BR112020005271A2 - proteína, polipeptídeo, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, método para produção de um polipeptídeo, métodos de tratamento de um distúrbio, de diminuição do acúmulo, de monitoramento, de transporte de um agente e de tratamento de um lsd e composição farmacêutica - Google Patents
proteína, polipeptídeo, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, método para produção de um polipeptídeo, métodos de tratamento de um distúrbio, de diminuição do acúmulo, de monitoramento, de transporte de um agente e de tratamento de um lsd e composição farmacêutica Download PDFInfo
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Abstract
São fornecidas neste documento proteínas de fusão que compreendem uma enzima de terapia de reposição enzimática e uma região Fc, bem como métodos de uso dessas proteínas para tratar um distúrbio de armazenamento lisossômico. Métodos para transportar agentes através da barreira hematoencefálica também são fornecidos neste documento.
Description
[0001] O presente pedido reivindica prioridade ao Pedido de Patente Provisório US. Nº 62/566.898, depositado em 2 de outubro de 2017, Pedido de Patente Provisório US Nº 62/583.276, depositado em 8 de novembro de 2017, Pedido de Patente Provisório US Nº 62/626.365, depositado em 5 de fevereiro de 2018, o Pedido Provisório de Patente US. Nº 62/678.183, depositado em 30 de maio de 2018, e o Pedido Provisório de Patente US nº 62/721.396, depositado em 22 de agosto de 2018, cujas divulgações são incorporadas neste documento por referência na sua totalidade para todos os fins.
[0002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequência, que foi submetida eletronicamente no formato ASCII e está incorporada por meio deste documento a título de referência em sua totalidade. A referida cópia ASCII, criada em 28 de setembro de 2018, é nomeada 102342-000350PC- 1103949_SL.txt e tem 580.464 bytes de tamanho.
[0003] Os distúrbios do armazenamento lisossômico (LSDs) são doenças metabólicas herdadas relativamente raras que resultam de defeitos na função lisossômica. Os LSDs são tipicamente causados pela deficiência de uma única enzima que participa da decomposição de produtos metabólicos no lisossomo. O acúmulo do produto resultante da falta de atividade enzimática afeta vários sistemas orgânicos e pode levar a sintomas graves e morte prematura. A maioria dos LSDs também possui um componente neurológico significativo, que varia de neurodegeneração progressiva e comprometimento cognitivo grave a distúrbios epiléticos, comportamentais e psiquiátricos. Uma forma recombinante de uma enzima que é deficiente em um LSD pode ser usada para tratar o distúrbio, mas tais terapias podem ter pouco efeito no cérebro devido a dificuldades em fornecer a enzima recombinante através da barreira hematoencefálica (BBB).
[0004] São fornecidas neste documento proteínas de fusão compreendendo enzimas de terapia de reposição enzimática (ERT) e métodos de uso destas para o tratamento de distúrbios de armazenamento lisossômico (LSDs).
[0005] Em alguns aspectos, é fornecida neste documento uma proteína que compreende: (a) um primeiro polipeptídeo Fc que está ligado a uma ERT, uma variante da enzima de ERT, ou um fragmento cataliticamente ativo desta; e (b) um segundo polipeptídeo Fc que forma um dímero Fc com o primeiro polipeptídeo Fc.
[0006] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc não inclui uma sequência de região variável de cadeia pesada e/ou leve de imunoglobulina ou uma porção de ligação a antígeno desta.
[0007] Em algumas modalidades, a enzima de ERT é a iduronato de 2-sulfatase (IDS), uma variante de IDS ou um fragmento cataliticamente ativo desta. Em algumas modalidades, a enzima de ERT compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 91, 92, 114, 230 e 234. Em algumas modalidades, a enzima de ERT compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 91, 92, 114, 230 e 234.
[0008] Em algumas modalidades, a enzima de ERT é a N-
sulfoglucosamina sulfo-hidrolase (SGSH), uma variante de SGSH ou um fragmento cataliticamente ativo desta. Em algumas modalidades, a enzima de ERT compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 119 e 120. Em algumas modalidades, a enzima de ERT compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 119 e 120.
[0009] Em algumas modalidades, a enzima de ERT é a esfingomielinase ácida (ASM), uma variante ASM ou um fragmento cataliticamente ativo desta. Em algumas modalidades, a enzima de ERT compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 121, 122 e 123. Em algumas modalidades, a enzima de ERT compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 121, 122 e 123.
[0010] Em algumas modalidades, a enzima de ERT é a - glucocerebrosidase (GBA), uma variante de GBA ou um fragmento cataliticamente ativo desta. Em algumas modalidades, a enzima de ERT compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 93 e 94. Em algumas modalidades, a enzima de ERT compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 93 e 94.
[0011] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc é um polipeptídeo de fusão que está ligado à enzima de ERT, à variante da enzima de ERT ou ao fragmento cataliticamente ativo desta por uma ligação peptídica ou por um ligante polipeptídico. Em algumas modalidades, o ligante polipeptídico é um ligante polipeptídico flexível. Em algumas modalidades, o ligante polipeptídico flexível é um ligante rico em glicina. Em algumas modalidades, o ligante rico em glicina é G4S (SEQ ID NO: 239) ou (G4S)2 (SEQ ID NO: 240). Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc não está ligado à enzima de ERT, à variante da enzima de ERT ou ao fragmento cataliticamente ativo desta por um agente de reticulação química, por exemplo, o polipeptídeo de fusão não inclui uma ligação não peptídica ou um ligante não polipeptídico.
[0012] Em certas modalidades, o polipeptídeo de fusão compreende, do terminal N ao C: a enzima de ERT, a variante da enzima de ERT, ou o fragmento cataliticamente ativo desta; o ligante polipeptídico; e o primeiro polipeptídeo Fc.
[0013] Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo Fc está ligado a uma enzima de ERT, uma variante da enzima de ERT ou um fragmento cataliticamente ativo desta. Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo Fc é um polipeptídeo de fusão que está ligado à enzima de ERT, à variante da enzima de ERT ou ao fragmento cataliticamente ativo desta por uma ligação peptídica ou por um ligante polipeptídico. Em algumas modalidades, o ligante polipeptídico é um ligante polipeptídico flexível. Em algumas modalidades, o ligante polipeptídico flexível é um ligante rico em glicina. Em algumas modalidades, o ligante rico em glicina é G4S (SEQ ID NO: 239) ou (G4S)2 (SEQ ID NO: 240). Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo Fc não está ligado à enzima de ERT, à variante da enzima de ERT ou ao fragmento cataliticamente ativo desta por um agente de reticulação química, por exemplo, o polipeptídeo de fusão não inclui uma ligação não peptídica ou um ligante não polipeptídico.
[0014] Em algumas modalidades, o terminal N do primeiro polipeptídeo Fc e/ou o terminal N do segundo polipeptídeo Fc está ligado à enzima de ERT. Em algumas modalidades, o terminal N do primeiro polipeptídeo Fc está ligado a uma enzima de ERT e o terminal N do segundo polipeptídeo Fc está ligado à outra enzima de ERT.
[0015] Em algumas modalidades, o terminal C do primeiro polipeptídeo Fc e/ou o terminal C do segundo polipeptídeo Fc está ligado à enzima de ERT. Em algumas modalidades, o terminal C do primeiro polipeptídeo Fc está ligado a uma enzima de ERT e o terminal C do segundo polipeptídeo Fc está ligado à outra enzima de ERT.
[0016] Em algumas modalidades, o terminal N do primeiro polipeptídeo Fc está ligado a uma enzima de ERT e o terminal C do segundo polipeptídeo Fc está ligado à outra enzima de ERT. Em algumas modalidades, o terminal C do primeiro polipeptídeo Fc está ligado a uma enzima de ERT e o terminal N do segundo polipeptídeo Fc está ligado à outra enzima de ERT.
[0017] Em algumas modalidades, a proteína compreende uma única enzima de ERT, e o terminal N ou o terminal C do primeiro polipeptídeo Fc está ligado à enzima de ERT. Em algumas modalidades, a proteína compreende duas enzimas de ERT (por exemplo, exatamente duas enzimas de ERT). Em algumas modalidades, a proteína compreende exatamente uma ou exatamente duas enzimas de ERT, variantes enzimáticas ou fragmentos cataliticamente ativos destas.
[0018] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptideo Fc é um polipeptídeo Fc modificado e/ou o segundo polipeptídeo Fc é um polipeptídeo Fc modificado.
[0019] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e o segundo polipeptídeo Fc contêm modificações que promovem heterodimerização. Em algumas modalidades, o dímero Fc é um heterodímero Fc. Em algumas modalidades, um dos polipeptídeos Fc tem uma substituição T366W e o outro polipeptídeo Fc tem substituições T366S, L368A e Y407V, de acordo com a numeração EU. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc contém as substituições T366S, L368A e Y407V e o segundo polipeptídeo Fc contém a substituição T366W. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo
Fc está ligado à IDS da enzima de ERT e compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 117, 232 e 236. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc contém a substituição T366W e o segundo polipeptídeo Fc contém as substituições T366S, L368A e Y407V. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc está ligado à IDS da enzima de ERT e compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 118, 233 e 237.
[0020] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende um sítio de ligação a FcRn nativo. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e o segundo polipeptídeo Fc não têm função efetora. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc inclui uma modificação que reduz a função efetora. Em algumas modalidades, a modificação que reduz a função efetora são as substituições de Ala na posição 234 e Ala na posição 235, de acordo com a numeração EU. Em algumas modalidades, a modificação que reduz a função efetora compreende ainda uma substituição de Gly na posição 329, de acordo com a numeração EU. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc está ligado à IDS da enzima de ERT e compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 115, 231 e 235. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc está ligado à SGSH da enzima de ERT e compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 149, 150, 152 e 153.
[0021] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende alterações de aminoácidos em relação à sequência Fc nativa que prolongam a meia-vida do soro. Em algumas modalidades, as alterações de aminoácidos compreendem substituições de Tyr na posição 252, Thr na posição 254 e Glu na posição 256, de acordo com a numeração EU. Alternativamente, em outras modalidades, as alterações de aminoácidos compreendem substituições de Leu na posição 428 e Ser na posição 434, de acordo com a numeração EU. Alternativamente, em outras modalidades, as alterações de aminoácidos compreendem uma substituição de Ser ou Ala na posição 434, de acordo com a numeração EU.
[0022] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc se liga especificamente a um receptor de transferrina (TfR).
[0023] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende pelo menos duas substituições em posições selecionadas do grupo que consiste em 384, 386, 387, 388, 389, 390, 413, 416 e 421, de acordo com a numeração EU. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende pelo menos três, quatro, cinco, seis, sete, oito, ou nove substituições nas posições.
[0024] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende ainda uma, duas, três ou quatro substituições em posições compreendendo 380, 391, 392 e 415, de acordo com a numeração EU. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende ainda uma, duas ou três substituições nas posições compreendendo 414, 424 e 426, de acordo com a numeração EU.
[0025] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende Trp na posição 388. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende um aminoácido aromático na posição 421. Em algumas modalidades, o aminoácido aromático na posição 421 é Trp ou Phe.
[0026] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende pelo menos uma posição selecionada das seguintes: posição 380 é Trp, Leu ou Glu; posição 384 é Tyr ou Phe; posição 386 é Thr; posição 387 é Glu; posição 388 é Trp; posição 389 é Ser, Ala, Val ou
Asn; posição 390 é Ser ou Asn; posição 413 é Thr ou Ser; posição 415 é Glu ou Ser; posição 416 é Glu; e posição 421 é Phe.
[0027] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 posições selecionadas dentre as seguintes: posição 380 é Trp, Leu ou Glu; posição 384 é Tyr ou Phe; posição 386 é Thr; posição 387 é Glu; posição 388 é Trp; posição 389 é Ser, Ala, Val ou Asn; posição 390 é Ser ou Asn; posição 413 é Thr ou Ser; posição 415 é Glu ou Ser; posição 416 é Glu; e posição 421 é Phe.
[0028] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende pelo menos 11 posições selecionadas como segue: posição 380 é Trp, Leu ou Glu; posição 384 é Tyr ou Phe; posição 386 é Thr; posição 387 é Glu; posição 388 é Trp; posição 389 é Ser, Ala, Val ou Asn; posição 390 é Ser ou Asn; posição 413 é Thr ou Ser; posição 415 é Glu ou Ser; posição 416 é Glu; e posição 421 é Phe.
[0029] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc têm um domínio CH3 com pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade, ou pelo menos 95% de identidade com os aminoácidos 111-217 de qualquer uma das SEQ ID NOS: 34-38, 58, e 60-90, 151 e 156-229. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 156-229. Em algumas modalidades, os resíduos em pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 das posições correspondentes às posições do índice EU 380, 384, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 413, 414, 415, 416, 421, 424 e 426 de qualquer uma das SEQ ID NOS: 34-38, 58, e 60- 90, 151 e 156-229 não são deletados ou substituídos.
[0030] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 157. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 169. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 181. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 193. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 205. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 217.
[0031] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 115, e o segundo polipeptídeo Fc compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 205 e 228 (por exemplo, SEQ ID NO: 228). Em outras modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 115, e o segundo polipeptídeo Fc compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 169 e 229 (por exemplo, SEQ ID NO: 229).
[0032] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 231, e o segundo polipeptídeo Fc compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 205 e 228 (por exemplo, SEQ ID NO: 228). Em outras modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 231, e o segundo polipeptídeo Fc compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 169 e 229 (por exemplo, SEQ ID NO: 229).
[0033] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 235, e o segundo polipeptídeo Fc compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 205 e 228 (por exemplo, SEQ ID NO: 228). Em outras modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 235, e o segundo polipeptídeo Fc compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 169 e 229 (por exemplo, SEQ ID NO: 229).
[0034] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc se liga ao domínio apical de TfR. Em algumas modalidades, a ligação da proteína a TfR não inibe substancialmente a ligação de transferrina a TfR.
[0035] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc tem uma identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 75%, ou pelo menos 80%, 85%, 90%, 92% ou 95%, em comparação com o polipeptídeo Fc do tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc de tipo selvagem correspondente é um polipeptídeo Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana.
[0036] Em algumas modalidades, a captação da enzima de ERT no cérebro (por exemplo, usando um modelo animal apropriado, como os descritos neste documento) é maior que a captação da enzima de ERT na ausência do primeiro polipeptídeo Fc e/ou do segundo polipeptídeo Fc ou a captação da enzima de ERT sem as modificações no primeiro polipeptídeo Fc e/ou no segundo polipeptídeo Fc que resultam na ligação a TfR. Em algumas modalidades, a captação da enzima de ERT no cérebro é pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 vezes maior em comparação com a captação da enzima de ERT na ausência do primeiro polipeptídeo Fc e/ou do segundo polipeptídeo Fc ou em comparação com a captação da enzima de ERT sem as modificações no primeiro polipeptídeo Fc e/ou no segundo polipeptídeo Fc que resultam na ligação a TfR.
[0037] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc não é modificado para se ligar a um receptor de barreira hematoencefálica (BBB) e o segundo polipeptídeo Fc é modificado para se ligar especificamente a TfR. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc é modificado para se ligar especificamente a TfR e o segundo polipeptídeo Fc não é modificado para se ligar a um receptor de BBB.
[0038] Em algumas modalidades, a proteína não inclui uma sequência de região variável de cadeia pesada e/ou leve de imunoglobulina ou uma porção de ligação a antígeno desta.
[0039] Em alguns aspectos, é fornecido neste documento um polipeptídeo Fc que está ligado a uma enzima de ERT, uma variante da enzima de ERT, ou um fragmento cataliticamente ativo desta, em que o polipeptídeo Fc contém uma ou mais modificações que promovem sua heterodimerização em outro polipeptídeo Fc.
[0040] Em algumas modalidades, a enzima de ERT é IDS, uma variante de IDS ou um fragmento cataliticamente ativo desta. Em algumas modalidades, a enzima de ERT compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 91, 92, 114, 230 e 234. Em algumas modalidades, a enzima de ERT compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 91, 92, 114, 230 e 234.
[0041] Em algumas modalidades, a enzima de ERT é SGSH, uma variante de SGSH ou um fragmento cataliticamente ativo desta. Em algumas modalidades, a enzima de ERT compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 119 e 120. Em algumas modalidades, a enzima de ERT compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 119 e 120.
[0042] Em algumas modalidades, a enzima de ERT é ASM, uma variante de ASM ou um fragmento cataliticamente ativo desta. Em algumas modalidades, a enzima de ERT compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 121, 122 e 123. Em algumas modalidades, a enzima de ERT compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 121, 122 e 123.
[0043] Em algumas modalidades, a enzima de ERT é GBA, uma variante de GBA ou um fragmento cataliticamente ativo desta. Em algumas modalidades, a enzima de ERT compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 93 e 94. Em algumas modalidades, a enzima de ERT compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 93 e 94.
[0044] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc é um polipeptídeo de fusão que está ligado à enzima de ERT, à variante da enzima de ERT ou ao fragmento cataliticamente ativo desta por uma ligação peptídica ou por um ligante polipeptídico. Em algumas modalidades, o ligante polipeptídico é um ligante polipeptídico flexível. Em algumas modalidades, o ligante polipeptídico flexível é um ligante rico em glicina. Em algumas modalidades, o ligante rico em glicina é G4S (SEQ ID NO: 239) ou (G4S)2 (SEQ ID NO: 240). Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc não está ligado à enzima de ERT, à variante da enzima de ERT ou ao fragmento cataliticamente ativo desta por um agente de reticulação química, por exemplo, o polipeptídeo de fusão não inclui uma ligação não peptídica ou um ligante não polipeptídico.
[0045] Em certas modalidades, o polipeptídeo de fusão compreende, do terminal N ao C: a enzima de ERT, a variante da enzima de
ERT, ou o fragmento cataliticamente ativo desta; o ligante polipeptídico; e o primeiro polipeptídeo Fc.
[0046] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc contém substituições T366S, L368A e Y407V, de acordo com a numeração EU. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 115, 117, 231, 232, 235 e 236. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 149 e 150. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc contém uma substituição T366W. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 118, 233 e 237. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 152 e 155. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende ainda o outro polipeptídeo Fc. Em algumas modalidades, o outro polipeptídeo Fc contém uma substituição T366W ou contém substituições T366S, L368A e Y407V e forma um dímero Fc com o polipeptídeo Fc de fusão da enzima de ERT.
[0047] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc compreende um sítio de ligação nativo a FcRn. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc não tem função efetora. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc inclui uma modificação que reduz a função efetora. Em algumas modalidades, a modificação que reduz a função efetora são as substituições de Ala na posição 234 e Ala na posição 235, de acordo com a numeração EU. Em algumas modalidades, a modificação que reduz a função efetora compreende ainda uma substituição de Gly na posição 329, de acordo com a numeração EU.
[0048] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc compreende alterações de aminoácidos em relação à sequência Fc nativa que prolonga a meia-vida do soro. Em algumas modalidades, as alterações de aminoácidos compreendem substituições de Tyr na posição 252, Thr na posição 254 e Glu na posição 256, de acordo com a numeração EU.
[0049] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc se liga especificamente a TfR.
[0050] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc compreende pelo menos duas substituições em posições selecionadas do grupo que consiste em 384, 386, 387, 388, 389, 390, 413, 416 e 421, de acordo com a numeração EU. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc compreende pelo menos três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou nove substituições nas posições.
[0051] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc compreende adicionalmente uma, duas, três ou quatro substituições em posições compreendendo 380, 391, 392 e 415, de acordo com o esquema de numeração EU. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende adicionalmente uma, duas ou três substituições nas posições compreendendo 414, 424 e 426, de acordo com a numeração EU.
[0052] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc compreende Trp na posição 388. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc compreende um aminoácido aromático na posição 421. Em algumas modalidades, o aminoácido aromático na posição 421 é Trp ou Phe.
[0053] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc compreende pelo menos uma posição selecionada das seguintes: posição 380 é Trp, Leu ou Glu; posição 384 é Tyr ou Phe; posição 386 é Thr; posição 387 é Glu; posição 388 é Trp; posição 389 é Ser, Ala, Val ou Asn; posição 390 é Ser ou Asn; posição 413 é Thr ou Ser; posição 415 é Glu ou Ser; posição 416 é Glu; e posição 421 é Phe.
[0054] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 posições selecionadas dentre as seguintes: posição 380 é Trp, Leu ou Glu; posição 384 é Tyr ou Phe; posição 386 é Thr; posição 387 é Glu; posição 388 é Trp; posição 389 é Ser, Ala, Val ou Asn; posição 390 é
Ser ou Asn; posição 413 é Thr ou Ser; posição 415 é Glu ou Ser; posição 416 é Glu; e posição 421 é Phe.
[0055] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc compreende pelo menos 11 posições selecionadas como segue: posição 380 é Trp, Leu ou Glu; posição 384 é Tyr ou Phe; posição 386 é Thr; posição 387 é Glu; posição 388 é Trp; posição 389 é Ser, Ala, Val ou Asn; posição 390 é Ser ou Asn; posição 413 é Thr ou Ser; posição 415 é Glu ou Ser; posição 416 é Glu; e posição 421 é Phe.
[0056] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc têm um domínio CH3 com pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade, ou pelo menos 95% de identidade com os aminoácidos 111-217 de qualquer uma das SEQ ID NOS: 34-38, 58 e 60-90. Em algumas modalidades, os resíduos em pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 das posições correspondentes às posições do índice EU 380, 384, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 413, 414, 415, 416, 421, 424 e 426 de qualquer uma das SEQ ID NOS: 34-38, 58, 60-90 não são deletados ou substituídos.
[0057] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc se liga ao domínio apical de TfR. Em algumas modalidades, a ligação da proteína a TfR não inibe substancialmente a ligação de transferrina a TfR.
[0058] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc tem uma identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 75%, ou pelo menos 80%, 85%, 90%, 92% ou 95%, em comparação com o polipeptídeo Fc do tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc de tipo selvagem correspondente é um polipeptídeo Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana.
[0059] Em algumas modalidades, o polipeptídeo FC não inclui uma sequência de região variável de cadeia pesada e/ou leve de imunoglobulina ou uma porção de ligação a antígeno desta.
[0060] Em algumas modalidades, é fornecido neste documento um polipeptídeo compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um polipeptídeo Fc que está ligado a uma enzima de ERT, uma variante da enzima de ERT, ou um fragmento cataliticamente ativo desta, em que o polipeptídeo Fc contém uma ou mais modificações que promovem sua heterodimerização em outro polipeptídeo Fc. Em algumas modalidades, é fornecido neste documento um vetor que compreende o polinucleotídeo. Em algumas modalidades, é fornecida neste documento uma célula hospedeira compreendendo o polinucleotídeo ou o vetor. Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende ainda um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica o outro polipeptídeo Fc. Em algumas modalidades, é fornecido neste documento um método para a produção do polipeptídeo descrito neste documento, compreendendo a cultura de uma célula hospedeira sob condições nas quais o polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo é expresso.
[0061] Em alguns aspectos, é fornecida neste documento uma proteína que compreende: (a) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a TfR; (b) uma segunda cadeia polipeptídica que compreende um polipeptídeo Fc, em que a primeira e a segunda cadeia polipeptídica formam um dímero Fc; e (c) uma enzima de ERT, uma variante da enzima de ERT ou um fragmento cataliticamente ativo desta, que está ligado ao polipeptídeo Fc modificado de (a) ou ao polipeptídeo Fc de (b).
[0062] Em algumas modalidades, a enzima de ERT é IDS, uma variante de IDS ou um fragmento cataliticamente ativo desta. Em algumas modalidades, a enzima de ERT compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 91, 92, 114, 230 e 234. Em algumas modalidades, a enzima de ERT compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 91, 92, 114, 230 e 234.
[0063] Em algumas modalidades, a enzima de ERT é SGSH, uma variante de SGSH ou um fragmento cataliticamente ativo desta. Em algumas modalidades, a enzima de ERT compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 119 e 120. Em algumas modalidades, a enzima de ERT compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 119 e 120.
[0064] Em algumas modalidades, a enzima de ERT é ASM, uma variante de ASM ou um fragmento cataliticamente ativo desta. Em algumas modalidades, a enzima de ERT compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 121, 122 e 123. Em algumas modalidades, a enzima de ERT compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 121, 122 e 123.
[0065] Em algumas modalidades, a enzima de ERT é GBA, uma variante de GBA ou um fragmento cataliticamente ativo desta. Em algumas modalidades, a enzima de ERT compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 93 e 94. Em algumas modalidades, a enzima de ERT compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 93 e 94.
[0066] Em algumas modalidades, a enzima de ERT está ligada ao polipeptídeo Fc modificado de (a). Em algumas modalidades, a enzima de ERT está ligada ao polipeptídeo Fc de (b). Em algumas modalidades, o polipeptídeo
Fc de (b) não é modificado para se ligar a um receptor de BBB. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc de (b) é um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a TfR.
[0067] Em algumas modalidades, a enzima de ERT está ligada (por exemplo, fundida) ao polipeptídeo Fc modificado de (a) ou ao polipeptídeo Fc de (b) por uma ligação peptídica ou por um ligante polipeptídico para formar um polipeptídeo de fusão. Em algumas modalidades, o ligante polipeptídico é um ligante polipeptídico flexível. Em algumas modalidades, o ligante polipeptídico flexível é um ligante rico em glicina. Em algumas modalidades, o ligante rico em glicina é G4S (SEQ ID NO: 239) ou (G4S)2 (SEQ ID NO: 240). Em algumas modalidades, a enzima de ERT não está ligada ao polipeptídeo Fc modificado de (a) ou ao polipeptídeo Fc de (b) por um agente de reticulação química, por exemplo, o polipeptídeo de fusão não inclui uma ligação não peptídica ou um ligante não polipeptídico.
[0068] Em algumas modalidades, a enzima de ERT está ligada ao terminal N do polipeptídeo Fc modificado de (a) ou ao terminal N do polipeptídeo Fc de (b). Em algumas modalidades, a enzima de ERT está ligada ao terminal C do polipeptídeo Fc modificado de (a) ou ao terminal C do polipeptídeo Fc de (b).
[0069] Em algumas modalidades, a proteína compreende duas enzimas de ERT. Em algumas modalidades, uma enzima de ERT está ligada ao polipeptídeo Fc modificado de (a) e a outra enzima de ERT está ligada ao polipeptídeo Fc de (b). Em algumas modalidades, as enzimas de ERT estão ligadas ao terminal N ou ao terminal C dos respectivos polipeptídeos Fc. Em algumas modalidades, uma enzima de ERT está ligada ao terminal N do polipeptídeo Fc modificado de (a) e a outra enzima de ERT está ligada ao terminal C do polipeptídeo Fc de (b). Em algumas modalidades, uma enzima de ERT está ligada ao terminal C do polipeptídeo Fc modificado de (a) e a outra enzima de ERT está ligada ao terminal N do polipeptídeo Fc de (b).
[0070] Em algumas modalidades, os polipeptídeos Fc de (a) e (b) cada um contêm modificações que promovem heterodimerização. Em algumas modalidades, um dos polipeptídeos Fc tem uma substituição T366W e o outro polipeptídeo Fc tem substituições T366S, L368A e Y407V, de acordo com a numeração EU. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado de (a) contém a substituição T366W e o polipeptídeo Fc de (b) contém as substituições T366S, L368A e Y407V. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc de (b) está ligado à IDS da enzima de ERT e compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 117, 232 e 236. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado de (a) contém as substituições T366S, L368A e Y407V e o polipeptídeo Fc de (b) contém a substituição T366W. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc de (b) está ligado à IDS da enzima ERT e compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 118, 233 e 237.
[0071] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado de (a) e/ou o polipeptídeo Fc de (b) compreende um sítio de ligação nativo a FcRn.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado de (a) e o polipeptídeo Fc de (b) não têm função efetora. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado de (a) e/ou o polipeptídeo Fc de (b) inclui uma modificação que reduz a função efetora. Em algumas modalidades, a modificação que reduz a função efetora são as substituições de Ala na posição 234 e Ala na posição 235, de acordo com a numeração EU. Em algumas modalidades, a modificação que reduz a função efetora compreende ainda uma substituição de Gly na posição 329, de acordo com a numeração EU. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc de (b) está ligado à IDS da enzima de ERT e compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 115, 231 e 235. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc de (b) está ligado à SGSH da enzima de ERT e compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS:
149, 150, 152 e 153.
[0072] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado de (a) e/ou o polipeptídeo Fc de (b) compreende alterações de aminoácidos em relação à sequência Fc nativa que prolonga a meia-vida do soro. Em algumas modalidades, as alterações de aminoácidos compreendem substituições de Tyr na posição 252, Thr na posição 254 e Glu na posição 256, de acordo com a numeração EU.
[0073] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende pelo menos duas substituições em posições selecionadas do grupo que consiste em 384, 386, 387, 388, 389, 390, 413, 416 e 421, de acordo com a numeração EU. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende pelo menos três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou nove substituições nas posições.
[0074] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende adicionalmente uma, duas, três ou quatro substituições em posições compreendendo 380, 391, 392 e 415, de acordo com a numeração EU.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende adicionalmente uma, duas ou três substituições nas posições compreendendo 414, 424 e 426, de acordo com a numeração EU.
[0075] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende Trp na posição 388. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende um aminoácido aromático na posição 421. Em algumas modalidades, o aminoácido aromático na posição 421 é Trp ou Phe.
[0076] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende pelo menos uma posição selecionada das seguintes: posição 380 é Trp, Leu ou Glu; posição 384 é Tyr ou Phe; posição 386 é Thr; posição 387 é Glu; posição 388 é Trp; posição 389 é Ser, Ala, Val ou Asn; posição 390 é Ser ou Asn; posição 413 é Thr ou Ser; posição 415 é Glu ou Ser; posição 416 é Glu;
e posição 421 é Phe.
[0077] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 posições selecionadas dentre as seguintes: posição 380 é Trp, Leu ou Glu; posição 384 é Tyr ou Phe; posição 386 é Thr; posição 387 é Glu; posição 388 é Trp; posição 389 é Ser, Ala, Val ou Asn; posição 390 é Ser ou Asn; posição 413 é Thr ou Ser; posição 415 é Glu ou Ser; posição 416 é Glu; e posição 421 é Phe.
[0078] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende pelo menos 11 posições selecionadas como segue: posição 380 é Trp, Leu ou Glu; posição 384 é Tyr ou Phe; posição 386 é Thr; posição 387 é Glu; posição 388 é Trp; posição 389 é Ser, Ala, Val ou Asn; posição 390 é Ser ou Asn; posição 413 é Thr ou Ser; posição 415 é Glu ou Ser; posição 416 é Glu; e posição 421 é Phe.
[0079] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado têm um domínio CH3 com pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade, ou pelo menos 95% de identidade com os aminoácidos 111-217 de qualquer uma das SEQ ID NOS: 34-38, 58 e 60-90, 151 e 156-229. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende a sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS: 156-229. Em algumas modalidades, os resíduos em pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 das posições correspondentes às posições do índice EU 380, 384, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 413, 414, 415, 416, 421, 424 e 426 de qualquer uma das SEQ ID NOS: 34-38, 58, 60-90, 151 e 156-229 não são deletados ou substituídos.
[0080] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 157. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 169. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 181. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 193. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 205.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 217.
[0081] Em algumas modalidades, a primeira cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 205 e 228 (por exemplo, SEQ ID NO: 228) e a segunda cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 115. Em outras modalidades, a primeira cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 169 e 229 (por exemplo, SEQ ID NO: 229) e a segunda cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 115.
[0082] Em algumas modalidades, a primeira cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 205 e 228 (por exemplo, SEQ ID NO: 228) e a segunda cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 231. Em outras modalidades, a primeira cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 169 e 229 (por exemplo, SEQ ID NO: 229) e a segunda cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 231.
[0083] Em algumas modalidades, a primeira cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 205 e 228 (por exemplo, SEQ ID NO: 228) e a segunda cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 235. Em outras modalidades, a primeira cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 169 e 229 (por exemplo, SEQ
ID NO: 229) e a segunda cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 235.
[0084] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc se liga ao domínio apical de TfR. Em algumas modalidades, a ligação da proteína a TfR não inibe substancialmente a ligação de transferrina a TfR.
[0085] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado tem uma identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 75%, ou pelo menos 80%, 85%, 90%, 92% ou 95%, em comparação com o polipeptídeo Fc do tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc de tipo selvagem correspondente é um polipeptídeo Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana.
[0086] Em algumas modalidades, a captação da enzima de ERT no cérebro (por exemplo, usando um modelo animal apropriado, como os descritos neste documento) é maior que a captação da enzima de ERT na ausência do polipeptídeo Fc ou a captação da enzima de ERT sem as modificações no polipeptídeo Fc que resultam na ligação a TfR. Em algumas modalidades, a captação da enzima de ERT no cérebro é pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 vezes maior em comparação com a captação da enzima de ERT na ausência do polipeptídeo Fc ou em comparação com a captação da enzima de ERT sem as modificações no polipeptídeo Fc que resultam na ligação a TfR.
[0087] Em alguns aspectos, é fornecido neste documento um método de tratamento de um LSD, o método compreendendo a administração de uma proteína ou polipeptídeo conforme descrito acima a um paciente em necessidade deste. Em algumas modalidades, o método diminui o acúmulo de um produto metabólico tóxico no paciente, por exemplo, um produto metabólico tóxico no cérebro do paciente e/ou líquido cefalorraquidiano (CSF) é diminuído.
[0088] Em aspectos relacionados, é fornecido neste documento um método para diminuir o acúmulo de um produto metabólico tóxico em um paciente com LSD, o método compreendendo a administração de uma proteína ou polipeptídeo, conforme descrito acima ao paciente. Em algumas modalidades, o método diminui o acúmulo de um produto metabólico tóxico no cérebro do paciente e/ou CSF.
[0089] Em algumas modalidades, o LSD é a síndrome de Hunter e a enzima de ERT é IDS. Em algumas modalidades, o produto metabólico tóxico compreende dissacarídeos derivados de sulfato de heparano e/ou dissacarídeos derivados de sulfato de dermatano.
[0090] Em algumas modalidades, o LSD é a síndrome de Sanfilippo A e a enzima de ERT é SGSH. Em algumas modalidades, o produto metabólico tóxico compreende oligossacarídeos derivados de sulfato de heparano (por exemplo, hexassacarídeos).
[0091] Em algumas modalidades, o LSD é a doença de Niemann- Pick e a enzima de ERT é ASM. Em algumas modalidades, o produto metabólico tóxico compreende esfingomielina.
[0092] Em algumas modalidades, o LSD é a doença de Gaucher ou a doença de Parkinson e a enzima de ERT é GBA. Em algumas modalidades, o produto metabólico tóxico compreende glicosilceramida.
[0093] Em algumas modalidades, a quantidade total de um produto metabólico tóxico é reduzida em pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% em comparação com a quantidade total do produto metabólico tóxico na ausência da proteína ou polipeptídeo. Ensaios ilustrativos para medir a atividade da enzima de ERT e o acúmulo de substrato são descritos neste documento.
[0094] Em alguns aspectos, é fornecida neste documento uma composição farmacêutica compreendendo uma proteína ou polipeptídeo conforme descrito acima e um carreador farmaceuticamente aceitável.
[0095] Em alguns aspectos, é fornecido neste documento um método para monitorar a acumulação de substrato para avaliar a atividade de IDS, o método compreendendo: (a) romper células em uma amostra de células ou tecidos ou microvesículas em uma amostra de fluido de um sujeito administrou uma proteína ou polipeptídeo conforme descrito acima para quebrar microvesículas abertas para obter uma solução de glicosaminoglicano (GAG) a ser analisada; (b) digerir a solução de GAG com pelo menos uma heparinase (por exemplo, heparinase I, heparinase II e heparinase III) e condroitinase B para obter dissacarídeos derivados de GAG; (c) analisar os dissacarídeos derivados de GAG por espectrometria de massa (por exemplo, LC-MS/MS); e (d) determinar os níveis de dissacarídeos derivados de sulfato de heparano e/ou sulfato de dermatano, em que os níveis reduzidos de dissacarídeos derivados de sulfato de heparano e/ou sulfato de dermatano em comparação a um controle que não possui atividade de IDS são indicativos de atividade de IDS aumentada na amostra comparada ao controle.
[0096] Em algumas modalidades, a etapa de rompimento de células ou microvesículas compreende pelo menos um ciclo de congelamento- descongelamento e/ou pelo menos uma etapa de sonicação. Em algumas modalidades, as células são de uma amostra de tecido e o método compreende pelo menos três, quatro ou cinco ciclos de congelamento e descongelamento.
Em algumas modalidades, o sujeito é um camundongo deficiente na atividade de IDS. Em algumas modalidades, o sujeito é um primata não humano. Em algumas modalidades, o sujeito é um paciente humano com síndrome de Hunter.
[0097] Em algumas modalidades, os níveis de dissacarídeos derivados de sulfato de heparano e/ou sulfato de dermatano são reduzidos em pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%,
55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% em comparação com os níveis de dissacarídeos derivados de sulfato de heparano e/ou sulfato de dermatano em um controle que não possui atividade de IDS. Em algumas modalidades, o controle é uma amostra de célula ou tecido da mesma célula do tipo de tecido obtida do sujeito antes da administração da proteína ou polipeptídeo. Em algumas modalidades, o controle é uma amostra de célula ou tecido da mesma célula do tipo de tecido conhecida por ser deficiente na atividade de IDS. Em algumas modalidades, a proteína ou polipeptídeo aumenta a atividade de IDS na amostra em pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 vezes em comparação com a atividade de IDS no controle.
[0098] Em outros aspectos, é fornecido neste documento um método para monitorar a acumulação de substrato para avaliar a atividade de SGSH, o método compreendendo: (a) romper células em uma amostra de células ou tecidos ou microvesículas em uma amostra de fluido de um sujeito administrou uma proteína ou polipeptídeo conforme descrito acima para quebrar microvesículas abertas para obter uma solução de glicosaminoglicano (GAG) a ser analisada; (b) digerir a solução de GAG com pelo menos uma heparinase para obter dissacarídeos derivados de GAG; (c) analisar os dissacarídeos derivados de GAG por espectrometria de massa (por exemplo, LC-MS/MS); e (d) determinar os níveis de dissacarídeos derivados de sulfato de heparano, em que os níveis reduzidos de dissacarídeos derivados de sulfato de heparano em comparação a um controle que não possui atividade de SGSH são indicativos de atividade de SGSH aumentada na amostra comparada ao controle.
[0099] Em algumas modalidades, a etapa de rompimento de células ou microvesículas compreende pelo menos um ciclo de congelamento- descongelamento e/ou pelo menos uma etapa de sonicação. Em algumas modalidades, as células são de uma amostra de tecido e o método compreende pelo menos três, quatro ou cinco ciclos de congelamento e descongelamento.
Em algumas modalidades, o sujeito é um camundongo deficiente na atividade de SGSH. Em algumas modalidades, o sujeito é um primata não humano. Em algumas modalidades, o sujeito é um paciente humano com síndrome de Sanfilippo A.
[0100] Em algumas modalidades, os níveis de dissacarídeos derivados de sulfato de heparano são reduzidos em pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% em comparação com os níveis de dissacarídeos derivados de sulfato de heparano em um controle que não possui atividade de SGSH. Em algumas modalidades, o controle é uma amostra de célula ou tecido da mesma célula do tipo de tecido obtida do sujeito antes da administração da proteína ou polipeptídeo. Em algumas modalidades, o controle é uma amostra de célula ou tecido da mesma célula do tipo de tecido conhecida por ser deficiente na atividade de SGSH. Em algumas modalidades, a proteína ou polipeptídeo aumenta a atividade de SGSH na amostra em pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 vezes em comparação com a atividade de SGSH no controle.
[0101] Em outros aspectos, é fornecido neste documento um método de transporte de um agente através da BBB de um mamífero, o método compreendendo a exposição da BBB a uma proteína que se liga a um TfR com uma afinidade de cerca de 50 nM a cerca de 250 nM, em que a proteína está ligada ao agente e transporta o agente ligado através da BBB. Em algumas modalidades, a concentração máxima (Cmax) do agente no cérebro do mamífero é melhorada. Em algumas modalidades, o agente é útil para o tratamento de um
[0102] Em outros aspectos, é fornecido neste documento um método de tratamento de um LSD, o método compreendendo a administração, a um mamífero, de uma proteína que se liga a um TfR com uma afinidade de cerca de 50 nM a cerca de 250 nM, em que a proteína está ligada a um agente para tratamento do LSD, expondo, desse modo, o cérebro do mamífero ao agente. Em algumas modalidades, a proteína melhora a Cmax do agente no cérebro em comparação com o agente ligado a uma proteína de referência que se liga ao TfR com uma afinidade mais fraca. Em algumas modalidades, a proteína de referência se liga ao TfR com uma afinidade de cerca de 600 nM, ou mais fraca.
[0103] Em algumas modalidades, o TfR é um TfR primata. Em algumas modalidades, o TfR de primata é um TfR de humano. Em algumas modalidades, a proteína se liga ao domínio apical de TfR.
[0104] Em algumas modalidades, a proteína se liga ao TfR com uma afinidade de cerca de 100 nM a cerca de 200 nM. Em algumas modalidades, a proteína se liga ao TfR com uma afinidade de cerca de 110 nM a cerca de 150 nM.
[0105] Em algumas modalidades, a concentração terapeuticamente eficaz do agente é uma concentração que trata um ou mais sintomas de um LSD no mamífero. Em algumas modalidades, o agente é um terapêutico de reposição de proteínas. Em algumas modalidades, o agente ou terapêutico de reposição de proteínas é uma enzima.
[0106] Em algumas modalidades, a enzima diminui o acúmulo de um produto metabólico tóxico no cérebro do mamífero com o LSD em maior extensão quando ligada à proteína em comparação com quando a enzima está ligada à proteína de referência. Em algumas modalidades, a enzima é IDS e o LSD é a síndrome de Hunter. Em algumas modalidades, o produto metabólico tóxico compreende dissacarídeos derivados de sulfato de heparina e/ou dissacarídeos derivados de sulfato de dermatano. Em algumas modalidades, a enzima é SGSH e o LSD é a síndrome de Sanfilippo A. Em algumas modalidades, a enzima é ASM e o LSD é a doença de Niemann-Pick. Em algumas modalidades, a enzima é GBA e o LSD é a doença de Gaucher.
[0107] Em algumas modalidades, o agente compreende uma região variável de anticorpo. Em algumas modalidades, o agente compreende um fragmento de anticorpo. Em algumas modalidades, o agente compreende um Fab ou scFv.
[0108] Em algumas modalidades, a proteína é um polipeptídeo Fc modificado que contém um sítio de ligação não nativo capaz de se ligar a TfR.
Em algumas modalidades, a proteína compreende uma região variável de anticorpo que se liga especificamente a TfR. Em algumas modalidades, a proteína compreende um fragmento de anticorpo. Em algumas modalidades, a proteína compreende um Fab ou scFv.
[0109] Em algumas modalidades, a proteína ligada ao agente é administrada como parte de um carreador farmaceuticamente aceitável.
[0110] A FIG. 1 mostra a purificação e análise de uma proteína de fusão IDS-Fc compreendendo um polipeptídeo Fc ligado a uma enzima iduronato-2-sulfatase (IDS) e um polipeptídeo Fc modificado que se liga ao receptor de transferrina (TfR).
[0111] A FIG. 2 mostra os resultados de um ensaio de afinidade de ligação para proteínas de fusão IDS-Fc analisadas na FIG. 1 demonstrando que as proteínas de fusão se ligam a TfR.
[0112] A FIG. 3 fornece dados demonstrando a atividade de IDS in vitro das proteínas de fusão IDS-Fc analisadas na FIG. 1.
[0113] A FIG. 4 fornece dados demonstrando que as células knockout que não possuem IDS aumentaram os níveis de dissacarídeos derivados do sulfato de heparano, conforme avaliado por um ensaio LC-MS/MS, e a expressão de IDS nas células knockout de IDS (KO) resgata o fenótipo de knockout.
[0114] A FIG. 5A mostra que as proteínas de fusão IDS-Fc como seja monozima do terminal N ou monozima do terminal C compreendendo o mesmo polipeptídeo Fc de ligação ao TfR (ou seja, CH3C.35.21.17) acumulação reversa de sulfato de heparano e sulfato de dermatano em células IDS KO. A FIG. 5B mostra que a monozima do terminal N (“ETV:IDS 35.21.17”) tem eficácia celular comparável à de IDS. A FIG. 5C mostra redução dependente da dose de proteínas marcadas com S35-sulfato acumuladas em fibroblastos de pacientes com MPS II tratados com proteína de fusão IDS-Fc ("ETV:IDS") ou IDS; n=8.
FIG. 5D mostra a avaliação da depuração dependente de M6PR de proteínas marcadas S35 em fibroblastos de pacientes com MPS II tratados com doses crescentes de proteína de fusão IDS-Fc ("ETV: IDS") ou IDS na presença ou ausência de 5mM M6P; n = 3. FIGs. 5C-5D: “ETV: IDS” = ETV: IDS 35.23.2; Os gráficos exibem valores médios nas réplicas experimentais ± SEM.
[0115] A FIG. 6 fornece dados que ilustram os níveis de sulfato de heparano e de dermatano no soro de camundongos do tipo selvagem (WT) dosados com veículo ou camundongos IDS KO dosados com IDS ou uma proteína de fusão IDS-Fc ("ETV: IDS") em camundongos ao longo do tempo.
“ETV: IDS” = ETV: IDS 35.21.
[0116] A FIG. 7 fornece dados que ilustram que os níveis coletivos de dissacarídeos D0SO, DOA0 e D0a4 (referidos como "Níveis totais de sGAG") em tecidos periféricos de camundongos IDS KO foram avaliados sete dias após a administração de uma única injeção intravenosa de 40 mg/kg de proteína de fusão IDS-Fc ("ETV:IDS") ou 5,3 mg/kg de IDS e comparada com IDS KO tratado com veículo e camundongos do tipo selvagem; n = 8 para grupos IDS KO e n =
3 para grupos do tipo selvagem. Dados mostrados como média ± SEM com valores de p: ANOVA unidirecional com teste de comparação múltipla Dunnett; ** p <0,01 e **** p 0,0001. “ETV:IDS” = ETV:IDS 35.21.
[0117] A FIG. 8 fornece dados que ilustram a concentração de proteínas de fusão IDS-Fc no cérebro de camundongos knock-in TfR humanos (TfRms/hu KI) após administração periférica da proteína de fusão IDS-Fc ETV:IDS 35,21 ou uma proteína de fusão IDS-Fc de controle sem as mutações que conferem a ligação ao TfR ("IDS: Fc").
[0118] A FIG. 9A fornece dados que ilustram a concentração de proteínas de fusão IDS-Fc no cérebro de camundongos TfRms/hu KI após administração periférica da proteína de fusão IDS-Fc ETV:IDS 35.21.17.2 ou ETV:IDS 35.23.2 ou uma proteína de fusão IDS-Fc de controle sem as mutações que conferem ligação ao TfR ("IDS:Fc"). A FIG. 9B fornece dados que ilustram a concentração hepática da proteína de fusão IDS-Fc ETV:IDS 35.21 ou IDS:Fc em camundongos TfRms/hu KI após uma única injeção intravenosa de dose de 50 mg/kg; n = 4-5. Os gráficos mostram a média ± SEM.
[0119] A FIGS. 10A-10C mostram que ETV: IDS reduz GAGs no cérebro e tecidos periféricos de camundongos IDS KO x TfRms/hu KI. Aos camundongos IDS KO x TfRms/hu KI foi administrada uma única injeção intravenosa de 40 mg/kg de ETV:IDS ou 14,2 mg/kg de IDS ou quatro doses semanais, conforme descrito no Exemplo 2. A concentração de IDS no soro (FIG.
10A) e tecidos (FIG. 10B) foi medida em camundongos IDS KO x TfRms/hu KI após uma dose única. O tecido PK é mostrado 2 h após a dose; n = 4. Os gráficos mostram os valores médios ± SEM e p: análise do teste t não pareado. FIG. 10C mostra os níveis de dissacarídeos D0SO, DOA0 e D0a4 ("Níveis totais de sGAG") no cérebro, no CSF e nos tecidos periféricos dos camundongos IDS KO x TfRms/hu KI foram medidos após uma dose única ou várias doses de ETV:IDS ou IDS e comparado com tratamento de veículo e camundongos do tipo selvagem; n = 8 por grupos IDS KO x TfRms/hu KI e n = 5 para o grupo do tipo selvagem. Os gráficos mostram os valores médios ± SEM e p: ANOVA unidirecional com teste de comparação múltipla Dunnett; ** p <0,01, *** p ≤ 0,001 e **** p ≤ 0,0001.
[0120] A FIG. 11 mostra a purificação e análise de uma proteína de fusão ASM-Fc compreendendo uma região Fc ligada a duas enzimas esfingomielinase ácidas (ASM).
[0121] A FIG. 12 fornece dados demonstrando a atividade ASM in vitro de uma proteína de fusão ASM-Fc analisada na FIG. 11.
[0122] A FIG. 13 fornece dados mostrando que uma proteína de fusão ASM-Fc como analisada na FIG. 11 reduz o acúmulo de esfingomielina nas células ASM KO usando um ensaio baseado em imagem.
[0123] A FIG. 14 fornece dados mostrando que uma proteína de fusão ASM-Fc como analisada na FIG. 11 reduz o acúmulo de esfingomielina nas células ASM KO usando um ensaio baseado em LC-MS/MS.
[0124] A FIG. 15 fornece dados demonstrando atividade in vitro da N-sulfoglucosamina sulfo-hidrolase (SGSH) das proteínas de fusão SGSH-Fc descritas no Exemplo 6.
[0125] A FIG. 16 fornece dados demonstrando que as células knockout (KO) que não possuem SGSH têm níveis aumentados de dissacarídeos derivados de sulfato de heparano, conforme avaliado por um ensaio de LC-MS/MS. n = 3-4 linhagens celulares independentes; dados mostrados como média s.e.m.
[0126] A FIG. 17 fornece dados que ilustram que uma proteína de fusão SGSH-Fc analisada na FIG. 15 reverte o acúmulo de sulfato de heparano nas células SGSH KO.
[0127] A FIG. 18 mostra a relação entre a afinidade hTfR do polipeptídeo de ligação a TfR manipulado e a exposição cerebral ao longo do tempo em camundongos TfRms/hu KI. Os pontos representam a exposição cerebral cumulativa ao longo do tempo (AUC) de diferentes variantes de afinidade de polipeptídeo de ligação a TfR manipulado após uma dose única de 50 mg/kg em camundongos TfRms/hu KI. As concentrações cerebrais de polipeptídeo (medidas por huIgG1) foram calculadas em vários dias após a dose (varia de 1 a 10 dias). Os dados representam um sumário de três estudos independentes, n = 4-5 camundongos por grupo para cada estudo.
[0128] A FIG. 19 mostra a relação entre a afinidade hTfR do polipeptídeo de ligação a TfR manipulado e a concentração cerebral máxima em camundongos TfRms/hu KI. Os pontos representam concentrações máximas no cérebro de diferentes variantes de afinidade polipeptídica, medidas 1 dia após a dose após uma dose única de 50 mg/kg. Os dados representam um sumário de três estudos independentes, n = 4-5 camundongos por grupo para cada estudo.
[0129] A FIG. 20 mostra a relação entre a afinidade hTfR do polipeptídeo de ligação a TfR manipulado e a razão entre a concentração cerebral e a concentração plasmática de polipeptídeo em camundongos TfR ms/hu KI. Os pontos representam a razão de concentração máxima de cérebro versus plasma de diferentes variantes de afinidade polipeptídica, medidas 1 dia após a dose após uma dose única de 50 mg/kg. Os dados representam um sumário de três estudos independentes, n = 4-5 camundongos por grupo para cada estudo.
[0130] As FIGS. 21A e 21B representam concentrações de huIgG1 no plasma (FIG. 21A) e lisados cerebrais (FIG. 21B) de camundongos TfR ms/hu knock-in (KI) após uma única injeção sistêmica de 50 mg/kg de fusão de polipeptídeo anti-BACE1_Ab153, CH3C35.21:Ab153, CH3C35.20:Ab153 ou CH3C35:Ab153 (média ± SEM, n = 5 por grupo).
[0131] A FIG. 21C representa a concentração endógena de Aβ de camundongo no lisado cerebral de camundongos TfRms/hu KI após uma única injeção sistêmica de 50 mg/kg de fusão de polipeptídeo anti-BACE1_Ab153,
CH3C35.21:Ab153, CH3C35.20:Ab153 ou CH3C35:Ab153 (média ± SEM, n = 5 por grupo).
[0132] A FIG. 21D representa a quantificação por Western blot da proteína TfR cerebral normalizada para actina no lisado cerebral de camundongos TfRms/hu KI após uma única injeção sistêmica de 50 mg/kg de fusão de polipeptídeo anti-BACE1_Ab153, CH3C35.21:Ab153, CH3C35.20:Ab153 ou CH3C35:Ab153 (média ± SEM, n = 5 por grupo).
[0133] Desenvolvemos proteínas de fusão que incluem uma enzima da terapia de reposição enzimática (ERT) ligada a um polipeptídeo Fc.
Essas proteínas podem ser usadas para tratar distúrbios do armazenamento lisossômico (LSDs). Em alguns casos, a proteína inclui um polipeptídeo Fc dimérico, em que um dos monômeros do polipeptídeo Fc está ligado à enzima de ERT. Os polipeptídeos Fc podem aumentar a meia-vida da enzima e, em alguns casos, podem ser modificados para conferir propriedades funcionais adicionais à proteína. Também são descritas neste documento proteínas de fusão que facilitam a distribuição de uma enzima de ERT através da barreira hematoencefálica (BBB). Essas proteínas compreendem um polipeptídeo Fc e um polipeptídeo Fc modificado que formam um dímero e uma enzima de ERT ligada à região Fc e/ou à região Fc modificada. A região Fc modificada pode se ligar especificamente a um receptor BBB, como um receptor de transferrina (TfR). Em algumas modalidades, a enzima de ERT é a iduronato de 2-sulfatase (IDS), ou uma variante ou fragmento cataliticamente ativo de uma IDS de tipo selvagem, por exemplo, uma IDS humana de tipo selvagem. Em outras modalidades, a enzima de ERT é N-sulfoglucosamina sulfo-hidrolase (SGSH), esfingomielinase ácida (ASM), -glucocerbrosidase (GBA) ou uma variante ou fragmento cataliticamente ativo de uma SGSH, ASM ou GBA do tipo selvagem,
por exemplo, uma SGSH, ASM ou GBA humana de tipo selvagem.
[0134] Também desenvolvemos um método para transportar agentes terapêuticos que estão ligados aos polipeptídeos e proteínas de ligação ao TfR através do BBB para o tratamento da doença. Descobrimos que a afinidade de ligação ao TfR desejada para o transporte de um agente terapêutico através da BBB depende do alvo do agente terapêutico, bem como do mecanismo de ação que impulsiona a eficácia no tratamento da doença. Em particular, descobrimos que o uso de polipeptídeos e proteínas que possuem afinidades mais fortes por TfR resulta em maior Cmax, mas uma depuração mais rápida.
[0135] Para algumas terapias, como terapias de reposição proteica, que podem ser usadas para tratar, por exemplo, LSDs, que incluem o uso de enzimas de ERT, como IDS (por exemplo, para o tratamento da síndrome de Hunter), além de outras, atingindo um alto nível cerebral C max do terapêutico é desejada sobre a janela de dosagem, pois concentrações extracelulares mais altas, por sua vez, conduzirão a concentrações aumentadas de proteína intracelular. Uma vez distribuída às células, a meia-vida intracelular da proteína distribuída é mantida por um período mais longo, em comparação com o tempo de permanência no plasma. Além disso, ter uma Cmax alta pode ser benéfico para a reposição enzimática, pois a alta concentração enzimática pode levar a uma taxa aumentada de rotatividade do substrato pela enzima. Para melhorar a Cmax cerebral, é particularmente útil o uso de polipeptídeos e proteínas que possuem uma gama de afinidade de TfR de 50-250 nM.
[0136] Conforme usado neste documento, as formas singulares "um(a)", e "o(a)" incluem as formas do plural referentes, a menos que o conteúdo indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "um polipeptídeo" pode incluir duas ou mais dessas moléculas, e semelhantes.
[0137] Conforme usado neste documento, os termos "cerca de" e "aproximadamente", quando usados para modificar uma quantidade especificada em um valor ou faixa numérica indicam que o valor numérico, bem como desvios razoáveis do valor conhecido pelos versados na técnica, por exemplo, ± 20%, ± 10% ou ± 5%, estão dentro do significado pretendido do valor recitado.
[0138] Uma "enzima de terapia de reposição enzimática" ou "enzima de ERT" refere-se a uma enzima que é deficiente em um distúrbio de armazenamento lisossômico. Uma "variante da enzima de ERT" refere-se a uma variante funcional, incluindo variantes alélicas e de splice, de uma enzima de ERT de tipo selvagem ou um fragmento desta, em que a variante da enzima de ERT tem pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% da atividade da enzima de ERT de tipo selvagem correspondente ou fragmento desta, por exemplo, quando analisado em condições idênticas. Um "fragmento cataliticamente ativo" de uma enzima de ERT refere-se a uma porção de uma enzima de ERT completa ou uma variante desta, em que o fragmento cataliticamente ativo possui pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% da atividade da enzima de ERT completa correspondente ou variante desta, por exemplo, quando testado em condições idênticas.
[0139] Uma "iduronato sulfatase", "iduronato 2-sulfatase" ou "IDS", conforme usado neste documento, refere-se ao iduronato 2-sulfatase (EC
3.1.6.13), que é uma enzima envolvida na degradação lisossômica dos glicosaminoglicanos de sulfato de heparano e sulfato de dermatano. A deficiência de IDS está associada à mucopolissacaridose II, também conhecida como síndrome de Hunter. O termo "IDS", conforme usado neste documento como um componente de uma proteína que compreende um polipeptídeo Fc, é cataliticamente ativo e abrange variantes funcionais, incluindo variantes alélicas e de splice, de uma IDS de tipo selvagem ou um fragmento deste. A sequência da isoforma IDS humana I, que é a sequência humana designada como sequência canônica, está disponível na entrada P22304 do UniProt e é codificada pelo gene IDS humano em Xq28. A sequência completa é fornecida como SEQ ID NO: 91. Uma sequência IDS "madura", conforme usada neste documento, refere-se a uma forma de uma cadeia polipeptídica que não possui as sequências de sinal e propeptídeo da cadeia polipeptídica de comprimento total que ocorre naturalmente. A sequência de aminoácidos de um polipeptídeo IDS humano maduro é fornecida como SEQ ID NO: 92, que corresponde aos aminoácidos 34-550 da sequência humana completa. Uma sequência de IDS "truncada", conforme usada neste documento, refere-se a um fragmento cataliticamente ativo da cadeia polipeptídica de comprimento total que ocorre naturalmente. A sequência de aminoácidos de um polipeptídeo IDS humano truncado exemplificativa é fornecida como SEQ ID NO: 114, que corresponde aos aminoácidos 26-550 da sequência humana completa. A estrutura da IDS humana foi bem caracterizada. Uma estrutura ilustrativa está disponível no código de acesso ao PDB 5FQL. A estrutura também é descrita em Nat. Comm.
8: 15786 doi: 10.1038/ncomms15786, 2017. Também foram descritas sequências IDS de primatas não humanos, incluindo chimpanzé (entrada UniProt K7BKV4) e macaco rhesus (entrada UniProt H9FTX2). Uma sequência IDS de camundongo está disponível na entrada Uniprot Q08890. Uma variante IDS tem pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% da atividade do correspondente IDS de tipo selvagem ou fragmento deste, por exemplo, quando ensaiado em condições idênticas. Um fragmento IDS cataliticamente ativo tem pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% da atividade do IDS completo correspondente ou variante desta, por exemplo, quando analisados em condições idênticas.
[0140] Uma "sulfoglucosamina sulfo-hidrolase", "N- sulfoglucosamina sulfo-hidrolase" ou "SGSH", conforme usado neste documento, refere-se à N-sulfoglucosamina sulfo-hidrolase (EC 3.10.1.1), que é uma enzima envolvida na degradação lisossômica do sulfato de heparano.
Mutações nesse gene estão associadas à síndrome de Sanfilippo A, um tipo da mucopolissacaridose III do distúrbio de armazenamento lisossômico, que resulta da degradação prejudicada do sulfato de heparano. O termo "SGSH", conforme usado neste documento como um componente de uma proteína que compreende um polipeptídeo Fc, é cataliticamente ativo e abrange variantes funcionais, incluindo variantes alélicas e de splice, de um SGSH de tipo selvagem ou um fragmento deste. A sequência de SGSH humana está disponível na entrada UniProt P51688 e é codificada pelo gene SGSH humana em 17q25.3. A sequência completa é fornecida como SEQ ID NO: 119. Uma sequência SGSH "madura", conforme usada neste documento, refere-se a uma forma de uma cadeia polipeptídica que não possui a sequências de sinal da cadeia polipeptídica de comprimento total que ocorre naturalmente. A sequência de aminoácidos de um polipeptídeo SGSH humano maduro é fornecida como SEQ ID NO: 120, que corresponde aos aminoácidos 21-502 da sequência humana de comprimento total. Uma sequência de SGSH "truncada", conforme usada neste documento, refere-se a um fragmento cataliticamente ativo da cadeia polipeptídica de comprimento total que ocorre naturalmente. A estrutura da SGSH humana foi bem caracterizada. Uma estrutura ilustrativa está disponível no código de acesso ao PDB 4MHX. Também foram descritas sequências de SGSH de primatas não humanos, incluindo o chimpanzé (entrada
UniProt K7C218). Uma sequência SGSH de camundongo está disponível na entrada Uniprot Q9EQ08. Uma variante SGSH tem pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% da atividade do correspondente SGSH de tipo selvagem ou fragmento deste, por exemplo, quando ensaiado em condições idênticas. Um fragmento SGSH cataliticamente ativo tem pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% da atividade de SGSH de comprimento total correspondente ou sua variante, por exemplo, quando analisados em condições idênticas.
[0141] Uma "esfingomielinase ácida", "esfingomielina fosfodiesterase" ou "ASM", conforme usado neste documento, refere-se à esfingomielina fosfodiesterase 1 (EC 3.1.4.12), que é uma enzima lisossômica que converte a esfingomielina em ceramida. As doenças associadas à deficiência de ASM incluem a doença de Niemann-Pick (por exemplo, tipo A ou tipo B). O termo "ASM", conforme usado neste documento como um componente de uma proteína que compreende um polipeptídeo Fc, é cataliticamente ativo e abrange variantes funcionais, incluindo variantes alélicas e de splice, de um ASM de tipo selvagem ou um fragmento deste. A sequência da isoforma ASM humana 1, que é a sequência humana designada como sequência canônica, está disponível na entrada P17405 do UniProt e é codificada pelo gene SMPD1 humano em 11p15.4. A sequência completa é fornecida como SEQ ID NO: 121.
Uma sequência ASM "madura", conforme usada neste documento, refere-se a uma forma de uma cadeia polipeptídica que não possui a sequência de sinal da cadeia polipeptídica de comprimento total que ocorre naturalmente. A sequência de aminoácidos de um polipeptídeo ASM humano maduro é fornecida como SEQ ID NO: 122, que corresponde aos aminoácidos 47-629 da sequência humana de comprimento total. Uma sequência de ASM "truncada", conforme usada neste documento, refere-se a um fragmento cataliticamente ativo da cadeia polipeptídica de comprimento total que ocorre naturalmente. A sequência de aminoácidos de um polipeptídeo ASM humano truncado exemplificativa é fornecida como SEQ ID NO: 123, que corresponde aos aminoácidos 47-620 da sequência humana de comprimento total. A estrutura da ASM humana foi bem caracterizada. Uma estrutura ilustrativa está disponível no código de acesso ao PDB 5I81. Também foram descritas sequências de ASM de primatas não humanos, incluindo o chimpanzé (entrada UniProt H2Q319). Uma sequência ASM de camundongo está disponível na entrada Uniprot Q04519. Uma variante ASM tem pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% da atividade da ASM correspondente de tipo selvagem ou fragmento desta, por exemplo, quando ensaiado em condições idênticas. Um fragmento ASM cataliticamente ativo tem pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% da atividade da ASM correspondente de comprimento total ou variante desta, por exemplo, quando analisados em condições idênticas.
[0142] Uma " -glucocerebrosidase" ou "GBA" também é conhecida como glucosilceramidase (EC 3.2.1.45). O termo conforme usado neste documento refere-se a uma enzima lisossômica que possui atividade de glicosilceramidase e catalisa a quebra da glicosilceramida em ceramida e glicose. A deficiência de GBA está associada à doença de Gaucher e à doença de Parkinson. O termo "GBA", conforme usado neste documento como um componente de uma proteína que compreende um polipeptídeo Fc, é cataliticamente ativo e abrange variantes funcionais, incluindo variantes alélicas e de splice, de uma GBA de tipo selvagem ou um fragmento desta. A sequência de GBA humano, isoforma longa, que é designada como sequência canônica, está disponível na entrada UniProt P04062-1 e é codificada pelo gene GBA humano em 1q22. A sequência completa é fornecida como SEQ ID NO: 93. Uma sequência GBA "madura", conforme usada neste documento, refere-se a uma forma de uma cadeia polipeptídica que não possui as sequências de sinal e propeptídeo da cadeia polipeptídica de comprimento total que ocorre naturalmente. A sequência de aminoácidos de um polipeptídeo GBA humano maduro é fornecida como SEQ ID NO: 94, que corresponde aos aminoácidos 40- 536 da sequência humana de comprimento total. Uma sequência de GBA "truncada", conforme usada neste documento, refere-se a um fragmento cataliticamente ativo da cadeia polipeptídica de comprimento total que ocorre naturalmente. A estrutura da GBA humana foi bem caracterizada. Estão disponíveis quase 20 estruturas de cristal de GBA. Também foram descritas sequências de GBA de primatas não humanos, incluindo chimpanzé (entrada UniProt Q9BDT0) e orangotango (entrada UniProt Q5R8E3). Uma sequência GBA de camundongo está disponível na entrada P17439 do UniProt. Uma variante GBA tem pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% da atividade da GBA correspondente de tipo selvagem ou fragmento desta, por exemplo, quando ensaiado em condições idênticas. Um fragmento GBA cataliticamente ativo tem pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% da atividade da GBA correspondente de comprimento total ou variante desta, por exemplo, quando analisados em condições idênticas.
[0143] Um "receptor de transferrina" ou "TfR", conforme usado neste documento, refere-se à proteína 1 do receptor de transferrina. A sequência polipeptídica do receptor 1 da transferrina humana é apresentada na SEQ ID
NO: 96. Também são conhecidas sequências de proteína 1 do receptor de transferrina de outras espécies (por exemplo, chimpanzé, número de acesso XP_003310238.1; macaco rhesus, NP_001244232.1; cachorro, NP_001003111.1; gado, NP_001193506.1; camundongo, NP_035768.1; rato, NP_073203.1; e frango, NP_990587.1). O termo "receptor de transferrina" também abrange variantes alélicas de sequências de referência exemplificativas, por exemplo, sequências humanas, que são codificadas por um gene em um locus cromossômico da proteína 1 do receptor de transferrina. A proteína receptora de transferrina de comprimento total inclui uma região intracelular de terminal N curta, uma região transmembranar e um grande domínio extracelular.
O domínio extracelular é caracterizado por três domínios: um domínio semelhante a protease, um domínio helicoidal e um domínio apical. A sequência do domínio apical do receptor de transferrina humano 1 é apresentada na SEQ ID NO: 238.
[0144] Uma "proteína de fusão" ou "proteína de fusão Fc de [enzima de ERT]", conforme usada neste documento, refere-se a uma proteína dimérica compreendendo um primeiro polipeptídeo Fc que está ligado (por exemplo, fundido) a uma enzima de ERT, uma variante da enzima de ERT ou um fragmento cataliticamente ativo desta (ou seja, um "polipeptídeo de fusão Fc de [ERT]"); e um segundo polipeptídeo Fc que forma um dímero Fc com o primeiro polipeptídeo Fc. O segundo polipeptídeo Fc também pode ser ligado (por exemplo, fundido) a uma enzima de ERT, uma variante da enzima de ERT ou um fragmento cataliticamente ativo desta. O primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc podem ser ligados à enzima de ERT, variante da enzima de ERT ou fragmento cataliticamente ativo desta por uma ligação peptídica ou por um ligante polipeptídico. O primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc pode ser um polipeptídeo Fc modificado que contém uma ou mais modificações que promovem sua heterodimerização no outro polipeptídeo Fc. O primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc pode ser um polipeptídeo Fc modificado que contém uma ou mais modificações que conferem ligação a um receptor de transferrina. O primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc pode ser um polipeptídeo Fc modificado que contém uma ou mais modificações que reduzem a função efetora. O primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc pode ser um polipeptídeo Fc modificado que contém uma ou mais modificações que prolongam a meia-vida do soro.
[0145] Um "polipeptídeo de fusão" ou "polipeptídeo de fusão Fc de [enzima de ERT]" conforme usado neste documento refere-se a um polipeptídeo Fc que está ligado (por exemplo, fundido) a uma enzima de ERT, uma variante da enzima de ERT ou um fragmento cataliticamente ativo desta. O polipeptídeo Fc pode ser ligado à enzima de ERT, variante da enzima de ERT ou fragmento cataliticamente ativo desta por uma ligação peptídica ou por um ligante polipeptídico. O polipeptídeo Fc pode ser um polipeptídeo Fc modificado que contém uma ou mais modificações que promovem sua heterodimerização para outro polipeptídeo Fc. O polipeptídeo Fc pode ser um polipeptídeo Fc modificado que contém uma ou mais modificações que conferem ligação a um receptor de transferrina. O polipeptídeo Fc pode ser um polipeptídeo Fc modificado que contém uma ou mais modificações que reduzem a função efetora. O polipeptídeo Fc pode ser um polipeptídeo Fc modificado que contém uma ou mais modificações que prolongam a meia-vida do soro.
[0146] Conforme usado neste documento, o termo "polipeptídeo Fc" refere-se à região de terminal C de um polipeptídeo de cadeia pesada de imunoglobulina de ocorrência natural que é caracterizado por um enovelamento de Ig como um domínio estrutural. Um polipeptídeo Fc contém sequências de regiões constantes, incluindo pelo menos o domínio CH2 e/ou o domínio CH3 e pode conter pelo menos parte da região de dobradiça. Em geral, um polipeptídeo
Fc não contém uma região variável.
[0147] Um "polipeptídeo Fc modificado" refere-se a um polipeptídeo Fc que possui pelo menos uma mutação, por exemplo, uma substituição, deleção ou inserção, em comparação com uma sequência de polipeptídeo Fc de cadeia pesada de imunoglobulina do tipo selvagem, mas mantém o enovelamento ou estrutura geral de Ig do polipeptídeo Fc nativo.
[0148] O termo "FcRn" refere-se ao receptor Fc neonatal. A ligação dos polipeptídeos Fc à FcRn reduz a depuração e aumenta a meia-vida do soro do polipeptídeo Fc. A proteína FcRn humana é um heterodímero que é composto por uma proteína com tamanho de cerca de 50 kDa que é semelhante a uma proteína classe I de histocompatibilidade maior (MHC) e uma β2-microglobulina com tamanho de cerca de 15 kDa.
[0149] Conforme usado neste documento, um "sítio de ligação à FcRn" refere-se à região de um polipeptídeo Fc que se liga à FcRn. Na IgG humana, o sítio de ligação à FcRn, conforme numerado usando o índice EU, inclui T250, L251, M252, I253, S254, R255, T256, T307, E380, M428, H433, N434, H435 e Y436. Essas posições correspondem às posições 20 a 26, 77, 150, 198 e 203 a 206 da SEQ ID NO: 1.
[0150] Conforme usado neste documento, um "sítio de ligação à FcRn nativa" refere-se a uma região de um polipeptídeo Fc que se liga à FcRn e que possui a mesma sequência de aminoácidos que a região de um polipeptídeo Fc de ocorrência natural que se liga à FcRn.
[0151] Os termos "domínio CH3" e "domínio CH2", conforme usados neste documento, referem-se a polipeptídeos de domínio da região constante de imunoglobulina. Para os fins deste pedido, um polipeptídeo do domínio CH3 refere-se ao segmento de aminoácidos desde cerca da posição 341 a cerca da posição 447, conforme numerado de acordo com o esquema de numeração EU, e um polipeptídeo do domínio CH2 refere-se ao segmento de aminoácidos da posição 231 para a posição 340, conforme numerada de acordo com o esquema de numeração EU e não inclui sequências da região de dobradiça. Os polipeptídeos do domínio CH2 e CH3 também podem ser numerados pelo esquema de numeração IMGT (ImMunoGeneTics), no qual a numeração do domínio CH2 é 1-110 e a numeração do domínio CH3 é 1-107, de acordo com a numeração do gráfico da IMGT Scientific (site da IMGT). Os domínios CH2 e CH3 fazem parte da região Fc de uma imunoglobulina. Uma região Fc refere-se ao segmento de aminoácidos da posição 231 à cerca da posição 447, conforme numerada de acordo com o esquema de numeração EU, mas conforme usado neste documento, pode incluir pelo menos uma parte da região de dobradiça de um anticorpo. Uma sequência de região de dobradiça ilustrativa é a sequência de dobradiça de IgG1 humana EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 95).
[0152] Os termos "tipo selvagem", "nativo" e "ocorrência natural" em relação a um domínio CH3 ou CH2 são usados neste documento para se referir a um domínio que possui uma sequência que ocorre na natureza.
[0153] Conforme usado neste documento, o termo "mutante" em relação a um polipeptídeo mutante ou polinucleotídeo mutante é usado de forma intercambiável com "variante". Uma variante em relação a uma dada sequência de referência de domínio CH3 ou CH2 do tipo selvagem pode incluir variantes alélicas que ocorrem naturalmente. Um domínio CH3 ou CH2 de ocorrência "não natural" refere-se a um domínio variante ou mutante que não está presente em uma célula da natureza e é produzido por modificação genética, por exemplo, usando tecnologia de manipulação genética ou técnicas de mutagênese, de um polinucleotídeo ou polipeptídeo do domínio CH2 ou domínio CH3 nativo. Uma "variante" inclui qualquer domínio compreendendo pelo menos uma mutação de aminoácido em relação ao tipo selvagem. Mutações podem incluir substituições, inserções e deleções.
[0154] O termo "aminoácido" refere-se a aminoácidos de ocorrência natural e sintéticos, bem como a análogos de aminoácidos e miméticos de aminoácidos que funcionam de um modo semelhante aos aminoácidos de ocorrência natural.
[0155] Aminoácidos de ocorrência natural são aqueles codificados pelo código genético, bem como os aminoácidos que são posteriormente modificados, por exemplo, hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato e O-fosfoserina.
"Análogos dos aminoácidos" referem-se aos compostos que possuem a mesma estrutura química básica que um aminoácido de ocorrência natural, ou seja, um carbono α que está ligado a um hidrogênio, um grupo carboxil, um grupo amina e um grupo R, por exemplo, homosserina, norleucina, metionina sulfóxido, metil- metionina-sulfônio. Tais análogos têm grupos R modificados (por exemplo, norleucina) ou estruturas principais peptídicas modificadas, mas mantêm a mesma estrutura química básica que um aminoácido de ocorrência natural.
"Miméticos de aminoácido" referem-se a compostos químicos que têm uma estrutura que é diferente da estrutura química geral de um aminoácido, mas que funcionam de forma semelhante a um aminoácido de ocorrência natural.
[0156] Os α-aminoácidos de ocorrência natural incluem, sem limitação, alanina (Ala), cisteína (Cys), ácido aspártico (Asp), ácido glutâmico (Glu), fenilalanina (Phe), glicina (Gly), histidina (His), isoleucina (Ile), arginina (Arg), lisina (Lys), leucina (Leu), metionina (Met), asparagina (Asn), prolina (Pro), glutamina (Gln), serina (Ser), treonina (Thr), valina (Val), triptofano (Trp), tirosina (Tyr) e combinações destes. Os estereoisômeros de um α-aminoácido de ocorrência natural incluem, sem limitação, D-alanina (D-Ala), D-cisteína (D-Cys), ácido D-aspártico (D-Asp), ácido D-glutâmico (D-Glu), D-fenilalanina (D-Phe), D- histidina (D-His), D-isoleucina (D-Ile), D-arginina (D-Arg), D-lisina (D-Lys), D- leucina (D-Leu), D-metionina (D-Met), D-asparagina (D-Asn), D-prolina (D-Pro), D-glutamina (D-Gln), D-serina (D-Ser), D-treonina (D-Thr), D-valina (D-Val), D-
triptofano (D-Trp), D-tirosina (D-Tyr) e combinações destes.
[0157] Os aminoácidos podem ser referidos neste documento pelos seus símbolos de três letras comumente conhecidos ou pelos símbolos de uma letra recomendados pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica IUPAC- IUB.
[0158] Os termos "polipeptídeo" e "peptídeo" são usados de forma intercambiável neste documento para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos em uma única cadeia. Os termos se aplicam a polímeros de aminoácidos, no qual um ou mais resíduos de aminoácidos é um mimético químico artificial de um aminoácido de ocorrência natural correspondente, bem como para polímeros de aminoácidos de ocorrência natural e polímeros de aminoácidos de ocorrência não natural. Os polímeros de aminoácidos podem compreender inteiramente L-aminoácidos, inteiramente D-aminoácidos ou uma mistura de L e D aminoácidos.
[0159] O termo "proteína", conforme usado neste documento, refere-se a um polipeptídeo ou um dímero (isto é, dois) ou multímero (isto é, três ou mais) de polipeptídeos de cadeia única. Os polipeptídeos de cadeia única de uma proteína podem ser unidos por uma ligação covalente, por exemplo, uma ligação de dissulfeto ou interações não covalentes.
[0160] O termo "substituição conservadora", "mutação conservadora" ou "variante conservadoramente modificada" refere-se a uma alteração que resulta na substituição de um aminoácido por outro aminoácido que pode ser classificado como tendo uma característica semelhante. Exemplos de categorias de grupos de aminoácidos conservadores definidos dessa maneira podem incluir: um "grupo polar/carregado" incluindo Glu (ácido glutâmico ou E), Asp (ácido aspártico ou D), Asn (asparagina ou N), Gln (glutamina ou Q), Lys (lisina ou K), Arg (arginina ou R) e His (histidina ou H); um "grupo aromático" incluindo Phe (fenilalanina ou F), Tyr (tirosina ou Y), Trp (triptofano ou W) e
(histidina ou H); e um "grupo alifático", incluindo Gly (Glicina ou G), Ala (Alanina ou A), Val (Valina ou V), Leu (Leucina ou L), Ile (Isoleucina ou I), Met (Metionina ou M), Ser (Serina ou S), Thr (Treonina ou T) e Cys (Cisteína ou C). Dentro de cada grupo, os subgrupos também podem ser identificados. Por exemplo, o grupo de aminoácidos carregados ou polares pode ser subdivididos em subgrupos, incluindo: um "subgrupo carregado positivamente" compreendendo Lys, Arg e His; um "subgrupo carregado negativamente" compreendendo Glu e Asp; e um "subgrupo polar" compreendendo Asn e Gln. Em outro exemplo, o grupo aromático ou cíclico pode ser subdividido em subgrupos, incluindo: um "subgrupo anel de nitrogênio" compreendendo Pro, His e Trp; e um "subgrupo fenil" compreendendo Phe e Tyr. Em outro exemplo adicional, o grupo alifático pode ser subdividido em subgrupos, por exemplo, um "subgrupo alifático não polar" compreendendo Val, Leu, Gly e Ala; e um "subgrupo alifático levemente polar" compreendendo Met, Ser, Thr e Cys. Exemplos de categorias de mutações conservadoras incluem substituições de aminoácidos de aminoácidos dentro dos subgrupos acima, tais como, mas não limitados a: Lys para Arg ou vice-versa, de modo que uma carga positiva possa ser mantida; Glu para Asp ou vice-versa, de modo que uma carga negativa possa ser mantida; Ser para Thr ou vice-versa, de modo que um -OH livre possa ser mantido; e Gln para Asn ou vice-versa, de modo que um -NH2 livre possa ser mantido. Em algumas modalidades, os aminoácidos hidrofóbicos são substituídos por aminoácidos hidrofóbicos que ocorrem naturalmente, por exemplo, no sítio ativo, para preservar a hidrofobicidade.
[0161] Os termos "idêntico" ou "identidade" porcento, no contexto de duas ou mais sequências de polipeptídeo, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências iguais ou com uma porcentagem especificada de resíduos de aminoácidos, por exemplo, pelo menos 60% de identidade, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos
85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% ou mais, que são idênticas em uma região especificada quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima em uma janela de comparação ou região designada, medida usando um algoritmo de comparação de sequência ou por alinhamento manual e inspeção visual.
[0162] Para comparação de sequências de polipeptídeos, tipicamente uma sequência de aminoácidos atua como uma sequência de referência, à qual uma sequência candidata é comparada. O alinhamento pode ser realizado usando vários métodos disponíveis para aquele versado na técnica, por exemplo, alinhamento visual ou usando software disponível ao público usando algoritmos conhecidos para alcançar o alinhamento máximo. Esses programas incluem os programas BLAST, ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, Califórnia) ou Megalign (DNASTAR). Os parâmetros empregados para um alinhamento para alcançar o alinhamento máximo podem ser determinados por aquele versado na técnica. Para comparação de sequências de sequências de polipeptídeos para os propósitos deste pedido, é utilizada a proteína BLAST padrão de BLASTP, para alinhar a sequência de duas proteínas com os parâmetros padrão.
[0163] Os termos "correspondentes a", "determinados com referência a" ou "numerados com referência a" quando utilizados no contexto da identificação de um determinado resíduo de aminoácido em uma sequência de polipeptídeos, referem-se à posição do resíduo de uma sequência de referência especificada quando a sequência de aminoácidos fornecida está alinhada ao máximo e comparada com a sequência de referência. Assim, por exemplo, um resíduo de aminoácido em um polipeptídeo Fc modificado "corresponde a" um aminoácido na SEQ ID NO: 1, quando o resíduo se alinha ao aminoácido na SEQ ID NO: 1 quando otimamente alinhado com a SEQ ID NO: 1. O polipeptídeo que está alinhado com a sequência de referência não precisa ter o mesmo comprimento que a sequência de referência.
[0164] Uma "afinidade de ligação", conforme usada neste documento, refere-se à força da interação não covalente entre duas moléculas, por exemplo, um único sítio de ligação em um polipeptídeo e um alvo, por exemplo, receptor de transferrina, ao qual se liga. Assim, por exemplo, o termo pode se referir a interações 1:1 entre um polipeptídeo e seu alvo, a menos que indicado de outra forma ou claro a partir do contexto. A afinidade de ligação pode ser quantificada medindo-se uma constante de dissociação de equilíbrio (KD), que se refere à constante da taxa de dissociação (kd, tempo-1) dividida pela constante da taxa de associação (ka, tempo-1 M-1). A KD pode ser determinada pela medição da cinética da formação e dissociação de complexos, por exemplo, usando métodos de Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR), por exemplo, um sistema Biacore™; ensaios de exclusão cinética como KinExA ®; e interferometria BioLayer (por exemplo, usando a plataforma ForteBio® Octet®).
Conforme usado neste documento, "afinidade de ligação" inclui não apenas afinidades formais de ligação, como aquelas que refletem interações 1:1 entre um polipeptídeo e seu alvo, mas também afinidades aparentes para as quais são calculadas KDs que podem refletir uma ligação ávida.
[0165] Conforme usado neste documento, o termo "liga-se especificamente" ou "liga-se seletivamente" a um alvo, por exemplo TfR, ao se referir a um polipeptídeo de ligação a TfR manipulado, peptídeo de ligação a TfR ou anticorpo de ligação a TfR, conforme descrito neste documento, refere-se a uma reação de ligação em que o polipeptídeo de ligação a TfR manipulado, peptídeo de ligação a TfR ou anticorpo de ligação a TfR se liga ao alvo com maior afinidade, maior avidez e/ou maior duração do que se liga a um alvo estruturalmente diferente. Em modalidades típicas, o polipeptídeo de ligação a TfR manipulado, peptídeo de ligação a TfR ou anticorpo de ligação a TfR tem pelo menos 5 vezes, 10 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 1.000 vezes, 10.000 vezes ou mais afinidade para um alvo específico, por exemplo, TfR, em comparação com um alvo não relacionado quando analisado nas mesmas condições de ensaio de afinidade. O termo "ligação específica", "liga-se especificamente a" ou "é específico para" um alvo em particular (por exemplo, TfR), conforme usado neste documento, pode ser exibido, por exemplo, por uma molécula com uma constante de dissociação de equilíbrio KD para o alvo ao qual se liga, por exemplo, 10-4 M ou menor, por exemplo, 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, or 10-12 M. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de ligação a TfR manipulado, peptídeo de ligação a TfR ou anticorpo de ligação a TfR se liga especificamente a um epítopo em TfR que é conservado entre as espécies (por exemplo, estruturalmente conservado entre as espécies), por exemplo, conservado entre primatas não humanos e espécies humanas (por exemplo, conservado estruturalmente entre primatas não humanos e espécies humanas). Em algumas modalidades, um polipeptídeo de ligação a TfR manipulado, peptídeo de ligação a TfR ou anticorpo de ligação a TfR pode se ligar exclusivamente a um TfR humano.
[0166] O termo "região variável" ou "domínio variável" refere-se a um domínio em uma cadeia pesada ou cadeia leve de anticorpo que deriva de um gene Variável (V) da linhagem germinativa, gene de Diversidade (D) ou gene de Junção (J) (e não derivado de um segmento de gene Constante (Cμ e Cδ)) e que dá a um anticorpo sua especificidade para a ligação a um antígeno.
Tipicamente, uma região variável de anticorpo compreende quatro regiões "framework" conservadas, intercaladas com três "regiões determinantes de complementaridade" hipervariáveis.
[0167] Os termos "porção de ligação ao antígeno" e "fragmento de ligação ao antígeno" são usados neste documento de forma intercambiável e se referem a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retém a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno por sua região variável. Exemplos de fragmentos de ligação ao antígeno incluem, mas não estão limitados a, um fragmento Fab (um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL e CH1), um fragmento F(ab')2 (um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de dobradiça), uma Fv de cadeia única (scFv), uma Fv ligada a dissulfeto (dsFv), regiões determinantes de complementaridade (CDRs), uma VL (região variável de cadeia leve) e uma VH (pesada região variável de cadeia pesada).
[0168] Os termos "tratamento" e "tratando" e similares são usados neste documento para geralmente significar a obtenção do efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado. “Tratar” ou “tratamento” pode se referir a qualquer indício de sucesso no tratamento ou melhoria de um distúrbio de armazenamento lisossômico, por exemplo, síndrome de Hunter, síndrome de Sanfilippo A, doença de Niemann-Pick, doença de Gaucher ou doença de Parkinson, incluindo qualquer objetivo ou parâmetro subjetivo, como redução, remissão, melhora na sobrevida do paciente, aumento no tempo ou na taxa de sobrevida, diminuição dos sintomas ou aumento da tolerância ao distúrbio, desaceleração da taxa de degeneração ou declínio ou melhoria do bem-estar físico ou mental do paciente.
O tratamento ou melhoria dos sintomas pode ser baseado em parâmetros objetivos ou subjetivos. O efeito do tratamento pode ser comparado a um indivíduo ou agrupamento de indivíduos que não receberam o tratamento, ou ao mesmo paciente antes do tratamento ou em um momento diferente durante o tratamento.
[0169] Os termos "sujeito", "indivíduo" e "paciente", conforme usados neste documento de forma intercambiável, referem-se a mamíferos, incluindo, mas não limitados a humanos, primatas não humanos, roedores (por exemplo, ratos, camundongos e porquinhos-da-índia), coelhos, vacas, porcos, cavalos e outras espécies de mamíferos. Em uma modalidade, o paciente é um humano.
[0170] O termo "excipiente farmaceuticamente aceitável" refere-se a um ingrediente farmacêutico não ativo que é biologicamente ou farmacologicamente compatível para uso em humanos ou animais, como, mas não se limitando a um tampão, carreador ou conservante.
[0171] Conforme usado neste documento, uma "quantidade terapêutica", "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "concentração terapeuticamente eficaz" de um agente é uma quantidade ou concentração do agente que trata sinais ou sintomas de uma doença (por exemplo, um LSD) no sujeito (por exemplo, mamífero).
[0172] O termo "administrar" refere-se a um método de distribuição de agentes, compostos ou composições ao sítio desejado de ação biológica.
Esses métodos incluem, mas não estão limitados a distribuição tópica, distribuição parenteral, distribuição intravenosa, distribuição intradérmica, distribuição intramuscular, distribuição intratecal, distribuição colônica, distribuição retal ou distribuição intraperitoneal. Numa modalidade, os polipeptídeos descritos neste documento são administrados por via intravenosa.
[0173] Os distúrbios do armazenamento lisossômico (LSDs) são doenças metabólicas hereditárias caracterizadas pelo acúmulo de macromoléculas não digeridas ou parcialmente digeridas, o que acaba resultando em disfunção celular e anormalidades clínicas. Classicamente, os LSDs foram definidos como deficiências na função lisossômica geralmente classificados pelo substrato acumulado e incluem esfingolipidoses, oligossacarídeos, mucolipidoses, mucopolissacaridoses, distúrbios de armazenamento de lipoproteínas, lipofuscinoses ceroides neuronais e outros. A classificação desses distúrbios foi recentemente ampliada para incluir outras deficiências ou defeitos nas proteínas que resultam no acúmulo de macromoléculas, como proteínas necessárias para a modificação pós-
traducional normal de enzimas lisossômicas ou proteínas importantes para o tráfego lisossômico adequado.
[0174] Em alguns aspectos, uma proteína de fusão descrita neste documento compreende: (i) um polipeptídeo Fc, que pode conter modificações (por exemplo, uma ou mais modificações que promovem heterodimerização) ou pode ser um polipeptídeo Fc do tipo selvagem; e uma enzima de ERT; e (ii) um polipeptídeo Fc, que pode conter modificações (por exemplo, uma ou mais modificações que promovem heterodimerização) ou pode ser um polipeptídeo Fc do tipo selvagem; e opcionalmente uma enzima de ERT. Em algumas modalidades, um ou ambos os polipeptídeos Fc podem conter modificações que resultam na ligação a um receptor de barreira hematoencefálica (BBB), por exemplo, um receptor de transferrina (TfR). A enzima de ERT pode ser qualquer enzima deficiente em um LSD. Uma enzima de ERT incorporada na proteína de fusão é cataliticamente ativa ou seja, retém a atividade enzimática deficiente no LSD. Em algumas modalidades, a enzima de ERT é a iduronato de 2-sulfatase (IDS), que é deficiente na síndrome de Hunter. Em algumas modalidades, a enzima de ERT é a N-sulfoglucosamina sulfohidrolase (SGSH), que é deficiente na síndrome de Sanfilippo. Em algumas modalidades, a enzima de ERT é a esfingomielinase ácida (ASM), que é deficiente na doença de Niemann-Pick. Em algumas modalidades, a enzima de ERT é a -glucocerebrosidase (GBA), que é deficiente na doença de Gaucher e na doença de Parkinson.
[0175] Em algumas modalidades, uma proteína de fusão compreendendo uma enzima de ERT e opcionalmente um polipeptídeo Fc modificado que se liga a um receptor BBB, por exemplo, um polipeptídeo Fc de ligação a TfR, compreende um fragmento ou variante cataliticamente ativo de uma IDS de tipo selvagem. Em algumas modalidades, a enzima IDS é uma variante ou um fragmento cataliticamente ativo de uma proteína IDS que compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS:
91, 92, 114, 230 e 234. Em algumas modalidades, uma variante ou fragmento cataliticamente ativo de uma enzima IDS tem pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou mais da atividade da enzima IDS de tipo selvagem.
[0176] Em algumas modalidades, uma proteína de fusão compreendendo uma enzima de ERT e opcionalmente um polipeptídeo Fc modificado que se liga a um receptor BBB, por exemplo, um polipeptídeo Fc de ligação a TfR, compreende um fragmento ou variante cataliticamente ativo de uma SGSH de tipo selvagem. Em algumas modalidades, a enzima SGSH é uma variante ou um fragmento cataliticamente ativo de uma proteína SGSH que compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 119 e 120. Em algumas modalidades, uma variante ou fragmento cataliticamente ativo de uma enzima SGSH tem pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou mais da atividade da enzima SGSH de tipo selvagem.
[0177] Em algumas modalidades, uma proteína de fusão compreendendo uma enzima de ERT e opcionalmente um polipeptídeo Fc modificado que se liga a um receptor BBB, por exemplo, um polipeptídeo Fc de ligação a TfR, compreende um fragmento ou variante cataliticamente ativo de uma ASM de tipo selvagem. Em algumas modalidades, a enzima ASM é uma variante ou um fragmento cataliticamente ativo de uma proteína ASM que compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 121, 122 e 123. Em algumas modalidades, uma variante ou fragmento cataliticamente ativo de uma enzima ASM tem pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou mais da atividade da enzima ASM de tipo selvagem.
[0178] Em algumas modalidades, uma proteína de fusão compreendendo uma enzima de ERT e opcionalmente um polipeptídeo Fc modificado que se liga a um receptor BBB, por exemplo, um polipeptídeo Fc de ligação a TfR, compreende um fragmento ou variante cataliticamente ativo de uma GBA de tipo selvagem. Em algumas modalidades, a enzima GBA é uma variante ou um fragmento cataliticamente ativo de uma proteína GBA que compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 93 e 94. Em algumas modalidades, uma variante ou fragmento cataliticamente ativo de uma enzima GBA tem pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou mais da atividade da enzima GBA de tipo selvagem.
[0179] Em algumas modalidades, uma enzima de ERT, por exemplo, IDS, SGSH, ASM ou GBA, ou uma variante ou fragmento cataliticamente ativo destas que está presente em uma proteína de fusão descrita neste documento, retém pelo menos 25% de sua atividade em comparação com sua atividade quando não está ligado a um polipeptídeo Fc ou um polipeptídeo Fc de ligação a TfR. Em algumas modalidades, uma enzima de ERT, ou uma variante ou fragmento cataliticamente ativo desta, retém pelo menos 10% ou pelo menos 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de sua atividade em comparação com a atividade quando não ligada a um polipeptídeo Fc ou um polipeptídeo Fc de ligação a TfR. Em algumas modalidades, uma enzima de ERT, ou uma variante ou fragmento cataliticamente ativo desta, retém pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% de sua atividade em comparação com sua atividade quando não associada a um polipeptídeo Fc ou um polipeptídeo Fc de ligação a TfR. Em algumas modalidades, a fusão com um polipeptídeo Fc não diminui a atividade da enzima de ERT, por exemplo, IDS, SGSH, ASM ou GBA, ou variante ou fragmento cataliticamente ativo desta. Em algumas modalidades, a fusão com um polipeptídeo Fc de ligação a TfR não diminui a atividade da enzima de ERT.
[0180] Em alguns aspectos, são fornecidas neste documento proteínas de fusão que são capazes de ser transportadas através da barreira hematoencefálica (BBB). Tal proteína compreende um polipeptídeo Fc modificado que se liga a um receptor BBB. Os receptores BBB são expressos nos endotélios da BBB, assim como em outros tipos de células e tecidos. Em algumas modalidades, o receptor BBB é receptor de transferrina (TfR).
[0181] Os resíduos de aminoácidos designados em várias modificações de Fc, incluindo aqueles introduzidos em um polipeptídeo Fc modificado que se liga a um receptor BBB, por exemplo, TfR, são numerados neste documento usando a numeração de índice EU. Qualquer polipeptídeo Fc, por exemplo, um polipeptídeo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 Fc, pode ter modificações, por exemplo, substituições de aminoácidos, em uma ou mais posições, conforme descrito neste documento.
[0182] Um polipeptídeo Fc modificado (por exemplo, aprimorando a heterodimerização e/ou a ligação ao receptor BBB) presente em uma proteína de fusão descrita neste documento pode ter pelo menos 70% de identidade, pelo menos 75% de identidade, pelo menos 80% de identidade, pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com uma sequência de região Fc nativa ou um fragmento desta, por exemplo, um fragmento de pelo menos 50 aminoácidos ou pelo menos 100 aminoácidos ou maior de comprimento. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos Fc nativa é a sequência da região Fc da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado tem pelo menos 70% de identidade,
pelo menos 75% de identidade, pelo menos 80% de identidade, pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com os aminoácidos 1- 110 da SEQ ID NO: 1, ou aos aminoácidos 111-217 da SEQ ID NO: 1, ou um fragmento deste, por exemplo, um fragmento de pelo menos 50 aminoácidos ou pelo menos 100 aminoácidos ou maior de comprimento.
[0183] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado (por exemplo, aprimorando a heterodimerização e/ou a ligação ao receptor BBB) compreende pelo menos 50 aminoácidos, ou pelo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ou 95 ou mais, ou pelo menos 100 aminoácidos, ou mais, que correspondem a uma sequência de aminoácidos de região Fc nativa. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende pelo menos 25 aminoácidos contíguos, ou pelo menos 30, 35, 40 ou 45 aminoácidos contíguos, ou 50 aminoácidos contíguos, ou pelo menos 60, 65, 70, 75, 80 85, 90 ou 95 ou mais aminoácidos contíguos, ou 100 ou mais aminoácidos contíguos, que correspondem a uma sequência de aminoácidos de região Fc nativa, tal como SEQ ID NO: 1.
[0184] Em algumas modalidades, o domínio que é modificado para a atividade de ligação ao receptor BBB é um domínio Ig CH3 humano, tal como um domínio IgG1 CH3. O domínio CH3 pode ser de qualquer subtipo de IgG, ou seja, de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. No contexto de anticorpos IgG1, um domínio CH3 refere-se ao segmento de aminoácidos a partir da posição 341 à posição 447, conforme numerada de acordo com o esquema de numeração EU.
[0185] Em algumas modalidades, o domínio que é modificado para a atividade de ligação ao receptor BBB é um domínio Ig CH2 humano, tal como um domínio IgG CH2. O domínio CH2 pode ser de qualquer subtipo de IgG, ou seja, de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. No contexto de anticorpos IgG1, um domínio CH2 refere-se ao segmento de aminoácidos da posição 231 à posição 340,
conforme numerada de acordo com o esquema de numeração EU.
[0186] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado (por exemplo, ligação ao receptor BBB) presente em uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma, duas ou três substituições; e, em algumas modalidades, pelo menos quatro cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições nas posições de aminoácidos compreendendo 266, 267, 268, 269, 270, 271, 295, 297, 298 e 299, de acordo com o esquema de numeração EU.
[0187] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado (por exemplo, ligação ao receptor BBB) presente em uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma, duas ou três substituições; e em algumas modalidades, pelo menos quatro, cinco, seis, sete, oito ou nove substituições nas posições de aminoácidos compreendendo 274, 276, 283, 285, 286, 287, 288, 289 e 290, de acordo com o esquema de numeração EU.
[0188] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado (por exemplo, ligação ao receptor BBB) presente em uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma, duas ou três substituições; e em algumas modalidades, pelo menos quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições nas posições de aminoácidos compreendendo 268, 269, 270, 271, 272, 292, 293, 294, 296 e 300, de acordo com o esquema de numeração EU.
[0189] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado (por exemplo, ligação ao receptor BBB) presente em uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma, duas ou três substituições; e em algumas modalidades, pelo menos quatro, cinco, seis, sete, oito ou nove substituições nas posições de aminoácidos compreendendo 272, 274, 276, 322, 324, 326, 329, 330 e 331, de acordo com o esquema de numeração EU.
[0190] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado (por exemplo, ligação ao receptor BBB) presente em uma proteína de fusão compreende pelo menos uma, duas ou três substituições; e em algumas modalidades, pelo menos quatro, cinco, seis ou sete substituições em posições de aminoácidos compreendendo 345, 346, 347, 349, 437, 438, 439 e 440, de acordo com o esquema de numeração EU.
[0191] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado (por exemplo, ligação ao receptor BBB) presente em uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma, duas ou três substituições; e em algumas modalidades, pelo menos quatro, cinco, seis, sete, oito ou nove substituições nas posições de aminoácidos 384, 386, 387, 388, 389, 390, 413, 416 e 421, de acordo com o esquema de numeração EU. Sítios de Ligação a FcRn
[0192] Em certos aspectos, os polipeptídeos Fc modificados (por exemplo, ligação ao receptor BBB) ou polipeptídeos Fc presentes em uma proteína de fusão descrita neste documento que não se ligam especificamente a um receptor BBB, também podem compreender um sítio de ligação a FcRn.
Em algumas modalidades, o sítio de ligação a FcRn está dentro do polipeptídeo Fc ou um fragmento deste.
[0193] Em algumas modalidades, o sítio de ligação a FcRn compreende um sítio de ligação a FcRn nativo. Em algumas modalidades, o sítio de ligação a FcRn não compreende alterações de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos de um sítio de ligação a FcRn nativo. Em algumas modalidades, o sítio de ligação a FcRn nativo é um sítio de ligação a IgG, por exemplo, um sítio de ligação a IgG humana. Em algumas modalidades, o sítio de ligação a FcRn compreende uma modificação que altera a ligação a FcRn.
[0194] Em algumas modalidades, um sítio de ligação a FcRn tem um ou mais resíduos de aminoácidos que são mutados, por exemplo, substituídos, em que as mutações aumentam a meia-vida do soro ou não reduzem substancialmente a meia-vida do soro (ou seja, reduzem a meia-vida do soro não mais do que 25% em comparação com um polipeptídeo Fc modificado em contrapartida com os resíduos do tipo selvagem nas posições mutadas quando analisados nas mesmas condições). Em algumas modalidades, um sítio de ligação a FcRn tem um ou mais resíduos de aminoácidos que são substituídos nas posições 250-256, 307, 380, 428 e 433-436, de acordo com o esquema de numeração EU.
[0195] Em algumas modalidades, um ou mais resíduos em um sítios de ligação a FcRn são mutados, em relação a uma sequência de IgG humana nativa, para prolongar a meia-vida do soro do polipeptídeo modificado.
Em algumas modalidades, as mutações são introduzidas em uma, duas ou três das posições 252, 254 e 256. Em algumas modalidades, as mutações são M252Y, S254T e T256E. Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado compreende adicionalmente as mutações M252Y, S254T e T256E.
Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado compreende uma substituição em uma, duas ou todas as três posições T307, E380 e N434, de acordo com o esquema de numeração EU. Em algumas modalidades, as mutações são T307Q e N434A. Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado compreende as mutações T307A, E380A e N434A. Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado compreende substituições nas posições T250 e M428, de acordo com o esquema de numeração EU. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende mutações T250Q e/ou M428L. Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado compreende mutações nas posições M428 e N434, de acordo com o esquema de numeração EU. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende as mutações M428L e N434S. Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado compreende uma mutação N434S ou N434A.
[0196] Esta seção descreve a geração de polipeptídeos Fc modificados descritos neste documento que se ligam ao receptor de transferrina
(TfR) e são capazes de serem transportados através da barreira hematoencefálica (BBB).
Polipeptídeos Fc de ligação a TfR compreendendo mutações no domínio CH3
[0197] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a TfR compreende substituições em um domínio CH3. Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado compreende um domínio CH3 de Ig humana, como um domínio CH3 de IgG, que é modificado para a atividade de ligação a TfR. O domínio CH3 pode ser de qualquer subtipo de IgG, ou seja, de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. No contexto de anticorpos IgG, um domínio CH3 refere-se ao segmento de aminoácidos a partir da posição 341 à posição 447, conforme numerada de acordo com o esquema de numeração EU.
[0198] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a TfR se liga ao domínio apical de TfR e pode se ligar a TfR sem bloquear ou inibir a ligação de transferrina a TfR. Em algumas modalidades, a ligação de transferrina a TfR não é substancialmente inibida. Em algumas modalidades, a ligação de transferrina a TfR é inibida em menos de cerca de 50% (por exemplo, menos de cerca de 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% ou 5%). Em algumas modalidades, a ligação de transferrina a TfR é inibida em menos de cerca de 20% (por exemplo, menos de cerca de 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1%).
[0199] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a TfR compreende pelo menos duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou nove substituições nas posições 384, 386, 387, 388, 389, 390, 413, 416 e 421, de acordo com o esquema de numeração EU.
Substituições ilustrativas que podem ser introduzidas nessas posições são mostradas nas Tabelas 4 e 5. Em algumas modalidades, o aminoácido na posição 388 e/ou 421 é um aminoácido aromático, por exemplo, Trp, Phe ou Tyr.
Em algumas modalidades, o aminoácido na posição 388 é Trp. Em algumas modalidades, o aminoácido aromático na posição 421 é Trp ou Phe.
[0200] Em algumas modalidades, pelo menos uma posição como a seguir é substituída: Leu, Tyr, Met ou Val na posição 384; Leu, Thr, His ou Pro na posição 386; Val, Pro ou um aminoácido ácido na posição 387; um aminoácido aromático, por exemplo, Trp na posição 388; Val, Ser ou Ala na posição 389; um aminoácido ácido, Ala, Ser, Leu, Thr ou Pro na posição 413; Thr ou um aminoácido ácido na posição 416; ou Trp, Tyr, His ou Phe na posição
421. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado pode compreender uma substituição conservativa, por exemplo, um aminoácido no mesmo agrupamento de carga, agrupamento de hidrofobicidade, agrupamento de estrutura de anel de cadeia lateral (por exemplo, aminoácidos aromáticos) ou agrupamento de tamanho e/ou polar ou agrupamento não polar, de um aminoácido especificado em uma ou mais das posições no conjunto. Portanto, por exemplo, Ile pode estar presente nas posições 384, 386 e/ou posição 413.
Em algumas modalidades, o aminoácido ácido na posição um, dois ou cada uma das posições 387, 413 e 416 é Glu. Em outras modalidades, o aminoácido ácido em uma, duas ou em cada uma das posições 387, 413 e 416 é Asp. Em algumas modalidades, duas, três, quatro, cinco, seis, sete ou todas as oito posições 384, 386, 387, 388, 389, 413, 416 e 421 têm uma substituição de aminoácidos conforme especificado neste parágrafo.
[0201] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc que é modificado conforme descrito nos dois parágrafos anteriores compreende um Asn nativo na posição 390. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende Gly, His, Gln, Leu, Lys, Val, Phe, Ser, Ala ou Asp na posição 390. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende adicionalmente uma, duas, três ou quatro substituições em posições compreendendo 380, 391, 392 e 415, de acordo com o esquema de numeração EU. Em algumas modalidades, Trp, Tyr, Leu ou Gln podem estar presentes na posição 380. Em algumas modalidades, Ser, Thr, Gln ou Phe podem estar presentes na posição 391. Em algumas modalidades, Gln, Phe ou His podem estar presentes na posição 392. Em algumas modalidades, Glu pode estar presente na posição 415.
[0202] Em certas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou onze posições seleccionadas dentre os seguintes: Trp, Leu ou Glu na posição 380; Tyr ou Phe na posição 384; Thr na posição 386; Glu na posição 387; Trp na posição 388; Ser, Ala, Val ou Asn na posição 389; Ser ou Asn na posição 390; Thr ou Ser na posição 413; Glu ou Ser na posição 415; Glu na posição 416; e/ou Phe na posição 421. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende todas as onze posições como se segue: Trp, Leu ou Glu na posição 380; Tyr ou Phe na posição 384; Thr na posição 386; Glu na posição 387; Trp na posição 388; Ser, Ala, Val ou Asn na posição 389; Ser ou Asn na posição 390; Thr ou Ser na posição 413; Glu ou Ser na posição 415; Glu na posição 416; e/ou Phe na posição 421.
[0203] Em certas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende Leu ou Met na posição 384; Leu, His ou Pro na posição 386; Val na posição 387; Trp na posição 388; Val ou Ala na posição 389; Pro na posição 413; Thr na posição 416; e/ou Trp na posição 421. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende adicionalmente Ser, Thr, Gln ou Phe na posição 391. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende adicionalmente Trp, Tyr, Leu ou Gln na posição 380 e/ou Gln, Phe ou His na posição 392. Em algumas modalidades, o Trp está presente na posição 380 e/ou o Gln está presente na posição 392. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado não tem um Trp na posição 380.
[0204] Em outras modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende Tyr na posição 384; Thr na posição 386; Glu ou Val e posição 387; Trp na posição 388; Ser na posição 389; Ser ou Thr na posição 413; Glu na posição 416; e/ou Phe na posição 421. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende um Asn nativo na posição 390. Em certas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende adicionalmente Trp, Tyr, Leu ou Gln na posição 380; e/ou Glu na posição 415. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende adicionalmente Trp na posição 380 e/ou Glu na posição 415.
[0205] Em modalidades adicionais, o polipeptídeo Fc modificado compreende adicionalmente uma, duas ou três substituições nas posições compreendendo 414, 424 e 426, de acordo com o esquema de numeração EU.
Em algumas modalidades, a posição 414 é Lys, Arg, Gly ou Pro; a posição 424 é Ser, Thr, Glu ou Lys; e/ou a posição 426 é Ser, Trp ou Gly.
[0206] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende uma ou mais das seguintes substituições: Trp na posição 380; Thr na posição 386; Trp na posição 388; Val na posição 389; Thr ou Ser na posição 413; Glu na posição 415; e/ou Phe na posição 421, de acordo com o esquema de numeração EU.
[0207] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado tem pelo menos 70% de identidade, pelo menos 75% de identidade, pelo menos 80% de identidade, pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com os aminoácidos 111-217 de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS: 4-90, 97-100 e 105-108 (por exemplo, SEQ ID NOS: 34-38, 58 e 60-90). Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado tem pelo menos 70% de identidade, pelo menos 75% de identidade, pelo menos 80% de identidade, pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90%
de identidade ou pelo menos 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 4-90, 97-100 e 105-108 (por exemplo, SEQ ID NOS: 34-38, 58 e 60-90).
Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende os aminoácidos nas posições de índice EU 384-390 e/ou 413-421 de qualquer uma das SEQ ID NOS: 4-90, 97-100 e 105-108 (por exemplo, SEQ ID NOS: 34-38, 58 e 60-90). Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende os aminoácidos nas posições de índice EU 380-390 e/ou 413-421 de qualquer uma das 4-90, 97-100 e 105-108 (por exemplo, SEQ ID NOS: 34- 38, 58 e 60-90). Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende os aminoácidos nas posições de índice EU 380-392 e/ou 413-426 de qualquer uma das SEQ ID NOS: 4-90, 97-100 e 105-108 (por exemplo, SEQ ID NOS: 34-38, 58 e 60-90).
[0208] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado tem pelo menos 75% de identidade, pelo menos 80% de identidade, pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 4-90, 97-100 e 105-108 (por exemplo, SEQ ID NOS: 34-38, 58 e 60-90) e compreende ainda pelo menos cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze ou dezesseis das posições, numeradas de acordo com o índice EU, como segue: Trp, Tyr, Leu, Gln ou Glu na posição 380; Leu, Tyr, Met ou Val na posição 384; Leu, Thr, His ou Pro na posição 386; Val, Pro ou um aminoácido ácido na posição 387; um aminoácido aromático, por exemplo, Trp, na posição 388; Val, Ser ou Ala na posição 389; Ser ou Asn na posição 390; Ser, Thr, Gln ou Phe na posição 391; Gln, Phe ou His na posição 392; um aminoácido ácido, Ala, Ser, Leu, Thr ou Pro na posição 413; Lys, Arg, Gly ou Pro na posição 414; Glu ou Ser na posição 415; Thr ou um aminoácido ácido na posição 416; Trp, Tyr, His ou Phe na posição 421; Ser, Thr, Glu ou Lys na posição 424; e Ser, Trp ou Gly na posição 426.
[0209] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende a sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS: 34-38, 58 e 60-90. Em outras modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende a sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS: 34-38, 58 e 60-90, mas na qual um, dois ou três aminoácidos são substituídos.
[0210] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende mutações adicionais, como as mutações descritas na Seção VI abaixo, incluindo, mas não se limitando a, uma mutação knob (por exemplo, T366W como numerada com referência à numeração EU), mutações hole (por exemplo, T366S, L368A e Y407V conforme numerado com referência à numeração EU), mutações que modulam a função efetora (por exemplo, L234A, L235A e/ou P329G (por exemplo, L234A e L235A) como numeradas com referência à numeração EU) e/ou mutações que aumentam a estabilidade do soro ou meia-vida do soro (por exemplo, (i) M252Y, S254T e T256E conforme numerado com referência à numeração EU ou (ii) N434S com ou sem M428L e numerado de acordo com a numeração EU). A título ilustrativo, as SEQ ID NOS: 156-229 fornecem exemplos não limitativos de polipeptídeos Fc modificados com mutações no domínio CH3 (por exemplo, clona CH3C.35.20.1, CH3C.35.23.2, CH3C.35.23.3, CH3C.35.23.4, CH3C.35.21.17.2 e CH3C.35.23) compreendendo uma ou mais dessas mutações adicionais.
[0211] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende uma mutação knob (por exemplo, T366W conforme numerado com referência à numeração EU) e tem pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com a sequência de qualquer uma da SEQ ID NOS: 156, 168, 180, 192, 204 e 216. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 156, 168, 180, 192, 204 e 216.
[0212] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende uma mutação knob (por exemplo, T366W conforme numerada com referência à numeração EU) e mutações que modulam a função efetora (por exemplo, L234A, L235A e/ou P329G (por exemplo, L234A e L235A) conforme numeradas com referência à numeração EU) e tem pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com a sequência de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS: 157, 158, 169, 170, 181, 182, 193, 194, 205, 206, 217, 218, 228 e 229. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 157, 158, 169, 170, 181, 182, 193, 194, 205, 206, 217 e 218.
[0213] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende uma mutação knob (por exemplo, T366W conforme numerada com referência à numeração EU) e mutações que aumentam a estabilidade do soro ou a meia-vida do soro (por exemplo, (i) M252Y, S254T e T256E conforme numeradas com referência à numeração EU, ou (ii) N434S com ou sem M428L, conforme numeradas de acordo com o esquema de numeração EU) e possui pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade para a sequência de qualquer um da SEQ ID NOS: 159, 171, 183, 195, 207 e 219. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 159, 171, 183, 195, 207 e 219.
[0214] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende uma mutação knob (por exemplo, T366W conforme numerada com referência à numeração EU), mutações que modulam a função efetora (por exemplo, L234A, L235A e/ou P329G (por exemplo, L234A e L235A) conforme numeradas com referência à numeração EU) e mutações que aumentam a estabilidade do soro ou a meia-vida do soro (por exemplo, (i) M252Y, S254T e T256E conforme numeradas com referência à numeração EU ou (ii) N434S com ou sem M428L conforme numeradas de acordo com o esquema de numeração EU) e tem pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 160, 161, 172, 173, 184, 185, 196, 197, 208, 209, 220 e 221. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 160, 161, 172, 173, 184, 185, 196, 197, 208, 209, 220 e 221.
[0215] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende mutações hole (por exemplo, T366S, L368A e Y407V, conforme numeradas com referência à numeração EU) e tem pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade para o sequência de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS: 162, 174, 186, 198, 210 e 222. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 162, 174, 186, 198, 210 e 222.
[0216] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende mutações hole (por exemplo, T366S, L368A e Y407V conforme numeradas com referência à numeração EU) e mutações que modulam a função efetora (por exemplo, L234A, L235A e/ou P329G (por exemplo, L234A e L235A), conforme numeradas com referência à numeração EU) e tem pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com a sequência de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS: 163, 164, 175, 176, 187, 188, 199, 200, 211, 212, 223 e 224. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 163, 164, 175, 176, 187, 188, 199, 200, 211, 212, 223 e 224.
[0217] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende mutações hole (por exemplo, T366S, L368A e Y407V, conforme numeradas com referência à numeração EU) e mutações que aumentam a estabilidade do soro ou a meia-vida do soro (por exemplo, (i) M252Y, S254T e T256E, conforme numeradas com referência à numeração EU, ou (ii) N434S com ou sem M428L, conforme numeradas de acordo com o esquema de numeração EU) e possua pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade para a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 165, 177, 189, 201, 213 e 225. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 165, 177, 189, 201, 213 e 225.
[0218] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende mutações hole (por exemplo, T366S, L368A e Y407V conforme numeradas com referência à numeração EU), mutações que modulam a função efetora (por exemplo, L234A, L235A e/ou P329G (por exemplo, L234A e L235A) conforme numerado com referência à numeração EU) e mutações que aumentam a estabilidade do soro ou a meia-vida do soro (por exemplo, (i) M252Y, S254T e T256E conforme numeradas com referência à numeração EU ou (ii) N434S com ou sem M428L, conforme numeradas de acordo com o esquema de numeração EU) e possui pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 166, 167, 178, 179, 190, 191, 202, 203, 214, 215, 226 e 227. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 166, 167, 178, 179, 190, 191, 202, 203, 214, 215, 226 e 227.
[0219] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a TfR compreende pelo menos duas, três, quatro, cinco, seis, sete ou oito substituições nas posições 345, 346, 347, 349, 437, 438, 439 e 440, de acordo com o esquema de numeração EU. Os polipeptídeos Fc modificados ilustrativos são fornecidos na SEQ ID NOS: 124-128. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende Gly na posição 437; Phe na posição 438; e/ou Asp na posição 440. Em algumas modalidades, Glu está presente na posição 440. Em certas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende pelo menos uma substituição em uma posição como se segue: Phe ou Ile na posição 345; Asp, Glu, Gly, Ala ou Lys na posição 346; Tyr, Met, Leu, Ile ou Asp na posição 347; Thr ou Ala na posição 349; Gly na posição 437; Phe na posição 438; Seu Tyr, Ser ou Phe na posição 439; ou Asp na posição 440.
Em algumas modalidades, duas, três, quatro, cinco, seis, sete ou todas as oito posições 345, 346, 347, 349, 437, 438, 439 e 440 e têm uma substituição conforme especificado neste parágrafo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado pode compreender uma substituição conservativa, por exemplo, um aminoácido no mesmo agrupamento de carga, agrupamento de hidrofobicidade, agrupamento de estrutura de anel de cadeia lateral (por exemplo, aminoácidos aromáticos) ou agrupamento de tamanho e/ou polar ou agrupamento não polar, de um aminoácido especificado em uma ou mais das posições no conjunto.
[0220] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado tem pelo menos 70% de identidade, pelo menos 75% de identidade, pelo menos 80% de identidade, pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com os aminoácidos 111- 217 de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS: 124-128. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado tem pelo menos 70% de identidade, pelo menos 75% de identidade, pelo menos 80% de identidade, pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NOS: 124-128. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende a sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS: 124-128. Em outras modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende a sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS: 124-128, mas na qual um, dois ou três aminoácidos são substituídos.
Polipeptídeos Fc de ligação a TfR compreendendo mutações no domínio CH2
[0221] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a TfR compreende substituições em um domínio CH2. Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado compreende um domínio Ig CH2 humano, como um domínio IgG CH2, que é modificado para a atividade de ligação a TfR. O domínio CH2 pode ser de qualquer subtipo de IgG, ou seja, de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. No contexto de anticorpos IgG, um domínio CH2 refere-se ao segmento de aminoácidos da posição 231 à posição 340, conforme numerada de acordo com o esquema de numeração EU.
[0222] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a TfR se liga ao domínio apical de TfR e pode se ligar a TfR sem bloquear ou inibir a ligação de transferrina a TfR. Em algumas modalidades, a ligação de transferrina a TfR não é substancialmente inibida. Em algumas modalidades, a ligação de transferrina a TfR é inibida em menos de cerca de 50% (por exemplo, menos de cerca de 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% ou 5%). Em algumas modalidades, a ligação de transferrina a TfR é inibida em menos de cerca de 20% (por exemplo, menos de cerca de 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1%).
[0223] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a TfR compreende pelo menos duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou nove substituições nas posições 274, 276, 283, 285, 286, 287, 288 e 290, de acordo com o esquema de numeração EU. Os polipeptídeos Fc modificados ilustrativos são fornecidos na SEQ ID NOS: 129-
133. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende Glu na posição 287 e/ou Trp na posição 288. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende pelo menos uma substituição em uma posição como se segue: Glu, Gly, Gln, Ser, Ala, Asn, Tyr ou Trp na posição 274; Ile, Val, Asp, Glu, Thr, Ala ou Tyr na posição 276; Asp, Pro, Met, Leu, Ala, Asn ou Phe na posição 283; Arg, Ser, Ala ou Gly na posição 285; Tyr, Trp, Arg ou Val na posição 286; Glu na posição 287; Trp ou Tyr na posição 288; Gln, Tyr, His, Ile, Phe, Val ou Asp na posição 289; ou Leu, Trp, Arg, Asn, Tyr ou Val na posição
290. Em algumas modalidades, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou todas as nove posições 274, 276, 283, 285, 286, 287, 288 e 290 têm uma substituição conforme especificado neste parágrafo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado pode compreender uma substituição conservativa, por exemplo, um aminoácido no mesmo agrupamento de carga, agrupamento de hidrofobicidade, agrupamento de estrutura de anel de cadeia lateral (por exemplo, aminoácidos aromáticos) ou agrupamento de tamanho e/ou agrupamento polar ou não polar, de um aminoácido especificado em uma ou mais das posições no conjunto.
[0224] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende Glu, Gly, Gln, Ser, Ala, Asn ou Tyr na posição 274; Ile, Val, Asp, Glu, Thr, Ala ou Tyr na posição 276 Asp, Pro, Met, Leu, Ala ou Asn na posição 283; Arg, Ser ou Ala na posição 285; Tyr, Trp, Arg ou Val na posição 286; Glu na posição 287; Trp na posição 288; Gln, Tyr, His, Ile, Phe ou Val na posição 289; e/ou Leu, Trp, Arg, Asn ou Tyr na posição 290. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende Arg na posição 285; Tyr ou Trp na posição 286; Glu na posição 287; Trp na posição 288; e/ou Arg ou Trp na posição
290.
[0225] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado tem pelo menos 70% de identidade, pelo menos 75% de identidade, pelo menos 80% de identidade, pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com os aminoácidos 1- 110 de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS: 129-133. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado tem pelo menos 70% de identidade, pelo menos 75% de identidade, pelo menos 80% de identidade, pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NOS: 129-133. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende a sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS: 129-133. Em outras modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende a sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS: 129-133, mas na qual um, dois ou três aminoácidos são substituídos.
[0226] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a TfR compreende pelo menos duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições nas posições 266, 267, 268, 269, 270, 271, 295, 297, 298 e 299, de acordo com o esquema de numeração EU. Os polipeptídeos Fc modificados ilustrativos são fornecidos na SEQ ID NOS: 134-138. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende Pro na posição 270, Glu na posição 295 e/ou Tyr na posição 297. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende pelo menos uma substituição em uma posição como se segue: Pro, Phe, Ala, Met ou Asp na posição 266; Gln, Pro, Arg, Lys, Ala, Ile, Leu, Glu, Asp ou Tyr na posição 267; Thr, Ser, Gly, Met, Vai, Phe, Trp ou Leu na posição 268; Pro, Val, Ala, Thr ou Asp na posição 269; Pro, Val ou Phe na posição 270; Trp, Gln, Thr ou Glu na posição 271; Glu, Val, Thr, Leu ou Trp na posição 295; Tyr, His, Val ou Asp na posição 297; Thr, His, Gln, Arg, Asn ou Val na posição 298; ou Tyr, Asn, Asp, Ser ou Pro na posição 299. Em algumas modalidades, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou todas as dez posições 266, 267, 268, 269, 270, 271, 295, 297, 298 e 299 têm uma substituição conforme especificado neste parágrafo. Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado pode compreender uma substituição conservativa, por exemplo, um aminoácido no mesmo agrupamento de carga, agrupamento de hidrofobicidade, agrupamento de estrutura de anel de cadeia lateral (por exemplo, aminoácidos aromáticos) ou agrupamento de tamanho e/ou agrupamento polar ou não polar, de um aminoácido especificado em uma ou mais das posições no conjunto.
[0227] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende Pro, Phe ou Ala na posição 266; Gln, Pro, Arg, Lys, Ala ou lle na posição 267; Thr, Ser, Gly, Met, Val, Phe ou Trp na posição 268; Pro, Val ou Ala na posição 269; Pro na posição 270; Trp ou Gln na posição 271; Glu na posição 295; Tyr na posição 297; Thr, His ou Gln na posição 298; e/ou Tyr, Asn, Asp ou Ser na posição 299.
[0228] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende Met na posição 266; Leu ou Glu na posição 267; Trp na posição 268; Pro na posição 269; Val na posição 270; Thr na posição 271; Val ou Thr na posição 295; His na posição 197; His, Arg ou Asn na posição 198; e/ou Pro na posição 299.
[0229] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende Asp na posição 266; Asp na posição 267; Leu na posição 268; Thr na posição 269; Phe na posição 270; Gln na posição 271; Val ou Leu na posição 295; Val na posição 297; Thr na posição 298; e/ou Pro na posição 299.
[0230] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado tem pelo menos 70% de identidade, pelo menos 75% de identidade, pelo menos 80% de identidade, pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com os aminoácidos 1- 110 de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS: 134-138. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado tem pelo menos 70% de identidade, pelo menos 75% de identidade, pelo menos 80% de identidade, pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NOS: 134-138. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende a sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ
ID NOS: 134-138. Em outras modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende a sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS: 134-138, mas na qual um, dois ou três aminoácidos são substituídos.
[0231] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a TfR compreende pelo menos duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições nas posições 268, 269, 270, 271, 272, 292, 293, 294 e 300, de acordo com o esquema de numeração EU. Os polipeptídeos Fc modificados ilustrativos são fornecidos na SEQ ID NOS: 139-
143. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende pelo menos uma substituição em uma posição como se segue: Val ou Asp na posição 268; Pro, Met ou Asp na posição 269; Pro ou Trp na posição 270; Arg, Trp, Glu ou Thr na posição 271; Met, Tyr ou Trp na posição 272; Leu ou Trp na posição 292; Thr, Val, Ile ou Lys na posição 293; Ser, Lys, Ala ou Leu na posição 294; His, Leu ou Pro na posição 296; ou Val ou Trp na posição 300. Em algumas modalidades, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou todas as dez posições 268, 269, 270, 271, 272, 292, 293, 294 e 300 têm uma substituição conforme especificado neste parágrafo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado pode compreender uma substituição conservativa, por exemplo, um aminoácido no mesmo agrupamento de carga, agrupamento de hidrofobicidade, agrupamento de estrutura de anel de cadeia lateral (por exemplo, aminoácidos aromáticos) ou agrupamento de tamanho e/ou agrupamento polar ou não polar, de um aminoácido especificado em uma ou mais das posições no conjunto.
[0232] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende Val na posição 268; Pro na posição 269; Pro na posição 270; Arg ou Trp na posição 271; Met na posição 272; Leu na posição 292; Thr na posição 293; Ser na posição 294; His na posição 296; e/ou Val na posição 300.
[0233] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende Asp na posição 268; Met ou Asp na posição 269; Trp na posição 270; Glu ou Thr na posição 271; Tyr ou Trp na posição 272; Trp na posição 292; Val, Ile ou Lys na posição 293; Lys, Ala ou Leu na posição 294; Leu ou Pro na posição 296; e/ou Trp na posição 300.
[0234] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado tem pelo menos 70% de identidade, pelo menos 75% de identidade, pelo menos 80% de identidade, pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com os aminoácidos 1- 110 de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS: 139-143. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado tem pelo menos 70% de identidade, pelo menos 75% de identidade, pelo menos 80% de identidade, pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NOS: 139-143. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende a sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS: 139-143. Em outras modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende a sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS: 139-143, mas na qual um, dois ou três aminoácidos são substituídos.
[0235] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a TfR tem pelo menos duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições nas posições 272, 274, 276, 322, 324, 326, 329, 330 e 331, de acordo com o esquema de numeração EU. Os polipeptídeos Fc modificados ilustrativos são fornecidos na SEQ ID NOS: 144-148. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende Trp na posição
330. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende pelo menos uma substituição em uma posição como se segue: Trp, Val, Ile ou Ala na posição 272; Trp ou Gly na posição 274; Tyr, Arg ou Glu na posição 276; Ser, Arg ou Gln na posição 322; Val, Ser ou Phe na posição 324; Ile, Ser ou Trp na posição 326; Trp, Thr, Ser, Arg ou Asp na posição 329; Trp na posição 330; ou
Ser, Lys, Arg ou Val na posição 331. Em algumas modalidades, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou todas as nove posições 272, 274, 276, 322, 324, 326, 329, 330 e 331 têm uma substituição conforme especificado neste parágrafo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado pode compreender uma substituição conservativa, por exemplo, um aminoácido no mesmo agrupamento de carga, agrupamento de hidrofobicidade, agrupamento de estrutura de anel de cadeia lateral (por exemplo, aminoácidos aromáticos) ou agrupamento de tamanho e/ou agrupamento polar ou não polar, de um aminoácido especificado em uma ou mais das posições no conjunto.
[0236] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou nove posições selecionadas dentre as seguintes: a posição 272 é Trp, Val, Ile ou Ala; a posição 274 é Trp ou Gly; a posição 276 é Tyr, Arg ou Glu; a posição 322 é Ser, Arg ou Gln; a posição 324 é Val, Ser ou Phe; a posição 326 é Ile, Ser ou Trp; a posição 329 é Trp, Thr, Ser, Arg ou Asp; a posição 330 é Trp; e a posição 331 é Ser, Lys, Arg ou Val. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende Val ou Ile na posição 272; Gly na posição 274; Arg na posição 276; Arg na posição 322; Ser na posição 324; Ser na posição 326; Thr, Ser ou Arg na posição 329; Trp na posição 330; e/ou Lys ou Arg na posição 331.
[0237] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado tem pelo menos 70% de identidade, pelo menos 75% de identidade, pelo menos 80% de identidade, pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com os aminoácidos 1- 110 de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS: 144-148. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado tem pelo menos 70% de identidade, pelo menos 75% de identidade, pelo menos 80% de identidade, pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NOS: 144-148. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende a sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS: 144-148. Em outras modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende a sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS: 144-148, mas na qual um, dois ou três aminoácidos são substituídos.
[0238] Em alguns aspectos, uma proteína de fusão descrita neste documento compreende dois polipeptídeos Fc que podem compreender modificações selecionadas independentemente ou podem ser um polipeptídeo Fc do tipo selvagem, por exemplo, um polipeptídeo IgG1 Fc humano. Em algumas modalidades, um ou ambos os polipeptídeos Fc contêm uma ou mais modificações que conferem ligação a um receptor de barreira hematoencefálica (BBB), por exemplo, receptor de transferrina (TfR). Exemplos não limitativos de outras mutações que podem ser introduzidas em um ou ambos os polipeptídeos Fc incluem, por exemplo, mutações para aumentar a estabilidade do soro ou meia-vida do soro, modular a função efetora, influenciar a glicosilação, reduzir a imunogenicidade em seres humanos e/ou fornecer heterodimerização de knob e hole dos polipeptídeos Fc.
[0239] Em algumas modalidades, os polipeptídeos Fc presentes na proteína de fusão têm independentemente uma identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% a um polipeptídeo Fc do tipo selvagem correspondente (por exemplo, um polipeptídeo Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humano).
[0240] Em algumas modalidades, os polipeptídeos Fc presentes no anticorpo na proteína de fusão incluem mutações knob e hole para promover a formação de heterodímero e dificultar a formação de homodímero. Geralmente, as modificações introduzem uma protuberância ("knob") na interface de um primeiro polipeptídeo e uma cavidade correspondente ("hole") na interface de um segundo polipeptídeo, de modo que a protuberância possa ser posicionada na cavidade para promover formação de heterodímero e, assim, dificultam a formação de homodímero. As protuberâncias são construídas substituindo pequenas cadeias laterais de aminoácidos da interface do primeiro polipeptídeo por cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). As cavidades compensatórias de tamanho idêntico ou semelhante às protuberâncias são criadas na interface do segundo polipeptídeo, substituindo grandes cadeias laterais de aminoácidos por cadeias menores (por exemplo, alanina ou treonina).
Em algumas modalidades, essas mutações adicionais estão em uma posição no polipeptídeo Fc que não tem um efeito negativo na ligação do polipeptídeo a um receptor da BBB, por exemplo, TfR.
[0241] Em uma modalidade ilustrativa de uma abordagem de knob e hole para dimerização, a posição 366 (numerada de acordo com o esquema de numeração EU) de um dos polipeptídeos Fc presentes na proteína de fusão compreende um triptofano no lugar de uma treonina nativa. O outro polipeptídeo Fc no dímero tem uma valina na posição 407 (numerada de acordo com o esquema de numeração EU) no lugar da tirosina nativa. O outro polipeptídeo Fc pode compreender adicionalmente uma substituição na qual a treonina nativa na posição 366 (numerada de acordo com o esquema de numeração EU) é substituída por uma serina e uma leucina nativa na posição 368 (numerada de acordo com o esquema de numeração EU) é substituída por uma alanina. Assim, um dos polipeptídeos Fc de uma proteína de fusão descrita neste documento tem a mutação knob T366W e o outro polipeptídeo Fc tem a mutação Y407V, que é tipicamente acompanhada pelas mutações hole T366S e L368A.
[0242] Em algumas modalidades, modificações para potencializar a meia-vida do soro podem ser introduzidas. Por exemplo, em algumas modalidades, um ou ambos os polipeptídeos Fc presentes em uma proteína de fusão descrita neste documento podem compreender uma tirosina na posição
252, uma treonina na posição 254 e um ácido glutâmico na posição 256, conforme numerado de acordo com o esquema de numeração EU. Portanto, um ou ambos os polipeptídeos Fc podem ter substituições M252Y, S254T e T256E.
Alternativamente, um ou ambos os polipeptídeos Fc podem ter substituições M428L e N434S, de acordo com o esquema de numeração EU.
Alternativamente, um ou ambos os polipeptídeos Fc podem ter uma substituição N434S ou N434A.
[0243] Em algumas modalidades, um ou ambos os polipeptídeos Fc presentes numa proteína de fusão descrita neste documento podem compreender modificações que reduzem a função efetora, ou seja, tendo uma capacidade reduzida de induzir certas funções biológicas após a ligação a um receptor Fc expresso em uma célula efetiva que medeia a função efetora. Os exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem, entre outros, ligação a C1q e citotoxicidade dependente do complemento (CDC), ligação ao receptor Fc, citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose mediada por células dependente de anticorpo (ADCP), regulação negativa dos receptores da superfície celular (por exemplo, receptor da célula B) e ativação das células B. As funções efetoras podem variar com a classe do anticorpo. Por exemplo, os anticorpos IgG1 e IgG3 humanos nativos podem desencadear atividades ADCC e CDC após a ligação a um receptor Fc apropriado presente em uma célula do sistema imunológico; e IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas nativas podem induzir funções ADCP após ligação ao receptor Fc apropriado presente em uma célula imunológica.
[0244] Em algumas modalidades, um ou ambos os polipeptídeos Fc presentes em uma proteína de fusão descrita neste documento também podem ser manipulados para conter outras modificações para heterodimerização, por exemplo, manipulação eletrostática de resíduos de contato dentro de uma interface CH3-CH3 que são carregadas naturalmente ou modificações hidrofóbicas de adesivos.
[0245] Em algumas modalidades, um ou ambos os polipeptídeos Fc presentes em uma proteína de fusão descrita neste documento podem incluir modificações adicionais que modulam a função efetora.
[0246] Em algumas modalidades, um ou ambos os polipeptídeos Fc presentes em uma proteína de fusão descrita neste documento podem compreender modificações que reduzem ou eliminam a função efetora. As mutações de polipeptídeo Fc ilustrativas que reduzem a função efetora incluem, mas não estão limitadas a substituições em um domínio CH2, por exemplo, nas posições 234 e 235, de acordo com o esquema de numeração EU. Por exemplo, em algumas modalidades, um ou ambos os polipeptídeos Fc podem compreender resíduos de alanina nas posições 234 e 235. Portanto, um ou ambos os polipeptídeos Fc podem ter substituições L234A e L235A (LALA).
[0247] Mutações adicionais do polipeptídeo Fc que modulam uma função efetora incluem, mas não estão limitadas a: a posição 329 pode ter uma mutação na qual a prolina é substituída por uma glicina ou arginina ou um resíduo de aminoácido grande o suficiente para destruir a interface do receptor de Fc/Fc que é formada entre a prolina 329 do Fc e os resíduos de triptofano Trp 87 e Trp 110 de Fc RIII. Substituições ilustrativas adicionais incluem S228P, E233P, L235E, N297A, N297D e P331S, de acordo com o esquema de numeração EU. As múltiplas substituições também podem estar presentes, por exemplo, L234A e L235A de uma região Fc de IgG1 humana; L234A, L235A e P329G de uma região Fc de IgG1 humana; S228P e L235E de uma região Fc de IgG4 humana; L234A e G237A de uma região Fc de IgG1 humana; L234A, L235A e G237A de uma região Fc de IgG1 humana; V234A e G237A de uma região Fc de IgG2 humana; L235A, G237A e E318A de uma região Fc de IgG4 humana; e S228P e L236E de uma região Fc de IgG4 humana, de acordo com o esquema de numeração EU. Em algumas modalidades, um ou ambos os polipeptídeos Fc podem ter uma ou mais substituições de aminoácidos que modulam o ADCC, por exemplo, substituições nas posições 298, 333 e/ou 334, de acordo com o esquema de numeração EU.
Polipeptídeos Fc ilustrativos que compreendem mutações adicionais
[0248] A título de exemplo não limitativo, um ou ambos os polipeptídeos Fc presentes em uma proteína de fusão descrita neste documento podem compreender mutações adicionais, incluindo uma mutação knob (por exemplo, T366W, conforme numerado de acordo com o esquema de numeração EU), mutações hole (por exemplo , T366S, L368A e Y407V, conforme numeradas de acordo com o esquema de numeração EU), mutações que modulam a função efetora (por exemplo, L234A, L235A e/ou P329G (por exemplo, L234A e L235A) conforme numeradas de acordo com o esquema de numeração EU) e/ou mutações que aumentam a estabilidade do soro ou meia- vida do soro (por exemplo, (i) M252Y, S254T e T256E conforme numeradas de acordo com o esquema de numeração EU, ou (ii) N434S com ou sem M428L e numeradas de acordo com a numeração EU).
[0249] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc pode ter uma mutação knob (por exemplo, T366W conforme numerado de acordo com o esquema de numeração EU) e pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com a sequência de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS: 1, 4-90 e 124-148. Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc com a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 1, 4-90 e 124-148 pode ser modificado para ter uma mutação knob.
[0250] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc pode ter uma mutação knob (por exemplo, T366W conforme numerada de acordo com o esquema de numeração EU), mutações que modulam a função efetora (por exemplo, L234A, L235A e/ou P329G (por exemplo, L234A e L235A) conforme numeradas de acordo com o esquema de numeração EU) e pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com a sequência de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS: 1, 4-90 e 124-
148. Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc com a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 1, 4-90 e 124-148 pode ser modificado para ter uma mutação knob e mutações que modulam a função efetora.
[0251] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc pode ter uma mutação knob (por exemplo, T366W conforme numerada de acordo com a numeração EU) e mutações que aumentam a estabilidade do soro ou a meia- vida do soro (por exemplo, (i) M252Y, S254T e T256E conforme numeradas com referência à numeração EU, ou (ii) N434S com ou sem M428L, conforme numerado de acordo com o esquema de numeração EU) e em pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade para a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 1, 4-90 e 124-148. Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc com a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 1, 4-90 e 124-148 pode ser modificado para ter uma mutação knob e mutações que aumentam a estabilidade do soro ou a meia-vida do soro.
[0252] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc pode ter uma mutação knob (por exemplo, T366W conforme numerada de acordo com o esquema de numeração EU), mutações que modulam a função efetora (por exemplo, L234A, L235A e/ou P329G (por exemplo, L234A e L235A) como numeradas de acordo com o esquema de numeração EU), mutações que aumentam a estabilidade do soro ou meia-vida do soro (por exemplo, (i) M252Y, S254T e T256E conforme numeradas de acordo com o esquema de numeração EU ou (ii) N434S com ou sem M428L conforme numeradas de acordo com o esquema de numeração EU) e pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com a sequência de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS: 1, 4-90 e 124-148. Em algumas modalidades,
um polipeptídeo Fc com a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 1, 4-90 e 124-148 pode ser modificado para ter uma mutação knob, mutações que modulam a função efetora e mutações que aumentam a estabilidade do soro ou meia-vida do soro.
[0253] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc pode ter uma mutação hole (por exemplo, T366S, L368A e Y407V conforme numerado de acordo com o esquema de numeração EU) e pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com a sequência de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS: 1, 4-90 e 124-148. Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc com a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 1, 4-90 e 124-148 pode ser modificado para ter mutações hole.
[0254] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc pode ter mutações hole (por exemplo, T366S, L368A e Y407V conforme numerada de acordo com o esquema de numeração EU), mutações que modulam a função efetora (por exemplo, L234A, L235A e/ou P329G (por exemplo, L234A e L235A) como numeradas de acordo com o esquema de numeração EU) e pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com a sequência de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS: 1, 4-90 e 124-148. Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc com a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 1, 4-90 e 124-148 pode ser modificado para ter mutações hole e mutações que modulam a função efetora.
[0255] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc pode ter mutações hole (por exemplo, T366S, L368A e Y407V conforme numerada de acordo com a numeração EU) e mutações que aumentam a estabilidade do soro ou a meia-vida do soro (por exemplo, (i) M252Y, S254T e T256E conforme numeradas com referência à numeração EU, ou (ii) N434S com ou sem M428L, conforme numerado de acordo com o esquema de numeração EU) e em pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95%
de identidade para a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 1, 4-90 e 124-148. Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc com uma sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 1, 4-90 e 124-148 pode ser modificado para ter uma mutações hole e mutações que aumentam a estabilidade do soro ou a meia- vida do soro.
[0256] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc pode ter mutações hole (por exemplo, T366S, L368A e Y407V conforme numerada de acordo com o esquema de numeração EU), mutações que modulam a função efetora (por exemplo, L234A, L235A e/ou P329G (por exemplo, L234A e L235A) conforme numeradas de acordo com o esquema de numeração EU), mutações que aumentam a estabilidade do soro ou meia-vida do soro (por exemplo, (i) M252Y, S254T e T256E conforme numeradas de acordo com o esquema de numeração EU ou (ii) N434S com ou sem M428L conforme numeradas de acordo com o esquema de numeração EU) e pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com a sequência de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS: 1, 4-90 e 124-148.
Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc com a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 1, 4-90 e 124-148 pode ser modificado para ter mutações hole, mutações que modulam a função efetora e mutações que aumentam a estabilidade do soro ou meia-vida do soro.
[0257] Em alguns aspectos, uma proteína de fusão descrita neste documento compreende um primeiro polipeptídeo Fc que está ligado a uma enzima da terapia de reposição enzimática (ERT), uma variante da enzima de ERT ou um fragmento cataliticamente ativo deste; e um segundo polipeptídeo Fc que forma um dímero Fc com o primeiro polipeptídeo Fc. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc não inclui uma sequência de região variável de cadeia pesada e/ou leve de imunoglobulina ou uma porção de ligação a antígeno desta. Em algumas modalidades, a enzima de ERT é IDS, SGSH, ASM ou GBA. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptideo Fc é um polipeptídeo Fc modificado e/ou o segundo polipeptídeo Fc é um polipeptídeo Fc modificado. Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo Fc é um polipeptídeo Fc modificado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado contém uma ou mais modificações que promovem sua heterodimerização no outro polipeptídeo Fc.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado contém uma ou mais modificações que reduzem a função efetora. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado contém uma ou mais modificações que prolongam a meia-vida do soro. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc contém uma ou mais modificações que conferem ligação a um receptor de barreira hematoencefálica (BBB), por exemplo, receptor de transferrina (TfR).
[0258] Em outros aspectos, uma proteína de fusão descrita neste documento compreende uma primeira cadeia polipeptídica que compreende um polipeptídeo Fc modificado que se liga especificamente a um receptor BBB, por exemplo TfR, e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende um polipeptídeo Fc que dimeriza com o polipeptídeo Fc modificado para formar um dímero Fc. Uma enzima de ERT pode estar ligada à primeira ou à segunda cadeia polipeptídica. Em algumas modalidades, a enzima de ERT é IDS, SGSH, ASM ou GBA. Em algumas modalidades, a enzima de ERT está ligada à segunda cadeia polipeptídica. Em algumas modalidades, a proteína compreende duas enzimas de ERT, cada uma ligada a uma das cadeias polipeptídicas. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc pode ser um polipeptídeo de ligação ao receptor BBB que se liga especificamente ao mesmo receptor BBB que o polipeptídeo Fc modificado na primeira cadeia polipeptídica. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc não se liga especificamente a um receptor BBB.
[0259] Em algumas modalidades, uma proteína de fusão descrita neste documento compreende uma primeira cadeia polipeptídica compreendendo um polipeptídeo Fc que se liga especificamente ao TfR e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende um polipeptídeo Fc, em que o polipeptídeo Fc modificado e o polipeptídeo Fc se dimerizam para formar um dímero Fc. Em algumas modalidades, a enzima de ERT é IDS, SGSH, ASM ou GBA. Em algumas modalidades, a enzima de ERT está ligada à primeira cadeia polipeptídica. Em algumas modalidades, a enzima de ERT está ligada à segunda cadeia polipeptídica. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc não se liga especificamente a um receptor BBB, por exemplo, TfR.
[0260] Em algumas modalidades, uma proteína de fusão descrita neste documento compreende uma primeira cadeia polipeptídica que compreende um polipeptídeo Fc modificado que se liga a TfR e compreende uma substituição T366W (knob); e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende um polipeptídeo Fc compreendendo substituições T366S, L368A e Y407V (hole). Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado e/ou o polipeptídeo Fc compreende ainda substituições de L234A e L235A (LALA). Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado e/ou o polipeptídeo Fc compreende ainda substituições M252Y, S254T e T256E (YTE). Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado e/ou o polipeptídeo Fc compreende ainda substituições L234A e L235A (LALA) e substituições M252Y, S254T e T256E (YTE). Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado e/ou o polipeptídeo Fc compreende resíduos de tipo selvagem de IgG1 humana nas posições 234, 235, 252, 254, 256 e 366.
[0261] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende as mutações knob, LALA e YTE, conforme especificado para qualquer uma das SEQ ID NOS: 97-100, 151, 156-161, 168-173, 180-185, 192- 197, 204 -209 e 216-221, e possui pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com a respectiva sequência; ou compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 97- 100, 151, 156-161, 168-173, 180-185, 192-197, 204-209 e 216-221. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc compreende as mutações hole, LALA e YTE, conforme especificado para qualquer uma das SEQ ID NOS: 101-104 e tem pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade para a respectiva sequência; ou compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 101-104. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende qualquer um dos SEQ ID NOS: 97-100, 151, 156-161, 168-173, 180-185, 192-197, 204-209 e 216-221 e o Fc polipeptídeo compreende qualquer uma das SEQ ID NOS: 101-104. Em algumas modalidades, o terminal N do polipeptídeo Fc modificado e/ou do polipeptídeo Fc inclui uma porção de uma região de dobradiça de IgG1 (por exemplo, DKTHTCPPCP; SEQ ID NO: 113). Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado tem pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 116, 228 e 229, ou compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 116, 228 e 229.
[0262] Em algumas modalidades, uma proteína de fusão descrita neste documento compreende uma primeira cadeia polipeptídica que compreende um polipeptídeo Fc modificado que se liga a TfR e compreende substituições T366S, L368A e Y407V (hole); e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende um polipeptídeo Fc compreendendo uma substituição T366W (knob). Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado e/ou o polipeptídeo Fc compreende ainda substituições de L234A e L235A (LALA). Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado e/ou o polipeptídeo Fc compreende ainda substituições M252Y, S254T e T256E (YTE). Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado e/ou o polipeptídeo Fc compreende ainda substituições L234A e L235A (LALA) e substituições M252Y, S254T e T256E (YTE). Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado e/ou o polipeptídeo Fc compreende resíduos de tipo selvagem de IgG1 humana nas posições 234, 235, 252, 254, 256 e 366.
[0263] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende as mutações hole, LALA e YTE, conforme especificado para qualquer uma das SEQ ID NOS: 105-108, 162-167, 174-179, 186-191, 198-203, 210-215 e 222-227, e possui pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com a respectiva sequência; ou compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 105-108, 162-167, 174-179, 186-191, 198-203, 210-215 e 222-227. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc compreende as mutações knob, LALA e YTE, conforme especificado para qualquer uma das SEQ ID NOS: 109-112 e tem pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade para a respectiva sequência; ou compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 109-112. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado compreende qualquer um dos SEQ ID NOS: 105-108, 162-167, 174- 179, 186-191, 198-203, 210-215 e 222-227, e o polipeptídeo Fc compreende qualquer um dos SEQ ID NOS: 109-112. Em algumas modalidades, o terminal N do polipeptídeo Fc modificado e/ou do polipeptídeo Fc inclui uma porção de uma região de dobradiça de IgG1 (por exemplo, DKTHTCPPCP; SEQ ID NO: 113).
[0264] Em algumas modalidades, uma enzima de ERT, por exemplo, IDS, SGSH, ASM ou GBA, presente em uma proteína de fusão descrita neste documento está ligada a uma cadeia polipeptídica que compreende um polipeptídeo Fc tendo pelo menos 85%, pelo menos 90% ou em pelo menos 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 101-104, ou compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 101-104 (por exemplo, como um polipeptídeo de fusão). Em algumas modalidades, a enzima de ERT, por exemplo, IDS, SGSH, ASM ou GBA, está ligada ao polipeptídeo Fc por um ligante, como um ligante flexível, e/ou uma região de dobradiça ou porção desta
(por exemplo, DKTHTCPPCP; SEQ ID NO: 113). Em algumas modalidades, a enzima de ERT compreende uma sequência de IDS com pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 114, 230 e 234, ou compreende a sequência de qualquer uma da SEQ ID NOS: 114, 230 e 234. Em algumas modalidades, a sequência IDS ligada ao polipeptídeo Fc tem pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 115, 117, 231, 232, 235 e 236, ou compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 115, 117, 231, 232, 235 e 236. Em algumas modalidades, a enzima de ERT compreende uma sequência de SGSH com pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 120 ou compreende a sequência da SEQ ID NO: 120. Em algumas modalidades, a sequência SGSH ligada ao polipeptídeo Fc tem pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 149 e 150, ou compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 149 e 150. Em algumas modalidades, a proteína de fusão compreende um polipeptídeo Fc modificado com pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 97-100, 151, 156-161, 168-173, 180-185, 192-197, 204-209 e 216-221, ou compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 97-100, 151, 156- 161, 168-173, 180-185, 192- 197, 204-209 e 216-221. Em algumas modalidades, o terminal N do polipeptídeo Fc e/ou do polipeptídeo Fc modificado inclui uma porção de uma região de dobradiça de IgG1 (por exemplo, DKTHTCPPCP; SEQ ID NO: 113). Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc modificado tem pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 116, 228 e 229, ou compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 116, 228 e 229.
[0265] Em algumas modalidades, a proteína de fusão compreende um polipeptídeo de fusão IDS-Fc compreendendo a sequência da SEQ ID NO:
115 e um polipeptídeo Fc modificado compreendendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 205 e 228. Em outras modalidades, a proteína de fusão compreende um polipeptídeo de fusão IDS-Fc compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 115 e um polipeptídeo Fc modificado compreendendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 169 e 229.
[0266] Em algumas modalidades, a proteína de fusão compreende um polipeptídeo de fusão IDS-Fc compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 231, e um polipeptídeo Fc modificado compreendendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 205 e 228. Em algumas modalidades, a proteína de fusão compreende um polipeptídeo de fusão IDS-Fc compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 231 e um polipeptídeo Fc modificado compreendendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 169 e 229.
[0267] Em algumas modalidades, a proteína de fusão compreende um polipeptídeo de fusão IDS-Fc compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 235 e um polipeptídeo Fc modificado compreendendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 205 e 228. Em outras modalidades, a proteína de fusão compreende um polipeptídeo de fusão IDS-Fc compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 235 e um polipeptídeo Fc modificado compreendendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 169 e 229.
[0268] Em algumas modalidades, uma enzima de ERT, por exemplo, IDS, SGSH, ASM ou GBA, presente em uma proteína de fusão descrita neste documento está ligada a uma cadeia polipeptídica que compreende um polipeptídeo Fc tendo pelo menos 85%, pelo menos 90% ou em pelo menos 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 109-112, ou compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 109-112 (por exemplo, como um polipeptídeo de fusão). Em algumas modalidades, a enzima de ERT, por exemplo, IDS, SGSH, ASM ou GBA, está ligada ao polipeptídeo Fc por um ligante, como um ligante flexível, e/ou uma região de dobradiça ou porção desta
(por exemplo, DKTHTCPPCP; SEQ ID NO: 113). Em algumas modalidades, a enzima de ERT compreende uma sequência de IDS com pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 114, 230 e 234, ou compreende a sequência de qualquer uma da SEQ ID NOS: 114, 230 e 234. Em algumas modalidades, a sequência IDS ligada ao polipeptídeo Fc tem pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 118, 233 e 237, ou compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 118, 233 e 237. Em algumas modalidades, a enzima de ERT compreende uma sequência de SGSH com pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 120 ou compreende a sequência da SEQ ID NO: 120. Em algumas modalidades, a sequência SGSH ligada ao polipeptídeo Fc tem pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 152 e 153, ou compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 152 e 153. Em algumas modalidades, a proteína de fusão compreende um polipeptídeo Fc modificado com pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 105-108, 162- 167, 174-179, 186 -191, 198-203, 210-215 e 222-227, ou compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 105-108, 162-167, 174-179, 186- 191, 198-203, 210- 215 e 222-227. Em algumas modalidades, o terminal N do polipeptídeo Fc e/ou do polipeptídeo Fc modificado inclui uma porção de uma região de dobradiça de IgG1 (por exemplo, DKTHTCPPCP; SEQ ID NO: 113).
[0269] Em algumas modalidades, uma enzima de ERT, por exemplo, IDS, SGSH, ASM ou GBA, presente em uma proteína de fusão descrita neste documento está ligada a uma cadeia polipeptídica que compreende um polipeptídeo Fc modificado com pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 97-100, 151, 156-161, 168-173, 180-185, 192-197, 204-209 e 216-221, ou compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 97-100, 151, 156-161, 168-173, 180-185, 192-197, 204-209 e 216-221 (por exemplo, como um polipeptídeo de fusão). Em algumas modalidades, a enzima de ERT, por exemplo, IDS, SGSH, ASM ou GBA, está ligada ao polipeptídeo Fc modificado por um ligante, como um ligante flexível, e/ou uma região de dobradiça ou porção desta (por exemplo, DKTHTCPPCP; SEQ ID NO: 113). Em algumas modalidades, a enzima de ERT compreende uma sequência de IDS com pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 114, 230 e 234, ou compreende a sequência de qualquer uma da SEQ ID NOS: 114, 230 e
234. Em algumas modalidades, a enzima de ERT compreende uma sequência de SGSH com pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 120 ou compreende a sequência da SEQ ID NO:
120. Em algumas modalidades, a sequência SGSH ligada ao polipeptídeo Fc modificado tem pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 154 e 155, ou compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 154 e 155. Em algumas modalidades, a proteína de fusão compreende um polipeptídeo Fc com pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 101-104, 149 e 150, ou compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 101-104, 149 e 150. Em algumas modalidades, o terminal N do polipeptídeo Fc modificado e/ou do polipeptídeo Fc inclui uma porção de uma região de dobradiça de IgG1 (por exemplo, DKTHTCPPCP; SEQ ID NO: 113).
[0270] Em algumas modalidades, uma enzima de ERT, por exemplo, IDS, SGSH, ASM ou GBA, presente em uma proteína de fusão descrita neste documento está ligada a uma cadeia polipeptídica que compreende um polipeptídeo Fc modificado com pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 105-108, 162-
167, 174-179, 186-191, 198-203, 210-215 e 222-227, ou compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 105-108, 162-167, 174-179, 186- 191, 198-203, 210-215 e 222-227 (por exemplo, como um polipeptídeo de fusão).
Em algumas modalidades, a enzima de ERT, por exemplo, IDS, SGSH, ASM ou GBA, está ligada ao polipeptídeo Fc modificado por um ligante, como um ligante flexível, e/ou uma região de dobradiça ou porção desta (por exemplo, DKTHTCPPCP; SEQ ID NO: 113). Em algumas modalidades, a enzima de ERT compreende uma sequência de IDS com pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 114, 230 e 234, ou compreende a sequência de qualquer uma da SEQ ID NOS: 114, 230 e
234. Em algumas modalidades, a enzima de ERT compreende uma sequência de SGSH com pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 120 ou compreende a sequência da SEQ ID NO:
120. Em algumas modalidades, a proteína de fusão compreende um polipeptídeo Fc com pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 109-112, ou compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 109-112. Em algumas modalidades, a proteína de fusão compreende uma sequência SGSH ligada ao polipeptídeo Fc tendo pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 152 e 153, ou compreendendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 152 e 153. Em algumas modalidades, o terminal N do polipeptídeo Fc modificado e/ou do polipeptídeo Fc inclui uma porção de uma região de dobradiça de IgG1 (por exemplo, DKTHTCPPCP; SEQ ID NO: 113).
[0271] As proteínas de fusão e outras composições descritas neste documento podem ter uma ampla gama de afinidades de ligação. Por exemplo,
em algumas modalidades, uma proteína tem uma afinidade por um receptor de barreira hematoencefálica (BBB), por exemplo, receptor de transferrina (TfR), variando de 1 pM a 10 μM. Em algumas modalidades, a afinidade para TfR varia de 1 nM a 5 μM, ou de 10 nM a 1 μM. Em algumas modalidades, a afinidade para TfR varia de cerca de 50 nM a cerca de 250 nM.
[0272] Em algumas modalidades, a afinidade de um polipeptídeo de ligação a TfR pode ser medida em um formato monovalente. Em outras modalidades, a afinidade pode ser medida em um formato bivalente, por exemplo, como um dímero compreendendo uma proteína de fusão Fab de polipeptídeo.
[0273] Os métodos para analisar a afinidade de ligação, a cinética de ligação e a reatividade cruzada para analisar a ligação a um receptor BBB, por exemplo TfR, são conhecidos na técnica. Esses métodos incluem, mas não estão limitados a, ensaios de ligação em fase sólida (por exemplo, ensaio ELISA), imunoprecipitação, ressonância plasmônica de superfície (por exemplo, Biacore™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ)), ensaios de exclusão cinética (por exemplo, KinExA®), citometria de fluxo, classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), interferometria BioLayer (por exemplo, Octet® (FortéBio, Inc., Menlo Park, CA)) e análise de Western blot. Em algumas modalidades, o ELISA é utilizado para determinar a afinidade de ligação e/ou reatividade cruzada. Os métodos para a realização de ensaios ELISA são conhecidos na técnica e também são descritos na seção Exemplos abaixo. Em algumas modalidades, a ressonância plasmônica de superfície (SPR) é usada para determinar a afinidade de ligação, a cinética de ligação e/ou a reatividade cruzada. Em algumas modalidades, ensaios de exclusão cinética são usados para determinar a afinidade de ligação, cinética de ligação e/ou reatividade cruzada. Em algumas modalidades, os ensaios de interferometria BioLayer são usados para determinar a afinidade de ligação, cinética de ligação e/ou reatividade cruzada.
[0274] Um exemplo não limitativo de um método para determinar a afinidade de ligação (por exemplo, para TfR) é descrito no Exemplo 13 abaixo, no qual um instrumento Biacore™ foi usado para determinar a afinidade por ressonância plasmônica de superfície (SPR). Nesse método, um polipeptídeo de ligação a TfR manipulado, um peptídeo de ligação a TfR ou um anticorpo de ligação a TfR de interesse é capturado em um chip sensor e diluições seriadas de TfR são injetadas no chip sensor a uma taxa de fluxo especificada (por exemplo, 30 µL/min) e temperatura (por exemplo, temperatura ambiente). As amostras são analisadas usando tempos de associação e dissociação especificados (por exemplo, 45 e 180 segundos, respectivamente), seguidos pela regeneração do chip sensor. As respostas de ligação são corrigidas subtraindo a resposta medida de um controle (por exemplo, usando uma IgG irrelevante em densidade semelhante) e, em seguida, as afinidades no estado de equilíbrio podem ser determinadas usando um software para ajustar a resposta de equilíbrio à concentração.
[0275] A concentração de um polipeptídeo de ligação a TfR manipulado, um peptídeo de ligação a TfR, um anticorpo de ligação a TfR ou um agente (por exemplo, ligado ao polipeptídeo de ligação a TfR manipulado, peptídeo de ligação a TfR ou anticorpo de ligação a TfR) no cérebro e/ou o plasma podem ser medidos, por exemplo, usando um modelo de camundongo knock-in para receptor de transferrina humana (hTfR). Esse modelo pode ser usado, por exemplo, para medir e/ou comparar a concentração máxima do cérebro (Cmax) e/ou a exposição do cérebro, por exemplo, para determinar se Cmax é aumentada e/ou a exposição do cérebro é prolongada. A criação de um modelo knock-in de camundongo TfR apical humano (TfRms/hu) é descrita abaixo no Exemplo 12. Para criar um modelo adequado, um sistema CRISPR/Cas9 pode ser usado para gerar um camundongo que expressa um domínio apical de
Tfrc humano dentro de um gene Tfrc murino (por exemplo, no qual a expressão in vivo está sob o controle de um promotor endógeno). Em particular, Cas9, RNAs de guia único e DNA doador (por exemplo, uma sequência de codificação de domínio apical humano que foi otimizada por códon para expressão em camundongos) podem ser introduzidos em embriões de camundongos (por exemplo, por injeção pronuclear). Os embriões podem ser transferidos para pseudo-grávidas. Um macho fundador da progênie da fêmea que recebeu os embriões pode ser criado para fêmeas do tipo selvagem para gerar camundongos heterozigotos F1. Camundongos homozigotos podem então ser gerados subsequentemente a partir da criação de camundongos heterozigotos da geração F1.
[0276] Para avaliação da concentração do cérebro e/ou plasma ou exposição do polipeptídeo de ligação a TfR manipulado, peptídeo de ligação a TfR, anticorpo de ligação a TfR ou agente (por exemplo, ligado ao polipeptídeo de ligação a TfR manipulado, peptídeo de ligação a TfR ou anticorpo de ligação a TfR), o polipeptídeo de ligação a TfR manipulado, peptídeo de ligação a TfR, anticorpo de ligação a TfR (por exemplo, ligado ao agente) pode ser administrado ao modelo de camundongo (por exemplo, TfRms/hu). As amostras de plasma podem ser obtidas do camundongo após um período de tempo adequado, seguido de perfusão do sistema vascular com uma solução adequada. Após a perfusão, os cérebros (ou porções destes) podem ser extraídos e homogeneizados e lisados. As concentrações do agente no plasma e/ou lisado cerebral podem então ser determinadas usando métodos padrão que serão conhecidos pelos versados na técnica. Como um exemplo não limitativo, um ensaio baseado em ELISA, como o descrito no Exemplo 3 abaixo, pode ser usado para medir concentrações. Resumidamente, a concentração de um agente, polipeptídeo de ligação a TfR manipulado, peptídeo de ligação a TfR ou anticorpo de ligação a TfR (por exemplo, no plasma ou lisado) pode ser quantificada usando um sanduíche ELISA. Um anticorpo de captura (por exemplo, um anticorpo de captura anti-Fc) pode ser revestido em uma placa (por exemplo, uma placa MaxiSorp™ de 384 poços) a uma concentração desejada (por exemplo, cerca de 3 µg/mL). A placa é bloqueada (por exemplo, com BSA a 5%) e depois incubada com plasma diluído (por exemplo, 1:1.000 ou 1:
10.000). Em seguida, um anticorpo de detecção é adicionado a uma concentração desejada (por exemplo, cerca de 0,5 µg/mL), seguido por um anticorpo secundário, como um anticorpo anti-cabra-HRP. As placas são então desenvolvidas (por exemplo, usando substrato TMB), interrompidas (por exemplo, com ácido sulfúrico) e a absorbância em um comprimento de onda apropriado (por exemplo, 450 nm) medido em um leitor de placas (por exemplo, um leitor de placas BioTek). As curvas padrão podem ser geradas usando uma série de diluição apropriada (por exemplo, 4 vezes) e ajustadas usando um algoritmo como uma regressão logística de quatro parâmetros.
[0277] Ao administrar uma gama de doses ao modelo de camundongo knock-in, uma curva padrão pode ser gerada. Ao administrar ao modelo de camundongo knock-in, um agente ligado a diferentes polipeptídeos de ligação a TfR manipulados, peptídeos de ligação a TfR ou anticorpos de ligação a TfR (por exemplo, com diferentes afinidades de TfR) ou um agente ligado a um polipeptídeo ou proteína de referência (por exemplo, que possui uma afinidade mais fraca pelo TfR do que o polipeptídeo ou proteína de interesse), comparações podem ser feitas com relação aos efeitos dos polipeptídeos de ligação a TfR mnipulados, peptídeos de ligação a TfR ou anticorpos de ligação a TfR na exposição cerebral ao agente e/ou valores de Cmax do agente no cérebro.
[0278] Em algumas modalidades, uma proteína de fusão descrita neste documento compreende dois polipeptídeos Fc conforme descritos neste documento e um ou ambos os polipeptídeos Fc podem ainda compreender uma região de dobradiça parcial ou completa. A região de dobradiça pode ser de qualquer subclasse ou isotipo de imunoglobulina. Uma dobradiça de imunoglobulina ilustrativa é uma região de dobradiça de IgG, como uma região de dobradiça de IgG1, por exemplo, sequência de aminoácidos de dobradiça de IgG1 humana EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 95) ou uma porção desta (por exemplo, DKTHTCPPCP; SEQ ID NO: 113). Em algumas modalidades, a região de dobradiça está na região de terminal N do polipeptídeo Fc.
[0279] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc é unido à enzima de ERT por um ligante, por exemplo, um ligante peptídico. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc é unido à enzima de ERT por uma ligação peptídica ou por um ligante peptídico, por exemplo, é um polipeptídeo de fusão.
O ligante peptídico pode ser configurado de modo a permitir a rotação da enzima de ERT em relação ao polipeptídeo Fc ao qual está ligado; e/ou é resistente à digestão por proteases. Os ligantes peptídicos podem conter aminoácidos naturais, aminoácidos não naturais ou uma combinação destes. Em algumas modalidades, o ligante peptídico pode ser um ligante flexível, por exemplo, contendo aminoácidos como Gly, Asn, Ser, Thr, Ala e similares. Esses ligantes são projetados usando parâmetros conhecidos e podem ter qualquer comprimento e conter qualquer número de unidades de repetição de qualquer comprimento (por exemplo, unidades de repetição de resíduos Gly e Ser). Por exemplo, o ligante pode ter repetições, como duas, três, quatro, cinco ou mais repetições de Gly4-Ser (SEQ ID NO: 239) ou um único Gly4-Ser (SEQ ID NO: 239). Em algumas modalidades, o ligante peptídico pode incluir um sítio de clivagem de protease, por exemplo, que é clivável por uma enzima presente no sistema nervoso central.
[0280] Em algumas modalidades, a enzima de ERT é unida ao terminal N do polipeptídeo Fc, por exemplo, por um ligante Gly4-Ser (SEQ ID NO:
239) ou um ligante (Gly4-Ser)2 (SEQ ID NO: 240). Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fc pode compreender uma sequência de dobradiça ou sequência de dobradiça parcial no terminal N que é unida ao ligante ou diretamente unida à enzima de ERT.
[0281] Em algumas modalidades, a enzima de ERT é unida ao terminal C do polipeptídeo Fc, por exemplo, por um ligante Gly4-Ser (SEQ ID NO: 239) ou um ligante (Gly4-Ser)2 (SEQ ID NO: 240). Em algumas modalidades, o terminal C do polipeptídeo Fc é diretamente ligado à enzima de ERT.
[0282] Em algumas modalidades, a enzima de ERT é unida ao polipeptídeo Fc por um agente de reticulação química. Tais conjugados podem ser gerados usando reagentes e protocolos de reticulação química conhecidos.
Por exemplo, existe um grande número de agentes de reticulação química que são conhecidos dos versados na técnica e úteis para reticular o polipeptídeo com um agente de interesse. Por exemplo, os agentes de reticulação são reticuladores heterobifuncionais, que podem ser usados para ligar moléculas de maneira gradual. Os reticuladores heterobifuncionais fornecem a capacidade de projetar métodos de acoplamento mais específicos para a conjugação de proteínas, reduzindo assim as ocorrências de reações colaterais indesejadas, como polímeros de homoproteínas. Uma grande variedade de reticuladores heterobifuncionais é conhecida na técnica, incluindo N-hidroxissuccinimida (NHS) ou seu análogo N-hidroxissulfossuccinimida solúvel em água (sulfo-NHS), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidil (SMCC), éster m- maleimidobenzoil-N-hidroxissuccinimida (MBS); (4-iodoacetil)aminobenzoato de N-succinimidil (SIAB), 4-(p-maleimidofenil) butirato de succinimidil (SMPB), cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodi-imida (EDC); 4- succinimidiloxicarbonil-a-metil-a-(2-piridilditio)-tolueno (SMPT), 3-(2- piridilditio)propionato de N-succinimidil (SPDP) e 6-[3-(2- piridilditio)propionato]hexanoato de succinimidil (LC-SPDP). Os agentes de reticulação possuindo frações N-hidroxissuccinimida podem ser obtidos como análogos da N-hidroxissulfossuccinimida, que geralmente têm maior solubilidade em água. Além disso, os agentes de reticulação que têm pontes dissulfeto na cadeia de ligação podem ser sintetizados como derivados alquil, de modo a reduzir a quantidade de clivagem do ligante in vivo. Além dos reticuladores heterobifuncionais, existem vários outros agentes de reticulação, incluindo reticuladores homobifuncionais e fotorreativos. Suberato de dissuccinimidil (DSS), bismaleimidohexano (BMH) e dimetilpimelimidato.2HCl (DMP) são exemplos de agentes de reticulação homobifuncionais úteis e de bis-[B-(4- azidosalicilamido)etil]dissulfeto (BASED) e N-succinimidil-6(4'-azido-2'- nitrofenilamino)hexanoato (SANPAH) são exemplos de reticuladores fotorreativos úteis.
[0283] A atividade das proteínas de fusão descritas neste documento que compreendem uma enzima de ERT, como, por exemplo, IDS, SGSH, ASM ou GBA, pode ser avaliada usando vários ensaios, incluindo ensaios que medem a atividade in vitro usando um substrato artificial, como os descritos na Seção de exemplos. Um protocolo ilustrativo para medir a atividade de IDS in vitro é fornecido no Exemplo 2. Um protocolo ilustrativo para medir a atividade de ASM in vitro é fornecido no Exemplo 5. Protocolos ilustrativos para medir a atividade de SGSH in vitro são fornecidos nos Exemplos 7 e 8.
[0284] Em alguns aspectos, a atividade de IDS é avaliada analisando uma amostra, como uma amostra de células, amostra de tecido ou amostra de fluido (por exemplo, CSF ou urina), para a quantidade de glicosaminoglicanos (GAGs) de sulfato de heparano e sulfato de dermatano, que se acumulam como resultado da deficiência de IDS. A quantidade de sulfato de heparano e de dermatano é determinada pela digestão de GAGs presentes em uma amostra com heparinase e condroitinase. Os dissacarídeos resultantes podem ser analisados por espectrometria de massa (por exemplo, LC-MS/MS).
Amostras com altos níveis de acúmulo de sulfato de heparano e de dermatano terão quantidades aumentadas de dissacarídeos derivados de sulfato de heparano e de dermatano. Assim, o nível de dissacarídeos é inversamente proporcional à atividade enzimática da IDS.
[0285] O ensaio de espectrometria de massa (por exemplo, LC- MS/MS) pode ser realizado em qualquer amostra na qual os GAGs se acumulam, incluindo amostras de células, amostras de tecidos e amostras de fluidos. Tais amostras podem ser avaliadas para monitorar a atividade de uma proteína contendo IDS descrita neste documento, por exemplo, que é administrada a células in vitro, ou em algumas modalidades, administrada a um sujeito in vivo.
O sujeito pode ser um animal, como um roedor, por exemplo, um camundongo ou um primata não humano. Em algumas modalidades, o sujeito é um paciente humano, como um paciente com síndrome de Hunter que está em tratamento com uma terapia IDS, em que o ensaio é usado para monitorar a atividade de IDS no paciente. Em algumas modalidades, o paciente humano está em tratamento com uma proteína de fusão descrita neste documento.
[0286] Para amostras celulares, como células ou amostras de tecido, o ensaio compreende o rompimento das células e a quebra de microvesículas abertas. O rompimento das células ou a quebra de microvesículas abertas podem ser alcançadas usando congelamento- descongelamento e/ou sonicação para obter um extrato (por exemplo, um extrato celular) compreendendo GAGs. Os GAGs são então sujeitos ao tratamento com heparinases (por exemplo, qualquer uma descrita neste documento) e condroitinase, que decompõem os GAGs de sulfato de heparano e sulfato de dermatano. Após a digestão, é obtido um sobrenadante contendo os dissacarídeos GAG e os produtos dissacarídeos são analisados por espectrometria de massa (por exemplo, LC-MS/MS). Um protocolo ilustrativo é fornecido no Exemplo 2.
[0287] Em algumas modalidades, uma amostra de célula a ser testada quanto à atividade de IDS é lavada e congelada. Os grânulos de células são sonicados em um tampão de digestão com dissacarídeos. Uma quantidade desejada de proteína total da amostra sonicada é então adicionada ao tampão de digestão compreendendo heparinase I, heparinase II, heparinase III e condroitinase B, a última das quais é específica para o sulfato de dermatano.
Após a digestão, por exemplo, cerca de 3 horas a 30°C, as enzimas são desativadas com EDTA e fervura. As amostras são então centrifugadas, por exemplo, a 16.000 x G, e o sobrenadante transferido para um filtro centrífugo e centrifugado a cerca de 14.000 x G. Os dissacarídeos são então ressuspensos em uma mistura de tampão de ensaio: acetonitrila na proporção de 1:1 v/v e ainda analisado por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa por eletropulverização, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 2. Os produtos dissacarídeos derivados de GAG podem ser identificados com base no tempo de retenção em comparação com os padrões de referência disponíveis comercialmente. Os dissacarídeos derivados de sulfato de heparano ilustrativos incluem D0S0 e D2S0 (nomenclatura de acordo com Lawrence et al., Nat.
Methods, 5:291-292 (2008)).
[0288] Em outros aspectos, a atividade de SGSH é avaliada analisando uma amostra, como uma amostra de células ou tecido, quanto à quantidade de glicosaminoglicanos (GAGs) de sulfato de heparano (GAGs), que se acumulam como resultado da deficiência de SGSH. A quantidade de sulfato de heparano é determinada pela digestão de GAGs presentes em uma amostra com heparinase (por exemplo, qualquer descrito neste documento). Os dissacarídeos resultantes podem ser analisados por espectrometria de massa (por exemplo, LC-MS/MS). Amostras com altos níveis de acúmulo de sulfato de heparano terão quantidades aumentadas de dissacarídeos derivados de sulfato de heparano. Assim, o nível de dissacarídeos é inversamente proporcional à atividade enzimática da SGSH.
[0289] O ensaio de espectrometria de massa (por exemplo, LC- MS/MS) pode ser realizado em qualquer amostra na qual os GAGs se acumulam, incluindo amostras de células, amostras de tecidos e amostras de fluidos. Tais amostras podem ser avaliadas para monitorar a atividade de uma proteína contendo SGSH descrita neste documento, por exemplo, que é administrada a células in vitro, ou em algumas modalidades, administrada a um sujeito in vivo.
O sujeito pode ser um animal, como um roedor, por exemplo, um camundongo ou um primata não humano. Em algumas modalidades, o sujeito é um paciente humano, como um paciente com síndrome de Sanfilippo que está em tratamento com uma terapia de SGSH, em que o ensaio é usado para monitorar a atividade de SGSH no paciente. Em algumas modalidades, o paciente humano está em tratamento com uma proteína de fusão descrita neste documento.
[0290] Para amostras celulares, como células ou amostras de tecido, o ensaio compreende o rompimento das células e/ou a quebra de microvesículas abertas. O rompimento das células ou a quebra de microvesículas abertas podem ser alcançadas usando congelamento- descongelamento e/ou sonicação para obter um extrato (por exemplo, um extrato celular) compreendendo GAGs. Os GAGs são então sujeitos ao tratamento com heparinases (por exemplo, qualquer uma descrita neste documento) que quebram os GAGs de sulfato de heparano. Após a digestão, é obtido um sobrenadante contendo os dissacarídeos GAG e os produtos dissacarídeos são analisados por espectrometria de massa (por exemplo, LC-MS/MS). Um protocolo ilustrativo é fornecido no Exemplo 7.
[0291] Em algumas modalidades, uma amostra de célula a ser testada quanto à atividade de SGSH é lavada e congelada. Os grânulos de células são sonicados em um tampão de digestão com dissacarídeos. Uma quantidade desejada de proteína total da amostra sonicada é então adicionada ao tampão de digestão compreendendo heparinase I, heparinase II e/ou heparinase III. Após a digestão, por exemplo, cerca de 3 horas a 30°C, as enzimas são desativadas com EDTA e fervura. As amostras são então centrifugadas, por exemplo, a 16.000 x G, e o sobrenadante transferido para um filtro centrífugo e centrifugado a cerca de 14.000 x G. Os dissacarídeos são então ressuspensos em uma mistura de tampão de ensaio: acetonitrila na proporção de 1:1 v/v e ainda analisado por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa por eletropulverização, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 7. Os produtos dissacarídeos derivados de GAG podem ser identificados com base no tempo de retenção em comparação com os padrões de referência disponíveis comercialmente. Os dissacarídeos derivados de sulfato de heparano ilustrativos incluem D0S0 e D2S0 (nomenclatura de acordo com Lawrence et al., Nat.
Methods, 5:291-292 (2008)).
[0292] Em algumas modalidades, uma amostra de tecido é avaliada. Uma amostra de tecido pode ser avaliada usando um ensaio conforme descrito acima, exceto vários ciclos de congelamento-descongelamento livre, por exemplo 2, 3, 4, 5 ou mais, são normalmente incluídos antes da etapa de sonicação para garantir que as microvesículas sejam quebradas.
[0293] As amostras que podem ser avaliadas pelos ensaios descritos neste documento incluem cérebro, fígado, rim, pulmão, baço, plasma, soro, líquido cefalorraquidiano (CSF) e urina. Em algumas modalidades, as amostras de CSF de um paciente que recebe uma proteína de fusão enzima-Fc (por exemplo, uma proteína de fusão IDS-Fc ou SGSH-Fc) descrita neste documento podem ser avaliadas.
[0294] As cadeias polipeptídicas contidas nas proteínas de fusão conforme descritas neste documento são tipicamente preparadas usando métodos recombinantes. Por conseguinte, em alguns aspectos, a presente divulgação fornece ácidos nucleicos isolados compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica qualquer uma das cadeias de polipeptídeos compreendendo polipeptídeos Fc, conforme descrito neste documento, e células hospedeiras nas quais são introduzidos os ácidos nucleicos que são usados para replicar os ácidos nucleicos que codificam polipeptídeo e/ou para expressar os polipeptídeos. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é eucariótica, por exemplo, uma célula humana.
[0295] Em outro aspecto, são fornecidos polinucleotídeos que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codifica as cadeias de polipeptídeos descritos neste documento. Os polinucleotídeos podem ser de fita simples ou de fita dupla. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é DNA. Em modalidades particulares, o polinucleotídeo é cDNA. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é RNA.
[0296] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é incluído dentro de um construto de ácido nucleico. Em algumas modalidades, o construto é um vetor replicável. Em algumas modalidades, o vetor é selecionado a partir de um plasmídeo, um vetor viral, um fagomídeo, um vetor cromossômico de levedura e um vetor de mamífero não epissomal.
[0297] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo está operacionalmente ligado a uma ou mais sequências nucleotídicas reguladoras em um construto de expressão. Em uma série de modalidades, os construtos de expressão de ácido nucleico são adaptados para uso como uma biblioteca de expressão de superfície. Em algumas modalidades, a biblioteca é adaptada para expressão da superfície em leveduras. Em algumas modalidades, a biblioteca é adaptada para expressão da superfície em fagos. Em outra série de modalidades, os construtos de expressão de ácido nucleico são adaptadas para expressão do polipeptídeo em um sistema que permite o isolamento do polipeptídeo em quantidades em miligrama ou grama. Em algumas modalidades, o sistema é um sistema de expressão de células de mamíferos. Em algumas modalidades, o sistema é um sistema de expressão de células de levedura.
[0298] Veículos de expressão para produção de um polipeptídeo recombinante incluem plasmídeos e outros vetores. Por exemplo, vetores adequados incluem plasmídeos dos seguintes tipos: plasmídeos derivados de pBR322, plasmídeos derivados de pEMBL, plasmídeos derivados de pEX, plasmídeos derivados de pBTac e plasmídeos derivados de pUC para expressão em células procarióticas, tais como E. coli. Os vetores derivados de pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo e pHyg são exemplos de vetores de expressão de mamífero adequados para transfecção de células eucarióticas. Alternativamente, derivados de vírus tais como o vírus do papiloma bovino (BPV-1) ou vírus de Epstein-Barr (pHEBo, derivados de pREP e p205) podem ser utilizados para expressão transiente de polipeptídeos em células eucarióticas. Em algumas modalidades, pode ser desejável expressar os polipeptídeos recombinantes pela utilização de um sistema de expressão de baculovírus. Exemplos de tais sistemas de expressão de baculovírus incluem vetores derivados de pVL (tais como pVL1392, pVL1393 e pVL941), vetores derivados de pAcUW (tais como pAcUW1) e vetores derivados de pBlueBac. Sistemas de expressão adicionais incluem adenoviral, vírus adeno-associado e outros sistemas de expressão viral.
[0299] Os vetores podem ser transformados em qualquer célula hospedeira adequada. Em algumas modalidades, as células hospedeiras, por exemplo, bactérias ou células de levedura, podem ser adaptadas para uso como uma biblioteca de expressão de superfície. Em algumas células, os vetores são expressos em células hospedeiras para expressar quantidades relativamente grandes do polipeptídeo. Tais células hospedeiras incluem células de mamífero, células de levedura, células de inseto e células procarióticas. Em algumas modalidades, as células são células de mamíferos, como célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO), célula de rim de hamster bebê (BHK), célula NS0, célula Y0, célula HEK293, célula COS, célula Vero ou célula HeLa.
[0300] Uma célula hospedeira transfectada com um vetor de expressão que codifica uma ou mais cadeias de polipeptídeos Fc, conforme descrito neste documento, pode ser cultivada em condições apropriadas para permitir a expressão de um ou mais polipeptídeos. Os polipeptídeos podem ser secretados e isolados de uma mistura de células e meio contendo os polipeptídeos. Alternativamente, os polipeptídeos podem ser retidos no citoplasma ou em uma fração de membrana e as células coletadas, lisadas e o polipeptídeo isolado usando um método desejado.
[0301] Uma proteína de fusão ou um agente (por exemplo, um agente terapêutico) ligado a um polipeptídeo de ligação a TfR manipulado, peptídeo de ligação a TfR ou anticorpo de ligação a TfR descrito neste documento pode ser usado terapeuticamente para tratar um LSD. Em algumas modalidades, um paciente com síndrome de Hunter é tratado com uma proteína de fusão ou um agente ligado a um polipeptídeo de ligação a TfR manipulado, peptídeo de ligação a TfR ou anticorpo de ligação a TfR que compreende IDS.
Em algumas modalidades, um paciente com síndrome de Sanfilippo A é tratado com uma proteína de fusão ou um agente ligado a um polipeptídeo de ligação a TfR, peptídeo de ligação a TfR ou anticorpo de ligação a TfR que compreende SGSH. Em algumas modalidades, um paciente com doença de Niemann-Pick é tratado com uma proteína de fusão ou um agente ligado a um polipeptídeo de ligação a TfR manipulado, peptídeo de ligação a TfR ou anticorpo de ligação a TfR que compreende ASM. Em algumas modalidades, um paciente com doença de Gaucher ou doença de Parkinson é tratado com uma proteína de fusão ou um agente ligado a um polipeptídeo de ligação a TfR manipulado, peptídeo de ligação a TfR ou anticorpo de ligação a TfR que compreende GBA.
[0302] Uma proteína de fusão descrita neste documento que compreende uma enzima de ERT, por exemplo, IDS, SGSH, ASM ou GBA, é administrada a um indivíduo em uma quantidade ou dose terapeuticamente eficaz. Pode ser usada uma dose diária na faixa de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 500 mg/kg, ou cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 200 mg/kg, ou cerca de 1 mg/kg a cerca de 100 mg/kg, ou cerca de 10 mg/kg a cerca de 50 mg/kg. Em algumas modalidades, a proteína tem uma atividade enzimática de pelo menos 500 unidades (U)/mg, cerca de 1.000 U/mg, ou pelo menos cerca de 1.500, 2.000,
2.500, 3.000, 3.500, 4.000, 4.500, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000 ou 10.000 U/mg. Em algumas modalidades, a atividade enzimática é pelo menos cerca de
11.000 U/mg, ou pelo menos cerca de 12.000, 13.000, 14.000, 15.000, 16.000,
17.000, 18.000, 19.000, 20.000, 25.000, 30.000, 35.000, 40.000, 45.000 ou
50.000 U/mg; ou em qualquer lugar na faixa de cerca de 500 U/mg a cerca de
50.000 U/mg. As dosagens, no entanto, podem ser variadas de acordo com vários fatores, incluindo a via de administração escolhida, a formulação da composição, a resposta do paciente, a gravidade da condição, o peso do sujeito e o julgamento do médico prescritor. A dosagem pode ser aumentada ou diminuída ao longo do tempo, conforme exigido por um paciente individual. Em certos casos, um paciente recebe inicialmente uma dose baixa, que é então aumentada para uma dosagem eficaz tolerável ao paciente. A determinação de uma quantidade eficaz está bem dentro da capacidade daqueles versados na técnica.
[0303] Em várias modalidades, uma proteína de fusão descrita neste documento é administrada parenteralmente. Em algumas modalidades, a proteína é administrada por via intravenosa. A administração intravenosa pode ser feita por infusão, por exemplo, durante um período de cerca de 10 a cerca de 30 minutos, ou durante um período de pelo menos 1 hora, 2 horas ou 3 horas.
Em algumas modalidades, a proteína é administrada como um bolo intravenoso.
Combinações de infusão e administração em bolo também podem ser usadas.
[0304] Em algumas modalidades parentéricas, uma proteína ou agente de fusão (por exemplo, agente terapêutico) ligado a um polipeptídeo de ligação a TfR manipulado, peptídeo de ligação a TfR ou anticorpo de ligação a TfR é administrado por via intraperitoneal, subcutânea, intradérmica ou intramuscular. Em algumas modalidades, a proteína ou agente ligado a um polipeptídeo de ligação a TfR manipulado, peptídeo de ligação a TfR ou anticorpo de ligação a TfR é administrado por via intradérmica ou intramuscular. Em algumas modalidades, a proteína ou agente ligado a um polipeptídeo de ligação a TfR manipulado, peptídeo de ligação a TfR ou anticorpo de ligação a TfR é administrado por via intratecal, como por administração peridural, ou por via intracerebroventricular.
[0305] Em outras modalidades, uma proteína de fusão ou um agente (por exemplo, agente terapêutico) ligado a um polipeptídeo de ligação a TfR manipulado, peptídeo de ligação a TfR ou anticorpo de ligação a TfR pode ser administrado por via oral, por administração pulmonar, administração intranasal, administração intra-ocular, ou por administração tópica. A administração pulmonar também pode ser utilizada, por exemplo, pelo uso de um nebulizador ou inalador, e uma formulação com um agente aerossolização.
[0306] Em outros aspectos, é fornecido neste documento um método para transportar um agente (por exemplo, um agente que é útil para o tratamento de um distúrbio de armazenamento lisossômico (LSD)) através da barreira hematoencefálica (BBB) de um mamífero. Em algumas modalidades, o método compreende a exposição da BBB a um polipeptídeo ou proteína que se liga (por exemplo, se liga especificamente) a um receptor de transferrina (TfR) com uma afinidade de cerca de 50 nM a cerca de 250 nM. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ou proteína está ligado ao agente e transporta o agente ligado através da BBB. Em algumas modalidades, a concentração máxima (Cmax) do agente no cérebro do mamífero é melhorada (por exemplo, aumentada).
[0307] Em outros aspectos, é fornecido neste documento um método para o tratamento de um LSD. Em algumas modalidades, o método compreende a administração a um mamífero de um polipeptídeo ou proteína que se liga (por exemplo, se liga especificamente) a um TfR com uma afinidade de cerca de 50 nM a cerca de 250 nM. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ou proteína está ligado a um agente para o tratamento do LSD, expondo assim o cérebro do mamífero ao agente.
[0308] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ou proteína se liga (por exemplo, se liga especificamente) a um TfR com uma afinidade de cerca de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240 ou 250 nM. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ou proteína se liga a um TfR com uma afinidade de cerca de 100 nM a cerca de 200 nM ou de cerca de 110 nM a cerca de 150 nM.
[0309] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ou proteína (por exemplo, ligado ao agente) melhora (por exemplo, aumenta) a Cmax do agente no cérebro em comparação com o agente ligado a um polipeptídeo ou proteína de referência que se liga (por exemplo, se liga especificamente) a um TfR com uma afinidade mais fraca.
[0310] Em algumas modalidades, a Cmax do agente no cérebro é melhorada (por exemplo, aumentada) em pelo menos cerca de 1,1 vezes, 1,2 vezes, 1,3 vezes, 1,4 vezes, 1,5 vezes, 1,6 vezes, 1,7 vezes, 1,8 vezes, 1,9 vezes, 2 vezes, 2,2 vezes, 2,4 vezes, 2,6 vezes, 2,8 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes ou mais, em comparação com o agente que é ligado a um polipeptídeo ou proteína de referência (por exemplo, que se liga a um TfR com uma afinidade mais fraca).
[0311] Em algumas modalidades, o cérebro do mamífero é exposto ao agente em uma concentração terapeuticamente eficaz (por exemplo, uma concentração que é suficiente para tratar um ou mais sinais ou sintomas de um LSD) por um período mais curto em comparação ao agente que é ligado ao polipeptídeo ou proteína de referência. Em algumas modalidades, a duração da exposição cerebral é reduzida em pelo menos cerca de 5%, 10%, 25%, 40%, 50%, 60%, 75%, 85%, 90%, 95% ou 98%.
[0312] Em algumas modalidades, a exposição cerebral é quantificada plotando a exposição cerebral (por exemplo, concentração do agente no cérebro) em função do tempo e calculando a área sob a curva (AUC).
AUC reduzida pode representar diminuição ou encurtamento da exposição cerebral. Em algumas modalidades, a duração da exposição cerebral ao agente (por exemplo, em uma concentração terapeuticamente eficaz) é reduzida.
[0313] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de referência ou proteína se liga (por exemplo, se liga especificamente) ao TfR com uma afinidade que é ou é mais fraca que cerca de 250 nM, 300 nM, 350 nM, 400 nM, 450 nM, 500 nM, 550 nM ou 600 nM. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ou proteína de referência se liga ao TfR com uma afinidade que é ou é mais fraca que cerca de 600 nM.
[0314] Em algumas modalidades, o mamífero é um primata (por exemplo, um humano). Em algumas modalidades, o humano é um paciente que precisa de tratamento para um LSD. Em algumas modalidades, o paciente tem um ou mais sinais ou sintomas de um LSD.
[0315] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ou proteína se liga (por exemplo, se liga especificamente) a um TfR de primata. Em algumas modalidades, o TfR de primata é um TfR de humano. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ou proteína se liga ao domínio apical de TfR.
[0316] Em algumas modalidades, o agente (por exemplo, agente terapêutico) está ligado a um polipeptídeo de ligação a TfR manipulado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de ligação a TfR manipulado compreende domínios CH3 ou CH2 que têm modificações que permitem que o polipeptídeo se ligue especificamente a TfR. Exemplos não limitativos de polipeptídeos de ligação a TfR manipulados adequados são descritos neste documento. Em algumas modalidades, o agente está ligado a um polipeptídeo de ligação a TfR manipulado que é descrito na Tabela 4 ou Tabela 5. Em algumas modalidades, o agente está ligado a um polipeptídeo de ligação a TfR manipulado selecionado a partir do grupo que consiste em CH3C.35.20.2, CH3C.35.23.2, CH3C.35.23.5, CH3C.35.21.17 e CH3C.35.21.17.2.
[0317] Em algumas modalidades, o agente (por exemplo, agente terapêutico) está ligado a um peptídeo de ligação a TfR. Em algumas modalidades, o peptídeo de ligação a TfR é um peptídeo curto, com cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 aminoácidos em comprimento. Os métodos para gerar, triar e identificar peptídeos adequados (ou seja, que se ligam a um TfR com uma afinidade dentro da faixa desejada) são conhecidos na técnica. Por exemplo, uma estratégia de exibição de fagos na qual são utilizados ciclos alternados de seleção negativa e positiva pode ser usada para identificar peptídeos adequados. Esta estratégia é descrita, por exemplo, em Lee et al., Eur. J. Biochem., 268: 2004-2012 (2001), que é incorporado neste documento na sua totalidade para todos os fins.
[0318] Em algumas modalidades, o agente (por exemplo, agente terapêutico) está ligado a um peptídeo de ligação a TfR. Exemplos não limitativos de anticorpos de ligação a TfR adequados incluem anticorpos anti-TfR OX26 (ou seja, tendo afinidades de cerca de 76 nM, 108 nM e 174 nM) que são divulgados em Thom et al., Mol. Pharm., 15(4):1420-1431 (2018). Em algumas modalidades, o agente está ligado a uma proteína que compreende uma região variável de anticorpo que se liga especificamente a TfR. Em alguns casos, a proteína compreende um Fab ou um scFv.
[0319] Em algumas modalidades, o agente (por exemplo, agente terapêutico) é uma proteína (por exemplo, uma enzima). Em algumas modalidades, o agente é um terapêutico de reposição de proteínas. Em algumas modalidades, o agente é uma proteína ou enzima que é deficiente (por exemplo, subexpresso ou ausente) em uma célula ou tecido (por exemplo, uma célula ou tecido neural) no mamífero. Em algumas modalidades, o agente é uma proteína ou enzima que é endógena ou expressa em uma célula ou tecido saudável normal (por exemplo, uma célula ou tecido neural) no mamífero, mas é deficiente (por exemplo, na célula ou tecido) no mamífero que está sendo tratado para o LSD.
[0320] Em algumas modalidades, o terapêutico de reposição de proteínas é uma enzima. Qualquer número de agentes (por exemplo, terapêutica de reposição de proteínas, como enzimas) pode ser ligado a polipeptídeos ou proteínas (por exemplo, que se ligam ao TfR) para o tratamento de vários LSDs.
Em algumas modalidades, o agente é uma enzima que diminui o acúmulo de um produto metabólico tóxico no cérebro do mamífero com o LSD em maior extensão quando ligado ao polipeptídeo ou à proteína em comparação com quando a enzima está ligada ao polipeptídeo ou à proteína de referência. Em algumas modalidades, a enzima é a iduronato de 2-sulfatase (IDS) e o LSD é a síndrome de Hunter. Em alguns exemplos, o produto metabólico tóxico compreende dissacarídeos derivados de sulfato de heparina e/ou dissacarídeos derivados de sulfato de dermatano. Em algumas modalidades, a enzima é N- sulfoglucosamina sulfohidrolase (SGSH) e o LSD é a síndrome de Sanfilippo. Em algumas modalidades, a enzima é a esfingomielinase ácida (ASM) e o LSD é a doença de Niemann-Pick. Em algumas modalidades, a enzima é a - glucocerebrosidase (GBA) e a doença de LSd Gaucher.
[0321] Em algumas modalidades, o agente (por exemplo, agente terapêutico) compreende uma região variável de anticorpo. Em algumas modalidades, o agente compreende um fragmento de anticorpo. Em algumas modalidades, o agente compreende um Fab ou um scFv. Em algumas modalidades, o agente não compreende uma região variável de anticorpo. Em alguns casos, o agente não compreende um Fab anti-beta secretase 1 (BACE1).
Modalidades adicionais e Ligantes
[0322] Um polipeptídeo (por exemplo, um polipeptídeo de domínio CH3 ou CH2 modificado, conforme descrito neste documento mais adiante) pode ser ligado a outro domínio de uma região Fc. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de domínio CH3 modificado é unido a um domínio CH2, que pode ser um domínio CH2 de ocorrência natural ou um domínio CH2 variante, tipicamente na extremidade de terminal C do domínio CH2. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de domínio CH2 modificado é unido a um domínio CH3, que pode ser um domínio CH3 de ocorrência natural ou um domínio CH3 variante, tipicamente na extremidade de terminal N do domínio CH3. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreendendo um domínio CH2 modificado associado a um domínio CH3, ou o polipeptídeo compreendendo o domínio CH3 modificado unido a um domínio CH2, compreende ainda uma região de dobradiça parcial ou completa de um anticorpo, resultando em um formato no qual o polipeptídeo de domínio CH3 modificado ou polipeptídeo de domínio CH2 modificado faz parte de uma região Fc com uma região de dobradiça parcial ou completa. A região de dobradiça pode ser de qualquer subclasse ou isotipo de imunoglobulina. Uma dobradiça de imunoglobulina ilustrativa é uma região de dobradiça de IgG, como uma região de dobradiça de IgG1, por exemplo, sequência de aminoácidos de dobradiça de IgG1 humana EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 95).
[0323] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de ligação a TfR manipulado, peptídeo de ligação a TfR ou anticorpo de ligação a TfR é fundido a um peptídeo ou proteína que é útil para a purificação de proteínas, por exemplo, polistidina, marcadores de epítopo, por exemplo, FLAG, c-Myc, marcadores de hemaglutinina e similares, glutationa S transferase (GST), tioredoxina, proteína A, proteína G ou proteína de ligação à maltose (MBP). Em alguns casos, o peptídeo ou proteína ao qual o polipeptídeo de ligação a TfR manipulado, peptídeo de ligação a TfR ou anticorpo de ligação a TfR é fundido pode compreender um sítio de clivagem de protease, como um sítio de clivagem para o Fator Xa ou trombina.
[0324] Nos métodos da presente divulgação, um agente (por exemplo, agente terapêutico) está ligado a um polipeptídeo ou proteína (por exemplo, um polipeptídeo de ligação a TfR manipulado, um peptídeo de ligação a TfR ou um anticorpo de ligação a TfR). O ligante pode ser qualquer ligante adequado para unir um agente ao polipeptídeo ou proteína. Em algumas modalidades, a ligação é clivável enzimaticamente. Em certas modalidades, a ligação é clivável por uma enzima presente no sistema nervoso central.
[0325] Em algumas modalidades, o ligante é um ligante peptídico.
O ligante peptídico pode ser configurado de modo a permitir a rotação do agente (por exemplo, agente terapêutico) e do polipeptídeo ou proteína em relação um ao outro; e/ou é resistente à digestão por proteases. Em algumas modalidades, o ligante pode ser um ligante flexível, por exemplo, contendo aminoácidos como Gly, Asn, Ser, Thr, Ala e similares. Esses ligantes são projetados usando parâmetros conhecidos. Por exemplo, o ligante pode ter repetições, como Gly- Ser.
[0326] Em várias modalidades, a ligação do agente (por exemplo, agente terapêutico) ao polipeptídeo ou proteína (por exemplo, polipeptídeo de ligação a TfR manipulado, peptídeo de ligação a TfR ou anticorpo de ligação a TfR) pode ser obtida usando a ligação química conhecida que reticula reagentes e protocolos. Por exemplo, existe um grande número de agentes de reticulação química que são conhecidos dos versados na técnica e úteis para reticular o polipeptídeo ou a proteína com um agente de interesse. Por exemplo, os agentes de reticulação são reticuladores heterobifuncionais, que podem ser usados para ligar moléculas de maneira gradual. Os reticuladores heterobifuncionais fornecem a capacidade de projetar métodos de acoplamento mais específicos para a conjugação de proteínas, reduzindo assim as ocorrências de reações colaterais indesejadas, como polímeros de homoproteínas.
[0327] O agente (por exemplo, agente terapêutico) pode estar ligado à região de terminal N ou terminal C do polipeptídeo ou proteína, ou ligado a qualquer região do polipeptídeo ou proteína (por exemplo, polipeptídeo de ligação a TfR manipulado, peptídeo de ligação a TfR ou anticorpo de ligação a TfR), desde que o agente não interfira na ligação do polipeptídeo ou proteína a um receptor de transferrina.
[0328] Em outros aspectos, são fornecidas composições e kits farmacêuticos compreendendo uma proteína de fusão descrita neste documento.
Composições Farmacêuticas
[0329] As orientações para a preparação de formulações para uso na presente divulgação podem ser encontradas em qualquer número de manuais para preparação e formulação farmacêutica que são conhecidos pelos versados na técnica.
[0330] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica compreende uma proteína de fusão, conforme descrito neste documento e compreende adicionalmente um ou mais carreadores e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
[0331] Em algumas modalidades, o carreador é adequado para administração subcutânea, intratecal, ocular, intracerebroventricular, intramuscular, oral, intraperitoneal, transdêrmica, tópica ou subcutânea.
Carreadores farmaceuticamente aceitáveis podem conter um ou mais compostos fisiologicamente aceitáveis os quais agem, por exemplo, estabilizando a composição ou aumentando ou diminuindo a absorção do polipeptídeo. Compostos fisiologicamente aceitáveis podem incluir, por exemplo, carboidratos, tais como glicose, sucrose, ou dextranos, antioxidantes, como ácido ascórbico ou glutationa, agentes quelantes, proteínas de baixo peso molecular, composições que reduzem a depuração ou hidrólise dos agentes ativos, ou excipientes ou outros estabilizantes e/ou tampões. Outros carreadores farmaceuticamente aceitáveis e suas formulações também estão disponíveis na técnica.
[0332] As composições farmacêuticas descritas neste documento podem ser fabricadas, por exemplo, por meio de processos de mistura convencional, dissolução, granulação, produção de drágeas, emulsificação, encapsulação, aprisionamento ou liofilização. Os seguintes métodos e excipientes são exemplificativos.
[0333] Para administração oral, uma proteína de fusão descrita neste documento pode ser formulada combinando-a com carreadores farmaceuticamente aceitáveis que são conhecidos na técnica. Esses carreadores permitem que a proteína de fusão seja formulada como comprimidos, pílulas, drágeas, cápsulas, emulsões, suspensões lipofílicas e hidrofílicas, líquidos, géis, xaropes, pastas fluidas, suspensões e similares, para ingestão oral por um paciente a ser tratado. As preparações farmacêuticas para uso oral podem ser obtidas pela mistura da proteína de fusão com um excipiente sólido, opcionalmente triturando uma mistura resultante, e processando a mistura de grânulos, após a adição de auxiliares adequados, se desejado, para obter núcleos de comprimidos ou drágeas. Excipientes adequados incluem, por exemplo, preenchedores, tais como açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol ou sorbitol; preparações de celulose, tais como, por exemplo, amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, goma tragacanto, metil celulose, hidroxipropilmetil-celulose, carboximetilcelulose de sódio, e/ou polivinilpirrolidona (PVP). Se desejado, agentes desintegrantes podem ser adicionados, tais como a polivinilpirrolidona reticulada, ágar, ou ácido algínico ou um sal dos mesmos, tais como alginato de sódio.
[0334] Como divulgado acima, uma proteína de fusão como descrita neste documento pode ser formulada para administração parentérica por injeção, por exemplo, por injeção em bolo ou infusão contínua. Para injeção, a proteína de fusão pode ser formulada em preparações por dissolução, suspensão ou emulsão destes em um solvente aquoso ou não aquoso, tal como óleos vegetais ou outros similares, glicerídeos de ácidos alifáticos sintéticos, ésteres de ácidos alifáticos superiores ou propilenoglicol; e, se desejado, com aditivos convencionais, tais como solubilizantes, agentes isotônicos, agentes de suspensão, agentes de emulsão, estabilizantes e conservantes. Em algumas modalidades, a proteína de fusão pode ser formulada em soluções aquosas, como tampões fisiologicamente compatíveis, exemplos não limitativos dos quais incluem solução de Hanks, solução de Ringer e tampão fisiológico salino. As formulações para injeção podem ser apresentadas sob forma de dosagem de unidade, por exemplo, em ampolas ou em recipientes de doses múltiplas, com um conservante adicionado. As composições podem tomar essas formas, como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos e podem conter agentes formulatórios, como agentes de suspensão, estabilização e/ou de dispersão.
[0335] Em algumas modalidades, uma proteina de fusão como a descrita neste documento é preparada para distribuição em uma formulação de liberação sustentada, liberação controlada, liberação prolongada, liberação programada ou liberação retardada, por exemplo, em matrizes semi-permeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o agente ativo. Vários tipos de materiais de liberação sustentada foram estabelecidos e são bem conhecidos daqueles versados na técnica. As formulações de liberação prolongada atuais incluem comprimidos revestidos com película, sistemas multiparticulados ou de grânulos, tecnologias de matriz utilizando materiais hidrofílicos ou lipofílicos e comprimidos à base de cera com excipientes formadores de poros.
Normalmente, as formulações de liberação sustentada podem ser preparadas utilizando polímeros de ocorrência natural ou sintéticos, por exemplo, polímero de vinilpirrolidona, tais como polivinilpirrolidona (PVP); polímeros hidrofílicos carboxivinílicos; hidrocoloides hidrofóbicos e/ou hidrofílicos, tais como metilcelulose, etilcelulose, hidroxipropilcelulose e hidroxipropilmetilcelulose; e carboxipolimetileno.
[0336] Tipicamente, uma composição farmacêutica para uso em administração in vivo é estéril. A esterilização pode ser realizada de acordo com métodos conhecidos na técnica, por exemplo, esterilização por calor, esterilização a vapor, filtração estéril ou irradiação.
[0337] As dosagens e a concentração de fármaco desejada das composições farmacêuticas descritas neste documento podem variar dependendo da utilização particular prevista. Dosagens adequadas também são descritas na Seção XII acima.
Kits
[0338] Em algumas modalidades, é fornecido um kit para uso no tratamento de um LSD, por exemplo, síndrome de Hunter, síndrome de Sanfilippo A, doença de Niemann-Pick, doença de Gaucher ou doença de Parkinson, compreendendo uma proteína de fusão como descrito neste documento.
[0339] Em algumas modalidades, o kit compreende ainda um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Por exemplo, em algumas modalidades, o kit compreende uma proteína de fusão como descrito neste documento e compreende ainda um ou mais agentes terapêuticos adicionais para uso no tratamento de sintomas neurológicos de um LSD. Em algumas modalidades, o kit compreende ainda materiais instrucionais contendo instruções (ou seja, protocolos) para a prática dos métodos descritos neste documento (por exemplo, instruções para usar o kit para administrar uma proteína de fusão compreendendo a enzima de ERT através da barreira hematoencefálica).
Enquanto os materiais instrucionais compreendem tipicamente materiais impressos ou escritos, eles não estão limitados a tais. Qualquer meio capaz de armazenar tais instruções e comunicá-las a um usuário final é contemplado por esta divulgação. Tais meios de comunicação incluem, mas não são limitados a mídia de armazenamento eletrônico (por exemplo, discos magnéticos, fitas, cartuchos, chips), mídia óptica (por exemplo, CD-ROM) e semelhantes. Tais meios podem incluir endereços de sites de internet que provêm tais materiais instrucionais.
[0340] A presente divulgação será descrita em maior detalhe por meio de exemplos específicos. Os exemplos a seguir são apresentados apenas para fins ilustrativos, não sendo destinados a impor limitações à divulgação, de qualquer maneira. Os versados na técnica reconhecerão facilmente uma variedade de parâmetros não críticos que podem ser alterados ou modificados para produzir essencialmente os mesmos resultados. Esforços foram feitos para garantir a precisão em relação aos números utilizados (por exemplo, quantidades, temperaturas, etc.), mas alguns erros e desvios experimentais podem estar presentes. A prática da presente divulgação empregará, salvo indicação em contrário, métodos convencionais da proteína da química, bioquímica, técnicas de recombinação de DNA e farmacológica, dentro do âmbito da técnica. Essas técnicas são totalmente explicadas na literatura. Além disso, deve ser evidente para um especialista na técnica que os métodos de engenharia aplicados a certas bibliotecas também podem ser aplicados a outras bibliotecas descritas neste documento.
Exemplo 1. Construção de Proteínas de Fusão Compreendendo Iduronato 2-Sulfatase (IDS).
Projeto e clonagem
[0341] Foram projetadas proteínas de fusão IDS-Fc que contêm (i) um polipeptídeo de fusão onde uma enzima IDS humana madura é fundida a um fragmento de IgG1 humana que inclui a região Fc (um "polipeptídeo de fusão IDS-Fc") e (ii) um fragmento de IgG1 humana modificada que contém mutações na região Fc que conferem ligação ao receptor de transferrina (TfR) (um "polipeptídeo Fc modificado"). Em particular, foram criados polipeptídeos de fusão IDS-Fc nos quais os fragmentos de IDS foram fundidos ao terminal N ou C da região Fc de IgG1 humana. Em alguns casos, um ligante foi colocado entre os fragmentos IDS e IgG1 para aliviar qualquer impedimento estérico entre os dois fragmentos. Em todos os construtos, o peptídeo sinal da cadeia kappa V-III, aminoácidos 1-20 (UniProtKB ID - P01661) foi inserido a montante da fusão para facilitar a secreção e o IDS foi truncado para consistir nos aminoácidos S26-P550 (UniProtKB ID - P22304). O fragmento da região Fc de IgG1 humana utilizado corresponde aos aminoácidos D104-K330 da sequência em UniProtKB ID P01857 (posições 221-447, numeração EU, que inclui 10 aminoácidos da dobradiça (posições 221-230)). Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo Fc derivado dos resíduos de IgG1 humana D104-K330, mas sem a fusão IDS, foi co-transfectado com o polipeptídeo de fusão IDS-Fc, a fim de gerar proteínas de fusão heterodiméricas com uma enzima IDS (uma "monoenzima").
Em alguns construtos, os fragmentos de IgG1 continham mutações adicionais para facilitar a heterodimerização das duas regiões Fc. As proteínas de fusão
IDS-Fc de controle que não possuem as mutações que conferem a ligação ao TfR foram projetadas e construídas de forma análoga, com a diferença de que essas proteínas não possuíam as mutações que conferem a ligação ao TfR.
Como controle adicional, geramos IDS (aminoácidos S26-P550) com uma tag hexa-histidina de terminal C (SEQ ID NO: 241) para facilitar a detecção e purificação.
[0342] As proteínas de fusão IDS-Fc de ligação a TfR utilizadas nos exemplos são dímeros formados por um polipeptídeo de fusão IDS-Fc e um polipeptídeo Fc modificado que se liga ao TfR. Para dímeros em que a enzima IDS está ligada ao terminal N da região Fc, o polipeptídeo de fusão IDS-Fc pode ter a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 115, 231 e 235. Nestas sequências, a sequência IDS está sublinhada e contém uma cisteína na posição 59 (sublinhado duplo) modificada para formilglicina. A IDS foi ligada ao polipeptídeo Fc por um ligante GGGGS (SEQ ID NO: 239). Uma porção de uma região de dobradiça de IgG1 (DKTHTCPPCP; SEQ ID NO: 113) foi incluída no terminal N do polipeptídeo Fc. A sequência do domínio CH2 começa na posição 541 da SEQ ID NOS: 115, 231 e 235.
[0343] A proteína de fusão IDS-Fc ETV: IDS 35.21 usada nos exemplos é um dímero formado por um polipeptídeo de fusão IDS-Fc tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 115, 231 e 235 e um polipeptídeo Fc modificado que se liga ao TfR tendo a sequência da SEQ ID NO: 116. Os 10 primeiros aminoácidos são uma porção de uma região de dobradiça de IgG1. A sequência do domínio CH2 começa na posição 11 da SEQ ID NO: 116.
[0344] A proteína de fusão IDS-Fc ETV: IDS 35.21.17.2 usada nos exemplos é um dímero formado por um polipeptídeo de fusão IDS-Fc tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 115, 231 e 235 e um polipeptídeo Fc modificado que se liga ao TfR tendo a sequência da SEQ ID NO: 228. Os 10 primeiros aminoácidos são uma porção de uma região de dobradiça de IgG1. A sequência do domínio CH2 começa na posição 11 da SEQ ID NO: 228.
[0345] A proteína de fusão IDS-Fc ETV: IDS 35.23.2 usada nos exemplos é um dímero formado por um polipeptídeo de fusão IDS-Fc tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 115, 231 e 235 e um polipeptídeo Fc modificado que se liga ao TfR tendo a sequência da SEQ ID NO: 229. Os 10 primeiros aminoácidos são uma porção de uma região de dobradiça de IgG1. A sequência do domínio CH2 começa na posição 11 da SEQ ID NO: 229.
[0346] A proteína de fusão IDS-Fc ETV: IDS 35.21.17 usada nos exemplos é um dímero formado por um polipeptídeo de fusão IDS-Fc tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 115, 231 e 235 e um polipeptídeo Fc modificado que se liga ao TfR tendo a sequência da SEQ ID NO: 151. O terminal N do polipeptídeo Fc modificado pode incluir uma porção de uma região de dobradiça de IgG1 (por exemplo, SEQ ID NO: 113).
Expressão e purificação de proteínas recombinantes
[0347] Para expressar a enzima IDS recombinante fundida a uma região Fc, as células ExpiCHO (Thermo Fisher Scientific) foram transfectadas com construções de DNA relevantes usando o kit de transfecção Expifectamine™ CHO de acordo com as instruções do fabricante (Thermo Fisher Scientific). As células foram cultivadas no meio de expressão ExpiCHO™ a 37°C, 6% de CO2 e 120 rpm em um agitador orbital (Infors HT Multitron). Em resumo, as células ExpiCHO™ em crescimento logarítmico foram transfectadas a uma densidade de 6x106 células/ml com 0,8 µg de plasmídeo de DNA por mL de volume de cultura. Após a transfecção, as células retornaram a 37°C e as culturas transfectadas foram suplementadas com alimentação, conforme indicado, 18-22 horas após a transfecção. Os sobrenadantes da cultura de células transfectadas foram colhidos 120 horas após a transfecção por centrifugação a 3.500 rpm a partir de 20 minutos. Os sobrenadantes clarificados foram filtrados (membrana de 0,22 µM) e armazenados a 4°C. A expressão de uma enzima IDS marcada com epítopo (usada como controle) foi realizada como descrito acima com pequenas modificações. Em resumo, uma enzima IDS que abriga uma tag hexa-histidina de terminal C (SEQ ID NO: 241) foi expressa em células ExpiCHO.
[0348] As proteínas de fusão IDS-Fc com (ou sem) regiões Fc manipuladas que conferem ligação ao TfR foram purificadas a partir de sobrenadantes da cultura de células utilizando cromatografia de afinidade por Proteína A. Os sobrenadantes foram carregados em uma coluna de afinidade por Proteína A HiTrap MabSelect SuRe (GE Healthcare Life Sciences usando um Sistema Akta Pure). Depois a coluna foi lavada com > 20 volumes de coluna (CVs) de PBS. As proteínas ligadas foram eluídas usando tampão citrato/NaOH 100 mM e pH 3,0 contendo NaCl 150 mM. Imediatamente após a eluição, as frações foram neutralizadas utilizando 1 M de tampão succinato de arginina 670 mM, pH 5,0 (a uma diluição de 1:5). A homogeneidade das proteínas de fusão IDS-Fc nas frações eluídas foi avaliada por SDS-PAGE redutora e não redutora.
[0349] Para purificar a enzima IDS marcada com hexahistadina (SEQ ID NO: 241), os sobrenadantes transfectados foram exaustivamente dialisados contra 15 L de HEPES 20 mM, pH 7,4, contendo NaCl 100 mM durante a noite. Os sobrenadantes dialisados foram ligados a uma coluna HisTrap (GE Healthcare Life Sciences usando um Sistema Akta Pure). Após ligação, a coluna foi lavada com 20 CV de PBS. As proteínas ligadas foram eluídas usando PBS contendo imidazol 500 mM. A homogeneidade da enzima IDS nas frações eluídas foi avaliada por SDS-PAGE redutora e não redutora. As frações agrupadas contendo a enzima IDS foram diluídas 1:10 em Tris 50 mM, pH 7,5 e adicionalmente purificadas utilizando Q Sepharose High Performance (GE Healthcare). Após ligação, a coluna foi lavada com 10 CV de Tris 50 mM, pH 7,5.
As proteínas ligadas foram eluídas usando um gradiente linear para Tris 50 mM, pH 7,5 e NaCl 0,5 M, e coletadas em frações de 1 CV. A pureza da fração foi avaliada por SDS-PAGE não redutora. Como mostrado na FIGURA 1, a purificação produziu proteínas de fusão IDS-Fc homogêneas e enzima IDS marcada com hexahistidina (SEQ ID NO: 241).
Exemplo 2. Caracterização de proteínas de fusão IDS.
As proteínas de fusão IDS-Fc com o local de ligação de TfR manipulado se ligam ao TfR humano
[0350] Para determinar se as proteínas de fusão IDS-Fc com ligação de TfR manipulada afetam a capacidade do domínio Fc modificado de interagir com o TfR humano, a afinidade dessa proteína pelo TfR humano foi avaliada usando um ensaio de ressonância plasmônica de superfície Biacore™.
Os chips sensores Biacore™ Série S CM5 foram imobilizados com Fab anti- humano (kit de captura Fab humano da GE Healthcare). 5 µg/mL das proteínas de fusão IDS-Fc foram capturados por 1 minuto em cada célula de fluxo e diluições em série de 3 vezes do domínio apical humano TfR foram injetadas a uma taxa de fluxo de 30 µL/min. Cada amostra foi analisada com uma associação em 3 minutos e dissociação em 3 minutos. Após cada injeção, o chip foi regenerado usando Glicina-HCl 10 mM (pH 2,1). A resposta de ligação foi corrigida subtraindo as RU de uma célula de fluxo capturando uma IgG irrelevante com densidade semelhante. As afinidades em estado estacionário foram obtidas ajustando a resposta em equilíbrio contra a concentração usando o Software de Avaliação Biacore™ T200 v3.1. Como mostrado na FIGURA 2, a análise Biacore™ estabeleceu que as proteínas de fusão IDS-Fc com um local de ligação ao TfR manipulado na região Fc se ligam ao TfR humano. A análise Biacore™ também estabeleceu que a proteína de fusão IDS-Fc ETV:IDS 35.21 se liga ao TfR humano com uma afinidade de aproximadamente 200 nM.
As proteínas de fusão IDS-Fc com o local de ligação de TfR manipulado são ativas in vitro, nas células e in vivo
[0351] A atividade in vitro e celular das proteínas de fusão IDS-Fc de ligação ao TfR manipuladas foi avaliada para demonstrar que o IDS mantém sua atividade enzimática quando fundido ao fragmento de IgG humana. A atividade in vitro foi medida com um ensaio enzimático fluorométrico de duas etapas usando um substrato artificial. Especificamente, 20 µL de substrato de sal dissódico do ácido 2-sulfato de 4-metilumbeliferil a-L-idopiranosidurônico 1 mM (Carbosynth Limited, #EM03201) foram diluídos no tampão de ensaio (acetato de sódio 100 mM, acetato de chumbo 10 mM, Triton X-100 0,05%, pH 5,0) e misturado com 10 µL de 0,2 nM de IDS. A primeira reação foi incubada por 4 horas a 37°C e finalizada com 60 µl de tampão fosfato-citrato 0,2 M, pH 5,0. Então, a segunda reação foi realizada na presença de 15 µg de lisado de células HEK 293T transfectadas transientemente com α-iduronidase humana (IDUA), incubadas por 16 horas a 37°C e interrompidas com a adição de 100 μL do tampão de carbonato de sódio 0,5 M, pH 10,5. A fluorescência da solução reacional foi então medida (excitação a 365 nm e emissão a 450 nm). Uma curva padrão de 4-metilumbeliferona foi ajustada por regressão linear para calcular a quantidade de produto e verificada como menos de 10% da clivagem total do substrato. A atividade específica (nmol de produto/min/nmol IDS) foi calculada dividindo a quantidade de produto pelo tempo de reação e quantidade molar de IDS.
[0352] O ensaio de atividade enzimática in vitro demonstrou que as proteínas de fusão IDS-Fc estavam ativas e indicou que a fusão de uma região Fc com IDS não interfere na atividade enzimática (FIGURA 3).
[0353] As células de inativação (KO) de IDS foram geradas usando CRISPR/CAS9 para fornecer um sistema celular para testar a atividade celular das proteínas de fusão IDS-Fc manipuladas. As células HEK 293T (ATCC) foram transfectadas com o vetor CRISPR/CAS9 pCas-Guide-EF1a-GFP (Origene) contendo sequências guia direcionadas para a segunda metade do exon 1 no IDS humano. Os clones de célula única foram analisados quanto à presença de indels na sequência genômica do IDS, seguido pelo Kit de Detecção de Mutação Guide-it (Clontech), de acordo com as instruções do fabricante. Para identificar células IDS KO, os lisados de células clones indel positivas foram analisados utilizando o ensaio de enzima IDS in vitro descrito acima. Resumidamente, o ensaio de atividade in vitro foi realizado usando lisado de células de 12,5, 25, 50 e 100 µg em tampão de ensaio de acetato de chumbo pH 5,0 (acetato de sódio 100 mM, acetato de chumbo 10 mM, NaAzida 0,02%) como descrito anteriormente (Vozyni et al., J. Inherit. Metab. Dis., 24:675-80 (2001)). A reação foi iniciada combinando 10 μL de lisado de células normalizado (em água) com 1 mM de substrato em 20 μL de tampão de acetato de chumbo. A primeira reação foi incubada por 4 horas a 37°C e finalizada com 60 µl de tampão fosfato-citrato 0,2 M, pH 5,0. Então, a segunda reação foi realizada com a adição de 10 µg/10 µL de lisado de células HEK 293T transfectadas transientemente com α- iduronidase humana (IDUA) e deixada prosseguir por 24 horas a 37°C e interrompida com o adição de 100 µl de tampão de carbonato de sódio 0,5 M, pH 10,3. A fluorescência da solução reacional foi então medida (excitação a 365 nm e emissão a 450 nm). A atividade de IDS nos clones HEK 293T CRISPR foi comparada com o IDS recombinante usado como padrão de ensaio, lisados de tipo selvagem (WT) HEK e lisados de células HEK que superexpressam IDS.
Clones com níveis de atividade enzimática comparáveis ao sinal de fundo tiveram a sequência verificada após clonagem mini-Topo (ThermoFisher) e confirmados como clones KO. Os ensaios de células subsequentes utilizam três clones IDS KO únicos e verificados e três lotes independentes de células WT HEK 293T.
[0354] Para testar a atividade celular da enzima IDS nua ou das proteínas de fusão IDS-Fc, foi desenvolvido um ensaio glicêmico baseado em LC-MS/MS que permite monitorar a quantidade de acumulação de substrato (sulfato de heparano e sulfato de dermatano) como um indicador da atividade da
IDS. A acumulação de substrato foi medida em células IDS KO antes e depois da adição de proteínas de fusão IDS ou IDS-Fc ao meio de cultura celular.
Resumidamente, as células foram lavadas três vezes com PBS, granuladas e congeladas. Os grânulos de células foram sonicados em tampão de digestão com dissacarídeos (111 mM de NH4OAc, 11 mM CaOAc, pH 7,0). A concentração de proteína foi medida usando o ensaio BCA (Pierce). Foi adicionada proteína total (100 µg) a 100 µl de tampão de digestão com DTT 2 mM, 1,25 mUI de Heparinase I (Galen), 1,25 mUI de Heparinase II (Galen), 1,25 mUI de Heparinase III (Galen) e 6,25 mUI de Condroitinase B (Galen). A digestão com sulfato de heparano e sulfato de dermatano foi concluída após três horas a 30°C, depois foram adicionados 20 ng de padrão interno (4UA-2S-GlcNCOEt-6S HD009 [Galen]) a cada amostra. As enzimas foram desativadas pela adição de 6 µl de EDTA 250 mM e as amostras foram fervidas a 95°C por 10 minutos. As amostras foram então centrifugadas a 16.000 x G por 5 minutos à temperatura ambiente. O sobrenadante foi transferido para um filtro centrífugo Amicon Ultra 30KD (Millipore) e centrifugado a 14.000 x G por 15 minutos. Os dissacarídeos foram concentrados no fluxo e ressuspensos em uma mistura de tampão de ensaio:acetonitrila de [1:1, v/v], que foi então transferido para os frascos de espectrometria de massa para análise adicional.
[0355] A análise dos dissacarídeos gerados pela digestão enzimática de sulfato de heparano e sulfato de dermatano foi realizada por cromatografia líquida (sistema Shimadzu Nexera X2, Shimadzu Scientific Instrument, Columbia, MD, EUA) acoplada à espectrometria de massa por eletropulverização (Sciex 6500+ QTRAP, Sciex, Framingham, MA, EUA). Para cada análise, 10 µL da amostra foram injetados em uma coluna ACQUITY UPLC BEH Amide 1,7 µm, 2,1×150 mm (Waters Corporation, Milford, Massachusetts, EUA) usando uma taxa de fluxo de 0,4 mL/min. com temperatura da coluna de 50°C. A fase móvel A consistiu em água com formato de amônio 10 mM e ácido fórmico a 0,1%. A fase móvel B consistiu em acetonitrila com ácido fórmico a 0,1%. O gradiente foi programado da seguinte forma: 0,0–1,0 minuto a 85% B, 1,0–5,0 minutos de 85% B a 50% B, 5,0–6,0 minutos de 50% B a 85% B, 6-8,0 minutos mantendo a 85% B. A ionização por eletropulverização foi realizada no modo de íons negativos, aplicando as seguintes configurações: gás de cortina a 30; o gás de colisão configurado para médio; voltagem de pulverização de íons a -4500; temperatura a 450; gás fonte de íons 1 a 50; gás fonte de íons 2 em 60.
A aquisição dos dados foi realizada usando o Analyst 1.6.3 (Sciex) no modo de monitoramento de reações múltiplas (MRM), com tempo de permanência de 25 (ms). Energia de colisão a -30; potencial de desagregação a -80; potencial de entrada a -10; potencial de saída da célula de colisão a -10. GAGs foram detectadas como [M--H]- usando as seguintes transições MRM: D0A0 em m/z 378,1> 87,0; D0a0 em m/z 378,1 > 175,0; D0S0 em m/z 416,1 > 138,0; D0a4 em m/z 458,1> 300,0; D0A6, D2A0, D0a6, D2a0 em m/z 458,1 > 97,0; D0S6, D2S0 em m/z 496,0c> 416,1; D2a4, D2a6, D0a10, D2A6 em m/z 538,0 > 458,0; D0S6 em m/z 575,95 > 97,0 4UA-2S-GlcNCOEt-6S em m/z 472,0 (fragmento de íon) > 97,0 foi usado como padrão interno (I.S.). GAGs foram identificadas com base em seus tempos de retenção e as transições MRM correspondem aos padrões de referência disponíveis comercialmente (Iduron Ltd, Manchester, Reino Unido). A quantificação foi realizada usando o MultiQuant 3.0.2 (Sciex) pela razão de área para I.S. GAGs foram normalizadas para a quantidade total de proteína. A concentração de proteína foi medida usando o ensaio BCA (Pierce).
[0356] Acumulação significativa de substrato, como refletido na quantidade de dissacarídeos observados após a digestão de sulfato de heparano e sulfato de dermatano, foi observado nas células IDS KO em comparação às linhagens celulares de controle, um efeito que poderia ser resgatado com a adição de IDS recombinante às células (FIGURA 4). Isso validou que o ensaio baseado em LC-MS/MS pode ser usado para avaliar a atividade celular das proteínas de fusão IDS e IDS-Fc.
[0357] Usando este ensaio, foi estabelecido que o tratamento de células com proteínas de fusão IDS-Fc como uma monoenzima do terminal N (ou seja, ETV:IDS 35.21.17) ou uma monoenzima do terminal C compreendendo o mesmo polipeptídeo Fc de ligação ao TfR (ou seja, CH3C.35.21.17) reduziu os níveis de dissacarídeos derivados de sulfato de heparano e sulfato de dermatano de volta aos observados em células de tipo selvagem (FIGURA 5A). Além disso, a atividade da monoenzima do terminal N era comparável à da IDS (FIGURA 5B). Juntos, esses dados demonstram que as proteínas de fusão IDS-Fc mantêm atividade enzimática e podem reduzir a acumulação de substrato nas células IDS KO.
[0358] A atividade celular das proteínas de fusão IDS-Fc também foi examinada em fibroblastos de pacientes com MPS II e controles saudáveis usando um ensaio de pulse-chase 35S, no qual o 35S é integrado a GAGs recém- sintetizadas, como descrito anteriormente (Lu et al., Bioconjugate Chemistry, 21: 151-156 (2010)). Os fibroblastos dos pacientes com MPS II não têm atividade detectável de IDS, levando a uma acumulação de substrato aproximada de 10 vezes e acumulação de 2,5 vezes do sinal 35S (FIGURA 5C). Semelhante às células IDS KO, as proteínas de fusão IDS-Fc, como ETV:IDS 35.23.2, foram altamente eficazes em células derivadas de pacientes com MPS II, exibindo um EC50 celular picomolar baixo para reduzir a acumulação de proteínas marcadas com S35 (FIGURA 5C). Além disso, a atividade celular de proteínas de fusão IDS- Fc, como ETV:IDS 35.23.2, demonstrou ser dependente de M6PR, pois um excesso de M6P inibiu a depuração de proteínas marcadas com 35S em fibroblastos de pacientes com MPS II tratados (FIGURA 5D). Coletivamente, esses dados demonstram que o tráfego dependente de M6PR e a atividade celular de IDS podem ser mantidos no formato da proteína de fusão IDS-Fc.
[0359] Para medir os dissacarídeos derivados de sulfato de heparano e sulfato de dermatano in vivo, o ensaio glicêmico baseado em LC- MS/MS foi adaptado para análise a partir de tecidos e fluidos. Resumidamente, todos os tecidos e fluidos foram coletados e imediatamente congelados e armazenados a -80°C. As amostras foram submetidas a 5 ciclos de congelamento e descongelamento e processadas como descrito acima para análise celular. Observou-se acumulação significativa de dissacarídeos derivados de sulfato de heparano e sulfato de dermatano em todos os tecidos e fluidos analisados em camundongos IDS KO machos em comparação aos controles de irmãos de ninhada do tipo selvagem machos (Tabela 1). Este ensaio é utilizado para estudos da eficácia das proteínas de fusão in vivo. Os camundongos IDS KO foram obtidos no laboratório The Jackson Laboratory (cepa JAX 024744).
Tabela 1. Análise glicêmica de tecidos e fluidos de camundongos IDS KO.
Quantidade de dissacarídeos Mudança em vezes totais derivados de HS e DS Mesmo Tipo (em peso) (proteína ng/100μg)
WT IDS KO Fígado 86,3 6,3 (+/- 0,4) 543,6 (+/- 14,7) Rim 14,1 29,3 (+/- 0,9) 413,4 (+/- 6,1) Pulmão 9,0 40,3 (+/- 6,9) 362,6 (+/- 37,0) Cérebro 8,8 5,8 (+/- 0,5) 51,3 (+/- 2,5) Baço 7,4 19,5 (+/- 5,8) 145,2 (+/- 5,3) Plasma 49,1 0,4 (+/- 0,03) 20,0 (+/- 5,1) Soro 43,1 0,5 (+/- 0,03) 23,5 (+/- 4,8) CSF 20,1 0,04 (+/- 0,78 (+/- 0,05) 0,007)
Urina 13,8 38,83* (+/- 537,3* (+/- 92,9) 1,4)
[0360] Usando esse método, os níveis de dissacarídeos derivados do sulfato de heparano e sulfato de dermatano foram avaliados no soro de camundongos do tipo selvagem (WT) dosados com veículo e camundongos IDS KO dosados com IDS ou uma proteína de fusão IDS-Fc (ou seja, ETV:IDS
35.21). As medições da linha de base antes da dosagem demonstraram acumulação significativa de dissacarídeos derivados de sulfato de heparano e de sulfato de dermatano no soro de camundongos IDS KO em comparação com camundongos WT. Após dosagem com a proteína de fusão IDS-Fc, os níveis de dissacarídeos derivados de sulfato de heparano e sulfato de dermatano foram significativamente reduzidos no soro de IDS KO, apresentando uma redução comparável à observada no soro de camundongos IDS KO dosados com IDS (FIGURA 6). Estes dados demonstram que a proteína de fusão IDS-Fc é ativa in vivo e pode reduzir a acumulação de substrato em camundongos IDS KO. Com base nesses dados, a distribuição e a resposta farmacodinâmica (PD) foram avaliadas em tecidos de camundongos IDS KO sete dias após uma dose única da proteína de fusão IDS-Fc. Camundongos IDS KO receberam por via intravenosa 40 mg/kg da proteína de fusão IDS-Fc ou 5,3 mg/kg de IDS (dose molar equivalente a 25%) como controle positivo, e os níveis de GAG foram avaliados. A distribuição de ambas as moléculas nos tecidos periféricos foi confirmada duas horas após a dose. Observou-se redução significativa do substrato no fígado, baço e pulmão de camundongos IDS KO sete dias após a dosagem com a proteína de fusão IDS-Fc (FIGURA 7).
[0361] Para determinar se as proteínas de fusão IDS-Fc de ligação ao TfR apresentaram melhor distribuição cerebral em comparação com uma proteína de fusão IDS-Fc de controle, camundongos knock-in TfR humanos (TfRms/hu KI) foram dosados com 50 mg/kg da proteína de fusão IDS-fc de ligação ao TfR ETV:IDS 35.21 ou uma proteína de fusão IDS-Fc de controle sem as mutações que conferem ligação ao TfR ("IDS: Fc") e a concentração da proteína de fusão IDS-Fc no cérebro foi medida usando um ensaio sanduíche baseado em ELISA descrito no Exemplo 3 abaixo, 4 horas após a dose. Os camundongosTfRms/hu KI foram gerados como descrito na Publicação de Patente Internacional Nº WO 2018/152285 utilizando a tecnologia CRISPR/Cas9 para expressar o domínio apical de Tfrc humano dentro do gene Tfrc murino; o TfR quimérico resultante foi expresso in vivo sob o controle do promotor endógeno.
Níveis significativamente mais altos da proteína de fusão IDS-Fc ETV:IDS 35.21 foram detectados no cérebro em comparação com a proteína de fusão IDS-Fc de controle, com uma concentração cerebral média de 23,7 nM para ETV:IDS
35.21 (FIGURA 8). A absorção cerebral de duas proteínas de fusão IDS-Fc de ligação a TfR adicionais, ETV:IDS 35.21.17.2 e ETV:IDS 35.23.2, foi avaliada usando camundongos TfRms/hu KI. Os camundongosTfRms/hu KI foram dosados com 50 mg/kg de ETV:IDS 35.21.17.2, ETV:IDS 35.23.2 ou a proteína de fusão IDS-Fc de controle ("IDS:Fc") e a concentração da proteína de fusão IDS-Fc no cérebro foi medida usando o ensaio sanduíche baseado em ELISA 2 horas e 8 horas após a dose. A administração das proteínas de fusão IDS-Fc de ligação ao TfR levou a um aumento de 5 vezes na absorção cerebral em relação à proteína de fusão IDS-Fc de controle em 2 horas e a um aumento de 10 a 20 vezes na concentração cerebral 8 horas após a dose (FIGURA 9A). A PK sérica e a acumulação da proteína de fusão intacta no fígado foram equivalentes para ETV:IDS 35.21 e IDS:Fc (FIGURA 9B), indicando que a fração IDS determina em grande parte a fase de distribuição da depuração plasmática. Os níveis cerebrais das proteínas de fusão IDS-Fc de ligação ao TfR permaneceram elevados por oito horas, diminuindo ligeiramente com a depuração periférica.
Juntos, estes dados demonstram que a interação entre proteínas de fusão IDS- Fc de ligação ao TfR com o TfR geralmente mantém distribuição periférica,
melhorando significativamente a exposição cerebral.
Administração intravenosa de ETV:IDS reduz GAGs no cérebro
[0362] Para examinar se a melhor exposição cerebral observada com as proteínas de fusão IDS-Fc de ligação a TfR descritas acima e preparadas de acordo com o Exemplo 1 (referido neste documento como ETV:IDS) produziu uma redução correspondente de substratos acumulados no cérebro, um modelo de camundongo deficiente em IDS que abriga o domínio apical de TfR humano colocado no TfR murino foi gerado (referido neste documento como camundongos IDS KO x TfRms/hu KI). Resumidamente, camundongos TfRms/hu KI machos foram cruzados com camundongos heterozigotos IDS fêmeas para gerar camundongos IDS KO em um fundo homozigótico TfRms/hu KI. Todos os camundongos utilizados neste estudo eram do sexo masculino e alojados em um ciclo claro-escuro de 12 horas com acesso ad libitum a alimentos (LabDiet JL irradiado em 6F) e água.
[0363] Os camundongos IDS KO x TfRms/hu KI receberam por via intravenosa doses únicas ou quatro doses semanais de ETV:IDS ou IDS (747 µmol de produto/min/kg ou 40 mg/kg e 14,2 mg/kg, respectivamente) equivalentes à atividade e as respostas farmacocinéticas e farmacodinâmicas foram avaliadas. Em particular, o efeito da administração periférica de ETV:IDS no cérebro e tecido GAG em camundongos IDS KO x TfRms/hu KI foi determinado usando camundongos IDS KO x TfRms/hu KI de 2 meses de idade, injetados intravenosamente (i.v.) com solução salina, IDS (14,2 mg/kg de peso corporal) ou ETV:IDS (40 mg/kg de peso corporal) uma vez (n=8) ou uma vez por semana durante 4 semanas (n=8). Camundongos TfRms/hu KI irmãos de ninhada de 2 meses de idade, injetados com solução salina i.v. uma vez (n=5) ou uma vez por semana durante 4 semanas (n=5), foram utilizados como controle. Para animais dosados com IDS ou ETV:IDS, amostras de soro em vida foram coletadas por sangramento submandibular em vários momentos. Todos os animais foram sacrificados 7 dias após a dose única ou 7 dias após a última dose de 4 semanas.
Urina, soro, líquido cefalorraquidiano (LCR), fígado, rim, baço, pulmão, coração e hemicérebro direito foram dissecados e congelados rapidamente em gelo seco.
[0364] Após uma dose única, o ETV:IDS exibiu um perfil de depuração sérica semelhante ao de IDS, avaliado usando um ensaio baseado em ELISA descrito no Exemplo 3 abaixo para detectar a concentração de IDS, fornecendo suporte adicional de que a enzima determina em grande parte a depuração periférica (FIGURA 10A). Níveis cerebrais de ETV:IDS aumentaram significativamente em comparação com IDS duas horas após a dose, com uma concentração média de 8,4 e 1,6 nM, respectivamente, e os níveis de ETV:IDS no fígado e no baço aumentaram significativamente em comparação com IDS (FIGURA 10B).
[0365] Para determinar se o ETV:IDS reduz os níveis de substrato no cérebro, os níveis de GAG foram avaliados como descrito no Exemplo 2 em camundongos IDS KO x TfRms/hu KI após uma dose única ou quatro doses semanais da enzima. IDS diminuiu marginalmente os níveis de GAG no cérebro nos primeiros momentos, mas foi ineficaz em diminuir significativamente GAGs após quatro semanas de tratamento (FIGURA 10C). ETV:IDS, no entanto, reduziu os níveis de GAG no cérebro em aproximadamente 58% após uma dose única e em 71% após quatro semanas de tratamento (FIGURA 10C). Isto levou a uma redução concomitante das GAG do LCR em aproximadamente 75% após uma dose única que foi mantida após quatro semanas de dosagem (FIGURA 10C). Ambas as moléculas reduziram efetivamente os níveis de GAG no fígado e baço após uma semana, e a resposta foi mantida com doses repetidas (FIGURA 10C), demonstrando que a ligação ao TfR não afeta negativamente as respostas farmacodinâmicas nesses tecidos. Juntos, esses dados demonstram que ETV:IDS aumenta significativamente a exposição cerebral da enzima e reduz de maneira robusta a acumulação de substrato no SNC e periférico.
Exemplo 3. Caracterização Farmacocinética de Proteínas de Fusão IDS.
[0366] Este exemplo descreve a caracterização farmacocinética (PK) de proteínas de fusão IDS-Fc manipuladas no plasma de camundongos.
[0367] Para determinar a meia-vida plasmática e a depuração das proteínas de fusão IDS-Fc que se ligam ao TfR, camundongos C57BL/6 machos de 7 a 8 semanas de idade foram dosados com 10 mg/kg de duas moléculas da proteína de fusão IDS-Fc (uma monoenzima do terminal N e uma monoenzima do terminal C) por injeção nas veias da cauda. A concentração de proteínas de fusão IDS-Fc restantes no plasma por um período de 24 horas foi medida usando um ensaio baseado em ELISA. Resumidamente, a concentração de proteínas de fusão IDS-Fc no plasma de camundongos foi quantificada usando um sanduíche ELISA. Um anticorpo de captura anti-Fc (Abcam #ab124055) foi revestido em uma placa MaxiSorp™ de 384 poços (Thermo Scientific #464718) a 3 µg/mL. A placa foi bloqueada com BSA a 5% e depois incubada com plasma diluído para 1:1.000 ou 1:10.000. Em seguida, um anticorpo policlonal de detecção anti-IDS (R&D Systems #AF2449) foi adicionado a 0,5 µg/mL, seguido por um anticorpo anti-cabra-HRP. As placas foram desenvolvidas usando substrato TMB, interrompidas com ácido sulfúrico e a absorvância a 450 nm foi medida em um leitor de placas BioTek. As curvas padrão foram os construtos individuais de 200-0,1 ng/mL em uma série de diluição de 4 vezes e foram ajustadas usando uma regressão logística de quatro parâmetros.
[0368] Utilizando este ensaio, foi estabelecido que a meia-vida plasmática terminal das proteínas de fusão IDS-Fc é de 7,7 a 10 horas (Tabela 2). Não foram observados passivos imprevistos de PK com proteínas de fusão IDS-Fc in vivo.
Tabela 2. Farmacocinética das proteínas de fusão IDS-Fc em camundongos durante 24 horas.
Cl CL Terminal Descrição de Dose (mg/kg) (mL/h/kg) (ml/d/kg) t1/2 ETV:IDS (horas) Monenozima do 10 22,0 528 10 terminal N Monoenzima do 10 42,6 1020 7,7 terminal C Exemplo 4. Construção de Proteínas de Fusão Compreendendo Esfingomielinase Ácida (ASM).
Projeto e clonagem
[0369] Foram projetadas proteínas de fusão ASM-Fc como dímeros de um polipeptídeo de fusão, em que uma enzima ASM humana madura é fundida a um fragmento de IgG1 humana que inclui a região Fc (um "polipeptídeo de fusão ASM-Fc"). Em algumas modalidades, um polipeptídeo de fusão ASM- Fc compreende uma região Fc modificada contendo mutações que conferem ligação ao receptor da transferrina (TfR). Em particular, foram criados polipeptídeos de fusão ASM-Fc nos quais os fragmentos de ASM foram fundidos ao terminal N da região Fc de IgG1 humana. Em alguns casos, um ligante foi colocado entre os fragmentos ASM e IgG1 para aliviar qualquer impedimento estérico entre os dois fragmentos. Em todos os construtos, a sequência de sinal ASM nativa, aminoácidos 1-46 (UniProtKB ID - P17405), foi removida e substituída por um sinal de secreção da cadeia kappa V-III, aminoácidos 1-20 (UniProtKB ID - P01661), para melhorar a secreção de ASM. Adicionalmente, nas proteínas de fusão, o ASM foi truncado no seu terminal C, terminando no aminoácido Q620, para impedir qualquer clivagem indesejada entre ASM e a região Fc de IgG1 humana. Um fragmento da região Fc de IgG1 humana (UniProtKB ID - P01857) foi então colocado na estrutura com o terminal C de ASM começando no aminoácido E99, com a cisteína na posição 103 sendo mutada para serina. Em algumas modalidades, os fragmentos de IgG1 continham mutações adicionais para facilitar a heterodimerização das duas regiões Fc. Além disso, as proteínas de fusão ASM-Fc foram geradas contendo uma ou duas moléculas de ASM. Como controle, as proteínas de fusão ASM- hexahistidina (SEQ ID NO: 241) foram projetadas consistindo nos aminoácidos ASM 1-628, truncadas para remover a cisteína do terminal C e promover a ativação enzimática e uma tag de hexahistidina fundida no terminal C (SEQ ID NO: 241).
Expressão e purificação de proteínas recombinantes
[0370] Para expressar a enzima ASM recombinante fundida com uma região Fc, as células ExpiCHO-S (Thermo Fisher) foram transfectadas a uma densidade de 6x106 células/ml com o complexo Expifectamine CHO/DNA plasmídeo de acordo com as instruções do fabricante (Thermo Fisher Scientific).
Após a transfecção, as células foram incubadas a 32°C com uma atmosfera umidificada de 6-8% de CO2 em um agitador orbital (Infors HT Multitron). No dia um após a transfecção, o intensificador de Expifectamine e a alimentação de Expifectamine foram adicionados à cultura. O sobrenadante do meio foi colhido por centrifugação após tempo de expressão de 48-72 horas. O sobrenadante clarificado foi suplementado com inibidor de protease livre de EDTA (Roche) e armazenado a -80°C.
[0371] Para purificação da proteína de fusão ASM-Fc, o sobrenadante do meio clarificado foi suplementado com 200 µM de acetato de zinco (Sigma Aldrich). O sobrenadante foi carregado na coluna de afinidade por Proteína A HiTrap MabSelect SuRe (GE Healthcare Life Sciences) e lavado com arginina 200 mM e tampão de succinato 137 mM, pH 5,0 (tampão de succinato de arginina). As proteínas de fusão foram eluídas em tampão de citrato QB 100 mM, pH 3,0, suplementado com 200 µM de acetato de zinco. Imediatamente após a eluição, o tampão de succinato de arginina foi adicionado para ajustar o pH. Os agregados de proteínas foram separados das proteínas de fusão ASM- Fc por cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) na coluna Superdex 200 Increase 10/300 GL (GE Healthcare Life Sciences). A fase móvel SEC foi mantida em tampão de succinato de arginina de pH 5,0 suplementado com 200 µM de acetato de zinco. Todas as etapas de cromatografia foram realizadas utilizando um sistema Akta Pure System ou Akta Avant (GE Healthcare Life Sciences). A pureza da fração foi avaliada por SDS-PAGE não redutora. Como mostrado na FIGURA 11, a purificação produziu proteínas de fusão ASM-Fc homogêneas. Exemplo 5. Caracterização de Proteínas de Fusão ASM.
As proteínas de fusão ASM-Fc são ativas in vitro e nas células
[0372] Para demonstrar que ASM mantém sua atividade enzimática quando fundida à cadeia pesada de IgG humana, foram avaliadas a atividade celular e in vitro das proteínas de fusão ASM-Fc. A atividade in vitro da enzima ASM recombinante ou proteínas de fusão ASM-Fc recombinantes foram medidas usando um análogo cromogênico sintético da esfingomielina.
Especificamente, misturou-se 2-(N-hexadecanoilamino)-4-nitrofenilfosforilcolina 2,5 mM (EMD Millipore) com ASM 0,75 nM em tampão de acetato de sódio 100 mM (pH 5,3; concentrações finais em 100 μL de volume de reação). A reação foi incubada por 16 horas a 37°C e interrompida com a adição de um volume igual de NaOH a 0,2 M. A absorvância da solução de reação foi então medida a 410 nm. Uma curva padrão de p-nitrofenol foi ajustada por regressão linear para calcular a quantidade de produto e verificada como menos de 10% da clivagem total do substrato. A atividade específica (nmol de produto/min/nmol ASM) foi calculada dividindo a quantidade de produto pelo tempo de reação e quantidade molar de ASM. O ensaio de atividade enzimática in vitro demonstrou que as proteínas de fusão ASM-Fc são ativas e indicam que a fusão de uma região Fc com ASM não interfere com sua atividade enzimática (FIGURA 12).
[0373] As células ASM KO foram geradas usando CRISPR/CAS9 para fornecer um sistema celular para testar a atividade celular das proteínas de fusão ASM-Fc. As células HEK 293T (ATCC) foram transfectadas com o vetor CRISPR/CAS9 pCas-Guide-EF1a-GFP (Origene) contendo sequências guia direcionadas para a segunda metade do exon 2 no SMPD1 humano. Os clones de célula única foram analisados quanto à presença de indels na sequência genômica de ASM, seguido pelo Kit de Detecção de Mutação Guide-it (Clontech), de acordo com as instruções do fabricante. Os lisados de células clones positivas para indel foram submetidos a um ensaio enzimático ASM in vitro usando o substrato cromogênico ASM 2-N-hexadecanoilamino-4-nitrofenilfosforilcolina (EMD Millipore). Resumidamente, o ensaio de atividade in vitro foi realizado usando 12,5, 25, 50 e 100 μg de lisado de células em tampão de acetato de sódio 100 mM (pH 5,3). A reação foi iniciada pela adição de substrato a 2,5 mM e interrompida após 20 horas com a adição de NaOH a 0,2 M. A atividade de ASM nos clones HEK293T CRISPR foi comparada com a ASM recombinante usada como padrão de ensaio, lisados de tipo selvagem (WT) HEK e lisados de células HEK que superexpressam ASM. Clones com níveis de atividade enzimática comparáveis ao sinal de fundo tiveram a sequência verificada após clonagem mini-Topo (Thermo Fisher Scientific) e confirmados como clones KO.
Os ensaios de células subsequentes usaram três clones ASM KO únicos e verificados e três lotes independentes de células WT HEK293T.
[0374] Para testar a atividade celular da enzima ASM nua ou das proteínas de fusão ASM-Fc, foram desenvolvidos dois ensaios celulares que permitem monitorar a quantidade de acumulação de substrato (esfingomielina) nas células ASM KO basicamente e após o tratamento com fusões ASM ou ASM- Fc. Primeiro, um ensaio baseado em imagem foi desenvolvido para monitorar a quantidade de acumulação de C5-esfingomielina conjugada com BODIPY em células ASM KO. Resumidamente, as células HEK293T WT e ASM KO foram revestidas em suplemento DMEM com 10% de FBS (Gibco) a baixa densidade em placas de 96 poços revestidas com PDL (Perkin Elmer). Quatro horas após o revestimento, enzima ASM recombinante, proteínas de fusão ASM-Fc ou tampão de controle foram adicionados a cada poço e incubados por 48 horas a 37°C. O meio foi removido, substituído por meio fresco contendo 1 µM de BODIPY-C5-esfingomielina (Thermo Fisher Scientific) e incubado a 37°C por 16 horas. As células foram então lavadas com PBS, fixadas com paraformaldeído a 4% e coradas com colorações nucleares (DAPI, Thermo Fisher) e citoplasmáticas (máscara de células vermelhas distantes, Thermo Fisher Scientific). As imagens foram adquiridas no microscópio confocal Opera Phenix (Perkin Elmer) com uma objetiva 63X com múltiplos campos por poço e poços triplicados por condição. A análise das imagens foi realizada usando o software Harmony (Perkin Elmer), que detecta e analisa a intensidade total média, número de pontos e intensidade de pontos de BODIPY-C5-esfingomielina com base em cada célula. A média destes valores por célula foi então calculada para um valor por poço, que foi usada para analisar o efeito do genótipo e/ou tratamento na acumulação de BODIPY-C5-esfingomielina. Foi observada uma acumulação significativa de BODIPY-C5-esfingomielina nas células ASM KO em comparação com as linhagens celulares de controle, um efeito que poderia ser resgatado com a adição da enzima ASM recombinante e proteínas de fusão ASM-Fc (FIGURA 13).
[0375] Para verificação adicional de que as proteínas de fusão ASM-Fc mantêm sua atividade nas células, um ensaio baseado em LC-MS/MS foi desenvolvido para monitorar a acumulação de esfingomielina endógena nas células ASM KO. As células HEK293T WT e ASM KO foram cultivadas e tratadas com enzima como descrito acima. 68 horas após o revestimento, com ou sem tratamento com proteína de fusão ASM ou ASM-Fc, as células foram lavadas cuidadosamente com PBS e os lipídios foram extraídos com uma mistura de água:metanol [1:1, v/v], com adição dos padrões internos apropriados. Os lipídios foram extraídos usando metil-terc-butil éter (MTBE), agitados em vórtex e centrifugados a 10.000 × g e 4°C por 10 minutos. A fração superior de MTBE contendo lípidos foi então evaporada até secar sob fluxo de nitrogênio suave. Os lipídios foram ressuspensos em uma mistura de isopropanol:acetonitrila:água [2:1:1, v/v/v] e depois transferidos para frascos de espectrometria de massa para análise adicional.
[0376] As análises lipídicas foram realizadas por cromatografia líquida (sistema Shimadzu Nexera X2, Shimadzu Scientific Instrument, Columbia, MD, EUA), acoplada à espectrometria de massa por eletropulverização (Sciex 6500+ QTRAP, Sciex, Framingham, MA, EUA). Para cada análise, 5 µL da amostra foram injetados em uma coluna BEH C18 de 1,7 µm, 2,1 × 100 mm (Waters Corporation, Milford, Massachusetts, EUA), usando uma taxa de fluxo de 0,25 mL/min a 55°C. A fase móvel A consistiu em 60:40 acetonitrila/água (v/v) com formiato de amônio 10 mM + ácido fórmico a 0,1%. A fase móvel B consistiu em 90:10 isopropanol/acetonitrila (v/v) com formiato de amônio 10 mM + ácido fórmico a 0,1%. O gradiente foi programado da seguinte forma: 0,0–8,0 minutos de 45% B a 99% B, 8,0–10,0 minutos a 99% B, 10,0– 10,1 minutos a 45% B e 10,1–12,0 minutos a 45% B. Ionização por eletropulverização foi realizada no modo de íons positivos, aplicando as seguintes configurações: gás de cortina a 20; gás de colisão configurado para médio; voltagem de pulverização de íons a 5200; temperatura a 250; gás fonte de íons 1 em 50; gás de fonte de íons 2 em 60. A aquisição dos dados foi realizada usando o Analyst 1.6. (Sciex) no modo de monitoramento de reações múltiplas (MRM). Energia de colisão a 40; potencial de desagregação a 80; potencial de entrada a 10; potencial de saída da célula de colisão em 12,5. As ceramidas (Cer) foram detectadas como [M-H2O+H]+ usando as seguintes transições de MRM: Cer d18:1/16:0 em m/z 538,5>264,3; Cer d18:1/18:0 em m/z
566,6>264,3; Cer d18:1/20:0 em m/z 594,6>264,3; Cer d18:1/22:0 em m/z 622,6>264,3; Cer d18:1/24:0 em m/z 650,6>264,3; Cer d18:1/24:1 em m/z 648,6>264,3; Cer d18:1/17:0 em m/z 552,4>264,3 usadas como padrão interno.
As esfingomielinas (SM) foram detectadas como [M+H]+ usando as seguintes transições de MRM: SM d18:1/16:0 em m/z 703,7>184,1; SM d18:1/18:0 em m/z 731,7>184,1; SM d18:1/20:0 em m/z 759,7>184,1; SM d18:1/22:0 em m/z 787,7>184,1; SM d18:1/24:0 em m/z 815,7>184,1; SM d18:1/24:1 em m/z 813,7>184,1; SM d18:1/18:1 (d9) em m/z 738,7>184,1 usadas como padrão interno. Os lipídios foram identificados com base em seus tempos de retenção e nas propriedades de MRM dos padrões de referência disponíveis comercialmente (Avanti Polar Lipids, Birmingham, AL, EUA). A quantificação foi realizada usando o MultiQuant 3.02 (Sciex). Os lipídios foram normalizados para a quantidade total de proteína. A concentração de proteína foi medida usando o ensaio BCA (Pierce). A análise LC-MS/MS demonstrou que as proteínas de fusão ASM-Fc podem reduzir os níveis de esfingomielina endógena nas células ASM KO, de volta ao observado nas células do tipo selvagem (FIGURA 14).
Adicionalmente, as proteínas de fusão ASM-Fc foram tão potentes quanto a enzima ASM nua na redução da esfingomielina em ambos os ensaios (Tabela 3).
Tabela 3. As proteínas de fusão ASM-Fc apresentam potência semelhante à da ASM em ensaios celulares.
Molécula EC50 EC50 (LC/MS-MS) (Ensaio de imagens) ASM 0,32 nM 0,47 nM ASM-Fc 0,25 nM 0,22 nM
[0377] Juntos, esses dados demonstram que as proteínas de fusão
ASM-Fc mantêm sua atividade e podem resgatar a acumulação de substrato em células com deficiência de ASM.
Exemplo 6. Construção de proteínas de fusão compreendendo N- Sulfoglucosamina Sulfohidrolase (SGSH).
Projeto e clonagem
[0378] Foram projetadas proteínas de fusão SGSH-Fc que contêm (i) um polipeptídeo de fusão onde uma enzima SGSH humana madura é fundida a um fragmento de IgG1 humana que inclui a região Fc (um "polipeptídeo de fusão SGSH-Fc") e (ii) um fragmento de IgG1 humana modificada que contém mutações na região Fc que conferem ligação ao receptor de transferrina (TfR) (um "polipeptídeo Fc modificado"). Em particular, foram criados polipeptídeos de fusão SGSH-Fc nos quais os fragmentos de SGSH foram fundidos ao terminal N ou C da região Fc de IgG1 humana. Em alguns casos, um ligante foi colocado entre os fragmentos SGSH e IgG1 para aliviar qualquer impedimento estérico entre os dois fragmentos. Em todos os construtos, o peptídeo sinal da cadeia kappa V-III, aminoácidos 1-20 (UniProtKB ID - P01661) foi inserido a montante da fusão para facilitar a secreção e o SGSH foi truncado para consistir nos aminoácidos S21-P502 (UniProtKB ID - P51688). O fragmento da região Fc de IgG1 humana utilizado corresponde aos aminoácidos D104-K330 da sequência em UniProtKB ID P01857 (posições 221-447, numeração EU, que inclui 10 aminoácidos da dobradiça (posições 221-230)). Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo Fc derivado dos resíduos de IgG1 humana D104-K330 contendo mutações na região Fc que conferem ligação ao TfR, mas sem a fusão SGSH, foi co-transfectado com o polipeptídeo de fusão SGSH-Fc, a fim de gerar proteínas de fusão heterodiméricas com uma enzima SGSH (uma "monoenzima"). Em outras modalidades, o segundo polipeptídeo Fc derivado dos resíduos de IgG1 humana D104-K330 contendo mutações na região Fc que conferem ligação a TfR e fundido a SGSH foi co-transfectado com o polipeptídeo de fusão SGSH-Fc para gerar proteínas de fusão heterodiméricas com duas enzimas SGSH (uma "bienzima"). Em alguns construtos, os fragmentos de IgG1 continham mutações adicionais para facilitar a heterodimerização das duas regiões Fc. As proteínas de fusão SGSH-Fc de controle que não possuem as mutações que conferem a ligação ao TfR foram projetadas e construídas de forma análoga. Como um controle adicional, SGSH (aminoácidos R21-L502) foi gerada com uma tag hexa-histidina no terminal C (SEQ ID NO: 241) para facilitar a detecção e purificação.
[0379] As proteínas de fusão SGSH-Fc compreendendo a ligação ao TfR usadas nos exemplos são dímeros formados por um polipeptídeo de fusão SGSH-Fc e um polipeptídeo Fc modificado que se liga ao TfR, em que o polipeptídeo Fc modificado não possui a fusão SGSH (uma "monoenzima") ou é fundido a uma segunda molécula de SGSH (um "bienzima").
[0380] Um polipeptídeo de fusão SGSH-Fc compreendendo uma sequência SGSH humana madura fundida com o terminal N de uma sequência de polipeptídeo Fc IgG1 com mutações hole e LALA tem a sequência da SEQ ID NO: 149. A enzima SGSH foi juntada ao polipeptídeo Fc por um ligante GGGGS (SEQ ID NO: 239) e o terminal N do polipeptídeo Fc incluiu uma porção de uma região de dobradiça de IgG1 (DKTHTCPPCP; SEQ ID NO: 113).
[0381] Um polipeptídeo de fusão SGSH-Fc compreendendo uma sequência SGSH humana madura fundida ao terminal C de uma sequência de polipeptídeo IgG1 Fc com mutações hole e LALA tem a sequência da SEQ ID NO: 150. A enzima SGSH foi juntada ao polipeptídeo Fc por um ligante GGGGS (SEQ ID NO: 239) e o terminal N do polipeptídeo Fc pode incluir uma porção de uma porção de dobradiça de IgG1 (por exemplo, SEQ ID NO: 113).
[0382] Um polipeptídeo Fc modificado que se liga ao TfR compreendendo a sequência do clone CH3C.35.21.17 (SEQ ID NO: 58) com mutações knob e LALA tem a sequência da SEQ ID NO: 151. O terminal N do polipeptídeo Fc modificado pode incluir uma porção de uma região de dobradiça de IgG1 (por exemplo, SEQ ID NO: 113).
[0383] Uma "monoenzima do terminal N" contendo uma única molécula de SGSH no terminal N do polipeptídeo Fc foi formada entre as SEQ ID NOS: 149 e 151. Uma "monoenzima do terminal C" contendo uma única molécula de SGSH no terminal C do polipeptídeo Fc foi formada entre as SEQ ID NOS: 150 e 151.
[0384] Um polipeptídeo Fc modificado que se liga ao TfR compreendendo uma sequência SGSH humana madura fundida com o terminal N da sequência do clone CH3C.35.21.17 (SEQ ID NO: 58) com mutações knob e LALA tem a sequência da SEQ ID NO: 154. A enzima SGSH foi juntada ao polipeptídeo Fc modificado por um ligante GGGGS (SEQ ID NO: 239) e o terminal N do polipeptídeo Fc modificado incluiu uma porção de uma região de dobradiça de IgG1 (SEQ ID NO: 113).
[0385] Uma "bienzima do terminal N" contendo uma primeira molécula de SGSH no terminal N do polipeptídeo Fc e uma segunda molécula de SGSH no terminal N do polipeptídeo Fc modificado foi formada entre as SEQ ID NOS: 149 e 154.
Expressão e purificação de proteínas recombinantes
[0386] Para expressar a enzima SGSH recombinante fundida a uma região Fc, as células ExpiCHO (Thermo Fisher Scientific) foram transfectadas com construtos de DNA relevantes usando o kit de transfecção Expifectamine™ CHO de acordo com as instruções do fabricante (Thermo Fisher Scientific). As células foram cultivadas no meio de expressão ExpiCHO™ a 37°C, 6% de CO2 e 120 rpm em um agitador orbital (Infors HT Multitron). Em resumo, as células ExpiCHO™ em crescimento logarítmico foram transfectadas a uma densidade de 6x106 células/ml com 0,8 µg de plasmídeo de DNA por mL de volume de cultura. Após a transfecção, as células retornaram a 37°C e as culturas transfectadas foram suplementadas com alimentação, conforme indicado, 18-22 horas após a transfecção. Os sobrenadantes da cultura de células transfectadas foram colhidos 120 horas após a transfecção por centrifugação a 3.500 rpm a partir de 20 minutos. Os sobrenadantes clarificados foram filtrados (membrana de 0,22 µM) e armazenados a 4°C. A expressão de uma enzima SGSH marcada com epítopo (usada como controle) foi realizada como descrito acima com pequenas modificações. Em resumo, uma enzima SGSH que abriga uma tag hexa-histidina no terminal C (SEQ ID NO: 241) foi expressa em células ExpiCHO.
[0387] As proteínas de fusão SGSH-Fc com (ou sem) regiões Fc manipuladas que conferem ligação ao TfR foram purificadas a partir de sobrenadantes da cultura de células utilizando cromatografia de afinidade por Proteína A. Os sobrenadantes foram carregados em uma coluna de afinidade por Proteína A HiTrap MabSelect SuRe (GE Healthcare Life Sciences usando um Sistema Akta Pure). Depois a coluna foi lavada com > 20 volumes de coluna (CVs) de PBS. As proteínas ligadas foram eluídas usando tampão citrato 100 mM/NaOH pH 3,0 contendo NaCl 150 mM. Imediatamente após a eluição, as frações foram neutralizadas utilizando 1 M de tampão de succinato de arginina 670 mM, pH 5,0 (a uma diluição de 1:5). A homogeneidade de fusões de SGSH- Fc nas frações eluídas foi avaliada por SDS-PAGE redutora e não redutora.
[0388] Para purificar SGSH marcada com hexa-histidina (SEQ ID NO: 241), os sobrenadantes transfectados foram exaustivamente dialisados contra 15 L de HEPES 20 mM, pH 7,4, contendo NaCl 100 mM durante a noite e imidazol 20 mM foi adicionado aos sobrenadantes dialisados antes da purificação. Os sobrenadantes dialisados foram ligados a uma coluna HisTrap (GE Healthcare Life Sciences usando um Sistema Akta Pure). Após a ligação, a coluna foi lavada com 20 CV de PBS. As proteínas ligadas foram eluídas usando PBS contendo imidazol 500 mM. A homogeneidade da enzima SGSH nas frações eluídas foi avaliada por SDS-PAGE redutora e não redutora. As frações agrupadas contendo a enzima SGSH foram diluídas 1:10 em Tris 50 mM, pH 7,5 e adicionalmente purificadas utilizando Q Sepharose High Performance (GE Healthcare). Após ligação, a coluna é lavada com 10 CV de Tris 50 mM, pH 7,5.
As proteínas ligadas são eluídas usando um gradiente linear para Tris 50 mM, pH 7,5 e NaCl 0,5 M, e coletadas em frações de 1 CV. A pureza da fração é avaliada por SDS-PAGE não redutora. A purificação produz proteínas de fusão SGSH-Fc homogêneas e SGSH marcada com hexahistidina (SEQ ID NO: 241).
Exemplo 7. Caracterização de Proteínas de Fusão SGSH. As proteínas de fusão SGSH-Fc com o local de ligação de TfR manipulado se ligam ao TfR humano
[0389] Para determinar se as proteínas de fusão SGSH-Fc com ligação ao TfR manipuladas afetam a capacidade do domínio Fc modificado de interagir com o TfR humano, a afinidade dessa proteína pelo TfR humano pode ser avaliada usando um ensaio de ressonância plasmônica de superfície Biacore™. Os chips sensores Biacore™ Série S CM5 são imobilizados com Fab anti-humano (kit de captura Fab humano da GE Healthcare). 5 µg / mL das proteínas de fusão SGSH-Fc são capturados por 1 minuto em cada célula de fluxo e diluições em série de 3 vezes do domínio apical humano TfR são injetadas a uma taxa de fluxo de 30 µL/min. Cada amostra é analisada com uma associação em 3 minutos e dissociação em 3 minutos. Após cada injeção, o chip é regenerado usando Glicina-HCl 10 mM (pH 2,1). A resposta de ligação é corrigida subtraindo as RU de uma célula de fluxo capturando uma IgG irrelevante com densidade semelhante. As afinidades em estado estacionário são obtidas ajustando a resposta em equilíbrio contra a concentração usando o Software de Avaliação Biacore™ T200 v3.1. A análise Biacore™ estabelece que as proteínas de fusão SGSH-Fc com um sítio de ligação ao TfR manipulado na região Fc se ligam ao TfR humano.
As proteínas de fusão SGSH-Fc com o local de ligação de TfR manipulado são ativas in vitro e nas células
[0390] A atividade in vitro e celular das proteínas de fusão SGSH- Fc de ligação ao TfR manipuladas foi avaliada para demonstrar que a SGSH mantém sua atividade enzimática quando fundida ao fragmento de IgG humana.
A atividade in vitro da SGSH recombinante foi medida usando um ensaio enzimático fluorimétrico de duas etapas usando um substrato artificial.
Especificamente, 20 L de substrato de sal de sódio 4-metilumbeliferil 2-desoxi- 2-sulfamino-a-D-glucopiranosídeo 1 mM (Carbosynth Limited, #EM06602) diluídos no tampão de ensaio (acetato de sódio 0,03 M, NaCl 0,12 M, pH 6,5) foram misturados com 10 L de SGSH 40 nM. A primeira reação foi incubada por 17 horas a 37°C e depois finalizada com 10 L de tampão fosfato-citrato 0,2 M, pH 6,7. Em seguida, a segunda reação foi iniciada com a adição de 10 L (0,5 U) de α-Glucosidase de levedura (Sigma, #G0660-750UN), incubada por 24 horas a 37°C e interrompida com a adição de 100 L do tampão de carbonato de sódio 0,5 M, pH 10,3. A fluorescência da solução reacional foi então medida (excitação a 365 nm e emissão a 450 nm). Uma curva padrão de 4- metilumbeliferona foi ajustada por regressão linear para calcular a quantidade de produto e verificada como menos de 10% da clivagem total do substrato. A atividade específica (fmol de produto/min/pmol SGSH) foi calculada dividindo a quantidade de produto pelo tempo de reação e quantidade molar de SGSH.
[0391] O ensaio de atividade enzimática in vitro demonstrou que as proteínas de fusão SGSH-Fc estavam ativas e indicou que a fusão de uma região Fc com SGSH não interfere na atividade enzimática (FIGURA 15).
[0392] As células de inativação (KO) de SGSH foram geradas usando CRISPR/CAS9 para fornecer um sistema celular para testar a atividade celular dos polipetídeos SGSH-Fc manipulados. As células HEK 293T (ATCC) foram transfectadas com o vetor CRISPR/CAS9 pCas-Guide-EF1a-GFP
(Origene) contendo sequências guia direcionadas para o exon 2 a montante do sítio de cisteína reativa que gera a formilglicina na SGSH humana. Para identificar células SGSH KO, clones de célula única foram cultivados e os lisados de células foram submetidos ao ensaio de enzima SGSH in vitro descrito acima.
Resumidamente, o ensaio de atividade in vitro foi realizado utilizando 12,5, 25, 50 e 100 µg de lisado de células em tampão de ensaio de acetato de chumbo pH 5,0 (acetato de sódio 100 mM, acetato de chumbo 10 mM). A reação foi iniciada combinando 20 µL de lisado de células normalizado (em água) com 1 mM de substrato em 10 µL de tampão de acetato de chumbo (3X) e incubação a 37°C por dezessete horas. Esta primeira reação foi interrompida pela adição de 70 µL de 4x tampão de citrato fosfato pH 6,7 mais 0,5 U NAGLU (Sigma). A reação prosseguiu por 24 horas a 37°C e foi interrompida com a adição de 100 µL de carbonato de sódio 0,5 M, pH 10,3. A atividade de SGSH nos clones HEK293T CRISPR foi comparada com SGSH (R&D) recombinante usada como padrão de ensaio, lisados HEK de tipo selvagem (WT) e lisados de células HEK que superexpressam SGSH. Clones com níveis de atividade enzimática comparáveis ao sinal de fundo tiveram a sequência verificada após clonagem mini-Topo (ThermoFisher) e confirmados como clones KO. Os ensaios de células subsequentes usaram três clones SGSH KO únicos e verificados e três lotes independentes de células WT HEK293T.
[0393] Para testar a atividade celular da enzima SGSH nua ou das proteínas de fusão SGSH-Fc, foi desenvolvido um ensaio glicêmico baseado em LC-MS/MS que permite monitorar a quantidade de acumulação de substrato (sulfato de heparano) como um indicador da atividade da SGSH. A acumulação de substrato foi medida em células SGSH KO e células WT HEK293T. As células SGSH KO e as células WT HEK293T foram cultivadas por 24 horas e as células foram lavadas três vezes com PBS, granuladas e congeladas. Os grânulos de células foram sonicados em tampão de digestão com dissacarídeos (111 mM de
NH4OAc, 11 mM CaOAc, pH 7,0). A concentração de proteína foi medida usando o ensaio BCA (Pierce). Foi adicionada proteína total (100 µg) a 100 µl de tampão de digestão com DTT 2 mM, 1,25 mUI de Heparinase I (Galen), 1,25 mUI de Heparinase II (Galen) e 1,25 mUI de Heparinase III (Galen). A digestão com sulfato de heparano foi concluída após três horas a 30°C, depois foram adicionados 20 ng de padrão interno (4UA-2S-GlcNCOEt-6S HD009 [Galen]) a cada amostra. As enzimas foram desativadas pela adição de 6 µl de EDTA 250 mM e as amostras foram fervidas a 95°C por 10 minutos. As amostras foram então centrifugadas a 16.000 x G por 5 minutos à temperatura ambiente. O sobrenadante foi transferido para um filtro centrífugo Amicon Ultra 30KD (Millipore) e centrifugado a 14.000 x G por 15 minutos. Os dissacarídeos foram concentrados no fluxo e ressuspensos em uma mistura de tampão de ensaio:acetonitrila [1:1, v/v], que foi então transferido para os frascos de espectrometria de massa para análise adicional.
[0394] As análises GAG foram realizadas por cromatografia líquida (sistema Shimadzu Nexera X2, Shimadzu Scientific Instrument, Columbia, MD, EUA), acoplada à espectrometria de massa por eletropulverização (Sciex 6500+ QTRAP, Sciex, Framingham, MA, EUA). Para cada análise, 10 µL da amostra foram injetados em uma coluna ACQUITY UPLC BEH Amide 1,7 µm, 2,1×150 mm (Waters Corporation, Milford, Massachusetts, EUA) usando uma taxa de fluxo de 0,4 mL/min. com temperatura da coluna de 50°C. A fase móvel A consistiu em água com formato de amônio 10 mM e ácido fórmico a 0,1%. A fase móvel B consistiu em acetonitrila com ácido fórmico a 0,1%. O gradiente foi programado da seguinte forma: 0,0–1,0 minuto a 85% B, 1,0–5,0 minutos de 85% B a 50% B, 5,0–6,0 minutos de 50% B a 85% B, 6-8,0 minutos mantendo a 85% B. A ionização por eletropulverização foi realizada no modo de íons negativos, aplicando as seguintes configurações: gás de cortina a 30; o gás de colisão configurado para médio; voltagem de pulverização de íons a -4500; temperatura a 450; gás fonte de íons 1 a 50; gás fonte de íons 2 em 60. A aquisição dos dados foi realizada usando o Analyst 1.6.3 (Sciex) no modo de monitoramento de reações múltiplas (MRM), com tempo de permanência de 25 (ms). Energia de colisão a -30; potencial de desagregação a -80; potencial de entrada a -10; potencial de saída da célula de colisão a -10. As GAGs foram detectadas como [M--H]- usando as seguintes transições de MRM: D0A0 em m/z 378,1>87,0; D0a0 em m/z 378,1>175,0; D0S0 em m/z 416,1>138,0; D0a4 em m/z 458,1>300.0; D0A6, D2A0, D0a6, D2a0 em m/z 458,1>97,0; D0S6, D2S0 em m/z 496,0>416,1; D2a4, D2a6, D0a10, D2A6 em m/z 538,0>458,0; D0S6 em m/z 575,95>97,0 4UA-2S-GlcNCOEt-6S em m/z 472,0 (fragmento de íon) > 97,0 foi usado como padrão interno (I.S.). GAGs foram identificadas com base em seus tempos de retenção e as transições MRM correspondem aos padrões de referência disponíveis comercialmente (Iduron Ltd, Manchester, Reino Unido). A quantificação foi realizada usando o MultiQuant 3.0.2 (Sciex) pela razão de área para I.S. GAGs foram normalizadas para a quantidade total de proteína. A concentração de proteína foi medida usando o ensaio BCA (Pierce).
[0395] Acumulação significativa de substrato, como refletido na quantidade de dissacarídeos observados após a digestão de sulfato de heparano, foi observada nas células SGSH KO em comparação com as linhagens celulares de controle (FIGURA 16). Utilizando o ensaio glicêmico baseado em LC-MS/MS, foi estabelecido que o tratamento de células com uma proteína de fusão SGSH-Fc de ligação a TfR reduziu os níveis de dissacarídeos derivados de sulfato de heparano de volta ao observado em células de tipo selvagem (FIGURA 17). Juntos, estes dados demonstram que as proteínas de fusão SGSH-Fc mantém a atividade enzimática e podem reduzir a acumulação de substrato em células SGSH KO.
Exemplo 8. Ensaio in vitro para Atividade de SGSH.
[0396] Este exemplo fornece um ensaio de atividade in vitro alternativo para proteínas de fusão SGSH-Fc. O ensaio é adaptado de Karpova et al., J. Inherit. Metab. Dis., 19:278-285 (1996).
[0397] As misturas de reação padrão consistiram em 10-15 µg de proteína e 20 µL de MU-α-GlcNS (5 ou 10 mmol/L, respectivamente) em tampão barbital de acetato de sódio de Michaelis, pH 6,5 (29 mmol/L barbital de sódio, 29 mmol/L acetato de sódio, 0,68% (p/v) de NaCl, 0,02% (p/v) de azida de sódio; ajustado para pH 6,5 com HCl) e as misturas de reação foram incubadas por 17 horas a 37 °C. MU-α-GlcNS está disponível na Moscerdam Substrates. Após a primeira incubação, 6 µl de tampão fosfato/citrato de McIlvain, concentrado duas vezes, pH 6,7, contendo azida de sódio a 0,02% e 10 µl (0,1 U) de α-glucosidase de levedura (Sigma) em água foram adicionados e uma segunda incubação de 24 horas a 37°C foi realizada. Incubações longas a 37°C (17-24 h) foram realizadas em placas de 96 poços que foram seladas hermeticamente com fita adesiva larga, limitando a evaporação a < 15%. Em seguida, 200 µL de Na2CO3/NaHCO3 a 0,5 mol /L, pH 10,7, foram adicionados e a fluorescência da 4-metilumbeliferona liberada (MU) foi medida em um fluorímetro Fluoroskan (Titertek). A proteína foi determinada como descrito anteriormente (van Diggelen et al., Clin. Chim. Acta., 187: 131-139 (1990)).
Exemplo 9. Polipeptídeos Fc modificados que se ligam ao TfR.
[0398] Este exemplo descreve modificações nos polipeptídeos Fc para conferir a ligação e o transporte do receptor de transferrina (TfR) através da barreira hematoencefálica (BBB).
[0399] Salvo indicação em contrário, as posições dos resíduos de aminoácidos nesta seção são numeradas com base na numeração de índice da EU para uma região Fc de tipo selvagem de IgG1 humana.
Geração e caracterização de polipeptídeos Fc compreendendo modificações nas posições 384, 386, 387, 388, 389, 390, 413, 416 e 421 (clones CH3C)
[0400] Bibliotecas de leveduras contendo regiões Fc tendo modificações introduzidas em posições incluindo as posições de aminoácidos 384, 386, 387, 388, 389, 390, 413, 416 e 421 foram geradas como descrito abaixo. Clones ilustrativos que se ligam ao TfR são mostrados nas Tabelas 4 e
5.
[0401] Após duas rodadas adicionais de classificação, os clones únicos foram sequenciados e quatro sequências únicas foram identificadas.
Essas sequências tinham um Trp conservado na posição 388 e todas tinham um resíduo aromático (ou seja, Trp, Tyr ou His) na posição 421. Havia muita diversidade em outras posições.
[0402] Os quatro clones selecionados da biblioteca foram expressos como fusões Fc em fragmentos Fab em células CHO ou 293, e purificados por Proteína A e cromatografia de exclusão por tamanho, e depois triados quanto à ligação ao TfR humano na presença ou ausência de holo-Tf por ELISA. Todos os clones se ligaram ao TfR humano e a ligação não foi afetada pela adição de excesso (5 µM) de holo-Tf. Os clones também foram testados quanto à ligação a células 293F, que expressam endogenamente o TfR humano.
Os clones se ligaram às células 293F, embora a ligação geral fosse substancialmente mais fraca que o controle positivo de alta afinidade.
[0403] Em seguida, os clones foram testados para se poderiam se internalizar em células que expressam TfR usando o clone CH3C.3 como um clone de teste. Células HEK 293 aderentes foram cultivadas em placas de 96 poços até cerca de 80% de confluência, o meio foi removido e as amostras foram adicionadas a concentrações de 1 µM:clone CH3C.3, anticorpo de controle positivo de referência anti-TfR (Ab204), anticorpo de controle negativo de referência anti-BACE1 (Ab107) e controle do isotipo IgG humano (obtido de Jackson Immunoresearch). As células foram incubadas a 37°C e com concentração de 8% de CO2 durante 30 minutos, depois lavadas,
permeabilizadas com Triton™ X-100 a 0,1% e coradas com anticorpo secundário IgG-Alexa Fluor® 488 anti-humano. Após lavagem adicional, as células foram fotografadas sob um microscópio de fluorescência de alto conteúdo (isto é, um sistema Opera Phenix™), e o número de pontos por célula foi quantificado. Em 1 µM, clones CH3C.3 mostraram uma propensão similar para internalização ao controle positivo anti-TfR, enquanto os controles negativos não mostraram internalização.
Manipulação adicional de clones
[0404] Bibliotecas adicionais foram geradas para melhorar a afinidade dos acertos iniciais contra o TfR humano usando uma abordagem de randomização suave, em que oligos de DNA foram gerados para introduzir mutagênese suave com base em cada um dos quatro acertos originais. Foram identificados clones adicionais que ligaram TfR e foram selecionados. Os clones selecionados caíram em dois grupos de sequência geral. Os clones do grupo 1 (ou seja, clones CH3C.18, CH3C.21, CH3C.25 e CH3C.34) tinha um Leu semi- conservado na posição 384, um Leu ou His na posição 386, um Val conservado e um semi-conservado nas posições 387 e 389, respectivamente, e um motivo P-T-W semiconservado nas posições 413, 416 e 421, respectivamente. Os clones do grupo 2 tinham um Tyr conservado na posição 384, o motivo TXWSX nas posições 386-390 e o motivo conservado S/T-E-F nas posições 413, 416 e 421, respectivamente. Os clones CH3C.18 e CH3C.35 foram utilizados em estudos adicionais como membros representativos de cada grupo de sequências.
Mapeamento de epítopos
[0405] Para determinar se as regiões Fc manipuladas se ligam ao domínio apical de TfR, o domínio apical de TfR foi expresso na superfície do fago. Para dobrar e exibir corretamente o domínio apical, uma das alças teve que ser truncada e a sequência precisava ser circularmente permutada. Clones
CH3C.18 e CH3C.35 foram revestidos em placas de ELISA e um protocolo ELISA de fago foi seguido. Brevemente, após lavagem e bloqueio com PBSA a 1%, foram adicionadas diluições de exibição de fagos e incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora. As placas foram subsequentemente lavadas e foi adicionado anti-M13-HRP e, após lavagem adicional, as placas foram desenvolvidas com substrato TMB e extintas com 2N H2SO4. Ambos os clones CH3C.18 e CH3C.35 ligados ao domínio apical neste ensaio.
Mapeamento de paratopos
[0406] Para entender quais resíduos no domínio Fc foram mais importantes para a ligação de TfR, uma série de regiões Fc em clones mutantes CH3C.18 e clone CH3C.35 foram criadas, em que cada mutante tinha uma posição única no registro de ligação ao TfR mutado de volta para o tipo selvagem. As variantes resultantes foram expressas de forma recombinante como fusões de Fc-Fab e testadas quanto à ligação ao TfR humana ou de cino.
Para o clone CH3C.35, as posições 388 e 421 foram importantes para ligação; reversão de qualquer destes para a ligação completamente ablacionada de tipo selvagem para TfR humana.
Caracterização de ligação de clones de maturação
[0407] Os ELISAs de ligação foram conduzidos com variantes de fusão Fc-Fab purificadas com TfR humana ou cino revestido na placa, como descrito acima. As variantes da biblioteca de maturação do clone CH3C.18, clone CH3C.3.2-1, clone CH3C.3.2-5 e clone CH3C.3.2-19, TfR humana e cino ligado com valores aproximadamente equivalentes de EC50, enquanto os clones precursores CH3C.18 e CH3C.35 tiveram uma ligação mais que 10 vezes melhor ao TfR humana versus de cino.
[0408] Em seguida, os polipeptídeos Fc modificados foram testados para se eram internalizados em células humanas e de macacos.
Utilizando o protocolo descrito acima, foi testada a internalização em células HEK
293 humanas e células rhesus LLC-MK2. As variantes que se ligam de forma semelhante a TfR humana e de cino, clones CH3C.3.2-5 e CH3C.3.2-19, tiveram internalização significativamente melhor nas células LLC-MK2 em comparação com o clone CH3C.35.
Manipulação adicional de clones
[0409] Manipulação adicional para outros clones maduros de afinidade CH3C.18 e CH3C.35 envolviam a adição de mutações adicionais às posições que melhoravam a ligação através de interações diretas, interações de segunda camada ou estabilização de estrutura. Isso foi alcançado através da geração e seleção de uma biblioteca “NNK walk” ou “NNK patch”. A biblioteca NNK walk envolveu a realização de mutações NNK uma a uma dos resíduos que estão próximos ao paratopo. Observando a estrutura do Fc ligado ao FcγRI (PDB ID: 4W4O), 44 resíduos próximos às posições de modificação originais foram identificados como candidatos à interrogação. Especificamente, os seguintes resíduos foram direcionados para a mutagênese NNK: K248, R255, Q342, R344, E345, Q347, T359, K360, N361, Q362, S364, K370, E380, E382, S383, G385, Y391, K392, T393, D399, S400, D401, S403, K409, L410, T411, V412, K414, S415, Q418, Q419, G420, V422, F423, S424, S426, Q438, S440, S442, L443, S444, P4458, G446 e K447. As 44 bibliotecas NNK de ponto único foram geradas usando a mutagênese de Kunkel e os produtos foram reunidos e introduzidos no fermento por eletroporação, como descrito acima para outras bibliotecas de levedura.
[0410] A combinação dessas minibibliotecas (cada uma das quais teve uma posição mutada, resultando em 20 variantes) gerou uma pequena biblioteca que foi selecionada usando a exibição da superfície da levedura para quaisquer posições que levem a uma ligação de afinidade mais alta. As seleções foram realizadas como descrito acima, utilizando proteínas do domínio apical de TfR. Após três rodadas de classificação, os clones da biblioteca de levedura enriquecida foram sequenciados, e várias posições de "ponto quente" foram identificadas onde certas mutações pontuais melhoraram significativamente a ligação às proteínas do domínio apical. Para o clone CH3C.35, estas mutações incluem E380 (mutada para Trp, Tyr, Leu ou Gln) e S415 (mutada para Glu). As sequências do clone CH3C.35 mutantes individuais e combinados são apresentados em SEQ ID NOS: 27-38. Para o clone CH3C.18, estas mutações incluíam E380 (modificada para Trp, Tyr ou Leu) e K392 (modificada para Gln, Phe ou His). As sequências do clone CH3C.18 mutantes individuais são apresentados em SEQ ID NOS: 21-26. Bibliotecas de maturação adicionais para melhorar o clone CH3C.
35Afinidade
[0411] Uma biblioteca adicional para identificar combinações de mutações da biblioteca NNK walk, ao adicionar várias posições adicionais na periferia delas, foi gerada como descrito para bibliotecas de leveduras anteriores.
Nesta biblioteca, os motivos YxTEWSS (SEQ ID NO: 242) e TxxExxxxF foram mantidos constantes e seis posições foram completamente randomizadas: E380, K392, K414, S415, S424 e S426. As posições E380 e S415 foram incluídas porque eram "pontos quentes" na biblioteca de NNK walk. As posições K392, S424 e S426 foram incluídas porque compõem parte do núcleo que pode posicionar a região de ligação, enquanto K414 foi selecionado devido à sua adjacência à posição 415.
[0412] Esta biblioteca foi classificada, como descrito anteriormente, apenas com o domínio apical de TfR cino. O conjunto enriquecido foi sequenciado após cinco rodadas, e as sequências das regiões modificadas dos clones únicos identificados são apresentadas na SEQ ID NOS: 42-59.
[0413] As próximas bibliotecas foram projetadas para explorar ainda mais a diversidade aceitável no principal paratopo de ligação. Cada uma das posições originais (384, 386, 387, 388, 389, 390, 413, 416 e 421) mais os dois pontos quentes (380 e 415) foram randomizados individualmente com códons NNK para gerar uma série de saturação de posição única bibliotecas de mutagênese em leveduras. Além disso, cada posição foi revertida individualmente para o resíduo do tipo selvagem e esses clones individuais foram exibidos em leveduras. Foi notado que as posições 380, 389, 390 e 415 foram as únicas posições que mantiveram uma ligação substancial a TfR após a reversão para o resíduo do tipo selvagem (alguma ligação residual mas muito diminuída para a reversão de 413 no tipo selvagem foi observada).
[0414] As bibliotecas NNK de posição única foram classificadas por três rodadas contra o domínio apical de TfR humana para coletar os ~5% superiores de ligantes e, em seguida, pelo menos 16 clones foram sequenciados de cada biblioteca. Os resultados indicam que os aminoácidos em cada posição podem ser tolerados sem reduzir significativamente a ligação à TfR humano, no contexto do clone CH3C.35. Um resumo está abaixo: Posição 380: Trp, Leu ou Glu; Posição 384: Tyr ou Phe; Posição 386: apenas Thr; Posição 387: apenas Glu; Posição 388: apenas Trp; Posição 389: Ser, Ala ou Val (embora o resíduo do tipo selvagem Asn pareça reter alguma ligação, ele não apareceu após a classificação da biblioteca); Posição 390: Ser ou Asn; Posição 413: Thr ou Ser; Posição 415: Glu ou Ser; Posição 416: apenas Glu; e Posição 421: apenas Phe.
[0415] Os resíduos acima, quando substituídos no clone CH3C.35 como alterações únicas ou em combinações, representam a diversidade de paratopos que retém a ligação ao domínio apical de TfR. Os clones com mutações nessas posições incluem os mostrados na Tabela 5, e as sequências dos domínios CH3 desses clones são apresentadas na SEQ ID NOS: 34-38, 58 e 60-90.
Exemplo 10. Posições Fc adicionais que podem ser modificadas para conferir a ligação TfR.
[0416] Polipeptídeos Fc modificados adicionais que se ligam ao receptor de transferrina (TfR) foram gerados com modificações em sítios alternativos na região Fc, por exemplo, nas seguintes posições: posições 274, 276, 283, 285, 286, 287, 288 e 290 (clones CH2A2); posições 266, 267, 268, 269, 270, 271, 295, 297, 298 e 299 (clones CH2C); posições 268, 269, 270, 271, 272, 292, 293, 294 e 300 (clones CH2D); posições 272, 274, 276, 322, 324, 326, 329, 330 e 331 (clones CH2E3); ou posições 345, 346, 347, 349, 437, 438, 439 e 440 (clones CH3B).
[0417] Clones CH3B ilustrativos que se ligam a TfR são apresentados em SEQ ID NOS: 124-128. Clones de CH2A2 ilustrativos que se ligam a TfR são apresentados em SEQ ID NOS: 129-133. Clones ilustrativos de CH2C que se ligam a TfR são apresentados na SEQ ID NOS: 134-138. Os clones CH2D ilustrativos que se ligam a TfR são apresentados na SEQ ID NOS: 139-
143. Clones de CH2E3 ilustrativos que se ligam a TfR são apresentados em SEQ ID NOS: 144-148.
Exemplo 11. Métodos.
Geração de bibliotecas de exibição de fagos
[0418] Um modelo de DNA que codifica para a sequência Fc humana de tipo selvagem foi sintetizado e incorporado em um vetor de fagemídeo. O vetor fagemídeo continha uma sequência líder ompA ou pelB, a inserção Fc fundida às tags de epítopo c-Mic e 6xHis (SEQ ID NO:241) e um códon de parada âmbar seguido pela proteína de revestimento M13, pIII.
[0419] Primers contendo tricódons "NNK" nas posições desejadas para modificações foram gerados, onde N é qualquer base de DNA (ou seja, A, C, G ou T) e K é G ou T. Alternativamente, primers para randomização "suave" foram usado, onde uma mistura de bases correspondente a 70% da base do tipo selvagem e 10% de cada uma das outras três bases foi usada para cada posição de randomização. As bibliotecas foram geradas realizando amplificação por PCR de fragmentos da região Fc correspondentes a regiões de randomização e depois montadas usando primers finais contendo sítios de restrição SfiI, depois digeridos com SfiI e ligados aos vetores fagemídeos. Alternativamente, os primers foram usados para conduzir a mutagênese de Kunkel. Os produtos ligados ou produtos Kunkel foram transformados em células E. coli eletrocompetentes da cepa TG1 (obtidas de Lucigen®). As células de E. coli foram infectadas com fago auxiliar M13K07 após a recuperação e cultivadas durante a noite, após o que o fago da biblioteca foi precipitado com 5% de PEG/NaCl, ressuspenso em 15% de glicerol em PBS e congelado até a utilização. Os tamanhos típicos de biblioteca variaram de cerca de 109 a cerca de 1011 transformantes. Os dímeros Fc foram exibidos no fago via pareamento entre Fc fundido com pIII e Fc solúvel não ligado a pIII (sendo este último gerado devido ao códon de parada âmbar antes de pIII).
Geração de Bibliotecas de Exibição de Leveduras
[0420] Um modelo de DNA que codifica para a sequência Fc humana de tipo selvagem foi sintetizado e incorporado em um vetor de exibição de levedura. Para as bibliotecas CH2 e CH3, os polipeptídeos Fc foram exibidos na proteína da parede celular Aga2p. Ambos os vetores continham peptídeos líderes prepro com uma sequência de clivagem Kex2 e uma tag de epítopo c- Myc fundida ao terminal do Fc.
[0421] As bibliotecas de exibição de leveduras foram montadas usando métodos semelhantes aos descritos para as bibliotecas de fagos, exceto que a amplificação dos fragmentos foi realizada com primers contendo extremidades homólogas para o vetor. Leveduras eletrocompetentes recém- preparadas (ou seja, cepa EBY100) foram eletroporadas com vetor linearizado e inserções de bibliotecas montadas. Os métodos de eletroporação serão conhecidos pelos versados na técnica. Após recuperação em meio SD-CAA seletivo, a levedura foi cultivada até confluência e dividida duas vezes, depois induzida para expressão proteica por transferência para o meio SG-CAA. Os tamanhos típicos de biblioteca variaram de cerca de 10 7 a cerca de 109 transformantes. Os dímeros Fc foram formados por pareamento de monômeros Fc exibidos adjacentemente.
Métodos Gerais para Seleção de Fagos
[0422] Os métodos de fago foram adaptados de Phage Display: A Laboratory Manual (Barbas, 2001). Detalhes adicionais do protocolo podem ser obtidos nesta referência.
Métodos de classificação de placas
[0423] O antígeno foi revestido em placas de microtitulação MaxiSorp® (tipicamente 1-10 µg/mL) durante a noite a 4°C. As bibliotecas de fagos foram adicionadas a cada poço e incubadas durante a noite para ligação.
Os poços de microtitulação foram lavados extensivamente com PBS contendo Tween® 20 a 0,05% (PBST) e o fago ligado foi eluído através da incubação dos poços com ácido (tipicamente HCl 50 mM com KCl 500 mM ou glicina 100 mM, pH 2,7) por 30 minutos. Os fagos eluídos foram neutralizados com Tris 1 M (pH 8) e amplificados utilizando células TG1 e fago auxiliar M13/KO7 e crescidos durante a noite a 37°C em meio 2YT contendo 50 µg/mL de carbenacilina e 50 ug/mL de canamicina. Os títulos de fago eluídos de um poço contendo alvo foram comparados com os títulos de fago recuperados de um poço não contendo alvo para avaliar o enriquecimento. O rigor da seleção foi aumentado diminuindo subsequentemente o tempo de incubação durante a ligação e aumentando o tempo de lavagem e o número de lavagens.
Métodos de classificação de esferas
[0424] O antígeno foi biotinilado através de aminas livres usando NHS-PEG4-Biotina (obtido de Pierce™). Para reações de biotinilação, um excesso molar de 3 a 5 vezes do reagente de biotina foi usado em PBS. As reações foram extintas com Tris seguida por extensa diálise em PBS. O antígeno biotinilado foi imobilizado em esferas magnéticas revestidas com estreptavidina (ou seja, esferas em M280-estreptavidina obtidas da Thermo Fisher). As bibliotecas de exibição de fagos foram incubadas com as esferas revestidas de antígeno à temperatura ambiente por 1 hora. Os fagos não ligados foram então removidos e as esferas foram lavadas com PBST. Os fagos ligados foram eluídos por incubação com HCl 50 mM contendo KCl 500 mM (ou glicina 0,1 M, pH 2,7) por 30 minutos, e depois neutralizados e propagados como descrito acima para classificação de placas.
[0425] Após três a cinco rodadas de filtragem, os clones individuais foram triados expressando Fc no fago ou soluvelmente no periplasma de E. coli.
Tais métodos de expressão serão conhecidos pelos versados na técnica.
Sobrenadantes de fagos individuais ou extratos periplásmicos foram expostos a placas de ELISA bloqueadas revestidas com antígeno ou um controle negativo e foram subsequentemente detectados usando anti-Fc de cabra conjugado com HRP (obtido de Jackson Immunoresearch) para extratos periplásmicos ou anti- M13 (GE Healthcare) para fago e depois desenvolvido com reagente TMB (obtido da Thermo Fisher). Os poços com valores OD450 superiores a cerca de 5 vezes sobre o fundo foram considerados clones positivos e sequenciados, após o que alguns clones foram expressos como um fragmento Fc solúvel ou fundidos a fragmentos Fab.
Métodos Gerais para Seleção de Leveduras Métodos de classificação de esferas (classificação de células assistidas magneticamente (MACS))
[0426] As seleções de MACS e FACS foram realizadas de maneira semelhante à descrita em Ackerman, et al., Biotechnol. Prog., 25(3):774 (2009).
As esferas magnéticas de estreptavidina (por exemplo, esferas M-280 de estreptavidina de Thermo Fisher) foram rotuladas com antígeno biotinilado e incubadas com levedura (tipicamente 5 a 10 vezes a diversidade de bibliotecas).
A levedura não ligada foi removida, as esferas foram lavadas e a levedura ligada foi cultivada em meio seletivo e induzido para rodadas subsequentes de seleção.
Métodos de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS)
[0427] As leveduras foram rotuladas com anticorpo amti-c-Myc para monitorar a expressão e o antígeno biotinilado (a concentração variava dependendo da rodada de classificação). Em algumas experiências, o antígeno foi pré-misturado com estreptavidina-Alexa Fluor® 647, a fim de aumentar a avidez da interação. Em outras experiências, o antígeno biotinilado foi detectado após ligação e lavagem com estreptavidina-Alexa Fluor® 647. A levedura singlete com ligação foi classificada usando um classificador de células FACS Aria III. As leveduras selecionadas foram cultivadas em meio seletivo e depois induzidas para as rodadas de seleção subsequentes.
[0428] Após a obtenção de uma população de levedura enriquecida, as leveduras foram plaqueadas em placas de ágar SD-CAA e as colônias individuais foram cultivadas e induzidas à expressão, depois rotuladas como descrito acima para determinar sua propensão a se ligar ao alvo. Os clones únicos positivos foram subsequentemente sequenciados para ligação ao antígeno, após o que alguns clones foram expressos como um fragmento Fc solúvel ou como fundido aos fragmentos Fab.
Métodos Gerais para Triagem Triagem por ELISA
[0429] Os clones foram selecionados a partir de resultados de filtragem e cultivados em poços individuais de placas de 96 poços profundos. Os clones foram induzidos para expressão periplásmica usando meio de auto- indução (obtido da EMD Millipore) ou infectados com fago auxiliar para exibição de fago das variantes individuais de Fc no fago. As placas de ELISA foram revestidas com antígeno, tipicamente a 0,5 mg/mL durante a noite, depois bloqueadas com BSA a 1% antes da adição de fagos ou extratos periplásmicos.
Após uma incubação de 1 hora e lavagem da proteína não ligada, o anticorpo secundário conjugado com HRP foi adicionado (ou seja, anti-Fc ou anti-M13 para Fc solúvel ou Fc exibido em fagos, respectivamente) e incubado por 30 minutos.
As placas foram lavadas novamente e depois desenvolvidas com reagente TMB e extintas com ácido sulfúrico 2N. A absorvância a 450 nm foi quantificada usando um leitor de placas (BioTek®) e as curvas de ligação foram plotadas utilizando o software Prism, quando aplicável. Em alguns ensaios, transferrina solúvel ou outro competidor foi adicionado durante a etapa de ligação, tipicamente com excesso molar significativo.
Triagem por citometria de fluxo
[0430] Os polipeptídeos de variantes Fc (expressos em fagos, em extratos periplásmicos ou soluvelmente como fusões em fragmentos Fab) foram adicionados às células em placas de fundo V de 96 poços (cerca de 100.000 células por poço em PBS +1% de BSA (PBSA)), e incubados a 4°C durante 1 hora. As placas foram subsequentemente centrifugadas e o meio foi removido e, em seguida, as células foram lavadas uma vez com PBSA. As células foram ressuspensas em anticorpo secundário contendo PBSA (tipicamente cabra anti-
IgG-Alexa humana Fluor® 647 (obtido de Thermo Fisher)). Após 30 minutos, as placas foram centrifugadas e o meio foi removido, as células foram lavadas 1-2 vezes com PBSA e, em seguida, as placas foram lidas em um citômetro de fluxo (ou seja, um citômetro de fluxo FACSCanto ™ II). Os valores medianos de fluorescência foram calculados para cada condição usando o software FlowJo e as curvas de ligação foram plotadas com o software Prism.
Exemplo 12. Seleção da Afinidade do Polipeptídeo de ligação a TfR.
[0431] Este exemplo descreve a relação entre a afinidade de um polipeptídeo de ligação ao TfR por um receptor de transferrina (TfR) e a exposição cerebral resultante a um agente terapêutico que está ligado ao polipeptídeo de ligação ao TfR.
[0432] A FIGURA 18 mostra que a exposição cerebral a um agente terapêutico (avaliada pela determinação da área sob a curva (AUC) da concentração cerebral versus tempo) foi reduzida quando o agente terapêutico foi ligado a um polipeptídeo que tinha uma afinidade relativamente mais forte por TfR. Em particular, a exposição cerebral foi substancialmente reduzida quando o agente terapêutico foi ligado a um polipeptídeo que tinha uma afinidade por TfR que era mais forte do que cerca de 250 nM.
[0433] Como mostrado na FIGURA 19, foi observada uma concentração máxima mais alta (Cmax) no cérebro quando um agente terapêutico foi ligado a um polipeptídeo que apresentava uma afinidade relativamente mais forte por TfR. Em particular, os valores da Cmax no cérebro foram significativamente mais altos quando o polipeptídeo de ligação ao TfR tinha uma afinidade mais forte do que cerca de 250 nM.
[0434] A FIGURA 20 mostra a razão de Cmax do cérebro para a concentração plasmática de um agente terapêutico quando ligado a polipeptídeos com uma série de afinidades para TfR.
Métodos Geração de TfRms/hu KI
[0435] Os métodos para gerar camundongos knock-in/knock-out foram publicados na literatura e são bem conhecidos pelos versados na técnica.
Em resumo, os camundongos TfRms/hu KI foram gerados usando a tecnologia CRISPR/Cas9 para expressar o domínio apical de Tfrc humano dentro do gene Tfrc murino; o TfR quimérico resultante foi expresso in vivo sob o controle do promotor endógeno. Conforme descrito na Publicação de Patente Internacional Nº WO 2018/152285, que é incorporada por referência na sua totalidade a este documento, os camundongos C57Bl6 foram usados para gerar um knock-in da linhagem de camundongo TfR apical humano via microinjeção pronuclear em embriões de célula única, seguido de transferência de embriões para camundongos pseudográvidas. Especificamente, Cas9, RNAs guia único e um DNA doador foram introduzidos nos embriões. O DNA doador compreendia uma sequência de codificação do domínio apical humano que havia sido otimizada por códon para a expressão em camundongos. A sequência de codificação do domínio apical foi flanqueada com um braço de homologia esquerdo e um direito.
A sequência doadora foi projetada de tal forma que o domínio apical foi inserido após o quarto exon do camundongo e foi imediatamente flanqueado na extremidade 3' pelo nono exon do camundongo. Um macho fundador da progênie da fêmea que recebeu os embriões foi criado para fêmeas do tipo selvagem para gerar camundongos heterozigotos F1. Camundongos homozigotos foram gerados subsequentemente a partir da criação de camundongos heterozigotos da geração F1.
PK/PD do camundongo
[0436] Para avaliação de PK/PD, os camundongos TfRms/hu KI foram dosados sistemicamente uma vez por injeção nas veias da cauda a 50 mg/kg. Antes da perfusão, o sangue foi coletado em tubos de plasma EDTA por punção cardíaca e girado a 14.000 rpm por 5 minutos. O plasma foi então isolado para análises subsequentes de PK/PD. Cérebros foram extraídos após a perfusão e os hemicérebros foram isolados para homogenização em 10x por peso de tecido de NP-40 a 1% em PBS (para PK) ou GuHCl 5 M (para PD).
[0437] As concentrações de polipeptídeos de ligação ao TfR manipulados no plasma de camundongo e lisados cerebrais foram quantificadas usando um ensaio IgG humano genérico (kit MSD de IgG humano #K150JLD) seguindo as instruções do fabricante. Brevemente, as placas pré-revestidas foram bloqueadas durante 30 minutos com MSD Blocker A. As amostras de plasma foram diluídas 1:10.000 utilizando um manipulador de líquido Hamilton Nimbus e adicionadas em duplicata às placas bloqueadas. As amostras de cérebro foram homogeneizadas em tampão de lise NP-40 a 1% e os lisados diluídos 1:10 para análise de PK. As soluções de dosagem também foram analisadas na mesma placa para confirmar a dosagem correta. A curva padrão, 0,78-200 ng/mL de IgG, foi ajustada usando uma regressão logística de quatro parâmetros.
Exemplo 13. Caracterização de Ligação de Variantes de CH3C Usando o Biacore™.
[0438] A afinidade das variantes clonais para o domínio apical de TfR recombinante foi determinada por ressonância plasmônica de superfície usando um instrumento Biacore™ T200. Os chips sensores Biacore™ Série S CM5 foram imobilizados com Fab anti-humano (kit de captura Fab humano da GE Healthcare). 5 µg/mL de fusão polipeptídeo-Fab foram capturados por 1 minuto em cada célula de fluxo e diluições em série de três vezes do domínio apical humano ou cino foram injetadas a uma taxa de fluxo de 30 µL/min à temperatura ambiente. Cada amostra foi analisada com uma associação de 45 segundos e uma dissociação de 3 minutos. Após cada injeção, o chip foi regenerado usando Glicina-HCl 10 mM (pH 2,1). A resposta de ligação foi corrigida subtraindo as RU de uma célula de fluxo capturando uma IgG irrelevante com densidade semelhante. As afinidades em estado estacionário foram obtidas ajustando a resposta em equilíbrio contra a concentração usando o Software de Avaliação Biacore™ T200 v3.1.
[0439] Para determinar a afinidade das variantes clonais para o ectodomínio de TfR recombinante (ECD), os chips sensores Biacore ™ Série S CM5 foram imobilizados com estreptavidina. O ECD de TfR humano ou cino biotinilado foi capturado por 1 minuto em cada célula de fluxo e diluições em série de três vezes de variantes clonais foram injetadas a uma taxa de fluxo de 30 µL/min à temperatura ambiente. Cada amostra foi analisada com uma associação de 45 segundos e uma dissociação de 3 minutos. A resposta de ligação foi corrigida subtraindo a RU de uma célula de fluxo sem ECD de TfR a uma densidade semelhante. As afinidades em estado estacionário foram obtidas ajustando a resposta em equilíbrio contra a concentração usando o Software de Avaliação Biacore™ T200 v3.1.
[0440] As afinidades de ligação estão resumidas na Tabela 6. As afinidades foram obtidas por ajuste no estado estacionário.
Tabela 6. Afinidades de ligação para variantes exemplares de CH3C.
TfR TfR apical TfR cino TfR apical Clone humano humano (µM) cino (µM) (µM) (µM) CH3C.35.19.mono 0,4 5,9 0,37 5,6 CH3C.35.20.mono 0,25 6,7 0,17 8 CH3C.35.21.mono 0,1 2,1 0,12 2,2 CH3C.35.24.mono 0,29 3,3 0,23 3 CH3C.35.21.11.mono 0,24 4 0,13 2,2
TfR TfR apical TfR cino TfR apical Clone humano humano (µM) cino (µM) (µM) (µM) CH3C.35.21.16.mono 0,18 1,8 0,12 1,9 CH3C.35.21.17.mono 0,3 2,9 0,13 2,6 CH3C.35.mono 0,61 >10 0,61 >10 CH3C.35.N153.mono 0,42 >10 0,95 >10 não CH3C.35.bi 0,22 >2 não testado testado não CH3C.35.N153.bi 0,37 3,3 não testado testado não CH3C.3.2-19.bi 5,2 5,6 não testado testado não CH3C.35.19.bi 0,074 1,5 não testado testado não CH3C.35.20.bi 0,054 1,7 não testado testado não CH3C.35.21.bi 0,049 0,7 não testado testado não CH3C.35.24.bi 0,061 0,65 não testado testado Exemplo 14. PKPD cerebral e plasmática de fusões polipeptídeo-Fab em camundongos TfRms/hu: CH3C.35.21, CH3C.35.20, CH3C.35, CH3C.35.23, CH3C.35.23.3.
[0441] Para avaliar o impacto da afinidade de ligação de TfR para PK e absorção de cérebro, fusões de Ab153 anti-BACE1 e polipeptídeo de ligação a TfR (fusões CH3C.35.21:Ab153, CH3C.35.20:Ab153, CH3C.35:Ab153 fusões) foram geradas que diferiam em sua afinidade de ligação ao TfR humano apical, medido por Biacore™. As afinidades de ligação das fusões
CH3C.35.21:Ab153, CH3C.35.20:Ab153, CH3C.35:Ab153 fusões ao TfR humano são 100 nM, 170 nM e 620 nM, respectivamente.
Camundongos TfRms/hu knock-in foram administrados sistemicamente com Ab153 ou as fusões polipeptídeo-Fab a 50 mg/kg, e a PK plasmática e a PKPD cerebral foram avaliadas 1, 3 e 7 dias após a dose.
A análise de PKPD no cérebro e no plasma foi conduzida como descrito acima.
Devido à expressão de TfR em tecidos periféricos, as fusões CH3C.35.21:Ab153, CH3C.35.20:Ab153 e CH3C.35:Ab153 exibiram uma depuração mais rápida no plasma em comparação com Ab153 isoladamente, consistente com a depuração mediada por alvo e indicativo de ligação in vivo a TfR (FIGURA 21A). De forma impressionante, as concentrações cerebrais das fusões CH3C.35.21:Ab153,
CH3C.35.20:Ab153 e CH3C.35:Ab153 foram significativamente aumentadas em comparação com Ab153, atingindo uma concentração mínima no cérebro superior a 30 nM 1 dia após a dose, comparativamente com apenas cerca de 3 nM para Ab153 neste mesmo ponto no tempo (FIGURA 21B). O aumento da exposição cerebral das fusões CH3C.35.21:Ab153, CH3C.35.20:Ab153 e
CH3C.35:Ab153 resultaram em cerca de 55-60% de níveis de Aβ de camundongo endógeno mais baixos nos cérebros dos camundongos em comparação com os níveis de Aβ nos camundongos doseados com Ab153
(FIGURA 21C). Os níveis de Aβ no cérebro inferior foram mantidos enquanto as concentrações das fusões CH3C.35.21:Ab153, CH3C.35.20:Ab153 e
CH3C.35:Ab153 permaneceram elevadas no cérebro e voltaram a níveis semelhantes aos dos camundongos tratados com Ab153 quando a exposição foi reduzida no dia 7. A redução na exposição cerebral ao longo do tempo se correlacionou com uma redução na exposição periférica das fusões
CH3C.35.21:Ab153, CH3C.35.20:Ab153 e CH3C.35:Ab153, fornecendo uma relação clara de PK/PD in vivo (compare as FIGURAS 21A e 21C). Além disso, os níveis totais de TfR no cérebro foram comparáveis para camundongos tratados com Ab153 e tratados com fusão de polipeptídeo-Fab após esta alta dose única, indicando que não há impacto significativo da exposição cerebral aumentada das fusões de polipeptídeo-Fab à expressão de TfR no cérebro (FIGURA 21D)
[0442] As substituições de aminoácidos para cada clone descrito nas tabelas (por exemplo, Tabela 5) determinam as substituições de aminoácidos nas posições de registro desse clone em vez dos aminoácidos encontrados na sequência estabelecida na lista de sequências, em caso de discrepância.
[0443] Entende-se que os exemplos e modalidades descritos neste documento são apenas para fins ilustrativos, e que várias modificações ou alterações à luz dos mesmos serão sugeridas para pessoas versadas na técnica e devem ser incluídas dentro do espírito e alcance deste pedido e escopo das reivindicações em anexo. As sequências dos números de acesso à sequência citados neste documento são aqui incorporadas por referência.
Tabela 4. Modificações de Domínio CH3. Nome de Clone Grupo 384 385 386 387 388 389 390 391 … 413 414 415 416 417 418 419 420 421 Tipo N G Q P E N N Y … D K S R W Q Q G N selvagem n/a 1 L G L V W V G Y … A K S T W Q Q G W 2 Y G T V W S H Y … S K S E W Q Q G Y 3 Y G T E W S Q Y … E K S D W Q Q G H 4 V G T P W A L Y … L K S E W Q Q G W 17 2 Y G T V W S K Y … S K S E W Q Q G F 18 1 L G H V W A V Y … P K S T W Q Q G W 21 1 L G L V W V G Y … P K S T W Q Q G W
Nome de Clone Grupo 384 385 386 387 388 389 390 391 … 413 414 415 416 417 418 419 420 421 Tipo N G Q P E N N Y … D K S R W Q Q G N selvagem n/a 25 1 M G H V W V G Y … D K S T W Q Q G W 34 1 L G L V W V F S … P K S T W Q Q G W 35 2 Y G T E W S S Y … T K S E W Q Q G F 44 2 Y G T E W S N Y … S K S E W Q Q G F 51 1/2 L G H V W V G Y … S K S E W Q Q G W
3.1-3 1 L G H V W V A T … P K S T W Q Q G W
3.1-9 1 L G P V W V H T … P K S T W Q Q G W
3.2-5 1 L G H V W V D Q … P K S T W Q Q G W
3.2-19 1 L G H V W V N Q … P K S T W Q Q G W
3.2-1 1 L G H V W V N F … P K S T W Q Q G W Tabela 5. Modificações Adicionais do Domínio CH3. Nome 378 379 380 381 382 383 384 385 386 387 388 389 390 391 392 411 412 413 414 415 416 417 418 419 420 421 422 423 de Clone Tipo selva A V E W E S N G Q P E N N Y K T V D K S R W Q Q G N V F gem
35.20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 F T EWS S T E E F
35.20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2 Y T EWA S T E E F
35.20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3 Y T EWV S T E E F
35.20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4 Y T EWS S S E E F
35.20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5 F T EWA S T E E F
Nome 378 379 380 381 382 383 384 385 386 387 388 389 390 391 392 411 412 413 414 415 416 417 418 419 420 421 422 423 de Clone Tipo selva A V E W E S N G Q P E N N Y K T V D K S R W Q Q G N V F gem
35.20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6 F T EWV S T E E F
35.21 . . . . . . . . . . . . . . . . . .a.1 W F T EWS S T E E F
35.21 . . . . . . . . . . . . . . . . . .a.2 W Y T EWA S T E E F
35.21 . . . . . . . . . . . . . . . . . .a.3 W Y T EWV S T E E F
35.21 . . . . . . . . . . . . . . . . . .a.4 W Y T EWS S S E E F
35.21 . . . . . . . . . . . . . . . . . .a.5 W F T EWA S T E E F
35.21 . . . . . . . . . . . . . . . . . .a.6 W F T EWV S T E E F
35.23 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 F T EWS T E E F
35.23 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2 Y T EWA T E E F
35.23 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3 Y T EWV T E E F
35.23 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4 Y T EWS S E E F
35.23 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5 F T EWA T E E F
Nome 378 379 380 381 382 383 384 385 386 387 388 389 390 391 392 411 412 413 414 415 416 417 418 419 420 421 422 423 de Clone Tipo selva A V E W E S N G Q P E N N Y K T V D K S R W Q Q G N V F gem
35.23 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6 F T EWV T E E F
35.24 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 W F T EWS T E E F
35.24 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2 W Y T EWA T E E F
35.24 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3 W Y T EWV T E E F
35.24 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4 W Y T EWS S E E F
35.24 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5 W F T EWA T E E F
35.24 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6 W F T EWV T E E F
35.21 . . . . . . . . . . . . . . . . . .17.1 L F T EWS S T E E F
35.21 . . . . . . . . . . . . . . . . . .17.2 L Y T EWA S T E E F
35.21 . . . . . . . . . . . . . . . . . .17.3 L Y T EWV S T E E F
35.21 . . . . . . . . . . . . . . . . . .17.4 L Y T EWS S S E E F
35.21 . . . . . . . . . . . . . . . . . .17.5 L F T EWA S T E E F
Nome 378 379 380 381 382 383 384 385 386 387 388 389 390 391 392 411 412 413 414 415 416 417 418 419 420 421 422 423 de Clone Tipo selva A V E W E S N G Q P E N N Y K T V D K S R W Q Q G N V F gem
35.21 . . . . . . . . . . . . . . . . . .17.6 L F T EWV S T E E F
35.20 . . . . . . Y . T E W S S . . . . T . E E . . . . F . .
35.21 . . W . . . Y . T E W S S . . . . T . E E . . . . F . .
35.22 . . W . . . Y . T E W S . . . . . T . . E . . . . F . .
35.23 . . . . . . Y . T E W S . . . . . T . E E . . . . F . .
35.24 . . W . . . Y . T E W S . . . . . T . E E . . . . F . .
35.21 . . . . . . . . . . . . . . . . . .17 L Y T EWS S T E E F
35.N3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90 Y T EWS T E F
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS INFORMAIS SEQ ID Sequência Descrição NO: 1 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Sequência Fc humana PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL do tipo selvagem
HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP posições 231-447 ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS Numeração de índice VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK da EU 2 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Sequência de domínio PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL CH2
HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK posições 231-340 Numeração de índice da EU 3 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE Sequência de domínio WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ CH3
QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK posições 341-447 Numeração de índice da EU
4 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED O clone CH3C.1
MHEALHNHYTQKSLSLSPGK 5 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED O clone CH3C.2
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 6 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.3
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 7 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.4
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 8 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.17
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 9 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.18
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 10 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.21
MHEALHNHYTQKSLSLSPGK 11 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.25
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 12 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.34
MHEALHNHYTQKSLSLSPGK 13 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 14 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.44
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 15 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.51
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 16 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.3.1-3
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 17 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.3.1-9
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 18 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.3.2-5
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 19 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.3.2-19
20 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.3.2-1
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 21 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.18 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL variante
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 22 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.18 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL variante
MHEALHNHYTQKSLSLSPGK 23 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.18 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL variante
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 24 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.18 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL variante
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 25 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.18 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL variante
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 26 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.18 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL variante
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 27 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.13
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 28 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.14
29 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.15
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 30 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.16
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 31 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.17
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 32 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.18
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 33 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.19
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 34 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.20
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 35 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.21
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 36 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.22
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 37 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 38 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.24
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 39 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.N163
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 40 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL CH3C.35.K165Q
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 41 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.N163.
PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV K165Q
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 42 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.21.1
MHEALHNHYTQKSLSLSPGK 43 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.21.2
MHEALHNHYTQKSLSLSPGK 44 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.21.3
MHEALHNHYTQKSLSLSPGK 45 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.21.4
MHEALHNHYTQKSLSLSPGK 46 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.21.5
MHEALHNHYTQKSLSLSPGK 47 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.21.6
MHEALHNHYTQKSLSLSPGK 48 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.21.7
MHEALHNHYTQKSLSLSPGK 49 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.21.8
MHEALHNHYTQKSLSLSPGK 50 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.21.9
MHEALHNHYTQKSLSLSPGK 51 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.21.10
MHEALHNHYTQKSLSLSPGK 52 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.21.11
MHEALHNHYTQKSLSLSPGK 53 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.21.12
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 54 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.21.13
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 55 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.21.14
56 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.21.15
WVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 57 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.21.16
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 58 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.21.17
MHEALHNHYTQKSLSLSPGK 59 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.21.18
MHEALHNHYTQKSLSLSPGK 60 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.20.1
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 61 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.20.2
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 62 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.20.3
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 63 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.20.4
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 64 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.20.5
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 65 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.20.6
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 66 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.21.a.1
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 67 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.21.a.2
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 68 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.21.a.3
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 69 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.21.a.4
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 70 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.21.a.5
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 71 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.21.a.6
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 72 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.1
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 73 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.2
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 74 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.3
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 75 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.4
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 76 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.5
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 77 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.6
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 78 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.24.1
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 79 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.24.2
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 80 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.24.3
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 81 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.24.4
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 82 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.24.5
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 83 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.24.6
84 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL CH3C.35.21.17.1
MHEALHNHYTQKSLSLSPGK 85 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL CH3C.35.21.17.2
MHEALHNHYTQKSLSLSPGK 86 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL CH3C.35.21.17.3
MHEALHNHYTQKSLSLSPGK 87 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL CH3C.35.21.17.4
MHEALHNHYTQKSLSLSPGK 88 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL CH3C.35.21.17.5
MHEALHNHYTQKSLSLSPGK 89 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL CH3C.35.21.17.6
MHEALHNHYTQKSLSLSPGK 90 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.N390
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 91 MPPPRTGRGLLWLGLVLSSVCVALGSETQANSTTDALNV Sequência de LLIIVDDLRPSLGCYGDKLVRSPNIDQLASHSLLFQNAFAQ polipeptídeo de QAVCAPSRVSFLTGRRPDTTRLYDFNSYWRVHAGNFSTI iduronato sulfatase PQYFKENGYVTMSVGKVFHPGISSNHTDDSPYSWSFPPY (IDS) humana de HPSSEKYENTKTCRGPDGELHANLLCPVDVLDVPEGTLP comprimento total
92 TDALNVLLIIVDDLRPSLGCYGDKLVRSPNIDQLASHSLLF Sequência de QNAFAQQAVCAPSRVSFLTGRRPDTTRLYDFNSYWRVH polipeptídeo de AGNFSTIPQYFKENGYVTMSVGKVFHPGISSNHTDDSPY iduronato sulfatase SWSFPPYHPSSEKYENTKTCRGPDGELHANLLCPVDVLD (IDS) humana madura
P 93 MEFSSPSREECPKPLSRVSIMAGSLTGLLLLQAVSWASG Sequência de ARPCIPKSFGYSSVVCVCNATYCDSFDPPTFPALGTFSRY polipeptídeo de β- ESTRSGRRMELSMGPIQANHTGTGLLLTLQPEQKFQKVK glucocerbrosidase GFGGAMTDAAALNILALSPPAQNLLLKSYFSEEGIGYNIIR humana de VPMASCDFSIRTYTYADTPDDFQLHNFSLPEEDTKLKIPLI comprimento total
AVGFLETISPGYSIHTYLWRRQ 94 ARPCIPKSFGYSSVVCVCNATYCDSFDPPTFPALGTFSRY Sequência de ESTRSGRRMELSMGPIQANHTGTGLLLTLQPEQKFQKVK polipeptídeo de β- GFGGAMTDAAALNILALSPPAQNLLLKSYFSEEGIGYNIIR glucocerbrosidase VPMASCDFSIRTYTYADTPDDFQLHNFSLPEEDTKLKIPLI humana madura
AVGFLETISPGYSIHTYLWRRQ 95 EPKSCDKTHTCPPCP Sequência de aminoácidos de dobradiça IgG1 humana 96 MMDQARSAFSNLFGGEPLSYTRFSLARQVDGDNSHVEM Proteína 1 do receptor KLAVDEEENADNNTKANVTKPKRCSGSICYGTIAVIVFFLI de transferrina humana GFMIGYLGYCKGVEPKTECERLAGTESPVREEPGEDFPA (TFR1)
DNEF 97 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.21 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutação knob
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 98 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.21 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações knob e
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 99 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.21 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações knob e
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 100 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.21 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações knob, HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV LALA e YTE
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 101 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Sequência Fc com PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL mutações hole
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 102 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Sequência Fc com PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL mutações hole e LALA
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 103 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Sequência Fc com PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL mutações hole e YTE
104 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Sequência Fc com PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL mutações hole, LALA e
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 105 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.21 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações hole
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 106 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.21 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações hole e
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 107 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.21 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações hole e
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 108 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.21 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações knob, HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV LALA e YTE
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 109 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Sequência Fc com PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL mutação knob
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 110 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Sequência Fc com PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL mutações knob e LALA
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 111 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Sequência Fc com PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL mutações knob e YTE
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 112 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Sequência Fc com PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL mutações knob, LALA HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV e YTE
113 DKTHTCPPCP Porção da sequência de dobradiça IgG1 humana 114 SETQANSTTD ALNVLLIIVD DLRPSLGCYG DKLVRSPNID Sequência IDS QLASHSLLFQ NAFAQQAVCA PSRVSFLTGR (cisteína modificada RPDTTRLYDF NSYWRVHAGN FSTIPQYFKE para formilglicina de NGYVTMSVGK VFHPGISSNH TDDSPYSWSF duplo sublinhado)
DSDPLQDHNM YNDSQGGDLF QLLMP 115 SETQANSTTD ALNVLLIIVD DLRPSLGCYG DKLVRSPNID Polipeptídeo de fusão QLASHSLLFQ NAFAQQAVCA PSRVSFLTGR IDS-Fc com a RPDTTRLYDF NSYWRVHAGN FSTIPQYFKE sequência IDS NGYVTMSVGK VFHPGISSNH TDDSPYSWSF sublinhada (cisteína PPYHPSSEKY ENTKTCRGPD GELHANLLCP modificada para VDVLDVPEGT LPDKQSTEQA IQLLEKMKTS formilglicina de ASPFFLAVGY HKPHIPFRYP KEFQKLYPLE NITLAPDPEV sublinhado duplo) e PDGLPPVAYN PWMDIRQRED VQALNISVPY mutações hole e LALA
ALHNHYTQKS LSLSPGK 116 DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT Clone CH3C.35.21 LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD com mutações knob e GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH LALA e porção da QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK sequência de GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSLWCLVK dobradiça IgG1 GFYPSDIAVW WESYGTEWSS YKTTPPVLDS humana
ALHNHYTQKS LSLSPGK 117 SETQANSTTD ALNVLLIIVD DLRPSLGCYG DKLVRSPNID Polipeptídeo de fusão QLASHSLLFQ NAFAQQAVCA PSRVSFLTGR IDS-Fc com a
RPDTTRLYDF NSYWRVHAGN FSTIPQYFKE sequência IDS NGYVTMSVGK VFHPGISSNH TDDSPYSWSF sublinhada (cisteína PPYHPSSEKY ENTKTCRGPD GELHANLLCP modificada para VDVLDVPEGT LPDKQSTEQA IQLLEKMKTS formilglicina de ASPFFLAVGY HKPHIPFRYP KEFQKLYPLE NITLAPDPEV sublinhado duplo) e PDGLPPVAYN PWMDIRQRED VQALNISVPY mutações hole
ALHNHYTQKS LSLSPGK 118 SETQANSTTD ALNVLLIIVD DLRPSLGCYG DKLVRSPNID Polipeptídeo de fusão QLASHSLLFQ NAFAQQAVCA PSRVSFLTGR IDS-Fc com a RPDTTRLYDF NSYWRVHAGN FSTIPQYFKE sequência IDS NGYVTMSVGK VFHPGISSNH TDDSPYSWSF sublinhada (cisteína PPYHPSSEKY ENTKTCRGPD GELHANLLCP modificada para VDVLDVPEGT LPDKQSTEQA IQLLEKMKTS formilglicina de ASPFFLAVGY HKPHIPFRYP KEFQKLYPLE NITLAPDPEV sublinhado duplo) e PDGLPPVAYN PWMDIRQRED VQALNISVPY mutação knob
ALHNHYTQKS LSLSPGK 119 MSCPVPACCALLLVLGLCRARPRNALLLLADDGGFESGA Sequência de YNNSAIATPHLDALARRSLLFRNAFTSVSSCSPSRASLLT polipeptídeos de GLPQHQNGMYGLHQDVHHFNSFDKVRSLPLLLSQAGVR sulfoglucosamina TGIIGKKHVGPETVYPFDFAYTEENGSVLQVGRNITRIKLL sulfohidrolase humana VRKFLQTQDDRPFFLYVAFHDPHRCGHSQPQYGTFCEKF de comprimento total
WETHDPWVCAPDGVLEEKLSPQCQPLHNEL 120 RPRNALLLLADDGGFESGAYNNSAIATPHLDALARRSLLF Sequência de RNAFTSVSSCSPSRASLLTGLPQHQNGMYGLHQDVHHF polipeptídeo de NSFDKVRSLPLLLSQAGVRTGIIGKKHVGPETVYPFDFAY sulfoglucosamina TEENGSVLQVGRNITRIKLLVRKFLQTQDDRPFFLYVAFH sulfohidrolase humana DPHRCGHSQPQYGTFCEKFGNGESGMGRIPDWTPQAY madura
LSPQCQPLHNEL 121 MPRYGASLRQSCPRSGREQGQDGTAGAPGLLWMGLVL Sequência de ALALALALALSDSRVLWAPAEAHPLSPQGHPARLHRIVPR polipeptídeo de LRDVFGWGNLTCPICKGLFTAINLGLKKEPNVARVGSVAI esfingomielinase ácida KLCNLLKIAPPAVCQSIVHLFEDDMVEVWRRSVLSPSEAC humana de GLLLGSTCGHWDIFSSWNISLPTVPKPPPKPPSPPAPGAP comprimento total
FC 122 LSDSRVLWAPAEAHPLSPQGHPARLHRIVPRLRDVFGWG Sequência de NLTCPICKGLFTAINLGLKKEPNVARVGSVAIKLCNLLKIAP polipeptídeo de PAVCQSIVHLFEDDMVEVWRRSVLSPSEACGLLLGSTCG esfingomielinase ácida HWDIFSSWNISLPTVPKPPPKPPSPPAPGAPVSRILFLTDL humana madura
ARADSPALCRHLMPDGSLPEAQSLWPRPLFC 123 LSDSRVLWAPAEAHPLSPQGHPARLHRIVPRLRDVFGWG Sequência de NLTCPICKGLFTAINLGLKKEPNVARVGSVAIKLCNLLKIAP polipeptídeo de PAVCQSIVHLFEDDMVEVWRRSVLSPSEACGLLLGSTCG esfingomielinase ácida HWDIFSSWNISLPTVPKPPPKPPSPPAPGAPVSRILFLTDL humana truncada
ARADSPALCRHLMPDGSLPEAQ 124 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3B.1
MHEALHNHYGFHDLSLSPGK 125 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3B.2
MHEALHNHYGFHDLSLSPGK 126 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3B.3
MHEALHNHYGFHDLSLSPGK 127 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3B.4
MHEALHNHYGFHDLSLSPGK 128 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3B.5
MHEALHNHYGFHDLSLSPGK 129 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH2A2.1
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 130 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH2A2.2
CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 131 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH2A2.3
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 132 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH2A2.4
CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 133 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH2A2.5
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 134 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDPQTPP Clone CH2C.1
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 135 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDPPSPP Clone CH2C.2
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 136 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDPQTPP Clone CH2C.3
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 137 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDFRGPP Clone CH2C.4
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 138 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDPQTVP Clone CH2C.5
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 139 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSVPP Clone CH2D.1
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 140 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSVPP Clone CH2D.2
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 141 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSDM Clone CH2D.3
CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 142 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSDDW Clone CH2D.4
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 143 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSDDW Clone CH2D.5
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 144 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH2E3.1
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 145 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH2E3.2
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 146 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH2E3.3
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 147 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH2E3.4
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 148 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH2E3.5
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 149 RPRNALLLLA DDGGFESGAY NNSAIATPHL Polipeptídeo de fusão DALARRSLLF RNAFTSVSSC SPSRASLLTG SGSH-Fc com LPQHQNGMYG LHQDVHHFNS FDKVRSLPLL sequência SGSH LSQAGVRTGI IGKKHVGPET VYPFDFAYTE humana madura ENGSVLQVGR NITRIKLLVR KFLQTQDDRP (sublinhada) fundida FFLYVAFHDP HRCGHSQPQY GTFCEKFGNG com o terminal N de ESGMGRIPDW TPQAYDPLDV LVPYFVPNTP uma sequência Fc com AARADLAAQY TTVGRMDQGV GLVLQELRDA mutações hole e LALA
NHYTQKSLSL SPGK 150 APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT Polipeptídeo de fusão CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK SGSH-Fc com PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK sequência SGSH CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT humana madura LPPSRDELTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE (sublinhada) fundida WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL ao terminal C de uma TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS sequência Fc com LSLSPGKGGG GSRPRNALLL LADDGGFESG mutações hole e LALA
AKWQWETHDP WVCAPDGVLE EKLSPQCQPL HNEL 151 APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT Clone CH3C.35.21.17 CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK com mutações knob e
TVTKEEWQQG FVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK 152 RPRNALLLLA DDGGFESGAY NNSAIATPHL Polipeptídeo de fusão DALARRSLLF RNAFTSVSSC SPSRASLLTG SGSH-Fc com LPQHQNGMYG LHQDVHHFNS FDKVRSLPLL sequência SGSH LSQAGVRTGI IGKKHVGPET VYPFDFAYTE humana madura ENGSVLQVGR NITRIKLLVR KFLQTQDDRP (sublinhada) fundida FFLYVAFHDP HRCGHSQPQY GTFCEKFGNG com o terminal N de ESGMGRIPDW TPQAYDPLDV LVPYFVPNTP uma sequência Fc com AARADLAAQY TTVGRMDQGV GLVLQELRDA mutações knob e LALA
NHYTQKSLSL SPGK 153 APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT Polipeptídeo de fusão CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK SGSH-Fc com PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK sequência SGSH CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT humana madura LPPSRDELTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE (sublinhada) fundida WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL ao terminal C de uma TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS sequência Fc com LSLSPGKGGG GSRPRNALLL LADDGGFESG mutações knob e LALA
AKWQWETHDP WVCAPDGVLE EKLSPQCQPL HNEL 154 RPRNALLLLA DDGGFESGAY NNSAIATPHL Polipeptídeo de fusão DALARRSLLF RNAFTSVSSC SPSRASLLTG SGSH-Fc com LPQHQNGMYG LHQDVHHFNS FDKVRSLPLL sequência de SGSH LSQAGVRTGI IGKKHVGPET VYPFDFAYTE humana madura ENGSVLQVGR NITRIKLLVR KFLQTQDDRP (sublinhada) fundida FFLYVAFHDP HRCGHSQPQY GTFCEKFGNG com o terminal N do ESGMGRIPDW TPQAYDPLDV LVPYFVPNTP clone CH3C.35.21.17 AARADLAAQY TTVGRMDQGV GLVLQELRDA com mutações knob e
NHYTQKSLSL SPGK 155 APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT Polipeptídeo de fusão CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK SGSH-Fc com
PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK sequência SGSH CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT humana madura LPPSRDELTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVL (sublinhada) fundida WESYGTEWSS YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL ao terminal C do clone TVTKEEWQQG FVFSCSVMHE ALHNHYTQKS CH3C.35.21.17 com LSLSPGKGGG GSRPRNALLL LADDGGFESG mutações knob e LALA
AKWQWETHDP WVCAPDGVLE EKLSPQCQPL HNEL 156 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.20.1 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutação knob
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 157 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.20.1 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações knob e
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 158 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.20.1 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações knob e
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 159 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.20.1 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações knob e
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 160 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.20.1 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações knob, HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV LALA e YTE
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 161 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.20.1 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações knob, HQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQV LALAPG e YTE
162 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.20.1 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações hole
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 163 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.20.1 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações hole e
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 164 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.20.1 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações hole e
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 165 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.20.1 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações hole e
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 166 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.20.1 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações hole, HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV LALA e YTE
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 167 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.20.1 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações hole, HQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQV LALAPG e YTE
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 168 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.2 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutação knob
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 169 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.2 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações knob e
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 170 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.2 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações knob e
171 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.2 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações knob e
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 172 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.2 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações knob, HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV LALA e YTE
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 173 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.2 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações knob, HQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQV LALAPG e YTE
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 174 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.2 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações hole
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 175 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.2 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações hole e
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 176 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.2 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações hole e
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 177 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.2 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações hole e
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 178 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.2 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações hole, HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV LALA e YTE
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 179 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.2 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações hole, HQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQV LALAPG e YTE
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 180 Clone CH3C.35.23.3 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED com mutação knob
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 181 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.3 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações knob e
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 182 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.3 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações knob e
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 183 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.3 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações knob e
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 184 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.3 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações knob, HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV LALA e YTE
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 185 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.3 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações knob, HQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQV LALAPG e YTE
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 186 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.3 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações hole
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 187 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.3 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações hole e
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 188 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.3 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações hole e
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 189 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.3 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações hole e
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 190 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.3 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações hole, HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV LALA e YTE
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 191 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.3 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações hole, HQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQV LALAPG e YTE
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 192 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.4 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutação knob
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 193 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.4 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações knob e
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 194 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.4 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações knob e
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 195 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.4 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações knob e
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 196 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.4 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações knob, HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV LALA e YTE
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 197 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.4 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações knob, HQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQV LALAPG e YTE
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 198 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.4 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações hole
199 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.4 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações hole e
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 200 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.4 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações hole e
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 201 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.4 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações hole e
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 202 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.4 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações hole, HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV LALA e YTE
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 203 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23.4 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações hole, HQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQV LALAPG e YTE
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 204 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL CH3C.35.21.17.2 com HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV mutação knob
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 205 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL CH3C.35.21.17.2 com HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV mutações knob e LALA
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 206 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL CH3C.35.21.17.2 com HQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQV mutações knob e
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 207 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Clone PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL CH3C.35.21.17.2 com HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV mutações knob e YTE
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 208 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Clone PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL CH3C.35.21.17.2 com
HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV mutações knob, LALA YTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVLWESYGTE e YTE
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 209 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Clone PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL CH3C.35.21.17.2 com HQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQV mutações knob, YTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVLWESYGTE LALAPG e YTE
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 210 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL CH3C.35.21.17.2 com HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV mutações hole
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 211 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL CH3C.35.21.17.2 com HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV mutações hole e LALA
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 212 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL CH3C.35.21.17.2 com HQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQV mutações hole e
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 213 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Clone PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL CH3C.35.21.17.2 com HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV mutações hole e YTE
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 214 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Clone PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL CH3C.35.21.17.2 com HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV mutações hole, LALA e
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 215 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Clone PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL CH3C.35.21.17.2 com HQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQV mutações hole, YTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVLWESYGTE LALAPG e YTE
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 216 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutação knob
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 217 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações knob e
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 218 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações knob e
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 219 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações knob e
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 220 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações knob, HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV LALA e YTE
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 221 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações knob, HQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQV LALAPG e YTE
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 222 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações hole
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 223 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações hole e
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 224 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações hole e
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 225 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações hole e
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 226 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações hole, HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV LALA e YTE
227 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHED Clone CH3C.35.23 PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL com mutações hole, HQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQV LALAPG e YTE
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 228 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT Clone CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS CH3C.35.21.17.2 com TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK mutações knob e LALA AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDI e porção da sequência AVLWESYGTEWASYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVTKEE de dobradiça IgG1 WQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK humana 229 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT Clone CH3C.35.23.2 CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS com mutações knob e TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK LALA e porção da AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDI sequência de AVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVTKEE dobradiça IgG1 WQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK humana 230 SETQANSTTD ALNVLLIIVD DLRPSLGCYG DKLVRSPNID Sequência IDS
DSDPLQDHNM YNDSQGGDLF QLLMP 231 SETQANSTTD ALNVLLIIVD DLRPSLGCYG DKLVRSPNID Polipeptídeo de fusão QLASHSLLFQ NAFAQQAVCA PSRVSFLTGR IDS-Fc com a RPDTTRLYDF NSYWRVHAGN FSTIPQYFKE sequência IDS NGYVTMSVGK VFHPGISSNH TDDSPYSWSF sublinhada e mutações PPYHPSSEKY ENTKTCRGPD GELHANLLCP hole e LALA
ALHNHYTQKS LSLSPGK 232 SETQANSTTD ALNVLLIIVD DLRPSLGCYG DKLVRSPNID Polipeptídeo de fusão QLASHSLLFQ NAFAQQAVCA PSRVSFLTGR IDS-Fc com a RPDTTRLYDF NSYWRVHAGN FSTIPQYFKE sequência IDS NGYVTMSVGK VFHPGISSNH TDDSPYSWSF sublinhada e mutações PPYHPSSEKY ENTKTCRGPD GELHANLLCP hole
ALHNHYTQKS LSLSPGK 233 SETQANSTTD ALNVLLIIVD DLRPSLGCYG DKLVRSPNID Polipeptídeo de fusão QLASHSLLFQ NAFAQQAVCA PSRVSFLTGR IDS-Fc com a RPDTTRLYDF NSYWRVHAGN FSTIPQYFKE sequência IDS NGYVTMSVGK VFHPGISSNH TDDSPYSWSF sublinhada e mutação PPYHPSSEKY ENTKTCRGPD GELHANLLCP knob
ALHNHYTQKS LSLSPGK 234 SETQANSTTD ALNVLLIIVD DLRPSLGCYG DKLVRSPNID Sequência IDS QLASHSLLFQ NAFAQQAVfGA PSRVSFLTGR
RPDTTRLYDF NSYWRVHAGN FSTIPQYFKE (resíduo formilglicina NGYVTMSVGK VFHPGISSNH TDDSPYSWSF "fG" de sublinhado PPYHPSSEKY ENTKTCRGPD GELHANLLCP duplo)
DSDPLQDHNM YNDSQGGDLF QLLMP 235 SETQANSTTD ALNVLLIIVD DLRPSLGCYG DKLVRSPNID Polipeptídeo de fusão QLASHSLLFQ NAFAQQAVfGA PSRVSFLTGR IDS-Fc com a RPDTTRLYDF NSYWRVHAGN FSTIPQYFKE sequência IDS NGYVTMSVGK VFHPGISSNH TDDSPYSWSF sublinhada (resíduo de PPYHPSSEKY ENTKTCRGPD GELHANLLCP formilglicina “fG” de VDVLDVPEGT LPDKQSTEQA IQLLEKMKTS sublinhado duplo) e ASPFFLAVGY HKPHIPFRYP KEFQKLYPLE NITLAPDPEV mutaçõeshole e LALA
ALHNHYTQKS LSLSPGK 236 SETQANSTTD ALNVLLIIVD DLRPSLGCYG DKLVRSPNID Polipeptídeo de fusão QLASHSLLFQ NAFAQQAVfGA PSRVSFLTGR IDS-Fc com a RPDTTRLYDF NSYWRVHAGN FSTIPQYFKE sequência IDS NGYVTMSVGK VFHPGISSNH TDDSPYSWSF sublinhada (resíduo de PPYHPSSEKY ENTKTCRGPD GELHANLLCP formilglicina “fG” de VDVLDVPEGT LPDKQSTEQA IQLLEKMKTS sublinhado duplo) e ASPFFLAVGY HKPHIPFRYP KEFQKLYPLE NITLAPDPEV mutações hole
ALHNHYTQKS LSLSPGK 237 SETQANSTTD ALNVLLIIVD DLRPSLGCYG DKLVRSPNID Polipeptídeo de fusão QLASHSLLFQ NAFAQQAVfGA PSRVSFLTGR IDS-Fc com a RPDTTRLYDF NSYWRVHAGN FSTIPQYFKE sequência IDS NGYVTMSVGK VFHPGISSNH TDDSPYSWSF sublinhada (resíduo de PPYHPSSEKY ENTKTCRGPD GELHANLLCP formilglicina “fG” de VDVLDVPEGT LPDKQSTEQA IQLLEKMKTS sublinhado duplo) e ASPFFLAVGY HKPHIPFRYP KEFQKLYPLE NITLAPDPEV mutação knob
ALHNHYTQKS LSLSPGK 238 NSVIIVDKNGRLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKLVHANF Domínio apical do TfR GTKKDFEDLYTPVNGSIVIVRAGKITFAEKVANAESLNAIG humano
KTDSTCRMVTSESKNVKLTVS 239 GGGGS Ligante rico em glicina 240 GGGGSGGGGS Ligante rico em glicina 241 HHHHHH Tag de hexahistidina 242 YxTEWSS Motivo da biblioteca
Claims (142)
1. PROTEÍNA caracterizada por compreender: (a) um primeiro polipeptídeo Fc que está ligado a uma enzima de terapia de reposição enzimática (ERT, enzyme replacement therapy), uma variante da enzima de ERT, ou um fragmento cataliticamente ativo da mesma; e (b) um segundo polipeptídeo Fc que forma um dímero de Fc com o primeiro polipeptídeo Fc, em que o primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc não incluem uma sequência de região variável de cadeia pesada e/ou leve de imunoglobulina ou uma porção de ligação a antígeno desta.
2. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela enzima de ERT ser a iduronato 2-sulfatase (IDS), uma variante de IDS, ou um fragmento cataliticamente ativo da mesma.
3. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pela enzima de ERT compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 91, 92, 114, 230 e 234.
4. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pela enzima de ERT compreender a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 91, 92, 114, 230 e 234.
5. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela enzima de ERT ser a N-sulfoglucosamina sulfo-hidrolase (SGSH), uma variante de SGSH, ou um fragmento cataliticamente ativo da mesma.
6. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pela enzima de ERT compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 119 e 120.
7. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pela enzima de ERT compreender a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 119 e 120.
8. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela enzima de ERT ser a esfingomielinase ácida (ASM), uma variante de ASM, ou um fragmento cataliticamente ativo da mesma.
9. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pela enzima de ERT compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 121, 122 e 123.
10. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pela enzima de ERT compreender a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 121, 122 e 123.
11. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela enzima de ERT ser a β-glucocerebrosidase (GBA), uma variante de GBA, ou um fragmento cataliticamente ativo da mesma.
12. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pela enzima de ERT compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS:93 e 94.
13. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pela enzima de ERT compreender a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS:93 e 94.
14. PROTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo primeiro polipeptídeo Fc ser um polipeptídeo de fusão que está ligado à enzima de ERT, à variante da enzima de ERT, ou ao fragmento cataliticamente ativo da mesma por uma ligação peptídica ou por um ligante polipeptídico.
15. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo ligante polipeptídico ser um ligante polipeptídico flexível.
16. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo ligante polipeptídico flexível ser um ligante rico em glicina.
17. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo ligante rico em glicina ser G4S (SEQ ID NO:239) ou (G4S)2 (SEQ ID NO:240).
18. PROTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo segundo polipeptídeo Fc estar ligado a uma enzima de ERT, uma variante da enzima de ERT, ou um fragmento cataliticamente ativo da mesma.
19. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo segundo polipeptídeo Fc ser um polipeptídeo de fusão que está ligado à enzima de ERT, à variante da enzima de ERT, ou ao fragmento cataliticamente ativo da mesma por uma ligação peptídica ou por um ligante polipeptídico.
20. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizada pelo terminal N do primeiro polipeptídeo Fc e/ou o terminal N do segundo polipeptídeo Fc está ligado à enzima de ERT.
21. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo terminal N do primeiro polipeptídeo Fc estar ligado a uma enzima de ERT e o terminal N do segundo polipeptídeo Fc está ligado à outra enzima de ERT.
22. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizada pelo terminal C do primeiro polipeptídeo Fc e/ou o terminal C do segundo polipeptídeo Fc está ligado à enzima de ERT.
23. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo terminal C do primeiro polipeptídeo Fc estar ligado a uma enzima de ERT e o terminal C do segundo polipeptídeo Fc estar ligado à outra enzima de ERT.
24. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizada pelo terminal N do primeiro polipeptídeo Fc estar ligado a uma enzima de ERT e o terminal C do segundo polipeptídeo Fc estar ligado à outra enzima de ERT.
25. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizada pelo terminal C do primeiro polipeptídeo Fc estar ligado a uma enzima de ERT e o terminal N do segundo polipeptídeo Fc estar ligado à outra enzima de ERT.
26. PROTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pela proteína compreender uma única enzima de ERT e em que o terminal N ou o terminal C do primeiro polipeptídeo Fc estar ligado à enzima de ERT.
27. PROTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 25, caracterizada pela proteína compreender duas enzimas de ERT.
28. PROTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17, caracterizada pelo polipeptídeo de fusão compreender, do terminal N ao C: a enzima de ERT, a variante da enzima de ERT, ou o fragmento cataliticamente ativo da mesma; o ligante polipeptídico; e o primeiro polipeptídeo Fc.
29. PROTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizada pelo primeiro polipeptídeo Fc ser um polipeptídeo Fc modificado e/ou o segundo polipeptídeo Fc ser um polipeptídeo Fc modificado.
30. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo primeiro polipeptídeo Fc e o segundo polipeptídeo Fc contêm, cada um, modificações que promovem a heterodimerização.
31. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo dímero de Fc ser um heterodímero de Fc.
32. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 30 ou 31, caracterizada por um dos polipeptídeos Fc ter uma substituição T366W e o outro polipeptídeo Fc ter substituições T366S, L368A e Y407V, de acordo com a numeração EU.
33. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo primeiro polipeptídeo Fc conter as substituições T366S, L368A e Y407V e o segundo polipeptídeo Fc conter a substituição T366W.
34. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo primeiro polipeptídeo Fc estar ligado à enzima de ERT e compreender a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 117, 232 e 236.
35. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo primeiro polipeptídeo Fc conter a substituição T366W e o segundo polipeptídeo Fc conter as substituições T366S, L368A e Y407V.
36. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo primeiro polipeptídeo Fc estar ligado à enzima de ERT e compreender a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 118, 233 e 237.
37. PROTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 36, caracterizada pelo primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreenderem um sítio de ligação a FcRn nativo.
38. PROTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 37, caracterizada pelo primeiro polipeptídeo Fc e o segundo polipeptídeo Fc não terem função efetora.
39. PROTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 37, caracterizada pelo primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc incluírem uma modificação que reduz a função efetora.
40. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pela modificação que reduz a função efetora serem as substituições de Ala na posição 234 e Ala na posição 235, de acordo com a numeração EU.
41. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo primeiro polipeptídeo Fc estar ligado à enzima de ERT e compreender a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 115, 231 e 235.
42. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo primeiro polipeptídeo Fc estar ligado à enzima de ERT e compreender a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 149, 150, 152 e
153.
43. PROTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 42, caracterizada pelo primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreenderem alterações de aminoácidos relativas à sequência de Fc nativa que prolonga a meia-vida sérica.
44. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelas alterações de aminoácidos compreenderem substituições de Tyr na posição 252, Thr na posição 254 e Glu na posição 256, de acordo com a numeração EU.
45. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelas alterações de aminoácidos compreendem substituições de Leu na posição 428 e Ser na posição 434, de acordo com a numeração EU.
46. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelas alterações de aminoácidos compreenderem uma substituição de Ser ou Ala na posição 434, de acordo com a numeração EU.
47. PROTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 46, caracterizada pelo primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc se ligaram especificamente a um receptor da transferrina (TfR).
48. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 47, caracterizada pelo primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreenderem pelo menos duas substituições nas posições selecionadas do grupo consistindo em 384, 386, 387, 388, 389, 390, 413, 416 e 421, de acordo com a numeração EU.
49. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 48, caracterizada pelo primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreenderem pelo menos três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou nove substituições nas posições.
50. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 48 ou 49, caracterizada pelo primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreenderem uma, duas, três ou quatro substituições nas posições compreendendo 380, 391, 392 e 415, de acordo com a numeração EU.
51. PROTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 50, caracterizada pelo primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreenderem ainda uma, duas ou três substituições nas posições compreendendo 414, 424 e 426, de acordo com a numeração EU.
52. PROTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 51, caracterizada pelo primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreenderem Trp na posição 388.
53. PROTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 52, caracterizada pelo primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreenderem um aminoácido aromático na posição 421.
54. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 53, caracterizada pelo aminoácido aromático na posição 421 ser Trp ou Phe.
55. PROTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 54, caracterizada pelo primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreenderem pelo menos uma posição selecionada dentre as seguintes: posição 380 é Trp, Leu, ou Glu; posição 384 é Tyr ou Phe; posição 386 é Thr; posição 387 é Glu; posição 388 é Trp; posição 389 é Ser, Ala, Val, ou Asn; posição 390 é Ser ou Asn; posição 413 é Thr ou Ser; posição 415 é Glu ou Ser; posição 416 é Glu; e posição 421 é Phe.
56. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreenderem 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou 11 posições selecionadas dentre as seguintes: posição
380 é Trp, Leu, ou Glu; posição 384 é Tyr ou Phe; posição 386 é Thr; posição 387 é Glu; posição 388 é Trp; posição 389 é Ser, Ala, Val, ou Asn; posição 390 é Ser ou Asn; posição 413 é Thr ou Ser; posição 415 é Glu ou Ser; posição 416 é Glu; e posição 421 é Phe.
57. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 56, caracterizada pelo primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreenderem 11 posições conforme se segue: posição 380 é Trp, Leu, ou Glu; posição 384 é Tyr ou Phe; posição 386 é Thr; posição 387 é Glu; posição 388 é Trp; posição 389 é Ser, Ala, Val, ou Asn; posição 390 é Ser ou Asn; posição 413 é Thr ou Ser; posição 415 é Glu ou Ser; posição 416 é Glu; e posição 421 é Phe.
58. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 56 ou 57, caracterizada pelo primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc terem um domínio CH3 com pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade, ou pelo menos 95% de identidade com os aminoácidos 111-217 de qualquer uma das SEQ ID NOS:34-38, 58, 60-90, 151 e 156-229.
59. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 58, caracterizada pelos resíduos em pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 das posições correspondentes às posições do índice EU 380, 384, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 413, 414, 415, 416, 421, 424 e 426 de qualquer uma das SEQ ID NOS:34-38, 58, 60-90, 151 e 156-229 não são deletados ou substituídos.
60. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 58 ou 59, caracterizada pelo primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreenderem a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 156-229.
61. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 60, caracterizada pelo primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreendem a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 157, 169, 181, 193, 205 e 217.
62. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 60, caracterizada pelo primeiro polipeptídeo Fc compreender a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 115, 231 e 235, e o segundo polipeptídeo Fc compreender a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS:205 e 228.
63. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 60, caracterizada pelo primeiro polipeptídeo Fc compreender a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 115, 231 e 235, e o segundo polipeptídeo Fc compreender a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 169 e 229.
64. PROTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 63, caracterizada pelo primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc se ligarem ao domínio apical do TfR.
65. PROTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 64, caracterizada pela ligação da proteína ao TfR não inibir substancialmente a ligação da transferrina ao TfR.
66. PROTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 65, caracterizada pelo primeiro polipeptídeo Fc e/ou o segundo polipeptídeo Fc terem uma identidade de sequência de pelo menos 75%, ou de pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, ou 95%, em comparação ao polipeptídeo Fc do tipo selvagem correspondente.
67. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 66, caracterizada pelo polipeptídeo Fc do tipo selvagem correspondente ser um polipeptídeo Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana.
68. PROTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 67, caracterizada pela captação da enzima de ERT no cérebro ser pelo menos dez vezes maior em comparação à captação da enzima de ERT na ausência do primeiro polipeptídeo Fc e/ou do segundo polipeptídeo Fc ou em comparação à captação da enzima de ERT sem as modificações no primeiro polipeptídeo Fc e/ou no segundo polipeptídeo Fc que resultam na ligação ao TfR.
69. PROTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 68, caracterizada pelo primeiro polipeptídeo Fc não ser modificado para se ligar a um receptor na barreira hematoencefálica (BBB, blood-brain barrier) e o segundo polipeptídeo Fc ser modificado para se ligar especificamente a um TfR.
70. PROTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 68, caracterizada pelo primeiro polipeptídeo Fc ser modificado para se ligar especificamente a um TfR e o segundo polipeptídeo Fc não ser modificado para se ligar a um receptor na BBB.
71. PROTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 70, caracterizada pela proteína não incluir uma sequência de região variável de cadeia pesada e/ou leve de imunoglobulina ou uma porção de ligação a antígeno da mesma.
72. POLIPEPTÍDEO caracterizado por compreender um polipeptídeo Fc que está ligado a uma enzima de ERT, uma variante da enzima de ERT, ou um fragmento cataliticamente ativo da mesma, em que o polipeptídeo Fc contém uma ou mais modificações que promovem sua heterodimerização em outro polipeptídeo Fc.
73. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pela enzima de ERT ser a iduronato 2-sulfatase (IDS), uma variante de IDS, ou um fragmento cataliticamente ativo da mesma.
74. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pela enzima de ERT ser a N-sulfoglucosamina sulfo-hidrolase (SGSH), uma variante de SGSH, ou um fragmento cataliticamente ativo da mesma.
75. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pela enzima de ERT ser a esfingomielinase ácida (ASM), uma variante de ASM, ou um fragmento cataliticamente ativo da mesma.
76. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pela enzima de ERT ser a β-glucocerebrosidase (GBA), uma variante de GBA, ou um fragmento cataliticamente ativo da mesma.
77. POLIPEPTÍDEO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 72 a 76, caracterizado pelo polipeptídeo Fc ser um polipeptídeo de fusão que está ligado à enzima de ERT, à variante da enzima de ERT, ou ao fragmento cataliticamente ativo da mesma por uma ligação peptídica ou por um ligante polipeptídico.
78. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 77, caracterizado pelo polipeptídeo de fusão compreender, do terminal N ao C: a enzima de ERT, a variante da enzima de ERT, ou o fragmento cataliticamente ativo da mesma; o ligante polipeptídico; e o primeiro polipeptídeo Fc.
79. POLIPEPTÍDEO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 72 a 78, caracterizado pelo polipeptídeo Fc conter substituições T366S, L368A e Y407V, de acordo com a numeração EU.
80. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 115, 117, 231, 232, 235 e 236.
81. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 149 e 150.
82. POLIPEPTÍDEO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 72 a 78, caracterizado pelo polipeptídeo Fc conter uma substituição T366W.
83. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 82, caracterizado pelo polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 118, 233 e 237.
84. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 82, caracterizado polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 152-155.
85. POLIPEPTÍDEO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 72 a 84, caracterizado pelo polipeptídeo compreender ainda o outro polipeptídeo Fc.
86. POLINUCLEOTÍDEO caracterizado por compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 72 a 84.
87. VETOR caracterizado por compreender o polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 86.
88. CÉLULA HOSPEDEIRA caracterizada por compreender o polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 86, ou o vetor, de acordo com a reivindicação 87.
89. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 88, caracterizada por compreender ainda um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica o outro polipeptídeo Fc.
90. MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO compreendendo um polipeptídeo Fc que está ligado a uma enzima de ERT, uma variante da enzima de ERT, ou um fragmento cataliticamente ativo da mesma, caracterizado por compreender o cultivo de uma célula hospedeira em condições nas quais o polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 86 é expresso.
91. MÉTODO DE TRATAMENTO DE UM DISTÚRBIO de armazenamento lisossômico (LSD, lysosomal storage disorder), sendo o método caracterizado por compreender a administração da proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 71, ou do polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 72 a 85, a um paciente em necessidade.
92. MÉTODO DE DIMINUIÇÃO DO ACÚMULO de um produto metabólico tóxico em um paciente com um LSD, sendo o método caracterizado por compreender a administração da proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 71, ou do polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 72 a 85, ao paciente.
93. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 91 ou 92, caracterizado pelo LSD ser a síndrome de Hunter, e a enzima de ERT ser a IDS.
94. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 93, caracterizado pelo produto metabólico tóxico compreender dissacarídeos derivados de sulfato de heparina e/ou dissacarídeos derivados de dermatan sulfato.
95. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 91 ou 92, caracterizado pelo LSD ser a síndrome de Sanfilippo A, e a enzima de ERT ser a SGSH.
96. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 95, caracterizado pelo produto metabólico tóxico compreender oligossacarídeos derivados de heparan sulfato.
97. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 91 ou 92, caracterizado pelo LSD ser a doença de Niemann-Pick, e a enzima de ERT ser a ASM.
98. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 97, caracterizado pelo produto metabólico tóxico compreender esfingomielina.
99. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 91 ou 92, caracterizado pelo LSD ser a doença de Gaucher ou a doença de Parkinson, e a enzima de ERT ser a GBA.
100. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 99, caracterizado pelo produto metabólico tóxico compreender glucosilceramida.
101. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA caracterizada por compreender a proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a
71, ou o polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 72 a 85, e um carreador farmaceuticamente aceitável.
102. MÉTODO DE MONITORAMENTO do acúmulo de substrato para avaliar a atividade da IDS, sendo o método caracterizado por compreender: (a) romper as células em uma amostra celular ou tecidual de um sujeito administrado com a proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, 14 a 41, e 43 a 71, ou com o polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 72 a 73, 77 a 80, 82 a 83 e 85, para abrir as microvesículas para obter uma solução de glicosaminoglicano (GAG) para ser analisada; (b) digerir a solução de GAG com pelo menos uma heparinase e condroitinase B para obter dissacarídeos derivados de GAG; (c) analisar os dissacarídeos derivados de GAG por espectrometria de massa; e (d) determinar os níveis de dissacarídeos derivados de heparan sulfato e/ou dermatan sulfato, em que os níveis reduzidos de dissacarídeos derivados de heparan sulfato e/ou dermatan sulfato em comparação a um controle que não possui atividade de IDS são indicativos de atividade de IDS aumentada na amostra comparada ao controle.
103. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 102, caracterizado pela etapa de rompimento das células compreender pelo menos um ciclo de congelamento-descongelamento e pelo menos uma etapa de sonicação.
104. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 103, caracterizado pelas células serem de uma amostra de tecido e o método compreender pelo menos três, quatro ou cinco ciclos de congelamento-descongelamento.
105. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 102 a 104, caracterizado pelo sujeito ser um camundongo deficiente na atividade da IDS.
106. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 102 a 104, caracterizado pelo sujeito ser um primata não humano.
107. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 102 a 104, caracterizado pelo sujeito ser um paciente humano com síndrome de Hunter.
108. MÉTODO DE MONITORAMENTO do acúmulo de substrato para avaliar a atividade da SGSH, sendo o método caracterizado por compreender: (a) romper as células em uma amostra celular ou tecidual de um sujeito administrado com a proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, 14 a 33, 35, 37 a 40 e 42 a 71, ou com o polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 72, 74, 77 a 79, 81 a 82 e 84 a 85, para abrir as microvesículas para obter uma solução de glicosaminoglicano (GAG) para ser analisada; (b) digerir a solução de GAG com pelo menos uma heparinase para obter dissacarídeos derivados de GAG; (c) analisar os dissacarídeos derivados de GAG por espectrometria de massa; e (d) determinar os níveis de dissacarídeos derivados de heparan sulfato, em que os níveis reduzidos de dissacarídeos derivados de heparan sulfato em comparação a um controle que não possui atividade de SGSH são indicativos de atividade de SGSH aumentada na amostra comparada ao controle.
109. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 108, caracterizado pela etapa de rompimento das células compreender pelo menos um ciclo de congelamento-descongelamento e pelo menos uma etapa de sonicação.
110. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 109, caracterizado pelas células serem de uma amostra de tecido e o método compreender pelo menos três, quatro ou cinco ciclos de congelamento-descongelamento.
111. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 108 a 110, caracterizado pelo sujeito ser um camundongo deficiente na atividade da SGSH.
112. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 108 a 110, caracterizado pelo sujeito ser um primata não humano.
113. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 108 a 110, caracterizado pelo sujeito ser um paciente humano com síndrome de Sanfilippo A.
114. MÉTODO DE TRANSPORTE DE UM AGENTE através da BBB de um mamífero, caracterizado por compreender a exposição da BBB a uma proteína que se liga a um TfR com uma afinidade de cerca de 50 nM a cerca de 250 nM, em que a proteína está ligada ao agente e transporta o agente ligado através da BBB.
115. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 114, caracterizado pela concentração máxima (Cmax) do agente no cérebro do mamífero ser melhorada.
116. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 114 ou 115, caracterizado pelo agente ser útil para o tratamento de um LSD.
117. MÉTODO DE TRATAMENTO DE UM LSD, caracterizado por compreender a administração, a um mamífero, de uma proteína que se liga a um TfR com uma afinidade de cerca de 50 nM a cerca de 250 nM, em que a proteína está ligada a um agente para tratamento do LSD, expondo, desse modo, o cérebro do mamífero ao agente.
118. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 114 a 117, caracterizado pela proteína melhorar a Cmax do agente no cérebro em comparação ao agente ligado a uma proteína de referência que se liga ao TfR com uma afinidade mais fraca.
119. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 114 a 118, caracterizado pela proteína melhorar a Cmax do agente em uma concentração terapeuticamente eficaz no mamífero em comparação ao agente ligado a uma proteína de referência que se liga ao TfR com uma afinidade mais fraca.
120. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 118 a 119, caracterizado pela proteína de referência se ligar ao TfR com uma afinidade de cerca de 600 nM, ou mais fraca.
121. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 114 a 120, caracterizado pelo TfR ser um TfR de primata.
122. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 121, caracterizado pelo TfR de primata ser um TfR humano.
123. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 114 a 122, caracterizado pela proteína se ligar ao domínio apical do TfR.
124. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 114 a 123, caracterizado pela proteína se ligar ao TfR com uma afinidade de cerca de 100 nM a cerca de 200 nM.
125. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 114 a 124, caracterizado pela proteína se ligar ao TfR com uma afinidade de cerca de 110 nM a cerca de 150 nM.
126. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 119 a 125, caracterizado pela concentração terapeuticamente eficaz do agente ser uma concentração que trata um ou mais sintomas de um LSD no mamífero.
127. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 114 a 126, caracterizado pelo agente ser um terapêutico de reposição de proteínas.
128. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 114 a 127, caracterizado pelo agente ou terapêutico de reposição de proteínas ser uma enzima.
129. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 128, caracterizado pela enzima diminuir o acúmulo de um produto metabólico tóxico no cérebro do mamífero que possui o LSD em um grau maior quando ligada à proteína em comparação a quando a enzima está ligada à proteína de referência.
130. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 128 ou 129, caracterizado pela enzima ser a IDS e o LSD ser a síndrome de Hunter.
131. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 130, caracterizado pelo produto metabólico tóxico compreender dissacarídeos derivados de sulfato de heparina e/ou dissacarídeos derivados de dermatan sulfato.
132. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 128 ou 129, caracterizado pela enzima ser a SGSH e o LSD ser a síndrome de Sanfilippo A.
133. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 128 ou 129, caracterizado pela enzima ser a ASM e o LSD ser a doença de Niemann-Pick.
134. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 128 ou 129, caracterizado pela enzima ser a GBA e o LSD é a doença de Gaucher.
135. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 114 a 126, caracterizado pelo agente compreender uma região variável de anticorpo.
136. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 135, caracterizado pelo agente compreender um fragmento de anticorpo.
137. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 136, caracterizado pelo agente compreender um Fab ou scFv.
138. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 114 a 137, caracterizado pela proteína ser um polipeptídeo Fc modificado que contém um sítio de ligação não nativo capaz de se ligar ao TfR.
139. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 114 a 137, caracterizado pela proteína compreender uma região variável de anticorpo que se liga especificamente ao TfR.
140. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 139, caracterizado pela proteína compreender um fragmento de anticorpo.
141. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 140, caracterizado pela proteína compreender um Fab ou scFv.
142. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 114 a 141, caracterizado pela proteína ligada ser administrada como parte de um carreador farmaceuticamente aceitável.
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