ES2947312T3 - Conjugados para la edición dirigida de la superficie celular - Google Patents

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Elliot C Woods
Han Xiao
Carolyn R Bertozzi
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Abstract

Se proporcionan conjugados que incluyen un resto de direccionamiento que se une a una molécula de la superficie celular de una célula diana y una enzima de edición de la superficie de la célula diana. También se proporcionan composiciones y kits que incluyen los conjugados, así como métodos para usar los conjugados. También se proporcionan métodos para hacer conjugados. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados para la edición dirigida de la superficie celular
INTRODUCCIÓN
Las terapias que mejoran la respuesta inmunitaria al cáncer están demostrando ser revolucionarias en la lucha contra los tumores intratables. Las células inmunitarias integran las señales de los receptores activadores e inhibidores para determinar su respuesta a una diana compleja: las señales activadoras les alertan de la presencia de una patología, mientras que las señales inhibidoras indican a la célula que se ha enfrentado a un "yo" saludable. Los tumores exitosos desarrollan mecanismos para frustrar el reconocimiento de las células inmunitarias, a menudo mediante la sobreexpresión de ligandos para receptores inhibidores. Este descubrimiento ha dado lugar a nuevas estrategias terapéuticas destinadas a bloquear la señalización inhibitoria de las células inmunitarias, como los inhibidores de los puntos de control de linfocitos T dirigidos a PD-1 y CTLA-4 clínicamente aprobados. Los estudios preclínicos en curso se han centrado en combinar terapias dirigidas a múltiples vías inmunitarias. Por ejemplo, los anticuerpos contra PD-1/PD-L1 en combinación con los que se dirigen a otros inhibidores de los puntos de control de linfocitos T demuestran una actividad antitumoral mejorada en modelos de tumores singénicos. Un complemento de estas intervenciones son las terapias dirigidas a las células inmunitarias innatas, en particular linfocitos citolíticos naturales (células NK), macrófagos y células dendríticas.
Tseng et al. (2007, Enzyme and Microbial Technology 41, 5-12) describe la adición de una sialidasa, Nanl, a células cancerosas NIH:OVCAR-3 en cultivo celular y señaló que el tratamiento con Nanl dio como resultado la hidrólisis de ácidos siálicos terminales de glucoconjugados en la superficie de las células cancerosas. Los autores postularon que dicho tratamiento puede utilizarse para tratar cánceres.
Sumario
La presente invención se define en las reivindicaciones y proporciona un conjugado adecuado para su uso en el tratamiento del cáncer, comprendiendo el conjugado una sialidasa y un anticuerpo que se une a una molécula de la superficie celular de una célula cancerosa, en donde la sialidasa se conjuga con el anticuerpo a través de un enlazador y, cuando se conjuga, la sialidasa es capaz de escindir un sialoglucano en la superficie de la célula cancerosa. También se proporcionan métodos para producir el conjugado de la invención, que comprenden conjugar una sialidasa con un anticuerpo que se une a una molécula de la superficie celular en la superficie de una célula cancerosa, en donde la sialidasa se conjuga con el anticuerpo a través de un enlazador y, cuando se conjuga, la sialidasa es capaz de escindir un sialoglucano en la superficie de la célula cancerosa. También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican conjugados de proteína de fusión de la invención y vectores de expresión y células hospedadoras correspondientes. También se proporciona un conjugado de la invención para su uso en un método para tratar el cáncer.
Breve descripción de las figuras
En la figura 1 se ilustra de manera esquemática una estrategia de evasión inmunitaria y un método para reducir dicha evasión inmunitaria de acuerdo con un ejemplo de la presente divulgación.
En la figura 2 se describe la preparación de conjugados de anticuerpo y sialidasa, y su análisis electroforético y de ESI-MS.
En la figura 3 se representa el análisis electroforético de sialidasas, actividades de hidrólisis, y citometría de flujo y análisis de imágenes de sus actividades
En la figura 4 se representan los niveles de sialilación de la superficie celular y los niveles de ligando de varios receptores con o sin tratamiento con sialidasa en diferentes estirpes celulares de cáncer de mama.
En la figura 5 se representa la citotoxicidad de células NK de sangre periférica aisladas en ausencia o presencia de sialidasa.
En la figura 6 se representan varios ensayos utilizados para la caracterización de la sialidasa de V. cholerae de tipo silvestre e inactivada por calor.
En la figura 7 se representan los espectros ESI-MS para la sialidasa de Vibrio cholerae, la sialidasa de Salmonella typhimurium, la IgG anti-Her2 y sus conjugados.
En la figura 8 se representan las actividades hidrolíticas de la sialidasa de V. cholerae y de IgG anti-Her2-Sia. También se representan las actividades hidrolíticas de la sialidasa de S. typhimurium y de IgG anti-Her2-StSia. En la figura 9 se representan imágenes que muestran el nivel de ácido siálico de la superficie celular en varias estirpes celulares con o sin tratamiento con el conjugado de trastuzumab y sialidasa. También se muestran datos de citometría de flujo que comparan la eliminación del ácido siálico de la superficie celular mediante dos conjugados de trastuzumab y sialidasa en varias estirpes celulares.
En la figura 10 se representan imágenes que muestran ligandos de Sambucus nigra en varias estirpes celulares en ausencia o presencia del conjugado IgG anti-Her2-Sia.
En la figura 11 se representa la citotoxicidad de células NK de sangre periférica aisladas en presencia de IgG anti-Her2 o IgG anti-Her2-Sia.
En la figura 12 se representa la actividad de trastuzumab y del conjugado de trastuzumab y sialidasa contra células cancerosas que expresan HER-2.
En la figura 13 se representan los niveles de expresión de Siglec y la citotoxicidad de poblaciones de monocitos aislados y de macrófagos diferenciados en presencia de sialidasa, trastuzumab y conjugados de trastuzumab y sialidasa contra células cancerosas que expresan HER2+.
En la figura 14 se representa la citotoxicidad de los linfocitos T y§ aislados en presencia de sialidasa, trastuzumab o conjugado de trastuzumab y sialidasa contra células cancerosas que expresan HER2+.
En la figura 15 se representa la citotoxicidad de las células NK de sangre periférica con IgG anti-Her2 o una mezcla de IgG anti-Her2 y sialidasa en ausencia o presencia de anticuerpos bloqueantes como se especifica. En la figura 16 se muestran datos de citometría de flujo mediante el análisis de marcadores CD56 y CD3 en leucocitos.
En la figura 17 se representan datos que demuestran que el tratamiento con sialidasa potencia la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) inducida por rituximab.
En la figura 18 se representan datos que muestran que las células Ramos tienen niveles más elevados de ligandos de Siglec-9 que las células Daudi.
En la figura 19 se representan datos que demuestran que la sialidasa potencia el rituximab de una manera dependiente del complemento.
Descripción detallada
La presente invención se define en las reivindicaciones y proporciona un conjugado adecuado para su uso en el tratamiento del cáncer, comprendiendo el conjugado una sialidasa y un anticuerpo que se une a una molécula de la superficie celular de una célula cancerosa, en donde la sialidasa se conjuga con el anticuerpo a través de un enlazador y, cuando se conjuga, la sialidasa es capaz de escindir un sialoglucano en la superficie de la célula cancerosa. También se proporcionan métodos para producir el conjugado de la invención, que comprenden conjugar una sialidasa con un anticuerpo que se une a una molécula de la superficie celular en la superficie de una célula cancerosa, en donde la sialidasa se conjuga con el anticuerpo a través de un enlazador y, cuando se conjuga, la sialidasa es capaz de escindir un sialoglucano en la superficie de la célula cancerosa. También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican conjugados de proteína de fusión de la invención y vectores de expresión y células hospedadoras correspondientes. También se proporciona un conjugado de la invención para su uso en un método para tratar el cáncer.
La divulgación técnica que se establece a continuación puede, en algunos aspectos, ir más allá del alcance de la invención, que se define por las reivindicaciones adjuntas. Los elementos de la divulgación que no entran en el alcance de las reivindicaciones se proporcionan a título informativo, es decir, para situar la invención real reivindicada en un contexto técnico más amplio.
Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, al décimo de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor declarado o intermedio en el intervalo indicado, está incluido en los conjugados, composiciones y métodos. Pueden incluirse independientemente los límites superiores e inferiores de estos intervalos más pequeños y también se encuentran incluidos en los conjugados, composiciones y métodos, sujetos a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, también se incluyen en los conjugados, composiciones y métodos los intervalos que excluyan uno cualquiera o ambos de los límites incluidos.
En el presente documento se presentan determinados intervalos con valores numéricos que están antecedidos por el término "aproximadamente". En el presente documento, el término "aproximadamente" se usa para proporcionar una ayuda literal al número exacto al que antecede, así como un número que es próximo a o aproximadamente el número que precede al término. En la determinación de si un número es próximo a o aproximadamente un número citado específicamente, el número no citado próximo o aproximado puede ser un número que, en el contexto en el que se presenta, proporciona el equivalente sustancial del número citado específicamente.
Salvo que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto habitual en la materia a la que pertenecen los conjugados, composiciones y métodos. Aunque cualquier conjugado, composición y método similares o equivalentes a los descritos en el presente documento también se pueden utilizar en la práctica o prueba de los conjugados, composiciones y métodos, a continuación se describen conjugados, composiciones y métodos ilustrativos representativos.
La cita de cualquier publicación es para su divulgación antes de la fecha de presentación y no debe interpretarse como una admisión de que los presentes conjugados, composiciones y os métodos no tienen derecho a ser anteriores a dicha publicación, ya que la fecha de publicación proporcionada puede ser diferentes de la fecha de publicación real, que puede necesitar confirmación independiente.
Se resalta que, tal como se utiliza en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "uno(a)", "el" y "la" incluyen los referentes en plural salvo que el contexto indique claramente otra cosa.
Se observa además que las reivindicaciones pueden redactarse para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, esta declaración está destinada a servir como base antecedente para la utilización de dicha terminología exclusiva como "únicamente", "sólo" y similares en relación con la exposición de elementos de reivindicación, o la utilización de una limitación "negativa".
Se aprecia que determinadas características de los conjugados, composiciones y métodos, que son, para mayor claridad, descritas en el contexto de realizaciones separadas, también pueden proporcionarse combinadas en una única realización. Por el contrario, diversas características de los conjugados, composiciones y métodos, que son, en aras de la brevedad, descritas en el contexto de una única realización, también se pueden proporcionar por separado o en cualquier subcombinación adecuada. Todas las combinaciones de las realizaciones están específicamente abarcadas por la presente divulgación y se divulgan en el presente documento como si todas y cada una de las combinaciones se divulgaran individual y explícitamente, en la medida en que dichas combinaciones abarcan procesos y/o composiciones operables. Además, todas las subcombinaciones enumeradas en las realizaciones que describen dichas variables también están específicamente abarcadas por los presentes conjugados, composiciones y métodos, y se divulgan en el presente documento como si todas y cada una de dichas subcombinaciones se divulgaran individual y explícitamente en el presente documento.
Cualquier método citado puede llevarse a cabo en el orden de los eventos citados o en cualquier otro orden que sea posible de manera lógica.
CONJUGADOS
Como se resume anteriormente, la presente divulgación se refiere a conjugados. Los conjugados de la invención incluyen un anticuerpo que se une a una molécula de la superficie celular de una célula diana, y una sialidasa, en donde la sialidasa se conjuga con el anticuerpo a través de un enlazador y, cuando se conjuga, la sialidasa es capaz de escindir un sialoglucano en la superficie de la célula cancerosa.
Fracciones dirigidas
Los conjugados de la presente invención incluyen una fracción dirigida a anticuerpos.
La fracción dirigida se une específicamente a la molécula de la superficie celular de una célula cancerosa. Como se utiliza en el presente documento, una fracción dirigida que "se une específicamente a la molécula de la superficie celular" o es "específica para la molécula de la superficie celular" se refiere a una fracción dirigida que se une a la molécula de la superficie celular con mayor afinidad que a otras moléculas de la superficie celular. La fracción dirigida puede presentar una afinidad de unión a la molécula de la superficie celular de una Kd inferior o igual a aproximadamente 10-5 M, inferior o igual a aproximadamente 10-6 M, o inferior o igual a aproximadamente 10-7 M, o inferior o igual a aproximadamente 10-8 M, o inferior o igual a aproximadamente 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, o 10-12 M o inferior. Dichas afinidades pueden determinarse fácilmente mediante técnicas convencionales, tales como mediante diálisis de equilibrio, tecnología de resonancia de plasmón superficial (SPR, del inglés surface plasmon resonance) (por ejemplo, el instrumento BIAcore 2000, utilizando los procedimientos generales descritos por el fabricante), radioinmunoensayo o mediante otro método.
De acuerdo con la invención, la fracción dirigida es un anticuerpo. Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" incluyen anticuerpos o inmunoglobulinas de cualquier isotipo (por ejemplo, IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), IgE, IgD, IgA, IgM, etc.), anticuerpos completos (por ejemplo, anticuerpos compuestos por un tetrámero que a su vez está compuesto por dos dímeros de un polipéptido de cadena ligera y pesada); anticuerpos monocatenarios; fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, fragmentos de anticuerpos de cadena completa o sencilla) que mantienen la unión específica a la molécula de la superficie celular de la célula diana, que incluyen, pero sin limitación, Fv monocatenario (scFv), Fab, (Fab')2 , (scFv')2 y diacuerpos; anticuerpos quiméricos; anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados (por ejemplo, anticuerpos completos humanizados, semianticuerpos humanizados o fragmentos de anticuerpos humanizados); y proteínas de fusión que comprenden una porción de unión a antígeno de un anticuerpo y una proteína que no es de anticuerpo. Los anticuerpos pueden marcarse de manera detectable, por ejemplo, con un agente de obtención imágenes in vivo, con un radioisótopo, con una enzima que genera un producto detectable, con una proteína fluorescente y similares. Adicionalmente, los anticuerpos pueden conjugarse con otras fracciones, tales como con miembros de pares de unión específicos, por ejemplo, biotina (miembro del par de unión específico de biotina-avidina), y similares.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo terapéutico incluso en ausencia de la enzima de edición de la superficie celular diana, por ejemplo, un anticuerpo que tiene eficacia por sí mismo en el tratamiento del cáncer (por ejemplo, mediante citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y/u otro mecanismo). Por ejemplo, el anticuerpo puede ser un anticuerpo terapéutico que se une específicamente a una molécula de la superficie celular asociada a un tumor o a una molécula de superficie celular específica de un tumor.
Los ejemplos no limitantes de anticuerpos que se unen específicamente a una molécula de la superficie celular asociada a un tumor o a una molécula de la superficie celular específica de un tumor que pueden emplearse en un conjugado de la presente invención incluyen adecatumumab, ascrinvacumab, cixutumumab, conatumumab, daratumumab, drozitumab, duligotumab, durvalumab, dusigitumab, enfortumab, enoticumab, figitumumab, ganitumab, glembatumumab, intetumumab, ipilimumab, iratumumab, icrucumab, lexatumumab, lucatumumab, mapatumumab, narnatumab, necitumumab, nesvacumab, ofatumumab, olaratumab, panitumumab, patritumab, pritumumab, radretumab, ramucirumab, rilotumumab, robatumumab, seribantumab, tarextumab, teprotumumab, tovetumab, vantictumab, vesencumab, votumumab, zalutumumab, flanvotumab, altumomab, anatumomab, arcitumomab, bectumomab, blinatumomab, detumomab, ibritumomab, minretumomab, mitumomab, moxetumomab, naptumomab, nofetumomab, pemtumomab, pintumomab, racotumomab, satumomab, solitomab, taplitumomab, tenatumomab, tositumomab, tremelimumab, abagovomab, igovomab, oregovomab, capromab, edrecolomab, nacolomab, amatuximab, bavituximab, brentuximab, cetuximab, derlotuximab, dinutuximab, ensituximab, futuximab, girentuximab, indatuximab, isatuximab, margetuximab, rituximab, siltuximab, ublituximab, ecromeximab, abituzumab, alemtuzumab, bevacizumab, bivatuzumab, brontictuzumab, cantuzumab, cantuzumab, citatuzumab, clivatuzumab, dacetuzumab, demcizumab, dalotuzumab, denintuzumab, elotuzumab, emactuzumab, emibetuzumab, enoblituzumab, etaracizumab, farletuzumab, ficlatuzumab, gemtuzumab, imgatuzumab, inotuzumab, labetuzumab, lifastuzumab, lintuzumab, lorvotuzumab, lumretuzumab, matuzumab, milatuzumab, nimotuzumab, obinutuzumab, ocaratuzumab, otlertuzumab, onartuzumab, oportuzumab, parsatuzumab, pertuzumab, pinatuzumab, polatuzumab, sibrotuzumab, simtuzumab, tacatuzumab, tigatuzumab, trastuzumab, tucotuzumab, vandortuzumab, vanucizumab, veltuzumab, vorsetuzumab, sofituzumab, catumaxomab, ertumaxomab, depatuxizumab, ontuxizumab, blontuvetmab, tamtuvetmab o una variante de unión a antígeno de los mismos. Como se utiliza en el presente documento, "variante" significa que el anticuerpo se une al antígeno particular (por ejemplo, HER2 para trastuzumab) pero tiene menos o más aminoácidos que el anticuerpo original, tiene una o más sustituciones de aminoácidos con respecto al anticuerpo original, o una combinación de los mismos.
La fracción dirigida puede ser un anticuerpo terapéutico expuesto en la tabla 1 a continuación aprobado para tratar el cáncer o una variante del mismo que se une a antígenos. En la tabla 1 también se proporciona la molécula de la superficie celular asociada al tumor correspondiente o la molécula de la superficie celular específica del tumor a la que se une específicamente el anticuerpo terapéutico, así como el tipo de cáncer para el cual el anticuerpo está aprobado para el tratamiento.
T l 1 - Ani r r r l r mi n l n r
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Las abreviaturas de la tabla 1 son las siguientes: LLA, leucemia linfoblástica aguda; LMA, leucemia mielógena aguda; BCR-ABL, tirosina cinasa de Abelson de la región del grupo de punto de ruptura; LLC, leucemia linfocítica crónica; CTLA-4, antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos; c Cr , cáncer colorrectal; EGFR, receptor del factor de crecimiento epidérmico; EpCAM, molécula de adhesión de células epiteliales; HER2, receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano; LNH, linfoma no hodgkiniano; CNMP, carcinoma no microcítico de pulmón; PAP, fosfatasa ácida prostática; PD-1, receptor 1 de muerte celular programada; ACR, adenocarcinoma renal; VEGF, factor de crecimiento endotelial vascular; VEGF-R2, receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular.
La fracción dirigida puede ser un anticuerpo terapéutico expuesto en la tabla 2 a continuación o una variante de unión a antígeno del mismo. En la tabla 2 también se proporciona la molécula de la superficie celular asociada al tumor correspondiente o la molécula de la superficie celular específica del tumor a la que se une específicamente el anticuerpo terapéutico, así como un tipo de cáncer ilustrativo que puede tratarse con un conjugado que incluye el anticuerpo.
T l 2 - Ani r ii nl ml l l rfii l l r i n r
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continuación
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Las abreviaturas de la tabla 2 son las siguientes: A2aR, receptor de adenosina A2a; AKAP4, Una proteína 4 de anclaje de la cinasa A; LMA, leucemia mielógena aguda; LLA, leucemia linfoblástica aguda; BAGE, antígeno de melanoma B; BORIS, hermano del regulador de sitios impresos; ACE, antígeno carcinoembrionario; LLC, leucemia linfocítica crónica; CCR, cáncer colorrectal; CS1, subconjunto 1 de CD2; CTLA-4, antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos; EBAG9, antígeno 9 asociado al sitio de unión del receptor de estrógeno; EGF, factor de crecimiento epidérmico; EGFR, receptor del factor de crecimiento epidérmico; CNMP, carcinoma no microcítico de pulmón; GAGE, antígeno G; GD2, disialogangliósido GD2; gp100, glucoproteína 100; HPV-16, virus del papiloma humano 16; HSP105, proteína 105 de choque térmico; IDH1, isocitrato deshidrogenasa de tipo 1; IDO1, indolamina-2,3-dioxigenasa 1; KIR, receptor de tipo inmunoglobulina de linfocitos citolíticos; LAG-3, gen 3 de activación de linfocitos; LY6K, antígeno linfocitario 6 complejo K; MAGE-A3, antígeno de melanoma 3; MAGE-C2, antígeno de melanoma C2; MAGE-D4, antígeno de melanoma D4; Melan-NMART-1, antígeno de melanoma reconocido por linfocitos T 1; MET, gen transformante de osteosarcoma humano de N-metil-N'-nitroso-guanidina; MUC1, mucina 1; MUC4, mucina 4; MUC16, mucina 16; LNH, linfoma no hodgkiniano; NY-ESO-1, carcinoma escamocelular esofágico 1 de Nueva York; PD-1, receptor 1 de muerte celular programada; PD-L1, ligando 1 del receptor de muerte celular programada; PRAME, antígeno expresado preferentemente de melanoma; PSA, antígeno específico de la próstata; ACR, adenocarcinoma renal; ROR1, receptor huérfano 1 de tirosina cinasa del receptor; CCECC, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello; SPAG-9, antígeno 9 asociado a espermatozoides; SSX1, punto de ruptura 1 del cromosoma X del sarcoma sinovial; TIM-3, dominio de inmunoglobulina de linfocitos T y dominio de mucina 3; VISTA, supresor de la activación de linfocitos T que contiene inmunoglobulina de dominio V; WT1, Tumor de Wilms-1; XAGE-1b, Antígeno 1b del cromosoma X.
La fracción dirigida puede ser un anticuerpo terapéutico expuesto en la tabla 3 a continuación o una variante de unión a antígeno del mismo. En la tabla 3 también se proporciona la molécula de la superficie celular asociada al tumor correspondiente o la molécula de la superficie celular específica del tumor a la que se une específicamente el anticuerpo terapéutico.
Tabla 3 pondientes
A ti M lé l d l fi i l l
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continuación
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Un conjugado de la presente invención puede incluir un anticuerpo terapéutico como la fracción dirigida seleccionado de trastuzumab, cetuximab, daratumumab, girentuximab, panitumumab, ofatumumab, rituximab y variantes de unión a antígeno de los mismos.
Un conjugado de la presente invención puede incluir un anticuerpo terapéutico como la fracción dirigida, y el anticuerpo terapéutico es trastuzumab o una variante del mismo que se une a HER2. Las secuencias de aminoácidos de cadena ligera y pesada de trastuzumab son conocidas y se proporcionan en la tabla 4 a continuación.
T l 4 - n i min i n li r r z m
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Cuando la fracción dirigida es un anticuerpo, la enzima de edición de la superficie celular diana puede conjugarse con cualquier región adecuada del anticuerpo. La fracción dirigida puede ser un anticuerpo que tiene un polipéptido de cadena ligera, y la enzima de edición de la superficie celular diana está conjugada con la cadena ligera, por ejemplo, en el extremo C o en una región interna de la cadena ligera. De acuerdo con determinadas realizaciones, la fracción dirigida es un anticuerpo que tiene un polipéptido de cadena pesada, y la enzima de edición de la superficie celular diana está conjugada con la cadena pesada, por ejemplo, en el extremo C o en una región interna de la cadena pesada. Si el anticuerpo que tiene una cadena pesada incluye una región de fragmento cristalizable (Fc, del inglés fragment crystallizable), la enzima de edición de la superficie celular diana puede conjugarse con la región Fc, por ejemplo, en el extremo C o en una región interna de la región Fc.
Enzimas de edición de la superficie celular diana
Como se resume anteriormente, los conjugados de la presente invención incluyen una enzima de edición de la superficie celular diana, que es una sialidasa. Como se utiliza en el presente documento, una "enzima de edición de la superficie celular diana" es una enzima que, tras la unión de la fracción dirigida a la molécula de la superficie celular correspondiente de la célula diana, produce un cambio estructural en una o más moléculas en la superficie de la célula diana. El cambio estructural puede ser en la molécula de la superficie celular a la que se une la fracción dirigida. El cambio estructural puede ser en una molécula en la superficie de la célula diana distinta de la molécula de la superficie celular a la que se une la fracción dirigida.
La enzima de edición de la superficie celular diana puede ser una enzima de tipo silvestre (es decir, una enzima que se encuentra en la naturaleza). Como alternativa, la enzima no es una enzima de tipo silvestre. Por ejemplo, la enzima de edición de la superficie celular diana puede ser un derivado no natural de una enzima de tipo silvestre. Dichos derivados mantienen, al menos parcialmente, la actividad enzimática de la correspondiente enzima de tipo silvestre. Los derivados de enzimas que pueden emplearse incluyen aquellos que tienen menos aminoácidos o más aminoácidos que la enzima de tipo silvestre correspondiente. Como alternativa, o adicionalmente, los derivados de enzimas pueden incluir una o más sustituciones de aminoácidos o modificaciones de aminoácidos con respecto a la enzima de tipo silvestre correspondiente.
Un ejemplo de un cambio estructural producido por una enzima de edición de la superficie celular diana en una molécula en la superficie de la célula diana es la escisión de la molécula. La molécula escindida por la enzima de edición de la superficie celular diana es un polímero. El polímero escindido por la enzima de edición de la superficie celular diana es un polisacárido (o "glucano"), es decir, una molécula que contiene monosacáridos enlazados glucosídicamente. La enzima de edición de la superficie de la célula diana es una glucósido hidrolasa, específicamente una sialidasa.
La enzima de edición de la superficie celular escinde (por ejemplo, hidroliza) un resto terminal de una molécula (por ejemplo, un polímero) en la superficie de la célula diana. El resto terminal es un resto de ácido siálico terminal. La enzima de edición de la superficie celular es una sialidasa (o un derivado de la misma como se describió anteriormente), que escinde los enlaces glucosídicos de los ácidos siálicos (neuramínicos), liberando restos de ácido siálico terminal de oligosacáridos, polisacáridos, glucoproteínas, glucolípidos y otros sustratos.
Las sialidasas que pueden emplearse en los conjugados de la invención incluyen, pero sin limitación, sialidasas procariotas y sialidasas eucariotas. Las sialidasas procariotas que pueden emplearse incluyen sialidasas bacterianas. Un ejemplo de una sialidasa bacteriana que encuentra uso en los conjugados de la presente divulgación es la sialidasa de Salmonella typhimurium (por ejemplo, UniProtκΒ - P29768). Otro ejemplo de una sialidasa bacteriana que encuentra uso en los conjugados de la presente divulgación es la sialidasa de Vibrio cólera (por ejemplo, UniProtκΒ - P0C6E9). Las sialidasas eucariotas que pueden emplearse incluyen, por ejemplo, sialidasas de mamíferos y sialidasas eucariotas de no mamíferos. Las sialidasas de mamíferos (o neuraminidasas de mamíferos) de interés incluyen las de primates, por ejemplo, neuraminidasas humanas o no humanas. En determinados aspectos, la sialidasa es una sialidasa humana. De acuerdo con determinadas realizaciones, la sialidasa humana se selecciona de neuraminidasa 1 humana (por ejemplo, UniProtκΒ - Q99519), neuraminidasa 2 humana (por ejemplo, UniProtκΒ - Q9Y3R4), neuraminidasa 3 humana (por ejemplo, UniProtκΒ - Q9UQ49) y neuraminidasa 4 humana (por ejemplo, UniProtκΒ - Q8WWR8). Se entenderá que la sialidasa puede ser un derivado de cualquiera de las sialidasas de tipo silvestre anteriores, tales como derivados truncados, derivados que incluyen más aminoácidos que la correspondiente sialidasa de tipo silvestre, derivados que incluyen una o más sustituciones de aminoácidos (por ejemplo, una o más sustituciones conservadora, una o más sustituciones no conservadoras, una sustitución de un aminoácido natural por un aminoácido no natural y/o similares), etc. Los derivados conservan al menos una parte de la actividad de glucósido hidrolasa de la sialidasa de tipo silvestre original.
T l - n i min i i li il r iv
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continuación
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La enzima de edición de la superficie celular diana puede escindir todo o una parte de un ligando en la superficie de la célula diana. El ligando puede ser un ligando de receptores inmunitarios. Los ligandos de receptores inmunitarios de interés incluyen, pero sin limitación, ligandos de receptores inmunitarios inhibidores. La enzima de edición de la superficie celular diana puede escindir un ligando de un receptor inmunitario inhibidor, donde el receptor inmunitario inhibidor está presente en una célula seleccionada de un linfocito citolítico natural (NK), un macrófago, un monocito, un neutrófilo, una célula dendrítica, un linfocito T, un linfocito B, un mastocito, un basófilo y un eosinófilo. A modo de ejemplo, el ligando en la superficie de la célula diana editado por la enzima de edición de la superficie celular diana puede ser un ligando para un receptor de lectina de tipo Ig que se une al ácido siálico (Siglec), por ejemplo, Siglec 7, Siglec 9 y/o similares. El ligando es un sialoglucano.
Células diana
La fracción dirigida y la enzima de edición de la superficie celular diana se seleccionan en función de la célula a la que se dirige. De acuerdo con la invención, la célula diana es una célula cancerosa.
Por "célula cancerosa" se entiende una célula que presenta un fenotipo celular neoplásico, que puede caracterizarse por uno o más de, por ejemplo, crecimiento celular anormal, proliferación celular anormal, pérdida de la inhibición del crecimiento dependiente de la densidad, potencial de crecimiento independiente del anclaje, capacidad para promover el crecimiento y/o desarrollo tumoral en un modelo animal no humano inmunodeprimido, y/o cualquier indicador adecuado de transformación celular. "Célula cancerosa" puede utilizarse indistintamente en este documento con "célula tumoral" o "célula maligna" y abarca las células cancerosas de un tumor sólido, un tumor semisólido, un tumor primario, un tumor metastásico y similares. En determinados aspectos, la célula cancerosa es una célula de carcinoma. De acuerdo con determinadas realizaciones, la célula cancerosa se selecciona de una célula de cáncer de mama, una célula de cáncer de ovario, una célula de cáncer gástrico y una célula de cáncer de colon. La célula cancerosa puede seleccionarse de cualquiera de los tipos de cáncer expuestos en las tablas 1 y 2 anteriores.
La molécula en la superficie de la célula cancerosa a la que se une la fracción dirigida puede ser una molécula de la superficie celular asociada a un tumor o una molécula de la superficie celular específica de tumor. Por "molécula de la superficie celular asociada a un tumor" se entiende una molécula de la superficie celular expresada en células malignas con expresión limitada en células de tejidos normales, una molécula de la superficie celular expresada a una densidad mucho mayor en células malignas que en células normales o una molécula de la superficie celular que se expresa durante el desarrollo.
La célula cancerosa puede expresar una molécula de la superficie celular asociada a un tumor o una molécula de la superficie celular específica de tumor a la que se une la fracción dirigida. La molécula de la superficie celular se puede seleccionar de HER2, CD19, CD22, CD30, CD33, CD56, CD66/CEACAM5, CD70, CD74, CD79b, CD138, nectina-4, mesotelina, glucoproteína transmembrana NMB (GPNMB), antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), SLC44A4, Ca 6, Ca -IX, una integrina, receptor de quimiocinas C-X-C de tipo 4 (CXCR4), proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4), neuropilina-1 (NRP1), matriptasa, cualquier molécula de la superficie celular expuesta en las tablas 1, 2 y 3 anteriores, y cualquier otra molécula de la superficie celular asociada a tumor o específica de tumor de interés.
Métodos para hacer conjugados
También se proporcionan métodos para preparar los conjugados de la invención.
En los casos en los que se desee producir la fracción dirigida y/o la enzima de edición de la superficie celular diana (por ejemplo, porque una fracción dirigida y/o enzima de edición de la superficie celular diana en particular no está disponible comercialmente), los métodos pueden incluir la producción de uno o ambos de la fracción dirigida y la enzima de edición de la superficie celular diana.
Cuando un componente del conjugado deseado (es decir, la fracción dirigida o la enzima de edición de la superficie celular diana) es un péptido o polipéptido, se pueden utilizar métodos recombinantes para producir el componente. Por ejemplo, un ADN que codifica un componente del conjugado deseado se puede insertar en un vector de expresión. El ADN que codifica el componente se puede unir operativamente a una o más secuencias de control en el vector de expresión que aseguran la expresión del componente. Las secuencias de control de expresión incluyen, pero sin limitación, promotores (por ejemplo, promotores asociados de manera natural o heterólogos), secuencias señalizadoras, elementos potenciadores y secuencias de terminación de la transcripción. Las secuencias de control de la expresión pueden ser sistemas promotores en vectores capaces de transformar o transfectar células hospedadoras procariotas o eucariotas. Una vez que el vector se ha incorporado al hospedador apropiado, el hospedador se mantiene en condiciones adecuadas para un nivel elevado de expresión de las secuencias de nucleótidos, y la recogida y purificación del componente.
Cuando un componente del conjugado deseado (es decir, la fracción dirigida o la enzima de edición de la superficie celular diana) es un péptido o polipéptido, el componente se puede producir mediante una técnica de síntesis química de péptidos. Cuando un polipéptido se sintetiza químicamente, la síntesis puede realizarse en fase líquida o en fase sólida. La síntesis de polipéptidos en fase sólida (SPPS, del inglés Solid phase polypeptide synthesis), en la que el aminoácido carboxiterminal de la secuencia se une a un soporte insoluble seguido de la adición secuencial de los aminoácidos restantes en la secuencia, es un ejemplo de un método adecuado para la síntesis química de un componente del conjugado deseado. Diversas formas de SPPS, tales como Fmoc y Boc, están disponibles para sintetizar el componente. En resumen, pequeñas perlas insolubles y porosas pueden tratarse con unidades funcionales sobre las que se construyen las cadenas peptídicas. Después de ciclos repetidos de acoplamiento/desprotección, la amina aminoterminal libre de una fase sólida conectada se acopla a una sola unidad de aminoácidos protegida con N. Después, esta unidad se desprotege, revelando una nueva amina aminoterminal a la que se puede conectar un aminoácido adicional. El péptido permanece inmovilizado en la fase sólida y se somete a un proceso de filtración antes de separarse.
Una vez sintetizados (ya sea por medios químicos o recombinantes), el componente se puede purificar de acuerdo con procedimientos convencionales de la materia, incluida la precipitación con sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía en columna, purificación por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), electroforesis en gel y similares.
Una vez que se obtienen la fracción dirigida y la enzima de edición de la superficie celular diana, hay disponibles una variedad de estrategias de conjugación, y se puede seleccionar un método particular en función de la naturaleza/tipo de la fracción dirigida y la enzima de edición de la superficie celular diana en el conjugado deseado (por ejemplo, en función de los grupos funcionales reactivos disponibles o proporcionados en la fracción dirigida y la enzima de edición de la superficie celular diana). Las estrategias de bioconjugación que encuentran uso en la asociación estable de una fracción dirigida y una enzima de edición de la superficie celular diana para producir un conjugado de la presente divulgación incluyen las descritas en Hermanson, "Bioconjugate Techniques", Academic Press, 2.a Edición, 1 de abril de 2008, Haugland, 1995, Methods Mol. Biol. 45:205-2l; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chemistry 3:2, y en otros lugares.
La fracción dirigida y la enzima de edición de la superficie celular diana se conjugan entre sí a través de un enlazador. Puede emplearse cualquier enlazador(es) adecuado(s). Los enlazadores que encuentran uso en los conjugados de la presente invención incluyen enlazadores de éster, enlazadores de amida, enlazadores de maleimida o basados en maleimida; enlazadores de valina-citrulina; enlazadores de hidrazona; enlazadores de N-succinimidil-4-(2-piridilditio)butirato (SPDB); enlazadores de succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (SMCc ); enlazadores basados en vinilsulfona; enlazadores que incluyen polietilenglicol (PEG), tales como, pero sin limitación, tetraetilenglicol; enlazadores que incluyen ácido propanoico; enlazadores que incluyen ácido caproleico y enlazadores que incluyen cualquier combinación de los mismos. El enlazador puede incluir polietilenglicol (PEG). En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador peptídico. El conector peptídico puede ser flexible o rígido. Los enlazadores peptídicos de interés incluyen, pero sin limitación, los descritos en Chen et al. (2013) Adv. Drug Deliv. Rev. 65(10):1357-1369. En determinados aspectos, cuando el enlazador es un enlazador peptídico, el conjugado es una proteína de fusión. Cuando el conjugado es una proteína de fusión, la presente divulgación proporciona además ácidos nucleicos que codifican dichas proteínas de fusión, vectores de expresión que incluyen dichos ácidos nucleicos unidos operativamente a un promotor y células hospedadoras (por ejemplo, células hospedadoras de mamífero) que incluyen dichas proteínas de fusión, ácidos nucleicos y/o vectores de expresión. El enlazador puede ser estable en suero. Los enlazadores estables en suero son conocidos e incluyen, por ejemplo, enlazadores que incluyen PEG, enlazadores de sulfona (por ejemplo, enlazadores de sulfona de feniloxadiazol (véase Patterson et al. (2014) Bioconj. Chem. 25(8):1402-7)), y similares.
Están disponibles numerosas estrategias para unir la fracción dirigida y la enzima de edición de la superficie celular diana a través de un enlazador. Por ejemplo, un componente del conjugado se puede derivatizar mediante la unión covalente de un enlazador al componente, donde el enlazador tiene un grupo funcional capaz de reaccionar con un "asidero químico" en ese componente, y donde el enlazador tiene un segundo grupo funcional capaz de reaccionar con un "asidero químico" en el otro componente. Los grupos funcionales del enlazador pueden variar y pueden seleccionarse en función de la compatibilidad con los asideros químicos de los componentes del conjugado deseado. Los componentes del conjugado pueden incluir ya un grupo funcional útil para reaccionar con un grupo funcional del enlazador, o dicho grupo funcional puede proporcionarse a uno o ambos componentes del conjugado deseado. Los grupos funcionales que se pueden utilizar para unir componentes de los conjugados a un enlazador incluyen, pero sin limitación, ésteres activados, isocianatos, imidoésteres, hidrazidas, grupos amino, aldehidos, cetonas, grupos fotorreactivos, grupos de maleimida, grupos a-halo-acetilo, epóxidos, azirdinas y similares. Reactivos tales como yodoacetamidas, maleimidas, haluros bencílicos y bromometilcetonas reaccionan mediante S-alquilación de tioles para generar productos de tioéter estables. Por ejemplo, a pH 6,5-7,5, los grupos de maleimida reaccionan con los grupos sulfhidrilo para formar enlaces tioéter estables. Los reactivos de arilación, tales como haluros de NBD, reaccionan con tioles o aminas mediante una sustitución similar del haluro aromático por el nucleófilo. Debido a que el anión tiolato es un mejor nucleófilo que el tiol neutro, la cisteína es más reactiva por encima de su pKa (~8,3, dependiendo del contexto estructural de la proteína). Los tioles también reaccionan con determinados reactivos que reaccionan con amina, incluidos isotiocianatos y succinimidil ésteres. La serie de reactivos TS-Link está disponible para la modificación tiol reversible.
Con respecto a los grupos reactivos de amina, las aminas primarias existen en el extremo N de las cadenas polipeptídicas y en la cadena lateral de los restos de aminoácidos de lisina (Lys, K). Entre los grupos funcionales disponibles en muestras típicas biológicas o de proteínas, las aminas primarias son especialmente nucleófilas, haciéndolas blancos listos para la conjugación con varios grupos reactivos. Por ejemplo, los ésteres de NHS son grupos reactivos formados por la activación con carbodiimida de moléculas de carboxilato. Los reticuladores activados por éster de NHS y los compuestos marcadores reaccionan con aminas primarias en condiciones fisiológicas a ligeramente alcalinas (pH 7,2 a 9) para producir enlaces amida estables. La reacción libera N-hidroxisuccinimida (NHS). También a modo de ejemplo, los reticuladores de imidoéster reaccionan con aminas primarias para formar enlaces de amidina. Los reticuladores de imidoéster reaccionan rápidamente con aminas a pH alcalino pero tienen semividas cortas. A medida que el pH se vuelve más alcalino, aumenta la semivida y la reactividad con aminas. Como tal, la reticulación es más eficaz cuando se realiza a pH 10 que a pH 8. Las condiciones de reacción por debajo de pH 10 pueden dar lugar a reacciones secundarias, aunque se favorece la formación de amidina entre pH 8 a 10.
Numerosos otros grupos químicos sintéticos formarán enlaces químicos con aminas primarias, incluidos, pero sin limitación, isotiocianatos, isocianatos, azidas de acilo, cloruros de sulfonilo, aldehídos, glioxales, epóxidos, oxiranos, carbonatos, haluros de arilo, carbodiimidas, anhídridos y ésteres de fluorofenilo. Dichos grupos se conjugan con aminas mediante acilación o alquilación.
El asidero químico en la fracción dirigida, en enzima de edición de la superficie celular diana o en ambas puede proporcionarse mediante la incorporación de un aminoácido no natural que tenga el asidero químico en el componente. El aminoácido no natural puede incorporarse mediante síntesis química o enfoques recombinantes, por ejemplo, con un par de aminoacil ARNt sintetasa-ARNt ortogonal adecuado para la incorporación del aminoácido no natural durante la traducción en una célula hospedadora. El grupo funcional de un aminoácido no natural presente en el componente puede ser una azida, alquino, alqueno, amino-oxi, hidracina, aldehído, nitrona, óxido de nitrilo, ciclopropeno, norborneno, isocianuro, haluro de arilo, ácido borónico u otro grupo funcional adecuado, y el grupo funcional del enlazador se selecciona para que reaccione con el grupo funcional del aminoácido no natural (o viceversa).
Como alternativa, el asidero químico en la fracción dirigida, en la enzima de edición de la superficie celular diana o en ambas puede proporcionarse utilizando un enfoque que no implique un aminoácido no natural. Por ejemplo, un componente que no contiene aminoácidos no naturales podría conjugarse con un enlazador utilizando, por ejemplo, grupos funcionales nucleófilos del componente (tal como la amina aminoterminal o la amina primaria de lisina, o cualquier otro resto de aminoácido nucleófilo) como nucleófilo en una reacción de sustitución con una construcción enlazadora que lleva un grupo saliente reactivo u otro grupo electrófilo.
La enzima de edición de la superficie celular diana puede conjugarse de forma específica del sitio con la fracción dirigida, la fracción dirigida puede conjugarse de forma específica del sitio con la enzima de edición de la superficie celular diana, o ambos. La conjugación específica del sitio se puede lograr mediante la incorporación de un aminoácido no natural que tenga el grupo funcional reactivo en una ubicación predeterminada en la fracción dirigida y/o en la enzima de edición de la superficie celular diana. Se pueden encontrar detalles para la incorporación específica del sitio de aminoácidos no naturales en proteínas, por ejemplo, en Young & Schultz (2010) J. Biol. Chem.
285:11039-11044.
La fracción dirigida puede tener un marcador de aldehido carboxiterminal, y la conjugación específica del sitio se logra haciendo reaccionar el aldehído carboxiterminal con aminooxi-tetraetilenglicol-azida (aminooxi-TEG-N3), seguido de la reacción con una enzima de edición de la superficie celular diana marcada con éster de biciclononina-N-hidroxisuccinimida (BCN-NHS). Este ejemplo se describe con más detalle en la sección experimental a continuación.
La fracción dirigida puede tener marcador de aldehído carboxiterminal, y la conjugación específica del sitio se logra haciendo reaccionar el aldehído carboxiterminal con aminooxi-tetraetilenglicol-azida (aminooxi-TEG-N3). Una enzima de edición de la superficie celular diana tiene una secuencia de marcador de aldehído (SLCTPSRGS), y la conjugación específica del sitio se logra haciendo reaccionar la cisteína del marcador de aldehído con dibenzociclooctino-tetrapolietilenglicol-maleimida (DBCO-PEG4-maleimida) seguido de la reacción con la fracción dirigida marcada con TEG-N3. Este ejemplo se describe con más detalle en la sección experimental a continuación. Por consiguiente, los métodos incluyen la conjugación de una enzima de edición de la superficie celular diana con una fracción dirigida que se une a una molécula de la superficie celular en la superficie de una célula diana. Uno o más (por ejemplo, dos o más, tres o más, cuatro o más, etc.) enzimas de edición de la superficie celular diana pueden conjugarse con la fracción dirigida. La fracción dirigida y la enzima de edición de la superficie celular diana son como se describen en el presente documento. Por lo tanto, la enzima de edición de la superficie celular diana es una sialidasa (por ejemplo, cualquiera de las sialidasas descritas en el presente documento) y la fracción dirigida es un anticuerpo (por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento, que incluyen, a modo de ejemplo, un anticuerpo anti-HER2 (por ejemplo, trastuzamab), cetuximab, daratumumab, girentuximab, panitumumab, ofatumumab, rituximab, etc.). Como se ha indicado anteriormente, la conjugación puede ser específica del sitio (por ejemplo, a través de un grupo funcional de un aminoácido no natural en una posición predeterminada) con respecto a la fracción dirigida, la enzima de edición de la superficie celular diana o ambas. COMPOSICIONES
Los conjugados de la presente invención se pueden proporcionar como composiciones. Las composiciones pueden incluir cualquiera de los conjugados descritos en el presente documento (por ejemplo, un conjugado que tiene cualquiera de las fracciones dirigidas y las enzimas de edición de la superficie celular diana descritas en el presente documento). Las composiciones pueden incluir un conjugado de la presente invención presente en un medio líquido. El medio líquido puede ser un medio líquido acuoso, tal como agua, una solución tamponada o similar. Uno o más aditivos, tales como una sal (por ejemplo, NaCl, MgCh, KCI, MgSO4), un agente tamponante (un tampón Tris, N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(ácido 2-etanosulfónico) (HEPES), ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), sal sódica del ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS), ácido N-tris[hidroximetil]metil-3-aminopropanosulfónico (TAPS), etc.), un agente solubilizante, un detergente (por ejemplo, un detergente no iónico tal como Tween-20, etc.), un inhibidor de la ribonucleasa, glicerol, un agente quelante y similares, pueden estar presentes en dichas composiciones.
Los conjugados de la presente invención se pueden proporcionar como composiciones farmacéuticas. Las composiciones farmacéuticas incluyen cualquiera de los conjugados de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En general, las composiciones farmacéuticas incluyen una cantidad terapéuticamente eficaz del conjugado. Por "cantidad terapéuticamente eficaz" se entiende una dosis suficiente para producir un resultado deseado, por ejemplo, una cantidad suficiente para lograr resultados terapéuticos beneficiosos o deseados (incluidos los preventivos), tales como una reducción en un síntoma de una enfermedad o trastorno asociado con la célula diana o una población de la misma, en comparación con un control. Una cantidad eficaz puede administrarse en una o más administraciones.
Un conjugado de la presente invención se puede incorporar en una variedad de formulaciones para administración terapéutica. Más particularmente, el conjugado se puede formular en composiciones farmacéuticas mediante la combinación con excipientes o diluyentes adecuados farmacéuticamente aceptables, y puede formularse en preparaciones en formas sólidas, semisólidas, líquidas o gaseosas, tales como comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, pomadas, soluciones, inyecciones, medicamento inhalatorio y aerosoles.
Las formulaciones de los conjugados de la presente invención adecuadas para la administración a un paciente (por ejemplo, adecuadas para la administración a seres humanos) son generalmente estériles y además pueden estar libres de pirógenos detectables u otros contaminantes contraindicados para la administración a un paciente de acuerdo con una vía de administración seleccionada.
En formas de dosificación farmacéutica, el conjugado se puede administrar en forma de sus sales farmacéuticamente aceptables, o también se puede utilizar solo o en una asociación adecuada, así como en combinación, con otros compuestos farmacéuticamente activos, por ejemplo, un agente antineoplásico (incluidos, pero sin limitación, agentes antineoplásicos de molécula pequeña), un inhibidor del punto de control inmunitario y cualquier combinación de los mismos. Los siguientes métodos y vehículos/excipientes son meramente ejemplos y no son de ningún modo limitativos.
Para preparaciones orales, el conjugado se puede utilizar solo o en combinación con aditivos adecuados para fabricar comprimidos, polvos, gránulos o cápsulas, por ejemplo, con aditivos convencionales, tales como lactosa, manitol, almidón de maíz o almidón de patata; con aglutinantes, tales como celulosa cristalina, derivados de celulosa, goma arábiga, almidón de maíz o gelatinas; con disgregantes, tales como almidón de maíz, almidón de patata o carboximetilcelulosa sódica; con lubricantes, tales como talco o estearato de magnesio; y si se desea, con diluyentes, agentes tamponantes, agentes humectantes, conservantes y aromatizantes.
El conjugado se puede formular para administración parenteral (por ejemplo, intravenosa, intrarterial, intraósea, intramuscular, intracerebral, intracerebroventricular, intratecal, subcutánea, etc.). En determinados aspectos, el conjugado se formula para inyección mediante la disolución, suspensión o emulsión del conjugado en un disolvente acuoso o no acuoso, tal como aceites vegetales u otros similares, glicéridos sintéticos de ácido alifático, ésteres de ácidos alifáticos superiores o propilenglicol; y si se desea, con aditivos convencionales tales como solubilizantes, agentes isotónicos, agentes de suspensión, agentes emulsionantes, estabilizadores y conservantes.
Las composiciones farmacéuticas que incluyen el conjugado se pueden preparan mediante la mezcla del conjugado que tiene el grado de pureza deseada con vehículos, excipientes, estabilizantes, tensioactivos, tampones y/o agentes de tonicidad opcionales fisiológicamente aceptables. Los vehículos, excipientes y/o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluido ácido ascórbico, glutatión, cisteína, metionina y ácido cítrico; conservantes (tales como etanol, alcohol bencílico, fenol, m-cresol, p-cloro-m-cresol, metil o propil parabenos, cloruro de benzalconio o combinaciones de los mismos); aminoácidos, tales como arginina, glicina, ornitina, lisina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, isoleucina, leucina, alanina, fenilalanina, tirosina, triptófano, metionina, serina, prolina y combinaciones de los mismos; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono; polipéptidos de bajo peso molecular (de menos de aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como gelatina o albúmina de suero; agentes quelantes, tales como EDTA; azúcares, tales como trehalosa, sacarosa, lactosa, glucosa, manosa, maltosa, galactosa, fructosa, sorbosa, rafinosa, glucosamina, N-metilglucosamina, galactosamina y ácido neuramínico; y/o tensioactivos no iónicos, tales como Tween, Brij Pluronics, Tritón-X o polietilenglicol (PEG).
La composición farmacéutica puede estar en una forma líquida, una forma liofilizada o una forma líquida reconstituida a partir de una forma liofilizada, en donde la preparación liofilizada se reconstituirá con una solución estéril antes de la administración. El procedimiento convencional para reconstituir una composición liofilizada es añadir de nuevo un volumen de agua pura (normalmente equivalente al volumen eliminado durante la liofilización); sin embargo, se pueden utilizar soluciones que comprenden agentes antibacterianos para la producción de composiciones farmacéuticas para la administración parenteral.
Se puede preparar una formulación acuosa del conjugado en una solución de pH tamponado, por ejemplo, a un pH que varíe de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 7,0, o de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,0, o de manera alternativa a un pH de aproximadamente 5,5. Los ejemplos de tampones que son adecuados para un pH dentro de este intervalo incluyen tampones de fosfato, histidina, citrato, succinato, de acetato y otros tampones de ácidos orgánicos. La concentración de tampón puede ser de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM, o de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 50 mM, dependiendo, por ejemplo, del tampón y la tonicidad deseados de la formulación.
Para modular la tonicidad de la formulación puede incluirse un agente de tonicidad en la formulación. Los agentes de tonicidad ilustrativos incluyen cloruro de sodio, cloruro potásico, glicerina y cualquier componente del grupo de aminoácidos, azúcares así como combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la formulación acuosa es isotónica, aunque pueden ser adecuadas soluciones hipertónicas o hipotónicas. El término "isotónico" indica una solución que tiene la misma tonicidad que alguna otra solución con la que se compara, tal como una solución salina fisiológica o suero. Los agentes de tonicidad se pueden utilizar en una cantidad de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 350 mM, por ejemplo, en una cantidad de 100 mM a 350 mM.
También se puede añadir un tensioactivo a la formulación para reducir la agregación y/o minimizar la formación de partículas en la formulación y/o reducir la adsorción. Como tensioactivos ilustrativos se incluyen ésteres de ácidos grasos de polioxietilensorbitán (Tween), éteres de alquilo de polioxietileno (Brij), éteres de alquilfenilpolioxietileno (Tritón-X), copolímero de polioxietileno-polioxipropileno (Poloxamer, Pluronic) y dodecilsulfato sódico (SDS). Son ejemplos de ésteres de ácidos grasos de polioxietilensorbitán adecuados, polisorbato 20, (comercializado con la marca registrada Tween 20™) y polisorbato 80 (comercializado con la marca registrada Tween 80™). Son ejemplos de copolímeros de polietileno-polipropileno adecuados los comercializados con los nombres Pluronic® F68 o Poloxamer 188™. Son ejemplos de éteres de alquilo de polioxietileno adecuados los comercializados con la marca registrada Brij™. Las concentraciones ilustrativas de tensioactivo pueden variar de aproximadamente un 0,001 % a aproximadamente un 1 % p/v.
También se puede añadir un lioprotector para proteger el conjugado contra condiciones desestabilizadoras durante un proceso de liofilización. Por ejemplo, como lioprotectores conocidos se incluyen azúcares (incluidos glucosa y sacarosa); polioles (incluidos manitol, sorbitol y glicerol); y aminoácidos (incluidos alanina, glicina y ácido glutámico).
Se pueden incluir lioprotectores en una cantidad de aproximadamente 10 mM a 500 nM.
La composición farmacéutica puede incluir un conjugado de la presente invención y uno o más de los agentes identificados anteriormente (por ejemplo, un tensioactivo, un tampón, un estabilizante, un agente de tonicidad) y está esencialmente libre de uno o más conservantes, tales como etanol, alcohol bencílico, fenol, m-cresol, p-cloro-mcresol, metil o propil parabenos, cloruro de benzalconio y combinaciones de los mismos. En otras realizaciones, en la formulación se incluye un conservante, por ejemplo, a concentraciones que varían de aproximadamente un 0,001 a aproximadamente un 2 % (p/v).
MÉTODOS
Los conjugados de la presente invención se utilizan en un método para tratar el cáncer. Los métodos pueden incluir administrar a un individuo que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de los conjugados de la presente invención, que pueden estar en forma de una composición farmacéutica.
La administración puede modular una vía inmunitaria en el individuo. Por ejemplo, la administración puede modular una vía inmunitaria seleccionada de una vía inhibidora del receptor inmunitario, una vía del complemento, una vía del receptor de tipo 2 similar a la inmunoglobulina pareado (PILR) y un grupo 2 citolítico natural, una vía de la proteína miembro D (NKG2D). La célula diana puede incluir un ligando en su superficie, y la administración da como resultado la edición del ligando por la enzima de edición de la superficie celular diana. El ligando es un sialoglucano, la enzima de edición de la superficie celular diana es una sialidasa y la edición puede incluir la escisión de un resto de ácido siálico terminal del sialoglucano. La sialidasa del conjugado puede ser una sialidasa bacteriana, una neuraminidasa de mamífero o similar. Cuando la sialidasa es una neuraminidasa de mamífero, la neuraminidasa de mamífero puede ser una neuraminidasa humana, por ejemplo, una neuraminidasa humana seleccionada de la neuraminidasa 1 humana, neuraminidasa 2 humana, neuraminidasa 3 humana y neuraminidasa 4 humana.
Cuando la administración da como resultado la edición de un ligando en la célula diana por la enzima de edición de la superficie celular diana, el ligando puede ser un ligando de un receptor inmunitario inhibidor. El ligando puede ser un ligando de un receptor inmunitario inhibidor presente en una célula inmunitaria seleccionada del grupo que consiste en: un linfocito citolítico natural (NK), un macrófago, un monocito, un neutrófilo, una célula dendrítica, un linfocito T, un linfocito B, un mastocito, un basófilo y un eosinófilo. El receptor inmunitario inhibidor puede ser un receptor de lectina similar a Ig que se une al ácido siálico (Siglec).
El uso médico de la invención incluye la administración del conjugado, que puede estar en forma de una composición farmacéutica, a una persona que tiene cáncer, para tratar el cáncer. Los cánceres que se pueden tratar de acuerdo con la invención incluyen, pero sin limitación, cualquiera de los cánceres expuestos en las tablas 1 y 2 anteriores. El conjugado puede incluir una fracción dirigida (por ejemplo, un anticuerpo terapéutico, tal como cualquiera de los anticuerpos expuestos en las tablas 1, 2 y 3 anteriores), que se une a una molécula de la superficie celular asociada a un tumor o a una molécula de la superficie celular específica de un tumor en la superficie de una célula cancerosa del individuo. En algunas realizaciones, la célula cancerosa es una célula de carcinoma. De acuerdo con determinadas realizaciones, la célula cancerosa se selecciona de una célula de cáncer de mama, una célula de cáncer de ovario, una célula de cáncer gástrico y una célula de cáncer de colon. La célula cancerosa puede seleccionarse de cualquiera de los tipos de cáncer expuestos en las tablas 1 y 2 anteriores. La molécula de la superficie celular puede ser el receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2). Cuando la molécula de la superficie celular es HER2, la diana puede ser, por ejemplo, un anticuerpo anti-HER2 (por ejemplo, trastuzamab u otro anticuerpo anti-HER2 adecuado).
La administración incluye administrar un conjugado de la invención, que pueden estar en forma de una composición farmacéutica. El conjugado incluye una fracción dirigida que es un anticuerpo. El individuo que lo necesita tiene cáncer, la fracción dirigida del conjugado puede ser un anticuerpo establecido en la tabla 1 y los métodos pueden ser para tratar (por ejemplo, mediante citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) mejorada) el mismo o diferente tipo de cáncer correspondiente al anticuerpo expuesto en la tabla 1.
El individuo que lo necesita tiene cáncer, la fracción dirigida del conjugado puede ser un anticuerpo establecido en la tabla 2 y los métodos pueden ser para tratar (por ejemplo, mediante citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) mejorada) el mismo o diferente tipo de cáncer correspondiente al anticuerpo expuesto en la tabla 2.
El individuo que lo necesita tiene cáncer, la fracción dirigida del conjugado puede ser un anticuerpo expuesto en la tabla 3 y los métodos son para tratar el cáncer (por ejemplo, mediante citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) mejorada).
La administración incluye administrar un conjugado de la invención, que puede estar en forma de una composición farmacéutica, y el conjugado puede incluir una fracción dirigida que es un anticuerpo seleccionado de trastuzamab, cetuximab, daratumumab, girentuximab, panitumumab, ofatumumab y rituximab.
Los conjugados de la presente invención se pueden administrar al individuo mediante cualquier método disponible y ruta adecuada para la administración de fármacos, incluidos métodos in vivo y ex vivo, así como vías de administración sistémicas y localizadas. Las vías de administración convencionales y farmacéuticamente aceptables incluyen intranasal, intramuscular, intratraqueal, subcutánea, intradérmica, aplicación tópica, ocular, intravenosa, intrarterial, nasal, oral y otras vías de administración enterales y parenterales. Las vías de administración pueden combinarse, si se desea, o ajustarse dependiendo del conjugado y/o del efecto deseado. El conjugado puede administrarse en una sola dosis o en múltiples dosis. El conjugado puede administrarse por vía oral. El conjugado puede administrarse por vía de inhalación. El conjugado puede administrarse por vía intranasal. El conjugado puede administrarse por vía local. El conjugado puede administrarse por vía ocular. El conjugado puede administrarse por vía intracraneal. El conjugado puede administrarse por vía intravenosa. El conjugado puede administrarse mediante inyección, por ejemplo, para administración sistémica (por ejemplo, infusión intravenosa) o en un sitio local.
Una variedad de individuos son tratables de acuerdo con los métodos en cuestión. En general, dichos individuos son "mamíferos", donde estos términos se utilizan ampliamente para describir organismos que están dentro de la clase de mamíferos, incluidos los órdenes carnívoros (por ejemplo, perros y gatos), roedores (por ejemplo, ratones, cobayas y ratas) y primates (por ejemplo, seres humanos, chimpancés y monos). El individuo puede ser un ser humano.
Por "tratar" o "tratamiento" se entiende al menos una mejora de los síntomas asociados con el proceso patológico que aqueja al individuo, donde mejoría se utiliza en un sentido amplio para referirse al menos a una reducción en la magnitud de un parámetro, por ejemplo, un síntoma, asociado con el proceso patológico que se está tratando, tal como una enfermedad o trastorno asociado con (por ejemplo, provocado por) la célula diana o población de la misma, donde la edición de la superficie de la célula diana es beneficiosa. Como tal, el tratamiento también incluye situaciones en las que el proceso patológico, o al menos los síntomas asociados con el mismo, se inhiben por completo, por ejemplo, se evitan que se produzcan, o se detienen, por ejemplo, se terminan, de tal manera que el individuo ya no padece el proceso patológico, o al menos los síntomas que lo caracterizan.
La dosificación es dependiente de la intensidad y la sensibilidad del estado de enfermedad que se va a tratar. Las pautas posológicas óptimas se pueden calcular a partir de las mediciones de la acumulación de conjugados en el cuerpo del individuo. El médico que administra puede determinar las dosis, metodologías de dosificación y frecuencias de repetición óptimas. Las dosificaciones óptimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa del conjugado y, en general, se pueden estimar en función de la CE50 que se encuentra que es eficaz en modelos animales in vitro e in vivo, etc. En general, la dosificación es de 0,01 |jg a 100 g por kg de peso corporal, y puede proporcionarse una vez o más diariamente, semanalmente, mensuales o anuales. El médico tratante puede estimar las frecuencias de repetición de la dosificación en función de los tiempos de permanencia medidos y las concentraciones del fármaco en líquidos o tejidos corporales. Tras un tratamiento satisfactorio, puede ser deseable hacer que el sujeto se someta a un tratamiento de mantenimiento para prevenir la recaída del estado de enfermedad, donde el conjugado se administra en dosis de mantenimiento, una o más veces al día, a una vez cada varios meses, una vez cada seis meses, una vez al año o con cualquier otra frecuencia adecuada.
Los usos terapéuticos pueden incluir la administración de un solo tipo de conjugado a un individuo, o pueden incluir la administración de dos o más tipos de conjugados a un individuo (por ejemplo, una mezcla de diferentes conjugados), donde los dos o más tipos de conjugados pueden diseñarse para editar la superficie del mismo tipo o diferentes tipos de células diana.
Un conjugado de la presente invención se puede administrar al individuo en combinación con un segundo agente terapéutico como parte de una terapia de combinación. Dicha administración puede incluir administrar el conjugado y el segundo agente al mismo tiempo, o administrar el conjugado y el segundo agente de manera secuencial. El individuo tiene cáncer y el segundo agente terapéutico puede ser un agente antineoplásico. Los agentes antineoplásicos de interés incluyen, pero sin limitación, anticuerpos antineoplásicos (por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos expuestos en las tablas 1, 2 y 3 anteriores), agentes antineoplásicos de molécula pequeña o similares. El segundo agente terapéutico puede ser un agente antineoplásico de molécula pequeña seleccionado de abiraterona, bendamustina, bexaroteno, bortezomib, clofarabina, decitabina, exemestano, temolozomida, afatinib, axitinib, bosutinib, cabozantinib, crizotinib, dabrafenib, dasatinib, erlotinib, gefitinib, ibrutinib, imatinib, lapatinib, nilotinib, pazopanib, ponatinib, regorafenib, ruxolitinib, sorafenib, sunitinib, vandetanib, vemurafenib, enzalutamida, fulvestrant, epirrubicina, ixabepilona, nelarabina, vismodegib, cabazitaxel, pemetrexed, azacitidina, carfilzomib, everolimus, temsirolimus, eribulina, omacetaxina, trametinib, lenalidomida, pomalidomida, romidepsina, vorinostato, brigatinib, ribociclib, midostaurina, telotristat etilo, niraparib, cabozantinib, lenvatinib, rucaparib, granisetrón, dronabinol, venetoclax, alectinib, cobimetinib, panobinostato, palbociclib, talimogén laherparepvec, lenvatinib, trifluridina y tipiracilo, ixazomib, sonidegib, osimertinib, rolapitant, triacetato de uridina, trabectedina, netupitant y palonosetrón, belinostat, ibrutinib, olaparib, idelalisib y ceritinib.
El segundo agente terapéutico puede ser un inhibidor del punto de control inmunitario. Los inhibidores del punto de control inmunitario de interés incluyen, pero sin limitación, inhibidores (por ejemplo, anticuerpos) que se dirigen a PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM3, LAG3 o un miembro de la familia B7.
El conjugado y el segundo agente terapéutico pueden administrarse de acuerdo con una pauta posológica aprobada para uso individual. La administración del segundo agente terapéutico puede permitir que el conjugado administrado al individuo se administre de acuerdo con una pauta posológica que implica una o más dosis más bajas y/o menos frecuentes, y/o un número reducido de ciclos en comparación con el utilizado cuando el conjugado se administra sin la administración del segundo agente terapéutico. La administración del conjugado puede permitir que el segundo agente terapéutico administrado al individuo se administre de acuerdo con una pauta posológica que implica una o más dosis más bajas y/o menos frecuentes, y/o un número reducido de ciclos en comparación con el utilizado cuando el segundo agente terapéutico se administra sin la administración del conjugado.
Las pautas posológicas relativas deseadas para los agentes administrados en combinación pueden evaluarse o determinarse de manera empírica, por ejemplo con modelos ex-vivo, in vivo y/o in vitro; pudiéndose hacer dicha evaluación o determinación empírica in vivo en una población de pacientes (por ejemplo, para que se establezca una correlación) o, como alternativa, en un individuo particular de interés.
Una o más dosis del conjugado y el segundo agente terapéutico pueden administrarse al individuo al mismo tiempo; pudiendo administrarse dichos agentes presentes en la misma composición farmacéutica. Como alternativa, sin embargo, el conjugado y el segundo agente terapéutico pueden administrarse al individuo en diferentes composiciones y/o en diferentes momentos. Por ejemplo, el conjugado puede administrarse antes de la administración del segundo agente terapéutico (por ejemplo, en un ciclo particular). Como alternativa, el segundo agente terapéutico puede administrarse antes de la administración del conjugado (por ejemplo, en un ciclo particular). El segundo agente a administrar puede administrarse un período de tiempo que comience al menos 1 hora, 3 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, o hasta 5 días o más después de la administración del primer agente a administrar.
KITS
Los kits pueden incluir cualquiera de los conjugados de la invención, que pueden proporcionarse en forma de una composición. Los kits encuentran uso, por ejemplo, en la práctica de los usos médicos de la invención. Por ejemplo, los kits para practicar los usos médicos pueden incluir una cantidad de las composiciones, presentes en dosis unitarias, por ejemplo, ampollas, o en un formato multidosis. Como tal, los kits pueden incluir una o más (por ejemplo, dos o más) dosis unitarias (por ejemplo, ampollas) de una composición que incluye un conjugado de la presente invención. El término "dosis unitaria", como se utiliza en el presente documento, se refiere a unidades físicamente diferenciadas adecuadas como dosis unitarias para sujetos humanos y animales, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de la composición calculada en una cantidad suficiente para producir el efecto deseado. La cantidad de la dosis unitaria depende de varios factores, tales como el conjugado particular empleado, el efecto a lograr y la farmacodinámica asociada con el conjugado en el sujeto. Los kits pueden incluir una única cantidad multidosis de la composición.
Los componentes de los kits pueden estar presentes en envases separados, o múltiples componentes pueden estar presentes en un solo envase. Un envase adecuado incluye un solo tubo (por ejemplo, frasco), uno o más pocillos de una placa (por ejemplo, una placa de 96 pocillos, una placa de 384 pocillos, etc.) o similares.
Los kits pueden incluir instrucciones para usar la composición para tratar a un individuo que lo necesite. Las instrucciones pueden estar grabadas en un medio de grabación adecuado. Por ejemplo, las instrucciones pueden estar impresas en un sustrato, tal como papel o plástico, etc. Como tal, las instrucciones pueden estar presentes en los kits en forma de prospecto, en el etiquetado del envase del kit o de los componentes del mismo (es decir, asociado con el paquete o subpaquete), etc. Las instrucciones pueden estar presentes como un archivo de datos de almacenamiento electrónico presente en un medio de almacenamiento legible por ordenador adecuado, por ejemplo, memoria USB portátil, DVD, CD-ROM, disquete, etc. Las instrucciones reales pueden no estar presentes en el kit, pero se proporcionan medios para obtener las instrucciones de una fuente remota, por ejemplo, a través de Internet. Un ejemplo de esto es un kit que incluye una dirección de Internet donde se pueden ver las instrucciones y/o desde donde se pueden descargar las instrucciones. Al igual que con las instrucciones, el medio para obtener las instrucciones se registra en un sustrato adecuado.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención, pero no limitan su alcance, que está definido por las reivindicaciones. PARTE EXPERIMENTAL
Materiales y métodos
El tampón PBS, el tampón DPBS, DMEM, el medio RPMI-1640 y el suero bovino fetal inactivado por calor se obtuvieron de Corning-Mediatech. El medio sin suero X-VIVO 15 se adquirió de Lonza. El agar LB, 2xYT y el antibiótico-antimicótico se adquirieron de Fisher Scientific y los geles Bis-Tris al 4-12% para SDS-PAGE se adquirieron de Bio-Rad. El suero AB masculino humano inactivado por calor se adquirió de Sigma-Aldrich. La IL-2 recombinante humana, la IL-4 recombinante humana y la IL-13 recombinante humana se adquirieron de Biolegend. La IgG anti-Her2 humanizada con un marcador de aldehído fue un obsequio de Catalent Pharma Solutions (Emeryville, CA). Los espectros de absorbencia se midieron con un SpectraMax i3x (Molecular Devices). Las columnas de centrifugación de eliminación de endotoxinas de alta capacidad Pierce, el kit de cuantificación de endotoxinas cromogénicas Pierce LAL y el kit de ensayo de citotoxicidad LDH se obtuvieron de Thermo Fisher Scientific. El éster de biciclononina-N-hidroxisuccinimida (BCN-NHS) y la aminooxi-tetraetilenglicol-azida (aminooxi-TEG-N3) se adquirieron de Berry & Associates, Inc. Se adquirió dibenzociclooctino-tetrapolietilenglicol-maleimida (DBCO-PEG4-maleimida) de Click Chemistry Tools. El ácido 2'-(4-metilumbeliferil)-a-D-N-acetilneuramínico (MuNeuNAc) se obtuvo de Biosynth International Inc. Todos los demás productos químicos se adquirieron de Sigma-Aldrich y se utilizaron sin purificación adicional.
Se utilizaron los siguientes anticuerpos y proteínas recombinantes: La quimera recombinante humana Siglec-7-Fc, la quimera Siglec-9-Fc, las proteínas quiméricas NKG2D-Fc, el AcM anti-Siglec-7 marcado con AF488 (clon 194211) y el AcM anti-NKG2D de bloqueo (clon 149810) se adquirieron de R&D Systems. La lectina de Sambucus nigra (SNA) marcada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) se obtuvo de EY Laboratories. El AcM anti-Her2 marcado con AF647 (clon 24D2), el AcM anti-CD16 marcado con AF647 (clon 3G8), el AcM anti-CD56 marcado con AF647 (clon HCD56), el AcM anti-Siglec-7 de bloqueo (clon S7.7) y el AcM anti-Siglec-9 de bloqueo (clon K8) se obtuvieron de Biolegend. El AcM anti-Fc marcado con TRITC se adquirió de Jackson Immunoresearch. El AcM anti-CD3 marcado con FITC (clon BW264/56) se adquirió de Miltenyi Biotec. La IgG anti-Her2 humanizada con marcador de aldehído carboxiterminal fue un obsequio de Catalent Pharma Solutions (Emeryville, CA).
Estirpes celulares y cultivo celular:
Se obtuvieron células de cáncer de mama SKΒR3, HCC-1954, MDA-MB-453, ZR-75-1, BT-20, MDA-MB-231 y MDA-MB-468 de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, American Type Culture Collection). SKΒR3, Hc C-1954, ZR-75-1 y MDA-MB-468 se mantuvieron en medio RPMI-1640 complementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10 %, más antibiótico-antimicótico al 0,4 % y L-glutamina (300 mg/l). MDA-MB-453, BT-20 y MDA-MB-231 se mantuvieron en medio DMEM complementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10 %, más antibióticoantimicótico al 0,4 %, L-glucosa (4,5 g/l), L-glutamina (584 mg/l) y piruvato de sodio (110 mg/l).
Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC, del inglés peripheral blood mononuclear cells) se obtuvieron de donantes sanos del banco de sangre y se aislaron mediante la separación de gradiente de densidad Ficoll-Paque (GE Healthcare Life Sciences, GE-17-1440-02). Las células NK se aislaron de las PBMC mediante selección negativa con el kit de aislamiento de células Nk MACS (Miltenyi Biotec, 130-092-657) y columnas LS (Miltenyi Biotec, 130-042-401) de acuerdo con el protocolo del fabricante y se cultivaron en X-VIVO 15 complementado con suero AB masculino humano inactivado por calor al 5 % (Sigma-Aldrich) e interleucina-2 (IL-2) recombinante humana 100ng/ml (Biolegend) durante la noche antes de utilizarse. El enriquecimiento de células NK se verificó mediante citometría de flujo para dar como resultado >95% de células CD56+/CD3-(véase la figura 16). Los monocitos se aislaron de las PBMC con el kit de aislamiento Pan Monocyte (Miltenyi Biotec 130-096-537). Los monocitos CD16+ se aislaron de las PBMC con el kit de aislamiento de monocitos CD16+ (Miltenyi Biotec 130-091­ 765). Después de aislar las PBMC nuevas, los macrófagos polarizados M1 y M2 se adquirieron mediante la colocación primero de las PBMC recién aisladas en RPMI sin suero en un matraz T75 (Fisher Scientific 1368065) a 37 °C en CO2 al 5 % durante 2 horas, después la retirada de los medios y el lavado de las células tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS Ca Mg) para aislar los monocitos. Las células M1 polarizadas se generaron mediante la incubación de los monocitos restantes con GM-CSF recombinante humano 50 ng/ml (PeproTech 300-03) durante 6 días en RPMI suero fetal bovino inactivado por calor al 20 %, seguido de 4 días de incubación con lipopolisacárido bacteriano 100 ng/ml (Invivogen tlrl-3pelps) e IFNy recombinante humano 20 ng/ml (PeproTech 300-02BC) en RPMI con suero bovino fetal inactivado por calor al 10 %. Los macrófagos M2 polarizados se generaron mediante la incubación de monocitos con M-CSF recombinante humano 50 ng/ml (PeproTech 300-25) durante 6 días en RPMI suero fetal bovino inactivado por calor al 20 % seguido de 4 días de incubación con IL-13 recombinante humana 20 ng/ml (sin portador) (Biolegend 571102) e IL-4 recombinante humana 100 ng/ml (sin portador) (Biolegend 574004). Se aislaron linfocitos T y§ humanos de PBMC mediante selección negativa con el kit de aislamiento de linfocitos T y/6 humanos EasySep™ (Stemcell Tech 19255).
Análisis FACS:
Las células se incubaron con sialidasa, IgG anti-Her2, IgG anti-Her2-Sia o control con PBS durante 1 hora a 37 °C. Después de tres lavados con PBS, las células se resuspendieron en PBS frío con albúmina de suero bovino (BSA) al 0,5 % que contenía la sonda elegida: un anticuerpo, una proteína de fusión receptor-Fc con anticuerpo secundario anti-Fc precomplejado en solución o lectina SNA marcada con FITC. Las células y los anticuerpos/proteínas de fusión se incubaron durante 30 minutos a 4 °C en oscuridad. Después de tres lavados con PBS con BSA al 0,5 %, las células se dejaron en PBS con BSA al 0,5 % y después se analizaron mediante citometría de flujo. Todos los datos de citometría de flujo se analizaron con FlowJo v. 10.0 (Tree Star).
Expresión y purificación de sialidasas:
C600 de Escherichia coli transformada con el plásmido pCVD364 que contiene el gen de la sialidasa de Vibrio cholerae fue un regalo del Prof. Eric R. Vimr, Universidad de Illinois, Urbana-Champaign. Las células se cultivaron en medio 2xYT, complementado con ampicilina (100 |jg/ml) a 37 °C durante 12 horas. Después de la incubación, las células se recogieron por centrifugación a 4.700 * g durante 10 min. Y el sedimento se resuspendió en tampón de choque osmótico (sacarosa al 20 %, EDTA 1 mM, Tris-HCl 30 mM, pH 8,0) y se agitó suavemente durante l0 min a temperatura ambiente. Las células se recogieron por centrifugación (9000 * g durante 10 min) y los sedimentos se resuspendieron en agua pura helada. Después de una incubación de 10 min a 4 °C, el sobrenadante se obtuvo por centrifugación a 9.000 * g durante 10 min. Para purificar la proteína, la muestra se concentró aún más utilizando un dispositivo de ultrafiltración Amicon (valor de corte de la masa molecular de membrana, 30.000 Da), se reconstituyó en tampón Tris-HCl 0,02 M (pH 7,6) y se cargó en una columna de intercambio aniónico HitrapQ-HP (GE Healthcare Life Sciences, 17-1154-01). La proteína se eluyó con un gradiente de NaCl en tampón Tris-HCl 0,02 M (pH 7,6) a un caudal de 5 ml/min. Se recogieron y agruparon las fracciones de proteína con la masa molecular esperada determinada por SDS-PAGE teñida con azul brillante de Coomassie. Las endotoxinas se eliminaron con un kit giratorio de eliminación de endotoxinas de alta capacidad (Thermo Fisher Scientific, 88275) y la concentración de endotoxinas de la muestra se determinó mediante el kit de cuantificación de endotoxinas cromogénicas LAL (Thermo Fisher Scientific, 88282).
El gen de la sialidasa de Salmonella typhimurium se clonó en el vector pET151 con un marcador de hexahisitidina aminoterminal y un marcador de aldehido carboxiterminal (SLCTPSRGS) y se transformó en BL21 (DE3) de E. coli competente (NEB C2527H). Las células se cultivaron en medio 2xYT, complementados con ampicilina (100 jg/ml) a 37 °C hasta que alcanzaron una densidad óptica de 0,6, a continuación se añadió IPTG 0,3 mM y las células se cultivaron a 37 °C con agitación durante 16 horas. Después de la incubación, las células se recogieron por centrifugación a 4.700 * g durante 10 min. Y el sedimento se resuspendió en 50 ml de tampón de lisis (solución salina tamponada con fosfato (Fisher Scientific MT21040cv) NaCl 150 mM imidazol 10 mM. Se añadió un comprimido de inhibidor de proteasa (Sigma 5892970001) y 1 j l de nucleasa (Thermo Scientific-Pierce 88702) y las células en tampón de lisis se incubaron a 4 °C con agitación durante 2 horas. Las células se lisaron a través de un homogeneizador y se purificaron con resina de níquel-NTA (Thermo Fisher 88221) con elución de imidazol 250 mM. Se recogieron y agruparon las fracciones de proteína con la masa molecular esperada determinada por SDS-PAGE teñida con azul brillante de Coomassie. Las endotoxinas se eliminaron con un kit giratorio de eliminación de endotoxinas de alta capacidad (Thermo Fisher Scientific, 88275) y la concentración de endotoxinas de la muestra se determinó mediante el kit de cuantificación de endotoxinas cromogénicas LAL (Thermo Fisher Scientific, 88282).
Ensayo de actividad de sialidasas con MuNeuNAc:
Se añadieron 5 j l de sialidasa (30 a 60 nM en tampón DPBS con Ca2+ y Mg2+, pH 7,0) a 50 j l de solución que contenía ácido 2'-(4-metilumbeliferil)-a-D-N-acetilneuramínico (MuNeuNAc, Biosynth International Inc.) 0,1 mM en tampón DPBS con Ca2+y Mg2+ (pH 7,0). Después de una incubación de 10 min a 37 °C, la mezcla se diluyó con 150 j l de tampón de glicina-NaOH 0,1 M, pH 10,4. La fluorescencia se leyó con un espectrofotómetro de fluorescencia (excitación 360 nm; emisión 440 nm). La actividad se indica como U/mg, donde una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para liberar 1 jmol de metilumbeliferona por minuto en tampón DPBS, pH 7.
Preparación de IgG anti-Her2-Sia:
Se hizo reaccionar sialidasa de Vibrio cholerae purificada (2 mg/ml en tampón DPBS con Ca2+y Mg2+, pH 7,0) con 12 equivalentes de éster de biciclononina-N-hidroxisuccinimida (BCN-NHS) a 4 °C durante la noche. El exceso de enlazador se eliminó utilizando una columna de desalinización PD-10 (GE Healthcare Life Sciences, 17-0851-01). El grado de marcaje se determinó mediante ESI-MS (véase la figura 6B). Se produjo IgG anti-Her2 humanizada con marcador de aldehído carboxiterminal como se describió anteriormente. Se preparó IgG anti-Her2-Sia mediante el acoplamiento primero de IgG anti-Her2 con marcador de aldehído carboxiterminal (120 jM ) a aminooxitetraetilenglicol-azida (aminooxi-TEG-N3) (10 mM) en tampón de acetato de amonio 100 mM, pH 4,5, a 37 °C durante 10 días, seguido de intercambio de tampón en tampón DPBS con Ca2+y Mg2+ (pH 7,0) utilizando una columna de desalinización PD-10 (GE Healthcare Life Sciences, 17-0851-01). A continuación, el conjugado resultante se acopló a sialidasa marcada en una proporción molar de 1:28 a una concentración de proteína total de 120 mg/ml en tampón DPBS con Ca2+y Mg2+ (pH 7,0). Después de una incubación de 3 días a temperatura ambiente, se purificó el IgG anti-Her2-Sia mediante cromatografía de exclusión por tamaño Superdex 200. El producto purificado se analizó mediante gel SDS-PAGE y ESI-MS.
Se hizo reaccionar sialidasa de Salmonella typhimurium purificada (3 mg/ml en tampón DPBS con Ca2+y Mg2+, pH 7.0) con 20 equivalentes de DBCO-PEG4-maleimida a 4 °C durante la noche. El exceso de enlazador se eliminó utilizando una columna de desalinización PD-10 (GE Healthcare Life Sciences, 17-0851-01). El grado de marcaje se determinó mediante ESI-MS (véase la figura 6B). Se produjo IgG anti-Her2 humanizada con marcador de aldehído carboxiterminal como se describió anteriormente. Se preparó IgG anti-Her2-Sia mediante el acoplamiento primero de IgG anti-Her2 con marcador de aldehído carboxiterminal (120 jM ) a aminooxi-tetraetilenglicol-azida (aminooxi-TEG-N3) (10 mM) en tampón de acetato de amonio 100 mM, pH 4,5, a 37 °C durante 10 días, seguido de intercambio de tampón en tampón DPBS con Ca2+y Mg2+ (pH 7,0) utilizando una columna de desalinización PD-10 (GE Healthcare Life Sciences, 17-0851-01). A continuación, el conjugado resultante se acopló a sialidasa marcada en una proporción molar de 1:14 a una concentración de proteína total de 25 mg/ml en tampón DPBS con Ca2+y Mg2+ (pH 7.0) . Después de una incubación de 3 días a temperatura ambiente, se purificó el IgG anti-Her2-Sia mediante cromatografía de exclusión por tamaño Superdex 200. El producto purificado se analizó mediante gel SDS-PAGE y ESI-MS.
Ensayo de citotoxicidad celular:
La citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC, del inglés antibody-dependent cellular cytotoxicity) se analizó mediante la medición de la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) de las células de cáncer de mama como resultado de la actividad de ADCC de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células NK, monocitos, monocitos CD16+, macrófagos M1 o macrófagos M2. Las células tumorales (células diana) se incubaron junto con PBMC, células NK, monocitos o macrófagos (células efectoras) en varias proporciones efector/diana (E/D) en presencia o ausencia de sialidasa o AcM por triplicado. En un experimento típico, se añadieron 100 μl de células efectoras a una placa de 96 pocillos con fondo en V que contenía 100 μl de células diana a 2 * 105 células/ml. Después de 4 horas, se recogieron los sobrenadantes y se midió la liberación de LDH con un kit de ensayo de citotoxicidad de LDH (Thermo Fisher Scientific, 88954) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La absorbencia a 490 nm se midió con un SpectraMax i3x (Molecular Devices). La lisis específica se calculó como 100 * (experimental - liberación espontánea de células efectoras - liberación espontánea de células diana)/(liberación máxima de células diana - liberación espontánea de células diana).
Microscopía de fluorescencia:
Para la visualización de la actividad enzimática específica de HER2 del conjugado: se incubaron células con diversas concentraciones de IgG anti-Her2-Sia en tampón PBS durante 1 hora a 37 °C. Después de los lavados con PBS, las células se fijaron a continuación con formaldehído al 4 % a temperatura ambiente durante 20 min. Las células fijadas se lavaron tres veces con BSA al 0,5 % en PBS, seguido de bloqueo en PBS con BSA al 0,5 % durante 1 hora. Las células se incubaron con SNA marcado con FITC (1:100) y anticuerpo anti-Her2 marcado con AF647 (1:100) en BSA al 0,5 % en PBS durante 30 min a temperatura ambiente en oscuridad con agitación suave. Después de lavar tres veces con BSA al 0,5 % en PBS, se añadió DAPI (dilución 1:1250 de una solución madre de 10 mM) justo antes de obtener imágenes con un microscopio confocal de barrido resonante Nikon A1R+.
Para la visualización de sinapsis de células tumorales-NK: las células tumorales se incubaron con IgG anti-Her2 6 nM o IgG anti-Her2-Sia 6 nM en tampón PBS durante 1 hora a 37 °C. Se añadieron células NK recién aisladas a las células tumorales en una proporción E/D de 2:1 y se incubaron juntas durante 15 min a 37 °C. Después de lavar con PBS, las células se fijaron con formaldehído al 4 % en PBS durante 20 min a temperatura ambiente. Las células fijadas se lavaron tres veces con BSA al 0,5 % en PBS, seguido de bloqueo en PBS con BSA al 0,5 % durante 1 hora. Las células se incubaron con una mezcla de anti-Siglec 7 marcado con AF488 (1:100), anti-Fc marcado con TRITC (1:400) y anti-CD16 marcado con AF647 (1:100) en tampón PBS durante 30 min a temperatura ambiente en oscuridad con agitación suave. Después de lavar tres veces con BSA al 0,5% en PBS, se añadió DAPI (dilución 1:1250 de una solución madre de 10 mM) justo antes de obtener imágenes con un microscopio confocal de barrido resonante Nikon A1R+.
Análisis estadístico:
Los análisis estadísticos se realizaron con Prism 6. Los datos se muestran como media ± DT de experimentos por triplicado, y la significación se determinó mediante una prueba de la t, a menos que se indique de otro modo. **= p <0,005, *= p <0,05, y un valor de p >0,05 se consideró significativo.
Introducción
Cuando son suficientemente abundantes, los glucanos que terminan en restos de ácido siálico crean un distintivo de "yo saludable" que suprime la activación inmunitaria a través de varias vías, por ejemplo, mediante el reclutamiento del factor H del complemento y la posterior disminución de la cascada alternativa del complemento, y mediante el reclutamiento de lectinas inmunosupresoras de tipo Ig que se unen al ácido siálico (Siglecs), que se encuentran en la mayoría de los tipos de leucocitos, en la sinapsis inmunitaria. El estado de sialilación juega un papel importante en la capacidad de una célula para desencadenar o evadir el reconocimiento inmunitario.
El aumento de los glucanos sialilados se ha correlacionado con un mal pronóstico y una disminución de la inmunogenia de los tumores. La hipersialilación de las células cancerosas puede contribuir a la evasión de la vigilancia inmunitaria por parte de las células NK, los principales mediadores de la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). Las poblaciones densas de glucanos sialilados pueden reclutar Siglec-7 y/o Siglec-9 asociados con células NK a la sinapsis inmunitaria (Figura 1). Como PD-1, estos Siglecs poseen un motivo inhibidor basado en tirosina del inmunorreceptor citosólico (ITIM) que media la supresión de señales de la activación de los receptores de células NK (Figura 1). La hipersialilación genomanipulada de dianas tumorales protege de la destrucción de células NK innatas, así como de la ADCC de una manera dependiente de Siglec-7. Del mismo modo, la eliminación enzimática de ácidos siálicos mediante el tratamiento de las células tumorales con sialidasa potencia la destrucción mediada por células NK, al igual que la inhibición de Siglec-7 o -9 con anticuerpos bloqueantes. La sialilación de los glucanos de las células cancerosas también interrumpe la interacción del receptor activador de NK, grupo citolítico natural 2D (NKG2D), con sus ligandos afines, reduciendo así las señales de activación de NK de las células tumorales (Figura 1). Por el contrario, la eliminación de los ácidos siálicos de la superficie celular mejora la activación de las células mediante el aumento de la unión del ligando de NKG2D. Por lo tanto, durante el proceso microevolutivo de progresión tumoral, la hipersialilación proporciona una ventaja selectiva mediante la reducción de las señales de activación de NK al tiempo que mejora las señales inhibidoras de NK que emanan de la sinapsis inmunitaria.
En la figura 1 se ilustra esquemáticamente una estrategia de evasión inmunitaria dirigida a receptores activadores de NK y receptores inhibidores de NK utilizando ácidos siálicos. En las células cancerosas que sobreexpresan ácido siálico, los glucanos hipersialilados interactúan con los receptores inhibidores de NK, lo que conduce a la inhibición de la activación de las células NK. La eliminación de los ácidos siálicos de la superficie celular por el conjugado de anticuerpo y sialidasa suprime la interacción de los glucanos sialilados y los receptores inhibidores de NK, y aumenta la unión entre el receptor activador de NK y sus ligandos, aumentando así la susceptibilidad de las células tumorales a la ADCC mediada por células NK.
Se razonó que la desialilación específica del tumor podría ser una poderosa intervención que potencie la citólisis tumoral por parte de las células n K. En el presente documento se informa que un conjugado de anticuerpo y enzima (CAE) puede editar selectivamente el glucocáliz de la célula tumoral y potenciar la destrucción de las células NK por ADCC, un mecanismo de importancia terapéutica aprovechado por muchos anticuerpos contra el cáncer. Una sialidasa recombinante se fusionó químicamente con el anticuerpo monoclonal terapéutico dirigido a HER2 trastuzumab. El conjugado de anticuerpo y sialidasa desialiló las células tumorales de una manera dependiente de HER2, destruyó ligandos para Siglecs inhibidores mientras mejoraba la unión de NKG2D y amplificó la destrucción de células NK en comparación con trastuzumab solo (Figura 1).
Ejemplo 1 - Idoneidad de las sialidasas de V. cholerae y S. typhimurium
Para identificar sialidasas adecuadas para el CAE con trastuzumab, un grupo de enzimas se expresaron y purificaron como se describió anteriormente (Figura 3A y B) y las sialidasas de Vibrio cholerae y Salmonella typhimurium se identificaron como adecuadas para este fin. Las sialidasas de V. cholerae y S. typhimurium se expresaron y purificaron como se describió anteriormente. La pureza de la proteína se determinó mediante gel SDS-PAGE y ESI-Ms (Figuras 2B, 2E, figura 3B, y figuras 7A y 7F). Se purificaron aproximadamente 15 mg de enzimas de 1 litro de células cultivadas, con una actividad hidrolítica in vitro de más de 10 U/mg para V. cholerae y 114 para S. typhimurium medido con el sustrato fluorogénico ácido 2'-(4-metilumbeliferil)-a-D-N-acetilneuramínico (MuNeuNAc) como se informó anteriormente, donde una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para liberar 1 μmol de metilumbeliferona por minuto en tampón DPBS, pH 7. Para determinar si la sialidasa de V. cholerae podría eliminar de manera eficaz los ácidos siálicos de los glucanos de la superficie celular, sus efectos en el marcaje de la superficie celular se probaron con aglutinina de Sambucus nigra (SNA) marcada con FITC. Asimismo, los efectos del tratamiento con V. cholerae en el marcaje celular se evaluaron con quimeras receptor-Fc que comprenden los ectodominios de Siglec-7, Siglec-9 o NKG2D. La desialización de varias estirpes de células tumorales mediante sialidasa a 37 °C durante 1 hora redujo de manera significativa la unión de SNA, así como de las quimeras Siglec-7-Fc y de Siglec-9-Fc (Figura 4). Con una disminución en la unión de SNA, se observó un aumento en la capacidad de unión de la quimera NKG2D-Fc para la mayoría de las estirpes celulares de cáncer de mama después del tratamiento con sialidasa (Figura 4D).
La preparación y caracterización de conjugados de anticuerpo y sialidasa se muestra en la figura 2. En la figura 2A se ilustra esquemáticamente la preparación de conjugados de anticuerpo y sialidasa de Vibrio cholerae. En la figura 2B se muestra el análisis SDS-PAGE de sialidasa, de trastuzumab y del conjugado de sialidasa y trastuzumab en condiciones no reductoras (carriles 3, 4 y 5) y reductoras (carriles 6, 7 y 8), visualizadas mediante tinción de Coomassie. Escala de proteína previamente teñida: carriles 1, 2 y 9. En la figura 2C se muestra ESI-MS del conjugado de anticuerpo y sialidasa con sialidasa de Vibrio cholerae. En la figura 2D se ilustra esquemáticamente la preparación de los conjugados de anticuerpo y sialidasa de Salmonella typhimurium. En la figura 2E se muestra el análisis SDS-PAGE de sialidasa, de sialidasa modificada con DBCO, de trastuzumab y del conjugado de trastuzumab y sialidasa en condiciones no reductoras (carriles 3, 4, 5 y 6), y de trastuzumab y del conjugado de trastuzumab y sialidasa en condiciones reductoras (carriles 7 y 8), visualizados mediante tinción de Coomassie. Escala de proteína previamente teñida: carriles 1, 2 y 9. En la figura 2F se muestra ESI-MS del conjugado anticuerpo y sialidasa con sialidasa de Salmonella typhimurium.
En la figura 3 se muestra la caracterización de un grupo de sialidasas. En la figura 3A se representa la actividad de las sialidasas en el sustrato de ácido 2'-(4-metilumbeliferil)-a-D-N-acetilneuramínico (MuNeuNAc). El análisis SDS-PAGE de neuraminidasa 2 humana de tipo silvestre, neuraminidasa 3 humana, sialidasa de V. cholerae, sialidasa de S. typhimurium, sialidasa de C. perfringens y sialidasa de A. ureafaciens se muestra en la figura 3B, visualizado por tinción de Coomassie. En la figura 3C se muestra la citometría de flujo de la escisión del ligando de Siglec 9 mediante V. cholerae, S. typhimurium y neuraminidasa 2 humana a partir de células de cáncer de mama ZR-75-1. Los ligandos de Siglec-7 en las células BT-20 se eliminan de manera eficaz después del tratamiento con sialidasa de V. cholerae, como se muestra en la figura 3D.
En la figura 4A se muestra el análisis de los niveles de sialilación de la superficie celular de diferentes estirpes celulares de cáncer de mama con o sin tratamiento con sialidasa. Los niveles de ligando de Siglec-7 en diferentes estirpes celulares de cáncer de mama con o sin tratamiento con sialidasa se muestran en la figura 4B. Los niveles de ligando de Siglec-9 en diferentes estirpes celulares de cáncer de mama con o sin tratamiento con sialidasa se muestran en la figura 4C. Los niveles de ligando de NKG2D en diferentes estirpes celulares de cáncer de mama con o sin tratamiento con sialidasa se muestran en la figura 4D.
Ejemplo 2: La eliminación de los ácidos siálicos de la superficie celular mejora la susceptibilidad a la ADCC
Para demostrar que la eliminación de los ácidos siálicos de la superficie celular puede aumentar su susceptibilidad a la ADCC mediada por células NK, se realizaron ensayos de AdCc con estirpes celulares SKΒR3 (HER23+), MDA-MB-453 (HER2 2+) y BT-20 (HER2 1+) con y sin tratamiento con sialidasa en presencia de trastuzumab 30 nM utilizando células NK de sangre periférica humana purificada. Se observó un aumento aproximado de un 5 % a un 100 % en la destrucción celular máxima en ADCC dirigida por trastuzumab con varias estirpes celulares tratadas con sialidasa (Figura 5). Para validar que la ADCC mejorada se debió a la actividad enzimática de la sialidasa, también se realizó el ensayo de actividad hidrolítica y el ensayo de ADCC con una sialidasa de V. cholerae inactivada por calor. La inactivación de la sialidasa de V. cholerae por calentamiento a 80 °C durante 20 minutos condujo a la pérdida de la actividad hidrolítica frente a los glucanos que contenían ácido siálico así como a la pérdida de la potenciación en la ADCC (Figura 6). Se esperaba que mediante la conjugación de la sialidasa con trastuzumab, el aumento de la concentración local de sialidasa en la superficie celular proporcionaría una actividad potenciada por la proximidad y potenciaría aún más el efecto, así como limitaría la promiscuidad de la actividad enzimática de una manera específica del tejido.
En la figura 5A se muestra la citotoxicidad de células NK aisladas de sangre periférica de donantes sanos frente a células de cáncer de mama BT-20 solas (sin tratamiento), en presencia de IgG anti-Her2 (Tras) o en presencia de IgG anti-Her2 y neuriminidasa 2 humana (Neu2), neuriminidasa 3 humana (Neu3), sialidasa de Vibrio cholerae (VCSia), sialidasa de Salmonella typhimurium (STSia), sialidasa de Arthrobacter ureafaciens (AUSia) o sialidasa de Clostridium perfringens (CPSia). En la figura 5B se muestra la citotoxicidad de células NK aisladas de sangre periférica de donantes sanos frente a diferentes células de cáncer de mama en ausencia o presencia de sialidasa (30 nM), IgG anti-Her2 (30 nM) o una mezcla de sialidasa (30 nM) e IgG anti-Her2 (30 nM) en proporciones de E/D de 2:1 y 4:1. *P <0,05, **P <0,005.
En la figura 6 se muestra la caracterización de la sialidasa de Vibrio cholerae de tipo silvestre e inactivada por calor. La citotoxicidad de células NK aisladas de sangre periférica frente a células BT-20 en ausencia o presencia de IgG anti-Her2 (30 nM), sialidasa (30 nM), una mezcla de IgG anti-Her2 (30 nM) y sialidasa (30 nM), sialidasa inactivada por calor (HI-Sialidasa 30 nM) o una mezcla de IgG anti-Her2 (30 nM) y sialidasa inactivada por calor (30 nM) en una proporción de E/D de 4:1 se muestra en la figura 6A. Las actividades hidrolíticas de la sialidasa de V. cholerae de tipo silvestre e inactivada por calor utilizando el ácido 2'-(4-metilumbeliferil)-a-D-N-acetilneuramínico (MuNeuNAc) se muestran en la figura 6B. Los niveles de ligandos de lectina de Sambucus nigra (SNA) en células BT-20 con o sin tratamiento con sialidasa inactivada por calor o sialidasa de tipo silvestre 30 nM se muestran en la figura 6C. Los niveles de ligandos de Siglec-7 en células BT-20 con o sin tratamiento con sialidasa inactivada por calor o sialidasa de tipo silvestre 30 nM se muestran en la figura 6D. Los niveles de ligandos de Siglec-9 en células BT-20 con o sin tratamiento con sialidasa inactivada por calor o sialidasa de tipo silvestre 30 nM se muestran en la figura 6E. Los niveles de ligandos de NKG2D en células BT-20 con o sin tratamiento con sialidasa inactivada por calor o sialidasa de tipo silvestre 30 nM se muestran en la figura 6F. **P <0,005, NS: no significativo.
Ejemplo 3 - Preparación y caracterización de conjugados anticuerpo y sialidasa
Una preocupación clave en el diseño de CAE de sialidasa y trastuzumab fue identificar un sitio para la conjugación enzimática que no socavara la unión a FcyRIII (CD16), la interacción que inicia la ADCC. Se tomó como inspiración el campo de los conjugados de anticuerpo y fármaco (CAF) donde los sitios de unión se han adaptado para evitar la interferencia con las funciones del efector inmunitario. Por consiguiente, se eligió sialidasa para unir cerca del extremo C de la cadena pesada de trastuzumab, lejos del dominio Ch2 en el que se une FcyRIII. El método de marcaje de aldehído para la conjugación específica del sitio se utilizó en función de los precedentes de su uso en el ensamblaje de fusiones químicas proteína-proteína, así como en conjugados de fármaco y anticuerpo específicos del sitio. Trastuzumab (IgG anti-Her2) que lleva un marcador de aldehído carboxiterminal se obtuvo como se describió anteriormente. El anticuerpo funcionalizado se acopló primero a aminooxi-tetraetilenglicol-azida (aminooxi-TEG-N3) (Figura 2A). En paralelo, se prepararon las sialidasas. La sialidasa de V cholerae se funcionalizó al azar en restos de lisina con éster de biciclononina-N-hidroxisuccinimida (BCN-NHS). Después de dejar reaccionar durante la noche, se eliminó el exceso de enlazador y se determinó el grado de modificación de la sialidasa por BCN-NHS mediante ESI-MS (Figura 7B). Finalmente, trastuzumab adornado con el enlazador funcionalizado con azida se conjugó con sialidasa de V. cholerae funcionalizada con BCN mediante química clic sin cobre (Figura 2A). El conjugado deseado se purificó utilizando una columna de exclusión por tamaño y su peso molecular aparente (IgG anti-Her2-Sia, alrededor de 312 kDa) se confirmó por SDS-PAGE (Figura 2B). El análisis ESI-MS confirmó que la sialidasa estaba unida covalentemente a la cadena pesada de trastuzumab (Figura 2C y figura 7E). La actividad sialidasa del CAE final se evaluó utilizando el sustrato fluorogénico MuNeuNAc. Más del 85 % de la actividad enzimática permaneció después del proceso de conjugación química (Figura 8). Como alternativa, la sialidasa de S. typhimurium se conjugó de forma específica del sitio con la cisteína en el marcador de aldehído carboxiterminal haciendo reaccionar con DBCO-PEG4-maleimida durante la noche; después este exceso de enlazador se eliminó y la conjugación de DBCO a sialidasa de S. typhimurium se determinó que estaba completa mediante ESI-MS (Figura 7G). Finalmente, trastuzumab con el enlazador de azida se conjugó con sialidasa de S. typhimurium funcionalizada con DBCO mediante química clic sin cobre (Figura 2D). El conjugado deseado se purificó utilizando una columna de exclusión por tamaño y su peso molecular aparente (IgG anti-HER2-StSia, alrededor de 240 kDa) se confirmó por SDS-PAGE (Figura 2E). El análisis ESI-MS confirmó que la sialidasa estaba unida covalentemente a la cadena pesada de trastuzumab (Figura 2F y figura 7H). La actividad sialidasa del CAE final se evaluó utilizando el sustrato fluorogénico MuNeuNAc. Se produjo un ligero aumento en la actividad enzimática en comparación con la sialidasa marcada con aldehído libre después del proceso de conjugación química con la cisteína libre en el marcador carboxiterminal (Figura 8).
En la figura 7 se muestran espectros ESI-MS de sialidasa, IgG anti-Her2 y sus conjugados. El espectro de ESI-MS de la sialidasa de Vibrio cholerae purificada se muestra en la figura 7A. El espectro de ESI-MS de la sialidasa de V. cholerae marcada con BCN-NHS en una proporción molar de 1:12 se muestra en la figura 7B. El espectro de ESI-MS de IgG anti-Her2 con marcador de aldehído carboxiterminal se muestra en la figura 7C. El espectro de ESI-MS de IgG anti-Her2 con marcador de aldehído carboxiterminal conjugada con aminooxi-TEG-azida se muestra en la figura 7D. El espectro de ESI-MS de IgG anti-Her2-Sia se muestra en la figura 7E. ESI-MS de la sialidasa de Salmonella typhimurium purificada se muestra en la figura 7F. ESI-MS de S. typhimurium marcada con DBCO_PEG4-maleimida en una proporción molar de 1:20 se muestra en la figura 7G. Espectro de ESI-MS de IgG anti-Her2-St-Sia
En la figura 8 se muestran las actividades hidrolíticas de la sialidasa de V. cholerae e IgG anti-Her2-Sia, así como de la sialidasa de S. typhimurium e IgG anti-Her2-StSia frente al sustrato de ácido 2'-(4-metilumbel¡fer¡l)-a-D-N-acetilneuramínico (MuNeuNAc)
Para demostrar además que IgG anti-Her2-Sia es capaz de eliminar específicamente el ácido siálico en las células que expresan HER2, se incubaron SKΒR3 (HER2 3+) y MDA-MB-468 (HER2 0) en ausencia o presencia de IgG anti-Her2-Sia 6 nM o 60 nM. Como se muestra en la figura 9 y la figura 10, el tratamiento con IgG anti-Her2-Sia 6 nM durante 1 h dio como resultado una desialilación selectiva de células SKΒR3 incluso en presencia de células MDA-MB-468 (Figura 9). Sin embargo, este efecto depende de la dosis. Los niveles de ácido siálico superficial de las células SKΒR3 y MDA-MB-468 se redujeron con un tratamiento a 60 nM de IgG anti-Her2-Sia durante 1 h. Este efecto se cuantificó usando citometría de flujo en mezclas de células tratadas con varias concentraciones de IgG anti-Her2-Sia (Figura 9A). Sin embargo, en otro conjugado con una sialidasa más pequeña que carece de dominios de lectina (IgG anti-Her2-St-Sia), los niveles de ácido siálico superficial de las células HER20 MDA-MB-468 fuera de la diana permanecieron inalterados hasta concentraciones mucho más elevadas de aproximadamente 1 μM de conjugados de IgG anti-Her2-St-Sia (Figura 9B).
En la figura 9 se muestra la caracterización in vitro de trastuzumab y del conjugado de trastuzumab y sialidasa con diferentes células cancerosas que expresan HER2. El ácido siálico de la superficie celular en la estirpe celular de elevada expresión de HER2, SKΒR3, se puede eliminar de forma selectiva utilizando un conjugado de trastuzumab y sialidasa 6 nM. Barra de escala, 25 μm.
En la figura 10 se muestran ligandos de SNA en células SKΒR3 y MDA-MB-468 en ausencia o presencia del conjugado IgG anti-Her2-Sia. Los ligandos de SNA en cultivos individuales de células SKΒR3 y MDA-MB-468 en ausencia o presencia del conjugado IgG anti-Her2-Sia se muestran en la figura 10A. Las células se incubaron con conjugado IgG anti-Her2-Sia 6 nM o PBS en medio RPMI-1640 durante 1 hora a 37 °C y se tiñeron con lectina de SNA marcada con FITC, anti-Her2 marcado con AF647 y tinción nuclear DAPI. Los ligandos de SNA en una mezcla de células SKΒR3 y MDA-MB-468 en ausencia o presencia de conjugado IgG anti-Her2-Sia se muestran en la figura 10B. Las células SKΒR3 y MDA-MB-468 se mezclaron en una proporción de 1:1 y se cultivaron durante la noche. Las mezclas de células se incubaron en ausencia o presencia de conjugado IgG anti-Her2-Sia 6 nM o 60 nM durante 1 hora a 37 °C. Barra de escala = 25 μm.
Para evaluar el efecto del conjugado de anticuerpo y sialidasa en la ADCC mediada por células NK, se realizaron ensayos de citotoxicidad utilizando varias estirpes celulares de cáncer de mama (SKΒR3, HER2 3+; HCC-1954, HER2 3+; MDA-MB-453, HER2 2+; ZR-75-1, HER2 1+; BT-20, HER2 1+; MDA-MB-231, HER2 1+; MDA-MB-468, HER2 0) en presencia de IgG anti-Her2 o IgG anti-Her2-Sia en proporciones efector/diana (E/D) de 4:1 y 8:1. En comparación con IgG anti-Her2, IgG anti-Her2-Sia demostró aumentos del 33 % al 140 % de destrucción celular máxima con las estirpes celulares HER2 1+ ZR-75-1, BT-20 y MDA-MB-231 (Figura 11). Además, se expusieron células BT-20 a células NK de sangre periférica humana purificadas en diversas proporciones de E/D en ausencia o presencia de sialidasa (30 nM), IgG anti-Her2 (30 nM) o IgG anti-Her2-Sia (30 nM) (Figura 12A). El tratamiento con sialidasa sola de estirpes de células BT-20 mostró poca citotoxicidad mediada por células NK en diferentes proporciones de E/D. En comparación con IgG anti-Her2, IgG anti-Her2-Sia mostró una citólisis significativamente mejorada en varias proporciones. A una proporción de E/D de 4, se observó la mayor mejora: 46 % ± 1 citólisis para IgG anti-Her2-Sia frente a 21 % ± 1 para IgG anti-Her2. Se verificó que la ADCC probablemente estaba mediada por células NK ya que las PBMC sin células NK mostraban poca lisis celular (Figura 12B).
En la figura 11 se muestran datos de citotoxicidad de células NK aisladas de sangre periférica de donantes sanos frente a diferentes células de cáncer de mama en presencia de IgG anti-Her2 (30 nM) o IgG anti-Her2-Sia (30 nM) en proporciones de E/D de 4:1 y 8:1.
En la figura 12 se muestra la actividad in vitro de trastuzumab y del conjugado de trastuzumab y sialidasa frente a diferentes células cancerosas que expresan HER2. Los ensayos de citotoxicidad realizados con células BT-20 en ausencia o presencia de sialidasa (30 nM), IgG anti-Her2 (30 nM) e IgG anti-Her2-Sia (30 nM) usando células NK se muestran en la figura 12A. Los resultados de los ensayos de citotoxicidad realizados con células BT-20 en ausencia o presencia de sialidasa (30 nM), IgG anti-Her2 (30 nM) e IgG anti-Her2-Sia (30 nM) usando PBMC sin células NK se muestran en la figura 12B. La tendencia observada en la mejora de la ADCC correlacionada con la unión de Siglec-7 y Fc, de Siglec-9 y Fc, y de NKG2D y Fc se muestra en las figuras 12C a 12F. La actividad citotóxica de las células NK contra diferentes células cancerosas que expresan HER2 en presencia de las concentraciones indicadas de trastuzumab y conjugado de trastuzumab y sialidasa se muestra en las figuras 12G a 12J. El análisis de microscopía fluorescente de la distribución de Siglec-7 en las células NK con tratamientos con trastuzumab o con conjugado de trastuzumab y sialidasa se muestra en la figura 12K. Siglec-7 mostró reclutamiento en la sinapsis NK con el tratamiento con trastuzumab. Después de eliminar los ácidos siálicos de las células SKΒR3 usando el conjugado de trastuzumab y sialidasa, se pierde el reclutamiento de Siglec-7 en la sinapsis NK-tumor. Barra de escala, 10 μm, **P <0,005.
Para evaluar el efecto del conjugado de anticuerpo y sialidasa en la citotoxicidad mediada por monocitos y macrófagos, se realizaron ensayos de citotoxicidad utilizando estirpes celulares de cáncer de mama (SKΒR3, HER2 3+; BT-20, HER2 1+) en presencia de sialidasa de Vibrio cholerae (VCSia) sola, IgG anti-Her2 (Tras) o IgG anti-Her2-Sia (T-Sia) en varias proporciones efector/diana (E/D). Mientras que la población total de monocitos presentó una baja destrucción general de células tumorales, los monocitos CD16+ aislados que expresan principalmente Siglecs 3, 7 y 9 demostraron aumentos de aproximadamente el 100 % con el tratamiento con el conjugado IgG anti-Her2-Sia (T-Sia) en comparación con el tratamiento con IgG anti-Her2 (Tras) (Figura 13). Los macrófagos M1 diferenciados que expresan Siglecs 3, 6, 7 y 9, y los macrófagos M2 que expresan Siglecs 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 11 parecen mostrar aumentos en la destrucción citotóxica de células tumorales con el conjugado de trastuzumab y sialidasa en oposición con el trastuzumab solo (Figura 13). La citotoxicidad mediada por linfocitos T y§ también puede potenciarse mediante el conjugado de trastuzumab y sialidasa (T-Sia) en lugar de el tratamiento con trastuzumab (Tras) o sialidasa (VCSia) solos (Figura 14).
En la figura 13A se representan los niveles de expresión de Siglec de una población de monocitos humanos aislados determinados por citometría de flujo. En la figura 13B se muestran datos de citotoxicidad de monocitos humanos aislados contra células de cáncer de mama BT-20 después de 24 horas de incubación con sialidasa de V. cholerae, IgG anti-Her2 (Tras) o IgG anti-Her2-Sia (T-Sia) y una proporción de E:D de 1:8. En la figura 13C se representan los niveles de expresión del receptor Siglec de monocitos CD16+ aislados a partir de la población de monocitos. En la figura 13D se muestran datos de citotoxicidad de monocitos CD16+ de donantes sanos después de cuatro horas de incubación con sialidasa de V. cholerae, IgG anti-Her2 (Tras) o IgG anti-Her2-Sia (T-Sia) y células de cáncer de mama BT-20. En la figura 13E se representan los niveles de expresión del receptor Siglec de monocitos aislados de donantes sanos que se han diferenciado en macrófagos M1 como se describió anteriormente. En la figura 13F se muestran datos de citotoxicidad de macrófagos M1 diferenciados de monocitos aislados de donantes sanos después de 24 horas de incubación con sialidasa de V. cholerae, IgG anti-Her2 (Tras) o IgG anti-Her2-Sia (T-Sia) y células de cáncer de mama SK-BR-3. En la figura 13G se representan los niveles de expresión del receptor Siglec de monocitos aislados de donantes sanos que se han diferenciado en macrófagos M2 como se describió anteriormente. En la figura 13H se muestran datos de citotoxicidad de macrófagos M2 diferenciados de monocitos aislados de donantes sanos después de 24 horas de incubación con sialidasa de V. cholerae, IgG anti-Her2 (Tras) o IgG anti-Her2-Sia (T-Sia) y células de cáncer de mama SK-BR-3. En la figura 13I se muestra el nivel de expresión de CD16 de los macrófagos M2 de (13E y 13F).
En la figura 14 se representa la citotoxicidad de los linfocitos T y§ aislados en presencia de la sialidasa de V. cholerae, IgG anti-Her2 (Tras) o IgG anti-Her2-Sia (T-Sia) y células SK-BR-3 a una proporción de E:D de 5:1.
Ejemplo 4 - Mecanismos de ADCC mejorada usando el conjugado de anticuerpo y sialidasa
Estudios anteriores han sugerido que la hipersialilación de las células cancerosas da como resultado una unión reducida del receptor activador NKG2D, así como una unión mejorada de los receptores inhibidores, Siglec-7 y Siglec-9, reduciendo así la citotoxicidad mediada por NK. Para explorar el mecanismo del aumento de la ADCC usando el conjugado de trastuzumab y sialidasa, el aumento de veces de la ADCC se correlacionó con la unión al receptor en varias estirpes celulares de cáncer de mama. Las estirpes celulares con los aumentos más elevados de la ADCC mediada por NK se correlacionaron con los niveles más elevados de unión a Siglec-7 y Siglec-9 (Figuras 12C a 12E). El tratamiento de las células BT-20 y ZR-75-1 (aquellas con la expresión más elevada de los ligandos de superficie Siglec-7 y Siglec-9) con el conjugado de trastuzumab y sialidasa mejoró la ADCC en más de 2 veces en comparación con el trastuzumab solo. En cambio, el conjugado ofreció poca mejora significativa en la ADCC de células MDA-MB-453, que tienen la expresión más baja de los ligandos de superficie Siglec-7 y Siglec-9. Para corroborar aún más que el IgG anti-Her2-Sia mejoraba la ADCC a través de una reducción en la unión de los receptores inhibidores Siglec-7 y Siglec-9 junto con la mejora de la interacción con el receptor activador NKG2D, se utilizaron anticuerpos bloqueantes contra Siglec-7, Siglec-9 y NKG2D se utilizaron para bloquear específicamente las interacciones ligando-receptor. Los anticuerpos anti-Siglec-7 y anti-Siglec-9 a 5 μg/ml condujeron a una citotoxicidad significativamente mayor de las células NK contra las células BT-20 con IgG anti-Her2, pero no con una mezcla de IgG anti-Her2 y sialidasa (Figura 15). Además, el bloqueo del receptor NKG2D mostró un mayor efecto en la ADCC en la mezcla de células tratadas con IgG anti-Her2 y sialidasa en comparación con la ADCC mediada por IgG anti-Her2 (Figura 15).
En la figura 15 se muestran los resultados relacionados con la citotoxicidad de células NK de sangre periférica aisladas de donantes sanos frente a células BT-20 con IgG anti-Her2 (30 nM) o una mezcla de IgG anti-Her2 (30 nM) y sialidasa (30 nM) en la ausencia o presencia de 5 μg/ml anticuerpo bloqueante anti-NKG2D (clon 149810), anticuerpo anti-Siglec-7 (clon S7.7), anticuerpo anti-Siglec-9 (clon S9), una mezcla de anticuerpos anti-Siglec-7 (clon S7.7) y anti-Siglec-9 (clon S9), o anticuerpo de isotipo IgG1 de ratón (clon MOPC-21) en una proporción E/D de 4:1. *P <0,05, **P <0,005, ns: no significativo.
Ejemplo 5 - Comparación entre el conjugado de anticuerpo y sialidasa y el anticuerpo solo
Para comparar directamente la capacidad de IgG anti-Her2-Sia para dirigir la ADCC frente a IgG anti-Her2 solo, la respuesta a la dosis para la citotoxicidad se midió utilizando cuatro estirpes celulares de cáncer de mama diferentes: SKΒR3 (HER2 3+), ZR-75-1 (HER2 1+), BT-20 (HER2 1+), MDA-MB-468 (HER2 0). En comparación con IgG anti-Her2, IgG anti-Her2-Sia es más citotóxico en las tres estirpes celulares que expresan HER2 en una proporción E/D de 4. Para la estirpe celular HER23+, IgG anti-Her2-Sia eliminó las células SKΒR3 con una CE50 de 76 ± 14 μM, que fue ligeramente mejor que IgG anti-Her2 (CE5 0177 ± 54 μM). Mientras que para las estirpes celulares HER21+ ZR-75-1 y BT-20, el IgG anti-Her2-Sia es ~ 10 veces más citotóxico que el IgG anti-Her2 (células ZR-75-1: IgG anti-Her2-Sia CE5 0135 ± 47 μM, IgG anti-Her2 CE5 01143 ± 274 μM; Células BT-20: IgG anti-Her2-Sia CE5 0170 ± 34 μM, IgG anti-Her2 CE50 1823 ± 850 μM) (Figuras 12G a 12J y tabla 6). Se observó poca lisis de la estirpe celular MDA-MB-468 negativa para HER2 para IgG anti-Her2 o IgG anti-Her2-Sia (Figura 12J). A continuación, se analizó la diferencia entre IgG anti-Her2-Sia y una mezcla de IgG anti-Her2 y sialidasa no conjugada (IgG anti-Her2/sialidasa). IgG anti-Her2-Sia mostró menor CE50 en células SKΒR3 (IgG anti-Her2-Sia CE5076 ± 14 μM; IgG anti-Her2/sialidasa CE5 0136 ± 52 μM), células ZR-75-1 (IgG anti-Her2-Sia CE5 0135 ± 47 μM; IgG anti-Her2/sialidasa CE50492 ± 67 μM) y células BT-20 (IgG anti-Her2-Sia CE50 170 ± 34 μM; IgG anti-Her2/sialidasa CE50 692 ± 156 μM) (Tabla 6). La potencia mejorada del conjugado frente a la mezcla de IgG anti-Her2 y sialidasa no conjugada es evidencia de un efecto de proximidad en la actividad enzimática.
Tabla 6: Actividad citotóxica de células NK aisladas contra varias células de cáncer de mama humano inducida por IgG anti-Her2, una mezcla de IgG anti-Her2 y sialidasa, o el conjugado IgG anti-Her2-Sia. (N.D. no detectado).
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Ejemplo 6: El tratamiento con sialidasa potencia la CDC inducida por rituximab
Se trataron células de linfoma de linfocitos B, estirpes celulares Daudi o Ramos, con sialidasa o control con PBS durante 1 hora a 37 °C para desialilar sus superficies celulares, después se añadió suero humano normal (1:4, completo con proteínas del complemento) y rituximab (10 μg/ml) y se dejó incubar la mezcla durante 2 horas a 37 °C. Se recogió el sobrenadante y se determinó la muerte celular (citotoxicidad) usando un kit que mide la liberación de LDH de las células lisadas y después se compara con las células completamente lisadas con detergente como un patrón de destrucción del 100%. Para la figura 17: SiAse: células tratadas con sialidasa, sin rituximab. Rituxan: tratado con PBS y rituximab 10 μg/ml. SiaAse Rituxan: tratado con sialidasa y rituximab 10 μg/ml. * p <0,05
Las células Daudi experimentan un aumento de -10% en la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) inducida por rituximab. Ramos, por otro lado, experimentan casi el doble de CDC después de la desialilación.
Ejemplo 7: Las células Ramos tienen niveles más elevados de ligandos de Siglec-9 que las células Daudi
El mayor efecto sobre la CDC mediante desialilación observado con células Ramos en el ejemplo anterior podría explicarse por una mayor sialilación inicial.
Las proteínas de fusión Siglec-Fc formaron complejos previamente a 5 |jg/ml de Sig-Fc y 4 |jg/ml de anti-Fc secundario y se incubaron con células durante 30 min a 4 °C. A continuación, las células se lavaron 3 veces y se realizó una citometría de flujo. Por separado, las células se trataron con el anticuerpo secundario anti-Fc (los mismos 4 jg/ml), después se lavaron como se indicó anteriormente y se realizó la citometría de flujo. El aumento de la fluorescencia de las células tratadas con la fusión Siglec-Fc sobre las células tratadas solo con el secundario indica que la unión se debió a la proteína Siglec-Fc y no al reactivo secundario.
En la figura 18 se muestra la desviación estándar promedio /- de la unión de Siglec-9-Fc de réplicas experimentales por triplicado de las estirpes celulares Daudi y Ramos. Las células de Ramos muestran -25 % más de unión a Siglec-9, por lo tanto, es probable que muestren más ácido siálico en la superficie de sus células.
Ejemplo 8: La sialidasa potencia el rituximab de una manera dependiente del complemento
La proteína del complemento C1q es un componente iniciador fundamental de la "vía clásica" de la citotoxicidad dependiente del complemento. Ayuda a formar el complejo C1, que se une a los anticuerpos en las células diana y después inicia la cascada del complemento que conduce a la muerte celular. Como se muestra en la figura 19, sin C1q, la sialidasa y/o el rituximab no lisan de manera eficaz las células. Estos datos indican que el tratamiento con sialidasa está potenciando la CDC inducida por rituximab a través de la vía clásica. Estos experimentos se realizaron como en la figura 17, sin embargo, para las barras rojas, se añadió suero que se había agotado de C1q en lugar de suero humano normal. Las barras azules representan células tratadas con suero humano normal. * p <0,05, ** p <0,01
Efecto del conjugado de anticuerpo y sialidasa en la sinapsis inmunitaria
En trabajos anteriores, se demostró que Siglec-7 se recluta en la sinapsis inmunitaria de células diana NK, induciendo así la señalización inhibidora a través de un motivo de inhibición basado en tirosina inmunorreceptor (ITIM). Para evaluar el efecto de la sialidasa conjugada en la sinapsis inmunitaria, se observaron imágenes de la sinapsis inmunitaria durante la ADCC. Las células SKΒR3 se incubaron previamente con IgG anti-Her2 o IgG anti-Her2-Sia y después se incubaron conjuntamente con células NK de sangre periférica humana purificada para inducir la formación de sinapsis. A continuación, las células se fijaron y tiñeron para Siglec-7, HER2, FcγIII (CD16) y se observaron imágenes por microscopía de fluorescencia. Con el tratamiento con IgG anti-Her2, Siglec-7 se localizó conjuntamente con FcyIII (CD16) en la sinapsis inmunitaria formada con células NK, lo cual es coherente con su papel como receptor inhibidor de la activación de células NK (Figura 12K). En cambio, las células SKΒR3 tratadas con IgG anti-Her2-Sia muestran poco reclutamiento de Siglec-7 a pesar de un reclutamiento eficaz de CD16. Estos resultados indican que el conjugado de trastuzumab y sialidasa remodela eficazmente la sinapsis de célula inmunitaria-cáncer mientras promueve la ADCC.
En el presente documento, se informa de una nueva clase de conjugados que pueden realizar la edición de glucanos de la superficie celular específica de tejido para mejorar la susceptibilidad a la ADCC. Los conjugados proporcionan el primer medio para una terapia de un solo anticuerpo que se dirige de manera simultánea a múltiples vías de estimulación inmunitaria. El tratamiento de células tumorales con el conjugado de anticuerpo y sialidasa no solo recluta activamente células NK a través de la interacción Fc-FcyIII (CD16), sino también retarda de manera eficaz el reclutamiento de receptores inhibidores Siglec en la sinapsis inmunitaria-tumor y expone la activación de ligandos de NKG2D a través de la edición precisa del glucocáliz. En comparación con el tratamiento con trastuzumab, el nuevo conjugado de trastuzumab y sialidasa puede dirigir de manera eficaz a las células NK para que eliminen las células cancerosas que expresan HER2 y es aún más eficaz para atacar las células de cáncer de mama con antígenos de baja abundancia. Esto tiene implicaciones significativas para la capacidad de tratar tumores que expresan HER2 de forma más moderada, ya que actualmente el trastuzumab solo se prescribe a pacientes con niveles muy elevados de expresión de HER2.
En particular, los macrófagos y las células dendríticas también expresan Siglecs inhibidores (Siglec-9 y -5, respectivamente). Por lo tanto, la hipersialilación puede ser ampliamente protectora contra la diana inmunitaria innata de las células y los factores del complemento.
A diferencia de las terapias inmunitarias contra el cáncer actuales, que cada una apunta a una sola vía, la edición del glucocáliz puede afectar múltiples vías a través de varias ramas del armamento del sistema inmunitario.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un conjugado adecuado para su uso en el tratamiento del cáncer, comprendiendo el conjugado una sialidasa y un anticuerpo que se une a una molécula de la superficie celular de una célula cancerosa, en donde la sialidasa se conjuga con el anticuerpo a través de un enlazador y, cuando se conjuga, la sialidasa es capaz de escindir un sialoglucano en la superficie de la célula cancerosa.
2. El conjugado de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es una IgG, un Fv monocatenario (scFv), Fab, (Fab)2 o (scFv')2.
3. El conjugado de la reivindicación 1 o 2, en donde la sialidasa se conjuga con una cadena pesada del anticuerpo, opcionalmente, en donde la sialidasa se conjuga con una región Fc del anticuerpo o el extremo C de la cadena pesada.
4. El conjugado de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la célula cancerosa se selecciona del grupo que consiste en: una célula de carcinoma, una célula de cáncer de mama, una célula de cáncer de ovario, una célula de cáncer gástrico y una célula de cáncer de colon.
5. El conjugado de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la sialidasa es una sialidasa de Salmonella typhimurium, una sialidasa de Vibrio cholerae o una neuraminidasa de mamífero.
6. El conjugado de la reivindicación 5, en donde la neuraminidasa de mamífero es una neuraminidasa humana.
7. El conjugado de la reivindicación 6, en donde la neuraminidasa humana se selecciona del grupo que consiste en: neuraminidasa 1 humana, neuraminidasa 2 humana, neuraminidasa 3 humana y neuraminidasa 4 humana.
8. El conjugado de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el enlazador es un péptido.
9. El conjugado de la reivindicación 8, en donde el conjugado es una proteína de fusión.
10. Un método para producir el conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende conjugar una sialidasa con un anticuerpo que se une a una molécula de la superficie celular en la superficie de una célula cancerosa, en donde la sialidasa se conjuga con el anticuerpo a través de un enlazador y, cuando se conjuga, la sialidasa es capaz de escindir un sialoglucano en la superficie de la célula cancerosa.
11. Un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la reivindicación 9.
12. Un vector de expresión que comprende un promotor ligado operativamente al ácido nucleico de la reivindicación 11.
13. Una célula hospedadora que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 11 o el vector de expresión de la reivindicación 12, opcionalmente, en donde la célula hospedadora es una célula hospedadora de mamífero.
14. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso en un método para tratar el cáncer.
15. El conjugado para el uso de la reivindicación 14, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en: un carcinoma, un cáncer de mama, un cáncer de ovario, un cáncer gástrico y un cáncer de colon.
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