BR112019013202A2 - formulação liofilizada - Google Patents

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Yasukawa Hidehito
Okabe Shinji
Yamaguchi Yuka
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Abstract

[problema] prover uma composição farmacêutica que contenha uma proteína de fusão de um anticorpo e uma enzima lisossomal como um ingrediente ativo e seja estável o suficiente para ser distribuída no mercado. [solução] uma preparação liofilizada que contém uma proteína de fusão de um anticorpo e uma enzima lisossomal como um ingrediente ativo e contém adicionalmente um sal neutro, um dissacarídeo, um tensoativo não iônico e um tampão. um exemplo de uma preparação liofilizada como essa contém uma proteína de fusão de um anticorpo antirreceptor de transferrina e iduronato-2-sulfatase humana como um ingrediente ativo e contém adicionalmente cloreto de sódio como um sal neutro, sacarose como um dissacarídeo, poloxâmero como um tensoativo não iônico e um tampão fosfato como tampão.

Description

FORMULAÇÃO LIOFILIZADA
Campo técnico [001] A presente invenção refere-se a uma formulação liofilizada estável em armazenamento contendo uma proteína, na qual um anticorpo e uma enzima lisossomal são combinados, como um ingrediente ativo, e mais particularmente, à formulação liofilizada contendo sacarose e um tensoativo não iônico como um agente estabilizante.
Fundamentos da técnica [002] As proteínas nas quais um anticorpo é combinado com uma enzima lisossomal foram reportadas como sendo produzidas, como uma proteína de fusão entre um anticorpo antirreceptor de insulina e α-L-iduronidase (Documento de Patente 1), e uma proteína de fusão entre um anticorpo antirreceptor de insulina e iduronato-2-sulfatase (Documento de Patente 2). Na formulação de tais proteínas novas construídas artificialmente, não se sabe quais as formas são preferíveis para a sua formulação.
[003] Em relação à formulação de anticorpos, muitos relatórios foram feitos, incluindo uma formulação liofilizada contendo anticorpo anti-IL-13 como ingrediente ativo (Documento de Patente 3), uma formulação liofilizada de um anticorpo contendo aminoácidos como arginina, histidina e lisina ou seus sais (Documento de Patente 4), uma formulação liofilizada de um anticorpo contendo meglumina (Documento de Patente 5), uma formulação liofilizada de um anticorpo antirreceptor de EGF contendo ácido lactobiônico (Documento de Patente 6) e uma formulação liofilizada de um anticorpo anti-IL-23pl9 humano contendo ácido cítrico, polissorbato 80 e sacarose (Documento de Patente 7). Ou seja, mesmo pensando apenas em anticorpos, a situação atual é que tentativa e erro são necessários na formulação de suas formulações.
Lista de citações
Literatura de patente
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 12/87 /68 [004] [Documento de Patente 1] JP 2010-534723 [Documento de Patente 2] JP 2012-521194 [Documento de Patente 3] JP 2016-519124 [Documento de Patente 4] WO 2007/074880 [Documento de Patente 5] WO 2006/132363 [Documento de Patente 6] JP 2009-540015 [Documento de Patente 7] JP 2012-501332
Sumário da invenção
Problemas a serem resolvidos pela invenção [005] Um objetivo da presente invenção é prover uma formulação liofilizada compreendendo, como ingrediente ativo, uma proteína na qual um anticorpo e uma enzima lisossomal estão ligados um ao outro, e como agentes estabilizantes, sacarose e um tensoativo não iônico, essa formulação é estável o suficiente para permitir sua distribuição ao mercado.
Meios para resolver os problemas [006] Em um estudo para o objetivo acima mencionado, os inventores verificaram que uma proteína, na qual um anticorpo e uma iduronato-2sulfatase humana, uma das enzimas lisossomais humanas, são combinados, pode ser armazenada de forma estável na forma de uma formulação liofilizada contendo sacarose e um tensoativo não iônico como excipientes. Assim, a presente invenção inclui o seguinte.
[007] (1) Uma formulação liofilizada compreendendo;
uma proteína de fusão incluindo um anticorpo e uma enzima lisossomal, como um ingrediente ativo, e adicionalmente um sal neutro, um dissacarídeo, um tensoativo não iônico e um tampão.
[008] (2) A formulação liofilizada de acordo com 1 acima, em que o sal neutro é o cloreto de sódio.
[009] (3) A formulação liofilizada de acordo com 1 ou 2 acima, em
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 13/87 /68 que o dissacarídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em trealose, sacarose, maltose e lactose.
[0010] (4) A formulação liofilizada de acordo com qualquer um dos 1 a 3 acima, em que o tensoativo não iônico é polissorbato ou poloxâmero.
[0011] (5) A formulação liofilizada de acordo com qualquer um dos 1 a 3 acima, em que o tensoativo não iônico é selecionado a partir do grupo que consiste em polissorbato 20, polissorbato 80, e polioxietileno( 160)polioxipropileno(3 0)glicol.
[0012] (6) A formulação liofilizada de acordo com qualquer um dos 1 a 5 acima, em que o tampão é um tampão fosfato.
[0013] (7) A formulação liofilizada de acordo com 1 ou 2 acima, em que o dissacarídeo é sacarose, o tensoativo não iônico é polioxietileno(160)polioxipropileno(30)glicol, e o tampão é um tampão fosfato.
[0014] (8) A formulação liofilizada de acordo com qualquer um de 1 a acima, em que as quantidades do sal neutro, do dissacarídeo, e do tensoativo iônico são 0,015-2,5 (p/p), 2,5 a 200 (p/p), e 0,005 a 6 (p/p), respectivamente, em relação à quantidade da proteína de fusão.
[0015] (9) A formulação liofilizada de acordo com qualquer um de 1 a acima, em que as quantidades do sal neutro, do dissacarídeo, e do tensoativo iônico são 0,05 a 0,5 (p/p), 5 a 50 (p/p), e 0,02 a 0,2 (p/p), respectivamente, em relação à quantidade da proteína de fusão.
[0016] (10) A formulação liofilizada de acordo com qualquer um de 1 a 7 acima, em que as quantidades do sal neutro, do dissacarídeo, e do tensoativo iônico são 0,1 a 0,25 (p/p), 10 a 25 (p/p), e 0,04 a 0,1 (p/p), respectivamente, em relação à quantidade da proteína de fusão.
[0017] (11) A formulação liofilizada de acordo com qualquer um dos a 10 acima, em que o pH é 5,5 a 7,5 quando dissolvida em água pura.
[0018] (12) A formulação liofilizada de acordo com qualquer um de 1
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 14/87 /68 all acima, em que a proteína de fusão é uma proteína de fusão em que a enzima lisossomal humana é unida à cadeia leve ou à cadeia pesada do anticorpo, no lado C-terminal ou no lado N-terminal da mesma por uma ligação peptídica.
[0019] (13) A formulação liofilizada de acordo com qualquer um de 1 all acima, em que a proteína de fusão é uma proteína de fusão em que a enzima lisossomal humana é unida à cadeia pesada do anticorpo no lado C-terminal da mesma por uma ligação peptídica.
[0020] (14) A formulação liofilizada de acordo com qualquer um de 1 all acima, em que a proteína de fusão é uma proteína de fusão em que a enzima lisossomal humana é unida à cadeia leve ou à cadeia pesada do anticorpo, no lado C-terminal ou no lado N-terminal da mesma através de um ligante incluindo um ou mais aminoácidos.
[0021] (15) A formulação liofilizada de acordo com qualquer um de 1 all acima, em que a proteína de fusão é uma proteína de fusão em que a enzima lisossomal humana é unida à cadeia pesada do anticorpo no lado C-terminal da mesma através de um ligante incluindo um ou mais aminoácidos.
[0022] (16) A formulação liofilizada de acordo com 14 ou 15 acima, em que o ligante inclui a sequência de aminoácidos de Gly-Ser.
[0023] (17) A formulação liofilizada de acordo com qualquer um dos a 16 acima, em que a enzima lisossomal é uma enzima lisossomal humana.
[0024] (18) A formulação liofilizada de acordo com qualquer um de 1 a 17 acima, em que a enzima lisossomal é selecionada a partir do grupo que consiste em a-L-iduronidase, iduronato-2-sulfatase, glucocerebrosidase, β-galactosidase, proteína ativadora de GM2, β-hexosaminidase A, β-hexosaminidase B, N-acetilglucosamina-1-fosfotransferase, a-manosidase, β-manosidase, galactosilceramidase, saposina C, arilsulfatase A, α-L-fucosidase, aspartilglicosaminidase, a-N-acetilgalactosaminidase,
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 15/87 /68 esfingomielinase ácida, α-galactosidase, β-glucuronidase, heparano N-sulfatase, α-Ν-acetilglucosaminidase, acetil-CoA:a-glucosaminida N-acetiltransferase, N-acetilglucosamina-6-sulfatase, ceramidase ácida, amilo-l,6-glucosidase, sialidase, aspartilglicosaminidase, palmitoil proteína tioesterase-1, tripeptidil-peptidase 1, hialuronidase 1, CLN1 e CLN2.
[0025] (19) A formulação liofilizada de acordo com 17 acima, em que a enzima lisossomal humana é a iduronato-2-sulfatase humana.
[0026] (20) A formulação liofilizada de acordo com qualquer um de 1 a 19 acima, em que o anticorpo é um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado.
[0027] (21) A formulação liofilizada de acordo com qualquer um de 1 a 20 acima, em que o anticorpo reconhece uma molécula presente na superfície de uma célula endotelial vascular como um antígeno.
[0028] (22) A formulação liofilizada de acordo com 21 acima, em que as células endoteliais vasculares são células endoteliais vasculares humanas.
[0029] (23) A formulação liofilizada de acordo com 21 ou 22 acima, em que as células endoteliais vasculares são células endoteliais vasculares cerebrais.
[0030] (24) A formulação liofilizada de acordo com 23 acima, em que a molécula presente na superfície da célula endotelial vascular cerebral é selecionada a partir do grupo que consiste em receptor de transferrina (TfR), receptor de insulina, receptor de leptina, receptor de lipoproteína, receptor de IGF, OATP-F, transportador de ânion orgânico, MCT-8 e transportador de monocarboxilato.
[0031] (25) A formulação liofilizada de acordo com 20 acima, em que o anticorpo é um anticorpo antirreceptor de transferrina humana (hTfR) humanizado.
[0032] (26) A formulação liofilizada de acordo com 20 acima, em que o anticorpo é um anticorpo anti-hTfR humanizado, em que a enzima
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 16/87 /68 lisossomal humana é iduronato-2-sulfatase humana, em que a proteína de fusão compreende o anticorpo anti-hTfR humanizado e a iduronato-2-sulfatase humana, e em que a proteína de fusão é selecionada a partir do grupo que consiste em (a) a (c) abaixo;
a proteína de fusão, em que a cadeia leve do anticorpo anti-hTfR humanizado tem a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:2, e em que a cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR humanizado tendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:8 é unida, no seu lado C-terminal, à iduronato-2-sulfatase humana através de uma sequência ligante, a proteína de fusão, em que a cadeia leve do anticorpo anti-hTfR humanizado tem a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:4, e em que a cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR humanizado tendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:9 é unida, no seu lado C-terminal, à iduronato-2-sulfatase humana através de uma sequência ligante, e a proteína de fusão, em que a cadeia leve do anticorpo anti-hTfR humanizado tem a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:6, e em que a cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR humanizado tendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 10 é unida, no seu lado C-terminal, à iduronato-2-sulfatase humana através de uma sequência ligante.
[0033] (27) A formulação liofilizada de acordo com 20 acima, em que o anticorpo é um anticorpo anti-hTfR humanizado, em que a enzima lisossomal humana é iduronato-2-sulfatase humana, em que a proteína de fusão compreende o anticorpo anti-HTFR humanizado e a iduronato-2-sulfatase humana, e em que a proteína de fusão é selecionada a partir do grupo que consiste em (a) a (c) abaixo;
a proteína de fusão, em que a cadeia leve do anticorpo
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 17/87 /68 anti-hTfR humanizado tem a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:2, e em que a cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR humanizado é unida, no lado C-terminal da mesma e através de uma sequência ligante de Gly-Ser, à iduronato-2-sulfatase humana, e a cadeia pesada unida inteira tem a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 13, a proteína de fusão, em que a cadeia leve do anticorpo anti-hTfR humanizado tem a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:4, e em que a cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR humanizado é unida, no lado C-terminal da mesma e através de uma sequência ligante de Gly-Ser, à iduronato-2-sulfatase humana, e a cadeia pesada unida inteira tem a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 15, e a proteína de fusão, em que a cadeia leve do anticorpo anti-hTfR humanizado tem a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:6, e em que a cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR humanizado é unida, no lado C-terminal da mesma e através de uma sequência ligante de Gly-Ser, à iduronato-2-sulfatase humana, e a cadeia pesada unida inteira tem a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 17.
[0034] (28) A formulação liofilizada de acordo com qualquer um de 1 a 27 acima, vedada em um recipiente formado de um vidro boros silicato ou uma resina hidrofóbica.
[0035] (29) A formulação liofilizada de acordo com 28 acima, em que o recipiente é formado por um copolímero de ciclo-olefina, um polímero de anel aberto de ciclo-olefina ou um polímero de anel aberto hidrogenado de ciclo-olefina.
Efeitos da invenção [0036] De acordo com a presente invenção, uma proteína de fusão, na qual um anticorpo e uma enzima lisossomal são combinados, pode ser estabilizada como uma formulação liofilizada de tal forma que possa ser distribuída no mercado.
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 18/87 /68
Modalidades para realizar a invenção [0037] A presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica que é estável no armazenamento em um estado liofilizado e contém, como ingrediente ativo, uma proteína na qual um anticorpo e uma enzima lisossomal são combinados. Aqui, o anticorpo a ser combinado com a enzima lisossomal é preferencialmente um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado, mas na medida em que o anticorpo tem a propriedade de se ligar especificamente ao antígeno, não existe nenhuma restrição em particular sobre as espécies de animais do anticorpo. Por exemplo, o anticorpo pode ser um anticorpo de mamífero não humano ou anticorpo quimérico entre um anticorpo humano e um anticorpo de mamífero não humano.
[0038] O termo “anticorpo humano” refere-se a um anticorpo cuja totalidade é codificada por um gene originário de humano. O termo “anticorpo humano”, no entanto, também inclui um anticorpo codificado por um gene obtido por introdução de uma mutação em um gene humano original com a finalidade de aumentar a eficiência de expressão do gene. O termo “anticorpo humano” também inclui um anticorpo que é produzido combinando dois ou mais genes que codificam anticorpos humanos e substituindo determinada parte de um anticorpo humano por uma parte de outro anticorpo humano. O mesmo pode ser aplicado aos anticorpos humanizados descritos abaixo.
[0039] Os anticorpos humanos, em princípio, têm três regiões determinantes de complementariedade (CDR) na região variável da cadeia leve da imunoglobulina e três regiões determinantes de complementariedade (CDR) na região variável da cadeia pesada da imunoglobulina. As três CDRs da cadeia leve da imunoglobulina são designadas CDR1, CDR2 e CDR3, em ordem a partir do lado N-terminal. As três CDRs da cadeia pesada da imunoglobulina são chamadas CDR1, CDR2 e CDR3, em ordem a partir do lado N-terminal. Um anticorpo é também um anticorpo humano em que uma
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 19/87 /68 das CDRs do anticorpo humano é substituída por uma CDR de outro anticorpo humano para alterar a sua especificidade de antígeno, afinidade e assim por diante. O mesmo se aplica aos anticorpos humanizados descritos abaixo.
[0040] Ambas as regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve de um anticorpo, em princípio, compreendem quatro regiões estruturais 1 a 4 (FR1 a FR4). FR1 é uma região adjacente à CDR1 no lado N-terminal da mesma, e consiste em uma sequência de aminoácidos a partir do N-terminal em cada peptídeo que constitui a cadeia pesada e a cadeia leve a um aminoácido adjacente ao N-terminal da CDR1 da mesma. FR2 consiste em uma sequência de aminoácidos entre CDR1 e CDR2 em cada peptídeo que constitui a cadeia pesada e a cadeia leve. FR3 consiste em uma sequência de aminoácidos entre CDR2 e CDR3 em cada peptídeo que constitui a cadeia pesada e a cadeia leve. FR4 consiste em uma sequência de aminoácidos de um aminoácido adjacente ao C-terminal de CDR3 ao C-terminal da região variável. No entanto, na presente invenção, que não é limitada por isso, uma região excluindo 1 a 5 aminoácidos do lado N-terminal e/ou 1 a 5 aminoácidos do lado C-terminal em cada região FR descrita acima pode ser definida como a região estrutural. O mesmo se aplica aos anticorpos humanizados descritos abaixo.
[0041] Na presente invenção, o termo “anticorpo humano” também inclui um anticorpo que é produzido através da modificação do gene do anticorpo humano original por introdução de uma mutação, tal como substituição, deleção, adição na sequência de aminoácidos do anticorpo original. Ao substituir um ou mais aminoácidos da sequência de aminoácidos do anticorpo original por outros aminoácidos, o número de aminoácidos substituídos podem ser preferencialmente 1 a 20, mais preferencialmente 1 a 5, e ainda mais preferencialmente 1 a 3. Ao deletar um ou mais aminoácidos da sequência de aminoácidos do anticorpo original, o número de aminoácidos
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 20/87 /68 deletados podem ser preferencialmente 1 a 20, mais preferencialmente 1 a 5, e ainda mais preferencialmente 1 a 3. Um anticorpo produzido por uma mutação combinada destas substituição e deleção de aminoácidos é também um “anticorpo humano”. Ao adicionar um ou mais aminoácidos, preferencialmente 1 a 20, mais preferencialmente 1 a 5, e ainda mais preferencialmente 1 a 3 aminoácidos podem ser adicionados dentro da sequência de aminoácidos do anticorpo original ou em seu N- ou C-terminal. Um anticorpo produzido por uma mutação combinada de adição, substituição e deleção de aminoácidos é também um “anticorpo humano”. A sequência de aminoácidos de tal anticorpo mutado tem uma homologia preferencialmente não inferior a 80%, mais preferencialmente não inferior a 90%, ainda mais preferencialmente não inferior a 95%, e ainda mais preferencialmente não inferior a 98%, à sequência de aminoácidos do anticorpo original. Assim, na presente invenção, o termo “gene proveniente de humano” inclui não apenas o gene não mutado proveniente de um ser humano, mas também um gene produzido pela modificação deste. O mesmo se aplica aos anticorpos humanizados descritos abaixo.
[0042] Por exemplo, quando uma mutação é adicionada à cadeia leve de anticorpo anti-hTfR N° 1 humanizado apresentada como SEQ ID NO:2, à cadeia leve de anticorpo anti-hTfR N° 2 humanizado apresentada como SEQ ID NO:4, e à cadeia leve do anticorpo anti-hTfR N° 3 humanizado apresentada como SEQ ID NO:6, são aplicadas as regras mostradas acima. As regras acima são aplicadas quando uma mutação é adicionada à cadeia pesada de anticorpo anti-hTfR N° 1 humanizado apresentada como SEQ ID NO:8, à cadeia pesada de anticorpo anti-hTfR N° 2 humanizado apresentada como SEQ ID NO:9, e à cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR N° 3 humanizado apresentada como SEQ ID NO: 10.
[0043] Ao introduzir uma mutação no gene que codifica a totalidade ou parte da região variável de cadeia leve do anticorpo humano original, o
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 21/87 /68 gene assim mutado tem uma homologia que é preferencialmente não inferior a 80%, mais preferencialmente não inferior a 90%, ao gene original, embora não haja limitação particular quanto ao nível de homologia. Ao substituir um ou mais aminoácidos da sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve por outros aminoácidos, o número de aminoácidos a ser substituído é preferencialmente 1 a 10, mais preferencialmente 1 a 5, ainda mais preferencialmente 1 a 3, e ainda mais preferencialmente 1 ou 2. Ao deletar um ou mais aminoácidos da sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve, o número de aminoácidos a serem deletados é preferencialmente 1 a 10, mais preferencialmente 1 a 5, ainda mais preferencialmente 1 a 3, ainda mais preferencialmente 1 ou 2. Uma mutação combinada destas substituição e deleção de aminoácidos também pode ser realizada. Ao adicionar um ou mais aminoácidos à região variável de cadeia leve, eles podem ser adicionados dentro, ou no lado N-terminal ou no lado C-terminal da sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve, e o número de aminoácidos adicionados é preferencialmente 1 a 10, mais preferencialmente 1 a 5, ainda mais preferencialmente 1 a 3, e ainda mais preferencialmente 1 ou 2. Uma mutação combinada destas adição, substituição e deleção de aminoácidos também pode ser realizada. A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve assim mutada tem uma homologia que é preferencialmente não inferior a 80%, mais preferencialmente não inferior a 90%, ainda mais preferencialmente não inferior a 95% à sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve original. Em particular, quando se substitui um ou mais aminoácidos da sequência de aminoácidos de CDR por outros aminoácidos, o número de aminoácido substituído é preferencialmente 1 a 5, mais preferencialmente 1 a 3, ainda mais preferencialmente 1 ou 2. Ao deletar um ou mais aminoácidos da sequência de aminoácidos de CDR, o número de aminoácidos a serem deletados é preferencialmente 1 a 5, mais preferencialmente 1 a 3, ainda mais
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 22/87 /68 preferencialmente 1 ou 2. Uma mutação combinada destas substituição e deleção do aminoácido também pode ser realizada. Ao adicionar um ou mais aminoácidos, eles podem ser adicionados dentro, ou no lado N-terminal ou no lado C-terminal da sequência de aminoácidos, e o número de aminoácidos adicionados é preferencialmente 1 a 5, mais preferencialmente 1 a 3, ainda mais preferencialmente 1 ou 2. Uma mutação combinada destas adição, substituição e deleção de aminoácidos também pode ser realizada. A sequência de aminoácidos da respectiva CDR mutada tem uma homologia que é preferencialmente não inferior a 80%, mais preferencialmente não inferior a 90%, e ainda mais preferencialmente não inferior a 95% à sequência de aminoácidos da CDR original. O mesmo se aplica aos anticorpos humanizados descritos abaixo.
[0044] Por exemplo, as regras acima são aplicadas quando uma mutação é adicionada à região variável da cadeia leve de anticorpo anti-hTfR N° 1 humanizado apresentada como SEQ ID NO :23, à região variável da cadeia leve de anticorpo anti-hTfR N° 2 humanizado apresentada como SEQ ID NO:25, ou à região variável da cadeia leve do anticorpo anti-hTfR N° 3 humanizado apresentada como SEQ ID NO:27 [0045] A região variável da cadeia leve apresentada como SEQ ID NO:23 contém a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:29 ou 30 na CDR1, contém a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:31 ou 32 na CDR2, e contém a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:33 na CDR3. A região variável da cadeia leve apresentada como SEQ ID NO:25 contém a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:40 ou 41 na CDR1, contém a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 ou 43 na CDR2, e contém a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:44 na CDR3. A região variável da cadeia leve apresentada como SEQ ID NO:27 contém a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:51 ou 52 na CDR1, contém a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53 ou 54 na CDR2, e contém a sequência de
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 23/87 /68 aminoácidos da SEQ ID NO: 55 na CDR3. Quando uma mutação é adicionada a essas CDRs, as regras acima se aplicam.
[0046] Ao introduzir uma mutação no gene que codifica a totalidade ou parte da região variável de cadeia pesada do anticorpo humano original, o gene assim mutado tem uma homologia que é preferencialmente não inferior a 80%, mais preferencialmente não inferior a 90%, ao gene original, embora não haja limitação particular quanto ao nível de homologia. Ao substituir um ou mais aminoácidos da sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada por outros aminoácidos, o número de aminoácidos a ser substituído é preferencialmente 1 a 10, mais preferencialmente 1 a 5, ainda mais preferencialmente 1 a 3, e ainda mais preferencialmente 1 ou 2. Ao deletar um ou mais aminoácidos da sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada, o número de aminoácidos a serem deletados é preferencialmente 1 a 10, mais preferencialmente 1 a 5, ainda mais preferencialmente 1 a 3, ainda mais preferencialmente 1 ou 2. Uma mutação combinada destas substituição e deleção de aminoácidos também pode ser realizada. Ao adicionar um ou mais aminoácidos à região variável de cadeia pesada, eles podem ser adicionados dentro, ou no lado N-terminal ou no lado C-terminal, da sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada, e o número de aminoácidos adicionados é preferencialmente 1 a 10, mais preferencialmente 1 a 5, ainda mais preferencialmente 1 a 3, e ainda mais preferencialmente 1 ou 2. Uma mutação combinada destas adição, substituição e deleção de aminoácidos também pode ser realizada. A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada assim mutada tem uma homologia que é preferencialmente não inferior a 80%, mais preferencialmente não inferior a 90%, ainda mais preferencialmente não inferior a 95% à sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada original. Em particular, quando se substitui um ou mais aminoácidos da sequência de aminoácidos de CDR por outros aminoácidos, o número de
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 24/87 /68 aminoácido substituído é preferencialmente 1 a 5, mais preferencialmente 1 a 3, ainda mais preferencialmente 1 ou 2. Ao deletar um ou mais aminoácidos da sequência de aminoácidos de CDR, o número de aminoácidos a serem deletados é preferencialmente 1 a 5, mais preferencialmente 1 a 3, ainda mais preferencialmente 1 ou 2. Uma mutação combinada destas substituição e deleção do aminoácido também pode ser realizada. Ao adicionar um ou mais aminoácidos, eles podem ser adicionados dentro, ou no lado N-terminal ou no lado C-terminal da sequência de aminoácidos, e o número de aminoácidos adicionados é preferencialmente 1 a 5, mais preferencialmente 1 a 3, ainda mais preferencialmente 1 ou 2. Uma mutação combinada destas adição, substituição e deleção de aminoácidos também pode ser realizada. A sequência de aminoácidos da respectiva CDR mutada tem uma homologia que é preferencialmente não inferior a 80%, mais preferencialmente não inferior a 90%, e ainda mais preferencialmente não inferior a 95% à sequência de aminoácidos da CDR original. O mesmo se aplica aos anticorpos humanizados descritos abaixo.
[0047] Por exemplo, as regras acima se aplicam quando uma mutação é adicionada à região variável da cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR N° 1 humanizado apresentada como SEQ ID NO:24, à região variável da cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR N° 2 humanizado apresentada como SEQ ID NO:26, ou à região variável da cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR N° 3 humanizado apresentada como SEQ ID NO:28.
[0048] A região variável da cadeia pesada representada pela SEQ ID NO:24 contém a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:34 ou 35 na CDR1, contém a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:36 ou 37 na CDR2, e contém a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:38 ou 39 na CDR3. A região variável da cadeia pesada representada pela SEQ ID NO:26 contém a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:45 ou 46 na CDR1, contém a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 ou 48 na CDR2, e
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 25/87 /68 contém a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:49 ou 50 na CDR3. A região variável da cadeia pesada representada pela SEQ ID NO:28 contém a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:56 ou 57 na CDR1, contém a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:58 ou 59 na CDR2, e contém a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:60 ou 61 na CDR3. Quando uma mutação é adicionada a essas CDRs, as regras acima se aplicam.
[0049] Na presente invenção, “homologia” significa a razão (%) de resíduos de aminoácidos homólogos para resíduos de aminoácidos totais no alinhamento ideal quando duas sequências de aminoácidos são comparadas usando um algoritmo de cálculo da homologia. Foi bem conhecido na técnica da invenção comparar as duas sequências de aminoácidos por uma homologia mostrada por tal razão e pode ser facilmente compreendida pelos especialistas na técnica.
[0050] A substituição de um aminoácido na sequência de aminoácidos da cadeia leve e da cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR por outro aminoácido, por exemplo, inclui a substituição por um aminoácido classificado no mesmo grupo, tal como aminoácidos aromáticos (Phe, Trp, Tyr), aminoácidos alifáticos (Ala, Leu, Ile, Vai), aminoácidos polares (Gin, Asn), aminoácidos básicos (Lys, Arg, His), aminoácidos ácidos (Glu, Asp), aminoácido com grupos hidroxil (Ser, Thr) e aminoácidos com pequenas cadeias laterais (Gly, Ala, Ser, Thr, Met). E previsto que a substituição por tais aminoácidos similares não causa alteração no fenótipo da proteína (ou seja, substituições de aminoácidos conservativas). Exemplos de tais substituições de aminoácidos conservativas são bem conhecidos na técnica e são descritos em várias literaturas (por exemplo, Bowie et al, Science, 247: 1306-1310 (1990)).
[0051] Na presente invenção, como um algoritmo de cálculo de homologia para o cálculo de homologia entre a sequência de aminoácidos da proteína original (incluindo um anticorpo) e a sequência de aminoácidos da
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 26/87 /68 proteína mutada, BLAST (Altschul SE J Mol. Biol. 215. 403-10 (1990)), método de pesquisa similar de Pearson e Lipman (Pearson and Lipman' s similar searching method) (Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 85. 2444 (1988)), algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (Smith and Waterman's local homology algorithm) (Adv. Appl. Math. 2. 482-9 (1981)) e assim por diante são bem conhecidos. Além disso, o blastp, um dos programas BLAST fornecidos na Internet pelo National Institutes of Health, tem sido bem conhecido como um meio de calcular a homologia de duas sequências de aminoácidos.
[0052] Na presente invenção, o termo “anticorpo humanizado” refere-se a um anticorpo em que parte da sequência de aminoácidos da sua região variável (por exemplo, especialmente toda ou parte das suas CDRs) é proveniente de um mamífero não humano, enquanto o restante é proveniente de humano. Um exemplo de anticorpo humanizado é um anticorpo produzido substituindo as três regiões determinantes de complementariedade (CDRs) da cadeia leve da imunoglobulina e as três regiões determinantes de complementariedade (CDRs) da cadeia pesada da imunoglobulina constituindo um anticorpo humano, com CDRs de um mamífero não humano. Não há limitação particular quanto às espécies biológicas das quais as CDRs enxertadas em uma posição apropriada do anticorpo humano se originam, na medida em que se originam de um mamífero não humano. Embora as espécies sejam preferencialmente camundongo, rato, coelho, cavalo ou primata não humano, e mais preferencialmente camundongo ou rato, por exemplo camundongo.
[0053] Na presente invenção, o termo “anticorpo quimérico” refere-se a um anticorpo produzido por fragmentos de conexão de dois ou mais anticorpos diferentes provenientes de duas ou mais diferentes espécies.
[0054] Um anticorpo quimérico compreendendo um anticorpo humano e um anticorpo de mamífero não humano é um anticorpo provido por
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 27/87 /68 substituição de parte de um anticorpo humano por uma parte de um anticorpo de mamífero não humano. Como explicado abaixo, um anticorpo é feito de uma região Fc, uma região Fab e uma região de dobradiça. Um exemplo específico de tais anticorpos quiméricos é um anticorpo quimérico cuja região Fc é proveniente de um anticorpo humano, enquanto a sua região Fab é proveniente de um anticorpo de mamífero não humano. A região de dobradiça é proveniente de um anticorpo humano ou de um anticorpo de mamífero não humano. Pelo contrário, o termo anticorpo quimérico também inclui um cuja região Fc é proveniente de um anticorpo de mamífero não humano, enquanto a sua região Fab é proveniente de um anticorpo humano. Em um caso assim, a região de dobradiça é proveniente de um anticorpo humano ou de um anticorpo de mamífero não humano.
[0055] Um anticorpo pode ser visto como composto por uma região variável e uma região constante. Exemplos adicionais de anticorpos quiméricos incluem um anticorpo em que a região constante de cadeia pesada (Ch) e região constante de cadeia leve (Ci) são provenientes de um anticorpo humano, enquanto a região variável de cadeia pesada (Vh) e a região variável da cadeia leve (VL) são provenientes de um anticorpo de um mamífero não humano, e, inversamente, um anticorpo em que a região constante de cadeia pesada (Ch) e região constante de cadeia leve (Ci) são provenientes de um anticorpo de um mamífero não humano, enquanto a região variável de cadeia pesada (Vh) e a região variável de cadeia leve (Vl) são provenientes de um anticorpo humano. Nestes, não há limitação particular quanto às espécies biológicas do mamífero não humano, na medida em que é um mamífero não humano, embora as espécies sejam preferencialmente camundongo, rato, coelho, cavalo ou primata não humano, mais preferencialmente camundongo.
[0056] Um anticorpo quimérico compreendendo um anticorpo humano e um anticorpo de camundongo é designado em particular “anticorpo quimérico humano/de camundongos”. Exemplos de tais anticorpos
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 28/87 /68 quiméricos humanos/de camundongos incluem um anticorpo quimérico no qual a região Fc é proveniente de um anticorpo humano enquanto a região Fab é proveniente de um anticorpo de camundongo, e, inversamente, um anticorpo quimérico cuja região Fc é proveniente de um anticorpo de camundongo enquanto a sua região Fab é proveniente de um anticorpo humano. Uma região de dobradiça é proveniente de um anticorpo humano ou de um anticorpo de camundongo. Exemplos adicionais de anticorpos quiméricos humanos/de camundongos incluem aqueles cuja região constante de cadeia pesada (Ch) e região constante de cadeia leve (Cl) são provenientes de um anticorpo humano, enquanto a sua região variável de cadeia pesada (Vh) e a região variável da cadeia leve (Vl) são provenientes de um anticorpo de camundongo, e, inversamente, aqueles cuja região constante de cadeia pesada (Ch) e região constante de cadeia leve (Cl) são provenientes de um anticorpo de camundongo, enquanto a sua região variável de cadeia pesada (Vh) e a região variável de cadeia leve (Vl) são provenientes de um anticorpo humano.
[0057] Originalmente, um anticorpo é da estrutura básica tendo quatro cadeias polipeptídicas no total, consistindo em duas cadeias leves de imunoglobulina e duas cadeias pesadas de imunoglobulina. No entanto, na presente invenção, o termo “anticorpo” refere-se, além de um anticorpo com essa estrutura básica, também a;
um consistindo em duas cadeias polipeptídicas compreendendo uma única cadeia leve de imunoglobulina e uma única cadeia pesada de imunoglobulina, e, como explicado posteriormente, um anticorpo de cadeia única consistindo em uma cadeia leve de imunoglobulina que é unida, no lado C-terminal da mesma, a uma sequência ligante que por sua vez está unida, no lado C-terminal da mesma, a uma cadeia pesada de imunoglobulina, anticorpos de cadeia única consistindo em uma cadeia pesada
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 29/87 /68 de imunoglobulina que é unida, no lado C-terminal da mesma, a uma sequência ligante que por sua vez está unida, no lado C-terminal da mesma, a uma cadeia levada de imunoglobulina, e um consistindo em uma região Fab, isto é, uma estrutura deixada para trás pela remoção da região Fc de um anticorpo tendo a estrutura básica, como o significado original, e um consistindo na região Fab e na totalidade ou parte da região de dobradiça (incluindo Fab, F(ab') e F(ab')2). Além disso, o scFv em que a região variável da cadeia leve e a região variável da cadeia pesada estão unidas através de uma sequência ligante para formar um anticorpo de cadeia única, também está incluído no anticorpo da presente invenção.
[0058] Aqui, o termo “Fab” refere-se a uma molécula que consiste em uma única cadeia leve compreendendo a região variável e a região Cl (região constante de cadeia leve) e uma única cadeia pesada que compreende a região variável e a região ChI (porção 1 da região constante de cadeia pesada) que são combinadas por uma ligação dissulfeto entre os seus respectivos resíduos de cisteína. Enquanto que a cadeia pesada em um Fab pode incluir parte da região de dobradiça além da região variável e a região ChI (porção 1 da região constante da cadeia pesada), a região de dobradiça em tal caso não tem o resíduo de cisteína que, de outro modo, está presente na região de dobradiça e que serviría para unir duas cadeias pesadas de um anticorpo em conjunto. Em Fab, a cadeia leve e a cadeia pesada estão conectadas por uma ligação dissulfeto formada entre o resíduo de cisteína presente na região constante de cadeia leve (região Cl) e o resíduo de cisteína localizado na região constante de cadeia pesada (região ChI) ou na região de dobradiça. A cadeia pesada que compõe Fab é referida como “cadeia pesada de Fab”. Como não possui o resíduo de cisteína na região de dobradiça que serve para ligar duas cadeias pesadas de um anticorpo, o Fab consiste em uma única cadeia leve e em uma única cadeia pesada. A cadeia leve constituindo Fab inclui uma região
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 30/87 /68 variável e uma região Cl. A cadeia pesada como um componente de Fab pode consistir em uma região variável e uma região ChI ou também de parte da região de dobradiça além da região variável e a região ChI. No entanto, nesse caso, a região de dobradiça é escolhida de modo a não incluir o resíduo de cisteína que podería ligar duas cadeias pesadas, de modo a evitar a formação de uma ligação dissulfeto entre duas cadeias pesadas nas suas regiões de dobradiça. Em F(ab'), a cadeia pesada inclui, além de uma região variável e uma região ChI, a totalidade ou parte de uma região de dobradiça contendo um resíduo de cisteína que podería ligar duas cadeias pesadas. F (ab')2 é uma molécula que consiste em dois F(ab')s ligados entre si através de uma ligação dissulfeto formada entre os resíduos de cisteína presentes nas suas respectivas regiões de dobradiça. A cadeia pesada que compõe F(ab') ou F(ab')2 é referida como cadeia pesada de Fab'. Além disso, um polímero tal como um dímero e um trímero, que consiste em dois ou mais anticorpos conectados uns aos outros, diretamente ou através de um ligante, está também incluído no termo “anticorpo”. Além disso, além do acima mencionado, qualquer molécula que inclui parte de uma molécula de imunoglobulina e tem uma propriedade de se ligar especificamente ao antígeno é também incluída no termo “anticorpo” na presente invenção. Assim, na presente invenção, o termo “cadeia leve de imunoglobulina” inclui uma molécula que é derivada de uma cadeia leve de imunoglobulina original e tendo a sequência de aminoácidos da totalidade ou parte da sua região variável. Da mesma maneira, o termo “cadeia pesada de imunoglobulina” inclui uma molécula que é derivada de uma cadeia pesada de imunoglobulina original e tendo a sequência de aminoácidos da totalidade ou parte da sua região variável. Portanto, na medida em que se tem a totalidade ou parte da sequência de aminoácidos da região variável, uma molécula é incluída no termo “cadeia pesada de imunoglobulina”, mesmo que não possua a sua região Fc, por exemplo.
[0059] Também, no dito acima, o termo “Fc” ou “região Fc” refere-se
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 31/87 /68 a uma região compreendendo um fragmento consistindo na região Ch2 (porção 2 da região constante da cadeia pesada) e na região Ch3 (porção 3 da região constante da cadeia pesada) na molécula de anticorpo.
[0060] Além disso, na presente invenção, o termo “anticorpo” também inclui:
(5) scFab, scF(ab') e scF(ab')2, que são anticorpos de cadeia única produzidos por ligação da cadeia leve à cadeia pesada que formam, respectivamente, o Fab, F(ab') e F (ab')2 mencionado em (4) acima, através de uma sequência ligante. Tal scFab, scFv (ab') e scF(ab')2 pode ser uma molécula na qual, quer a cadeia leve está unida, no lado do C-terminal da mesma, a uma sequência ligante, que por sua vez está unida, no lado do C-terminal da mesma, à cadeia pesada, ou a cadeia pesada está unida, no lado do C-terminal da mesma, a uma sequência ligante, que por sua vez está unida, no lado do C-terminal da mesma, à cadeia leve. Além disso, um scFv, que é um anticorpo de cadeia única provido pela ligação da região variável de cadeia leve à região variável de cadeia pesada, através de uma sequência ligante entre elas, está também incluído no termo “anticorpo” na presente invenção. Tal scFv pode ser uma molécula na qual, quer a região variável de cadeia leve está unida, no lado do C-terminal da mesma, a uma sequência ligante, que por sua vez está unida, no lado do C-terminal da mesma, à região variável de cadeia pesada, ou a região variável de cadeia pesada está unida, no lado do C-terminal da mesma, a uma sequência ligante, que por sua vez está unida, no lado do C-terminal da mesma, à região variável de cadeia leve.
[0061] Na presente invenção, o termo “anticorpo de cadeia única” refere-se a uma proteína em que uma sequência de aminoácidos que compreende a totalidade ou parte de uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina unida, no lado do C-terminal da mesma, a uma sequência ligante, que por sua vez está unida, no lado C-terminal da mesma, à sequência de aminoácidos da totalidade ou parte de uma região variável de cadeia
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 32/87 /68 pesada de imunoglobulina e tendo uma capacidade de se ligar especificamente a um determinado antígeno. Por exemplo, os mostrados em (2), (3) e (5) acima estão incluídos no anticorpo de cadeia única. Além disso, uma proteína em que uma sequência de aminoácidos que compreende a totalidade ou parte de uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina está unida, no lado do C-terminal da mesma, a uma sequência de ligação, que por sua vez está adicionalmente unida, no lado C-terminal da mesma, à sequência de aminoácidos da totalidade ou parte de uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina e que tem uma capacidade de se ligar especificamente a um determinado antígeno, também está incluída no termo “anticorpo de cadeia única” na presente invenção. Em um anticorpo de cadeia única no qual uma cadeia pesada de imunoglobulina está unida, no lado C-terminal da mesma e através de uma sequência ligante, a uma cadeia leve de imunoglobulina, a cadeia pesada de imunoglobulina geralmente não possui a região Fc. Uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina possui três regiões determinantes de complementariedade (CDRs) que participam na determinação da especificidade de antígenos de um anticorpo. Do mesmo modo, uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina também tem três CDRs. Essas CDRs são as regiões primárias que determinam a especificidade do antígeno de um anticorpo. Por conseguinte, um anticorpo de cadeia única contém preferencialmente todas as três CDRs da cadeia pesada de imunoglobulina e todas as três CDRs da cadeia leve de imunoglobulina. No entanto, é também possível prover um anticorpo de cadeia única em que uma ou mais das ditas CDRs são deletadas, na medida em que a afinidade específica de antígeno do anticorpo é mantida.
[0062] Em um anticorpo de cadeia única, a sequência ligante colocada entre a cadeia leve e a cadeia pesada da imunoglobulina é uma cadeia peptídica que consiste preferencialmente em 2 a 50, mais preferencialmente 8 a 50, ainda mais preferencialmente 10 a 30, ainda mais preferencialmente 12 a
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 33/87 /68 ou 15 a 25, por exemplo 15 ou 25 resíduos de aminoácidos. Embora não exista limitação particular quanto à sequência específica de aminoácidos de tal sequência ligante na medida em que o anticorpo anti-hTfR compreendendo as duas cadeias unidas retém assim a afinidade ao hTfR, ela é preferencialmente constituída apenas por glicina, ou por glicina e serina. Por exemplo, existem a sequência de aminoácidos Gly-Ser, a sequência de aminoácidos Gly-Gly-Ser, a sequência de aminoácidos Gly-Gly-Gly, a sequência de aminoácidos Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 19), a sequência de aminoácidos Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO:20), a sequência de aminoácidos Ser-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO:21), ou uma sequência que inclui uma sequência correspondendo a 2 a 10 ou 2 a 5 de qualquer uma daquelas sequências de aminoácidos unidas consecutivamente. Por exemplo, na união da sequência de aminoácidos da inteira região variável de cadeia pesada de imunoglobulina, no lado do C-terminal da mesma e através de uma sequência ligante, à região variável da cadeia leve de imunoglobulina, uma sequência ligante preferível compreende uma sequência ligante que consiste em um total de 15 aminoácidos que corresponde a três da sequência de aminoácidos Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 19) unida consecutivamente.
[0063] Na presente invenção, o antígeno especificamente reconhecido pelo anticorpo é, por exemplo, uma molécula presente na superfície das células endoteliais vasculares (antígeno de superfície). Exemplos de tais antígenos de superfície incluem o receptor de transferrina (TfR), receptor de insulina, receptor de leptina, receptor de lipoproteína, receptor de IGF, transportadores de ânion orgânico, tais como OATP-F, os transportadores de ácidos monocarboxílicos tais como MCT-8, receptores de Fc, e assim por diante, mas não estão limitados a estes. Os antígenos são preferencialmente essas moléculas (antígenos de superfície) presentes na superfície das células endoteliais vasculares humanas.
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 34/87 /68 [0064] Entre os antígenos de superfície descritos acima, o receptor de transferrina (TfR), receptor de insulina, receptor de leptina, receptor de lipoproteína, receptor de IGF, transportadores de ânion orgânico como OATP-F e transportador de ácido monocarboxílico como MCT-8 estão presentes na superfície das células endoteliais capilares de cérebro que formam a barreira hematoencefálica (Barreira Hematoencefálica). Os anticorpos capazes de reconhecer estes antígenos podem se ligar a células endoteliais capilares do cérebro (células endoteliais vasculares cerebrais) através de antígenos. E os anticorpos ligados às células endoteliais capilares do cérebro podem atravessar a barreira hematoencefálica e alcançar o sistema nervoso central. Portanto, ligando a proteína de interesse a tal anticorpo, é possível atingir o sistema nervoso central. A proteína de interesse pode ser uma proteína com uma função para exercer o efeito de um fármaco no sistema nervoso central. Por exemplo, enzimas lisossomais que são deficientes ou disfuncionais em pacientes com doença lisossomal com distúrbios do sistema nervoso central estão incluídas nas proteínas de interesse. Tal enzima lisossomal não pode atingir o sistema nervoso central sem alteração e não mostra o efeito de um fármaco contra um distúrbio do sistema nervoso central de um paciente, mas ao permitir que ela se ligue a esses anticorpos, ela pode passar pela barreira hematoencefálica, e como resultado, o distúrbio do sistema nervoso central encontrado em pacientes com doença lisossomal pode ser melhorado.
[0065] Na presente invenção, o termo “receptor de transferrina humana” ou “hTfR” refere-se a uma proteína de membrana possuindo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:22. O anticorpo anti-hTfR da presente invenção é, em uma das suas modalidades, o que se liga à região do resíduo de cisteína na posição 89 do N-terminal à fenilalanina no C-terminal na sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:22 (a região extracelular de hTfR), embora não esteja limitado a esta modalidade.
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 35/87 /68 [0066] Um método para preparar um anticorpo é descrito abaixo, um anticorpo contra hTfR tomado como um exemplo. Para a preparação de um anticorpo ao hTfR, é conhecido um método geral segundo o qual um receptor de transferrina humana recombinante (rhTfR) é produzido usando células que têm um vetor de expressão introduzido tendo um gene de hTfR incorporado, e então animais como camundongos são imunizados com este rhTfR. Coletando as células que produzem anticorpos para hTfR a partir dos animais imunizados e fundindo-os com células de mieloma, podem ser obtidas células de hibridoma com capacidade para produzir o anticorpo anti-hTfR.
[0067] Além disso, as células produtoras de um anticorpo ao hTfR também podem ser obtidas coletando células imunocompetentes de um animal, tal como camundongo, e imunizando-as com rhTfR por imunização in vitro. Na realização de imunização por imunização in vitro, não há limitação particular quanto às espécies de animais das quais as células imunocompetentes são derivadas, embora sejam preferidos camundongo, rato, coelho, porquinho-da-índia, cão, gato, cavalo e primatas incluindo humanos, e os mais preferidos são camundongo, rato e humano, e ainda mais preferencialmente camundongo e humano. Como células imunocompetentes de camundongos, as células do baço preparadas a partir de baço de camundongo podem ser utilizadas, por exemplo. Como células imunocompetentes humanas, essas células podem ser utilizadas como preparadas a partir de sangue periférico humano, medula óssea, baço e semelhantes. Ao imunizar células imunocompetentes humanas de acordo com a imunização in vitro, pode ser obtido um anticorpo humano para hTfR.
[0068] Na presente invenção, embora não haja nenhuma limitação em particular quanto à enzima lisossomal humana a ser ligada ao anticorpo, tais enzimas lisossomais incluem α-L-iduronidase (IDUA), iduronato-2-sulfatase (IDS), glucocerebrosidase (GBA), β-galactosidase, proteína ativadora de GM2, β-hexosaminidase A, β-hexosaminidase B,
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N-acetilglucosamina-l-fosfotransferase, α-manosidase (LAMAN), β-manosidase, galactosilceramidase (GALC), saposina C, arilsulfatase A (ARSA), α-L-fucosidase (FUCA1), aspartilglucosaminidase, α-Ν-acetilgalactosaminidase, esfingomielinase ácida (ASM), a-galactosidase, β-glucuronidase (GUSB), heparano-N-sulfatase (SGSH), a-N-acetilglucosaminidase (NAGLU), acetil-CoA:a-glucosaminide N-acetiltransferase, N-acetilglucosamina-6-sulfatase, ceramidase ácida (AC), amilo-l,6-glicosidase, sialidase, aspartilglicosaminidase, palmitoil proteína tioesterase-1 (PPT-1), tripeptidil-peptidase 1 (TPP-1), hialuronidase 1, a-glucosidase ácida (GAA), CLN1, CLN2 e semelhantes.
[0069] Quando o anticorpo reconhece especificamente uma molécula presente na superfície da célula endotelial vascular (antígeno de superfície), a enzima lisossomal humana unida ao anticorpo pode ser usada como agente terapêutico para distúrbios do sistema nervoso, ou seja, oc-L-iduronidase (IDUA) como um agente terapêutico para distúrbios do sistema nervoso central na síndrome de Hurler ou síndrome de Hurler-Scheie; iduronato-2-sulfatase (IDS) como um agente terapêutico para distúrbios do sistema nervoso central na síndrome de Hunter; glucocerebrosidase (GBA) como um agente terapêutico para distúrbios do sistema nervoso central na doença de Gaucher; β-galactosidase como um agente terapêutico para distúrbios do sistema nervoso central em gangliosidose GM1 Tipos 1 a 3; proteína ativadora de GM2 como um agente terapêutico para distúrbios do sistema nervoso central em gangliosidose GM2, variante AB; β-hexosaminidase A como um agente terapêutico para distúrbios do sistema nervoso central na doença de Sandhoff e doença de Tay-Sachs; β-hexosaminidase B como um agente terapêutico para distúrbios do sistema nervoso central na doença de Sandhoff; N-acetilglucosamina-1-fosfotransferase como um agente terapêutico para distúrbios do sistema nervoso central na doença de célula I; oc-manosidase
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 37/87 /68 (LAMAN) como um agente terapêutico para distúrbios do sistema nervoso central em oc-manosidose; β-manosidase como um agente terapêutico para distúrbios do sistema nervoso central em β-manosidose; galactosilceramidase (GALC) como um agente terapêutico para distúrbios do sistema nervoso central na doença de Krabbe; saposina C como um agente terapêutico para distúrbios do sistema nervoso central na doença de depósito do tipo doença de Gaucher; arilsulfatase A (ARSA) como um agente terapêutico para distúrbios do sistema nervoso central na degeneração metacromática de substância branca (leucodistrofia metacromática); oc-L-fucosidase (FUCA1) como um agente terapêutico para distúrbios do sistema nervoso central na fucosidose; aspartilglucosaminidase como um agente terapêutico para distúrbios do sistema nervoso central em aspartilglucosaminúria; oc-N-acetilgalactosaminidase como um agente terapêutico para distúrbios do sistema nervoso central, na doença Schindler e doença de Kawasaki; esfingomielinase ácida (ASM) como um agente terapêutico para distúrbios do sistema nervoso central na doença de Niemann-Pick; oc-galactosidase A como um agente terapêutico para distúrbios do sistema nervoso central na doença de Fabry; β-glucuronidase (GUSB) como um agente terapêutico para distúrbios do sistema nervoso na síndrome de Sly; heparano-N-sulfatase (SGSH), oc-N-acetilglucosaminidase (NAGLU), acetil-CoA:-glucosaminide N-acetiltransferase e N-acetilglucosamina-6-sulfatase como agentes terapêuticos para distúrbios do sistema nervoso na síndrome de Sanfilippo; ceramidase ácida (AC) como um agente terapêutico para distúrbios do sistema nervoso central na doença de Farber; amilo-l,6-glicosidase como um agente terapêutico para distúrbios do sistema nervoso central na doença de Cori (doença de Forbes-Cori); sialidase como um agente terapêutico para distúrbios do sistema nervoso central na deficiência de sialidase; palmitoil proteína tioesterase-1 (PPT-1) como um agente terapêutico para distúrbios do sistema nervoso central em lipofuscinose ceroide neuronal ou doença de
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Santavuori-Haltia; tripeptidil-peptidase 1 (TPP-1) como um agente terapêutico para distúrbios do sistema nervoso central em lipofuscinose ceroide neuronal ou doença de Jansky-Bielschowsky; hialuronidase 1 como um agente terapêutico para distúrbios do sistema nervoso central na deficiência de hialuronidase; α-glucosidase ácida (GAA) como um agente terapêutico para distúrbios do sistema nervoso central, na doença de Pompe; CLN1 e CLN2 como agentes terapêuticos para distúrbios do sistema nervoso central na doença de Batten.
[0070] No caso em que o anticorpo reconhece especificamente uma molécula presente na superfície das células endoteliais vasculares (antígeno de superfície), as enzimas lisossomais a serem preferencialmente unidas ao anticorpo incluem iduronato-2-sulfatase (hI2S) humana. A I2S é uma das enzimas lisossomais com atividade para a hidrólise das ligações sulfato presentes nas moléculas de glicosaminoglicanos (GAG), como sulfato de heparano e sulfato de dermatano. A síndrome de Hunter é um distúrbio genético no qual essa enzima é deletada congenitamente. Nos pacientes da síndrome de Hunter, o sulfato de heparano e o sulfato de dermatano se acumulam nos tecidos, resultando em vários sintomas, como opacidade da córnea, atraso no desenvolvimento mental e assim por diante. No entanto, nos casos leves, o atraso no desenvolvimento mental pode não ser observado. Portanto, uma vez que a proteína de fusão compreendendo o anticorpo e hI2So pode degradar o GAG acumulado nos tecidos cerebrais passando através da BBB, ela pode ser utilizada como um agente terapêutico para distúrbios do sistema nervoso central pela administração a um paciente com síndrome de Hunter apresentando atraso no desenvolvimento mental. Além disso, ela pode ser profilaticamente administrada aos pacientes da síndrome de Hunter que não apresentam atraso no desenvolvimento mental.
[0071] Na presente invenção, o termo “I2S humana” ou “hI2S” refere-se à hI2S tendo particularmente a mesma sequência de aminoácidos
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 39/87 /68 que a hI2S de tipo selvagem. A hI2S do tipo selvagem possui uma sequência de aminoácidos consistindo em 525 aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 1. No entanto, não se limitando a isto, uma hI2S contendo uma mutação, tal como substituição, deleção, adição e assim por diante, adicionada à sequência de aminoácidos do hI2S do tipo selvagem também está incluída na hI2S, na medida em que tem atividade de I2S. Quando um ou mais aminoácidos da sequência de aminoácidos de hI2S são substituídos por outros aminoácidos, o número de aminoácidos a serem substituídos é, preferencialmente 1 a 10, mais preferencialmente 1 a 5, ainda mais preferencialmente 1 a 3, e mesmo ainda mais preferencialmente 1 a 2. Quando um ou mais aminoácidos na sequência de aminoácidos de hI2S são deletados, o número de aminoácidos a serem deletados é preferencialmente 1 a 10, mais preferencialmente 1 a 5, ainda mais preferencialmente 1 a 3, e ainda mais preferencialmente 1 ou 2. Uma mutação combinada destas substituição e deleção de aminoácidos também pode ser realizada. Ao adicionar um ou mais aminoácidos à hI2S, eles podem ser adicionados dentro, ou no lado C-terminal ou N-terminal da mesma, e o número de aminoácidos adicionados é preferencialmente 1 a 10, mais preferencialmente 1 a 5, ainda mais preferencialmente 1 a 3, e ainda mais preferencialmente 1 ou 2. Uma mutação combinada destas adição, substituição e deleção de aminoácidos também pode ser realizada. A sequência de aminoácidos de tal hI2S mutada tem uma homologia preferencialmente não inferior a 80%, mais preferencialmente não inferior a 90%, ainda mais preferencialmente não inferior a 95%, e ainda mais preferencialmente não inferior a 98% à sequência de aminoácidos da hI2S original.
[0072] Na presente invenção, a afirmação de que a hI2S tem a atividade de I2S significa que a hI2S fundida a um anticorpo para formar uma proteína de fusão tem uma atividade não inferior a 3% da atividade que a hI2S do tipo natural possui intrinsecamente. Contudo, a atividade é
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 40/87 /68 preferencialmente não inferior a 10%, mais preferencialmente não inferior a 20%, ainda mais preferencialmente não inferior a 50%, ainda mais preferencialmente não inferior a 80% da atividade que a hI2S de tipo natural possui intrinsecamente. O mesmo também se aplica quando a I2S tem uma ou mais mutações. O anticorpo é, por exemplo, um anticorpo anti-hTfR.
[0073] Na presente invenção, o termo “proteína de fusão” refere-se a uma substância obtida por ligação de um anticorpo e de uma enzima lisossomal humana diretamente, ou através de um ligante não peptídico ou um ligante peptídico. Os métodos para conjugar anticorpos e enzimas lisossomais humanas são descritos em detalhe abaixo.
[0074] Para ligar um anticorpo a uma enzima lisossomal, está disponível um método para os ligar através de um ligante não peptídico ou um ligante peptídico. Como ligantes não peptídicos, podem ser utilizados biotina-estreptavidina, polietilenoglicol, polipropilenoglicol, copolímero de etilenoglicol e propilenoglicol, poliol polioxietilado, álcool polivinílico, polissacarídeos, dextrano, éter polivinílico, polímero biodegradável, lipídio polimerizado, quitinas e ácido hialurônico, ou seus derivados, ou suas combinações. Um ligante peptídico é uma cadeia peptídica que consiste em 1 a 50 aminoácidos unidos por ligações peptídicas ou um derivado do mesmo, cujo N-terminal e N-terminal estão unidos co valentemente ao anticorpo ou à enzima lisossomal, respectivamente, para ligar o anticorpo à enzima lisossomal humana.
[0075] Quando a biotina-estreptavidina é utilizada como ligante não peptídico, o anticorpo e a enzima lisossomal humana podem ser unidos entre si através da ligação entre biotina e estreptavidina, onde o anticorpo é ligado à biotina, e a enzima lisossomal humana é ligada à estreptavidina. Por outro lado, o anticorpo e a enzima lisossomal humana podem ser ligados entre si através da ligação entre biotina e estreptavidina, onde o anticorpo é ligado à estreptavidina, e a enzima lisossomal humana é ligada à biotina. Biotina e
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 41/87 /68 estreptavidina podem ser ligadas a proteínas por métodos bem conhecidos. [0076] Em particular, um conjugado que é formado pela ligação do anticorpo da presente invenção à enzima lisossomal humana através de PEG como um ligante não peptídico, é designado “anticorpo-PEG-enzima lisossomal humana”. O anticorpo-PEG-enzima lisossomal humana pode ser preparado por primeiro ligar o anticorpo ao PEG para formar anticorpo-PEG, e, em seguida, ligar o anticorpo-PEG à enzima lisossomal humana. Altemativamente, um anticorpo-PEG-enzima lisossomal humana pode ser preparado por primeiro ligar a enzima lisossomal humana ao PEG para formar “enzima lisossomal humana-PEG”, e, em seguida, ligar a “enzima lisossomal humana-PEG” ao anticorpo. Para ligar PEG ao anticorpo e à enzima lisossomal humana, emprega-se um PEG que é modificado com grupos funcionais tais como carbonato, carbonilimidazol, éster ativo de ácido carboxílico, azlactona, imida tiona cíclica, isocianato, isotiocianato, imidato, aldeído ou semelhante. Tais grupos funcionais introduzidos no PEG reagem principalmente com grupos amino no anticorpo e na enzima lisossomal humana para ligar covalentemente o PEG ao anticorpo e à enzima lisossomal humana. Embora não exista limitação particular quanto ao peso molecular e à configuração do PEG aqui usado, o seu peso molecular médio (MW) é o seguinte: preferencialmente MW = 300 a 60000, mais preferencialmente MW = 500 a 20000. Por exemplo, tal PEG cujo peso molecular médio é de cerca de 300, cerca de 500, cerca de 1000, cerca de 2000, cerca de 4000, cerca de 10000, cerca de 20000 e semelhantes, é preferencialmente usado como um ligante não peptídico.
[0077] Por exemplo, “anticorpo-PEG” pode ser preparado misturando o anticorpo com um polietilenoglicol tendo grupos aldeído como grupos funcionais (ALD-PEG-ALD) de modo que a razão molar de ALD-PEG-ALD para o anticorpo é 11, 12,5, 15, 110, 120 e semelhantes e depois adiciona-se à mistura um agente redutor tal como NaCNBH3 para deixar ocorrer uma
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 42/87 /68 reação. Depois, reagindo “anticorpo-PEG” com uma enzima lisossomal humana na presença de um agente redutor tal como NaCNBHs, é obtido o “anticorpo-PEG-enzima lisossomal humana”. Ao contrário, é também possível obter “anticorpo-PEG-enzima lisossomal humana” por primeiro ligar uma enzima lisossomal humana ao ALD-PEG-ALD para preparar o “enzima lisossomal humana-PEG”, e, em seguida, ligar o “enzima lisossomal humana-PEG” ao anticorpo.
[0078] O anticorpo e uma enzima lisossomal humana também podem ser ligados através de ligações peptídicas através da união da cadeia pesada ou da cadeia leve do anticorpo, no lado C-terminal ou no lado N-terminal da mesma, quer através de sequência ligante ou diretamente, ao N-terminal ou ao C-terminal da enzima lisossomal humana, respectivamente. Assim, a proteína de fusão compreendendo o anticorpo anti-hTfR e uma enzima lisossomal humana pode ser obtida através da incorporação em um vetor de expressão para eucariotas tais como células de mamíferos e leveduras de um fragmento de DNA em que um cDNA que codifica a enzima lisossomal humana é colocado na estrutura diretamente, ou através de um fragmento de DNA que codifica uma sequência ligante, no lado da extremidade 3’ ou da extremidade 5’ de um cDNA que codifica a cadeia pesada ou a cadeia leve do anticorpo, e da cultura de células de mamífero nas quais foi introduzido o vetor de expressão acima. Quando o fragmento de DNA que codifica uma enzima lisossomal humana está unido à cadeia pesada, um vetor de expressão de mamífero em que um fragmento de cDNA que codifica a cadeia leve do anticorpo é também introduzido nas mesmas células hospedeiras, enquanto que se o fragmento de DNA que codifica uma enzima lisossomal humana estiver ligado à cadeia leve, um vetor de expressão de mamífero em que um fragmento de cDNA que codifica a cadeia pesada do anticorpo é também incorporado nas mesmas células hospedeiras. No caso em que o anticorpo é um anticorpo de cadeia única, a proteína de fusão compreendendo o anticorpo
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 43/87 /68 e uma enzima lisossomal humana combinados podem ser obtidos por incorporação em um vetor de expressão para células eucarióticas tais como células de mamíferos e levedura, de um fragmento de DNA que é formado por união do cDNA que codifica uma enzima lisossomal humana, no lado da extremidade 5’ ou no lado da extremidade 3’ do mesmo, diretamente ou através de um fragmento de DNA que codifica uma sequência ligante, ao cDNA que codifica o anticorpo de cadeia única, e permitindo que a proteína de fusão seja expressa naquelas células em que foi introduzido o vetor de expressão.
[0079] Em uma proteína de fusão do tipo em que uma enzima lisossomal humana está unida à cadeia leve de anticorpo no lado C-terminal da mesma, o anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos incluindo a totalidade ou parte da região variável de cadeia leve e uma sequência de aminoácidos incluindo a totalidade ou parte da região variável da cadeia pesada, e a enzima lisossomal humana está unida à cadeia leve deste anticorpo no lado C-terminal da mesma. Aqui, a cadeia leve do anticorpo e uma enzima lisossomal humana podem ser unidas juntas, diretamente ou através de um ligante.
[0080] Em uma proteína de fusão do tipo em que uma enzima lisossomal humana está unida à cadeia pesada de anticorpo no lado C-terminal da mesma, o anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos incluindo a totalidade ou parte da região variável de cadeia leve e uma sequência de aminoácidos incluindo a totalidade ou parte da região variável da cadeia pesada, e a enzima lisossomal humana está unida à cadeia pesada deste anticorpo no lado C-terminal da mesma. Aqui, a cadeia pesada do anticorpo e uma enzima lisossomal humana podem ser unidas juntas, diretamente ou através de um ligante.
[0081] Em uma proteína de fusão do tipo em que uma enzima lisossomal humana está unida à cadeia leve de anticorpo no lado N-terminal
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 44/87 /68 da mesma, o anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos incluindo a totalidade ou parte da região variável de cadeia leve e uma sequência de aminoácidos incluindo a totalidade ou parte da região variável da cadeia pesada, e a enzima lisossomal humana está unida à cadeia leve deste anticorpo no lado N-terminal da mesma. Aqui, a cadeia leve do anticorpo e uma enzima lisossomal humana podem ser unidas juntas, diretamente ou através de um ligante.
[0082] Em uma proteína de fusão do tipo em que uma enzima lisossomal humana está unida à cadeia pesada de anticorpo no lado N-terminal da mesma, o anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos incluindo a totalidade ou parte da região variável de cadeia leve e uma sequência de aminoácidos incluindo a totalidade ou parte da região variável da cadeia pesada, e a enzima lisossomal humana está unida à cadeia pesada deste anticorpo no lado N-terminal da mesma. Aqui, a cadeia pesada do anticorpo e uma enzima lisossomal humana podem ser unidas juntas, diretamente ou através de um ligante.
[0083] No dito acima, quando a sequência ligante é colocada entre o anticorpo e uma enzima lisossomal humana, a sequência ligante pode consistir preferencialmente em 1 a 50, mais preferencialmente em 1 a 17, ainda mais preferencialmente em 1 a 10, ainda mais preferencialmente em 1 a 5 aminoácidos e, de acordo com a enzima lisossomal humana a ser unida ao anticorpo, o número de aminoácidos da sequência ligante pode ser ajustado para 1, 2, 3, 1 a 17, 1 a 10, 10 a 40, 20 a 34, 23 a 31, 25 a 29, etc., conforme desejado. Embora não exista limitação particular quanto à sequência de aminoácidos da sequência ligante na medida em que o anticorpo ligado por ela retém a afinidade ao hTfR e uma enzima lisossomal humana unida pela sequência ligante também exiba a atividade fisiológica da própria proteína sob uma condição fisiológica, o ligante pode preferencialmente ser composto por glicina e serina. Exemplos de tais ligantes incluem um consistindo em um
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 45/87 /68 único aminoácido seja glicina ou senna, a sequência de aminoácidos Gly-Ser, a sequência de aminoácidos Gly-Gly-Ser, a sequência de aminoácidos Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 19), a sequência de aminoácidos Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO:20), a sequência de aminoácidos Ser-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO:21), ou uma sequência que inclui 1 a 10 ou 2 a 5 de qualquer uma dessas sequências de aminoácidos unidas consecutivamente consistindo em 1 a 50, 2 a 17, 2 a 10, 10 a 40, 20 a 34, 23 a 31 ou 25 a 29 aminoácidos. Por exemplo, aqueles compreendendo a sequência de aminoácidos Gly-Ser podem preferencialmente ser utilizados como sequências ligantes. O mesmo pode ser aplicado quando o anticorpo é um anticorpo de cadeia única.
[0084] Além disso, na presente invenção, quando uma cadeia peptídica inclui uma pluralidade de sequências ligantes, cada uma dessas sequências ligantes é designada, a partir do lado N-terminal, a primeira sequência ligante, a segunda sequência ligante, e assim por diante, por conveniência.
[0085] As modalidades preferidas do anticorpo, anticorpo esse que é um anticorpo humanizado e um anticorpo antirreceptor da transferrina humana, incluem os seguintes (x) a (z) abaixo, (X) a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 2, e a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 8;
(Y) a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 4, e a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 9;
(Z) a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 6, e a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 10.
[0086] Aqui, (x), (y) e (z) correspondem a um anticorpo anti-hTfR N°
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 46/87 /68 humanizado, um anticorpo anti-hTfR N° 2 humanizado, e um anticorpo anti-hTfR N° 3 humanizado, respectivamente, tais anticorpos são descritos nos exemplos.
[0087] No entanto, as modalidades preferidas do anticorpo não estão limitadas aos (x) a (z) acima, quando o anticorpo é um anticorpo humanizado e um anticorpo antirreceptor de transferrina humana. Por exemplo, o anticorpo pode ser utilizado na presente invenção, cuja sequência de aminoácidos da cadeia leve tem uma homologia não inferior a 80% à sequência de aminoácidos de cada uma das cadeias leves nos (x) a (z) acima e cuja sequência de aminoácidos da cadeia pesada tem uma homologia não inferior a 80% à sequência de aminoácidos de cada uma das cadeias pesadas nos (x) a (z) acima na medida em que o anticorpo tem afinidade por hTfR. Além disso, o anticorpo pode ser utilizado na presente invenção, cuja sequência de aminoácidos da cadeia leve tem uma homologia não inferior a 90% à sequência de aminoácidos de cada uma das cadeias leves nos (x) a (z) acima e cuja sequência de aminoácidos da cadeia pesada tem uma homologia não inferior a 90% à sequência de aminoácidos de cada uma das cadeias pesadas nos (x) a (z) acima na medida em que o anticorpo tem afinidade por hTfR. Além disso, o anticorpo pode ser utilizado na presente invenção, cuja sequência de aminoácidos da cadeia leve tem uma homologia não inferior a 95% à sequência de aminoácidos de cada uma das cadeias leves nos (x) a (z) acima e cuja sequência de aminoácidos da cadeia pesada tem uma homologia não inferior a 95% à sequência de aminoácidos de cada uma das cadeias pesadas nos (x) a (z) acima na medida em que esse anticorpo tem afinidade por hTfR.
[0088] Além disso, o anticorpo pode ser utilizado na presente invenção, o qual tem na cadeia leve a sequência de aminoácidos que corresponde à substituição, deleção ou adição de 1 a 10 aminoácidos introduzida na sequência de aminoácidos em cada uma da sequência de
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 47/87 /68 aminoácidos da cadeia leve apresentada em (x) a (z) acima, e/ou tem na cadeia pesada a sequência de aminoácidos que corresponde à substituição, deleção ou adição de 1 a 10 aminoácidos introduzida na sequência de aminoácidos em cada uma da sequência de aminoácidos da cadeia pesada apresentada em (x) a (z) acima na medida em que tem uma afinidade ao hTfR. Além disso, o anticorpo pode ser utilizado na presente invenção, o qual tem na cadeia leve a sequência de aminoácidos que corresponde à substituição, deleção ou adição de 1 a 5 aminoácidos introduzida na sequência aminoácidos em cada uma da sequência de aminoácidos da cadeia leve apresentada em (x) a (z) acima, e tem na cadeia pesada a sequência de aminoácidos que corresponde à substituição, deleção ou adição de 1 a 5 aminoácidos introduzida na sequência de aminoácidos em cada uma da sequência de aminoácidos da cadeia pesada apresentada em (x) a (z) acima, na medida em que tem uma afinidade por hTfR. Além disso, o anticorpo pode ser utilizado na presente invenção, o qual tem na cadeia leve a sequência de aminoácidos que corresponde à substituição, deleção ou adição de 1 a 3 aminoácidos introduzida na sequência de aminoácidos em cada uma da sequência de aminoácidos da cadeia leve apresentada em (x) a (z) acima, e tem na cadeia pesada a sequência de aminoácidos que corresponde à substituição, deleção ou adição de 1 a 3 aminoácidos introduzida na sequência de aminoácidos em cada uma da sequência de aminoácidos da cadeia pesada apresentada em (x) a (z) acima na medida em que tem uma afinidade por hTfR.
[0089] Na modalidade preferida acima (x) do anticorpo, a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 23 corresponde a uma região variável na sequência de aminoácidos da cadeia leve apresentada como SEQ ID NO: 2, e a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 24 corresponde a uma região variável na sequência de aminoácidos da cadeia pesada apresentada como SEQ ID NO: 8. Na modalidade preferida acima (y) do anticorpo, a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 25
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 48/87 /68 corresponde a uma região variável na sequência de aminoácidos da cadeia leve apresentada como SEQ ID NO: 4, e a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 26 corresponde a uma região variável na sequência de aminoácidos da cadeia pesada apresentada como SEQ ID NO: 9. Na modalidade preferida acima (z) do anticorpo, a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 27 corresponde a uma região variável na sequência de aminoácidos da cadeia leve apresentada como SEQ ID NO: 6, e a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 28 corresponde a uma região variável na sequência de aminoácidos da cadeia pesada apresentada como SEQ ID NO: 10. Nas modalidades preferidas (x) a (z) destes anticorpos, a substituição, deleção ou adição dentro da sequência de aminoácidos que constitui a sequência de aminoácidos da cadeia pesada e/ou da cadeia leve é particularmente introduzida nestas regiões variáveis.
[0090] As modalidades preferidas das proteínas de fusão compreendendo o anticorpo e um enzima lisossomal humana na presente invenção incluem uma proteína de fusão compreendendo um anticorpo antirreceptor de transferrina humana humanizado (anticorpo anti-hTfR humanizado) e iduronato-2-sulfatase humana (hI2S). Nesta proteína de fusão, a hI2S pode ser fundida à cadeia pesada ou leve, que constitui o anticorpo anti-hTfR humanizado na medida em que ele pode reter a sua afinidade ao receptor de transferrina humana e a atividade enzimática da enzima lisossomal humana. Quando a hI2S é fixada a uma cadeia pesada, a hI2S pode ser fundida ao lado C-terminal ou ao lado N-terminal da cadeia pesada, e quando a hI2S está ligada a uma cadeia leve, a hI2S pode ser fundida ao lado C-terminal ou ao lado N-terminal da cadeia leve.
[0091] Como modalidades preferidas das proteínas de fusão compreendendo o anticorpo anti-hTfR humanizado e hI2S incluem uma proteína de fusão na qual o anticorpo anti-hTfR humanizado está unido ao lado C-terminal da cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR humanizado.
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Exemplos de proteínas de fusão preferíveis incluem as mostradas em (1) a (3) abaixo;
uma proteína de fusão compreendendo uma cadeia leve do anticorpo anti-hHfR humanizado tendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 2, e uma cadeia pesada de anticorpo anti-hTfR humanizado tendo a sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO: 8 e unida, no C-terminal da mesma através de uma sequência ligante, à iduronato-2-sulfatase humana, uma proteína de fusão compreendendo uma cadeia leve do anticorpo anti-hTfR humanizado tendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:4, e uma cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR humanizado tendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 9 e unida, no C-terminal da mesma através de uma sequência ligante, à iduronato-2-sulfatase humana, uma proteína de fusão compreendendo uma cadeia leve do anticorpo anti-hHfR humanizado tendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 6, e uma cadeia pesada de anticorpo anti-hTfR humanizado tendo a sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO: 10 e unida, no C-terminal da mesma através de uma sequência ligante, à iduronato-2-sulfatase humana.
[0092] Nestas proteínas de fusão (1) a (3) acima, a iduronato-2-sulfatase humana tem, preferencialmente, o aminoácido representado pela SEQ ID NO: 1, e a sequência ligante tem preferencialmente a sequência de aminoácidos Gly-Ser. Estas proteínas de fusão compreendem normalmente duas cadeias leves e duas cadeias pesadas ligadas à iduronato-2-sulfatase humana.
[0093] Adicionalmente, como modalidades preferidas das proteínas de fusão compreendendo o anticorpo anti-hTfR humanizado e hI2S incluem;
uma proteína de fusão compreendendo uma cadeia leve do
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 50/87 /68 anticorpo anti-hHfR humanizado tendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 2, e uma cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR humanizado unida, no lado C-terminal da mesma e através de uma sequência ligante Gly-Ser, à iduronato-2-sulfatase humana, e tendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 13 como o todo, (2) uma proteína de fusão compreendendo uma cadeia leve do anticorpo anti-hHfR humanizado tendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 4, e uma cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR humanizado unida, no lado C-terminal da mesma e através de uma sequência ligante Gly-Ser, à iduronato-2-sulfatase humana, e tendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 15 como o todo, (3) uma proteína de fusão compreendendo uma cadeia leve do anticorpo anti-hHfR humanizado tendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 6, e uma cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR humanizado unida, lado C-terminal da mesma e através de uma sequência ligante Gly-Ser, à iduronato-2-sulfatase humana, e tendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 17 como o todo.
[0094] Estas proteínas de fusão compreendem normalmente duas cadeias leves e duas cadeias pesadas unidas à iduronato-2-sulfatase humana.
[0095] A formulação liofilizada da presente invenção contém, como um ingrediente ativo, uma proteína de fusão compreendendo um anticorpo e uma enzima lisossomal humana, e contém adicionalmente um sal neutro, um dissacarídeo, um tensoativo não iônico e um tampão.
[0096] Quanto ao sal neutro a ser contido na formulação liofilizada, não há nenhuma limitação particular na medida em que são farmaceuticamente aceitáveis, mas o cloreto de sódio e cloreto de magnésio
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 51/87 /68 são preferíveis como tais sais neutros, e cloreto de sódio é particularmente preferível.
[0097] A quantidade do sal neutro na formulação liofilizada é preferencialmente 0,015 a 2,5 (p/p), mais preferencialmente 0,05 a 0,5 (p/p), ainda mais preferencialmente 0,1 a 0,25 (p / p), em relação à quantidade da proteína de fusão, por exemplo 0,16 (p/p).
[0098] O dissacarídeo contido na formulação liofilizada não é particularmente limitado na medida em que é farmaceuticamente aceitável, mas trealose, sacarose, maltose, lactose e uma combinação das mesmas são preferíveis, e a sacarose é particularmente preferida.
[0099] A quantidade de dissacarídeo na formulação liofilizada é preferencialmente 2,5 a 200 (p/p), mais preferencialmente 5 a 50 (p/p), ainda mais preferencialmente 10 a 25 (p/p), em relação à quantidade de proteína de fusão, por exemplo 15 (p/p).
[00100] O tensoativo não iônico contido na formulação liofilizada não está particularmente limitado na medida em que é farmaceuticamente aceitável, mas o polissorbato e o poloxâmero são preferíveis como tal surfactante não iônico. Por exemplo, polissorbato 20, polissorbato 80 e polioxietileno(160)polioxipropileno(30)glicol são preferíveis como agentes tensoativos não iônicos. Em particular, o polioxietileno(160)polioxipropileno(30)glicol é preferido.
Polioxietileno(160)polioxipropileno(30)glicol é sinonimo de poloxâmero 188. [00101] A quantidade de tensoativo não iônico na formulação liofilizada é preferencialmente 0,05 a 6 (p/p), mais preferencialmente 0,02 a 0,2 (p/p), ainda mais preferencialmente 0,04 a 0,1 (p/p), em relação à quantidade de proteína de fusão, por exemplo 0,065 (p/p).
[00102] O tampão na formulação liofilizada não é particularmente limitado na medida em que podem ser utilizados como um excipiente para um produto farmacêutico, mas é preferencialmente um tampão fosfato. O tampão
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 52/87 /68 fosfato é adicionado à formulação liofilizada de tal modo que quando a formulação liofilizada é dissolvida em água pura, o pH é preferencialmente
5,5 a 7,5 e mais preferencialmente o pH é 6,0 a 7,0, por exemplo pH 6,5. [00103] Exemplos de composições preferíveis das formulações liofilizadas da presente invenção incluem:
A quantidade da proteína de fusão compreendendo um anticorpo e uma enzima lisossomal humana é 0,5 a 20 mg, e as quantidades de um sal neutro, um dissacarídeo, e um tensoativo não iônico em relação à quantidade da proteína de fusão são 0,015 a 2,5 (p/p), 2,5 a 200 (p/p) e 0,005 a 6 (p/p), respectivamente.
[00104] A quantidade da proteína de fusão compreendendo um anticorpo e uma enzima lisossomal humana é 0,5 a 20 mg, e as quantidades de um sal neutro, um dissacarídeo, e um tensoativo não iônico em relação à quantidade da proteína de fusão são 0,05 a 0,5 (p/p), 5 a 50 (p/p) e 0,02 a 0,2 (p/p), respectivamente.
[00105] A quantidade da proteína de fusão compreendendo um anticorpo e uma enzima lisossomal humana é 0,5 a 20 mg, e as quantidades de um sal neutro, um dissacarídeo, e um tensoativo não iônico para a quantidade da proteína de fusão são 0,1 a 0,25 (p/p), 10 a 25 (p/p) e 0,04 a 0,1 (p/p), respectivamente.
[00106] Em (A) ao (C) acima, um tampão fosfato é adicionado à formulação liofilizada de tal modo que quando a formulação liofilizada é dissolvida em água pura, o pH é 5,5 a 7,5 ou 6,0 a 7,0, por exemplo, a 6,5.
[00107] Exemplos de composições mais preferíveis das formulações liofilizadas da presente invenção incluem;
(D) A quantidade da proteína de fusão compreendendo um anticorpo e uma enzima lisossomal humana é 0,5 a 20 mg, e as quantidades de cloreto de sódio, sacarose e polioxietileno(160)polioxipropileno(30)glicol em relação à quantidade da proteína de fusão são 0,015 a 2,5 (p/p), 2,5 a 200
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 53/87 /68 (p/p) e 0,005 a 6 (p/p), respectivamente.
[00108] (E) A quantidade da proteína de fusão compreendendo um anticorpo e uma enzima lisossomal humana é 0,5 a 20 mg, e as quantidades de cloreto de sódio, sacarose e polioxietileno(160)polioxipropileno(30)glicol em relação à quantidade da proteína de fusão são 0,05 a 0,5 (p/p), 5 a 50 (p/p) e 0,02 a 0,2 (p/p), respectivamente.
[00109] (F) A quantidade da proteína de fusão compreendendo um anticorpo e uma enzima lisossomal humana é 0,5 a 20 mg, e as quantidades de cloreto de sódio, sacarose e polioxietileno(160)polioxipropileno(30)glicol em relação à quantidade da proteína de fusão são 0,1 a 0,25 (p/p), 10 a 25 (p/p) e 0,04 a 0,1 (p/p), respectivamente.
[00110] Em (D) ao (F) acima, um tampão fosfato é adicionado de tal modo que quando a formulação liofilizada é dissolvida em água pura, o pH é
5,5 a 7,5 ou 6,0 a 7,0, especialmente, 6,5.
[00111] Como exemplo de uma composição mais específica da formulação liofilizada da presente invenção, [00112] (G) A quantidade da proteína de fusão compreendendo um anticorpo e uma enzima lisossomal humana é 10 mg, e as quantidades de cloreto de sódio, sacarose e polioxietileno(160)polioxipropileno(30)glicol em relação à quantidade da proteína de fusão são 0,16 (p/p), 15 (p/p) e 0,65 (p/p), respectivamente, com um tampão fosfato adicionado de modo que o pH se tome 6,0 a 7,0 quando dissolvido com água pura.
[00113] Na formulação liofilizada indicada por (A) a (G) acima, a proteína de fusão de um anticorpo e uma enzima lisossomal humana é, por exemplo, uma proteína de fusão compreendendo o anticorpo anti-hTfR humanizado e hI2S. Como modalidades preferidas da proteína de fusão compreendendo um anticorpo anti-hTfR humanizado e hI2S incluem;
uma proteína de fusão, em que a cadeia leve do anticorpo anti-hTfR humanizado tem uma sequência de aminoácidos apresentada como
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SEQ ID N0:2, a cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR humanizado tem uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:8, e o lado C-terminal da cadeia pesada está unido à iduronato-2-sulfatase humana através de uma sequência ligante, uma proteína de fusão, em que a cadeia leve do anticorpo anti-hTfR humanizado tem uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:4, a cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR humanizado tem uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:9, e o lado C-terminal da cadeia pesada está unido à iduronato-2-sulfatase humana através de uma sequência ligante, uma proteína de fusão, em que a cadeia leve do anticorpo anti-hTfR humanizado tem uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:6, a cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR humanizado tem uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 10, e o lado C-terminal da cadeia pesada está unido à iduronato-2-sulfatase humana através de uma sequência ligante.
[00114] Nas proteínas de fusão de (1) a (3) acima, a iduronato-2-sulfatase humana tem, preferencialmente, o aminoácido apresentado como SEQ ID NO:1, e a sequência ligante tem a sequência de aminoácidos apresentada como (Gly-Ser). E estas proteínas de fusão são geralmente compostas por duas cadeias pesadas ligadas à iduronato-2-sulfatase humana e duas cadeias leves.
[00115] Como modalidades adicionais preferidas das proteínas de fusão compreendendo um anticorpo anti-hTfR humanizado e hI2S na formulação liofilizada mostrada em (A) a (G) acima incluem;
(4) uma proteína de fusão em que, a cadeia leve do anticorpo anti-hHfR humanizado tem uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:2, e a cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR humanizado está unida
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 55/87 /68 à iduronato-2-sulfatase humana no seu lado C-terminal através de um ligante tendo a sequência de aminoácidos apresentada como (Gly-Ser) e tem a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 13, (5) uma proteína de fusão em que, a cadeia leve do anticorpo anti-hHfR humanizado tem uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:4, e a cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR humanizado está unida à iduronato-2-sulfatase humana no seu lado C-terminal através de um ligante tendo a sequência de aminoácidos apresentada como (Gly-Ser) e tem a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 15, (6) uma proteína de fusão em que, a cadeia leve do anticorpo anti-hHfR humanizado tem uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:6, e a cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR humanizado está unida à iduronato-2-sulfatase humana no seu lado C-terminal através de um ligante tendo a sequência de aminoácidos apresentada como (Gly-Ser) e tem a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 17.
[00116] Na formulação liofilizada mostrada em (A) ou (F) acima, quando as proteínas de fusão de um anticorpo e uma enzima lisossomal humana são mostradas em (1) a (6) acima, a quantidade da proteína de fusão é preferencialmente 0,5 a 20 mg, por exemplo, 2,0 a 10 mg, 2,0 a 6,0 mg e assim por diante. A quantidade é ajustada para 2,5 mg, 5,0 mg e similares, conforme necessário. Exemplos das composições de formulações liofilizadas preferíveis das proteínas de fusão incluem;
(H) uma formulação liofilizada, em que a quantidade de proteína de fusão é 0,5 a 20 mg, e as quantidades de cloreto de sódio, sacarose e polioxietileno(160)polioxipropileno(30)glicol em relação à quantidade de proteína de fusão são 0,015 a 2,5 (p/p), 2,5 a 200 (p/p) e 0,005 a 6 (p/p), respectivamente,
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 56/87 /68 (I) uma formulação liofilizada, em que a quantidade de proteína de fusão é 0,5 a 20 mg, e as quantidades de cloreto de sódio, sacarose e polioxietileno(160)polioxipropileno(30)glicol em relação à quantidade de proteína de fusão são 0,05 a 0,5 (p/p), 5 a 50 (p/p) e 0,02 a 0,2 (p/p), respectivamente, (J) uma formulação liofilizada, em que a quantidade de proteína de fusão é 0,5 a 20 mg, e as quantidades de cloreto de sódio, sacarose e polioxietileno(160)polioxipropileno(30)glicol em relação à quantidade de proteína de fusão são 0,1 a 0,25 (p/p), 10 a 25 (p/p) e 0,04 a 0,1 (p/p), respectivamente.
[00117] Um exemplo mais específico é (K) uma formulação liofilizada, em que a quantidade de proteína de fusão é 10 mg, e as quantidades de cloreto de sódio, sacarose e polioxietileno(160)polioxipropileno(30)glicol em relação à quantidade de proteína de fusão são 0,16 (p/p), 15 (p/p) e 0,65 (p/p), respectivamente, com um tampão fosfato adicionado de modo que o pH se tome 6,0 a 7,0 quando dissolvido com água pura.
[00118] A formulação liofilizada da presente invenção contendo, como ingrediente ativo, a proteína de fusão compreendendo um anticorpo e uma enzima lisossomal humana, pode ser fornecida, por exemplo, em uma forma vedada ou cheia em um recipiente tal como uma seringa de câmara dupla ou frasco. A formulação liofilizada da presente invenção também pode ser fornecida como um kit com uma solução dedicada a dissolver a formulação liofilizada. As formulações liofilizadas, por exemplo, são dissolvidas em uma solução dedicada, água pura, solução de Ringer, e assim por diante, antes do uso, e então diluídas com solução salina fisiológica para fazer uma infusão. Esta infusão é infundida por via intravenosa. Alternativamente, as formulações liofilizadas podem ser administradas intramuscularmente, intraperitonealmente, subcutaneamente e assim por diante, aos pacientes. O
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 57/87 /68 material do recipiente tal como uma seringa e um frasco para vedar ou encher a formulação liofilizada não é particularmente limitado, mas o vidro borossilicato é preferível, e também a resina hidrofóbica tal como um copolímero de ciclo-olefinas que é um copolímero de uma olefina cíclica e uma olefina, um polímero de anel aberto de ciclo-olefinas ou um polímero de anel aberto hidrogenado de ciclo-olefinas é preferível.
Exemplos [00119] Embora a presente invenção seja descrita com mais detalhe abaixo com referência a exemplos, não se pretende que a presente invenção seja limitada aos exemplos.
[Exemplo 1] Construção de vetor de expressão para a proteína de fusão hI2S-anticorpo anti-hTfR humanizado [00120] Um vetor de expressão para a proteína de fusão hI2S-anticorpo anti-hTfR humanizado foi construído utilizando genes que codificam três tipos de anticorpos anti-hTfR humanizados (N°s 1 a 3). O anticorpo N° 1 compreende uma cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:2 e uma cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:8, o anticorpo N° 2 compreende uma cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:4 e uma cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:9, o anticorpo N° 3 compreende uma cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:6 e uma cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 10, respectivamente.
[00121] Um vetor pEF/myc/nuc (Invitrogen Inc.) foi digerido com Kpnl e Ncol para remover a região contendo o promotor EF-Ια e o seu primeiro íntron, e a região formou extremidades cegas com T4 DNA polimerase. Um pCI-neo (Invitrogen Inc.) foi digerido com BglII e EcoRI para remover a região contendo o potenciador/promotor e o íntron de CMV, e,
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 58/87 /68 em seguida, a região formou extremidades cegas com T4 DNA polimerase. A região acima contendo o promotor EF-Ια e o seu primeiro íntron foi inserido neste para construir um vetor pE-neo. O vetor pE-neo foi digerido com Sfil e BstXI e uma região de aproximadamente 1 kpb contendo o gene de resistência à neomicina foi removida. A amplificação do gene de higromicina foi realizada por reação de PCR utilizando os iniciadores Hyg-Sfi5' (SEQ ID NO: 11) e Hyg-BstX3’ (SEQ ID NO: 12) e usando pcDNA 3.1/Hygro (+) (Invitrogen Inc.) como um molde. O gene de higromicina amplificado foi digerido com Sfil e BstXI e inserido no vetor pE-neo a partir do qual o gene de resistência à neomicina acima foi removido para construir um vetor pE-hygr.
[00122] Um fragmento de DNA (SEQ ID NO:3) contendo o gene que codifica o comprimento total da cadeia leve do anticorpo humanizado anti-hTfR N° 1 tendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 2 foi sintetizado. Uma sequência MluI foi introduzida no lado 5’ deste fragmento de DNA e uma sequência Notl no seu lado 3’. Este fragmento de DNA foi digerido com MluI e Notl e incorporado entre MluI e Notl do vetor pE-neo. O vetor obtido foi designado pE-hygr(LCl) que é um vetor para expressar a cadeia leve do anticorpo anti-hTfR N° 1 humanizado.
[00123] Um fragmento de DNA (SEQ ID NO:5) contendo um gene que codifica o comprimento total da cadeia leve de anticorpo anti-hTfR N° 2 humanizado tendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 4 foi sintetizado. A sequência MluI foi introduzida no lado 5’ deste fragmento de DNA e a sequência Notl no seu lado 3’. Este fragmento de DNA foi digerido com MluI e Notl e incorporado entre MluI e Notl do vetor pE-neo. O vetor resultante foi designado pE-hygr(LC2) que é um vetor para expressar a cadeia leve do anticorpo anti-hTfR N° 2 humanizado.
[00124] Um fragmento de DNA (SEQ ID NO:7) contendo um gene que codifica o comprimento total da cadeia leve de anticorpo anti-hTfR N° 3
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 59/87 /68 humanizado tendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 6 foi sintetizado. A sequência MluI foi introduzida no lado 5’ deste fragmento de DNA e a sequência Notl no seu lado 3’. Este fragmento de DNA foi digerido com MluI e Notl e incorporado entre MluI e Notl do vetor pE-neo. O vetor obtido foi definido como pE-hygr(LC3) que é um vetor para expressar a cadeia leve do anticorpo anti-hTfR N° 3 humanizado.
[00125] Um fragmento de DNA foi sintetizado artificialmente, tendo uma sequência nucleotídica apresentada como SEQ ID NO: 14 contendo um gene que codifica uma proteína na qual a hI2S tendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:1 está unida ao lado C-terminal da cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR N° 1 humanizado tendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 8 através de um ligante tendo uma sequência de aminoácidos apresentada como (Gly-Ser). Este fragmento de DNA codifica uma proteína tendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 13, em que uma cadeia pesada de anticorpo anti-hTfR N° 1 humanizado se liga à hI2S. Este fragmento de DNA foi digerido com MluI e Notl e inserido entre MluI e Notl do vetor pE-neo para construir pE-neo (HC-I2S-1).
[00126] Um fragmento de DNA foi sintetizado artificialmente, tendo uma sequência nucleotídica apresentada como SEQ ID NO: 16 contendo um gene que codifica uma proteína na qual a hI2S tendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:1 está unida ao lado do C-terminal da cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR N° 2 humanizado tendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 9 através de um ligante tendo uma sequência de aminoácidos apresentada como (Gly-Ser). Este fragmento de DNA codifica uma proteína tendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 15, em que uma cadeia pesada de anticorpo anti-hTfR N° 2 humanizado se liga à hI2S. Este fragmento de DNA foi digerido com MluI e Notl e inserido entre MluI e Notl do vetor
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 60/87 /68 pE-neo para construir pE-neo (HC-I2S-2).
[00127] Um fragmento de DNA foi sintetizado artificialmente, tendo uma sequência nucleotídica apresentada como SEQ ID NO: 18 contendo um gene que codifica uma proteína na qual a hI2S tendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:1 está unida ao lado do C-terminal da cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR N° 3 humanizado tendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 10 através de um ligante tendo uma sequência de aminoácidos apresentada como (Gly-Ser). Este fragmento de DNA codifica uma proteína tendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 17, em que uma cadeia pesada de anticorpo anti-hTfR N° 3 humanizado se liga à hI2S. Este fragmento de DNA foi digerido com MluI e Notl e inserido entre MluI e Notl do vetor pE-neo para construir pE-neo (HC-I2S-3).
[Exemplo 2] Preparação de linhas celulares de alta expressão de proteínas de fusão hI2S-anticorpo anti-hTfR humanizado.
[00128] As células CHO (CHO-K1 obtida da American Type Culture Collection) foram transformadas com combinações de pE-hygr (LC1) e pE-neo (HC-I2S-1) construído no Exemplo 1, pE-hygr (LC2) e pE-neo (HC-I2S-2) construído no Exemplo 1 e pE-hygr (LC3) e pE-neo (HC-I2S-3) construídos no Exemplo 1, respectivamente, utilizando o GenePulser (Bio-Rad Inc.). A transformação de células foi realizada pelo seguinte método resumido.
[00129] 5 x 105 células CHO-K1 foram semeadas em uma placa de cultura de 3,5 cm ao qual o meio CD OptiCHO™ (Thermo Fisher Scientific Inc.) foi adicionado e cultivado durante a noite a 37°C sob 5% de CO2. Após a cultura, as células foram suspensas em meio Opti-MEM™I (Thermo Fisher Scientific Inc.) a uma densidade de 5 x 106 células/mL. Foram coletados 100 μΕ da suspensão celular e nos mesmos 5 μΕ de cada uma das soluções de DNA de plasmídeo pE-hygr (LC1) e pE-neo (HC-I2S-1) diluídas a 100 pg/mL
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 61/87 /68 com meio CD OptiCHO™ foi adicionado. A eletroporação foi realizada utilizando GenePulser (Bio-Rad Inc.) para introduzir os plasmídeos nas células. Após a cultura durante a noite sob a condição de 37°C, 5% de CO2, as células foram seletivamente cultivadas em meio CD OptiCHO™ suplementado com 0,5 mg/mL de higromicina e 0,8 mg/mL de G418. Para a combinação de pE-hygr (LC2) e pE-neo (HC-I2S-2) e a combinação de pE-hygr (LC3) e pE-neo (HC-I2S-3), as transformações das células foram realizadas pelo mesmo método.
[00130] Depois, as células selecionadas acima através da cultura de seleção foram semeadas em placas de 96 poços, de modo que não mais do que uma célula pudesse ser semeada por poço por diluição limitante. As células foram então cultivadas durante cerca de 10 dias para que as colônias monoclonais fossem formadas. Respectivamente, os sobrenadantes de cultura dos poços nos quais a colônia monoclonal formada foi coletada, a quantidade do anticorpo humanizado contido nos sobrenadantes da cultura foi determinada por ELISA, e foram selecionadas linhas celulares de alta expressão de proteína de fusão hI2S-anticorpo anti-hTfR humanizado.
[00131] ELISA acima foi realizado como segue em geral. A cada poço de placas de microtitulação de 96 poços (Nunc Inc.) foram adicionados 100 pL de uma solução de anticorpo policlonal de IgG anti-humano de cabra diluído com tampão de bicarbonato de sódio 0,05 M (pH 9,6) a 4 pg/mL, e a placa foi deixada em repouso durante pelo menos uma hora à temperatura ambiente de modo a permitir que o anticorpo seja adsorvido pelas placas. Em seguida, após cada poço ter sido lavado três vezes com uma solução salina tamponada com fosfato (pH 7,4) suplementada com 0,05% de Tween20 (PBS-T), foram adicionados 200 pL de Tampão de Bloqueio Starting Block (PBS) (Thermo Fisher Scientific Inc.) a cada poço e as placas foram deixadas em repouso durante 30 minutos à temperatura ambiente. Após cada poço ter sido lavado com PBS-T três vezes, o sobrenadante de cultura ou o produto
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 62/87 /68 padrão de referência de IgG humana que tinha sido diluído com uma solução salina de tampão fosfato suplementada com BS A a 0,5% e Tween20 a 0,05% (PBS-BT) para concentrações apropriadas, foi adicionado a cada poço, na quantidade de 100 μΕ, e as placas foram deixadas em repouso durante pelo menos uma hora à temperatura ambiente. Após as placas terem sido lavadas três vezes com PBS-T, foram adicionados a cada poço 100 μΕ de solução de anticorpo policlonal anti-IgG humana marcada com HRP que tinha sido diluída com PBS-BT, e as placas foram deixadas em repouso durante pelo menos uma hora à temperatura ambiente. Após os poços terem sido lavados três vezes com PBS-T, tampão citrato-fosfato (pH 5,0) contendo o-fenilenodiamina 0,4 mg/mL foi adicionado a cada poço, na quantidade de 100 μΕ, e os poços foram deixados em repouso durante 8 a 20 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, foi adicionado ácido sulfúrico 1 mol/L a cada poço, na quantidade de 100 pL para terminar a reação, e a absorbância para cada poço foi medida a 490 nm utilizando um leitor de placas de 96 poços. As células correspondentes aos poços que exibiram as medições mais elevadas foram consideradas como uma linha celular de alta expressão para proteína de fusão hI2S-anticorpo anti-hTfR humanizado.
[00132] Uma linha celular de alta expressão de uma proteína de fusão hI2S-anticorpo anti-hTfR humanizado obtida por transformação com combinação de pE-hygr (LC1) e pE-neo (HC-I2S-1) foi designada como uma cepa de expressão de hI2S-anticorpo anti-hTfR 1. A proteína de fusão de hI2S e anticorpo anti-hTfR humanizado expressa por essa linha celular foi designada como I2S-anticorpo anti-hTfR 1.
[00133] Uma linha celular de alta expressão de uma proteína de fusão hI2S-anticorpo anti-hTfR humanizado obtida por transformação com combinação de pE-hygr (LC2) e pE-neo (HC-I2S-2) foi designada como uma cepa de expressão de hI2S-anticorpo anti-hTfR 2. A proteína de fusão de hI2S e anticorpo anti-hTfR humanizado expressa por essa linha celular foi
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 63/87 /68 designada como I2S-anticorpo anti-hTfR 2.
[00134] Uma linha celular de alta expressão de uma proteína de fusão hI2S-anticorpo anti-hTfR humanizado obtida por transformação com combinação de pE-hygr (LC3) e pE-neo (HC-I2S-3) foi designada como uma cepa de expressão de hI2S-anticorpo anti-hTfR 3. A proteína de fusão de hI2S e anticorpo anti-hTfR humanizado expressa por essa linha celular foi designada como I2S-anticorpo anti-hTfR 3.
[00135] Os números de sequência de sequências de aminoácidos das cadeias leve e pesada de anticorpos humanizados, as sequências de aminoácidos das regiões variáveis contidas nessas cadeias leve e pesada e as sequências de aminoácidos de CDR 1 a 3 contidas nessas regiões variáveis, que estão contidas em I2S-anticorpo anti-hTfR 1, I2S-anticorpo anti-hTfR 2, ou I2S-anticorpo anti-hTfR 3, estão resumidos na Tabela 1.
[Tabela 1]
Tabela 1. SEQ ID Nos das sequências de aminoácidos de cadeia pesada e de cadeia leve contidas na proteína de fusão
Nome da proteína de fusão Cadeia leve Cadeia pesada
Comp. total Região variável CDR1 CDR2 CDR3 Comp. total Região variável CDR1 CDR2 CDR3
I2S-anticorpo anti-hTfR 1 2 23 29, 30 31, 32 33 8 24 34, 35 36, 37 38, 39
I2S-anticorpo anti-hTfR 2 4 25 40,41 42, 43 44 9 26 45,46 47, 48 49, 50
I2S-anticorpo anti-hTfR 3 6 27 51,52 53,54 55 10 28 56, 57 58,59 60,61
[Exemplo 3] Cultura da cepa de expressão de hI2S-anticorpo anti-hTfR [00136] Os hI2S-anticorpos anti-hTfR foram produzidos pelo método descrito abaixo. A cepa de expressão do hI2S-anticorpo anti-hTfR 3 obtida no Exemplo 2 foi suspensa em cerca de 200 L de meio isento de soro (Meio semi-descontínuo EX-CELL Advanced CHO, Sigma Aldrich Inc.) contendo 4 mM de L-alanil-L- glutamina, 100 μπιοΙ/L hipoxantina e 16 μπιοΙ/L de timidina até a densidade de cerca de 2 x 105 células/mL. 140 L desta suspensão de células foi transferida para um tanque de cultura. As células
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 64/87 /68 foram cultivadas durante cerca de 11 dias a uma faixa de temperatura de 34 a 37°C, enquanto o meio foi agitado com um impulsor a uma velocidade de 89 rpm, e a saturação de oxigênio dissolvido do meio foi mantida a cerca de 40%. Durante o período de cultura, o número de células, a viabilidade celular e as concentrações de glicose e lactato do meio foram monitoradas. Quando a concentração de glicose do meio se tomou inferior a 15 mmol/L, a solução de glicose foi imediatamente adicionada ao meio de modo que a concentração de glicose se tomou 37,89 mmol/L. Após o término da cultura, o meio foi coletado. O meio recuperado foi filtrado com Millistak+HC Pod Filter grau DOHC (Merck Inc.) e filtrado adicionalmente com Millistak+HC grau XOHC (Merck Inc.) para obter um sobrenadante de cultura contendo o I2S-anticorpo anti-hTfR 3. O sobrenadante da cultura foi submetido à ultrafiltração utilizando uma membrana Pellicon™ 3 Cassette w/Ultracel PLCTK (tamanho do poro: 30 kDa, área de membrana: 1,14 m2, Merck Inc.) e concentrado até o volume de líquido ser de cerca de 1/17. O concentrado foi então filtrado usando Opticap XL600 (0,22 pm, Merck Inc.). A solução obtida foi usada como um sobrenadante de cultura concentrado.
[Exemplo 4] Inativação do víms [00137] Ao sobrenadante de cultura concentrado obtido no Exemplo 3, fosfato de tri-n-butil (TNBP) e polissorbato 80 foram adicionados de modo que as concentrações finais fossem 0,3% (v/v) e 1% (p/v), respectivamente, e agitou-se suavemente à temperatura ambiente durante 4 horas. Este processo é realizado para inativar o vírus contaminando o sobrenadante da cultura. No entanto, na medida em que a cultura é realizada utilizando um meio isento de soro que não contenha componentes biológicos, existe pouca possibilidade de que os vírus prejudiciais ao corpo humano estejam contaminados no sobrenadante da cultura.
[Exemplo 5] Purificação de hI2S-anticorpos anti-hTfR [00138] O sobrenadante da cultura concentrada após a inativação do
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 65/87 /68 vírus foi filtrado por uma Unidade de Filtro Millipak-200 (tamanho do poro: 0,22 gm, Merck Inc.) após a adição de tampão Tris-HCl 20 mM (pH 7,0) contendo 0,5 volume de NaCI 140 mM. A solução após filtração foi carregada em uma coluna MabSelect SuRe LX (volume da coluna: cerca de 3,2 L, altura do leito: cerca de 20 cm, GE Healthcare Inc.), que era uma coluna de afinidade de proteína A e equilibrada com 4 volumes de coluna de Tampão Tris-HCl 20 mM (pH 7,0) contendo NaCI 140 mM, a uma vazão constante de 200 cm/h para adsorver o I2S-anticorpo anti-hTfR 3 na proteína A.
[00139] Subsequentemente, a coluna foi lavada com 5 volumes de coluna de tampão Tris-HCl 10 mM (pH 7,0) contendo NaCI 500 mM e arginina 450 mM na mesma vazão. Em seguida a coluna foi adicionalmente lavada com 2,5 volumes de coluna de tampão Tris-HCl 20 mM (pH 7,0) contendo NaCI 140 mM na mesma vazão. Em seguida, o I2S-anticorpo anti-hTfR adsorvido em Proteína A foi eluído com 5 volumes de coluna de tampão de glicina 100 mM (pH 3,5) contendo NaCI 140 mM. O eluato foi imediatamente neutralizado recebendo-o em um recipiente contendo tampão Tris-HCl 1 M (pH 7,5) antecipadamente.
[00140] Ao eluato acima da coluna de afinidade de Proteína A, o tampão fosfato 200 mM (pH 7,0), tampão MES 10 mM (pH 7,3) contendo NaCI 4 M e tampão fosfato 2 mM e solução tampão de Tris-HCl 1 M (pH 8,0) foram adicionados na ordem, e as concentrações de fosfato de sódio e NaCI contidas no eluato foram ajustadas para 2 mM e 215 mM, respectivamente, e o pH do eluato foi ajustado para 7,3. O eluato foi então filtrado através de Opticap XL 600 (tamanho do poro: 0,22 qm, Merck Inc.). A solução após filtração foi aplicada a uma coluna de 40 qm CHT tipo II, uma coluna de hidroxiapatita (volume da coluna: cerca de 3,2 L, altura do leito: cerca de 20 cm, Bio-Rad Inc.), equilibrada com 4 volumes de coluna de solução de tampão MES 10 mM (pH 7,3) contendo NaCI 215 mM e fosfato de sódio 2 mM a uma vazão constante de 200 cm/h para adsorver o I2S-anticorpo
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 66/87 /68 anti-hTfR 3 na hidroxiapatita.
[00141] Subsequentemente, a coluna foi lavada com 5 volumes de coluna do mesmo tampão na mesma vazão. Em seguida, o I2S-anticorpo anti-hTfR adsorvido em hidroxiapatita foi eluído com 5 volumes de coluna de tampão fosfato 35 mM (pH 7,3) contendo NaCl 215 mM. A purificação por coluna de hidroxiapatita foi realizada duas vezes usando metade do volume do eluato da coluna de afinidade de proteína A.
[00142] Ao eluato anterior da coluna de hidroxiapatita, foi adicionado ácido clorídrico diluído para ajustar o pH a 6,5. Em seguida, a ultrafiltração foi realizada usando uma membrana Pellicon™ 3 Cassette w/Ultracel PLCTK (tamanho do poro: 30 kDa, área de membrana: 1,14 m2, Merck Inc.) para concentrar I2S-anticorpo anti-hTfR 3 na solução na concentração de cerca de 2 mg/mL. O concentrado foi então filtrado usando Opticap XL 600 (0,22 pm, Merck Inc.).
[00143] A solução concentrada anterior foi aplicada a uma coluna Superdex 200, coluna de exclusão por tamanho (volume da coluna: cerca de 12,6 L, altura do leito: 40 cm, GE Healthcare Inc.) equilibrada com 5 volumes de coluna de tampão fosfato 20 mM (pH 6,5) contendo 0,8 mg/mL de NaCl e 75 mg/mL de sacarose a uma vazão constante de 19 cm/h, e o mesmo tampão foi fornecido na mesma vazão. Neste momento, um fotômetro de absorbância para medir continuamente a absorbância do eluato foi colocado no percurso de fluxo do eluato da coluna de exclusão por tamanho, e a absorbância a 280 nm foi monitorada. As frações que correspondiam a um pico de absorção a 280 nm foram coletadas como frações contendo o I2S-anticorpo anti-hTfR 3, que foi designado como um produto purificado de I2S-anticorpo anti-hTfR. A purificação na coluna de exclusão por tamanho foi realizada duas vezes usando metade do volume do eluato da coluna de hidroxiapatita.
[Exemplo 6] Fabricação de produtos liofilizados contendo I2S-anticorpos anti-hTfR
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 67/87 /68 [00144] Uma solução aquosa, cuja composição é mostrada na Tabela 2, foi preparada utilizando o I2S-anticorpo anti-hTfR purificado obtido no Exemplo 5. A solução aquosa foi filtrada usando um sistema de filtro a vácuo/garrafa de armazenamento, 0,22 pm (Coming Inc.). A solução após filtração foi usada como solução de teste. Adicionou-se solução de hidróxido de sódio ou ácido clorídrico diluído conforme necessário para ajustar o pH da solução de teste para cerca de 6,5.
[Tabela 2]
Tabela 2. Composição da solução de teste
Componente Concentração (mg/mL)
I2S-anticorpo anti-hTfR 5
NaCl 0,8
NaH2PO4 2H2O 2,136
NaH2PO4 12 H2O 2,256
sacarose 75
Poloxâmero 188 0,325
[00145] 2,5 mL de cada uma das soluções de teste foram transferidos para um frasco de vidro boros silicato, com uma rolha de borracha (fabricada com butil clorado) tampado pela metade e liofilizados. No processo de liofilização, a fase gasosa nos frascos foi substituída por nitrogênio, e então toda a tampa de borracha foi usada para tampar para selar os frascos. Os produtos liofilizados formaram uma massa branca nos frascos.
[Exemplo 7] Avaliação da estabilidade da formulação liofilizada contendo I2S-anticorpo anti-hTfR [00146] Os produtos liofilizados preparados no Exemplo 6 foram deixados em repouso em um ambiente escuro a 5°C ou 25°C durante 6 meses. Os produtos liofilizados nos frascos no início do repouso, depois de um mês, após 3 meses, e após 6 meses, foram dissolvidos em 2,5 ml de água pura e as soluções foram usadas como soluções de amostra. O pH de cada solução de amostra foi medido e a presença ou ausência de matéria estranha foi examinada visualmente com um brilho de 2000 a 3750 Ix sob uma fonte de luz branca. O número de partículas finas, cujo tamanho das partículas era de 1
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 68/87 /68 a 100 gm, foi medido pelo método mostrado no Exemplo 8. A razão de polímeros de I2S-anticorpo anti-hTfR em cada solução de amostra foi determinada pelo método mostrado no Exemplo 9. Adicionalmente, a afinidade do I2S-anticorpo anti-hTfR contido em cada solução de amostra com TfR humano foi determinada pelo método mostrado no Exemplo 10. Além disso, a atividade enzimática do I2S-anticorpo anti-hTfR contido em cada solução de amostra foi determinada pelo método mostrado no Exemplo
11.
[00147] A Tabela 3 mostra os resultados das medições de estabilidade de formulações liofilizadas contendo o I2S-anticorpo anti-hTfR depois de deixado durante 6 meses no escuro a 5°C. Como mostrado na Tabela 3, o pH das soluções de amostra foi mantido a aproximadamente pH 6,5 durante o período de repouso de 6 meses do produto liofilizado. Não houve matéria insolúvel estranha nas soluções da amostra durante o mesmo período, o que podería ser claramente observado opticamente. A razão de polímeros para I2S-anticorpo anti-hTfR inteiro nas soluções de amostra durante o mesmo período era quase constante. Além disso, o número de partículas finas, cujo tamanho das partículas era de 1 a 100 μηι, não aumentou significativamente durante o mesmo período. Observou-se um aumento no número de partículas na solução da amostra deixada em repouso durante 6 meses, mas estava dentro de uma faixa aceitável quando o período de armazenamento da formulação liofilizada foi fixado em 2 anos em um local frio. A atividade enzimática do I2S-anticorpo anti-hTfR nas soluções de amostras permaneceu quase constante durante o mesmo período. Além disso, a afinidade do I2S-anticorpo anti-hTfR contido nas soluções da amostra para o TfR humano não diminuiu significativamente durante o mesmo período (dados não mostrados).
[Tabela 3]
Tabela 3. Resultados da avaliação de estabilidade de formulação liofilizada
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 69/87 /68 armazenada no escuro a 5°C
Item de Teste No início 1 mês 2 meses 3 meses 6 meses
pH 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5
Matéria insolúvel estranha (observação visual) nenhuma nenhuma nenhuma nenhuma nenhuma
Razão de polímeros (%) 1,13 1,09 1,08 1,02 1,19
Número de partículas (/frasco) 1110 1500 1550 730 3240
Atividade enzimática (mU/mg) 419 436 425 422 515
Afinidade por hTfR (KD) - - - - -
[00148] A Tabela 4 mostra os resultados das medições de estabilidade de formulações liofilizadas contendo o I2S-anticorpos anti-hTfR depois de deixadas em repouso durante 6 meses no escuro a 25°C. Como mostrado na Tabela 4, o pH da solução de amostra foi mantido a aproximadamente pH 6,5 durante o período de repouso de 6 meses do produto liofilizado. Qualquer matéria insolúvel estranha não foi observada nas soluções da amostra durante o mesmo período, o que podería ser claramente observado oticamente. A razão de polímero foi quase constante durante o mesmo período. O número de partículas finas, cujo tamanho das partículas era de 1 a 100 pm, não aumentou significativamente durante o mesmo período. Observou-se um aumento no número de partículas finas depois de 6 meses, o qual estava dentro de uma faixa aceitável quando o período de armazenamento da formulação liofilizada foi fixado em 2 anos em um local frio. A atividade enzimática do I2S-anticorpo anti-hTfR nas soluções de amostras permaneceu quase constante durante o mesmo período. Além disso, a afinidade do I2S-anticorpo anti-hTfR contido nas soluções da amostra por TfR humano não diminuiu significativamente durante o mesmo período (dados não mostrados).
[Tabela 4]
Tabela 4. Resultados da avaliação de estabilidade para formulação liofilizada armazenada no escuro a 25 °C
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 70/87 /68
Item de Teste No início 1 mês 2 meses 3 meses 6 meses
pH 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5
Matéria insolúvel estranha (observação visual) nenhuma nenhuma nenhuma nenhuma nenhuma
Razão de polímeros (%) 1,13 1,09 1,09 1,02 1,19
Número de partículas (/frasco) 1110 2140 3130 1060 2620
Atividade enzimática (mU/mg) 419 445 430 430 506
Afinidade por hTfR (KD) - - - - -
[00149] Estes resultados acima indicam que um fármaco contendo o
I2S-anticorpo anti-hTfR como um ingrediente ativo pode ser provido ao mercado em um estado farmacologicamente estável utilizando a formulação liofilizada com a composição mostrada na Tabela 2, desde que o fármaco seja colocado em um local frio no processo de distribuição e no armazenamento. [Exemplo 8] Medição do número de partículas contidas na solução da amostra (tamanho da partícula: 1 a 100 qm);
[00150] A medição do número de partículas contidas nas soluções da amostra foi realizada utilizando um analisador de partículas por análise de imagens de fluxo FlowCAMTM (Fluid Imaging Technologies Inc.). Ο analisador de partículas por análise de imagens de fluxo permite medir o número de partículas contidas na solução de amostra através do arraste da solução de amostra em uma célula de fluxo disposta perpendicularmente ao sistema óptico por uma bomba de seringa, e para fotografar as partículas que passam através da célula de fluxo em tempo real. A medição foi realizada ajustando o tamanho de partícula a ser detectado para 1 a 100 qm.
[Exemplo 9] Medição da quantidade de polímeros de I2S-anticorpos anti-hTfR contidos em uma solução de amostra [00151] A coluna TSKgel UltraSW Aggregate de 3qm, uma cromatografia de coluna por exclusão de tamanho, (7,8 mm de diâmetro x 30 cm de comprimento, TOSOH Inc.) foi ajustada em sistema de HPLC Shimazu
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 71/87 /68
LC-20A (Shimadzu Corporation). Um espectrofotômetro foi instalado a jusante da coluna para medir a absorbância (Comprimento de onda de medição: 215 nm) do efluente da coluna continuamente. Depois de equilibrar a coluna carregando solução tampão aquosa de fosfato de sódio 0,2 M a uma vazão de 0,5 mL/min, uma solução de amostra contendo 3 a 20 pg de I2S-anticorpo anti-hTfR foi carregada na coluna e mais solução tampão aquosa de fosfato de sódio 0,2 M estava carregando na mesma vazão. Durante esse tempo, o perfil de eluição foi obtido medindo-se a absorbância (Comprimento de onda de medição: 215 nm) do efluente da coluna. A partir dos perfis de eluição obtidos, a área do pico do monômero do I2S-anticorpo anti-hTfR (área do pico do monômero) e a área do pico do polímero do I2S-anticorpo anti-hTfR que aparecem antes do pico do monômero (área do pico do polímero) foram determinados. A quantidade (%) do polímero foi determinada pela seguinte equação.
[00152] Quantidade de polímero (%) = {área do pico do polímero/ (área do pico do monômero + área do pico do polímero)} x 100 [Exemplo 10] Medição da afinidade do I2S-anticorpo anti-hTfR em solução de amostra por TfR humano [00153] A afinidade do I2S-anticorpo anti-hTfR por TfR humano foi determinada utilizando OctetRED 96 (ForteBio Inc., uma divisão da Pali Corporation), na qual é aplicada a interferometria de biocamada (BLI). Os princípios básicos da interferometria de biocamada são brevemente explicados abaixo. Quando uma camada de uma biomolécula imobilizada na superfície de uma ponta do sensor é irradiada com luz de um determinado comprimento de onda, a luz é refletida a partir de duas das superfícies, aquela da biomolécula e a outra da camada interna de referência, produzindo ondas de luz interferentes. Uma molécula na amostra a ser medida liga-se à biomolécula na superfície da ponta do sensor e, assim, aumenta a espessura das camadas na ponta do sensor, o que resulta em um deslocamento entre as
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 72/87 /68 ondas interferentes. Ao medir as variações desse deslocamento entre as ondas interferentes, a determinação do número de moléculas ligadas à camada das biomoléculas imobilizadas na superfície da ponta do sensor e a análise cinética da mesma podem ser realizadas em tempo real. A medição foi realizada de acordo com o manual de operação anexado ao Octeto RED96. Como um TfR humano, um TfR humano recombinante (rhTlR: Sino Biological Inc,) foi utilizado, o qual tinha a sequência de aminoácidos da região extracelular de hTfR, isto é, o resíduo de cisteína na posição 89 a partir do lado N-terminal à fenilalanina no C-terminal, da sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:1, com uma etiqueta de histidina fixada ao N-terminal.
[00154] As soluções de amostra preparadas no Exemplo 6 foram submetidas a etapas de diluição de 2 vezes com HBS-P+ (HEPES 10 mM contendo NaCI 150 mM, EDTA 50 μΜ e tensoativo P20 0,05%) para preparar soluções diluídas em 7 etapas, cujas concentrações foram 0,78125 a 50 nM (0,117 a 7,5 g/mL). A solução de rhTfR-ECD(Histag) foi preparada por diluição de hTfR com HBS-P+ para ajustar a concentração para 25 pg/mL.
[00155] Cada uma das soluções de amostra preparadas acima por etapas de diluição de 2 vezes foi adicionada, 200 μΕ/poço, a uma placa de 96 poços, preta (Greiner Bio-One Inc.). Cada uma das soluções TfR-ECD r humana (Histag) acima preparadas foi adicionada, 200 μΕ/poço, a poços predeterminados. Aos respectivos poços para o nível basal, dissociação e lavagem foram adicionados HBS-P+, 200 μΕ/poço. Aos poços para regeneração, foram adicionados 10 mM de Glicina-HCl, pH 1,7, 200 μΕ/poço. Aos poços para ativação, adicionou-se solução de NiCE 0,5 mM, 200 μΕ/poço. A placa e o biossensor (Biosensor/Ni-NTA: ForteBio Inc., uma divisão da Pall Corporation) foram colocados nas posições prescritas de Octet RED96.
[00156] O Octet RED96 foi executado sob as condições mostradas na
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 73/87 /68
Tabela 5 abaixo para coletar dados, no qual, então, usando o software de análise anexado ao Octet RED96, e ajustando a curva de reação de ligação ao modelo de ligação 1:1 ou modelo de ligação 2:1 , a constante de velocidade de associação (kon) e constante de velocidade de dissociação (koff) do anticorpo anti-hTfR ao TfR r humano foram medidas e a constante de dissociação (KD) foi calculada. A medição foi realizada a 25 a 30oC.
[Tabela 5]
Tabela 5. Condições operacionais de OctetRED 96
Etapa Tempo de contato Velocidade (rpm) Limiar
1 Nível basal 1 60 1000 -
2 Carga 600 1000 1,5-2,0
3 Nível basal 2 60 1000
4 Associação 180 1000
5 Dissociação 540 1000
6 Regeneração 5 1000
7 Lavagem 5 1000
Etapas 6-7 repetidas 6 a 7 vezes
8 Ativação 60 1000 -
Etapas 1 -8 repetidas até que todas as amostras foram medidas
[Exemplo 11] Medição da atividade enzimática de I2S-anticorpos anti-hTfR na solução de amostra [00157] As soluções de amostra foram dessalinizadas por filtração por membrana utilizando uma membrana de polietersulfona vertical (VIVASPIN2 5.000 MWCO PES, Saltrius Inc.) como uma membrana de ultrafiltração, e depois as amostras dessalinizadas foram diluídas para aproximadamente 100 ng/mL com tampão de reação (acetato de sódio 5 mM, BSA 0,5 mg/L, Triton X-100 a 0,1%, pH 4,45). A cada poço de uma placa de microtitulação de 96 poços (FluoroNunc Plate, Nunc Inc.), 10 μΕ de cada amostra de rhI2S foi adicionada e pré-incubada durante 15 minutos a 37°C. As soluções de substrato foram preparadas dissolvendo sulfato de 4-metilumbeliferil (SIGMA) em tampão de substrato (5 mM de acetato de sódio, pH 4,45, contendo 0,5 mg/mL de BSA) até uma concentração final de 1,5 mg/mL. Adicionou-se 100 pL de soluções de substrato a cada poço contendo solução de amostra de rhI2S e deixou-se as placas em repouso no escuro a 37°C
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 74/87 /68 durante 1 hora. Após a incubação, 190 μί de tampão de paragem (0,33 M de glicina, 0,21 M de solução tampão de carbonato de sódio, pH 10,7) foram adicionados a cada poço contendo a amostra. 150 gL de solução de 4-metilumbeliferona (4-MUF, Sigma) 0,4 μπιοΙ/L e 150 μΕ do tampão de paragem foram adicionados a um poço como padrão, em seguida a placa foi lida em um leitor de placa de 96 poços com luz de excitação no comprimento de onda de 330 nm e luz fluorescente no comprimento de onda de 440 nm.
[00158] Uma curva padrão foi produzida medindo a intensidade de fluorescência em várias concentrações de 4-MUF em solução. A intensidade de fluorescência de cada amostra foi extrapolada na curva padrão. Os resultados foram calculados como atividade em Unidades/mL onde uma unidade de atividade era igual a 1 μιηοΙ de 4-MUF produzido por minuto a 37°C. Um pedido de patente dos EUA publicado (publicação N° 2004-0229250) foi mencionado para a realização desta medição.
Aplicabilidade industrial [00159] De acordo com a presente invenção, uma formulação liofilizada contendo uma proteína na qual um anticorpo e uma enzima lisossomal são combinados como um ingrediente ativo pode ser provida ao mercado em um estado farmacologicamente estável.
Texto livre da listagem de sequência [00160] SEQ ID NO:2: Sequência de aminoácidos da cadeia leve de anti-hTfR humanizado
SEQ ID NO:3: Sequência nucleotídica que codifica a sequência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo anti-hTfR N° 1 humanizado, sequência sintética
SEQ ID NO:4: Sequência de aminoácidos da cadeia leve de anticorpo anti-hTfR N° 2 humanizado
SEQ ID NO:5: Sequência nucleotídica que codifica a sequência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo antihTfR N° 2
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 75/87 /68 humanizado, sequência sintética
SEQ ID NO:6: sequência de aminoácidos da cadeia leve de anticorpo anti-hTfR N° 3 humanizado
SEQ ID NO:7: Sequência nucleotídica que codifica a sequência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo antihTfR N° 3 humanizado, sequência sintética
SEQ ID NO:8: Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de anticorpo anti-hTfR N° 1 humanizado
SEQ ID NO:9: Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de anticorpo anti-hTfR N° 2 humanizado
SEQ ID NO: 10: Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de anticorpo anti-hTfR N° 3 humanizado
SEQ ID NO: 11: Iniciador Hyg-Sfi5', sequência sintética
SEQ ID NO: 12: Iniciador Hyg-BstX3', sequência sintética
SEQ ID NO: 13: Sequência de aminoácidos de proteína fundida da cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR N° 1 humanizado e hI2S
SEQ ID NO: 14: Sequência nucleotídica que codifica a sequência de aminoácidos da proteína fundida da cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR N° 1 humanizado e hI2S, sequência sintética
SEQ ID NO: 15: Sequência de aminoácidos da proteína fundida da cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR N° 2 humanizado e hI2S
SEQ ID NO: 16: Sequência nucleotídica que codifica a sequência de aminoácidos da proteína fundida da cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR N° 2 humanizado e hI2S, sequência sintética
SEQ ID NO: 17: Sequência de aminoácidos da proteína fundida da cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR N° 3 humanizado e hI2S
SEQ ID NO: 18: Sequência nucleotídica que codifica a sequência de aminoácidos da proteína fundida da cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR N° 3 humanizado e hI2S, sequência sintética
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 76/87 /68
SEQ
ID
NO: 19:
Sequência de aminoácidos de um ligante exemplificado 1
SEQ
ID
NO:20:
Sequência de aminoácidos de um ligante exemplificado 2
SEQ
ID
NO:21:
Sequência de aminoácidos de um ligante exemplificado 3
SEQ ID NO :23: Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve do anticorpo anti-hTfR N° 1 humanizado
SEQ ID NO :24: Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR N° 1 humanizado
SEQ ID NO :25: Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve do anticorpo anti-hTfR N° 2 humanizado
SEQ ID NO :26: Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR N° 2 humanizado
SEQ ID NO:27: Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve do anticorpo anti-hTfR N° 3 humanizado
SEQ ID NO :28: Sequência de aminoácidos da região variável humanizado de cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR N°
SEQ ID NO :29: Sequência cadeia leve do anticorpo anti-hTfR N° 1
SEQ ID NO:30: Sequência cadeia leve do anticorpo anti-hTfR N° 1
SEQ ID NO:31: Sequência cadeia leve do anticorpo anti-hTfR N° 1
SEQ ID NO:32: Sequência cadeia leve do anticorpo anti-hTfR N° 1
SEQ ID NO:33: Sequência de aminoácidos de CDR3 na cadeia leve do anticorpo anti-hTfR N° 1
SEQ ID NO:34: Sequência de aminoácidos 1 de CDR1 na de de de de aminoácidos aminoácidos aminoácidos aminoácidos de de de de
CDR1
CDR1
CDR2
CDR2 na na na na
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 77/87 /68 cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR N° 1
SEQ ID NO:35: Sequência cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR N° 1
SEQ ID NO:36: Sequência cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR N° 1
SEQ ID NO:37: Sequência cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR N° 1
SEQ ID NO:38: Sequência cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR N° 1
SEQ ID NO:39: Sequência cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR N° 1
SEQ ID NO :40: Sequência cadeia leve do anticorpo anti-hTfR N° 2
SEQ ID NO:41: Sequência cadeia leve do anticorpo anti-hTfR N° 2
SEQ ID NO :42: Sequência cadeia leve do anticorpo anti-hTfR N° 2
SEQ ID NO :43: Sequência cadeia leve do anticorpo anti-hTfR N° 2
SEQ ID NO:44: Sequência de aminoácidos de CDR3 na cadeia leve do anticorpo anti-hTfR N° 2 de de de de de de de de de aminoácidos aminoácidos aminoácidos aminoácidos aminoácidos aminoácidos aminoácidos aminoácidos aminoácidos de de de de de de de de de
CDR1
CDR2
CDR2
CDR3
CDR3
CDR1
CDR1
CDR2
CDR2 na na na na na na na na na
SEQ ID NO :45: Sequência de aminoácidos 1 de CDR1 na cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR N° 2
SEQ ID NO :46: Sequência de aminoácidos 2 de CDR1 na cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR N° 2
SEQ ID NO :47: Sequência de aminoácidos 1 de CDR2 na cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR N° 2
SEQ ID NO :48: Sequência de aminoácidos 2 de CDR2 na cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR N° 2
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 78/87 /68
SEQ ID NO :49: Sequência cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR N° 2
SEQ ID NO:50: Sequência cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR N° 2
SEQ ID NO:51: Sequência cadeia leve do anticorpo anti-hTfR N° 3
SEQ ID NO:52: Sequência cadeia leve do anticorpo anti-hTfR N° 3
SEQ ID NO:53: Sequência cadeia leve do anticorpo anti-hTfR N° 3
SEQ ID NO:54: Sequência cadeia leve do anticorpo anti-hTfR N° 3
SEQ ID NO:55: Sequência de aminoácidos de CDR3 na cadeia de de de de de de aminoácidos aminoácidos aminoácidos aminoácidos aminoácidos aminoácidos de de de de de de
CDR3
CDR3
CDR1
CDR1
CDR2
CDR2 na na na na na na leve do anticorpo anti-hTfR N° 3
SEQ ID NO:56: Sequência de aminoácidos 1 de CDR1 na cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR N° 3
SEQ ID NO:57: Sequência de aminoácidos 2 de CDR1 na cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR N° 3
SEQ ID NO:58: Sequência de aminoácidos 1 de CDR2 na cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR N° 3
SEQ ID NO:59: Sequência de aminoácidos 2 de CDR2 na cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR N° 3
SEQ ID NO :60: Sequência de aminoácidos 1 de CDR3 na cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR N° 3
SEQ ID NO:61: Sequência de aminoácidos 2 de CDR3 na cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR N° 3
Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 79/87

Claims (29)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Formulação liofilizada, caracterizada pelo fato de que compreende uma proteína de fusão incluindo um anticorpo e uma enzima lisossomal, como um ingrediente ativo, e adicionalmente um sal neutro, um dissacarídeo, um tensoativo não iônico e um tampão.
  2. 2. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o sal neutro é o cloreto de sódio.
  3. 3. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 1 ou
    2, caracterizada pelo fato de que o dissacarídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em trealose, sacarose, maltose e lactose.
  4. 4. Formulação liofilizada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o tensoativo não iônico é polissorbato ou poloxâmero.
  5. 5. Formulação liofilizada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o tensoativo não iônico é selecionado a partir do grupo que consiste em polissorbato 20, polissorbato 80, e polioxietileno(160)polioxipropileno(30)glicol.
  6. 6. Formulação liofilizada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o tampão é um tampão fosfato.
  7. 7. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 1 ou
    2, caracterizada pelo fato de que o dissacarídeo é sacarose, o tensoativo não iônico é polioxietileno(160)polioxipropileno(30)glicol, e o tampão é um tampão fosfato.
  8. 8. Formulação liofilizada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que as quantidades do sal neutro, do dissacarídeo, e do tensoativo iônico são 0,015 a 2,5 (p/p), 2,5 a 200
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    2 !6 (p/p), e 0,005 a 6 (p/p), respectivamente, em relação à quantidade da proteína de fusão.
  9. 9. Formulação liofilizada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que as quantidades do sal neutro, do dissacarídeo, e do tensoativo iônico são 0,05 a 0,5 (p/p), 5 a 50 (p/p), e 0,02 a 0,2 (p/p), respectivamente, em relação à quantidade da proteína de fusão.
  10. 10. Formulação liofilizada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que as quantidades do sal neutro, do dissacarídeo, e do tensoativo iônico são 0,1 a 0,25 (p/p), 10 a 25 (p/p), e 0,04 a 0,1 (p/p), respectivamente, em relação à quantidade da proteína de fusão.
  11. 11. Formulação liofilizada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o pH é 5,5 a 7,5 quando dissolvida em água pura.
  12. 12. Formulação liofilizada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão é uma proteína de fusão em que a enzima lisossomal humana é unida à cadeia leve ou à cadeia pesada do anticorpo no lado C-terminal ou no lado N-terminal da mesma por uma ligação peptídica.
  13. 13. Formulação liofilizada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão é uma proteína de fusão em que a enzima lisossomal humana é unida à cadeia pesada do anticorpo no lado C-terminal da mesma por uma ligação peptídica.
  14. 14. Formulação liofilizada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão é uma proteína de fusão em que a enzima lisossomal humana é unida à cadeia leve ou à cadeia pesada do anticorpo no lado C-terminal ou no lado N-terminal da mesma através de um ligante incluindo um ou mais aminoácidos.
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    3 /6
  15. 15. Formulação liofilizada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão é uma proteína de fusão em que a enzima lisossomal humana é unida à cadeia pesada do anticorpo no lado C-terminal da mesma através de um ligante incluindo um ou mais aminoácidos.
  16. 16. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizada pelo fato de que o ligante inclui a sequência de aminoácidos de Gly-Ser.
  17. 17. Formulação liofilizada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizada pelo fato de que a enzima lisossomal é uma enzima lisossomal humana.
  18. 18. Formulação liofilizada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo fato de que a enzima lisossomal é selecionada a partir do grupo que consiste em a-L-iduronidase, iduronato-2-sulfatase, glucocerebrosidase, β-galactosidase, proteína ativadora de GM2, β-hexosaminidase A, β-hexosaminidase B, N-acetilglucosamina-1 -fosfotransferase, a-manosidase, β-manosidase, galactosilceramidase, saposina C, arilsulfatase A, a-L-fucosidase, aspartilglicosaminidase, a-N-acetilgalactosaminidase, esfingomielinase ácida, a-galactosidase, β-glucuronidase, heparano N-sulfatase, a-N-acetilglucosaminidase, acetil-CoA:a-glucosaminida N-acetiltransferase, N-acetilglucosamina-6-sulfatase, ceramidase ácida, amilo-l,6-glucosidase, sialidase, aspartilglicosaminidase, palmitoil proteína tioesterase-1, tripeptidil-peptidase 1, hialuronidase 1, CLN1 e CLN2.
  19. 19. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a enzima lisossomal humana é a iduronato-2-sulfatase humana.
  20. 20. Formulação liofilizada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é um
    Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 82/87
    4 /6 anticorpo humano ou um anticorpo humanizado.
  21. 21. Formulação liofilizada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizada pelo fato de que o anticorpo reconhece uma molécula presente na superfície de uma célula endotelial vascular como um antígeno.
  22. 22. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que as células endoteliais vasculares são células endoteliais vasculares humanas.
  23. 23. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizada pelo fato de que as células endoteliais vasculares são células endoteliais vasculares cerebrais.
  24. 24. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que a molécula presente na superfície da célula endotelial vascular cerebral é selecionada a partir do grupo que consiste em receptor de transferrina (TfR), receptor de insulina, receptor de leptina, receptor de lipoproteína, receptor de IGF, OATP-F, transportador de ânion orgânico, MCT-8 e transportador de monocarboxilato.
  25. 25. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo antirreceptor de transferrina humana (hTfR) humanizado.
  26. 26. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo anti-hTfR humanizado, em que a enzima lisossomal humana é iduronato-2-sulfatase humana, em que a proteína de fusão inclui o anticorpo anti-hTfR humanizado e a iduronato-2-sulfatase humana, e em que a proteína de fusão é selecionada a partir do grupo que consiste em (a) a (c) abaixo;
    (a) a proteína de fusão, em que a cadeia leve do anticorpo anti-hTfR humanizado tem a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:2, e em que a cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR humanizado
    Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 83/87
    5 /6 tendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:8 é unida, no lado C-terminal da mesma, à iduronato-2-sulfatase humana através de uma sequência ligante, (b) a proteína de fusão, em que a cadeia leve do anticorpo anti-hTfR humanizado tem a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:4, e em que a cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR humanizado tendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:9 é unida, no lado C-terminal da mesma, à iduronato-2-sulfatase humana através de uma sequência ligante, (c) a proteína de fusão, em que a cadeia leve do anticorpo anti-hTfR humanizado tem a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:6, e em que a cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR humanizado tendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 10 é unida, no lado C-terminal da mesma, à iduronato-2-sulfatase humana através de uma sequência ligante.
  27. 27. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo anti-hTfR humanizado, em que a enzima lisossomal humana é iduronato-2-sulfatase humana, em que a proteína de fusão inclui o anticorpo anti-hTfR humanizado e a iduronato-2-sulfatase humana, e em que a proteína de fusão é selecionada a partir do grupo que consiste em (a) a (c) abaixo;
    (a) a proteína de fusão, em que a cadeia leve do anticorpo anti-hTfR humanizado tem a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:2, e em que a cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR humanizado é unida, no lado C-terminal da mesma e através de uma sequência ligante de Gly-Ser, à iduronato-2-sulfatase humana, e a cadeia pesada unida inteira tem a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 13, (b) a proteína de fusão, em que a cadeia leve do anticorpo anti-hTfR humanizado tem a sequência de aminoácidos apresentada como
    Petição 870190058812, de 25/06/2019, pág. 84/87
    6 /6
    SEQ ID N0:4, e em que a cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR humanizado é unida, no lado C-terminal da mesma e através de uma sequência ligante de Gly-Ser, à iduronato-2-sulfatase humana, e a cadeia pesada unida inteira tem a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 15, e (c) a proteína de fusão, em que a cadeia leve do anticorpo anti-hTfR humanizado tem a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:6, e em que a cadeia pesada do anticorpo anti-hTfR humanizado é unida, no lado C-terminal da mesma e através de uma sequência ligante de Gly-Ser, à iduronato-2-sulfatase humana, e a cadeia pesada unida inteira tem a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 17.
  28. 28. Formulação liofilizada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizada pelo fato de ser vedada em um recipiente formado de um vidro borossilicato ou uma resina hidrofóbica.
  29. 29. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que o recipiente é formado por um copolímero de ciclo-olefina, um polímero de anel aberto de ciclo-olefina ou um polímero de anel aberto hidrogenado de ciclo-olefina.
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Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5901877B2 (ja) 2007-07-27 2016-04-13 アーメイゲン・テクノロジーズ・インコーポレイテッドＡｒｍａｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． 中枢神経系のα−Ｌ−イデュロニダーゼ活性を増加させるための方法および組成物
CN114409783A (zh) 2015-06-24 2022-04-29 Jcr制药股份有限公司 通过血脑屏障的抗人转铁蛋白受体抗体
CN107849150B (zh) 2015-06-24 2021-12-14 Jcr制药股份有限公司 含有bdnf的融合蛋白
ES2947312T3 (es) 2016-07-01 2023-08-04 Univ Leland Stanford Junior Conjugados para la edición dirigida de la superficie celular
AR110586A1 (es) 2016-12-26 2019-04-10 Japan Chem Res Anticuerpo de receptor antitransferrina humana que penetra la barrera hematoencefálica
CN111278453A (zh) * 2017-09-07 2020-06-12 Jcr制药股份有限公司 水性药物组合物
MA50746A (fr) 2017-10-02 2020-08-12 Denali Therapeutics Inc Protéines de fusion comprenant des enzymes d'enzymothérapie substitutive
MX2020007024A (es) 2018-01-03 2020-10-28 Palleon Pharmaceuticals Inc Sialidasas humanas recombinantes, proteinas de fusion de sialidasa y metodos para usar las mismas.
US11738068B2 (en) 2018-06-25 2023-08-29 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Protein-containing aqueous liquid formulation
MX2021009851A (es) 2019-02-18 2021-09-10 Lilly Co Eli Formulacion de anticuerpos terapeuticos.
PE20231931A1 (es) 2020-10-14 2023-12-01 Denali Therapeutics Inc Proteinas de fusion que comprenden enzimas sulfoglucosamina sulfohidrolasa y metodos de estas
AU2022245592A1 (en) * 2021-03-24 2023-10-19 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Stable aqueous pharmaceutical composition or freeze-dried pharmaceutical composition
CN117279665A (zh) * 2021-05-12 2023-12-22 Jcr制药股份有限公司 黏多糖贮积症i型的治疗用药物组合物
CN114058603B (zh) * 2021-11-26 2023-08-04 武汉瀚海新酶生物科技有限公司 一种鞘磷脂酶的冻干保护剂及制备方法
KR20230134823A (ko) * 2022-03-15 2023-09-22 주식회사 녹십자 α-갈락토시다제 A의 융합단백질을 포함하는 동결 건조 제제

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10163459A1 (de) 2001-12-21 2003-07-03 Merck Patent Gmbh Lyophilisierte Zubereitung enthaltend Antikörper gegen EGF-Rezeptor
AU2004210936C1 (en) 2003-02-11 2010-12-02 Takeda Pharmaceutical Company Limited Diagnosis and treatment of Multiple Sulfatase Deficiency and other using a Formylglycine Generating Enzyme (FGE)
EP1765868B1 (en) * 2004-06-07 2016-04-20 MacroGenics, Inc. Transferrin receptor antibodies
AU2006256041B2 (en) 2005-06-10 2012-03-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Stabilizer for protein preparation comprising meglumine and use thereof
EP1977763A4 (en) 2005-12-28 2010-06-02 Chugai Pharmaceutical Co Ltd STABILIZER PREPARATION CONTAINING ANTIBODIES
US20100158925A1 (en) 2006-06-14 2010-06-24 Meera Agarkhed Lyophilized formulations of anti-egfr antibodies
JP5901877B2 (ja) 2007-07-27 2016-04-13 アーメイゲン・テクノロジーズ・インコーポレイテッドＡｒｍａｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． 中枢神経系のα−Ｌ−イデュロニダーゼ活性を増加させるための方法および組成物
NZ709704A (en) 2007-11-30 2017-03-31 Abbvie Biotechnology Ltd Protein formulations and methods of making same
WO2010027766A1 (en) 2008-08-27 2010-03-11 Schering Corporation Lyophilized formulatons of engineered anti-il-23p19 antibodies
CN102271707B (zh) * 2008-10-29 2015-04-08 阿布林克斯公司 单域抗原结合性分子的制剂
JP5873003B2 (ja) 2009-03-18 2016-03-01 アーメイゲン・テクノロジーズ・インコーポレイテッドＡｒｍａｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． ＩｇＧデコイ受容体融合タンパク質の血液脳関門送達のための組成物および方法
RU2549986C2 (ru) 2009-09-15 2015-05-10 Канека Корпорейшн Модифицированный эритропоэтин, к которому присоединена водорастворимая длинноцепочечная молекула
IL291556B2 (en) * 2010-06-25 2024-02-01 Shire Human Genetic Therapies Methods and compositions for administration of arylsulfatase A to the central nervous system
RU2012154576A (ru) 2010-06-25 2014-07-27 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. Способы и композиции для доставки к цнс гепаран-n-сульфатазы
RU2660348C2 (ru) 2010-06-25 2018-07-05 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. Способы и композиции для доставки в цнс идуронат-2-сульфатазы
SG11201405475UA (en) 2012-03-07 2014-10-30 Cadila Healthcare Ltd Pharmaceutical formulations of tnf-alpha antibodies
RS57259B1 (sr) * 2012-12-24 2018-08-31 Abbvie Inc Prolaktin receptor vezujući proteini i njihova upotreba
TWI679019B (zh) 2013-04-29 2019-12-11 法商賽諾菲公司 抗ｉｌ－４／抗ｉｌ－１３之雙特異性抗體調配物
WO2015009961A1 (en) 2013-07-19 2015-01-22 Armagen Technologies, Inc. Compositions and methods related to structures that cross the blood brain barrier
US9994641B2 (en) * 2013-12-25 2018-06-12 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Anti-human transferrin receptor antibody that passes through blood-brain barrier
TW201623331A (zh) 2014-03-12 2016-07-01 普羅帝納生物科學公司 抗黑色素瘤細胞黏著分子（ｍｃａｍ）抗體類及使用彼等之相關方法
CN107849150B (zh) 2015-06-24 2021-12-14 Jcr制药股份有限公司 含有bdnf的融合蛋白
CN114409783A (zh) 2015-06-24 2022-04-29 Jcr制药股份有限公司 通过血脑屏障的抗人转铁蛋白受体抗体
AU2017222620B2 (en) 2016-02-24 2022-06-16 Biomarin Pharmaceutical Inc. Targeted therapeutic lysosomal enzyme fusion proteins, associated formulations and uses thereof

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