にＡｓｐを含む。いくつかの実施形態では、４４０位にＧｌｕが存在する。ある特定の実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、ＰｈｅもしくはＩｌｅである３４５位、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＡｌａもしくはＬｙｓである３４６位、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＩｌｅもしくはＡｓｐである３４７位、ＴｈｒもしくはＡｌａである３４９位、Ｇｌｙである４３７位、Ｐｈｅである４３８位、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、ＳｅｒもしくはＰｈｅである４３９位、またはＡｓｐである４４０位という位置のように、少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、３４５位、３４６位、３４７位、３４９位、４３７位、４３８位、４３９位及び４４０位のうちの２個、３個、４個、５個、６個、７個または８個すべてが、この段落に定められているように置換を有する。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、上記の組の中の位置のうちの１つ以上に、所定のアミノ酸の保存的置換、例えば、同じ荷電グループ、同じ疎水性グループ、同じ側鎖環構造グループ（例えば芳香族アミノ酸）、同じサイズグループ及び／または極性もしくは非極性グループ内のアミノ酸を含み得る。
いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１２４〜１２８のうちのいずれか１つの１１１〜２１７位のアミノ酸と、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１２４〜１２８と、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１２４〜１２８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１２４〜１２８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むが、１個、２個または３個のアミノ酸が置換されている。
ＣＨ２ドメインに変異を含むＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチドは、ＣＨ２ドメインに置換を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＴｆＲ結合活性のために改変されているヒトＩｇ ＣＨ２ドメイン（ＩｇＧ ＣＨ２ドメインなど）を含む。そのＣＨ２ドメインは、いずれかのＩｇＧサブタイプ、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４に由来するものであることができる。ＩｇＧ抗体に関しては、ＣＨ２ドメインとは、ＥＵナンバリングスキームに従って番号付けした場合、約２３１位〜約３４０位のアミノ酸のセグメントを指す。
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチドは、ＴｆＲのアピカルドメインに結合し、トランスフェリンのＴｆＲへの結合をブロックしたり、または別段に阻害したりすることなく、ＴｆＲに結合し得る。いくつかの実施形態では、トランスフェリンのＴｆＲへの結合は、実質的に阻害されない。いくつかの実施形態では、トランスフェリンのＴｆＲへの結合が阻害されるのは、約５０％未満（例えば、約４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満または５％未満）である。いくつかの実施形態では、トランスフェリンのＴｆＲへの結合が阻害されるのは、約２０％未満（例えば、約１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満または１％未満）である。
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵナンバリングスキームによれば、２７４位、２７６位、２８３位、２８５位、２８６位、２８７位、２８８位及び２９０位における少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個または９個の置換を含む。例示的な改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１２９〜１３３に記載されている。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、２８７位にＧｌｕ及び／または２８８位にＴｒｐを含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｓｎ、ＴｙｒもしくはＴｒｐである２７４位、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、ＡｌａもしくはＴｙｒである２７６位、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、ＡｓｎもしくはＰｈｅである２８３位、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＡｌａもしくはＧｌｙである２８５位、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、ＡｒｇもしくはＶａｌである２８６位、Ｇｌｕである２８７位、ＴｒｐもしくはＴｙｒである２８８位、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、ＶａｌもしくはＡｓｐである２８９位、またはＬｅｕ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、ＴｙｒもしくはＶａｌである２９０位という位置のように、少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、２７４位、２７６位、２８３位、２８５位、２８６位、２８７位、２８８位及び２９０位のうちの２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個または９個すべてが、この段落に定められているように置換を有する。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、上記の組の中の位置のうちの１つ以上に、所定のアミノ酸の保存的置換、例えば、同じ荷電グループ、同じ疎水性グループ、同じ側鎖環構造グループ（例えば芳香族アミノ酸）、同じサイズグループ、及び／または同じ極性もしくは非極性グループ内のアミノ酸を含み得る。
いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、２７４位にＧｌｕ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＡｓｎもしくはＴｙｒ、２７６位にＩｌｅ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、ＡｌａもしくはＴｙｒ、２８３位にＡｓｐ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＡｌａもしくはＡｓｎ、２８５位にＡｒｇ、ＳｅｒもしくはＡｌａ、２８６位にＴｙｒ、Ｔｒｐ、ＡｒｇもしくはＶａｌ、２８７位にＧｌｕ、２８８位にＴｒｐ、２８９位にＧｌｎ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、ＰｈｅもしくはＶａｌ、及び／または２９０位にＬｅｕ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、ＡｓｎもしくはＴｙｒを含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、２８５位にＡｒｇ、２８６位にＴｙｒもしくはＴｒｐ、２８７位にＧｌｕ、２８８位にＴｒｐ、及び／または２９０位にＡｒｇもしくはＴｒｐを含む。
いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１２９〜１３３のうちのいずれか１つの１〜１１０位のアミノ酸と、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１２９〜１３３と、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１２９〜１３３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１２９〜１３３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むが、１個、２個または３個のアミノ酸が置換されている。
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵナンバリングスキームによれば、２６６位、２６７位、２６８位、２６９位、２７０位、２７１位、２９５位、２９７位、２９８位及び２９９位における少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の置換を含む。例示的な改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１３４〜１３８に示されている。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、２７０位にＰｒｏ、２９５位にＧｌｕ及び／または２９７位にＴｙｒを含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、ＭｅｔもしくはＡｓｐである２６６位、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、ＡｓｐもしくはＴｙｒである２６７位、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、ＴｒｐもしくはＬｅｕである２６８位、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ａｌａ、ＴｈｒもしくはＡｓｐである２６９位、Ｐｒｏ、ＶａｌもしくはＰｈｅである２７０位、Ｔｒｐ、Ｇｌｎ、ＴｈｒもしくはＧｌｕである２７１位、Ｇｌｕ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＬｅｕもしくはＴｒｐである２９５位、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、ＶａｌもしくはＡｓｐである２９７位、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、ＡｓｎもしくはＶａｌである２９８位、またはＴｙｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、ＳｅｒもしくはＰｒｏである２９９位という位置のように、少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、２６６位、２６７位、２６８位、２６９位、２７０位、２７１位、２９５位、２９７位、２９８位及び２９９位のうちの２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個すべてが、この段落に定められているような置換を有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、上記の組の中の位置のうちの１つ以上に、所定のアミノ酸の保存的置換、例えば、同じ荷電グループ、同じ疎水性グループ、同じ側鎖環構造グループ（例えば芳香族アミノ酸）、同じサイズグループ、及び／または同じ極性もしくは非極性グループ内のアミノ酸を含み得る。
いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、２６６位にＰｒｏ、ＰｈｅもしくはＡｌａ、２６７位にＧｌｎ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＡｌａもしくはＩｌｅ、２６８位にＴｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、ＰｈｅもしくはＴｒｐ、２６９位にＰｒｏ、ＶａｌもしくはＡｌａ、２７０位にＰｒｏ、２７１位にＴｒｐもしくはＧｌｎ、２９５位にＧｌｕ、２９７位にＴｙｒ、２９８位にＴｈｒ、ＨｉｓもしくはＧｌｎ、及び／または２９９位にＴｙｒ、Ａｓｎ、ＡｓｐもしくはＳｅｒを含む。
いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、２６６位にＭｅｔ、２６７位にＬｅｕもしくはＧｌｕ、２６８位にＴｒｐ、２６９位にＰｒｏ、２７０位にＶａｌ、２７１位にＴｈｒ、２９５位にＶａｌもしくはＴｈｒ、１９７位にＨｉｓ、１９８位にＨｉｓ、ＡｒｇもしくはＡｓｎ、及び／または２９９位にＰｒｏを含む。
いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、２６６位にＡｓｐ、２６７位にＡｓｐ、２６８位にＬｅｕ、２６９位にＴｈｒ、２７０位にＰｈｅ、２７１位にＧｌｎ、２９５位にＶａｌもしくはＬｅｕ、２９７位にＶａｌ、２９８位にＴｈｒ、及び／または２９９位にＰｒｏを含む。
いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１３４〜１３８のうちのいずれか１つの１〜１１０位のアミノ酸と、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１３４〜１３８と、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１３４〜１３８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１３４〜１３８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むが、１個、２個または３個のアミノ酸が置換されている。
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵナンバリングスキームによれば、２６８位、２６９位、２７０位、２７１位、２７２位、２９２位、２９３位、２９４位及び３００位に、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の置換を含む。例示的な改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１３９〜１４３に示されている。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、ＶａｌもしくはＡｓｐである２６８位、Ｐｒｏ、ＭｅｔもしくはＡｓｐである２６９位、ＰｒｏもしくはＴｒｐである２７０位、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、ＧｌｕもしくはＴｈｒである２７１位、Ｍｅｔ、ＴｙｒもしくはＴｒｐである２７２位、ＬｅｕもしくはＴｒｐである２９２位、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＩｌｅもしくはＬｙｓである２９３位、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、ＡｌａもしくはＬｅｕである２９４位、Ｈｉｓ、ＬｅｕもしくはＰｒｏである２９６位、またはＶａｌもしくはＴｒｐである３００位という位置のように、少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、２６８位、２６９位、２７０位、２７１位、２７２位、２９２位、２９３位、２９４位及び３００位のうちの２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個すべてが、この段落に定められているような置換を有する。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、上記の組の中の位置のうちの１つ以上に、所定のアミノ酸の保存的置換、例えば、同じ荷電グループ、同じ疎水性グループ、同じ側鎖環構造グループ（例えば芳香族アミノ酸）、同じサイズグループ、及び／または同じ極性もしくは非極性グループ内のアミノ酸を含み得る。
いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、２６８位にＶａｌ、２６９位にＰｒｏ、２７０位にＰｒｏ、２７１位にＡｒｇもしくはＴｒｐ、２７２位にＭｅｔ、２９２位にＬｅｕ、２９３位にＴｈｒ、２９４位にＳｅｒ、２９６位にＨｉｓ、及び／または３００位にＶａｌを含む。
いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、２６８位にＡｓｐ、２６９位にＭｅｔもしくはＡｓｐ、２７０位にＴｒｐ、２７１位にＧｌｕもしくはＴｈｒ、２７２位にＴｙｒもしくはＴｒｐ、２９２位にＴｒｐ、２９３位にＶａｌ、ＩｌｅもしくはＬｙｓ、２９４位にＬｙｓ、ＡｌａもしくはＬｅｕ、２９６位にＬｅｕもしくはＰｒｏ、及び／または３００位にＴｒｐを含む。
いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１３９〜１４３のうちのいずれか１つの１〜１１０位のアミノ酸と、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１３９〜１４３と少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１３９〜１４３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１３９〜１４３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むが、１個、２個または３個のアミノ酸が置換されている。
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵナンバリングスキームによれば、２７２位、２７４位、２７６位、３２２位、３２４位、３２６位、３２９位、３３０位及び３３１位の位置における少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の置換を有する。例示的な改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１４４〜１４８に示されている。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、３３０位にＴｒｐを含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、ＩｌｅもしくはＡｌａである２７２位、ＴｒｐもしくはＧｌｙである２７４位、Ｔｙｒ、ＡｒｇもしくはＧｌｕである２７６位、Ｓｅｒ、ＡｒｇもしくはＧｌｎである３２２位、Ｖａｌ、ＳｅｒもしくはＰｈｅである３２４位、Ｉｌｅ、ＳｅｒもしくはＴｒｐである３２６位、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ＡｒｇもしくはＡｓｐである３２９位、Ｔｒｐである３３０位、またはＳｅｒ、Ｌｙｓ、ＡｒｇもしくはＶａｌである３３１位という位置のように、少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、２７２位、２７４位、２７６位、３２２位、３２４位、３２６位、３２９位、３３０位及び３３１位のうちの２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個または９個すべてが、この段落に定められているような置換を有する。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、上記の組の中の位置のうちの１つ以上に、所定のアミノ酸の保存的置換、例えば、同じ荷電グループ、同じ疎水性グループ、同じ側鎖環構造グループ（例えば芳香族アミノ酸）、同じサイズグループ、及び／または同じ極性もしくは非極性グループ内のアミノ酸を含み得る。
いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、ＩｌｅもしくはＡｌａである２７２位、ＴｒｐもしくはＧｌｙである２７４位、Ｔｙｒ、ＡｒｇもしくはＧｌｕである２７６位、Ｓｅｒ、ＡｒｇもしくはＧｌｎである３２２位、Ｖａｌ、ＳｅｒもしくはＰｈｅである３２４位、Ｉｌｅ、ＳｅｒもしくはＴｒｐである３２６位、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ＡｒｇもしくはＡｓｐである３２９位、Ｔｒｐである３３０位、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、ＡｒｇもしくはＶａｌである３３１位から選択した２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個または９個の位置を含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、２７２位にＶａｌもしくはＩｌｅ、２７４位にＧｌｙ、２７６位にＡｒｇ、３２２位にＡｒｇ、３２４位にＳｅｒ、３２６位にＳｅｒ、３２９位にＴｈｒ、ＳｅｒもしくはＡｒｇ、３３０位にＴｒｐ、及び／または３３１位にＬｙｓもしくはＡｒｇを含む。
いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１４４〜１４８のうちのいずれか１つの１〜１１０位のアミノ酸と、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１４４〜１４８と、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１４４〜１４８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１４４〜１４８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むが、１個、２個または３個のアミノ酸が置換されている。
ＶＩ．追加のＦｃポリペプチド変異
いくつかの態様では、本明細書に記載されている融合タンパク質はそれぞれ、独立して選択した改変を含み得るか、または野生型Ｆｃポリペプチド、例えばヒトＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドであり得る２つのＦｃポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、一方または両方のＦｃポリペプチドは、血液脳関門（ＢＢＢ）受容体、例えばトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）への結合をもたらす１つ以上の改変を含む。一方または両方のＦｃポリペプチドに導入できる他の変異の非限定的な例としては、例えば、血清中安定性もしくは血清中半減期を向上させるための変異、エフェクター機能を調節するための変異、グリコシル化に影響を及ぼすための変異、ヒトにおいて免疫原性を低下させるための変異、及び／またはそれらのＦｃポリペプチドのノブとホールをヘテロ二量化させるための変異が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本発明の融合タンパク質に存在するＦｃポリペプチドは独立して、対応する野生型Ｆｃポリペプチド（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＦｃポリペプチド）と、少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、本発明の融合タンパク質に存在するＦｃポリペプチドは、ヘテロ二量体の形成を促すとともに、ホモ二量体の形成を阻害するように、ノブ変異及びホール変異を含む。概して、その改変では、第１のポリペプチドの界面に隆起（「ノブ」）を導入するとともに、第２のポリペプチドの界面に、対応するくぼみ（「ホール」）を導入して、その隆起をそのくぼみの中に配置して、ヘテロ二量体の形成を促し、その結果、ホモ二量体の形成を阻害できるようにする。隆起は、第１のポリペプチドの界面の小さいアミノ酸側鎖を大きい側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）に置き換えることによって構築する。隆起を相殺するくぼみであって、隆起と同じまたは同程度のサイズのくぼみは、大きいアミノ酸側鎖を小さい側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）に置き換えることによって、第２のポリペプチドの界面に作製する。いくつかの実施形態では、このような追加の変異は、Ｆｃポリペプチドの位置のうち、そのポリペプチドのＢＢＢ受容体、例えばＴｆＲへの結合に対する悪影響を有さない位置に存在する。
二量化のための、ノブ及びホールによるアプローチの例示的な一実施形態では、本発明の融合タンパク質に存在するＦｃポリペプチドのうちの１つの３６６位（ＥＵナンバリングスキームに従って番号付けした場合）は、天然型トレオニンの代わりに、トリプトファンを含む。その二量体のもう一方のＦｃポリペプチドは、４０７位（ＥＵナンバリングスキームに従って番号付けした場合）に、天然型チロシンの代わりにバリンを有する。そのもう一方のＦｃポリペプチドは、３６６位（ＥＵナンバリングスキームに従って番号付けした場合）の天然型トレオニンがセリンに置換されているとともに、３６８位（ＥＵナンバリングスキームに従って番号付けした場合）の天然型ロイシンがアラニンに置換されている置換をさらに含み得る。したがって、本明細書に記載されている融合タンパク質のＦｃポリペプチドのうちの一方は、Ｔ３６６Ｗというノブ変異を有し、もう一方のＦｃポリペプチドは、Ｙ４０７Ｖという変異を有し、典型的には、Ｔ３６６Ｓ及びＬ３６８Ａというホール変異を伴う。
いくつかの実施形態では、血清中半減期を向上させる改変を導入し得る。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている融合タンパク質に存在する一方または両方のＦｃポリペプチドは、ＥＵナンバリングスキームに従って番号付けした場合、２５２位にチロシン、２５４位にトレオニン、及び２５６位にグルタミン酸を含み得る。したがって、一方または両方のＦｃポリペプチドは、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅという置換を有し得る。あるいは、一方または両方のＦｃポリペプチドは、ＥＵナンバリングスキームに従って番号付けした場合、Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓという置換を有し得る。あるいは、一方または両方のＦｃポリペプチドは、Ｎ４３４ＳまたはＮ４３４Ａという置換を有し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている融合タンパク質に存在する一方または両方のＦｃポリペプチドは、エフェクター機能を低下させる改変、すなわち、そのエフェクター機能を媒介するエフェクター細胞上に発現しているＦｃ受容体に結合すると、特定の生体機能を誘導する能力が低減されている改変を含み得る。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合性及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）、細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）のダウンレギュレーション及びＢ細胞の活性化が挙げられるが、これらに限らない。エフェクター機能は、抗体のクラスによって異なり得る。例えば、天然型ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ３抗体は、免疫系細胞上に存在する適切なＦｃ受容体に結合すると、ＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性を誘発でき、天然型ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４は、免疫細胞上に存在する適切なＦｃ受容体に結合すると、ＡＤＣＰの機能を誘発できる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている融合タンパク質に存在する一方または両方のＦｃポリペプチドは、ヘテロ二量化のための他の改変（例えば、ＣＨ３とＣＨ３の界面内の接触残基であって、天然においては帯電している残基の静電的操作、または疎水性パッチの改変）を含むように操作されていてよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている融合タンパク質に存在する一方または両方のＦｃポリペプチドは、エフェクター機能を調節する追加の改変を含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている融合タンパク質に存在する一方または両方のＦｃポリペプチドは、エフェクター機能を低下または消失させる改変を含み得る。エフェクター機能を低下させる例示的なＦｃポリペプチド変異としては、ＥＵナンバリングスキームによれば、ＣＨ２ドメイン内、例えば２３４位及び２３５位の置換が挙げられるが、これらに限らない。例えば、いくつかの実施形態では、一方または両方のＦｃポリペプチドは、２３４位及び２３５位にアラニン残基を含むことができる。したがって、一方または両方のＦｃポリペプチドは、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）という置換を有し得る。
エフェクター機能を調節する追加のＦｃポリペプチド変異としては、そのＦｃのプロリン３２９と、ＦｃγＲＩＩＩのトリプトファン残基Ｔｒｐ８７及びＴｒｐ１１０の間で形成されるＦｃ／Ｆｃγ受容体界面を破壊するのに充分な大きさのグリシン、アルギニンまたはアミノ酸残基で、プロリンが置換されている変異を有し得る３２９位が挙げられるが、これらに限らない。追加の例示的な置換としては、ＥＵナンバリングスキームによれば、Ｓ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ及びＰ３３１Ｓが挙げられる。置換は、複数存在してもよい（例えば、ＥＵナンバリングスキームによれば、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域のＳ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅ、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ及びＧ２３７Ａ、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＧ２３７Ａ、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域のＶ２３４Ａ及びＧ２３７Ａ、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域のＬ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ及びＥ３１８Ａ、ならびにヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域のＳ２２８Ｐ及びＬ２３６Ｅ）。いくつかの実施形態では、一方または両方のＦｃポリペプチドは、ＡＤＣＣを調節する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、ＥＵナンバリングスキームによれば、２９８位、３３３位及び／または３３４位の置換を有し得る。
追加の変異を含む例示的なＦｃポリペプチド
非限定的な例として、本明細書に記載されている融合タンパク質に存在する一方または両方のＦｃポリペプチドは、ノブ変異（例えば、ＥＵナンバリングスキームに従って番号付けした場合のＴ３６６Ｗ）、ホール変異（例えば、ＥＵナンバリングスキームに従って番号付けした場合のＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵナンバリングスキームに従って番号付けした場合のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び／またはＰ３２９Ｇ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ））、及び／または血清中安定性または血清中半減期を向上させる変異（例えば、（ｉ）ＥＵナンバリングを基準にして番号付けした場合のＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、または（ｉｉ）ＥＵナンバリングスキームに従って番号付けした場合の、Ｍ４２８Ｌを伴うかもしくは伴わないＮ４３４Ｓ）を含む追加の変異を含み得る。
いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ノブ変異（例えば、ＥＵナンバリングスキームに従って番号付けした場合のＴ３６６Ｗ）を有し得るとともに、配列番号１、４〜９０及び１２４〜１４８のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、配列番号１、４〜９０及び１２４〜１４８のうちのいずれか１つの配列を有するＦｃポリペプチドは、ノブ変異を有するように改変されていてよい。
いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ノブ変異（例えば、ＥＵナンバリングスキームに従って番号付けした場合のＴ３６６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵナンバリングスキームに従って番号付けした場合のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び／またはＰ３２９Ｇ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ））を有し得るとともに、配列番号１、４〜９０及び１２４〜１４８のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、配列番号１、４〜９０及び１２４〜１４８のうちのいずれか１つの配列を有するＦｃポリペプチドは、ノブ変異、及びエフェクター機能を調節する変異を有するように改変されていてよい。
いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ノブ変異（例えば、ＥＵナンバリングスキームに従って番号付けした場合のＴ３６６Ｗ）、血清中安定性または血清中半減期を向上させる変異（例えば、（ｉ）ＥＵナンバリングを基準にして番号付けした場合のＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、または（ｉｉ）ＥＵナンバリングスキームに従って番号付けした場合の、Ｍ４２８Ｌを伴うかもしくは伴わないＮ４３４Ｓ）を有し得るとともに、配列番号１、４〜９０及び１２４〜１４８のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、配列番号１、４〜９０及び１２４〜１４８のうちのいずれか１つの配列を有するＦｃポリペプチドは、ノブ変異、及び血清中安定性または血清中半減期を向上させる変異を有するように改変されていてよい。
いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ノブ変異（例えば、ＥＵナンバリングスキームに従って番号付けした場合のＴ３６６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵナンバリングスキームに従って番号付けした場合のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び／またはＰ３２９Ｇ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を向上させる変異（例えば、（ｉ）ＥＵナンバリングを基準にして番号付けした場合のＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、または（ｉｉ）ＥＵナンバリングスキームに従って番号付けした場合の、Ｍ４２８Ｌを伴うかもしくは伴わないＮ４３４Ｓ）を有し得るとともに、配列番号１、４〜９０及び１２４〜１４８のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、配列番号１、４〜９０及び１２４〜１４８のうちのいずれか１つの配列を有するＦｃポリペプチドは、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を向上させる変異を有するように改変されていてよい。
いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ホール変異（例えば、ＥＵナンバリングスキームに従って番号付けした場合のＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）を有し得るとともに、配列番号１、４〜９０及び１２４〜１４８のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、配列番号１、４〜９０及び１２４〜１４８のうちのいずれか１つの配列を有するＦｃポリペプチドは、ホール変異を有するように改変されていてよい。
いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ホール変異（例えば、ＥＵナンバリングスキームに従って番号付けした場合のＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵナンバリングスキームに従って番号付けした場合のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び／またはＰ３２９Ｇ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ））を有し得るとともに、配列番号１、４〜９０及び１２４〜１４８のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、配列番号１、４〜９０及び１２４〜１４８のうちのいずれか１つの配列を有するＦｃポリペプチドは、ホール変異、及びエフェクター機能を調節する変異を有するように改変されていてよい。
いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ホール変異（例えば、ＥＵナンバリングスキームに従って番号付けした場合のＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）、血清中安定性または血清中半減期を向上させる変異（例えば、（ｉ）ＥＵナンバリングを基準にして番号付けした場合のＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、または（ｉｉ）ＥＵナンバリングスキームに従って番号付けした場合の、Ｍ４２８Ｌを伴うかもしくは伴わないＮ４３４Ｓ）を有し得るとともに、配列番号１、４〜９０及び１２４〜１４８のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、配列番号１、４〜９０及び１２４〜１４８のうちのいずれか１つの配列を有するＦｃポリペプチドは、ホール変異、及び血清中安定性または血清中半減期を向上させる変異を有するように改変されていてよい。
いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ホール変異（例えば、ＥＵナンバリングスキームに従って番号付けした場合のＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵナンバリングスキームに従って番号付けした場合のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び／またはＰ３２９Ｇ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を向上させる変異（例えば、（ｉ）ＥＵナンバリングを基準にして番号付けした場合のＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、または（ｉｉ）ＥＵナンバリングスキームに従って番号付けした場合の、Ｍ４２８Ｌを伴うかもしくは伴わないＮ４３４Ｓ）を有し得るとともに、配列番号１、４〜９０及び１２４〜１４８のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、配列番号１、４〜９０及び１２４〜１４８のうちのいずれか１つの配列を有するＦｃポリペプチドは、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を向上させる変異を有するように改変されていてよい。
ＶＩＩ．ＥＲＴ用酵素を含む例示的な融合タンパク質
いくつかの態様では、本明細書に記載されている融合タンパク質は、酵素補充療法（ＥＲＴ）用酵素、ＥＲＴ用酵素バリアントまたはその触媒活性断片に連結されている第１のＦｃポリペプチド、及び第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖及び／または軽鎖可変領域配列、あるいはそれらの抗原結合部分を含まない。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、ＩＤＳ、ＳＧＳＨ、ＡＳＭまたはＧＢＡである。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、改変Ｆｃポリペプチドであり、及び／または第２のＦｃポリペプチドは、改変Ｆｃポリペプチドである。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、改変Ｆｃポリペプチドである。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、もう一方のＦｃポリペプチドとのヘテロ二量化を促す１つ以上の改変を含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、エフェクター機能を低下させる１つ以上の改変を含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、血清中半減期を延長する１つ以上の改変を含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、血液脳関門（ＢＢＢ）受容体、例えばトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）への結合をもたらす１つ以上の改変を含む。
別の態様では、本明細書に記載されている融合タンパク質は、ＢＢＢ受容体、例えばＴｆＲに特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチドを含む第１のポリペプチド鎖、及びその改変Ｆｃポリペプチドと二量化して、Ｆｃ二量体を形成するＦｃポリペプチドを含む第２のポリペプチド鎖を含む。ＥＲＴ用酵素は、第１のポリペプチド鎖または第２のポリペプチド鎖のいずれかに連結されていてよい。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、ＩＤＳ、ＳＧＳＨ、ＡＳＭまたはＧＢＡである。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、第２のポリペプチド鎖に連結されている。いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質は、それらのポリペプチド鎖の一方にそれぞれ連結されている２つのＥＲＴ用酵素を含む。いくつかの実施形態では、そのＦｃポリペプチドは、第１のポリペプチド鎖の改変Ｆｃポリペプチドと同じＢＢＢ受容体に特異的に結合するＢＢＢ受容体結合ポリペプチドであってよい。いくつかの実施形態では、そのＦｃポリペプチドは、ＢＢＢ受容体に特異的に結合しない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている融合タンパク質は、ＴｆＲに特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチドを含む第１のポリペプチド鎖、及びＦｃポリペプチドを含む第２のポリペプチド鎖を含み、その改変Ｆｃポリペプチド及びＦｃポリペプチドは、二量化して、Ｆｃ二量体を形成する。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、ＩＤＳ、ＳＧＳＨ、ＡＳＭまたはＧＢＡである。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、第１のポリペプチド鎖に連結されている。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、第２のポリペプチド鎖に連結されている。いくつかの実施形態では、そのＦｃポリペプチドは、ＢＢＢ受容体、例えばＴｆＲに特異的に結合しない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている融合タンパク質は、ＴｆＲに結合するとともに、Ｔ３６６Ｗ（ノブ）置換を含む改変Ｆｃポリペプチドを含む第１のポリペプチド鎖、ならびにＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（ホール）置換を含むＦｃポリペプチドを含む第２のポリペプチド鎖を含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチド及び／またはＦｃポリペプチドは、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチド及び／またはＦｃポリペプチドは、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ（ＹＴＥ）置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチド及び／またはＦｃポリペプチドは、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）置換、ならびにＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ（ＹＴＥ）置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチド及び／またはＦｃポリペプチドは、２３４位、２３５位、２５２位、２５４位、２５６位及び３６６位に、ヒトＩｇＧ１ 野生型残基を含む。
いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号９７〜１００、１５１、１５６〜１６１、１６８〜１７３、１８０〜１８５、１９２〜１９７、２０４〜２０９及び２１６〜２２１のいずれか１つにおいて、定められているようなノブ変異、ＬＡＬＡ変異及びＹＴＥ変異を含むとともに、そのそれぞれの配列と、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性もしくは少なくとも９５％の同一性を有するか、または配列番号９７〜１００、１５１、１５６〜１６１、１６８〜１７３、１８０〜１８５、１９２〜１９７、２０４〜２０９及び２１６〜２２１のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＦｃポリペプチドは、配列番号１０１〜１０４のいずれか１つにおいて、定められているようなホール変異、ＬＡＬＡ変異及びＹＴＥ変異を含むとともに、そのそれぞれの配列と、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性もしくは少なくとも９５％の同一性を有するか、または配列番号１０１〜１０４のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号９７〜１００、１５１、１５６〜１６１、１６８〜１７３、１８０〜１８５、１９２〜１９７、２０４〜２０９及び２１６〜２２１のうちのいずれか１つを含み、そのＦｃポリペプチドは、配列番号１０１〜１０４のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチド及び／またはＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、配列番号１１３）を含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１１６、２２８及び２２９のうちのいずれかの１つと、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有するか、または配列番号１１６、２２８及び２２９のうちのいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている融合タンパク質は、ＴｆＲに結合するとともに、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（ホール）置換を含む改変Ｆｃポリペプチドを含む第１のポリペプチド鎖、ならびにＴ３６６Ｗ（ノブ）置換を含むＦｃポリペプチドを含む第２のポリペプチド鎖を含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチド及び／またはＦｃポリペプチドは、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチド及び／またはＦｃポリペプチドは、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ（ＹＴＥ）置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチド及び／またはＦｃポリペプチドは、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）置換、ならびにＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ（ＹＴＥ）置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチド及び／またはＦｃポリペプチドは、２３４位、２３５位、２５２位、２５４位、２５６位及び３６６位に、ヒトＩｇＧ１ 野生型残基を含む。
いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１０５〜１０８、１６２〜１６７、１７４〜１７９、１８６〜１９１、１９８〜２０３、２１０〜２１５及び２２２〜２２７のうちのいずれか１つにおいて、定められているようなホール変異、ＬＡＬＡ変異及びＹＴＥ変異を含み、そのそれぞれの配列と、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性もしくは少なくとも９５％の同一性を有するか、または配列番号１０５〜１０８、１６２〜１６７、１７４〜１７９、１８６〜１９１、１９８〜２０３、２１０〜２１５及び２２２〜２２７のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＦｃポリペプチドは、配列番号１０９〜１１２のいずれか１つにおいて、定められているようなノブ変異、ＬＡＬＡ変異及びＹＴＥ変異を含み、そのそれぞれの配列と、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性もしくは少なくとも９５％の同一性を有するか、または配列番号１０９〜１１２のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１０５〜１０８、１６２〜１６７、１７４〜１７９、１８６〜１９１、１９８〜２０３、２１０〜２１５及び２２２〜２２７のうちのいずれか１つを含み、そのＦｃポリペプチドは、配列番号１０９〜１１２のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチド及び／またはＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、配列番号１１３）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている融合タンパク質に存在するＥＲＴ用酵素、例えば、ＩＤＳ、ＳＧＳＨ、ＡＳＭまたはＧＢＡは、配列番号１０１〜１０４のうちのいずれかと、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有するＦｃポリペプチドを含むか、または（例えば融合ポリペプチドとして、）配列番号１０１〜１０４のうちのいずれか１つの配列を含むポリペプチド鎖に連結されている。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素、例えば、ＩＤＳ、ＳＧＳＨ、ＡＳＭまたはＧＢＡは、そのＦｃポリペプチドに、フレキシブルリンカーなどのリンカー、及び／またはヒンジ領域もしくはその一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、配列番号１１３）によって連結されている。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、配列番号１１４、２３０及び２３４のうちのいずれか１つと、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有するＩＤＳ配列を含むか、または配列番号１１４、２３０及び２３４のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＦｃポリペプチドに連結されているＩＤＳ配列は、配列番号１１５、１１７、２３１、２３２、２３５及び２３６のいずれか１つと、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有するか、または配列番号１１５、１１７、２３１、２３２、２３５及び２３６のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、配列番号１２０と少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有するＳＧＳＨ配列を含むか、または配列番号１２０の配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＦｃポリペプチドに連結されているＳＧＳＨ配列は、配列番号１４９及び１５０のうちのいずれか１つと、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有するか、または配列番号１４９及び１５０のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号９７〜１００、１５１、１５６〜１６１、１６８〜１７３、１８０〜１８５、１９２〜１９７、２０４〜２０９及び２１６〜２２１のうちのいずれか１つと、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有する改変Ｆｃポリペプチドを含むか、または配列番号９７〜１００、１５１、１５６〜１６１、１６８〜１７３、１８０〜１８５、１９２〜１９７、２０４〜２０９及び２１６〜２２１のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＦｃポリペプチド及び／または改変ＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、配列番号１１３）を含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１１６、２２８及び２２９のうちのいずれか１つと、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有するか、または配列番号１１６、２２８及び２２９のうちのいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１１５の配列を含むＩＤＳ−Ｆｃ融合ポリペプチド、ならびに配列番号２０５及び２２８のうちのいずれか１つの配列を含む改変Ｆｃポリペプチドを含む。別の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１１５の配列を含むＩＤＳ−Ｆｃ融合ポリペプチド、ならびに配列番号１６９及び２２９のうちのいずれか１つの配列を含む改変Ｆｃポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号２３１の配列を含むＩＤＳ−Ｆｃ融合ポリペプチド、ならびに配列番号２０５及び２２８のうちのいずれか１つの配列を含む改変Ｆｃポリペプチドを含む。別の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号２３１の配列を含むＩＤＳ−Ｆｃ融合ポリペプチド、ならびに配列番号１６９及び２２９のうちのいずれか１つの配列を含む改変Ｆｃポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号２３５の配列を含むＩＤＳ−Ｆｃ融合ポリペプチド、ならびに配列番号２０５及び２２８のうちのいずれか１つの配列を含む改変Ｆｃポリペプチドを含む。別の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号２３５の配列を含むＩＤＳ−Ｆｃ融合ポリペプチド、ならびに配列番号１６９及び２２９のうちのいずれか１つの配列を含む改変Ｆｃポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている融合タンパク質に存在するＥＲＴ用酵素、例えば、ＩＤＳ、ＳＧＳＨ、ＡＳＭまたはＧＢＡは、配列番号１０９〜１１２のうちのいずれか１つと、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有するＦｃポリペプチドを含むか、または（例えば融合ポリペプチドとして、）配列番号１０９〜１１２のうちのいずれか１つの配列を含むポリペプチド鎖に連結されている。いくつかの実施形態では、ＥＲＴ用酵素、例えば、ＩＤＳ、ＳＧＳＨ、ＡＳＭまたはＧＢＡは、そのＦｃポリペプチドに、フレキシブルリンカーなどのリンカー、及び／またはヒンジ領域もしくはその一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、配列番号１１３）によって連結されている。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、配列番号１１４、２３０及び２３４のうちのいずれか１つと、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有するＩＤＳ配列を含むか、または配列番号１１４、２３０及び２３４のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＦｃポリペプチドに連結されているＩＤＳ配列は、配列番号１１８、２３３及び２３７のうちのいずれか１つと、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有するか、または配列番号１１８、２３３及び２３７のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、配列番号１２０と少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有するＳＧＳＨ配列を含むか、または配列番号１２０の配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＦｃポリペプチドに連結されているＳＧＳＨ配列は、配列番号１５２及び１５３のうちのいずれか１つと、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有するか、または配列番号１５２及び１５３のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１０５〜１０８、１６２〜１６７、１７４〜１７９、１８６〜１９１、１９８〜２０３、２１０〜２１５及び２２２〜２２７のうちのいずれか１つと、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有する改変Ｆｃポリペプチドを含むか、または配列番号１０５〜１０８、１６２〜１６７、１７４〜１７９、１８６〜１９１、１９８〜２０３、２１０〜２１５及び２２２〜２２７のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＦｃポリペプチド及び／または改変ＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、配列番号１１３）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている融合タンパク質に存在するＥＲＴ用酵素、例えば、ＩＤＳ、ＳＧＳＨ、ＡＳＭまたはＧＢＡは、配列番号９７〜１００、１５１、１５６〜１６１、１６８〜１７３、１８０〜１８５、１９２〜１９７、２０４〜２０９及び２１６〜２２１のうちのいずれか１つと、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有する改変Ｆｃポリペプチドを含むか、または（例えば融合ポリペプチドとして、）配列番号９７〜１００、１５１、１５６〜１６１、１６８〜１７３、１８０〜１８５、１９２〜１９７、２０４〜２０９及び２１６〜２２１のうちのいずれか１つの配列を含むポリペプチド鎖に連結されている。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素、例えば、ＩＤＳ、ＳＧＳＨ、ＡＳＭまたはＧＢＡは、その改変Ｆｃポリペプチドに、フレキシブルリンカーなどのリンカー、及び／またはヒンジ領域もしくはその一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、配列番号１１３）によって連結されている。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、配列番号１１４、２３０及び２３４のうちのいずれか１つと、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有するＩＤＳ配列を含むか、または配列番号１１４、２３０及び２３４のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、配列番号１２０と少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有するＳＧＳＨ配列を含むか、または配列番号１２０の配列を含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチドに連結されているＳＧＳＨ配列は、配列番号１５４及び１５５のうちのいずれか１つと、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有するか、または配列番号１５４及び１５５のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１０１〜１０４、１４９及び１５０のうちのいずれか１つと、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有するＦｃポリペプチドを含むか、または配列番号１０１〜１０４、１４９及び１５０のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチド及び／またはＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、配列番号１１３）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている融合タンパク質に存在するＥＲＴ用酵素、例えば、ＩＤＳ、ＳＧＳＨ、ＡＳＭまたはＧＢＡは、配列番号１０５〜１０８、１６２〜１６７、１７４〜１７９、１８６〜１９１、１９８〜２０３、２１０〜２１５及び２２２〜２２７のうちのいずれか１つと、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有する改変Ｆｃポリペプチドを含むか、または（例えば融合ポリペプチドとして、）配列番号１０５〜１０８、１６２〜１６７、１７４〜１７９、１８６〜１９１、１９８〜２０３、２１０〜２１５及び２２２〜２２７のうちのいずれか１つの配列を含むポリペプチド鎖に連結されている。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素、例えば、ＩＤＳ、ＳＧＳＨ、ＡＳＭまたはＧＢＡは、その改変Ｆｃポリペプチドに、フレキシブルリンカーなどのリンカー、及び／またはヒンジ領域もしくはその一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、配列番号１１３）によって連結されている。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、配列番号１１４、２３０及び２３４のうちのいずれか１つと、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有するＩＤＳ配列を含むか、または配列番号１１４、２３０及び２３４のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、配列番号１２０と少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有するＳＧＳＨ配列を含むか、または配列番号１２０の配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１０９〜１１２のうちのいずれか１つと、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有するＦｃポリペプチドを含むか、または配列番号１０９〜１１２のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１５２及び１５３のうちのいずれか１つと、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有するか、または配列番号１５２及び１５３のうちのいずれか１つの配列を含むＦｃポリペプチドに連結されているＳＧＳＨ配列を含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｆｃポリペプチド及び／またはＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、配列番号１１３）を含む。
ＶＩＩＩ．結合反応速度、親和性、脳内濃度及び脳暴露の測定
本明細書に記載されている融合タンパク質及びその他の組成物は、結合親和性が広範であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、タンパク質は、血液脳関門（ＢＢＢ）受容体、例えばトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に対する親和性が、１ｐＭ〜１０μＭのうちのいずれかの範囲である。いくつかの実施形態では、ＴｆＲに対する親和性は、１ｎＭ〜５μＭまたは１０ｎＭ〜１μＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ＴｆＲに対する親和性は、約５０ｎＭ〜約２５０ｎＭの範囲である。
いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合ポリペプチドの親和性は、一価の形態で測定し得る。別の実施形態では、親和性は、二価の形態、例えば、ポリペプチド−Ｆａｂ融合タンパク質を含む二量体として測定し得る。
ＢＢＢ受容体、例えばＴｆＲへの結合を解析するために、結合親和性、結合反応速度及び交叉反応性を解析する方法は、当該技術分野において知られている。これらの方法としては、固相結合アッセイ（例えばＥＬＩＳＡアッセイ）、免疫沈降法、表面プラズモン共鳴（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））、結合平衡除外アッセイ（例えばＫｉｎＥｘＡ（登録商標））、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、バイオレイヤー干渉法（例えば、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ））及びウエスタンブロット解析が挙げられるが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、ＥＬＩＳＡを用いて、結合親和性及び／または交叉反応性を求める。ＥＬＩＳＡアッセイを実施する方法は、当該技術分野において知られており、下記の実施例の節にも記載されている。いくつかの実施形態では、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて、結合親和性、結合反応速度及び／または交叉反応性を求める。いくつかの実施形態では、結合平衡除外アッセイを用いて、結合親和性、結合反応速度及び／または交叉反応性を求める。いくつかの実施形態では、バイオレイヤー干渉アッセイを用いて、結合親和性、結合反応速度及び／または交叉反応性を求める。
結合親和性（例えばＴｆＲに対する結合親和性）を求める方法の非限定的な例は、下記の実施例１３に記載されており、実施例１３では、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）の計器を用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって親和性を求めた。この方法では、対象となる操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドまたはＴｆＲ結合抗体をセンサーチップ上に捕捉させ、そのセンサーチップ上に、ＴｆＲの段階希釈液を所定の流速（例えば３０μＬ／分）及び温度（例えば室温）で注入する。所定の結合時間及び解離時間（例えば、４５秒の結合時間及び１８０秒の解離時間）を用いて、試料を解析してから、センサーチップを再生した。結合応答測定値をコントロール（例えば、同様の密度で無関係なＩｇＧを用いたもの）から減じることによって、結合応答を補正してから、平衡応答を濃度に対してフィッティングするためのソフトウェアを用いることによって、定常状態親和性を求めることができる。
脳内及び／または血漿中の操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチド、ＴｆＲ結合抗体または薬剤（例えば、その操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドもしくはＴｆＲ結合抗体に連結されている薬剤）の濃度は、例えば、ヒトトランスフェリン受容体（ｈＴｆＲ）ノックインマウスモデルを用いて測定できる。このようなモデルを用いて、例えば、最高脳内濃度（Ｃｍａｘ）及び／または脳暴露を測定及び／または比較して、例えば、Ｃｍａｘが上昇しているか、及び／または脳暴露が延長してるかを判断できる。ヒトアピカルＴｆＲ（ＴｆＲｍｓ／ｈｕ）ノックインマウスモデルの作製については、下記の実施例１２に記載されている。好適なモデルを作製するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて、マウスＴｆｒｃ遺伝子内でヒトＴｆｒｃアピカルドメインを発現する（例えば、内因性プロモーターの制御下で、インビボ発現する）マウスを作製できる。特には、Ｃａｓ９、シングルガイドＲＮＡ及びドナーＤＮＡ（例えば、マウスでの発現に合わせてコドン最適化されたヒトアピカルドメインコード配列）をマウス胚に（例えば前核注入によって）導入できる。続いて、その胚を偽妊娠雌マウスに移すことができる。胚を移植されたその雌の子孫に由来する雄ファウンダーを野生型の雌と交配して、Ｆ１ヘテロ接合体マウスを得ることができる。続いて、Ｆ１世代のヘテロ接合体マウスの交配によって、ホモ接合体マウスを得ることができる。
操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチド、ＴｆＲ結合抗体または薬剤（例えば、その操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドもしくはＴｆＲ結合抗体に連結されている薬剤）の脳内及び／または血漿中の濃度または暴露を評価するために、その操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチド、ＴｆＲ結合抗体（例えば、薬剤に連結されている）を、そのマウスモデル（例えばＴｆＲｍｓ／ｈｕ）に投与できる。好適な期間の後、そのマウスから血漿試料を採取してから、その血管系に好適な液を灌流させることができる。灌流後、脳（またはその一部）を取り出し、ホモジナイズして、溶解させることができる。続いて、当業者に理解される標準的な方法を用いて、血漿及び／または脳溶解液中の薬剤の濃度を求めることができる。非限定的な例として、下記の実施例３に記載されているようなＥＬＩＳＡベースのアッセイを用いて、濃度を測定できる。簡潔に述べると、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、（例えば、血漿または溶解液中の）薬剤、操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドまたはＴｆＲ結合抗体の濃度を定量できる。捕捉用抗体（例えば、抗Ｆｃ捕捉用抗体）をプレート（例えば、３８４ウェルＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレート）に、所望の濃度（例えば約３μｇ／ｍＬ）でコーティングできる。そのプレートを（例えば５％ＢＳＡで）ブロックしてから、（例えば１：１，０００または１：１０，０００に）希釈した血漿とともにインキュベートする。次に、検出抗体を所望の濃度（例えば約０．５μｇ／ｍＬ）で加えてから、二次抗体（抗ヤギＨＲＰ抗体など）を加える。続いて、（例えばＴＭＢ基質を用いて、）そのプレートを発色させ、（例えば硫酸で）停止させ、プレートリーダー（例えばＢｉｏＴｅｋプレートリーダー）で、適切な波長（例えば４５０ｎｍ）における吸光度を測定する。適切な（例えば４倍）希釈系列を用いて、検量線を作成して、４パラメーターロジスティック回帰のようなアルゴリズムを用いてフィッティングできる。
そのノックインマウスモデルに様々な用量を投与することによって、検量線を作成できる。そのノックインマウスモデルに、異なる操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドもしくはＴｆＲ結合抗体（例えば、ＴｆＲ親和性が異なるもの）に連結されている薬剤、または参照ポリペプチドもしくは参照タンパク質（例えば、試験対象のポリペプチドもしくはタンパク質よりも、ＴｆＲに対する親和性が弱いもの）に連結されている薬剤を投与することによって、本発明の操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドまたはＴｆＲ結合抗体が、薬剤への脳暴露及び／または脳内での薬剤のＣｍａｘ値に及ぼす作用について、比較を行うことができる。
ＩＸ．Ｆｃポリペプチドに連結されているＥＲＴ用酵素
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている融合タンパク質は、本明細書に記載されているような２つのＦｃポリペプチドを含み、そのＦｃポリペプチドの一方または両方は、ヒンジ領域の一部または全部をさらに含み得る。そのヒンジ領域は、いずれかの免疫グロブリンサブクラスまたはアイソタイプに由来することができる。例示的な免疫グロブリンヒンジは、ＩｇＧ１ヒンジ領域などのＩｇＧヒンジ領域、例えば、ヒトＩｇＧ１ヒンジアミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号９５）またはその一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、配列番号１１３）である。いくつかの実施形態では、そのヒンジ領域は、そのＦｃポリペプチドのＮ末端領域にある。
いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ＥＲＴ用酵素に、リンカー、例えばペプチドリンカーによって連結されている。いくつかの実施形態では、そのＦｃポリペプチドは、ＥＲＴ用酵素に、ペプチド結合またはペプチドリンカー、例えば融合ポリペプチドによって連結されている。そのペプチドリンカーは、ＥＲＴ用酵素に連結されているＦｃポリペプチドに対して、ＥＲＴ用酵素を回転させるように、及び／またはプロテアーゼによる消化に対して耐性を示すように構成されていてよい。ペプチドリンカーは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸またはこれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、そのペプチドリンカーは、例えばＧｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａなどのようなアミノ酸を含むフレキシブルリンカーであり得る。このようなリンカーは、既知のパラメーターを用いて設計されており、任意の長さであり得るとともに、任意の長さの繰り返し単位（例えば、Ｇｌｙ及びＳｅｒ残基の繰り返し単位）を任意の数、含み得る。例えば、そのリンカーは、２個、３個、４個、５個もしくはそれを上回る数のＧｌｙ４−Ｓｅｒ（配列番号２３９）の繰り返しのような繰り返し、または１個のＧｌｙ４−Ｓｅｒ（配列番号２３９）を有し得る。いくつかの実施形態では、そのペプチドリンカーは、例えば、中枢神経系に存在する酵素によって切断可能であるプロテアーゼ切断部位を含み得る。
いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、そのＦｃポリペプチドのＮ末端に、例えば、Ｇｌｙ４−Ｓｅｒリンカー（配列番号２３９）または（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）２リンカー（配列番号２４０）によって連結されている。いくつかの実施形態では、そのＦｃポリペプチドは、そのリンカーに連結されているか、またはそのＥＲＴ用酵素に直接連結されているＮ末端に、ヒンジ配列またはヒンジ配列の一部を含み得る。
いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、そのＦｃポリペプチドのＣ末端に、例えば、Ｇｌｙ４−Ｓｅｒリンカー（配列番号２３９）または（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）２リンカー（配列番号２４０）によって連結されている。いくつかの実施形態では、そのＦｃポリペプチドのＣ末端は、そのＥＲＴ用酵素に直接連結されている。
いくつかの実施形態では、そのＥＲＴ用酵素は、そのＦｃポリペプチドに、化学架橋剤によって連結されている。このようなコンジュゲートは、周知の化学架橋試薬及びプロトコールを用いて作製できる。例えば、当業者に知られているとともに、そのポリペプチドを対象となる薬剤と架橋するのに有用である化学架橋剤は多数存在する。例えば、その架橋剤は、分子を段階的に連結するのに使用できるヘテロ二官能性架橋剤である。ヘテロ二官能性架橋剤によって、タンパク質をコンジュゲーションするために、より特異的なカップリング方法を設計できるようになり、それによって、ホモタンパク質ポリマーのような不要な副反応物の発生が低減される。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）またはその水溶性アナログＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−ａ−メチル−ａ−（２−ピリジルジチオ）−トルエン（ＳＭＰＴ）、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）及びスクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート］ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）を含め、多種多様なヘテロ二官能性架橋剤が、当該技術分野において知られている。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド部分を有するこれらの架橋剤は、概して水溶性が向上しているＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドアナログとして得ることができる。加えて、連結鎖内にジスルフィド架橋を有するこれらの架橋剤は、上記の代わりに、アルキル誘導体として合成して、インビボでのリンカー切断量を低減するようにできる。ヘテロ二官能性架橋剤に加えて、ホモ二官能性架橋剤及び光反応性架橋剤を含む他の架橋剤も数多く存在する。スベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）及びジメチルピメリミデート２ＨＣｌ（ＤＭＰ）は、有用なホモ二官能性架橋剤の例であり、ビス−［Ｂ−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）及びＮ−スクシンイミジル−６（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（ＳＡＮＰＡＨ）は、有用な光反応性架橋剤の例である。
Ｘ．タンパク質活性の評価
本明細書に記載されている融合タンパク質であって、例えばＩＤＳ、ＳＧＳＨ、ＡＳＭまたはＧＢＡのようなＥＲＴ用酵素を含む融合タンパク質の活性は、人工基質を用いてインビトロで活性を測定するアッセイを含む様々なアッセイ（実施例の節に記載されているようなアッセイなど）を用いて評価できる。インビトロでＩＤＳ活性を測定するための例示的なプロトコールは、実施例２に示されている。インビトロでＡＳＭ活性を測定するための例示的なプロトコールは、実施例５に示されている。インビトロでＳＧＳＨ活性を測定するための例示的なプロトコールは、実施例７及び８に示されている。
いくつかの態様では、ＩＤＳ活性は、ＩＤＳの欠損により蓄積するグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）であるヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の量について、細胞試料、組織試料または流体試料（例えば、ＣＳＦもしくは尿）などの試料をアッセイすることによって評価する。ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の量は、試料に存在するＧＡＧをヘパリナーゼ及びコンドロイチナーゼで消化することによって求める。続いて、得られた二糖を質量分析法（例えばＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によってアッセイできる。ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の蓄積が高レベルの試料では、ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸由来の二糖の量が増加していることになる。したがって、二糖のレベルは、ＩＤＳ酵素活性と反比例する。
質量分析（例えばＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）アッセイは、細胞試料、組織試料及び流体試料を含め、ＧＡＧが蓄積するいずれの試料でも行うことができる。このような試料を評価して、本明細書に記載されているＩＤＳ含有タンパク質であって、例えば、細胞にインビトロ投与するか、またはいくつかの実施形態では、対象にインビボ投与するＩＤＳ含有タンパク質の活性をモニタリングできる。その対象は、齧歯類動物、例えばマウス、またはヒト以外の霊長類動物のような動物であってよい。いくつかの実施形態では、その対象は、ＩＤＳ療法による治療を受けているハンター症候群患者のようなヒト患者であり、この場合、そのアッセイを用いて、その患者におけるＩＤＳ活性をモニタリングする。いくつかの実施形態では、そのヒト患者は、本明細書に記載されている融合タンパク質による治療を受けている。
細胞などの細胞性試料または組織試料では、そのアッセイは、細胞を破壊すること、及びマイクロベシクルを破壊して開くことを含む。細胞を破壊すること、またはマイクロベシクルを破壊して開くことは、凍結融解及び／または超音波処理を用いることによって行って、ＧＡＧを含む抽出物（例えば細胞抽出物）を得てよい。続いて、そのＧＡＧに対して、ヘパリナーゼ（例えば、本明細書に記載されているいずれか）及びコンドロイチナーゼでの処理を行い、その処理により、ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸ＧＡＧを分解する。消化後、ＧＡＧ二糖を含む上清を得て、その二糖生成物を質量分析法（例えばＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって解析する。例示的なプロトコールは、実施例２に示されている。
いくつかの実施形態では、ＩＤＳ活性についてアッセイする細胞試料を洗浄し、凍結する。細胞ペレットを二糖消化緩衝液中で超音波処理する。続いて、ヘパリナーゼＩ、ヘパリナーゼＩＩ、ヘパリナーゼＩＩＩ及びコンドロイチナーゼＢを含む消化緩衝液（コンドロイチナーゼＢは、デルマタン硫酸に対して特異的である）に、超音波処理した試料から得た全タンパク質を所望の量、加える。例えば約３時間、３０℃で消化後、酵素をＥＤＴＡ及び煮沸によって失活させる。続いて、試料を例えば１６，０００×Ｇで遠心分離し、その上清を遠心フィルターに移し、約１４，０００×Ｇで遠心分離する。続いて、二糖をアッセイ緩衝液：アセトニトリルの１：１（ｖ／ｖ比）の混合物に再懸濁し、例えば実施例２に記載されているように、エレクトロスプレー質量分析法と組み合わせた液体クロマトグラフィーによってさらに解析する。市販の参照標準物質の保持時間と比較した保持時間に基づき、ＧＡＧ由来の二糖生成物を同定できる。例示的なヘパラン硫酸由来の二糖としては、Ｄ０Ｓ０及びＤ２Ｓ０（Ｌａｗｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，５：２９１−２９２（２００８）による呼称）が挙げられる。
別の態様では、ＳＧＳＨ活性は、ＳＧＳＨの欠損により蓄積するヘパラン硫酸グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の量について、細胞試料または組織試料のような試料をアッセイすることによって評価する。ヘパラン硫酸の量は、試料に存在するＧＡＧをヘパリナーゼ（例えば、本明細書に記載さているいずれか）で消化することによって求める。続いて、得られた二糖を質量分析法（例えばＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によってアッセイできる。ヘパラン硫酸の蓄積が高レベルの試料では、ヘパラン硫酸由来の二糖の量が増加していることになる。したがって、二糖のレベルは、ＳＧＳＨ酵素活性と反比例する。
質量分析（例えばＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）アッセイは、細胞試料、組織試料及び流体試料を含め、ＧＡＧが蓄積するいずれの試料でも行うことができる。このような試料を評価して、本明細書に記載されているＳＧＳＨ含有タンパク質であって、例えば、細胞にインビトロ投与するか、またはいくつかの実施形態では、対象にインビボ投与するＳＧＳＨ含有タンパク質の活性をモニタリングできる。その対象は、齧歯類動物、例えばマウス、またはヒト以外の霊長類動物のような動物であってよい。いくつかの実施形態では、その対象は、ＳＧＳＨ療法による治療を受けているサンフィリポ症候群Ａ患者のようなヒト患者であり、この場合、そのアッセイを用いて、その患者におけるＳＧＳＨ活性をモニタリングする。いくつかの実施形態では、そのヒト患者は、本明細書に記載されている融合タンパク質による治療を受けている。
細胞などの細胞性試料または組織試料では、そのアッセイは、細胞を破壊すること、及び／またはマイクロベシクルを破壊して開くことを含む。細胞を破壊すること、またはマイクロベシクルを破壊して開くことは、凍結融解及び／または超音波処理を用いることによって行って、ＧＡＧを含む抽出物（例えば細胞抽出物）を得てよい。続いて、そのＧＡＧに対して、ヘパリナーゼ（例えば、本明細書に記載されているいずれか）での処理を行い、その処理により、ヘパラン硫酸ＧＡＧを分解する。消化後、ＧＡＧ二糖を含む上清を得て、その二糖生成物を質量分析法（例えばＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって解析する。例示的なプロトコールは、実施例７に示されている。
いくつかの実施形態では、ＳＧＳＨ活性についてアッセイする細胞試料を洗浄し、凍結する。細胞ペレットを二糖消化緩衝液中で超音波処理する。続いて、ヘパリナーゼＩ、ヘパリナーゼＩＩ及び／またはヘパリナーゼＩＩＩを含む消化緩衝液に、超音波処理した試料から得た全タンパク質を所望の量、加える。例えば約３時間、３０℃で消化後、酵素をＥＤＴＡ及び煮沸によって失活させる。続いて、試料を例えば１６，０００×Ｇで遠心分離し、その上清を遠心フィルターに移し、約１４，０００×Ｇで遠心分離する。続いて、二糖をアッセイ緩衝液：アセトニトリルの１：１（ｖ／ｖ比）の混合物に再懸濁し、例えば実施例７に記載されているように、エレクトロスプレー質量分析法と組み合わせた液体クロマトグラフィーによってさらに解析する。市販の参照標準物質の保持時間と比較した保持時間に基づき、ＧＡＧ由来の二糖生成物を同定できる。例示的なヘパラン硫酸由来の二糖としては、Ｄ０Ｓ０及びＤ２Ｓ０（Ｌａｗｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，５：２９１−２９２（２００８）による呼称）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、組織試料を評価する。組織試料は、典型的には、マイクロベシクルを破壊して開くようにする超音波処理ステップの前に、凍結−融解サイクルを複数回、例えば、２回、３回、４回、５回またはこれを上回る回数行うことが含まれる以外は、上記と同様のアッセイを用いて評価できる。
本明細書に記載されているアッセイによって評価できる試料としては、脳、肝臓、腎臓、肺、脾臓、血漿、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）及び尿が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている酵素−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、ＩＤＳ−ＦｃまたはＳＧＳＨ−Ｆｃ融合タンパク質）を投与されている患者から採取したＣＳＦ試料を評価し得る。
ＸＩ．核酸、ベクター及び宿主細胞
本明細書に記載されているような融合タンパク質に含まれるポリペプチド鎖は典型的には、組み換え法を用いて調製する。したがって、いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載されているようなＦｃポリペプチドを含むポリペプチド鎖のうちのいずれかをコードする核酸配列を含む単離核酸、及びその核酸が導入されている宿主細胞であって、そのポリペプチドコード核酸を複製し、及び／またはそのポリペプチドを発現させるのに使用する宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、その宿主細胞は、真核細胞、例えばヒト細胞である。
別の態様では、本明細書に記載されているポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。そのポリヌクレオチドは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。いくつかの実施形態では、そのポリヌクレオチドは、ＤＮＡである。ある特定の実施形態では、そのポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡである。いくつかの実施形態では、そのポリヌクレオチドは、ＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、そのポリヌクレオチドは、核酸コンストラクト内に含まれる。いくつかの実施形態では、そのコンストラクトは、複製可能なベクターである。いくつかの実施形態では、そのベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、ファージミド、酵母染色体ベクター及び非エピソーム哺乳動物ベクターから選択されている。
いくつかの実施形態では、そのポリヌクレオチドは、発現コンストラクト内の１つ以上の調節ヌクレオチド配列に機能可能に連結されている。一連の実施形態では、その核酸発現コンストラクトは、表面発現ライブラリーとして使用するように適合されている。いくつかの実施形態では、そのライブラリーは、酵母での表面発現用に適合されている。いくつかの実施形態では、そのライブラリーは、ファージでの表面発現用に適合されている。別の一連の実施形態では、その核酸発現コンストラクトは、ミリグラムまたはグラム単位の量でポリペプチドを単離可能にする系で、ポリペプチドを発現させるように適合されている。いくつかの実施形態では、その系は、哺乳動物細胞発現系である。いくつかの実施形態では、その系は、酵母細胞発現系である。
組み換えポリペプチドを産生させるための発現ビヒクルとしては、プラスミド及びその他のベクターが挙げられる。例えば、好適なベクターとしては、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞で発現させるためのｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミド及びｐＵＣ由来プラスミドというタイプのプラスミドが挙げられる。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏ及びｐＨｙｇ由来ベクターは、真核細胞のトランスフェクションに適する哺乳動物発現ベクターの例である。あるいは、真核細胞でポリペプチドを一過性に発現させるのには、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）またはエプスタインバーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来及びｐ２０５）のようなウイルスの誘導体を用いることができる。いくつかの実施形態では、バキュロウイルス発現系を用いることによって、組み換えポリペプチドを発現させるのが望ましいことがある。このようなバキュロウイルス発現系の例としては、ｐＶＬ由来ベクター（ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３及びｐＶＬ９４１など）、ｐＡｃＵＷ由来ベクター（ｐＡｃＵＷ１など）、ならびにｐＢｌｕｅＢａｃ由来ベクターが挙げられる。さらなる発現系としては、アデノウイルス発現系、アデノ随伴ウイルス発現系及びその他のウイルスの発現系が挙げられる。
ベクターは、いずれかの好適な宿主細胞に導入し得る。いくつかの実施形態では、その宿主細胞、例えば、細菌細胞または酵母細胞は、表面発現ライブラリーとして使用するように適合されていてよい。いくつかの細胞では、ベクターを宿主細胞で発現させて、比較的大量のポリペプチドを発現させる。このような宿主細胞としては、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び原核細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、その細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＮＳ０細胞、Ｙ０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ベロ細胞またはＨｅＬａ細胞のような哺乳動物細胞である。
本明細書に記載されているような１つ以上のＦｃポリペプチド鎖をコードする発現ベクターをトランスフェクションした宿主細胞は、１つ以上のポリペプチドを発現させるのに適切な条件下で培養できる。そのポリペプチドを分泌させ、そのポリペプチドを含む細胞及び培地の混合物から単離し得る。あるいは、そのポリペプチドは、細胞質または膜画分内に保持してよく、細胞を回収して溶解させ、所望の方法を用いて、ポリペプチドを単離してよい。
ＸＩＩ．治療方法
本明細書に記載されている操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドまたはＴｆＲ結合抗体に連結されている融合タンパク質または薬剤（例えば療法剤）を治療で用いて、ＬＳＤを治療してよい。いくつかの実施形態では、ＩＤＳを含む操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドまたはＴｆＲ結合抗体に連結されている融合タンパク質または薬剤で、ハンター症候群の患者を治療する。いくつかの実施形態では、ＳＧＳＨを含む操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドまたはＴｆＲ結合抗体に連結されている融合タンパク質または薬剤で、サンフィリポ症候群Ａの患者を治療する。いくつかの実施形態では、ＡＳＭを含む操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドまたはＴｆＲ結合抗体に連結されている融合タンパク質または薬剤で、ニーマンピック病の患者を治療する。いくつかの実施形態では、ＧＢＡを含む操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドまたはＴｆＲ結合抗体に連結されている融合タンパク質または薬剤で、ゴーシェ病またはパーキンソン病の患者を治療する。
本明細書に記載されている融合タンパク質であって、ＥＲＴ用酵素、例えば、ＩＤＳ、ＳＧＳＨ、ＡＳＭまたはＧＢＡを含む融合タンパク質は、対象に、治療上有効な量または用量で投与する。例示的な投与量としては、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまたは約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの１日用量の範囲を用いることができる。いくつかの実施形態では、そのタンパク質は、酵素活性が少なくとも約５００ユニット（Ｕ）／ｍｇ、約１，０００Ｕ／ｍｇ、または少なくとも約１，５００Ｕ／ｍｇ、２，０００Ｕ／ｍｇ、２，５００Ｕ／ｍｇ、３，０００Ｕ／ｍｇ、３，５００Ｕ／ｍｇ、４，０００Ｕ／ｍｇ、４，５００Ｕ／ｍｇ、５，０００Ｕ／ｍｇ、６，０００Ｕ／ｍｇ、７，０００Ｕ／ｍｇ、８，０００Ｕ／ｍｇ、９，０００Ｕ／ｍｇもしくは１０，０００Ｕ／ｍｇである。いくつかの実施形態では、その酵素活性は、少なくとも約１１，０００Ｕ／ｍｇ、または少なくとも約１２，０００Ｕ／ｍｇ、１３，０００Ｕ／ｍｇ、１４，０００Ｕ／ｍｇ、１５，０００Ｕ／ｍｇ、１６，０００Ｕ／ｍｇ、１７，０００Ｕ／ｍｇ、１８，０００Ｕ／ｍｇ、１９，０００Ｕ／ｍｇ、２０，０００Ｕ／ｍｇ、２５，０００Ｕ／ｍｇ、３０，０００Ｕ／ｍｇ、３５，０００Ｕ／ｍｇ、４０，０００Ｕ／ｍｇ、４５０００Ｕ／ｍｇもしくは５０，０００Ｕ／ｍｇ、あるいは、約５００Ｕ／ｍｇ〜約５０，０００Ｕ／ｍｇの範囲内のいずれかの値である。しかしながら、その投与量は、選択した投与経路、組成物の配合、患者の応答、状態の重症度、対象の体重及び処方医の判断を含むいくつかの要因に応じて変動し得る。その投与量は、時間の経過に伴い、個々の患者に必要とされるのに応じて、増減することができる。いくつかの実施形態では、最初は、患者に少ない用量で投与してから、患者が耐え得る有効な投与量まで増加させる。有効量の判断は、充分に当業者の能力の範囲内である。
各種実施形態では、本明細書に記載されている融合タンパク質は、非経口投与する。いくつかの実施形態では、そのタンパク質は、静脈内投与する。静脈内投与は、例えば、約１０〜約３０分の期間にわたって、または少なくとも１時間、２時間もしくは３時間の期間にわたって注入することによるものであることができる。いくつかの実施形態では、そのタンパク質は、静脈内ボーラスとして投与する。注入及びボーラス投与を組み合わせたものも用いてよい。
いくつかの非経口の実施形態では、操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドまたはＴｆＲ結合抗体に連結されている融合タンパク質または薬剤（例えば療法剤）は、腹腔内、皮下、皮内または筋肉内投与する。いくつかの実施形態では、操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドまたはＴｆＲ結合抗体に連結されているタンパク質または薬剤は、皮内または筋肉内投与する。いくつかの実施形態では、操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドまたはＴｆＲ結合抗体に連結されているタンパク質または薬剤は、髄腔内投与する（硬膜外投与または脳室内投与など）。
別の実施形態では、操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドまたはＴｆＲ結合抗体に連結されている融合タンパク質または薬剤（例えば療法剤）は、経口投与、経肺投与、鼻腔内投与、眼内投与または局所投与し得る。経肺投与は、例えば、吸入器またはネブライザー及びエアゾール化剤を有する製剤を用いることによって採用することもできる。
ＸＩＩＩ．タンパク質補充方法
別の態様では、本発明で提供するのは、哺乳動物の血液脳関門（ＢＢＢ）を越えて、薬剤（例えば、リソソーム蓄積障害（ＬＳＤ）の治療に有用である薬剤）を輸送する方法である。いくつかの実施形態では、その方法は、約５０ｎＭ〜約２５０ｎＭの親和性で、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に結合する（例えば特異的に結合する）ポリペプチドまたはタンパク質に、ＢＢＢを暴露させることを含む。いくつかの実施形態では、そのポリペプチドまたはタンパク質は、その薬剤に連結されており、ＢＢＢを越えて、その連結された薬剤を輸送する。いくつかの実施形態では、その哺乳動物の脳内のその薬剤の最高濃度（Ｃｍａｘ）が改善される（例えば上昇する）。
別の態様では、本発明で提供するのは、ＬＳＤの治療方法である。いくつかの実施形態では、その方法は、約５０ｎＭ〜約２５０ｎＭの親和性で、ＴｆＲに結合する（例えば特異的に結合する）ポリペプチドまたはタンパク質を哺乳動物に投与することを含む。いくつかの実施形態では、そのポリペプチドまたはタンパク質は、ＬＳＤを治療するための薬剤に連結されており、それによって、その哺乳動物の脳をその薬剤に暴露させる。
いくつかの実施形態では、そのポリペプチドまたはタンパク質は、約５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、１１０ｎＭ、１２０ｎＭ、１３０ｎＭ、１４０ｎＭ、１５０ｎＭ、１６０ｎＭ、１７０ｎＭ、１８０ｎＭ、１９０ｎＭ、２００ｎＭ、２１０ｎＭ、２２０ｎＭ、２３０ｎＭ、２４０ｎＭまたは２５０ｎＭの親和性で、ＴｆＲに結合する（例えば特異的に結合する）。いくつかの実施形態では、そのポリペプチドまたはタンパク質は、約１００ｎＭ〜約２００ｎＭまたは約１１０ｎＭ〜約１５０ｎＭの親和性で、ＴｆＲに結合する。
いくつかの実施形態では、そのポリペプチドまたはタンパク質（例えば、薬剤に連結されているもの）は、より弱い親和性でＴｆＲに結合する（例えば特異的に結合する）参照ポリペプチドまたは参照タンパク質に連結されている薬剤と比べて、その薬剤の脳内のＣｍａｘを改善（例えば上昇）させる。
いくつかの実施形態では、その薬剤の脳内のＣｍａｘは、参照ポリペプチドまたは参照タンパク質（例えば、より弱い親和性でＴｆＲに結合するもの）に連結されている薬剤と比べて、少なくとも約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．２倍、２．４倍、２．６倍、２．８倍、３倍、４倍、５倍またはそれを上回る程度、改善される（例えば上昇する）。
いくつかの実施形態では、その哺乳動物の脳は、参照ポリペプチドまたは参照タンパク質に連結されている薬剤よりも短い期間、治療上有効な濃度（例えば、ＬＳＤの１つ以上の兆候または症状を治療するのに充分な濃度）の薬剤に暴露させる。いくつかの実施形態では、脳暴露期間は、少なくとも約５％、１０％、２５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８５％、９０％、９５％または９８％短縮する。
いくつかの実施形態では、脳暴露（例えば、脳内の薬剤濃度）を時間の関数としてプロットし、その曲線下面積（ＡＵＣ）を算出することによって、脳暴露を定量化する。ＡＵＣの減少は、脳暴露量の低下または脳暴露時間の短縮を表すことができる。いくつかの実施形態では、脳の薬剤（例えば、治療上有効な濃度の薬剤）への暴露時間は、短縮する。
いくつかの実施形態では、その参照ポリペプチドまたは参照タンパク質は、約２５０ｎＭ、３００ｎＭ、３５０ｎＭ、４００ｎＭ、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭもしくは６００ｎＭであるか、またはこれよりも弱い親和性で、ＴｆＲに結合する（例えば特異的に結合する）。いくつかの実施形態では、その参照ポリペプチドまたは参照タンパク質は、約６００ｎＭ、またはそれより弱い親和性で、ＴｆＲに結合する。
いくつかの実施形態では、その哺乳動物は、霊長類動物（例えばヒト）である。いくつかの実施形態では、そのヒトは、ＬＳＤの治療が必要な患者である。いくつかの実施形態では、その患者は、ＬＳＤの１つ以上の兆候または症状を有する。
いくつかの実施形態では、そのポリペプチドまたはタンパク質は、霊長類動物ＴｆＲに結合する（例えば特異的に結合する）。いくつかの実施形態では、その霊長類動物ＴｆＲは、ヒトＴｆＲである。いくつかの実施形態では、そのポリペプチドまたはタンパク質は、ＴｆＲアピカルドメインに結合する。
いくつかの実施形態では、その薬剤（例えば療法剤）は、操作されたＴｆＲ結合ポリペプチドに連結されている。いくつかの実施形態では、その操作されたＴｆＲ結合ポリペプチドは、そのポリペプチドをＴｆＲに特異的に結合させる改変を有するＣＨ３またはＣＨ２ドメインを含む。好適な操作されたＴｆＲ結合ポリペプチドの非限定的な例が、本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、その薬剤は、表４または表５に記載されている操作されたＴｆＲ結合ポリペプチドに連結されている。いくつかの実施形態では、その薬剤は、ＣＨ３Ｃ．３５．２０．２、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．２、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．５、ＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７及びＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２からなる群から選択した操作されたＴｆＲ結合ポリペプチドに連結されている。
いくつかの実施形態では、その薬剤（例えば療法剤）は、ＴｆＲ結合ペプチドに連結されている。いくつかの実施形態では、そのＴｆＲ結合ペプチドは、約５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個または２０個のアミノ酸の長さである短いペプチドである。好適なペプチド（すなわち、所望の範囲の親和性でＴｆＲに結合するペプチド）を作製、スクリーニング及び特定する方法は、当該技術分野において知られている。例えば、ネガティブ選択及びポジティブ選択を交互に数ラウンド行うファージディスプレイ法を用いて、好適なペプチドを特定できる。この方策は、例えばＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６８：２００４−２０１２（２００１）に記載されており、この文献は、参照により、その全体が、あらゆる目的で本明細書に援用される。
いくつかの実施形態では、その薬剤（例えば療法剤）は、ＴｆＲ結合抗体に連結されている。好適なＴｆＲ結合抗体の非限定的な例としては、Ｔｈｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．，１５（４）：１４２０−１４３１（２０１８）に開示されているＯＸ２６抗ＴｆＲ抗体（すなわち、親和性が約７６ｎＭ、１０８ｎＭ及び１７４ｎＭであるＯＸ２６抗ＴｆＲ抗体）が挙げられる。いくつかの実施形態では、その薬剤は、ＴｆＲに特異的に結合する抗体可変領域を含むタンパク質に連結されている。いくつかのケースでは、そのタンパク質は、ＦａｂまたはｓｃＦｖを含む。
いくつかの実施形態では、その薬剤（例えば療法剤）は、タンパク質（例えば酵素）である。いくつかの実施形態では、その薬剤は、タンパク質補充療法剤である。いくつかの実施形態では、その薬剤は、哺乳動物の細胞またな組織（例えば、神経の細胞または組織）において欠損している（例えば、発現または存在しない）タンパク質または酵素である。いくつかの実施形態では、その薬剤は、哺乳動物の正常な健常細胞またな組織（例えば、神経の細胞または組織）において内因性であるかまたは発現するが、ＬＳＤの治療を受けている哺乳動物では（例えば、対応する細胞またな組織において）欠損しているタンパク質または酵素である。
いくつかの実施形態では、そのタンパク質補充療法剤は、酵素である。各種ＬＳＤの治療のために、任意の数の薬剤（例えば、酵素などのタンパク質補充療法剤）をポリペプチドまたはタンパク質（例えば、ＴｆＲに結合するもの）に連結できる。いくつかの実施形態では、その薬剤は、そのポリペプチドまたはタンパク質に連結されていると、その酵素が参照ポリペプチドまたは参照タンパク質に連結されている場合よりも、ＬＳＤである哺乳動物の脳内の毒性代謝産物の蓄積を大きく低減する酵素である。いくつかの実施形態では、その酵素は、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）であり、そのＬＳＤは、ハンター症候群である。いくつかのケースでは、その毒性代謝産物は、ヘパラン硫酸由来の二糖及び／またはデルマタン硫酸由来の二糖を含む。いくつかの実施形態では、その酵素は、Ｎ−スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）であり、そのＬＳＤは、サンフィリポ症候群である。いくつかの実施形態では、その酵素は、酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）であり、そのＬＳＤは、ニーマンピック病である。いくつかの実施形態では、その酵素は、β−グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）であり、そのＬＳＤは、ゴーシェ病である。
いくつかの実施形態では、その薬剤（例えば療法剤）は、抗体可変領域を含む。いくつかの実施形態では、その薬剤は、抗体断片を含む。いくつかの実施形態では、その薬剤は、ＦａｂまたはｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、その薬剤は、抗体可変領域を含まない。いくつかのケースでは、その薬剤は、抗βセクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）Ｆａｂを含まない。
追加の実施形態及びリンカー
ポリペプチド（例えば、本明細書にさらに記載されているような改変ＣＨ３またはＣＨ２ドメインポリペプチド）は、Ｆｃ領域の別のドメインに連結されていてよい。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＣＨ２ドメイン（天然のＣＨ２ドメインであっても、またはバリアントＣＨ２ドメインであってよい）に、典型的にはそのＣＨ２ドメインのＣ末端で連結されている。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ２ドメインポリペプチドは、ＣＨ３ドメイン（天然のＣＨ３ドメインであっても、またはＣＨ３バリアントドメインであってもよい）に、典型的にはそのＣＨ３ドメインのＮ末端で連結されている。いくつかの実施形態では、ＣＨ３ドメインに連結されている改変ＣＨ２ドメインを含むポリペプチド、またはＣＨ２ドメインに連結されている改変ＣＨ３ドメインを含むポリペプチドは、抗体のヒンジ領域の一部または全部をさらに含み、その結果、その改変ＣＨ３ドメインポリペプチドまたは改変ＣＨ２ドメインポリペプチドが、ヒンジ領域の一部または全部を有するＦｃ領域の一部である形態が得られる。そのヒンジ領域は、いずれかの免疫グロブリンサブクラスまたはアイソタイプに由来することができる。例示的な免疫グロブリンヒンジは、ＩｇＧヒンジ領域（ＩｇＧ１ヒンジ領域など）、例えばヒトＩｇＧ１ヒンジアミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号９５）である。
いくつかの実施形態では、操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドまたはＴｆＲ結合抗体は、タンパク質精製に有用であるペプチドまたはタンパク質、例えば、ポリヒスチジン、エピトープタグ（例えば、ＦＬＡＧ、ｃ−Ｍｙｃ、ヘマグルチニンタグなど）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧまたはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）に融合されている。いくつかのケースでは、操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドまたはＴｆＲ結合抗体が融合されているペプチドまたはタンパク質は、第Ｘａ因子またはトロンビンの切断部位のようなプロテアーゼ切断部位を含み得る。
本開示の方法では、薬剤（例えば療法剤）は、ポリペプチドまたはタンパク質（例えば、操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドまたはＴｆＲ結合抗体）に連結されている。そのリンカーは、薬剤をそのポリペプチドまたはタンパク質に連結するのに適するいずれかのリンカーであり得る。いくつかの実施形態では、その連結は、酵素によって切断可能である。特定の実施形態では、その連結は、中枢神経系に存在する酵素によって切断可能である。
いくつかの実施形態では、そのリンカーは、ペプチドリンカーである。そのペプチドリンカーは、薬剤（例えば療法剤）及びポリペプチドもしくはタンパク質を互いに対して回転させるように、及び／またはプロテアーゼによる消化に対して耐性を示すように構成されていてよい。いくつかの実施形態では、そのリンカーは、例えば、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａなどのようなアミノ酸を含むフレキシブルリンカーであってよい。このようなリンカーは、既知のパラメーターを用いて設計する。例えば、そのリンカーは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒの繰り返しのような繰り返しを有し得る。
各種実施形態では、そのポリペプチドまたはタンパク質（例えば、操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドまたはＴｆＲ結合抗体）へのその薬剤（例えば療法剤）の連結は、周知の化学架橋試薬及びプロトコールを用いて行うことができる。例えば、当業者に知られているとともに、そのポリペプチドまたはタンパク質を、対象となる薬剤と架橋するのに有用である化学架橋剤が、多数存在する。例えば、その架橋剤は、分子を段階的に連結するのに使用できるヘテロ二官能性架橋剤である。ヘテロ二官能性架橋剤は、タンパク質をコンジュゲートするためのさらに特異的なカップリング方法を設計できるようにし、それによって、ホモタンパク質ポリマーのような不要な副反応物の発生を低減する。
その薬剤（例えば療法剤）は、そのポリペプチドもしくはタンパク質のＮ末端もしくはＣ末端領域に連結されていても、またはそのポリペプチドもしくはタンパク質（例えば、操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドもしくはＴｆＲ結合抗体）のいずれかの領域に結合されていてもよい。ただし、その薬剤が、トランスフェリン受容体へのそのポリペプチドまたはタンパク質の結合を損なわないことを条件とする。
ＸＩＶ．医薬組成物及びキット
別の態様では、本明細書に記載されている融合タンパク質を含む医薬組成物及びキットを提供する。
医薬組成物
本開示で使用するための製剤を調製するための手引きは、当業者に知られている医薬調製物及び製剤用のいずれかの数のハンドブックに見ることができる。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載されているような融合タンパク質を含み、１つ以上の製薬学的に許容可能な担体及び／または賦形剤をさらに含む。製薬学的に許容可能な担体としては、生理学的に適合可能であるとともに、活性剤の活性を妨げたり、または別段に阻害したりしないいずれかの溶媒、分散媒またはコーティングが挙げられる。
いくつかの実施形態では、その担体は、静脈内投与、髄腔内投与、眼局所投与、脳室内投与、筋肉内投与、経口投与、腹腔内投与、経皮投与、局所投与または皮下投与に適するものである。製薬学的に許容可能な担体は、例えば、本発明の組成物を安定化させるか、または本発明のポリペプチドの吸収を増減させるように作用する１つ以上の生理学的に許容可能な化合物を含むことができる。生理学的に許容可能な化合物としては、例えば、グルコース、スクロースまたはデキストランのような炭水化物、アスコルビン酸またはグルタチオンのような抗酸化剤、キレート剤、低分子量タンパク質、活性剤の除去または加水分解を低減する組成物、賦形剤、あるいはその他の安定剤及び／または緩衝剤を挙げることができる。その他の製薬学的に許容可能な担体及びそれらの配合物も、当該技術分野において入手可能である。
本明細書に記載されている医薬組成物は、例えば、従来の混合プロセス、溶解プロセス、造粒プロセス、糖衣剤作製プロセス、乳化プロセス、カプセル化プロセス、封入プロセスまたは凍結乾燥プロセスによって製造できる。下記の方法及び賦形剤は、例示的なものである。
経口投与用では、本明細書に記載されているような融合タンパク質は、当該技術分野において周知である製薬学的に許容可能な担体と組み合わせることによって調合できる。そのような担体によって、本発明の融合タンパク質は、治療対象の患者が経口摂取するための錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、乳剤、親油性懸濁剤、親水性懸濁剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤などとして調合可能になる。経口用途の医薬調製物は、本発明の融合タンパク質と、固体賦形剤を混合し、任意に、得られた混合物を粉砕するとともに、所望の場合には、好適な補助剤を加えた後に、その顆粒混合物を処理して、錠剤または糖衣錠の中心錠を得ることによって得ることができる。好適な賦形剤としては、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトールもしくはソルビトールを含む糖のような充填剤、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、バレイショデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースのようなセルロース調製物、及び／またはポリビニルピロリドンが挙げられる。所望の場合には、架橋化ポリビニルピロリドン、寒天またはアルギン酸もしくはその塩（アルギン酸ナトリウムなど）のような崩壊剤を加えることができる。
上で開示したように、本明細書に記載されているような融合タンパク質は、注射、例えばボーラス注射、または持続注入による非経口投与用に調合できる。注射用では、本発明の融合タンパク質は、そのタンパク質を植物油またはその他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸またはプロピレングリコールのエステルのような水性または非水性溶媒中に、所望の場合には、可溶化剤、等張化剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤及び保存剤のような従来の添加剤とともに溶解、懸濁または乳化することによって、調製物に調合できる。いくつかの実施形態では、本発明の融合タンパク質は、生理学的に適合可能な緩衝剤のような水溶液中で調合でき、その水溶液の非限定的な例としては、ハンクス液、リンゲル液及び生理食塩水緩衝剤が挙げられる。注射用の製剤は、単位剤形で、例えばアンプルに、または保存剤が添加されている多投与量容器に入れることができる。その組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、溶液剤または乳剤としての形態を取ることができ、懸濁化剤、安定剤及び／または分散剤のような製剤化剤を含むことができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているような融合タンパク質は、持続放出型製剤、放出制御型製剤、徐放性製剤、時限放出型製剤または遅延放出型製剤、例えば、活性剤を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスで送達するように調製されている。様々な種類の持続放出型物質が確立されており、それらは、当業者に周知である。徐放性製剤としては、フィルムコート錠、多粒子またはペレット系、親水性または親油性物質を用いるマトリックス技術、及び細孔形成賦形剤を含むワックスベースの錠剤が挙げられる。通常、持続放出型製剤は、天然または合成ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドンのようなポリマービニルピロリドン、カルボキシビニル親水性ポリマー、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロースのような疎水性及び／または親水性ハイドロコロイド、ならびにカルボキシポリメチレンを用いて調製できる。
典型的には、インビボ投与用の医薬組成物は、無菌である。滅菌は、当該技術分野において知られている方法、例えば、加熱滅菌、蒸気滅菌、滅菌ろ過または照射滅菌に従って行うことができる。
本明細書に記載されている医薬組成物の投与量及び所望の薬物濃度は、想定される特定の用途に応じて変動し得る。好適な投与量は、上記のＸＩＩ節にも記載されている。
キット
いくつかの実施形態では、ＬＳＤ、例えば、ハンター症候群、サンフィリポ症候群Ａ、ニーマンピック病、ゴーシェ病またはパーキンソン病の治療に用いるためのキットであって、本明細書に記載されているような融合タンパク質を含むキットを提供する。
いくつかの実施形態では、そのキットは、１つ以上の追加の療法剤をさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、そのキットは、本明細書に記載されているような融合タンパク質を含み、ＬＳＤの神経症状の治療に用いる１つ以上の追加の療法剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、そのキットは、本明細書に記載されている方法を実施する手順（すなわちプロトコール）（例えば、血液脳関門を越えて、ＥＲＴ用酵素を含む融合タンパク質を投与するためのキットを使用するための説明）を含む説明資料さらに含む。その説明資料は典型的には、書面または印刷による資料を含むが、それらに限らない。本開示では、このような説明を格納して、それらをエンドユーザーに伝達できるいずれかの媒体が想定されている。このような媒体としては、電子的記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えばＣＤ−ＲＯＭ）などが挙げられるが、これらに限らない。このような媒体には、このような説明資料を提供するインターネットサイトのアドレスを含めてよい。
ＸＶ．実施例
具体的な実施例によって、本開示について、より詳細に説明する。以下の実施例は、例示目的で示されているにすぎず、いかなる形でも、本開示を限定しようとするものではない。当業者には、本質的に同じ結果を生じるように変更または改変できる様々な重要でないパラメーターが容易に認識されよう。用いられている数値（例えば、量、温度など）に関しては、精度を確保すべく努めたが、ある程度の実験的誤差及び偏差は存在し得る。本開示の実施の際には、別段に示されていない限り、当該技術分野の技術の範囲内で、タンパク質化学、生化学、組み換えＤＮＡ技術及び薬理学の従来の方法を用いる。このような技法は、文献で充分に説明されている。加えて、特定のライブラリーに適用するような操作方法は、本明細書に記載されている他のライブラリーにも適用できることは、当業者には明らかなはずである。
実施例１．イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）を含む融合タンパク質の構築
設計及びクローニング
（ｉ）成熟ヒトＩＤＳ酵素が、Ｆｃ領域を含むヒトＩｇＧ１断片に融合されている融合ポリペプチド（「ＩＤＳ−Ｆｃ融合ポリペプチド」）、及び（ｉｉ）トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）への結合をもたらす変異をＦｃ領域に含む改変ヒトＩｇＧ１断片（「改変Ｆｃポリペプチド」）を含むＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質を設計した。具体的には、ＩＤＳ断片をヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合したＩＤＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドを作製した。いくつかのケースでは、リンカーをＩＤＳとＩｇＧ１断片の間に配置して、その２つの断片間のいずれの立体障害も軽減した。すべてのコンストラクトにおいて、分泌を促進するために、κ鎖Ｖ−ＩＩＩの１〜２０位のアミノ酸（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ＩＤ−Ｐ０１６６１）に由来するシグナルペプチドを融合部の上流に挿入し、ＩＤＳをトランケートして、Ｓ２６〜Ｐ５５０のアミノ酸（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ＩＤ−Ｐ２２３０４）からなるようにした。使用したヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域の断片は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ＩＤ Ｐ０１８５７の配列のＤ１０４〜Ｋ３３０のアミノ酸（ＥＵナンバリングで２２１〜４４７位、ヒンジの１０個のアミノ酸（２２１〜２３０位）を含む）に対応する。いくつかの実施形態では、１つのＩＤＳ酵素を有するヘテロ二量体融合タンパク質（「モノザイム」）を作製するために、ヒトＩｇＧ１残基Ｄ１０４〜Ｋ３３０に由来するが、ＩＤＳとの融合は含まない第２のＦｃポリペプチドをＩＤＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドとコトランスフェクションした。いくつかのコンストラクトにおいては、ＩｇＧ１断片に追加の変異を含めて、２つのＦｃ領域のヘテロ二量化を促した。ＴｆＲへの結合をもたらす変異を有さないコントロールＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質を、それらのタンパク質が、ＴｆＲへの結合をもたらす変異を含まないという相違点以外は同様にして、設計及び構築した。追加のコントロールとして、我々は、検出及び精製を促すためのＣ末端ヘキサヒスチジンタグ（配列番号２４１）を含むＩＤＳ（アミノ酸Ｓ２６−Ｐ５５０）を作製した。
実施例で使用したＴｆＲ結合ＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質は、ＩＤＳ−Ｆｃ融合ポリペプチド、及びＴｆＲに結合する改変Ｆｃポリペプチドによって形成された二量体である。ＩＤＳ酵素が、Ｆｃ領域のＮ末端に連結されている二量体では、ＩＤＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、配列番号１１５、２３１及び２３５のうちのいずれか１つの配列を有し得る。これらの配列では、ＩＤＳ配列には下線が引かれており、その配列は、ホルミルグリシンに改変される、５９位のシステイン（二重下線が引かれている）を含む。そのＩＤＳは、Ｆｃポリペプチドに、ＧＧＧＧＳというリンカー（配列番号２３９）によって連結した。そのＦｃポリペプチドのＮ末端に、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、配列番号１１３）を含めた。そのＣＨ２ドメイン配列は、配列番号１１５、２３１及び２３５の５４１位から始まる。
実施例で使用したＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質ＥＴＶ：ＩＤＳ３５．２１は、配列番号１１５、２３１及び２３５のうちのいずれか１つの配列を有するＩＤＳ−Ｆｃ融合ポリペプチド、ならびにＴｆＲに結合する改変Ｆｃポリペプチドであって、配列番号１１６の配列を有する改変Ｆｃポリペプチドによって形成された二量体である。最初の１０個のアミノ酸は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部である。そのＣＨ２ドメイン配列は、配列番号１１６の１１位から始まる。
実施例で使用したＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質ＥＴＶ：ＩＤＳ３５．２１．１７．２は、配列番号１１５、２３１及び２３５のうちのいずれか１つの配列を有するＩＤＳ−Ｆｃ融合ポリペプチド、ならびにＴｆＲに結合する改変Ｆｃポリペプチドであって、配列番号２２８の配列を有する改変Ｆｃポリペプチドによって形成された二量体である。最初の１０個のアミノ酸は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部である。そのＣＨ２ドメイン配列は、配列番号２２８の１１位から始まる。
実施例で使用したＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質ＥＴＶ：ＩＤＳ３５．２３．２は、配列番号１１５、２３１及び２３５のうちのいずれか１つの配列を有するＩＤＳ−Ｆｃ融合ポリペプチド、ならびにＴｆＲに結合する改変Ｆｃポリペプチドであって、配列番号２２９の配列を有する改変Ｆｃポリペプチドによって形成された二量体である。最初の１０個のアミノ酸は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部である。そのＣＨ２ドメイン配列は、配列番号２２９の１１位から始まる。
実施例で使用したＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質ＥＴＶ：ＩＤＳ３５．２１．１７は、配列番号１１５、２３１及び２３５のうちのいずれか１つの配列を有するＩＤＳ−Ｆｃ融合ポリペプチド、ならびにＴｆＲに結合する改変Ｆｃポリペプチドであって、配列番号１５１の配列を有する改変Ｆｃポリペプチドによって形成された二量体である。その改変ＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（例えば配列番号１１３）を含み得る。
組み換えタンパク質の発現及び精製
Ｆｃ領域に融合された組み換えＩＤＳ酵素を発現させるために、Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯトランスフェクションキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をメーカーの指示に従って用いて、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に、該当するＤＮＡコンストラクトをトランスフェクションした。細胞をＥｘｐｉＣＨＯ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍにおいて、オービタルシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ ＨＴ Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ）で、３７℃、６％ＣＯ２及び１２０ｒｐｍで増殖させた。簡潔に述べると、対数増殖しているＥｘｐｉＣＨＯ（商標）細胞に、６×１０６細胞／ｍｌの密度で、培養体積１ｍＬ当たり０．８μｇのＤＮＡプラスミドをトランスフェクションした。トランスフェクション後、細胞を３７℃に戻し、トランスフェクションの１８〜２２時間後に、トランスフェクションした培養液に、示されているようなフィード液を添加した。トランスフェクションの１２０時間後に、３，５００ｒｐｍで２０分遠心分離することによって、トランスフェクションした細胞培養液の上清を回収した。清澄化した上清をろ過し（０．２２μＭの膜）、４℃で保存した。エピトープタグ付きＩＤＳ酵素（コントロールとして使用）の発現を、上記に若干の修正を加えて行った。簡潔に述べると、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグ（配列番号２４１）を有するＩＤＳ酵素をＥｘｐｉＣＨＯ細胞で発現させた。
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて、ＴｆＲへの結合をもたらす操作されたＦｃ領域を有する（または有さない）ＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質を細胞培養液の上清から精製した。上清をプロテインＡアフィニティーカラムＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｋｔａ Ｐｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍを使用）に流した。続いて、カラムを２０カラム容量（ＣＶ）超のＰＢＳで洗浄した。１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１００ｍＭのクエン酸／ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ３．０）を用いて、結合したタンパク質を溶出した。溶出直後に、１Ｍアルギニン−６７０ｍＭコハク酸の緩衝液（ｐＨ５．０、１：５希釈液）を用いて、画分を中和した。溶出された画分中のＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質の均質性を還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。
ヘキサヒスチジンタグ（配列番号２４１）付きＩＤＳ酵素を精製するために、１００ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）１５Ｌに対して、トランスフェクションした上清を徹底的に一晩透析した。透析した上清をＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｋｔａ Ｐｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍを使用）に結合させた。結合後、そのカラムを２０ＣＶのＰＢＳで洗浄した。５００ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳを用いて、結合したタンパク質を溶出した。溶出された画分中のＩＤＳ酵素の均質性を還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。ＩＤＳ酵素を含むプール画分を５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）で１：１０に希釈し、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてさらに精製した。結合後、カラムを１０ＣＶの５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）で洗浄した。５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）及び０．５ＭのＮａＣｌへの線状勾配を用いて、結合したタンパク質を溶出し、１ＣＶの画分で回収した。画分純度を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。図１に示されているように、精製によって、均質なＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質及びヘキサヒスチジンタグ（配列番号２４１）付きＩＤＳ酵素を得た。
実施例２．ＩＤＳ融合タンパク質の特徴付け
操作されたＴｆＲ結合部位を有するＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質は、ヒトＴｆＲに結合する。
改変ＦｃドメインがヒトＴｆＲと相互作用する能力に、操作されたＴｆＲ結合部位を有するＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質が影響を及ぼすか判定するために、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）表面プラズモン共鳴アッセイを用いて、このタンパク質のヒトＴｆＲに対する親和性を評価した。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５というセンサーチップに、抗ヒトＦａｂを固定化した（ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのヒトＦａｂ捕捉キット）。５μｇ／ｍＬのＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質を各フローセル上に１分捕捉させ、ヒトアピカルドメインＴｆＲの３倍段階希釈液を３０μＬ／分の流速で注入した。各試料を３分の結合及び３分の解離で解析した。注入後に毎回、１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．１）を用いて、チップを再生した。無関係なＩｇＧが同程度の密度で捕捉されているフローセルから得たＲＵを減ずることによって、結合応答を補正した。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ３．１を用いて、平衡状態の結合応答を濃度に対してフィッティングすることによって、定常状態の親和性を得た。図２に示されているように、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）による解析によって、Ｆｃ領域に操作されたＴｆＲ結合部位を有するＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質が、ヒトＴｆＲに結合することが明らかになった。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）による解析によって、ＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質ＥＴＶ：ＩＤＳ３５．２１が、約２００ｎＭの親和性で、ヒトＴｆＲに結合することも明らかになった。
操作されたＴｆＲ結合部位を有するＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質は、インビトロ、細胞内及びインビボにおいて活性を有する。
操作されたＴｆＲ結合ＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質のインビトロ活性及び細胞内活性を評価したところ、ヒトＩｇＧ断片に融合した場合に、ＩＤＳが、その酵素活性を保つことが示された。インビトロ活性は、人工基質を用いる２段階蛍光酵素アッセイによって測定した。具体的には、２０μＬの１ｍＭの４−メチルウンベリフェリルａ−Ｌ−イドピラノシドウロン酸２−硫酸エステル２ナトリウム塩基質（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ Ｌｉｍｉｔｅｄ、＃ＥＭ０３２０１）をアッセイ緩衝液（１００ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭ酢酸鉛、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ５．０）で希釈し、１０μＬの０．２ｎＭのＩＤＳと混合した。その第１の反応物を４時間、３７℃でインキュベートし、６０μＬの０．２Ｍリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で停止させた。続いて、ヒトα−イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）を一過性にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞から得た細胞溶解液１５μｇの存在下で、第２の反応を行い、１６時間、３７℃でインキュベートし、１００μＬの０．５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．５）を加えることによって停止させた。続いて、その反応溶液の蛍光（３６５ｎｍにおける励起及び４５０ｎｍにおける発光）を測定した。生成物量を算出するために、４−メチルウンベリフェロンによる検量線を線形回帰によってフィッティングして、総基質切断の１０％未満として確認した。生成物量を反応時間及びＩＤＳのモル量で除することによって、比活性（生成物量（ｎｍｏｌ）／分／ＩＤＳ １ｎｍｏｌ）を算出した。
インビトロ酵素活性アッセイによって、ＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質が活性を有したことが示されたとともに、Ｆｃ領域をＩＤＳに融合しても、酵素活性が損なわれないことが示された（図３）。
ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９を用いて、ＩＤＳノックアウト（ＫＯ）細胞を作製して、操作されたＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質の細胞内活性を試験するための細胞系を得た。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）に、ヒトＩＤＳのエキソン１の後半部を標的とするガイド配列を含むＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９ ｐＣａｓ−Ｇｕｉｄｅ−ＥＦ１ａ−ＧＦＰベクター（Ｏｒｉｇｅｎｅ）をトランスフェクションした。Ｇｕｉｄｅ−ｉｔ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をメーカーの指示に従って用いて、ＩＤＳのゲノム配列内のインデルの存在について、単一細胞クローンを解析した。ＩＤＳ ＫＯ細胞を特定するために、上記のインビトロＩＤＳ酵素アッセイを用いて、インデル陽性クローン細胞溶解液を解析した。簡潔に述べると、そのインビトロ活性アッセイは、以前に記載されたように、酢酸鉛アッセイ緩衝液（ｐＨ５．０、１００ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭ酢酸鉛、０．０２％アジ化Ｎａ）中の細胞溶解液１２．５μｇ、２５μｇ、５０μｇ及び１００μｇを用いて行った（Ｖｏｚｙｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｈｅｒｉｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓ．，２４：６７５−８０（２００１））。１０μＬの標準化細胞溶解液（水中）と、２０μＬの酢酸鉛緩衝液中の１ｍＭ基質を混ぜ合わせることによって、反応を開始させた。第１の反応物を４時間、３７℃でインキュベートし、６０μＬの０．２Ｍリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で停止させた。続いて、ヒトα−イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）を一過性にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞から得た１０μｇ／１０μＬの細胞溶解液を加えることによって、第２の反応を行い、２４時間、３７℃で進行させ、１００μＬの０．５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．３）を加えることによって停止させた。続いて、その反応溶液の蛍光（３６５ｎｍにおける励起及び４５０ｎｍにおける発光）を測定した。ＨＥＫ２９３Ｔ ＣＲＩＳＰＲクローンにおけるＩＤＳ活性と、組み換えＩＤＳ（アッセイ基準として使用）、ＨＥＫ野生型（ＷＴ）溶解液、及びＩＤＳを過剰発現するＨＥＫ細胞溶解液を比較した。ｍｉｎｉ−Ｔｏｐｏ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）クローニング後、バックグラウンドシグナルに相当する酵素活性レベルを有するクローンの配列確認をし、ＫＯクローンとして確認した。その後の細胞アッセイでは、確認された３つの特有のＩＤＳ ＫＯクローン及び３つの独立したＷＴ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞バッチが使用されている。
ネイキッドＩＤＳ酵素またはＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質の細胞内活性を試験するために、ＩＤＳ活性の指標として、基質（ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸）の蓄積量をモニタリング可能にするＬＣ−ＭＳ／ＭＳベースのグライコミクスアッセイを行った。ＩＤＳまたはＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質を細胞培養培地に加える前後に、基質の蓄積をＩＤＳ ＫＯ細胞で測定した。簡潔に述べると、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ペレット化し、凍結した。細胞ペレットを二糖消化緩衝液（１１１ｍＭのＮＨ４ＯＡｃ、１１ｍＭのＣａＯＡｃ、ｐＨ７．０）中で超音波処理した。ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、タンパク質濃度を測定した。２ｍＭのＤＴＴ、１．２５ｍＩＵヘパリナーゼＩ（Ｇａｌｅｎ）、１．２５ｍＩＵヘパリナーゼＩＩ（Ｇａｌｅｎ）、１．２５ｍＩＵヘパリナーゼＩＩＩ（Ｇａｌｅｎ）及び６．２５ｍＩＵコンドロイチナーゼＢ（Ｇａｌｅｎ）を含む１００μＬの消化緩衝液に、全タンパク質（１００μｇ）を加えた。３０℃で３時間後、ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の消化が完結し、その後、２０ｎｇの内部標準（４ＵＡ−２Ｓ−ＧｌｃＮＣＯＥｔ−６Ｓ ＨＤ００９［Ｇａｌｅｎ］）を各試料に加えた。６μＬの２５０ｍＭのＥＤＴＡを加えることによって、酵素を失活させ、試料を９５℃で１０分煮沸した。続いて、試料を１６，０００×Ｇで５分、室温で遠心分離した。上清を遠心フィルターＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ３０ＫＤ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、１４，０００×Ｇで１５分遠心分離した。そのフロースルーで二糖を濃縮し、アッセイ緩衝液：アセトニトリル［１：１、ｖ／ｖ］の混合物に再懸濁してから、さらなる解析のために、質量分析用バイアルに移した。
エレクトロスプレー質量分析法（Ｓｃｉｅｘ ６５００＋ＱＴＲＡＰ、Ｓｃｉｅｘ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）と組み合わせた液体クロマトグラフィー（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｎｅｘｅｒａ Ｘ２システム、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ，ＵＳＡ）によって、酵素によるヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の消化によって生成された二糖の解析を行った。解析ごとに、０．４ｍＬ／分の流速とともに、５０℃のカラム温度を用いて、１０μＬの試料をＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅ １．７μｍ（２．１×１５０ｍＭ）のカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）に注入した。移動相Ａは、１０ｍＭギ酸アンモニウム及び０．１％ギ酸を含む水から構成された。移動相Ｂは、０．１％ギ酸を含むアセトニトリルから構成された。勾配は、Ｂ８５％を０．０〜１．０分、１．０〜５．０分でＢ８５％→Ｂ５０％、５．０〜６．０分でＢ５０％→Ｂ８５％、Ｂ８５％を６〜８．０分保持のようにプログラムした。エレクトロスプレーによるイオン化は、カーテンガス：３０、コリジョンガス：中度、イオンスプレー電圧：−４５００、温度：４５０、イオン源ガス１：５０、イオン源ガス２：６０という設定を適用したネガティブイオンモードで行った。Ａｎａｌｙｓｔ１．６．３（Ｓｃｉｅｘ）を多重反応モニタリングモード（ＭＲＭ）で、ドウェル時間：２５（ミリ秒）、衝突エネルギー：−３０、デクラスタリング電位：−８０、エントランス電位：−１０、コリジョンセルイグジット電位：−１０において用いて、データ取得を行った。ＭＲＭトランジション（ｍ／ｚ３７８．１＞８７．０のＤ０Ａ０、ｍ／ｚ３７８．１＞１７５．０のＤ０ａ０、ｍ／ｚ４１６．１＞１３８．０のＤ０Ｓ０、ｍ／ｚ４５８．１＞３００．０のＤ０ａ４、ｍ／ｚ４５８．１＞９７．０のＤ０Ａ６、Ｄ２Ａ０、Ｄ０ａ６、Ｄ２ａ０、ｍ／ｚ４９６．０＞４１６．１のＤ０Ｓ６、Ｄ２Ｓ０、ｍ／ｚ５３８．０＞４５８．０のＤ２ａ４、Ｄ２ａ６、Ｄ０ａ１０、Ｄ２Ａ６、ｍ／ｚ５７５．９５＞９７．０のＤ０Ｓ６、ｍ／ｚ４７２．０（フラグメントイオン）＞９７．０の４ＵＡ−２Ｓ−ＧｌｃＮＣＯＥｔ−６Ｓを内部標準（Ｉ．Ｓ．）として使用した）を用いて、ＧＡＧを［Ｍ−−Ｈ］として検出した。ＧＡＧを、それらの保持時間及びＭＲＭトランジションの市販の参照標準物質（Ｉｄｕｒｏｎ Ｌｔｄ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）への一致に基づき、特定した。ＭｕｌｔｉＱｕａｎｔ ３．０．２（Ｓｃｉｅｘ）を用いて、Ｉ．Ｓ．に対する面積比によって、定量を行った。ＧＡＧは、全タンパク質量に対して正規化した。ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、タンパク質濃度を測定した。
ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の消化後に観察された二糖の量に反映されているように、ＩＤＳ ＫＯ細胞において、コントロール細胞株と比べて、基質の有意な蓄積が見られ、組み換えＩＤＳをその細胞に加えることによって、その作用をレスキューできた（図４）。これにより、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳベースのアッセイを用いて、ＩＤＳ及びＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質の細胞内活性を評価できることが検証された。
このアッセイを用いて、同じＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド（すなわちＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７）を含むＮ末端モノザイム（すなわちＥＴＶ：ＩＤＳ３５．２１．１７）またはＣ末端モノザイムのいずれかとしてのＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質で細胞を処置したところ、ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸由来の二糖のレベルが、野生型細胞で見られたレベルまで低下したことが明らかになった（図５Ａ）。加えて、そのＮ末端モノザイムの活性は、ＩＤＳに匹敵していた（図５Ｂ）。勘案すると、これらのデータによって、ＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質が、酵素活性を保持するとともに、ＩＤＳ ＫＯ細胞における基質の蓄積を低減できることが示されている。
以前に記載されたように（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２１：１５１−１５６（２０１０））、新たに合成されるＧＡＧに３５Ｓを組み入れる３５Ｓパルス−チェイスアッセイを用いて、ＭＰＳ ＩＩ患者及び健常なコントロールに由来する線維芽細胞でも、ＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質の細胞内活性を調べた。ＭＰＳ ＩＩ患者の線維芽細胞では、検出可能なＩＤＳ活性が欠損しており、それにより、基質が約１０倍蓄積され、３５Ｓシグナルの蓄積が２．５倍である（図５Ｃ）。ＩＤＳ ＫＯ細胞と同様に、ＭＰＳ ＩＩ患者由来細胞でも、ＥＴＶ：ＩＤＳ３５．２３．２などのＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質は、有効性が高く、Ｓ３５標識タンパク質の蓄積を低減するための細胞ＥＣ５０が低ピコモルレベルであった（図５Ｃ）。さらに、ＥＴＶ：ＩＤＳ３５．２３．２などのＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質の細胞内活性は、Ｍ６ＰＲに依存することが示された。処置したＭＰＳ ＩＩ患者の線維芽細胞では、過剰のＭ６Ｐによって、３５Ｓ標識タンパク質の除去が阻害されたからである（図５Ｄ）。勘案すると、これらのデータによって、ＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質の形態において、ＩＤＳのＭ６ＰＲ依存的な輸送及び細胞内活性を保持できることが示されている。
インビボでヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸由来の二糖を測定するために、組織及び流体に由来する解析用に、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳベースのグライコミクスアッセイを適応させた。簡潔に述べると、すべての組織及び体液は、採取してからすぐに凍結し、−８０℃で保存した。試料に対して、５回の凍結融解サイクルを行い、細胞の解析のために、上記のように処理した。雄のＩＤＳ ＫＯマウスに由来する、解析したすべての組織及び体液において、雄の野生型同腹子コントロールと比べて、ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸由来の二糖の有意な蓄積が見られた（表１）。このアッセイは、インビボでの融合タンパク質の有効性試験で用いられている。ＩＤＳ ＫＯマウスは、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した（ＪＡＸ株０２４７４４）。
この方法を用いて、ビヒクルを投与された野生型（ＷＴ）マウス、及びＩＤＳまたはＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質（すなわちＥＴＶ：ＩＤＳ３５．２１）を投与されたＩＤＳ ＫＯマウスに由来する血清において、ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸由来の二糖のレベルを評価した。投与前のベースライン測定値では、ＩＤＳ ＫＯマウスに由来する血清において、ＷＴマウスと比べて、ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸由来の二糖の有意な蓄積が示された。ＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質を投与後、ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸由来の二糖のレベルは、ＩＤＳ ＫＯ血清において有意に低下し、ＩＤＳを投与されたＩＤＳ ＫＯマウスに由来する血清で見られたレベルに匹敵する低下が見られた（図６）。これらのデータによって、ＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質が、インビボにおいて活性を有するとともに、ＩＤＳ ＫＯマウスにおいて基質の蓄積を低減できることが示されている。これらのデータに基づき、ＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質を１回投与してから７日後に、ＩＤＳ ＫＯマウスの組織において、分布及び薬力学的（ＰＤ）応答を評価した。ＩＤＳ ＫＯマウスに、ＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質４０ｍｇ／ｋｇまたはポジティブコントロールとしてのＩＤＳ５．３ｍｇ／ｋｇ（２５％モル当量の用量）を静脈内投与し、ＧＡＧレベルを評価した。投与から２時間後に、末梢組織における両方の分子の分布を確認した。ＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質を投与してから７日後に、ＩＤＳ ＫＯマウスの肝臓、脾臓及び肺において、基質の有意な減少が観察された（図７）。
ＴｆＲ結合ＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質において、コントロールのＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質と比べて、脳送達の改善が見られたか判定するために、ヒトＴｆＲノックイン（ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩ）マウスに、ＴｆＲ結合ＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質ＥＴＶ：ＩＤＳ３５．２１、またはＴｆＲへの結合をもたらす変異を有さないコントロールのＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質（「ＩＤＳ：Ｆｃ」）を５０ｍｇ／ｋｇ投与し、投与から４時間後に、下記の実施例３に記載されているサンドイッチＥＬＩＳＡベースのアッセイを用いて、脳内のＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質の濃度を測定した。ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスは、国際公開第２０１８／１５２２８５号に記載されているようにして、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いて作製し、そのマウスＴｆｒｃ遺伝子内でヒトＴｆｒｃアピカルドメインを発現させ、得られたキメラＴｆＲをインビボにおいて、内因性プロモーターの制御下で発現させた。コントロールのＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質と比べて、有意に高いレベルのＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質ＥＴＶ：ＩＤＳ３５．２１が脳内で検出され、ＥＴＶ：ＩＤＳ３５．２１の平均脳内濃度は２３．７ｎＭであった（図８）。ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスを用いて、２つの追加のＴｆＲ結合ＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質ＥＴＶ：ＩＤＳ３５．２１．１７．２及びＥＴＶ：ＩＤＳ３５．２３．２の脳への取り込みを評価した。ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスに、ＥＴＶ：ＩＤＳ３５．２１．１７．２、ＥＴＶ：ＩＤＳ３５．２３．２またはコントロールのＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質（「ＩＤＳ：Ｆｃ」）を５０ｍｇ／ｋｇ投与し、投与の２時間後及び８時間後に、サンドイッチＥＬＩＳＡベースのアッセイを用いて、脳内のＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質の濃度を測定した。ＴｆＲ結合ＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質の投与によって、コントロールのＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質と比べて、脳への取り込みが２時間で５倍増加し、投与の８時間後には、脳内濃度が１０〜２０倍上昇した（図９Ａ）。インタクトな融合タンパク質の血清中ＰＫ及び肝臓中蓄積が、ＥＴＶ：ＩＤＳ３５．２１及びＩＤＳ：Ｆｃの両方で同等であった（図９Ｂ）ことから、主に、ＩＤＳ部分によって、血漿クリアランスの分布相が定められることが示されている。ＴｆＲ結合ＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質の脳内レベルは、８時間、高い状態を保ち、末梢クリアランスによって、多少低下した。勘案すると、これらのデータによって、ＴｆＲ結合ＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質とＴｆＲとの相互作用によって、末梢分布が概ね維持される一方で、脳暴露量が有意に改善されることが示されている。
ＥＴＶ：ＩＤＳの静脈内投与により、脳内のＧＡＧが低減される。
上に記載されているとともに、実施例１に従って調製したＴｆＲ結合ＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質（本明細書では、ＥＴＶ：ＩＤＳという）で観察された脳暴露の改善によって、脳における基質の蓄積が、それに対応して低減するか調べるために、マウスＴｆＲにノックインされたヒトＴｆＲアピカルドメインを有するＩＤＳ欠損マウスモデルを作製した（本明細書では、ＩＤＳ ＫＯ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスという）。簡潔に述べると、ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩ雄マウスを雌のＩＤＳヘテロ接合体マウスと交配して、ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩホモ接合体バックグラウンドのＩＤＳ ＫＯマウスを作製した。この試験で用いたすべてのマウスは雄であり、１２時間の明暗サイクルで、飼料（ＬａｂＤｉｅｔ ＪＬ ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ６Ｆ）と水を自由摂取させて飼育した。
ＩＤＳ ＫＯ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスに、ＥＴＶ：ＩＤＳまたはＩＤＳを単回または４週間にわたり週に１回、活性が同等の用量で静脈内投与し（７４７μモルの生成物／分／ｋｇ、またはＥＴＶ：ＩＤＳは４０ｍｇ／ｋｇ、ＩＤＳは１４．２ｍｇ／ｋｇ）、薬物動態学的及び薬力学的な応答を評価した。具体的には、生理食塩水、ＩＤＳ（１４．２ｍｇ／体重１ｋｇ）またはＥＴＶ：ＩＤＳ（４０ｍｇ／体重１ｋｇ）を１回（ｎ＝８）または４週間にわたり週に１回（ｎ＝８）、静脈内（ｉ．ｖ．）注射した２月齢のＩＤＳ ＫＯ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスを用いて、ＩＤＳ ＫＯ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスにおいて、ＥＴＶ：ＩＤＳの末梢投与が、脳及び組織内のＧＡＧに及ぼす作用を求めた。生理食塩水を１回（ｎ＝５）または４週間にわたり週に１回（ｎ＝５）、ｉ．ｖ．注射した２月齢の同腹子ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスをコントロールとして使用した。ＩＤＳまたはＥＴＶ：ＩＤＳを投与されたマウスでは、生存中の血清試料を顎下採血によって、様々な時点に採取した。１回投与から７日後、または４週目の最後の投与から７日後のいずれかに、すべてのマウスを殺処分した。尿、血清、ＣＳＦ、肝臓、腎臓、脾臓、肺、心臓及び右半脳を解剖し、ドライアイスで急速凍結した。
下記の実施例３に記載されているＥＬＩＳＡベースのアッセイであって、ＩＤＳの濃度を検出するためのアッセイを用いて評価したところ、１回投与後、ＥＴＶ：ＩＤＳでは、ＩＤＳと同様の血清クリアランスプロファイルが見られ、主に、この酵素によって、末梢クリアランスが定められることの追加の裏付けが得られた（図１０Ａ）。ＥＴＶ：ＩＤＳの脳内レベルは、投与の２時間後、ＩＤＳと比べて有意に上昇し、平均濃度は、ＥＴＶ：ＩＤＳでは８．４ｎＭ、ＩＤＳでは１．６ｎＭであったとともに、ＥＴＶ：ＩＤＳの肝臓中及び脾臓中レベルは、ＩＤＳと比べて有意に上昇した（図１０Ｂ）。
ＥＴＶ：ＩＤＳが、脳内の基質レベルを低下させるか判定するために、酵素を１回投与または週に１回で４回投与した後のＩＤＳ ＫＯ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスにおいて、実施例２に記載されているように、ＧＡＧレベルを評価した。ＩＤＳは、早い時点において、脳内のＧＡＧレベルをわずかに低下させたが、４週間の処置後、ＧＡＧを有意に減少させる効果は見られなかった（図１０Ｃ）。しかしながら、ＥＴＶ：ＩＤＳは、１回投与後には、脳内のＧＡＧレベルを約５８％低下させ、４週間の処置後には、７１％低下させた（図１０Ｃ）。これにより、１回投与後に、ＣＳＦ ＧＡＧが約７５％付随的に低下し、この低下は、４週間の投与後、持続した（図１０Ｃ）。両方の分子とも、１週間後、肝臓中及び脾臓中のＧＡＧレベルを効果的に低下させ、その応答は、反復投与によって持続し（図１０Ｃ）、これらの組織において、ＴｆＲへの結合が薬力学的応答に悪影響を及ぼさないことが示された。勘案すると、これらのデータによって、ＥＴＶ：ＩＤＳが、酵素の脳暴露を有意に向上させるとともに、末梢及びＣＮＳの両方における基質の蓄積を着実に低減させることが示されている。
実施例３．ＩＤＳ融合タンパク質の薬物動態学的な特徴付け
この実施例では、マウス血漿における操作されたＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質の薬物動態学的（ＰＫ）特徴付けについて記載する。
ＴｆＲ結合ＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質の血漿中半減期及びクリアランスを求めるために、７〜８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、２つのＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質分子（Ｎ末端モノザイム及びＣ末端モノザイム）１０ｍｇ／ｋｇを尾静脈注射によって投与した。ＥＬＩＳＡベースのアッセイを用いて、２４時間の期間にわたり、血漿に残ったＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質の濃度を測定した。簡潔に述べると、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、マウス血漿中のＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質の濃度を定量した。抗Ｆｃ捕捉用抗体（Ａｂｃａｍ＃ａｂ１２４０５５）を３８４ウェルＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃４６４７１８）に３μｇ／ｍＬでコーティングした。そのプレートを５％ＢＳＡでブロックしてから、１：１，０００または１：１０，０００のいずれかで希釈した血漿とインキュベートした。次に、ポリクローナル抗ＩＤＳ検出抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ＃ＡＦ２４４９）を０．５μｇ／ｍＬで加えてから、抗ヤギＨＲＰ抗体を加えた。ＴＭＢ基質を用いてプレートを発色させ、硫酸で停止させ、ＢｉｏＴｅｋプレートリーダーで、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。検量線は、４倍希釈系列で２００〜０．１ｎｇ／ｍＬから個々に構築し、４パラメーターロジスティック回帰を用いてフィッティングした。
このアッセイを用いて、ＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質の血漿中終末相半減期が７．７〜１０時間であったことが明らかになった（表２）。インビボでのＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質では、予期されなかったＰＫ面での問題は見られなかった。
実施例４．酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）を含む融合タンパク質の構築
設計及びクローニング
成熟ヒトＡＳＭ酵素が、Ｆｃ領域を含むヒトＩｇＧ１断片に融合されている融合ポリペプチド（「ＡＳＭ−Ｆｃ融合ポリペプチド」）の二量体として、ＡＳＭ−Ｆｃ融合タンパク質を設計した。いくつかの実施形態では、ＡＳＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）への結合をもたらす変異を含む改変Ｆｃ領域を含む。具体的には、ＡＳＭ断片が、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＮ末端に融合されているＡＳＭ−Ｆｃ融合ポリペプチドを作製した。いくつかのケースでは、リンカーをそのＡＳＭとＩｇＧ１断片の間に配置して、その２つの断片間のいずれの立体障害も緩和した。すべてのコンストラクトにおいて、天然型ＡＳＭシグナル配列の１〜４６位のアミノ酸（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ＩＤ−Ｐ１７４０５）を除去し、κ鎖Ｖ−ＩＩＩの１〜２０位のアミノ酸（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ＩＤ−Ｐ０１６６１）に由来する分泌シグナルと置き換えて、ＡＳＭの分泌を向上させた。加えて、その融合タンパク質では、ＡＳＭとそのヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域の間のいずれの不要な切断も阻止するために、ＡＳＭをそのＣ末端でトランケートした（アミノ酸Ｑ６２０で終端する）。続いて、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ＩＤ−Ｐ０１８５７）の断片をＡＳＭのＣ末端とインフレームで配置し（アミノ酸Ｅ９９で始まる）、１０３位のシステインは、セリンに変異させた。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１断片に、２つのＦｃ領域のヘテロ二量化を促すための追加の変異を含めた。加えて、ＡＳＭ−Ｆｃ融合タンパク質は、ＡＳＭの１つまたは２つの分子を含むように作製した。コントロールとして、Ｃ末端システインを除去するとともに、酵素活性を促進するようにトランケートした、ＡＳＭの１〜６２８位のアミノ酸をヘキサヒスチジンタグ（配列番号２４１）にＣ末端で融合したものからなるＡＳＭ−ヘキサヒスチジン（配列番号２４１）融合タンパク質を設計した。
組み換えタンパク質の発現及び精製
Ｆｃ領域に融合された組み換えＡＳＭ酵素を発現させるために、メーカー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の指示に従って、ＥｘｐｉＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に、６×１０６細胞／ｍｌの密度で、Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ／プラスミドＤＮＡ複合体をトランスフェクションした。トランスフェクション後、オービタルシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ ＨＴ Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ）で、細胞を３２℃で、６〜８％ＣＯ２の加湿雰囲気においてインキュベートした。トランスフェクションから１日後に、Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅエンハンサー及びＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅフィード液を培養物に加えた。４８〜７２時間の発現時間後に、培地上清を遠心分離によって回収した。清澄化したその上清に、ＥＤＴＡ非含有プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を添加し、−８０℃で保存した。
ＡＳＭ−Ｆｃ融合タンパク質の精製のために、清澄化した培地上清に、２００μＭの酢酸亜鉛（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。その上清をプロテインＡアフィニティーカラムＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に流し、２００ｍＭアルギニン及び１３７ｍＭコハク酸緩衝液（ｐＨ５．０、アルギニン−コハク酸緩衝液）で洗浄した。２００μＭ酢酸亜鉛を添加した１００ｍＭのＱＢクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）で、融合タンパク質を溶出した。溶出直後に、アルギニン−コハク酸緩衝液を加えて、ｐＨを調整した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって、タンパク質凝集体をＡＳＭ−Ｆｃ融合タンパク質から分離した。そのＳＥＣ移動相は、２００μＭ酢酸亜鉛を添加したアルギニン−コハク酸（ｐＨ５．０）緩衝液に保持した。すべてのクロマトグラフィーステップは、Ａｋｔａ Ｐｕｒｅ ＳｙｓｔｅｍまたはＡｋｔａ Ａｖａｎｔのシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。画分純度を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。図１１に示されているように、精製によって、均質なＡＳＭ−Ｆｃ融合タンパク質が得られた。
実施例５．ＡＳＭ融合タンパク質の特徴付け
ＡＳＭ−Ｆｃ融合タンパク質は、インビトロ及び細胞において活性を有する。
ＡＳＭが、ヒトＩｇＧ重鎖に融合されたときに、その酵素活性を保持することを示すために、ＡＳＭ−Ｆｃ融合タンパク質のインビトロ活性及び細胞内活性を評価した。組み換えＡＳＭ酵素または組み換えＡＳＭ−Ｆｃ融合タンパク質のインビトロ活性を、スフィンゴミエリンの合成発色類似体を用いて測定した。具体的には、１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．３、１００μＬの反応体積における終濃度）において、２．５ｍＭの２−（Ｎ−ヘキサデカノイルアミノ）−４−ニトロフェニルホスホリルコリン（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と０．７５ｎＭのＡＳＭを混合した。その反応物を１６時間、３７℃でインキュベートし、等量の０．２ＭのＮａＯＨを加えることによって停止させた。続いて、その反応溶液の吸光度を４１０ｎｍにおいて測定した。生成物の量を算出するために、ｐ−ニトロフェノールによる検量線を線形回帰によってフィッティングして、総基質切断の１０％未満として確認した。生成物量を反応時間及びＩＤＳのモル量で除することによって、比活性（生成物量（ｎｍｏｌ）／分／ＩＤＳ １ｎｍｏｌ）を算出した。そのインビトロ酵素活性アッセイによって、ＡＳＭ−Ｆｃ融合タンパク質が活性を有することが示されたとともに、Ｆｃ領域のＡＳＭへの融合によって、その酵素活性が損なわれないことが示された（図１２）。
ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９を用いて、ＡＳＭ ＫＯ細胞を作製して、ＡＳＭ−Ｆｃ融合タンパク質の細胞内活性を試験するための細胞系を得た。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）に、ヒトＳＭＰＤ１のエキソン２の後半部を標的とするガイド配列を含むＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９ ｐＣａｓ−Ｇｕｉｄｅ−ＥＦ１ａ−ＧＦＰベクター（Ｏｒｉｇｅｎｅ）をトランスフェクションした。Ｇｕｉｄｅ−ｉｔ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をメーカーの指示に従って用いて、ＡＳＭのゲノム配列内のインデルの存在について、単一細胞クローンを解析した。ＡＳＭ発色基質の２−Ｎ−ヘキサデカノイルアミノ−４−ニトロフェニルホスホリルコリン（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、インデル陽性クローン細胞溶解液に対して、インビトロＡＳＭ酵素アッセイを行った。簡潔に述べると、そのインビトロ活性アッセイは、１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．３）中の１２．５μｇ、２５μｇ、５０μｇ及び１００μｇの細胞溶解液を用いて行った。２．５ｍＭ基質を加えることによって、反応を開始させ、２０時間後、０．２ＭのＮａＯＨを加えることによって反応を停止した。ＨＥＫ２９３Ｔ ＣＲＩＳＰＲクローンにおけるＡＳＭ活性と、組み換えＡＳＭ（アッセイ基準として使用）、ＨＥＫ野生型（ＷＴ）溶解液、及びＡＳＭを過剰発現するＨＥＫ細胞溶解液を比較した。ｍｉｎｉ−Ｔｏｐｏ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）クローニング後、バックグラウンドシグナルに相当する酵素活性レベルを有するクローンの配列を確認し、ＫＯクローンとして確認した。その後の細胞アッセイでは、確認された３つの特有のＡＳＭ ＫＯクローン及び３つの独立したＷＴ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞バッチを使用した。
ネイキッドＡＳＭ酵素またはＡＳＭ−Ｆｃ融合タンパク質の細胞内活性を試験するために、ＡＳＭ ＫＯ細胞において、ベースラインとして、及びＡＳＭまたはＡＳＭ−Ｆｃ融合物による処理後に、基質（スフィンゴミエリン）の蓄積量をモニタリング可能にする２つの細胞内アッセイを行った。まず、イメージングベースのアッセイを行って、ＡＳＭ ＫＯ細胞において、ＢＯＤＩＰＹコンジュゲートＣ５−スフィンゴミエリンの蓄積量をモニタリングした。簡潔に述べると、ＰＤＬでコーティングした９６ウェルプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上で、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＤＭＥＭに、ＨＥＫ２９３Ｔ ＷＴ細胞及びＡＳＭ ＫＯ細胞を低密度で播種した。播種から４時間後、組み換えＡＳＭ酵素、ＡＳＭ−Ｆｃ融合タンパク質またはコントロールの緩衝液を各ウェルに加え、４８時間、３７℃でインキュベートした。培地を除去し、１μＭのＢＯＤＩＰＹ−Ｃ５−スフィンゴミエリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む新鮮な培地に交換し、３７℃で１６時間インキュベートした。続いて、細胞をＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、核染色（ＤＡＰＩ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）及び細胞質染色（遠赤外セルマスク、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色した。画像は、共焦点顕微鏡Ｏｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で、対物倍率６３倍、１ウェル当たり複数視野で、１条件当たり３連のウェルにおいて取得した。１細胞ベースで、平均強度合計、蛍光斑の数、ＢＯＤＩＰＹ−Ｃ５−スフィンゴミエリンの蛍光斑強度を検出及び解析するＨａｒｍｏｎｙというソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、画像解析を行った。続いて、これらの１細胞ベースの値を平均化して１ウェル当たりの値にし、この値を用いて、遺伝子型及び／または処理が、ＢＯＤＩＰＹ−Ｃ５−スフィンゴミエリンの蓄積に及ぼす作用を解析した。ＡＳＭ ＫＯ細胞では、コントロール細胞株と比べて、ＢＯＤＩＰＹ−Ｃ５−スフィンゴミエリンの有意な蓄積が見られ、その作用は、組み換えＡＳＭ酵素及びＡＳＭ−Ｆｃ融合タンパク質を加えることによってレスキューできた（図１３）。
ＡＳＭ−Ｆｃ融合タンパク質が、細胞内でその活性を保持することをさらに確認するために、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳベースのアッセイを開発して、ＡＳＭ ＫＯ細胞において、内因性スフィンゴミエリンの蓄積をモニタリングした。上記のように、ＨＥＫ２９３Ｔ ＷＴ細胞及びＡＳＭ ＫＯ細胞を培養し、酵素で処理した。ＡＳＭまたはＡＳＭ−Ｆｃ融合タンパク質による処理を行ってまたは行わずに、播種から６８時間後、細胞をＰＢＳで充分に洗浄し、適切な内部標準を添加した状態で、水：メタノール［１：１，ｖ／ｖ］の混合物で脂質を抽出した。メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）を用いて脂質を抽出し、ボルテックスし、１０，０００×ｇ、４℃で１０分遠心分離した。続いて、脂質を含む上方のＭＴＢＥ画分を穏やかな窒素流下で蒸発乾固させた。脂質をイソプロパノール：アセトニトリル：水［２：１：１、ｖ／ｖ／ｖ］の混合物に再懸濁してから、さらなる解析のために、質量分析用バイアルに移した。
エレクトロスプレー質量分析法（Ｓｃｉｅｘ ６５００＋ＱＴＲＡＰ、Ｓｃｉｅｘ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）と組み合わせた液体クロマトグラフィー（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｎｅｘｅｒａ Ｘ２システム、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ，ＵＳＡ）によって、脂質解析を行った。解析ごとに、５μＬの試料をＢＥＨ Ｃ１８ １．７μｍ（２．１×１００ｍｍ）のカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）に、０．２５ｍＬ／分の流速、５５℃で注入した。移動相Ａは、１０ｍＭギ酸アンモニウム＋０．１％ギ酸を含む６０：４０のアセトニトリル／水（ｖ／ｖ）から構成させた。移動相Ｂは、１０ｍＭギ酸アンモニウム＋０．１％ギ酸を含む９０：１０のイソプロパノール／アセトニトリル（ｖ／ｖ）から構成させた。勾配は、０．０〜８．０分でＢ４５％→Ｂ９９％、Ｂ９９％で８．０〜１０．０分、１０．０〜１０．１分でＢ４５％、Ｂ４５％で１０．１〜１２．０分のようにプログラムした。エレクトロスプレーによるイオン化は、カーテンガス：２０、コリジョンガス：中度、イオンスプレー電圧：５２００、温度：２５０、イオン源ガス１：５０、イオン源ガス２：６０という設定を適用したポジティグイオンモードで行った。Ａｎａｌｙｓｔ１．６．（Ｓｃｉｅｘ）を多重反応モニタリングモード（ＭＲＭ）で、衝突エネルギー：４０、デクラスタリング電位：８０、エントランス電位：１０、コリジョンセルイグジット電位：１２．５において用いて、データ取得を行った。ＭＲＭトランジション（ｍ／ｚ５３８．５＞２６４．３のＣｅｒ ｄ１８：１／１６：０、ｍ／ｚ５６６．６＞２６４．３のＣｅｒ ｄ１８：１／１８：０、ｍ／ｚ５９４．６＞２６４．３のＣｅｒ ｄ１８：１／２０：０、ｍ／ｚ６２２．６＞２６４．３のＣｅｒ ｄ１８：１／２２：０、ｍ／ｚ６５０．６＞２６４．３のＣｅｒ ｄ１８：１／２４：０、ｍ／ｚ６４８．６＞２６４．３のＣｅｒ ｄ１８：１／２４：１、ｍ／ｚ５５２．４＞２６４．３のＣｅｒ ｄ１８：１／１７：０を内部標準として使用した）を用いて、セラミド（Ｃｅｒ）を［Ｍ−Ｈ２Ｏ＋Ｈ］＋として検出した。ＭＲＭトランジション（ｍ／ｚ７０３．７＞１８４．１のＳＭ ｄ１８：１／１６：０、ｍ／ｚ７３１．７＞１８４．１のＳＭ ｄ１８：１／１８：０、ｍ／ｚ７５９．７＞１８４．１のＳＭ ｄ１８：１／２０：０、ｍ／ｚ７８７．７＞１８４．１のＳＭ ｄ１８：１／２２：０、ｍ／ｚ８１５．７＞１８４．１のＳＭ ｄ１８：１／２４：０、ｍ／ｚ８１３．７＞１８４．１のＳＭ ｄ１８：１／２４：１、ｍ／ｚ７３８．７＞１８４．１のＳＭ ｄ１８：１／１８：１（ｄ９）を内部標準として使用した）を用いて、スフィンゴミエリン（ＳＭ）を［Ｍ＋Ｈ］＋として検出した。脂質を、それらの保持時間及び市販の参照標準物質（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ，ＵＳＡ）のＭＲＭ特性に基づき、特定した。ＭｕｌｔｉＱｕａｎｔ３．０２（Ｓｃｉｅｘ）を用いて、定量を行った。脂質は、全タンパク質量に対して正規化した。ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、タンパク質濃度を測定した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析によって、ＡＳＭ−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＳＭ ＫＯ細胞における内因性スフィンゴミエリンのレベルを、野生型細胞で見られるレベルまで低下させることができることが示された（図１４）。さらに、ＡＳＭ−Ｆｃ融合タンパク質は、いずれのアッセイでも、スフィンゴミエリンを減少させる効能が、ネイキッドＡＳＭ酵素と同程度であった（表３）。
勘案すると、これらのデータによって、ＡＳＭ−Ｆｃ融合タンパク質が、それらの活性を保持するとともに、ＡＳＭ欠損細胞において、基質の蓄積をレスキューできることが示されている。
実施例６．Ｎ−スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）を含む融合タンパク質の構築
設計及びクローニング
（ｉ）成熟ヒトＳＧＳＨ酵素が、Ｆｃ領域を含むヒトＩｇＧ１断片に融合されている融合ポリペプチド（「ＳＧＳＨ−Ｆｃ融合ポリペプチド」）、及び（ｉｉ）Ｆｃ領域に、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）への結合をもたらす変異を含む改変ヒトＩｇＧ１断片（「改変Ｆｃポリペプチド」）を含むＳＧＳＨ−Ｆｃ融合タンパク質を設計した。具体的には、ＳＧＳＨ断片をヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合したＳＧＳＨ−Ｆｃ融合ポリペプチドを作製した。いくつかのケースでは、リンカーをそのＳＧＳＨとＩｇＧ１断片の間に配置して、その２つの断片間のいずれの立体障害も緩和した。すべてのコンストラクトにおいて、κ鎖Ｖ−ＩＩＩの１〜２０位のアミノ酸（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ＩＤ−Ｐ０１６６１）に由来するシグナルペプチドをその融合物の上流に挿入して、分泌を促し、ＳＧＳＨをトランケートして、Ｒ２１〜Ｌ５０２のアミノ酸（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ＩＤ−Ｐ５１６８８）からなるようにした。使用したヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域の断片は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ＩＤ Ｐ０１８５７における配列のＤ１０４〜Ｋ３３０のアミノ酸（ＥＵインデックス番号で２２１〜４４７位、そのヒンジの１０個のアミノ酸（２２１〜２３０位）を含む）に対応する。いくつかの実施形態では、１つのＳＧＳＨ酵素を有するヘテロ二量体の融合タンパク質（「モノザイム」）を作製するために、ヒトＩｇＧ１の残基Ｄ１０４〜Ｋ３３０に由来する第２のＦｃポリペプチドであって、そのＦｃ領域に、ＴｆＲへの結合をもたらす変異を含むが、ＳＧＳＨへの融合を含まない第２のＦｃポリペプチドをＳＧＳＨ−Ｆｃ融合ポリペプチドとコトランスフェクションした。別の実施形態では、２つのＳＧＳＨ酵素を有するヘテロ二量体の融合タンパク質（「バイザイム」）を作製するために、ヒトＩｇＧ１残基Ｄ１０４〜Ｋ３３０に由来する第２のＦｃポリペプチドであって、そのＦｃ領域に、ＴｆＲへの結合をもたらす変異を含み、ＳＧＳＨに融合した第２のＦｃポリペプチドをＳＧＳＨ−Ｆｃ融合ポリペプチドとコトランスフェクションした。いくつかのコンストラクトでは、ＩｇＧ１断片に追加の変異を含めて、２つのＦｃ領域のヘテロ二量化を促した。ＴｆＲへの結合をもたらす変異を含まないコントロールのＳＧＳＨ−Ｆｃ融合タンパク質を同様にして設計及び構築した。追加のコントロールとして、検出及び精製を促すために、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグ（配列番号２４１）を有するＳＧＳＨ（アミノ酸Ｒ２１〜Ｌ５０２）を作製した。
実施例で使用した、ＴｆＲ結合を含むＳＧＳＨ−Ｆｃ融合タンパク質は、ＳＧＳＨ−Ｆｃ融合ポリペプチド、及びＴｆＲに結合する改変Ｆｃポリペプチドによって形成された二量体であって、その改変Ｆｃポリペプチドが、ＳＧＳＨへの融合を含まない（「モノザイム」）か、または第２のＳＧＳＨ分子に融合されている（「バイザイム」）二量体である。
ホール変異及びＬＡＬＡ変異を有するＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチド配列のＮ末端に融合された成熟ヒトＳＧＳＨ配列を含むＳＧＳＨ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、配列番号１４９の配列を有する。そのＳＧＳＨ酵素は、Ｆｃポリペプチドに、ＧＧＧＧＳというリンカー（配列番号２３９）によって連結したとともに、ＦｃポリペプチドのＮ末端には、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、配列番号１１３）を含めた。
ホール変異及びＬＡＬＡ変異を有するＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチド配列のＣ末端に融合された成熟ヒトＳＧＳＨ配列を含むＳＧＳＨ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、配列番号１５０の配列を有する。そのＳＧＳＨ酵素は、Ｆｃポリペプチドに、ＧＧＧＧＳというリンカー（配列番号２３９）によって連結したとともに、ＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（例えば配列番号１１３）を含み得る。
ＴｆＲに結合する改変Ｆｃポリペプチドであって、ノブ変異及びＬＡＬＡ変異とともに、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７（配列番号５８）の配列を含む改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１５１の配列を有する。その改変ＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（例えば配列番号１１３）を含み得る。
ＦｃポリペプチドのＮ末端に１つのＳＧＳＨ分子を含む「Ｎ末端モノザイム」は、配列番号１４９及び配列番号１５１の間に形成した。ＦｃポリペプチドのＣ末端に１つのＳＧＳＨ分子を含む「Ｃ末端モノザイム」は、配列番号１５０及び配列番号１５１の間に形成した。
ＴｆＲに結合する改変Ｆｃポリペプチドであって、ノブ変異及びＬＡＬＡ変異とともに、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７（配列番号５８）の配列のＮ末端に融合された成熟ヒトＳＧＳＨ配列を含む改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１５４の配列を有する。そのＳＧＳＨ酵素は、改変Ｆｃポリペプチドに、ＧＧＧＧＳというリンカー（配列番号２３９）によって連結したとともに、改変ＦｃポリペプチドのＮ末端に、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（配列番号１１３）を含めた。
そのＦｃポリペプチドのＮ末端に第１のＳＧＳＨ分子及びその改変ＦｃポリペプチドのＮ末端に第２のＳＧＳＨ分子を含む「Ｎ末端バイザイム」は、配列番号１４９及び配列番号１５４の間に形成した。
組み換えタンパク質の発現及び精製
Ｆｃ領域に融合された組み換えＳＧＳＨ酵素を発現させるために、Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯトランスフェクションキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をメーカーの指示に従って用いて、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に、該当するＤＮＡコンストラクトをトランスフェクションした。オービタルシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ ＨＴ Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ）で、細胞をＥｘｐｉＣＨＯ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍにおいて、３７℃、６％ＣＯ２及び１２０ｒｐｍで増殖させた。簡潔に述べると、対数増殖しているＥｘｐｉＣＨＯ（商標）細胞に、６×１０６細胞／ｍｌの密度で、培養体積１ｍＬ当たり０．８μｇのＤＮＡプラスミドをトランスフェクションした。トランスフェクション後、細胞を３７℃に戻し、トランスフェクションの１８〜２２時間後に、トランスフェクションした培養液に、示されているようなフィード液を添加した。トランスフェクションの１２０時間後に、３，５００ｒｐｍで２０分遠心分離することによって、トランスフェクションした細胞培養液の上清を回収した。清澄化した上清をろ過し（０．２２μＭの膜）、４℃で保存した。エピトープタグ付きＳＧＳＨ酵素（コントロールとして使用）の発現を、上記に若干の修正を加えて行った。簡潔に述べると、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグ（配列番号２４１）を有するＳＧＳＨ酵素をＥｘｐｉＣＨＯ細胞で発現させた。
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて、ＴｆＲへの結合をもたらす操作されたＦｃ領域を有する（または有さない）ＳＧＳＨ−Ｆｃ融合タンパク質を細胞培養液の上清から精製した。上清をプロテインＡアフィニティーカラムＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｋｔａ Ｐｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍを使用）に流した。続いて、カラムを２０カラム容量（ＣＶ）超のＰＢＳで洗浄した。１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１００ｍＭクエン酸／ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ３．０）を用いて、結合したタンパク質を溶出した。溶出直後に、１Ｍアルギニン−６７０ｍＭコハク酸の緩衝液（ｐＨ５．０、１：５希釈液）を用いて、画分を中和した。溶出された画分中のＳＧＳＨ−Ｆｃ融合タンパク質の均質性を還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。
ヘキサヒスチジンタグ（配列番号２４１）付きＳＧＳＨを精製するために、１００ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）１５Ｌに対して、トランスフェクションした上清を徹底的に一晩透析し、精製前に、その透析した上清に、２０ｍＭイミダゾールを加えた。透析した上清をＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｋｔａ Ｐｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍを使用）に結合させた。結合後、そのカラムを２０ＣＶのＰＢＳで洗浄した。５００ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳを用いて、結合したタンパク質を溶出した。溶出された画分中のＳＧＳＨ酵素の均質性を還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。ＳＧＳＨを含むプール画分を５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）で１：１０に希釈し、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてさらに精製できる。結合後、カラムを１０ＣＶの５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）で洗浄する。５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）及び０．５ＭのＮａＣｌへの線状勾配を用いて、結合したタンパク質を溶出し、１ＣＶの画分で回収する。画分純度を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価する。精製によって、均質なＳＧＳＨ−Ｆｃ融合タンパク質及びヘキサヒスチジンタグ（配列番号２４１）付きＳＧＳＨを得る。
実施例７．ＳＧＳＨ融合タンパク質の特徴付け
操作されたＴｆＲ結合部位を有するＳＧＳＨ−Ｆｃ融合タンパク質は、ヒトＴｆＲに結合する。
改変ＦｃドメインがヒトＴｆＲと相互作用する能力に、操作されたＴｆＲ結合部位を有するＳＧＳＨ−Ｆｃ融合タンパク質が影響を及ぼすか判定するために、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）表面プラズモン共鳴アッセイを用いて、このタンパク質のヒトＴｆＲに対する親和性を評価できる。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５センサーチップに、抗ヒトＦａｂを固定化する（ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのヒトＦａｂ捕捉キット）。５μｇ／ｍＬのＳＧＳＨ−Ｆｃ融合タンパク質を各フローセル上に１分捕捉させ、ヒトアピカルドメインＴｆＲの３倍段階希釈液を３０μＬ／分の流速で注入する。各試料を３分の結合及び３分の解離で解析する。注入後に毎回、１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ ２．１）を用いて、チップを再生する。無関係なＩｇＧが同程度の密度で捕捉されているフローセルから得たＲＵを減ずることによって、結合応答を補正する。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ３．１を用いて、平衡状態の結合応答を濃度に対してフィッティングすることによって、定常状態の親和性を得る。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）による解析によって、Ｆｃ領域に操作したＴｆＲ結合部位を有するＳＧＳＨ−Ｆｃ融合タンパク質が、ヒトＴｆＲに結合することが明らかになる。
操作されたＴｆＲ結合部位を有するＳＧＳＨ−Ｆｃ融合タンパク質は、インビトロ及び細胞において活性を有する。
操作されたＴｆＲ結合ＳＧＳＨ−Ｆｃ融合タンパク質のインビトロ活性及び細胞内活性を評価して、ヒトＩｇＧ断片に融合した場合に、ＳＧＳＨが、その酵素活性を保つことを示した。組み換えＳＧＳＨのインビトロ活性は、人工基質を用いる２段階蛍光酵素アッセイによって測定した。具体的には、アッセイ緩衝液（０．０３Ｍ酢酸ナトリウム、０．１２ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５）で希釈した２０μＬの１ｍＭの４−メチルウンベリフェリル２−デオキシ−２−スルファミノ−ａ−Ｄ−グルコピラノシドナトリウム塩基質（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ Ｌｉｍｉｔｅｄ、＃ＥＭ０６６０２）を１０μＬの４０ｎＭのＳＧＳＨと混合した。その第１の反応物を１７時間、３７℃でインキュベートしてから、１０μＬの０．２Ｍリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）で停止させた。次に、１０μＬ（０．５Ｕ）の酵母α−グルコシダーゼ（Ｓｉｇｍａ、＃Ｇ０６６０−７５０ＵＮ）を加えることによって、第２の反応を開始し、２４時間、３７℃でインキュベートし、１００μＬの０．５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．３）を加えることによって停止させた。続いて、その反応溶液の蛍光（３６５ｎｍにおける励起及び４５０ｎｍにおける発光）を測定した。生成物量を算出するために、４−メチルウンベリフェロンによる検量線を線形回帰によってフィッティングして、総基質切断の１０％未満として確認した。生成物量を反応時間及びＳＧＳＨのモル量で除することによって、比活性（生成物量（フェモトモル）／分／ＳＧＳＨ １ピコモル）を算出した。
インビトロ酵素活性アッセイによって、ＳＧＳＨ−Ｆｃ融合タンパク質が活性を有したことが示されたとともに、Ｆｃ領域をＳＧＳＨに融合しても、酵素活性が損なわれないことが示された（図１５）。
ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９を用いて、ＳＧＳＨノックアウト（ＫＯ）細胞を作製して、操作されたＳＧＳＨ−Ｆｃポリペプチドの細胞内活性を試験するための細胞系を得た。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）に、ヒトＳＧＳＨにおいてホルミルグリシンを生成する、反応性システイン部位の上流のエキソン２を標的とするガイド配列を含むＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９ ｐＣａｓ−Ｇｕｉｄｅ−ＥＦ１ａ−ＧＦＰベクター（Ｏｒｉｇｅｎｅ）をトランスフェクションした。ＳＧＳＨ ＫＯ細胞を特定するために、単一細胞クローンを増殖させ、細胞溶解液に対して、上記のインビトロＳＧＳＨ酵素アッセイを行った。簡潔に述べると、そのインビトロ活性アッセイは、酢酸鉛アッセイ緩衝液（ｐＨ５．０、１００ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭ酢酸鉛）中の細胞溶解液１２．５μｇ、２５μｇ、５０μｇ及び１００μｇを用いて行った。２０μＬの標準化細胞溶解液（水中）と、１０μＬの酢酸鉛緩衝液（３×）中の１ｍＭ基質を混ぜ合わせることによって、反応を開始させ、３７℃で１７時間インキュベートした。７０μＬの４×クエン酸・リン酸緩衝液（ｐＨ６．７）及び０．５Ｕ ＮＡＧＬＵ（Ｓｉｇｍａ）を加えることによって、この第１の反応を停止させた。その反応を２４時間、３７℃で進行させてから、１００μＬの０．５Ｍ炭酸ナトリウム（ｐＨ１０．３）を加えることによって停止させた。ＨＥＫ２９３Ｔ ＣＲＩＳＰＲクローンにおけるＳＧＳＨ活性と、組み換えＳＧＳＨ（Ｒ＆Ｄ）（アッセイ基準として使用）、ＨＥＫ野生型（ＷＴ）溶解液及びＳＧＳＨを過剰発現するＨＥＫ細胞溶解液と比較した。ｍｉｎｉ−Ｔｏｐｏ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）クローニング後、バックグラウンドシグナルに相当する酵素活性レベルを有するクローンの配列を確認し、ＫＯクローンとして確認した。その後の細胞アッセイでは、確認された３つの特有のＳＧＳＨ ＫＯクローン及び３つの独立したＷＴ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞バッチを使用した。
ネイキッドＳＧＳＨ酵素またはＳＧＳＨ−Ｆｃ融合タンパク質の細胞内活性を試験するために、ＳＧＳＨ活性の指標として、基質（ヘパラン硫酸）の蓄積量をモニタリング可能にするＬＣ−ＭＳ／ＭＳベースのグライコミクスアッセイを開発した。基質の蓄積は、ＳＧＳＨ ＫＯ細胞及びＷＴ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で測定した。ＳＧＳＨ ＫＯ細胞及びＷＴ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を２４時間培養し、細胞を３回、ＰＢＳで洗浄し、ペレット化し、凍結した。細胞ペレットを二糖消化緩衝液（１１１ｍＭのＮＨ４ＯＡｃ、１１ｍＭのＣａＯＡｃ、ｐＨ７．０）で超音波処理した。ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、タンパク質濃度を測定した。２ｍＭのＤＴＴ、１．２５ｍＩＵ ヘパリナーゼＩ（Ｇａｌｅｎ）、１．２５ｍＩＵ ヘパリナーゼＩＩ（Ｇａｌｅｎ）及び１．２５ｍＩＵ ヘパリナーゼＩＩＩ（Ｇａｌｅｎ）を含む１００μＬの消化緩衝液に、全タンパク質（１００μｇ）を加えた。３０℃で３時間後、ヘパラン硫酸の消化が完結し、その後、２０ｎｇの内部標準（４ＵＡ−２Ｓ−ＧｌｃＮＣＯＥｔ−６Ｓ ＨＤ００９［Ｇａｌｅｎ］）を各試料に加えた。６μＬの２５０ｍＭのＥＤＴＡを加えることによって、酵素を失活させ、試料を９５℃で１０分煮沸した。続いて、試料を１６，０００×Ｇで５分、室温で遠心分離した。上清を遠心フィルターＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ３０ＫＤ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、１４，０００×Ｇで１５分遠心分離した。そのフロースルーで二糖を濃縮し、アッセイ緩衝液：アセトニトリル［１：１、ｖ／ｖ］の混合物に再懸濁してから、さらなる解析のために、質量分析用バイアルに移した。
エレクトロスプレー質量分析法（Ｓｃｉｅｘ ６５００＋ＱＴＲＡＰ、Ｓｃｉｅｘ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）と組み合わせた液体クロマトグラフィー（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｎｅｘｅｒａ Ｘ２システム、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ，ＵＳＡ）によって、ＧＡＧの解析を行った。解析ごとに、０．４ｍＬ／分の流速とともに、５０℃のカラム温度を用いて、１０μＬの試料をＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅ １．７μｍ（２．１×１５０ｍＭ）のカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）に注入した。移動相Ａは、１０ｍＭギ酸アンモニウム及び０．１％ギ酸を含む水から構成させた。移動相Ｂは、０．１％ギ酸を含むアセトニトリルから構成させた。勾配は、Ｂ８５％を０．０〜１．０分、１．０〜５．０分でＢ８５％→Ｂ５０％、５．０〜６．０分でＢ５０％→Ｂ８５％、Ｂ８５％を６〜８．０分保持のようにプログラムした。エレクトロスプレーによるイオン化は、カーテンガス：３０、コリジョンガス：中度、イオンスプレー電圧：−４５００、温度：４５０、イオン源ガス１：５０、イオン源ガス２：６０という設定を適用したネガティブイオンモードで行った。Ａｎａｌｙｓｔ１．６．３（Ｓｃｉｅｘ）を多重反応モニタリングモード（ＭＲＭ）で、ドウェル時間：２５（ミリ秒）、衝突エネルギー：−３０、デクラスタリング電位：−８０、エントランス電位：−１０、コリジョンセルイグジット電位：−１０において用いて、データ取得を行った。ＭＲＭトランジション（ｍ／ｚ３７８．１＞８７．０のＤ０Ａ０、ｍ／ｚ３７８．１＞１７５．０のＤ０ａ０、ｍ／ｚ４１６．１＞１３８．０のＤ０Ｓ０、ｍ／ｚ４５８．１＞３００．０のＤ０ａ４、ｍ／ｚ４５８．１＞９７．０のＤ０Ａ６、Ｄ２Ａ０、Ｄ０ａ６、Ｄ２ａ０、ｍ／ｚ４９６．０＞４１６．１のＤ０Ｓ６、Ｄ２Ｓ０、ｍ／ｚ５３８．０＞４５８．０のＤ２ａ４、Ｄ２ａ６、Ｄ０ａ１０、Ｄ２Ａ６、ｍ／ｚ５７５．９５＞９７．０のＤ０Ｓ６、ｍ／ｚ４７２．０（フラグメントイオン）＞９７．０の４ＵＡ−２Ｓ−ＧｌｃＮＣＯＥｔ−６Ｓを内部標準（Ｉ．Ｓ．）として使用した）を用いて、ＧＡＧを［Ｍ−−Ｈ］として検出した。ＧＡＧを、それらの保持時間及びＭＲＭトランジションの市販の参照標準物質（Ｉｄｕｒｏｎ Ｌｔｄ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）への一致に基づき、特定した。ＭｕｌｔｉＱｕａｎｔ ３．０．２（Ｓｃｉｅｘ）を用いて、Ｉ．Ｓ．に対する面積比によって、定量を行った。ＧＡＧは、全タンパク質量に対して正規化した。ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、タンパク質濃度を測定した。
ヘパラン硫酸の消化後に観察された二糖の量に反映されているように、ＳＧＳＨ ＫＯ細胞において、コントロール細胞株と比べて、基質の有意な蓄積が見られた（図１６）。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳベースのグライコミクスアッセイを用いて、ＴｆＲ結合ＳＧＳＨ−Ｆｃ融合タンパク質によって細胞を処理すると、ヘパラン硫酸由来の二糖のレベルが、野生型細胞で見られたレベルまで低下したことが明らかになった（図１７）。勘案すると、これらのデータによって、ＳＧＳＨ−Ｆｃ融合タンパク質が、酵素活性を保持するとともに、ＳＧＳＨ ＫＯ細胞における基質の蓄積を低減できることが示されている。
実施例８．ＳＧＳＨ活性に関するインビトロアッセイ
この実施例には、ＳＧＳＨ−Ｆｃ融合タンパク質に関する代替的なインビトロ活性アッセイが示されている。そのアッセイは、Ｋａｒｐｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｈｅｒｉｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓ．，１９：２７８−２８５（１９９６）から改変したものである。
標準反応混合物を、ミハエリスのバルビタール酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５、２９ｍｍｏｌ／Ｌのバルビタールナトリウム、２９ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸ナトリウム、０．６８％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、ＨＣｌによってｐＨ６．５に調整）中の１０〜１５μｇのタンパク質及び２０μＬのＭＵ−α−ＧｌｃＮＳ（それぞれ、５ｍｍｏｌ／Ｌまたは１０ｍｍｏｌ／Ｌ）から構成させ、その反応混合物を１７時間、３７℃でインキュベートした。ＭＵ−α−ＧｌｃＮＳは、Ｍｏｓｃｅｒｄａｍ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓから入手可能である。１回目のインキュベーション後、０．０２％アジ化ナトリウムを含む２倍濃縮マッキルベインリン酸／クエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）を６μＬ、及び水中の酵母ａ−グルコシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）１０μＬ（０．１Ｕ）を加え、２回目のインキュベーションを２４時間、３７℃で行った。３７℃で長時間のインキュベーション（１７〜２４時間）を９６ウェルプレートで行い、そのプレートは、空気を通さないように、幅広い粘着テープで密閉し、蒸発を１５％未満に制限した。次に、０．５ｍｏｌ／ＬのＮａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３（ｐＨ１０．７）を２００μＬ加え、放出された４−メチルウンベリフェロン（ＭＵ）の蛍光を蛍光光度計Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ）で測定した。以前に記載されたように（ｖａｎ Ｄｉｇｇｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．，１８７：１３１−１３９（１９９０））、タンパク質を求めた。
実施例９．ＴｆＲに結合する改変Ｆｃポリペプチド
この実施例では、Ｆｃポリペプチドに対する改変であって、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）への結合をもたらし、血液脳関門（ＢＢＢ）を越えて輸送するための改変について記載する。
別段に示されていない限り、この節におけるアミノ酸残基の位置は、ヒトＩｇＧ１野生型Ｆｃ領域に関して、ＥＵインデックスナンバリングに基づき番号付けがなされている。
３８４位、３８６位、３８７位、３８８位、３８９位、３９０位、４１３位、４１６位及び４２１位に改変を含むＦｃポリペプチド（ＣＨ３Ｃクローン）の作製及び特徴付け
３８４位、３８６位、３８７位、３８８位、３８９位、３９０位、４１３位、４１６位及び４２１位のアミノ酸位置を含む位置に改変が導入されているＦｃ領域を含む酵母ライブラリーを下記のように作製した。ＴｆＲに結合する例示的なクローンは、表４及び５に示されている。
選別を追加で２ラウンド行った後、シングルクローンをシーケンシングし、固有の配列を４つ特定した。これらの配列は、保存されているＴｒｐを３８８位に有していたとともに、いずれも、芳香族残基（すなわちＴｒｐ、ＴｙｒまたはＨｉｓ）を４２１位に有していた。他の位置では、多様性が非常に大きかった。
そのライブラリーから選択した４つのクローンをＣＨＯ細胞または２９３細胞において、Ｆａｂ断片へのＦｃ融合物として発現させ、プロテインＡ及びサイズ排除クロマトグラフィーによって精製してから、ホロ−Ｔｆの存在下または非存在下で、ヒトＴｆＲへの結合について、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。それらのクローンはすべて、ヒトＴｆＲに結合したとともに、その結合は、過剰な（５μＭ）ホロ−Ｔｆを加えたことによる影響を受けなかった。クローンは、ヒトＴｆＲを内因的に発現する２９３Ｆ細胞への結合についても試験した。クローンは、２９３Ｆ細胞に結合したが、その結合は全体的に、高親和性ポジティブコントロールよりも実質的に弱かった。
次に、クローンＣＨ３Ｃ．３を試験クローンとして用いて、クローンがＴｆＲ発現細胞に内在化できるか試験した。接着性ＨＥＫ２９３細胞を９６ウェルプレートで約８０％コンフルエンスまで増殖させ、培地を除去し、試料（クローンＣＨ３Ｃ．３、抗ＴｆＲベンチマークポジティブコントロール抗体（Ａｂ２０４）、抗ＢＡＣＥ１ベンチマークネガティブコントロール抗体（Ａｂ１０７）及びヒトＩｇＧアイソタイプコントロール（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈから入手したもの））を１μＭの濃度で加えた。その細胞を３７℃、８％のＣＯ２濃度で３０分インキュベートしてから洗浄し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００で浸透化処理し、二次抗体の抗ヒト−ＩｇＧ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８で染色した。さらなる洗浄後、その細胞をハイコンテント蛍光顕微鏡（すなわちＯｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘ（商標）システム）で画像化し、１細胞当たりの蛍光斑の数を定量した。１μＭでは、クローンＣＨ３Ｃ．３は、抗ＴｆＲポジティブコントロールと同様の内在化の傾向を示したが、ネガティブコントロールは内在化を示さなかった。
クローンのさらなる操作
ソフトランダム化のアプローチを用いて、ヒトＴｆＲに対する最初のヒットの親和性を向上させるために、追加のライブラリーを作製した（その際には、ＤＮＡオリゴを作製して、最初の４つのヒットのそれぞれに基づき、ソフト変異誘発を導入した）。ＴｆＲに結合した追加のクローンを特定し、選択した。選択したクローンは、２つの大まかな配列グループに分かれた。グループ１のクローン（すなわち、クローンＣＨ３Ｃ．１８、ＣＨ３Ｃ．２１、ＣＨ３Ｃ．２５及びＣＨ３Ｃ．３４）は、３８４位に半保存的なＬｅｕ、３８６位にＬｅｕまたはＨｉｓ、３８７位に保存的なＶａｌ、３８９位に半保存的なＶａｌ、４１３位、４１６位及び４２１位にそれぞれ半保存的なＰ−Ｔ−Ｗモチーフを有していた。グループ２のクローンは、３８４位に保存的なＴｙｒ、３８６〜３９０位にモチーフＴＸＷＳＸ、ならびに４１３位、４１６位及び４２１位に保存的なモチーフＳ／Ｔ−Ｅ−Ｆを有していた。追加の試験では、クローンＣＨ３Ｃ．１８及びＣＨ３Ｃ．３５を各配列グループの代表的なメンバーとして使用した。
エピトープマッピング
操作されたＦｃ領域が、ＴｆＲのアピカルドメインに結合するか判定するために、ＴｆＲアピカルドメインをファージの表面で発現させた。アピカルドメインを適正にフォールディングして提示させるには、そのループの１つをトランケートする必要があったとともに、その配列を環状に並び替える必要があった。クローンＣＨ３Ｃ．１８及びＣＨ３Ｃ．３５をＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、ファージＥＬＩＳＡプロトコールに従った。簡潔に述べると、１％ＰＢＳＡで洗浄及びブロックした後、ファージディスプレイの希釈液を加え、室温で１時間インキュベートした。次いで、そのプレートを洗浄し、抗Ｍ１３−ＨＲＰを加え、さらに洗浄後、そのプレートをＴＭＢ基質で発色させ、２Ｎ Ｎ２ＳＯ４でクエンチした。このアッセイでは、クローンＣＨ３Ｃ．１８及びＣＨ３Ｃ．３５のいずれも、アピカルドメインに結合した。
パラトープマッピング
ＴｆＲへの結合には、Ｆｃドメイン内のどの残基が最も重要であるのかを把握するために、各変異体のＴｆＲ結合レジスター内の１つの位置を変異させて野生型に戻した一連の変異体クローンＣＨ３Ｃ．１８及びクローンＣＨ３Ｃ．３５Ｆｃ領域を作製した。得られたバリアントをＦｃ−Ｆａｂ融合物として組み換え発現させ、ヒトＴｆＲまたはカニクイザルＴｆＲへの結合について試験した。クローンＣＨ３Ｃ．３５では、結合のためには、３８８位及び４２１位が重要であり、これらの位置のいずれかを野生型に戻すと、ヒトＴｆＲへの結合が完全に消失した。
成熟クローンの結合の特徴付け
上記のように、精製Ｆｃ−Ｆａｂ融合バリアントと、プレートにコーティングしたヒトＴｆＲまたはカニクイザルＴｆＲによって、結合ＥＬＩＳＡを行った。クローンＣＨ３Ｃ．１８成熟ライブラリー、クローンＣＨ３Ｃ．３．２−１、クローンＣＨ３Ｃ．３．２−５及びクローンＣＨ３Ｃ．３．２−１９に由来するバリアントは、同程度のＥＣ５０値で、ヒトＴｆＲ及びカニクイザルＴｆＲに結合したが、親クローンＣＨ３Ｃ．１８及びＣＨ３Ｃ．３５では、ヒトＴｆＲへの結合性は、カニクイザルＴｆＲと比べて１０倍高かった。
次に、改変Ｆｃポリペプチドが、ヒト細胞及びサル細胞に内在化されるかを試験した。上記のプロトコールを用いて、ヒトＨＥＫ２９３細胞及びアカゲザルＬＬＣ−ＭＫ２細胞への内在化を試験した。ヒトＴｆＲ及びカニクイザルＴｆＲに同様に結合したバリアントのクローンＣＨ３Ｃ．３．２−５及びＣＨ３Ｃ．３．２−１９では、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞への内在化が、クローンＣＨ３Ｃ．３５と比べて有意に向上した。
クローンの追加の操作
さらなる親和性成熟クローンＣＨ３Ｃ．１８及びＣＨ３Ｃ．３５に対する追加の操作には、直接的な相互作用、第２殻相互作用または構造安定化を通じて結合を向上させる位置に、追加の変異を加えることを含めた。これは、「ＮＮＫウォーク」または「ＮＮＫパッチ」ライブラリーから作製及び選択することを介して行った。そのＮＮＫウォークライブラリーでは、パラトープに近い残基に１つずつＮＮＫ変異を導入した。ＦｃγＲＩに結合したＦｃ（ＰＤＢ ＩＤ：４Ｗ４Ｏ）の構造を調べることにより、元の改変位置の近くの４４個の残基が調査候補として特定された。具体的には、Ｋ２４８、Ｒ２５５、Ｑ３４２、Ｒ３４４、Ｅ３４５、Ｑ３４７、Ｔ３５９、Ｋ３６０、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｋ３７０、Ｅ３８０、Ｅ３８２、Ｓ３８３、Ｇ３８５、Ｙ３９１、Ｋ３９２、Ｔ３９３、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｓ４０３、Ｋ４０９、Ｌ４１０、Ｔ４１１、Ｖ４１２、Ｋ４１４、Ｓ４１５、Ｑ４１８、Ｑ４１９、Ｇ４２０、Ｖ４２２、Ｆ４２３、Ｓ４２４、Ｓ４２６、Ｑ４３８、Ｓ４４０、Ｓ４４２、Ｌ４４３、Ｓ４４４、Ｐ４４５８、Ｇ４４６及びＫ４４７という残基をＮＮＫ変異誘発の標的とした。Ｋｕｎｋｅｌの変異誘発法を用いて、これらの４４個の一点ＮＮＫライブラリーを作製し、その生成物をプールし、他の酵母ライブラリーについて上で説明したように、エレクトロポレーションによって酵母に導入した。
これらのミニライブラリー（それぞれ、１個の位置を変異させ、２０個のバリアントを得た）を組み合わせて、小規模のライブラリーを作製し、酵母表面への提示を用いて、このライブラリーを、より高い親和性で結合をもたらす位置について選択した。選択は、上記のように、ＴｆＲアピカルドメインタンパク質を用いて行った。選別を３ラウンド行った後、濃縮された酵母ライブラリーに由来するクローンをシークエンシングし、特定の点変異によって、アピカルドメインタンパク質への結合が顕著に向上するいくつかの「ホットスポット」の位置が特定された。クローンＣＨ３Ｃ．３５では、これらの変異には、Ｅ３８０（Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、またはＧｌｎに変異）及びＳ４１５（Ｇｌｕに変異）が含まれていた。クローンＣＨ３Ｃ．３５の単一変異体及び複合変異体の配列は、配列番号２７〜３８に示されている。クローンＣＨ３Ｃ．１８では、これらの変異には、Ｅ３８０（Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＬｅｕに変異）及びＫ３９２（Ｇｌｎ、ＰｈｅまたはＨｉｓに変異）が含まれていた。クローンＣＨ３Ｃ．１８の単一変異体の配列は、配列番号２１〜２６に示されている。
クローンＣＨ３Ｃ．３５の親和性を向上させるための追加の成熟ライブラリー
ＮＮＫウォークライブラリーから変異の組み合わせを特定する一方で、これらの周辺に、いくつかの追加の位置を追加するための追加のライブラリーを、上記の酵母ライブラリーについて述べたようにして作製した。このライブラリーでは、ＹｘＴＥＷＳＳ（配列番号２４２）及びＴｘｘＥｘｘｘｘＦモチーフを一定に保ち、Ｅ３８０、Ｋ３９２、Ｋ４１４、Ｓ４１５、Ｓ４２４及びＳ４２６という６つの位置を完全にランダム化した。Ｅ３８０及びＳ４１５の位置は、ＮＮＫウォークライブラリーにおいて「ホットスポット」であったので、これらの位置を含めた。Ｋ３９２、Ｓ４２４及びＳ４２６という位置は、結合領域の位置を決定し得るコアの部分を構成するので、これらの位置を含め、Ｋ４１４は、４１５位に隣接するので、選択した。
上述のように、カニクイザルＴｆＲのアピカルドメインのみによって、このライブラリーを選別した。５ラウンド後に、濃縮されたプールをシークエンシングしたが、特定された固有のクローンの改変領域の配列は、配列番号４２〜５９に示されている。
主な結合パラトープにおける許容可能な多様性をさらに調べるために、次のライブラリーを設計した。元の位置（３８４位、３８６位、３８７位、３８８位、３８９位、３９０位、４１３位、４１６位及び４２１位）のそれぞれ、ならびに２つのホットスポット（３８０位及び４１５位）をＮＮＫコドンで個々にランダム化して、一連の一点飽和変異誘発ライブラリーを酵母で作製した。加えて、それぞれの位置を個々に野生型残基に戻し、これらの個々のクローンを酵母上に提示させた。野生型残基に戻した際に、ＴｆＲへの実質的な結合を維持した位置は、３８０位、３８９位、３９０位及び４１５位のみであったことが認められた（４１３位を野生型に戻した際には、結合が若干残っていたものの、大幅に消失したことが観察された）。
単一位置のＮＮＫライブラリーを、ヒトＴｆＲアピカルドメインに対して、３ラウンドで選別して、結合したライブラリーの上位約５％を回収してから、少なくとも１６個のクローンを各ライブラリーからシークエンシングした。その結果によって、ＣＨ３Ｃ．３５クローンに関して、各位置のどのアミノ酸が、ヒトＴｆＲへの結合を大きく低下させることなく、許容できるかが示される。以下に要約を示す。
３８０位：Ｔｒｐ、ＬｅｕまたはＧｌｕ
３８４位：ＴｙｒまたはＰｈｅ
３８６位：Ｔｈｒのみ
３８７位：Ｇｌｕのみ
３８８位：Ｔｒｐのみ
３８９位：Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＶａｌ（野生型のＡｓｎ残基では、結合が若干維持されるようであるが、ライブラリーの選別後には認められなかった。）
３９０位：ＳｅｒまたはＡｓｎ
４１３位：ＴｈｒまたはＳｅｒ
４１５位：ＧｌｕまたはＳｅｒ
４１６位：Ｇｌｕのみ
４２１位：Ｐｈｅのみ
上記の残基は、１つの変化として、または組み合わせて、クローンＣＨ３Ｃ．３５内へ置換された場合には、ＴｆＲアピカルドメインへの結合を維持するパラトープ多様性をもたらす。これらの位置に変異を有するクローンとしては、表５に示されているものが挙げられ、これらのクローンのＣＨ３ドメインの配列は、配列番号３４〜３８、５８及び６０〜９０に示されている。
実施例１０．ＴｆＲへの結合をもたらすように改変できる追加のＦｃ位置
トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に結合する追加の改変Ｆｃポリペプチドであって、Ｆｃ領域内の代替的な部位、例えば、
２７４位、２７６位、２８３位、２８５位、２８６位、２８７位、２８８位及び２９０位（ＣＨ２Ａ２クローン）、
２６６位、２６７位、２６８位、２６９位、２７０位、２７１位、２９５位、２９７位、２９８位及び２９９位（ＣＨ２Ｃクローン）、
２６８位、２６９位、２７０位、２７１位、２７２位、２９２位、２９３位、２９４位及び３００位（ＣＨ２Ｄクローン）、
２７２位、２７４位、２７６位、３２２位、３２４位、３２６位、３２９位、３３０位及び３３１位（ＣＨ２Ｅ３クローン）または
３４５位、３４６位、３４７位、３４９位、４３７位、４３８位、４３９位及び４４０位（ＣＨ３Ｂクローン）
の位置に改変を有する追加の改変Ｆｃポリペプチドを作製した。
ＴｆＲに結合する例示的なＣＨ３Ｂクローンは、配列番号１２４〜１２８に示されている。ＴｆＲに結合する例示的なＣＨ２Ａ２クローンは、配列番号１２９〜１３３に示されている。ＴｆＲに結合する例示的なＣＨ２Ｃクローンは、配列番号１３４〜１３８に示されている。ＴｆＲに結合する例示的なＣＨ２Ｄクローンは、配列番号１３９〜１４３に示されている。ＴｆＲに結合する例示的なＣＨ２Ｅ３クローンは、配列番号１４４〜１４８に示されている。
実施例１１．方法．
ファージディスプレイライブラリーの作製
野生型ヒトＦｃ配列をコードする鋳型ＤＮＡを合成し、ファージミドベクターに組み込んだ。そのファージミドベクターは、ｏｍｐＡまたはｐｅｌＢリーダー配列、ｃ−Ｍｙｃ及び６ｘＨｉｓ（配列番号２４１）エピトープタグに融合されたＦｃインサート、ならびにアンバー終止コドンに続いて、Ｍ１３コートタンパク質ｐＩＩＩを含むものであった。
改変を行うための所望の位置に「ＮＮＫ」三重コドンを含むプライマーを作製した（Ｎは、いずれかのＤＮＡ塩基（すなわち、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）であり、Ｋは、ＧまたはＴのいずれかである）。あるいは、「ソフト」ランダム化用のプライマーを使用し、そのプライマーでは、７０％が野生型塩基に対応し、１０％ずつが他の３つの塩基に対応した塩基ミックスをそれぞれのランダム化位置に使用した。ランダム化の領域に対応するＦｃ領域の断片のＰＣＲ増幅を行ってから、ＳｆｉＩ制限部位を含む末端プライマーを用いてアセンブルした後、ＳｆｉＩで消化して、ファージミドベクターにライゲーションすることによって、ライブラリーを作製した。あるいは、それらのプライマーを用いて、Ｋｕｎｋｅｌの変異誘発法を行った。そのライゲーション産物またはＫｕｎｋｅｌ法による産物をＴＧ１株のＥ．ｃｏｌｉエレクトロコンピテントセル（Ｌｕｃｉｇｅｎ（登録商標）から入手したもの）に導入した。回収後、そのＥ．ｃｏｌｉ細胞にＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを感染させ、一晩増殖させた後、ライブラリーファージを５％ＰＥＧ／ＮａＣｌで沈殿させ、ＰＢＳ中の１５％グリセロールに再懸濁し、使用時まで凍結した。典型的なライブラリーサイズは、形質転換体約１０９〜約１０１１個の範囲であった。ｐＩＩＩ融合Ｆｃと、ｐＩＩＩに結合されていない可溶性Ｆｃとの対合によって、ファージ上にＦｃ二量体を提示させた（その可溶性Ｆｃは、ｐＩＩＩの手前のアンバー終止コドンにより生成される）。
酵母ディスプレイライブラリーの作製
野生型ヒトＦｃ配列をコードする鋳型ＤＮＡを合成し、酵母ディスプレイベクターに組み込んだ。ＣＨ２及びＣＨ３ライブラリーでは、ＦｃポリペプチドをＡｇａ２ｐ細胞壁タンパク質上に提示させた。いずれのベクターも、Ｋｅｘ２切断配列を有するプレプロリーダーペプチド、及びＦｃの末端に融合されたｃ−Ｍｙｃエピトープタグを含むものであった。
そのベクターに対する相同末端を有するプライマーを用いて、断片の増幅を行った以外は、ファージライブラリーについて述べたものと同様の方法を用いて、酵母ディスプレイライブラリーをアセンブルした。新たに調製したエレクトロコンピテント酵母（すなわちＥＢＹ１００株）に、直鎖状にしたベクター及びアセンブルしたライブラリーインサートをエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション法は、当業者には既知であろう。選択培地ＳＤ−ＣＡＡで回収後、酵母をコンフルエンスまで増殖させ、２回分割した後、ＳＤ−ＣＡＡ培地に移すことによって、タンパク質の発現を誘導した。典型的なライブラリーサイズは、形質転換体約１０７〜約１０９個の範囲であった。隣接して提示されたＦｃ単量体の対合によって、Ｆｃの二量体が形成された。
ファージの一般的な選択方法
ファージ法は、Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｂａｒｂａｓ，２００１）から改変した。追加のプロトコールの詳細は、この参照文献から入手できる。
プレートの選別方法
抗原をＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）マイクロタイタープレートに一晩、４℃でコーティングした（典型的には１〜１０μｇ／ｍＬ）。ファージライブラリーを各ウェルに加え、結合のために、一晩インキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳで、マイクロタイターウェルを広範囲に洗浄し、ウェルを酸（典型的には、５００ｍＭのＫＣｌまたは１００ｍＭのグリシンを含む５０ｍＭのＨＣｌ（ｐＨ２．７））と３０分インキュベートすることによって、結合したファージを溶出した。溶出されたファージを１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）で中和し、ＴＧ１細胞及びＭ１３／ＫＯ７ヘルパーファージを用いて増幅し、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン及び５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ＹＴ培地において一晩、３７℃で増殖させた。標的の入ったウェルから溶出されたファージの力価と、標的の入っていないウェルから回収されたファージの力価を比較して、濃縮度を評価した。次に、結合の際のインキュベーション時間を短縮し、洗浄時間及び洗浄の回数を増やすことによって、選択のストリンジェンシーを向上させた。
ビーズの選別方法
ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）から入手したもの）を用いて、遊離アミンを介して、抗原をビオチン化した。ビオチン化反応では、３〜５倍モル過剰のビオチン試薬をＰＢＳ中で用いた。反応をＴｒｉｓでクエンチした後、ＰＢＳ中で充分に透析した。ビオチン化された抗原をストレプトアビジンコート磁気ビーズ（すなわち、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから入手したＭ２８０ストレプトアビジンビーズ）上に固定化した。ファージディスプレイライブラリーを抗原コートビーズと室温で１時間インキュベートした。続いて、結合しなかったファージを除去し、ビーズをＰＢＳＴで洗浄した。結合したファージを除去し、ビーズをＰＢＳＴで洗浄した。５００ｍＭのＫＣｌ（または０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７）を含む５０ｍＭのＨＣｌと３０分インキュベートすることによって、結合したファージを溶出した後、プレートの選別について上記に述べたようにして、中和し、増殖させた。
パニングを３〜５ラウンド行った後、ファージ上で、またはＥ．ｃｏｌｉペリプラズム中で可溶性に、Ｆｃを発現させることによって、シングルクローンをスクリーニングした。このような発現法は、当業者には既知であろう。抗原またはネガティブコントロールをコーティングし、ブロックしたＥＬＩＳＡプレートに、個々のファージ上清またはペリプラズム抽出物を曝露させた後、ペリプラズム抽出物ではＨＲＰコンジュゲートヤギ抗Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈから入手したもの）を用いて、またはファージでは抗Ｍ１３（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて検出してから、ＴＭＢ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから入手したもの）で発色させた。ＯＤ４５０値がバックグラウンドの約５倍超であるウェルを陽性クローンとみなし、シークエンシングし、その後、一部のクローンを可溶性Ｆｃ断片として発現させるか、またはＦａｂ断片に融合させた。
酵母の一般的な選択方法
ビーズの選別（磁気細胞選別（ＭＡＣＳ））の方法
Ａｃｋｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．２００９ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２５（３），７７４（２００９）に記載されているのと同様にして、ＭＡＣＳ及びＦＡＣＳによる選択を行った。ストレプトアビジン磁気ビーズ（例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒのストレプトアビジンビーズＭ−２８０）をビオチン化抗原で標識し、酵母とインキュベートした（典型的には、５〜１０倍のライブラリー多様性）。結合しなかった酵母を除去し、ビーズを洗浄し、結合した酵母を選択培地中で増殖させ、後の選択ラウンド用に誘導した。
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）の方法
発現及びビオチン化抗原（選別ラウンドに応じて、濃度が変動する）をモニタリングするために、酵母を抗ｃ−Ｍｙｃ抗体で標識した。一部の実験では、相互作用のアビディティを高めるために、抗原をストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７と予め混合した。他の実験では、結合後、ビオチン化抗原を検出し、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７で洗浄した。セルソーターＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＩを用いて、結合を有するシングレットの酵母を選別した。選別した酵母を選択培地中で増殖させてから、後の選択ラウンド用に誘導した。
濃縮された酵母集団を得た後、酵母をＳＤ−ＣＡＡ寒天プレートに播種し、シングルコロニーを増殖させ、発現を誘導した後、上記のように標識して、標的に結合する傾向を求めた。次いで、陽性のシングルクローンを抗原の結合についてシークエンシングした後、一部のクローンを可溶性のＦｃ断片として発現させるか、またはＦａｂ断片に融合させた。
一般的なスクリーニング方法
ＥＬＩＳＡによるスクリーニング
パニングの結果からクローンを選択し、９６ウェルディープウェルプレートの個々のウェル中で増殖させた。そのクローンに、オートインダクション培地（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから入手したもの）を用いてペリプラズム発現を誘導するか、またはファージ上に個々のＦｃバリアントをファージディスプレイさせるために、ヘルパーファージを感染させた。ＥＬＩＳＡプレートを、典型的には０．５ｍｇ／ｍＬの抗原で一晩コーティングしてから、１％ＢＳＡでブロックした後、ファージまたはペリプラズム抽出物を加えた。１時間インキュベートし、未結合のタンパク質を洗い落とした後、ＨＲＰコンジュゲート二次抗体（すなわち、可溶性Ｆｃでは抗Ｆｃ、またはファージに提示させたＦｃでは抗Ｍ１３）を加え、３０分インキュベートした。そのプレートを再度洗浄してから、ＴＭＢ試薬で発色させ、２Ｎ硫酸でクエンチした。プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ（登録商標））を用いて、４５０ｎｍにおける吸光度を定量し、適用可能である場合には、Ｐｒｉｓｍというソフトウェアを用いて、結合曲線をプロットした。一部のアッセイでは、結合ステップの際に、可溶性トランスフェリンまたはその他の競合物質を、典型的には大幅なモル過剰量で加えた。
フローサイトメトリーによるスクリーニング
９６ウェルＶ底プレート中で、Ｆｃバリアントポリペプチド（ファージ上で、ペリプラズム抽出物中で、またはＦａｂ断片への融合物として可溶性に発現させたもの）を細胞に加え（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ（ＰＢＳＡ）中、１ウェル当たり約１００，０００細胞）、４℃で１時間インキュベートした。この後、そのプレートを回転させ、培地を除去してから、細胞をＰＢＳＡで１回洗浄した。二次抗体（典型的には、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから入手したもの））を含むＰＢＳＡに、その細胞を再懸濁した。３０分後、プレートを回転させ、培地を除去し、細胞をＰＢＳＡで１〜２回洗浄した後、そのプレートをフローサイトメーター（すなわち、フローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩ）で読み取った。ＦｌｏｗＪｏというソフトウェアを用いて、条件ごとに、蛍光の中央値を算出し、Ｐｒｉｓｍというソフトウェアで、結合曲線をプロットした。
実施例１２．ＴｆＲ結合ポリペプチドの親和性の選択
この実施例では、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に対するＴｆＲ結合ポリペプチドの親和性と、そのＴｆＲ結合ポリペプチドに連結されている療法剤への脳暴露の結果との関係について記載する。
図１８には、ＴｆＲに対する親和性が比較的強いポリペプチドに療法剤を連結したところ、その療法剤への脳暴露が短縮したことが示されている（時間に対する、脳内濃度の曲線下面積（ＡＵＣ）を求めることによって評価した場合）。具体的には、ＴｆＲに対する親和性が約２５０ｎＭよりも強いポリペプチドに療法剤を連結したところ、脳暴露が実質的に短縮した。
図１９に示されているように、ＴｆＲに対する親和性が比較的強いポリペプチドに療法剤を連結した場合に、脳内の最高濃度（Ｃｍａｘ）が高くなったことが観察された。具体的には、ＴｆＲ結合ポリペプチドの親和性が約２５０ｎＭよりも強い場合に、脳内Ｃｍａｘ値は、有意に高くなった。
図２０には、ＴｆＲに対する親和性が様々であるポリペプチドに連結されている場合の療法剤の血漿中濃度に対する脳内Ｃｍａｘの比率が示されている。
方法
ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩの作製
ノックインマウス／ノックアウトマウスを作製する方法は、文献に公開されており、当業者には周知である。要約すると、ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスは、マウスＴｆｒｃ遺伝子内でヒトＴｆｒｃアピカルドメインを発現させるように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いて作製し、得られたキメラＴｆＲをインビボにおいて、内因性プロモーターの制御下で発現させた。国際公開第２０１８／１５２２８５号（参照により、その全体が本明細書に援用される）に記載されているように、Ｃ５７Ｂｌ６マウスを用いて、単一細胞胚への前核マイクロインジェクションによって、ヒトアピカルＴｆＲマウス株のノックインを行ってから、胚を偽妊娠雌マウスに移した。具体的には、Ｃａｓ９、シングルガイドＲＮＡ及びドナーＤＮＡを胚に導入した。そのドナーＤＮＡは、マウスでの発現に合わせてコドン最適化したヒトアピカルドメインコード配列を含むものであった。そのアピカルドメインコード配列は、左右のホモロジーアームに挟まれていた。そのドナー配列は、アピカルドメインが第４マウスエキソンの後に挿入されるとともに、３’末端で、第９マウスエキソンに直接隣接するように設計した。胚を移植されたその雌の子孫に由来する雄ファウンダーを野生型の雌と交配して、Ｆ１ヘテロ接合体マウスを得た。その後、Ｆ１世代のヘテロ接合体マウスの交配によって、ホモ接合体マウスを得た。
マウスＰＫ／ＰＤ
ＰＫ／ＰＤ評価の際には、ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスに１回、尾静脈注射によって５０ｍｇ／ｋｇで全身投与した。灌流前に、心臓穿刺によって、血液をＥＤＴＡ血漿チューブに採取し、１４，０００ｒｐｍで５分回転させた。続いて、後のＰＫ及びＰＤ解析用に、血漿を単離した。灌流後、脳を摘出し、脳半球を分離して、ＰＢＳにおける、組織重量の１０倍の１％ＮＰ−４０（ＰＫ用）または５ＭのＧｕＨＣｌ（ＰＤ用）中でホモジナイズした。
一般的なヒトＩｇＧアッセイ（ＭＳＤヒトＩｇＧキット＃Ｋ１５０ＪＬＤ）をメーカーの指示に従って用いて、マウス血漿及び脳溶解液中の操作されたＴｆＲ結合ポリペプチドの濃度を定量した。簡潔に述べると、予めコーティングしたプレートを３０分、ＭＳＤ Ｂｌｏｃｋｅｒ Ａでブロックした。Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｎｉｍｂｕｓというリキッドハンドラーを用いて、血漿試料を１：１０，０００で希釈し、ブロックしたプレートにｄｕｐｌｉｃａｔｅで加えた。脳試料を１％ＮＰ４０溶解緩衝液中でホモジナイズし、ＰＫ解析用に、溶解液を１：１０に希釈した。投与溶液も同じプレートで解析して、適正な投与量を確認した。４パラメーターロジスティック回帰を用いて、検量線（０．７８〜２００ｎｇ／ｍＬのＩｇＧ）をフィッティングした。
実施例１３．Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）を用いた、ＣＨ３Ｃバリアントの結合の特徴付け
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００という計器を用いた表面プラズモン共鳴によって、組換えＴｆＲのアピカルドメインに対するクローンバリアントの親和性を求めた。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５というセンサーチップに、抗ヒトＦａｂを固定化した（ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのヒトＦａｂ捕捉キット）。５μｇ／ｍＬのポリペプチド−Ｆａｂ融合物を各フローセル上に１分捕捉させ、３０μＬ／分の流速で、ヒトアピカルドメインまたはカニクイザルアピカルドメインの３倍段階希釈液を室温で注入した。各試料を４５秒の結合及び３分の解離で解析した。注入後に毎回、１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．１）を用いて、チップを再生した。無関係なＩｇＧが同程度の密度で捕捉されているフローセルから得たＲＵを減ずることによって、結合応答を補正した。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ３．１を用いて、平衡状態の結合応答を濃度に対してフィッティングすることによって、定常状態の親和性を得た。
組換えＴｆＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対するクローンバリアントの親和性を求めるために、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５というセンサーチップに、ストレプトアビジンを固定化した。ビオチン化したヒトＴｆＲ ＥＣＤまたはカニクイザルＴｆＲ ＥＣＤを各フローセル上に１分捕捉させ、３０μＬ／分の流速で、クローンバリアントの３倍段階希釈液を室温で注入した。各試料を４５秒の結合及び３分の解離で解析した。同様の密度でＴｆＲ ＥＣＤを有さないフローセルから得たＲＵを減じることによって、結合応答を補正した。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ３．１を用いて、平衡状態の結合応答を濃度に対してフィッティングすることによって、定常状態の親和性を得た。
その結合親和性は、表６にまとめられている。親和性は、定常状態でのフィッティングによって得た。
実施例１４．ＴｆＲｍｓ／ｈｕマウスにおけるポリペプチド−Ｆａｂ融合物（ＣＨ３Ｃ．３５．２１、ＣＨ３Ｃ．３５．２０、ＣＨ３Ｃ．３５、ＣＨ３Ｃ．３５．２３、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．３）の脳内及び血漿中ＰＫＰＤ
ＰＫ及び脳への取り込みに対するＴｆＲ結合親和性の影響を評価するために、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）によって測定した場合、アピカルヒトＴｆＲに対する結合親和性の異なる抗ＢＡＣＥ１ Ａｂ１５３及びＴｆＲ結合ポリペプチド融合物（ＣＨ３Ｃ．３５．２１：Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ．３５．２０：Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ．３５：Ａｂ１５３という融合物）を作製した。ヒトＴｆＲに対するＣＨ３Ｃ．３５．２１：Ａｂ１５３融合物の結合親和性は１００ｎＭ、ＣＨ３Ｃ．３５．２０：Ａｂ１５３融合物の結合親和性は１７０ｎＭ、ＣＨ３Ｃ．３５：Ａｂ１５３融合物の結合親和性は６２０ｎＭである。ＴｆＲｍｓ／ｈｕノックインマウスに、Ａｂ１５３またはポリペプチド−Ｆａｂ融合物のいずれかを５０ｍｇ／ｋｇで全身投与し、投与から１日後、３日後及び７日後に、血漿中ＰＫ及び脳内ＰＫＰＤを評価した。脳内及び血漿中ＰＫＰＤの解析は、上記のようにして行った。末梢組織でのＴｆＲの発現により、ＣＨ３Ｃ．３５．２１：Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ．３５．２０：Ａｂ１５３及びＣＨ３Ｃ．３５：Ａｂ１５３の融合物では、血漿中のクリアランスが、Ａｂ１５３単独と比べて速かったが、これは、標的介在性のクリアランスと一致し、インビボでのＴｆＲへの結合を示すものである（図２１Ａ）。印象的なことに、ＣＨ３Ｃ．３５．２１：Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ．３５．２０：Ａｂ１５３及びＣＨ３Ｃ．３５：Ａｂ１５３の融合物の脳内濃度は、Ａｂ１５３と比べて有意に上昇し、投与から１日目に、最高脳内濃度が３０ｎｍ超であったのに対し、Ａｂ１５３では、同じ時点に、約３ｎＭに過ぎなかった（図２１Ｂ）。ＣＨ３Ｃ．３５．２１：Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ．３５．２０：Ａｂ１５３及びＣＨ３Ｃ．３５：Ａｂ１５３の融合物の脳曝露の増大により、マウスの脳内の内因性マウスＡβレベルは、Ａｂ１５３を投与されたマウスにおけるＡβレベルと比べて、約５５〜６０％低かった（図２１Ｃ）。このようにより低い脳内Ａβレベルが維持されたと同時に、ＣＨ３Ｃ．３５．２１：Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ．３５．２０：Ａｂ１５３及びＣＨ３Ｃ．３５：Ａｂ１５３の融合物の濃度は、脳内で高い状態に保たれ、７日目までに曝露が低下したときには、Ａｂ１５３で処置したマウスと同様のレベルまで戻った。経時的な脳曝露の低下は、ＣＨ３Ｃ．３５．２１：Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ．３５．２０：Ａｂ１５３及びＣＨ３Ｃ．３５：Ａｂ１５３の融合物の末梢曝露の低下と相関しており、インビボでの明らかなＰＫ／ＰＤの関係が示された（図２１Ａと図２１Ｃを比較）。加えて、この単回の高用量投与後、全体の脳内ＴｆＲレベルは、Ａｂ１５３で処置したマウスと、ポリペプチド−Ｆａｂ融合物で処置したマウスで同程度であったことから、ポリペプチド−Ｆａｂ融合物の脳曝露の増加が、脳内でのＴｆＲの発現に対して有意な影響を及ぼさないことが示された（図２１Ｄ）。
矛盾がある場合、表（例えば表５）に記載されている各クローンのアミノ酸置換が、配列表に示されている配列に見られるアミノ酸に優先して、そのクローンのレジスター位置のアミノ酸置換を決定する。
本明細書に記載されている実施例及び実施形態は、例示目的のものに過ぎず、それらに鑑みれば、様々な改変または変更が当業者に示され、その改変及び変更が、本願の趣旨及び範囲、ならびに添付の特許請求の範囲に含まれるものであることは理解されよう。本明細書に引用されている配列アクセッション番号の配列は、参照により、本明細書に援用される。

Claims (142)

  1. （ａ）酵素補充療法（ＥＲＴ）用酵素、ＥＲＴ用酵素バリアントまたはその触媒活性断片に連結されている第１のＦｃポリペプチドと、
    （ｂ）前記第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドと、
    を含むタンパク質であって、
    前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、免疫グロブリン重鎖及び／または軽鎖可変領域配列、あるいはそれらの抗原結合部分を含まない前記タンパク質。
  2. 前記ＥＲＴ用酵素が、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、ＩＤＳバリアントまたはその触媒活性断片である、請求項１に記載のタンパク質。
  3. 前記ＥＲＴ用酵素が、配列番号９１、９２、１１４、２３０及び２３４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のタンパク質。
  4. 前記ＥＲＴ用酵素が、配列番号９１、９２、１１４、２３０及び２３４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のタンパク質。
  5. 前記ＥＲＴ用酵素が、Ｎ−スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）、ＳＧＳＨバリアントまたはその触媒活性断片である、請求項１に記載のタンパク質。
  6. 前記ＥＲＴ用酵素が、配列番号１１９及び１２０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５に記載のタンパク質。
  7. 前記ＥＲＴ用酵素が、配列番号１１９及び１２０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のタンパク質。
  8. 前記ＥＲＴ用酵素が、酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）、ＡＳＭバリアントまたはその触媒活性断片である、請求項１に記載のタンパク質。
  9. 前記ＥＲＴ用酵素が、配列番号１２１、１２２及び１２３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のタンパク質。
  10. 前記ＥＲＴ用酵素が、配列番号１２１、１２２及び１２３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のタンパク質。
  11. 前記ＥＲＴ用酵素が、β−グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）、ＧＢＡバリアントまたはその触媒活性断片である、請求項１に記載のタンパク質。
  12. 前記ＥＲＴ用酵素が、配列番号９３及び９４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のタンパク質。
  13. 前記ＥＲＴ用酵素が、配列番号９３及び９４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のタンパク質。
  14. 前記第１のＦｃポリペプチドが、前記ＥＲＴ用酵素、前記ＥＲＴ用酵素バリアントまたは前記その触媒活性断片に、ペプチド結合またはポリペプチドリンカーによって連結されている融合ポリペプチドである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  15. 前記ポリペプチドリンカーが、フレキシブルポリペプチドリンカーである、請求項１４に記載のタンパク質。
  16. 前記フレキシブルポリペプチドリンカーが、グリシンリッチリンカーである、請求項１５に記載のタンパク質。
  17. 前記グリシンリッチリンカーが、Ｇ４Ｓ（配列番号２３９）または（Ｇ４Ｓ）２（配列番号２４０）である、請求項１６に記載のタンパク質。
  18. 前記第２のＦｃポリペプチドが、ＥＲＴ用酵素、ＥＲＴ用酵素バリアントまたはその触媒活性断片に連結されている、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のタンパク質。
  19. 前記第２のＦｃポリペプチドが、前記ＥＲＴ用酵素、前記ＥＲＴ用酵素バリアントまたは前記その触媒活性断片に、ペプチド結合またはポリペプチドリンカーによって連結されている融合ポリペプチドである、請求項１８に記載のタンパク質。
  20. 前記第１のＦｃポリペプチドのＮ末端及び／または前記第２のＦｃポリペプチドのＮ末端が、前記ＥＲＴ用酵素に連結されている、請求項１８または１９に記載のタンパク質。
  21. 前記第１のＦｃポリペプチドのＮ末端が、一方のＥＲＴ用酵素に連結されており、前記第２のＦｃポリペプチドのＮ末端が、もう一方のＥＲＴ用酵素に連結されている、請求項２０に記載のタンパク質。
  22. 前記第１のＦｃポリペプチドのＣ末端及び／または前記第２のＦｃポリペプチドのＣ末端が、前記ＥＲＴ用酵素に連結されている、請求項１８または１９に記載のタンパク質。
  23. 前記第１のＦｃポリペプチドのＣ末端が、一方のＥＲＴ用酵素に連結されており、前記第２のＦｃポリペプチドのＣ末端が、もう一方のＥＲＴ用酵素に連結されている、請求項２２に記載のタンパク質。
  24. 前記第１のＦｃポリペプチドのＮ末端が、一方のＥＲＴ用酵素に連結されており、前記第２のＦｃポリペプチドのＣ末端が、もう一方のＥＲＴ用酵素に連結されている、請求項１８または１９に記載のタンパク質。
  25. 前記第１のＦｃポリペプチドのＣ末端が、一方のＥＲＴ用酵素に連結されており、前記第２のＦｃポリペプチドのＮ末端が、もう一方のＥＲＴ用酵素に連結されている、請求項１８または１９に記載のタンパク質。
  26. 前記タンパク質が、１つのＥＲＴ用酵素を含み、前記第１のＦｃポリペプチドのＮ末端またはＣ末端が、前記ＥＲＴ用酵素に連結されている、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のタンパク質。
  27. ２つのＥＲＴ用酵素を含む、請求項１８〜２５のいずれか１項に記載のタンパク質。
  28. 前記融合ポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端の順に、前記ＥＲＴ用酵素、前記ＥＲＴ用酵素バリアントまたは前記その触媒活性断片、前記ポリペプチドリンカー、及び前記第１のＦｃポリペプチドを含む、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載のタンパク質。
  29. 前記第１のＦｃポリペプチドが、改変Ｆｃポリペプチドであり、及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、改変Ｆｃポリペプチドである、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のタンパク質。
  30. 前記第１のＦｃポリペプチド及び前記第２のＦｃポリペプチドがそれぞれ、ヘテロ二量化を促す改変を含む、請求項２９に記載のタンパク質。
  31. 前記Ｆｃ二量体が、Ｆｃヘテロ二量体である、請求項３０に記載のタンパク質。
  32. ＥＵナンバリングによれば、前記Ｆｃポリペプチドのうちの一方が、Ｔ３６６Ｗという置換を有し、もう一方のＦｃポリペプチドが、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖという置換を有する、請求項３０または３１に記載のタンパク質。
  33. 前記第１のＦｃポリペプチドが、前記Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖという置換を有し、前記第２のＦｃポリペプチドが、前記Ｔ３６６Ｗという置換を含む、請求項３２に記載のタンパク質。
  34. 前記第１のＦｃポリペプチドが、前記ＥＲＴ用酵素に連結されており、配列番号１１７、２３２及び２３６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載のタンパク質。
  35. 前記第１のＦｃポリペプチドが、前記Ｔ３６６Ｗという置換を含み、前記第２のＦｃポリペプチドが、前記Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖという置換を含む、請求項３２に記載のタンパク質。
  36. 前記第１のＦｃポリペプチドが、前記ＥＲＴ用酵素に連結されており、配列番号１１８、２３３及び２３７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載のタンパク質。
  37. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、天然型ＦｃＲｎ結合部位を含む、請求項２９〜３６のいずれか１項に記載のタンパク質。
  38. 前記第１のＦｃポリペプチド及び前記第２のＦｃポリペプチドが、エフェクター機能を有さない、請求項２９〜３７のいずれか１項に記載のタンパク質。
  39. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、エフェクター機能を低下させる改変を含む、請求項２９〜３７のいずれか１項に記載のタンパク質。
  40. ＥＵナンバリングによれば、エフェクター機能を低下させる前記改変が、２３４位のＡｌａ及び２３５位のＡｌａへの置換である、請求項３９に記載のタンパク質。
  41. 前記第１のＦｃポリペプチドが、前記ＥＲＴ用酵素に連結されており、配列番号１１５、２３１及び２３５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項４０に記載のタンパク質。
  42. 前記第１のＦｃポリペプチドが、前記ＥＲＴ用酵素に連結されており、配列番号１４９、１５０、１５２及び１５３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項４０に記載のタンパク質。
  43. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、天然型Ｆｃ配列に対するアミノ酸変化であって、血清中半減期を延長するアミノ酸変化を含む、請求項２９〜４２のいずれか１項に記載のタンパク質。
  44. ＥＵナンバリングによれば、前記アミノ酸変化が、２５２位のＴｙｒ、２５４位のＴｈｒ及び２５６位のＧｌｕへの置換を含む、請求項４３に記載のタンパク質。
  45. ＥＵナンバリングによれば、前記アミノ酸変化が、４２８位のＬｅｕ及び４３４位のＳｅｒへの置換を含む、請求項４３に記載のタンパク質。
  46. ＥＵナンバリングによれば、前記アミノ酸変化が、４３４位のＳｅｒまたはＡｌａの置換を含む、請求項４３に記載のタンパク質。
  47. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に特異的に結合する、請求項２９〜４６のいずれか１項に記載のタンパク質。
  48. ＥＵナンバリングによれば、前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、３８４位、３８６位、３８７位、３８８位、３８９位、３９０位、４１３位、４１６位及び４２１位からなる群から選択した位置に、少なくとも２つの置換を含む、請求項４７に記載のタンパク質。
  49. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、前記位置に、少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個または９個の置換を含む、請求項４８に記載のタンパク質。
  50. ＥＵナンバリングによれば、前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、３８０位、３９１位、３９２位及び４１５位を含む位置に、１個、２個、３個または４個の置換をさらに含む、請求項４８または４９に記載のタンパク質。
  51. ＥＵナンバリングによれば、前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、４１４位、４２４位及び４２６位を含む位置に、１個、２個または３個の置換をさらに含む、請求項４８〜５０のいずれか１項に記載のタンパク質。
  52. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、３８８位にＴｒｐを含む、請求項４８〜５１のいずれか１項に記載のタンパク質。
  53. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、４２１位に芳香族アミノ酸を含む、請求項４８〜５２のいずれか１項に記載のタンパク質。
  54. ４２１位の前記芳香族アミノ酸が、ＴｒｐまたはＰｈｅである、請求項５３に記載のタンパク質。
  55. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、Ｔｒｐ、ＬｅｕまたはＧｌｕである３８０位、ＴｙｒまたはＰｈｅである３８４位、Ｔｈｒである３８６位、Ｇｌｕである３８７位、Ｔｒｐである３８８位、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＶａｌまたはＡｓｎである３８９位、ＳｅｒまたはＡｓｎである３９０位、ＴｈｒまたはＳｅｒである４１３位、ＧｌｕまたはＳｅｒである４１５位、Ｇｌｕである４１６位、及びＰｈｅである４２１位から選択した少なくとも１つの位置を含む、請求項４８〜５４のいずれか１項に記載のタンパク質。
  56. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、Ｔｒｐ、ＬｅｕまたはＧｌｕである３８０位、ＴｙｒまたはＰｈｅである３８４位、Ｔｈｒである３８６位、Ｇｌｕである３８７位、Ｔｒｐである３８８位、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＶａｌまたはＡｓｎである３８９位、ＳｅｒまたはＡｓｎである３９０位、ＴｈｒまたはＳｅｒである４１３位、ＧｌｕまたはＳｅｒである４１５位、Ｇｌｕである４１６位、及びＰｈｅである４２１位から選択した２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個または１１個の位置を含む、請求項５５に記載のタンパク質。
  57. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、Ｔｒｐ、ＬｅｕまたはＧｌｕである３８０位、ＴｙｒまたはＰｈｅである３８４位、Ｔｈｒである３８６位、Ｇｌｕである３８７位、Ｔｒｐである３８８位、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＶａｌまたはＡｓｎである３８９位、ＳｅｒまたはＡｓｎである３９０位、ＴｈｒまたはＳｅｒである４１３位、ＧｌｕまたはＳｅｒである４１５位、Ｇｌｕである４１６位、及びＰｈｅである４２１位という１１個の位置を含む、請求項５６に記載のタンパク質。
  58. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号３４〜３８、５８、６０〜９０、１５１及び１５６〜２２９のうちのいずれか１つの１１１〜２１７位のアミノ酸と、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有するＣＨ３ドメインを有する、請求項５６または５７に記載のタンパク質。
  59. 配列番号３４〜３８、５８、６０〜９０、１５１及び１５６〜２２９のうちのいずれか１つの、ＥＵインデックスで３８０位、３８４位、３８６位、３８７位、３８８位、３８９位、３９０位、３９１位、３９２位、４１３位、４１４位、４１５位、４１６位、４２１位、４２４位及び４２６位に対応する位置のうちの少なくとも５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個または１６個の残基が、欠失または置換されていない、請求項５８に記載のタンパク質。
  60. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号１５６〜２２９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項５８または５９に記載のタンパク質。
  61. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号１５７、１６９、１８１、１９３、２０５及び２１７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項６０に記載のタンパク質。
  62. 前記第１のＦｃポリペプチドが、配列番号１１５、２３１及び２３５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み、前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号２０５及び２２８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項６０に記載のタンパク質。
  63. 前記第１のＦｃポリペプチドが、配列番号１１５、２３１及び２３５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み、前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号１６９及び２２９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項６０に記載のタンパク質。
  64. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、前記ＴｆＲのアピカルドメインに結合する、請求項４７〜６３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  65. 前記タンパク質の前記ＴｆＲへの前記結合によって、トランスフェリンの前記ＴｆＲへの結合が実質的に阻害されない、請求項４７〜６４のいずれか１項に記載のタンパク質。
  66. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドの、対応する野生型Ｆｃポリペプチドに対するアミノ酸配列同一性が、少なくとも７５％、または少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％もしくは９５％である、請求項４７〜６５のいずれか１項に記載のタンパク質。
  67. 前記対応する野生型Ｆｃポリペプチドが、ヒトＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＦｃポリペプチドである、請求項６６に記載のタンパク質。
  68. 前記ＥＲＴ用酵素の脳への取り込みが、前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドの非存在下における前記ＥＲＴ用酵素の取り込みと比べて、あるいは前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドへの前記改変であって、ＴｆＲへの結合をもたらす前記改変を行わなかった場合の前記ＥＲＴ用酵素の取り込みと比べて、少なくとも１０倍多い、請求項４７〜６７のいずれか１項に記載のタンパク質。
  69. 前記第１のＦｃポリペプチドが、血液脳関門（ＢＢＢ）受容体に結合するように改変されておらず、前記第２のＦｃポリペプチドが、ＴｆＲに特異的に結合するように改変されている、請求項１〜６８のいずれか１項に記載のタンパク質。
  70. 前記第１のＦｃポリペプチドが、ＴｆＲに特異的に結合するように改変されており、前記第２のＦｃポリペプチドが、ＢＢＢ受容体に結合するように改変されていない、請求項１〜６８のいずれか１項に記載のタンパク質。
  71. 免疫グロブリンの重鎖及び／または軽鎖可変領域配列、あるいはそれらの抗原結合部分を含まない、請求項１〜７０のいずれか１項に記載のタンパク質。
  72. ＥＲＴ用酵素、ＥＲＴ用酵素バリアントまたはその触媒活性断片に連結されているＦｃポリペプチドを含むポリペプチドであって、前記Ｆｃポリペプチドが、別のＦｃポリペプチドとのヘテロ二量化を促す１つ以上の改変を含む前記ポリぺプチド。
  73. 前記ＥＲＴ用酵素が、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、ＩＤＳバリアントまたはその触媒活性断片である、請求項７２に記載のポリペプチド。
  74. 前記ＥＲＴ用酵素が、Ｎ−スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）、ＳＧＳＨバリアントまたはその触媒活性断片である、請求項７２に記載のポリペプチド。
  75. 前記ＥＲＴ用酵素が、酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）、ＡＳＭバリアントまたはその触媒活性断片である、請求項７２に記載のポリペプチド。
  76. 前記ＥＲＴ用酵素が、β−グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）、ＧＢＡバリアントまたはその触媒活性断片である、請求項７２に記載のポリペプチド。
  77. 前記Ｆｃポリペプチドが、前記ＥＲＴ用酵素、前記ＥＲＴ用酵素バリアントまたは前記その触媒活性断片に、ペプチド結合またはポリペプチドリンカーによって連結されている融合ポリペプチドである、請求項７２〜７６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  78. 前記融合ポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端の順に、前記ＥＲＴ用酵素、前記ＥＲＴ用酵素バリアントまたは前記その触媒活性断片、前記ポリペプチドリンカー、及び前記第１のＦｃポリペプチドを含む、請求項７７に記載のポリペプチド。
  79. ＥＵナンバリングによれば、前記Ｆｃポリペプチドが、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖという置換を含む、請求項７２〜７８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  80. 配列番号１１５、１１７、２３１、２３２、２３５及び２３６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項７９に記載のポリペプチド。
  81. 配列番号１４９及び１５０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項７９に記載のポリペプチド。
  82. 前記Ｆｃポリペプチドが、Ｔ３６６Ｗという置換を含む、請求項７２〜７８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  83. 配列番号１１８、２３３及び２３７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項８２に記載のポリペプチド。
  84. 配列番号１５２〜１５５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項８２に記載のポリペプチド。
  85. 前記もう１つのＦｃポリペプチドをさらに含む、請求項７２〜８４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  86. 請求項７２〜８４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
  87. 請求項８６に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  88. 請求項８６に記載のポリヌクレオチドまたは請求項８７に記載のベクターを含む宿主細胞。
  89. 前記もう１つのＦｃポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドをさらに含む、請求項８８に記載の宿主細胞。
  90. ＥＲＴ用酵素、ＥＲＴ用酵素バリアントまたはその触媒活性断片に連結されているＦｃポリペプチドを含むポリペプチドの作製方法であって、請求項８６に記載のポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドを発現させる条件で、宿主細胞を培養することを含む前記方法。
  91. リソソーム蓄積障害（ＬＳＤ）の治療方法であって、治療が必要な患者に、請求項１〜７１のいずれか１項に記載のタンパク質、または請求項７２〜８５のいずれか１項に記載のポリペプチドを投与することを含む前記方法。
  92. ＬＳＤ患者における毒性代謝産物の蓄積の低減方法であって、前記患者に、請求項１〜７１のいずれか１項に記載のタンパク質、または請求項７２〜８５のいずれか１項に記載のポリペプチドを投与することを含む前記方法。
  93. 前記ＬＳＤが、ハンター症候群であり、前記ＥＲＴ用酵素が、ＩＤＳである、請求項９１または９２に記載の方法。
  94. 前記毒性代謝産物が、ヘパラン硫酸由来の二糖及び／またはデルマタン硫酸由来の二糖を含む、請求項９３に記載の方法。
  95. 前記ＬＳＤが、サンフィリポ症候群Ａであり、前記ＥＲＴ用酵素が、ＳＧＳＨである、請求項９１または９２に記載の方法。
  96. 前記毒性代謝産物が、ヘパラン硫酸由来のオリゴ糖を含む、請求項９５に記載の方法。
  97. 前記ＬＳＤが、ニーマンピック病であり、前記ＥＲＴ用酵素が、ＡＳＭである、請求項９１または９２に記載の方法。
  98. 前記毒性代謝産物が、スフィンゴミエリンを含む、請求項９７に記載の方法。
  99. 前記ＬＳＤが、ゴーシェ病またはパーキンソン病であり、前記ＥＲＴ用酵素が、ＧＢＡである、請求項９１または９２に記載の方法。
  100. 前記毒性代謝産物が、グルコシルセラミドを含む、請求項９９に記載の方法。
  101. 請求項１〜７１のいずれか１項に記載のタンパク質、または請求項７２〜８５のいずれか１項に記載のポリペプチド、及び製薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
  102. 基質の蓄積をモニタリングして、ＩＤＳ活性を評価する方法であって、
    （ａ）請求項２〜４、１４〜４１及び４３〜７１のいずれか１項に記載のタンパク質、または請求項７２〜７３、７７〜８０、８２〜８３及び８５のいずれか１項に記載のポリペプチドを投与された対象に由来する細胞試料または組織試料中の細胞を破壊して、マイクロベシクルを破壊して開いて、解析対象のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）溶液を得ること、
    （ｂ）前記ＧＡＧ溶液を少なくとも１つのヘパリナーゼ及びコンドロイチナーゼＢで消化して、ＧＡＧ由来の二糖を得ること、
    （ｃ）前記ＧＡＧ由来の二糖を質量分析法によって解析すること、ならびに
    （ｄ）ヘパラン硫酸由来及び／またはデルマタン硫酸由来の二糖のレベルを求めることであって、ＩＤＳ活性が欠損しているコントロールと比べて、ヘパラン硫酸由来及び／またはデルマタン硫酸由来の二糖のレベルが低いことによって、前記コントロールと比べて、前記試料中のＩＤＳ活性が上昇していることが示される、前記求めること
    を含む前記方法。
  103. 前記細胞を破壊するステップが、少なくとも１回の凍結融解サイクル及び少なくとも１回の超音波処理ステップを含む、請求項１０２に記載の方法。
  104. 前記細胞が、組織試料に由来するものであり、前記方法が、少なくとも３回、４回または５回の凍結融解サイクルを含む、請求項１０３に記載の方法。
  105. 前記対象が、ＩＤＳ活性の欠損したマウスである、請求項１０２〜１０４のいずれか１項に記載の方法。
  106. 前記対象が、ヒト以外の霊長類動物である、請求項１０２〜１０４のいずれか１項に記載の方法。
  107. 前記対象が、ハンター症候群であるヒト患者である、請求項１０２〜１０４のいずれか１項に記載の方法。
  108. 基質の蓄積をモニタリングして、ＳＧＳＨ活性を評価する方法であって、
    （ａ）請求項５〜７、１４〜３３、３５、３７〜４０及び４２〜７１のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項７２、７４、７７〜７９、８１〜８２及び８４〜８５のいずれか１項に記載のポリペプチドを投与された対象に由来する細胞試料または組織試料中の細胞を破壊して、マイクロベシクルを破壊して開いて、解析対象のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）溶液を得ること、
    （ｂ）前記ＧＡＧ溶液を少なくとも１つのヘパリナーゼで消化して、ＧＡＧ由来の二糖を得ること、
    （ｃ）前記ＧＡＧ由来の二糖を質量分析法によって解析すること、ならびに
    （ｄ）ヘパラン硫酸由来の二糖のレベルを求めることであって、ＳＧＳＨ活性が欠損しているコントロールと比べて、ヘパラン硫酸由来の二糖のレベルが低いことによって、前記コントロールと比べて、前記試料中のＳＧＳＨ活性が上昇していることが示される、前記求めること
    を含む前記方法。
  109. 前記細胞を破壊するステップが、少なくとも１回の凍結融解サイクル及び少なくとも１回の超音波処理ステップを含む、請求項１０８に記載の方法。
  110. 前記細胞が、組織試料に由来しており、前記方法が、少なくとも３回、４回または５回の凍結融解サイクルを含む、請求項１０９に記載の方法。
  111. 前記対象が、ＳＧＳＨ活性の欠損したマウスである、請求項１０８〜１１０のいずれか１項に記載の方法。
  112. 前記対象が、ヒト以外の霊長類動物である、請求項１０８〜１１０のいずれか１項に記載の方法。
  113. 前記対象が、サンフィリポ症候群Ａであるヒト患者である、請求項１０８〜１１０のいずれか１項に記載の方法。
  114. 哺乳動物のＢＢＢを越えて、薬剤を輸送する方法であって、約５０ｎＭ〜約２５０ｎＭの親和性で、ＴｆＲに結合するタンパク質に前記ＢＢＢを暴露させることを含み、前記タンパク質が、前記薬剤に連結されており、前記ＢＢＢを越えて、前記連結された薬剤を輸送する前記方法。
  115. 前記哺乳動物の脳内の前記薬剤の最高濃度（Ｃｍａｘ）を向上させる、請求項１１４に記載の方法。
  116. 前記薬剤が、ＬＳＤを治療するのに有用である、請求項１１４または１１５に記載の方法。
  117. ＬＳＤの治療方法であって、約５０ｎＭ〜約２５０ｎＭの親和性で、ＴｆＲに結合するタンパク質を哺乳動物に投与することを含み、前記タンパク質が、ＬＳＤを治療するための薬剤に連結されており、それによって、前記哺乳動物の脳を前記薬剤に暴露する前記方法。
  118. 前記タンパク質が、前記よりも弱い親和性で、ＴｆＲに結合する参照タンパク質に連結されている前記薬剤と比べて、前記脳内の前記薬剤のＣｍａｘを向上させる、請求項１１４〜１１７のいずれか１項に記載の方法。
  119. 前記タンパク質が、前記よりも弱い親和性で、ＴｆＲに結合する参照タンパク質に連結されている薬剤と比べて、前記哺乳動物において、治療上有効な濃度で、前記薬剤のＣｍａｘを向上させる、請求項１１４〜１１８のいずれか１項に記載の方法。
  120. 前記参照タンパク質が、約６００ｎＭの、またはそれより弱い親和性で、前記ＴｆＲに結合する、請求項１１８〜１１９のいずれか１項に記載の方法。
  121. 前記ＴｆＲが、霊長類動物のＴｆＲである、請求項１１４〜１２０のいずれか１項に記載の方法。
  122. 前記霊長類動物ＴｆＲが、ヒトＴｆＲである、請求項１２１に記載の方法。
  123. 前記タンパク質が、ＴｆＲアピカルドメインに結合する、請求項１１４〜１２２のいずれか１項に記載の方法。
  124. 前記タンパク質が、約１００ｎＭ〜約２００ｎＭの親和性で、前記ＴｆＲに結合する、請求項１１４〜１２３のいずれか１項に記載の方法。
  125. 前記タンパク質が、約１１０ｎＭ〜約１５０ｎＭの親和性で、前記ＴｆＲに結合する、請求項１１４〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
  126. 前記薬剤の前記治療上有効な濃度が、前記哺乳動物におけるＬＳＤの１つ以上の症状を治療する濃度である、請求項１１９〜１２５のいずれか１項に記載の方法。
  127. 前記薬剤が、タンパク質補充療法剤である、請求項１１４〜１２６のいずれか１項に記載の方法。
  128. 前記薬剤またはタンパク質補充療法剤が、酵素である、請求項１１４〜１２７のいずれか１項に記載の方法。
  129. 前記酵素が、前記タンパク質に連結されていると、前記酵素が前記参照タンパク質に連結されている場合と比べて、前記ＬＳＤである前記哺乳動物の前記脳における毒性代謝産物の蓄積を低減する度合いが高くなる、請求項１２８に記載の方法。
  130. 前記酵素が、ＩＤＳであり、前記ＬＳＤが、ハンター症候群である、請求項１２８または１２９に記載の方法。
  131. 前記毒性代謝産物が、ヘパラン硫酸由来の二糖及び／またはデルマタン硫酸由来の二糖を含む、請求項１３０に記載の方法。
  132. 前記酵素が、ＳＧＳＨであり、前記ＬＳＤが、サンフィリポ症候群Ａである、請求項１２８または１２９に記載の方法。
  133. 前記酵素が、ＡＳＭであり、前記ＬＳＤが、ニーマンピック病である、請求項１２８または１２９に記載の方法。
  134. 前記酵素が、ＧＢＡであり、前記ＬＳＤが、ゴーシェ病である、請求項１２８または１２９に記載の方法。
  135. 前記薬剤が、抗体可変領域を含む、請求項１１４〜１２６のいずれか１項に記載の方法。
  136. 前記薬剤が、抗体断片を含む、請求項１３５に記載の方法。
  137. 前記薬剤が、ＦａｂまたはｓｃＦｖを含む、請求項１３６に記載の方法。
  138. 前記タンパク質が、ＴｆＲと結合できる非天然型結合部位を含む改変Ｆｃポリペプチドである、請求項１１４〜１３７のいずれか１項に記載の方法。
  139. 前記タンパク質が、ＴｆＲと特異的に結合する抗体可変領域を含む、請求項１１４〜１３７のいずれか１項に記載の方法。
  140. 前記タンパク質が、抗体断片を含む、請求項１３９に記載の方法。
  141. 前記タンパク質が、ＦａｂまたはｓｃＦｖを含む、請求項１４０に記載の方法。
  142. 前記薬剤に連結されている前記タンパク質を、製薬学的に許容可能な担体の一部として投与する、請求項１１４〜１４１のいずれか１項に記載の方法。
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