JP2009531031A - 抗−腫瘍細胞抗原抗体療法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、哺乳動物において癌を診断および/または治療する方法を提供する。該方法は、有効量の抗−腫瘍抗原アゴニストまたはアンタゴニストを投与することを含み、ここに、該腫瘍抗原は正常な組織に対する発現において少なくとも3倍上昇すると定義され、ここに、腫瘍抗原はKIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GPR160、GPCR41、およびSLC1A5の群から選択される。特別な具体例において、該アゴニストまたはアンタゴニストは抗−腫瘍細胞抗原抗体または小分子である。
a)これまでの具体例のいずれか1による、抗体またはその断片、または免疫結合体またはその断片、ここに、該抗体または断片は腫瘍細胞抗原に特異的に結合することができ、ここに、該腫瘍細胞抗原はKIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GPR160、GPCR41、およびSLC1A5の群から選択され;
b)該哺乳動物において該癌の該診断または検出を可能とする検出方法;および
c)該キットの使用のための指示書;
を含む。
特に断りのない限り、用語「KIAA1815」は、本明細書中で用いる場合、ヒトゲノムにおける未知の機能の蛋白質をいい、ここに、該蛋白質は元来FLJ23309として知られていたものである。遺伝子座に対する別名はLLID79956またはbA207C16.3である。KIAA1815遺伝子は仮定アミノペプチダーゼドメインを含有する。KIAA1815はいずれかの哺乳動物から、好ましくは、ヒトから由来するものでよい。KIAA1815は分子の天然源から単離することができるか、あるいは(例えば、組換えDNA技術を用いて)合成手段によって生産することができる。ヒトKIAA1815についての核酸配列は、例えば、受託番号NM_024896下でNIH NCBI配列ビューアーウェブサイトで見出すことができる。アミノ酸配列は受託番号NP_079172を用いて見ることができる。KIAA1815は、癌細胞において専ら発現されるいずれのKIAA1815変種もいうことができ、ここに、非−癌性細胞で発現されたKIAA1815に対するアミノ酸相同性は80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%であり得る。別の具体例において、KIAA1815はD19Wsu12eとして知られたヒトKIAA1815のマウスをホモログであってよい。別名はFxna、MGC28280、mFLJ23309およびD19Ertd410eである。マウスD19Wsu12eについての核酸配列は、受託番号XM_358328下でNIH NCBI配列ビューアーウェブサイトで見出すことができる。なお別の具体例において、KIAA1815はFxnaとして知られたヒトKIAA1815遺伝子のラットホモログであってよい。ラットFxnaについての配列は、受託番号NM 184050を用いてNIH NCBI配列ビューアーで見ることができる。もう1つの具体例において、KIAA1815はヒトKIAA1815遺伝子の霊長類ホモログであってよい。例えば、Pan troglodytes(チンパンジー)ホモログは、核酸配列については受託番号XM_526478、またはアミノ酸配列についてはXP520478を用いてNCBI配列ビューアーで見出すことができる。
アンタゴニストについてアッセイするには、腫瘍細胞抗原は、特定の抗体についてスクリーニングされるべき化合物と一緒に細胞に加えることができ、腫瘍細胞抗原の存在下において注目する活性を阻害する化合物の能力は、化合物が腫瘍細胞抗原に対してアンタゴニストであることを示す。別法として、アンタゴニストは、腫瘍細胞抗原および潜在的なアンタゴニストを、競合阻害アッセイについての適当な条件下で膜−結合腫瘍細胞抗原受容体または組換え受容体と組み合わせることによって検出することができる。腫瘍細胞抗原は、受容体に結合した腫瘍細胞抗原分子の数を用いて、潜在的アンタゴニストの有効性を決定することができるように、放射能によるなどして標識することができる。受容体をコードする遺伝子は、当業者に知られた多数の方法、例えば、リガンドパニングおよびFACSソーティングによって同定することができる。Coliganら、Current Protocols in Immun.,1(2):Chapter 5(1991)。好ましくは、発現クローニングが使用され、ポリアデニル化RNAは腫瘍細胞抗原に対して応答性の細胞から調製され、このRNAから作り出されたcDNAライブラリーをプールに分割し、それを用いて、腫瘍細胞抗原に対して応答性でないCOA細胞または他の細胞をトランスフェクトする。スライドグラス上で成長させるトランスフェクトされた細胞を、標識された腫瘍細胞抗原に曝露する。腫瘍細胞抗原は、ヨウ素化、あるいは部位−特異的プロテインキナーゼについての認識部位を含めることを包含する、種々の手段によって標識することができる。固定およびインキュベーションに続いて、スライドをオートラジオグラフィー分析に付す。陽性プールが同定され、サブ−プールを調製し、相互作用サブ−プーリングおよび再−スクリーニングプロセスを用いて再度トランスフェクトされ、結局は、推定受容体をコードする単一クローンが得られる。
記載は、本発明に従って用いる抗体の生産のための例示的技術に従う。抗体の生産で用いるべき腫瘍細胞抗原は、例えば、所望のエピトープを含有する、腫瘍細胞抗原の細胞外ドメインの可溶性形態、またはその部分であってよい。別法として、それらの細胞表面における腫瘍細胞抗原を発現する細胞を用いて、抗体を生じさせることができる。もう1つの具体例において、腫瘍細胞抗原をコードする遺伝子を用いるDNA−ベースの免疫化を用いて、抗体を生じさせることができる(Ramos J.D.A et al Allergy,Volume 59,Number 5,May 2004,pp.539−547(9)参照)。抗体を生じさせるのに有用な腫瘍細胞抗原の他の形態は当業者に明らかであろう。
抗−腫瘍細胞抗原抗体はポリクローナル抗体を含むことができる。ポリクローナル抗体を調製する方法は当業者に知られている。ポリクローナル抗体は、例えば、免疫化剤および、所望であれば、アジュバントの1以上の注射によって哺乳動物において生起させることができる。典型的には、免疫化剤および/またはアジュバントは、多数の皮下または腹腔内注射によって哺乳動物に注射されるであろう。免疫化剤は、腫瘍細胞抗原またはその融合蛋白質を含むことができる。免疫化剤を、免疫化すべき哺乳動物において免疫原性であることが知られている蛋白質に結合体化するのは有用であろう。そのような免疫原性蛋白質の例は、限定されるものではないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、および大豆トリプシン阻害剤を含む。使用することができるアジュバントの例はフロイントの完全アジュバントおよびMPL−TDMアジュバント(モノホスホリル脂質A、合成トレハロースジコルノミコレート)を含む。免疫化プロトコルは、過度な実験なくして当業者によって選択され得る。
モノクローナルは実質的に均質な抗体の集団から得られたものであり、すなわち、該集団を含む個々の抗体は、微量に存在し得る可能な天然に生じる突然変異を除いて同一である。かくして、修飾語「モノクローナル」は、区別される抗体の混合物ではない抗体の特徴を示す。
本発明の抗−腫瘍細胞抗原抗体は、さらに、ヒト化抗体またはヒト抗体を含むことができる。非−ヒト(例えば、ネズミ)抗体、のヒト化形態はキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、あるいは非−ヒト免疫グロブリンから由来する最小配列を含有する(Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2または抗体の他の抗原−結合サブ配列のような)その断片である。ヒト化抗体は、受容体の相補性決定領域(CDR)からの残基は、所望の特異性、親和性および容量を有するマウス、ラットまたはウサギのような非−ヒト種(ドナー抗体)のCDRからの残基によって置換えられているヒト免疫グロブリン(受容体抗体)を含む。いくつかの場合においては、ヒト免疫グロブリンFvフレームワーク残基は、対応する非−ヒト残基によって置換えられる。ヒト化抗体は、受容体抗体において、または輸入されたCDRまたはフレームワーク配列において見出されない残基も含むことができる。一般に、ヒト化抗体は少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含み、そこでは、CDR領域の全てまたは実質的に全ては非−ヒト免疫グロブリンのそれに対応し、FR領域の全てまたは実質的に全てはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のそれである。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも部分、典型的には、ヒト免疫グロブリンのそれを含むであろう[Jonesら、Nature,321:522−525(1986);Riechmannら、Nature,332:323−329(1988);およびPresta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593−596(1992)]。
ヒト化に対する代替法として、ヒト抗体を生じさせることができる。今日、ヒト化に際して、内因性免疫グロブリンの生産不存在下でヒト抗体の十分なレパートリーを生産することができるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を生産するのが可能である。例えば、キメラおよび生殖系突然変異体マウスにおける抗体重鎖接合領域(JH)遺伝子のホモ接合性欠失の結果、内因性抗体生産の完全な阻害がもたらされる。ヒト生殖系免疫グロブリン遺伝子のそのような生殖系突然変異体マウスの導入の結果、抗原挑戦に際してヒト抗体の生産がもたらされるであろう。例えば、Jakobovitsら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993);Jakobovitsら、Nature,362:255−258(1993);Bruggermannら、Year in Immuno.,7:33(1993);および米国特許第5,591,669号、第5,589,369号、および第5,545,807号参照。
種々の技術が、抗体断片の生産のために開発されてきた。伝統的には、これらの断片は無傷抗体の蛋白質分解消化を介して誘導された(例えば、Morimotoら、Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107−117(1992);およびBrennanら、Science,229:81(1985)参照)。しかしながら、これらの断片は組換え宿主細胞によって今日では直接的に生産することができる。例えば、抗体断片は、先に議論した抗体ファージライブラリーから単離することができる。別法として、Fab’−SH断片はE.coliから直接的に回収することができ、化学的にカップリングして、F(ab’)2断片を形成することができる(Carterら、Bio/Technology 10:163−167(1992))。もう1つのアプローチに従うと、F(ab’)2断片は組換え宿主細胞培養から直接的に単離することができる。抗体断片の生産のための他の技術は当業者にとって明らかであろう。他の具体例において、選択する抗体は単一鎖Fv断片(scFv)である。WO 93/16185;米国特許第5,571,894号;および米国特許第5,587,458号参照。抗体断片は、例えば、米国特許第5,641,870号に記載された、例えば、「線状抗体」であってもよい。そのような線状抗体断片は一特異的または二特異的であってよい。
二特異性抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。例示的な二特異性抗体は、腫瘍抗原蛋白質の2つの異なるエピトープに結合することができる。別法として、抗−腫瘍細胞抗原アームは、T−細胞受容体分子(例えば、CD2またはCD3)のような白血球、またはFcガンマRI(CD64)、FcガンマRII(CD32)およびFcガンマRIII(CD16)のようなIgGに対するFc受容体(FcガンマR)上のトリガリング分子に結合するアームと組合せて、腫瘍抗原−発現細胞に対する細胞防御メカニズムに焦点を合わせることができる。二特異性抗体を用いて、腫瘍抗原を発現する細胞に対して細胞傷害性剤を局所化することもできる。これらの抗体は腫瘍抗原−結合アーム、および細胞傷害性剤(例えば、サポリン、抗−インターフェロン−アルファ、ビンカアルカロイド、リシンA鎖、メトトレキセートまたは放射性同位体ハプテン)に結合するアームを保有する。二特異性抗体は、全長抗体または抗体断片(例えば、F(ab’)2二特異性抗体)として調製することができる。
例示的な二特異性抗体は、ここに、与えられた腫瘍細胞抗原ポリペプチド上の2つの異なるエピトープに結合することができる。別法として、抗−腫瘍細胞抗原アームは、T−細胞受容体分子(例えば、CD2、CD3、CD28、またはB7)のような白血球、またはFCγRI(CD64)、FCγRII(CD32)およびFCγRIII(CD16)のようなIgG(FCγR)に対するFc受容体上のトリガリング分子に結合するアームと組合せて、特定の腫瘍細胞抗原を発現する細胞に対する細胞防御メカニズムに集中することができる。二特異性抗体を用いて、特定の腫瘍細胞抗原を発現する細胞に対して細胞傷害性剤を局所化することもできる。これらの抗体は腫瘍細胞抗原−結合アーム、およびEOTUBE、DPTA、DOTA、またはTETAのような、細胞傷害性剤または放射性核種キレーターに結合するアームを保有する。注目するもう1つの二特異性抗体は腫瘍細胞抗原に結合し、さらに、組織因子(TF)に結合する。
本明細書中に記載された抗−腫瘍細胞抗原抗体のアミノ酸配列の修飾が考えられる。例えば、抗体の結合親和性および/または他の生物学的特性を改良するのが望ましいであろう。抗−腫瘍細胞抗原抗体のアミノ酸配列変種は、適当なヌクレオチドの変化を抗−腫瘍細胞抗原抗体核酸に導入することによって、あるいはペプチド合成によって調製される。そのような修飾は、例えば、抗−腫瘍細胞抗原抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および/またはそれへの挿入、および/またはその置換を含む。欠失、挿入、および置換のいずれの組合せも、最終構築体に到達するようになされ、但し、最終構築体は所望の特徴を保有することを条件とする。アミノ酸の変化は、グリコシル化部位の数または位置の変更のような、抗−腫瘍細胞抗原抗体の翻訳後プロセッシングを改変することもできる。
2)中性親水性:cys、ser、thr;
3)酸性:asp、glu;
4)塩基性:asn、gln、his、lys、arg;
5)鎖の向きに影響する残基:gly、pro;および
6)芳香族:trp、tyr、phe。
本発明の抗体の親和性を増大させる必要があり、この仕事を達成するのに当該分野で知られた多くの方法がある。例えば、集中された工程ごとの突然変異誘発を、ファージ発現抗体ライブラリーを用いて行うことができ、そこでは、単一の突然変異を含有する全ての6つの重鎖および軽鎖CDRを増大した抗原親和性について発現させ、スクリーニングさせる(Wuら、(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95(11):6037−42参照)。もう1つの集中したアプローチは「ホット−スポット突然変異誘発」といわれ、そこでは、ランダムに導入された突然変異は、改良された親和性を最も生じさせるような部位に導入される(Hoら、(2005)J.Biol.Chem.280:607−17参照)。これらのような集中されたアプローチは、小さなライブラリーのみがスクリーニングで必要であるが、後に、全ての変種組合せの広範なスクリーニングが最良のクローンを得るのに必要な点で不利を有する。
エフェクター機能に関して本発明の抗体を修飾して、例えば、抗体の抗原−依存性細胞−媒介細胞傷害性(ADCC)および/または補体依存性細胞傷害性(CDC)を増強させるのが望ましいであろう。これは、1以上のアミノ酸置換を抗体のFc領域に導入することによって達成することができる。別法として、あるいは加えて、システイン残基をFc領域に導入することができ、それにより、この領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能とする(レビューについては:Weiner and Carter(2005)Nature Biotechnology 23(5):556−557)。かく作製されたホモダイマー抗体は、改良された内部化能力および/または増大した補体−媒介細胞殺傷および抗体−依存性細胞傷害性(ADCC)を有することができる。Caronら、J.Exp Med.176:1191−1195(1992)およびShopes,B.J.Immunol.148:2918−2922(1992)参照。増強された抗−腫瘍活性を持つホモダイマー抗体は、Wolff et al.Cancer Research 53:2560−2565(1993)に記載されたヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製することもできる。別法として、デュアルFc領域を有し、それにより、補体溶解性およびADCC能力を有する抗体を作製することができる。Stevenson et al.Anti−Cancer Drug Design 3:219−230(1989)参照。Fc領域内に修飾されたグリコシル化を持つ抗体を生産することができる。例えば、炭水化物鎖におけるフコース含有量を低下させることは、抗体の固有のADCC活性を改良することができる(例えば、WO0061739に記載された、BioWa’s PotillegentTM ADCC Enhancing Technology参照)。別法として、二等分された非−フコシル化オリゴ糖鎖を加える抗体を細胞系で生産することができる(US 6,602,684参照)。これらの技術の双方は、エフェクター細胞上のFcガンマIIIa受容体に対する増大された親和性を持つ抗体を生じさせ、その結果、増大したADCC効率がもたらされる。Fc領域を作製して、本発明の抗体の血清中半減期を改変することもできる。AbdegsはFcRnサルベージ受容体に対する増大した親和性を持つ作製されたIgGであり、従って、慣用的なIgGよりも短い半減期を有する(Vaccaroら、(2005)Nature Biotechnology 23(10):1283−1288参照)。血清中半減期を増加させるためには、FcRnでもって親和性を減少させるように見える、特異的突然変異をFc領域に導入することができる(Hintonら、(2004)J Biol Chem 297(8):6213−6216参照)。本発明の抗体を修飾して、血清中半減期を改変する他のメカニズムを用いることもでき、これは、血清中アルブミン結合ドメイン(dAb)を含めること等である(例えば、WO05035572参照)。作製されたFcドメイン(例えば、XmABTM、WO05077981)を本発明の抗体に組み込んで、改良されたADCC活性、改変された血清中半減期または増大した抗体蛋白質安定性に導くこともできる。
また、本発明は、化学治療剤、トキシン(例えば、酵素的に活性なトキシン、または細菌、真菌、植物または動物起源の酵素的に活性なトキシン;その断片および/または変種を含む)、プロドラッグのような細胞傷害性剤、あるいは免疫モジュレーター、ホルモンまたはホルモンアゴニスト、および酵素または酵素阻害剤のようなもう1つの剤、色素原または色素のような光活性治療剤、脈管形成阻害剤、その代替抗体または断片、または放射性同位体(例えば、放射性結合体)に結合体化された抗体を含む免疫結合体にも関する(レビューについては、Schramaら、(2006)Nature Reviews 5:147−159参照)。
本発明の抗体は、プロドラッグ(例えば、ペプチジル化学療法剤、WO81/01145参照)を活性な抗−癌薬物に変換するプロドラッグ−活性化酵素に抗体を結合体化することによって、ADEPTにおいて用いることもできる。例えば、WO 88/07378および米国特許第4,975,278号参照。
抗体の他の修飾が本明細書中では考えられる。例えば、抗体は、種々の非蛋白質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールのうちの1つに連結させることができる。抗体は、例えば、コロイド薬物送達システム(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ−粒子およびナノカプセル)において、あるいはマクロエマルジョンにおいて、コアセルベーション技術によって、あるいは界面重合(例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ(メチルメタクリレート)マクロカプセルによって調製されたマイクロカプセルに捕獲することもできる。そのような技術はRemington’s Pharmaceutical Sciences,16th edition,Oslo,A.,Ed.,(1980)に開示されている。
抗体を集めるための技術は前記されている。さらに、所望であれば、ある種の生物学的特徴を持つ抗体をさらに選択することができる。
また、本発明は、ヒト化抗−腫瘍細胞抗原抗体をコードする単離された核酸、該核酸を含むベクターおよび宿主細胞、および該抗体の生産のための組換え技術も提供する。
本発明の抗−腫瘍細胞抗原抗体は、直接的にのみならず、好ましくは、シグナル配列、あるいは成熟蛋白質またはポリペプチドのN−末端に特異的な切断部位を有する他のポリペプチドである異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても組換えにより生産することができる。選択された異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識され、処理される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。天然抗−腫瘍細胞抗原抗体シグナル配列を認識し、処理しない原核生物宿主細胞では、シグナル配列が、例えば、アルカリホスファターゼ、ぺニシリナーゼ、lpp、または熱−安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。酵母分泌では、天然シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、(Saccharomyces and Kluyveromycesアルファ−因子リーダーを含めた)アルファ因子リーダー、または酸性ホスファターゼリーダー、C.albicansグルコアミラーゼリーダー、またはWO 90/13646に記載されたシグナルによって置換することができる。哺乳動物細胞発現においては、哺乳動物シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー、例えば、単純疱疹gDシグナルが利用できる。
発現およびクローニングベクターの双方は、1以上の選択された宿主細胞においてベクターが複製するのを可能とする核酸配列を含有する。一般には、クローニングベクターにおいては、この配列は、宿主染色体DNAから独立してベクターが複製するのを可能とするものであり、複製起点または自律複製配列を含む。そのような配列は種々の細菌、酵母およびウイルスについてよく知られている。プラスミドpBR322からの複製起点はほとんどのグラム−陰性細菌に適しており、2μプラスミド起点は酵母に適しており、種々のウイルス起点(SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSVまたはBPV)は哺乳動物細胞においてクローニングベクターで有用である。一般には、複製起点成分は、哺乳動物発現ベクターで必要とされない(SV40起点は、典型的には、それが初期プロモーターを含有する故だけで用いることができる)。
発現およびクローニングベクターは選択可能マーカーともいわれる選択遺伝子を含有することもできる。典型的な選択遺伝子は、(a)抗体または他のトキシン、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、またはテトラサイクリンに対して耐性を付与する、(b)栄養要求性欠乏を補う、または(c)複雑な培地から利用できない臨界的な栄養素を供給する蛋白質をコードする。例えば、BacilliについてD−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子。
発現およびクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、抗−腫瘍細胞抗原抗体核酸に操作可能に連結されたプロモーターを含有する。原核生物宿主で用いるのに適したプロモーターはphoAプロモーター、ベータ−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系、およびtacプロモーターのようなハイブリッドプロモーターを含む。しかしながら、他の公知の細菌プロモーターが適している。細菌系で用いられるプロモーターは、抗−腫瘍細胞抗原抗体をコードするDNAに操作可能に連結されたシャイン−ダルガルノ(S.D.)配列を含有するであろう。
EP 73,657にさらに記載されている。酵母エンハンサーもまた、有利には、酵母プロモーターと共に用いられる。
高等真核生物による本発明の抗−腫瘍細胞抗原抗体をコードするDNAの転写は、しばしば、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増加される。多くのエンハンサー配列が、今日、哺乳動物遺伝子(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ−フェトプロテインおよびインスリン)から知られている。典型的には、しかしながら、真核生物細胞ウイルスからのエンハンサーが用いられるであろう。その例は、複製起点の後期側のSV40エンハンサー(bp100−270)、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを含む。また、真核生物プロモーターの活性化のためのエレメントの増強については、Yaniv,Nature 297:17−18(1982)も参照。該エンハンサーは、抗−腫瘍細胞抗原抗体−コーディング配列に対して5’または3’側の位置においてベクターにスプライシングすることができるが、好ましくは、プロモーターから5’側に位置する。
真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物からの有核細胞)で用いられる発現ベクターは、転写の終止に、およびmRNAを安定化するために必要な配列も含有する。そのような配列は、真核生物またはウイルスDNAまたはcDNAの5’および、場合によっては、3’非翻訳領域から通常は利用可能である。これらの領域は、抗−腫瘍細胞抗原抗体をコードするmRNAの非翻訳部分におけるポリアデニル化断片として転写されたヌクレオチドセグメントを含有する。1つの有用な転写終止成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。WO94/11026およびそこで発現された発現ベクターを参照されたし。
宿主細胞を、抗体の生産のために本明細書中に記載された発現またはクローニングベクターでトランスフェクトし、または形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に修飾された慣用的な栄養倍地中で培養する。培地、温度、pH等のような培養条件は、過度な実験なくして当業者によって選択することができる。一般には、細胞培養の生産性を最大化するための原理、プロトコルおよび現実的な技術は、Mammalian Cell Biotechnology:A Practical Approach,M.Butler,ed.(IRL Press,1991)およびSambrookら、supraに見出すことができる。
本発明の抗−腫瘍細胞抗原抗体を生産するのに用いた宿主細胞は種々の倍地中で培養することができる。Ham’s F10(Sigma)、最小必須培地((MEM)、(Sigma)、RPMI−1640(Sigma))、およびダルベッコの修飾イーグル培地((DMEM),Sigma)のような商業的に入手可能な培地は宿主細胞を培養するのに適している。加えて、Hamら、Meth.Enz.58:44(1979)Barnesら、Anal.Biochem.102:225(1980)米国特許第4,767,704;4,657,866;4,927,762;4,560,655;または5,122,469;WO 90/03430;WO 87/00195;または 米国再発行特許第30,985号に記載された培地のいずれも、宿主細胞のための培養基として用いることができる。これらの培地のいずれも、必要に応じて、(インスリン、トランスフェリン、または表皮成長因子のような)ホルモンおよび/または他の成長因子、(塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩のような)塩;(HEPESのような)緩衝液、(アデノシンおよびチミジンのような)ヌクレオチド、(GENTAMYCIN.TM.薬物のような)抗生物質、(マイクロモル範囲の最終濃度で通常は存在する無機化合物として定義される)痕跡元素、およびグルコースまたは同等なエネルギー源を補足することができる。当業者に知られているであろういずれの他の必要な補足物も適切な濃度で含めることもできる。温度、pH等のような培養条件は、発現のために選択された宿主で従前に用いられたものであり、当業者に明らかであろう。
遺伝子の増幅および/または発現は、本明細書中で提供される配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、慣用的なサザーンブロッティング、mRNAの転写を定量するためのノーザンブロッティング[Thomas,Proc.Nad.Acid.Sci.USA.77:5201−5205(1980)]、ドットブロッティング(DNA分析)、またはイン・サイチュハイブリダイゼーションによって直接的に試料中で測定することができる。別法として、DNAデュプレックス、RNAデュプレックス、およびDNA−RNAハイブリッドデュプレックスまたはDNA−蛋白質デュプレックスを含めた特異的デュプレックスを認識することができる抗体を使用することができる。抗体は、今度は、標識することができ、デュプレックスが表面に結合する場合には、アッセイを行うことができ、従って、表面でのデュプレックスの形成に際して、デュプレックスに結合した抗体の存在を検出することができる。
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内で、ペリプラズム空間で生産し、あるいは培地に直接的に分泌させることができる。もし抗体が最初の工程として細胞内で生産されるならば、特定のデブリス、宿主細胞または溶解された断片は、例えば、遠心または限外濾過によって除去される。Carterら、Bio/Technology 10:163−167(1992)は、E.coli.のペリプラズム空間に分泌される抗体を単離させるための手法を記載する。簡単に述べれば、細胞ペーストを酢酸ナトリウム(pH3.5)、EDTA、およびフェニルメチルスルホニルフルオライド(PMSF)の存在下で約30分間にわたって解凍する。細胞デブリスは遠心によって除去することができる。抗体が培地に分泌される場合、そのような発現系からの上清は、一般には、まず、商業的に入手可能な蛋白質濃縮フィルター、例えば、AmiconまたはMillipore Pellicon限外濾過ユニットを用いて濃縮される。PMSFのようなプロテアーゼ阻害剤を、これまでの工程のいずれかに含めて、蛋白質分解を阻害することができ、抗生物質を含めて、不慮な汚染物の成長を妨げることができる。
本発明に従って用いられるアゴニスト/アンタゴニストまたは抗体分子の治療剤処方は、所望の純度の程度を有する分子を、凍結乾燥処方または水性溶液の形態にて、任意の医薬上許容される担体、賦形剤または安定化剤(Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980))と混合することによって貯蔵のために調製される。許容される担体、賦形剤、または安定化剤は、使用される容量および濃度において受容者に対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸のような緩衝液;アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗生物質;(塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール;メチルまたはプロピルパラベンのようなアルキルパラベン;カテコール;レゾロシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;およびm−クレゾールのような)保存剤;低分子量(約10未満の残基)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのような蛋白質;ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンのようなアミノ酸;グルコース、マンノースまたはデキストリンを含めた単糖、二糖、および他の炭水化物;EDTAのようなキレート化剤;スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールのような糖;ナトリウムのような塩−形成対イオン;金属錯体(例えば、Zn−蛋白質錯体);および/またはTWEENTM,PLURONICSTMまたはポリエチレングリコール(PEG)のような非−イオン界面活性剤を含む。好ましい凍結乾燥された抗−腫瘍細胞抗原抗体処方は、ここに明示的に引用して援用するWO 97/04801に記載されている。
本発明によると、抗―腫瘍細胞抗原アゴニスト/アンタゴニストまたは抗体分子を用いて、種々の病気または障害を治療することができると考えられる。例示的な疾患または障害は良性または悪性腫瘍;白血病およびリンパ性悪性疾患;ニューロン、神経膠細胞、星状神経膠細胞、視床下部、腺、マクロファージ、上皮、間質、胞胚腔、炎症、脈関係性および免疫学的障害を含む。
スコア0
染色は観察されないか、または膜染色が腫瘍細胞の10%未満で観察される。
弱い/かろうじて認知可能な膜染色が腫瘍細胞の10%を超えて検出される。細胞はそれらの膜の一部において染色されるに過ぎない。
弱いないし中程度の完全な膜染色が腫瘍細胞の10%を超えて観察される。
中程度ないし強い完全な膜染色が腫瘍細胞の10%を超えて観察される。
本発明の抗体を、安全性および毒物学的特徴について調べる。これらのタイプの実験についてのガイドラインは、ここに引用して援用する、USDA CBER部門によって発行された書籍、“Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use”(http://www.fda.gov/cber/gdlns/ptc_mab.pdf参照)に見出すことができる。一般に、候補抗体は、多数のヒト組織試料および/または単離されたヒト細胞型を用いて前臨床実験でスクリーニングして、非―標的組織結合および交差反応性を評価すべきである。これらのヒト組織実験からの満足すべき結果に従い、種々の動物種からの組織試料または単離された細胞のパネルをスクリーニングして、一般的な毒物学的実験で用いるための適当な種を同定することができる。交差反応性動物種が同定されなければ、他のタイプのモデルは適切であると見なすことができる。これらの他のモデルは、ヒト腫瘍細胞がげっ歯類宿主に移植される異種移植片モデルのような実験、または毒物学的実験のために選択された動物種における対応する腫瘍−細胞抗原を認識する代行モノクローナル抗体の使用を含むことができる。これらのタイプの代替モデルからのデータは最初の近似であり、高等な種への進行は注意深くなすべきであることが認識されるべきである。
本発明のもう1つの具体例において、前記した障害の治療で有用な物質を含有する製品が提供される。該製品は容器、および容器の上の、または容器に会合させたラベルまたは添付文書を含む。適当な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジなどを含む。容器はガラスまたはプラスチックのような種々の材料から形成することができる。容器は疾患を治療するのに有効な組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有することができる(例えば、容器は、皮下注射針が刺すことができるストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであってよい)。組成物における少なくとも1つの活性剤は、抗―腫瘍細胞抗原抗体である。ラベルまたは添付文書は、組成物は癌のような選択される疾患を治療するのに用いられることを示す。1つの具体例において、ラベルまたは添付文書は、腫瘍細胞抗原に結合する抗体を含む組成物を用いて、腫瘍細胞抗原を発現する癌を治療することができることを示す。また、ラベルまたは添付文書は、組成物を用いて癌を治療することができることを示すことができ、ここに、癌は腫瘍細胞抗原の過剰発現によって特徴付けられない。
例えば、HERCEPTIN(登録商標)についての本発明の添付文書は、その腫瘍がErbB2蛋白質を過剰発現する転移性乳癌を持つ患者を治療することを示すが、ここに、添付文書は、抗体または組成物を用いて、腫瘍細胞抗原過剰発現の程度に拘わらず癌を治療することを示すことができる。他の具体例において、添付文書は、抗体または組成物を用いて、乳癌(例えば、転移性乳癌);ホルモン独立性癌;前立腺癌(例えば、アンドロゲン独立性前立腺癌);肺癌(例えば、非―小細胞肺癌);結腸、直腸または結直腸癌;本明細書中に開示された他の病気または障害のいずれかを治療することができることを示すことができる。さらに、該製品は(a)そこに含有された組成物を含む第一の容器、ここに、該組成物は、腫瘍細胞抗原に結合し、腫瘍細胞抗原を過剰発現する癌細胞の成長を阻害する第一の抗体を含み;および(b)そこに含有された組成物を含む第二の容器、ここに、該組成物は腫瘍細胞抗原に結合する第二の抗体を含む;を含むことができる。本発明のこの具体例における製品は、更に、該第一および第二の抗体組成物を用いて、癌を治療することができることを示す添付文書を含むことができる。更に、添付文書は(腫瘍細胞抗原に結合する抗体を含む)組成物のユーザーに、療法を、抗体、およびこれまでのセクションで記載された補助的療法のいずれか(例えば、化学療法剤、抗―脈関係製剤、抗―ホルモン化合物、および/またはサイトカイン)と組み合わせることを支持することができる。別法として、あるいは加えて、該製品は、更に、注射のための静細菌水(BWFI)リン酸―干渉化生理食塩水、リンゲル溶液及びデキストロース溶液のような医薬上許容される緩衝液を含有する第二の(または第三の)容器を含むことができる。それは、更に、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針およびシリンジを含めた、商業的およびユーザーの立場から望ましい他の物質を含むことができる。
本発明の抗生物質(例えば、抗―腫瘍細胞抗原抗体)は、更に、非―治療適用を有する。
(i)基質としての水素ペルオキシダーゼと共にホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRPO)、ここに、水素ペルオキシダーゼは色素前駆体(例えば、オルトフェニレンジアミン(OPD)または3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン塩酸(TMB))を酸化する;
(ii)色原体基質としてのパラ―ニトロフェニルリン酸と共にアルカリホスファターゼ(AP);および
(iii)色原体基質(例えば、p−ニトロフェニル―ベータ―D−ガラクトシダーゼ)または発蛍光性基質4−メチルウンベリフェニル―ベータ―D−ガラクトシダーゼと共にベータ―D−ガラクトシダーゼ(ベータ―D−Gal)。
標的化のための腫瘍関連抗原の選択
A.腫瘍性細胞および隣接する正常なもののレーザー切開、および切開した細胞からのRNAの生産
正常および癌性組織を、レーザー捕獲マイクロ切開(LCM)を用いて蛋白質から収集し、当該分野で良く知られた技術を用い、RNAをこれらの組織から調製した(例えば、Ohyama et al.(2000)Biotech’iques 29:530−6;Curran et al.(2000)Mol.Pathol.53:64−8;Suarez−Quian et al.(1999)Biotech’iques 26:328−35;Simone et al.(1998)Trends Gerzet 14:272−6;Conia et al.(1997)J.Clin.Lab.Anal.11:28−38;Emmert−Buck et al.(1996)Science 274:998−1001参照)。LCMは実質的に均質な細胞試料を供するための特異的細胞型の単離を供するので、これは同様に純粋なRNA試料を提供する。
cDNAの生産:次いで、切開した細胞から生産された全RNAを用いて、Affymetrix2−サイクルcDNA合成キット(cat#900432)を用いてcDNAを生じさせた。8μLの全RNAを、11μL反応中の1μL T7−(dT) 24プライマー(50ピコモル/μL)と共に用い、これを70℃まで12分間で加熱した。次いで、混合物を5分間で室温まで冷却した。9μLマスターミックス(4μL 5×第一ストランドcDNA緩衝液、2μLの0.1M DTT、1μL 10mM dNTPミックス、2μL Superscript II(600U/μL))を加え、混合物を42℃にて2.5時間インキュベートした(混合物の全容量は20μLであった)。氷上での冷却に続き、第二ストランドの合成は以下のように完了した:前記からの20μL混合物は130μLの第二ストランドマスターミックス(91μL水、30μL 5×第二ストランド反応緩衝液、3μL 10mM dNTPミックス、1μL 10U/μL E.coli DNAリガーゼ、4μL 10U/μL E.coli DNAポリメラーゼI、1μL 2U/μL E.coli Rnase H)と混合し、16℃にて2時間、および10分間インキュベートした。氷上での冷却に続き、dsDNAは反応混合物から精製した。簡単に述べると、QiaQuick PCT精製キットを用い(Qiagen,cat#28104)、および5容量の緩衝液PBを1容量のcDNA混合物に加えた。次いで、cDNAをQIAquickスピンカラムにて製造業者の指示に従って精製し、60μLの最終容量を得た。
実施例1で用いたマイクロアレイ手法を用いて、多数の癌性腫瘍タイプおよび多数の正常試料からの組織における発現を広く探した。cDNA、RNAの生産、およびハイブリダイゼーション条件は、U133 Plus 2.0アレイを用いた(Affymetrix cat#900470)以外は、実施例1で用いた全てのものであった。DecisionSiteSoftware(Spotfire、Somerville、MA)およびイン−ハウス開発Pipeline Pilot(SciTegic,San Deigo,CA,in−house developer Joseph Ringgenberg)プロトコルを用いて、図1〜6に示したグラフ表示を作製した。グラフ表示においては、正常なおよび癌性組織タイプは水平軸に沿って置かれた。癌性組織を「c」で標識し、例えば、(乳癌組織試料を表す「c乳房管」)、正常組織を同様に「n」で現す。組織タイプは、さらに、もし知られていれば、組織のタイプおよびサブタイプに関して標識される。例えば、「c乳房管」は、乳房管に局所化された乳癌からの癌性組織である。もしサブタイプが外科的除去の間に明瞭でないか、または未知であったならば、標識は「非−特異的」については「ns」という。垂直軸上の各スポットは単一患者からの組織試料を表し、垂直軸上の各スポットの高さ(log2ベース)は、プローブ組の相対的発現レベルを表す。塗り潰ぶした丸は、直線状検出範囲における発現レベルを持つ試料を表す。塗り潰ぶしていない丸は試料における遺伝子発現についての上方限界を表し、ここに、遺伝子がプローブ組の検出限界未満であった。塗りつぶしていない四角は、プローブ組が飽和された試料における遺伝子発現についての下方限界を表す。簡単に述べれば、分析を行う前に、試料の大きな多様な組を横切ってのその構成プローブの挙動を分析することによってキャリブレートした。このキャリブレーションは各プローブの相対的感度、およびプローブ組の応答がプローブの間で直線上である強度の範囲を決定する。この範囲未満の強度は「未検出」と呼ばれ、他方、それを超える強度は「飽和した」と呼ばれる。ハイブリダイゼーションの変動、および試料間の標識効率のため、各チップはキャリブレーションを適用する後に正規化される。
前記腫瘍細胞抗原の同定に続き、蛋白質のトポロジーを分析して、理論的細胞外ドメインを同定した。2つの分析アルゴリズムを用いたが、これは膜貫通ドメインを予測するものであり、結果を比較した。第一のものはTMpredであった(K.Hofmann&W.Stoffel(1993)TMbase−A database of membrane spanning proteins segments Biol.Chem.Hoppe−Seyler 374,166参照)。用いた第二の分析プログラムはTMHMM(A.Krogh,B.Larsson,G.von Heijne,and E.L.L.Sonnhammer.Predicting transmemberande protein topology with a hidden Markov mode:Application to complete genomes.Journal of Molecular Biology,305(3):567−580,January 2001)であった。腫瘍細胞抗原の各々についての結果を表3において以下に示す。一般には、分析の2つの組からの結果はかなり良く合致しているが、いくつかの場合においては、アルゴリズムは、確実性をもって、1つのトポロジー的向きをもう1つの向きから予測できなかった。それらの場合において、双方の向きをリストする。表3は推定膜貫通ラセン(TMラセン)の位置、ならびに原形質膜の外側または内側いずれかに位置する蛋白質の理論的部分を示す。加えて、SignalP3.0(Bednstenら、(2004)J Mol Biol.2004 Jul 16;340(4):783−95)を用いて、シグナルペプチドの存在を予測し、それらのペプチドがどこで全長蛋白質から切断されるであろうかを予測した。細胞の外側の蛋白質の部分は、抗体相互作用についての標的として働くことができた。
A.KIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GPF160、GPCR41、およびSLC1A5のPCRクローニング
RNAは、実質的には、Chirgwinら、Biochemistry(1979)17:5294によって記載されているように、癌細胞抗原を発現するヒト癌細胞の集団から単離されるであろう。簡単に述べれば、細胞はリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で2回洗浄し、0.7M 2−メルカプトエタノールの存在下で5Mチオシアン酸グアニジウム中で溶解させた。細胞溶解物を不連続なCsClグラジエント(Chirgwin et al.)上に重ね、Beckman SW28ローター中で、26,000rpmにおいて16時間遠心した。ペレットをDEPC−処理水中に溶解させることによって、RNAを回収する。RNAをエタノールで1回沈殿し、DEPC−処理水に再懸濁し、−70℃で貯蔵した。
KIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GPR160、GPCR41、およびSLC1A5をコードする配列を、注目する全長DNA分子を含む導入ベクターを用いて、Autographa californicaバキュロウイルス(AcNPV)に個々に組み換える。プラスミドを野生型バキュロウイルスDNA(2〜10pfu)(AcNPV;Summersら、A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures,Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No.1555(1987))で、106細胞/mLの密度にてSf9(Spodoptera frugiperda)細胞に共トランスフェクトする(Summers et al.)。組換えバキュロウイルス−感染Sf9細胞を同定し、クローンにより精製する(Summers et al.)。組換え蛋白質の細胞表面発現については、細胞を48時間の培養後に収穫する。
雌BALB/cマウスに、注目する遺伝子を含有するウイルス、またはいずれかのインサートを欠如する対照ウイルスで感染させた5×106Sf9細胞で0日および14日に腹腔内注射する。21日に、100μlの血清が得られて、特異的抗体についてテストした。少なくとも2週間の残りの期間の後、マウスは組換え体または対照で感染させたSf9 5×106細胞での最終の注射を受ける。この最後の注射から3日後、脾臓細胞と細胞融合のために用いる。
免疫化されたBALB/cマウスからの脾臓細胞を、de Boerら、J.Immunol.Meth.(1988)113:143によって従前に記載されているように、50%ポリエチレングリコールを用い、10:1の比率にてSP2/0ネズミミエローマ細胞と融合させる。融合した細胞を、ヒポキサンチン(0.1mM)、アミノプテリン(0.01mM)、チミジン(0.016mM)および0.5ng/ml hIL−6(Genzyme,Cambridge,Mass.)を細くした完全IMDM培地に再懸濁させる。次いで、各々が平均して単一の成長するハイブリドーマを含有するように、96−ウェル組織培養プレートのウェルの間に融合した細胞を分配する。
ハイブリドーマ技術を解する抗体作製の使用に対する別のアプローチとして、ディスプレイ技術を用い、あるいはトランスジェニック動物の使用を通じて、本発明の抗体を作製することができる。
頑強なADCCまたはCDC活性が本発明の抗体で望まれるならば、抗体はヒトまたはヒト化定常領域を含有しなければならない。もし抗体が非−ヒト種に由来するならば、本発明の抗体からの可変ドメインをヒト定常ドメインに融合させることができる。ヒト定常ドメインに対する融合に続き、可変ドメインは、加えて、ヒト化して、潜在的免疫原性を低下させてもよい。加えて、数個の例を挙げるならば、融合蛋白質の構築、アフィニティー成熟、またはさらなるエフェクター機能エンジニアリングのような、他の遺伝子的または組換え修飾をこの時点で行うことができる。
注目する抗体は、当該分野で良く知られた技術を用い、標準的なプロテインAクロマトグラフィーを用いてハイブリドーマ培養から精製する。当該分野で良く知られた方法に従い、ハイブリドーマ上清を収穫し、終わった後にはいずれの細胞も濾過によって除去する。濾液を(必要ならば複数回通して)プロテインカラムに負荷する。カラムを洗浄し、次いで、発現され分泌された免疫グロブリンポリペプチドをカラムから溶出させる。抗体産物の調製のために、ウイルス不活化工程として、プロテインAプールを低いpH(最初の30分間、および最大1時間の間のpH3)に保持する。吸着カチオン交換工程を次に用いて、産物をさらに精製する。吸着分離カラムからの溶出物を、ウイルス保持フィルターを通して、潜在的なウイルス粒子のさらなる除去を供する。そこでは産物が結合しないアニオン交換カラムを通すことによって、濾液をさらに精製する。最後に、産物を透析濾過を通す処方緩衝液に導入することによって、精製プロセスを行う。保持物を少なくとも1mg/mLの蛋白質の独活に調整し、安定化剤を加える。
本発明の抗体は、BIACoreマイクロチップ分析を用いて、注目する標的に対するそれらの親和性について分析することができる。例えば、BIACore2000アナライザーを、CM5センサーチップ(BIACore;Piscataway,NJ)と協調させて用いることができる。HBS−EP緩衝液(10mM HEPES、0.15M NaCl、3.4mM EDTA、0.005%P−20、pH7.4)の連続流を用い、製造業者の指示に従い、精製された抗原蛋白質をセンサーチップ表面に固定化する。センサーチップ表面のカルボキシル基を、0.2M N−エチル−N’−(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)および0.05M N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を含有する60uLの混合物を注射することによって活性化する。10ug/mLの濃度の、10mM酢酸塩、pH4.5(BIACore,Inc.;Piscataway,NJ)に希釈された組換え腫瘍細胞抗原を注射することによって、特異的表面が得られて、2,000共鳴単位(RU)の中程度の表面密度を得る。ある具体例において、25g/mLのような腫瘍細胞抗原の他の濃度を用いることもできる。チップ表面の過剰の反応性基を、60uLの1Mエタノールアミンを注射することによって、脱活性化する。ブランクのモック−カップルド参照表面を各センサーチップ上で調製する。モック−カップリングについては、活性化および不活化工程を蛋白質なくして行う。
もし本発明の抗体をパートナーとしてイムノ結合体で用いるべきであれば、今回、精製された抗体をもう1つの部位に結合体化することができる。例えば、抗体を、ADEPT技術で用いるプロドラッグ−活性化酵素、放射性核種、トキシンまたは他の免疫変調剤に結合体化することができる。
A.ADCC活性についてのスクリーニング
イン・ビトロADCCアッセイ:クロム51−標識標的細胞を調製するためには、腫瘍細胞系を組織培養プレートで成長させ、PBS中の滅菌10mM EDTAを用いて収穫する。脱着させた細胞を細胞培養基で2回洗浄する。細胞(5×106)を200μCiのクロム51(New England Nuclear/DuPont)で場合によっては混合しつつ、37℃で1時間標識する。標識細胞を細胞培養基で3回洗浄し、次いで、1×105細胞/mLの濃度に再懸濁する。細胞をオプソニン化なくして用いるか、あるいはPBMCアッセイにおいては100ng/mLおよび1.5ng/mLにて、あるいはNKアッセイにおいては20ng/mlおよび1ng/mLにおけるテスト抗体でのインキュベーションによってアッセイに先立ってオプソニン化する。正常な健康なドナーから血液をヘパリン上に収集することによって、末梢血液単核細胞を調製し、等容量のリン酸化生理食塩水(PBS)で希釈する。次いで、血液をLYMPHOCYTE SEPARATION MEDIUM(登録商標)(LSM:Organon Teknika)に重ね、製造業者の指示に従い遠心する。単核細胞をLSM−血漿界面から収集し、PBSで3回洗浄する。エフェクター細胞を細胞培養基に1×107/細胞mLの最終濃度まで懸濁する。LSMを通す精製の後、製造業者の指示に従い、NK細胞単離キットおよび磁性カラム(Miltenyi Biotech)を用いる陰性選択によって、ナチュラルキラー(NK)をPBMCから単離する。単離されたNK細胞を収集し、洗浄し、細胞培養基に2×106細胞/mLの濃度まで再懸濁する。NK細胞の同一性を、フローサイトメトリー分析によって確認する。変化させるエフェクター:標的比率は、マイクロタイタープレート(100μLの最終容量)の列に沿ってエフェクター(PMBCまたはNKいずれか)細胞を細胞培養基中に2倍系列希釈することによって調製する。エフェクター細胞の濃度は、PBMCについては1.0×107/mLないし2.0×104/mL、およびNKについては2.0×106/mLないし3.9×103/mLの範囲である。エフェクター細胞の滴定の後、100μLの1×105細胞/mLのクロム51−標識標的細胞(オプソニン化または非オプソニン化)をプレートの各ウェルに加える。この結果、PBMCについては100:1、NK細胞については20:1の初期エフェクター:標的比率が得られる。全てのアッセイを二連で行い、各プレートは自然溶解(エフェクター細胞なし)および合計溶解(標的細胞+100μLの1%ドデシル硫酸ナトリウム1N水酸化ナトリウム)双方についての対照を含有する。プレートを37℃にて18時間インキュベートし、その後、上清収集システム(Skatron Instrument,Inc.)を用いて細胞培養上清を収穫し、Manaxi自動−ガンマ5000シリーズガンマカウンター(Packard)にて1分間カウントする。次いで、式:%細胞傷害性=(試料cpm−自然溶解)/(全溶解−自然溶解)×100を用いてパーセント細胞傷害性として結果を表す。
このアッセイは、アネキシンVが、細胞の外側へのその曝露がアポトーシスプロセスの初期ホールマークである、ホスホスチジルセリン(PS)に対する高い親和性を有する。腫瘍細胞抗原を発現する細胞を、10%加熱−不活化FBS(Hyclone)および2mM L−グルタミンを補足したダルベッコの修飾イーグル培地(D−MEM):ハムF−12(50:50)中で培養する。腫瘍抗原発現腫瘍細胞を、100×200mm皿中に皿当たり3×106の密度で撒き、一晩接着させる。PSに対するアネキシンVの高い親和性に基づくことができる、商業的に入手可能なアネキシンV染色試薬のいずれかを用いて細胞表面PSを検出する。細胞培地を除去し、新鮮な培地単独で、あるいは10μg/mLのモノクローナル抗体を含有する培地で置換える。3日間のインキュベーション時間の後、単層をPBSで洗浄し、トリプシン処理によって脱着させる。次いで、細胞を遠心し、Ca2+結合緩衝液に再懸濁させ、チューブにアリコットする。次いで、チューブは標識されたアネキシン(例えば、アネキシンV−FTIC)(1μg/mL)を受ける。FACSCANTMフローサイトメーターおよびFACSCONVERTTM CellQuestソフトウエア(Becton Dickinson)を用いて試料を分析することができる。対照に対するアネキシン結合の統計学的に有意なレベルに誘導する抗体を、アポトーシス−誘導抗体として選択する。
抗体を、イン・ビボにて、腫瘍形成および/または成長を妨げ、成長を阻害し、または樹立された腫瘍のサイズを低下させ、転移を阻害し、または樹立された転移性病巣を治療する能力についてテストする。各腫瘍抗原についての相対的腫瘍モデルを、RNAまたは蛋白質発現によって評価されるように、腫瘍細胞系における腫瘍抗原発現に基づいて選択する。記載した腫瘍細胞抗原に対する代表的な腫瘍細胞系は、限定されるものでは無いが、以下のものを含む:
KIAA1815:
T47Dヒト乳房
COLO205ヒト結腸」
HT29ヒト結腸
HCT116ヒト結腸
LOC157378:
A549ヒト非小細胞肺癌
FLJ20421:
MDA−MB−435
DSCD74:
KM12ヒト結腸
COLO205
GPR160:
T47Dヒト乳房
MCF7ヒト乳房
GPCR41:
COLO205ヒト結腸
PC3−M−lucヒト前立腺
MDA−MB−435ヒト乳房
SLC1A5
COLO205ヒト結腸
SW620ヒト結腸。
平均体重が20gの4〜7週齢の年齢の免疫寛容マウスをこれらの実験で用いる。
COLO205、KM−12またはSW620のようなヒト結直腸癌細胞系は、Sheng et al.J.Clin.Invest.99:2254−2259(1997)に記載されたように無胸腺ヌードマウスに皮下移植する。マウスをグループにランダム化し、処理を腫瘍移植の日に開始し、0.1〜50mg/kgの注目するモノクローナル抗体を、注射によって毎週2回静脈内または腹腔内投与する。腫瘍の幅および長さのキャリパー測定を用いて、腫瘍容量を計算する。腫瘍の形成または成長はこれまでの実験の結果として開始されると予測される。
T47D,MCF−7 pr MDA−MB−435のようなヒト乳癌細胞系を、Sheng et al.J.Clin.Invest.99:2254−2259(1997)に記載されたように無胸腺ヌードマウスに皮下移植する。別法として、直接的注射または外科的インプラントによって、細胞を乳頭脂肪パッドに同所性移植する。これらの腫瘍モデルは成長についてエストロゲン依存性であり、エストロゲンを補足した雌マウスを用いる。マウスをグループにランダム化し、腫瘍移植の日に治療を開始し、0.1〜50mg/kgの注目するモノクローナル抗体を、注射によって毎週2回静脈内または腹腔内投与する。腫瘍の幅および長さのキャリパー測定を用いて、腫瘍容量を計算する。腫瘍の形成または成長は、これまでの実験の結果として阻害されると予測される。
A549のようなヒト非小細胞肺癌系を、Sheng et al.J.Clin.Invest.99:2254−2259(1997)に記載されたように無胸腺ヌードマウスに皮下移植する。マウスをグループにランダム化し、腫瘍移植の日に治療を開始し、0.1〜50mg/kgの注目するモノクローナル抗体を注射によって毎週2回静脈内または腹腔内投与する。腫瘍の幅および長さの毎週2回行われたキャリパー測定を用いて、腫瘍容量を計算する。腫瘍の形成または成長はこれまでの実験の結果として阻害されると予測される。
ヒト前立腺癌細胞に対する本発明の抗体の効果を、ヒト前立腺PC−3またはPC−M−luc腫瘍モデルに対して評価する。細胞を雄マウスに皮下注射する。マウスをグループにランダム化し(各群においてn=10)、0日に、本発明の抗体またはイソタイプMAb対照にて治療を静脈内または腹腔内(i.p.)で開始する。動物を毎週2回処理する。毎週2回行われる腫瘍の長さおよび幅のキャリパー測定を用いて腫瘍の成長をモニターする。別法として、PC−3M luc細胞について、Xenogen IVISシステムにて、培養ルミネセントイメージングを用いて腫瘍成長をモニターし、毎週1回または2回腫瘍におけるルシフェラーゼシグナルを測定する。
ヒト前立腺癌細胞の転移、および骨および柔軟組織における転移性病巣の成長に対する本発明の抗体の効果を、ヒト前立腺PC−M−luc腫瘍モデルを用いて評価する。細胞を、雄マウスへの心臓内経路を介して注射する。マウスをグループにランダム化し、本発明の抗体またはイソタイプMAb対照にて、0日に、処理を静脈内または腹腔内(i.p.)で開始する。動物を毎週2回処理する。骨および柔軟組織における腫瘍成長を、Xenogen IVISシステムにて、培養ルミネセントイメージングを用いてモニターし、腫瘍中のルシフェラーゼシグナルを毎週1回測定する。別法として、インプラントから1〜3週間の後に、Xenogen IVIS(Living Image 2.5ソフトウエアを備えたXenogen 100シリーズ)システムを用いて動物をイメージし、抗体処理の開始に先立ってルシフェラーゼシグナルに基づいてグループにランダム化する。主要の成長応答を、Xenogen IVISイメージングによって毎週1回評価する。
Claims (43)
- 哺乳動物において、正常な隣接組織試料またはプールされた正常な組織試料に対して少なくとも3倍上昇される腫瘍細胞抗原を発現する癌を診断し、検出し、または治療する方法であって、治療上有効量の該腫瘍細胞抗原に結合する抗体またはその断片を該哺乳動物に投与することを含み、該腫瘍細胞抗原はKIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GRP160、GPCR41、およびSLC1A5の群から選択される、方法。
- 前記抗体がヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはその断片である、請求項1記載の抗体またはその断片。
- 前記断片がFv、F(ab’)2、Fab’およびFabからなる群より選択される請求項1記載の抗体またはその断片。
- 前記抗体またはその断片が、前記腫瘍細胞抗原の細胞外ドメインに特異的に結合し、ここに、該腫瘍細胞抗原はKIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GPR160、GPCR41、およびSLC1A5の群から選択される請求項1〜3のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
- 前記抗体がKIAA1815の細胞外ドメインに結合し、ここに、該細胞外ドメインはおよそ位置1〜408、およそ位置474〜489、およそ位置545〜581、およそ位置603〜621、およそ位置642〜653、およびおよそ位置674〜904のアミノ酸の群から選択される請求項4記載の抗体またはその断片。
- 前記抗体がBC017881の細胞外ドメインに結合し、ここに、該細胞外ドメインは、およそ位置1〜117、約140〜148、約165〜211、および約230〜240のアミノ酸の群から選択される請求項4記載の抗体またはその断片。
- 前記抗体がFLJ20421の細胞外ドメインに結合し、ここに、該細胞外ドメインがおよそアミノ酸位置30〜359である、請求項4記載の抗体またはその断片。
- 前記抗体がDSCD75の細胞外ドメインに結合し、ここに、該細胞外ドメインはおよそアミノ酸位置20〜208である、請求項4記載の抗体またはその断片。
- 前記抗体がGPR160の細胞外ドメインに結合し、ここに、該細胞外ドメインはおよそ位置1〜15、およそ位置80〜93、およそ位置157〜182、およびおよそ位置263〜276のアミノ酸の群から選択される、請求項4記載の抗体またはその断片。
- 前記抗体がGPCR41の細胞外ドメインに結合し、ここに、該細胞外ドメインがおよそ位置31〜49、およそ位置104〜112、およそ位置134〜145、およそ位置170〜195、およそ位置212〜270、およそ位置299〜307、およそ位置360〜368、およそ位置390〜403、およびおよそ位置427〜445のアミノ酸の群から選択される、請求項4記載の抗体またはその断片。
- 前記抗体またはその断片が免疫結合体である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の哺乳動物において癌を診断し、検出し、または治療する方法。
- 抗−腫瘍細胞抗原抗体またはその断片、または抗−腫瘍細胞抗原抗体融合蛋白質またはその断片を含む抗体を含み、ここに、該抗体の成分は少なくとも1つの診断/検出剤、または少なくとも1つの治療剤に結合する、請求項11記載の診断、検出または治療免疫結合体。
- 前記診断/検出剤が少なくとも1つの光活性診断/検出剤を含み、ここに、該光活性診断剤が色素原(chromagen)または色素を含む、請求項12記載の診断/検出免疫結合体。
- 前記免疫結合体が手術中、内視鏡、または血管内腫瘍検出/診断で用いられる、請求項12記載の診断/検出免疫結合体。
- 前記治療剤が放射性核種、ホウ素、ガドリニウムまたはウラン原子、免疫モジュレーター、サイトカイン、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、酵素阻害剤、光活性治療剤、細胞傷害性薬物、トキシン、脈管形成阻害剤、異なる抗体、およびその組合せからなる群より選択される請求項12記載の治療免疫結合体。
- 前記細胞傷害性薬物が薬物、プロドラッグ、酵素またはトキシンである請求項15記載の治療免疫結合体。
- 前記細胞傷害性薬物がカリケアミシンまたはカリケアミシンアナログ、メイタンシンまたはメイタンシン誘導体、またはオーリスタチンEまたはオーリスタチンE誘導体である請求項15記載の治療免疫結合体。
- 前記細胞傷害性薬物がトキシンまたはその断片であり、ここに、該トキシンが植物、微生物および動物トキシン、およびその合成変形物からなる群より選択される請求項15記載の治療免疫結合体。
- 前記免疫モジュレーターがサイトカイン、幹細胞成長因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子(CSF)、インターフェロン(IFN)、幹細胞成長因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、抗体およびその組合せからなる群より選択される請求項15記載の治療免疫結合体。
- 前記酵素がプロドラッグ−活性化酵素である請求項15記載の治療免疫結合体。
- 前記プロドラッグ−活性化酵素がアルカリホスファターゼ、アリールスルファターゼ、シトシンデアミナーゼ、プロテアーゼ、D−アラニルカルボキシペプチダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼのような炭水化物−切断酵素、ベータ−ラクタマーゼ、ペニシリンアミダーゼ;および酵素活性を持つ抗体の群から選択される請求項20記載の治療免疫結合体。
- 腫瘍細胞抗原に対する親和性を有する1以上の抗原結合部位、およびエピトープに対して親和性を有する1以上のエピトープ結合部位を含む、多価、多特異的抗体またはその断片であって、該腫瘍細胞抗原はKIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GPR160、GPCR41、およびSLC1A5の群から選択される、多価、多特異的抗体またはその断片。
- 前記多価、多特異的抗体またはその断片が、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、請求項22記載の多価、多特異的抗体またはその断片。
- さらに、診断剤/検出剤または治療剤を含む請求項22記載の多価、多特異的抗体またはその断片。
- 少なくとも2つの抗−腫瘍細胞抗原抗体またはその断片を含む、抗体融合蛋白質またはその断片であって、該抗体またはその断片が請求項1記載の抗−腫瘍細胞抗原抗体またはその断片から選択される、抗体融合蛋白質またはその断片。
- 哺乳動物において癌を治療する方法であって、治療上有効量の請求項1〜25のいずれか一項に記載の抗体またはその断片で治療することを含み、該抗体は治療上許容される処方物に処方される、方法。
- 哺乳動物において癌を診断/検出する方法であって、該哺乳動物に、医薬上許容されるビヒクルに処方された、請求項1〜26いずれか記載の抗体またはその断片の診断上有効量を投与する工程を含む、方法。
- 哺乳動物において癌を治療、または診断/検出する方法であって、
(i)それを必要とする哺乳動物に、請求項1〜27のいずれか一項に記載の抗体またはその断片を投与する工程;
(ii)ある量の非−結合蛋白質が該哺乳動物の血流を浄化するのに十分な時間待機する工程;ならびに、
(iii)該哺乳動物に、該抗体の結合部位に結合する、診断剤、治療剤、またはその組合せを含む担体分子を投与する工程を含む、方法。 - 請求項1〜28のいずれか一項に記載の抗−腫瘍細胞抗原抗体、またはその断片、または免疫結合体をコードする核酸を含むDNA配列。
- 請求項29記載のDNA配列を含む発現ベクター。
- 請求項30記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 診断剤/検出剤または治療剤、またはその組合せを標的に送達する方法であって、
(i)請求項1〜31のいずれか一項に記載の抗体またはその断片を含む免疫結合体を含む組成物を提供する工程;および
(ii)それを必要とする哺乳動物に該組成物を投与する工程
を含む、方法。 - 哺乳動物において癌を治療する方法であって、医薬上適当な賦形剤中に処方された、請求項1〜32のいずれか一項に記載の抗体を含む、少なくとも2つの抗体またはその断片を含む治療上有効量の抗体またはその断片を該哺乳動物に投与することを含む、方法。
- さらに、請求項1に記載されていない第二の抗体またはその断片を含む請求項33記載の方法。
- さらに、請求項1記載の第二の抗体またはその断片を含む請求項33記載の方法。
- 前記第二の抗体が治療剤または診断剤/検出剤に結合体化されている、請求項33記載の方法。
- 前記抗−腫瘍細胞抗原抗体またはその断片が、悪性疾患によって発現された第二の腫瘍細胞抗原と反応性である第二の結合体化された抗体が前記哺乳動物に投与される前にか、投与されるのと一緒にか、または投与された後に投与される請求項34記載の方法。
- 前記抗−腫瘍細胞抗原抗体が、用量あたり10ng/kg哺乳動物の体重から最大100mg/kg哺乳動物の体重までの投与量で投与される、請求項1〜37のいずれか一項に記載の方法。
- 前記投与量が反復して投与される、請求項38記載の方法。
- 請求項1〜39のいずれか一項に記載の抗体または免疫結合体を用いることを含む、哺乳動物において乳癌、前立腺癌、または結腸癌を検出または診断する方法。
- 請求項1〜40のいずれか一項に記載の抗体または免疫結合体を用いることを含む、哺乳動物において乳癌、前立腺癌または結腸癌を治療する方法。
- 哺乳動物において乳癌、前立腺癌または結腸癌を治療する方法であって、請求項1〜41のいずれか一項に記載の抗体または免疫結合体を用いることを含み、該腫瘍細胞抗原がKIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GPR160、GPCR41、およびSLC1A5の群から選択される、方法。
- 哺乳動物において癌を診断または検出するためのキットであって、該キットは:
d)請求項1〜42のいずれか一項に記載の抗体またはその断片、免疫結合体またはその断片であって、該抗体または断片は腫瘍細胞抗原に特異的に結合することができ、該腫瘍細胞抗原はKIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GPR160、GPCR41、およびSLC1A5の群から選択される、抗体またはその断片、免疫結合体またはその断片;
e)該哺乳動物における該癌の診断または検出を可能とする検出方法;ならびに
該キットを使用するための説明書
を含むキット。
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