ES2941897T3 - Compuestos que interaccionan con glicanos y procedimientos de uso - Google Patents

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Abstract

La presente invención proporciona anticuerpos que interactúan con glicanos y métodos para producir anticuerpos que interactúan con glicanos útiles en el tratamiento y prevención de enfermedades humanas, incluido el cáncer. Dichos anticuerpos que interactúan con glicanos incluyen anticuerpos monoclonales, derivados y fragmentos de los mismos, así como composiciones y kits que los comprenden. Además se proporcionan métodos de uso de anticuerpos que interactúan con glicanos para dirigirse a células y tratar enfermedades. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Compuestos que interaccionan con glicanos y procedimientos de uso
REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS
La presente solicitud reivindica prioridad con respecto a la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No. 62/078.610 presentada el 12 de noviembre de 2014 titulada Glycan-Interacting Compounds and Methods of Use, la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No. 62/102.527, presentada el 12 de enero de 2015 y titulada Glycan-Interacting Compounds and Methods of Use, la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No. 62/145.214, presentada el 9 de abril de 2015 y titulada titulada Compositions and Methods for Targeting Cancer Stem Cells, la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No. 62/173.560, presentada el 10 de junio de 2015 ytitulada Compounds and Methods of Use, y la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No. 62/187.587, presentada el 1 de julio de 2015 y titulada Glycan-Interacting Compounds and Methods of Use.
APOYO DEL GOBIERNO
Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno bajo la subvención No. HHSN261201400027C otorgada por el Departamento de Salud y Servicios Humanos. El gobierno de los Estados Unidos puede tener ciertos derechos sobre la invención.
LISTA DE SECUENCIAS
La solicitud instantánea contiene una lista de secuencias que se ha enviado electrónicamente en formato ASCII. Dicha copia ASCII, creada el 1 de noviembre de 2015, se denomina 2033_1012PCT_SL.txt y tiene un tamaño de 144.772 bytes.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
Esta invención se refiere a procedimientos para el desarrollo de compuestos y composiciones, incluyendo, pero no limitado a anticuerpos para la detección y/o eliminación de materia glicosilada de un organismo.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La glicosilación aberrante acompaña a algunas de las otras mutaciones comúnmente observadas en los carcinomas. Se ha estimado que aproximadamente 80 % de todos los carcinomas expresan los glicanos truncados, el antígeno Tn y la forma sialilada, Sialyl Tn (STn). Con pocas excepciones, la Tn y la STn no se expresan en los tejidos sanos normales. Además, el ácido siálico no inmunógeno, el ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc), parece expresarse diferencialmente en carcinomas tal como el cancer de mama en forma de Neu5Gc-STn (GcSTn).
Se han descrito múltiples formas aberrantes de glicosilación en cánceres humanos, identificando glicanos específicos como una clase de moléculas de superficie celular adecuadas para la orientación específica hacia tumores (Cheever, M.A. et al., Clin Cancer Res. 2009 Sep 1;15(17):5323-37). Por ejemplo, diversos tipos de cáncer humano (tal como cancer de vejiga, mama, cuello uterino, colon, pulmón y ovario, entre otros) muestran una elevada expresión del antígeno STn, que es poco frecuente en los tejidos humanos normales (Karlen, P. et al., Gastroenterology. 1998 Dec;11 5(6): 1395-404; Ohno, S. et al, Anticancer Res. 2006 Nov-Dic;26(6A):4047-53). Además, la presencia de STn en mucinas asociadas a tumores se relaciona con cáncer de mal pronóstico y, por tanto, se considera un epítopo atractivo para la detección del cáncer y la terapia dirigida (Cao, Y. et al., Virchows Arch. 1997 Sep;431(3): 159­ 66; Julien, S. et al., Br J Cancer. 2009 Jun 2;100(11): 1746-54; Itzkowitz, S.H. et al., Cancer. 1990 Nov 1;66(9):1960-6; Motoo, Y. et al., Oncology. 1991;48(4):321-6; Kobayashi, H. et al., J Clin Oncol. 1992 Enero;10(1):95-101). La formación de Tn y STn está asociada a mutaciones somáticas en el gen Cosmc que codifica un chaperón molecular necesario para la formación de la T-sintasa activada (Ju, T. et al., Nature. 2005 Oct 27;437(7063):1252; Ju, T. et al., Cancer Res. 2008 Mar 15;68(6): 1636-46). También puede ser el resultado de una mayor expresión de la sialil transferasa, ST6GalNAc-I (Ikehara, Y. et al., Glycobiology. 1999 Nov;9(11): 1213-24; Brockhausen, I. et al., Biol Chem.
2001 Feb;382(2):219-32). La expresión de-novo de STn puede modular las células de carcinoma, cambiar el fenotipo maligno y conducir a comportamientos celulares más agresivos (Pinho, S. et al., Cancer Lett. 2007 Mayo 8;249(2): 157-70). Aunque la STn se expresa en gran medida en tejidos malignos, también se encuentran niveles bajos en células humanas sanas (Jass, J.R. et al., J Pathol. 1995 Jun;176(2):143-9; Kirkeby, S. et al., Arch Oral Biol. 2010 Nov;55(11):830-41). La STn por sí sola ha atraído la atención como objetivo para la detección y el tratamiento del cáncer (Cheever, M.A. et al., Clin Cancer Res.2009 Sep 1;15(17):5323-37). La STn también está presente en mucinas asociadas a células madre cancerosas (Engelmann et al., Cancer research, 2008, 68, 2419-2426) y la STn está implicada en la supresión inmunitaria (Carrascal, M.A., et al., Molecular Oncology. 2014. 8(3): 753-65).
Además de la presencia de STn, se han descrito otros cambios de glicosilación en el cáncer. Uno de ellos es el Neu5Gc. El ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac) y el Neu5Gc son los dos principales ácidos siálicos de la superficie celular de los mamíferos. Neu5Ac y Neu5Gc difieren únicamente en que Neu5Gc comprende un átomo de oxígeno adicional asociado al grupo químico unido al carbono 5. Debido a la pérdida de un gen funcional, los humanos sólo pueden sintetizar ácido siálico en forma de Neu5Ac, pero no Neu5Gc. Sin embargo, el Neu5Gc puede incorporarse metabólicamente a los seres humanos a partir de fuentes alimentarias de origen animal, tal como las carnes rojas (Tangvoranuntakul, P. et al., Proc Natl Acad Sci EE. UU. 2003 Oct 14; 100(21):12045-50; Nguyen, D.H. et al., J Immunol. 2005 Jul 1; 175(1):228-36; documentos US7,682,794, US8,084,219, US2012/0142903 y WO2010030666). Neu5Gc es significativamente abundante en los tumores humanos (Higashi, H. et al., Cancer Res. 1985 Ago; 45(8):3796-802; Miyoshi I. et al., Mol Immunol. 1986. 23: 631-638; Hirabayashi, Y. et al., Jpn J Cancer Res. 1987. 78: 614-620; Kawachi. S, et al., Int Arch Allergy Appl Immunol. 1988. 85: 381-383; Devine, P.L. et al., Cancer Res. 1991.
51: 5826-5836; Malykh, Y.N. et al, Biochimie. 2001. 83: 623-634 y Inoue, S. et al., 2010. Glycobiology. 20(6): 752-762) y notablemente bajo en tejidos humanos normales, que se había pasado por alto durante varias décadas (Diaz, S.L. et al., PLoS One. 2009. 4: e4241; Tangvoranuntakul, P. et al., Proc Natl Acad Sci EE. UU. 2003. 100: 12045­ 12050; Varki, A. et al., Glycoconj J. 2009. 26: 231-245). La mayor acumulación metabólica de Neu5Gc derivado de la dieta en el tejido canceroso en comparación con los tejidos humanos sanos se explica probablemente por al menos tres factores: un crecimiento rápido con una producción insuficiente de Neu5Ac endógeno competidor, una macropinocitosis mejorada inducida por factores de crecimiento (Dharmawardhane, S. et al., Mol Biol Cell. 2000 Oct;11(10):3341-52; Simonsen, A. et al., Curr Opin Cell Biol. 2001 Aug;13(4):485-92; Johannes, L. et al., Traffic. 2002 Jul;3(7):443-51; Amyere, M. et al., Int J Med Microbiol. 2002 Feb;291(6-7):487-94), y el aumento de la expresión génica del gen transportador de ácido siálico lisosómico sialina por hipoxia (Yin, J. et al., Cancer Res. 2006 Mar 15;66(6):2937-45). Además, todos los humanos analizados hasta la fecha comprenden un reservorio de anticuerpos policlonales contra el Neu5Gc no humano, lo que lo convierte en el primer ejemplo de xenoautoantígeno (Padler-Karavani, V. et al., Glycobiology. 2008 oct;18(10):818-30; Varki, N.M. et al., Annu Rev Pathol. 2011;6:365-93). Se ha demostrado que la acumulación de Neu5Gc dietético en tumores malignos frente a una respuesta anti-Neu5Gc facilita la progresión tumoral al inducir una inflamación crónica de bajo grado (Hedlund, M. et al., Proc Natl Acad Sci EE. UU. 2008 Dic 2;105(48):18936-41). Así pues, los epítopos de glicanos que contienen Neu5Gc en los tumores humanos representan una valiosa posibilidad para orientar fármacos. Un estudio reciente sugiere la existencia de anticuerpos contra la STn que contiene Neu5Gc (GcSTn), pero no Neu5Ac-STn (AcSTn), en pacientes con cáncer y explora su potencial como biomarcador específico para la detección del cáncer (Padler-Karavani, V. et al., Cancer Res. 2011 Mayo 1;71(9):3352-63). Blixt et al ("Glycan Microarray Analysis of Tumor-Associated Antibodies" en Paul Kosma (Ed) "Anticarbohydrate Antibodies", 27 Nov 2011, Springer-Verlag, Wien) divulga que el mAb 3F1 se une tanto a Neu5Ac-Tn como a Neu5Gc-Tn.
Sigue existiendo una necesidad en la técnica de anticuerpos capaces de unirse a glicanos, incluyendo glicanos asociados con enfermedades y células y tejidos enfermos. Dichos anticuerpos podrían utilizarse para atacar células tumorales y tejidos cancerosos y para tratar a sujetos enfermos de cáncer. Además, siguen siendo necesarios mejores procedimientos para desarrollar dichos anticuerpos, así como procedimientos para la caracterización específica de epítopos unidos por anticuerpos que interactúan con glicanos. La presente invención satisface esta necesidad proporcionando anticuerpos dirigidos contra glicanos, proporcionando procedimientos de desarrollo de anticuerpos antiglicanos y proporcionando procedimientos de uso de anticuerpos antiglicanos para identificar y orientar células y tejidos cancerosos en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un anticuerpo como se describe en las reivindicaciones. También se divulgan anticuerpos que comprenden un dominio variable, el dominio variable que comprende al menos 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 15-52 o un fragmento del mismo. En algunos casos, dichos anticuerpos comprenden un par de dominios variables seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:30; SEQ iD NO:15 y SEQ ID NO:16; SEQ ID NO:17 y SEQ ID NO:18; SEQ ID NO:19 y SEQ ID NO:20; SEQ ID NO:21 y SEQ ID NO:22; SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24; SEQ ID NO:25 y SEQ ID NO:26; SEQ ID NO:27 y SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:31 y SEQ ID NO:32; SEQ ID NO:35 y SEQ ID NO:36; SEQ ID NO:37 y SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:39 y SEQ ID NO:40; SEQ ID NO:42 y SEQ ID NO:32; SEQ ID NO:44 y SEQ ID NO:45; SEQ ID NO:46 y SEQ ID NO:32; SEQ ID NO:47 y SEQ ID NO:32; SEQ ID NO:48 y SEQ ID NO:50; SEQ ID NO:48 y SEQ ID NO:49; y SEQ ID NO:51 y SEQ ID NO:52.
Algunos anticuerpos comprenden al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) que comprende de aproximadamente 60 % a aproximadamente 95 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 81-148, SEQ ID NOs: 152-155, y SEQ ID NOs: 159-164. En algunos casos, dichos anticuerpos comprenden una CDR con un dominio variable de cadena pesada (VH) CDR (CDR-H) que comprende al menos 70 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 81-99, SEQ ID NOs: 143-148, y SEQ ID NOs: 152-155. Algunos anticuerpos comprenden una CDR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 90-99, y SEQ ID NOs: 152-155. En algunos casos, los anticuerpos comprenden un dominio variable de cadena ligera (VL) CDR (CDR-L) que comprende al menos 70 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 100-142, y SEQ ID NOs: 159-164. Dichos anticuerpos pueden comprender un CDR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 127-142.
La presente divulgación proporciona un anticuerpo que comprende: (1) un CDR-L1 seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 100-114, y SEQ ID NOs: 159-167; (2) un CDR-L2 seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 115-126, y SEQ ID n Os: 168-170; (3) un CDR-L3 seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 127-142, y SEQ ID NOs: 171-173; (4) un CDR-H1 seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 81-83, SEQ ID NO: 143, y SEQ ID NO: 144; (5) un CDR-H2 seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 84-89, y SEQ ID NOs: 145-151; y (6) un CDR-H3 seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 90-99, y SEQ ID NOs: 152­ 158.
Algunos anticuerpos de la divulgación son anticuerpos monoclonales. Algunos anticuerpos presentan un isotipo IgG1. Otros anticuerpos presentan un isotipo IgG2. En algunos casos, los anticuerpos de la divulgación pertenecen a un grupo de anticuerpos seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo del Grupo 1, un anticuerpo del Grupo 2, un anticuerpo del Grupo 3 y un anticuerpo del Grupo 4. Algunos anticuerpos se dirigen específicamente a un antígeno seleccionado del grupo que consiste en el antígeno N-acetilneuramínico sialil Tn (AcSTn) y el antígeno N-glicolilneuramínico sialil Tn (GcSTn). Dichos anticuerpos pueden dirigirse a antígenos que comprenden un grupo 9-O-acetilo. Algunos anticuerpos se unen a un grupo de dos o más glicanos. Otros anticuerpos comprenden anticuerpos biespecíficos.
En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención se utilizan en un conjugado anticuerpo-fármaco. Algunos conjugados anticuerpo-fármaco comprenden un agente terapéutico. Algunos conjugados anticuerpo-fármaco comprenden un agente citotóxico. En algunos casos, los agentes citotóxicos se conjugan directamente con anticuerpos. En algunos casos, los agentes citotóxicos se conjugan con anticuerpos mediante un enlazador. Dichos enlazadores pueden incluir enlazadores escindibles o no escindibles. En algunos casos, el agente citotóxico es un agente que daña el ADN. En algunos casos, el agente citotóxico es un inhibidor del citoesqueleto.
Los anticuerpos de la invención se unen a un antígeno carbohidrato asociado a tumor (TACA). Dichos TACA pueden incluir el antígeno Tn, el antígeno Tn sialilado (STn), el antígeno Thomsen-Friedenreich, el antígeno LewisY(LeY), el antígeno LewisX (LeX), el antígeno Sialyl LewisX (SLeX), el antígeno Sialyl LewisA (SLeA), el Globo H, el antígeno embrionario específico de estadio-3 (SSEA-3), un glicoesfingolípido que comprende ácido siálico, el gangliósido GD2, el gangliósido GD3, el gangliósido GM2, el fucosil GM1, el gangliósido Neu5GcGM3 o un antígeno relacionado con el ácido polisiálico.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un anticuerpo de la invención para su uso en la destrucción de una célula tumoral.
De acuerdo con otras realizaciones, la presente invención proporciona un anticuerpo de la invención para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el procedimiento administrar al sujeto un anticuerpo de la invención. En algunos casos, dichos procedimientos se utilizan para tratar un cáncer epitelial. Dichos cánceres epiteliales pueden incluir cáncer de mama, colon, pulmón, vejiga, cuello uterino, ovario, estómago, próstata y/o hígado.
En algunos aspectos, la presente invención proporciona composiciones que comprenden al menos uno de los anticuerpos de la invención. Además, se proporcionan kits que comprenden dichas composiciones e instrucciones de uso de las mismas.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona procedimientos para reducir el volumen tumoral en un sujeto que comprenden administrar a dicho sujeto una composición de la invención. En algunos casos, los procedimientos de la invención pueden utilizarse para aumentar la actividad inmunitaria de las células antitumorales poniendo en contacto al menos una célula tumoral inmunorresistente con un anticuerpo de la invención. Dicha actividad inmunitaria de las células antitumorales puede incluir la actividad inmunitaria innata (por ejemplo, la actividad antitumoral de las células asesinas naturales (NK)). En algunos casos, la actividad de las células antitumorales incluye la actividad inmunitaria adaptativa (por ejemplo, la actividad de las células B contra las células tumorales o la actividad de las células dendríticas (CD) contra las células tumorales). En algunos casos, las composiciones de la invención pueden aumentar la expresión en DC de uno o más factores seleccionados del grupo que consiste en CD80, CD86, IL-12 y TNF-a. Otros procedimientos de la invención incluyen el tratamiento de un tumor inmunorresistente en un sujeto que lo necesite mediante la administración de una composición de la invención.
De acuerdo con algunas realizaciones, la presente invención proporciona un anticuerpo de la invención para su uso en la reducción o eliminación de células madre cancerosas (CSC) en un sujeto. En algunos casos, las CSC están presentes en el tejido mamario, ovárico, pancreático, vesical, cervical, de colon y/o pulmonar. En algunos casos, las CSC comprenden biomarcadores CD133 y/o CD44. En algunos casos, los procedimientos para reducir o eliminar las CSC comprenden además la administración de al menos un agente quimioterapéutico. Dichos agentes quimioterapéuticos pueden seleccionarse entre paclitaxel y carboplatino.
También se divulgan intracuerpos que comprenden un dominio variable que comprende al menos 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 15-52 y un fragmento del mismo. Algunos intracuerpos comprenden un par de dominios variables seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:30; SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO:17 y SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO:19 y SEQ ID NO:20; SEQ ID NO:21 y SEQ ID NO:22; SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24; SEQ ID NO:25 y SEQ ID NO:26; SEQ ID NO:27 y SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:31 y SEQ ID NO:32; SEQ ID NO:35 y SEQ ID NO:36; SEQ ID NO:37 y SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:39 y SEQ ID NO:40; SEQ ID NO:42 y SEQ ID NO:32; SEQ ID NO:44 y SEQ ID NO:45; SEQ ID NO:46 y SEQ ID NO:32; SEQ ID NO:47 y SEQ ID NO:32; SEQ ID NO:48 y SEQ ID NO:50; SEQ ID NO:48 y SEQ ID NO:49; y SEQ ID NO:51 y SEQ ID NO:52.
También se divulga un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un dominio variable que comprende al menos 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 15-52 y un fragmento del mismo. Algunos CAR comprenden un par de dominios variables seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:30; Se Q ID NO: 15 y SEQ ID NO:16; SEQ ID NO:17 y SEQ ID NO:18; SEQ ID NO:19 y SEQ ID NO:20; SEQ ID NO:21 y SEQ ID NO:22; SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24; SEQ ID NO:25 y SEQ ID NO:26; SEQ ID NO:27 y SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:31 y SEQ ID NO:32; SEQ ID NO:35 y SEQ ID NO:36; SEQ ID NO:37 y SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:39 y SEQ ID NO:40; SEQ ID NO:42 y SEQ ID NO:32; SEQ ID NO:44 y SEQ ID NO:45; SEQ ID NO:46 y SEQ ID NO:32; SEQ ID NO:47 y SEQ ID NO:32; SEQ ID NO:48 y SEQ ID NO:50; SEQ ID NO:48 y SEQ ID NO:49; y SEQ ID NO:51 y SEQ ID NO:52.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona constructos que codifican anticuerpos de la invención. Dichos constructos pueden comprender al menos una secuencia de nucleótidos que tenga al menos 95 % de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 192-233 y un fragmento del mismo. También se divulgan constructos que codifican intracuerpos o CAR.
Se proporcionan además células que comprenden uno o más constructos de la invención. También se proporcionan virus que comprenden constructos de la invención.
De acuerdo con algunas realizaciones, la presente invención proporciona procedimientos de identificación de células y/o tejidos que expresan STn con anticuerpos de la invención. Además, se proporcionan procedimientos de identificación de células cancerosas en tejidos u órganos con anticuerpos de la invención. Dichos tejidos u órganos pueden incluir mama, ovario y páncreas.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona variantes de anticuerpos que comprenden variantes de anticuerpos de la invención informadas por análisis de secuencias. Dichas variantes de anticuerpos pueden comprender una especificidad y/o afinidad epitópica mejorada. También se proporcionan como parte de la divulgación variantes de anticuerpos que comprenden una modificación de la longitud CDR (por ejemplo, una modificación de la longitud CDR-H3). Algunas variantes de anticuerpos comprenden una sustitución de uno o más aminoácidos en una o más CDR. En algunos casos, las variantes de anticuerpos comprenden al menos una modificación genética de la línea germinal. Algunas variantes de anticuerpos comprenden un scFv, monocuerpo, diacuerpo, intracuerpo o CAR.
También se divulga un procedimiento de desarrollo de una biblioteca de expresión de fragmentos de anticuerpos que comprende: (1) alinear secuencias de aminoácidos de dominio variable entre dos o más anticuerpos de la invención; (2) identificar aminoácidos conservados y variables entre los anticuerpos alineados, y (3) construir una biblioteca de expresión de fragmentos de anticuerpos, en la que la variabilidad entre los miembros de la biblioteca se limita a la variación de aminoácidos de los aminoácidos variables identificados. Otras realizaciones proporcionan bibliotecas de expresión de fragmentos de anticuerpos producidas de acuerdo con dichos procedimientos. Otras realizaciones proporcionan anticuerpos que comprenden dominios variables aislados de dichas bibliotecas de expresión de fragmentos de anticuerpos. Dichos anticuerpos pueden incluir un scFv, un monocuerpo, un diacuerpo, un intracuerpo o un CAR.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Lo anterior y otros objetos, características y ventajas serán evidentes a partir de la siguiente descripción de realizaciones particulares de la invención, como se ilustra en los dibujos adjuntos. Los dibujos no están necesariamente a escala, sino que se hace hincapié en ilustrar los principios de las diversas realizaciones de la invención.
Las Figs. 1A-1D son diagramas que representan la N-acetilgalactosamina a2,6-sialilada (STn) e indican los epítopos putativos implicados en la unión del anticuerpo anti-STn. La elipse más grande de cada diagrama indica la región específica de STn a la que se dirige cada uno de los 4 grupos de anticuerpos. Estos grupos incluyen anticuerpos del Grupo 1 (unión a la región elíptica grande indicada en la Fig. 1A), anticuerpos del Grupo 2 (unión a la región elíptica grande indicada en la Fig. 1B), anticuerpos del Grupo 3 (unión a la región elíptica grande indicada en la Fig. 1C) y anticuerpos del Grupo 4 (unión a la región elíptica grande indicada en la Fig. ID).
Las Figs. 2A y 2B son gráficos de barras que presentan los datos de unión de anticuerpos. La Fig. 2A es un gráfico de barras que presenta los resultados de la unión de anticuerpos con células OVCAR3. La Fig. 2B es un gráfico de barras que presenta los resultados de la unión de anticuerpos con células SNU-16.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Introducción
De acuerdo con la presente invención son anticuerpos específicos para o que interactúan con epítopos que comprenden grupos de carbohidratos denominados en el presente documento como glicanos. Algunos anticuerpos que interactúan con glicanos descritos en el presente documento pueden utilizarse como bioterapéuticos. Otras realizaciones proporcionan procedimientos para generar dichos anticuerpos que interactúan con los glicanos.
En la naturaleza, los glicanos pueden estar sialilados con ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac) o ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc). Los anticuerpos que interactúan con glicanos de acuerdo con la presente invención pueden dirigirse a glicanos relacionados con el cáncer que comprenden N-acetilgalactosamina a2,6-sialilada (STn). Dichos anticuerpos pueden dirigirse a cualquier STns (anticuerpos pan-STn), glicanos que comprenden STns que tienen Neu5Ac específicamente (AcSTn) o glicanos que tienen STns que comprenden Neu5Gc específicamente (GcSTn). En algunas realizaciones, los anticuerpos que interactúan con glicanos de la presente invención se dirigen a otros antígenos glicanos relacionados con el cáncer.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona procedimientos de producción de anticuerpos que interactúan con glicanos. Tales procedimientos pueden comprender el uso de ratones para generar una respuesta inmunitaria a uno o más antígenos que comprenden STn (por ejemplo, AcSTn y/o GcSTn). Como se describe en el presente documento, pueden utilizarse varios procedimientos para manipular los anticuerpos resultantes producidos mediante inmunización en ratones. Dichos procedimientos pueden incluir la variación de la cepa y/o el sexo de los ratones inmunizados, la variación del antígeno utilizado, la variación del tipo y la dosis de adyuvante incluido en la administración del antígeno y el curso temporal de la inmunización antes del inicio de la fusión del hibridoma.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona procedimientos para eliminar células madre cancerosas utilizando anticuerpos que interactúan con glicanos. En otras realizaciones, la presente invención proporciona procedimientos para tratar el cáncer en un sujeto mediante la eliminación de células madre cancerosas utilizando anticuerpos que interactúan con glicanos. En algunos aspectos, los anticuerpos que interactúan con los glicanos pueden utilizarse solos. En otros aspectos, los anticuerpos que interactúan con los glicanos se utilizan en combinación con agentes quimioterapéuticos.
Se proporcionan además formas optimizadas, humanizadas y conjugadas de anticuerpos que interactúan con glicanos. Además, se presentan kits, ensayos y reactivos que comprenden anticuerpos y/o procedimientos de la presente invención.
Definiciones
Adyacente: Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "adyacente" se refiere a algo que es colindante, vecino o próximo a una entidad determinada. En algunas realizaciones, los "residuos adyacentes" son residuos de azúcar dentro de una cadena de glicano que están unidos entre sí. En algunas realizaciones, los "glicanos adyacentes" son cadenas de glicanos que se encuentran una al lado de la otra, bien en contacto directo o en estrecha proximidad y sin otro glicano entre ambas.
Administrado en combinación: Como se utiliza en el presente documento, el término "administrado en combinación" o "administración combinada" significa que un sujeto está expuesto simultáneamente a dos o más agentes administrados al mismo tiempo o dentro de un intervalo de tiempo tal que el sujeto está en algún momento simultáneamente expuesto a ambos y/o tal que puede haber un solapamiento en el efecto de cada agente sobre el paciente. En algunas realizaciones, al menos una dosis de uno o más agentes se administra en un plazo de aproximadamente 24 horas, 12 horas, 6 horas, 3 horas, 1 hora, 30 minutos, 15 minutos, 10 minutos, 5 minutos o 1 minuto de al menos una dosis de uno o más agentes. En algunas realizaciones, la administración se produce en regímenes de dosificación superpuestos. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "régimen de dosificación" se refiere a una pluralidad de dosis espaciadas en el tiempo. Dichas dosis pueden producirse a intervalos regulares o incluir uno o varios paréntesis en la administración. En algunas realizaciones, la administración de dosis individuales de uno o más anticuerpos que interactúan con los glicanos, como se describe en el presente documento, se espacian lo suficiente entre sí como para lograr un efecto combinatorio (por ejemplo, sinérgico).
Aminoácidos En el presente documento, los términos "aminoácido" y "aminoácidos" se refieren a todos los L-alfaaminoácidos naturales, así como a los aminoácidos no naturales. Los aminoácidos se identifican mediante las siguientes designaciones de una o tres letras: ácido aspártico (Asp:D), isoleucina (Ile:I), treonina (Thr:T), leucina (Leu:L), serina (Ser:S), tirosina (Tyr:Y), ácido glutámico (Glu:E), fenilalanina (Phe:F), prolina (Pro:P), histidina (His:H), glicina (Gly:G), lisina (Lys:K), alanina (Ala:A), arginina (Arg:R), cisteína (Cys:C), triptófano (Trp:W), valina (Val:V), glutamina (Gln:Q) metionina (Met:M), asparagina (Asn:N), donde el aminoácido se enumera primero seguido parentéticamente por los códigos de tres y una letra, respectivamente.
Animal: Como se utiliza en el presente documento, el término “animal” se refiere a cualquier miembro del reino animal. En algunas realizaciones, "animal" se refiere a humanos en cualquier etapa de desarrollo. En algunas realizaciones, "animal" se refiere a animales no humanos en cualquier etapa de desarrollo. En ciertas realizaciones, el animal no humano es un mamífero (por ejemplo. un roedor, un ratón, una rata, un conejo, un mono, un perro, un gato, una oveja, ganado, un primate o un cerdo). En algunas realizaciones, los animales incluyen, pero no se limitan a, mamíferos, aves, reptiles, anfibios, peces y gusanos. En algunas realizaciones, el animal es un animal transgénico, un animal modificado genéticamente o un clon.
Anticuerpo: Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "anticuerpo" se emplea en el sentido más amplio y abarca específicamente diversas formas de realización, incluyendo, pero no limitado a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos) y fragmentos de anticuerpos, tales como los diacuerpos, siempre que presenten una actividad biológica deseada. Los anticuerpos son principalmente moléculas con base en aminoácidos, pero también pueden incluir una o más modificaciones, tal como por ejemplo fracciones de azúcar.
Fragmento de anticuerpo: Tal como se utiliza en el presente documento, el término "fragmento de anticuerpo" se refiere a una porción de un anticuerpo intacto, que comprende preferentemente una región de unión a antígeno del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos de cadena sencilla; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. La digestión de los anticuerpos con papaína produce dos fragmentos idénticos de unión al antígeno, denominados fragmentos "Fab", cada uno con un único sitio de unión al antígeno. También se produce un fragmento residual "Fc", cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de unión al antígeno y sigue siendo capaz de reticular el antígeno. Los anticuerpos que interactúan con glicanos pueden comprender uno o más de estos fragmentos. A efectos del presente documento, un anticuerpo puede comprender un dominio variable pesado y ligero, así como una región Fc.
Aproximadamente: Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente" o "de manera aproximada", cuando se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia establecido. En ciertas realizaciones, el término "aproximadamente" o "de manera aproximada" se refiere a un intervalo de valores que se encuentran dentro del 25 %, 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % o menos en cualquier dirección (mayor o menor que) del valor de referencia establecido a menos que se indique lo contrario o sea evidente del contexto (excepto donde tal número excedería 100 % de un valor posible).
Asociado a: Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "asociado con", "conjugado", "enlazado", "unido" y "atado", cuando se utilizan con respecto a dos o más fracciones, significan que las fracciones están físicamente asociadas o conectadas entre sí, ya sea directamente o a través de una o más fracciones adicionales que sirven como agente de enlace, para formar una estructura que es lo suficientemente estable como para que las fracciones permanezcan físicamente asociadas en las condiciones en las que se utiliza la estructura, por ejemplo, condiciones fisiológicas. Una "asociación" no tiene por qué ser estrictamente a través de un enlace químico covalente directo. También puede sugerir un enlace iónico o de hidrógeno o una conectividad basada en la hibridación lo suficientemente estable como para que las entidades "asociadas" permanezcan físicamente asociadas.
Bifuncional: Tal como se utiliza en el presente documento, el término "bifuncional" se refiere a cualquier sustancia, molécula o fracción que es capaz de realizar o mantiene al menos dos funciones. Las funciones pueden afectar al mismo resultado o a un resultado diferente. La estructura que produce la función puede ser la misma o diferente.
Biomolécula: Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "biomolécula" es cualquier molécula natural basada en aminoácidos, ácidos nucleicos, carbohidratos o lípidos, y similares.
Anticuerpo biespecífico: En el presente documento, el término "anticuerpo biespecífico" se refiere a un anticuerpo capaz de unirse a dos antígenos diferentes. Dichos anticuerpos suelen comprender regiones de al menos dos anticuerpos diferentes. Los anticuerpos biespecíficos pueden incluir cualquiera de los descritos en Riethmuller, G.
2012. Cancer Immunity. 12:12-18, Marvin, J.S. et al., 2005. Acta Pharmacologica Sinica. 26(6):649-58 y Schaefer, W. et al., 2011. PNAS. 108(27): 11187-92.
Rama: En el presente documento, el término "rama" se refiere a una entidad, fracción o apéndice que está vinculado o se extiende desde una entidad principal o fuente. En algunas realizaciones, una "cadena ramificada" o "cadena de ramificación" comprende uno o más residuos (incluyendo, pero no limitado a, residuos de azúcar) que se extienden desde una cadena madre. Tal y como se utiliza en el presente documento, una "cadena madre" se utiliza para referirse a una cadena de residuos (incluyendo, pero no limitado a, los residuos de azúcar) a partir de la cual se enlaza una cadena ramificada. En el caso de un glicano con múltiples ramificaciones, la cadena madre también puede referirse a la cadena de origen a partir de la cual se unen directa o indirectamente todas esas ramificaciones. En el caso de un polisacárido que comprende una cadena de residuos de hexosa, los enlaces de la cadena madre se producen normalmente entre los carbonos 1 y 4 de residuos adyacentes, mientras que las cadenas ramificadas se unen a una cadena madre a través de un enlace entre el carbono 1 del residuo ramificado y el carbono 3 del residuo madre del que se extiende la ramificación. Tal como se utiliza aquí, el término "residuo de ramificación" se refiere al residuo unido a la cadena madre en una cadena de ramificación.
Células madre cancerígenas: En el presente documento, las células madre cancerosas (CSC) se refieren a un subconjunto de células tumorales que tienen la capacidad de autorrenovarse. Las CSC pueden ser capaces de regenerar diversos tipos de células. En algunos casos, estas células son difíciles o imposibles de eliminar mediante tratamiento quirúrgico o químico de un tumor.
Compuesto: Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "compuesto" se refiere a una entidad química distinta. En algunas realizaciones, un compuesto particular puede existir en una o más formas isoméricas o isotópicas (incluyendo, pero sin limitarse a estereoisómeros, isómeros geométricos e isótopos). En algunas realizaciones, un compuesto se proporciona o utiliza en una única forma de este tipo. En algunas realizaciones, un compuesto se proporciona o utiliza como una mezcla de dos o más de dichas formas (incluyendo, pero sin limitarse a una mezcla racémica de estereoisómeros). Los expertos en la técnica aprecian que algunos compuestos existen en diferentes formas y muestran diferentes propiedades y/o actividades (incluyendo, pero sin limitarse a, actividades biológicas). En tales casos está dentro de la habilidad ordinaria de aquellos en la técnica seleccionar o evitar formas particulares del compuesto para su uso de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, los compuestos que contienen átomos de carbono sustituidos asimétricamente pueden aislarse en formas ópticamente activas o racémicas. Los procedimientos para preparar formas ópticamente activas a partir de materiales de partida ópticamente activos son conocidos en la técnica, tal como la resolución de mezclas racémicas o la síntesis estereoselectiva.
Cíclico o ciclizado: Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "cíclico" se refiere a la presencia de un bucle continuo. Las moléculas cíclicas no necesitan ser circulares, sólo estar unidas para formar una cadena ininterrumpida de subunidades.
Monofosfato de citidina-ácido N-acetilneuramínico hidroxilasa: Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "citidina monofosfato-ácido N-acetilneuramínico hidroxilasa" o "CMAH" se refiere a una enzima, ausente en humanos, pero presente en la mayoría de otros mamíferos (incluyendo, pero no limitado a ratones, cerdos y chimpancés) que cataliza la formación de ácido N-glicolilneuramínico a partir de ácido N-acetilneuramínico. La ausencia de la enzima en humanos se debe a una mutación que provoca la terminación prematura del transcrito de la CMAH y la producción de una proteína no funcional.
Citotóxico: Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "citotóxico" se utiliza para referirse a un agente que mata o causa efectos nocivos, tóxicos o mortales en una célula (por ejemplo, una célula de mamífero (por ejemplo, una célula humana)), bacteria, virus, hongo, protozoo, parásito, prión o una combinación de los mismos.
Administración: Tal y como se utiliza en el presente documento, "administración" se refiere al acto o la forma de transportar un compuesto, sustancia, entidad, fracción, carga o carga útil a un destino previsto.
Agente de administración: Tal y como se utiliza en el presente documento, se entiende por "agente de administración" cualquier sustancia que facilite, al menos en parte, la administración in vivo de un compuesto, sustancia, entidad, fracción, carga o carga útil.
Etiqueta detectable: Tal como se utiliza en el presente documento, "etiqueta detectable" se refiere a uno o más marcadores, señales o elementos que están unidos, incorporados o asociados a otra entidad, cuyos marcadores, señales o fracciones se detectan fácilmente por procedimientos conocidos en la técnica, incluyendo la radiografía, la fluorescencia, la quimioluminiscencia, la actividad enzimática, la absorbancia y similares. Las etiquetas detectables incluyen radioisótopos, fluoróforos, cromóforos, enzimas, tintes, iones metálicos, ligandos tales como biotina, avidina, estreptavidina y haptenos, puntos cuánticos y similares. Las etiquetas detectables pueden estar situadas en cualquier posición de la entidad a la que están adheridas, incorporadas o asociadas. Por ejemplo, cuando están unidos, incorporados o asociados a un péptido o proteína, pueden estar dentro de los aminoácidos, los péptidos o las proteínas, o localizados en los extremos N o C.
Biblioteca de expresión: Tal como se utiliza en el presente documento, el término "biblioteca de expresión" se refiere a una herramienta utilizada en el descubrimiento científico para identificar interacciones biomoleculares. Existen diferentes variaciones de bibliotecas de expresión que incluyen la utilización de bacteriófagos, levaduras y ribosomas. En cada caso, las proteínas de una determinada biblioteca (también denominadas en el presente documento "miembros de la biblioteca") están vinculadas (físicamente o mediante asociación con un huésped) al ácido nucleico que codifica la proteína. Cuando una molécula objetivo se incuba con los miembros de una biblioteca de expresión, cualquier miembro de la biblioteca que se una al objetivo puede aislarse y las secuencias que codifican la proteína unida pueden determinarse mediante el análisis del ácido nucleico unido. En algunas realizaciones, las bibliotecas de expresión son "bibliotecas de expresión de fagos" en las que la biblioteca de expresión se compone de partículas virales de bacteriófagos (también denominadas en el presente documento "partículas de fagos") en las que se han incorporado ácidos nucleicos al genoma del fago, lo que da lugar a la producción de proteínas de la cubierta viral que se fusionan con proteínas codificadas por los ácidos nucleicos que se han introducido. Estas proteínas fusionadas se "muestran" en la superficie exterior de las partículas de fago ensambladas, donde pueden interactuar con un objetivo determinado.
Distal: Tal como se utiliza en el presente documento, el término "distal" significa situado lejos del centro o lejos de un punto o región de interés.
Modificado: Tal y como se utiliza en el presente documento, las realizaciones de la invención son "modificadas" cuando están diseñadas para tener una característica o propiedad, ya sea estructural o química, que varía con respecto a un punto de partida, tipo silvestre o molécula nativa. Así, los agentes o entidades modificados son aquellos cuyo diseño y/o producción incluyen un acto de la mano del hombre.
Epítopo: Tal y como se utiliza en el presente documento, un "epítopo" se refiere a una superficie o región de una molécula que es capaz de interactuar con componentes del sistema inmunitario, incluyendo, pero no limitado a los anticuerpos. En algunas realizaciones, un epítopo puede comprender un sitio objetivo. Los epítopos pueden comprender una región en un antígeno o entre dos o más antígenos que es específicamente reconocida y unida por un anticuerpo correspondiente. Algunos epítopos pueden comprender uno o más residuos de azúcar a lo largo de uno o más glicanos. Dichos epítopos pueden comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o al menos 10 residuos de azúcar. Los epítopos también pueden comprender una o más regiones de interacción entre entidades. En algunas realizaciones, los epítopos pueden comprender una unión entre dos residuos de azúcar, entre una cadena ramificada y una cadena madre o entre un glicano y una proteína.
Enlace éter: Tal y como se utiliza en el presente documento, un "enlace éter" se refiere a un enlace químico que comprende un oxígeno enlazado entre dos átomos de carbono. En algunas realizaciones, los enlaces éter enlazan residuos de azúcar a otras entidades, incluyendo, pero sin limitarse a otros residuos de azúcar para formar una cadena de glicano. Estos enlaces también se denominan "uniones glicosídicas" o "enlaces glicosídicos". En el contexto de al menos un residuo de azúcar, los términos "unión" y/o "enlace" también se utilizan en el presente documento cuando se refieren a un enlace glucosídico. En algunas realizaciones, los enlaces pueden unir glicanos a otras entidades, incluyendo, pero sin limitarse a proteínas, lípidos, fosfolípidos y esfingolípidos. En algunas realizaciones, los residuos de azúcar pueden estar unidos a proteínas, formando típicamente un enlace entre un residuo de azúcar y un residuo de aminoácido. Dichos residuos de aminoácidos incluyen la serina y la treonina. En algunas realizaciones, los enlaces éter enlazan glicanos a un conjunto de glicanos que comprende un enlazador carbohidrato que participa en la formación del enlace. Los enlaces glicosídicos pueden diferir en sus propiedades estereoquímicas. En algunas realizaciones, los enlaces glicosídicos orientados alfa (también denominados en el presente documento "enlaces alfa") dan lugar a una orientación axial entre el oxígeno enlazado del enlace éter y el anillo de ciclohexano del azúcar residuo. En algunas realizaciones, los enlaces glicosídicos orientados beta (también denominados en el presente documento "enlaces beta") dan lugar a una orientación ecuatorial entre el oxígeno enlazado del enlace éter y el anillo de ciclohexano del residuo de azúcar.
Expresión: Tal como se utiliza en el presente documento, "expresión" puede referirse a uno o más de los siguientes eventos: (1) producción de una plantilla de ARN a partir de una secuencia de ADN (por ejemplo, mediante transcripción); (2) procesamiento de una transcripción de ARN (por ejemplo, mediante corte y empalme, edición, formación de caperuza en 5' y/o procesamiento en el extremo 3'); (3) traducción de un ARN en un polipéptido o proteína; (4) plegamiento de un polipéptido o proteína; y (5) modificación postraduccional de un polipéptido o proteína (por ejemplo, por glicosilación).
Característica: Tal y como se utiliza en el presente documento, un "rasgo" se refiere a una característica, una propiedad o un elemento distintivo.
Formulación: Tal como se utiliza en el presente documento, una "formulación" se refiere a un material o mezcla preparado de acuerdo con una fórmula y que puede comprender al menos un anticuerpo, compuesto, sustancia, entidad, fracción, carga o carga útil y un agente de administración, portador o excipiente.
Funcional: Tal como se utiliza en el presente documento, una molécula biológica "funcional" es una entidad biológica con una estructura y en una forma en la que presenta una propiedad y/o actividad por la que se caracteriza. Tal y como se utiliza en el presente documento, un "grupo funcional" o "grupo químico" se refiere a un grupo característico de átomos o enlaces químicos que forman parte de una molécula mayor. En algunas realizaciones, los grupos funcionales pueden estar asociados a diferentes moléculas, pero pueden participar en reacciones químicas similares independientemente de la molécula de la que formen parte. Los grupos funcionales comunes incluyen, entre otros, grupos carboxilo (-COOH), grupos acetilo (-COH), grupos amino (-NH2), grupos metilo (-CH3), grupos sulfato (-SO3H) y grupos acilo. En algunas realizaciones, la adición de uno o más grupos funcionales a una molécula puede expresarse utilizando términos que modifican el nombre del grupo funcional con la terminación "-ilado", por ejemplo, acetilado, metilado y sulfatado.
Glicano: En el presente documento, los términos "glicano", "oligosacárido" y "polisacárido" se utilizan indistintamente y se refieren a polímeros formados por monómeros de azúcar, normalmente unidos por enlaces glucosídicos también denominados en el presente documento como enlaces. En algunas realizaciones, los términos "glicano", "oNgosacárido" y "poNsacárido" pueden utilizarse para referirse a la porción de carbohidrato de un glicoconjugado (por ejemplo, glicoproteína, glicolípido o proteoglicano).
Cadena de glicanos: Tal como se utiliza en el presente documento, el término "cadena de glicanos" se refiere a un polímero de azúcar que comprende dos o más azúcares. En algunas realizaciones, las cadenas de glicanos están unidas covalentemente a proteínas a través de residuos de serina o treonina en la proteína.
Composición rica en glicanos: Tal como se utiliza en el presente documento, el término "composición rica en glicanos" se refiere a la composición que comprende un gran porcentaje de glicanos. En algunas realizaciones, los glicanos dentro de una composición rica en glicanos pueden comprender de aproximadamente 1 % a aproximadamente 10 %, de aproximadamente 5 % a aproximadamente 15 %, de aproximadamente 20 % a aproximadamente 40 %, de aproximadamente 30 % a aproximadamente 50 %, de aproximadamente 60 % a aproximadamente 80 %, de aproximadamente 70 % a aproximadamente 90 % o al menos 100 % del peso total de la composición.
Enlace glicosídico: Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "enlace glucosídico" se refiere a un enlace covalente formado entre un carbohidrato y otro grupo químico. En algunas realizaciones, se forman enlaces glicosídicos entre el extremo reductor de una molécula de azúcar y el extremo no reductor de una segunda molécula de azúcar o cadena de polisacárido. Estos enlaces glicosídicos también se conocen como enlaces O-glicosídicos debido al oxígeno (o enlace éter) entre los azúcares unidos. En algunas realizaciones, un enlace glucosídico entre dos azúcares o entre un azúcar y un enlazador también puede denominarse "enlace".
In vitro: Tal como se utiliza en el presente documento, el término "in vitro" se refiere a acontecimientos que tienen lugar en un entorno artificial, por ejemplo, en un tubo de ensayo o recipiente de reacción, en un cultivo celular, en una placa de Petri, etc., en lugar de dentro de un organismofpor ejemplo, animal, vegetal o microbio).
In vivo: Tal como se utiliza en el presente documento, el término "in vivo" se refiere a acontecimientos que ocurren dentro de un organismo (por ejemplo, un animal, una planta o un microbio o una célula o tejido del mismo).
Aislado: Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "aislado" es sinónimo de "separado", pero conlleva la inferencia de que la separación fue llevada a cabo por la mano del hombre. En una realización, una sustancia o entidad aislada es aquella que ha sido separada de al menos algunos de los componentes con los que estaba previamente asociada (ya sea en la naturaleza o en un entorno experimental). Las sustancias aisladas pueden tener distintos niveles de pureza en referencia a las sustancias a partir de las cuales se han asociado. Las sustancias y/o entidades aisladas se pueden separar de al menos aproximadamente 10 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 % o más, de los demás componentes con los que se asociaron inicialmente. En algunas realizaciones, los agentes aislados son más de aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 %, o más de aproximadamente 99 % de pureza. Como se utiliza en el presente documento, una sustancia es “pura” si está sustancialmente libre de otros componentes.
Kit: Tal como se utiliza en el presente documento, el término "kit" se refiere a un conjunto que comprende uno o más componentes adaptados para un fin cooperativo e instrucciones para su uso.
Inactivo: Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "inactivo" se refiere a un organismo en el que un gen existente se ha inactivado mediante un procedimiento que normalmente implica la mano del hombre. En un organismo inactivo, se dice que un gen que se ha inactivado ha sido "inactivado". En algunas realizaciones, el gen eliminado puede inactivarse mediante la inserción de una secuencia de nucleótidos en el gen o mediante la sustitución del gen por completo.
Enlazador: Como se utiliza en el presente documento, un "enlazador" se refiere a una fracción que conecta dos o más dominios, fracciones o entidades. En una realización, un enlazador puede comprender 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más átomos. En otra realización, un enlazador puede comprender un grupo de átomos, por ejemplo, 10-1.000 átomos, y puede estar compuesto por átomos o grupos tales como, pero no limitados a, carbono, amino, alquilamino, oxígeno, azufre, sulfóxido, sulfonilo, carbonilo e imina. En algunas realizaciones, el enlazador puede comprender un aminoácido, péptido, polipéptido o proteína. En algunas realizaciones, una fracción unida por un enlazador puede incluir, pero no limitarse a, un átomo, un grupo químico, un nucleósido, un nucleótido, una nucleobase, un azúcar, un ácido nucleico, un aminoácido, un péptido, un polipéptido, una proteína, un complejo proteico, una carga útil (por ejemplo, un agente terapéutico) o un marcador (incluyendo, pero no limitado a, un marcador químico, fluorescente, radiactivo o bioluminiscente). El enlazador puede utilizarse para cualquier fin útil, como formar multímeros o conjugados, así como para administrar una carga útil, tal como se describe en el presente documento. Ejemplos de grupos químicos que pueden incorporarse al enlazador incluyen, pero no se limitan a, alquilo, alquenilo, alquinilo, amido, amino, éter, tioéter, éster, alquileno, heteroalquileno, arilo o heterociclilo, cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido, como se describe en el presente documento. Ejemplos de enlazadores incluyen, pero no se limitan a, alcanos insaturados, polietilenglicoles (por ejemplo, unidades monoméricas de etilenglicol o propilenglicol, por ejemplo, dietilenglicol, dipropilenglicol, trietilenglicol, tripropilenglicol, tetraetilenglicol, o tetraetilenglicol), y polímeros de dextrano. Otros ejemplos incluyen, pero no se limitan a, elementos escindibles dentro del enlazador, tal como, por ejemplo, un enlace disulfuro (-S-S-) o un enlace azo (-N=N-), que pueden escindirse utilizando un agente reductor o fotólisis. Ejemplos no limitantes de enlaces selectivamente escindibles incluyen un enlace amido que puede escindirse, por ejemplo, mediante el uso de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), u otros agentes reductores, y/o fotólisis, así como un enlace éster que puede escindirse, por ejemplo, mediante hidrólisis ácida o básica. En algunas realizaciones, un enlazador es una fracción de carbohidrato utilizada para enlazar glicanos a un sustrato, tal como en una matriz de glicanos. Tales enlazadores de carbohidratos incluyen, pero no se limitan a -O(CH2)2CH2HN2 y -O(CH2)aNHCOCH2 (OCH2CH2)aNH2.
Mucina: Tal como se utiliza en el presente documento, el término "mucina" hace referencia a una familia de proteínas muy glicosiladas. En algunas realizaciones, las mucinas son producidas por las glándulas submaxilares y se encuentran en la saliva y las mucosas.
Selección negativa: Tal como se utiliza en el presente documento, el término "selección negativa" se refiere a la selección de miembros de biblioteca de una biblioteca de expresión con base en su capacidad para unirse a entidades y/o componentes de una composición que no comprenden un antígeno objetivo. En algunas realizaciones, la selección negativa se utiliza antes de la selección positiva para eliminar elementos que podrían unirse de forma inespecífica al objetivo.
Fuera del objetivo: En el presente documento, "fuera del objetivo" se refiere a cualquier efecto no deseado sobre uno o más objetivo, genes o transcritos celulares.
Paciente: Tal y como se utiliza en el presente documento, "paciente" se refiere a un sujeto que puede buscar o necesitar tratamiento, requiere tratamiento, está recibiendo tratamiento, recibirá tratamiento, o un sujeto que está bajo el cuidado de un profesional capacitado (por ejemplo, licenciado) para una enfermedad o condición particular.
Péptidos: Tal como se utiliza en el presente documento, "péptido" es una proteína o polipéptido cuya longitud es inferior o igual a 50 aminoácidos, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 aminoácidos.
Farmacéuticamente aceptable: La expresión "farmacéuticamente aceptable" se utiliza en la presente memoria para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosis que resultan, dentro del criterio médico razonable, adecuados para la utilización en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otros problemas o complicaciones, proporcionales a una relación razonable de beneficio/riesgo.
Excipientes farmacéuticamente aceptables: La frase "excipiente farmacéuticamente aceptable", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier ingrediente distinto de los agentes activos (por ejemplo, como se describe en el presente documento) presente en una composición farmacéutica y que tiene las propiedades de ser sustancialmente no tóxico y no inflamatorio en un paciente. En algunas realizaciones, un excipiente farmacéuticamente aceptable es un vehículo capaz de suspender o disolver el agente activo. Los excipientes pueden incluir, por ejemplo: antiadherentes, antioxidantes, aglutinantes, recubrimientos, ayudas a la compresión, desintegrantes, tintes (colores), emolientes, emulsionantes, cargas (diluyentes), formadores de película o recubrimientos, sabores, fragancias, deslizantes (potenciadores del flujo), lubricantes, conservantes, tintas de impresión, sorbentes, agentes de suspensión o dispersión, edulcorantes y aguas de hidratación. Los excipientes ejemplares incluyen, pero no se limitan a: hidroxitolueno butilado (BHT), carbonato cálcico, fosfato cálcico (dibásico), estearato cálcico, croscarmelosa, polivinilpirrolidona reticulada, ácido cítrico, crospovidona, cisteína, etilcelulosa, gelatina, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, lactosa, estearato de magnesio, maltitol, manitol, metionina, metilcelulosa, metilparabeno, celulosa microcristalina, polietilenglicol, polivinilpirrolidona, povidona, almidón pregelatinizado, propilparabeno, palmitato de retinilo, goma laca, dióxido de silicio, carboximetilcelulosa sódica, citrato sódico, almidón glicolato sódico, sorbitol, almidón (maíz), ácido esteárico, sacarosa, talco, dióxido de titanio, vitamina A, vitamina E, vitamina C y xilitol.
Sales farmacéuticamente aceptables: Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos descritos en el presente documento son formas de los compuestos divulgados en las que la fracción ácida o básica se encuentra en su forma salina (por ejemplo, tal como se genera al hacer reaccionar un grupo base libre con un ácido orgánico adecuado). Los ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, sales de ácidos minerales u orgánicos de residuos básicos tales como aminas; sales alcalinas u orgánicas de residuos ácidos tales como ácidos carboxílicos; y similares. Las sales de adición de ácido representativas incluyen acetato, adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, benzoato, bisulfato, borato, butirato, canforato, canforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, hemisulfato, heptonato, hexanoato bromhidrato, clorhidrato, yodhidrato, 2-hidroxi-etanosulfonato, lactobionato, lactato, laurato, lauril sulfato, malato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, sales de 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, toluenosulfonato, undecanoato, valerato y similares. Las sales representativas de metales alcalinos o alcalinotérreos incluyen sodio, litio, potasio, calcio, magnesio y similares, así como amonio no tóxico, amonio cuaternario y cationes de amina, incluyendo, pero no limitado a amonio, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina, etilamina y similares. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales no tóxicas convencionales, por ejemplo, de ácidos inorgánicos u orgánicos no tóxicos. En algunas realizaciones, se prepara una sal farmacéuticamente aceptable a partir de un compuesto original que contiene una fracción básica o ácida mediante procedimientos químicos convencionales. Generalmente, tales sales pueden prepararse haciendo reaccionar las formas de ácido o base libres de estos compuestos con una cantidad estequiométrica de la base o ácido apropiado en agua o en un solvente orgánico, o en una mezcla de los dos; generalmente, se prefieren medios no acuosos como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Las listas de sales adecuadas se encuentran en Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pensilvania, 1985, p. 1418, Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P.H. Stahl y C.G. Wermuth (eds.), Wiley-VCH, 2008, y Berge et al., Journal of Pharmaceutical Science, 66, 1-19 (1977). Solvato farmacéuticamente aceptable: El término "solvato farmacéuticamente aceptable", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una forma cristalina de un compuesto en la que se incorporan moléculas de un disolvente adecuado en la red cristalina. Por ejemplo, los solvatos pueden prepararse por cristalización, recristalización o precipitación a partir de una solución que incluya disolventes orgánicos, agua o una mezcla de los mismos. Ejemplos de disolventes adecuados son etanol, agua (por ejemplo, mono-, di- y trihidratos), N-metilpirrolidinona (n Mp ), dimetilsulfóxido (DMSO), N,N'-dimetilformamida (DMF), N,N'-dimetilacetamida (DMAC), 1,3-dimetil-2-imidazolidinona (DMEU), 1,3-dimetil-3,4,5,6-tetrahidro-2-(1H)-pirimidinona (DMEU),3-dimetil-2-imidazolidinona (DMEU), 1,3-dimetil-3,4,5,6-tetrahidro-2-(1H)-pirimidinona (DMPU), acetonitrilo (ACN), propilenglicol, acetato de etilo, alcohol bencílico, 2-pirrolidona, benzoato de bencilo y similares. Cuando el agua es el disolvente, el solvato se denomina "hidrato" En algunas realizaciones, el disolvente incorporado en un solvato es de un tipo o a un nivel que es fisiológicamente tolerable para un organismo al que se administra el solvato (por ejemplo, en una forma de dosificación unitaria de una composición farmacéutica).
Farmacocinética: En el presente documento, el término "farmacocinética" hace referencia a una o más propiedades de una molécula o compuesto relacionadas con la determinación del destino de las sustancias administradas a un organismo vivo. La farmacocinética se divide en varias áreas que incluyen el grado y la velocidad de absorción, distribución, metabolismo y excreción. Es lo que comúnmente se denomina ADME: (A) Absorción es el procedimiento por el que una sustancia entra en la circulación sanguínea; (D) Distribución es la dispersión o diseminación de sustancias por los fluidos y tejidos del organismo; (M) Metabolismo (o Biotransformación) es la transformación irreversible de compuestos parentales en metabolitos hijos; y (E) Excreción (o Eliminación) se refiere a la eliminación de las sustancias del organismo. En raras ocasiones, algunos fármacos se acumulan de forma irreversible en el tejido corporal.
Fisicoquímico: Tal como se utiliza en el presente documento, "fisicoquímico" significa de o relativo a una propiedad física y/o química.
Selección positiva: Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "selección positiva" se refiere a la selección de una entidad determinada de un grupo de entidades únicas. Estas entidades y sus grupos pueden ser, por ejemplo, anticuerpos. En algunos casos pueden ser fragmentos de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos expresados en asociación con un agente capaz de expresar dichos fragmentos (por ejemplo, miembros de una biblioteca de expresión). La selección puede basarse en la capacidad de las entidades seleccionadas para unirse a un objetivo o epítopo deseado. En algunas realizaciones, la selección positiva puede utilizarse con bibliotecas de expresión de fagos para identificar partículas de fagos que expresen scFvs que se unen al objetivo deseado. En otras realizaciones, la selección positiva puede referirse a la selección de anticuerpos candidatos de entre un conjunto de anticuerpos. En otros casos, las entidades pueden ser células, líneas celulares o clones, como en la selección de clones durante la selección de hibridomas. En tales casos, la selección positiva puede referirse a la selección clonal con base en una o más características de los anticuerpos (por ejemplo, especificidad para uno o más epítopos deseados) producidos por dichos clones. En algunos casos, los epítopos deseados en los procedimientos de selección positiva pueden comprender STn (por ejemplo, AcSTn y/o GcSTn).
Por el contrario, la "selección negativa", tal como se utiliza en el presente documento, incluye los mismos principios y ejemplos descritos para la selección positiva, pero con la característica distintiva de que se utiliza para la eliminación de entidades no deseadas de un grupo de entidades únicas.
Prevenir: Tal como se utiliza en el presente documento, el término "prevenir" se refiere a retrasar parcial o completamente la aparición de una infección, una enfermedad, un trastorno y/o una afección; retrasar parcial o completamente la aparición de uno o más síntomas, características o manifestaciones clínicas de una infección, una enfermedad, un trastorno y/o una afección particulares; retrasar parcial o completamente la aparición de uno o más síntomas, características o manifestaciones de una infección, enfermedad, trastorno y/o afección en particular; retrasar parcial o completamente la progresión de una infección, enfermedad, trastorno y/o afección en particular; y/o disminuir el riesgo de desarrollar una patología asociada a la infección, enfermedad, trastorno y/o afección.
Fármaco: La presente divulgación también incluye profármacos de los compuestos descritos en el presente documento. En el presente documento, por "profármaco" se entiende cualquier sustancia, molécula o entidad que se encuentra en una forma que permite que dicha sustancia, molécula o entidad actúe como terapéutica tras una alteración química o física. Los profármacos pueden estar unidos covalentemente o secuestrados de algún modo y que liberan o se convierten en la fracción activa del fármaco antes, durante o después de su administración a un mamífero. Los profármacos pueden prepararse modificando los grupos funcionales presentes en los compuestos de tal manera que las modificaciones se escindan, ya sea en la manipulación rutinaria o in vivo, a los compuestos parentales. Los profármacos incluyen compuestos en los que los grupos hidroxilo, amino, sulfhidrilo o carboxilo están unidos a cualquier grupo que, cuando se administra a un sujeto mamífero, se escinde para formar un grupo hidroxilo, amino, sulfhidrilo o carboxilo libre, respectivamente. La preparación y el uso de profármacos se analizan en T. Higuchi y V. Stella, "Pro-drugs as Novel Delivery Systems", vol. 14 de la A.C.S. Symposium Series, and in Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987.
Proximal: Tal como se utiliza en el presente documento, el término "proximal" significa situado más cerca del centro o de un punto o región de interés.
Región de interacción: Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "región de interacción" se refiere a una región a lo largo de dos o más entidades en la que dichas entidades interactúan o se solapan. En algunas realizaciones, una región de interacción puede comprender uno o más residuos de azúcar a lo largo de una cadena de glicano que entra en contacto con una segunda cadena de glicano. En algunas realizaciones, las cadenas de glicanos son cadenas ramificadas de la misma cadena madre. En algunas realizaciones, una región de interacción puede producirse entre dos cadenas de glicanos en las que una cadena es una cadena ramificada y la segunda cadena es una cadena parental. En el caso de las cadenas de glicanos, las regiones de interacción pueden comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o al menos 10 residuos de azúcar. En algunas realizaciones, las regiones de interacción también pueden darse entre glicanos y proteínas o entre glicanos y lípidos.
Residuo: Tal como se utiliza en el presente documento, el término "residuo" se refiere a un monómero asociado o capaz de asociarse a un polímero. En algunas realizaciones, los residuos comprenden moléculas de azúcar que incluyen, pero no se limitan a glucosa, galactosa, N-acetilglucosamina, N-acetilgalactosamina, ácidos siálicos. En algunas realizaciones, los residuos comprenden aminoácidos.
Muestra: En el presente documento, el término "muestra" se refiere a una alícuota o porción tomada de una fuente y/o suministrada para su análisis o procesamiento. En algunas realizaciones, la muestra procede de una fuente biológica, tal como un tejido, una célula o un componente (por ejemplo, un fluido corporal, incluyendo, pero no limitado a, la sangre, el moco, el líquido linfático, el líquido sinovial, el líquido cefalorraquídeo, la saliva, el líquido amniótico, la sangre del cordón amniótico, la orina, el flujo vaginal y el semen). En algunas realizaciones, una muestra puede ser o comprender un homogeneizado, lisado o extracto preparado a partir de un organismo entero o un subconjunto de sus tejidos, células o partes componentes, o una fracción o porción de los mismos, incluyendo, pero no limitándose a, por ejemplo, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido linfático, las secciones externas de la piel, vías respiratorias, intestinales y genitourinarias, lágrimas, saliva, leche, células sanguíneas, tumores, órganos. En algunas realizaciones, una muestra comprende un medio, tal como un caldo nutritivo o un gel, que puede contener componentes celulares, tal como proteínas o moléculas de ácido nucleico. En algunas realizaciones, una muestra "primaria" es una alícuota de la fuente. En algunas realizaciones, una muestra primaria se somete a uno o más pasos de procesamiento (por ejemplo, separación, purificación, etc.) para preparar una muestra para su análisis u otro uso.
Sialilo: Tal como se utiliza en el presente documento, el prefijo "sialilo", así como el término "sialilado", describen compuestos que comprenden ácido siálico.
Fragmento variable de cadena simple: Tal como se utiliza en el presente documento, el término "fragmento variable de cadena única" o "scFv" se refiere a una proteína de fusión que comprende regiones variables de anticuerpos conectadas por un enlazador. En algunas realizaciones, los scFvs se utilizan junto con procedimientos de expresión de fagos donde pueden expresarse en asociación con una proteína de cubierta de fago y utilizarse en la identificación de péptidos de alta afinidad para un antígeno dado.
Dosis unitaria única: Tal como se utiliza en el presente documento, una "dosis unitaria única" es una dosis de cualquier fármaco administrada en una dosis/en un momento/por una única vía/en un único punto de contacto, es decir, en un único acto de administración. En algunas realizaciones, una dosis unitaria única se suministra como una forma de dosificación discreta (por ejemplo, un comprimido, una cápsula, un parche, una jeringa cargada, un vial, etc.).
Dosis dividida: Tal como se utiliza en el presente documento, una "dosis dividida" es la división de la dosis unitaria única o la dosis diaria total en dos o más dosis.
Estable: Tal como se utiliza en el presente documento, "estable" se refiere a un compuesto o entidad que es suficientemente robusto para sobrevivir al aislamiento hasta un grado útil de pureza a partir de una mezcla de reacción, y preferentemente capaz de formularse en un agente terapéutico eficaz.
Estabilizado: Tal como se utiliza en el presente documento, el término "estabilizar", "estabilizado", "región estabilizada" significa hacer o volverse estable. En algunas realizaciones, la estabilidad se mide en relación con un valor absoluto. En algunas realizaciones, la estabilidad se mide en relación con un compuesto o entidad de referencia.
Sujeto: Tal como se utiliza en el presente documento, el término "sujeto" o "paciente" se refiere a cualquier organismo al que se le puede administrar una composición de acuerdo con la invención, por ejemplo, con fines experimentales, de diagnóstico, profilácticos y/o terapéuticos. Los sujetos típicos incluyen animales (por ejemplo, mamíferos tales como ratones, ratas, conejos, primates no humanos y humanos) y/o plantas.
Glándulas submaxilares: En el presente documento, los términos "glándulas submaxilares" o "glándulas submandibulares" se refieren a las glándulas productoras de mucosa situadas bajo el suelo de la boca. Estas glándulas son capaces de producir mucinas y, en algunas realizaciones, pueden extraerse de mamíferos como fuente de mucina.
Que padece de: Un individuo que "sufre" una enfermedad, trastorno y/o condición se ha diagnosticado o muestra uno o más síntomas de una enfermedad, trastorno y/o condición.
Susceptible a: Un individuo "susceptible a" una enfermedad, trastorno y/o afección no ha sido diagnosticado y/o puede no presentar síntomas de la enfermedad, trastorno y/o afección, pero alberga una propensión a desarrollar una enfermedad o sus síntomas. En algunas realizaciones, un individuo susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afección (por ejemplo, cáncer) puede caracterizarse por uno o más de los siguientes: (1) una mutación genética asociada al desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o afección; (2) un polimorfismo genético asociado al desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o afección; (3) un aumento y/o disminución de la expresión y/o actividad de una proteína y/o ácido nucleico asociado a la enfermedad, trastorno y/o afección; (4) hábitos y/o estilos de vida asociados con el desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o afección; (5) antecedentes familiares de la enfermedad, trastorno y/o afección; y (6) exposición y/o infección con un microbio asociado con el desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o afección. En algunas realizaciones, un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o condición desarrollará la enfermedad, trastorno y/o condición. En algunas realizaciones, un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o condición no desarrollará la enfermedad, trastorno y/o condición.
Sintético: El término "sintético" significa producido, preparado y/o fabricado por la mano del hombre. La síntesis de polinucleótidos o polipéptidos u otras moléculas de la presente invención puede ser química o enzimática.
Objetivo: Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "objetivo" se refiere a un objeto o entidad que se verá afectado por una acción. En algunas realizaciones, los objetivos se refieren a antígenos que se utilizarán para el desarrollo de anticuerpos que se unen específicamente a los antígenos.
Cribado de objetivos: En el presente documento, el término "cribado de objetivos" se refiere al uso de una sustancia objetivo para identificar socios de unión para dicha sustancia.
Sitio objetivo: Tal como se utiliza en el presente documento, el término "sitio objetivo" se refiere a un objetivo en o dentro de uno o más glicanos, biomoléculas y/o bioestructuras dentro de una célula, el espacio extracelular, un tejido, un órgano y/o un organismo. En algunas realizaciones, los sitios objetivo de los glicanos pueden residir exclusivamente en un residuo de azúcar o pueden estar formados por dos o más residuos. En algunas realizaciones, los sitios objetivo se forman entre dos o más glicanos. En algunas realizaciones, los sitios objetivo se forman entre cadenas ramificadas del mismo glicano o entre una o más cadenas ramificadas y una cadena madre.
Células objetivo: En el presente documento, "células objetivo" se refiere a una o más células de interés. Las células pueden encontrarse in vitro, in vivo, in situ o en el tejido u órgano de un organismo. El organismo puede ser un animal, preferentemente un mamífero, más preferentemente un ser humano y más preferentemente un paciente.
Residuo terminal: En el presente documento, el término "residuo terminal" se refiere al último residuo de una cadena polimérica. En algunas realizaciones, los residuos terminales son residuos de azúcar situados en el extremo no reductor de una cadena de polisacáridos.
Agente terapéutico: El término "agente terapéutico" se refiere a cualquier agente que, cuando se administra a un sujeto, tiene un efecto terapéutico, diagnóstico y/o profiláctico y/o provoca un efecto biológico y/o farmacológico deseado.
Cantidad terapéuticamente efectiva: Como se utiliza en el presente documento, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de un agente que se va a administrar (por ejemplo, ácido nucleico, fármaco, agente terapéutico, agente de diagnóstico, agente profiláctico, etc.) que es suficiente, cuando se administra a un sujeto que padece o es susceptible de padecer una infección, enfermedad, trastorno y/o afección, para tratar, mejorar los síntomas de, diagnosticar, prevenir y/o retrasar la aparición de la infección, enfermedad, trastorno y/o afección. En algunas realizaciones, se proporciona una cantidad terapéuticamente eficaz en una sola dosis. En algunas realizaciones, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz en un régimen de dosificación que comprende una pluralidad de dosis. Los expertos en la técnica apreciarán que, en algunas realizaciones, puede considerarse que una forma de dosificación unitaria comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente o entidad particular si comprende una cantidad que es eficaz cuando se administra como parte de dicho régimen de dosificación.
Resultado terapéuticamente eficaz: Como se utiliza en el presente documento, el término "resultado terapéuticamente eficaz" significa un resultado que es suficiente en un sujeto que padece o es susceptible a una infección, enfermedad, trastorno y/o afección, para tratar, mejorar los síntomas de, diagnosticar, prevenir y/o retrasar la aparición de la infección, enfermedad, trastorno y/o afección.
Dosis diaria total: Tal como se utiliza en el presente documento, una "dosis diaria total" es una cantidad administrada o prescrita en un periodo de 24 horas. Puede administrarse como dosis unitaria única.
Transgénico: Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "transgénico" se refiere a un organismo que comprende uno o más genes incorporados dentro del genoma del organismo que no se encuentran de forma natural en dicho organismo.
Tratar: Tal como se utiliza en el presente documento, el término "tratar" se refiere a aliviar parcial o totalmente, mejorar, aliviar, retrasar la aparición, inhibir la progresión, reducir la gravedad y/o reducir la incidencia de uno o más síntomas o características de una infección, enfermedad, trastorno y/o afección en particular. Por ejemplo, "tratar" el cáncer puede referirse a inhibir la supervivencia, el crecimiento y/o la propagación de un tumor. El tratamiento puede administrarse a un sujeto que no muestre signos de una enfermedad, trastorno y/o afección y/o a un sujeto que sólo muestre signos tempranos de una enfermedad, trastorno y/o afección con el fin de disminuir el riesgo de desarrollar una patología asociada a la enfermedad, trastorno y/o afección.
Región variable: Como se utiliza en el presente documento, el término "región variable" o "dominio variable" se refiere a dominios específicos de anticuerpos que difieren ampliamente en secuencia entre anticuerpos y se utilizan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular.
IgG entera: En el presente documento, el término "IgG entera" se refiere a una molécula IgG completa. En algunas realizaciones, las moléculas IgG enteras comprenden regiones que se encuentran de forma natural en otros dos o más organismos.
Tipo silvestre: Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "tipo silvestre" se refiere a un organismo que comprende un genoma natural (libre de genes derivados de otros organismos).
I. Composiciones de la invención
La presente invención proporciona compuestos, así como composiciones que comprenden al menos un anticuerpo que interactúa con glicanos. Dentro de un glicano, los monómeros de monosacáridos pueden ser todos iguales o diferentes. Los monómeros comunes incluyen, pero no se limitan a triosas, tetrosas, pentosas, glucosa, fructosa, galactosa, xilosa, arabinosa, lixosa, aldosa, altrosa, manosa, gulosa, yodosa, ribosa, mannoheptulosa, sedoheptulosa y talosa. Los aminoazúcares también pueden ser monómeros dentro de un glicano. Los glicanos que comprenden dichos azúcares se denominan en el presente documento aminoglicanos. Los aminoazúcares, tal y como se utilizan en el presente documento, son moléculas de azúcar que contienen un grupo amina en lugar de un grupo hidroxilo o, en algunas realizaciones, un azúcar derivado de dicho azúcar. Algunos ejemplos de aminoazúcares incluyen, pero no se limitan a, la glucosamina, la galactosamina, la N-acetilglucosamina, la N-acetilgalactosamina, los ácidos siálicos (incluyendo, pero no limitado a, el ácido N-acetilneuramínico y el ácido N-glicolilneuramínico) y la L-daunosamina.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "anticuerpo que interactúa con glicanos" se refiere a un anticuerpo que puede interactuar con una fracción de glicano. Los anticuerpos que interactúan con glicanos pueden actuar para unirse, alterar, activar, inhibir, estabilizar, degradar y/o modular un glucano o una molécula o entidad asociada a glucano. De este modo, los anticuerpos que interactúan con los glicanos pueden funcionar como terapéutica, ya sea paliativa, profiláctica o como composición de un tratamiento continuo. En algunas realizaciones, los anticuerpos que interactúan con glicanos pueden comprender conjugados o combinaciones con otras moléculas. En algunas realizaciones, los anticuerpos que interactúan con glicanos están dirigidos hacia glicanos que comprenden uno o más aminoazúcares. En otra realización, uno o más aminoazúcares son ácidos siálicos. En otra realización, uno o más ácidos siálicos son el ácido N-acetilneuramínico y/o el ácido N-glicolilneuramínico.
Anticuerpos:
Los anticuerpos que interactúan con glicanos pueden comprender anticuerpos enteros o fragmentos de los mismos. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "anticuerpo" se emplea en el sentido más amplio y abarca específicamente diversas formas de realización que incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos), anticuerpos biespecíficos formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos), conjugados de anticuerpos (incluyendo, pero sin limitarse a, conjugados anticuerpo-fármaco), variantes de anticuerpos [incluyendo, pero sin limitarse a, miméticos de anticuerpos, anticuerpos quiméricos (por ejemplo, anticuerpos con secuencias de aminoácidos derivadas de más de una especie) y variantes sintéticas] y fragmentos de anticuerpos tales como diacuerpos, siempre que presenten una actividad biológica deseada. Los anticuerpos son principalmente moléculas con base en aminoácidos, pero también pueden incluir una o más modificaciones, tal como por ejemplo fracciones de azúcar.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "fragmento de anticuerpo" se refiere a una porción de un anticuerpo intacto o de una proteína de fusión del mismo, que en algunos casos comprende al menos una región de unión a antígeno. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 , fragmentos Fv, fragmentos variables monocatenarios (scFvs); diacuerpos; tri(a)cuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos de cadena sencilla; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. La digestión de los anticuerpos con papaína produce dos fragmentos idénticos de unión al antígeno, denominados fragmentos "Fab", cada uno con un único sitio de unión al antígeno. También se produce un fragmento residual "Fc", cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de unión al antígeno y sigue siendo capaz de reticular el antígeno. Los anticuerpos que interactúan con glicanos pueden comprender uno o más de estos fragmentos.
Los "anticuerpos nativos" suelen ser glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 Daltons, compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Se conocen los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos y los segmentos que componen cada una de ellas han sido bien caracterizados y descritos (Matsuda, F. y et al., 1998. The Journal of Experimental Medicine. 188(11); 2151-62 y Li, A. et al., 2004. Blood. 103(12): 4602-9). Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de los diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro intracadena regularmente espaciados. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (Vh) seguido de varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (Vl) y un dominio constante en el otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "dominio variable" se refiere a dominios específicos de anticuerpos que se encuentran tanto en las cadenas pesadas como ligeras del anticuerpo y que difieren ampliamente en secuencia entre los anticuerpos y se utilizan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Los dominios variables comprenden regiones hipervariables. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "región hipervariable" se refiere a una región dentro de un dominio variable que comprende residuos de aminoácidos responsables de la unión al antígeno. Los aminoácidos presentes en las regiones hipervariables determinan la estructura de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que pasan a formar parte del sitio de unión al antígeno del anticuerpo. En el presente documento, el término "CDR" se refiere a una región de un anticuerpo que comprende una estructura complementaria a su antígeno o epítopo objetivo. Otras porciones del dominio variable, que no interactúan con el antígeno, se denominan regiones marco (FW). El sitio de unión al antígeno (también conocido como sitio de combinación del antígeno o parátopo) comprende los residuos de aminoácidos necesarios para interactuar con un antígeno concreto. Los residuos exactos que componen el sitio de unión al antígeno suelen dilucidarse mediante cristalografía conjunta con el antígeno unido, aunque también pueden utilizarse evaluaciones computacionales basadas en comparaciones con otros anticuerpos (Strohl, W.R. Therapeutic Antibody Engineering. Woodhead Publishing, Filadelfia PA. 2012. Cap. 3, p47-54). La determinación de los residuos que componen las CDR puede incluir el uso de esquemas de numeración que incluyen, pero no están limitados a, los enseñados por Kabat [Wu, T.T. et al., 1970, JEM, 132(2):211-50 y Johnson, G. et al., 2000, Nucleic Acids Res. 28(1): 214-8], Chothia [Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901 (1987), Chothia et al., Nature 342, 877 (1989) y Al-Lazikani, B. et al., 1997, J. Mol. Biol. 273(4):927-48], Lefranc (Lefranc, M.P. et al., 2005, Immunome Res. 1:3) y Honegger (Honegger, A. y Pluckthun, A. 2001. J. Mol. Biol. 309(3):657-70).
Los dominios VH y VL tienen tres CDR cada uno. Las VL CDR se denominan en el presente documento CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3, en orden de aparición cuando se desplaza del extremo N- al C- a lo largo del polipéptido de dominio variable. Las VH CDR se denominan en el presente documento CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3, en orden de aparición cuando se desplaza del extremo N- al C- a lo largo del polipéptido de dominio variable. Cada una de las CDR ha favorecido estructuras canónicas con la excepción de la CDR-H3, que comprende secuencias de aminoácidos que pueden ser muy variables en secuencia y longitud entre los anticuerpos dando lugar a una variedad de estructuras tridimensionales en los dominios de unión a antígeno (Nikoloudis, D. et al., 2014. PeerJ. 2:e456). En algunos casos, las CDR-H3 pueden analizarse entre un panel de anticuerpos relacionados para evaluar la diversidad de anticuerpos. Se conocen diversos procedimientos para determinar las secuencias CDR y pueden aplicarse a secuencias de anticuerpos conocidas (Strohl, W.R. Therapeutic Antibody Engineering. Woodhead Publishing, Filadelfia, PA. 2012. Cap. 3, p47-54).
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "Fv" se refiere a un fragmento de anticuerpo que comprende el fragmento mínimo de un anticuerpo necesario para formar un sitio de unión a antígeno completo. Estas regiones consisten en un dímero de una cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera en estrecha asociación no covalente. Los fragmentos Fv pueden generarse por escisión proteolítica, pero son en gran medida inestables. En la técnica se conocen procedimientos recombinantes para generar fragmentos estables de Fv, normalmente mediante la inserción de un enlazador flexible entre el dominio variable de cadena ligera y el dominio variable de cadena pesada [para formar un Fv de cadena única (scFv)] o mediante la introducción de un puente disulfuro entre los dominios variables de cadena pesada y ligera (Strohl, W.R. Therapeutic Antibody Engineering. Woodhead Publishing, Filadelfia, PA. 2012. Cap. 3, p46-47).
Las "cadenas ligeras" de anticuerpos de cualquier especie vertebrada pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa y lambda, basándose en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.
En función de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos pueden asignarse a distintas clases. Existen cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de ellas pueden dividirse a su vez en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "Fv de cadena simple" o "scFv" se refiere a una proteína de fusión de dominios de anticuerpos VH y VL, en la que estos dominios están unidos en una cadena polipeptídica única por un enlazador peptídico flexible. En algunas realizaciones, el polipéptido enlazador Fv permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. En algunas realizaciones, los scFvs se utilizan junto con la expresión de fagos, la expresión de levaduras u otros procedimientos de expresión en los que pueden expresarse en asociación con un miembro de la superficie (por ejemplo, la proteína de cubierta del fago) y utilizarse en la identificación de péptidos de alta afinidad para un antígeno determinado.
El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a antígenos, que comprenden un dominio variable de cadena pesada Vh conectado a un dominio variable de cadena ligera Vl en la misma cadena polipeptídica. Al utilizar un enlazador demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, los dominios se ven obligados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígenos. Los diacuerpos se describen con más detalle en, por ejemplo, en el documento EP 404.097; el documento WO 93/11161y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 90:6444-6448 (1993).
El término "intracuerpo" se refiere a una forma de anticuerpo que no se secreta de una célula en la que se produce, sino que se dirige a una o más proteínas intracelulares. Los intracuerpos pueden utilizarse para afectar a multitud de procedimientos celulares, pero no limitado a, el tráfico intracelular, la transcripción, la traducción, los procedimientos metabólicos, la señalización proliferativa y la división celular. En algunas realizaciones, los procedimientos de la presente invención pueden incluir terapias intracuerpo. En algunas de estas realizaciones, las secuencias de dominio variable y/o las secuencias CDR divulgadas en el presente documento pueden incorporarse a uno o más constructos para terapia intracuerpo. En algunos casos, los intracuerpos de la invención pueden dirigirse a una o más proteínas intracelulares glicosiladas o pueden modular la interacción entre una o más proteínas intracelulares glicosiladas y una proteína alternativa.
El término "receptor de antígeno quimérico" o "CAR", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a receptores artificiales (también conocidos como "inmunorreceptores quiméricos", "receptores artificiales de células T" o "receptores quiméricos de células T") que se diseñan para expresarse en la superficie de células efectoras inmunitarias, lo que da lugar a la orientación específica de dichas células efectoras inmunitarias a células que expresan entidades que se unen con alta afinidad a los receptores artificiales. Los CAR pueden diseñarse para incluir uno o más segmentos de un anticuerpo, scFv, dominio variable de anticuerpo y/o CDR de anticuerpo, de modo que cuando dichos CAR se expresan en células efectoras inmunitarias, las células efectoras inmunitarias se unen y eliminan cualquier célula que sea reconocida por las porciones de anticuerpo de los CAR. En algunos casos, los CAR están diseñados para unirse específicamente a las células cancerosas, lo que conduce a la eliminación inmunorregulada de las células cancerosas. Las frases "tener especificidad antigénica" y "provocar una respuesta específica antigénica", utilizadas con respecto a los CAR, significan que el CAR puede unirse específicamente a un antígeno y reconocerlo inmunológicamente para provocar una respuesta inmunitaria.
El término "anticuerpo monoclonal", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de células sustancialmente homogéneas (o clones), es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por las posibles variantes que puedan surgir durante la producción del anticuerpo monoclonal, estando dichas variantes generalmente presentes en cantidades menores. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales que suelen incluir diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante del antígeno
El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo mediante cualquier procedimiento particular. Los anticuerpos monoclonales en el presente documento incluyen anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de tales anticuerpos.
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de la región hipervariable de un anticuerpo del receptor se reemplazan por residuos de la región hipervariable de un anticuerpo de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tenga la especificidad, afinidad y capacidad deseadas.
También se contemplan los anticuerpos miméticos que interactúan con los glicanos. El término "mimético de anticuerpo" se refiere a cualquier molécula que imita la función o el efecto de un anticuerpo y que se une específicamente y con alta afinidad a sus objetivos moleculares. En algunas realizaciones, los anticuerpos miméticos pueden ser monocuerpos, diseñados para incorporar el dominio de fibronectina tipo III (Fn3) como andamiaje proteico (documento US 6.673.901; documento US 6.348.584). En algunas realizaciones, los miméticos de anticuerpos pueden ser los conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, moléculas de ficuerpo, afilinas, affitinas, anticalinas, avimeros, DARPins, Fynómeros y Kunitz y péptidos de dominio. En otras realizaciones, los miméticos de anticuerpos pueden incluir una o más regiones no peptídicas.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "variante de anticuerpo" se refiere a una biomolécula parecida a un anticuerpo en estructura y/o función que comprende algunas diferencias en su secuencia de aminoácidos, composición o estructura en comparación con un anticuerpo nativo.
Desarrollo de anticuerpos
Los anticuerpos que interactúan con glicanos de la presente invención se desarrollan para unirse a antígenos tal como los descritos en el presente documento. Tal y como se utiliza en el presente documento, un "antígeno" es una entidad que induce o evoca una respuesta inmunitaria en un organismo. Una respuesta inmunitaria se caracteriza por la reacción de las células, tejidos y/u órganos de un organismo ante la presencia de una entidad extraña. Dicha respuesta inmunitaria suele conducir a la producción por parte del organismo de uno o más anticuerpos contra la entidad extraña, por ejemplo, el antígeno o una porción del antígeno. En algunos casos, los procedimientos de inmunización pueden modificarse en función de uno o más resultados de inmunización deseados. Tal como se utiliza aquí, el término "resultado de la inmunización" se refiere a uno o más efectos deseados de la inmunización. Los ejemplos incluyen títulos elevados de anticuerpos y/o especificidad aumentada de anticuerpos para un objetivo de interés.
Los antígenos pueden comprender glicanos, glicoconjugados (incluyendo, pero sin limitarse a glicoproteínas y glicolípidos), péptidos, polipéptidos, proteínas de fusión o cualquiera de los anteriores y pueden conjugarse o complejarse con uno o más adyuvantes o proteínas heterólogas independientes. En algunas realizaciones, los antígenos utilizados de acuerdo con los procedimientos de la presente invención pueden comprender glicanos sialilados, tal como STn. Los antígenos que comprenden STn pueden comprender mucinas. Las mucinas son una familia de proteínas muy glicosiladas. Son un componente de muchos tumores originados a partir de células epiteliales (Ishida, A. et al., 2008. Proteomics. 8: 3342-9). Se expresan en gran medida en las glándulas submaxilares y pueden encontrarse en altos niveles en la saliva y las mucosas. Las mucinas submaxilares de origen animal pueden utilizarse como antígenos para generar anticuerpos anti-STn en huéspedes inmunogénicos. La mucina submaxilar de diferentes especies difiere en su contenido de STn con respecto a las formas AcSTn frente a GcSTn. La mucina submaxilar porcina (PSM) es particularmente rica en GcSTn, que constituye alrededor del 90 % de la STn total. La STn de la mucina submaxilar bovina (BSM) comprende porcentajes aproximadamente iguales de GcSTn y AcSTn. La mucina submaxilar ovina (OSM) es particularmente rica en AcSTn, que constituye aproximadamente 90 % de la STn total. En algunos casos, las soluciones preparadas para la inmunización pueden modificarse para incluir uno o más de PSM, BSM y OSM dependiendo del objetivo deseado de los anticuerpos resultantes de dicha inmunización. La PSM puede utilizarse en inmunizaciones para generar anticuerpos en huéspedes inmunogénicos que tengan más probabilidades de ser específicos para GcSTn. La PSM es rica en glicoproteínas de tipo mucina que contienen Neu5Gc y están decoradas con GcSTn. Entre las fuentes actualmente conocidas de alto contenido en Neu5Gc se encuentra la carne roja; especialmente las glándulas submaxilares se describieron previamente como una fuente rica en Neu5Gc debido a la alta expresión de la enzima CMAH, que cataliza la reacción para producir el precursor de Neu5Gc, CMP-Neu5Ac. En algunos casos, la PSM puede utilizarse para evitar una respuesta pan-anti-Neu5Gc e inducir una respuesta inmunitaria más específica contra GcSTn. o Sm puede utilizarse en inmunizaciones para generar anticuerpos en huéspedes inmunogénicos que tengan más probabilidades de ser específicos para AcSTn.
En algunas realizaciones, los antígenos pueden someterse a digestión enzimática antes de la inmunización para modular la respuesta inmunitaria resultante en huéspedes inmunogénicos. En un ejemplo, las mucinas submaxilares pueden tratarse con tripsina o enzimas de proteinasa K antes de la inmunización. La actividad de estas enzimas puede ayudar a escindir y, por tanto, reducir el porcentaje y la variabilidad de los epítopos no STn. Los glicanos pueden proteger las regiones del péptido a las que están unidos de la proteólisis enzimática y, por tanto, permanecer intactos. Los títulos de anticuerpos resultantes de las inmunizaciones pueden comprender diferentes niveles dependiendo del tipo y la cantidad de antígeno utilizado en dichas inmunizaciones. En algunos casos, determinados antígenos pueden seleccionarse para su uso en inmunizaciones basándose en el título esperado.
Tal como se utiliza en el presente documento, un "adyuvante" es un agente farmacológico o inmunológico que modifica el efecto de otros agentes. Los adyuvantes de acuerdo con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, composiciones químicas, biomoléculas, terapéuticas y/o regímenes terapéuticos. Los adyuvantes pueden incluir el adyuvante de Freund (completo y/o incompleto), oligonucleótidos inmunoestimulantes [por ejemplo CpG oligodesoxinucleótidos (ODN)], composiciones que contengan minerales, toxinas bacterianas ADP-ribosiladas, bioadhesivos, mucoadhesivos, micropartículas, lípidos, liposomas, péptidos muramilos, derivados N-oxidados de polietileno-piperazina, saponinas y/o complejos inmunoestimulantes (ISCO). En algunas realizaciones, los adyuvantes pueden comprender emulsiones de aceite en agua (por ejemplo, emulsiones submicrónicas de aceite en agua). Los adyuvantes de acuerdo con la presente invención también pueden incluir cualquiera de los divulgados en la Publicación de Patente de EE. UU. No. US20120027813 y/o en la Patente de EE. UU. No. US8506966.
Los anticuerpos de la presente invención pueden ser policlonales o monoclonales o recombinantes, producidos por procedimientos conocidos en la técnica o como se describe en esta solicitud. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención pueden etiquetarse para fines de detección con una etiqueta detectable conocida por un experto en la técnica. La etiqueta puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto quimioluminiscente, una enzima o un cofactor enzimático, o cualquier otra etiqueta conocida en la técnica. En algunos aspectos, el anticuerpo que se une a un antígeno deseado no está marcado, pero puede detectarse mediante la unión de un anticuerpo secundario marcado que se une específicamente al anticuerpo primario.
Los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos que interactúan con glicanos) incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos policlonales, monoclonales, multiespecíficos, humanos, humanizados o quiméricos, anticuerpos de cadena simple, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos producidos por una biblioteca de expresión Fab, anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id) (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos anti-Id de anticuerpos de la invención), anticuerpos fabricados intracelularmente (es decir, intracuerpos) y fragmentos de unión a epítopos de cualquiera de los anteriores. Los anticuerpos de la presente invención (por ejemplo, anticuerpos que interactúan con glicanos) pueden ser de cualquier origen animal, incluyendo aves y mamíferos. Preferentemente, dichos anticuerpos son de origen humano, murino (por ejemplo, ratón y rata), asnal, ovino, conejo, caprino, cobaya, camello, caballo o pollo. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespecíficos o multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos, triespecíficos o de mayor multiespecificidad). Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un antígeno objetivo de la presente invención, o pueden ser específicos tanto para un antígeno objetivo de la presente invención, como para un epítopo heterólogo, tal como un glicano, péptido o material de soporte sólido heterólogo. (Véanse, por ejemplo, los documentos WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, A. et al., Trispecific F(ab')3 derivatives that use cooperative signaling via the TCR/CD3 complex and CD2 to activate and redirect resting cytotoxic T cells. J Immunol. 1991 Jul 1;147(1):60-9; U.S. Pat. Nos.
4,474,893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,819y Kostelny, S.A. S.A. et al., Formation of a bispecific antibody by the use of leucine zippers. J Immunol. 1992 Mar 1;148(5):1547-53).
Los anticuerpos que interactúan con glicanos de la presente invención que comprenden anticuerpos monoclonales pueden prepararse utilizando procedimientos bien establecidos conocidos por los expertos en la técnica. En una realización, los anticuerpos monoclonales se preparan utilizando la tecnología del hibridoma (Kohler, G. et al., Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 1975 Ago 7;256(5517):495-7). Para la formación de hibridomas, en primer lugar, se inmuniza un ratón, hámster u otro animal huésped apropiado con un agente inmunizante (por ejemplo, un antígeno objetivo de la invención) para obtener linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unan específicamente al agente inmunizante. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. A continuación, los linfocitos se fusionan con una línea celular inmortalizada utilizando un agente de fusión adecuado, tal como el polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, J.W., Monoclonal Antibodies: Principles and Practice. Academic Press. 1986; 59-1031). Las líneas celulares inmortalizadas suelen ser células transformadas de mamíferos, en particular células de mieloma de origen roedor, conejo, bovino y humano. Por lo general, se emplean líneas celulares de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en un medio de cultivo adecuado que contenga preferentemente una o más sustancias que inhiban el crecimiento o la supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo de los hibridomas incluirá típicamente hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"), sustancias que impiden el crecimiento de las células deficientes en HGPRT.
Las líneas celulares inmortalizadas preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan una expresión estable de alto nivel de anticuerpo por las células productoras de anticuerpo seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Otras líneas celulares inmortalizadas preferidas son las líneas de mieloma murino, que pueden obtenerse, por ejemplo, del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, y de la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. También se han descrito líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma humano-ratón para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, D. et al., A human hybrid myeloma for production of human monoclonal antibodies. J Immunol. 1984 Dic;133(6):3001-5; Brodeur, B. et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications. Marcel Dekker, Inc., Nueva York. 1987; 33:51-63).
En algunas realizaciones, las células de mieloma pueden someterse a manipulación genética. Dicha manipulación puede llevarse a cabo mediante mutagénesis con nucleasas de dedo de zinc (ZFN), tal como se describe en el presente documento. Alternativamente, pueden utilizarse procedimientos de transfección conocidos en la técnica. Pueden utilizarse células de mieloma NS0 u otras líneas celulares de mieloma de ratón. Por ejemplo, Sp2/0-Agl4 puede ser una línea celular alternativa para el desarrollo de hibridomas.
La edición génica inducida por nucleasas efectoras similares al activador de la transcripción (TALENs) proporciona un procedimiento alternativo de eliminación génica. Las TALEN son enzimas de restricción artificiales generadas al fusionar el dominio de unión al ADN del efector TAL con un dominio de escisión del ADN. Al igual que los ZFN, los TALEN inducen roturas de doble cadena en los loci deseados que pueden repararse mediante n HeJ propenso a errores para producir inserciones/deleciones en los sitios de rotura (Wood, A.J. et al., Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science. 2011 Jul 15;333(6040):307). Cellectis Bioresearch (Cambridge, MA) proporciona el servicio de diseño TALEN y construcción de plásmidos. El medio de cultivo en el que se cultivan las células de hibridoma puede entonces analizarse para detectar la presencia de anticuerpos monoclonales. Preferentemente, la especificidad de unión (es decir, la inmunorreactividad específica) de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como el radioinmunoensayo (RIA) o el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Tales técnicas y ensayos son conocidos por los expertos en la técnica. La especificidad de unión del anticuerpo monoclonal puede determinarse, por ejemplo, mediante el análisis de Scatchard (Munson, P.J. et al., Ligand: a versatile computerized approach for characterization of ligand-binding systems. Anal Biochem. 1980 Sep 1;107(1):220-39). En algunos casos, la especificidad del anticuerpo para regiones de un antígeno dado puede caracterizarse modificando químicamente los antígenos antes de ensayar la unión del anticuerpo. En un ejemplo, el tratamiento con periodato puede utilizarse para destruir la cadena lateral C6 de los ácidos siálicos. Los ensayos pueden realizarse con y sin tratamiento de periodato para revelar si la unión en muestras no tratadas es específica del ácido siálico o no. En algunos casos, los antígenos que comprenden ácido siálico 9-O-acetilado pueden someterse a un tratamiento base suave (por ejemplo, con NaOH 0,1 M) para destruir los grupos 9-O-acetilo. Los ensayos pueden realizarse con y sin tratamiento de base suave para revelar si la unión en muestras no tratadas depende o no de la 9-O-acetilación del ácido siálico.
Una vez identificadas las células de hibridoma deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante y cultivarse por procedimientos estándar. Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, el medio Eagle modificado de Dulbecco o el medio RPMI-1640. Alternativamente, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo como ascitis en un mamífero.
Procedimientos alternativos para clonar hibridomas pueden incluir los proporcionados por kits de STEMCELL Technologies (Vancouver, BC, Canadá), por ejemplo, el kit CLONACELL™-HY, que contiene medio semisólido con base en metilcelulosa y otros medios y reactivos, para apoyar la selección y el crecimiento de clones de hibridoma. Sin embargo, los medios de este kit contienen FCS, que proporciona una fuente exógena para la incorporación de Neu5Gc. Aunque la maquinaria para la síntesis endógena de Neu5Gc está destruida en el hibridoma Cmahy_, el Neu5Gc incorporado de los medios de cultivo también puede plantear un problema en algunos casos (Bardor, M. et al., Mechanism of uptake and incorporation of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid into human cells. J Biol Chem. 2005. 280: 4228-4237). En tales casos, los medios de cultivo pueden complementarse con Neu5Ac para eliminar la incorporación de Neu5Gc por competencia metabólica (Ghaderi, D. et al., Implications of the presence of N-glycolylneuraminic acid in recombinant therapeutic glycoproteins. Nat Biotechnol. 2010. 28: 863-867).
Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden aislarse o purificarse del medio de cultivo o del líquido de ascitis mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas tal como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía de hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.
En otra realización, los anticuerpos monoclonales de la presente invención también pueden fabricarse por procedimientos de ADN recombinante, tales como los descritos en la Pat. de EE. UU. No. 4,816,567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención puede aislarse y secuenciarse fácilmente mediante procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas de oligonucleótidos capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos murinos). Las células de hibridoma de la invención sirven como fuente preferente de ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que luego se transfectan en células huésped, tal como células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que, por lo demás, no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. El ADN también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificadora de los dominios constantes de las cadenas pesada y ligera humanas por las secuencias murinas homólogas (Pat. de EE. UU. No. 4,816,567) o mediante la unión covalente a la secuencia codificante de inmunoglobulina de toda o parte de la secuencia codificante de un polipéptido no inmunoglobulínico. Dicho polipéptido no inmunoglobulínico puede sustituirse por los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o puede sustituirse por los dominios variables de un sitio de combinación de antígenos de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico.
En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención (por ejemplo, anticuerpos que interactúan con glicanos) pueden producirse mediante diversos procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Para la producción de anticuerpos policlonales in vivo, los animales huéspedes, tales como conejos, ratas, ratones, vacas, caballos, burros, pollos, monos, ovejas o cabras, se inmunizan con antígenos libres o acoplados a portadores, por ejemplo, mediante inyección intraperitoneal y/o intradérmica. En algunas realizaciones, el material de inyección puede ser una emulsión que contenga aproximadamente 100 |jg de antígeno o proteína portadora. En algunas realizaciones, los materiales de inyección comprenden una composición rica en glicanos tal como la mucina submaxilar de mamíferos no humanos en solución. También pueden utilizarse diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie huésped. Los adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, los de Freund (completos e incompletos), geles minerales tales como el hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, TITERMAX® (CytRx Corp, Los Angeles, CA), hemocianinas de lapa, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y corynebacterium parvum. Dichos adyuvantes también son bien conocidos en la técnica. Pueden ser necesarias varias inyecciones de refuerzo, por ejemplo, a intervalos de unas dos semanas, para proporcionar un título útil de anticuerpo que pueda detectarse, por ejemplo, mediante un ensayo ELISA utilizando glicanos y/o péptido libre adsorbido a una superficie sólida. El título de anticuerpos en el suero de un animal inmunizado puede aumentarse mediante la selección de anticuerpos, por ejemplo, por adsorción de antígenos en un soporte sólido y elución de los anticuerpos seleccionados de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica.
Los anticuerpos que interactúan con glicanos, sus variantes y fragmentos pueden seleccionarse y producirse utilizando procedimientos de descubrimiento de alto rendimiento. En una realización, los anticuerpos que interactúan con glicanos que comprenden anticuerpos sintéticos, variantes y fragmentos de los mismos se producen mediante el uso de bibliotecas de expresión. El término "expresión", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a la expresión o "visualización" de proteínas o péptidos en la superficie de un huésped determinado. El término "biblioteca", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a una colección de secuencias únicas de ADNc y/o a las proteínas codificadas por ellas. Una biblioteca puede contener desde tan sólo dos ADNc únicos hasta cientos de miles de millones de ADNc únicos. En una realización preferida, los anticuerpos que interactúan con glicanos que comprenden anticuerpos sintéticos se producen utilizando bibliotecas de expresión de anticuerpos o bibliotecas de expresión de fragmentos de anticuerpos. El término "biblioteca de expresión de fragmentos de anticuerpos", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una biblioteca de expresión en la que cada miembro codifica un fragmento de anticuerpo que contiene al menos una región variable de un anticuerpo. Dichos fragmentos de anticuerpos son preferentemente fragmentos Fab, pero también se contemplan otros fragmentos de anticuerpos tales como los fragmentos variables de cadena simple (scFvs). En una biblioteca de fragmentos de anticuerpos Fab, cada Fab codificado puede ser idéntico excepto por la secuencia de aminoácidos contenida dentro de los bucles variables de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del fragmento Fab. En una realización alternativa o adicional, las secuencias de aminoácidos dentro de las regiones Vh y/o Vl individuales también pueden diferir.
Las bibliotecas de expresión pueden expresarse en una serie de huéspedes posibles que incluyen, pero no se limitan a, levaduras, bacteriófagos, bacterias y retrovirus. Otras tecnologías de expresión que pueden utilizarse son la expresión de ribosomas, la expresión de microesferas y las técnicas de enlace proteína-ADN. En una realización preferida, las bibliotecas de expresión Fab se expresan en levadura o en bacteriófagos (también denominados en el presente documento como "fagos" o "partículas fago"). Cuando se expresan, los Fabs decoran la superficie del fago o la levadura donde pueden interactuar con un antígeno determinado. Puede utilizarse un antígeno que comprenda un glicano u otro antígeno de un objetivo deseado para seleccionar partículas de fagos o células de levadura que expresen fragmentos de anticuerpos con la mayor afinidad por ese antígeno. La secuencia de ADN que codifica la CDR del fragmento de anticuerpo unido puede entonces determinarse mediante secuenciación utilizando la partícula o célula unida. En una realización, la selección positiva se utiliza en el desarrollo de anticuerpos. En algunas realizaciones, se utiliza la selección negativa en el desarrollo de anticuerpos. En algunas realizaciones, se utilizan procedimientos de selección tanto positiva como negativa durante múltiples rondas de selección en el desarrollo de anticuerpos utilizando bibliotecas de expresión.
En el despliegue en levadura, el ADNc que codifica diferentes fragmentos de anticuerpos se introduce en células de levadura donde se expresan y los fragmentos de anticuerpos se "despliegan" en la superficie celular como describen Chao et al. (Chao, G. et al., Isolating and engineering human antibodies using yeast surface display. Nat Protoc.
2006;1(2):755-68). En la expresión de superficie de levadura, los fragmentos de anticuerpos expresados contienen un dominio adicional que comprende la proteína aglutinina de levadura, Aga2p. Este dominio permite que la proteína de fusión del fragmento de anticuerpo se adhiera a la superficie externa de la célula de levadura mediante la formación de enlaces disulfuro con la Agalp expresada en la superficie. El resultado es una célula de levadura recubierta de un determinado fragmento de anticuerpo. Inicialmente se utilizan bibliotecas de ADNc que codifican estos fragmentos de anticuerpos, cada uno de los cuales tiene una secuencia única. Estas proteínas de fusión se expresan en la superficie celular de millones de células de levadura, donde pueden interactuar con un antígeno objetivo deseado, incubado con las células. Los antígenos objetivo pueden modificarse covalentemente o de otro modo con un grupo químico o magnético para permitir una clasificación celular eficaz después de que se produzca una unión satisfactoria con un fragmento de anticuerpo adecuado. La recuperación puede realizarse mediante clasificación celular activada por magnetismo (MACS), clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) u otros procedimientos de clasificación celular conocidos en la técnica. Una vez seleccionada una subpoblación de células de levadura, pueden analizarse los plásmidos correspondientes para determinar la secuencia c Dr .
La tecnología de expresión de bacteriófagos utiliza típicamente fagos filamentosos que incluyen, pero no se limitan a, los viriones fd, F1 y M13. Estas cepas no son líticas, lo que permite la propagación continua del huésped y el aumento de los títulos virales. Entre los ejemplos de procedimientos de expresión de fagos que pueden utilizarse para fabricar los anticuerpos de la presente invención se incluyen los divulgados en Miersch et al. (Miersch, S. et al., Synthetic antibodies: Concepts, potential and practical considerations. Methods. 2012 Ago; 57(4):486-98), Bradbury et al. (Bradbury, A.R. et al., Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies. Nat Biotechnol. 2011 Mar;29(3):245-54), Brinkman et al. (Brinkmann, U. et al., Phage display of disulfide-stabilized Fv fragments. J Immunol Methods. 1995 May 11; 182(1):41-50); Ames et al. (Ames, R.S. et al., Conversion of murine Fabs isolated from a combinatorial phage display library to full length immunoglobulins. J Immunol Methods. 1995 Ago 18;184(2): 177-86); Kettleborough et al. (Kettleborough, C.A. et al., Isolation of tumor cell-specific sencillo-chain Fv from immunized mice using phage-antibody libraries and the re-construction of whole antibodies from these antibody fragments. Eur J Immunol. 1994 Abr; 24(4):952-8); Persic et al. (Persic, L. et al., An integrated vector system for the eukaryotic expression of antibodies or their fragments after selection from phage display libraries. Gene. 1997 Mar 10; 187(1):9-18); Publicaciones PCT WO 92/001047; Documentos WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401y Pat de EE.U.U Nos.
5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,7 80,225; 5,658,727; 5,733,743 y 5,969,108. La expresión de fragmentos de anticuerpos en bacteriófagos puede llevarse a cabo insertando el ADNc que codifica el fragmento en el gen que expresa una proteína de cubierta vírica. La cubierta vírica de los bacteriófagos filamentosos está formada por cinco proteínas de cubierta, codificadas por un genoma monocatenario. La proteína de cubierta pIII es la preferida para la expresión de fragmentos de anticuerpos, normalmente en el extremo N-terminal. Si la expresión del fragmento de anticuerpo compromete la función de pIII, la función viral puede restaurarse mediante la coexpresión de un pIII de tipo silvestre, aunque dicha expresión reducirá el número de fragmentos de anticuerpo expresados en la cubierta viral, pero puede mejorar el acceso al fragmento de anticuerpo por parte del antígeno objetivo. La expresión de las proteínas virales, así como de los fragmentos de anticuerpos, puede codificarse alternativamente en múltiples plásmidos. Este procedimiento puede utilizarse para reducir el tamaño total de los plásmidos infecciosos y mejorar la eficacia de la transformación.
Como se ha descrito anteriormente, tras la selección de un huésped que exprese un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de alta afinidad, (por ejemplo, anticuerpos que interactúan con glicanos) las regiones codificantes del anticuerpo o fragmento de anticuerpo pueden aislarse y utilizarse para generar anticuerpos enteros, incluyendo anticuerpos humanos, o cualquier otro fragmento de unión a antígeno deseado, y expresarse en cualquier huésped deseado, incluyendo células de mamífero, células de insecto, células vegetales, levaduras y bacterias, por ejemplo, como se describe en detalle a continuación.
La secuencia de ADN que codifica un anticuerpo de alta afinidad puede mutarse para rondas adicionales de selección en un procedimiento conocido como maduración de afinidad. El término "maduración por afinidad", tal como se utiliza en el presente, se refiere a un procedimiento por el que se producen anticuerpos con afinidad creciente por un antígeno dado mediante rondas sucesivas de mutación y selección de secuencias de ADNc que codifican anticuerpos o fragmentos de anticuerpos. En algunos casos, este procedimiento se lleva a cabo in vitro. Para lograrlo, la amplificación de las secuencias codificantes CDR puede llevarse a cabo mediante PCR propensa a errores para producir millones de copias que contengan mutaciones, incluyendo, pero no limitado a, mutaciones puntuales, mutaciones regionales, mutaciones por inserción y mutaciones por deleción. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "mutación puntual" se refiere a una mutación de ácido nucleico en la que un nucleótido dentro de una secuencia de nucleótidos se cambia por un nucleótido diferente. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "mutación regional" se refiere a una mutación de ácido nucleico en la que dos o más nucleótidos consecutivos se cambian por nucleótidos diferentes. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "mutación insercional" se refiere a una mutación de ácido nucleico en la que uno o más nucleótidos se insertan en una secuencia de nucleótidos. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "mutación delecional" se refiere a una mutación de ácido nucleico en la que se eliminan uno o más nucleótidos de una secuencia de nucleótidos. Las mutaciones insercionales o delecionales pueden incluir la sustitución completa de un codón entero o el cambio de un codón por otro alterando uno o dos nucleótidos del codón de partida.
La mutagénesis puede llevarse a cabo en secuencias de ADNc que codifican CDR para crear millones de mutantes con mutaciones singulares en las regiones de cadenas pesadas y ligeras de CDR. En otro enfoque, se introducen mutaciones aleatorias sólo en los residuos CDR con más probabilidades de mejorar la afinidad. Estas bibliotecas mutagénicas recién generadas pueden utilizarse para repetir el procedimiento de búsqueda de clones que codifiquen fragmentos de anticuerpos con una afinidad aún mayor por el antígeno objetivo. Las continuas rondas de mutación y selección promueven la síntesis de clones con una afinidad cada vez mayor (Chao, G. et al., Isolating and engineering human antibodies using yeast surface display. Nat Protoc. 2006;1(2):755-68).
Ejemplos de técnicas que pueden usarse para producir anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, tales como Fabs y scFvs, incluyen las descritas en la Pat. de EE. UU. Nos. 4,946,778 y 5,258, 498; Miersch et al. (Miersch, S. et al., Synthetic antibodies: Concepts, potential and practical considerations. Methods. 2012 Ago;57(4):486-98), Chao et al. (Chao, G. et al., Isolating and engineering human antibodies using yeast surface display. Nat Protoc. 2006;1(2):755-68), Huston et al. (Huston, J.S. et al., Protein engineering of sencillo-chain Fv analogs and fusionproteins. Methods Enzymol. 1991; 203:46-88); Shu et al. (Shu, L. et al., Secretion of a sencillo-gene-encoded immunoglobulin from myeloma cells. Proc Natl Acad Sci USA. 1993 Sep 1;90(17):7995-9); y Skerra et al. (Skerra, A. et al., Assembly of a functional immunoglobulin Fv fragment in Escherichia coli. Science. 1988 May 20;240(4855): 1038-41).
Para algunos usos, incluyendo el uso in vivo de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos que interactúan con glicanos) en humanos y ensayos de detección in vitro, puede ser preferible usar anticuerpos quiméricos, humanizados o humanos. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que diferentes porciones del anticuerpo derivan de diferentes especies animales, tal como los anticuerpos que tienen una región variable derivada de una inmunoglobulina monoclonal murina y una región constante de inmunoglobulina humana. Los procedimientos para producir anticuerpos quiméricos son conocidos en la técnica. (Morrison, S.L., Transfectomas provide novel chimeric antibodies. Science.
1985 Sep 20;229(4719):1202-7; Gillies, S.D. et al., High-level expression of chimeric antibodies using adapted cDNA variable region cassettes. J Immunol Methods. 1989 Dic 20;125(1-2): 191-202.; y Pat de EE. UU. Nos. 5,807, 715; 4,816,567; y 4,816,397).
Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo de especies no humanas que se unen al antígeno deseado y tienen una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de especies no humanas y regiones marco de una molécula de inmunoglobulina humana. A menudo, los residuos marco de las regiones marco humanas se sustituyen por residuos correspondientes de las regiones CDR y marco del anticuerpo donante para alterar, preferentemente mejorar, la unión al antígeno. Estas sustituciones de la estructura se identifican mediante procedimientos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante el modelado de las interacciones de las CDR y los residuos marco para identificar los residuos marco importantes para la unión al antígeno, y mediante la comparación de secuencias para identificar residuos marco inusuales en posiciones particulares. (Pat. de EE. UU. Nos. 5,693,762 y 5,585, 089; Riechmann, L. et al., Reshaping human antibodies for therapy. Nature. 1988 Mar 24;332(6162):323-7). Los anticuerpos pueden humanizarse utilizando una variedad de técnicas conocidas en la técnica, incluyendo, por ejemplo, el injerto de CDR (documento EP 239.400; Publicación PCT WO 91/09967; Pat de EE. UU. Nos. 5,225,539; 5,530,101; y 5,585,089); recubrimiento o rejuvenecimiento (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, E.A., A possible procedure for reducing the immunogenicity of antibody variable domains while preserving their ligandbinding properties. Mol Immunol. 1991 Abr-May;28(4-5):489-98; Studnicka, G.M. et al., Human-engineered monoclonal antibodies retain full specific binding activity by preserving non-CDR complementarity-modulating residues. Protein Eng. 1994 Jun;7(6):805-14; Roguska, M.A. et al., Humanization of murine monoclonal antibodies through variable domain resurfacing. Proc Natl Acad Sci USA. 1994 Feb 1;91(3):969-73); y barajado en cadena (Pat. de EE. UU. No.
5,565,332). Los anticuerpos humanizados de la presente invención pueden desarrollarse para la especificidad de unión deseada, la citotoxicidad dependiente del complemento y la citotoxicidad mediada por células dependiente del anticuerpo, etc.
Los anticuerpos completamente humanos (por ejemplo, anticuerpos que interactúan con glicanos) son particularmente deseables para el tratamiento terapéutico de pacientes humanos, con el fin de evitar o aliviar la reacción inmunitaria a la proteína extraña. Los anticuerpos humanos pueden fabricarse mediante diversos procedimientos conocidos en la técnica, incluyendo los procedimientos de expresión de anticuerpos descritos anteriormente, utilizando bibliotecas de anticuerpos derivadas de secuencias de inmunoglobulinas humanas. Véase también Pat. de EE. UU. Nos.
4,444,887 y 4,716,111 y Publicaciones PCT WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735y WO 91/10741.
Los anticuerpos humanos (por ejemplo, anticuerpos que interactúan con glicanos) también pueden producirse utilizando ratones transgénicos que son incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que pueden expresar polinucleótidos de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, los complejos polinucleotídicos de inmunoglobulina humana de cadena pesada y ligera pueden introducirse al azar, o por recombinación homóloga, en células madre embrionarias de ratón. Alternativamente, la región variable, la región constante y la región de diversidad humanas pueden introducirse en células madre embrionarias de ratón, además de los polinucleótidos de cadena pesada y ligera humanos. Los polinucleótidos de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera de ratón pueden dejar de ser funcionales por separado o simultáneamente con la introducción de loci de inmunoglobulina humana por recombinación homóloga. En particular, la deleción homocigota de la región Jh impide la producción endógena de anticuerpos. Las células madre embrionarias modificadas se expanden y se microinyectan en blastocitos para producir ratones quiméricos. A continuación, los ratones quiméricos se crían para producir descendencia homocigótica que exprese anticuerpos humanos. Los ratones transgénicos se inmunizan de manera normal con un antígeno seleccionado, por ejemplo, todo o una porción de un glicano, glicoconjugado y/o polipéptido de la invención.
Por lo tanto, utilizando dicha técnica, es posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM, IgD e IgE humanos útiles. Para una visión general de la tecnología de producción de anticuerpos humanos, véase Lonberg y Huszar (Lonberg, N. et al., Human antibodies from transgenic mice. Int Rev Immunol. 1995; 13(1):65-93). Para un análisis detallado de la tecnología de producción de anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos, así como de los protocolos de producción de dichos anticuerpos, véanse, por ejemplo, las publicaciones PCT WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; Pat. de EE. UU. Nos.
5,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; 5,885,793; 5,916,771; 5,939,598; 6,0 75,181; y 6,114,598. Además, se puede contratar a empresas como Abgenix, Inc. (Fremont, California), Protein Design Labs, Inc. (Mountain View, California) y Genpharm (San José, California) para que proporcionen anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado utilizando una tecnología similar a las descritas anteriormente.
Una vez que una molécula de anticuerpo de la presente invención ha sido producida por un animal, una línea celular, sintetizada químicamente, o expresada recombinantemente, puede ser purificada (es decir, aislada) por cualquier procedimiento conocido en la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglobulina o polipéptido, por ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, particularmente por afinidad por el antígeno específico, Proteína A, y cromatografía en columna de tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial, o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Además, los anticuerpos de la presente invención o fragmentos de los mismos pueden fusionarse a secuencias polipeptídicas heterólogas descritas en el presente documento o conocidas de otro modo en la técnica, para facilitar la purificación.
La afinidad entre un anticuerpo y un objetivo o ligando (tal como un antígeno utilizado para generar un anticuerpo dado) puede medirse en términos de Kd utilizando uno o más ensayos de unión como se describe en el presente documento. Dependiendo de la aplicación deseada para un anticuerpo dado, puede ser conveniente variar los valores de Kd. Los anticuerpos de alta afinidad suelen formar enlaces ligando con un Kd de aproximadamente 10-5 M o menos, por ejemplo, aproximadamente 10-6 M o menos, aproximadamente 10-7 M o menos, aproximadamente 10-8 M o menos, aproximadamente 10-9M o menos, aproximadamente 10-10 M o menos, aproximadamente 10-11 M o menos o aproximadamente 10-12 M o menos.
En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención pueden caracterizarse de acuerdo con su concentración media máxima efectiva o inhibitoria (EC50 o IC50, respectivamente). En algunos casos, este valor puede representar la concentración de anticuerpo necesaria para inhibir las células que expresan STn (por ejemplo, matar, reducir la proliferación y/o reducir una o más funciones celulares) a un nivel igual a la mitad de la inhibición máxima observada con las concentraciones más altas de anticuerpo. Dichos valores IC50 pueden ser de aproximadamente 0,001 nM a aproximadamente 0,01 nM, de aproximadamente 0,005 nM a aproximadamente 0,05 nM, de aproximadamente 0,01 nM a aproximadamente 1 nM, de aproximadamente 0,05 nM a aproximadamente 5 nM, de aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 10 nM, de aproximadamente 0,5 nM a aproximadamente 25 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 50 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 75 nM, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 25 nM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 200 nM a aproximadamente 1000 nM o más de 1000 nM.
La preparación de anticuerpos, ya sean monoclonales o policlonales, es conocida en la técnica. Las técnicas para la producción de anticuerpos son bien conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en Harlow y Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 y Harlow y Lane "Using Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999.
Objetivos
Los anticuerpos que interactúan con glicanos de la presente invención ejercen sus efectos mediante la unión (reversible o irreversible) a uno o más glicanos u objetivos asociados o relacionados con glicanos. En algunas realizaciones, los anticuerpos que interactúan con glicanos pueden prepararse a partir de cualquier región de los objetivos enseñados en el presente documento. En algunas realizaciones, los objetivos de la presente invención comprenden glicanos. Los glicanos utilizados para generar anticuerpos pueden comprender una cadena de azúcares que comprenda al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 residuos. Preferentemente, los glicanos utilizados para generar anticuerpos comprenden de aproximadamente 2 residuos a aproximadamente 5 residuos.
En algunas realizaciones, los antígenos objetivo de anticuerpos que interactúan con glicanos comprenden ácidos siálicos. El ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac) y el ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc) son los principales ácidos siálicos en la superficie de las células de mamíferos. De ellos, el Neu5Ac se produce de forma natural en los seres humanos. El Neu5Gc se produce de forma natural en la mayoría de los mamíferos, a excepción de los humanos, debido a una mutación en el gen de la citidina monofosfato (CMP)-ácido N-acetilneuramínico hidroxilasa (CMAH) responsable de la producción de CMP-Neu5Gc a partir de CMP-Neu5Ac. De hecho, en el ser humano, el Neu5Gc es inmunógeno y casi todos los seres humanos expresan anticuerpos anti-Neu5Gc. A pesar de la falta de producción, la mayoría de los sistemas humanos comprenden algún nivel de Neu5Gc debido a la ingesta dietética. Estos productos extraños se incorporan posteriormente a las glicoproteínas humanas. Tales glicoproteínas se contemplan como objetivo de la invención. Los antígenos glicanos objetivo incluyen, pero no se limitan a, los enumerados en la Tabla 1.
T l 1: An í n li n iv
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Las siguientes abreviaturas se utilizan en el presente documento: Glc - glucosa, Gal- galactosa, GIcNAc - N-acetilglucosamina, GalNAc - N-acetilgalactosamina, GlcNAc6S - 6-Sulfo-N-acetilglucosamina, KDN - ácido 2-keto-3-deoxi-D-glicero-D-galactonónico, Neu5,9Ac2 - ácido N-acetil-9-O-acetilneuramínico, Fuc - fucosa y Neu5GcOMe -ácido 2-O-metil-N-glicolilneuramínico. Los enlaces O-glicosídicos están presentes entre cada residuo en los glicanos enumerados con a y p indicando la estequiometría relativa entre los dos residuos unidos por el enlace, donde a indica una orientación axial y p indica una orientación ecuatorial. Los números que siguen a a y/o p, en el formato x,x, indicaban el número de carbono de cada uno de los carbonos de cada uno de los residuos contiguos que participan en la formación del enlace. Si bien los glicanos enumerados en la Tabla 1 representan antígenos objetivo glicanos individuales contemplados, la presente divulgación también incluye realizaciones en donde los glicanos presentados anteriormente comprenden combinaciones de enlaces O-glicosídicos orientados a y p diferentes de las presentadas. También en la Tabla 1, R representa una entidad a la que se puede acoplar el glicano. En algunas realizaciones, R es una proteína en la que el glicano está unido típicamente a un residuo de serina o treonina. En algunas realizaciones, R es una molécula enlazadora utilizada para unir el glicano a un sustrato, tal como en una matriz de glicanos. En algunas realizaciones, R puede ser un enlazador que comprende -(CH2)2CH2NH2 or -(CH2)3NHCOCH2(OCH2CH2)6NH2. En algunas realizaciones, R puede ser biotina, albúmina, ProNH2,-CH-, -OH, -OCH3 , -OCH2CH3, -H, hidrido, hidroxi, alcoxilo, oxígeno, carbono, azufre, nitrógeno, poliacrilamida, fósforo, NH2 , ProNH2=O(CH2)2CH2NH2 , (OCH2CH2)aNH2, O(CH2) 3NHCOCH2 (OCH2CH2)aNH2, las etiquetas fluorescentes 2-aminobenzamida (AB) y/o ácido 2-aminobenzoide (AA), análogo de 2-aminobenzamida que contiene una alquilamina (AEAB), grupos aminooxi, grupos metilaminooxi, grupos hidrazida, amino lípido 1,2-dihexadecil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DHPE), DHPE funcionalizado con aminooxi (AO) y glucosilfosfatidilinositol (GPI). Sin pretender limitar la fuente o la naturaleza de R, esto puede incluir estructuras que afecten al espaciado físico de los residuos de glicano. En algunas realizaciones, el grupo R puede comprender una combinación de los grupos R aquí presentados, por ejemplo, una poliacrilamida biotinilada. En algunas realizaciones, el grupo R en combinación con los sustratos subyacentes efectúan el espaciado de los residuos de glicano.
Los objetivos de glicano de la presente invención pueden comprender regiones de reconocimiento de anticuerpos. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "región de reconocimiento de anticuerpos" se refiere a una o más regiones localizadas en cualquier parte de la molécula, un grupo unido o localizado en una región de interacción entre el glicano y otra molécula, incluyendo, pero no limitado a otro glicano. En algunas realizaciones, las regiones de reconocimiento de anticuerpos se localizan en sitios objetivo intercadena, en donde el término intercadena significa dentro de la presente cadena polimérica. Los sitios objetivo intercadena pueden comprender regiones de reconocimiento de anticuerpos que comprendan 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o al menos 10 residuos, enlaces entre residuos o combinaciones de residuos y enlaces. En algunas realizaciones, las regiones de reconocimiento de anticuerpos se localizan en regiones de interacción entre una o más cadenas de glicanos. Dichas regiones pueden estar comprendidas entre 2, 3, 4 o al menos 5 cadenas de glicanos.
En algunas realizaciones, las regiones de reconocimiento de anticuerpos se localizan en regiones de interacción entre cadenas ramificadas de glicanos conectadas a una cadena madre común. En algunas realizaciones, las regiones de reconocimiento de anticuerpos se localizan en regiones de interacción entre una cadena ramificada de glicano y una cadena madre. En algunas realizaciones, las regiones de reconocimiento de anticuerpos se localizan en regiones de interacción entre glicanos y proteínas. Tales regiones de interacción pueden comprender enlaces químicos entre el glicano y la proteína, incluyendo, pero sin limitarse a enlaces covalentes, enlaces iónicos, enlaces hidrostáticos, enlaces hidrofóbicos y enlaces de hidrógeno. En algunas realizaciones, las regiones de reconocimiento de anticuerpos se localizan en regiones de interacción entre glicanos y otras biomoléculas, incluyendo, pero sin limitarse a, lípidos y ácidos nucleicos. Dichas regiones de interacción pueden comprender enlaces químicos entre el glicano y la biomolécula, incluyendo, pero no limitado a, enlaces covalentes, enlaces iónicos, enlaces hidrostáticos, enlaces hidrófobos y enlaces de hidrógeno.
En algunos aspectos, los objetivos de glicanos de la presente divulgación son componentes de glicoconjugados. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "glicoconjugado" se refiere a cualquier entidad que comprenda una fracción de glicano. En algunos aspectos, los glicoconjugados son glicolípidos. En el presente documento, el término "glicolípido" se refiere a una clase de lípidos a los que se une covalentemente una fracción de carbohidrato. En algunos aspectos, las moléculas de carbohidratos presentes en los glicolípidos comprenden glicanos. En algunos aspectos, los componentes lipídicos de los glicolípidos comprenden restos de ceramida. Ejemplos de glicolípidos contemplados como objetivos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a gliceroglicolípidos (incluyendo, pero no limitándose a galactolípidos y sulfolípidos), glicoesfingolípidos (incluyendo, pero no limitándose a cerebrósidos (por ejemplo, galactocerebrósidos, glucocerebrósidos y sulfátidos), gangliósidos, globósidos y glicofosfingolípidos) y glicosilfosfatidilinositoles. Cuando se localizan dentro de las membranas celulares, los glicanos de los glicolípidos se sitúan en el lado extracelular de la membrana, donde pueden interactuar con otras células, así como con ligandos de señalización celular (Maccioni, H.J. et al., Organization of the synthesis of glycolipid oligosaccharides in the Golgi complex. FEBS Lett. 2011 Jun 6;585(11):1691-8).
En algunas realizaciones, los objetivos de los glicoconjugados son glicoproteínas y/o proteoglicanos. Las glicoproteínas son proteínas unidas covalentemente a glicanos. Los proteoglicanos son una clase de proteínas muy glicosiladas con glicanos que suelen tener carga negativa. Esta propiedad los hace muy hidrófilos y componentes importantes del tejido conjuntivo.
Anticuerpos recombinantes
Los anticuerpos recombinantes (por ejemplo, anticuerpos que interactúan con glicanos) de la invención pueden generarse utilizando técnicas estándar conocidas en la técnica. Los anticuerpos recombinantes de la invención pueden producirse utilizando dominios variables obtenidos a partir de anticuerpos derivados de células de hibridoma producidos de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento. Las secuencias de ADNc de la región variable de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos pueden determinarse mediante técnicas bioquímicas estándar. El ARN total puede extraerse de células de hibridoma productoras de anticuerpos y convertirse en ADNc mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con transcriptasa inversa (RT). La amplificación por PCR puede llevarse a cabo con el ADNc resultante para amplificar los genes de la región variable. Dicha amplificación puede comprender el uso de cebadores específicos para la amplificación de secuencias de cadenas pesadas y ligeras. En otras realizaciones, los anticuerpos recombinantes pueden producirse utilizando dominios variables obtenidos de otras fuentes. Esto incluye el uso de dominios variables seleccionados de una o más bibliotecas de fragmentos de anticuerpos, tal como una biblioteca de scFv utilizada en el paneo de antígenos. Los productos PCR resultantes pueden subclonarse en plásmidos para el análisis de secuencias. Una vez secuenciadas, las secuencias codificantes de los anticuerpos pueden colocarse en vectores de expresión. Para la humanización, pueden utilizarse secuencias codificantes de dominios constantes de cadenas pesadas y ligeras humanas en sustitución de secuencias murinas homólogas. Los constructos resultantes pueden transfectarse en células de mamífero para su traducción a gran escala.
Anticuerpos anti-Tn
Los anticuerpos recombinantes divulgados en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos que interactúan con glicanos) pueden ser anticuerpos anti-Tn. Dichos anticuerpos pueden unirse a objetivos que comprendan Tn. Los anticuerpos anti-Tn pueden ser específicos para Tn o pueden unirse a otras formas modificadas de Tn, tal como la Tn unida a otras moléculas, incluyendo, pero sin limitarse a, residuos de carbohidratos adicionales. En algunos casos, los anticuerpos anti-Tn pueden ser anticuerpos anti-sialil-Tn. Dichos anticuerpos pueden unirse a dianas que comprenden Tn sialilada que comprende Neu5Ac y/o objetivos que comprenden Tn sialilada que comprende Neu5Gc. Algunos anticuerpos anti-Tn pueden unirse específicamente a grupos de antígenos Tn.
Anticuerpos anti-STn
Los anticuerpos divulgados en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos que interactúan con glicanos) pueden unirse específicamente a antígenos que comprenden STn. Los anticuerpos anti-STn pueden clasificarse por su unión a porciones específicas de antígenos STn y/o por su especificidad para AcSTn frente a GcSTn. En algunos casos, los anticuerpos anti-STn son anticuerpos del Grupo 1. Los anticuerpos del "Grupo 1" de acuerdo con la divulgación son anticuerpos capaces de unirse a AcSTn y GcSTn. Dichos anticuerpos también pueden denominarse en el presente documento anticuerpos pan-STn debido a su capacidad para asociarse con una gama más amplia de estructuras STn. En algunas realizaciones, los anticuerpos del Grupo 1 pueden asociarse con la porción de STn indicada por el óvalo grande en la Fig. 1A. En algunos casos, los anticuerpos anti-STn son anticuerpos del Grupo 2. Los anticuerpos del "Grupo 2", de acuerdo con la divulgación, son anticuerpos capaces de unirse a STn, así como a algunas estructuras relacionadas que incluyen un enlace O con serina o treonina. En algunas realizaciones, los anticuerpos del Grupo 2 pueden asociarse con glicanos que comprenden un residuo de galactosa sialilada. En algunos casos, los anticuerpos del Grupo 2 pueden asociarse con la porción de STn indicada por el óvalo grande en la Fig. 1B. Algunos anticuerpos del Grupo 2 se unen preferentemente a estructuras con AcSTn antes que a estructuras con GcSTn. Otros anticuerpos anti-STn pueden ser anticuerpos del Grupo 3. Como se menciona en el presente documento, los anticuerpos del "Grupo 3" son anticuerpos capaces de unirse a STn, pero también pueden unirse a un conjunto más amplio de estructuras relacionadas. A diferencia de los anticuerpos del Grupo 2, los del Grupo 3 no requieren que dichas estructuras tengan un enlace O con la serina o la treonina. En algunas realizaciones, los anticuerpos del Grupo 3 pueden asociarse con la porción de STn indicada por el óvalo grande en la Fig. 1C. Por último, algunos anticuerpos anti-STn de la invención pueden ser anticuerpos del Grupo 4. Como se menciona en el presente documento, los anticuerpos del "Grupo 4" son capaces de unirse tanto a AcSTn como a GcSTn, así como al antígeno Tn no sialilado, y por lo tanto tienen una especificidad más amplia. En algunas realizaciones, los anticuerpos del Grupo 4 pueden asociarse con la porción de STn indicada por el óvalo grande en la Fig. ID.
En algunos casos, los anticuerpos anti-STn de la divulgación pueden unirse específicamente a grupos de STn en un antígeno o superficie celular particular. Algunos de estos anticuerpos pueden reconocer epítopos formados por la agrupación de STn, incluyendo epítopos que incluyen áreas de contacto entre estructuras STn vecinas. Dichos epítopos pueden estar formados por la agrupación de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más estructuras STn.
Componentes de anticuerpos
En algunos casos, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden comprender secuencias de aminoácidos de dominio variable y/o CDR proporcionadas en el presente documento. Algunos anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos pueden comprender diferentes combinaciones de dichas secuencias. En algunos casos, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la divulgación pueden comprender una o más de las secuencias de dominio variable enumeradas en la Tabla 2. Los residuos indicados con una "X" pueden estar ausentes o seleccionarse de cualquier residuo de aminoácido. Los dominios variables de cadena ligera presentados en la Tabla pueden expresarse con o sin un residuo de arginina C-terminal. Este residuo suele unir los dominios variables de cadena ligera con los dominios constantes de cadena ligera y puede expresarse como parte del dominio constante de cadena ligera en lugar del dominio variable de cadena ligera. En algunos casos, los anticuerpos o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden comprender una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de aproximadamente 50 % a aproximadamente 99,9 % (por ejemplo, de aproximadamente 50 % a aproximadamente 60 %, de aproximadamente 55 % a aproximadamente 65 %, de aproximadamente 60 % a aproximadamente 70 %, de aproximadamente 65 % a aproximadamente 75 %, de aproximadamente 70 % a aproximadamente 80 %, de aproximadamente 75 % a aproximadamente 85 %, de aproximadamente 80 % a aproximadamente 90 %, de aproximadamente 85 % a aproximadamente 95 %, de aproximadamente90 % a aproximadamente 99,9 %, de aproximadamente 95 % a aproximadamente 99,9 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 97,5 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 98,5 %, aproximadamente 99 %, aproximadamente 99,5 %, aproximadamente 99,6 %, aproximadamente 99,7 % o aproximadamente 99,8 %) con una o más de las secuencias de dominio variable enumeradas en la Tabla 2 o un fragmento de las mismas (por ejemplo, un fragmento N-terminal, un fragmento C-terminal o un fragmento interno).
Tabla 2: Secuencias de dominio variable
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Los anticuerpos de la divulgación pueden desarrollarse utilizando una o más CDR derivadas de cualquiera de las secuencias de dominio variable presentadas en la Tabla anterior. En algunos casos, las secuencias CDR se determinan a partir de una secuencia de dominio variable mediante el uso de uno o más esquemas de numeración incluyendo, pero sin limitarse a, los enseñados por Kabat [Wu, T.T. et al., 1970, JEM, 132(2):211-50 y Johnson, G. et al., 2000, Nucleic Acids Res. 28(1): 214-8], Chothia [Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901 (1987), Chothia et al., Nature 342, 877 (1989) y Al-Lazikani, B. et al., 1997, J. Mol. Biol. 273(4):927-48], Lefranc (Lefranc, M.P. et al., 2005, Immunome Res. 1:3) y Honegger (Honegger, A. y Pluckthun, A. 2001. J. Mol. Biol. 309(3):657-70).
En algunos casos, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la divulgación pueden comprender una o más de las secuencias de aminoácidos CDR enumeradas en la Tabla 3. Los residuos indicados con una "X" pueden estar ausentes o seleccionarse de cualquier residuo de aminoácido. En algunos casos, los anticuerpos o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden comprender una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de aproximadamente50 % a aproximadamente 99,9 % (por ejemplo, de aproximadamente 50 % a aproximadamente 60 %, de aproximadamente 55 % a aproximadamente 65 %, de aproximadamente 60 % a aproximadamente 70 %, de aproximadamente 65 % a aproximadamente 75 %, de aproximadamente 70 % a aproximadamente 80 %, de aproximadamente 75 % a aproximadamente 85 %, de aproximadamente 80 % a aproximadamente 90 %, de aproximadamente 85 % a aproximadamente 95 %, de aproximadamente 90 % a aproximadamente l 99,9 %, de aproximadamente 95 % a aproximadamente 99,9 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 97,5 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 98,5 %, aproximadamente 99 %, aproximadamente 99,5 %, aproximadamente 99,6 %, aproximadamente 99,7 % o aproximadamente 99,8 %) con una o más de las secuencias CDR enumeradas en la Tabla 3. En algunos casos, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la divulgación pueden comprender una secuencia de aminoácidos que comprenda uno o más fragmentos de cualquiera de las secuencias enumeradas en la Tabla 3. En la Tabla, "consenso" se refiere a una secuencia de anticuerpos derivada de la alineación de múltiples secuencias en las que se utilizaron los residuos más conservados para formar la secuencia consenso. B72.3 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) y CC49 (véase Muraro, R. et al., 1988. Cancer Res. 48: 4588-96) son anticuerpos disponibles en el mercado.
Tabla 3: Secuencias CDR
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(co n tin u a c ió n )
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(co n tin u a c ió n )
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En algunos casos, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno pueden codificarse mediante una secuencia de nucleótidos que comprende una o más de las secuencias de dominio variable enumeradas en la Tabla 4. Los residuos marcados con "N" pueden estar ausentes o seleccionarse de nucleótidos A, C, G o T. En algunos casos, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden estar codificados por una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia con una identidad de secuencia de aproximadamente 50 % a aproximadamente 99,9 % (p. ej. de aproximadamente 50 % a aproximadamente 60 %, de aproximadamente 55 % a aproximadamente 65 %, de aproximadamente 60 % a aproximadamente 70 %, de aproximadamente 65 % a aproximadamente 75 %, de aproximadamente 70 % a aproximadamente 80 %, de aproximadamente 75 % a aproximadamente 85 %, de aproximadamente 80 % a aproximadamente 90 %, de aproximadamente 85 % a aproximadamente 95 %, de aproximadamente 90 % a aproximadamente 99,9 %, de aproximadamente 95 % a aproximadamente 99,9 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 97,5 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 98,5 %, aproximadamente 99 %, aproximadamente 99,5 %, aproximadamente 99,6 %, aproximadamente 99,7 % o aproximadamente 99,8 %) con una o más de las secuencias de dominio variable enumeradas en la tabla 4. En algunos casos, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la invención pueden estar codificados por una secuencia de nucleótidos que comprenda uno o más fragmentos de cualquiera de las secuencias enumeradas en la Tabla 4.
Tabla 4: Secuencias de nucleótidos de dominio variable
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(c o n tin u a c ió n )
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(continuación)
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En algunos casos, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno pueden comprender las secuencias de dominio constante de cadena pesada IgG2a y/o cadena ligera kappa enumeradas en la Tabla 5. En algunos casos, los anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden comprender una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de aproximadamente 50 % a aproximadamente 99,9 % (por ejemplo, de aproximadamente 50 % a aproximadamente 60 %, de aproximadamente 55 % a aproximadamente 65 %, de aproximadamente 60 % a aproximadamente 70 %, de aproximadamente 65 % a aproximadamente 75 %, de aproximadamente 70 % a aproximadamente 80 %, de aproximadamente 75 % a aproximadamente 85 %, de aproximadamente 80 % a aproximadamente 90 %, de aproximadamente 85 % a aproximadamente 95 %, de aproximadamente 90 % a aproximadamente 99 %, de aproximadamente 95 % a aproximadamente 99,9 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 97,5 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 98,5 %, aproximadamente 99 %, aproximadamente 99,5 %, aproximadamente 99,6 %, aproximadamente 99,7 % o aproximadamente 99,8 %) con una o más de las secuencias de dominio constante enumeradas en la Tabla 5. En algunos casos, los anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden comprender una secuencia de aminoácidos que comprenda uno o más fragmentos de cualquiera de las secuencias enumeradas en la Tabla 5.
Tabla 5: Secuencias de dominio constantes
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En algunos casos, los anticuerpos pueden comprender la secuencia de cadena pesada de
Q VQ LQ Q SD AELVKPG ASVKISC KASG YTFTD H AIH W VKQ KPEQ G LDW IG YISPG N G
D IK Y N E K F K D K V T L T ADKS S ST A C M H LN SLTSED S A V Y F C KR SLLA LD Y W GQGTTL
TVSSAKTTAPSVYPLAPVCG DTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTW NSGSLSSGVHTFP
AVLQSDLYTLSSSVTVTSSTW PSQSITCNVAFiPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCP
APNLLGGP S VFIFPPKIKD V L M IS L SPIYT C V Y Y D Y SEDDPD Y QIS WF V N N V E V H T AQ
TQ THREDYNSTLRVVSALPIQ HQ DW M SG KEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKG SVRA
PQ VYVLPPPEEEM TKKQ VTLTC M VTD FM PED IYVEW TN NG KTELN YKN TEPVLDSD
GSYFM YSKLRVEKKNW VERNSYSCSVVHEG LHNFIHTTKSFSRTPGK (SEQ ID NO:
236)
que puede estar codificada por la secuencia de nucleótidos
ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTCTGGGTGCTGCTGCTCTGGGTGCCCGGCTCCA
CCGGACAGGTTCAGCTGCAGCAG TCTGACGCTG AGTTGGTGAAACCTGGG GCTTC
AG TG AAG ATATC C TG C AAG G C TTC TG G C TAC AC C TTCAC TG AC C ATG C TATTC AC
TG G G TG AAG CAAAAG CCTG AACAG G G CCTG G ACTG G ATTG G ATATATTTCTCCC
G G AAATG G T GAT A TT A A G T AC A A T G AG AAG TTC AAG G AC AAG G T C AC ACTG ACT
G CAG ACAAATCCTCCAG CACTG CCTG CATG CACCTCAACAG CCTG ACATCTG AG G
ATTCTG C AG TG TATTTC TG C AAAAG ATC CC TAC TAG CTC TTG AC TAC TG G G G C CA
AG G CACCACTCTCACAG TCTCCTCAG CTAAAACAACAG CCCCATCG G TCTATCCA
CTGGCCCCTGTGTGTGG AGATACAACTGG CTCCTCG GTGACTCTAGGATGCCTGG
TCAAG GGTTATTTCCCTGAG CCAGTGACCTTGACCTGGAACTCTGGTTCCCTG TCC
AG TG GTGTGCACACCTTCCCAG CTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACCCTCAGCT
CAAG CG TG ACTG TAACCAG CTCG ACCTG G CCCAG CCAG TCCATCACCTG CAATG T
GGCCCACCCG G CAAG CAG CACCAAG G TG G ACAAG AAAATTG AG CCCAG AG G G C
CCACAATCAAG CCCTG TCCTCCATG CAAATG CCCAG CACCTAACCTCTTG G G TG G
AC C ATC CG TCTTCATCTTCCCTCCAAAG ATCAAG G ATG TACTCATG ATCTCCCTG A
G CCCCATAG TCACATG TG TAG TCG TTG ATG TG AG CG AG G ATG ACCCAG ATG TCCA
GAT C AG CTGG TTT GT G AAC AAC G T G G AAG T GC AC ACTGCTC AG AC AC AGACGC A
TAGAG AG G ATTACAACAG TACTCTCCG G G TTG TCAG TG CCCTCCCCATCCAG CAC
C AG G AC TG G ATG AG TG G C AAG G AG TTC AAATG C AAG G TCAAC AAC AAAG AC C TC
CCAG C G C C CATCG AG AG AACC ATC TC AAAAC C C AAAG G G TC AG TAAG AG C TC CA
C AG G TATATG TC TTG CC TC C AC C AG AAG AG G AG ATG AC TAAG AAAC AG G TCAC T
CTG ACCTG CATG G TCACAG ACTTCATG CCTG AAG ACATTTACG TG G AG TG G ACCA
AC A AC G G G A AA AC AG A G C TAAA C TA C AAG AAC AC TG A AC C AG TC C TG G AC TC TG
A T GGTTCTT ACTT C A T GT AC AGC AAG C TG AG AG T G G AG AAG AAG AAC TG G G T GG
AG AG AAATAG CTACTCCTG TTCAG TG G TCCACG AG G G TCTG CACAATCACCACAC
G ACTAAG AG CTTCTCCCG G ACTCCG G G TAAATAG (SEQ ID NO: 237)
o una versión optimizada de la misma. En algunos casos, los anticuerpos de la invención pueden comprender las secuencias de aminoácidos de cadena ligera de
D IVM TQ SH KFM STSVG D R VSITCKASQ D VG TN IAW YQ Q KPG R SPKVLIYSASTR H TG
VPDRFTG SG SG TDFTLTISNVQ SEDLTDYFCQ Q YSSFPLTFG VG TKLELKRADAAPTV
SIFPPSSEQ LTSG GASVVCFLNNFYPKDINVKW KIDGSERQ NG VLNSW TDQDSKDST
YSM SSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO: 238),
que pueden estar codificadas por la secuencia de nucleótidos
ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTCTGGGTGCTGCTGCTCTGGGTGCCCGGCTCCA
C C G G AG AC ATTG TG ATG AC C CAG TC TC ACAAATTC ATG TC C AC ATC AG TAG G AG A
CAG G G TCAG CATCACCTG CAAG G CCAG TCAG G ATG TG G G CACTAATATAG CCTG
G TATC AAC AG AAAC C AG G C CG ATC TC C TAAAG TAC TG ATTTACTC G G C ATC C AC C
CGGCACACTG G AG TCCCTG ATCG CTTCACAG G CAG TG G ATCTG G G ACAG ATTTCA
C TCTC AC C ATTAG CAATG TG C AG TCTG AAG AC TTG AC AG ATTATTTC TG TC AG C A
ATATAG CAG CTTTCCTCTCACG TTCG G TG TTG G G ACCAAG CTG G AG CTG AAACG G
G CAG ATG CTG C AC C AAC TG TATC C ATC TTCC C AC C ATC C AG TG AG C AG TTAACAT
CTG G AG G TG C C TC AG TCG TG TG C TTC TTG AACAAC TTCTACC C C AAAG ACATCAA
TG TC AAG TG G AAG ATTG ATG G C AG TG AAC G ACAAAATG G C G TC C TG AAC AG TTG
G ACTG ATCAG G ACAG C AAAG ACAG C AC C TAC AG C ATG AG C AG CAC CC TC AC G TT
G AC C AAG G AC G AG TATG AAC G AC ATAAC AG C TATAC C TG TG AG G C C AC TC AC AA
G A C A TC A AC TTC AC C C ATTG TC AAG AG C TTC AAC AG G AATG AG TG TTG A (SEQ ID
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o una versión optimizada de la misma. En algunos casos, los anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden comprender una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de aproximadamente 50 % a aproximadamente 99,9 % (por ejemplo, de aproximadamente 50 % a aproximadamente 60 %, de aproximadamente 55 % a aproximadamente 65 %, de aproximadamente 60 % a aproximadamente 70 %, de aproximadamente 65 % a aproximadamente 75 %, de aproximadamente 70 % a aproximadamente 80 %, de aproximadamente 75 % a aproximadamente 85 %, de aproximadamente 80 % a aproximadamente 90 %, de aproximadamente 85 % a aproximadamente 95 %, de aproximadamente 90 % a aproximadamente 99,9 %, de aproximadamente 95 % a aproximadamente 99,9 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 97,5 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 98,5 %, aproximadamente 99 %, aproximadamente 99,5 %, aproximadamente 99,6 %, aproximadamente 99,7 % o aproximadamente 99,8 %) con una o más de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 236 y/o 227. En algunos casos, los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención pueden comprender una secuencia de aminoácidos que comprenda uno o más fragmentos de cualquiera de las secuencias de SEQ ID NOs: 236 y/o 238. En algunos casos, los anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden estar codificados por una secuencia de nucleótidos con una identidad de secuencia de aproximadamente 50 % a aproximadamente 99,9 % (por ejemplo, de aproximadamente 50 % a aproximadamente 60 %, de aproximadamente 55 % a aproximadamente 65 %, de aproximadamente 60 % a aproximadamente 70 %, de aproximadamente 65 % a aproximadamente 75 %, de aproximadamente 70 % a aproximadamente 80 %, de aproximadamente 75 % a aproximadamente 85 %, de aproximadamente 80 % a aproximadamente 90 %, de aproximadamente 85 % a aproximadamente 95 %, de aproximadamente 90 % a aproximadamente 99,9 %, de aproximadamente 95 % a aproximadamente 99,9 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 97,5 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 98,5 %, aproximadamente 99 %, aproximadamente 99,5 %, aproximadamente 99,6 %, aproximadamente 99,7 % o aproximadamente 99,8 %) con una o más de las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NOs: 237 y/o 239.
Síntesis de IgG
Los anticuerpos IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) que comprenden una o más secuencias de aminoácidos de dominio variable y/o CDR presentadas en el presente documento (o fragmentos o variantes de las mismas) pueden sintetizarse para pruebas posteriores y/o desarrollo de productos. Dichos anticuerpos pueden producirse mediante la inserción de uno o más segmentos de ADNc que codifiquen las secuencias de aminoácidos deseadas en vectores de expresión adecuados para la producción de IgG. Los vectores de expresión pueden comprender vectores de expresión de mamíferos adecuados para la expresión de IgG en células de mamíferos. La expresión en mamíferos de las IgG puede llevarse a cabo para garantizar que los anticuerpos producidos comprendan modificaciones (por ejemplo, glicosilación) características de las proteínas de mamíferos y/o para garantizar que las preparaciones de anticuerpos carecen de endotoxina y/u otros contaminantes que pueden estar presentes en las preparaciones de proteínas procedentes de sistemas de expresión bacterianos.
Objetivos relacionados con el cáncer
En algunas realizaciones, los objetivos de la presente invención son antígenos o epítopos relacionados con el cáncer. En el presente documento, el término "relacionado con el cáncer" se utiliza para describir entidades que pueden estar asociadas de algún modo con el cáncer, las células cancerosas y/o los tejidos cancerosos. Se han identificado muchos antígenos o epítopos relacionados con el cáncer que comprenden glicanos y que se expresan en correlación con las células tumorales (Heimburg-Molinaro, J. y otros, Cancer vaccines and carbohydrate epitopes. Vaccine. 2011 Nov 8;29(48):8802-26). En el presente documento se denominan "antígenos carbohidratos asociados a tumores" o "TACA" Los TACA incluyen, pero no se limitan a, antígenos relacionados con mucinas [incluyendo, pero sin limitarse a, Tn, Sialil Tn (STn) y antígeno de Thomsen-Friedenreich], antígenos relacionados con Lewis del grupo sanguíneo [incluyendo, pero sin limitarse a, LewisY (LeY), LewisX (LeX), Sialyl LewisX (SLeX) y Sialyl LewisA (SLeA)], antígenos relacionados con glicoesfingolípidos [incluyendo, pero sin limitarse a Globo H, antígeno embrionario específico de estadio-3 (SSEA-3) y glicoesfingolípidos que comprenden ácido siálico], antígenos relacionados con gangliósidos [incluyendo, pero sin limitarse a gangliósidos GD2, GD3, GM2, fucosil GM1 y Neu5GcGM3] y antígenos relacionados con ácido polisialico. Muchos de estos antígenos se describen en la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US2011/021387 (WO 2011/088385).
En algunas realizaciones, los objetivos TACA de la presente divulgación incluyen antígenos del grupo sanguíneo de Lewis. Los antígenos del grupo sanguíneo de Lewis comprenden un residuo de fucosa unido a GlcNAc por un enlace a1-3 o un enlace a1-4. Pueden encontrarse tanto en los glicolípidos como en las glicoproteínas. Los antígenos del grupo sanguíneo Lewis pueden encontrarse en el fluido corporal de individuos que son secretores de estos antígenos. Su aparición en los glóbulos rojos se debe a la absorción de antígenos Lewis del suero por los glóbulos rojos.
En algunas realizaciones, los objetivos TACA de la presente divulgación comprenden LeY. LeY (también conocido como CD174) está formado por Galp1,4GlcNAC que comprende residuos de fucosa ligados a a1,2- así como a a1,3 dando lugar al epítopo Fuca(1,2)Galp(1,4)Fuca(1,3)GlcNAc. Se sintetiza a partir del antígeno H mediante a1,3 fucosiltransferasas que unen la a1,3 fucosa al residuo GlcNAc de la cadena madre. LeY puede expresarse en una variedad de cánceres, incluyendo, pero no limitado a ovario, mama, próstata, colon, pulmón y epitelial. Debido a su bajo nivel de expresión en los tejidos normales y a su elevado nivel de expresión en muchos cánceres, el antígeno LeY es un objetivo atractivo para los anticuerpos terapéuticos.
En algunas realizaciones, los objetivos TACA de la presente divulgación comprenden LeX. LeX comprende el epítopo Galp1-4(Fuca1-3)GlcNAcp-R. También se conoce como CD15 y antígeno embrionario específico de estadio-1 (SSEA1). Este antígeno se reconoció por primera vez como inmunorreactivo con sueros tomados de un ratón sometido a inmunización con células de teratocarcinoma F9. También se descubrió que LeX se correlaciona con el desarrollo embrionario en fases específicas. También se expresa en diversos tejidos, tanto en presencia como en ausencia de cáncer, pero también puede encontrarse en los cánceres de mama y ovario, donde sólo se expresa en las células cancerosas.
En algunas realizaciones, los objetivos TACA de la presente divulgación comprenden SLeA y/o SLeX SLeA y SLeX comprenden las estructuras [Neu5Aca2-3Galp1-3(Fuca1-4)GlcNAcp-R] y [Neu5Aca2-3Galp1-4(Fuca1-3)GlcNAcp-R] respectivamente. Su expresión aumenta en las células cancerosas. La presencia de estos antígenos en el suero se correlaciona con malignidad y mal pronóstico. SLeX se encuentra principalmente como epítopo terminal de mucina. Se expresa en varios tipos de cáncer, como los de mama, ovario, melanoma, colon, hígado, pulmón y próstata. En algunas realizaciones de la presente invención, los objetivos s SLeA y SLeX comprenden Neu5Gc (denominadas en el presente documento GcSLeA y GcSLeX, respectivamente).
En algunos casos, los objetivos relacionados con el cáncer de la divulgación pueden incluir mucinas. Ishida et al demuestran que la interacción de MUC2 con las células dendríticas (con actividad antitumoral) conduce a la apoptosis de las células dendríticas (Ishida, A. et al., 2008. Proteomics. 8: 3342-9). En algunos aspectos, la presente invención proporcionó anticuerpos antimucina para prevenir la apoptosis de células dendríticas y apoyar la actividad antitumoral.
En algunas realizaciones, los objetivos TACA de la presente divulgación comprenden glicolípidos y/o epítopos presentes en glicolípidos, incluyendo, pero sin limitarse a, glicoesfingolípidos. Los glicoesfingolípidos comprenden el lípido ceramida unido a un glicano por el grupo hidroxilo de la ceramida. En la membrana celular, los glicoesfingolípidos forman agrupaciones denominadas "balsas lipídicas".
En algunas realizaciones, los objetivos TACA de la presente divulgación comprenden Globo H. Globo H es un glicoesfingolípido relacionado con el cáncer identificado por primera vez en células de cáncer de mama. La porción de glicano de Globo H comprende Fuca(1-2)Galp(1-3)GalNAcp(1-3)Gala(1-4)Galp(1-4)Glcp(1). Aunque se encuentra en varios tejidos epiteliales normales, Globo H se ha identificado en asociación con muchos tejidos tumorales, incluyendo, pero no limitado a, tumores de células pequeñas de pulmón, mama, próstata, pulmón, páncreas, estómago, ovario y endometrio.
En algunas realizaciones, los objetivos de glicoesfingolipídicas relacionadas con el cáncer de la presente divulgación incluyen gangliósidos. Los gangliósidos son glicoesfingolípidos que contienen ácido siálico. De acuerdo con la nomenclatura de los gangliósidos, G se utiliza como abreviatura de gangliósido. Esta abreviatura va seguida de las letras M, D o T, que hacen referencia al número de residuos de ácido siálico unidos (1,2 o 3, respectivamente). Por último, los números 1, 2 o 3 se utilizan para referirse al orden de la distancia que recorre cada uno al ser analizado por cromatografía en capa fina (en la que el 3 recorre la mayor distancia, seguido del 2 y luego del 1). Se sabe que los gangliósidos intervienen en el crecimiento y la metástasis relacionados con el cáncer y se expresan en la superficie celular de las células tumorales. Los gangliósidos expresados en las células tumorales incluyen, pero no se limitan a, GD2, GD3, GM2 y fucosil GM1 (también denominado en el presente como documento Fuc-GM1). En algunas realizaciones de la presente invención, los anticuerpos que interactúan con los glicanos están dirigidos hacia GD3. El GD3 es un regulador del crecimiento celular. En algunas realizaciones, los anticuerpos dirigidos contra GD3 se utilizan para modular el crecimiento celular y/o la angiogénesis. En algunas realizaciones, los anticuerpos dirigidos contra GD3 se utilizan para modular la adhesión celular. El GD3 asociado a algunas células tumorales puede comprender residuos de ácido siálico 9-O-acetilado (Mukherjee, K. et al., 2008. J Cell Biochem. 105: 724-34 and Mukherjee, K. et al., 2009. Biol Chem. 390: 325-35). En algunos casos, los anticuerpos de la invención son selectivos para residuos de ácido siálico 9-O-acetilado. Algunos anticuerpos pueden ser específicos para los GD3 9-O-acetilados. Dichos anticuerpos pueden utilizarse para atacar células tumorales que expresen GD3 9-O-acetilado. En algunas realizaciones de la presente invención, los anticuerpos que interactúan con glicanos están dirigidos hacia GM2. En algunas realizaciones, los anticuerpos dirigidos contra GM2 se utilizan para modular el contacto célula-célula. En algunas realizaciones, los objetivos de gangliósidos de la presente invención comprenden Neu5Gc. En algunas realizaciones, dichos objetivos pueden incluir una variante de GM3 que comprende Neu5Gc (denominada en el presente documento GcGM3). El componente glicano de GcGM3 es Neu5Gca2-3Galp1-4Glc. GcGM3 es un componente conocido de las células tumorales (Casadesus, A.V. et al., 2013. Glycoconj J. 30(7):687-99).
En algunas realizaciones, los antígenos carbohidratos asociados a tumores de la presente invención comprenden Neu5Gc.
Huéspedes inmunogénicos
En algunas realizaciones, los anticuerpos que interactúan con glicanos de la presente divulgación pueden desarrollarse mediante el uso de animales no humanos como huéspedes para la inmunización, denominados en el presente documento "huéspedes inmunogénicos". En algunas realizaciones, los huéspedes inmunogénicos son mamíferos. En algunas realizaciones, los huéspedes inmunogénicos son ratones inactivos transgénicos. Los antígenos que comprenden sitios objetivo y/o objetivos epitópicos de anticuerpos que interactúan con glicanos pueden utilizarse para entrar en contacto con huéspedes inmunogénicos con el fin de estimular una respuesta inmunitaria y producir anticuerpos en el huésped inmunogénico que se unan específicamente a los sitios objetivo y/o objetivos epitópicos presentes en los antígenos introducidos.
De acuerdo con algunos procedimientos de la presente divulgación, el desarrollo de anticuerpos anti-STn puede comprender la inmunización de ratones a los que se les ha interrumpido el gen Cmah. Tales mutaciones pueden dar lugar a una fisiología más parecida a la humana en la medida en que Neu5Gc, la forma inmunogénica no humana del ácido siálico, ya no se produce en tales ratones. También se proporciona una célula Cmah-/'mieloma para producir un hibridoma que esté libre de expresión Neu5Gc, para la producción de un anticuerpo monoclonal GcSTn ya sea reduciendo la cantidad de anti-GcSTn recuperable o el hibridoma comenzará a morir debido a la unión del anticuerpo de nuevo al hibridoma. En el fondo de las células de mieloma Cmah-7- pueden eliminarse otros genes. Por ejemplo, el gen de la alfa-1,3-galactosiltransferasa, que codifica una enzima crítica para la formación de un epítopo altamente inmunogénico para los humanos (Chung, C.H. et al., Cetuximab-induced anaphylaxis and IgE specific for galactosealpha-1,3-galactose. N Engl J Med. 2008 Mar 13;358(11):1109-17), puede eliminarse en el fondo de las células de mieloma Cmah-7-.
De acuerdo con otros procedimientos de la presente invención, pueden utilizarse ratones de tipo salvaje para la inmunización. Tales procedimientos pueden ser a veces favorables para la producción de anticuerpos que interactúen con epítopos AcSTn o pan-STn. En algunos casos, las respuestas inmunitarias en ratones de tipo silvestre pueden ser más robustas.
Los anticuerpos producidos mediante inmunización pueden aislarse del suero de los huéspedes inmunogénicos. Las células productoras de anticuerpos de los huéspedes inmunogénicos también pueden utilizarse para generar líneas celulares que produzcan el anticuerpo deseado. En algunas realizaciones, el cribado de anticuerpos y/o células productoras de anticuerpos del huésped inmunogénico puede llevarse a cabo mediante el uso de ensayos inmunoenzimáticos (ELISA) y/o matrices de glicanos.
Adyuvantes
La inmunización de huéspedes inmunogénicos con antígenos descritos en el presente documento puede comprender el uso de uno o más adyuvantes. Pueden utilizarse adyuvantes para provocar una mayor respuesta inmunitaria en estos huéspedes inmunógenos. Como tales, los adyuvantes utilizados de acuerdo con la presente invención pueden seleccionarse con base en su capacidad para afectar a los títulos de anticuerpos.
En algunas realizaciones, las emulsiones de agua en aceite pueden ser útiles como adyuvantes. Las emulsiones de agua en aceite pueden actuar formando depósitos móviles de antígeno, facilitando la liberación lenta del antígeno y mejorando su presentación a los componentes inmunitarios. El adyuvante de Freund puede utilizarse como adyuvante de Freund completo (CFA), que comprende partículas micobacterianas que se han secado e inactivadas, o como adyuvante de Freund incompleto (IFA), que carece de tales partículas. Otros adyuvantes con base en agua en aceite pueden ser EMULSIGEN® (MVP Technologies, Omaha, NE). EMULSIGEN® se compone de gotas de aceite de tamaño micrométrico que no contienen componentes de origen animal. Puede utilizarse solo o en combinación con otros adyuvantes, incluyendo, pero sin limitarse a, hidróxido de aluminio y CARBIGEN™ (MVP Technologies, Omaha, NE).
En algunas realizaciones, puede utilizarse el adyuvante TITERMAX®. TITERMAX® es otra emulsión de agua en aceite que contiene escualeno, así como monooleato de sorbitán 80 (como emulsionante) y otros componentes. En algunos casos, TITERMAX® puede proporcionar respuestas inmunitarias más elevadas, pero con menor toxicidad hacia huéspedes inmunogénicos.
Los oligonucleótidos inmunoestimuladores también se pueden usar como adyuvantes. Dichos adyuvantes pueden incluir oligodesoxinucleótidos (ODN) CpG. Los CpG ODN son reconocidos por el receptor tipo Toll 9 (TLR9), lo que provoca fuertes efectos inmunoestimulantes. Los CpG ODN de tipo C inducen una fuerte producción de IFN-a a partir de la estimulación de células dendríticas plasmocitoides (pDC) y células B, así como la producción de IFN-y a partir de células T colaboradoras (Th). Se ha demostrado que el adyuvante CpG ODN aumenta significativamente la IgG2a y la IgG3 específicas del polisacárido neumocócico (19F y tipo 6B) en ratones. El ODN CpG también potenció las respuestas de anticuerpos frente al portador de la proteína CRM197, en particular las IgG2a e IgG3 específicas de CRM197 (Chu et al., Infection Immunity 2000, vol 68(3): 1450-6). Además, la inmunización de ratones de edad avanzada con polisacárido capsular neumocócico del serotipo 14 (PPS14) combinado con un CpG-ODN restauró las respuestas IgG anti-PPS14 a niveles de adultos jóvenes (Sen et al., Infection Immunity, 2006, 74(3):2177-86). Los CpG ODN utilizados de acuerdo con la presente invención pueden incluir los ODN de clase A, B o C. En algunas realizaciones, los ODN pueden incluir cualquiera de los disponibles comercialmente, tales como ODN-1585, ODN-1668, ODN-1826, ODN-2006, ODN-2007, ODN-2216, ODN-2336, ODN-2395 y/o ODN-M362, cada uno de los cuales puede adquirirse, por ejemplo, de InvivoGen, (San Diego, CA). En algunos casos, puede utilizarse ODN-2395. ODN-2395 es un ODN CpG de clase C que estimula específicamente el TLR9 humano y de ratón. Estos ODN incluyen esqueletos de fosforotioato y motivos palindrómicos CpG.
En algunas realizaciones, los complejos inmunoestimulantes (ISCOM) pueden utilizarse como adyuvantes. Los ISCOM son estructuras esféricas abiertas en forma de jaula (normalmente de 40 nm de diámetro) que se forman espontáneamente al mezclar colesterol, fosfolípidos y saponinas de Quillaia con una estequiometría específica. La tecnología ISCOM está probada para una gran variedad de antígenos, desde grandes glicoproteínas tales como gp340 del virus de Epstein-Barr (un antígeno de 340 kDa compuesto en un 80 % de carbohidratos) hasta péptidos sintéticos conjugados con portadores y pequeños haptenos tales como la biotina. Algunos ISCOM son capaces de generar una respuesta inmunitaria equilibrada con características tanto Th1 como Th2. La respuesta inmunitaria a los ISCOM se inicia en los ganglios linfáticos de drenaje, pero se desplaza eficazmente al bazo, lo que lo hace especialmente adecuado para generar también anticuerpos monoclonales. En algunas realizaciones, puede utilizarse el adyuvante ISCOM AbISCO-100 (Isconova, Uppsala, Suecia). AbISCO-100 es un adyuvante con base en saponina desarrollado específicamente para su uso en huéspedes inmunógenos, tales como los ratones, que pueden ser sensibles a otras saponinas.
De acuerdo con las realizaciones de la presente invención, los componentes adyuvantes de las soluciones de inmunización pueden variarse para lograr los resultados deseados. Dichos resultados pueden incluir la modulación del nivel general de respuesta inmunitaria y/o del nivel de toxicidad en huéspedes inmunogénicos.
Secuencia de anticuerpos y análisis y optimización estructurales
En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención pueden someterse a análisis de secuencias y/o análisis estructurales en los que se analizan las características que pueden afectar a la afinidad, especificidad, plegamiento proteico, estabilidad, fabricación, expresión y/o inmunogenicidad (es decir, reacciones inmunitarias en sujetos tratados con dichos anticuerpos). Dicho análisis puede incluir comparaciones entre anticuerpos que se unen al mismo epítopo o a epítopos similares.
Las secuencias de anticuerpos que se unen al mismo epítopo pueden analizarse en busca de variación en las secuencias de cadena ligera y/o pesada. Dicho análisis puede incluir secuencias de la línea germinal y/o secuencias CDR. La información obtenida de dicho análisis puede utilizarse para identificar (y opcionalmente modificar, eliminar, sustituir o reparar) residuos de aminoácidos conservados; segmentos de aminoácidos conservados; posiciones de aminoácidos con características de cadena lateral conservadas; longitudes de CDR conservadas; y otras características conservadas entre anticuerpos que se unen al mismo epítopo. Esta información puede utilizarse para diseñar variantes o para fundamentar procedimientos de optimización de anticuerpos con el fin de mejorar su afinidad, especificidad, plegamiento proteico, estabilidad, fabricación, expresión y/o inmunogenicidad.
El análisis de secuencias puede incluir la alineación de dos o más anticuerpos que se unen al mismo epítopo o a epítopos similares para identificar similitudes. Dicho análisis puede comparar la secuencia y/o longitud de regiones de anticuerpos (por ejemplo, CDR, dominios variables, segmentos de línea germinal). Pueden identificarse y evaluarse las inserciones de aminoácidos, las supresiones de aminoácidos y las sustituciones. Las diferencias de secuencia pueden compararse con la afinidad y/o especificidad de los anticuerpos.
En algunos casos, los análisis de secuencia se llevan a cabo para identificar (y opcionalmente modificar, borrar, reemplazar o reparar) una o más de las cisteínas no apareadas o disulfuros irregulares; sitios de glicosilación (por ejemplo, sitios NXS/T ligados a N); sitios de escisión de ácidos, sitios de oxidación de aminoácidos, conformidad con secuencias de línea germinal de ratón; sitios de desamidación de asparagina; sitios de isomerización de aspartato; sitios de formación de piroglutamato N-terminal; y parches propensos a agregación en CDRs.
En algunos casos, la presente invención proporciona variantes informadas por análisis de secuencias de los anticuerpos presentados en el presente documento. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "variante informada por análisis de secuencias" se refiere a una variante de anticuerpo que se ha modificado basándose en una o más conclusiones derivadas del análisis de secuencias de anticuerpos. En algunos casos, los anticuerpos de la invención pueden modificarse para producir variantes de anticuerpos que comprendan modificaciones de una o más de las afinidades, especificidad, plegamiento proteico, estabilidad, fabricación, expresión y/o inmunogenicidad del anticuerpo.
Algunas variantes informadas por análisis de secuencia de la divulgación comprenden una o más modificaciones de la longitud de CDR. Los anticuerpos modificados en la longitud de CDR pueden comprender uno o más aminoácidos añadidos o suprimidos en una o más CDR en relación con una secuencia de anticuerpo original. En algunos casos, las variantes informadas por análisis de secuencias pueden comprender una sustitución de una o más CDR por una o más CDR derivadas de otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo que se une al mismo epítopo o a uno similar). En algunos casos, las variantes informadas por análisis de secuencias pueden comprender una sustitución de un dominio variable de cadena pesada o ligera de otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo que se une al mismo epítopo o a uno similar). Las variantes informadas por análisis de secuencias pueden comprender modificaciones de uno o más genes de la línea germinal a partir de los cuales se expresa el anticuerpo. Dichas modificaciones pueden incluir mutaciones puntuales, mutaciones regionales, mutaciones por inserción o mutaciones por deleción. En algunos casos, las modificaciones de los genes de la línea germinal se llevan a cabo para trasladar las CDR de un gen de la línea germinal conocido a otro. Las variantes informadas por análisis de secuencias pueden incluir otras variantes descritas en el presente documento, incluyendo, pero sin limitarse a, scFvs, monocuerpos, diacuerpos, intracuerpos, CAR, anticuerpos miméticos, etc.
En algunas realizaciones, la secuencia y/o el análisis estructural pueden usarse para informar la construcción de bibliotecas de expresión de fragmentos de anticuerpos (incluyendo, pero sin limitarse a bibliotecas scFv, bibliotecas de expresión de fagos y bibliotecas de expresión de levadura). En un ejemplo, puede llevarse a cabo la alineación de secuencias para alinear dos o más anticuerpos con un antígeno o epítopo común y pueden identificarse residuos de aminoácidos que se conservan entre los anticuerpos alineados o que son variables entre los anticuerpos alineados. En tales casos, las bibliotecas de expresión de fragmentos de anticuerpos pueden construirse de manera que la variabilidad entre los miembros de la biblioteca se limite principalmente a los aminoácidos variables identificados en el análisis de la secuencia. En algunos casos, dichas bibliotecas pueden utilizarse para identificar variantes con afinidad y/o especificidad alterada por un antígeno objetivo (por ejemplo, STn) o un epítopo específico del antígeno objetivo (por ejemplo, los epítopos reconocidos por los anticuerpos de los Grupos 1, 2, 3 y 4, tal como se describe en el Ejemplo 1, a continuación).
En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención pueden modificarse para retirar, sustituir o eliminar de otro modo uno o más residuos de cisteína no apareados. En algunos casos, los residuos de cisteína no apareados pueden ser reactivos y en algunos casos pueden afectar a la afinidad y/o especificidad del anticuerpo. En consecuencia, algunos anticuerpos de la invención se han modificado para eliminar residuos de cisteína no apareados. En algunos casos, dichas variantes pueden tener una especificidad y/o afinidad epitópica modificada. En algunos casos, la modificación de residuos de cisteína no apareados puede alterar el plegamiento del anticuerpo. En algunos casos, estas variantes comprenden una sustitución o deleción de uno o más residuos de cisteína. En algunos casos, estas variantes comprenden uno o más residuos de aminoácidos adicionales (incluyendo, pero no limitado a, la adición de uno o más residuos de cisteína) para prevenir o reducir los efectos no deseados de los residuos de cisteína no apareados. En algunos casos, los residuos de cisteína se sustituyen por un aminoácido que tiene una cadena lateral hidrófoba (por ejemplo, tirosina, alanina, valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina o triptófano).
Pruebas y caracterización de anticuerpos
Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden ensayarse y/o caracterizarse utilizando diversos procedimientos. Dichos procedimientos pueden utilizarse para determinar una variedad de características que pueden incluir, pero no limitarse a, la afinidad del anticuerpo, la especificidad y la actividad (por ejemplo, la activación o inhibición de vías de señalización celular u otras actividades celulares o biológicas).
Ensayos basados en células
En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención pueden probarse o caracterizarse mediante el uso de uno o más ensayos con base en células. Estos ensayos celulares pueden realizarse in vitro con células en cultivo. En algunos casos, los ensayos celulares pueden realizarse in vivo. Entre los ejemplos de ensayos in vivo basados en células se incluyen los modelos tumorales en los que se inyectan o introducen de otro modo células tumorales en un huésped.
En algunos casos, las células utilizadas en ensayos basados en células pueden expresar uno o más glicanos objetivo reconocidos por uno o más anticuerpos de la invención. Tales glicanos pueden ser expresados naturalmente por dichas células o, alternativamente, las células pueden inducirse a expresar uno o más glicanos deseados para los fines de un ensayo particular. La expresión inducida puede ser a través de uno o más tratamientos que regulen al alza la expresión de proteínas glicosiladas o de enzimas que regulen la glicosilación. En otros casos, la expresión inducida puede incluir transfección, transducción u otra forma de introducción de uno o más genes o transcritos para la expresión endógena de una o más proteínas glicosiladas o enzimas implicadas en la regulación de la glicosilación.
En algunos casos, los ensayos basados en células utilizados en el presente documento pueden incluir el uso de células cancerosas. Se dispone de muchas líneas celulares de cáncer para experimentos de ensayo de anticuerpos de la invención. Dichas células pueden expresar el glicano objetivo o pueden inducirse a expresar los glicanos objetivo. Además, se pueden utilizar líneas celulares de cáncer para probar anticuerpos de la invención, donde las líneas celulares de cáncer son representativas de células madre de cáncer. Las líneas celulares de células madre cancerosas (CSC) pueden aislarse o diferenciarse a partir de células cancerosas cultivadas (por ejemplo, mediante clasificación basada en marcadores específicos de células madre cancerosas).
En algunas realizaciones, pueden utilizarse líneas celulares de cáncer de ovario. Dichas líneas celulares pueden incluir, pero sin limitarse a, las líneas celulares SKOV3, OVCAR3, OV90 y A2870. En algunos casos, las células CSC pueden aislarse de estas líneas celulares aislando las células que expresan los marcadores celulares CD44 y/o CD133.
Las células OVCAR3 se establecieron por primera vez utilizando ascitis maligna obtenida de una paciente que padecía adenocarcinoma de ovario progresivo (Hamilton, T.C. et al., 1983. Cancer Res. 43: 5379-89). Las poblaciones de células madre cancerosas pueden aislarse a partir de cultivos de células OVCAR3 mediante selección con base en marcadores específicos de la superficie celular como CD44 (implicado en la adhesión y migración celular), CD133 y CD117 (Liang, D. et al., 2012. BMC Cancer. 12: 201). Las células OV90 son células epiteliales de cáncer de ovario que se derivaron de forma similar de ascitis humana (véase la Patente de EE. UU. No. 5,710,038). Las células OV-90 también pueden expresar CD44 cuando se activan (Meunier, L. et al., 2010. Transl Oncol. 3(4): 230-8).
En algunas realizaciones, pueden utilizarse líneas celulares derivadas de cánceres gástricos. Dichas líneas celulares pueden incluir, pero no se limitan a, las células SNU-16 (véase la descripción en Park J.G. y otros, 1990. Cancer Res.
50: 2773-80). Las células SNU-16 expresan STn de forma natural, pero a niveles bajos.
Arreglos de glicanos
En algunas realizaciones, los anticuerpos que interactúan con glicanos de la presente invención pueden desarrollarse mediante el uso de matrices de glicanos. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "arreglo de glicanos" se refiere a una herramienta utilizada para identificar agentes que interactúan con cualquiera de una serie de glicanos diferentes unidos al sustrato del arreglo. En algunas realizaciones, las matrices de glicanos comprenden una serie de glicanos sintetizados químicamente, denominados en el presente documento "sondas de glicanos". En algunas realizaciones, las matrices de glicanos comprenden al menos 2, al menos 5, al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 150, al menos 350, al menos 1000 o al menos 1500 sondas de glicanos. En algunas realizaciones, las matrices de glicanos pueden personalizarse para presentar un conjunto deseado de sondas de glicanos. En algunas realizaciones, las sondas de glicanos pueden unirse al sustrato del arreglo mediante una molécula enlazadora. Tales enlazadores pueden comprender moléculas que incluyen, pero no se limitan a -O(CH2)2CH2)NH2 y O(CH2)aNHCOCH2(OCH2CH2)aNH2.
En algunas realizaciones, una matriz de glicanos tiene más de 70 glicanos sintetizados químicamente, la mayoría de los cuales se presentan como pares de glicanos que contienen Neu5Ac y Neu5Gc. Algunos ejemplos de sondas de glicanos pueden incluir: Neu5Ac-a-2-6-GalNAc (AcSTn); Neu5Gc-a-2-6-GalNAc (GcSTn); Neu5,9Ac2-a-2,6-GalNAc; Neu9Ac5Gc-a-2,6-GalNAc, y GalNAc (Tn). La especificidad de unión del anticuerpo a AcSTn frente a GcSTn puede determinarse utilizando el arreglo u otros procedimientos de determinación de la especificidad conocidos en la técnica. Además, se puede determinar el perfil de unión de los anticuerpos a la STn O-acetilada. La pérdida de O-acetilación en STn es relevante para el cáncer, ya que la expresión asociada al cáncer se correlaciona con un mayor reconocimiento de STn por los anticuerpos (Ogata, S. et al., Tumor-associated sialylated antigens are constitutively expressed in normal human colonic mucosa. Cancer Res. 1995 May 1;55(9): 2773-80). En algunos casos, pueden utilizarse matrices de glicanos para determinar el reconocimiento de STn frente a Tn.
Técnicas de cribado de bibliotecas de expresión de fragmentos de anticuerpos
En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención pueden producirse y/o optimizarse utilizando procedimientos de descubrimiento de alto rendimiento. Dichos procedimientos pueden incluir cualquiera de las L profundas de expresión (por ejemplo, técnicas de cribado de bibliotecas de expresión) divulgadas en la Solicitud Internacional de Patente No. WO2014074532. En algunas realizaciones, los anticuerpos sintéticos pueden diseñarse, seleccionarse u optimizarse mediante el cribado de antígenos diana utilizando tecnologías de expresión (por ejemplo, tecnologías de expresión de fagos). Las bibliotecas de expresión de fagos pueden estar formadas por millones o miles de millones de partículas de fagos, cada una de las cuales expresa fragmentos de anticuerpos únicos en su cubierta vírica. Dichas bibliotecas pueden proporcionar recursos muy diversos que pueden utilizarse para seleccionar potencialmente cientos de fragmentos de anticuerpos con diversos niveles de afinidad por uno o más antígenos de interés (McCafferty, et al., 1990. Nature. 348:552-4; Edwards, B.M. et al., 2003. JMB. 334: 103-18; Schofield, D. et al., 2007. Genome Biol. 8, R254 y Pershad, K. et al., 2010. Protein Engineering Design and Selection. 23:279-88). A menudo, los fragmentos de anticuerpos presentes en dichas bibliotecas comprenden fragmentos de anticuerpos scFv, que comprenden una proteína de fusión de dominios de anticuerpos Vh y Vl unidos por un enlazador flexible. En algunos casos, los scFv pueden contener la misma secuencia con la excepción de secuencias únicas que codifican bucles variables de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR). En algunos casos, los scFv se expresan como proteínas de fusión, unidas a proteínas de cubierta víricas (por ejemplo, el N-terminal de la proteína de cubierta pIII vírica). Las cadenas Vl pueden expresarse por separado para ensamblarse con las cadenas Vh en el periplasma antes de la incorporación del complejo a las cubiertas virales. Los miembros de la biblioteca precipitados pueden secuenciarse a partir del fago unido para obtener ADNc que codifique los scFv deseados. Dichas secuencias pueden incorporarse directamente a secuencias de anticuerpos para la producción de anticuerpos recombinantes, o mutarse y utilizarse para una mayor optimización mediante la maduración por afinidad in vitro.
Desarrollo de anticuerpos citotóxicos
En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención pueden ser capaces de inducir citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) y/o fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP). La ADCC es un mecanismo inmunitario por el que las células son lisadas como resultado de un ataque de células inmunitarias. Estas células inmunitarias pueden incluir células CD56+, células asesinas naturales (NK) CD3-, monocitos y neutrófilos (Strohl, W.R. Therapeutic Antibody Engineering. Woodhead Publishing, Filadelfia, PA. 2012. Ch. 8, p186).
En algunos casos, los anticuerpos de la presente invención pueden diseñarse para comprender un isotipo dado dependiendo de si se desea o no ADCC o ADCP tras la unión del anticuerpo. Dichos anticuerpos, por ejemplo, pueden modificarse de acuerdo con cualquiera de los procedimientos descritos en Alderson, K.L. et al., J Biomed Biotechnol.
2011. 2011:379123). En el caso de los anticuerpos de ratón, los diferentes isotipos de anticuerpos son más eficaces para promover ADCC. La IgG2a, por ejemplo, es más eficaz para inducir la ADCC que la IgG2b. Algunos anticuerpos de la presente invención, que comprenden anticuerpos IgG2b de ratón, pueden modificarse para que comprendan anticuerpos IgG2a. Estos anticuerpos rediseñados pueden ser más eficaces en la inducción de ADCC al unirse a antígenos asociados a células.
En algunas realizaciones, los genes que codifican regiones variables de anticuerpos desarrollados de acuerdo con procedimientos de la presente invención pueden clonarse en vectores de expresión de mamíferos que codifican regiones Fc humanas. Dichas regiones Fc pueden comprender regiones Fc de IgG1K humana. Las regiones Fc de las IgG1K pueden incluir mutaciones de aminoácidos conocidas por potenciar la unión al receptor Fc y la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC).
En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención pueden desarrollarse para aplicaciones terapéuticas de conjugados anticuerpo-fármaco (ADC). Los ADC son anticuerpos en los que se unen una o más cargas (por ejemplo, agentes terapéuticos o agentes citotóxicos) [por ejemplo, directamente o mediante un enlazador (por ejemplo, un enlazador escindible o un enlazador no escindible)]. Los ADC son útiles para administrar dichos agentes terapéuticos o citotóxicos a una o más células o tejidos objetivo (Panowski, S. et al., 2014. mAbs 6:1, 34-45). En algunos casos, los ADC pueden diseñarse para unirse a un antígeno de superficie de una célula objetivo. Tras la unión, todo el complejo anticuerpo-antígeno puede internalizarse y dirigirse a un lisosoma celular. Los ADCs pueden entonces degradarse, liberando la carga ligada. Cuando la carga es un agente citotóxico, la célula objetivo muere o queda inutilizada. Los agentes citotóxicos pueden incluir, entre otros, inhibidores del citoesqueleto [por ejemplo, inhibidores de la polimerización de la tubulina tal como maytansinas o auristatinas (por ejemplo, monometil auristatina E [MMAE] y monometil auristatina F [MMAF])] y agentes que dañan el ADN (por ejemplo, inhibidores de la polimerización del ADN tales como calqueamicinas y duocarmicinas).
En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención pueden ser probados por su capacidad para promover la muerte celular cuando se desarrollan como los ADC. Los ensayos de viabilidad celular pueden realizarse en presencia y ausencia de conjugados secundarios anticuerpo-fármaco. Los anticuerpos con potente inhibición del crecimiento celular pueden utilizarse entonces para diseñar conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) directos. El uso de estos conjugados secundarios anticuerpo-fármaco en ensayos citotóxicos celulares puede permitir una preselección rápida de muchos candidatos a ADC. Basándose en dichos ensayos, se añade directamente a las células un candidato a anticuerpo no conjugado en presencia de un anticuerpo secundario conjugado con uno o más agentes citotóxicos (denominado en el presente documento 2°ADC). La internalización del complejo anticuerpo/2°ADC en las células que expresan una alta densidad del antígeno objetivo puede lograr una liberación del fármaco dependiente de la dosis dentro de las células, provocando un efecto citotóxico para destruir las células (por ejemplo, células tumorales), mientras que las células que expresan una baja densidad del antígeno objetivo no se ven afectadas (por ejemplo, células normales).
Los ADC de la invención pueden diseñarse para orientarse a las células cancerosas. Dichos ADC pueden comprender anticuerpos dirigidos a uno o más antígenos carbohidratos asociados a tumores (TACA). En algunos casos, los ADC de la invención comprenden anticuerpos anti-STn.
Desarrollo de receptores de antígenos quiméricos
En algunas realizaciones, las secuencias de anticuerpos de la invención pueden utilizarse para desarrollar un receptor de antígeno quimérico (CAR). Los CAR son receptores transmembrana expresados en células inmunitarias que facilitan el reconocimiento y la destrucción de células objetivo (por ejemplo, células tumorales). Los CAR suelen constar de tres partes básicas. Estos incluyen un ectodominio (también conocido como dominio de reconocimiento), un dominio transmembrana y un dominio intracelular (de señalización). Los ectodominios facilitan la unión a antígenos celulares en las células objetivo, mientras que los dominios intracelulares suelen comprender funciones de señalización celular para promover la destrucción de las células objetivo unidas. Además, pueden tener un dominio extracelular con uno o más dominios variables de anticuerpos descritos en el presente documento o fragmentos de los mismos. Los CAR de la invención también incluyen un dominio transmembrana y una cola citoplasmática. Los CAR pueden diseñarse para incluir uno o más segmentos de un anticuerpo, dominio variable de anticuerpo y/o CDR de anticuerpo, de modo que cuando dichos CAR se expresan en células efectoras inmunitarias, las células efectoras inmunitarias se unen y eliminan cualquier célula que sea reconocida por las porciones de anticuerpo de los CAR.
Las características de los CAR incluyen su capacidad para redirigir la especificidad y reactividad de las células T hacia un objetivo seleccionado de forma no restringida por MHC, explotando las propiedades de unión a antígeno de los anticuerpos monoclonales. El reconocimiento de antígenos no restringido por el MHC confiere a las células T que expresan los CAR la capacidad de reconocer antígenos independientemente de su procesamiento, eludiendo así uno de los principales mecanismos de escape tumoral. Además, cuando se expresan en células T, los CAR no dimerizan con las cadenas alfa y beta de los receptores endógenos de células T (TCR).
Los CAR modificados para dirigirse a tumores pueden tener especificidad para uno o más antígenos carbohidratos asociados a tumores (TACA). En algunas realizaciones, los ectodominios de estos CAR pueden comprender uno o más dominios variables de anticuerpos o un fragmento de los mismos. En algunas realizaciones, los CAR se expresan en células T y pueden denominarse "células T modificadas con CAR" o "CAR-T". Las CAR-T pueden diseñarse con ectodominios CAR que tengan uno o más dominios variables de anticuerpos.
Características estructurales de los receptores de antígenos quiméricos
Con la tecnología de transferencia de genes, las células T pueden diseñarse para expresar anticuerpos de forma estable en su superficie, confiriendo una especificidad de antígeno deseada. Los receptores quiméricos de antígenos (CAR) combinan un dominio de reconocimiento de antígenos de un anticuerpo específico con un dominio intracelular de la cadena CD3-zeta o la proteína FcyRI con propiedades activadoras de células T en una única proteína quimérica de fusión. La tecnología c Ar proporciona un reconocimiento sin restricciones del MHC de las células objetivo por parte de las células T. La eliminación de la restricción MHC de las células T facilita el uso de estas moléculas en cualquier paciente, y, además, tanto en células T CD8+ como CD4+, normalmente restringidas a epítopos MHC de clase I o II, respectivamente. El uso de regiones de unión a Ab permite a las células T responder a epítopos formados no sólo por proteínas, sino también por hidratos de carbono y lípidos. Este enfoque de receptores quiméricos es especialmente adecuado para la inmunoterapia del cáncer, ya que puede evitar muchos de los mecanismos por los que los tumores evitan el inmunorreconocimiento, tal como la regulación a la baja del MHC, la falta de expresión de moléculas coestimuladoras, la resistencia a los CTL y la inducción de la supresión de células T, y donde el uso de CTL CD8+ y células T CD4+ se combina mejor para una eficacia antitumoral óptima. Se ha demostrado que este enfoque es aplicable a una amplia gama de antígenos tumorales, además de a virus tal como el VIH (Finney, et al., J. Immunology, 2004, 172:104-113).
Aunque los receptores de antígenos quiméricos pueden desencadenar la activación de células T de manera similar a la de los receptores de células T endógenos, en la práctica, la aplicación clínica de la tecnología CAR se ha visto obstaculizada por la expansión in vivo inadecuada de células T receptoras de antígenos quiméricos. Por ejemplo, los CAR de primera generación incluían como dominio de señalización la región citoplasmática de la cadena y del receptor CD3Z o Fc. Estos CAR de primera generación se probaron en estudios clínicos de fase I en pacientes con cáncer de ovario, cáncer renal, linfoma y neuroblastoma, y se observó que inducían respuestas modestas, redirigiendo eficazmente la citotoxicidad de las células T, pero sin lograr la proliferación y supervivencia de las células T tras la exposición repetida al antígeno. Los prototipos de CAR de segunda generación incluían receptores que abarcaban tanto CD28 como CD3Z, y los CAR de segunda generación se han probado para el tratamiento de neoplasias de células B y otros tipos de cáncer (Sadelain, et al., (2009) Current Opinion in Immunology, 21(2):215-223). De este modo, los CAR se han expandido rápidamente en un arreglo diverso de receptores con diferentes propiedades funcionales.
Más recientemente, se descubrió que las respuestas de células T mediadas por CAR pueden mejorarse con la adición de un dominio coestimulador. En modelos preclínicos, se observó que la inclusión del dominio de señalización CD137 (4-1BB) aumentaba significativamente la actividad antitumoral y la persistencia in vivo de los receptores antigénicos quiméricos en comparación con la inclusión de la cadena CD3-zeta sola (Porter, et al., N. Engl. J. Med. 2011, 365:725-733).
Así, en algunas realizaciones de la presente divulgación, las secuencias de anticuerpos de la invención pueden utilizarse para desarrollar un receptor de antígeno quimérico (CAR). En algunas realizaciones, los CAR son receptores transmembrana expresados en células inmunitarias que facilitan el reconocimiento y la eliminación de células objetivo (por ejemplo, células tumorales).
En muchos cánceres, no se han definido antígenos tumorales específicos a los que orientarse, pero en las neoplasias de células B, CD19 es un objetivo atractivo. La expresión de CD19 está restringida a las células B normales y malignas y a los precursores de células B. Se llevó a cabo un ensayo clínico piloto de tratamiento con células T autólogas que expresan un receptor quimérico de antígeno anti-CD19 (CART19) en pacientes con leucemia linfoide crónica (l Lc ) avanzada y deficiente en p53. La generación de una respuesta inmunitaria CD19-específica en la médula ósea se demostró por la liberación temporal de citoquinas y la ablación de células leucémicas que coincidió con el pico de infiltración de células T receptoras de antígenos quiméricos. (Porter, et al., N. Engl. J. Med. 2011, 365:725-733).
Otras características estructurales de los CAR pueden incluir cualquiera de las divulgadas en varias Publicaciones PCT asignadas a City of Hope y cuyo inventor común es Michael Jensen. Por ejemplo, Publicación PCT WO 00/23573 describe células T redirigidas específicas para CD20, modificadas genéticamente, que expresan una proteína de superficie celular que tiene un dominio extracelular que comprende un receptor específico para CD20, un dominio de señalización intracelular y un dominio transmembrana. Uso de dichas células para la inmunoterapia celular de neoplasias CD20+ y para anular cualquier función adversa de las células B. En una realización, la proteína de superficie celular es un receptor FvFc:Z de cadena única donde Fv designa las cadenas VH y VL de un anticuerpo monoclonal de cadena única frente a CD20 unido por péptido, Fc representa una región bisagra-CH2-CH3 de una IgG1 humana, y Z representa el dominio de señalización intracelular de la cadena zeta de CD3 humana. Un procedimiento para fabricar una célula T redirigida que exprese un receptor quimérico de células T mediante electroporación utilizando ADN desnudo que codifique el receptor. Del mismo modo, Publicación PCT WO 02/077029 describe células inmunitarias redirigidas específicas para CD19, modificadas genéticamente, que expresan una proteína de superficie celular que tiene un dominio extracelular que comprende un receptor específico para CD19, un dominio de señalización intracelular y un dominio transmembrana. Uso de dichas células para la inmunoterapia celular de neoplasias CD20+ y para anular cualquier función adversa de las células B. En una realización, la célula inmunitaria es una célula T y la proteína de superficie celular es un receptor svFvFc:Z de cadena única donde scFv designa las cadenas VH y VL de un anticuerpo monoclonal de cadena única frente a CD 19, Fc representa al menos parte de una región constante de una IgG1, y zeta representa el dominio de señalización intracelular de la cadena zeta del complejo receptor de antígenos de células T (cadena zeta de CD3 humano). El dominio extracelular scFvFc y el dominio intracelular zeta están unidos por un dominio transmembrana tal como el dominio transmembrana de CD4. Un procedimiento para fabricar una célula T redirigida que exprese un receptor quimérico de células T mediante electroporación utilizando ADN desnudo que codifique el receptor. Estos receptores de antígenos quiméricos tienen la capacidad, cuando se expresan en células T, de redirigir el reconocimiento del antígeno con base en la especificidad del anticuerpo monoclonal. El diseño de scFvFc: receptores con especificidades objetivo para epítopos de la superficie de células tumorales es una estrategia conceptualmente atractiva para generar células inmunitarias efectoras antitumorales para terapia adoptiva, ya que no depende de la inmunidad antitumoral preexistente. Estos receptores son "universales" en el sentido de que se unen al antígeno de forma independiente del MHC, por lo que puede utilizarse un constructo de receptor para tratar a una población de pacientes con tumores positivos al antígeno. Ciudad de la Esperanza Publicaciones PCT WO 02/088334, WO 2007/059298 y WO 2010/065818 describen "zetaquinas" compuestas por un dominio extracelular que comprende un ligando receptor soluble unido a una región de soporte capaz de anclar el dominio extracelular a una superficie celular, una región transmembrana y un dominio de señalización intracelular. Las zetaquinas, cuando se expresan en la superficie de los linfocitos T, dirigen la actividad de las células T hacia aquellas células específicas que expresan un receptor para el que el ligando del receptor soluble es específico.
Las características adicionales de los CAR pueden incluir cualquiera de las divulgadas en dos Publicaciones PCT asignadas a la University of Texas y cuyo inventor común es Lawrence Cooper. Publicación PCT No. WO 2009/091826 describe composiciones que comprenden un polipéptido receptor quimérico de células T (o receptor quimérico de antígenos, c A r ) específico de c D19 humano (designado hCD19CAR) que comprende un dominio de señalización intracelular, un dominio transmembrana y un dominio extracelular, comprendiendo el dominio extracelular una región de unión a CD 19 humano. En otro aspecto, la región de unión a CD 19 es un F(ab')2, Fab', Fab, Fv o scFv. El dominio intracelular puede comprender un dominio de señalización intracelular de CD3Z humano y puede comprender además el segmento intracelular CD28 humano. En ciertos aspectos, el dominio transmembrana es un dominio transmembrana CD28. Publicación PCT No. WO 2013/074916 describe procedimientos y composiciones para inmunoterapia que emplean células T CAR+ modificadas genéticamente para eliminar la expresión del receptor de células T y/o HLA. En determinadas realizaciones, las células T receptoras de células T negativas y/o HLA negativas se generan utilizando nucleasas de dedos de zinc, por ejemplo. Las células T CAR+ de donantes sanos alogénicos pueden administrarse a cualquier paciente sin causar la enfermedad injerto contra huésped (EICH), actuando como reactivos universales para el tratamiento inmediato de afecciones médicas tal como el cáncer, la autoinmunidad y las infecciones.
La publicación PCT WO 2011/041093 asignada al Department of Health and Human Services de los EE. UU. describe receptores de antígenos quiméricos anti-receptor del factor de crecimiento endotelial vascular-2 que comprenden un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo KDR-1121 o DC101, un dominio bisagra extracelular, un dominio transmembrana del receptor de células T y un dominio de señalización intracelular del receptor de células T, y su uso en el tratamiento del cáncer.
Publicaciones PCT WO 2012/079000 y WO 2013/040557, están asignadas a la University of Pennsylvania y comparten el inventor común Carl H. June; estas publicaciones describen CAR que comprenden un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana, una región de señalización coestimuladora y un dominio de señalización CD3 zeta, y procedimientos para generar células T transfectadas con ARN receptor de antígeno quimérico (CAR), respectivamente.
Publicación PCT WO2013/126712, también asignada a la University of Pennsylvania y que comparte el inventor común Carl H. June, describe composiciones y procedimientos para generar una población persistente de células T que exhiben una expansión exponencial prolongada en cultivo que es independiente del ligando e independiente de la adición de citoquinas exógenas o células alimentadoras, que son útiles para el tratamiento del cáncer. En algunas realizaciones, el dominio de unión a antígeno es un dominio de unión a anti-cMet. En algunas realizaciones, el dominio de unión a antígeno es un dominio de unión a anti-mesotelina. En algunas realizaciones, el dominio de unión a antígeno es un dominio de unión a anti-CD 19. El dominio bisagra es IgG4, el dominio transmembrana es un dominio transmembrana CD28. En algunas realizaciones, la región de señalización costimuladora es una región de señalización CD28. También se proporciona un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR), y el CAR que comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio bisagra, un dominio transmembrana, una región de señalización costimuladora, y un dominio de señalización CD3 zeta.
La publicación PCT WO 2014/039513 asignada a la University of Pennsylvania describe composiciones y procedimientos para inhibir una o más isotermas de diacilglicerol quinasa (DGK) en una célula con el fin de potenciar la actividad citolítica de la célula. Las células pueden utilizarse en la transferencia adoptiva de células T, en la que la célula se modifica para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR). La inhibición de la DGK en las células T utilizadas en la transferencia adoptiva de células T aumenta la actividad citolítica de las células T y, por lo tanto, puede utilizarse en el tratamiento de diversas afecciones, que incluyen el cáncer, las infecciones y los trastornos inmunitarios.
La publicación PCT WO 2014/055771 asignada a la University of Pennsylvania describe composiciones y procedimientos para tratar el cáncer de ovario. Específicamente, la invención se refiere a la administración de una célula T modificada genéticamente que tiene un dominio de unión al receptor de folato alfa (FR-alfa) y un dominio coestimulador CD27 para tratar el cáncer de ovario. En una realización, se dice que el dominio de unión FR-alfa es totalmente humano, evitando así una respuesta inmunitaria del huésped.
En algunas realizaciones, los CAR pueden diseñarse para dirigirse a tumores. Tales CAR pueden tener especificidad para uno o más TACA. En algunos casos, los ectodominios de estos CAR pueden comprender uno o más dominios variables de anticuerpos presentados en el presente documento o un fragmento de los mismos. En algunas realizaciones, los CAR se expresan en células T, denominadas en el presente documento "células T modificadas con CAR" o "CAR-T". Las CAR-T pueden diseñarse con ectodominios CAR que tengan uno o más de los dominios variables de anticuerpos presentados en el presente documento.
Anticuerpos multiespecíficos
En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención pueden unirse a más de un epítopo. En el presente documento, los términos "anticuerpo multicuerpo" o "anticuerpo multiespecífico" se refieren a un anticuerpo en el que dos o más regiones variables se unen a epítopos diferentes. Los epítopos pueden estar en los mismos objetivos o en diferentes. En ciertas realizaciones, un anticuerpo multiespecífico es un "anticuerpo biespecífico", que reconoce dos epítopos diferentes en el mismo antígeno o en antígenos diferentes.
Anticuerpos biespecíficos
Los anticuerpos biespecíficos son capaces de unirse a dos antígenos diferentes. Tales anticuerpos comprenden típicamente regiones de unión a antígeno de al menos dos anticuerpos diferentes. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal biespecífico (BsMAb, BsAb) es una proteína artificial compuesta por fragmentos de dos anticuerpos monoclonales diferentes, lo que permite que el BsAb se una a dos tipos diferentes de antígeno. Una aplicación habitual de esta tecnología es la inmunoterapia contra el cáncer, en la que los BsMAbs se modifican para que se unan simultáneamente a una célula citotóxica (utilizando un receptor como el CD3) y a un objetivo como la célula tumoral que se desea destruir.
Los anticuerpos biespecíficos pueden incluir cualquiera de los descritos en Riethmuller, G., 2012. Cancer Immunity.
12:12-18; Marvin, J.S. et al., 2005. Acta Pharmacologica Sinica. 26(6):649-58; and Schaefer, W. et al., 2011. PNa S.
108(27):11187-92.
Se han desarrollado nuevas generaciones de BsMAb, denominadas anticuerpos "trifuncionales biespecíficos". Consisten en dos cadenas pesadas y dos ligeras, una de cada dos anticuerpos diferentes, donde las dos regiones Fab (los brazos) se dirigen contra dos antígenos, y la región Fc (el pie) comprende las dos cadenas pesadas y forma el tercer sitio de unión.
De los dos parátopos que forman la parte superior de los dominios variables de un anticuerpo biespecífico, uno puede estar dirigido contra un antígeno objetivo y el otro contra un antígeno de linfocitos T como CD3. En el caso de los anticuerpos trifuncionales, la región Fc puede unirse además a una célula que exprese receptores Fc, como un macrófago, una célula asesina natural (NK) o una célula dendrítica. En resumen, la célula objetivo se conecta a una o dos células del sistema inmunitario, que posteriormente la destruyen.
Se han diseñado otros tipos de anticuerpos biespecíficos para superar ciertos problemas, tal como la vida media corta, la inmunogenicidad y los efectos secundarios causados por la liberación de citoquinas. Entre ellos se encuentran los Fab unidos químicamente, formados únicamente por las regiones Fab, y diversos tipos de fragmentos variables de cadena única (scFvs) bivalentes y trivalentes, proteínas de fusión que imitan los dominios variables de dos anticuerpos. Los más avanzados de estos nuevos formatos son los captadores biespecíficos de células T (BiTE) y los mAb2, anticuerpos modificados para contener un fragmento de unión al antígeno Fcab en lugar de la región constante Fc.
Se utilizó con éxito un fragmento Fv de anticuerpo biespecífico de cadena única (Bs-scFv) para destruir células cancerosas. Algunos cánceres humanos están causados por defectos funcionales en p53 que se restauran mediante terapia génica con p53 de tipo silvestre. Weisbart, et al., describen la construcción y expresión de un anticuerpo biespecífico de cadena única que penetra en las células vivas de cáncer de colon, se une a p53 intracelular, y se dirige y restaura su función de tipo silvestre(Weisbart, et al., Int. J. Oncol. 2004 Oct;25(4):1113-8y Weisbart, et al., Int. J.
Oncol. 2004 Dec;25(6):1867-73). En estos estudios, se construyó un fragmento Fv de anticuerpo biespecífico de cadena única (Bs-scFv) a partir de (i) un fragmento Fv de cadena única de mAb 3E10 que penetra en las células vivas y se localiza en el núcleo, y (ii) un fragmento Fv de cadena única de un anticuerpo no penetrante, mAb PAb421 que se une al C-terminal de p53. La unión de PAb421 restaura las funciones de tipo silvestre de algunos mutantes de p53, incluyendo los de las células humanas de cáncer de colon SW480. El Bs-scFv penetró en las células SW480 y fue citotóxico, lo que sugiere una capacidad para restaurar la actividad de la p53 mutante. Las células COS-7 (células de riñón de mono con p53 de tipo silvestre) sirvieron de control, ya que no responden a la PAb421 debido a la presencia del antígeno SV40 grande T, que inhibe la unión de la PAb421 a la p53. El Bs-scFv penetró en las células c OS-7 pero no fue citotóxico, eliminando así la toxicidad inespecífica del Bs-scFv no relacionada con la unión a p53. Los fragmentos Fv por sí solos no fueron citotóxicos, lo que indica que la muerte se debió a la transducción de p53. Una única mutación en la CDR1 de PAb421 VH eliminó la unión del Bs-scFv a p53 y anuló la citotoxicidad para las células SW480 sin alterar la penetración celular, lo que apoya aún más el requisito de la unión de PAb421 a p53 para la citotoxicidad (Weisbart, et al., Int. J. Oncol. 2004 Oct;25(4):1113-8y Weisbart, et al., Int. J. Oncol. 2004 Dec;25(6):1867-73).
En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención pueden ser diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos biespecíficos funcionales de cadena única (bscAb). Estas moléculas bivalentes de unión a antígenos están compuestas por dímeros no covalentes de scFvs, y pueden producirse en células de mamífero mediante procedimientos recombinantes. (Véase, por ejemplo, Mack et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 92: 7021-7025, 1995). Pocos diacuerpos han entrado en fase de desarrollo clínico. En un estudio patrocinado por el Beckman Research Institute of the City of Hope (Clinicaltrials.gov NCT00647153) se ha evaluado una versión marcada con yodo-123 del anticuerpo quimérico anti-CEA cT84.66 para la detección inmunoscintigráfica prequirúrgica del cáncer colorrectal (Nelson, A. L., MAbs.2010. Ene-Feb; 2(1):77-83).
Usando genética molecular, se pueden modificar dos scFv en tándem en un solo polipéptido, separados por un dominio enlazador, llamado un "scFv en tándem" (tascFv). Se ha observado que los TascFv son poco solubles y requieren replegamiento cuando se producen en bacterias, o pueden fabricarse en sistemas de cultivo de células de mamífero, lo que evita los requisitos de replegamiento, pero puede dar lugar a rendimientos pobres. La construcción de un tascFv con genes para dos scFvs diferentes da lugar a "fragmentos variables biespecíficos de cadena única" (bis-scFvs). Sólo dos tascFv han sido desarrollados clínicamente por empresas comerciales; ambos son agentes biespecíficos en fase temprana activa de desarrollo por Micromet para indicaciones oncológicas, y se describen como "Enganches biespecíficos de células T (BiTE)" Blinatumomab es un tascFv biespecífico anti-CD 19/anti-CD3 que potencia las respuestas de las células T al linfoma no Hodgkin de células B en fase 2. MT110 es un tascFv biespecífico anti-EP-CAM/anti-CD3 que potencia la respuesta de las células T frente a tumores sólidos en fase 1. Affimed también está investigando "TandAbs" biespecíficos y tetravalentes (Nelson, A. L., MAbs.2010. Ene-Feb; 2(1):77-83).
También se incluyen los maxicuerpos (scFv bivalentes fusionados al extremo amino de los dominios Fc (CH2-CH3) de IgG.
Los anticuerpos activadores de células T biespecíficos (BiTE) están diseñados para activar transitoriamente células T citotóxicas para la lisis de células objetivo seleccionadas. La actividad clínica de los anticuerpos BiTE corrobora los hallazgos de que las células T autólogas expandidas ex vivo derivadas de tejido tumoral, o transfectadas con receptores específicos de células T, han mostrado potencial terapéutico en el tratamiento de tumores sólidos. Aunque estos enfoques personalizados demuestran que las células T por sí solas pueden tener una actividad terapéutica considerable, incluso en cánceres en fase avanzada, son engorrosos de llevar a cabo de forma generalizada. Esto es diferente en el caso de los anticuerpos contra el antígeno linfocitario T citotóxico 4 (CTLA-4), que facilitan la generación de clones de células T específicos de tumores, y también en el caso de los anticuerpos bi-y tri-específicos que implican directamente a una gran proporción de las células T de los pacientes para la lisis de células cancerosas. Se está investigando activamente el potencial de la captación global de células T para la terapia del cáncer humano mediante anticuerpos captadores de células T (Baeuerle PA, et al., Current Opinion in Molecular Therapeutics. 2009, 11(1):22-30).
Las moléculas de tercera generación incluyen anticuerpos "miniaturizados". Entre los mejores ejemplos de miniaturización de mAb se encuentran los pequeños inmunofármacos modulares (SMIP) de Trubion Pharmaceuticals. Estas moléculas, que pueden ser monovalentes o bivalentes, son moléculas recombinantes de cadena única que contienen un dominio de unión al antígeno Vl, un dominio de unión al antígeno Vh y uno o dos dominios "efectores" constantes, todos ellos conectados por dominios enlazadores. Presumiblemente, una molécula de este tipo podría ofrecer las ventajas de una mayor penetración tisular o tumoral que reclaman los fragmentos, conservando al mismo tiempo las funciones de efector inmunitario que confieren los dominios constantes. Al menos tres SMIP "miniaturizados" han entrado en fase de desarrollo clínico. TRU-015, un anti-CD20 SMIP desarrollado en colaboración con Wyeth, es el proyecto más avanzado, ya que ha pasado a la fase 2 para la artritis reumatoide (RA). Los intentos anteriores en el lupus eritematoso sistémico (SLE) y los linfomas de células B se interrumpieron en última instancia. Trubion y Facet Biotechnology colaboran en el desarrollo de TRU-016, un anti-CD37 SMIP, para el tratamiento de la CLL y otras neoplasias linfoides, proyecto que ha alcanzado la fase 2. Wyeth ha concedido la licencia del anti-CD20 SMIP SBI-087 para el tratamiento de enfermedades autoinmunes, que incluyen RA, SLE y posiblemente la esclerosis múltiple, aunque estos proyectos siguen en las primeras fases de ensayo clínico. (Nelson, A. L., MAbs.2010. Jan-Feb; 2(1):77-83).
Genmab está investigando la aplicación de su tecnología "Unicuerpo", en la que se ha eliminado la región de bisagra de las moléculas IgG4. Mientras que las moléculas de IgG4 son inestables y pueden intercambiar heterodímeros de cadena ligera-pesada entre sí, la deleción de la región bisagra impide por completo el emparejamiento de cadena pesada-cadena pesada, dejando heterodímeros ligeros/pesados monovalentes altamente específicos, al tiempo que se conserva la región Fc para garantizar la estabilidad y la semivida in vivo. Esta configuración puede minimizar el riesgo de activación inmunitaria o de crecimiento oncogénico, ya que la IgG4 interactúa poco con los FcR y los unicuerpos monovalentes no consiguen promover la formación de complejos de señalización intracelular. Sin embargo, estas afirmaciones se basan en gran medida en pruebas de laboratorio, más que clínicas. Biotecnol también está desarrollando un mAb "miniaturizado", CAB051, que es un anticuerpo anti-HER2 de 100 kDa "compactado" en investigación preclínica (Nelson, A. L., MAbs.2010. Jan-Feb; 2(1):77-83).
También se han desarrollado terapias recombinantes compuestas por dominios únicos de unión a antígenos, aunque actualmente sólo representan 4 % de la cartera de productos clínicos. Estas moléculas son extremadamente pequeñas, con pesos moleculares de aproximadamente una décima parte de los observados en los mAbs de tamaño completo. Arana y Domantis modifican moléculas compuestas por dominios de unión a antígeno de cadenas ligeras o pesadas de inmunoglobulina humana, aunque sólo Arana tiene un candidato en pruebas clínicas, ART-621, una molécula anti-TNFa en estudio de fase 2 para el tratamiento de la psoriasis y la artritis reumatoide. Ablynx produce "nanocuerpos" derivados de las regiones de cadena pesada variable (Vhh) de los anticuerpos de cadena pesada de camellos y llamas, que carecen de cadenas ligeras. Dos nanocuerpos de Ablynx contra el factor von Willebrand han avanzado hacia el desarrollo clínico, entre ellos ALX-0081, en fase 2 de desarrollo como terapia intravenosa para prevenir la trombosis en pacientes sometidos a intervención coronaria percutánea por síndrome coronario agudo, y ALX-0681, una molécula de fase 1 para administración subcutánea destinada tanto a pacientes con síndrome coronario agudo como con púrpura trombótica trombocitopénica (Nelson, A. L., MAbs.2010. Ene-Feb; 2(1):77-83).
Desarrollo de anticuerpos multiespecíficos
En algunas realizaciones, las secuencias de anticuerpos de la invención pueden utilizarse para desarrollar anticuerpos multiespecíficos(por ejemplo, biespecíficos, triespecíficos o de mayor multiespecificidad). Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un antígeno objetivo de la presente invención, o pueden ser específicos tanto para un antígeno objetivo de la presente invención, como para un epítopo heterólogo, tal como un glicano, péptido o material de soporte sólido heterólogo. (Véase, por ejemplo, los documentos WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, A. et al., Trispecific F(ab')3 derivatives that use cooperative signaling via the TCR/CD3 complex and CD2 to activate and redirect resting cytotoxic T cells. J. Immunol.
1991 Jul 1; 147(1):60-9; Pat. de EE. UU. Nos. 4,474,893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,819y Kostelny, S.A. et al., Formation of a bispecific antibody by the use of leucine zippers. J. Immunol. 1992 Mar 1;148(5):1547-53); Pat. de EE. UU. No. 5,932,448.
Divulgado y reivindicado en Publicación PCT WO2014144573 al Memorial Sloan-Kettering Cancer Center son tecnologías de multimerización para fabricar agentes de unión multiespecíficos diméricos(por ejemplo, proteínas de fusión que comprenden componentes de anticuerpos) con propiedades mejoradas con respecto a los agentes de unión multiespecíficos sin capacidad de dimerización.
Divulgado y reivindicado en Publicación PCT WO2014144357 a Merck Patent GMBH son anticuerpos biespecíficos tetravalentes (TetBiAbs), y procedimientos de fabricación y procedimientos de utilización de TetBiAbs para el diagnóstico y para el tratamiento del cáncer o de trastornos inmunitarios. Los TetBiAbs presentan un segundo par de fragmentos Fab con una segunda especificidad antigénica unidos al C-terminal de un anticuerpo, proporcionando así una molécula que es bivalente para cada una de las dos especificidades antigénicas. El anticuerpo tetravalente se produce por procedimientos de ingeniería genética, mediante la unión covalente de una cadena pesada de anticuerpo a una cadena ligera Fab, que se asocia con su cadena pesada Fab coexpresada.
Divulgado y reivindicado en Publicación PCT WO2014028560 a IBC Pharmaceuticals, Inc. son anticuerpos biespecíficos (bsAb) redireccionadores de células T, con al menos un sitio de unión para un antígeno de células T y al menos un sitio de unión para un antígeno en una célula enferma o patógeno, para el tratamiento de enfermedades. Preferentemente, este bsAb es un anticuerpo biespecífico anti-CD3 x anti-CD19, aunque pueden utilizarse anticuerpos contra otros antígenos de células T y/o antígenos asociados a enfermedades. El complejo es capaz de dirigirse a células T efectoras para inducir la citotoxicidad mediada por células T de células asociadas a una enfermedad, tal como cáncer, enfermedad autoinmune o enfermedad infecciosa. La respuesta inmunitaria citotóxica se potencia mediante la administración conjunta de agentes con base en interferón que comprenden interferón-a, interferón-bgr; interferón-A1, interferón-A2 o interferón-A3.
Divulgado y reivindicado en Publicación PCT WO2013092001 a Synimmune GMBH es una molécula de anticuerpo biespecífico, así como un procedimiento para producir la misma, su uso y una molécula de ácido nucleico que codifica la molécula de anticuerpo biespecífico. En particular, se proporciona una molécula de anticuerpo que es capaz de mediar en la activación restringida a la célula objetivo de las células inmunitarias.
Divulgado y reivindicado en Publicación PCT WO2012007167 es un anticuerpo modular multiespecífico que se une específicamente al menos a un glicoepítopo y a un receptor de la clase erbB en la superficie de una célula tumoral, reticulando de este modo el glicoepítopo y el receptor, cuyo anticuerpo tiene actividad apoptótica efectuando citólisis independiente de las células NK.
Divulgado y reivindicado en Publicaciones PCT WO2012048332 y WO2013055404 son meditopos, anticuerpos de unión a meditopos, sistemas de administración de meditopos, así como una interfaz de unión a una estructura de anticuerpos monoclonales para meditopos, y procedimientos para su uso. En concreto, dos péptidos de unión a anticuerpos, C-QFDLSTRRLK-C ("cQFD"; número de identificación de secuencia 1 en la misma; s Eq ID NO: 240 del presente documento) y C-QYNLSSRALK-C ("cQYN"; número de identificación de secuencia 2 del presente documento; SEQ ID NO: 241) demostraron tener nuevas propiedades de unión a mAb. También denominados "meditopos", se demostró que cQFD y cQYN se unen a una región de la estructura Fab del mAb antiEGFR cetuximab y no a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que se unen al antígeno. La región de unión de la estructura Fab es distinta de la de otros antígenos de unión a estructuras, tal como los superantígenos proteína estafilocócica A (SpA) (Graille et al., 2000) y proteína L (PpL) de Peptostreptococcus magnus (Graille et al., 2001). En consecuencia, una realización divulgada es una interfaz de unión a marco que comprende una región marco de un anticuerpo murino-humano único o un fragmento funcional del mismo que se une a un meditopo cíclico.
Algunos ejemplos de patentes y publicaciones de patentes de interés son: Patente de EE. UU. Nos.
5,585,089; 5,693,761y 5,693,762, todas presentadas el 7 de junio de 1995 y Patente de EE. UU. No. 6,180,370, todos asignados a Protein Design Labs, Inc., describen procedimientos para producir y composiciones de inmunoglobulinas humanizadas que tienen una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) y posibles aminoácidos adicionales de una inmunoglobulina donante y una región estructural de una inmunoglobulina humana receptora. Se dice que cada cadena de inmunoglobulina humanizada comprende generalmente, además de las CDR, aminoácidos de la estructura de la inmunoglobulina donante que son, por ejemplo, capaces de interactuar con las CDR para efectuar la afinidad de unión, tal como uno o más aminoácidos que son inmediatamente adyacentes a una CDR en la inmunoglobulina donante o aquellos dentro de aproximadamente 3 A según lo predicho por modelado molecular. Las cadenas pesadas y ligeras pueden diseñarse utilizando uno o diversos criterios de posición. Cuando se combinan en un anticuerpo intacto, se dice que las inmunoglobulinas humanizadas de la presente invención son sustancialmente no inmunogénicas en humanos y conservan sustancialmente la misma afinidad que la inmunoglobulina donante con el antígeno, tal como una proteína u otro compuesto que contenga un epítopo.
La patente de EE. UU. No. 5,951,983, asignada a Universite Catholique De Louvain y Bio Transplant, Inc., describe un anticuerpo humanizado contra linfocitos T. Allí se exponen regiones marco de un gen V kappa humano designado como HUM5400 (acceso EMBL X55400) y del clon de anticuerpo humano Amu 5-3 (número de acceso GenBank U00562).
La patente de EE. UU. No. 5,091,513a Creative Biomolecules, Inc., describe una familia de proteínas sintéticas que tienen afinidad por un antígeno preseleccionado. Las proteínas se caracterizan por una o más secuencias de aminoácidos que constituyen una región que se comporta como un sitio de unión de anticuerpos biosintéticos (BABS). Los sitios comprenden 1) dímeros sintéticos Vh y Vl no asociados covalentemente o unidos por disulfuro, 2) cadenas simples Vh-Vl o Vl-Vh en las que el Vh y el Vl están unidos por un enlazador polipeptídico, o 3) dominios Vh o Vl individuales. Los dominios de unión comprenden regiones CDR y FR unidas, que pueden derivarse de inmunoglobulinas separadas. Las proteínas también pueden incluir otras secuencias polipeptídicas que funcionan, por ejemplo, como enzima, toxina, sitio de unión o sitio de unión a un medio de inmovilización o átomo radiactivo. Se dan a conocer procedimientos para producir las proteínas, para diseñar BABS que tengan cualquier especificidad que pueda obtenerse mediante la generación in vivo de anticuerpos, y para producir análogos de los mismos.
La patente de EE. UU. No. 8,399,625, a ESBA Techuna Alcon Biomedical Research Unit, LLC, describe marcos aceptores de anticuerpos y procedimientos para injertar anticuerpos no humanos, porejemplo, anticuerpos de conejo, utilizando una estructura aceptora de anticuerpos particularmente bien adaptada.
Intracuerpos
En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención pueden ser intracuerpos. Los intracuerpos son una forma de anticuerpo que no se segrega de la célula en la que se produce, sino que se dirige a una o más proteínas intracelulares. Los intracuerpos se expresan y funcionan intracelularmente, y pueden utilizarse para afectar a multitud de procedimientos celulares, incluyendo, pero sin limitarse a, el tráfico intracelular, la transcripción, la traducción, los procedimientos metabólicos, la señalización proliferativa y la división celular. En algunas realizaciones, los procedimientos descritos en el presente documento incluyen terapias intracuerpo. En algunas de dichas realizaciones, las secuencias de dominio variable y/o las secuencias c Dr divulgadas en el presente documento se incorporan a uno o más constructos para terapia basada en intracuerpos. Por ejemplo, los intracuerpos pueden dirigirse a una o más proteínas intracelulares glicosiladas o pueden modular la interacción entre una o más proteínas intracelulares glicosiladas y una proteína alternativa.
Hace más de dos décadas, se describieron por primera vez los anticuerpos intracelulares contra objetivos intracelulares (Biocca, Neuberger y Cattaneo EMBO J. 9: 101-108, 1990). La expresión intracelular de intracuerpos en diferentes compartimentos de las células de mamíferos permite bloquear o modular la función de moléculas endógenas (Biocca, et al., EMBO J. 9: 101-108, 1990; Colby et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU.. 101: 17616-21, 2004). Los intracuerpos pueden alterar el plegamiento de proteínas, las interacciones proteína-proteína, proteína-ADN, proteína-ARN y la modificación de proteínas. Pueden inducir un inactivo fenotípico y funcionar como agentes neutralizantes mediante la unión directa al antígeno objetivo, desviando su tráfico intracelular o inhibiendo su asociación con socios de unión. Se han empleado en gran medida como herramientas de investigación y están emergiendo como moléculas terapéuticas para el tratamiento de enfermedades humanas como patologías víricas, cáncer y enfermedades de mal plegamiento. El rápido crecimiento del biomercado de anticuerpos recombinantes proporciona intracuerpos con mayor especificidad de unión, estabilidad y solubilidad, junto con una menor inmunogenicidad, para su uso en terapia (Biocca, resumen en Antibody Expression and Production Cell Engineering Volumen 7, 2011, pp. 179-195).
En algunas realizaciones, los intracuerpos tienen ventajas sobre el ARN interferente (ARNi); por ejemplo, se ha demostrado que el ARNi ejerce múltiples efectos inespecíficos, mientras que los intracuerpos han demostrado tener alta especificidad y afinidad por los antígenos objetivo. Además, como proteínas, los intracuerpos poseen una semivida activa mucho más larga que los ARNi. Así, cuando la vida media activa de la molécula objetivo intracelular es larga, el silenciamiento génico mediante ARNi puede tardar en producir efecto, mientras que los efectos de la expresión intracuerpo pueden ser casi instantáneos. Por último, es posible diseñar intracuerpos que bloqueen determinadas interacciones de unión de una molécula objetivo concreta, al tiempo que preservan otras.
Desarrollo de intracuerpos
Los intracuerpos son a menudo fragmentos variables de cadena simple (scFvs) expresados a partir de una molécula de ácido nucleico recombinante y diseñados para retenerse intracelularmente(porejemplo, retenidos en el citoplasma, retículo endoplásmico o periplasma). Los intracuerpos pueden utilizarse, por ejemplo, para eliminar la función de una proteína a la que se une el intracuerpo. La expresión de los intracuerpos también puede regularse mediante el uso de promotores inducibles en el vector de expresión de ácido nucleico que comprende el intracuerpo. Los intracuerpos pueden producirse utilizando procedimientos conocidos en la técnica, como los divulgados y revisados en: (Marasco et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 90: 7889-7893; Chen et al., 1994, Hum. Gene Ther. 5:595-601; Chen et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU.., 91: 5932-5936; Maciejewski et al., 1995, Nature Med., 1: 667-673; Marasco, 1995, Immunotech, 1: 1-19; Mhashilkar, et al., 1995, EMBO J. 14: 1542-51; Chen et al., 1996, Hum. Gene Therap., 7: 1515-1525; Marasco, Gene Ther. 4:11-15, 1997; Rondon y Marasco, 1997, Annu. Rev. Microbiol. 51:257-283; Cohen, et al., 1998, Oncogene 17:2445-56; Proba et al., 1998, J. Mol. Biol. 275:245-253; Cohen et al., 1998, Oncogene 17:2445-2456; Hassanzadeh, et al., 1998, FEBS Lett. 437:81-6; Richardson et al., 1998, Gene Ther. 5:635-44; Ohage y Steipe, 1999, J. Mol. Biol. 291:1119-1128; Ohage et al., 1999, J. Mol. Biol. 291:1129-1134; Wirtz y Steipe, 1999, Protein Sci. 8:2245-2250; Zhu et al., 1999, J. Immunol. Methods 231:207-222; Arafat et al., 2000, Cancer Gene Ther.
7:1250-6; derMaur et al., 2002, J. Biol. Chem. 277:45075-85; Mhashilkar et al., 2002, Gene Ther. 9:307-19; y Wheeler et al., 2003, FASEB J. 17: 1733-5; y referencias citadas en el mismo). En particular, un intracuerpo CCR5 ha sido producido por Steinberger et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:805-810). Véase en general Marasco, WA, 1998, "Intrabodies: Basic Research and Clinical Gene Therapy Applications" Springer: Nueva York; y para una revisión de scFvs, véase Pluckthun en "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies," 1994, vol. 113, Rosenburg y Moore eds. Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269-315.
En algunas realizaciones, se utilizan secuencias de anticuerpos para desarrollar intracuerpos. Los intracuerpos suelen expresarse de forma recombinante como fragmentos de dominio único, tal como los dominios VH y VL aislados, o como un anticuerpo de fragmento variable de cadena única (scFv) dentro de la célula. Por ejemplo, los intracuerpos se expresan a menudo como un único polipéptido para formar un anticuerpo de cadena única que comprende los dominios variables de la cadena pesada y ligera unidos por un polipéptido enlazador flexible. Los intracuerpos suelen carecer de enlaces disulfuro y son capaces de modular la expresión o la actividad de los genes objetivo mediante su actividad de unión específica. Los anticuerpos de cadena simple también pueden expresarse como un fragmento de región variable de cadena simple unido a la región constante de cadena ligera.
Como es conocido en la técnica, un intracuerpo puede modificarse en vectores polinucleótidos recombinantes para codificar señales de tráfico subcelular en su extremo N o C para permitir la expresión a altas concentraciones en los compartimentos subcelulares donde se localiza una proteína objetivo. Por ejemplo, los intracuerpos dirigidos al retículo endoplásmico (ER) se diseñan para incorporar un péptido líder y, opcionalmente, una señal de retención de ER C-terminal, tal como el motivo de aminoácidos KDEL (SEQ ID NO: 242). Los intracuerpos destinados a ejercer actividad en el núcleo se modifican para incluir una señal de localización nuclear. Los lípidos se unen a los intracuerpos para fijarlos al lado citosólico de la membrana plasmática. Los intracuerpos también pueden dirigirse para ejercer su función en el citosol. Por ejemplo, los intracuerpos citosólicos se utilizan para secuestrar factores dentro del citosol, impidiendo así que sean transportados a su destino celular natural.
Existen ciertos desafíos técnicos con la expresión intracuerpo. En particular, el plegamiento conformacional de la proteína y la estabilidad estructural del intracuerpo recién sintetizado dentro de la célula se ven afectados por las condiciones reductoras del entorno intracelular. En la terapia clínica humana, existen preocupaciones de seguridad en torno a la aplicación de ADN recombinante transfectado, que se utiliza para lograr la expresión intracuerpo dentro de la célula. Especialmente preocupantes son los diversos vectores virales utilizados habitualmente en la manipulación genética. Así pues, un procedimiento para sortear estos problemas consiste en fusionar dominios de transducción de proteínas (PTD) con anticuerpos scFv, para crear un anticuerpo "permeable a las células" o "transcuerpo". Los transcuerpos son anticuerpos permeables a las células en los que se fusiona un dominio de transducción de proteínas (PTD) con anticuerpos de fragmento variable de cadena simple (scFv) (Heng y Cao, 2005, Med Hypotheses. 64:1105-8).
Al interactuar con un gen objetivo, un intracuerpo modula la función de la proteína objetivo y/o consigue una inactivación fenotípica/funcional mediante mecanismos tal como la aceleración de la degradación de la proteína objetivo y el secuestro de la proteína objetivo en un compartimento subcelular no fisiológico. Otros mecanismos de inactivación génica mediada por intracuerpos pueden depender del epítopo al que se dirige el intracuerpo, tal como la unión al sitio catalítico de una proteína objetivo o a epítopos que participan en interacciones proteína-proteína, proteína-ADN o proteína-ARN.
En una realización, los intracuerpos se utilizan para capturar un objetivo en el núcleo, impidiendo así su actividad dentro del núcleo. Las señales de orientación nuclear se incorporan a estos intracuerpos para lograr la orientación deseada. Estos intracuerpos están diseñados para unirse específicamente a un dominio objetivo concreto. En otra realización, los intracuerpos citosólicos que se unen específicamente a una proteína objetivo se utilizan para impedir que el objetivo acceda al núcleo, impidiendo así que ejerza cualquier actividad biológica dentro del núcleo (por ejemplo, impidiendo que el objetivo forme complejos de transcripción con otros factores).
Para dirigir específicamente la expresión de tales intracuerpos a células particulares, la transcripción del intracuerpo se coloca bajo el control regulador de un promotor y/o potenciador específico de tumor apropiado. Para dirigir la expresión del intracuerpo específicamente a la próstata, por ejemplo, se puede utilizar el promotor del PSA y/o el promotor/ potenciador (Véase, por ejemplo, la Patente de Ee . UU. No. 5,919,652, publicada el 6 de julio de 1999).
Los dominios de transducción de proteínas (PTD) son secuencias peptídicas cortas que permiten a las proteínas translocarse a través de la membrana celular e internalizarse dentro del citosol, a través de vías atípicas de secreción e internalización. Un "transcuerpo" tendría varias ventajas sobre los intracuerpos convencionales expresados en la célula. Para empezar, el plegamiento conformacional "correcto" y la formación de enlaces disulfuro pueden tener lugar antes de la introducción en la célula objetivo. Y lo que es más importante, el uso de anticuerpos permeables a las células o "transcuerpos" evitaría las enormes preocupaciones éticas y de seguridad que rodean la aplicación directa de la tecnología del ADN recombinante en la terapia clínica humana, necesaria para la expresión intracuerpo dentro de la célula. Los "transcuerpos" introducidos en la célula sólo poseerían una vida media activa limitada, sin provocar ninguna alteración genética permanente. Esto disiparía cualquier duda sobre su seguridad en relación con su aplicación en la terapia clínica humana (Heng y Cao 2005, Med Hypotheses. 64:1105-8).
Los intracuerpos son agentes terapéuticos prometedores para el tratamiento de enfermedades de mal plegamiento, incluyendo las enfermedades de Alzheimer, Parkinson, Huntington y priónicas, debido a su capacidad prácticamente infinita de reconocer específicamente las diferentes conformaciones de una proteína, incluyendo las isoformas patológicas, y porque pueden orientarse a los sitios potenciales de agregación (tanto sitios intracelulares como extracelulares). Estas moléculas pueden actuar como agentes neutralizantes contra las proteínas amiloidógenas, impidiendo su agregación, y/o como desviadores moleculares del tráfico intracelular, desviando la proteína de su posible lugar de agregación (Cardinale y Biocca, Curr. Mol. Med. 2008, 8:2-11).
A continuación, se exponen ejemplos de publicaciones de patentes que describen anticuerpos intracelulares o intracuerpos.
Publicación PCT WO03014960 y Patente de EE. UU. 7,608,453 concedida a Cattaneo, et al., describen un procedimiento de tecnología de captura de anticuerpos intracelulares para identificar al menos una secuencia consenso para un anticuerpo intracelular (ICS) que comprende los pasos de: crear una base de datos que comprende secuencias de anticuerpos intracelulares validados (base de datos VIDA) y alinear las secuencias de anticuerpos intracelulares validados de acuerdo con Kabat; determinar la frecuencia con la que un aminoácido particular ocurre en cada una de las posiciones de los anticuerpos alineados; seleccionar un valor umbral de frecuencia (LP o umbral de consenso) en el intervalo del 70 % al 100 %; identificar las posiciones del alineamiento en las que la frecuencia de un aminoácido particular es mayor o igual que el valor LP; e identificar el aminoácido más frecuente, en la posición de dicho alineamiento.
Publicaciones PCT WO0054057; WO03077945; WO2004046185; WO2004046186; WO2004046187; WO2004046188; WO200404618; Publicaciones de Solicitud de Patente US2005272107; US2005276800; US2005288492; US2010143939 Patentes de EE. UU.
concedidas 7,569,390 y 7,897,347 y Patentes europeas concedidas EP1560853y EP1166121 todas ellas asignadas al Medical Research Council y que incluyen a los inventores Cattaneo, et al., describen inmunoglobulinas intracelulares de dominio único, y un procedimiento para determinar la capacidad de una inmunoglobulina de dominio único para unirse a un objetivo en un entorno intracelular, así como procedimientos para generar anticuerpos intracelulares.
Publicación PCT WO0235237; Publicación de Solicitud de Patente US 2003235850 y Patente Europea concedida EP1328814 que nombra a Catteneo como inventor y se asigna a S.I.S.S.A. Scuola Internazionale Superiore describen un procedimiento para la identificación in vivo de epítopos de un antígeno intracelular.
Publicación PCT WO2004046192 y Patente Europea EP1565558 asignada a Lay Line Genomics SPA y que nombra a Catteneo como inventor describen un procedimiento para aislar anticuerpos intracelulares que interrumpen y neutralizan una interacción entre un ligando proteico x y un ligando proteico y dentro de una célula. También se divulga un procedimiento para identificar un ligando proteico x capaz de unirse a un ligando conocido y utilizando anticuerpos intracelulares capaces de la interacción entre x e y; y un procedimiento para el aislamiento de un conjunto de fragmentos de anticuerpos contra una proporción significativa de las interacciones proteína-proteína de una célula dada (interactoma) o contra las interacciones proteicas que constituyen una vía o red intracelular.
Publicación de Solicitud de Patente US 2006034834 y Publicación PCT WO9914353 titulada "Intrabody-mediated control of immune reactions" y asignada a los inventores Marasco y Mhashilkar del Dana Farber Cancer Institute Inc. están dirigidas a procedimientos para alterar la regulación del sistema inmunitario, por ejemplo, orientándose selectivamente a moléculas receptoras inmunomoduladoras (IRM) individuales o de clase en células que comprenden la transducción de las células con un anticuerpo expresado intracelularmente, o intracuerpo, contra las IRM. En una realización preferida, el intracuerpo comprende un anticuerpo de cadena simple contra un iRm , por ejemplo, moléculas MHC-1.
La publicación PCT WO2013033420 asignada al Dana Farber Cancer Institute Inc. y Whitehead Biomedical Institute, y que nombra a los inventores Bradner, Rahl y Young describe procedimientos y composiciones útiles para inhibir la interacción entre una proteína bromodominio y un elemento regulador de inmunoglobulina (Ig) y regular a la baja la expresión de un oncogén translocado con un locus Ig, así como para tratar un cáncer(porejemplo, malignidad hematológica) caracterizado por una expresión aumentada de un oncogén translocado con un locus Ig. En general, se describen los intracuerpos.
Publicación PCT WO02086096 y Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. 2003104402 titulada "Methods of producing or identifying intrabodies in eukaryotic cells," asignada al University of Rochester Medical Center y que nombra a los inventores Zauderer, Wei y Smith describen un procedimiento de alta eficiencia para expresar moléculas de inmunoglobulinas intracelulares y bibliotecas de inmunoglobulinas intracelulares en células eucariotas utilizando un procedimiento de recombinación trimolecular. Se proporcionan además procedimientos de selección y cribado de moléculas de inmunoglobulina intracelular y fragmentos de las mismas, y kits para producir, cribado y selección de moléculas de inmunoglobulina intracelular, así como las moléculas de inmunoglobulina intracelular y fragmentos producidos utilizando estos procedimientos.
Publicación PCT WO2013023251 asignada a Affinity Biosciences PTY LTD y que nombra a los inventores Beasley, Niven y Kiefel describe polipéptidos, tales como moléculas de anticuerpos y polinucleótidos que codifican tales polipéptidos, y bibliotecas de los mismos, en las que los polipéptidos expresados demuestran una alta estabilidad y solubilidad. En particular, se describen polipéptidos que comprenden dominios VL y VH emparejados que demuestran expresión soluble y plegamiento en un entorno reductor o intracelular, en el que se examinó una biblioteca scFv humana, lo que dio como resultado el aislamiento de genes scFv solubles que tienen regiones marco idénticas a la secuencia de la línea germinal humana, así como una termoestabilidad y tolerancia notables del injerto CDR3 en el andamiaje scFv.
Solicitud de Patente europea EP2314622 y Publicaciones PCT WO03008451 y WO03097697 asignadas a Esbatech AG y a la University of Zuerich y en las que se nombra a los inventores Ewert, Huber, Honneger y Pluckthun describen la modificación de dominios variables humanos y proporcionan composiciones útiles como estructuras para la creación de fragmentos de anticuerpos Fv de cadena única muy estables y solubles. Estas estructuras han sido seleccionadas por su rendimiento intracelular y, por lo tanto, son ideales para la creación de fragmentos de anticuerpos scFv o bibliotecas de anticuerpos scFv para aplicaciones en las que la estabilidad y la solubilidad son factores limitantes para el rendimiento de los fragmentos de anticuerpos, tal como en el entorno reductor de una célula. Dichas estructuras también pueden utilizarse para identificar residuos altamente conservados y secuencias consenso que demuestren una mayor solubilidad y estabilidad.
Publicación PCT WO02067849 y Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. 2004047891 titulada "Systems devices and methods for intrabody targeted delivery and reloading of therapeutic agents" describen sistemas, dispositivos y procedimientos para la administración intracuerpo dirigida de moléculas. Más concretamente, algunas realizaciones se refieren a un sistema recargable de administración de fármacos, que permite la administración dirigida de agentes terapéuticos a una región tisular de un sujeto, de forma localizada y oportuna.
Publicación PCT WO2005063817 y Patente de EE. UU. 7,884,054 asignada a Amgen Inc. y que nombra a los inventores Zhou, Shen y Martin describen procedimientos para identificar anticuerpos funcionales, incluyendo intracuerpos. En particular, se describe un intracuerpo homodimérico, en el que cada cadena polipeptídica del homodímero comprende una región Fc, un scFv y una secuencia de localización intracelular. La secuencia de localización intracelular puede hacer que el intracuerpo se localice en el ER o en el Golgi. Opcionalmente, cada cadena polipeptídica comprende no más de un scFv.
La publicación PCT WO2013138795 de Vogan, et al. y asignada a Permeon Biologics Inc. describe composiciones de penetración celular para el suministro de anticuerpos intracelulares y elementos similares a anticuerpos y procedimientos para suministrarlos (denominados en el presente documento "elementos AAM" o "un elemento AAM") a una célula. Sin estar limitada por la teoría, la presente divulgación se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que una fracción de AAM puede introducirse en una célula formando un complejo entre la fracción de AAM y un polipéptido de penetración celular con carga superficial positiva (denominado en el presente documento "polipéptido de penetración superficial"). También se ofrecen ejemplos de algunas aplicaciones de la tecnología intraphilin.
La publicación PCT WO2010004432 asignada al Instituto Pasteur describe inmunoglobulinas de camélidos (camellos, dromedarios, llamas y alpacas), de las que aproximadamente 50 % son anticuerpos desprovistos de cadena ligera. Estos anticuerpos de cadena pesada interactúan con el antígeno en virtud de un único dominio variable, denominado(s) VHH, dominio(s) VHH o anticuerpo(s) VHH. A pesar de la ausencia de cadena ligera, estos anticuerpos homodiméricos exhiben un amplio repertorio de unión a antígenos mediante la ampliación de sus regiones hipervariables, y pueden actuar como transcuerpo y/o intracuerpo in vitro, así como in vivo, cuando el dominio VHH se dirige contra un objetivo intracelular.
La publicación PCT WO2014106639 describe un procedimiento para identificar un objetivo celular implicado en un fenotipo celular mediante la identificación de un intracuerpo que puede modificar un fenotipo celular y la identificación de un objetivo celular directo o indirecto del intracuerpo. En particular, los intracuerpos 3H2-1, 3H2-VH y 5H4 son capaces de inhibir la reacción de degranulación en mastocitos desencadenada por un estímulo alérgico; además, los intracuerpos 3H2-1 y 5H4 se dirigían directa o indirectamente a una proteína de la familia ABCF1 y C120RF4, respectivamente. Se dice que estos inhibidores de ABCF1 y C120RF4 son útiles en terapia, en particular para tratar afecciones alérgicas y/o inflamatorias.
Publicación PCT WO0140276 asignada a Urogenesis Inc. describe en general la posibilidad de inhibición de las proteínas STEAP (Six Transmembrane Epithelial Antigen of the Prostate) utilizando anticuerpos intracelulares (intracuerpos).
Publicación PCT WO02086505 asignada a la University of Manchester y Publicación de Solicitud de Patente US2004115740 los inventores Simon y Benton describen un procedimiento para el análisis intracelular de una molécula objetivo, en el que se dice que son preferibles los intracuerpos. En una realización, se describe un vector (designado pScFv-ECFP) capaz de expresar un intracuerpo anti-MUC1 acoplado a CFP.
Publicación PCT WO03095641 y WO0143778 asignada a Gene Therapy Systems Inc. describen composiciones y procedimientos para la liberación intracelular de proteínas, y en general se describen intracuerpos.
La publicación PCT WO03086276 asignada a Selective Genetics Inc. describe una tecnología de plataforma para el tratamiento de infecciones intracelulares. Las composiciones y procedimientos descritos incluyen vectores no específicos que se dirigen a células infectables a través de ligandos enlazados que se unen e internalizan a través de receptores/mocidades de la superficie celular asociados con la infección. Los vectores comprenden secuencias exógenas de ácido nucleico que se expresan al internalizarse en una célula objetivo. Los ligandos asociados al vector y las moléculas de ácido nucleico pueden alterarse para orientarse a diferentes agentes infecciosos. Además, la invención proporciona procedimientos para identificar epítopos y ligandos capaces de dirigir la internalización de un vector y capaces de bloquear la entrada viral.
La publicación PCT WO03062415 asignada a la Erasmus University describe un organismo transgénico que comprende un constructo de polinucleótido que codifica un anticuerpo intracelular que interrumpe la catálisis de la producción del xenoantígeno galactosa alfa 1,3 galactosa y/o un constructo de polinucleótido que codifica un anticuerpo intracelular que se une específicamente a una proteína de retrovirus, tal como una proteína de partícula PERV. Las células, tejidos y órganos del organismo transgénico podrán utilizarse en xenotrasplantes.
Publicación PCT WO2004099775 titulada "Means for detecting protein conformation and applications thereof' describe el uso de fragmentos scFv como anticuerpos específicos de conformación para detectar específicamente un estado conformacional de proteínas, que se dice que tienen aplicaciones como sensores para seguir en células vivas, tras la expresión intracelular, el comportamiento de proteínas endógenas.
La publicación PCT WO2008070363 asignada a Imclone Systems Inc. describe un intracuerpo de dominio único que se une a una proteína intracelular o a un dominio intracelular de una proteína intracelular, tal como Etk, la tirosina quinasa endotelial y epitelial, que es miembro de la familia Tec de tirosina quinasas no receptoras. También se proporciona un procedimiento para inhibir una enzima intracelular, y tratar un tumor en un paciente administrando el intracuerpo o un ácido nucleico que expresa el intracuerpo.
La publicación PCT WO2009018438 asignada a Cornell Research Foundation Inc. describe un procedimiento de identificación de una proteína que se une a una molécula objetivo y tiene funcionalidad intracelular, proporcionando un constructo que comprende una molécula de ADN que codifica la proteína que se une a la molécula objetivo, estando la molécula de ADN acoplada a una secuencia de parada. Se transforma una célula huésped con el constructo y se cultiva bajo condiciones eficaces para formar, dentro de la célula huésped, un complejo de la proteína cuya traducción se ha detenido, el ARNm que codifica la proteína y los ribosomas. La proteína del complejo se encuentra en una forma activa correctamente plegada y el complejo se recupera de la célula. Este procedimiento puede llevarse a cabo con una preparación de extracto libre de células que contenga ribosomas en lugar de una célula huésped. La presente invención también se refiere a un constructo que incluye una molécula de ADN que codifica una proteína que se une a una molécula objetivo y una secuencia de estancamiento SecM acoplada a la molécula de ADN. La molécula de ADN y la secuencia de estancamiento SecM están acopladas con suficiente distancia entre ellas para permitir la expresión de su proteína codificada, dentro de la célula, en una forma activa y correctamente plegada. En general, se describe el uso de intracuerpos.
La publicación PCT WO2014030780 asignada a Mogam Biotech Research Institute describe un procedimiento denominado modificación de proteínas asociada a Tat (TAPE), para el cribado de una proteína objetivo de mayor solubilidad y excelente termoestabilidad, en particular, un dominio variable de inmunoglobulina (VH o VL) derivado de células germinales humanas, mediante la preparación de un constructo genético en el que la proteína objetivo y una proteína resistente a los antibióticos están unidas a una secuencia señal Tat, y luego expresando esto dentro de E. coli. También se divulgan anticuerpos de dominio VH y VL humanos o modificados y andamiajes de anticuerpos de dominio VH y VL humanos o modificados que tienen solubilidad y excelente termoestabilidad, que se examinan por el procedimiento TAPE. También se proporciona una biblioteca que incluye secuencias CDR aleatorias en el andamiaje de anticuerpos de dominio VH o VL humanos o modificados cribados por el procedimiento TAPE, un procedimiento de preparación del mismo, un anticuerpo de dominio VH o VL que tiene capacidad de unión a la proteína objetivo seleccionada mediante el uso de la biblioteca, y una composición farmacéutica que incluye el anticuerpo de dominio.
La solicitud de patente europea EP2422811 describe un anticuerpo que se une a un epítopo intracelular; tales intracuerpos comprenden al menos una porción de un anticuerpo que es capaz de unirse específicamente a un antígeno y preferentemente no contiene secuencias operables que codifiquen para su secreción y por lo tanto permanece dentro de la célula. En una realización, el intracuerpo comprende un scFv. El polipéptido scFv comprende además un polipéptido enlazador entre los dominios VH y VL que permite al scFv formar la estructura deseada para la unión al antígeno. También se describe una realización específica en la que el intracuerpo se une al dominio citoplasmático de un receptor Eph e impide su señalización(por ejemplo, autofosforilación). En otra realización específica, un intracuerpo se une al dominio citoplasmático de una efrina de tipo B (por ejemplo, efrinaB1, efrinaB2 o efrinaB3).
Publicación PCT WO2011003896 y Solicitud de Patente Europea EP2275442 describen cromocuerpos PCNA funcionales intracelulares fabricados utilizando una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que se une específicamente al antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA). Ejemplos de tales polipéptidos que comprenden sustituciones conservadoras de uno o más aminoácidos en una o dos regiones de estructura están representados por SEQ ID NOs: 16 y 18 divulgados en ellos, incluyendo la región de estructura del polipéptido. En los ejemplos, se han determinado las regiones de estructura, así como las regiones CDR implicadas en la unión del PCNA.
La solicitud de patente europea EP2703485 describe un procedimiento para seleccionar células plasmáticas o plasmoblastos, así como para producir anticuerpos específicos contra antígenos objetivo, y nuevos anticuerpos monoclonales. En una realización, se identificaron células que expresaban inmunoglobulina intracelular.
Proteínas y variantes
Los anticuerpos que interactúan con glicanos de la presente invención pueden existir como un polipéptido completo, una pluralidad de polipéptidos o fragmentos de polipéptidos, que independientemente pueden estar codificados por uno o más ácidos nucleicos, una pluralidad de ácidos nucleicos, fragmentos de ácidos nucleicos o variantes de cualquiera de los mencionados anteriormente. Tal y como se utiliza en el presente documento, "polipéptido" significa un polímero de residuos de aminoácidos (naturales o no naturales) unidos entre sí la mayoría de las veces por enlaces peptídicos. El término, tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a proteínas, polipéptidos y péptidos de cualquier tamaño, estructura o función. En algunos casos, el polipéptido codificado es inferior a aproximadamente 50 aminoácidos y el polipéptido se denomina entonces péptido. Si el polipéptido es un péptido, tendrá al menos aproximadamente 2, 3, 4 o al menos 5 residuos de aminoácidos de longitud. Así, los polipéptidos incluyen productos génicos, polipéptidos naturales, polipéptidos sintéticos, homólogos, ortólogos, paralogos, fragmentos y otros equivalentes, variantes y análogos de los anteriores. Un polipéptido puede ser una molécula única o un complejo multimolecular, tal como un dímero, un trímero o un tetrámero. También pueden comprender polipéptidos de cadena simple o multicadena y pueden estar asociados o enlazados. El término polipéptido también puede aplicarse a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos son un análogo químico artificial de un aminoácido natural correspondiente.
El término "variante polipeptídica" se refiere a moléculas que difieren en su secuencia de aminoácidos de una secuencia nativa o de referencia. Las variantes de la secuencia de aminoácidos pueden poseer sustituciones, supresiones y/o inserciones en determinadas posiciones dentro de la secuencia de aminoácidos, en comparación con una secuencia nativa o de referencia. Normalmente, las variantes poseerán al menos aproximadamente 50 % de identidad (homología) con una secuencia nativa o de referencia, y preferentemente, serán al menos aproximadamente 80 %, más preferentemente al menos aproximadamente 90 % idénticas (homólogas) a una secuencia nativa o de referencia.
En algunas realizaciones se proporcionan "variantes mímicas". Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "variante imitadora" es aquella que contiene uno o más aminoácidos que imitarían una secuencia activada. Por ejemplo, el glutamato puede servir como imitador de la fosforo-treonina y/o la fosforo-serina. Alternativamente, las variantes mímicas pueden resultar en la desactivación o en un producto inactivado que contenga la mímica, por ejemplo, la fenilalanina puede actuar como una sustitución inactivadora de la tirosina; o la alanina puede actuar como una sustitución inactivadora de la serina. Las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos que interactúan con glicanos de la invención pueden comprender aminoácidos naturales y, como tales, pueden considerarse proteínas, péptidos, polipéptidos o fragmentos de los mismos.
Alternativamente, los anticuerpos que interactúan con los glicanos pueden comprender tanto aminoácidos naturales como no naturales.
El término "variante de secuencia de aminoácidos" se refiere a moléculas con algunas diferencias en sus secuencias de aminoácidos en comparación con una secuencia nativa o de partida. Las variantes de la secuencia de aminoácidos pueden presentar sustituciones, deleciones y/o inserciones en determinadas posiciones dentro de la secuencia de aminoácidos. La secuencia "nativa" o "inicial" no debe confundirse con una secuencia de tipo silvestre. Tal y como se utiliza en el presente documento, una secuencia nativa o de partida es un término relativo que se refiere a una molécula original con la que se puede realizar una comparación. Las secuencias o moléculas "nativas" o "de partida" pueden representar el tipo silvestre (la secuencia que se encuentra en la naturaleza), pero no tienen por qué ser la secuencia de tipo silvestre.
Normalmente, las variantes poseerán al menos aproximadamente 70 % de homología con una secuencia nativa, y preferentemente, tendrán al menos aproximadamente 80 %, más preferentemente al menos aproximadamente 90 % de homología con una secuencia nativa. La "homología" aplicada a las secuencias de aminoácidos se define como el porcentaje de residuos de la secuencia de aminoácidos candidata que son idénticos a los residuos de la secuencia de aminoácidos de una segunda secuencia tras alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para alcanzar el máximo porcentaje de homología. Los procedimientos y programas informáticos para la alineación son bien conocidos en la técnica. Se entiende que la homología depende de un cálculo del porcentaje de identidad, pero puede diferir en valor debido a las lagunas y penalizaciones introducidas en el cálculo.
Por "homólogas", en lo que se refiere a las secuencias de aminoácidos, se entiende la secuencia correspondiente de otras especies que tiene una identidad sustancial con una segunda secuencia de una segunda especie.
Por "análogos" se entienden las variantes polipeptídicas que difieren por una o más alteraciones aminoacídicas, por ejemplo, sustituciones, adiciones o supresiones de residuos aminoacídicos que siguen manteniendo las propiedades del polipéptido parental.
La presente invención contempla varios tipos de anticuerpos que interactúan con glicanos basados en aminoácidos, incluyendo variantes y derivados. Se trata de variantes y derivados sustitucionales, insercionales, delecionales y covalentes. Como tales, se incluyen dentro del alcance de esta invención las moléculas de anticuerpos que interactúan con glicanos que contienen sustituciones, inserciones y/o adiciones, deleciones y modificaciones covalentes. Por ejemplo, pueden añadirse etiquetas de secuencia o aminoácidos, tal como una o más lisinas, a las secuencias peptídicas de la invención (por ejemplo, en los extremos N-terminal o C-terminal). Las etiquetas de secuencia pueden utilizarse para la purificación o localización de péptidos. Las lisinas pueden utilizarse para aumentar la solubilidad del péptido o para permitir la biotinilación. Alternativamente, los residuos de aminoácidos situados en las regiones carboxi y amino terminales de la secuencia de aminoácidos de un péptido o proteína pueden suprimirse opcionalmente, dando lugar a secuencias truncadas. Ciertos aminoácidos (por ejemplo, residuos C-terminales o N-terminales) pueden suprimirse alternativamente dependiendo del uso de la secuencia, como, por ejemplo, la expresión de la secuencia como parte de una secuencia mayor que sea soluble, o unida a un soporte sólido.
Las "variantes sustitucionales" cuando se refieren a proteínas son aquellas que tienen al menos un residuo de aminoácido en una secuencia nativa o de partida eliminado y un aminoácido diferente insertado en su lugar en la misma posición. Las sustituciones pueden ser únicas, cuando sólo se ha sustituido un aminoácido de la molécula, o pueden ser múltiples, cuando se han sustituido dos o más aminoácidos en la misma molécula.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "sustitución conservadora de aminoácidos" se refiere a la sustitución de un aminoácido que está normalmente presente en la secuencia por un aminoácido diferente de tamaño, carga o polaridad similares. Ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo no polar (hidrófobo) tal como isoleucina, valina y leucina por otro residuo no polar. Asimismo, ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo polar (hidrófilo) por otro, tal como entre arginina y lisina, entre glutamina y asparagina, y entre glicina y serina. Además, la sustitución de un residuo básico tal como la lisina, la arginina o la histidina por otro, o la sustitución de un residuo ácido tal como el ácido aspártico o el ácido glutámico por otro residuo ácido son ejemplos adicionales de sustituciones conservadoras. Ejemplos de sustituciones no conservadoras incluyen la sustitución de un residuo de aminoácido no polar (hidrófobo) tal como isoleucina, valina, leucina, alanina, metionina por un residuo polar (hidrófilo) tal como cisteína, glutamina, ácido glutámico o lisina y/o un residuo polar por un residuo no polar.
Las "variantes insercionales" cuando se refieren a proteínas son aquellas con uno o más aminoácidos insertados inmediatamente adyacentes a un aminoácido en una posición particular en una secuencia nativa o de partida. "Inmediatamente adyacente" a un aminoácido significa conectado al grupo funcional alfa-carboxi o alfa-amino del aminoácido.
Las "variantes delecionales", cuando se refieren a proteínas, son aquellas en las que se eliminan uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos nativa o de partida. Normalmente, las variantes delecionales tendrán uno o más aminoácidos suprimidos en una región particular de la molécula.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "derivado" se utiliza como sinónimo del término "variante" y se refiere a una molécula que se ha modificado o cambiada de alguna manera en relación con una molécula de referencia o molécula de partida. En algunas realizaciones, los derivados incluyen proteínas nativas o de partida que se han modificado con un agente derivatizante orgánico proteináceo o no proteináceo, y modificaciones postraduccionales. Las modificaciones covalentes se introducen tradicionalmente haciendo reaccionar residuos de aminoácidos específicos de la proteína con un agente derivatizante orgánico capaz de reaccionar con cadenas laterales o residuos terminales seleccionados, o aprovechando mecanismos de modificaciones postraduccionales que funcionan en células huésped recombinantes seleccionadas. Los derivados covalentes resultantes son útiles en programas dirigidos a identificar residuos importantes para la actividad biológica, para inmunoensayos o para la preparación de anticuerpos antiproteína para la purificación por inmunoafinidad de la glicoproteína recombinante. Tales modificaciones están dentro de la habilidad ordinaria en la técnica y se realizan sin experimentación indebida.
Ciertas modificaciones postraduccionales son el resultado de la acción de células huésped recombinantes sobre el polipéptido expresado. Los residuos de glutaminilo y asparaginilo son frecuentemente deamidados postraduccionalmente a los correspondientes residuos de glutamilo y aspartrilo. Alternativamente, estos residuos se desamidan en condiciones ligeramente ácidas. Cualquiera de estas formas de residuos puede estar presente en las proteínas utilizadas de acuerdo con la presente invención.
Otras modificaciones postraduccionales incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos serilo o treonilo, metilación de los grupos alfa-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)). Los derivados covalentes incluyen específicamente moléculas de fusión en las que las proteínas de la invención están unidas covalentemente a un polímero no proteínico. El polímero no proteínico suele ser un polímero sintético hidrófilo, es decir, un polímero que no se encuentra en la naturaleza. Sin embargo, son útiles los polímeros que existen en la naturaleza y se producen por procedimientos recombinantes o in vitro, así como los polímeros aislados de la naturaleza. Los polímeros polivinílicos hidrófilos entran dentro del alcance de esta invención, por ejemplo, el polivinilalcohol y la polivinilpirrolidona. Son particularmente útiles los polivinilalquilenéteres tales como el polietilenglicol, el polipropilenglicol. Las proteínas pueden enlazarse a diversos polímeros no proteínicos, tales como polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera expuesta en la Pat. de EE. UU. No.
4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 o 4,179,337.
Las "características", cuando se refieren a proteínas, se definen como componentes distintos de una molécula basados en la secuencia de aminoácidos. Las características de las proteínas de la presente invención incluyen manifestaciones superficiales, forma conformacional local, pliegues, bucles, medios bucles, dominios, medios dominios, sitios, terminaciones o cualquier combinación de los mismos.
Tal como se utiliza en el presente documento cuando se hace referencia a proteínas, el término "manifestación superficial" se refiere a un componente basado en polipéptidos de una proteína que aparece en una superficie más externa.
Tal como se utiliza en el presente documento cuando se hace referencia a proteínas, el término "forma conformacional local" significa una manifestación estructural basada en un polipéptido de una proteína que se localiza dentro de un espacio definible de la proteína.
Tal como se utiliza en el presente documento para referirse a las proteínas, el término "pliegue" significa la conformación resultante de una secuencia de aminoácidos tras la minimización de la energía. Un pliegue puede producirse en el nivel secundario o terciario del procedimiento de plegado. Algunos ejemplos de pliegues de nivel secundario son las láminas beta y las hélices alfa. Los ejemplos de pliegues terciarios incluyen dominios y regiones formados debido a la agregación o separación de fuerzas energéticas. Las regiones formadas de este modo incluyen bolsas hidrofóbicas e hidrófilas, y similares.
Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "giro" en relación con la conformación de proteínas significa una curvatura que altera la dirección de la columna vertebral de un péptido o polipéptido y puede implicar uno, dos, tres o más residuos de aminoácidos.
Tal como se utiliza en el presente documento cuando se hace referencia a proteínas, el término "bucle" se refiere a una característica estructural de un péptido o polipéptido que invierte la dirección de la columna vertebral de un péptido o polipéptido y comprende cuatro o más residuos de aminoácidos. Oliva et al. han identificado al menos 5 clases de bucles de proteínas (J. Mol Biol 266 (4): 814-830; 1997).
Tal y como se utiliza en el presente documento al referirse a proteínas, el término "medio bucle" se refiere a una porción de un bucle identificado que tiene al menos la mitad del número de aminoácidos que reside en el bucle del que se deriva. Se entiende que los bucles pueden no contener siempre un número par de residuos de aminoácidos. Por lo tanto, en aquellos casos en los que un bucle contenga o se identifique que comprende un número impar de aminoácidos, un medio bucle del bucle impar comprenderá la porción de número entero o la siguiente porción de número entero del bucle (número de aminoácidos del bucle/2+/-0,5 aminoácidos). Por ejemplo, un bucle identificado como un bucle de 7 aminoácidos podría producir medios bucles de 3 aminoácidos o de 4 aminoácidos (7/2=3,5+/-0,5 siendo 3 o 4).
Tal y como se utiliza en el presente documento cuando se hace referencia a proteínas, el término "dominio" se refiere a un motivo de un polipéptido que tiene una o más características o propiedades estructurales o funcionales identificables (por ejemplo, capacidad de unión, servir como sitio para interacciones proteína-proteína.
Tal como se utiliza en el presente documento al referirse a proteínas, el término "medio dominio" significa porción de un dominio identificado que tiene al menos la mitad del número de aminoácidos que reside en el dominio del que se deriva. Se entiende que los dominios pueden no contener siempre un número par de residuos de aminoácidos. Por lo tanto, en los casos en que un dominio contenga o se identifique que comprende un número impar de aminoácidos, un semidominio del dominio impar comprenderá la porción de número entero o la siguiente porción de número entero del dominio (número de aminoácidos del dominio/2+/-0,5 aminoácidos). Por ejemplo, un dominio identificado como de 7 aminoácidos podría producir semidominios de 3 aminoácidos o de 4 aminoácidos (7/2=3,5+/-0,5 siendo 3 o 4). También se entiende que pueden identificarse subdominios dentro de dominios o semidominios, poseyendo estos subdominios menos de todas las propiedades estructurales o funcionales identificadas en los dominios o semidominios de los que se derivaron. También se entiende que los aminoácidos que comprenden cualquiera de los tipos de dominio descritos en el presente documento no necesitan ser contiguos a lo largo de la columna vertebral del polipéptido (es decir, los aminoácidos no adyacentes pueden plegarse estructuralmente para producir un dominio, medio dominio o subdominio).
Tal como se utiliza en el presente documento cuando se hace referencia a proteínas, los términos "sitio", en lo que respecta a las realizaciones basadas en aminoácidos, se utilizan como sinónimos de "residuo de aminoácido" y "cadena lateral de aminoácido". Un sitio representa una posición dentro de un péptido o polipéptido que puede modificarse, manipularse, alterarse, derivatizarse o variarse dentro de las moléculas basadas en polipéptidos de la presente invención.
Tal y como se utilizan en el presente documento los términos "terminal o extremo" cuando se refieren a proteínas se refieren a una extremidad de un péptido o polipéptido. Dicha extremidad no se limita únicamente al sitio primero o final del péptido o polipéptido, sino que puede incluir aminoácidos adicionales en las regiones terminales. Las moléculas basadas en polipéptidos de la presente invención pueden caracterizarse por tener tanto un N-terminal (terminado por un aminoácido con un grupo amino libre (NH2)) como un C-terminal (terminado por un aminoácido con un grupo carboxilo libre (COOH)). Las proteínas de la invención están formadas en algunos casos por múltiples cadenas polipeptídicas unidas por enlaces disulfuro o por fuerzas no covalentes (multímeros, oligómeros). Este tipo de proteínas tienen múltiples N y C-terminales. Alternativamente, los terminales de los polipéptidos pueden modificarse de modo que comiencen o terminen, según el caso, con una fracción no polipeptídica, como un conjugado orgánico.
Una vez que cualquiera de las características se ha identificado o definida como un componente de una molécula de la invención, cualquiera de varias manipulaciones y/o modificaciones de estas características pueden realizarse moviendo, intercambiando, invirtiendo, borrando, aleatorizando o duplicando. Además, se entiende que la manipulación de las características puede dar el mismo resultado que una modificación de las moléculas de la invención. Por ejemplo, una manipulación que implique la supresión de un dominio tendría como resultado la alteración de la longitud de una molécula, al igual que la modificación de un ácido nucleico para codificar menos que una molécula de longitud completa.
Las modificaciones y manipulaciones pueden realizarse mediante procedimientos conocidos en la técnica, tal como la mutagénesis dirigida al sitio. La actividad de las moléculas modificadas resultantes puede comprobarse a continuación mediante ensayos in vitro o in vivo tal como los descritos en el presente documento o cualquier otro ensayo de cribado adecuado conocido en la técnica.
Variaciones isotópicas
Los anticuerpos que interactúan con glicanos de la presente invención pueden contener uno o más átomos que son isótopos. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "isótopo" se refiere a un elemento químico que tiene uno o más neutrones adicionales. En una realización, los compuestos de la presente invención pueden ser deuterados. En el presente documento, el término "deuterado" se refiere a una sustancia a la que se han sustituido uno o más átomos de hidrógeno por isótopos de deuterio. Los isótopos de deuterio son isótopos del hidrógeno. El núcleo del hidrógeno contiene un protón, mientras que los núcleos de deuterio contienen un protón y un neutrón. Los anticuerpos que interactúan con los glicanos pueden deuterarse para cambiar una propiedad física del compuesto, tal como la estabilidad, o para permitir que los compuestos se utilicen en aplicaciones de diagnóstico y experimentales.
Conjugados y combinaciones
Se contempla en la presente invención que los anticuerpos que interactúan con glicanos de la presente invención pueden complejarse, conjugarse o combinarse con una o más moléculas homólogas o heterólogas. Tal como se utiliza en el presente documento, por "molécula homóloga" se entiende una molécula que es similar en al menos uno de los aspectos de estructura o función con respecto a una molécula de partida, mientras que una "molécula heteróloga" es una molécula que difiere en al menos uno de los aspectos de estructura o función con respecto a una molécula de partida. Los homólogos estructurales son, por tanto, moléculas sustancialmente similares desde el punto de vista estructural. Pueden ser idénticos. Los homólogos funcionales son moléculas sustancialmente similares desde el punto de vista funcional. Pueden ser idénticos.
Los anticuerpos que interactúan con glicanos de la invención pueden utilizarse en conjugados. Dichos conjugados de la invención pueden incluir una sustancia o ligando de origen natural, tal como una proteína (por ejemplo, albúmina sérica humana (HSA), lipoproteína de baja densidad (LDL), lipoproteína de alta densidad (HDL) o globulina); un hidrato de carbono (por ejemplo, un dextrano, pullulano, quitina, quitosano, inulina, ciclodextrina o ácido hialurónico); o un lípido. El ligando también puede ser una molécula recombinante o sintética, tal como un polímero sintético, por ejemplo, un poliaminoácido sintético, un oligonucleótido (por ejemplo, un aptámero). Ejemplos de poliaminoácidos son polilisina (PLL), poliácido L-aspártico, poliácido L-glutámico, copolímero de anhídrido estireno-ácido málico, copolímero poli(L-lactida-co-glicolida), copolímero de éter divinílico y anhídrido maleico, copolímero de N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HMPA), polietilenglicol (PEG), alcohol polivinílico (PVA), poliuretano, poli(ácido 2-etilacrílico), polímeros de N-isopropilacrilamida o polifosfazina. Ejemplos de poliaminas son: polietilenimina, polilisina (PLL), espermina, espermidina, poliamina, pseudopéptido-poliamina, poliamina peptidomimética, dendrímero poliamina, arginina, amidina, protamina, lípido catiónico, porfirina catiónica, sal cuaternaria de una poliamina o un péptido alfa helicoidal.
Los conjugados también pueden incluir grupos objetivo, por ejemplo, un agente o grupo objetivo celular o tisular, por ejemplo, una lectina, glicoproteína, lípido o proteína, por ejemplo, un anticuerpo, que se une a un tipo celular específico, tal como una célula renal. Un grupo objetivo puede ser una tirotropina, melanotropina, lectina, glicoproteína, proteína tensioactiva A, carbohidrato mucina, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetil-galactosamina, N-acetilglucosamina manosa multivalente, fucosa multivalente, poliaminoácidos glicosilados, galactosa multivalente, transferrina, bifosfonato, poliglutamato, poliaspartato, un lípido, colesterol, un esteroide, ácido biliar, folato, vitamina B 12, biotina, un péptido r Gd , un mimético de péptido RGD o un aptámero.
Los grupos objetivo pueden ser proteínas, por ejemplo, glicoproteínas, o péptidos, por ejemplo, moléculas que tienen una afinidad específica por un coligando, o anticuerpos, por ejemplo, un anticuerpo, que se une a un tipo celular específico tal como una célula cancerosa, una célula endotelial o una célula ósea. Los grupos objetivo también pueden incluir hormonas y receptores hormonales. También pueden incluir especies no peptídicas, tales como lípidos, lectinas, carbohidratos, vitaminas, cofactores, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetil-galactosamina, N-acetilglucosamina manosa multivalente, fucosa multivalente o aptámeros.
El grupo objetivo puede ser cualquier ligando capaz de dirigirse a un receptor específico. Los ejemplos incluyen, sin limitación, folato, GalNAc, galactosa, manosa, manosa-6P, apatámeros, ligandos de receptores de integrinas, ligandos de receptores de quimioquinas, transferrina, biotina, ligandos de receptores de serotonina, PSMA, endotelina, GCPII, somatostatina, ligandos de LDL y HDL. En realizaciones particulares, el grupo objetivo es un aptámero. El aptámero puede estar sin modificar o tener cualquier combinación de las modificaciones descritas en el presente documento.
En otras realizaciones, los anticuerpos que interactúan con glicanos se conjugan covalentemente con un polipéptido penetrante celular. El péptido de penetración celular también puede incluir una secuencia señal. Los conjugados de la invención pueden diseñarse para tener una mayor estabilidad; una mayor transfección celular; y/o una biodistribución alterada (por ejemplo, dirigida a tejidos o tipos celulares específicos).
Pueden añadirse moléculas conjugantes a los anticuerpos que interactúan con los glicanos, de forma que permitan marcar o etiquetar objetivos para su eliminación. Dichas moléculas de marcado/etiquetado incluyen, pero no se limitan a, ubiquitina, moléculas fluorescentes, hemaglutinina (HA) de la gripe humana, c-myc [un segmento de 10 aminoácidos del protooncogén humano myc con secuencia EQKLISEEDL (SEQ ID NO: 243)], histidina (His), marcador [un péptido corto de secuencia DYKDDDDK (SEQ ID NO: 244)], glutatión S-transferasa (g St ), V5 (un epítopo del paramixovirus del virus simio 5), biotina, avidina, estreptavidina, peroxidasa de rábano caballo (HRP) y digoxigenina.
En algunas realizaciones, los anticuerpos que interactúan con glicanos pueden combinarse entre sí o con otra molécula en el tratamiento de una enfermedad o afección.
Ácidos nucleicos
La presente invención abarca moléculas de ácido nucleico. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos codifican anticuerpos de la invención (incluyendo, pero sin limitarse a, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, intracuerpos y antígenos receptores quiméricos). Tales moléculas de ácido nucleico incluyen, sin limitación, moléculas de ADN, moléculas de ARN, polinucleótidos, oligonucleótidos, moléculas de ARNm, vectores, plásmidos y otros constructos. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "constructo" se refiere a cualquier molécula de ácido nucleico recombinante, incluyendo, pero sin limitarse a, plásmidos, cósmidos, moléculas de polinucleótidos de replicación autónoma o moléculas de polinucleótidos de ADN o ARN lineales o circulares monocatenarias o bicatenarias. La presente invención también abarca células programadas o generadas para expresar moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos que interactúan con glicanos. Dichas células pueden generarse mediante transfección, electroporación, administración viral y similares. Los virus diseñados con constructos de la invención pueden incluir, pero sin limitarse a, lentivirus, adenovirus, virus adenoasociados y fagos. En algunos casos, los ácidos nucleicos de la invención incluyen ácidos nucleicos de codón optimizado. Los procedimientos para generar ácidos nucleicos de codón optimizado son conocidos en la técnica y pueden incluir, pero sin limitarse a, los descritos en las Patentes de EE. UU. Nos. 5,786,464 y 6,114,148.
II. Procedimientos y usos
Terapéutica
Aplicaciones relacionadas con el cáncer
La glicosilación aberrante es un sello distintivo de la transformación de las células cancerosas. Se han descrito múltiples formas aberrantes de glicosilación en cánceres humanos, identificando antígenos de carbohidratos específicos asociados a tumores (TACA) como una clase de moléculas de superficie celular adecuadas para la orientación específica a tumores (Cheever, M.A. et al., Clin Cancer Res. 2009 Sep 1;15(17):5323-37). La expresión del antígeno TACA se ha detectado en cánceres epiteliales tal como los de mama, colon, pulmón, vejiga, cuello uterino, ovario, estómago, próstata e hígado. La expresión del antígeno TACA se ha encontrado en cánceres embrionarios, incluyendo, pero sin limitarse a, los tumores del saco vitelino y los seminomas. Además, se ha encontrado expresión del antígeno TACA en muchos melanomas, carcinomas y leucemias de diversos tejidos (Heimburg-Molinaro et al., Vaccine. 2011 Nov 8: 29(48):8802-8826). Los anticuerpos de la presente invención que se dirigen a uno o más TACA se denominan en el presente documento "anticuerpos anti-TACÁ'
MUC1 es una glicoproteína clave de la superficie celular que normalmente está extensamente glicosilada pero que está infraglicosilada en las células tumorales. La escasa glicosilación de MUC1 conduce a la exposición de antígenos inmunogénicos. Estos pueden estar a lo largo de la secuencia del péptido central de MUC1 o a lo largo de los residuos de carbohidratos centrales. Estos TACA incluyen, pero no se limitan a, N-acetilgalactosamina (Tn), sialil(a2,6)N-acetilgalactosamina (STn) y galactosa(p1-3)N-acetilgalactosamina (también conocida como antígeno de Thomsen-Friedenreich o TF). Se ha estimado que aproximadamente 80 % de todos los carcinomas expresan Tn entre los carbohidratos centrales de MUC1, siendo STn fuertemente expresado en células de carcinoma humano y relacionado con la progresión del cáncer y la metástasis. Con pocas excepciones, la Tn y la STn no se expresan en los tejidos sanos normales. El ácido siálico forma un epítopo prominente en la STn. La invención aprovecha el hecho de que la expresión aberrante del glicano Neu5Gc-STn (GcSTn) parece ser altamente específica de varios carcinomas.
En el caso de MUC1, la incorporación de Neu5Gc en STn produce un objetivo específico de tumor, un sitio que es un objetivo atractivo para terapias basadas en anticuerpos para tratar el tejido tumoral. En algunas realizaciones de la presente invención, los anticuerpos que interactúan con glicanos se dirigen a células cancerosas que expresan MUC1 y que comprenden Neu5Gc. Hasta la fecha, se ha detectado Neu5Gc en glicoconjugados de varios tejidos cancerosos humanos que incluyen, pero no se limitan a, el cáncer de colon, el tejido de retinoblastoma, el melanoma, el cáncer de mama y el tejido tumoral del saco vitelino. En algunas realizaciones de la presente invención, se contemplan procedimientos para el tratamiento con anticuerpos que interactúan con glicanos de estas formas de cáncer, así como de otras formas de cáncer, no enumeradas específicamente aquí, caracterizadas por la presencia de células cancerosas que comprenden Neu5Gc.
Se han identificado antígenos adicionales que comprenden glicanos y que se expresan en correlación con el cáncer (Heimburg-Molinaro, J. et al., Cancer vaccines and carbohydrate epitopes. Vaccine. 2011 Nov 8;29(48):8802-26). Estos antígenos de carbohidratos asociados a tumores incluyen, pero no se limitan a, antígenos relacionados con el grupo sanguíneo Lewis [incluyendo, pero no limitados a, LewisY (LeY), LewisX(LeX), Sialyl LewisX (SLeX) y Sialyl LewisA (SLeA)],, antígenos relacionados con glicoesfingolípidos [incluyendo, pero no limitados a Globo H, antígeno embrionario específico de etapa-3 (SSEA-3) y glicoesfingolípidos que comprenden ácido siálico], antígenos relacionados con gangliósidos [incluyendo, pero no limitados a gangliósidos GD2, GD3, GM2, fucosil GM1 y Neu5GcGM3] y antígenos relacionados con ácido polisialico.
En algunas realizaciones, la terapéutica de la presente invención puede dirigirse hacia antígenos del grupo sanguíneo de Lewis. Los antígenos del grupo sanguíneo de Lewis comprenden un residuo de fucosa unido a GlcNAc por un enlace a l-3 o un enlace a1-4. Pueden encontrarse tanto en los glicolípidos como en las glicoproteínas. Los antígenos del grupo sanguíneo Lewis pueden encontrarse en el fluido corporal de individuos que son secretores de estos antígenos. Su aparición en los glóbulos rojos se debe a la absorción de antígenos Lewis del suero por los glóbulos rojos.
En algunas realizaciones, la terapéutica de la presente invención puede dirigirse hacia LeY. LeY (también conocido como CD174) está formado por Galp1,4GlcNAC que comprende residuos de fucosa ligados a a1,2- así como a a1,3 dando lugar al epítopo Fuca(1,2)Galp(1,4)Fuca(1,3)GlcNAc. Se sintetiza a partir del antígeno H mediante a1,3 fucosiltransferasas que unen la a1,3 fucosa al residuo GlcNAc de la cadena madre. LeY puede expresarse en una variedad de cánceres, incluyendo, pero no limitado a ovario, mama, próstata, colon, pulmón y epitelial. Debido a su bajo nivel de expresión en los tejidos normales y a su elevado nivel de expresión en muchos cánceres, el antígeno LeY es un objetivo atractivo para los anticuerpos terapéuticos.
En algunas realizaciones, la terapéutica de la presente invención puede dirigirse hacia LeX. LeX comprende el epítopo Galp1-4(Fuca1-3)GlcNAcp-R. También se conoce como CD15 y antígeno embrionario específico de estadio-1 (SSEA-1). Este antígeno se reconoció por primera vez como inmunorreactivo con sueros tomados de un ratón sometido a inmunización con células de teratocarcinoma F9. También se descubrió que LeX se correlaciona con el desarrollo embrionario en fases específicas. También se expresa en diversos tejidos, tanto en presencia como en ausencia de cáncer, pero también puede encontrarse en los cánceres de mama y ovario, donde sólo se expresa en las células cancerosas.
En algunas realizaciones, la terapéutica de la presente invención puede estar dirigida hacia SLeA y/o SLeX. SLeA y SLeX comprenden las estructuras [Neu5Aca2-3Galp1-3(Fuca1-4)GlcNAcp-R] y [Neu5Aca2-3Galp1-4(Fuca1-3)GlcNAcp-R] respectivamente. Su expresión aumenta en las células cancerosas. La presencia de estos antígenos en el suero se correlaciona con malignidad y mal pronóstico. SLeX se encuentra principalmente como epítopo terminal de mucina. Se expresa en varios tipos de cáncer, como los de mama, ovario, melanoma, colon, hígado, pulmón y próstata. En algunas realizaciones de la presente invención, los objetivos s SLeA y SLeX comprenden Neu5Gc (denominadas en el presente documento GcSLeA y GcSLeX, respectivamente).
En algunas realizaciones, la terapéutica de la presente invención puede estar dirigida hacia glicolípidos y/o epítopos presentes en glicolípidos, incluyendo, pero no limitado a glicosfingolípidos. Los glicoesfingolípidos comprenden el lípido ceramida unido a un glicano por el grupo hidroxilo de la ceramida. En la membrana celular, los glicoesfingolípidos forman agrupaciones denominadas "balsas lipídicas".
En algunas realizaciones, la terapéutica de la presente invención puede dirigirse hacia Globo H. Globo H es un glicoesfingolípido relacionado con el cáncer identificado por primera vez en células de cáncer de mama. La porción de glicano de Globo H comprende Fuca(1-2)Galp(1-3)GalNAcp(1-3)Gala(1-4)Galp(1-4)Glcp(1). Aunque se encuentra en varios tejidos epiteliales normales, Globo H se ha identificado en asociación con muchos tejidos tumorales, incluyendo, pero no limitado a, tumores de células pequeñas de pulmón, mama, próstata, pulmón, páncreas, estómago, ovario y endometrio.
En algunas realizaciones, la terapéutica de la presente invención puede dirigirse hacia los gangliósidos. Los gangliósidos son glicoesfingolípidos que contienen ácido siálico. De acuerdo con la nomenclatura de los gangliósidos, G se utiliza como abreviatura de gangliósido. Esta abreviatura va seguida de las letras M, D o T, que hacen referencia al número de residuos de ácido siálico unidos (1, 2 o 3, respectivamente). Por último, los números 1, 2 o 3 se utilizan para referirse al orden de la distancia que recorre cada uno al ser analizado por cromatografía en capa fina (en la que el 3 recorre la mayor distancia, seguido del 2 y luego del 1). Se sabe que los gangliósidos intervienen en el crecimiento y la metástasis relacionados con el cáncer y se expresan en la superficie celular de las células tumorales. Los gangliósidos expresados en las células tumorales incluyen, pero no se limitan a, GD2, GD3, GM2 y fucosil GM1 (también denominado en el presente como documento Fuc-GM1). En algunas realizaciones de la presente invención, los anticuerpos que interactúan con los glicanos están dirigidos hacia GD3. El GD3 es un regulador del crecimiento celular. En algunas realizaciones, los anticuerpos dirigidos contra GD3 se utilizan para modular el crecimiento celular y/o la angiogénesis. En algunas realizaciones, los anticuerpos dirigidos contra GD3 se utilizan para modular la adhesión celular. En algunas realizaciones de la presente invención, los anticuerpos que interactúan con glicanos están dirigidos hacia GM2. En algunas realizaciones, los anticuerpos dirigidos contra GM2 se utilizan para modular el contacto célula-célula. En algunas realizaciones, los objetivos de gangliósidos de la presente invención comprenden Neu5Gc. En algunas realizaciones, dichos objetivos pueden incluir una variante de GM3 que comprende Neu5Gc (denominada en el presente documento GcGM3). El componente glicano de GcGM3 es Neu5Gca2-3Galp1-4Glc. GcGM3 es un componente conocido de las células tumorales.
En algunas realizaciones, los TACA dirigidos por anticuerpos anti-TACA de la presente invención pueden incluir, pero no se limitan a cualquiera de los enumerados en la publicación de EE. UU. Nos. US2013/0236486A1, US2013/0108624A1, US2010/0178292A1, US2010/0104572A1, US2012/0039984A1, US 2009/0196916A1y US2009/0041836A1.
STn en el cáncer
El sistema inmunitario tiene múltiples mecanismos para promover la actividad inmunitaria de las células antitumorales, incluyendo tanto la actividad inmunitaria innata como la adaptativa. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "actividad inmunitaria de células antitumorales" hace referencia a cualquier actividad del sistema inmunitario que elimine o impida el crecimiento y/o la proliferación de células tumorales. En algunos casos, la actividad inmunitaria antitumoral incluye el reconocimiento y la destrucción de las células tumorales por las células asesinas naturales (NK) y la fagocitosis por los macrófagos. Las respuestas inmunitarias adaptativas antitumorales incluyen la captación y presentación del antígeno tumoral por parte de las células presentadoras de antígenos (CPA), tal como las células dendríticas (CD), lo que conduce a la modulación de la actividad antitumoral de las células T y/o a la expansión de las células B con secreción de anticuerpos específicos contra el tumor. La unión de anticuerpos tumorales específicos a los tumores puede dar lugar a mecanismos de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) para la muerte de las células tumorales.
Como se usa en el presente documento, el término "célula tumoral inmunorresistente" se refiere a una célula tumoral que reduce o evade la actividad inmune de las células antitumorales. Algunos estudios indican que la expresión de STn (un conocido TACA) en las superficies de las células tumorales o secretado en el microambiente de las células tumorales puede promover la evasión de la actividad inmunitaria antitumoral por parte de las células tumorales. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "microentorno de la célula tumoral" se refiere a cualquier área adyacente o circundante a una célula tumoral. Tales áreas incluyen, pero no se limitan a, áreas entre células tumorales, entre células tumorales y no tumorales, fluidos circundantes y componentes circundantes de la matriz extracelular.
Las mucinas sialiladas que comprenden STn fueron demostradas por Ogata et al para reducir la orientación de células NK en células tumorales (Ogata, S. et al., 1992. Canc. Res. 52:4741-6). Este estudio descubrió que la presencia de mucina submaxilar ovina, bovina y porcina (OSM, BSM y PSM, respectivamente) provocaba una inhibición de la citotoxicidad de casi el cien por cien (véase la Tabla 2 de Ogata et al). Otros estudios de Jandus et al, demuestran que algunas células tumorales pueden evadir la destrucción NK debido a la expresión de ligandos sialoglicanos que pueden interactuar con los receptores siglec de las células NK, lo que conduce a la inhibición NK (Jandus, C. et al., 2014, JCI. pii: 65899).
Estudios realizados por Toda et al. demuestran que la STn puede unirse a los receptores CD22 de las células B, lo que provoca una disminución de la transducción de señales y una menor activación de las células B (Toda, M. et al., 2008. Biochem Biophys Res Commun. 372(1):45-50). Las células dendríticas (DC) pueden afectar a la actividad inmunitaria adaptativa modulando la actividad de las células T. Los estudios de Carrascal et al descubrieron que la expresión de STn por células de cáncer de vejiga inducía tolerancia en las DC, reduciendo su capacidad de inducir actividad inmunitaria antitumoral en células T (Carrascal, MA et al., 2014. Mol Oncol. pii: S1574-7891(14)00047-7). Estos estudios revelaron que las DC que entraban en contacto con células de cáncer de vejiga STn-positivas mostraban un perfil de expresión tolorigénico con baja expresión de CD80, CD86, IL-12 y TNF-a. Además, se observó que las DC modulaban las células T reguladoras de forma que estas tenían una baja expresión de IFNy y una alta expresión de FoxP3. Otros estudios realizados por van Vliet y otros indican que la expresión de la lectina de tipo galactosa (MGL) de los macrófagos en la superficie de las DC puede conducir a la orientación de estas células hacia los tejidos tumorales (van Vliet, SJ, 2007) Vliet, SJ., 2007. Amsterdam: Vrije Universiteit. p1-232 y van Vliet, SJ. et al., 2008. J Immunol. 181(5):3148-55, Nollau, P. et al., 2013. J Histochem Cytochem. 61(3):199-205). Las DC que llegan a los tejidos debido a las interacciones MGL pueden influir en las células T auxiliares (Th) de una de estas tres maneras. Las DC pueden inducir la tolerancia de las células T, la actividad inmunitaria de las células T o la regulación a la baja de las células T efectoras. Se ha demostrado que el MGL se une tanto al AcSTn como al GcSTn y su afinidad se ha analizado en profundidad (Mortezai, N. et al., 2013. Glycobiology. 23(7):844-52). Curiosamente, se ha demostrado que la expresión de MUC1 en los tumores conduce a la tolerancia de las células T, protegiendo a las células tumorales de la erradicación inmunitaria.
En algunas realizaciones, los anticuerpos que interactúan con glicanos (incluyendo, pero sin limitarse a anticuerpos anti-STn) de la presente invención pueden usarse para tratar sujetos que comprenden una o más células tumorales que expresan uno o más TACA. En algunos casos, los anticuerpos que interactúan con los glicanos (incluyendo, pero no se limitan a, los anticuerpos anti-STn) de la invención pueden utilizarse para aumentar la actividad inmunitaria de las células antitumorales hacia las células tumorales que expresan STn. Dichos anticuerpos pueden aumentar la respuesta inmunitaria adaptativa y/o la respuesta inmunitaria innata hacia las células tumorales inmunorresistentes. Algunos anticuerpos que interactúan con los glicanos pueden utilizarse para aumentar la actividad antitumoral de las células NK. Dichos anticuerpos que interactúan con los glicanos pueden, en algunos casos, bloquear la interacción entre los receptores de glicanos expresados en las células NK y los glicanos STn de las células cancerosas o de los tejidos circundantes.
En algunas realizaciones, los anticuerpos que interactúan con glicanos (incluyendo, pero no limitados a anticuerpos anti-STn) de la invención pueden usarse para incrementar la actividad anti-tumoral de las células B. Estos anticuerpos pueden reducir la interacción entre los receptores CD22 de los linfocitos B y los glicanos STn de las células cancerosas o de los tejidos circundantes. Un estudio de Sjoberg et al. demuestra que la acetilación 9-O de los ácidos siálicos ligados a a2,6 en glicoproteínas también redujo la interacción entre los receptores CD22 de células B y dichas glicoproteínas (Sjoberg, E.R. et al. 1994. JCB. 126(2): 549-562). Otro estudio de Shi et al. revela que los niveles más altos de residuos de ácido siálico 9-O-acetilado en células de eritroleucemia murina hacen que estas células sean más susceptibles a la lisis mediada por complemento (Shi, W-X. et al., 1996. J of Biol Chem. 271(49): 31526-32). En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-STn de la invención son capaces de unirse selectivamente a STn no 9-O-acetilada, reduciendo la unión global de STn, pero reduciendo el crecimiento y/o proliferación de células tumorales (por ejemplo, a través de una mayor actividad antitumoral de células B y una mayor destrucción de células tumorales mediada por complemento). En algunas realizaciones, los anticuerpos que interactúan con los glicanos (incluyendo, pero no limitado a, los anticuerpos anti-STn) de la invención pueden utilizarse para aumentar la actividad antitumoral de las DC. Estos anticuerpos pueden utilizarse para reducir la tolerancia de las De a las células tumorales. La reducción de la tolerancia de DC puede comprender el aumento de la expresión de CD80, CD86, IL-12 y/o TNF-a en DC. En algunos casos, la actividad antitumoral de las DC puede comprender la promoción de la actividad antitumoral de las células T. Dichos anticuerpos pueden impedir la unión entre Dc MGL y los glicanos expresados en las células cancerosas o alrededor de ellas.
Un estudio de Ibrahim et al. sugiere que altos niveles de anticuerpos anti-STn junto con terapia endocrina pueden aumentar la supervivencia global y el tiempo hasta la progresión (TTP) en mujeres con cáncer de mama metastásico (Ibrahim, N.K. et al., 2013. 4(7): 577-584). En este estudio, los niveles de anticuerpos anti-STn se elevaron tras la vacunación con STn ligada a hemocianina de lapa californiana (KLH). En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-STn de la invención pueden utilizarse en combinación con terapia endocrina (por ejemplo, tamoxifeno y/o un inhibidor de la aromatasa).
Células madre del cáncer como objetivos terapéuticos
Las células madre cancerosas o CSC (también denominadas células iniciadoras de tumores) son un subconjunto de células dentro de una población tumoral heterogénea que impulsan la iniciación, el crecimiento, la diseminación y la recurrencia de tumores primarios y metastásicos (Karsten y Goletz, SpringerPlus, 2013, 2, 301), que pueden presentarse en proporciones variables de la población total en función del tipo de tumor. Las CSC se distinguen de las células diferenciadas terminalmente por su capacidad de autorrenovación y de dar lugar a progenie diferenciada no CSC (Gupta et al., Nature medicine, 2009, 15, 1010-1012). Estas propiedades son similares a las de las células madre normales. Estas diferencias entre las células madre normales y las c Sc tienen importantes implicaciones terapéuticas.
Se ha identificado un número creciente de biomarcadores de la superficie celular que pretenden diferenciar las CSC de sus contrapartes no CSC (Medema et al., Nature cell biology, 2013, 15, 338-344; Zoller, Cáncer, 2011, 11, 254­ 267). Aunque muchas de ellas proceden de estudios de tumores de ratón y líneas celulares humanas, varias se han validado utilizando muestras de tumores humanos primarios. Uno de ellos, la glicoproteína de membrana CD44, o receptor de hialuronano, que es un constituyente bien conocido de una variedad de tipos de tumores, también ha encontrado aceptación más recientemente como marcador de buena fe de CSC en cánceres humanos, y de hecho es el que se observa con más frecuencia (Lobo et al., 2007, 23, 675-699).
CD44 existe en varias isoformas variantes generadas por eventos de empalme alternativo que se producen entre los 20 exones y 19 intrones del gen CD44 de longitud completa (Williams et al, Experimental biology and medicine, 2013, 238, 324-338). Cada vez más pruebas experimentales apuntan al papel de apoyo de CD44 y sus variantes en la contribución al fenotipo metastásico y farmacorresistente innato de las CSC (Negi et al., Journal of drug targeting,2012, 20, 561-573), en parte debido a la modulación de las vías de transducción de señales intracelulares (Williams et al, Experimental biology and medicine, 2013, 238, 324-338). Además, se sabe que los pacientes con cáncer de mama triple negativo, junto con varios otros tipos de cáncer, que muestran niveles elevados de células CD44 tienen un mal pronóstico y una mayor mortalidad (Negi et al., Journal of drug targeting,2012, 20, 561-573). Estas observaciones respaldan la idea de que la acción sobre CD44 ofrece un medio para tratar el cáncer mediante la inhibición o eliminación de las CSC, además de las células cancerosas maduras. De hecho, se han ensayado experimentalmente numerosos enfoques dirigidos contra CD44 con diversos grados de éxito. Estas abarcan una amplia gama de tecnologías que incluyen el uso de anticuerpos conjugados y no conjugados, sistemas de fármacos nanotransportados y fármacos conjugados con hialuronano (Negi et al., Journal of drug targeting, 2012, 20, 561-573). En varios casos, sin embargo, se observaron efectos tóxicos en estudios in vivo; estos efectos secundarios adversos pueden atribuirse a la presencia generalizada de CD44 y sus variantes en las membranas de la mayoría de las células vertebradas (Naor et al., Seminars in cancer biology, 2008, 18, 260-267), además de su presencia en la superficie de las CSC objetivo y las células tumorales maduras. Dirigirse a la proteína CD44, que es un constituyente de las células madre humanas normales (Williams et al, Experimental biology and medicine, 2013, 238, 324-338), también puede dañar la función normal de las células madre (Leth-Larsen et al., Molecular Medicina molecular, 2012, 18, 1109-1121). Aunque un gran número de investigaciones apuntan a la conveniencia de atacar la proteína CD44 en las CSC, así como en las células tumorales maduras, el problema intrínseco de este enfoque sigue siendo la dificultad actual para diseñar inhibidores que preserven el tejido normal, así como las células madre normales.
Otro antígeno tumoral bien conocido con implicaciones en la biología de las CSC es la mucina epitelial MUC1, una glicoproteína unida a la membrana que se expresa diferencialmente a niveles altos en la mayoría de los adenocarcinomas, pero a niveles bajos o nulos en las células epiteliales normales. MUC1 se ha identificado recientemente como biomarcador de CSC en diversas neoplasias, incluyendo la mama (Engelmann et al., Cancer research, 2008, 68, 2419-2426), y cánceres de páncreas, donde su expresión se correlaciona con una elevada metástasis y un mal pronóstico. Como componente de las CSC, se ha demostrado que MUC1 interviene en la adhesión, proliferación, supervivencia y señalización celular (Engelmann et al., Cancer research,2008, 68, 2419-2426) y también puede coexpresarse con CD44 (Leth-Larsen et al., Molecular medicine, 2012, 18, 1109-1121). Se están aplicando enfoques inmunoterapéuticos para atacar la MUC1 en el cáncer mediante vacunas, así como otros enfoques, pero principalmente en el contexto de la terapia celular del cáncer maduro (Julien et al., Biomolecules,2012, 2, 435-466; Acres et al., Expert review of vaccines,2005, 4, 493-502).
[Se ha planteado la hipótesis de que las células madre cancerosas se generan a través de la transición epiteliomesénquima (EMT) (Gupta et al., Nature medicine, 2009, 15, 1010-1012), y/o a la inversa, la transición de mesenquimal a epitelial (MET) que se produce en el lugar de la metástasis ((Leth-Larsen et al., Molecular medicine,2012, 18, 1109-1121) (también denominada plasticidad de las CSC, en la que las no CSC pueden dar lugar a CSC). Este descubrimiento subraya aún más la necesidad de eliminar tanto las CSC como las no CSC en una población tumoral.
Estudios recientes con poblaciones enriquecidas de CSC han revelado que estas células, a diferencia del grueso del tumor, son relativamente quiescentes y son preferentemente resistentes a muchos tipos de terapias actuales, incluyendo la quimioterapia y la radiación (Leth-Larsen et al., Molecular medicine,2012, 18, 1109-1121). Así pues, las estrategias terapéuticas actuales se dirigen a los componentes no CSC del tumor, dejando a las CSC prácticamente intactas, sólo para resurgir tras las señales apropiadas para reformar tumores primarios recurrentes en el sitio inicial o para diseminarse a sitios distantes, colonizar y crear enfermedad metastásica, la principal causa de mortalidad por cáncer.
La comprensión actual de las propiedades de las células madre cancerosas enfatizó claramente la necesidad no sólo de dirigirse al grueso de las células presentes en los tumores, como es la práctica actual, sino también al compartimento de las CSC para potencialmente efectuar curas completas.
Como se ha discutido anteriormente, las estrategias que se han desarrollado basadas en biomarcadores asociados a tumores (incluyendo las CSC) se enfrentan al reto de que la mayoría de los biomarcadores de cáncer también están presentes en células normales, incluyendo células madre normales. Una terapia dirigida a un biomarcador proteínico para eliminar las CSC, también puede dirigirse a las células madre normales, provocando la eliminación de las células normales.
Glicanos específicos del tumor en las CSC
Formas aberrantes de glicosilación, incluyendo la aparición del antígeno Thomsen-nouveau (Tn) (GalNAc-O-Ser/Thr), se han descrito en numerosos cánceres humanos, identificando a los glicanos como una clase totalmente novedosa de antígenos de carbohidratos asociados a tumores, adecuados para la focalización tumoral específica (Rabu et al. Future oncology, 2012, 8, 943-960). La formación del derivado sialílico de Tn (STn) está mediada por la sialil transferasa ST6GalNAc-I, que añade ácido siálico en un enlace a2,6 al antígeno Tn. La sialilación de STn impide nuevas adiciones de azúcar, truncando así nuevas extensiones de glicanos (Schultz et al., Cancer metastasis reviews, 2012, 31, 501-518).
Mientras que la presencia de STn en tejidos humanos adultos normales es rara, STn se da en diversos cánceres humanos, incluyendo cáncer de ovario, vejiga, mama, cuello uterino, colon y pulmón, entre otros (Ferreira et al., Molecular oncology, 2013, 7, 719-731; Kinney et al., Cáncer, 1997, 80, 2240-2249). Además, la presencia de STn en tumores se asocia con enfermedad metastásica, mal pronóstico y menor supervivencia global (Ferreira et al., Molecular oncology, 2013, 7, 719-731; Kinney et al., Cáncer,1997, 80, 2240-2249); por lo tanto, la STn se considera un objetivo muy atractivo para la detección y terapia del cáncer. Existen dos formas distintas de ácido siálico - Neu5Ac y Neu5Gc - situadas en la posición terminal de STn. La forma Neu5Ac-sialilada predomina en los seres humanos, ya que éstos no pueden sintetizar Neu5Gc debido a la inactividad del gen CMP-Neu5Ac hidroxilasa (CMAH). Sin embargo, el consumo de alimentos ricos en Neu5Gc conduce a la incorporación de Neu5Gc extraño en las células humanas, especialmente en los carcinomas. Estudios anteriores han demostrado que los tumores sólidos captan y expresan la forma Neu5Gc del ácido siálico (Inoue et al., Glycobiology,2010, 20, 752-762; Malykh et al., Biochimie, 2001, 83, 623­ 634; Padler-Karavani et al., Cancer research, 2011, 71, 3352-3363). mAbs que se unen a ambas glicoisoformas de STn que son potenciales objetivos contra el cáncer: Neu5Ac-STn (AcSTn) y Neu5Gc-STn (GcSTn)(es decir, designados como anticuerpos pan-STn).
La acumulación de STn se asocia con mutaciones somáticas específicas observadas repetidamente en tumores sólidos y con la inactivación del gen que codifica la chaperona molecular Cosmc, necesaria para la formación de la T-sintasa activa (Ju et al., Nature,2005, 437, 125). La T-sintasa compite con la ST6GalNAc-I por el sustrato GalNAc y, por tanto, cuando se inactiva por mutación da lugar a una elevada síntesis de STn. Además, la acumulación de STn también puede ser el resultado de una mayor expresión de ST6GalNAc-I, que se observa con frecuencia (Brockhausen et al., Biological chemistry,2001, 382, 219-232; Ikehara et al., Glycobiology,1999, 9, 1213-1224). La expresión de novo de STn puede modular las células de carcinoma, cambiar el fenotipo maligno y conducir a comportamientos celulares más agresivos (Pinho et al., Cancer letters, 2007, 249, 157-170). Como tal, la STn no sólo es un interesante biomarcador del cáncer y un objetivo terapéutico, sino que interferir en la función de la STn ofrece el intrigante potencial de tener importantes beneficios terapéuticos funcionales y antimetastásicos.
Aunque es bien sabido que la glicosilación de las glicoproteínas celulares está alterada en el cáncer, parece que la glicosilación aberrante es selectiva con respecto tanto a la glicoproteína como al glicano en cuestión. De hecho, en las CSC tumorales humanas sólo CD44 y MUC1 son los principales portadores del antígeno STn (Cazet et al., Breast cancer research: BCR, 2010, 12.204; Julien et al., Glycobiology, 2006, 16, 54-64), lo que sugiere inmediatamente un enfoque selectivo para atacar no sólo a las células tumorales maduras, sino también a las CSC. Mientras que MUC1 es un constituyente normal de la superficie de algunas células epiteliales en las que cumple una función de barrera. La MUC1 asociada a tumores se caracteriza por la hipoglicosilación y el aumento de la sialilación en las CSC del mismo modo que se observa en las células cancerosas maduras, apareciendo la STn como marcador específico tanto de las CSC como de las células tumorales maduras (Curry et al., Journal of surgical oncology,2013, 107, 713-722). El perfil aberrante de oligosacáridos de MUC1 da lugar a la expresión de neomarcadores tales como sialil-Lea (utilizado en la prueba CA19-9), sialil-Lex y sialil-Tn (TAG-72), así como de epítopos crípticos tal como Tn en células cancerosas (por ejemplo, CSC). Además, debido a la infraglucosilación, el núcleo peptídico de la mucina queda expuesto, de modo que los epítopos del núcleo (no accesibles en la MUC1 derivada del tejido normal) pueden servir como antígenos potenciales.
Los enfoques clínicos dirigidos a la STn han consistido hasta ahora únicamente en vacunas contra la STn. El candidato clínico más avanzado es Theratope, una vacuna terapéutica consistente en STn acoplada a hemocianina de lapa de ojo de cerradura. En estudios in vivo con ratones, la inmunización con Theratope indujo una potente respuesta de anticuerpos que se demostró que mediaba un retraso en el crecimiento de las células de carcinoma mamario que expresaban STn inyectadas (Julien et al., British journal of cancer, 2009, 100, 1746-1751). Sin embargo, Theratope no alcanzó su objetivo primario en un ensayo clínico de fase III en cáncer de mama metastásico. Una de las principales hipótesis de por qué el ensayo Theratope no alcanzó su criterio de valoración primario es que no se evaluó la expresión de STn en la población de pacientes antes de la inscripción. Dado que la expresión de STn en el cáncer de mama es muy heterogénea entre pacientes, oscilando entre 25 % y 80 % según el estudio y el procedimiento de detección, la falta de capacidad para correlacionar la expresión de STn con la respuesta puede haber enmascarado cualquier beneficio de Theratope. Es importante señalar que un subgrupo de pacientes que recibían terapia hormonal mostró un aumento significativo de 7,5 meses en la mediana de supervivencia global cuando fueron tratados con Theratope en comparación con la terapia hormonal sola (Ibrahim et al., Journal of clinical oncology: official journal of the American Society of Clinical Oncology, 2004, 22, 2547y Miles et al., The oncologist, 2011, 16, 1092-1100), lo que valida el potencial terapéutico de dirigirse a la STn en poblaciones de pacientes concretas. Además, dado que la respuesta inmunitaria suele variar considerablemente entre los pacientes vacunados, los enfoques vacunales carecen de la capacidad de controlar o modular el título de anticuerpos, lo que da lugar a amplios intervalo de exposición a anticuerpos terapéuticos entre los pacientes. No obstante, Theratope fue bien tolerado con una toxicidad mínima, lo que demuestra la seguridad de la terapia dirigida a la STn contra el cáncer.
La creciente comprensión de la base molecular de la expresión de STn en células cancerosas sugiere fuertemente que las células que expresan STn en cualquier proteína de superficie celular también expresarán STn en muchas (si no todas) otras proteínas de superficie celular O-glicosiladas, convirtiéndola en un excelente objetivo terapéutico ampliamente distribuido asociado al cáncer. Por lo tanto, las poblaciones de células cancerosas STn positivas pueden estar enriquecidas para CSC. Además, datos recientes demuestran que la anulación de la expresión de STn hace que los cánceres sean menos agresivos, con reducciones significativas del comportamiento metastásico (Gill et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2013, 110, E3152-3161).
Anticuerpos anti-STn dirigidos a las CSC como tratamiento del cáncer
Se han descrito varios anticuerpos anti-STn en el campo, pero algunos demuestran baja especificidad hacia el antígeno STn o las isoformas sialiladas. Por ejemplo, se ha demostrado que el anticuerpo comercial B72.3 anti-STn se une no sólo a STn sino también al antígeno Tn (Bapat, S. A. (2010) Human ovarian cancer stem cells. Reproduction 140, 33-41). La disponibilidad de anticuerpos monoclonales (mAbs) dirigidos a STn, diseñados para inducir citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC), o conjugados con una carga útil citotóxica [por ejemplo, un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC)], ofrece el potencial de un beneficio terapéutico significativo para los pacientes con cáncer con tumores que expresan STn. Además, estos anticuerpos también permitirían desarrollar un diagnóstico complementario para preseleccionar a los pacientes con más probabilidades de responder a la terapia.
La STn suele estar presente en uno o más de los antígenos de superficie de las CSC, y juntos sirven para promover las propiedades de tallo y quimiorresistencia asociadas a las CSC. Por lo tanto, los anticuerpos anti-STn ofrecen un agente dirigido contra el cáncer asociado a las CSC con el potencial no sólo de destruir directamente las CSC a través de la participación directa y/o ADCC, sino que también ofrecen una oportunidad única para unirse a una amplia gama de proteínas de la superficie celular e interferir con sus funciones asociadas esenciales para la viabilidad, autorrenovación y replicación de las CSC.
Como se discute en el presente documento, el fundamento y las ventajas de apuntar STn en CSC pueden incluir: (1) muchas glicoproteínas truncadas específicas de tumores llevan STn en el cáncer; (2) STn es un objetivo de glicano único expresado preferentemente en CD44, MUC1, y potencialmente en otros marcadores importantes de la superficie celular, tanto en CSC como en células tumorales maduras, independientemente del estado de proliferación, lo que permite dirigirse a ambos componentes tumorales mediante un único agente terapéutico; (3) STn también es un componente de CA-125, un biomarcador del cáncer de ovario y otros; (4) STn es un componente del marcador de CSC de ovario CD44. Por lo tanto, el uso de mAbs murinos pan-STn, dirigidos a un epítopo que abarca tanto la forma Neu5Ac como Neu5Gc del ácido siálico unido a Tn, se unirá a las CSC y las eliminará o perjudicará su función y, en virtud del epítopo común, a las células tumorales no CSC.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona nuevo(s) mAb(s) anti-pan STn para la eliminación específica de CSC humanas, así como de células tumorales maduras. En un aspecto de la presente invención, el anticuerpo anti-STn se dirigirá al propio glicano STn validado, no a un glicopéptido o proteína portadora en particular, lo que debería ofrecer el amplio potencial de unión a CD44, MUC1 u otros marcadores glicosilados STn tanto en poblaciones tumorales CSC como no CSC.
Dada la excepcional especificidad de la STn asociada a tumores, la presente invención puede preservar tejidos normales, incluyendo células madre adultas normales, permitiendo así una excelente ventana terapéutica.
De acuerdo con la presente invención, se proporciona en el presente documento una solución inmunoterapéutica única dirigida a erradicar neoplasias humanas eliminando tanto las CSC como las células cancerosas maduras contenidas dentro del compartimento tumoral. La presente invención proporciona terapias y procedimientos dirigidos específicamente a tumores, que ahora incluyen a las CSC y, por tanto, amplían la ventana terapéutica al dirigirse a las moléculas de carbohidratos específicas del tumor asociadas a estos objetivos potenciales. La eliminación se produce específicamente a través de las estructuras del antígeno sialilado Tn (STn) de la superficie celular asociada al tumor, que están presentes de forma exclusiva en el tejido canceroso, incluyendo las células madre cancerosas
CSC de ovario
El cáncer de ovario es el principal cáncer ginecológico afectando a las mujeres en EE. UU. Durante 2013. Se calcula que 22.240 mujeres serán diagnosticadas y 14.030 morirán de esta enfermedad, lo que la convierte en la quinta causa de muerte por cáncer relacionado con la mujer y en la neoplasia ginecológica maligna más letal en EE. UU. (Siegel et al., Cancer statistics, 2013. CA: a cancer journal for clinicians 63, 11-30). Esta elevada mortalidad puede atribuirse a la aparición no sintomática, al diagnóstico inicial tardío, a la agresividad de este tipo de cáncer y a la falta general de cambios genéticos terapéuticamente abordables. El tratamiento estándar actual es la citorreducción tumoral seguida de quimioterapia basada en taxanos y platino. Aunque este tratamiento inicial da lugar a que ~70 % de los pacientes logren una respuesta clínica completa inicial, lamentablemente una mayoría de estos pacientes recaerán con enfermedad quimiorresistente (Foster et al., Cancer letters, 2013, 338, 147-157y McCann et al., PloS one, 2011,6, e28077). En parte, la enfermedad recurrente se ha atribuido, al igual que en otros tipos de cáncer, a la presencia de CSC dentro de la población tumoral total. De hecho, se han identificado CSC ováricas que han demostrado ser resistentes a la quimio y radioterapia (Burgos-Ojeda et al., Cancer letters, 2012, 322, 1-7). Por lo tanto, al igual que ocurre con otras formas de cáncer, la eliminación de las CSC junto con las células maduras de la población tumoral ofrece la mejor esperanza para controlar la enfermedad recurrente y, en el mejor de los casos, lograr la curación.
En algunas realizaciones de la presente invención, las CSC ováricas pueden dirigirse al tratamiento del cáncer de ovario. Aunque CD133 es el más ampliamente estudiado de los marcadores putativos de CSC de ovario, se reconoce que CD44, un conocido portador de STn como se ha comentado anteriormente, está asociado con el cáncer de ovario y se incluye en el conjunto de marcadores que identifican las CSC de ovario (Zhang et al., Cancer research, 2008, 68, 4311-4320; Foster et al., Cancer letters, 2013, 338, 147-157; y Zoller, Cancer, 2011, 11, 254-267). Además, STn se expresa en el conocido biomarcador del cáncer de ovario CA-125 (MUC16), así como en MUC1, donde los niveles de estas mucinas asociadas a STn en suero se han utilizado recientemente como diferenciadores adicionales de la enfermedad ovárica cancerosa frente a la benigna. Los niveles séricos elevados de STn se dan en ~50 % de las pacientes con cáncer de ovario y se correlacionan con una menor tasa de supervivencia a 5 años (Kobayashi et al., Journal of clinical oncology: official journal of the American Society of Clinical Oncology, 1991, 9, 983-987; Kobayashi et al., Journal of clinical oncology: official journal of the American Society of Clinical Oncology, 1992, 10, 95-101y Chen et al., Journal of proteome research, 2013, 12, 1408-1418). Por último, Vathipadiekal et al. en un estudio sobre la expresión génica diferencial entre las CSC de carcinoma ovárico primario humano y las poblaciones no CSC descubrieron que la expresión de la sialil transferasa generadora de STn ST6GalNAc-I no difería entre las células de los dos compartimentos.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona anticuerpos para dirigir CSC para prevenir el control o curar el cáncer relacionado con CSC. Tales anticuerpos pueden incluir anticuerpos anti-STn, incluyendo, pero no limitándose a cualquiera de los descritos (o derivados de cualquiera de los descritos) en la solicitud internacional número PCT/US14/60079 (WO 2015/054600). Otros anticuerpos anti-STn pueden incluir el anticuerpo 3F1 (SBH Sciences, Natick, MA) o derivados del mismo, incluyendo anticuerpos recombinantes con CDRs de 3F1 y/o derivados humanizados.
Terapias combinadas contra el cáncer
En algunas realizaciones, los compuestos y composiciones de la invención pueden combinarse con una o más formas adicionales de tratamiento del cáncer. En algunos casos, dichas formas adicionales pueden incluir tratamientos quimioterapéuticos.
Como se usa en el presente documento, el término "quimioterapia" se refiere a una forma de tratamiento usando sustancias químicas. Tales sustancias químicas se denominan en el presente documento "agentes quimioterapéuticos" En el tratamiento del cáncer, los agentes quimioterapéuticos pueden comprender uno o más fármacos anticancerosos. En algunas realizaciones, los agentes quimioterapéuticos que pueden usarse de acuerdo con los procedimientos de la presente invención o en combinación con compuestos o composiciones de la invención pueden incluir, pero no se limitan a capecitabina, gemcitabina, ABRAXANE® (partículas de paclitaxel unidas a proteínas para suspensión inyectable), docetaxel, fluorouracilo (5-FU), oxaliplatino, cisplatino, carboplatino, irinotecán, topotecán, paclitaxel, leucovorina, doxorrubicina y combinaciones de los mismos.
Objetivos relacionados con la inmunidad
En algunas realizaciones, los anticuerpos que interactúan con glicanos de la invención pueden ser anticuerpos inmunomoduladores. Como se utiliza en el presente documento, un anticuerpo inmunomodulador es un anticuerpo que mejora o suprime una o más funciones o vías inmunitarias.
Se sabe que muchos glicanos bacterianos contienen ácido siálico. En algunos casos, estos glicanos permiten a las bacterias eludir el sistema inmunitario innato de los huéspedes, incluyendo, pero no limitado a, los seres humanos. En un ejemplo, los glicanos bacterianos inhiben la activación de la vía alterna del complemento mediante el reconocimiento del factor H. En otro ejemplo, los glicanos bacterianos enmascaran residuos subyacentes que pueden ser antigénicos. Algunos glicanos bacterianos participan en eventos de señalización celular a través de la activación de lectinas inhibidoras de ácido siálico (Siglecs) que amortiguan la respuesta inmune a entidades que comprenden ciertos elementos sialilados (Chen, X. et al., Advances in the biology and chemistry of sialic acids. ACS Chem Biol.
2010 Feb 19;5(2): 163-76). En algunas realizaciones, los anticuerpos que interactúan con glicanos de la presente invención pueden utilizarse para tratar complicaciones inmunitarias relacionadas con glicanos bacterianos.
Debido a la naturaleza extraña de Neu5Gc como se describe en el presente documento, algunos glicanos Neu5Gc son inmunogénicos resultando en la destrucción inmune relacionada de células y otras entidades donde estos glicanos pueden expresarse. Esta destrucción autoinmune puede ser patógena. En algunas realizaciones, los anticuerpos que interactúan con los glicanos pueden utilizarse para tratar a pacientes que sufren trastornos autoinmunes relacionados con los glicanos Neu5Gc.
En algunas realizaciones, los anticuerpos inmunomoduladores de la invención pueden usarse para promover o suprimir la inmunidad mediada por células T. Dichos anticuerpos pueden interactuar con uno o más glicanos presentes en células T, proteínas relacionadas con células T y/o en uno o más tipos celulares que interactúan con células T. Los anticuerpos inmunomoduladores que potencian la inmunidad mediada por células T pueden utilizarse para estimular la orientación mediada por células T de células cancerosas.
En algunos tumores, la infiltración por macrófagos asociados a tumores (TAM) puede conducir a la inmunosupresión promoviendo la viabilidad y crecimiento de las células tumorales. Se cree que esto se debe a la señalización celular inmunosupresora que se produce a través de interacciones entre los receptores de lectina de tipo C (CLR) mieloides presentes en los t A m y las mucinas asociadas a tumores (Allavena, P. et al., Clin Dev Immunol. 2010;2010:547179). En algunas realizaciones, la unión de anticuerpos inmunomoduladores de la invención a una o más mucinas asociadas a tumores o TACA previene la señalización celular inmunosupresora en TAM.
Aplicaciones antivirales
En algunas realizaciones, los anticuerpos que interactúan con glicanos de la invención pueden dirigirse a virus. Las proteínas de la cubierta viral y las envolturas virales a menudo contienen glicanos, denominados en el presente documento como glicanos de superficie viral. Dichos glicanos pueden ser objetivos de anticuerpos que interactúan con los glicanos. En algunas realizaciones, los glicanos de superficie virales comprenden sialil-STn. En otra realización, los glicanos de superficie virales comprenden GcSTn. Los virus a los que pueden dirigirse los anticuerpos que interactúan con los glicanos incluyen, pero no se limitan a, el VIH, la gripe, el rinovirus, la varicela-zóster, el rotavirus, el herpes (por ejemplo, los tipos 1 y 2), la hepatitis (por ejemplo, los tipos A, B, C, D y E), la fiebre amarilla y el virus del papiloma humano.
Otras aplicaciones terapéuticas
En algunas realizaciones, los anticuerpos que interactúan con glicanos de la invención pueden actuar para alterar o controlar eventos proteolíticos. En algunas realizaciones, los anticuerpos que interactúan con glicanos de la presente invención pueden internalizarse en las células antes de unirse a los objetivos
Aplicaciones veterinarias
Se contempla que los anticuerpos que interactúan con glicanos de la invención encontrarán utilidad en el área del cuidado veterinario, incluyendo el cuidado y tratamiento de vertebrados no humanos. Tal y como se describe en el presente documento, el término "vertebrado no humano" incluye a todos los vertebrados a excepción del Homo sapiens, incluyendo las especies salvajes y domesticadas, tal como los animales de compañía y el ganado. Entre los vertebrados no humanos figuran mamíferos tales como la alpaca, el banteng, el bisonte, el camello, el gato, el ganado vacuno, el ciervo, el perro, el burro, el gayal, la cabra, la cobaya, el caballo, la llama, la mula, el cerdo, el conejo, el reno, la oveja, el búfalo de agua y el yak. El ganado incluye animales domesticados criados en un entorno agrícola para producir materiales tales como alimentos, mano de obra y productos derivados como fibras y productos químicos. Por lo general, la ganadería incluye todos los mamíferos, aves y peces con potencial agrícola. En particular, los animales de abasto de cuatro patas incluyen novillos, novillas, vacas, terneros, toros, bovinos, porcinos y ovinos.
Bioprocesamiento
En algunas realizaciones de la invención son procedimientos para producir productos biológicos en células huésped contactando las células con uno o más anticuerpos que interactúan con glicanos (tales como un anticuerpo o proteína de fusión) capaces de modular la expresión génica, o alterar los niveles y/o tipos de glicanos producidos en donde tal modulación o alteración mejora la producción de productos biológicos. De acuerdo con la presente invención, los procedimientos de bioprocesamiento pueden mejorarse utilizando uno o más de los anticuerpos que interactúan con glicanos de la presente invención. También pueden mejorarse complementando, sustituyendo o añadiendo uno o más anticuerpos que interactúen con los glicanos.
Diagnóstico
En algunas realizaciones, los compuestos y composiciones de la invención pueden usarse como diagnósticos. En algunos casos, los anticuerpos de la invención pueden utilizarse para identificar, etiquetar o teñir células, tejidos, órganos, etc. que expresen antígenos objetivo. En otras realizaciones, los anticuerpos de la invención pueden utilizarse para identificar STn presentes en secciones de tejido (es decir, secciones de tejido histológico), incluyendo tejido conocido o sospechoso de tener células cancerosas. Tales procedimientos de uso de anticuerpos de la invención pueden utilizarse en algunos casos para identificar células cancerosas o tumores en secciones de tejido. Las secciones de tejido pueden ser de cualquier tejido u órgano, incluyendo, pero no limitados a, mama, colon, páncreas, ovario, cerebro, hígado, riñón, bazo, pulmón, piel, estómago, intestino, esófago o hueso.
III. Composiciones farmacéuticas
Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden caracterizarse por una o más de biodisponibilidad, ventana terapéutica y/o volumen de distribución.
Biodisponibilidad
Los anticuerpos que interactúan con glicanos, cuando se formulan en una composición con un agente de administración/formulación o vehículo como se describe en el presente documento, pueden presentar un aumento de la biodisponibilidad en comparación con una composición que carece de un agente de administración como se describe en el presente documento. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "biodisponibilidad" se refiere a la disponibilidad sistémica de una cantidad determinada de anticuerpos que interaccionan con glicanos administrada a un mamífero. La biodisponibilidad puede evaluarse midiendo el área bajo la curva (AUC) o la concentración sérica o plasmática máxima (Cmáx) de la forma inalterada de un compuesto tras su administración a un mamífero. El AUC es una determinación del área bajo la curva que traza la concentración sérica o plasmática de un compuesto a lo largo de la ordenada (eje Y) frente al tiempo a lo largo de la abscisa (eje X). En general, el AUC de un compuesto concreto puede calcularse mediante procedimientos conocidos por los expertos en la materia y descritos en G. S. Banker, Modern Pharmaceutics, Drugs and the Pharmaceutical Sciences, v. 72, Marcel Dekker, Nueva York, Inc., 1996.
El valor Cmáx es la concentración máxima del compuesto alcanzada en el suero o plasma de un mamífero tras la administración del compuesto al mamífero. El valor Cmáx de un compuesto particular puede medirse utilizando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Las frases "aumento de la biodisponibilidad" o "mejora de la farmacocinética", tal como se utilizan en el presente documento, significan que la disponibilidad sistémica de un anticuerpo que interactúa con un glicano, medida como AUC, Cmáx o Cmín en un mamífero, es mayor cuando se coadministra con un agente de administración como el descrito en el presente documento, que cuando no tiene lugar dicha coadministración. En algunas realizaciones, la biodisponibilidad del anticuerpo que interactúa con glicanos puede aumentar en al menos aproximadamente 2 %, al menos aproximadamente 5 %, al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 15 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 25 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 35 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 45 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 55 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 65 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 % o aproximadamente 100 %.
Ventana terapéutica
Los anticuerpos que interactúan con los glicanos, cuando se formulan en una composición con un agente de administración como se describe en el presente documento, pueden mostrar un aumento de la ventana terapéutica de la composición de anticuerpos que interactúan con los glicanos administrada en comparación con la ventana terapéutica de la composición de anticuerpos que interactúan con los glicanos administrada que carece de un agente de administración como se describe en el presente documento. En el presente documento, "ventana terapéutica" se refiere al intervalo de concentraciones plasmáticas, o el intervalo de niveles de la sustancia terapéuticamente activa en el lugar de acción, con una alta probabilidad de provocar un efecto terapéutico. En algunas realizaciones, la ventana terapéutica del anticuerpo que interactúa con glicanos cuando se administra conjuntamente con un agente de administración como se describe en el presente documento puede aumentar en al menos aproximadamente 2 %, al menos aproximadamente 5 %, al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 15 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 25 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 35 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 45 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 55 %, al menos al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 65 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, o aproximadamente 100 %.
Volumen de distribución
Los anticuerpos que interactúan con glicanos, cuando se formulan en una composición con un agente de administración como el descrito en el presente documento, pueden presentar un volumen de distribución (Vdist) mejorado, por ejemplo, reducido o dirigido, en relación con una composición que carece de un agente de administración como el descrito en el presente documento. El volumen de distribución (Vdist) relaciona la cantidad de fármaco en el organismo con la concentración del fármaco en la sangre o el plasma. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "volumen de distribución" se refiere al volumen de fluido que se necesitaría para contener la cantidad total del fármaco en el organismo a la misma concentración que en la sangre o el plasma: El Vdist es igual a la cantidad de droga en el cuerpo/concentración de droga en sangre o plasma. Por ejemplo, para una dosis de 10 mg y una concentración plasmática de 10 mg/L, el volumen de distribución sería de 1 litro. El volumen de distribución refleja el grado de presencia del fármaco en el tejido extravascular. Un gran volumen de distribución refleja la tendencia de un compuesto a unirse a los componentes tisulares en comparación con la unión a las proteínas plasmáticas. En un contexto clínico, la Vdist puede utilizarse para determinar una dosis de carga para alcanzar una concentración en estado estacionario. En algunas realizaciones, el volumen de distribución del anticuerpo que interactúa con el glicano cuando se coadministra con un agente de administración como el descrito en el presente documento puede disminuir al menos aproximadamente 2 %, al menos aproximadamente 5 %, al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 15 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 25 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 35 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 45 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 55 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 65 %, al menos aproximadamente 70 %.
En algunas realizaciones, los anticuerpos que interactúan con glicanos comprenden composiciones y/o complejos en combinación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender opcionalmente uno o más principios activos adicionales, por ejemplo, principios activos terapéuticos y/o profilácticos. Pueden encontrarse consideraciones generales sobre la formulación y/o fabricación de agentes farmacéuticos, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005.
En algunas realizaciones, las composiciones se administran a seres humanos, pacientes humanos o sujetos. A los efectos de la presente divulgación, la expresión "ingrediente activo" se refiere en general a los anticuerpos que interactúan con los glicanos y que se administrarán como se describe en el presente documento.
Aunque las descripciones de las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento están dirigidas principalmente a las composiciones farmacéuticas que son adecuadas para la administración a seres humanos, el experto en la técnica entenderá que dichas composiciones son generalmente adecuadas para la administración a cualquier otro animal, por ejemplo, animales no humanos, por ejemplo, mamíferos no humanos. La modificación de las composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración a los seres humanos con el fin de hacer que las composiciones sean adecuadas para su administración a diversos animales es bien conocida, y el farmacólogo veterinario normalmente capacitado puede diseñar y llevar a cabo dicha modificación con una experimentación meramente ordinaria, si es que la hay. Los sujetos a los que se contempla la administración de las composiciones farmacéuticas incluyen, pero no se limitan a, seres humanos y/u otros primates; mamíferos, incluyendo mamíferos comercialmente relevantes tales como ganado vacuno, cerdos, caballos, ovejas, gatos, perros, ratones y/o ratas; y/o aves, incluyendo aves comercialmente relevantes tales como aves de corral, pollos, patos, gansos y/o pavos.
Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se pueden preparar mediante cualquier procedimiento conocido o desarrollado en el futuro en la técnica de la farmacología. En general, tales procedimientos de preparación incluyen el paso de asociar el ingrediente activo con un excipiente y/o uno o más ingredientes auxiliares y luego, si es necesario y/o deseable, dividir, moldear y/o empaquetar el producto en un unidad monodosis o multidosis deseada.
Una composición farmacéutica de acuerdo con la invención se puede preparar, empacar y/o vender a granel, como una dosis unitaria única y/o como una pluralidad de dosis unitarias únicas. Como se utiliza en el presente documento, una “dosis unitaria” es una cantidad discreta de la composición farmacéutica que comprende una cantidad predeterminada del ingrediente activo. La cantidad del ingrediente activo es, en general, igual a la dosis del ingrediente activo que se administraría a un sujeto y/o una fracción conveniente de dicha dosis, tal como, por ejemplo, la mitad o un tercio de dicha dosis.
Las cantidades relativas del ingrediente activo, el excipiente farmacéuticamente aceptable y/o cualquier ingrediente adicional en una composición farmacéutica de acuerdo con la invención variarán, dependiendo de la identidad, el tamaño y/o la condición del sujeto tratado y además dependiendo de la vía por la que se vaya a administrar la composición. A modo de ejemplo, la composición puede comprender entre 0,1 % y 100 %, por ejemplo, entre 0,5 y 50 %, entre 1-30 %, entre 5-80 %, o al menos 80 % (p/p) de ingrediente activo. En una realización, los ingredientes activos son anticuerpos dirigidos contra las células cancerosas.
Formulación
Los anticuerpos que interactúan con glicanos de la invención pueden formularse utilizando uno o más excipientes para: (1) aumentar la estabilidad; (2) aumentar la permeabilidad celular; (3) permitir la liberación sostenida o retardada (por ejemplo, a partir de una formulación del anticuerpo que interactúa con el glicano); y/o (4) alterar la biodistribución (por ejemplo, orientar el anticuerpo que interactúa con el glicano a tejidos o tipos celulares específicos). Además de los excipientes tradicionales, tales como todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, diluyentes u otros vehículos líquidos, coadyuvantes de dispersión o suspensión, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, las formulaciones de la presente invención pueden incluir, sin limitación, liposomas, nanopartículas lipídicas, polímeros, lipoplejos, nanopartículas núcleo-carcaza, péptidos, proteínas, células transfectadas con los anticuerpos que interactúan con los glicanos (por ejemplo, para el trasplante a un sujeto) y combinaciones de los mismos.
Excipientes
Como se usa en el presente documento, el término "excipiente" se refiere a cualquier sustancia combinada con un compuesto y/o composición de la invención antes de su uso. En algunas realizaciones, los excipientes son inactivos y se utilizan principalmente como portador, diluyente o vehículo para un compuesto y/o composición de la presente invención. Se conocen en la técnica diversos excipientes para formular composiciones farmacéuticas y técnicas para preparar la composición (véase Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a edición, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006).
El uso de un medio excipiente convencional se contempla dentro del alcance de la presente divulgación, excepto en la medida en que cualquier medio excipiente convencional pueda ser incompatible con una sustancia o sus derivados, tal como por ejemplo produciendo cualquier efecto biológico indeseable o interactuando de otro modo de manera deletérea con cualquier otro componente(s) de la composición farmacéutica.
Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se pueden preparar mediante cualquier procedimiento conocido o desarrollado en el futuro en la técnica de la farmacología. En general, tales procedimientos preparatorios incluyen el paso de asociar el ingrediente activo con un excipiente y/o uno o más ingredientes accesorios.
Una composición farmacéutica de acuerdo con la presente divulgación puede prepararse, envasarse y/o venderse a granel, como una dosis unitaria única y/o como una pluralidad de dosis unitarias únicas.
Las cantidades relativas del ingrediente activo, el excipiente farmacéuticamente aceptable y/o cualquier ingrediente adicional en una composición farmacéutica de acuerdo con la presente divulgación pueden variar, dependiendo de la identidad, el tamaño y/o la condición del sujeto que se está tratando y dependiendo además de la vía por la que se vaya a administrar la composición.
En algunas realizaciones, un excipiente farmacéuticamente aceptable tiene una pureza de al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 %. En algunas realizaciones, un excipiente está aprobado para su uso en humanos y para uso veterinario. En algunas realizaciones, un excipiente está aprobado por la United States Food and Drug Administration. En algunas realizaciones, un excipiente es de calidad farmacéutica. En algunas realizaciones, un excipiente cumple las normas de la United States Pharmacopoeia (USP), la European Pharmacopoeia (EP), la British Pharmacopoeia, y/o la International Pharmacopoeia.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables usados en la fabricación de composiciones farmacéuticas incluyen, pero no se limitan a, diluyentes inertes, agentes dispersantes y/o granulares, agentes tensioactivos y/o emulsionantes, agentes disgregantes, agentes aglutinantes, conservantes, agentes amortiguadores, agentes lubricantes y/o aceites. Dichos excipientes pueden incluirse opcionalmente en composiciones farmacéuticas.
Los diluyentes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, carbonato de calcio, carbonato de sodio, fosfato de calcio, fosfato dicálcico, sulfato de calcio, hidrógeno fosfato de calcio, fosfato de sodio lactosa, sacarosa, celulosa, celulosa microcristalina, caolín, manitol, sorbitol, inositol, cloruro de sodio, almidón seco, almidón de maíz, azúcar en polvo, etc., y/o combinaciones de los mismos.
Los agentes granulantes y/o dispersantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, almidón de patata, almidón de maíz, almidón de tapioca, glicolato sódico de almidón, arcillas, ácido algínico, goma guar, pulpa de cítricos, agar, bentonita, celulosa y productos de madera, esponja natural, resinas de intercambio catiónico, carbonato cálcico, silicatos, carbonato sódico, poli(vinilpirrolidona) reticulada (crospovidona), carboximetilalmidón sódico (glicolato sódico de almidón), carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica reticulada (croscarmelosa), metilcelulosa, almidón pregelatinizado (almidón 1500), almidón microcristalino, almidón insoluble en agua, carboximetilcelulosa cálcica, silicato de aluminio y magnesio (VEEGUM®), laurilsulfato sódico, compuestos de amonio cuaternario, etc., y/o combinaciones de los mismos.
Los agentes tensioactivos y/o emulsionantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, emulsionantes naturales (por ejemplo, acacia, agar, ácido algínico, alginato de sodio, tragacanto, chondrux, colesterol, xantano, pectina, gelatina, yema de huevo, caseína, grasa de lana, colesterol, cera y lecitina), arcillas coloidales (por ejemplo, bentonita [silicato de aluminio] y VEEGUM® [silicato de aluminio y magnesio]), derivados de aminoácidos de cadena larga, alcoholes de alto peso molecular (por ejemplo, alcohol estearílico, alcohol cetílico, alcohol oleílico, monoestearato de triacetina, diestearato de etilenglicol, monoestearato de glicerilo y monoestearato de propilenglicol, alcohol polivinílico), carbómeros (por ejemlo, carboxipolimetileno, ácido poliacrílico, polímero de ácido acrílico y polímero de carboxivinilo), carragenina, derivados celulósicos (por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, celulosa en polvo, hidroximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, metilcelulosa), ésteres de ácidos grasos de sorbitán (por ejemplo, monolaurato de polioxietilensorbitán [TWEEN®20], polioxietilensorbitán [TWEENn®60], monooleato de sorbitán polioxietilenado [TWEEN®80], monopalmitato de sorbitán [SPAN®40], monoestearato de sorbitán [Span®60], triestearato de sorbitán [Span®65], monooleato de glicerilo, monooleato de sorbitán [SPAN®80]), ésteres de polioxietileno (por ejemplo, monoestearato de polioxietileno [MYRJ®45], aceite de ricino hidrogenado con polioxietileno, aceite de ricino polietoxilado, estearato de polioximetileno y SOLUTOL®), ésteres de ácidos grasos de sacarosa, ésteres de ácidos grasos de polietilenglicol (por ejemplo, CREMOPHOR®), éteres de polioxietileno (por ejemplo, éter laurílico de polioxietileno [ BRIJ®30]), poli(vinilpirrolidona), monolaurato de dietilenglicol, oleato de trietanolamina, oleato de sodio, oleato de potasio, oleato de etilo, ácido oleico, laurato de etilo, laurilsulfato de sodio, PLUORINC®F 68, POLOXAMER®188, bromuro de cetrimonio, cloruro de cetilpiridinio, cloruro de benzalconio, docusato de sodio, etc. y/o combinación de los mismos.
Los aglutinantes ejemplares incluyen, pero no limitado a, almidónj'por ejemplo, almidón de maíz y pasta de almidón); gelatina; azúcaresj'por ejemplo, sacarosa, glucosa, dextrosa, dextrina, melaza, lactosa, lactitol, manitol); gomas naturales y sintéticasfpor ejemplo, acacia, alginato de sodio, extracto de musgo irlandés, goma panwar, goma ghatti, mucílago de cáscaras de isapol, carboximetilcelulosa, metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, celulosa microcristalina, acetato de celulosa, poli(vinilpirrolidona), silicato de aluminio y magnesio (VEEGUM®) y arabogalactano de alerce); alginatos; óxido de polietileno; polietilenglicol; sales inorgánicas de calcio; ácido silícico; polimetacrilatos; ceras; agua; alcohol; etc.; y combinaciones de los mismos.
Los conservantes ejemplares pueden incluir, pero no limitarse a, antioxidantes, agentes quelantes, conservantes antimicrobianos, conservantes antifúngicos, conservantes alcohólicos, conservantes ácidos y/u otros conservantes. Los antioxidantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, alfa tocoferol, ácido ascórbico, palmitato de ascorbilo, butilhidroxianisol, butilhidroxitolueno, monotioglicerol, metabisulfito de potasio, ácido propiónico, galato de propilo, ascorbato de sodio, bisulfito de sodio, metabisulfito de sodio y/o sulfito de sodio. Algunos agentes quelantes ejemplares incluyen ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido cítrico monohidratado, edetato disódico, edetato dipotásico, ácido edético, ácido fumárico, ácido málico, ácido fosfórico, edetato sódico, ácido tartárico y/o edetato trisódico. Los conservantes antimicrobianos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, alcohol bencílico, bronopol, cetrimida, cloruro de cetilpiridinio, clorhexidina, clorobutanol, clorocresol, cloroxilenol, cresol, alcohol etílico, glicerina, hexetidina, imidurea, fenol, fenoxietanol, alcohol feniletílico, nitrato fenilmercúrico, propilenglicol y/o timerosal. Los conservantes antifúngicos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, butilparabeno, metilparabeno, etilparabeno, propilparabeno, ácido benzoico, ácido hidroxibenzoico, benzoato potásico, sorbato potásico, benzoato sódico, propionato sódico y/o ácido sórbico. Los conservantes alcohólicos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, etanol, polietilenglicol, fenol, compuestos fenólicos, bisfenol, clorobutanol, hidroxibenzoato y/o alcohol feniletílico. Los conservantes ácidos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, vitamina A, vitamina C, vitamina E, betacaroteno, ácido cítrico, ácido acético, ácido deshidroacético, ácido ascórbico, ácido sórbico y/o ácido fítico. Otros conservantes incluyen, pero no se limitan a, tocoferol, acetato de tocoferol, mesilato de deteroxima, cetrimida, butilhidroxianisol (BHA), butilhidroxitolueno (BHT), etilendiamina, lauril sulfato sódico (SLS), lauril éter sulfato sódico (SLES), bisulfito sódico, metabisulfito sódico, sulfito potásico, metabisulfito potásico, GLYd An TPLUS®, PHENONIP®, metilparabeno, GERMALL®115, GERMABEN®II, NEOLONE™, KATHON™, y/o EUXYL®.
Agentes amortiguadores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, soluciones de tampón de citrato, soluciones de tampón de acetato, soluciones de tampón de fosfato, cloruro de amonio, carbonato de calcio, cloruro de calcio, citrato de calcio, glubionato de calcio, gluceptato cálcico, gluconato cálcico, ácido D-glucónico, glicerofosfato cálcico, lactato cálcico, ácido propanoico, levulinato cálcico, ácido pentanoico, fosfato cálcico dibásico, ácido fosfórico, fosfato cálcico tribásico, hidróxido fosfato cálcico, acetato de potasio, cloruro de potasio, gluconato de potasio, mezclas de potasio, fosfato de potasio dibásico, fosfato de potasio monobásico, mezclas de fosfato de potasio, acetato de sodio, bicarbonato de sodio, cloruro de sodio, citrato de sodio, lactato de sodio, fosfato de sodio dibásico, fosfato de sodio monobásico, mezclas de fosfato de sodio, trometamina, hidróxido de magnesio, hidróxido de aluminio, ácido algínico, agua libre de pirógenos, solución salina isotónica, solución de Ringer, alcohol etílico, etc., y/o combinaciones de los mismos.
Los agentes lubricantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, estearato de magnesio, estearato de calcio, ácido esteárico, sílice, talco, malta, behanato de glicerilo, aceites vegetales hidrogenados, polietilenglicol, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio, leucina, lauril sulfato de magnesio, lauril sulfato de sodio, etc., y combinaciones de los mismos.
Los aceites ejemplares incluyen, pero no se limitan a aceites de, almendra, semilla de albaricoque, aguacate, babasú, bergamota, semilla de corriente negra, borraja, cade, manzanilla, canola, alcaravea, carnauba, ricino, canela, manteca de cacao, coco, bacalao hígado, café, maíz, semilla de algodón, emú, eucalipto, onagra, pescado, linaza, geraniol, calabaza, semilla de uva, avellana, hisopo, miristato de isopropilo, jojoba, nuez de kukui, lavandín, lavanda, limón, litsea cubeba, macadamia nuez, malva, semilla de mango, semilla de espuma de pradera, visón, nuez moscada, aceituna, naranja, reloj anaranjado, palma, semilla de palma, semilla de melocotón, maní, semilla de amapola, semilla de calabaza, colza, salvado de arroz, romero, cártamo, sándalo, sasquana, ajedrea, espino amarillo, sésamo, manteca de karité, silicona, soja, girasol, árbol de té, cardo, tsubaki, vetiver, nuez y germen de trigo. Los aceites ejemplares incluyen, pero no se limitan a, estearato de butilo, triglicérido caprílico, triglicérido cáprico, ciclometicona, sebacato de dietilo, dimeticona 360, miristato de isopropilo, aceite mineral, octildodecanol, alcohol oleílico, aceite de silicona y/o combinaciones de los mismos.
Excipientes como manteca de cacao y ceras para supositorios, colorantes, agentes de recubrimiento, edulcorantes, saborizantes y/o perfumantes pueden estar presentes en la composición, según el juicio del formulador.
Vehículos
Liposomas, lipoplejos y nanopartículas lipídicas
Los anticuerpos que interactúan con glicanos de la presente invención pueden formularse utilizando uno o más liposomas, lipoplejos o nanopartículas lipídicas. En una realización, las composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos que interactúan con glicanos comprenden además liposomas. Los liposomas son vesículas preparadas artificialmente que pueden estar compuestas principalmente por una o más bicapas lipídicas y pueden utilizarse como vehículo de administración de nutrientes y formulaciones farmacéuticas. Los liposomas pueden ser de diferentes tamaños, tales como, pero sin limitarse a, una vesícula multilamelar (MLV), que puede tener cientos de nanómetros de diámetro y contener una serie de bicapas concéntricas separadas por estrechos compartimentos acuosos, una pequeña vesícula unicelular (SUV), que puede tener menos de 50 nm de diámetro, y una gran vesícula unilamelar (LUV), que puede tener entre 50 y 500 nm de diámetro. El diseño de los liposomas puede incluir, pero sin limitarse a, opsoninas o ligandos para mejorar la adhesión de los liposomas a tejidos no sanos o para activar eventos tales como, pero sin limitarse a, la endocitosis. Los liposomas pueden contener un pH bajo o alto para mejorar la administración de las formulaciones farmacéuticas.
La formación de liposomas puede depender de las características fisicoquímicas tales como, pero sin limitarse a, la formulación farmacéutica atrapada y los ingredientes liposomales, la naturaleza del medio en el que se dispersan las vesículas lipídicas, la concentración efectiva de la sustancia atrapada y su toxicidad potencial, cualquier procedimiento adicional implicado durante la aplicación y/o suministro de las vesículas, el tamaño de optimización, la polidispersidad y la vida útil de las vesículas para la aplicación prevista, y la reproducibilidad entre lotes y la posibilidad de producción a gran escala de productos liposomales seguros y eficaces.
En una realización tales formulaciones también pueden construirse o composiciones alteradas de tal manera que pasiva o activamente sean dirigidas a diferentes tipos de células in vivo.
Las formulaciones también pueden ser dirigidas selectivamente a través de la expresión de diferentes ligandos en su superficie como se ejemplifica, pero no se limita a, folato, transferrina, N-acetilgalactosamina (GalNAc), y enfoques orientados por anticuerpos.
Liposomas, lipoplexos, o nanopartículas lipídicas pueden usarse para mejorar la eficacia de la función de anticuerpos que interactúan con glicanos ya que estas formulaciones pueden ser capaces de incrementar la transfección celular con anticuerpos que interactúan con glicanos. Los liposomas, lipoplejos o nanopartículas lipídicas también pueden utilizarse para aumentar la estabilidad de los anticuerpos que interactúan con los glicanos.
Los liposomas que se formulan específicamente para la carga de anticuerpos se preparan de acuerdo con técnicas conocidas en la técnica, tales como las descritas por Eppstein et al. (Eppstein, D.A. et al., Biological activity of liposome-encapsulated murine interferon gamma is mediated by a cell membrane receptor. Proc Natl Acad Sci USA.
1985 Jun;82(11):3688-92); Hwang et al. (Hwang, K.J. y otros, Hepatic uptake and degradation of unilamellar sphingomyelin/cholesterol liposomes: a kinetic study. Proc Natl Acad Sci USA. 1980 Jul;77(7):4030-4); US 4,485,045 y US 4,544,545. La producción de liposomas con tiempo de circulación sostenido también se describe en el documento US 5,013,556.
Los liposomas que comprenden anticuerpos que interactúan con glicanos de la presente invención pueden generarse usando evaporación en fase inversa utilizando lípidos tales como fosfatidilcolina, colesterol, así como fosfatidiletanolamina que ha sido derivatizada con polietilenglicol. Se utilizan filtros con un tamaño de poro definido para extrudir liposomas del diámetro deseado. En otra realización, los anticuerpos que interactúan con los glicanos de la presente invención pueden conjugarse con la superficie externa de los liposomas mediante una reacción de intercambio de disulfuro como la descrita por Martin et al. (Martin, F.J. et al., Irreversible coupling of immunoglobulin fragments to preformed vesicles. An improved method for liposome targeting. J Biol Chem. 1982 Ene 10;257(1):286-8).
Polímeros y nanopartículas
Los anticuerpos que interactúan con glicanos de la invención pueden formularse utilizando polímeros naturales y/o sintéticos. Ejemplos no limitantes de polímeros que pueden utilizarse para la administración incluyen, pero no se limitan a, DMRI/DOPE, poloxámero, quitosano, ciclodextrina y polímeros de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA). Pueden ser biodegradables.
La formulación polimérica puede permitir la liberación sostenida o retardada de anticuerpos que interactúan con los glicanos (por ejemplo, tras una inyección intramuscular o subcutánea). El perfil de liberación alterado de los anticuerpos que interaccionan con los glicanos puede dar lugar, por ejemplo, a la liberación de los anticuerpos que interaccionan con los glicanos durante un periodo de tiempo prolongado. La formulación polimérica también puede utilizarse para aumentar la estabilidad de los anticuerpos que interactúan con los glicanos.
Las formulaciones poliméricas también pueden dirigirse selectivamente a través de la expresión de diferentes ligandos como, por ejemplo, folato, transferrina y N-acetilgalactosamina (GalNAc) (Benoit et al., Biomacromolecules. 2011 12:2708-2714; Rozema et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2007 104:12982-12887; Davis, Mol Pharm. 2009 6:659-668; Davis, Nature 2010464:1067-1070).
Los anticuerpos que interactúan con glicanos de la invención también pueden formularse como nanopartículas utilizando una combinación de polímeros, lípidos y/u otros agentes biodegradables, tales como, pero no limitados a, fosfato de calcio. Los componentes pueden combinarse en una arquitectura de núcleo-cáscara, híbrida y/o de capa por capa, para permitir el ajuste fino de la nanopartícula de modo que pueda mejorarse la administración de anticuerpos que interactúan con los glicanos. Para los anticuerpos que interactúan con glicanos, pueden utilizarse sistemas basados en poli(2-(metacriloxi)etil fosforilcolina)-bloque-(2-(diisopropilamino)etil metacrilato), (PMPC-PDPA), un copolímero dibloque sensible al pH que se autoensambla para formar vesículas de tamaño nanométrico, también conocidas como polimersomas, a pH fisiológico. Se ha demostrado que estos polimersomas liberan con éxito cargas relativamente altas de anticuerpos en células vivas. (Massignani, et al, Cellular delivery of antibodies: effective targeted subcellular imaging and new therapeutic tool. Nature Proceedings, mayo, 2010).
En una realización, un polímero de conversión de carga PEG (Pitella et al., Biomaterials. 2011 32:3106-3114) puede utilizarse para formar una nanopartícula para administrar anticuerpos que interactúan con glicanos de la presente invención. El polímero de conversión de carga de PEG puede mejorar a los copolímeros en bloque de PEG-polianión al escindirse en un policationato a pH ácido, mejorando así el escape endosomal.
El uso de nanopartículas de núcleo-corteza se ha centrado adicionalmente en un enfoque de alto rendimiento para sintetizar núcleos de nanogel reticulados catiónicos y diversas cáscaras (Siegwart et al., Proc Natl Acad Sci U S A.
2011 108:12996-13001). La complejación, el suministro y la internalización de las nanopartículas poliméricas pueden controlarse con precisión alterando la composición química de los componentes del núcleo y de la cubierta de la nanopartícula.
En una realización, se utilizan matrices de poli(etileno-co-acetato de vinilo) para administrar anticuerpos que interactúan con glicanos de la invención. Dichas matrices se describen en Nature Biotechnology 10, 1446 - 1449 (1992).
Formulaciones de anticuerpos
Los anticuerpos que interactúan con glicanos de la invención pueden formularse para administración intravenosa o extravascular (Daugherty, et al., Formulation and delivery issues for monoclonal antibody therapeutics. Adv Drug Deliv Rev. 2006 Ago 7;58(5-6):686-706, Número de publicación de la patente de EE. UU. 2011/0135570). Las vías de administración extravascular pueden incluir, pero no se limitan a, la administración subcutánea, la administración intraperitoneal, la administración intracerebral, la administración intraocular, la administración intralesional, la administración tópica y la administración intramuscular.
Las estructuras de los anticuerpos pueden modificarse para mejorar su eficacia como terapéuticos. Las mejoras pueden incluir, pero no se limitan, la mejora de la estabilidad termodinámica, la reducción de las propiedades de unión al receptor Fc y la mejora de la eficacia de plegado. Las modificaciones pueden incluir, pero no se limitan a, sustituciones de aminoácidos, glucosilación, palmitoilación y conjugación de proteínas.
Los anticuerpos que interactúan con glicanos pueden formularse con antioxidantes para reducir la oxidación del anticuerpo. Los anticuerpos que interactúan con glicanos también pueden formularse con aditivos para reducir la agregación de proteínas. Dichos aditivos pueden incluir, pero no se limitan a, albúmina, aminoácidos, azúcares, urea, cloruro de guanidinio, polialcoholes, polímeros (tales como polietilenglicol y dextranos), tensioactivos (incluyendo, pero sin limitarse a, polisorbato 20 y polisorbato 80) o incluso otros anticuerpos.
Los anticuerpos que interactúan con glicanos de la presente invención pueden formularse para reducir el impacto del agua en la estructura y función del anticuerpo. Las preparaciones de anticuerpos en tales formulaciones pueden liofilizarse. Las formulaciones sujetas a liofilización pueden incluir carbohidratos o compuestos de poliol para proteger y estabilizar la estructura del anticuerpo. Dichos compuestos incluyen, pero no se limitan a, sacarosa, trehalosa y manitol.
Los anticuerpos que interactúan con glicanos de la presente invención pueden formularse con polímeros. En una realización, las formulaciones poliméricas pueden contener polímeros hidrófobos. Dichos polímeros pueden ser microesferas formuladas con polilactida-co-glicolida mediante un procedimiento de encapsulación sólido-en-aceite-enagua. Las microesferas que comprenden copolímero de etilvinilacetato también se contemplan para la administración de anticuerpos y pueden utilizarse para prolongar el curso temporal de la liberación de anticuerpos en el lugar de administración. En otra realización, los polímeros pueden ser geles acuosos. Estos geles pueden contener, por ejemplo, carboximetilcelulosa. Los geles acuosos también pueden comprender hidrogel de ácido hialurónico. Los anticuerpos pueden unirse covalentemente a dichos geles mediante un enlace de hidrazona que permite una liberación sostenida en los tejidos, incluyendo, pero no se limitan a, los tejidos del sistema nervioso central.
Formulaciones de péptidos y proteínas
Los anticuerpos que interactúan con glicanos de la invención pueden formularse con péptidos y/o proteínas. En una realización, péptidos tales como, pero no limitados a, péptidos penetrantes de células y proteínas y péptidos que permiten el suministro intracelular pueden utilizarse para suministrar formulaciones farmacéuticas. Un ejemplo no limitativo de un péptido penetrante celular que puede utilizarse con las formulaciones farmacéuticas de la presente invención incluye una secuencia de péptido penetrante celular unida a policationes que facilita el suministro al espacio intracelular, por ejemplo, el péptido TAT derivado del VIH, las penetratinas, los transportanos o los péptidos penetrantes celulares derivados del hCT (véase, por ejemplo, Caron et al. Ther. 3(3):310-8 (2001); Langel, Cell-Penetrating Peptides: Processes and Applications (CRC Press, Boca Raton FL, 2002); El-Andaloussi et al., Curr. Pharm. Des. 11(28):3597-611 (2003); y Deshayes et al., Cell. Mol. Life Sci. 62 (16): 1839-49 (2005)). Las composiciones también pueden formularse para incluir un agente de penetración celular, por ejemplo, liposomas, que mejoran el suministro de las composiciones al espacio intracelular. Los anticuerpos que interactúan con glicanos de la invención pueden acomplejarse con péptidos y/o proteínas tales como, pero no limitados a, péptidos y/o proteínas de Aileron Therapeutics (Cambridge, mA) y Permeon Biologics (Cambridge, MA) para permitir la administración intracelular (Cronican et al., ACS Chem. Biol. 2010 5:747-752; McNaughton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2009 106:6111-6116; Sawyer, Chem Biol Drug Des. 200973:3-6; Verdine y Hilinski, Methods Enzymol. 2012;503:3-33).
En una realización, el polipéptido penetrador de células puede comprender un primer dominio y un segundo dominio.
El primer dominio puede comprender un polipéptido supercargado. El segundo dominio puede comprender un socio de unión a proteínas. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "socio de unión a proteínas" incluye, pero no se limita a, anticuerpos y fragmentos funcionales de los mismos, proteínas de andamiaje o péptidos. El polipéptido de penetración celular puede comprender además un socio de unión intracelular para el socio de unión a proteínas. El polipéptido de penetración celular puede ser capaz de secretarse a partir de una célula en la que pueden introducirse anticuerpos que interactúan con los glicanos.
En formulaciones de la presente invención, se pueden incorporar péptidos o proteínas para aumentar la transfección celular por anticuerpos que interactúan con glicanos o alterar la biodistribución de anticuerpos que interactúan con glicanos (por ejemplo, dirigiéndose a tejidos o tipos celulares específicos).
Formulaciones celulares
Las formulaciones basadas en células de composiciones de anticuerpos que interactúan con glicanos de la invención pueden usarse para asegurar la transfección celular (por ejemplo, en el portador celular) o alterar la biodistribución de las composiciones (por ejemplo, dirigiendo el portador celular a tejidos o tipos celulares específicos).
Procedimientos de transferencia celular
Una variedad de procedimientos es conocido en la técnica y son adecuados para la introducción de ácidos nucleicos o proteínas, tales como anticuerpos que interactúan con glicanos, en una célula, incluyendo técnicas mediadas virales y no virales. Algunos ejemplos de técnicas típicas no virales incluyen, pero no se limitan a, la electroporación, la transferencia mediada por fosfato cálcico, la nucleofección, la sonoporación, el choque térmico, la magnetofección, la transferencia mediada por liposomas, la microinyección, la transferencia mediada por microproyectiles (nanopartículas), la transferencia mediada por polímeros catiónicos (DEAE-dextrano, polietilenimina, polietilenglicol (PEG) y similares) o la fusión celular.
La técnica de sonoporación, o sonicación celular, es el uso del sonido (por ejemplo, frecuencias ultrasónicas) para modificar la permeabilidad de la membrana plasmática celular. Los procedimientos de sonoporación son conocidos por los expertos y se utilizan para administrar ácidos nucleicos in vivo (Yoon y Park, Expert Opin Drug Deliv. 2010 7:321-330; Postema y Gilja, Curr Pharm Biotechnol. 20078:355-361; Newman y Bettinger, Gene Ther. 2007 14:465-475). Los procedimientos de sonoporación son conocidos en la técnica y también se enseñan, por ejemplo, en lo que se refiere a las bacterias en la Publicación de Patente de EE. UU. 20100196983 y en lo que se refiere a otros tipos de células en, por ejemplo, la Publicación de Patente de EE. UU. 20100009424.
Las técnicas de electroporación también son bien conocidas en la técnica y se utilizan para administrar ácidos nucleicos in vivo y clínicamente (Andre et al., Curr Gene Ther. 2010 10:267-280; Chiarella et al., Curr Gene Ther. 2010 10:281-286; Hojman, Curr Gene Ther. 2010 10:128-138). En una realización, los anticuerpos que interactúan con los glicanos pueden administrarse por electroporación.
Administración y suministro
Las composiciones de la presente invención se pueden administrar mediante cualquiera de los procedimientos o vías estándar conocidos en la técnica.
Los anticuerpos que interactúan con glicanos de la presente invención pueden administrarse por cualquier vía que produzca un resultado terapéuticamente eficaz. Entre ellas se incluyen, pero no se limitan a, la administración enteral, gastroenteral, epidural, oral, transdérmica, epidural (peridural), intracerebral (en el cerebro), intracerebroventricular (en los ventrículos cerebrales), epicutánea (aplicación sobre la piel), intradérmica, (en la propia piel), subcutánea (bajo la piel), administración nasal (a través de la nariz), intravenosa (en una vena), intraarterial (en una arteria), intramuscular (en un músculo), intracardíaca (en el corazón), infusión intraósea (en la médula ósea), intratecal (en el canal espinal), intraperitoneal, (infusión o inyección en el peritoneo), infusión intravesical, intravítrea, (a través del ojo), inyección intracavernosa, (en la base del pene), administración intravaginal, intrauterina, administración extraamniótica, transdérmica (difusión a través de la piel intacta para distribución sistémica), transmucosa (difusión a través de una membrana mucosa), insuflación (esnifar), sublingual, sublabial, enema, colirio (sobre la conjuntiva) o en gotas para los oídos. En determinadas realizaciones, las composiciones pueden administrarse de forma que puedan atravesar la barrera hematoencefálica, la barrera vascular u otra barrera epitelial. A continuación, se describen vías de administración no limitantes para los anticuerpos que interaccionan con glicanos de la presente invención.
Administración parenteral e inyectable
Las formas de dosificación líquidas para administración oral y parenteral incluyen, pero no se limitan a, emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y/o elixires farmacéuticamente aceptables. Además de los ingredientes activos, las formas de dosificación líquidas pueden comprender diluyentes inertes comúnmente utilizados en la técnica tales como, por ejemplo, agua u otros solventes, agentes solubilizantes y emulsionantes tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular, aceite de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán, y mezclas de los mismos. Además de los diluyentes inertes, las composiciones orales pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, aromatizantes y/o perfumantes. En ciertas realizaciones para administración parenteral, las composiciones se mezclan con agentes solubilizantes tales como CREMOPHOR®, alcoholes, aceites, aceites modificados, glicoles, polisorbatos, ciclodextrinas, polímeros y/o combinaciones de los mismos. En otras realizaciones, se incluyen tensioactivos tal como la hidroxipropilcelulosa.
Las preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles se pueden formular de acuerdo con la técnica conocida usando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados. Las preparaciones inyectables estériles pueden ser soluciones, suspensiones y/o emulsiones inyectables estériles en diluyentes y/o disolventes aceptables por vía parenteral no tóxicos, por ejemplo, tal como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear se encuentran el agua, la solución de Ringer, U.S.P., y la solución isotónica de cloruro de sodio. Los aceites fijos estériles se emplean convencionalmente como disolvente o medio de suspensión. Para este propósito, se puede emplear cualquier aceite fijo suave incluyendo mono o diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos tal como el ácido oleico se pueden utilizar en la preparación de inyectables. Las formulaciones inyectables pueden esterilizarse, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias y/o incorporando agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse o dispersarse en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes de su uso.
Para prolongar el efecto de un ingrediente activo, a menudo es deseable retardar la absorción del ingrediente activo de la inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede llevar a cabo mediante el uso de una suspensión líquida o material cristalino o amorfo con poca hidrosolubilidad. La velocidad de absorción del fármaco depende, en este caso, de su velocidad de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y de la forma cristalina. Como alternativa, la absorción retrasada de una forma del fármaco administrada por vía parenteral se logra disolviendo o suspendiendo el fármaco en un vehículo oleoso. Las formas de depósito inyectables se fabrican mediante la formación de matrices microencapsuladas del fármaco en polímeros biodegradables tal como poliláctido-poliglicólido. Dependiendo de la relación de fármaco a polímero y de la naturaleza del polímero particular empleado, se puede controlar la velocidad de liberación del fármaco. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las formulaciones inyectables de depósito se preparan atrapando el fármaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con los tejidos corporales.
Administración rectal y vaginal
Las composiciones para administración rectal o vaginal suelen ser supositorios que se pueden preparar mezclando composiciones con excipientes no irritantes adecuados, tales como manteca de cacao, polietilenglicol o una cera para supositorios que son sólidos a temperatura ambiente, pero líquidos a temperatura corporal y, por lo tanto, se derriten en el recto o en la cavidad vaginal y liberan el ingrediente activo.
Administración oral
Las formas de dosificación sólidas para administración oral incluyen cápsulas, tabletas, píldoras, polvos y gránulos. En tales formas de dosificación sólidas, un ingrediente activo se mezcla con al menos un excipiente inerte farmacéuticamente aceptable, tal como citrato de sodio o fosfato dicálcico y/o rellenos o diluyentes (por ejemplo, almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y ácido silícico), aglutinantes (por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidinona, sacarosa y acacia), humectantes (por ejemplo, glicerol), agentes desintegrantes (por ejemplo, agar, carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos y carbonato de sodio), retardantes de la solución (por ejemplo, parafina), aceleradores de absorción (por ejemplo, compuestos de amonio cuaternario), agentes humectantes (por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol), absorbentes (por ejemplo, caolín y arcilla de bentonita) y lubricantes (por ejemplo, talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato de sodio), y mezclas de los mismos. En el caso de cápsulas, tabletas y píldoras, la forma de dosificación puede comprender agentes de tampón.
Administración tópica o transdérmica
Como se describe en el presente documento, las composiciones que contienen anticuerpos que interactúan con glicanos de la invención pueden formularse para administración tópica. La piel puede ser un lugar ideal para la administración, ya que es fácilmente accesible. La expresión génica puede restringirse no sólo a la piel, evitando potencialmente la toxicidad inespecífica, sino también a capas y tipos celulares específicos dentro de la piel.
El sitio de expresión cutánea de las composiciones administradas dependerá de la ruta de administración del ácido nucleico. Se suelen considerar tres vías para administrar anticuerpos que interactúan con los glicanos en la piel: (i) aplicación tópica (por ejemplo, para tratamiento local/regional y/o aplicaciones cosméticas); (ii) inyección intradérmica (por ejemplo, para tratamiento local/regional y/o aplicaciones cosméticas); y (iii) administración sistémica (por ejemplo, para tratamiento de enfermedades dermatológicas que afectan tanto a regiones cutáneas como extracutáneas). Los anticuerpos que interactúan con los glicanos pueden administrarse a la piel mediante diversos procedimientos conocidos en la técnica.
En una realización, la invención proporciona una variedad de apósitos (por ejemplo, apósitos para heridas) o vendas (por ejemplo, vendas adhesivas) para llevar a cabo de forma conveniente y/o eficaz los procedimientos de la presente invención. Típicamente, los apósitos o vendajes pueden comprender cantidades suficientes de composiciones farmacéuticas y/o anticuerpos que interactúan con glicanos descritos en el presente documento para permitir a un usuario realizar múltiples tratamientos de un sujeto(s).
En una realización, la invención proporciona composiciones que comprenden anticuerpos que interactúan con glicanos para administrarse en más de una inyección.
Las formas de dosificación para la administración tópica y/o transdérmica de una composición pueden incluir ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles, polvos, soluciones, aerosoles, inhalantes y/o parches. Generalmente, un ingrediente activo se mezcla en condiciones estériles con un excipiente farmacéuticamente aceptable y/o cualquier conservante y/o tampón que se requiera.
Además, la presente invención contempla el uso de parches transdérmicos, que a menudo tienen la ventaja adicional de proporcionar una administración controlada de un compuesto al cuerpo. Dichas formas de dosificación se pueden preparar, por ejemplo, disolviendo y/o distribuyendo el compuesto en el medio apropiado. Como alternativa o adicionalmente, la velocidad puede controlarse proporcionando una membrana de control de la velocidad y/o dispersando el compuesto en una matriz polimérica y/o gel.
Las formulaciones adecuadas para la administración tópica incluyen, pero no se limitan a, preparaciones líquidas y/o semilíquidas tales como linimentos, lociones, aceite en agua y/o emulsiones de agua en aceite como cremas, ungüentos y/o pastas, y/o soluciones y/o suspensiones.
Las formulaciones administrables por vía tópica pueden, por ejemplo, comprender de aproximadamente 1 % a aproximadamente 10 % (p/p) de ingrediente activo, aunque la concentración de ingrediente activo puede ser tan alta como el límite de solubilidad del ingrediente activo en el solvente. Las formulaciones para administración tópica pueden comprender además uno o más de los ingredientes adicionales descritos en el presente documento.
Administración de depósitos
Como se describe en el presente documento, en algunas realizaciones, las composiciones de la presente invención se formulan en depósitos de liberación prolongada. Por lo general, la administración se dirige a un órgano o tejido específico (un "tejido objetivo").
En algunos aspectos de la invención, los anticuerpos que interactúan con los glicanos se retienen espacialmente dentro o proximalmente a un tejido objetivo. Se proporcionan procedimientos para suministrar composiciones a uno o más tejidos objetivo de un sujeto mamífero mediante el contacto de uno o más tejidos objetivo (que comprenden una o más células objetivo) con composiciones en condiciones tales que las composiciones, en particular los componentes de anticuerpos que interactúan con glicanos de las composiciones, se retienen sustancialmente en el tejido objetivo, lo que significa que al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,99 o más del 99,99 % de la composición se retiene en el tejido objetivo. Ventajosamente, la retención se determina midiendo el nivel de anticuerpos que interactúan con los glicanos presentes en las composiciones que entran en los tejidos y/o células objetivo. Por ejemplo, al menos 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 8 5 , 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9, 99,99 o más del 99,99 % de los anticuerpos que interaccionan con los glicanos administrados al sujeto están presentes intracelularmente en un periodo de tiempo posterior a la administración. Por ejemplo, la inyección intramuscular a un sujeto mamífero se realiza utilizando una composición acuosa que comprende uno o más anticuerpos que interactúan con los glicanos y un reactivo de transfección, y la retención de la composición se determina midiendo el nivel de anticuerpos que interactúan con los glicanos presentes en las células musculares.
Ciertos aspectos de la invención están dirigidos a procedimientos para proporcionar composiciones a tejidos objetivo de sujetos mamíferos, contactando los tejidos objetivo (que contienen una o más células objetivo) con composiciones bajo condiciones tales que las composiciones son sustancialmente retenidas en el tejido objetivo. Las composiciones contienen una cantidad eficaz de anticuerpos que interaccionan con los glicanos, de forma que se produce el efecto de interés en al menos una célula objetivo. Las composiciones generalmente contienen agentes de penetración celular y un portador farmacéuticamente aceptable, aunque también se contemplan anticuerpos "desnudos" que interactúan con glicanos (tales como anticuerpos que interactúan con glicanos sin agentes de penetración celular u otros agentes).
En algunas realizaciones, las composiciones incluyen una pluralidad de diferentes anticuerpos que interactúan con glicanos, donde uno o más de uno de los anticuerpos que interactúan con glicanos se dirige a un glicano de interés. Opcionalmente, las composiciones también contienen agentes de penetración celular para ayudar al suministro intracelular de las composiciones. Se determina la dosis de composición necesaria para dirigirse a los glicanos de interés en un porcentaje sustancial de células contenidas dentro de un volumen predeterminado del tejido objetivo (generalmente, sin orientarse a los glicanos en el tejido adyacente al volumen predeterminado, o distalmente a los tejidos objetivo). Tras esta determinación, la dosis determinada puede introducirse directamente en el tejido del sujeto mamífero.
En una realización, la invención proporciona anticuerpos que interactúan con glicanos para ser administrados en más de una inyección o por inyecciones de dosis divididas.
Administración pulmonar
Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar, envasar y/o vender en formulaciones adecuadas para la administración pulmonar a través de la cavidad bucal. Dichas formulaciones pueden comprender partículas secas que comprenden además ingredientes activos y que tienen un diámetro en el intervalo de aproximadamente 0,5 nm a aproximadamente 7 nm o de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 6 nm. Tales composiciones están adecuadamente en forma de polvos secos para la administración usando un dispositivo que comprende un depósito de polvo seco al que se puede dirigir una corriente de propulsor para dispersar el polvo y/o usando un recipiente dispensador de disolvente/polvo autopropulsado tal como un dispositivo que comprende el ingrediente activo disuelto y/o suspendido en un propulsor de bajo punto de ebullición en un recipiente sellado. Dichos polvos comprenden partículas en las que al menos 98 % de las partículas en peso tienen un diámetro superior a 0,5 nm y al menos 95 % de las partículas en número tienen un diámetro inferior a 7 nm. Alternativamente, al menos 95 % de las partículas en peso tienen un diámetro superior a 1 nm y al menos 90 % de las partículas en número tienen un diámetro inferior a 6 nm. Las composiciones de polvo seco pueden incluir un diluyente de polvo fino sólido tal como azúcar y se proporcionan convenientemente en forma de dosis unitaria.
Los propulsores de bajo punto de ebullición generalmente incluyen propulsores líquidos que tienen un punto de ebullición menor que 65 °F a presión atmosférica. Generalmente, el propulsor puede constituir del 50 % al 99,9 % (p/p) de la composición y el ingrediente activo puede constituir del 0,1 % al 20 % (p/p) de la composición. Un propulsor puede comprender además ingredientes adicionales tales como un tensioactivo líquido no iónico y/o aniónico sólido y/o un diluyente sólido (que puede tener un tamaño de partícula del mismo orden que las partículas que comprenden el ingrediente activo).
Las composiciones farmacéuticas formuladas para administración pulmonar pueden proporcionar un ingrediente activo en forma de gotitas de una solución y/o suspensión. Dichas formulaciones pueden prepararse, envasarse y/o venderse como soluciones y/o suspensiones acuosas y/o alcohólicas diluidas, opcionalmente estériles, que comprenden ingrediente activo, y pueden administrarse convenientemente usando cualquier dispositivo de nebulización y/o atomización. Dichas formulaciones pueden comprender además uno o más ingredientes adicionales, incluyendo, pero sin limitarse a, un agente aromatizante tal como sacarina sódica, un aceite volátil, un agente tampón, un agente tensioactivo o un conservante tal como metilhidroxibenzoato. Las gotas proporcionadas por esta vía de administración pueden tener un diámetro promedio en el intervalo de aproximadamente 0,1 nm a aproximadamente 200 nm.
Administración intranasal, nasal y bucal
Las formulaciones descritas en el presente documento como útiles para la administración pulmonar son útiles para la administración intranasal de una composición farmacéutica. Otra formulación adecuada para administración intranasal es un polvo grueso que comprende el ingrediente activo y tiene una partícula promedio de aproximadamente 0,2 pm a 500 pm. Tal formulación se administra de la misma manera que se toma el rapé, es decir, por inhalación rápida a través de las fosas nasales desde un recipiente del polvo que se mantiene cerca de la nariz.
Las formulaciones adecuadas para la administración nasal pueden, por ejemplo, comprender desde aproximadamente un 0,1 % (p/p) hasta un 100 % (p/p) de ingrediente activo, y pueden comprender uno o más de los siguientes ingredientes descritos en el presente documento. Una composición farmacéutica se puede preparar, envasar y/o vender en una formulación adecuada para la administración bucal. Dichas formulaciones pueden, por ejemplo, estar en forma de comprimidos y/o pastillas fabricadas utilizando procedimientos convencionales y pueden, por ejemplo, contener del 0,1 % al 20 % (p/p) de ingrediente activo, comprendiendo el resto una composición oralmente soluble y/o degradable y, opcionalmente, uno o más de los ingredientes adicionales descritos en el presente documento. Alternativamente, las formulaciones adecuadas para la administración bucal pueden comprender un polvo y/o una solución y/o suspensión aerosolizada y/o atomizada que comprende el ingrediente activo. Tales formulaciones en polvo, aerosolizadas y/o aerosolizadas, cuando se dispersan, pueden tener un tamaño promedio de partículas y/o gotas en el intervalo de aproximadamente 0,1 nm a aproximadamente 200 nm, y pueden comprender además uno o más de los ingredientes adicionales descritos en el presente documento.
Administración oftálmica u ótica
Se puede preparar, envasar y/o vender una composición farmacéutica en una formulación adecuada para administración oftálmica u ótica. Dichas formulaciones pueden, por ejemplo, estar en forma de gotas para los ojos o los oídos que incluyen, por ejemplo, una solución y/o suspensión al 0,1/1,0 % (p/p) del ingrediente activo en un excipiente líquido acuoso u oleoso. Dichas gotas pueden comprender además agentes de tampón, sales y/o uno o más de los ingredientes adicionales descritos en el presente documento. Otras formulaciones administrables oftálmicamente que son útiles incluyen aquellas que comprenden el ingrediente activo en forma microcristalina y/o en una preparación liposomal. También pueden utilizarse inserciones subretinianas como forma de administración.
Administración de la carga útil
Los anticuerpos que interactúan con glicanos descritos en el presente documento pueden usarse en varios escenarios diferentes en los que se desea el suministro de una sustancia (la "carga útil") a un objetivo biológico, por ejemplo, el suministro de sustancias detectables para la detección del objetivo, o el suministro de un agente terapéutico o de diagnóstico. Los procedimientos de detección pueden incluir, pero no limitarse a, procedimientos de obtención de imágenes in vitro e in vivo, por ejemplo inmunohistoquímica, formación de imágenes por bioluminiscencia (BLI), formación de imágenes por resonancia magnética (IRM), tomografía por emisión de positrones (PET), microscopía electrónica, tomografía computarizada por rayos X, formación de imágenes Raman, tomografía de coherencia óptica, formación de imágenes por absorción, formación de imágenes térmicas, formación de imágenes por reflectancia de fluorescencia, microscopía de fluorescencia, formación de imágenes por tomografía molecular de fluorescencia, formación de imágenes por resonancia magnética nuclear, formación de imágenes por rayos X, formación de imágenes por ultrasonidos, formación de imágenes fotoacústicas, ensayos de laboratorio o en cualquier situación en la que sea necesario el marcado/la tinción/la formación de imágenes.
Los anticuerpos que interactúan con glicanos pueden diseñarse para incluir tanto un enlazador como una carga útil en cualquier orientación útil. Por ejemplo, se utiliza un enlazador con dos extremos para unir un extremo a la carga útil y el otro extremo al anticuerpo que interactúa con el glicano. Los anticuerpos que interactúan con glicanos de la invención pueden incluir más de una carga útil, así como un enlazador escindible. En otro ejemplo, un fármaco que puede estar unido a anticuerpos que interactúan con glicanos mediante un enlazador y puede estar marcado con fluorescencia puede utilizarse para rastrear el fármaco in vivo, por ejemplo, intracelularmente.
Otros ejemplos incluyen, pero no se limitan a, el uso de anticuerpos que interactúan con glicanos en la administración reversible de fármacos a las células.
Los anticuerpos que interactúan con glicanos descritos en el presente documento pueden usarse para dirigir intracelularmente una carga útil, por ejemplo, agentes detectables o terapéuticos, a orgánulos específicos. Además, los anticuerpos que interaccionan con glicanos descritos en el presente documento pueden utilizarse para administrar agentes terapéuticos a células o tejidos, por ejemplo, en animales vivos. Por ejemplo, los anticuerpos que interactúan con glicanos descritos en el presente documento pueden utilizarse para administrar agentes quimioterapéuticos con el fin de destruir células cancerosas. Los anticuerpos que interactúan con glicanos unidos a agentes terapéuticos mediante enlazadores pueden facilitar la permeación de los miembros, permitiendo que el agente terapéutico se desplace dentro de una célula para alcanzar un objetivo intracelular.
En algunas realizaciones, la carga útil puede ser un agente terapéutico tal como una citotoxina, ion radioactivo, quimioterapéutico u otro agente terapéutico. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que pueda ser perjudicial para las células. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenipósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracinediona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, puromicina, maytansinoides, por ejemplo, maytansinol (véase Pat. de EE. UU.. No.
5,208,020), raquelmicina (CC-1065, véase la Pat de EE. UU. Nos. 5,475,092, 5,585,499y 5,846,545), y análogos u homólogos de los mismos. Los iones radiactivos incluyen, pero no se limitan a, yodo (por ejemplo, yodo 125 o yodo 131), estroncio 89, fósforo, paladio, cesio, iridio, fosfato, cobalto, itrio 90, samario 153 y praseodimio. Otros agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo decarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tiotepa clorambucil, raquelmicina (CC-1065), melfalán, carmustina (BSNU), lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (antes daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (antes actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)) y agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina, vinblastina, taxol y maytansinoides). En el caso de los anticuerpos anti-STn de la presente invención, la eliminación de tumores puede potenciarse mediante la conjugación de una toxina con dichos anticuerpos anti-STn.
En algunas realizaciones, la carga útil puede ser un agente detectable, tales como diversas moléculas orgánicas pequeñas, compuestos inorgánicos, nanopartículas, enzimas o sustratos de enzimas, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes (por ejemplo, luminol), materiales bioluminiscentes (por ejemplo, luciferasa, luciferina y aequorina), materiales quimioluminiscentes, materiales radiactivos (por ejemplo, 18F, 67Ga, 81mKr, 82Rb, 111In, 123I, 133Xe, 201Tl, 125I, 35S, 14C, 3H, o 99mTc (por ejemplo, como pertecnetato (tecnetato(VII),TcO4')), y agentes de contraste (por ejemplo, oro (por ejemplo, nanopartículas de oro), gadolinio (por ejemplo, Gd quelado), óxidos de hierro (por ejemplo, óxido de hierro superparamagnético (SPIO), nanopartículas de óxido de hierro monocristalino (MION) y óxido de hierro superparamagnético ultrapequeño (USPIO)), quelatos de manganeso (por ejemplo, Mn-DPDP), sulfato de bario, medios de contraste yodados (iohexol), microburbujas o perfluorocarburos). Tales etiquetas ópticamente detectables incluyen, por ejemplo, sin limitación, ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatostilbeno-2,2'disulfónico; acridina y derivados (por ejemplo, acridina e isotiocianato de acridina); ácido 5(2'-aminoetil)aminaonaftaleno-1-sulfónico (EDANS); 4-amino-N-[3-vinilsulfonil)fenil]naftalimida-3,5 disulfonato; N-(4-anilino-1-naftil)maleimida; antranilamida; BODIPY; Amarillo Brillante; cumarina y derivados (por ejemplo, cumarina, 7-amino-4-metilcumarina (AMC, cumarina 120), y 7-amino-4-trifluorometilcumarina (cumarina 151)); colorantes de cianina; cianosina; 4',6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI); 5' 5"-dibromopirogalol-sulfonaftalina (Bromopirogalol Rojo); 7-diethylamino-3-(4'-isotiocianatofenil)-4-metilcumarina; pentaacetato de dietilentriamina; ácido 4,4'-isotiocianatodihidroestilbeno-2,2'-disulfónico; ácido 4,4'-isotiocianatostilbeno-2,2'-disulfónico; cloruro de 5-[dimetilamino]-naftaleno-1-sulfonilo (DNS, cloruro de dansilo); 4-dimetilaminofenofenozofenil-4'-isotiocianato (DABITC); eosina y derivados (por ejemplo, eosina e isotiocianato de eosina); eritrosina y derivados (por ejemplo, eritrosina B e isotiocianato de eritrosina); etidio; fluoresceína y derivados (por ejemplo, 5-carboxifluoresceína (FAM), 5-(4,6-diclorotriazin-2-il)aminofluoresceína (DTAF), 2',7'-dimetoxi-4'5'-dicloro-6-carboxifluoresceína, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, 5-(y 6)-isotiocianato de X-rodamina (QFITC o XRITC) y fluorescamina); 2-[2-[3-[[1,3-dihidro-1,1 -dimetil-3-(3-sulfopropil)-2H-benz[e]indol-2-ilideno]etilideno]-2-[4-(etoxicarbonil)-1 -piperazinil]-1-ciclopenten-1-il]etenil]-1,1-dimetil-3-(3-sulforpropil)-1H-benz[e]indolio hidróxido, sal interna, compuesto con n,ndiethiletanamina(1:1) (IR144); perclorato de 5-cloro-2-[2-[(5-cloro-3-etil-2(3H)-benzotiazol- ylideno)etilideno]-2-(difenilamino)-1 -ciclopenten-1 -il]etenil]-3-etil benzotiazolio (IR140); Isotiocianato de Verde de Malaquita; ortocresolftaleína de 4-metilumbeliferona; nitrotirosina; pararosanilina; Rojo de Fenol; B-ficoeritrina; oftaldialdehído; pireno y derivados(por ejemplo, pireno, butirato de pireno y succinimidil 1-pireno); puntos cuánticos de butirato; Rojo Reactivo 4 (CIBACRON™ Brilliant Red 3B-A); rodamina y derivados (por ejemplo, 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxirrodamina (R6G), lisamina rodamina B cloruro de sulfonilo rodamina (Rhod), rodamina B, rodamina 123, isotiocianato de rodamina X, sulforhodamina B, sulforhodamina 101, cloruro de sulfonilo derivado de la sulforhodamina 101 (Texas Red), N,N,N',N'tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA) tetrametil rodamina y tetrametil isotiocianato de rodamina (TRITC)); riboflavina; ácido rosólico; derivados de quelato de terbio; cianina-3 (Cy3); cianina-5 (Cy5); cianina-5.5 (Cy5.5), cianina-7 (Cy7); IRD 700; IRD 800; Alexa 647; La Jolta Blue; ftalocianina; y naftalocianina.
En algunas realizaciones, el agente detectable puede ser un precursor no detectable que se vuelve detectable al activarse (por ejemplo, constructos fluorogénicos de tetrazina-fluoróforo (por ejemplo, tetrazina-BODIPY FL, tetrazina-Oregon Green 488, o tetrazina-BODIPY TMR-X) o agentes fluorogénicos activables por enzimas (por ejemplo, PROSENSE® (VisEn Medical)). Los ensayos in vitro en los que pueden utilizarse las composiciones marcadas con enzimas incluyen, pero no se limitan a, ensayos inmunoenzimáticos (ELISA), ensayos de inmunoprecipitación, inmunofluorescencia, inmunoensayos enzimáticos (EIA), radioinmunoensayos (RIA) y análisis Western blot.
Combinaciones
Los anticuerpos que interactúan con glicanos pueden usarse en combinación con uno o más agentes terapéuticos, profilácticos, de diagnóstico o de imagen. Por "en combinación con", no se pretende implicar que los agentes deban administrarse al mismo tiempo y/o formularse para la administración juntos, aunque estos procedimientos de administración están dentro del alcance de la presente divulgación. Las composiciones se pueden administrar al mismo tiempo, antes o después de uno o más de otros procedimientos terapéuticos o médicos deseados. En general, cada agente se administrará en una dosis y/o en un horario determinado para ese agente. En algunas realizaciones, la presente divulgación abarca la administración de composiciones farmacéuticas, profilácticas, de diagnóstico y/o de formación de imágenes en combinación con agentes que pueden mejorar su biodisponibilidad, reducir y/o modificar su metabolismo, inhibir su excreción y/o modificar su distribución. dentro del cuerpo
Dosificación
La presente divulgación abarca la administración de anticuerpos que interactúan con glicanos para cualquiera de los fines terapéuticos, farmacéuticos, de diagnóstico o de formación de imágenes por cualquier ruta apropiada teniendo en cuenta los avances probables en las ciencias de la administración de fármacos. El suministro puede ser desnuda o formulada.
Entrega al desnudo
Los anticuerpos que interactúan con glicanos de la presente invención pueden administrarse a células, tejidos, órganos u organismos en forma desnuda. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "desnudo" se refiere a los anticuerpos que interactúan con glicanos y que se administran libres de agentes o modificaciones que promuevan la transfección o la permeabilidad. Los anticuerpos que interaccionan con glicanos desnudos pueden administrarse a células, tejidos, órganos y/u organismos utilizando vías de administración conocidas en la técnica y descritas en el presente documento. La administración desnuda puede incluir la formulación en un tampón simple como solución salina o PBS.
Suministro formulado
Los anticuerpos que interactúan con glicanos de la presente invención pueden formularse utilizando los procedimientos descritos en el presente documento. Las formulaciones pueden comprender anticuerpos que interactúan con los glicanos, que pueden estar modificados y/o no modificados. Las formulaciones pueden incluir, además, pero no limitarse a, agentes de penetración celular, portadores farmacéuticamente aceptables, agentes de liberación, polímeros bioerodibles o biocompatibles, disolventes y depósitos de liberación sostenida. Los anticuerpos formulados que interaccionan con los glicanos pueden administrarse a las células utilizando vías de administración conocidas en la técnica y descritas en el presente documento.
Las composiciones también pueden ser formuladas para la administración directa a órganos o tejidos en cualquiera de varias maneras en la técnica incluyendo, pero no limitado a, remojo directo o baño, a través de un catéter, por geles, polvo, ungüentos, cremas, geles, lociones, y/o gotas, mediante el uso de sustratos tales como tela o materiales biodegradables recubiertos o impregnados con composiciones, y similares.
Dosificación
La presente invención proporciona procedimientos que comprenden la administración de uno o más anticuerpos que interactúan con glicanos de acuerdo con la invención a un sujeto que los necesite. Los ácidos nucleicos que codifican anticuerpos que interactúan con glicanos, proteínas o complejos que comprenden anticuerpos que interactúan con glicanos, o composiciones farmacéuticas, de formación de imágenes, diagnósticas o profilácticas de los mismos, pueden administrarse a un sujeto utilizando cualquier cantidad y cualquier vía de administración eficaz para prevenir, tratar, diagnosticar o crear imágenes de una enfermedad, trastorno y/o afección. La cantidad exacta requerida variará de un sujeto a otro, dependiendo de la especie, la edad y el estado general del sujeto, la gravedad de la enfermedad, la composición particular, su modo de administración, su modo de actividad y similares. Las composiciones de acuerdo con la invención se formulan típicamente en forma de unidades de dosificación para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. Sin embargo, se entenderá que el médico tratante decidirá el uso diario total de las composiciones de la presente invención dentro del alcance del buen juicio médico. El nivel de dosis de formación de imágenes específico terapéuticamente efectivo, profilácticamente efectivo o apropiado para cualquier paciente en particular dependerá de una variedad de factores que incluyen el trastorno que se está tratando y la gravedad del trastorno; la actividad del compuesto específico empleado; la composición específica empleada; la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente; el tiempo de administración, vía de administración y velocidad de excreción del compuesto específico empleado; la duración del tratamiento; fármacos utilizados en combinación o coincidentes con el compuesto específico empleado; y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.
En ciertas realizaciones, las composiciones de acuerdo con la presente invención se pueden administrar a niveles de dosificación suficientes para administrar de aproximadamente 0,0001 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, o de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg, del peso corporal del sujeto por día, una o más veces al día, para obtener el efecto terapéutico, de diagnóstico, profiláctico o de formación de imágenes deseado. La dosis deseada puede administrarse tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, cada dos días, cada tres días, cada semana, cada dos semanas, cada tres semanas o cada cuatro semanas. En ciertas realizaciones, la dosificación deseada se puede suministrar utilizando múltiples administraciones (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o más administraciones).
De acuerdo con la presente invención, los anticuerpos que interactúan con glicanos pueden administrarse en regímenes de dosis divididas. Tal como se utiliza en el presente documento, una "dosis dividida" es la división de la dosis unitaria única o la dosis diaria total en dos o más dosis, por ejemplo, dos o más administraciones de la dosis unitaria única. Tal como se utiliza en el presente documento, una "dosis unitaria única" es una dosis de cualquier fármaco administrada en una dosis/en un momento/por una única vía/en un único punto de contacto, es decir, en un único acto de administración. Tal y como se utiliza en el presente documento, una "dosis diaria total" es una cantidad administrada o prescrita en un periodo de 24 horas. Puede administrarse como dosis unitaria única. En una realización, los anticuerpos que interaccionan con glicanos de la presente invención se administran a un sujeto en dosis divididas. Los anticuerpos que interactúan con glicanos pueden formularse sólo en tampón o en una formulación descrita en el presente documento. Las composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos que interaccionan con los glicanos descritos en el presente documento pueden formularse en una forma de dosificación descrita en el presente documento, tal como una forma tópica, intranasal, intratraqueal o inyectable (por ejemplo, intravenosa, intraocular, intravítrea, intramuscular, intracardíaca, intraperitoneal o subcutánea). Pueden encontrarse consideraciones generales sobre la formulación y/o fabricación de agentes farmacéuticos, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005.
Recubrimientos o carcasas
Las formas de dosificación sólidas de comprimidos, grageas, cápsulas, píldoras y gránulos se pueden preparar con recubrimientos y cubiertas tales como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de formulación farmacéutica. Opcionalmente pueden comprender agentes opacificantes y pueden ser de una composición que liberan los ingredientes activos solo, o preferentemente, en una determinada parte del tracto intestinal, opcionalmente, de manera retardada. Los ejemplos de composiciones de inclusión que se pueden usar incluyen sustancias poliméricas y ceras. Se pueden emplear composiciones sólidas de un tipo similar como agentes de carga en cápsulas de gelatina rellenas blandas y duras usando excipientes tales como lactosa o azúcar de leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.
IV. Kits y dispositivos
Kits
Cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento puede estar comprendida en un kit. En un ejemplo no limitante, los reactivos para generar anticuerpos que interactúan con glicanos, incluyendo las moléculas de antígeno, se incluyen en un kit. El kit puede incluir además reactivos o instrucciones para crear o sintetizar anticuerpos que interactúen con los glicanos. También puede incluir uno o más tampones. Otros kits de la invención pueden incluir componentes para fabricar arreglos o bibliotecas de anticuerpos, proteínas o ácidos nucleicos que interactúan con los glicanos y, por lo tanto, pueden incluir, por ejemplo, un soporte sólido.
Los componentes de los kits pueden envasarse en medio acuoso o en forma liofilizada. Los medios contenedores de los kits incluirán generalmente al menos un vial, tubo de ensayo, matraz, botella, jeringa u otro medio contenedor, en el que pueda colocarse un componente, y preferentemente, alicuotar adecuadamente. Cuando hay más de un componente en el kit (el reactivo de etiquetado y la etiqueta pueden envasarse juntos), el kit también contendrá generalmente un segundo, tercer u otro recipiente adicional en el que los componentes adicionales pueden colocarse por separado. Los kits también pueden incluir un segundo recipiente para contener un tampón estéril farmacéuticamente aceptable y/u otro diluyente. No obstante, un vial puede contener diversas combinaciones de componentes. Los kits de la presente invención también incluirán típicamente un medio para contener los anticuerpos que interactúan con los glicanos, por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos y cualquier otro recipiente de reactivos en estrecho confinamiento para su venta comercial. Dichos recipientes pueden incluir recipientes de plástico moldeados por inyección o soplado en los que se conservan los viales deseados.
Cuando los componentes del kit se proporcionan en una y/o más soluciones líquidas, la solución líquida es una solución acuosa, siendo particularmente preferida una solución acuosa estéril. Sin embargo, los componentes del kit pueden suministrarse como polvo(s) seco(s). Cuando los reactivos y/o componentes se suministran en forma de polvo seco, el polvo puede reconstituirse mediante la adición de un disolvente adecuado. Se prevé que el disolvente también puede proporcionarse en otro medio de recipiente. En algunas realizaciones, los colorantes de etiquetado se suministran en forma de polvo seco. Se contempla que en los kits de la invención se proporcionen 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 microgramos o al menos 1000 microgramos o como máximo 10 g de colorante seco. A continuación, el colorante puede resuspenderse en cualquier disolvente adecuado, tal como DMSO.
Un kit puede incluir instrucciones para emplear los componentes del kit, así como el uso de cualquier otro reactivo no incluido en el kit. Las instrucciones pueden incluir variaciones que pueden aplicarse.
Dispositivos
Cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento puede combinarse, recubrirse o incrustarse en un dispositivo. Los dispositivos incluyen, pero no se limitan a, implantes dentales, endoprótesis, prótesis óseas, articulaciones artificiales, válvulas, marcapasos u otros dispositivos terapéuticos implantables.
V. Equivalentes y alcance
En las reivindicaciones, los artículos tales como “un/una” y “el/la” pueden significar uno o más de uno a menos que se indique lo contrario o sea evidente por el contexto. Las afirmaciones o descripciones que incluyen “o” entre uno o más miembros de un grupo se consideran satisfechas si uno, más de uno o todos los miembros del grupo están presentes, se emplean o son importantes por lo demás para un producto o un procedimiento determinado, a menos que se indique lo contrario o sea evidente por el contexto. La invención incluye realizaciones en las que exactamente un miembro del grupo está presente, se emplea o es importante por lo demás para un producto o un procedimiento determinado. La invención incluye realizaciones en las que más de uno, o la totalidad de los miembros del grupo, están presentes, se emplean o son relevantes de otro modo para un producto o procedimiento determinado.
También se observa que el término "que comprende" pretende ser abierto y permite, pero no requiere la inclusión de elementos o pasos adicionales. Cuando se utiliza el término "que comprende", también se incluye el término "que consiste en".
Cuando se dan intervalos, se incluyen puntos finales. Adicionalmente, se debe entender que a menos que se indique lo contrario o sea evidente a partir del contexto y la comprensión de un experto en la técnica, los valores que se expresan como rangos pueden asumir cualquier valor o subrango específico dentro de los rangos establecidos en diferentes realizaciones de la invención, a la décima parte de la unidad del límite inferior del rango, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Además, debe entenderse que cualquier realización particular de la presente invención que se encuentre dentro de la técnica anterior puede excluirse explícitamente de una o más de las reivindicaciones. Dado que tales realizaciones se consideran conocidas para un experto en la técnica, pueden excluirse incluso si la exclusión no se establece explícitamente en el presente documento. Cualquier realización particular de las composiciones de la invención (por ejemplo, cualquier ácido nucleico o proteína codificada por el mismo; cualquier procedimiento de producción; cualquier procedimiento de uso; etc.) puede excluirse de una o más reivindicaciones, por cualquier motivo, relacionado o no con la existencia de estado de la técnica.
Los títulos de las secciones y tablas no pretenden ser limitativos.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Análisis de arreglos de glicanos
Los arreglos de glicanos optimizadas se utilizan para probar la afinidad y especificidad de los anticuerpos para múltiples glicanos en un solo experimento. Las matrices de glicanos utilizadas en el presente documento incluyen arreglos que comprenden 71 glicanos sintetizados químicamente y bien definidos, la mayoría de los cuales comprenden pares de glicanos Neu5Ac y Neu5Gc. Los portaobjetos de arreglos se obtienen comercialmente (ArrayIt Corp, Sunnyvale, CA) e incluyen los glicanos enumerados en la tabla siguiente.
T l : rr l li n
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Se preparan 300 ml de tampón de bloqueo epoxi combinando 15 ml de tampón Tris 2 M (pH 8) con 0,9 ml de etanolamina 16,6 M y 284,1 ml de agua destilada La solución se lleva a un pH final de 9,0 con HCl. La solución se filtra utilizando una membrana de nitrocelulosa de 0,2 pM. La solución tampón epoxídica y 1 L de agua destilada se precalientan a 50°C. Los portaobjetos de vidrio se colocan en un portaobjetos y se sumergen rápidamente en una cubeta de tinción con el tampón de bloqueo epoxídico calentado. Los portaobjetos se incuban en el tampón de bloqueo de epoxi durante 1 hora a 50 °C con agitación periódica para desactivar los sitios de unión de epoxi. A continuación, se enjuagan los portaobjetos y se bloquean con PBS con 1 % de OVA a 25 °C durante una hora. Las muestras de suero con anticuerpos policlonales (1:1000) o anticuerpos monoclonales purificados (1ug/ml), se diluyen en PBS con 1 % de OVA y se añaden al arreglo de glicanos durante una hora a 25 °C. Tras un lavado exhaustivo, la unión de los anticuerpos se detecta incubando los portaobjetos del microarreglo de glicanos con IgG antiratón conjugado con Cy3 (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) durante una hora. A continuación, los portaobjetos se lavan abundantemente, se secan y se escanean con un escáner Genepix 4000B (láser al 100 %; ganancia a 350; píxeles de 10 pm). Los datos brutos de las imágenes escaneadas se extraen utilizando el software Genepix y se lleva a cabo el análisis de los datos brutos. Se considera que los anticuerpos son altamente específicos para AcSTn y GcSTn si demuestran unión a ambas moléculas, pero no a Tn ni a ningún otro glicano del arreglo.
Basándose en el análisis del arreglo, los anticuerpos se clasifican de acuerdo con el perfil de unión a glicanos del arreglo. Los anticuerpos se clasifican como anticuerpos del "Grupo 1", capaces de unirse a AcSTn y GcSTn, si se unen a los glicanos 5, 6, 23 y 24. Dichos anticuerpos se denominan anticuerpos Pan-STn debido a su capacidad para asociarse con una gama más amplia de estructuras STn y la porción de STn indicada por el óvalo grande en la Fig. 1A. Los anticuerpos se clasifican como anticuerpos del "Grupo 2", capaces de unirse a STn, así como a algunas estructuras relacionadas que incluyen un enlace O a serina o treonina, si se unen a los glicanos 5, 6, 23, 24, 27 y 31. Se cree que estos anticuerpos se asocian con la porción de STn indicada por el óvalo grande en la Fig. IB. Algunos anticuerpos del Grupo 2 se unen preferentemente a estructuras con AcSTn antes que a estructuras con GcSTn. Los anticuerpos se clasifican como anticuerpos del "Grupo 3" (capaces de unirse a STn, pero también pueden unirse a un conjunto más amplio de estructuras relacionadas) si se unen a los glicanos 5, 6, 23, 24, 17, 3, 19, 37, 27 y 31. A diferencia de los anticuerpos del Grupo 2, los del Grupo 3 no requieren que dichas estructuras tengan un enlace O con la serina o la treonina. Se cree que los anticuerpos del Grupo 3 se asocian con la porción de STn indicada por el óvalo grande en la Fig. 1C. Por último, los anticuerpos son anticuerpos del "Grupo 4", capaces de unirse tanto al AcSTn como al GcSTn, así como al antígeno Tn no sialilado (por lo tanto, tienen una especificidad más amplia) si se unen a los glicanos 5, 6, 23, 24 y 47. Se cree que los anticuerpos del Grupo 4 se asocian con la porción de STn indicada por el óvalo grande en la Fig. 1D.
Ejemplo 2. Análisis de la unión de anticuerpos mediante citometría de flujo
El análisis basado en citometría de flujo se lleva a cabo para dilucidar la curva dosis-respuesta para la unión de anticuerpos a antígenos de la superficie celular. Para estos análisis se emplean diversas líneas celulares.
Las células MDA-MB-231 son células humanas de cáncer de mama. Se cultivan en medio esencial mínimo de Earle suplementado con 10 % de suero fetal de ternera (FCS), 100 pg/ml de penicilina, 100 Ul/ml de estreptomicina y 45 pg/ml de gentamicina. Las células MCF-7 también son células humanas de cáncer de mama y se cultivan en las mismas condiciones que las células MDA-MB-231. Versiones transfectadas de forma estable de células MDA-MB-231 y MCF-7 (clon TAH3.P10 para células MDA-MB-231 y clon A12.1 para células MCF-7) que sobreexpresan GalNAc a2,6-sialiltransferasa (ST6GalNAc 1,) también se cultivan en las mismas condiciones con la excepción de una adición de 1mg/ml de G418 para mantener las células que expresan el transgén. ST6GalNAc 1 es una enzima capaz de sialilar GalNAc. Como resultado de la sobreexpresión, las células transfectadas expresan altos niveles de Neu5Ac-STn (véase Julien, S. et al., Glycoconjugate journal. 2001. 18, 883-93).
Las células E3 son células murinas de cáncer de mama. Se cultivan en medio E4 de Dulbecco con un 10 % de FCS. Versiones transfectadas de forma estable de células E3 que expresan altos niveles de Neu5Gc-STn (E3-STn) se cultivan con 600 pg/ml de G418 y 200 pg/ml de higromicina. Durante el crecimiento y el mantenimiento de las células experimentales, la tripsina no se utiliza para el paso de células.
También se utilizan células OV90 y OVCAR3. Se trata de líneas celulares de cáncer de ovario humano, descritas anteriormente.
También se utilizan células SNU-16. Se trata de líneas celulares de cáncer gástrico que expresan bajos niveles de STn.
Para el análisis, las células son cosechadas usando StemPro Accutase (Life Technologies, Carlsbad, CA) y lavadas con PBS que contiene 5 % de FBS antes de ser peletizadas por centrifugación ligera. El número de células y su viabilidad se determinan mediante un análisis de exclusión del colorante azul tripán y las concentraciones celulares se ajustan a 5 * 106 células/ml en PBS con un 5 % de FBS. Se añaden 50 pl de células a cada pocillo de una placa de ensayo. Las células se combinan con soluciones de 50 pl del anticuerpo analizado o de anticuerpos de control y se incuban durante 1 hora a 4 °C. Las células se lavan y transforman en pellas dos veces con PBS con 5 % de FBS antes de tratarlas con 100 pl de PBS con 5 % de FBS que contienen una dilución 1:1.500 de IgG anti-ratón (Southern Biotech, Birmingham, Alabama) conjugada con aloficocianina (APC). Las células se incuban durante 30 min a 4 °C antes de lavarlas y resuspenderlas en 200 pl de yoduro de propidio (PI) diluido 1:1000 en PBS con 5 % de FBS. A continuación, las células tratadas se someten a un análisis de citometría de flujo y se adquieren 10.000 eventos por cada muestra.
Ejemplo 3: Inmunización con antígenos alternativos y adyuvantes
Se llevó a cabo un estudio de inmunización para desarrollar anticuerpos contra STn. Se aclimataron 40 ratones C57BL/6 o Balb/C de tipo silvestre (hembras, 6-8 semanas de edad) durante al menos 3 días y tuvieron acceso a una dieta estándar (2920X.10, Global 18 % Protein Rodent Diet, Harlan, San Diego, CA) y agua acidificada (pH 2,7-3,0) ad libitum durante todo el periodo de estudio. Los ratones se dividieron en 4 grupos de 10 ratones cada uno (un total de 8 grupos). Los ratones se inmunizron de acuerdo con el diseño del estudio que se muestra en la siguiente Tabla, utilizando PSM (incluyendo PSM digerido) y/u OSM a una dosis de 10 pg mezclado con adyuvantes. Los adyuvantes incluían el adyuvante de Freund (completo o incompleto) o adyuvantes mejorados compuestos por AbiSCO-100 (12pg) y ODN-2395 (50pg).
Tabla 7: Diseño del estudio
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Los ratones se distribuyeron aleatoriamente en grupos de tratamiento individuales en función del peso corporal y el sexo. Las vacunas se administraron mediante inyecciones subcutáneas (SC) alrededor de las axilas y las regiones inguinales (50 pl por sitio, 4 sitios para un total de 200 pl por ratón). Cada ratón recibió 4 inmunizaciones en los días 0, 14, 28 y 42 mediante inyección subcutánea durante el periodo de estudio. Cada ratón se inmunizó con 10 pg de PSM, PSM digerido o antígeno OSM que se mezcló con 12 pg de AbiSCO-100 y 50pg de ODN-2395. Después de la 4a inyección subcutánea, se inmunizó a cada ratón con 10 pg de PSM, PSM digerido u OSM solo por vía intraperitoneal (IP) el día 63, 64 o 70 como inmunización final para cada ratón, dependiendo del animal o grupo seleccionado. El calendario de vacunación detallado se presenta en la siguiente tabla.
Además, se determinaron el peso corporal y las observaciones de salud de cada ratón dos veces por semana. Se extrajo sangre de todos los animales antes de la inmunización en cada fecha de inmunización, excepto para el último refuerzo (es decir, la 5a inmunización por IP) durante el periodo de estudio. La última muestra de sangre se recogió el día 51.
Durante cada extracción de sangre, se recogieron aproximadamente 0,2 ml de sangre total por sangrado de la vena facial y se colocaron en tubos separadores de suero. A continuación, los tubos se mantuvieron a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos para permitir la coagulación. A continuación, el suero se dividió en alícuotas de igual volumen y se almacenó a -80 °C hasta su análisis.
Tabla 8: Calendario de vacunación
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Se determinó el título sérico anti-STn utilizando un ELISA anti-STn murino de mucina submaxilar bovina (BSM) (con o sin tratamiento con periodato) junto con los perfiles séricos observados mediante microarreglos de glicanos. Se recubrieron placas de 96 pocillos con 1 pg/pocillo de BSM y se incubaron durante la noche a 4 °C. La O-acetilación del antígeno BSM se eliminó tratando los pocillos con hidróxido de sodio 0,1 M. La unión específica a la STn se determinó mediante el tratamiento de los pocillos con periodato sódico. El tratamiento con periodato destruye la cadena lateral C6 del ácido siálico; por lo que los anticuerpos contra STn no deberían unirse a los pocillos tratados con periodato. Los pocillos se bloquearon con PBS al 1 % de ovoalbúmina (OVA). Las muestras de suero que se iban a analizar se diluyeron en serie en PBS al 1 % de OVA. Como control positivo se utilizó un anticuerpo monoclonal anti-STn de ratón disponible en el mercado, 3F1 (SBH Sciences, Natick, MA). Este anticuerpo también se diluyó en serie en PBS con 1 % de OVA. Para la preparación de las muestras de control negativo se utilizó una agrupación de suero de ratones ingenuos de tipo silvestre. La detección de anticuerpos anti-STn presentes en el suero se determinó utilizando un anticuerpo policlonal IgG anti-ratón de cabra conjugado con HRP (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA). La reacción se detuvo mediante la adición de ácido sulfúrico (1,6 M). Las densidades ópticas se midieron a 490 nm utilizando un lector de microplacas Spectramax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). El título sérico se obtuvo por comparación de los valores de densidad óptica con un valor de corte calculado como dos desviaciones estándar por encima de la media de los valores de densidad óptica del control negativo. Las pruebas de muestras se consideraron positivas si el valor medio de densidad óptica era superior al valor de corte.
Se seleccionaron ratones con altos títulos de anticuerpos anti-STn para las fusiones de hibridoma. Las hibridomas resultantes se analizaron mediante ELISA BSM (con o sin tratamiento con periodato para indicar anticuerpos capaces de diferenciar entre las variantes 9-O-acetiladas de STn) como se ha descrito anteriormente. Los hibridomas seleccionados se subclonaron y los subclones se caracterizaron adicionalmente mediante ELISA y análisis de citometría de flujo (utilizando células MDA-MB-231 que expresan STn, como se ha descrito previamente, o utilizando células OV90) para identificar si los anticuerpos producidos por dichas células son capaces de unirse al Grupo 1, 2, 3 o 4 de epítopo (véase la Fig. 1). Los datos de caracterización obtenidos para anticuerpos seleccionados se presentan en la siguiente Tabla. En la Tabla, NB indica que se observó una unión débil o nula y ND indica que no se determinó un valor.
T l : ELI A l n n i r n i- Tn r riz i n r i m rí fl
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Los resultados de la caracterización del arreglo de glicanos se presentan en la siguiente Tabla. Se indica el nivel más alto de señal obtenido para cada anticuerpo durante el análisis del arreglo de glicanos, así como el grupo resultante y la determinación de la especificidad basada en los glicanos a los que se asoció cada anticuerpo y la intensidad de la señal obtenida para cada glicano. La determinación del grupo se realizó de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 1. Las determinaciones de especificidad también tienen en cuenta la intensidad de asociación con estructuras Ac frente a estructuras Gc.
Tabla 10: Datos de caracterización del arreglo de glicanos anti-STn
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Los subclones que expresan anticuerpos capaces de unir STn se sometieron a análisis de secuencia de aminoácidos y nucleótidos (véase el siguiente Ejemplo).
Ejemplo 4: Pares de dominios variables
Los clones secuenciados produjeron pares de dominios variables con las secuencias de aminoácidos presentadas en la siguiente Tabla. "ND" indica que no se ha determinado la secuencia.
Tabla 11: Pares de dominios variables
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Se determinaron las CDR para cada dominio variable y se presentan en la siguiente Tabla. Cada fila presenta un conjunto de seis CDR identificadas para cada clon.
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E je m p lo 5. A n á lis is p o r c ito m e tr ía d e flu jo d e la in te rn a liza c ió n d e an tic u e rp o s
Se realiza un análisis de citometría de flujo para cuantificar el grado de internalización del anticuerpo. Para el análisis, las variantes transfectadas de forma estable de células MDA-MB-231 (clon TAH3.P10) que expresan altos niveles de Neu5Ac-STn unido a la superficie celular se recogen utilizando EDTA 10 mM y se lavan con PBS que contiene 1 % de BSA antes de la precipitación por centrifugación ligera. El número de células y su viabilidad se determinan mediante un análisis de exclusión del colorante azul tripán y las concentraciones celulares se ajustan a 5 * 106 células/ml en PBS con un 1 % de BSA. Se añaden 50 pl de células a cada pocillo de una placa de ensayo. Las células se combinan con soluciones de 50 pl de anticuerpo o anticuerpo marcado con fluorescencia y se incuban durante 1 hora a 4 °C. Tras este periodo de incubación, las células se lavan con PBS para eliminar el anticuerpo no unido y se extraen alícuotas para incubarlas durante diversos tiempos (15, 30, 60 minutos) a 37 °C para permitir que el anticuerpo unido se internalice a una temperatura fisiológicamente relevante. Después de cada incubación, el anticuerpo unido a la superficie celular se elimina tratando las células con medio ácido (150 mM NaCl, pH = 2,5). Las células tratadas con anticuerpo no marcado se lavan con PBS y se fijan con tampón de fijación de paraformaldehído (PFA) que contiene 3 % de paraformaldehído y 2 % de sacarosa en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente. Estas células se enjuagan de nuevo en PBS y se tratan con tampón de bloqueo compuesto de PBS con 1 % de seroalbúmina bovina (BSA). Las células se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente, se enjuagan con PBS y se tratan con anticuerpo secundario (IgG de cabra anti-ratón marcado con aloficocianina) durante 2 horas a temperatura ambiente. A continuación, todas las células se lavan con PBS y se someten a un análisis de citometría de flujo en el que se registran 10.000 eventos por cada muestra. La señal fluorescente residual en las muestras tratadas con ácido se apaga aún más mediante el tratamiento con colorante azul tripán.
E je m p lo 6. E va lu a c ió n d e la in te rn a liza c ió n d e a n tic u e rp o s m e d ia n te e n s a y o d e v ia b ilid a d c e lu la r
Se realizan ensayos de viabilidad celular para examinar anticuerpos anti-STn de la presente invención en presencia y ausencia de conjugados secundarios anticuerpo-fármaco (2°ADCs). El objetivo del cribado es identificar la capacidad de cada anticuerpo anti-STn para inhibir el crecimiento celular. Los anticuerpos con potente inhibición del crecimiento celular se utilizan para diseñar conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) directos. El uso de estos conjugados secundarios anticuerpo-fármaco (2°a Dc ) en ensayos citotóxicos celulares permite realizar rápidamente un cribado previo de muchos candidatos a ADC frente a células tumorales. Según el ensayo, se añade directamente un candidato a anticuerpo desnudo a las células en presencia de un 2°ADC. La internalización del complejo mAb/2°ADC en células que expresan una alta densidad del antígeno objetivo puede lograr una liberación del fármaco en el interior de las células dependiente de la dosis, provocando un efecto citotóxico para destruir las células (por ejemplo, células tumorales), mientras que las células que expresan una baja densidad del antígeno objetivo no se ven afectadas (por ejemplo, células normales).
Para realizar los ensayos de viabilidad celular, se preparan las líneas celulares descritas en la presente solicitud (MDA-MB-231 parental, MDA-MB-231-STn+ y OV-90) y se cultivan para los ensayos. El cultivo celular se optimiza para la densidad celular sembrando diferentes densidades de células (por ejemplo, 2.000, 4.000 y 7.500 por pocillo) en una placa de 96 pocillos y observando el crecimiento celular durante 96 horas. Se identifican las condiciones de cultivo en las que las células alcanzan alrededor del 90 % de confluencia al final de las 96 horas y se utiliza el número óptimo de células en el ensayo de viabilidad final.
Los anticuerpos se prueban en una o más líneas celulares en presencia y ausencia de un 2°ADC tal como Fab aMFc-CL-MMAF. Para probar cada candidato a anticuerpo se utilizan placas duplicadas o triplicadas para cada línea celular.
Para los ensayos de viabilidad celular, se recogen puntos de datos para cada anticuerpo candidato con duplicados para cada punto de datos. Cada anticuerpo candidato se diluye en concentraciones seriadas de 0,3pM a 20nM. En el ensayo de viabilidad se utiliza una cantidad constante de Fab aMFc-CL-MMAF (40 nM).
Alternativamente, se recogen puntos de datos para cada anticuerpo candidato con triplicados para cada punto de datos. Cada anticuerpo candidato se diluye en concentraciones seriadas de 1 pM a 20 nM. En el ensayo de viabilidad se utiliza una cantidad constante de Fab aMFc-CL-MMAF (40 nM).
La viabilidad celular se mide mediante ensayos basados en luminiscencia Cell-Titer Glo.
E je m p lo 7. D e m o s tra c ió n d e la c a p a c id a d d e d e s tru c c ió n tu m o ra l in vivo
La capacidad de destruir tumores in vivo se demuestra con líneas celulares tumorales de ratón y/o humanas. Las líneas celulares tumorales que expresan los objetivos STn se transfieren a ratones y se determina la capacidad de los anticuerpos candidatos para destruir los tumores resultantes.
Las líneas celulares de ratón utilizadas in vivo en ensayos de destrucción tumoral incluyen la línea celular de adenocarcinoma de colon de ratón, MC38, derivada de ratones C57BL/6 y transfectada de forma estable con ST6 (alfa-N-acetil-neuraminil-2,3-beta-galactosil-1,3)-N-acetilgalactosaminida alfa-2,6-sialiltransferasa 1 (ST6GalNac1).
Estas células se alimentan con ácido siálico (Neu5Ac y/o Neu5Gc, dependiendo del objetivo) antes de su uso en ensayos de destrucción tumoral in vivo utilizando ratones Cmahy_ singénicos.
Alternativamente, para ensayos de destrucción tumoral in vivo, líneas celulares de cáncer de mama humano (T47-D, MCF-7 o MDA-MB-231) inducidas para expresar un alto nivel de STn se transfieren a células inmunodeficientes FOXN1 -/-(desnudas), células de diabéticos no obesos (NOD) o ratones con inmunodeficiencia severa (SCID).
La ADCC in vivo es inducida por transferencia pasiva de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) o células asesinas naturales (NK) purificadas. En los casos en que los anticuerpos candidatos se unen de forma inespecífica al tejido de ratones de tipo silvestre, se crían ratones inmunodeficientes en el fondo Cmah -/-.
Ejemplo 8. Construcción y selección de bibliotecas de fagos
El ARN se prepara a partir de bazos cosechados de ratones con una fuerte respuesta inmune a la inmunización. Las regiones variables (V) de ratón se amplifican por PCR y se ensamblan en constructos de expresión de scFv. Las secuencias de ScFv se clonan en vectores de expresión de fagémidos que permiten la expresión de scFv en la superficie de partículas de fago M13. La biblioteca resultante se transforma en E. coli (TG1). Se cultivan transformaciones a granel de E. coli y se preparan fagos mediante rescate de fagos. En la primera ronda de selección, los fagos del medio de cultivo se purifican por precipitación con PEG.
Los scFvs candidatos se seleccionan utilizando procedimientos de selección negativa y positiva. Para la selección negativa, la biblioteca se incuba con mucina STn-negativa "destruida" (por ejemplo, PSM tratada químicamente). Para la selección positiva, la biblioteca se incuba con mucina GcSTn (por ejemplo, PSM y/o BSM desacetilada), mucina AcSTn (por ejemplo, OSM y/o BSM desacetilada) o BSM (y/o BSM desacetilada) y un glicano sintético (Neu5Gc y/o Neu5Ac) en presencia de un Neu5Ac o Neu5Gc (dependiendo del objetivo deseado).
Después de 3-4 rondas de selección con concentraciones de antígeno reductoras, se analizan 1000 clones por ELISA para la unión a STn (por ejemplo, Neu5Ac y/o Neu5Gc) utilizando objetivos de glicanos sintéticos y naturales. Los candidatos a fagos/scFv principales se prueban en un ensayo celular secundario basado en citometría de flujo para la unión a GcSTn y/o AcSTn utilizando células Jurkat con o sin "inducción" de GcSTn o AcSTn. Hasta 20 scFv candidatos de interés seleccionados se someten a análisis posteriores.
Los candidatos scFv principales se seleccionan para su conversión a IgG. Las regiones variables de cada scFv se clonan en vectores de expresión de mamíferos entre un promotor CMV corriente arriba y una región constante de inmunoglobulina corriente abajo. El vector de cadena pesada incluye regiones constantes IgG1 y k murinas. Los vectores se transfectan transitoriamente en células HEK293/EBNA. Las muestras de anticuerpos se purifican y caracterizan mediante la unión a epítopos de glicanos positivos y negativos. Se analizan muestras de hasta 0,5 mg de cada IgG entera.
Ejemplo 9. Optimización de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos
Los genes que codifican las regiones variables de una IgG seleccionada se clonan en vectores de expresión de mamíferos que codifican regiones Fc humanas (hulgGlK) que contienen mutaciones de aminoácidos conocidas por potenciar la unión al receptor Fc y la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC). Los vectores se transfectan transitoriamente en células HEK293/EBNA. Al cabo de 2-7 días, se cuantifica la expresión de IgG y se purifican muestras de anticuerpo en columnas de proteína A. A continuación, los anticuerpos se prueban en ensayos ADCC. Se utilizan líneas celulares Jurkat que expresan Neu5Gc y Neu5Ac como células objetivo y células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) como fuente de células efectoras. Las células objetivo se valoran utilizando la lisis celular máxima para determinar la densidad celular óptima para su uso en el ensayo en formato de placa multipared. El anticuerpo mutado ADCC junto con la IgG no mutada se preincuban con las células objetivo, a continuación, se añaden las células efectoras en proporciones variables de células objetivo: efectoras, y los cultivos se incuban a 37 °C. El porcentaje de viabilidad se determina mediante la liberación del colorante Calcein-AM (BD Biosciences, San Jose, CA). Las muestras de hasta 0,5 mg de IgG mutada por ADCC se someten a análisis posteriores.
Ejemplo 10. Producción del anticuerpo principal a partir de una línea celular HEK semiestable
Las regiones variables de IgG se clonan en vectores de expresión de mamíferos entre un promotor CMV corriente arriba y una región constante de inmunoglobulina corriente abajo. El vector de cadena pesada incluye regiones constantes IgG1 y k murinas. Los vectores se transfectan transitoriamente en células HEK293/EBNA y los títulos de anticuerpos se evalúan a las 72 horas. Las células HEK293/EBNA transfectadas transitoriamente se seleccionan con higromicina para establecer un sistema de expresión semiestable. Las células semiestables se expanden a 10 litros. Los anticuerpos se purifican a partir del sobrenadante del cultivo mediante proteína A, se dializan en PBS y la preparación resultante se analiza para detectar (1) agregados mediante cromatografía analítica de exclusión por tamaño (SEC), (2) niveles de endotoxinas mediante análisis de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) (expresados como EU/mg), y (3) unión al antígeno en el ensayo primario.
Ejemplo 11. Ensayos adicionales para el cribado de candidatos a scFv por afinidad al objetivo
Los ScFv candidatos se someten a procedimientos de cribado adicionales para afinidad STn (pan-STn, AcSTn y/o GcSTn) usando una variedad de objetivos propuestos.
Cribado de objetivos de glicanos sintéticos
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "cribado de objetivos" se refiere al uso de una sustancia objetivo para identificar socios de unión para dicha sustancia. El cribado de objetivos de glicanos sintéticos se lleva a cabo utilizando antígenos objetivo STn deseados unidos a poli(ácido acrílico) (PAA) con una etiqueta de biotina. Los antígenos objetivo STn no deseados, así como la Tn unida a PAA con una etiqueta de biotina, se utilizan como controles negativos. Las células asociadas a los scFvs candidatos se aíslan mediante precipitación con entidades asociadas a avidina.
Cribado de objetivos de glicanos naturales en células vivas
El cribado de objetivos utilizando células vivas se lleva a cabo utilizando células Jurkat alimentadas con ácido siálico (Neu5Gc y/o Neu5Ac, dependiendo del objetivo de anticuerpo deseado) o células Jurkat alimentadas con una forma alternativa de ácido siálico (Neu5Gc y/o Neu5Ac, dependiendo del objetivo de anticuerpo deseado) como control negativo. El cribado de objetivos con células vivas también se lleva a cabo utilizando células MCF-7 o MDA-MB-231 alimentadas con ácido siálico (Neu5Gc y/o Neu5Ac, dependiendo del objetivo de anticuerpo deseado o de si se está utilizando para el cribado de control negativo) y transfección estable. La citometría de flujo se utiliza en ambos casos para aislar las células asociadas a los scFv candidatos.
Cribado de objetivos de glicanos naturales en tejidos (ex vivo)
El cribado de objetivos utilizando tejido ex vivo se lleva a cabo utilizando muestras de tejido de biopsia. La unión de los candidatos a scFv con el tejido ex vivo se analiza mediante procedimientos inmunohistoquímicos estándar. Se utilizan secciones individuales de tejido, así como secciones de microarreglos de tejido. Las muestras se tratan con o sin sialidasa y/o periodato en los experimentos de control.
Ejemplo 12. Humanización de anticuerpos
Las cadenas pesadas y ligeras totalmente humanizadas se diseñan con las CDR presentadas en el presente documento. Los modelos proteínicos de las regiones variables se generan utilizando estructuras de anticuerpos existentes como plantillas. Se comparan segmentos de secuencias de aminoácidos de la región variable de las cadenas pesada y ligera de partida con secuencias humanas para su posible inclusión en las secuencias totalmente humanizadas. Las series de regiones variables de cadenas pesada y ligera humanizadas están diseñadas íntegramente a partir de segmentos de secuencias de regiones variables humanas con el objetivo de que se eviten los epítopos de células T. Se descartan los segmentos de secuencias humanas variantes con una incidencia significativa de epítopos potenciales de células T según lo determinado por las tecnologías in silico.
Los genes humanizados de la región variable de las cadenas pesada y ligera se construyen a partir de oligonucleótidos superpuestos ensamblados en genes de longitud completa utilizando la reacción en cadena de la ligasa (LCR). Los productos LCR se amplifican y se añaden sitios de restricción adecuados para su clonación en vectores de expresión. Los productos de la PCR se clonan en vectores intermedios y se confirman mediante secuenciación.
Para la construcción de plásmidos de expresión que codifican anticuerpos totalmente humanizados con regiones constantes humanas, se insertan secuencias de ADN para cada región variable en vectores de expresión de mamíferos entre un promotor/reforzador inmediato/temprano de citomegalovirus (CMV IE) corriente arriba más la secuencia señal de inmunoglobulina y un gen de región constante de inmunoglobulina corriente abajo. Se preparan muestras de ADN para su transfección en células de mamífero.
Para la generación de líneas celulares y la selección de anticuerpos principales totalmente humanizados, se transfectan pares de ADN plasmídico de cadena pesada y ligera en células de mamífero (NS0). Se amplían las líneas celulares productoras de anticuerpos humanizados y se purifican las muestras de anticuerpos. Los anticuerpos se prueban en ensayos de unión primarios y secundarios para determinar los principales candidatos a anticuerpos. Los 3 principales candidatos se utilizan para el análisis posterior.
Ejemplo 13. Pruebas de inmunogenicidad
Los anticuerpos líderes se someten a ensayos de células T humanas de anticuerpos enteros EpiScreen (Antitope, Paradise Valley, AZ) utilizando un mínimo de 20 muestras de sangre de donantes voluntarios sanos. La inmunogenicidad de los anticuerpos principales se compara con la de los anticuerpos quiméricos de control con regiones variables de anticuerpos de partida y regiones constantes humanas coincidentes. Los datos se comparan con los datos de proteínas completas de EpiScreen para productos biológicos en fase clínica.
Ejemplo 14. Desarrollo de líneas celulares
Se desarrollan líneas celulares con la capacidad de producir altos niveles de anticuerpo sin glicosilación no humana debido a la inactivación del gen CMAH. Las líneas celulares se modifican con glicoingeniería para aumentar la ADCC. Estas líneas celulares tienen la capacidad de funcionar en producción a pequeña y gran escala.
Ejemplo 15. Inhibición dependiente de anticuerpos de la tolerancia inmunitaria de las células tumorales STnpositivas
Los anticuerpos anti-STn de la presente invención se proporcionan y utilizan para contactar con células tumorales y tejidos que comprenden glicanos STn. Aumenta la orientación inmunodependiente de las células tumorales STn.
Ejemplo 16. Tratamiento de tumores inmunotolerantes mediante anticuerpos anti-STn
Un sujeto con glicanos STn expresados sobre y alrededor de células tumorales es tratado con un anticuerpo anti-STn de la presente invención. Disminuye la tolerancia inmunitaria de las células tumorales del sujeto.
Ejemplo 17. Generación de anticuerpos S3F
Los anticuerpos S3F IgG2a se generaron mediante la combinación de dominios variables 3F1 IgG1 (SBH Biosciences, Natick, MA) con regiones de dominio constante de anticuerpos IgG2. Se secuenciaron los dominios variables de las cadenas pesada y ligera de 3F1 y se generaron constructos que codificaban los dominios variables de 3F1 corriente arriba de los vectores de expresión de IgG2, el plásmido H1206 (LakePharma, Belmont, CA) para las cadenas pesadas de anticuerpos y el plásmido L1206 (LakePharma, Belmont, CA) para las cadenas ligeras de anticuerpos. Las secuencias relacionadas se presentan en la siguiente tabla.
T l 1 : n i iliz n l n r i n l n i r F I 2
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Los plásmidos que codifican secuencias de aminoácidos de cadena pesada completa S3F y los plásmidos que codifican secuencias de aminoácidos de cadena ligera completa S3F se transfectaron en células de ovario de hámster chino-Kl (CHO-K1) para la generación de líneas celulares estables que expresan anticuerpos IgG2a S3F. Las células se cultivaron en un incubador humidificado con 5 % de CO2 a 37 °C en medios químicamente definidos (CD-CHO, Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementados con L-glutamina.
Aproximadamente 80 millones de células CHO en suspensión, creciendo en fase logarítmica, fueron transfectadas por electroporación (MaxCyte) con 80 |jg de plásmido total que codifica las cadenas pesada y ligera de longitud completa de S3F. Veinticuatro horas después, las células transfectadas se sometieron a selección para la integración estable de los genes de anticuerpos. Durante el procedimiento de selección, las células se centrifugaron y resuspendieron en medio de selección fresco cada 2-3 días hasta que la agrupación recuperó su tasa de crecimiento y viabilidad. Se controló el crecimiento, el título y la integración estable de los constructos de expresión de anticuerpos en las células. La tasa de duplicación fue de 20 horas.
Se realizaron dos escalados de producción a pequeña escala utilizando las células transfectadas de forma estable. Las células se escalaron para su producción en medio de crecimiento OptiCHO CD (Invitrogen). El producto se produjo a un título de aproximadamente 12 mg por litro. La tasa de duplicación fue de 20 horas. El sobrenadante de los medios condicionados recogidos de la producción de transfección transitoria se clarificó mediante centrifugación. La proteína se pasó por una columna de proteína A y se eludió utilizando dos formulaciones de tampón diferentes (tampón citrato y tampón HEPES). Se filtró con un filtro de membrana de 0,2 jm . Se realizó una cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) para ambas formulaciones (véase la siguiente tabla).
Tabla 14: Datos SEC
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Se cultivaron líneas celulares estables para la producción a gran escala y se produjeron 10 L de cultivo. El medio condicionado cosechado de la producción de la agrupación de células estables se clarificó mediante centrifugación y filtración por membrana de 0,2 |jm. El anticuerpo se purificó mediante cromatografía de afinidad con proteína A, después se esterilizó y se limpió de partículas pasándolo por un filtro de membrana de 0,2 jm . Tras la purificación y filtración con baja endotoxina, la concentración se fijó en 5 mg/ml y se recuperaron 120 mg de anticuerpo S3F.
Ejemplo 18. Caracterización de líneas de células madre cancerosas de carcinoma y subfracciones de CSC mediante niveles de expresión de antígenos STn utilizando anticuerpos anti-STn
Para probar la viabilidad del presente enfoque inmunoterapéutico único para la erradicación de las CSC, se emplean líneas celulares de carcinoma ovárico humano y sus subfracciones de CSC asociadas como población celular objetivo.
Para identificar líneas celulares de carcinoma ovárico apropiadas y subfracciones de CSC a partir de estas líneas celulares identificadas, para un análisis in vitro adicional de la eficacia del anticuerpo anti-STn, se analizan diferentes líneas celulares de cáncer ovárico humano incluyendo SKOV3, OVCAR3, OVCAR4, OV90 y A2870 para la expresión de biomarcadores de CSC ovárica: CD44 y CD133, mediante citometría de flujo. Las subfracciones de CSC ováricas CD44 y/o CD133 positivas/expresadas se someten entonces a pruebas adicionales para determinar los niveles de coexpresión del antígeno STn de superficie celular utilizando anticuerpos específicos anti-STn, por ejemplo, anticuerpos anti-STn S3F y mAb recombinante 18D2 pan anti-STn IgG2a [R18D2; versión IgG2a de 18D2 (que es una IgG2b) descrita en la publicación internacional No. WO2015/054600]. Las subfracciones de CSC que muestran una fuerte tinción anti-STn se purifican mediante clasificación celular y se someten a pruebas adicionales para determinar los atributos de las células madre. Las subfracciones de CSC seleccionadas se someten a pruebas de características "similares a las de las células madre" mediante ensayos seriados de trasplante de formación de colonias. A continuación, se identifican las subfracciones STn+ que demuestran una capacidad superior de formación de colonias para los experimentos de eficacia. Además de los ensayos de formación de colonias, también se analizan el ciclo celular y la quimiorresistencia.
Para verificar esto, se aíslan fracciones de CSC de líneas celulares de cáncer de ovario basadas en marcadores de superficie (CD44, CD133) conocidos por enriquecer las CSC en cáncer de ovario. Se utilizan cinco líneas celulares diferentes de cáncer de ovario (SKOV3, OV90, OVCAR3, OVCAR4 y A2870). Sólo OV90, OVCAR4 y OVCAR3 albergan subfracciones de células que expresan CD133 y/o CD44 que muestran algún aspecto de propiedades similares a las de las células madre. Estas líneas celulares de cáncer de ovario se someten a análisis de citometría de flujo (a través de Aria) utilizando el software FlowJo y la clasificación a través de múltiples estrategias.
Para caracterizar la expresión de STn en subfracciones de CSC que expresan CD44 y/o CD133, se utiliza citometría de flujo de las líneas celulares parentales junto con anticuerpos conjugados con fluoróforos contra CD44 y CD133 (Miltenyl Biotech, Cambridge, MA) para preparar subfracciones que expresan uno o ambos de estos marcadores, así como una fracción en la que no se expresa ninguno de estos marcadores. Posteriormente, se utiliza mAb S3F conjugado con fluoróforo para determinar los niveles de marcaje STn de estas subfracciones mediante procedimientos estándar. Se prueban varias concentraciones de S3F conjugado junto con experimentos de curso temporal para establecer las condiciones óptimas de unión celular. Se utilizan anticuerpos apropiados conjugados con fluoróforos, de isotipo coincidente, como controles para establecer la tinción de fondo. Las células marcadas se resuspenden en tampón PBS y se someten a análisis de citometría de flujo utilizando un instrumento BD FACSAria y el software FlowJo 7.6.5 (Treestar, Ashland, OR).
En consecuencia, estos análisis se utilizan para caracterizar las subfracciones definidas por CD44/133 de las CSC ováricas en términos de coexpresión de STn.
Además, las mismas líneas celulares descritas anteriormente se someten a una clasificación FACS basada en fracciones de células STn+ y STn-, seguida de una segunda clasificación basada en la expresión de CD44 y CD133. Estas ocho subfracciones se siembran en un ensayo de formación de colonias. Está bien aceptado que se cree que las células madre se replican con poca frecuencia, dando lugar únicamente a un número limitado de células hijas que acaban dando lugar al grueso de la población de células tumorales. Esta propiedad se ha explotado ampliamente para identificar y rastrear células madre. Las colonias se dejan formar durante 3-4 semanas y se cuentan al microscopio tras una tinción de una noche con 1 mg/ml de cloruro de nitroazul de tetrazolio en PBS. La eficacia de formación de colonias se calcula dividiendo el número de colonias por el número total de células sembradas y multiplicando por 100.
La metodología de trasplante en serie in vitro se lleva a cabo según lo descrito por Padler-Karavani et al (Padler-Karavani et al., Cancer research, 2011, 71, 3352-3363; y Friel et al., Cell cycle, 2008, 7, 242-249). Las placas de cultivo que contienen capas inferiores de agar Noble se utilizan para sembrar subfracciones celulares clasificadas a una densidad de siembra de 1 * 104 en capas superiores de agar Noble. Los cultivos se incuban en un ambiente humidificado con 5 % de CO2 a 37 °C. Tras aproximadamente 4 semanas en cultivo, las células se cuentan al microscopio tras una tinción de una noche con 1 mg/ml de cloruro de nitroazul de tetrazolio en PBS y se repiten como se ha indicado anteriormente. El trasplante en serie in vitro se prolonga durante varios pasajes (en función de las características de cada línea celular). Las células CD44+ y/o CD133+ que coexpresan STn muestran una mayor ventaja en la formación de colonias que las subfracciones celulares CD44-/CD133-/STn-, CD44+/CD133-/STn-, CD44+/CD133+/STn-, CD44-/CD133+/STn- y CD44-/CD133-/STn+.
Se analizan otras líneas celulares en cuanto a su potencial para la síntesis de STn mediante PCR para medir la expresión de la única enzima conocida como responsable de su biosíntesis, es decir, la sialiltransferasa ST6GalNAc I. Se aísla ARN de subfracciones congeladas y clasificadas tal como se cultivaron inicialmente y se prepara ADNc mediante procedimientos estándar antes de la PCR cuantitativa. Primero se prueba un conjunto de genes de mantenimiento (por ejemplo, PUM1, RPLP0, ACTB) para determinar cuál es el más apropiado (es decir, para determinar cuáles son los que se expresan de forma más homogénea en todas las subfracciones celulares) para utilizarlo como referencia interna. A continuación, se mide la expresión de ST6GalNAc I utilizando un conjunto de sondas PCR validadas por su eficacia en el procedimiento. Cada subfracción se compara además con controles positivos, incluyendo el ADNc de ST6GalNAc I insertado en plásmidos bacterianos, y el a Rn total de células de cáncer de mama transfectadas de forma estable con ADNc de ST6GalNAc I como se describe (Julien et al., Glycoconjugate journal, 2001, 18, 883-893). A partir de los niveles de ARNm de ST6GalNac I, se manipulan las condiciones de cultivo para garantizar la expresión de STn en la superficie celular y se realizan estudios para su posterior análisis.
Los estudios se utilizan para definir los niveles de expresión de STn en las diversas subfracciones de CSC según lo determinado por el análisis citométrico de flujo de tres CSC de carcinoma ovárico CD44/CD133 positivas. Además, se llevan a cabo ensayos de formación de colonias de trasplante en serie para comparar las propiedades características similares a las células madre de las subfracciones de c Sc de estas tres líneas. En función de los niveles de expresión de STn y de la capacidad de formación de colonias de la subfracción STn+, se eligen dos de las tres líneas celulares ováricas para ensayos funcionales in vitro e in vivo.
Ejemplo 19. Determinación de la actividad anti-CSC de mAbs murinos anti-STn in vitro
La capacidad proliferativa de las subfracciones STn+ y la actividad anti-CSC de los anti-STn mAbs (por ejemplo, S3F) se prueban in vitro. Se realiza una serie de experimentos in vitro para evaluar los efectos del tratamiento con mAb sobre la proliferación de células madre y la destrucción inducida por ADC de subfracciones de CSC y líneas celulares progenitoras. En ensayos apropiados, los anti-STn mAbs se combinan con agentes quimioterápicos de uso habitual (por ejemplo, carboplatino, paclitaxel).
Con el fin de optimizar los ensayos posteriores utilizados para determinar el efecto del anticuerpo S3F anti-STn sobre las subfracciones de CSC, se realizan ensayos de proliferación esencialmente como se describe (Friel et al., Cell cycle, 2008, 7, 242-249). Las ocho combinaciones de subfracciones de CSC seleccionadas posibles de cada una de las dos líneas celulares de carcinoma ovárico seleccionadas más las células de las dos líneas parentales se siembran por triplicado (diluciones que comienzan en 5 *103 células/pocillo) en placas de cultivo de 24 pocillos. Las células viables, determinadas por exclusión con azul tripán, se cuentan utilizando un hemocitómetro y/o un lector de placas mediante el ensayo MTT los días 1, 3, 5, 7, 8 y 9, o más si es necesario. Se utiliza la prueba t de Student para comparar grupos y las comparaciones con un valor p de < 0,05 se consideran significativas. A partir de los resultados, se diseñan protocolos subobjetivos para realizar ensayos de citotoxicidad.
Se realizan ensayos de citotoxicidad para evaluar la sensibilidad de las ocho subfracciones clasificadas STn+ y STnde cada línea celular, así como de las líneas parentales al S3F mAb solo, S3F paclitaxel carboplatino o a la combinación de agentes quimioterapéuticos solos. S3F (junto con un anticuerpo irrelevante de isotipo similar como control) se prueba en varias diluciones a partir de 0,1 pM. Los agentes quimioterapéuticos se utilizan a 0,1, 1,0, 10 y 100 nM. También se incluyen grupos de control con vehículos apropiados y los ensayos se realizan esencialmente como se ha descrito anteriormente (Friel et al., Cell cycle, 2008, 7, 242-249). Las subfracciones de CSC clasificadas se siembran por triplicado en placas de cultivo de 24 pocillos con el número de células determinado en ensayos de proliferación celular y se deja que alcancen una confluencia del 50 %. A continuación, las células se dejan en ayunas durante 24 horas, tras lo cual se añaden agentes inhibidores. La viabilidad celular se determina como se ha indicado anteriormente en los días 2, 4 y 5, o más si es necesario. Se utiliza la prueba t de Student para comparar grupos y las comparaciones con un valor p de < 0,05 se consideran significativas.
La capacidad proliferativa de todas las combinaciones posibles de subfracciones definidas por marcadores de CSC (CD44, CD133 y STn), así como las líneas celulares parentales, se mide y se utiliza para establecer protocolos para evaluar el efecto del anticuerpo anti-STn (+/- quimioterapia estándar) sobre estas células. Las células positivas para marcadores de células madre tienen una capacidad proliferativa reducida en comparación con las líneas parentales y las subfracciones negativas para antígenos de CSC. Se determina el efecto anti-CSC del S3F con formato ADC (+/-quimioterapia estándar) y su(s) mecanismo(s) de acción.
Ejemplo 20: Determinación de la actividad anti-CSC del anti-STn murino in vivo
Para determinar si los anticuerpos STn murinos poseen actividad antitumoral in vivo como resultado de dirigirse a las CSC, se realizan experimentos de toxicología y farmacología in vivo en ratones. Se establecen y analizan las condiciones de crecimiento de las subfracciones de CSC en ratones NOD/SCID. Los anticuerpos anti-STn se administran a ratones como conjugados con quimioterapia y se comprueba la eficacia tóxica de los ratones tratados mediante observaciones y pesos de los ratones.
Una cantidad equivalente de células de subfracciones positivas o negativas diluidas en serie (es decir,1*105, 1x104, y I x io 3; 2-8 ratones/grupo) se inyectan por vía subcutánea (s.c.) en ratones NOD/SCID, para comparar su potencial para generar tumores. Tras la inyección de las células tumorales, los ratones son sometidos a un seguimiento diario para comprobar la formación de tumores y su estado general de salud. Para el tratamiento, se pueden generar tumores en ratones de hasta cuatro fuentes: 1) tumores ováricos primarios; 2) tumores xenoinjertados previamente establecidos en ratones NOD/SCID; 3) tejido tumoral xenoinjertado criopreservado; o 4) líneas celulares de cáncer de ovario humano o subfracciones de líneas celulares aisladas con base en la expresión de CD133/STn. Para cada tipo de tumor, una vez que un número suficiente de ratones tiene tumores de un volumen comprendido entre 200 y 300mm3, los ratones se distribuyen aleatoriamente en 4 grupos (n=8-14 ratones/grupo) de forma que los volúmenes medios de los tumores de los grupos sean esencialmente equivalentes. El primer grupo recibe un control de anticuerpo de isotipo único, IgG-MMAE (1-5 mg/kg), en 200 pl de vehículo administrado por vía intraperitoneal (i.p.) una vez a la semana; el segundo grupo recibe i.p. S3F-MMAE (1-5 mg/kg), en 200 pl de vehículo administrado por vía intraperitoneal (i.p.) una vez por semana; el tercer grupo recibirá, mediante inyección i.p., SIA101-MMAE (1-5 mg/kg), en 200 pl de vehículo administrado por vía intraperitoneal (i.p.) una vez por semana, y el cuarto grupo recibe vehículo i.p. semanalmente.
Luego se miden los tumores dos veces por semana con calibradores [volumen tumoral = (Lmm * Wmm * Lmm)/2]. Los ratones, al mismo tiempo, se observan con frecuencia y se pesan dos veces por semana para evaluar los posibles efectos tóxicos. Los ratones con una carga tumoral excesiva o en estado moribundo son eutanasiados. La prueba de suma de rangos de Wilcoxon no paramétrica para muestras no pareadas se usa para comparar los volúmenes tumorales entre los diferentes brazos.
S3F-MMAE es capaz de retrasar el crecimiento o erradicar los tumores CSC y la combinación con agentes quimioterapéuticos estándar utilizados para el cáncer de ovario aumenta la eficacia del mAb.
Ejemplo 21. Pruebas in vitro de anticuerpos ADC
Los anticuerpos S3F, 8C2-2D6, 2G12-2B2, 4G8-1E3 y 5G2-1B3 se conjugaron con maleimidocaproil-valina-citrulinap-aminobenciloxicarbonil-monometil auristatina E (MC-vc-PAB-MMAE). La conjugación se llevó a cabo reduciendo primero los enlaces disulfuro intercadena del anticuerpo con TCEP y uniendo después la fracción maleimida del fármaco a las cisteínas reducidas. Los anticuerpos conjugados se desalaron en columnas Sephadex G50 para eliminar las toxinas residuales no reactivas y, a continuación, se dializaron en HEPES 30 mM pH 7,7 con NaCl 150 mM. La relación fármaco-anticuerpo (DAR) se determinó para cada anticuerpo conjugado utilizando la relación de los valores de absorbancia UV a 248 y 280 nm (A248 y A280, respectivamente; véase la siguiente tabla ).
T l 1 : An i r n n MMAE
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Las preparaciones de anticuerpos se analizaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño para confirmar la presencia de monómeros puros.
A continuación, se probó la capacidad de los anticuerpos conjugados para destruir células que expresaban STn. Cultivos de células MDA-MB-231, con o sin expresión superficial de STn. Las células MDA STn negativas se cultivaron en EMEM suplementado con un 10 % de FBS, 1* Pen/Strep y 45ug/ml de gentamicina. Las células MDA STn positivas se cultivaron en los mismos medios excepto con la adición de 1mg/ml de G418 para la selección antibiótica. Las células se sembraron por separado (4.000 células/pocillo STn negativo o 2.000/pocillo STn positivo) en placas de 96 pocillos utilizando los medios adecuados descritos anteriormente. Las células se cultivaron durante la noche. Después de 16-20 horas, las células se trataron con una dilución en serie de anticuerpos de prueba por triplicado (50nM a 0,012nM, dilución en serie 1:4 en medios) durante 72 horas. Tras el tratamiento, no se observó ninguna disminución significativa de la viabilidad de las células STn-negativas mediante el ensayo de viabilidad celular luminiscenteCELLTITER-GLO®, mientras que se observaron disminuciones de la viabilidad celular con todos los anticuerpos conjugados (a excepción del anticuerpo conjugado de control no específico para STn) en los cultivos de células STn-positivas (véase la siguiente tabla ).
Tabla 16: Valores I r n i r n n MMAE r n élulas STn+ MDA
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De los anticuerpos conjugados probados, el anticuerpo S3F tuvo la concentración inhibitoria más baja (IC50). Los anticuerpos 2G12-2B2, 4G8-1E3 y 8C2-2D6 tenían IC50 nanomolares de un solo dígito. El anticuerpo 5G2-1B3 fue el menos eficaz con un valor IC50 superior a 10. Esto puede deberse a un DAR inferior y a un isotipo de IgG diferente (5G2-1B3 es IgG1, mientras que los demás son IgG2a). El anticuerpo conjugado de control del isotipo no mostró ningún efecto.
Ejemplo 22. Ensayo in vitro de ADC con las líneas celulares OVCAR3 y SNU-16
El experimento realizado anteriormente se repitió utilizando células OVCAR3 (que expresan niveles moderados de STn) o células SNU-16 (que expresan niveles bajos de STn). Las células se sembraron (10.000 células/pocillo) en placas de ensayo de 96 pocillos utilizando medio RPMI con 10 % de FBS con 0,01 % de insulina bovina y 1* Pen/Strep. Las células se incubaron en condiciones estándar de cultivo celular durante la noche antes del tratamiento con anticuerpos de prueba (con o sin conjugados de fármacos MMAE) o anticuerpo de control irrelevante. Las células se trataron con una dilución en serie de anticuerpos de prueba por triplicado (50nM a 0,012nM, dilución en serie 1:4 en medios).
Cuatro días después, se midió la viabilidad celular mediante el ensayo de viabilidad celular luminiscente CELL TITER-GLO®. Al igual que en el ensayo anterior, los anticuerpos no conjugados no tuvieron ningún efecto sobre la viabilidad celular; sin embargo, los anti-STn conjugados disminuyeron la viabilidad celular con dosis crecientes (véase la siguiente tabla ).
T l 17: V l r I l n i r r
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De los anticuerpos probados en células OVCAR3, el S3F conjugado tuvo el IC50 más bajo, mientras que todos los demás anticuerpos probados tuvieron valores de IC50 superiores a 5. 8C2-2D6 y 5G2-1B3 tenían IC50s por encima de 10nM, mientras que el anticuerpo 2G12-2B2 y 4G8-1E3 tenían IC50s más deseables en el rango nanomolar único. El anticuerpo conjugado de control del isotipo no mostró ningún efecto.
Se observaron resultados similares en células SNU-16, con S3F conjugado demostrando el mayor efecto. 2G12-2B2, 8C2-2D6 y 5G2-1B3 también demostraron una gran capacidad para destruir las células SNU-16.
Ejemplo 23. Afinidad de unión de OVCAR3
Se probó la unión de los anticuerpos S3F, 8C2-2D6, 4G8-1E3 y 2G12-2B2 a las células OVCAR3 mediante análisis de citometría de flujo. Para el análisis, las células OVCAR3 se cultivaron y cosecharon utilizando StemPro Accutase (Life Technologies, Carlsbad, CA) y se lavaron con PBS que contenía 5 % de FBS antes de la precipitación por centrifugación ligera. El número de células y su viabilidad se determinaron mediante un análisis de exclusión del colorante azul tripán y las concentraciones celulares se ajustaron a 5 *106 células/ml en PBS con 5 % de FBS. Se añadieron 50 pl de células a cada pocillo de una placa de ensayo. A continuación, se combinaron las células con soluciones de 50 pl de los anticuerpos analizados o de anticuerpos de control y se incubaron durante 1 hora a 4 °C. A continuación, las células se lavaron y sedimentaron dos veces con PBS con 5 % de FBS antes de tratarlas con 100 pl de PBS con 5 % de FBS que contenían una dilución 1:1.500 de IgG anti-ratón (Southern Biotech, Birmingham, Alabama) conjugada con aloficocianina (APC). A continuación, las células se incubaron durante 30 minutos a 4 °C antes de lavarlas y resuspenderlas en 200 pl de yoduro de propidio (PI) diluido 1:1000 en PBS con 5 % de FBS. Por último, las células tratadas se sometieron a análisis de citometría de flujo.
La media de la intensidad de fluorescencia APC se trazó frente al logaritmo de la concentración de anticuerpo para obtener una curva utilizada para el cálculo de EC50. Los valores EC50 obtenidos para cada anticuerpo se presentan en la siguiente Tabla.
T l 1 : n n r i n f iv r l ni n V AR
Figure imgf000138_0002
Todos los anticuerpos fueron ligantes eficaces con valores EC50 nanomolares de un solo dígito.
Ejemplo 24. Pruebas de anticuerpos mediante inmunohistoquímica
Se probó la capacidad de S3F, 2C2-2C5, 5E6-2E7, 9F11-1F7, 5G2-1B3, 4G8-IE3 y 8C2-2D6 para detectar STn en secciones de tejido congeladas, secciones de tejido fijadas y en microarreglos de tejido canceroso. También se probó 2429-2B2-3B9 (según se describe en la publicación de EE. UU. No. US2014/0178365). Además, se utilizó el anticuerpo B72.3 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) como control positivo (excepto en las pruebas de tejido congelado).
Se obtuvieron muestras de tejido congelado de carcinoma pancreático humano (Hu14 Neo-1) y se examinó la tinción en células tumorales, endotelio, células espindloides y epitelio del conducto. Se tomaron muestras de tejido fijadas con formol e incluyendo en parafina (FFPE) de carcinoma pancreático humano (Hu3 PA Neo-1) y se examinó la tinción en células tumorales, estroma y lumen.
Los anticuerpos analizados se utilizaron para tratar secciones de tejido y luego se detectaron utilizando reactivos de detección secundarios marcados con peroxidasa. Se observaron secciones de tejido y se evaluó la intensidad de la reactividad específica, la frecuencia de células que mostraban reactividad específica y la localización subcelular de la reactividad específica.
Las observaciones de tinción se presentan en las siguientes Tablas.
T l 1 : l v r vi r r rv i n in i n
Figure imgf000138_0001
Tabla 20: Evaluación de tejidos FFPE
Figure imgf000139_0002
Los anticuerpos S3F y 8C2-2D6 demostraron los resultados de tinción más fuertes.4G8-IE3 y 2G12-2B2 también presentaron fuertes resultados de tinción cuando se utilizaron concentraciones más altas (10 |jg/ml sobre 1 |jg/ml).
T l 21: Ev l i n i n l
Figure imgf000139_0001
(co n tin u a c ió n )
Figure imgf000140_0001
En muestras de tejido congelado, 2C2-2C5, 4G8-IE3, 2G12-2B2 y S3F produjeron la tinción más intensa y frecuente en células tumorales. Se observó poca tinción con cualquier anticuerpo en endotelio, estroma o conductos en las muestras de tejido analizadas.
Los estudios de microarreglos de tejidos cancerosos examinaron la tinción de anticuerpos en tejidos cancerosos de ovario, pulmón, páncreas y vejiga urinaria. 4G8-1E3 y 8C2-2D6 demostraron la mejor reactividad global con múltiples tipos de tumores y tuvieron una reactividad limitada con tejidos normales. 5G2-1B3 y 5E6-2E7 presentaron una buena reactividad con el carcinoma pancreático y una baja reactividad con los tejidos normales. 5E6-2E7 presentaba cierta reactividad con el adenocarcinoma de páncreas, el carcinoma de células transicionales en vejiga urinaria y el adenocarcinoma de ovario, con una reactividad bastante baja con los tejidos normales. 2G12-2B2 presentaba una buena reactividad con el carcinoma de ovario y el carcinoma de pulmón y una reactividad relativamente baja con los tejidos endoteliales.
S3F demostró una fuerte tinción de carcinoma, pero también exhibió una tinción moderada de células endoteliales. Esta tinción endotelial no se observó con 2G12-2B2. Estos resultados sugieren que el anticuerpo S3F puede reconocer epítopos STn más amplios, posiblemente debido a la presencia de cisteínas no apareadas y/o una región CDR-H3 más larga.
Ejemplo 25. Análisis de la secuencia de anticuerpos
Las secuencias de dominio variable para los anticuerpos generados de acuerdo con el estudio de inmunización descrito en el presente documento se analizaron en busca de similitudes de secuencia, así como de características que pudieran afectar a la función, expresión, estabilidad o inmunogenicidad del anticuerpo.
El análisis de secuencias identificó las regiones CDR presentadas en la siguiente Tabla. El análisis reveló además que los anticuerpos generados según el estudio mostraban una variabilidad mucho mayor en los dominios variables de la cadena ligera en comparación con los dominios variables de la cadena pesada. Además, se determinó que los dominios variables de cadena pesada de los anticuerpos del estudio se originaban a partir de un gen de línea germinal, muIGHV1S53, un gen de línea germinal que se comparte con anticuerpos anti-STn conocidos en la técnica: anticuerpo 3F1 (SBH Sciences, Natick, MA), anticuerpo B72.3 (véase Colcher, D. y otros, 1981. PNAS. 78(5): 3199-203), y el anticuerpo CC49 (véase Muraro, R. et al., 1988. Cancer Res.48: 4588-96). En la siguiente tabla se presenta una visión comparativa de las secuencias CDR de la cadena pesada basada en el análisis.
T l 22:ii m r i n n i n i DR
Figure imgf000141_0001
Las secuencias CDR-H3 variaron en más o menos un aminoácido con respecto a la longitud media.
Curiosamente, las cadenas ligeras específicas de objetivo tenían las mismas longitudes de secuencia CDR-L2 y CDR-L3. Se encontró que persistían dos clases de secuencias CDR-L1 [largas (2G12-2B2, 5E6-2E7 y CC49) y cortas (8C2-2D6, 4G8-1E3, 5G2-1B3, 2C2-2C5, 3F1 y B72.3)], presentando potencialmente una topología unificada en cada clase. En la siguiente tabla se presenta una comparación de las secuencias CDR de las cadenas ligeras.
Tabla 23: Com aración de cadena li era de secuencia CDR
Figure imgf000141_0002
En conjunto, el análisis de la secuencia sugiere distintos patrones de diversidad CDR-H3 que se corresponden con emparejamientos específicos de la línea germinal de la cadena ligera. A partir de estos emparejamientos se identificaron tres grupos. El grupo A incluye los anticuerpos 8C2-2D6, 4G8-1E3 y S3F. Estos anticuerpos tienen secuencias CDR-H3 similares, con la excepción de S3F, que es distinto de todos los demás anticuerpos en cuanto a la longitud CDR-H3 (tiene un aminoácido extra, lo que crea un bucle más largo). Los anticuerpos del grupo A también tienen CDR de cadena ligera con similitudes, especialmente en la longitud de los residuos CDR.
El grupo B incluye los anticuerpos 2G12-2B2 y CC49. Entre las similitudes en las secuencias de la cadena pesada, estos anticuerpos tienen residuos F y D conservados en la CDR-H2 y un residuo L conservado en la CDR-H3. Además, los anticuerpos del grupo B tienen secuencias de cadena ligera muy similares.
Los anticuerpos del grupo C incluyen 5G2-1B3 y B72.3. Entre las similitudes entre sus secuencias de cadena pesada, estos anticuerpos tienen residuos D conservados en sus secuencias CDR-H2, así como un motivo YYG en sus secuencias CDR-H3. Los anticuerpos del grupo C también tienen secuencias de cadena ligera muy similares.
El número limitado de grupos identificados pone de relieve la especificidad de secuencia relativamente rara necesaria para la unión anti-STn. La agrupación de anticuerpos facilita la identificación de contribuciones relevantes basadas en secuencias intragrupo a la unión del epítopo. En particular, dentro del Grupo A, S3F contiene de forma única un bucle CDR-H3 ampliado que puede contribuir a un perfil de unión novedoso. Curiosamente, los datos inmunohistoquímicos indican que S3F puede unirse a una gama más amplia de objetivos, incluyendo la unión no deseada a células endoteliales.
Ejemplo 26. Variantes de anticuerpos
Las secuencias de dominio variable para los anticuerpos generados de acuerdo con el estudio de inmunización descrito en el presente documento se analizaron en busca de características de secuencia que pudieran afectar a la función, expresión, estabilidad y/o inmunogenicidad del anticuerpo.
Muchos de los anticuerpos generados en el estudio tenían secuencias CDR-H2 que contenían pares de residuos NG, haciéndolos susceptibles a la desamidación de asparagina, con posible conversión a glutamato y piroglutamato en una relación 3:1 con el tiempo. Estas secuencias pueden someterse a mutagénesis para convertir pares de residuos NG en pares SG o QG para evitar la desamidación en estos sitios. Alternativamente, estos anticuerpos pueden formularse para reducir la desamidación.
Los anticuerpos 2B2-2A7 y 5G2-1B3 tenían sitios de isomerización de aspartato (identificados por pares de residuos de aminoácidos DG) en sus dominios variables de cadena ligera. El ácido aspártico en estos sitios puede convertirse en glutamato y piroglutamato en una relación de 3:1 con el tiempo. Estas secuencias pueden someterse a mutagénesis para convertir los pares de residuos DG en SG o QG para evitar la isomerización en estos sitios. Alternativamente, estos anticuerpos pueden formularse para reducir la isomerización.
Muchos de los anticuerpos tienen cadenas pesadas con residuos de glutamina N-terminal. Estas secuencias pueden someterse a mutagénesis para convertir los residuos N-terminales de glutamina en residuos de glutamato.
El análisis de la secuencia de los parches propensos a la agregación reveló un segmento HFW en la CDR-L3 de 5G2-1B3, que conlleva cierto riesgo de aumentar la agregación de anticuerpos. Pueden realizarse estudios de estabilidad de agregación con variantes de este motivo para identificar anticuerpos menos propensos a la agregación.
Ejemplo 27. Comparación de la unión de células cancerosas
Se probó la unión de los anticuerpos S3F, 8C2-2D6, 4G8-1E3 y 2G12-2B2 a células OVCAR3 y células SNU-16 mediante análisis de citometría de flujo. Para el análisis, las células se cultivaron y se cosecharon utilizando StemPro Accutase (Life Technologies, Carlsbad, CA) y se lavaron con PBS que contenía 5 % de FBS antes de la precipitación por centrifugación ligera. El número de células y su viabilidad se determinaron mediante un análisis de exclusión del colorante azul tripán y las concentraciones celulares se ajustaron a 5 ><106 células/ml en PBS con 5 % de FBS. Se añadieron 50 pl de células a cada pocillo de una placa de ensayo. A continuación, se combinaron las células con soluciones de 50 pl de los anticuerpos analizados o de anticuerpos de control y se incubaron durante 1 hora a 4 °C. A continuación, las células se lavaron y sedimentaron dos veces con PBS con 5 % de FBS antes de tratarlas con 100 pl de PBS con 5 % de FBS que contenían una dilución 1:1.500 de IgG anti-ratón (Southern Biotech, Birmingham, Alabama) conjugada con aloficocianina (APC). A continuación, las células se incubaron durante 30 minutos a 4 °C antes de lavarlas y resuspenderlas en 200 pl de yoduro de propidio (PI) diluido 1:1000 en PBS con 5 % de FBS. Por último, las células tratadas se sometieron a análisis de citometría de flujo.
El porcentaje de células con unión positiva fue graficado contra el logaritmo de la concentración de anticuerpo para cada tipo celular (véase la Fig. 2A y 2B). El anticuerpo S3F demostró unirse a un número significativamente mayor de células en comparación con otros anticuerpos STn en todas las concentraciones probadas, lo que sugiere (1) un epítopo más amplio o (2) una unión más promiscua contra ciertos tipos de células.
A continuación, los valores medios de intensidad de fluorescencia de APC se trazaron frente al logaritmo de la concentración de anticuerpo para determinar la concentración de anticuerpo necesaria para observar una eficacia de unión semimáxima (EC50). Los datos se presentan en la siguiente tabla.
T l 24: V l r E r l ni n l n i r l l l V AR N -1
Figure imgf000142_0001
Figure imgf000143_0001
En general, los datos indicaron que las células SNU-16 expresan menos STn. Curiosamente, los anticuerpos del Grupo A (S3F y 4G8-1E3) demostraron una unión mucho más débil a las células SNU-16.
Ejemplo 28. Análisis ampliado de secuencias de anticuerpos y desarrollo de variantes
El análisis de la secuencia de anticuerpos de acuerdo con el Ejemplo 25 se lleva a cabo para comparar anticuerpos adicionales dirigidos contra STn. Los resultados se utilizan para identificar tendencias adicionales basadas en secuencias y patrones de emparejamiento de cadenas pesadas y ligeras. Estas tendencias se utilizan para fundamentar estrategias de maduración de la afinidad para crear bibliotecas de expresión de fragmentos de anticuerpos basadas en mutaciones dirigidas para mejorar las características de unión.
Ejemplo 29. Anticuerpos biespecíficos STn/CD3
Se producen anticuerpos biespecíficos que se unen tanto a STn como a CD3. Estos anticuerpos se utilizan para unir células cancerosas que presentan STn y ponerlas en contacto con células citotóxicas que expresan CD3.
Ejemplo 30. Estudios con modelos de xenoinjerto
Los estudios de modelos de xenoinjerto se llevan a cabo para probar los anticuerpos ADC in vivo. Se inducen tumores en ratones mediante la inyección de células MDA-MB-231 STn+, células SNU-16, células COLO-205 o células OVAR3. A continuación, se trata a los ratones con anticuerpos S3F, 4G8-1E3, 2G12-2B2 conjugados con MMAE, anticuerpos de control irrelevantes o controles de anticuerpos 4G8-1E3 o 2G12-2B2 desnudos (no conjugados). Se controla el peso y el volumen tumoral de los ratones.

Claims (30)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo aislado que comprende:
(a) un CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:
108;
(b) un CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123;
(c) un CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:
135;
(d) un CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:
81;
(e) un CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:
84; y
(f) un CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:
96;
en el que el anticuerpo se dirige específicamente tanto al antígeno N-acetilneuramínico sialil Tn (AcSTn) como al antígeno N-glicolilneuramínico sialil Tn (GcSTn).
2. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, que es un anticuerpo monoclonal.
3. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
4. El anticuerpo aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que tiene un isotipo IgG1 o un isotipo IgG2.
5. El anticuerpo aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho anticuerpo se dirige específicamente tanto al antígeno N-acetilneuramínico sialil Tn (AcSTn) como al antígeno N-glicolilneuramínico sialil Tn (GcSTn), en el que dicho AcSTn y/o GcSTn comprende un grupo 9-O-acetilo.
6. El anticuerpo aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo biespecífico.
7. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1 que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) con una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 37 y un dominio variable de cadena ligera (VL) con una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 38.
8. Un conjugado anticuerpo-fármaco que comprende un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que dicho conjugado anticuerpo-fármaco comprende un agente terapéutico o un agente citotóxico.
9. El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 8, en el que dicho conjugado anticuerpo-fármaco comprende un agente citotóxico.
10. El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 9, en el que dicho agente citotóxico es
(a) conjugado con dicho anticuerpo directamente, o
(b) conjugado con dicho anticuerpo mediante un enlazador.
11. El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 10, en el que dicho enlazador se selecciona del grupo que consiste en un enlazador escindible y un enlazador no escindible.
12. El conjugado anticuerpo-fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en el que dicho agente citotóxico es un agente que daña el ADN o un inhibidor del citoesqueleto.
13. El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 12, en el que dicho inhibidor del citoesqueleto es una maytansina o auristatina.
14. El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 13, en el que dicha auristatina es monometil auristatina E (MMAE) o monometil auristatina F (MMAF).
15. Una composición que comprende el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o el conjugado anticuerpofármaco de una cualquiera de las reivindicaciones 8-14.
16. Un anticuerpo, conjugado anticuerpo-fármaco o composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1­ 6 y 8-15 para su uso en terapia.
17. Un anticuerpo, conjugado anticuerpo-fármaco, o composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y 8-15 para su uso en la destrucción de una célula tumoral.
18. Un anticuerpo, conjugado anticuerpo-fármaco o composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y 8-15 para su uso en el tratamiento del cáncer.
19. Un anticuerpo, conjugado anticuerpo-fármaco, o composición para su uso de la reivindicación 18, en el que dicho cáncer es un cáncer epitelial.
20. Un anticuerpo, conjugado anticuerpo-fármaco o composición para el uso de la reivindicación 19, en el que dicho cáncer epitelial es cáncer de mama, colon, pulmón, vejiga, cuello uterino, ovario, estómago, próstata y/o hígado.
21. Un anticuerpo, conjugado anticuerpo-fármaco o composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y 8-15 para su uso en el aumento de la actividad inmunitaria de células antitumorales.
22. El anticuerpo, conjugado anticuerpo-fármaco o composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y 8-15 para su uso en la reducción del volumen tumoral en un sujeto.
23. El anticuerpo, conjugado anticuerpo-fármaco o composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y 8-15 para su uso en el tratamiento de un tumor inmunorresistente en un sujeto.
24. El anticuerpo, conjugado anticuerpo-fármaco o composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1­ 6 y 8-15 para su uso en la reducción o eliminación de células madre cancerosas (CSC) en un sujeto.
25. El anticuerpo, conjugado anticuerpo-fármaco o composición para uso de la reivindicación 24, en el que dichas CSC están presentes en tejido de mama, ovario, páncreas, vejiga, cuello uterino, colon y/o pulmón.
26. El anticuerpo, conjugado anticuerpo-fármaco, o composición para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 16-25, comprendiendo además administrar a dicho sujeto al menos un agente quimioterapéutico.
27. El anticuerpo, conjugado anticuerpo-fármaco, o composición para uso de la reivindicación 26, en el que dicho agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste en paclitaxel y carboplatino.
28. Un constructo que codifica el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el constructo es una molécula de ácido nucleico.
29. Una célula o virus que comprende el constructo de la reivindicación 28.
30. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para su uso en un procedimiento de identificación de células y/o tejidos que expresan STn.
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL3218005T3 (pl) 2014-11-12 2023-05-02 Seagen Inc. Związki oddziałujące z glikanami i sposoby ich zastosowania
EP4088732A1 (en) * 2015-05-01 2022-11-16 The Regents of The University of California Glycan-dependent immunotherapeutic molecules
US20200041517A1 (en) * 2015-06-12 2020-02-06 Seattle Genetics, Inc. Compositions and methods for targeting cancer stem cells
IL302822A (en) * 2015-11-12 2023-07-01 Seagen Inc Compounds interacting with glycans and methods of use
WO2018094143A1 (en) * 2016-11-17 2018-05-24 Siamab Therapeutics, Inc. Glycan-interacting compounds and methods of use
US11447562B2 (en) * 2017-01-01 2022-09-20 Chi-Yu Gregory Lee RP215 chimeric antigen receptor construct and methods of making and using same
CA3052446A1 (en) * 2017-02-02 2018-08-09 The Scripps Research Institute Engineered cells and methods of use
BR112019018043A2 (pt) * 2017-03-03 2020-04-07 Seattle Genetics Inc método de tratamento de câncer, e, conjugado de anticorpo-fármaco
EP4065606A4 (en) * 2019-11-26 2023-08-02 Ramot at Tel-Aviv University Ltd. CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR FOR CARBOHYDRATES
US20240043561A1 (en) * 2020-11-24 2024-02-08 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Humanized antibodies and fragments thereof binding to carbohydrate antigens and uses thereof
AU2021414400A1 (en) 2020-12-31 2023-08-17 Innate Pharma Multifunctional natural killer (nk) cell engagers binding to nkp46 and cd123
EP4326777A1 (en) * 2021-04-20 2024-02-28 Ramot at Tel-Aviv University Ltd. Humanized anti-sialyl-tn glycan antibodies and uses thereof
WO2022224241A1 (en) * 2021-04-20 2022-10-27 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Chimeric antigen receptors to sialyl-tn glycan antigen
WO2023154708A2 (en) * 2022-02-10 2023-08-17 The Scripps Research Institute Car-t therapies targeted via covalently bonded adapters

Family Cites Families (247)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US715A (en) 1838-04-28 Improvement in water-wheels
US5807A (en) 1848-09-26 Brake fob cabs
US823244A (en) 1906-01-18 1906-06-12 Emerson Mfg Co Wheeled plow.
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
US6872868B1 (en) 1981-06-12 2005-03-29 Ohio University Transgenic mammals
US4714681A (en) 1981-07-01 1987-12-22 The Board Of Reagents, The University Of Texas System Cancer Center Quadroma cells and trioma cells and methods for the production of same
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4716111A (en) 1982-08-11 1987-12-29 Trustees Of Boston University Process for producing human antibodies
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
IN164232B (es) 1986-04-11 1989-02-04 Hoechst India
US4695198A (en) 1986-05-23 1987-09-22 Chevron Research Company Lip-type sealing system for a removable bottom founded structure
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
EP0256654B1 (en) * 1986-07-07 1996-09-18 Centocor, Inc. Chimeric murine/human immunoglobulin specific for tumour-associated 17-1A Antigen
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5059680A (en) 1986-11-24 1991-10-22 Centocor, Inc. Method of isolating ca 125 antigen
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
CA1340927C (en) 1987-10-09 2000-03-14 Peter S. Linsley Method for increasing the sensitivity of assays for target ligand
IT1212041B (it) 1987-11-02 1989-11-08 Fidia Farmaceutici Gangliosidi esteri interni come agenti terapeutici capaci di eliminare il dolore nelle neuropatie periferiche
JPH02486A (ja) 1987-11-13 1990-01-05 Mect Corp 遊離ｎ−アセチルノイラミン酸を認識するモノクローナル抗体
US4978745A (en) 1987-11-23 1990-12-18 Centocor, Inc. Immunoreactive heterochain antibodies
US4975369A (en) 1988-04-21 1990-12-04 Eli Lilly And Company Recombinant and chimeric KS1/4 antibodies directed against a human adenocarcinoma antigen
US4925648A (en) 1988-07-29 1990-05-15 Immunomedics, Inc. Detection and treatment of infectious and inflammatory lesions
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
JP3771253B2 (ja) 1988-09-02 2006-04-26 ダイアックス コープ． 新規な結合タンパク質の生成と選択
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
CA2062795A1 (en) 1989-06-29 1990-12-30 Michael W. Fanger Bispecific reagents for aids therapy
US5413923A (en) 1989-07-25 1995-05-09 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
WO1991010737A1 (en) 1990-01-11 1991-07-25 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
CA2050918A1 (en) 1990-01-12 1991-07-13 Raju Kucherlapati Generation of xenogeneic antibodies
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9012995D0 (en) * 1990-06-11 1990-08-01 Celltech Ltd Multivalent antigen-binding proteins
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
EP0553244B8 (en) 1990-10-05 2005-06-08 Celldex Therapeutics, Inc. Targeted immunostimulation with bispecific reagents
ATE160379T1 (de) 1990-10-29 1997-12-15 Chiron Corp Bispezifische antikörper, verfahren zu ihrer herstellung und deren verwendungen
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech Inc Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
AU662148B2 (en) 1991-04-10 1995-08-24 Scripps Research Institute, The Heterodimeric receptor libraries using phagemids
EP0582595A1 (en) 1991-04-26 1994-02-16 Surface Active Limited Novel antibodies, and methods for their use
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
AU3178993A (en) 1991-11-25 1993-06-28 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
WO1993011236A1 (en) 1991-12-02 1993-06-10 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
PT627940E (pt) 1992-03-05 2003-07-31 Univ Texas Utilizacao de imunoconjugados para o diagnostico e/ou terapia de tumores vascularizados
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
EP0563475B1 (en) 1992-03-25 2000-05-31 Immunogen Inc Cell binding agent conjugates of derivatives of CC-1065
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US5951983A (en) 1993-03-05 1999-09-14 Universite Catholique De Louvain Methods of inhibiting T cell mediated immune responses with humanized LO-CD2A-specific antibodies
US20030108548A1 (en) 1993-06-01 2003-06-12 Bluestone Jeffrey A. Methods and materials for modulation of the immunosuppressive activity and toxicity of monoclonal antibodies
JPH09506262A (ja) 1993-12-08 1997-06-24 ジェンザイム・コーポレイション 特異的抗体の製造方法
DE69531148T2 (de) 1994-01-31 2004-04-29 Trustees Of Boston University, Boston Bibliotheken aus polyklonalen antikörpern
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
US5786464C1 (en) 1994-09-19 2012-04-24 Gen Hospital Corp Overexpression of mammalian and viral proteins
US5919652A (en) 1994-11-09 1999-07-06 The Regents Of The University Of California Nucleic acid molecules comprising the prostate specific antigen (PSA) promoter and uses thereof
US5710038A (en) 1994-11-25 1998-01-20 Universite De Montreal Primary cultures of normal and tumoral human ovarian epithelium
US5811510A (en) 1995-04-14 1998-09-22 General Hospital Corporation Biodegradable polyacetal polymers and methods for their formation and use
KR100654645B1 (ko) 1995-04-27 2007-04-04 아브게닉스, 인크. 면역화된 제노마우스 유래의 인간 항체
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
US5733920A (en) 1995-10-31 1998-03-31 Mitotix, Inc. Inhibitors of cyclin dependent kinases
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
US5849733A (en) 1996-05-10 1998-12-15 Bristol-Myers Squibb Co. 2-thio or 2-oxo flavopiridol analogs
JP2000514919A (ja) 1996-07-03 2000-11-07 ミレニアム ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド 少くとも三分枝の連鎖オリゴ糖を持つ癌特異的抗原の検定による癌の検出
US6114148C1 (en) 1996-09-20 2012-05-01 Gen Hospital Corp High level expression of proteins
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
US6348584B1 (en) 1996-10-17 2002-02-19 John Edward Hodgson Fibronectin binding protein compounds
ATE549918T1 (de) 1996-12-03 2012-04-15 Amgen Fremont Inc Menschliche antikörper, die ausdrücklich menschliches tnf alpha binden
EP0970126B1 (en) 1997-04-14 2001-04-18 Micromet AG Novel method for the production of antihuman antigen receptors and uses thereof
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
DE69839147T2 (de) 1997-06-12 2009-02-19 Novartis International Pharmaceutical Ltd. Künstliche antikörperpolypeptide
CA2304208A1 (en) 1997-09-19 1999-03-25 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Intrabody-mediated control of immune reactions
WO1999037751A1 (en) 1998-01-23 1999-07-29 Imclone Systems Incorporated Purified populations of stem cells
US6410319B1 (en) 1998-10-20 2002-06-25 City Of Hope CD20-specific redirected T cells and their use in cellular immunotherapy of CD20+ malignancies
US20030170249A1 (en) 1999-02-19 2003-09-11 Hakomori Sen-Itiroh Vaccines directed to cancer-associated carbohydrate antigens
US20020012660A1 (en) 1999-03-04 2002-01-31 Alan Colman Method of preparing a somatic cells for nuclear transfer
GB2344886B (en) 1999-03-10 2000-11-01 Medical Res Council Selection of intracellular immunoglobulins
EP1196031A1 (en) 1999-06-16 2002-04-17 Biocrystal Limited Vaccine formulations and methods for immunizing an individual against shed antigen-specific b cells
ATE456578T1 (de) 1999-12-06 2010-02-15 Agensys Inc Serpentinetransmembranrezeptoren exprimiert in menschlichem prostatakrebs und ihre verwendungen
WO2001043778A1 (en) 1999-12-17 2001-06-21 Gene Therapy Systems, Inc. Use of cationic lipids for intracellular protein delivery
US20030008813A1 (en) 1999-12-17 2003-01-09 Felgner Philip L. Intracellular protein delivery compositions and methods of use
AU2001253140A1 (en) 2000-04-03 2001-10-15 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Tumor markers in ovarian cancer
IT1317922B1 (it) 2000-10-24 2003-07-15 S I S S A Scuola Internaz Supe Metodo per identificare in vivo epitopi intracellulari.
ATE338124T1 (de) 2000-11-07 2006-09-15 Hope City Cd19-spezifische umgezielte immunzellen
AU2002338446A1 (en) 2001-01-23 2002-11-05 University Of Rochester Medical Center Methods of producing or identifying intrabodies in eukaryotic cells
AU2002233619A1 (en) 2001-02-26 2002-09-12 Zur Pierre Beserman Systems devices and methods for intrabody targeted delivery and reloading of therapeutic agents
GB0108165D0 (en) 2001-03-31 2001-05-23 Univ Manchester Intracellular analysis
US20030171546A1 (en) 2001-04-30 2003-09-11 City Of Hope Chimeric immunoreceptor useful in treating human cancers
US7514537B2 (en) 2001-04-30 2009-04-07 City Of Hope Chimeric immunoreceptor useful in treating human gliomas
US20090257994A1 (en) 2001-04-30 2009-10-15 City Of Hope Chimeric immunoreceptor useful in treating human cancers
CA2445945A1 (en) 2001-04-30 2002-11-07 Rbc Biotechnology, Inc. Modified organs and cells for xenotransplantation
KR100486784B1 (ko) 2001-05-22 2005-04-29 김하형 솔비나무로 부터 추출된 렉틴 단백질, 그의 제조방법 및용도
AU2002316162A1 (en) 2001-05-24 2002-12-03 Immucom Inc. Method of increasing anti-neugc antibody levels in blood
US6814734B2 (en) 2001-06-18 2004-11-09 Sdgi Holdings, Inc, Surgical instrumentation and method for forming a passage in bone having an enlarged cross-sectional portion
EP1406931A2 (en) 2001-07-19 2004-04-14 Universität Zürich Modification of human variable domains
AU2002355477B2 (en) 2001-08-03 2008-09-25 Medical Research Council Method of identifying a consensus sequence for intracellular antibodies
US20050042714A1 (en) 2001-08-17 2005-02-24 Michael Pawlita Glycoconjugates of sialic acid derivates, methods for their production and use thereof
EP1442063A2 (de) 2001-11-09 2004-08-04 Hexal Biotech Forschungsgmbh Anti-n-glykolyl-neuraminsäure-antikörper und ihre verwendung zur bestimmung von glykoproteinen
EP2261250B1 (en) 2001-12-21 2015-07-01 Human Genome Sciences, Inc. GCSF-Albumin fusion proteins
AU2003237009B2 (en) 2002-01-22 2008-10-02 Warner-Lambert Company Llc 2-(pyridin-2-ylamino)-pyrido[2,3d]pyrimidin-7-ones
GB0201611D0 (en) 2002-01-24 2002-03-13 Grosveld Frank Transgenic animal
GB0226727D0 (en) 2002-11-15 2002-12-24 Medical Res Council Intrabodies
GB0226723D0 (en) 2002-11-15 2002-12-24 Medical Res Council Antibodies for in vitro use
WO2003077945A1 (en) 2002-03-14 2003-09-25 Medical Research Council Intracellular antibodies
AU2003222171A1 (en) 2002-04-05 2003-10-27 Selective Genetics, Inc. Compositions and methods for portal specific gene delivery and treatment of infection
US8853362B2 (en) 2002-05-22 2014-10-07 Esbatech, An Alcon Biomedical Research Unit Llc Immunoglobulin frameworks which demonstrate enhanced stability in the intracellular environment and methods of identifying same
US7119200B2 (en) 2002-09-04 2006-10-10 Schering Corporation Pyrazolopyrimidines as cyclin dependent kinase inhibitors
GB0226729D0 (en) 2002-11-15 2002-12-24 Medical Res Council Intracellular antibodies
GB0226731D0 (en) 2002-11-15 2002-12-24 Medical Res Council Method for generating immunoglobulin genes
CA2506128A1 (en) 2002-11-15 2004-06-03 Medical Research Council Anti-activated ras antibodies
ITRM20020588A1 (it) 2002-11-21 2004-05-22 Lay Line Genomics Spa Metodo per isolare anticorpi intracellulari neutralizzanti di interazioni proteiche.
EP1482309A1 (en) 2003-05-07 2004-12-01 Institut Curie Means for detecting protein conformation and applications thereof
CN1835951B (zh) 2003-07-11 2010-06-02 沃尼尔·朗伯有限责任公司 选择性cdk4抑制剂的羟乙基磺酸盐
EP2302390B1 (en) 2003-07-15 2013-06-05 The Regents of The University of California Methods for detecting and analyzing n-glycolylneuraminic acid (Neu5Gc) specific antibodies in biological materials
ITMI20031909A1 (it) 2003-10-03 2005-04-04 Keryos Spa Linee cellulari di mammifero modificate per la produzione di glicoproteine ricombinanti.
EP1699825A2 (en) 2003-12-22 2006-09-13 Amgen, Inc. Methods for identifying functional antibodies
EP1723422A2 (en) 2004-03-05 2006-11-22 The Scripps Research Institute High throughput glycan microarrays
PL1740616T3 (pl) 2004-04-30 2012-06-29 Inst Nat Sante Rech Med Przeciwciało przeciwko tfr
KR100620554B1 (ko) 2004-06-05 2006-09-06 한국생명공학연구원 Ｔａｇ-72에 대한 인간화 항체
CA2571431A1 (en) 2004-06-24 2006-01-05 The Scripps Research Institute Arrays with cleavable linkers
US7638467B2 (en) 2004-08-03 2009-12-29 Intevep, S.A. Reversible gelling system and method using same during well treatments
WO2006047639A2 (en) 2004-10-27 2006-05-04 Medimmune, Inc. Modulation of antibody specificity by tailoring the affinity to cognate antigens
WO2006068758A2 (en) 2004-11-19 2006-06-29 The Scripps Research Institute Detection, prevention and treatment of breast cancer
US8008443B2 (en) 2005-04-26 2011-08-30 Medimmune, Llc Modulation of antibody effector function by hinge domain engineering
US20090041783A1 (en) 2005-04-28 2009-02-12 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. Anti-platelet membrane glycoprotein vi monoclonal antibody
US20080166805A1 (en) 2005-06-08 2008-07-10 The Regents Of The University Of California Culturing human cells and tissues in an N-glycolylneuraminic acid-free environment
EP2399609B1 (en) 2005-08-24 2015-03-18 ImmunoGen, Inc. Process for preparing maytansinoid antibody conjugates
LT2913343T (lt) 2005-12-20 2018-11-26 Sbi Biotech Co., Ltd. Anti-ilt7 antikūnas
CA2674269C (en) 2006-01-03 2018-06-12 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Three component glycolipopeptides
PL1808442T3 (pl) 2006-01-13 2011-12-30 Pasteur Institut Enzymatyczna synteza glikokoniugatów mucyny na dużą skalę i ich zastosowanie immunogenne
JP2009531031A (ja) 2006-03-23 2009-09-03 ノバルティス アーゲー 抗−腫瘍細胞抗原抗体療法
WO2007116779A1 (ja) 2006-03-31 2007-10-18 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. 新規血小板活性化マーカー及びその測定方法
US20070265170A1 (en) 2006-05-15 2007-11-15 Ola Blixt Detection, prevention and treatment of ovarian cancer
GB0613209D0 (en) 2006-07-03 2006-08-09 Ucb Sa Methods
JP2010505775A (ja) 2006-10-04 2010-02-25 クーベンハヴンス・ユニヴェルシテット Ｍｕｃ１に対する癌特異的な免疫反応の産生及び癌特異的ｍｕｃ１抗体
WO2008070363A2 (en) 2006-10-31 2008-06-12 Domantis Limited Intrabodies
US20100104572A1 (en) 2006-11-02 2010-04-29 Sylvie Luria Methods for screening for therapeutic molecules and use of the molecules therefrom
WO2009018438A1 (en) 2007-07-31 2009-02-05 Cornell Research Foundation, Inc. Protein discovery using intracellular ribosome display
EP2014302A1 (en) 2007-07-12 2009-01-14 Institut Curie An antibody specific for the Tn antigen for the treatment of cancer
WO2009035494A2 (en) 2007-07-30 2009-03-19 The Scripps Research Institute Methods for producing anti-glycan antibodies, vaccines and methods for treating cancer or infectious disease
FI20070853A0 (fi) 2007-11-09 2007-11-09 Glykos Finland Oy Glykaania sitovat monoklonaaliset vasta-aineet
NZ585559A (en) 2007-11-13 2012-11-30 Teva Biopharmaceuticals Usa Inc Humanized antibodies against tl1a
WO2009091826A2 (en) 2008-01-14 2009-07-23 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods related to a human cd19-specific chimeric antigen receptor (h-car)
US20120027813A1 (en) 2008-02-22 2012-02-02 Novartis Vaccines And Diagnostics Srl Adjuvanted influenza vaccines for pediatric use
US8506966B2 (en) 2008-02-22 2013-08-13 Novartis Ag Adjuvanted influenza vaccines for pediatric use
US8298773B2 (en) 2008-05-02 2012-10-30 Marko Vuskovic Methods, assays and kits for cancer diagnosis and screening utilizing glycan-binding and glycan epitopes
US9226934B2 (en) 2008-06-02 2016-01-05 The University Of Tokyo Anti-cancer drug
US20120039984A1 (en) 2008-07-03 2012-02-16 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Glycopeptide and uses thereof
EP2143735A1 (en) 2008-07-10 2010-01-13 Institut Pasteur Variable domains of camelid heavy-chain antibodies directed against glial fibrillary acidic proteins
US20100009424A1 (en) 2008-07-14 2010-01-14 Natasha Forde Sonoporation systems and methods
FI20095418A0 (fi) 2009-04-16 2009-04-16 Suomen Punainen Risti Veripalv Kryptinen subpopulaatio
PE20110419A1 (es) 2008-08-22 2011-07-13 Novartis Ag Compuestos de pirrolo-pirimidina como inhibidores de cdk
JP2012501661A (ja) 2008-09-09 2012-01-26 ザ レジェンツ オブ ザ ユニヴァースティ オブ カリフォルニア 代謝競合による汚染非ヒトシアル酸の除去
US20120045816A1 (en) 2008-09-09 2012-02-23 Sialix, Inc. Novel Glycosylated Polypeptides
JO2885B1 (en) 2008-12-22 2015-03-15 ايلي ليلي اند كومباني Protein kinase inhibitors
US20100178292A1 (en) 2009-01-12 2010-07-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Cryptic glycan markers and applications thereof
US8669085B2 (en) 2009-02-05 2014-03-11 Ut-Battelle, Llc Transformation of gram positive bacteria by sonoporation
WO2010138719A1 (en) 2009-05-28 2010-12-02 Mersana Therapeutics, Inc. Polyal drug conjugates comprising variable rate-releasing linkers
US8399624B1 (en) 2009-06-25 2013-03-19 Esbatech, An Alcon Biomedical Research Unit Llc Acceptor framework for CDR grafting
WO2011000054A1 (en) 2009-07-03 2011-01-06 Avipep Pty Ltd Immuno-conjugates and methods for producing them
EP2275442A1 (en) 2009-07-06 2011-01-19 Ludwig-Maximilians-Universität München Detection and vizualization of the cell cycle in living cells
US8858949B2 (en) 2009-08-06 2014-10-14 Immunas Pharma, Inc. Antibodies that specifically bind to a beta oligomers and use thereof
EP2287202A1 (en) * 2009-08-07 2011-02-23 Dublin City University Anti-sialic acid antibody molecules
WO2011041093A1 (en) 2009-10-01 2011-04-07 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-vascular endothelial growth factor receptor-2 chimeric antigen receptors and use of same for the treatment of cancer
JP6184695B2 (ja) 2009-12-04 2017-08-23 ジェネンテック， インコーポレイテッド 多重特異性抗体、抗体アナログ、組成物、及び方法
US20110177614A1 (en) * 2010-01-15 2011-07-21 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for detecting cancer
EP2347769A1 (en) 2010-01-20 2011-07-27 Glycotope GmbH Cancer stem cell markers and uses thereof
EP2565268A4 (en) 2010-04-28 2013-10-09 Shionogi & Co NEW MUC1 ANTIBODY
EP2566514A4 (en) 2010-05-03 2013-11-27 Abbvie Inc METHODS OF INHIBITING FIBROSIS WITH ANTI-PAI-1 ANTIBODIES
CA2800911A1 (en) 2010-06-11 2011-12-15 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Immunogenic vaccine
JP5777712B2 (ja) 2010-07-13 2015-09-09 ウルトラジェニックス ファーマシューティカル インコーポレイテッド シアル酸欠乏症を治療するための方法および製剤
EP2407487A1 (en) 2010-07-14 2012-01-18 F-Star Biotechnologische Forschungs - und Entwicklungsges. M.B.H. Multispecific modular antibody
KR102344129B1 (ko) 2010-10-08 2021-12-30 시티 오브 호프 메디토프를 위한 단일클론 항체 프레임워크 결합 계면, 메디토프 전달 시스템 및 이의 사용 방법
US20120115878A1 (en) 2010-11-10 2012-05-10 John Vincent Calienni Salt(s) of 7-cyclopentyl-2-(5-piperazin-1-yl-pyridin-2-ylamino)-7h-pyrrolo[2,3-d]pyrimidine-6-carboxylic acid dimethylamide and processes of making thereof
NZ612512A (en) * 2010-12-09 2015-03-27 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
SG190260A1 (en) 2011-01-06 2013-06-28 Univ Johns Hopkins Method of production of recombinant glycoproteins with increased circulatory half-life in mammalian cells
WO2012106465A2 (en) 2011-02-01 2012-08-09 Hibm Research Group, Inc. Methods and compositions for increasing sialic acid production and treating sialic related disease conditions
US20140005069A1 (en) 2011-03-01 2014-01-02 Glycosensors And Diagnostics, Llc. Glycoprofiling with multiplexed suspension arrays
EP2703485B1 (en) 2011-03-30 2018-12-26 National University Corporation University Of Toyama Method for selecting plasma cells and plasmablasts, and method for producing target antigen-specific antibody
MX368966B (es) 2011-06-10 2019-10-23 Mersana Therapeutics Inc Conjugados de proteina-polimero-farmaco.
DK2744931T3 (en) 2011-08-18 2018-08-06 Affinity Biosciences Pty Ltd SOLUBLE POLYPEPTIDES
WO2013033420A1 (en) 2011-08-30 2013-03-07 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods of downregulating translocated oncogene expression using bromodomain inhibitors
CA2848410A1 (en) 2011-09-16 2013-03-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Rna engineered t cells for the treatment of cancer
CN104039809A (zh) 2011-10-10 2014-09-10 希望之城公司 中间位和中间位结合抗体及其用途
US10391126B2 (en) 2011-11-18 2019-08-27 Board Of Regents, The University Of Texas System CAR+ T cells genetically modified to eliminate expression of T-cell receptor and/or HLA
DK2794658T3 (en) 2011-12-19 2017-06-19 Synimmune Gmbh BISPECIFIC ANTIBODY MOLECULE
TW201333040A (zh) 2012-01-06 2013-08-16 Bioalliance Cv 抗－輸鐵蛋白受器之抗體及其使用方法
WO2013126712A1 (en) 2012-02-22 2013-08-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for generating a persisting population of t cells useful for the treatment of cancer
US20150266939A1 (en) 2012-03-15 2015-09-24 Permeon Biologics, Inc. Cell penetrating compositions for delivery of intracellular antibodies and antibody-like moieties and methods of use
WO2013151649A1 (en) 2012-04-04 2013-10-10 Sialix Inc Glycan-interacting compounds
WO2013173820A2 (en) 2012-05-18 2013-11-21 Scott & White Healthcare Bispecific scfv immunofusion (bif)
WO2014028560A2 (en) 2012-08-14 2014-02-20 Ibc Pharmaceuticals, Inc. T-cell redirecting bispecific antibodies for treatment of disease
KR101796689B1 (ko) 2012-08-22 2017-11-10 재단법인 목암생명과학연구소 안정화된 면역글로불린가변도메인 선별방법 및 선별된 도메인의 응용
US9937205B2 (en) 2012-09-04 2018-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Inhibition of diacylglycerol kinase to augment adoptive T cell transfer
US9598489B2 (en) 2012-10-05 2017-03-21 The Trustees Of The Univeristy Of Pennsylvania Human alpha-folate receptor chimeric antigen receptor
SG11201503271XA (en) 2012-11-06 2015-05-28 Scholar Rock Inc Compositions and methods for modulating cell signaling
US10226535B2 (en) 2012-12-10 2019-03-12 Mersana Therapeutics, Inc. Auristatin compounds and conjugates thereof
TW201920283A (zh) 2012-12-24 2019-06-01 美商艾伯維有限公司 催乳激素受體結合蛋白質及其用途
EP2752487A1 (en) 2013-01-03 2014-07-09 Sanofi Intracellular phenotypic screening
WO2014160360A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Mersana Therapeutics Inc. Tubulysin compounds and conjugates thereof
US9802995B2 (en) 2013-03-15 2017-10-31 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Antibody multimerization technologies
WO2014144357A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Merck Patent Gmbh Tetravalent bispecific antibodies
AU2014293116A1 (en) 2013-07-23 2016-02-18 Ohio State Innovation Foundation Methods and compositions related to single chain antibody fragments that bind to tumor-associated glycoprotein 72 (TAG-72)
WO2015048748A1 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Myeloid-derived suppressor cell-specific peptides for diagnostic and therapeutic use
WO2015054600A2 (en) 2013-10-10 2015-04-16 Siamab Therapeutics, Inc. Glycan-interacting compounds and methods of use
CN111849921A (zh) 2014-03-04 2020-10-30 西格马-奥尔德里奇有限责任公司 抗病毒细胞及其用途
GB201406767D0 (en) 2014-04-15 2014-05-28 Cancer Rec Tech Ltd Humanized anti-Tn-MUC1 antibodies anf their conjugates
MA40041B1 (fr) 2014-05-28 2021-03-31 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Anticorps anti-gitr et leurs procédés d'utilisation
TWI695011B (zh) 2014-06-18 2020-06-01 美商梅爾莎納醫療公司 抗ｈｅｒ２表位之單株抗體及其使用之方法
CA2959529A1 (en) 2014-08-27 2016-03-03 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for treatment of cancer
US20170305950A1 (en) 2014-10-10 2017-10-26 Siamab Therapeutics, Inc. Glycan analysis and profiling
WO2016057916A1 (en) 2014-10-10 2016-04-14 Siamab Therapeutics, Inc. Glycan-interacting compounds and methods of use
US9879087B2 (en) * 2014-11-12 2018-01-30 Siamab Therapeutics, Inc. Glycan-interacting compounds and methods of use
PL3218005T3 (pl) 2014-11-12 2023-05-02 Seagen Inc. Związki oddziałujące z glikanami i sposoby ich zastosowania
WO2016090034A2 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Novartis Ag Methods for b cell preconditioning in car therapy
CA2979976A1 (en) 2015-03-17 2016-09-22 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Anti-muc16 antibodies and uses thereof
EP3091032A1 (en) 2015-05-08 2016-11-09 Miltenyi Biotec GmbH Humanized antibody or fragment thereof specific for cd3
US20200041517A1 (en) 2015-06-12 2020-02-06 Seattle Genetics, Inc. Compositions and methods for targeting cancer stem cells
IL302822A (en) 2015-11-12 2023-07-01 Seagen Inc Compounds interacting with glycans and methods of use
US20190031780A1 (en) 2016-01-27 2019-01-31 Siamab Therapeutics, Inc. Compositions and methods for targeting cancer stem cells
WO2018094143A1 (en) 2016-11-17 2018-05-24 Siamab Therapeutics, Inc. Glycan-interacting compounds and methods of use
EP3541421A4 (en) 2016-11-17 2020-07-01 Seattle Genetics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING CANCER
BR112019018043A2 (pt) 2017-03-03 2020-04-07 Seattle Genetics Inc método de tratamento de câncer, e, conjugado de anticorpo-fármaco

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