KR20080110810A - 항-종양 세포 항원 항체 치료제 - Google Patents

항-종양 세포 항원 항체 치료제 Download PDF

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Abstract

암은 정상 인접 조직에 비하여 증가된 종양 세포 항원을 발현하며, 종양 세포 항원에 결합하는 항체 또는 항체 절편을 투여하여 암을 진단, 검출 또는 치료하는 방법. 이 방법은 종양 세포 항원 KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, 및 SLC1A5에 결합하는 항체를 사용하는 것과 관계되어 있다.
종양 세포 항원, 항체 또는 항체 절편, 암 진단, 암 검출, 암 치료.

Description

항-종양 세포 항원 항체 치료제{ANTI-TUMOR CELL ANTIGEN ANTIBODY THERAPEUTICS}
본 발명은 일반적으로 인체 적응형 항-암 항체를 포함하는 항-종양 세포 항원 작용제 또는 길항제 및 이러한 항체를 이용한 진단 및/또는 치료 방법에 관한 것이다.
항-암 치료제 개발에 있어서 상당한 진보가 있었음에도 불구하고, 암은 전체 인구의 사망원인의 2위로 남아있다(최신의 통계에 의하면, 2002년에 22.8%). 사실, 미국 남성은 일생 동안 어떠한 형태의 암을 발달시키는 2 번 중 1 번의 기회를 갖게 된다고 추정되며, 반면에 미국 여성은 3번 중의 1번의 기회를 갖게된다(www.cancer.org). 대부분의 종래의 암 치료제는 활동적으로 증식하는 세포를 사멸시킴으로써 작용하며, 결과적으로 종종 비-특이적이어서, 건강한 조직에 손상을 줄 수 있거나 또는 전신 독성을 나타내기도 한다. 인체 내에서 건강한 정상 세포에서 표적화된 암 세포를 식별하기 위한 노력으로 종양 세포 내에서 발현되는 마커를 탐색하고 확인하기 위한 대안적 접근법을 찾고 있다. 이러한 종양 마커의 결합 파트너로서 활동하며, 그 다음 종양 세포 자신에 직접적으로 작용하거나, 또는 이러한 암성 세포에 대한 면역학적 반응을 유발시키거나, 또는 치료제 탑재량의 일정 방식을 선택적으로 전달하는, 작용제/길항제 분자 또는 항체를 개발할 수 있다(Houshmand 및 Zlotnik (2003) Current Opinion in Cell Biology 15(5):640-44).
치료적 또는 진단적 용도로 인가되거나 또는 전임상적 및 임상적으로 개발 중인 몇 종의 항-암 항체 치료제가 있다. 현재 사용가능한 인가된 치료적 항-암 항체는 만성 림프성 백혈병(CLL)용 알렘투주맵(Campath, ILEX Oncology 및 Schering AG), 비-호지킨성 림프종(NHL)용 리툭시맵(Rituxan, IDEC 및 Hoffmann-LaRoche), 및 유방암용 트라스투주맵(Herceptin, Genentech 및 Hoffmann-LaRoche)을 포함한다. 현재 임상 시험중인 분자의 몇 종의 예는 소세포 폐암용 항체 huN901-DM1(면역gen), 전립선암용 비바투주맵 메르탄신(MLN2704, Millennium), 및 전립선, 난소 및 유방암용 페르투주맵(Omnitarg,Genentech)을 포함한다(Krauss (2003) MoI. Biotechnol 25(1): 1-17). 일반적으로 이러한 항체는 종양 세포의 표면에서 발견되는 특이적 단백질을 표적화하며, 종양 세포에 대한 일종의 면역원성 반응을 유발시킴으로써 작용한다(예를 들면, 보체-의존성 세포독성(CDC) 또는 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC)), 또는 항체는 접합된 세포독성있는 실체(entities)를 항체와 종양 세포 마커의 상호작용을 하는 표적화 세포에 전달한다.
인가된 항-암 항체 치료제가 증가함에도, 이 분야에서 미개발된 상당한 수요가 잔존해 있다. 인가된 치료제의 일부는 유관된 상당한 세포독성을 보유하는 것으로 알려져 있다. 많은 역 반응은 치료적 항체와 건강한 비-종양 조직간의 비특이적이고, 원치 않았던 상호작용에 기인한다. 이와 함께, 모든 환자가 현재 인가된 항체 치료제를 사용하는 소망하는 정도로 반응하는 것은 아니다. 따라서, 암 세포에 더욱 선택적으로 종양 세포 항원을 표적화하는 치료제의 개발은 암 치료제 분야에서 중대한 진보를 보인다.
항-암 항체의 개발에 사용하기 위하여 종양 세포 마커를 선택하는 경우, 가장 바람직한 마커는 각 종양 유형의 환자의 대다수의 암세포에서만 다량으로, 균일하게 발현되나 다른 모든 조직에서는 발현되지 않는 것이 될 것이다. 불행하게도, 이러한 특이성 수준을 현시하는 마커는 극소수이기 때문에, 따라서, 건강한 조직과 특이적 암성 조직 사이의 수용할만한 양의 발현차를 나타내는 마커를 찾아 내야한다. 예를 들면, 현재 인가된 항체 치료제가 인식하는 단백질은 CD52(Campath), CD20(Rituxan, US5736137), Zevalin, Bexxar, HER2(Herceptin, US5821337), EGFR(Erbitux) 및 VEGF(Avastatin)를 포함한다. 다수의 이러한 세포성 마커는 건강한 조직뿐만 아니라 암 세포에서도 발현하나 종종 정상 조직에 비하여 암에서 더 고도로 발현한다(Flynn and Byrd (2000) Current Opinion in Oncology 12(6): 574). 이러한 조직 특이성 고려는 잠재적 세포독성 약물을 수반할 수 있는 면역접합 항체 구조에 대한 중요한 문제이다.
암 세포의 특이적 표적화는 항암 치료제의 개발의 상당한 진보를 제공한다. 일정한 유형의 암에 유관된 수종의 마커를 확인했음에도, 건강한 조직을 손상시키지 않는 잠재적인 항-암 치료제의 개발을 위하여, 개개의 암 유형에 더 특이적인 추가의 마커에 대한 현저한 수요가 존재한다. 인체 내에서 정상 세포를 해하지 않는 항체 유래 암 치료제를 통한 표적화제의 개발에서 이러한 마커의 탐색은 분명하고, 상당한 의학적 수요와 함께 이 분야의 중대한 치료적 진보를 제공한다.
발명의 개요
본 발명은 포유류 내의 암에 대한 진단 및/또는 치료 방법을 제공한다. 이 방법은 항-종양 항원 작용제 또는 길항제의 유효량을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 종양 항원은 정상 조직에 비하여 발현이 최소한 3배 증가한 것으로 정의되며, 종양 항원은 KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, 및 SLC1A5의 군에서 선택된다. 본 발명의 특정 실시상태에서, 작용제 또는 길항제는 항-종양 세포 항원 항체 또는 소분자이다.
본 발명의 다른 실시상태에서, 본 발명은 종양 세포 항원을 후보 분자와 접촉시키는 단계를 포함하는 종양 세포 항원에 대한 작용제 또는 길항제를 확인하는 방법 및 상기 종양 세포 항원에 의하여 매개된, 또는 상기 후보 분자와 상기 종양 세포 항원의 상호작용에 의하여 매개된 생물학적 효과를 모니터링 하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 실시상태에서, 본 발명은 담체와 조합하여, 전술한 종양 세포 항원의 작용제 또는 길항제, 또는 항-종양 세포 항원 항체를 포함하는 물질의 조성물에 관한 것이다. 선택적으로, 담체는 약학적으로 허용가능한 담체이다.
본원에서는 다양한 형태의 항체를 고려하였다. 예를 들면, 항-종양 항원 항체는 전장 항체(예컨대, 인간 면역글로블린 불변 영역을 보유함) 또는 항체 절편(예컨대, F(ab'2), Fv 또는 단일 사슬 항체 또는 표적과 특이적으로 결합하는 다른 기능성 절편)이 될 수 있다. 이와 함께, 항체는 검출가능한 라벨로 표지되고, 고체 상에 고정되며, 및/또는 이종 화합물(예컨대 세포독성제)와 접합될 수 있다. 항체는 유인 영장류 항-종양 세포 항원 항체, 뮤린 단클론 항-종양 세포 항원 항체, 키메라 항-종양 세포 항원 항체, 인간 항-종양 세포 항원 항체, 및 인체 적응형 항-종양 세포 항원 항체의 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 인체 내에서 암을 진단 또는 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 바람직한 형태의 암은 결장, 직장 또는 직장직장, 유방, 및 전립선암을 포함하며, KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, 및 SLC1A5의 군으로부터 선택된 종양 항원에 결합한 항체의 유효량을 인간에 투여하는 단계를 포함한다.
항체의 진단적 용도를 고려하였다. 진단적 응용에 있어서, 본 발명은 종양 세포 항원을 함유하는 것으로 의심되는 시료를 본 발명의 항체에 노출시키는 단계 및 항체와 시료의 결합을 결정하는 단계를 포함하며, KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, 및 SLC1A5의 군으로부터 선택된 종양 세포 항원의 존재를 결정하는 방법을 제공한다. 이러한 용도에서, 본 발명은 항체 및 종양 세포 항원을 검출하기 위하여 항체를 사용하기 위한 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 추가의 실시상태에서, 본 발명은 상기 방법에 (그중에서도 특히) 사용하기 위한 제조 물품을 제공한다. 예를 들면, 본 발명은 용기 및 그 안에 함유된 조성물을 포함하는 제조 물품을 제공하며, 여기서 조성물은 본 발명의 작용제/길항제 또는 항체에 결합된 종양 세포 항원의 하나를 발현하는 암을 치료하기 위하여 사용될 수 있으며, 조성물이 KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, 및 SLC1A5의 군에서 선택된 종양 항원 중의 하나를 발현하는 암을 치료하기 위하여 사용할 수 있다는 것을 나타내는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 추가로: 항체를 암호화하는 분리된 항체; 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 의하여 인식되는 조절 서열에 선택적으로 작동가능하게 링크된 핵산을 포함하는 벡터; 벡터를 포함하는 숙주 세포; 숙주 세포를 배양하여 핵산을 발현시키는 단계를 포함하고, 선택적으로, 숙주 세포 배양물로부터(예컨대 숙주 세포 배양 배지로부터) 항체를 회수하는 단계를 추가적으로 포함하는 단계를 포함하는 항체의 생산 절차를 제공한다.
본 발명은 추가적으로 하나 이상의 이종 분자에 접합되며, KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, 및 SLC1A5의 군으로부터 선택된 종양 세포 항원에 결합한 항체를 포함하는 면역접합체 및 이러한 암 치료용 접합체의 용도에 관한 것이며, 여기서 암성 세포는 인체 내에서 KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, 및 SLC1A5로부터 선택된 종양 항원의 하나를 발현한다. 면역접합체 내의 항체는 무손상 항체(예컨대, 무손상 IgG1 항체) 또는 항체 절편(예컨대 Fab, F(ab)2, 이합체 등)이 될 수 있다.
본 발명은 다가, 다특이적 항체 또는 그것의 절편용으로 제공되며, 여기서 다가 항체는 KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, 및 SLC1A5의 군으로부터 선택된 종양 세포 항원에 대한 친화도를 지닌 결합 부위 및 추가적인 결합 부위 중의 하나를 보유한다.
본 발명은 진단/검출용 약제 또는 치료제를 KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, 및 SLC1A5의 군으로부터 선택된 종양 세포 항원을 발현하는 종양 세포에 전달하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 본 발명의 항체 또는 면역접합 조성물을 제공하는 단계 및 이들을 필요로하는 환자에 이들을 투여하는 단계를 포함한다.
또한 본 발명에서 고려된 것은 암의 검출/진단 또는 치료를 위한 두 항체 또는 그것의 절편의 용도이며, 여기서 최소한 하나의 항체 또는 절편은 KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, 및 SLC1A5의 군으로부터 선택된 종양 세포 항원에 결합한다.
본 발명의 일 실시상태는 포유류 내의 암을 진단, 검출 또는 치료하는 방법이며, 여기서 암은 정상 인접 조직 시료 또는 풀이 형성된 정상 조직 시료에 비하여 최소한 3배 증가된 종양 세포 항원을 발현하고, 그 종양 세포 항원에 결합하는 항체 또는 그것의 절편의 치료적 유효량을 포유류에 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 종양 세포 항원은 KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, 및 SLC1A5의 군으로부터 선택된다.
본 발명의 선호하는 실시상태에서, 항체 또는 그것의 절편은 인간, 인체 적응형, 키메라 또는 그것의 절편이다.
본 발명의 또 다른 실시상태에서, 항체 또는 그것의 절편은 Fv, F(ab')2, Fab' 및 Fab로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특히 바람직한 실시상태에서, 포유류 내의 암의 진단, 검출 또는 치료 방법에 사용된 항체 또는 그것의 절편은 종양 세포 항원의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하며, 여기서 종양 세포 항원은 KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, 및 SLC1A5의 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 실시상태에서, 포유류 내의 암의 진단, 검출 또는 치료 방법에 사용되는 항체 또는 그것의 절편은 KIAA1815의 세포외 도메인에 결합하며, 세포외 도메인은 약 1-408 위치, 약 474-489 위치, 약 545-581 위치, 약 603-621 위치, 약 642-653 위치, 약 674-904 위치의 아미노산의 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 실시상태에서, 포유류 내의 암의 진단, 검출 또는 치료 방법에 사용된 항체 또는 그것의 절편은 BC017881의 세포외 도메인에 결합하며, 세포외 도메인은 약 1-117 위치, 약 140-148 위치, 약 165-211 위치, 약 230-240 위치의 아미노산의 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 실시상태에서, 포유류 내의 암의 진단, 검출 또는 치료 방법에 사용되는 항체 또는 그것의 절편은 FLJ20421의 세포외 도메인에 결합하며, 세포외 도메인은 약 30-359 위치의 아미노산이다.
본 발명의 또 다른 실시상태에서, 포유류 내의 암의 진단, 검출 또는 치료 방법에 사용되는 항체 또는 그것의 절편은 DSCD75의 세포외 도메인에 결합하며, 세포외 도메인은 약 20-208 위치의 아미노산이다.
본 발명의 또 다른 실시상태에서, 포유류 내의 암의 진단, 검출 또는 치료 방법에 사용되는 항체 또는 그것의 절편은 GPR160의 세포외 도메인에 결합하며, 세포외 도메인은 약 1-15 위치, 약 80-93 위치, 약 157-182 위치, 약 263-276 위치의 아미노산의 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 실시상태에서, 포유류 내의 암의 진단, 검출 또는 치료 방법에 사용되는 항체 또는 그것의 절편은 GPCR41 세포외 도메인에 결합하며, 세포외 도메인은 아미노산 위치, 약 31-49 위치, 약 104-112 위치, 약 134-145 위치, 약 170-195 위치, 약 212-270 위치, 약 299-307 위치, 약 360-368 위치, 약 390-403 및 약 427-445 위치의 아미노산의 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 실시상태에서, 포유류 내의 암의 진단, 검출 또는 치료 방법에서 사용된 항체 또는 그것의 절편은 면역접합체이다.
본 발명의 선호하는 실시상태에서, 항-종양 세포 항원 항체 또는 그것의 절편 또는 항-종양 세포 항원 항체 융합 단백질 또는 그것의 절편을 포함하는 항체를 포함하는 진단, 검출 또는 치료용 면역접합체는 최소한 하나의 진단/검출용 약제 또는 최소한 하나의 치료제에 결합되어 있다.
본 발명의 또 다른 실시상태에서, 진단/검출용 면역접합체는 최소한 하나의 광활성 진단/검출용 약제를 포함하는 진단/검출용 약제를 포함하며, 여기서 광활성 진단용 약제는 크로마겐 또는 염료를 포함한다.
본 발명의 선호하는 실시상태에서, 진단/검출용 면역접합체는 수술중, 내시경, 또는 혈관내 종양 검출/진단에 사용된다.
본 발명의 다른 실시상태에서, 치료용 면역접합체는 방사선핵종, 붕소, 가돌리늄 또는 우라늄 원자, 면역조절제, 사이토카인, 호르몬, 호르몬 길항제, 효소, 효소 억제제, 광활성 치료제, 세포독성 약물, 독소, 혈관형성 억제제, 서로 다른 항체 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 치료제를 포함한다.
본 발명의 추가적인 실시상태에서, 치료용 면역접합체는 약물, 전구약물, 효소 또는 독소인 세포독성 약물을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시상태에서, 치료용 면역접합체는 칼리키마이신 또는 칼리키마이신 유사체, 메이탄신 또는 메이탄신 유도체 또는 아우리스타틴(auristatin) E 또는 아우리스타틴 E 유도체인 세포독성 약물을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시상태에서, 치료용 면역접합체는 독소 또는 그것의 절편인 세포독성 약물을 포함하며, 여기서 상기 독소는 식물, 미생물, 및 동물 독소, 및 이들의 합성 변이체로 구성되는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 실시상태에서, 치료용 면역접합체는 사이토카인, 줄기 세포 성장 인자, 림프독소, 조혈 인자, 집락 자극 인자(CSF), 인터페론(IFN), 줄기 세포 성장 인자, 에리스로포이에틴, 트롬보포이에틴, 항체 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 면역조절제를 포함한다.
본 발명의 선호하는 실시상태에서, 치료용 면역접합체는 전구약물-활성화 효소인 효소를 포함한다.
본 발명의 추가적인 실시상태에서, 치료용 면역접합체는 알칼리성 인산분해효소 , 아릴설파타아제, 사이토신 디아미나아제, 프로테아제, D-알라닐카르복시펩티다아제, 탄수화물-분해 효소 예컨대 베타-갈락토시다아제 및 뉴라미니다아제, 베타-락타마아제, 페니실린 아미다아제, 및 효소 활성을 지닌 항체로 구성되는 군으로부터 선택된 전구약물-활성화 효소를 포함한다.
본 발명의 추가적인 실시상태에서, 다가, 다특이적 항체 또는 그것의 절편은 종양 세포 항원에 친화도를 지닌 하나 이상의 항원 결합 부위 및 에피토프에 친화도를 지닌 하나 이상의 에피토프 결합 부위를 포함하며, 여기서 상기 종양 세포 항원은 KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41 및 SLC1A5의 군으로부터 선택된다.
본 발명의 선호하는 실시상태에서, 다가, 다특이적 항체 또는 그것의 절편은 인간, 인체 적응형 또는 키메라인 다가, 다특이적 항체 또는 그것의 절편을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시상태에서, 다가, 다특이적 항체 또는 그것의 절편은 진단/검출용 약제 또는 치료제를 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시상태에서, 항체 융합 단백질 또는 그것의 절편은 최소한 두 종의 항-종양 세포 항원 항체 또는 그것의 절편을 포함하며, 여기서 항체 또는 그것의 절편은 전술한 실시 상태에 따른 상기 항-종양 세포 항원 항체 또는 그것의 절편으로부터 선택된다.
본 발명의 선호하는 실시상태에서, 포유류 내의 암을 치료하는 방법은 전술한 실시 상태 중 어느 하나를 따른 항체 또는 그것의 절편의 치료적 유효량으로 치료하는 단계를 포함하며, 여기서 항체는 치료적으로 허용가능한 제형 중에 제형화되어 있다.
본 발명의 또 다른 실시상태에서, 포유류 내의 암을 진단/검출하는 방법은 약학적으로 허용가능한 운반체 중에 제형화된 전술한 실시 상태 중 어느 하나를 따른 항체 또는 그것의 절편의 진단적 유효량을 상기 포유류에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 실시상태에서, 포유류 내의 암을 치료 또는 진단/검출하는 방법은 (i) 전술한 실시 상태 중 어느 하나를 따른 항체 또는 그것의 절편을 이들이 필요한 포유류에 투여하는 단계; (ii) 비-결합 단백질의 양이 포유류의 혈관에서 제거되기에 충분한 시간을 대기하는 단계; 및 (iii) 상기 항체의 결합 부위에 결합하며, 진단용 약제, 치료제, 또는 이들의 조합을 포함하는 담체 분자를 상기 포유류에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 실시상태에서, 포유류 내의 암의 진단, 검출 또는 치료 방법은 전술한 실시 상태 중 어느 하나를 따른 항-종양 세포 항원 항체 또는 그것의 절편 또는 면역접합체를 암호화하는 핵산을 포함하는 DNA 서열을 포함한다.
본 발명의 추가적인 실시상태에서, 포유류 내의 암의 진단, 검출 또는 치료 방법은 전술한 실시 상태 중 어느 하나를 따른 항-종양 세포 항원 항체 또는 그것의 절편 또는 면역접합체의 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함한다.
본 발명의 추가적인 실시상태에서, 포유류 내의 암의 진단, 검출 또는 치료 방법은 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함한다.
본 발명의 다른 실시상태에서, 포유류 내의 암의 진단, 검출 또는 치료 방법은 (i) 전술한 실시 상태 중 어느 하나를 따른 항체 또는 그것의 절편을 포함하는 면역접합체를 포함하는 조성물을 제공하는 단계, 및 (ii) 이들이 필요한 포유류에 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 진단/검출용 약제 또는 치료제, 또는 이들의 조합을 표적에 전달하는 방법을 포함한다.
본 발명의 추가적인 실시상태에서, 항체 또는 그것의 절편의 치료적 유효량을 상기 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 포유류 내의 암을 치료하는 방법은 최소한 두 종의 항체 또는 그것의 절편을 포함하며, 약학적으로 적합한 부형제 중에 제형화된 전술한 실시 상태 중 어느 하나를 따른 항체의 사용을 포함한다.
본 발명의 추가적인 실시상태에서, 항체 또는 그것의 절편의 치료적 유효량을 상기 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 포유류 내의 암을 치료하는 방법은 종양 세포 항원에 결합하지 않는 제2 항체 또는 절편을 추가로 포함하며, 여기서 종양 세포 항원은 KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, 및 SLC1A5의 군으로부터 선택된다.
본 발명의 추가적인 실시상태에서, 항체 또는 그것의 절편의 치료적 유효량을 상기 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 포유류 내의 암을 치료하는 방법은 종양 세포 항원에 결합하는 제2 항체 또는 절편을 추가로 포함하며, 여기서 종양 세포 항원은 KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, 및 SLC1A5의 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 실시상태에서, 항체 또는 그것의 절편의 치료적 유효량을 상기 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 포유류 내의 암을 치료하는 방법은 제2 항체 또는 그것의 절편을 추가로 포함하며, 여기서 제2 항체는 치료 또는 진단/검출용 약제와 접합된다.
본 발명의 추가적인 실시상태에서, 포유류 내의 암을 치료하는 방법은 항체 또는 그것의 절편의 치료적 유효량을 상기 포유류에 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 항-종양 세포 항원 항체 또는 그것의 절편은 2차 접합된 항체가 상기 악성종양에서 발현되는 제2 종양 세포 항원에 반응하기 전, 동시 또는 이 후에 투여된다.
본 발명의 다른 실시상태에서, 전술한 실시 상태 중 어느 하나를 따른 방법은 1회 투약당 10ng/kg의 포유류 체중 내지 100mg/kg의 포유류 체중의 투약량으로 투여된 항-종양 세포 항원 항체의 사용을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시상태에서, 전술한 실시 상태 중 어느 하나를 따른 방법은 항-종양 세포 항원 항체의 사용을 포함하며, 여기서 투약량은 반복적으로 투여된다.
본 발명의 선호하는 실시상태에서, 포유류 내의 유방, 전립선 또는 결장암을 검출 또는 진단하는 방법은 전술한 실시 상태 중 어느 하나를 따른 항체 또는 면역접합체의 사용을 포함한다.
본 발명의 선호하는 실시상태에서, 포유류 내의 유방암, 전립선암 또는 결장암을 치료하는 방법은 전술한 실시 상태 중 어느 하나를 따른 항체 또는 면역접합체의 사용을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시 상태에서, 포유류 내의 유방암, 전립선암 또는 결장암을 치료하는 방법은 전술한 실시 상태 중 어느 하나를 따른 항체 또는 면역접합체의 사용을 포함하며, 여기서 종양 세포 항원은 KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, 및 SLC1A5의 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 실시상태에서, 방법은 포유류 내의 암의 검출 또는 진단용 키트를 포함하며, 여기서 상기 키트는:
a) 항체 또는 절편은 종양 세포 항원에 특이적으로 결합가능하며, 상기 종양 세포 항원은 KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, 및 SLC1A5의 군으로부터 선택되는, 전술한 실시 상태 중 어느 하나를 따른 항체 또는 그것의 절편, 또는 면역접합체 또는 그것의 절편;
b) 상기 포유류 내의 상기 암의 진단 또는 검출을 가능하게 하는 검출 방법; 및
c) 이 키트의 사용 설명서.
도 1은 암성 조직 및 정상 조직 둘 모두에서의 종양 세포 항원 KIAA1815의 마이크로어레이 발현 분석의 그래프를 나타낸다.
도 2는 암성 조직 및 정상 조직 둘 모두에서의 종양 세포 항원 LOC157378의 마이크로어레이 발현 분석의 그래프를 나타낸다.
도 3은 암성 조직 및 정상 조직 둘 모두에서의 종양 세포 항원 FLJ20421의 마이크로어레이 발현 분석의 그래프를 나타낸다.
도 4는 암성 조직 및 정상 조직 둘 모두에서의 종양 세포 항원 GPR160의 마이크로어레이 발현 분석의 그래프를 나타낸다.
도 5는 암성 조직 및 정상 조직 둘 모두에서의 종양 세포 항원 GPCR41의 마이크로어레이 발현 분석의 그래프를 나타낸다.
도 6는 암성 조직 및 정상 조직 둘 모두에서의 종양 세포 항원 SLC1A5의 마이크로어레이 발현 분석의 그래프를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
I. 정의
달리 적시하지 않는다면, 용어 "KIAA1815"를 본원에서 사용하는 경우 인간 게놈 내의 미지의 기능의 단백질을 의미하며, 여기서 단백질은 원래 FLJ23309로 알려져 있다. 유전좌의 다른 이름은 LLID79956 또는 bA207C16.3이다. KIAA1815 유전자는 이론상의 아미노펩티다아제 도메인을 함유한다. KIAA1815는 모든 포유류로부터 유도할 수 있으나, 인간으로부터 유도하는 것이 바람직하다. KEAA1815는 천연 공급원의 분자로부터 분리되거나 또는 합성 수단에 의하여 제조될 수 있다(예컨대, 재조합 DNA 기법을 사용). 인간 KEAA1815의 핵산 서열은 인증 번호 NM_024896로 NIH NCBI 서열 뷰어 웹사이트 상에서 검색할 수 있으며, 예를 들면 아미노산 서열은 인증 번호 NP_O79172를 사용하여 검색할 수 있다. KIAA1815는 암 세포 내에서 배타적으로 발현되는 모든 KIAA1815 변이체를 의미하며, 여기서 비-암성 세포 내에서 발현하는 KIAA1815와의 아미노산 상동성은 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%일 수 있다. 본 발명의 다른 실시 상태에서, KIAA1815는 D19Wsul2e로 알려진 인간 KIAA1815의 마우스 상동체가 될 수 있다. 다른 이름은 Fxna, mgC28280, mFLJ23309 및 D19Ertd410e이다. 마우스 D19Wsul2e의 핵산 서열은 인증 번호 XM_358328로 NIH NCBI 서열 뷰어 웹사이트에서 검색할 수 있다. 다른 실시상태로서, KIAA1815는 Fxna로 알려진 인간 KIAA1815 유전자의 레트 상동체일 수 있다. 레트 Fxna의 서열은 인증 번호 NM_184050를 사용하여 NIH NCBI 서열 뷰어 상에서 검색할 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시상태에서, KIAA1815는 인간 KIAA1815 유전자의 영장류 상동체일 수 있다. 예를 들면, 판 트로글로다이트(Pan troglodytes, chimpanzee) 상동체는 핵산 서열은 인증 번호 XM_526478, 또는 아미노산 서열은 XP520478를 사용하여 NCBI 서열 뷰어에서 찾을 수 있다.
"KIAA1815 ECD"는 KIAA1815 종양 세포 항원의 세포외 도메인(ECD)을 의미한다. KIAA1815 ECD는 암 세포를 배타적으로 발현하는 모든 KIAA1815 ECD 변이체를 의미한다. KIAA1815 ECD는 모든 단백질 또는 펩타이드를 의미하며, 여기서 아미노산 상동성은 세포 외부에 존재하는 단백질의 부분의 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 될 수 있다. 토폴로지 예상 프로그램을 사용하여 ECD를 포함하는 단백질의 영역을 평가하였다(실시예 2 참조). 다른 실시상태에서, KIAA1815 ECD는 인간 KIAA1815 ECD의 마우스, 레트 또는 영장류 상동체에서 유도된다.
달리 적시하지 않는다면, 용어 "BC017881"를 본원에서 사용하는 경우 LOC157378 또는 TMEM65라는 다른 이름으로 알려진 인간 게놈 내의 미지의 기능의 막관통 단백질을 의미한다. BC017881는 모든 포유류로부터 유도할 수 있으나, 인간으로부터 유도하는 것이 바람직하다. BCO17881는 천연 공급원의 분자로부터 분리되거나 또는 합성 수단에 의하여 제조될 수 있다(예컨대, 재조합 DNA 기법을 사용). 인간 BCO17881의 핵산 서열은 인증 번호 NM_194291로 NIH NCBI 서열 뷰어 웹사이트에서 검색할 수 있으며, 예를 들면. 아미노산 서열도 이와 같이 인증 번호 NP_919267를 사용하여 검색할 수 있다. BC017881는 암 세포 내에서 배타적으로 발현되는 모든 BC017881 변이체를 의미하며, 여기서 비-암성 세포 내에서 발현되는 BC017881와의 상동성은 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%일 수 있다. 본 발명의 다른 실시 상태에서, BC017881는 4930438D12Rik으로 알려진 인간 BC017881의 마우스 상동체가 될 수 있다. 4930438D12Rik의 다른 이름은 2610029O13Rik이다. 마우스 4930438D12Rik의 핵산 서열은 인증 번호 NM_175212로 NIH NCBI 서열 뷰어 웹사이트에서 검색할 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시상태에서, BC017881는 LOC500874로 알려진 레트 상동체가 될 수 있다. LOC500874의 핵산 서열은 인증 번호 XM_576273를 사용하여 NIH NCBI 서열 뷰어에서 검색할 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시상태에서, BC017881는 인간 BC017881 유전자의 영장류 상동체일 수 있다. 예를 들면, 판 트로글로다이트(Pan troglodytes, chimpanzee) 상동체는 핵산 서열 인증 번호 XM_528228, 또는 아미노산 서열 인증 번호 XP_528228를 사용하여 NCBI 서열 뷰어에서 찾을 수 있다.
"BC017881 ECD"는 BC017881 종양 세포 항원의 세포외 도메인(ECD)을 의미한다. BC017881 ECD는 암 세포를 배타적으로 발현하는 모든 BC017881 ECD 변이체를 의미한다. BC017881 ECD는 모든 단백질 또는 펩타이드를 의미하며, 여기서 아미노산 상동성은 세포 외부에 존재하는 단백질의 부분의 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 될 수 있다. 토폴로지 예상 프로그램을 사용하여 ECD를 포함하는 단백질의 영역을 평가하였다(실시예 2 참조). 다른 실시상태에서, BC017881 ECD는 인간 BC017881 ECD의 마우스, 레트 또는 영장류 상동체에서 유도된다.
달리 적시하지 않는다면, 용어 "FLJ20421"를 본원에서 사용하는 경우 BAA91158, IMPA3 및 Impad1의 다른 이름으로 알려진 인간 게놈 내의 미지의 기능의 미오-이노시톨(myo-inositol) 막관통 단백질을 의미한다. FLJ20421는 약 아미노산 62 내지아미노산 349 위치에 존재하는 잠정적 IPPase 도메인을 보유한다. FLJ20421는 모든 포유류로부터 유도할 수 있으나, 인간으로부터 유도하는 것이 바람직하다. FLJ20421는 천연 공급원의 분자로부터 분리되거나 또는 합성 수단에 의하여 제조될 수 있다(예컨대, 재조합 DNA 기법을 사용). 인간 FLJ20421의 핵산 서열은 인증 번호 BC067814로 NIH NCBI 서열 뷰어 웹사이트에서 검색할 수 있으며, 예를 들면 아미노산 서열도 이와 같이 인증 번호 AAH67814를 사용하여 검색할 수 있다. FLJ20421는 암 세포 내에서 배타적으로 발현되는 모든 FLJ20421 변이체를 의미하며, 여기서 비-암성 세포 내에서 발현되는 FLJ20421와의 상동성은 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%일 수 있다. 본 발명의 다른 실시 상태에서, FLJ20421는 Impad1으로 알려진 인간 FLJ20421의 마우스 상동체일 수 있다. Impad1는 AA08880, AI451589, AL022796, B23027P20 또는 1110001C29Rik로 알려져 있다. 마우스 Impad1의 핵산 서열은 인증 번호 NM_177730로 NIH NCBI 서열 뷰어 웹사이트에서 검색할 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시상태에서, FLJ20421는 RGD1306455로 알려진 인간 유전자 FLJ20421의 레트 상동체가 될 수 있다. RGD1306455의 핵산 서열은 인증 번호 XM_575759를 사용하여 NIH NCBI 서열 뷰어에서 검색할 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시상태에서, FLJ20421는 인간 FLJ20421 유전자의 영장류 상동체일 수 있다. 예를 들면, 판 트로글로다이트(Pan troglodytes, chimpanzee) 상동체는 핵산 서열 인증 번호 XM_519770, 또는 아미노산 서열 인증 번호 XP_519770를 사 용하여 NCBI 서열 뷰어에서 찾을 수 있다.
"FLJ20421 ECD"는 BC017881 종양 세포 항원의 세포외 도메인(ECD)을 의미한다. FLJ20421 ECD는 암 세포를 배타적으로 발현하는 모든 FLJ20421 ECD 변이체를 의미한다. FLJ20421 ECD는 모든 단백질 또는 펩타이드를 의미하며, 여기서 아미노산 상동성은 세포 외부에 존재하는 단백질의 부분의 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 될 수 있다. 토폴로지 예상 프로그램을 사용하여 ECD를 포함하는 단백질의 영역을 평가하였다(실시예 2 참조). 다른 실시상태에서, FLJ20421 ECD는 인간 FLJ20421 ECD의 마우스, 레트 또는 영장류 상동체에서 유도된다.
달리 적시하지 않는다면, 용어 "DSCD75"를 본원에서 사용하는 경우 중간엽 줄기 세포 내에서 발현되는 미지의 기능의 단백질을 의미하며, 약 아미노산 54 내지 아미노산 179 위치에 존재하는 티오에스테라아제 기능을 보유하는 것으로 예상되는 FcbC 도메인을 함유한다. DSCD75 유전좌의 다른 이름은 LOC51337 또는 C8orf55이다. DSCD75는 모든 포유류로부터 유도할 수 있으나, 인간으로부터 유도하는 것이 바람직하다. DSCD75는 천연 공급원의 분자로부터 분리되거나 또는 합성 수단에 의하여 제조될 수 있다(예컨대, 재조합 DNA 기법을 사용). 인간 DSCD75의 핵산 서열은 인증 번호 AF242773로 NIH NCBI 서열 뷰어 웹사이트에서 검색할 수 있으며, 예를 들면 아미노산 서열도 이와 같이 인증 번호 AAF65450를 사용하여 검색할 수 있다. DSCD75는 암 세포 내에서 배타적으로 발현되는 모든 DSCD75 변이체를 의미하며, 여기서 비-암성 세포 내에서 발현되는 DSCD75와의 상동성은 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%일 수 있다. 본 발명의 다른 실시 상태에서, DSCD75는 4930572J05Rik 또는 mgC54796로 알려진 인간 DSCD75 유전자의 마우스 상동체가 될 수 있다. 마우스 4930572J05Rik의 핵산 서열은 인증 번호 NM_198607로 NIH NCBI 서열 뷰어에서 검색할 수 있다. 다른 실시상태로서, DSCD75는mgC94661로 알려진 인간 DSCD75 유전자의 레트 상동체가 될 수 있다. 레트 DSCD75의 핵산 서열은 인증 번호 NM_001007658로 NIH NCBI 서열 뷰어에서 검색할 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시상태에서, DSCD75는 인간 DSCD75 유전자의 영장류 상동체가 될 수 있다. 예를 들면, 판 트로글로다이트(Pan troglodytes, chimpanzee) 상동체는 핵산 서열 인증 번호 XM_519991, 또는 아미노산 서열 인증 번호 XP_519991를 사용하여 NCBI 서열 뷰어에서 찾을 수 있다.
"DSCD75 ECD"는 BC017881 종양 세포 항원의 세포외 도메인(ECD)을 의미한다. DSCD75 ECD는 암 세포를 배타적으로 발현하는 모든 DSCD75 ECD 변이체를 의미한다. DSCD75 ECD는 모든 단백질 또는 펩타이드를 의미하며, 여기서 아미노산 상동성은 세포 외부에 존재하는 단백질의 부분의 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 될 수 있다. 토폴로지 예상 프로그램을 사용하여 ECD를 포함하는 단백질의 영역을 평가하였다(실시예 2 참조). 다른 실시상태에서, DSCD75 ECD는 인간 DSCD75 ECD의 마우스, 레트 또는 영장류 상동체에서 유도된다.
달리 적시하지 않는다면, 용어 "GPR160" 를 본원에서 사용하는 경우 미지의 기능의 수용체와 커플된 잠정적 G-단백질을 의미한다. 이는 다수의 다른 잠정적 G-단백질 수용체와 함께 문헌 Takeda et al.에서 설명하였다(FEBS Lett. 520 (1-3), 97-101 (2002)). GPCR1으로 알려진 하나 이상의 독특한 인간 유전좌가 존재함에도, 이는 또한 GPCR1, 또는 GPCR150으로 나타낸다. GPR160는 모든 포유류로부터 유도할 수 있으나, 인간으로부터 유도하는 것이 바람직하다. GPR160는 천연 공급원의 분자로부터 분리되거나 또는 합성 수단에 의하여 제조될 수 있다(예컨대, 재조합 DNA 기법을 사용). 인간 GPR160의 핵산 서열은 인증 번호 NM_014373로 NIH NCBI 서열 뷰어 웹사이트에서 검색할 수 있으며, 예를 들면 아미노산 서열은 이와 유사하게 인증 번호 NP_055188를 사용하여 검색할 수 있다. GPR160는 암 세포 내에서 배타적으로 발현되는 모든 GPR160 변이체를 의미하며, 여기서 비-암성 세포 내에서 발현되는 GPR160와의 상동성은 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%일 수 있다. 본 발명의 다른 실시 상태에서, GPCR160는 Gpr160으로 알려진 인간 GPCR160 유전자의 마우스 상동체가 될 수 있다. 마우스 Gpr160의 핵산 서열은 인증 번호 XM_896590로 NIH NCBI 서열 뷰어에서 검색할 수 있다. 다른 실시상태로서, GPR160는 Gpr160으로 알려진 인간 GPR160 유전자의 레트 상동체가 될 수 있다. 레트 Gpr160의 핵산 서열은 인증 번호 NM_001025147로 NIH NCBI 서열 뷰어에서 검색할 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시상태에서, GPR160는 인간 GPR160 유전자의 영장류 상동체가 될 수 있다. 예를 들면, 판 트로글로다이트(Pan troglodytes, chimpanzee) 상동체는 핵산 서열 인증 번호 XM_530685, 또는 아미노산 서열 인증 번호 XP_530685를 사용하여 NCBI 서열 뷰어에서 찾을 수 있다.
"GPR160 ECD"는 BC017881 종양 세포 항원의 세포외 도메인(ECD)을 의미한다. GPR160 ECD는 암 세포를 배타적으로 발현하는 모든 GPR160 ECD 변이체를 의미한다. GPR160 ECD는 모든 단백질 또는 펩타이드를 의미하며, 여기서 아미노산 상동성은 세포 외부에 존재하는 단백질의 부분의 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 될 수 있다. 토폴로지 예상 프로그램을 사용하여 ECD를 포함하는 단백질의 영역을 평가하였다(실시예 2 참조). 다른 실시상태에서, GPR160 ECD는 인간 GPR160 ECD의 마우스, 레트 또는 영장류 상동체에서 유도된다.
달리 적시하지 않는다면, 용어 "GPCR41" 를 본원에서 사용하는 경우 미지의 기능의 수용체와 커플된 잠정적 G-단백질을 의미한다. GPCR41는 PAR1 (프로테아제-활성화 수용체 1) 및 PERV-A 수용체 (돼지 내인성 레트로바이러스 수용체), D15Ertd747e 및 GPR172A로 알려져 있다. 돼지 내인성 레트로바이러스의 수용체는 문헌 Ericsson et al.에서 설명하였다(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (11), 6759-6764 (2003)). GPCR41은 아미노산 265-371의 DUF1011 도메인을 포함한다. DUF 도메인은 수종의 단백질에 의하여 공유된 미지의 기능의 도메인이다. GPCR41는 모든 포유류로부터 유도할 수 있으나, 인간으로부터 유도하는 것이 바람직하다. GPCR41는 천연 공급원의 분자로부터 분리되거나 또는 합성 수단에 의하여 제조될 수 있다(예컨대, 재조합 DNA 기법을 사용). 인간 GPCR41의 핵산 서열은 인증 번호 BC002917로 NIH NCBI 서열 뷰어 웹사이트에서 검색할 수 있다. 예를 들면, 아미노산 서열은 이와 유사하게 인증 번호 AAH02917를 사용하여 검색할 수 있다. GPCR41는 암 세포 내에서 배타적으로 발현되는 모든 GPCR41 변이체를 의미하며, 여기서 비-암성 세포 내에서 발현되는 GPCR41와의 상동성은 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%일 수 있다. 본 발명의 다른 실시 상태에서, GPRC41는 Gprl72b 또는 다른 이름인 GPCR, PAR2, GPCR42, D15Ertd747e 또는 2010003P03Rik로 알려진 인간 GPRC41 유전자의 마우스 상동체가 될 수 있다. 마우스 GPCR41 상동체의 서열은 인증 번호 NM_029643를 사용하여 NIH NCBI 서열 뷰어에서 검색할 수 있다. 예를 들면. 본 발명의 또 다른 실시상태에서, GPCR41는 LOC362942로 알려진 인간 GCPR41 유전자의 레트 상동체가 될 수 있다. 레트 GCPR41의 서열은 예를 들면 인증 번호 XM_343272를 사용하여 NIH NCBI 서열 뷰어에서 검색할 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시상태에서, GPCR41은 인간 GCPR41 유전자의 영장류 상동체일 수 있다. 예를 들면, 파피오 하마드리야스(Papio hamadryas, 비비원숭이) 상동체는 핵산 서열 인증 번호 AY070778, 또는 아미노산 서열 인증 번호 AAL59884를 사용하여 NCBI 서열 뷰어에서 찾을 수 있다.
"GPCR41 ECD"는 BC017881 종양 세포 항원의 세포외 도메인(ECD)을 의미한다. GPCR41 ECD는 암 세포를 배타적으로 발현하는 모든 GPCR41 ECD 변이체를 의미한다. GPCR41 ECD는 모든 단백질 또는 펩타이드를 의미하며, 여기서 아미노산 상동성은 세포 외부에 존재하는 단백질의 부분의 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 될 수 있다. 토폴로지 예상 프로그램을 사용하여 ECD를 포함하는 단백질의 영역을 평가하였다(실시예 2 참조). 다른 실시상태에서, GPCR41 ECD는 인간 GPCR41 ECD의 마우스, 레트 또는 영장류 상동체에서 유도된다.
달리 적시하지 않는다면, 용어 "SLC1A5" 를 본원에서 사용하는 경우 ASCT-2 또는 ATBO라는 중성 아미노산 트랜스포터를 의미하며, 중성 아미노산 예컨대 알라닌, 세린, 및 시스테인을 이송하는 나트륨 의존성 아미노산 트랜스포터로서 기능을 한다. 이와 함께, SLC1A5는 다수의 바이러스 예컨대 펠린 내인성 바이러스, 비비원숭이 내인성 바이러스, 인간 내인성 바이러스 타입 W 및 타입 D, 감염성 면역결핍에 유관된 영장류 또는 원숭이 레트로바이러스의 수용체로서 작용한다. 광범위(broad-scope), 중성 아미노산 트랜스포터 Bo에 대하여 문헌 Kekuda et al.에서 설명하였으며, 이는 인간 태반 세포주에서 분리되었다(J. Biol. Chem. 271 (31), 18657-18661 (1996)). SLC1A5은 약 아미노산 54 및 485의 보존성 나트륨 카르복실라아제 심포터(symporter) (SDF) 도메인을 포함한다. SLC1A5의 다른 이름은 R16, AAAT, M7V1, RDRC, 및 M7VS1을 포함한다. SLC1A5는 모든 포유류로부터 유도할 수 있으나, 인간으로부터 유도하는 것이 바람직하다. SLC1A5는 천연 공급원의 분자로부터 분리되거나 또는 합성 수단에 의하여 제조될 수 있다(예컨대, 재조합 DNA 기법을 사용). 인간 SLC1A5의 핵산 서열 인증 번호 BC000062로 NIH NCBI 서열 뷰어 웹사이트에서 검색할 수 있다. 예를 들면, 아미노산 서열은 이와 유사하게 인증 번호 AAH00062.1을 사용하여 검색할 수 있다. SLC1A5는 암 세포 내에서 배타적으로 발현되는 모든 SLC1A5 변이체를 의미하며, 여기서 비-암성 세포 내에서 발현되는 SLC1A5와의 상동성은 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%일 수 있다. 본 발명의 다른 실시 상태에서, SLC1A5는 Slc1a5 또는 다르게는 R16, AAAT, ATBO, M7V1, RDRC, ASCT2, M7VS1, Slc1a7 또는 mgC46952로 알려진 인간 SLC1A5 유전자의 마우스 상동체일 수 있다. 예를 들면, 마우스 Slc1a5의 서열은 인증 번호 NM_009201을 사용하여 NIH NCBI 서열 뷰어에서 검색할 수 있다. 다른 실시상태로서, Slc1a5는 Slc1a5, 또는 다르게는 Asct2, Slcla7 또는 H4-ASCT2로 알려진 인간 SLC1A5의 레트 상동체를 의미한다. 레트 Slc1a5 서열은 예를 들면, 인증 번호 NM_175758을 사용하여 NIH NCBI 서열 뷰어에서 검색할 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시상태에서, SLC1A5는 인간 SLC1A5 유전자의 영장류 상동체가 될 수 있다. 예를 들면, 마카카 파시큘라리스(Macaca fasicularis, 긴꼬리 원숭이) 상동체는 핵산 서열 인증 번호 AB168329, 또는 아미노산 서열 인증 번호 BAE00453.1를 사용하여 NCBI 서열 뷰어에서 찾을 수 있다.
"SLC1A5 ECD"는 BC017881 종양 세포 항원의 세포외 도메인(ECD)을 의미한다. SLC1A5 ECD는 암 세포를 배타적으로 발현하는 모든 SLC1A5 ECD 변이체를 의미한다. SLC1A5 ECD는 모든 단백질 또는 펩타이드를 의미하며, 여기서 아미노산 상동성은 세포 외부에 존재하는 단백질의 부분의 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 될 수 있다. 토폴로지 예상 프로그램을 사용하여 ECD를 포함하는 단백질의 영역을 평가하였다(실시예 2 참조). 다른 실시상태에서, SLC1A5 ECD는 인간 SLC1A5 ECD의 마우스, 레트 또는 영장류 상동체에서 유도된다.
"천연 서열" 폴리펩타이드는 자연으로부터 유도된 폴리펩타이드와 동일한 아미노산 서열을 보유하는 것이다. 이러한 천연 서열 폴리펩타이드는 자연으로부터 분리되거나 또는 재조합 또는 합성 수단으로 제조될 수 있다. 따라서, 천연 서열 폴리펩타이드는 자연발생적 인간 폴리펩타이드, 뮤린 폴리펩타이드, 또는 다른 포유류 종의 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 보유할 수 있다.
용어 "아미노산 서열 변이체"는 천연 서열 폴리펩타이드와 다소 다른 아미노산 서열을 보유한 폴리펩타이드를 의미한다. 일반적으로, 아미노산 서열 변이체는 최소한 하나의 천연 리간드의 수용체 결합 도메인 또는 자연 수용체의 최소한 하나의 리간드 결합 도메인과 최소한 약 70%의 상동성을 보유하게되며, 바람직하게는 이들은 이러한 수용체 또는 리간드 결합 도메인과 최소한 약 80%, 더 바람직하게는 최소한 약 90%의 상동성이 있다. 아미노산 서열 변이체는 천연 아미노산 서열의 아미노산 서열 내의 특정 포지션에서 치환, 결실, 및/또는 삽입을 보유하게 된다.
"상동성"은 필요하다면, 최대 백분율 상동성을 달성하기 위하여 서열 정렬과 갭 도입 후에 일치하는 아미노산 서열 변이체 내의 잔기의 백분율로 정의된다. 정렬(alignment)을 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.
용어 "길항제"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 이는 본원의 종양 세포 항원의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 전부 차단, 억제, 또는 중성화 시키는 모든 분자를 포함한다. 이와 유사한 방법으로, 용어 "작용제"도 가장 넓은 의미로 사용되며, 본원의 종양 세포 항원의 생물학적 활성을 모사하는 모든 분자를 포함한다. 적합한 작용제 또는 길항제 분자는 특히 작용제 또는 길항제 항체 또는 항체 절편, 종양 세포 항원의 절편 또는 아미노산 서열 변이체, 펩타이드, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 소 유기 분자, 등을 포함한다. 종양 세포 항원의 작용제 또는 길항제를 확인하는 방법은 대상 항원을 발현하는 양 세포와 후보 작용제 또는 길항제 분자를 접촉시키는 단계 및 정상적으로 종양 세포 항원에 관련된 하나 이상의 생물학적 활성의 검출가능한 변화를 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 길항제는 합리적인 설계 또는 파지 디스플레이로 생성된 펩타이드일수 있다(예컨대, W098/35036, 13 August 1998). 일 실시 상태에서, 선택된 분자는 항체의 CDR에 기초하여 설계된 "CDR 모방체" 또는 항체 유사체일 수 있다. 이러한 펩타이드는 자신에 대하여 길항제일 수 있는 반면, 펩타이드는 선택적으로 세포독성 약제에 융합되어 펩타이드의 길항제 특성을 부가 또는 증진시키게 된다.
"소분자"는 본원에서 약 500 달톤 이하의 분자량을 지니는 것으로 정의된다.
용어 "항체"는 본원에서 가장 광범위한 의미로 사용되며, 특히 소망하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 무손상 단클론 항체, 다클론 항체, 최소한 두종의 무손상 항체로부터 생성된 다특이적 항체(예컨대 이중특이적 항체), 단일 사슬 항체, 변형된 Fc 영역 및 항체 절편을 지닌 항체를 포괄하며, 여기서 소망하는 생물학적 활성은 소망하는 표적에 대한 결합 특이성을 보유하는 것으로 정의될 수 있다.
용어 "단클론 항체"는 본원에서 실질적으로 균일한 항체의 집단으로부터 획득한 항체를 의미하며, 즉, 집단을 포함하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생적 돌연변이를 제외하고 일치한다. 단클론 항체는 단일 항원 부위에 대하여 고도로 특이적이다. 이와 함께, 다른 결정기(에피토프)에 대한 다른 항체를 포함하는 다클론 항체 제조와 대비하여, 각 단클론 항체는 항원상의 단일 결정기에 대응한다. 이들의 특이성과 함께, 단클론 항체는 다른 항체에 의하여 합성되어 미오염되었다는 점에서 이점이 있다. 변형인 "단클론"은 실질적으로 균일한 집단의 항체에서 획득한 항체의 특성을 나타내며, 특정 방법에 의한 항체의 제조에 필요한 것으로 이해하여서는 아니된다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용되는 단클론 항체는 문헌 Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)에서 최초로 언급된 하이브 리도마법, 또는 재조합 DNA법(예컨대, U.S. Pat. No. 4,816,567)에 의하여 생산될 수 있다. "단클론 항체"는 예를 들면 문헌 Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. MoI. Biol., 222:581-597 (1991)에 설명된 기법을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 분리될 수 있다.
단클론 항체는 본원에서 특히 중쇄 및/또는 경쇄의 부분이 특정 종에서 유도된 항체 또는 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 내의 대응 서열과 일치하거나 또는 상동인 "키메라" 항체를 포함하며, 이들이 소망하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 사슬(들)의 잔여부가 특정 종에서 유도된 항체 또는 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 및 이러한 항체의 절편 내의 대응 서열과 일치하거나 또는 상동이다(U.S. Pat. No. 4,816,567; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). 대상 키메라 항체는 본원에서 비-인간 영장류(예컨대 구세계 원숭이, 영장류 등) 및 인간 불변 영역 서열에서 유도된 가변 도메인 항원-결합 서열을 포함하는 "영장류화" 항체를 포함한다.
"항체 절편"은 무손상 항체, 바람직하게는 항원-결합 또는 이들의 가변 영역을 포함하는 무손상 항체의 부분을 포함한다. 항체 절편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 절편; 이합체; 선형 항체 (Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); 단일-사슬 항체 분자; 및 항체 절편(들)로부터 형성된 다특이적 항체를 포함한다.
"무손상" 항체는 항원-결합 가변 영역 및 경쇄 불변 도메인(CL) 및 중쇄 불 변 도메인, CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 것이다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인(예컨대 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 이들의 아미노산 서열 변이체가 될 수 있다. 바람직하게는, 무손상 항체는 하나 이상의 효과기(효과기) 기능을 갖는다.
항체 "효과기 기능"은 항체의 Fc 영역(천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인한 생물학적 활성을 의미한다. 항체 효과기 기능의 예는 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC); 포식작용; 세포 표면 수용체의 하방 조절(예컨대 B 세포 수용체; BCR), 등을 포함한다.
"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 Fc 수용체(FcRs) 위에 결합한 분비된 Ig가 특정 세포독성 세포상(예컨대, 자연사 (NK) 세포, 호중구, 및 대식세포)에 제공되는 세포독성의 형태를 의미하며, 이러한 세포독성 효과기 세포가 항원-함유 표적 세포에 특이적으로 결합하여 세포독소로 표적 세포를 실질적으로 사멸시키게된다. 항체 "팔(arm)" 세포독성 세포이며 이는 이러한 사멸에 절대적으로 필요하다. ADCC, NK 세포의 매개를 위한 1차 세포는 FcγRIII 만을 발현하나, 반면에 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포상에서의 FcR 발현은 문헌 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)의 464 페이지 표 3에 요약되어 있다. 대상 분자의 ADCC 활성을 사정하기 위하여, 시험관 내 ADCC 분석, 예컨대 U.S. Pat. No. 5,500,362 또는 5,821,337에 설명한 것을 수행하 였다. 이러한 분석을 위한 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 자연사(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 대상 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서 평가할 수 있으며, 예컨대, 문헌 Clynes et al. (USA) 95:652-656 (1998)에서 개시한 동물 모델에서 평가할 수 있다.
"인간 효과기 세포"는 하나 이상의 FcRs를 발현하고 효과기 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 세포가 최소한 FcγRIII를 발현하고, ADCC 효과기 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 자연사(NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 중성구를 포함하며; PBMCs 및 NK 세포가 선호된다. 효과기 세포는 이들의 천연 공급원, 예컨대 본원의 혈액 또는 PBMCs로부터 분리된다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"는 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 설명하기위하여 사용된다. 양호한 FcR는 천연 서열 인간 FcR 이다. 더욱이, 양호한 FcR는 IgG 항체(감마 수용체)에 결합하는 것이며, 대립 변이체를 포함하는 FcγRI, FcγRII, 및 Fcγ RIII 서브클래스의 수용체, 및 대안적으로 이러한 수용체의 스플라이싱된 형태를 포함한다. FcγRII 수용체는 Fcγ RIIA("활성화 수용체") 및 FcγRIIB("억제 수용체")를 포함하며, 이들은 이들의 세포질 도메인 내에서 1차적으로 다른 유사한 아미노산 서열을 보유한다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 이들의 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신-기초 활성화 모티프(ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 이들의 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신-기초 억제 모티프(ITlM)를 함유한다(M. in Daron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcRs 는 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)에서 연구되었다. 장래 확인될 것들도 포함하는 다른 FcRs는 본원의 용어 "FcR"에 포괄된다. 용어는 또한 신생아 수용체, FcRn을 포함하며, 이는 모체 IgGs를 태아에 전이시키는 책임을 진다(Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)).
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재하에 표적을 용해시키는 분자의 능력을 의미한다. 보체 활성화 경로는 보체 시스템의 제1 성분(C1q)과 인지 항원과 복합된 분자(예컨대 항체)의 결합에 의하여 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위하여, CDC 분석, 예컨대 문헌 Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)에 설명된 방법을 수행하였다.
항체, 올리고펩타이드 또는 "세포 사멸을 유도하는" 다른 유기 분자는 생육가능 세포를 생육 불가능하도록 하는 것이다. 세포는 암세포 특이적 항원을 발현하는 것이며, 바람직하게는 동일한 조직 타입의 정상 세포에 비하여 암 항원을 과다발현하는 세포이다. 바람직하게는, 세포는 암세포, 예컨대, 유방, 난소, 위, 자궁내막, 타액선, 폐, 신장, 결장, 흉선, 췌장 또는 방광 세포이다. 시험관 내 세포 사멸은 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 또는 보체 의존성 세포독성(CDC)에 의하여 유도된 세포 사멸을 구별하기 위하여 보체 및 면역 효과기 세포의 부재하에 측정하였다. 따라서, 세포 사멸의 분석은 열 불활성화 혈청(즉, 기능성 보체의 부재하에)을 사용하여, 면역 효과기 세포의 부재하에 수행하였다. 항체, 올리고펩타 이드 또는 다른 유기 분자가 세포 사멸을 유도할 수 있는지 여부를 결정하기 위하여, 프로피디움 요오드 (PI), 트리판 블루(Moore et al. Cytotechnology 17:1-11 (1995)) 또는 7AAD의 흡수에 의하여 평가된 막 통합성 상실을 미처리 세포와 비교하여 평가하였다. 양호한 세포 사멸-유도 항체, 올리고펩타이드 또는 다른 유기 분자는 표적 세포의 최소한 20% 내에서 PI 흡수 분석에서의 PI 흡수를 유도하는 것들이다.
"세포자멸사를 유도하는" 항체는 아넥신 V의 결합, DNA 절편화, 세포 수축, 세포질 세망의 확장, 세포 절편화, 및/또는 막 운반체의 형성(세포자멸체)에 의하여 결정되는 프로그램된 세포 사멸을 유도하는 것이다. 바람직하게는 세포는 종양 세포, 예컨대 유방, 난소, 위, 자궁내막, 타액선, 폐, 신장, 결장, 흉선, 췌장 또는 방광 세포이다. 세포자멸사와 관련된 세포내 사건을 평가하기 위하여 다양한 방법이 활용된다. 예를 들면, 포스파티딜 세린(PS) 전위(translocation)는 아넥신(annexin) 결합에 의하여 측정될 수 있고; DNA 절편화는 DNA 레더링(laddering)에 의하여 평가될 수 있으며; DNA 절편화에 따른 핵/염색질 응축은 저이배체 세포 내의 모든 증가에 의하여 평가될 수 있다. 바람직하게는, 세포자멸사를 유도하는 항체는 BT474 세포를 사용한 아넥신 결합 분석 내에서 미처리 세포에 비하여 아넥신 결합의 유도를 약 2 내지 50배, 바람직하게는 약 5 내지 50배, 및 가장 바람직하게는 약 10 내지 50배, 또는 50배 이상 나타내는 것이다(하기 참조).
"천연 항체"는 일반적으로 약 150,000 달톤의 이형4합체 글리코단백질이며, 두개의 동일한 경쇄(L) 및 두개의 동일한 중쇄(H)로 구성되어 있다. 각 경쇄는 하 나의 공유 이황화 결합에 의하여 중쇄에 링크되며, 이황화 결합의 수는 다른 면역글로블린 아이소타입의 중쇄에 따라 다르다. 각 중쇄 및 경쇄는 규칙적으로 채워진 사슬내 이황화 브릿지를 보유한다. 각 중쇄는 일 말단에 가변 도메인(VH)을 보유하며, 그 다음에 다수의 불변 도메인이 온다. 각 경쇄는 일 말단에 가변 도메인(VL)을 보유하며 다른 말단에 불변 도메인을 보유한다. 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 함께 정렬되며, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 함께 정렬된다. 특히 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이의 경계면을 형성하는 것으로 알려져 있다.
"순수(Naked) 항체"는 일반적으로 어떠한 화학적, 생물학적 또는 방사선핵종 모이어티와 링크되거나 또는 접합되지 않으나, 자연적 변형 예컨대 글리코실화를 포함할 수 있는 항체 또는 그것의 절편이다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체 사이의 서열이 광범위하게 변화한다는 사실을 의미하며 이들의 특정 항원을 위한 각 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인에 공평하게 분배되지 않는다. 이는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두의 안의 고가변 영역이라 하는 3 부분에 집중된다. 가변 도메인의 가장 고도로 보존된 부분 프레임워크 영역(FRs)이라한다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 4개의 FRs를 포함하며, 널리 베타-시트 구조를 지니고, 3 개의 고가변 영역에 루프 연결을 형성하여 연결되어 있으며, 어떠한 경우에는 베타-시트 구조의 일부를 형성하기도 한다. 각 사슬의 고가변 영역은 FRs에 의하여 근접하게 서로 고정되며, 다른 사슬의 고가변 영역은 항체의 항원-결합 부 위의 형성에 기여하게 된다(Kabat et al., sequences of proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). 불변 도메인은 결합 항체와 항원의 결합에 직접적으로 관련되는 것은 아니나, 다양한 효과기 기능, 예컨대 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC) 내에서 항체의 참여를 나타낸다.
용어 "고가변 영역"을 본원에서 사용하는 경우 항원 결합의 원인이 되는 항체의 아미노산 잔기를 의미한다. 고가변 영역은 일반적으로 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"의 아미노산 잔기(예컨대 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3)는 경쇄 가변 도메인 내에, 31-35(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3)는 중쇄 가변 도메인 내에 존재; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) 및/또는 "고가변 루프"의 잔기(예컨대 잔기 26-32(L1), 50-52(L2) 및 91-96 (L3)는 경쇄 가변 도메인 내에, 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3)는 중쇄 가변 도메인 내에 존재; Chothia and Lesk J. MoI. Biol. 196:901-917 (1987))를 포함한다. "프레임워크 영역" 또는 "FR" 잔기는 본원의 고가변 영역 잔기이 아닌 가변 도메인 잔기이다.
항체의 파파인 소화에 의하여 두개의 동일한 항원-결합 절편, 소위 "Fab" 절편을 생산하였으며, 각각은 단일 항원-결합 부위, 및 잔여 "Fc" 절편을 지니고, 이들의 명칭은 손쉽게 결정화하는 이들의 능력을 반영한다. 펩신 처리는 두개의 항원-결합 부위를 지닌 F(ab')2 절편을 산출하게되며, 이는 여전히 항원에 가교결합 할 수 있다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 절편이다. 이 영역은 밀집, 비 공유 관계의 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. VH-VL 이량체의 표면상에 항원-결합 부위를 정의하기 위하여 각 가변 도메인의 세 개의 고가변 영역이 상호작용하는 것은 이 구조에서 일어난다. 총체적으로, 6개의 고가변 영역이 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 전체 결합 부위보다 낮은 친화도 임에도 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 고가변 영역만을 포함하는 Fv의 반)도 항원 인식 및 결합능을 가진다.
Fab 절편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유할 수 있다. Fab' 절편은 항체 힌지 영역의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 소수의 잔기를 첨가함으로써 Fab 절편과 달라진다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들) 최소한 하나의 유리 티올기를 보유한 Fab'로 지정된다. F(ab')2 항체 절편은 원래 이들 사이에 힌지 시스테인을 보유한 Fab' 절편의 짝으로 생산된다. 항체 절편의 다른 화학적 커플링이 공지되어 있다.
모든 척추동물 종의 항체의 "경쇄"는 이들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초한 두개의 분명하게 구별되는 타입, 소위 카파 및 람다 중의 하나로 지정될 수 있다.
이들의 중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라서, 무손상 항체가 다른 " 클래스"로 할당될 수 있다. 무손상 항체의 5개의 주요 클래스가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 및 이들의 다수는 추가로 "서브클래스"(아이소타입)로 세분될 수 있으며, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 및 IgA2이다. 항체의 다른 클래스에 대응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 알파, 델타, 입실론, 감마 및 뮤로 호칭된다. 면역글로블린의 다른 클래스의 서브유닛 구조 및 3차원 구조가 공지되어 있다.
"단일-사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 절편는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 여기서 이러한 도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬 내에 제공된다. 바람직하게는, Fv 폴리펩타이드는 scFv가 항원 결합을 위한 소망하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 연구에 대한 문헌 Pluckthun in The Pharmacology of monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)를 참조한다. 항-ErbB2 항체 scFv 절편은 WO93/16185; U.S. Pat. No. 5,571,894; 및 U.S. Pat. No. 5,587,458에서 개시하였다.
용어 "이합체"는 두개의 항원-결합 부위를 지닌 작은 항체 절편을 의미하며, 절편은 동일한 폴리펩타이드 사슬(VH-VL) 내의 가변 경쇄 도메인(VL)에 연결된 가변 중쇄 도메인(VH)을 포함한다. 너무 짧아서 의 두 도메인 사이의 결합을 허용할 수 없는 링커를 사용함으로서, 도메인은 또다른 사슬의 상보적 도메인과 짝을 이루게되며, 두개의 항원-결합 부위를 생성한다. 이합체는, 예를 들면, EP 404,097; WO 93/11161; 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)에 좀더 상세하게 설명되어 있다.
"다가 항체"는 최소한 두개의 결합 부위를 포함하는 항체 또는 항체 절편이며, 여기서 결합 부위는 동일한 에피토프, 또는 대안적으로, 서로 다른 두개의 에피토프에 특이성을 모두 보유한다.
비-인간(예컨대, 설치류) 항체의 "인체 적응형" 형태는 비-인간 면역글로블린으로부터 유도된 최소 서열을 함유한 키메라 항체이다. 대부분에 있어서, 인체 적응형 항체는 인간 면역글로블린(수용자 항체)이며, 여기서 수용자의 고가변 영역의 잔기는 소망하는 특이성, 친화도, 및 용량을 지닌 비-인간 종(공여자 항체) 예컨대 마우스, 레트, 레빗 또는 비인간 영장류의 고가변 영역의 잔기로 치환되었다. 일 예로써, 인간 면역글로블린의 프레임워크 영역(FR) 잔기는 대응 비-인간 잔기으로 치환되었다. 이와 함께, 인체 적응형 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체 내에서 발견되지 않으나 예를 들면 다른 인간 항체 내에서는 발견되는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형 ("초인체적응화")은 항체 성능을 추가로 향상시키게 된다. 일반적으로, 인체 적응형 항체는 최소한 하나의, 전형적으로는 두개의 가변 도메인의 실질적으로 모두 포함하게 되며, 비-인간 면역글로블린의 것에 대응하는 고가변 루프의 전부 또는 실질적으로 전부 및 FRs의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로블린 서열의 것이다. 인체 적응형 항체는 선택적으로 최소한 면역글로블린 불변 영역(Fc)의 부분, 전형적으로는 인간 면역글로블린의 부분을 포함하게 된다. 상세한 설명을 위하여, 문헌 Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)를 참조한다.
"분리된" 항체는 이들의 자연 환경에서의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 것이다. 이들의 자연 환경의 오염 성분은 항체의 진단적 또는 치료적 사용을 방해하는 물질이며, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 양호한 실시 상태에서, 항체는 (1) 로우리법으로 측정시 항체 중량부로 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 중량부 이상으로, (2) 스피닝 컵(spinning cup) 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 최소한 15 개의 잔기를 얻기 위하여 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는, 바람직하게는, 은염색을 사용하는 환원 또는 비환원 조건하에서의 SDS-PAGE에 의한 균질성으로 정제되었다. 분리된 항체는 항체의 자연 환경의 최소한 하나의 성분이 제공되지 않았기 때문에 재조합 세포 내에 항체 그 자체를 포함한다. 일반적으로, 그러나, 분리된 항체는 최소한 하나의 정제 단계에 의하여 제조될 것이다.
대상 항원에 "결합한" 항체는 충분한 친화도를 지닌 항원과 결합이 가능한 것이며, 따라서 항원 발현 세포의 표적화에 치료적 또는 진단용 약제로서 유용한 항체이다.
"특이적으로 결합하는" 항체 또는 특정 폴리펩타이드 또는 특정 폴리펩타이드상의 에피토프에 "특이적인" 항체는 모든 다른 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 에피토프에 실질적으로 결합하지 않으면서 특정 폴리펩타이드 또는 특정 폴리펩타이드 상의 에피토프에 결합하는 것이다. 바람직하게는, 대상 표적에 특이적인 항체는 다른 비-특이적 에피토프보다 1.5-배, 2-배, 5-배, 10-배, 100-배, 103-배, 104- 배, 105-배, 106-배 또는 그이상의 결합으로 표적 세포 상의 항원에 결합한다. 선택적으로, 항체는 영장류, 마우스 및/또는 레트의 오르돌로그를 포함하는 모든 공지의 표적 종양 세포 항원 오르돌로그(ortholog)에 특이적 또는 특이적 비-결합을 입증할 수 있다. 선택적으로, 항원은 대상 종양 세포 항원와 동일한 종 내의 공지의 상동체를 식별할 수 있다. 식별은 일 상동체와 다른 것의 결합 특이성으로 결정될 수 있으며, 항체와 대상 유사체의 결합은 항체와 원치않는 상동체의 결합과 비교하여 1.5-배, 2-배, 5-배, 10-배, 100-배, 103-배, 104-배, 105-배, 106-배 또는 그 이상의 결합으로 결합한다. 항체는 해리 상수가 1μM 이하, 바람직하게는 100 nM 이하 및 가장 바람직하게는 10 nM 이하인 경우 에피토프에 특이적으로 결합한다고 알려져 있다.
본 발명의 항-종양 세포 항원 항체는 종양 세포를 포함하는 표적에 의하여 발현되는 경우, 아미노-산-잔기-특이적-에피토프, 탄수화물-특이적 에피토프, 또는 아미노산 잔기 및 분자의 탄수화물 부분 모두에 의하여 형성된 에피토프에 결합할 수 있다. 항-종양 세포 항원 항체가 세포독성 또는 세포증식억제제를 담지하는 경우, 항체는 항체-표적 수용체 복합체를 내재화하는 에피토프에 결합하는 것이 바람직하다. 항-표적 항체가 ADCC 및 CDC를 통하여 작용하는 경우, 항-표적 항체는 항체의 Fc 영역이 효과기 세포에 결합할 때까지 표적 종양 세포의 표면에 잔존하는 것이 바람직하다. 인지 세포 표면 항원에 결합된 항체가 세포 표면 상에 잔존하는지 또는 내재화되었는지 여부를 결정하는 방법은 기술 분야에 공지되어 있다.
용어 "에피토프"는 항체의 가변 말단에 결합하는 항원 상의 특이적 결합 부위 또는 항원 결정기를 의미한다. 에피토프는 선형이 될 수 있으며, 즉 1차 포르민(pormin) 서열 내에서 발견되는 아미노산 잔기의 서열로 구성되어 있다. 에피토프는 입체적일 수 있으며, 따라서 접힌 포리민(porimin) 분자에서 발견되는 3-D 구조를 인식하게되며, 포리민 발현 세포의 표면 상에 발현되는 경우 인식된 아미노산이 1차 서열 내에서 인접할 필요는 없다. 에피토프는 선형 및 입체 요소의 조합이 될 수 있다. 추가적으로, 종양 세포를 포함하는 표적에 의하여 발현되는 경우, 분자의 탄수화물 부분이 에피토프가 될 수 있다.
용어 "종양 세포 항원"은 면역 반응을 유발시킬 수 있는 모든 단백질, 탄수화물 또는 다른 성분을 의미한다. 정의는 항원으로서 이들의 유관 항원의 전부와 함께 전체 종양 세포, 및 세포질로부터 분리한 모든 성분, 예컨대 원형질막, 세포 표면 또는 막에서 정제한 단백질, 또는 세포 표면과 유관된 독특한 탄수화물 모이어티를 사용하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다는 것을 의미한다. 정의는 세포의 특수한 치료에 접근하기 위하여 필요한 세포 표면의 항원을 포함한다. "마커"는 등가의 정상 세포에 비하여 종양 세포 내에서 고도로 발현하는 종양 세포 항원을 의미한다.
단어 "라벨"을 본원에서 사용하는 경우 항체에 직접 또는 간접적으로 접합된 검출가능한 화합물 또는 조성물로서 "표지된" 항체를 생성할 수 있는 것을 의미한다. 라벨은 그 자체로 검출가능한 것일 수 있으며(예컨대 방사성동위원소 라벨 또는 형광 라벨) 또는, 효소적 라벨의 경우, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매하게 된다.
"고체 상"은 본 발명의 항체를 부착할 수 있는 비수성 매트릭스를 의미한다. 본원에서 포괄하는 고체 상의 예는 부분적으로 또는 전체적으로 유리(예컨대, 다공성 유리), 다당류(예컨대, 아가로스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알콜 및 실리콘으로 형성된 것을 포함한다. 특정 실시 상태에서는, 상황에 따라서, 고체 상은 분석 프레이트의 웰을 포함할 수 있으며; 다른 경우에는 정제 컬럼이다(예컨대, 친화도 크로마토그래피 컬럼). 이 용어는 입자를 분리하는 불연속적 고체 상을 포함하며, 예컨대 U.S. Pat. No. 4,275,149에 설명되어 있는 것이다.
"길항제 항체" 또는 "길항제적 항체"는 본원의 종양 세포 항원의 생물학적 활성을 차단, 억제 또는 중성화시키는 항체이다. 대상 종양 세포 항원의 길항제적 항체를 확인하는 방법은 대상 종양 세포 항원을 발현하는 종양 세포를 후보 항체와 접촉시키는 단계, 및 그 다음 종양 세포 내의 종양 세포 항원과 정상적으로 관련된 생물학적 활성의 변화를 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들면, 종양 세포 항원은 종양 세포 증식을 유도하는 것일 수 있으며, 효과적인 길항제적 항체는 종양 세포 항원과 특이적으로 상호작용하는 것일 수 있으며, 세포 증식의 감소를 나타낸다. 양호한 길항제 항체는 대상 생물학적 활성이 30-75% 감소하는 것이며, 더 바람직한 것은 75-99.9% 또는 그 이상의 감소를 나타내는 것이다.
리간드 활성화를 "차단"하는 항체, 또는 "차단 항체"는 항체가 결합하는 리간드의 활성화를 감소 또는 예방하는 길항제적 항체의 일 유형이다. 바람직하게는, 차단 항체는 리간드 활성화 분석을 잠정적 차단 항체의 존재 또는 부재하에 병렬적 으로 측정하는 경우, 리간드 활성화를 30-75% 차단하는 것이며, 가장 바람직하게는 75-99.9% 또는 그 이상의 리간드 활성화를 차단하는 것이다. 리간드 활성화의 예방은 예를 들면 수용체 포스포릴화의 감소 또는 대상 리간드의 하방 신호 전달 경로의 다른 성분의 활성화의 손실 등의 현상을 관찰하여 측정될 수 있다.
"작용제 항체"는 항체에 결합하는 리간드의 활성화를 유도하는 것이다. 바람직하게는, 작용제 항체는 리간드 활성화 분석시 후보 항체를 비-특이적 항체 대조구와 병렬 비교하는 경우, 리간드 활성화 2배-, 4배-, 10배-, 50배- 또는 그 이상 증가하는 것이다. 리간드 활성화는 예를 들면 수용체 포스포릴화의 감소 또는 대상 리간드의 하방 신호 전달 경로의 다른 성분의 활성화의 손실 등의 현상을 관찰하여 측정될 수 있다.
지정 항체의 "생물학적 특성"을 지닌 항체는 동일한 항원에 결합된 다른 항체와 구별되는 항체의 하나 이상의 생물학적 특성을 보유하는 것이다.
"성장 억제제"를 본원에서 사용하는 경우 시험관 내에서든 생체 내에서든 세포의 성장, 특히 암세포의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 따라서, 성장 억제제는 S 기의 세포 비율을 현저하게 감소시키는 것이 될 수 있다. 성장 억제제의 예는 (S 기가 아닌 다른 곳에서) 세포 주기 진행을 차단하는 약제, 예컨대 G1 정지 및 M-기 정지를 유도하는 약제를 포함한다. 전통적인 M-기 차단제는 빈카스(빈카스) (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산스(탁산), 및 토포 II 억제제, 예컨대 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포사이드, 및 블레오마이신을 포함한다. G1을 정지시키는 이러한 약제는 S-기 정지에 미치며, 예를 들면, DNA 알 킬화 약제 예컨대 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플레틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 및 아라-C이다. 추가의 정보는 문헌 The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplasm drugs" by Murakami et al. (W B Saunders: Philadelphia, 1995), 특히 p. 13에서 찾을 수 있다. 양호한 성장 억제제는 성장 억제제의 존재하에 세포 성장을 20% 이상 억제하는 것이거나, 또는 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상 이상, 40% 이상, 45% 이상 억제하는 것이고, 더욱 바람직한 것은 세포 성장을 50% 차단 하는 것이거나 또는 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상 억제하는 것이며, 가장 바람직한 것은 세포 성장을 95% 이상 억제, 또는 99.9% 이상 억제하는 것이다.
"세포증식억제제"를 본원에서 사용하는 경우 세포 사멸을 유발하지 않는 세포 분화를 억제하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 세포증식억제 약제는 세포 주기를 통한 세포 진행을 억제할 수 있으며, 예를 들면 S 기 전에 세포 주기 내의 특정 시점에서 분화 정지를 유발시킬 수 있다. 양호한 세포증식억제제는 세포의 30-50% 내에서 정지시키는 것이며, 더욱 양호한 것은 세포의 50-95% 내에서 정지를 유발시키는 것이고, 가장 양호한 것은 집락의 95-99.9% 또는 그 이상의 세포에서 정지를 유발시키는 약제이다.
용어 "치유", "치료하는", "치료" 등은 본원에서 일반적으로 소망하는 약리적 및/또는 생리적 효과를 얻을 수 있는 것을 의미한다. "치료"는 치료적 치료 및 예방적 또는 방지적 수단을 의미한다. 치료가 필요한 대상은 이미 질환을 보유한 대상들 뿐만 아니라 질병을 예방하고자 하는 대상을 포함한다. 따라서, 본원에서 치료하고자 하는 포유류는 질환을 보유한 것으로 진단되었거나 또는 질병의 소인이 있거나 민감한 것일 수 있다.
본원의 폴리펩타이드 또는 이들의 작용제 또는 길항제의 "유효량"은 특별히 언급한 목적을 수행하기 충분한 양이다. "유효량"은 언급한 목적과 관련하여 경험적으로 및 통상의 방식으로 측정될 수 있다.
치료의 목적인 "포유류"는 인간, 가축 및 축산용 동물, 및 동물원, 스포츠용, 또는 애완용 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 소 등을 포함하는 포유류로 분류된 모든 동물을 의미한다. 바람직하게는, 포유류는 인간이다.
"질환"은 작용제/길항제로 치료하거나 또는 항체 또는 본 발명의 면역접합체의 표적화로 이득을 얻을 수 있는 모든 상태를 말한다. 이는 만성 및 급성 질환 또는 포유류가 질환에 걸릴수 있는 소인이 있는 병리학적 상태를 포함하는 질병을 포함한다. 본원에서 치료하는 질환의 비제한적인 실시예는 양성 및 악성 종양; 백혈병 및 림프 악성종양; 신경, 아교, 성상교, 시상하부 및 다른 림프절, 대식세포, 상피, 기질 및 포배강 질환; 및 염증성, 혈관형성 및 면역학적 질환을 포함한다.
용어 "치료적 유효량"은 포유류내의 질병 또는 질환을 치료하기에 효과적인 약물의 양을 의미한다. 암의 경우, 약물의 치료적 유효량은 암 세포의 수를 감소; 종양 크기를 감소; 주변 기관으로 암세포 침윤을 억제(즉, 다소 감속 및 바람직하게는 정지) ; 종양 전이를 억제(즉, 다소 감속 및 바람직하게는 정지); 종양 성장을 일정량 억제; 및/또는 하나 이상의 암 유관 증상을 일정량 경감시킬 수 있다. 약물이 성장을 예방 및/또는 현존 암 세포의 사멸할 수 있는 정도로, 이는 세포증식억제 및/또는 세포독성일 수 있다. 암 치료를 위하여, 효능은, 예를 들면, 질병 진행 시간(TTP)을 평가하거나 및/또는 반응 속도(RR)를 결정함으로써 측정할 수 있다.
"고증식성 질병 또는 질환"은 악성 또는 양성을 불문하고 모든 신생물 세포 성장 및 증식을 의미하고, 모든 전환된 세포 및 조직 및 모든 암성 세포 및 조직을 포함한다. 고증식성 질병 또는 질환은 전암성 병변, 비정상 세포 성장, 양성 종양, 악성 종양, 및 "암"을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 고증식성 질병, 질환, 및/또는 상태의 추가적인 예는 양성 또는 악성을 불문하는 신생물로서: 전립선, 결장, 복부, 뼈, 유방, 소화계, 간, 췌장, 복막, 내분비선(부신, 부갑상선, 뇌하수체, 고환, 난소, 흉선, 갑상선), 눈, 두부 및 경부, 신경(중추 및 말초), 림프계, 골반, 피부, 연약 조직, 지라, 흉부, 및 비뇨생식관에 위치하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
용어 "암", "신생물", "종양", "암성" 및 "암종"은 일반적으로 통제불능 세포 성장으로 특성화되는 포유류 내의 생리적 상태를 의미하거나 또는 설명한다. 일반적으로, 본원에서 검출 또는 치료를 위한 대상 세포는 전암성(예컨대, 양성), 악성, 전이성, 및 비-전이성 세포를 포함한다. 암성 세포의 검출이 관심 대상이다. 암의 예는 암종, 림프종, 발생모체, 육종, 및 백혈병 또는 림프 악성종양을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 암의 특정 예는 편평 세포 암(예컨대 상피 편평 세포 암), 소세포 폐암, 비소세포 폐 암, 폐 선암종 및 폐 편평 암종을 포함하는 폐암, 복막 암, 간세포암, 위장관 암을 포함하는 위샘 또는 위암, 췌장암, 아교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간암, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁암종, 타액선 암종, 신장 또는 신장암, 전립선암, 질암, 흉선암, 간암종, 항문 암종, 음경 암종과 두부 및 경부암을 포함한다.
종양 세포 항원을 "과다발현"하는 암은 동일 조직 타입의 비암성 세포에 비하여 항원이 현저하게 높은 수준으로 생성되는 것이다. 이러한 과다발현은 유전자 증폭 또는 증가된 전사 또는 번역에 의하여 유발될 수 있다. 항원의 과다발현은 환자, 예컨대 종양 생검 내에서 리간드(또는 이를 암호화한 핵산)의 수준을 평가하거나 또는 다양한 진단적 분석, 예컨대 IHC, FISH, 서던 블롯팅, PCR 또는 전술한 생체 내 분석에 의하여 진단적으로 결정될 수 있다.
용어 "예후"는 질병 완화, 질병 재발, 종양 재발생, 전이, 및 사망의 가능성에 관한 치료적 개입에 대한 예정 과정, 및 질병 또는 질병 진행의 방향의 예상을 포괄하는 것으로 이해한다. 본 발명의 생체 외 예후 분석은 특정 항-종양 세포 항원 치료제, 또는 항-종양 세포 항원 치료제의 클래스에 대한 후보 대상체의 반응을 예측하기 위하여 사용되거나, 또는 ADCC를 조절하는데 사용될 수 있다. "후보 대상체의 반응을 예측"한다는 것은 특정 항-종양 세포 항원 치료제에 대하여 양성 또는 음성 결과를 경험하게 될 가능성을 평가한다는 의미이다. 본 발명의 목적을 위하여, 본 발명의 생체 외 예후 분석에 있어서 "양성 치료 결과의 지표"는 심사숙고하에 항-종양 세포 항원 치료제에 대한 반응에서 유리한 결과를 얻게될 가능성을 증가시킨다는 의미이며, 따라서 항-종양 세포 항원 치료제의 치료적 개입이 보장된 다. 이에 반하여, "음성 치료 결과의 지표"는 심사숙고하에 항-종양 세포 항원 치료제의 치료적 개입으로부터 유리한 결과를 얻지 못할 가능성이 증가하는 것을 의미하며, 따라서 항-종양 세포 항원 치료제의 치료적 개입이 보장되지 못한다.
항-종양 세포 항원 치료제의 치료적 개입으로 달성할 수 있는 유리한 결과는 양성 치료적 반응을 포함한다. 암 치료에 있어서 "양성 치료적 반응"은 항-종양 세포 항원 치료제의 항-종양 활성에 관련되어 질병의 개선 및/또는 대상 질병에 관련된 증상의 개선을 의미한다. 즉, 항-증식 효과, 추가의 종양 성장의 예방, 종양 크기의 감소, 암 세포 수의 감소, 및/또는 종양 세포 항원-발현 세포의 자극에 의하여 매개된 하나 이상의 증상의 감소가 관찰될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 양성 치료적 반응은 질병 내의 하나 이상의 다음의 개선을 의미한다: (1) 종양 크기의 감소; (2) 암 (즉, 신생물) 세포 수의 감소; (3) 신생물 세포 사멸의 증가; (4) 신생물 세포 생존의 억제; (4) 종양 성장의 억제 (즉, 다소 감속, 바람직하게는 정지); (5) 말초 기관으로의 암세포 침윤 억제 (즉, 다소 감속, 바람직하게는 정지); (6) 종양 전이의 억제 (즉, 다소 감속, 바람직하게는 정지); (7) 추가의 종양 성장의 예방; (8) 환자 생존율의 증가; 및 (9) 하나 이상의 암 유관 증상의 다소 경감. 모든 주어진 악성종양 내의 양성 치료적 반응은 악성종양에 특이적인 표준화된 반응 기준에 의하여 측정될 수 있다.
종양 반응은 선별 기법 예컨대 자기 공명 영상화(MRI) 스캔, x-레이 영상화, 컴퓨터 단층(CT) 스캔, 뼈 스캔 영상화, 내시경, 및 골수 흡인(BMA)을 포함하는 종양 생검 시료화 및 순환시 종양 세포의 계수를 사용하여 종양 형태(즉, 전체 종양 부하, 종양 크기, 등)의 변화로 평가될 수 있다. 이러한 양성 치료적 반응과 함께, 항-종양 세포 항원 치료제로 치료중인 대상체는 질병 유관 증상이 개선되는 유리한 효과를 얻게된다. 따라서 B 세포 종양에 있어서, 대상체는 소위 B 증상, 즉, 야간 발한, 발열, 체중감소, 및/또는 두드러기 등의 감소를 경험한다. 사전-악성 상태에 있어서, 항-종양 세포 항원 치료제의 치료는 유관 악성 상태의 발달 전의 시간을 차단 및/또는 연장하게 된다.
일 실시 상태에서, 본 발명의 방법을 사용하는 생체 외 예후 분석은 본원의 항-종양 세포 항원 치료제의 치료적 개입의 예후를 필요로하는 후보 대상체로부터 생물학적 시험 시료 및 생물학적 대조구 시료를 제공하는 단계로서, 생물학적 시험 및 대조구 시료는 생체 내 또는 생체 외에서 종양 세포 리간드로 자극되는 종양 세포 항원-발현 신생물 세포를 포함하며; 대상 항-종양 세포 항원 치료제의 유효량을 생물학적 시험 시료에 접촉시키는 단계; 이 생물학적 시험 시료 내의 최소한 하나의 생물학적마커의 수준을 검출하는 단계로서, 생물학적마커는 세포성 세포자멸사 생물학적마커, 및 세포 생존의 생물학적마커로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이는 대상 항-종양 세포 항원 치료제의 활동의 모드에 의존하며; 및 항-종양 세포 항원 치료제와 접촉한적이 없는 생물학적 대조구 시료 내의 생물학적마커(들)의 수준과 생물학적 시험 시료 내의 생물학적마커(들)의 수준을 비교하는 단계를 포함한다. 항-종양 세포 항원 치료제가 신호를 차단 또는 갑섭하거나 ADCC를 조절하는 길항제인 경우, 항-종양 세포 항원 치료제의 치료에 응답하는 암 또는 사전-악성 상태를 보유한 대상체를 확인하기 위하여 세포 증식 및 생존의 모든 이러한 생물학적 마커, 세포자멸사, 및 신호에 대한 본원에서 설명한 생체 외 예후 분석은 신호에 의하여 통제불능된 사이토카인 마커의 분석 및/또는 하나 이상의 본원의 종양 세포 항원-유관 인자의 분석과 조합하여 또는 단독으로 치료제의 잠재적인 유효한 효과를 평가하기 위하여 사용할 수 있다. 항-종양 세포 항원 치료제가 ADCC 활성의 조절을 통한 활성을 위한 이들만의 모드를 보유하는 경우, 예를 들면, 항-종양 세포 항원 항체, 항-종양 세포 항원 치료제의 치료에 응답하는 암 또는 사전-악성 상태를 보유한 대상체를 확인하기 위하여, 세포자멸사의 생물학적마커에 대한 생체 외 예후 분석은 하나 이상의 본원의 종양 세포 항원-유관 인자의 분석과 조합하여 또는 단독으로 치료제의 잠재적인 유효한 효과를 평가하기 위하여 사용할 수 있다.
본 발명의 생체 외 예후 분석에 따라, 대상 항-종양 세포 항원 치료제와 접촉한 생물학적 시험 시료 내에서 하나 이상의 생물학적마커, 및 선택적으로 하나 이상의 사이토카인 마커의 발현 수준을 생물학적 대조구 시료 내의 생물학적마커(들), 및 선택적으로 사이토카인 마커(들)의 발현 수준과 비교하였다. "생물학적 시험 시료"는 후보 대상체에서 획득한 CD40-발현 신생물 세포를 포함하는 생물학적 시료를 의미하며, 이는 후보 대상체의 치료를 위한 고려하에 항-종양 세포 항원 치료제로 접촉될 것이다. "생물학적 대조구 시료"는 대략 동일한 수 및 종류의 종양 세포 항원-발현 신생물 세포를 포함하므로써 생물학적 시험 시료와 비교되는 생물학적 시료를 의미하며, 동일 시기에, 생물학적 시험 시료를 획득하기 위하여 사용한 것과 동등한 방법으로 후보 대상체로부터 획득하였으며, 시험 시료로서 동일한 시험 조건에 놓이게되나, 대상 항-종양 세포 항원 치료제와 접촉하게되지는 않는 다. 생물학적 시험 시료 및 생물학적 대조구 시료는 대상체로부터 획득하여, 부표본으로 나누어진 단일 생물학적 시료로 제공될 수 있으며, 이중 하나는 생물학적 시험 시료로, 다른 하나는 생물학적 대조구 시료로 할당된다. 대안적으로, 생물학적 시험 시료 및 생물학적 대조구 시료는 2 이상의 생물학적 시료로부터 제공될 수 있으며, 이는 풀을 형성할 수 있고, 그 다음 전술한 부표본으로 나누어지거나, 또는 생물학적 시험 및 대조구 시료로 각각 제공될 수 있다.
용어 "세포독성 약제" 본원에서 세포의 기능을 억제 또는 예방 및/또는 세포의 파괴를 유발하는 물질을 의미한다. 이러한 약제는 항유사분열제, 알킬화제, 항대사물질, 혈관형성-억제제, 세포자멸제, 알칼로이드, COS-2 억제 및 항생제 화합물 및 이들의 조합일 수 있다. 이 용어는 방사성 동위원소(예컨대 225Ac, 18F, 68Ga, 67Ga, 90Y, 86Y, 111In, 131I, 125I, 123I, 99mTc, 94mTc, 86Re, 188Re, 177Lu, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 212Bi, 213Bi, 32P, 11C, 13N, 15O, 76Br, 및 211At, 다른 방사선핵종은 진단적 및 치료제로서 활용할 수 있으며, 특히 20-10,000 keV의 범위의 것), 화학치료제, 및 독소 예컨대 절편 및/또는 이들의 변이체를 포함하는 박테리아, 곰팡이, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소적 활성 독소를 포함할 수 있다..
"화학치료제"는 암 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학치료제의 예는 알킬화 약제 예컨대 티오테파 및 시클로스포스파미드(CYTOXAN.TM.); 알킬 설포네이트 예컨대 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘 예컨대 벤조도파, 카르보퀴온, 메츄레도파, 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미 드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸롤로멜라민를 포함하는 에틸렌이민 및 에틸아멜라민; 질소 머스타드 예컨대 클로람부칠, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 머클로르타민, 머클로르타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아스 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 로니무스틴; 항생제 예컨대 아클로시노마이신, 액티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리키마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 클로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루미신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 유베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물질 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 폴산 유사체 예컨대 데놉테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘, 5-FU; 안드로겐 예컨대 칼루스테론, 드로모스타로톤 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-부신 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충물 예컨대 폴렌산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코사이드; 아미노레블린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에 다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지퀴온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 레티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나멧; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카바진; PSK.RTM.; 라족산; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아조산; 트리아지퀴온; 2, 2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁산, 예컨대 파크리탁셀(TAXOL.RTM., Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) 및 데코탁셀(TAXOTERE.RTM., Rhne-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로람부칠; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토 퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드(VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포사이드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포아이소머라아제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노산; 에스페라미신; 카페시타빈; 및 전술한 것의 약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 이 정의에 포함되는 것은 종양에 작용하는 호르몬을 제어 또는 억제하는 작용을 하는 항-호르몬 약제, 예컨대 항-에스트로겐 예를 들면 타목시펜, 라록시펜, 아로마타아제 억제 4(5)-이미다졸, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜(Fareston); 및 항-안드로겐 예컨대 플루타미드, 니루타미드, 바이칼루타미드, 류프로라이드, 및 고세렐린; 및 전술한 것의 약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체이다.
"항-혈관형성 약제"는 혈관의 발달을 다소 차단 또는 방해하는 화합물을 의미한다. 항-혈관형성 인자는 예컨대, 혈관형성을 증진시키는 성장 인자 또는 성장 인자 수용체에 결합하는 소분자 또는 항체일 수 있다.
용어 "사이토카인"은 세포내 매개체로서 다른 세포상에 작용하는 세포 집락 중의 하나에서 방출하는 단백질의 일반명칭이다. 이러한 사이토카인의 예는 림포카인, 모노카인, 및 전통적인 폴리펩타이드 호르몬이다. 사이토카인에 포함되는 것은 성장 호르몬 예컨대 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 릴렉신; 프로릴렉신; 글리코단백질 호르몬 예컨대 소포 자극 호르몬(FSH), 흉선 자극 호르몬(TSH), 및 황체형성 호르몬(LH); 간 성장 인자; 섬유모세포 성장 인자; 프롤락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 뮬러-억제 물질; 마우스 생식선자극호르몬-유관 펩타이드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴(TPO); 신경 성장 인자 예컨대 NGF-베타; 혈소판-성장 인자; 전환 성장 인자(TGFs) 예컨대 TGF-알파 및 TGF-베타; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 II; 에리스로포이에틴(EPO); 골유도 인자; 인터페론 예컨대 인터페론-알파, -베타, 및 -감마; 집락 자극 인자(CSFs) 예컨대 대식세포-CSF(M-CSF); 과립구-대식세포-CSF(GM-CSF); 및 과립구-CSF(G-CSF); 인터류킨 (ILs) 예컨대 IL-1, IL-1알파, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; 종양 괴사 인자 예컨대 TNF-알파 또는 TNF-베타; 및 다른 폴리펩타이드 인자 예컨대 LIF 및 키트 리간드(KL)이다. 본원에 서 사용한 바와 같이, 용어 사이토카인은 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양 및 천연 서열 사이토카인의 생물학적 활성 동등물로부터의 단백질을 포함한다.
단백질 또는 뉴클레오타이드 수준에서 대상 생물학적마커의 검출은 당해 기술 분야의 숙련자에게 공지된 모든 검출 방법을 사용하여 달성할 수 있다. "발현의 검출" 또는 "수준의 검출"은 생물학적 시료 내의 생물학적마커 단백질 또는 유전자의 존재 또는 양을 결정하는 것이다. 따라서, "발현의 검출"은 생물학적마커가 발현하지 않거나, 검출할 수 있을 정도로 발현하지 않거나, 낮은 수준으로 발현하거나, 정상수준으로 발현하거나 또는 과다발현하는 것을 포괄한다. 항-종양 세포 항원 치료제의 효과를 결정하기 위하여, 종양 세포 항원-발현 신생물 세포를 포함하는 생물학적 시험 시료를 치료제가 세포성 반응을 발휘하도록 충분한 시간 동안 항종양 세포 항원 치료제에 접촉시키고, 그 다음 생물학적 시험 시료 내의 하나 이상의 대상 생물학적마커의 발현 수준을 항-종양 세포 항원 치료제에 접촉시키지 않은 생물학적 대조구 시료의 발현 수준과 비교한다. 일 실시 상태에서, 신생물 세포의 생물학적 대조구 시료는 중성 물질 또는 음성 대조구와 접촉시킨다. 예를 들면, 일 실시 상태에서, 비-특이적 면역글로블린, 예를 들면 IgG1는 음성 대조구로 제공되는 종양 세포 항원에 결합되지 않는다. 시간에 따른 생물학적마커의 변화를 모니터링하기 위하여 시간 경과에 따라 검출하였다. 주어진 모든 대상 생물학적마커의 "투여-반응" 곡선을 생성하기 위하여 서로 다른 농도의 항-종양 세포 항원 치료제에 노출시켜 검출하였다.
본원에 사용된 용어 "전구약물"은 모약물에 비하여 종양 세포에 대한 세포독 성이 덜한 약학적 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 의미하며, 더 활성인 모 형태로 효소적으로 활성화 또는 전환될 수 있다. 예컨대, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) 및 Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, humana Press (1985)를 참조한다. 본 발명의 전구약물은 포스페이트-함유 전구약물, 티오포스페이트-함유 전구약물, 황산염-함유 전구약물, 펩타이드-함유 전구약물, D-아미노산-변형 전구약물, 글리코실화 전구약물, 베타-락탐-함유 전구약물, 선택적으로 치환된 페녹시아세타미드-함유 전구약물 또는 선택적으로 치환된 페닐아세타미드-함유 전구약물, 5-플르오로사이토신 및 더욱 활성인 무세포독성 약물로 전환될 수 있는 다른 5-플루오로우리딘 전구약물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 사용되기 위하여 전구약물 형태로 유도될 수 있는 세포독성 약물의 예는 전술한 화학치료제를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
"리포좀"은 다양한 타입의 지질, 포스포리피드 및/또는 약물(예컨대 본원의 항-종양 세포 항원 항체, 선택적으로, 화학치료제)을 포유류에 전달하기 위한 계면활성제를 포함하는 작은 운반체이다. 리포좀의 성분은 생물학적 막의 지질 배열과 유사한 이중층 형태로 일반적으로 배열된다.
용어 "포장 삽입물"은 치료제 제품의 상업용 포장에 관습상 포함되는 설명서를 의미하며, 지시사항, 용법, 투약량, 투여, 금기 및/또는 이러한 치료제 사용시 주의 사항에 관한 정보를 포함한다.
"분리된" 핵산 분자는 일반적으로 천연 공급원의 항체 핵산과 관계된 최소한 하나의 오염 핵산 분자로부터 확인 및 분리된 핵산 분자이다. 분리된 핵산 분자는 자연상에서 발견되는 형태 또는 환경과는 다른 것이다. 분리된 핵산 분자는 따라서 천연 세포 내에 존재하는 핵산 분자로부터 구별된다. 그러나, 예를 들면, 핵산 분자가 천연 세포와 다른 염색체 위치에 있는 경우, 분리된 핵산 분자는 일반적으로 항체를 발현하는 세포 내에 함유된 핵산 분자를 포함한다.
발현 "대조구 서열"은 특정 숙주 유기체 내에 작동가능하게 링크된 암호화 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 원핵세포에 적합한 대조구 서열은, 예를 들면, 프로모터, 선택적으로 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 생물 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 및 인헨서를 활용하는 것으로 알려져 있다.
핵산이 "작동가능하게 링크된"다는 것은 또다른 핵산 서열과 기능적 관계를 갖는 것을 의미한다. 예를 들면, 전서열(presequence) 또는 분비 레더의 DNA는, 이들이 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드의 DNA에 작동가능하게 링크된다; 프로모터 또는 인헨서는, 이들이 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 암호화 서열에 작동가능하게 링크된다; 또는 리보솜 결합 부위는 이들이 번역을 촉진하도록 위치되는 경우 암호화 서열에 작동가능하게 링크된다. 일반적으로, "작동가능하게 링크된"다는 의미는 링크된 DNA 서열이 인접하다는 것이며, 분비 레더의 경우, 인접하거나 리딩 페이즈 내에 있다는 것이다. 그러나, 인헨서는 인접할 필요가 없다. 링크는 편리한 제한 부위에서의 결찰에 의하여 달성된 다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커가 종래의 실시에 따라 사용된다.
본원에서 사용한 바와 같이, 표현 "세포" "세포주," 및 "세포 배양물"은 호환하여 사용될 수 있으며, 이들은 모두 자손을 포함한다. 따라서, 단어 "형질전환주" 및 "전환된 세포"는 1차 대상 세포 및 전이된 수에 무관하게 이들로부터 유도된 배양물을 포함한다. 모든 자손은 DNA 함량이 정확하게 일치하지 않으며, 이는 유도된 또는 우발성 돌연변이에 기인한다고 알려져 있다. 원래 전환된 세포 내에서 선별된 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 지닌 돌연변이 자손이 포함된다. 별도의 명칭을 의도한 경우, 이는 상황에 따라 분명할 것이다.
II. 종양 세포 항원의 작용제 또는 길항제 선별
길항제를 분석하기 위하여, 특정 활성을 선별하기 위하여 종양 세포 항원을 화합물과 함께 세포에 첨가하였으며, 종양 세포 항원의 존재하에 대상 활성을 억제하는 화합물의 능력은 화합물이 종양 세포 항원의 길항제라는 것을 나타낸다. 대안적으로, 길항제는 경쟁적 억제 분석을 위한 적절한 조건 하에서 종양 세포 항원 및 잠재적인 길항제와 막-결합 종양 세포 항원 수용체 또는 재조합 수용체를 결합시켜 검출할 수 있다. 종양 세포 항원은 라벨화, 예컨대 방사능활성일 수 있으며, 수용체에 결합한 종양 세포 항원 분자의 수를 잠재적인 길항제의 효과를 결정하기 위하여 사용할 수 있다. 수용체를 암호화한 유전자는 당해 기술 분야의 숙련자에게 공지된 다수의 방법에 의하여 확인할 수 있으며, 예를 들면, 리간드 패닝(패닝) 및 FACS 분별이다(Coligan et al., Current Protocols in Immun., 1(2) : Chapter 5 (1991)). 바람직하게는, 발현 크로닝을 사용하며, 여기서 폴리아데닐화 RNA는 종양 세포 항원에 반응하는 세포로부터 준비되며, 이 RNA에서 생성된 cDNA 라이브러리는 풀(pool)로 나누어지고, 종양 세포 항원에 반응하지 않는 COS 세포 또는 다른 세포를 전달감염하기 위하여 사용된다. 유리 슬라이드에서 성장한 전달감염된 세포를 라벨화한 종양 세포 항원에 노출시켰다. 종양 세포 항원은 요오드화 또는 부위-특이적 단백질 키나아제를 위한 인식 부위의 삽입을 포함하는 다양한 수단에 의하여 표지된다. 고정 및 배양 후, 슬라이드에 자기방사도 분석을 가하였다. 양성 풀을 확인하였으며, 인터렉티브 서브-풀링 및 재-선별 프로세스를 사용하여 서브-풀을 준비하고 재-전달감염하였고, 궁극적으로 잠정적 수용체를 암호화하는 단일 클론을 산출하였다.
수용체 확인을 위한 다른 접근법으로서, 표지된 종양 세포 항원은 세포막 또는 수용체 분자를 발현하는 제조 추출물과 광친화도-링크를 할 수 있다. 크로스-링크된 물질은 PAGE에 용해되었으며, X-ray 필름에 노출되었다. 수용체를 함유하는 표지된 복합체가 제거될 수 있으며 펩타이드 절편내로 용해시키고, 단백질 마이크로-시퀀싱을 가하였다. 마이크로-시퀀싱으로 얻은 아미노산 서열은 잠정적 수용체를 암호화하는 유전자를 확인하기 위하여 cDNA 라이브러리를 선별하는 분해 올리고뉴클레오타이드 프로브의 세트를 설계하기 위하여 사용되었다.
길항제에 대한 또다른 분석에서, 포유류 세포 또는 수용체를 발현하는 막 제조품은 후보 화합물의 존재하에 표지된 종양 세포 항원과 함께 배양하였다. 이 상호작용을 증진 또는 차단하는 화합물의 능력을 측정하였다.
잠재적인 길항제의 더 특이적인 예는 면역글로블린과 종양 세포 항원, 및, 특히, 다클론- 및 단클론 항체 및 항체 절편, 단일-사슬 항체, 항-이디오타입 항체, 및 키메라 또는 이러한 항체 또는 절편의 인체 적응형 버전, 및 인간 항체 및 항체 절편을 제한없이 포함하는 항체의 융합체에 결합하는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 대안적으로, 잠재적인 길항제는 밀접하게 유관된 단백질, 예를 들면, 수용체를 인식하나 효과를 부여하지 않아 종양 세포 항원의 작용을 경쟁적으로 억제하게되는 돌연변이 형태의 종양 세포 항원리 될 수 있다.
또다른 잠재적인 종양 세포 항원 길항제는 안티센스 기법을 사용하여 제조된 안티센스 RNA 또는 DNA 구조체이며, 여기서, 예컨대, 안티센스 RNA 또는 DNA 분자는 표적화된 mRNA에 혼성화하고, 단백질 번역을 예방함으로써 mRNA의 번역을 직접적으로 차단하게된다. 안티센스 기술은 3중-나선 구조 또는 안티센스 DNA 또는 RNA를 통한 유전자 발현을 조절하기 위하여 사용할 수 있으며, 이 두 방법은 폴리뉴클레오타이드와 DNA 또는 RNA의 결합에 기초한다. 예를 들면, 본원의 성숙한 종양 세포 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 5'암호화 부분이 안티센스 RNA 올리고뉴클레오타이드의 약 10 내지 40 염기상 길이의 위치에 설계하기 위하여 사용되었다. DNA 올리고뉴클레오타이드는 전사에 관여하는 유전자 영역에 상보적이 되도록 설계되어 (triple helix-see Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 (1988); Dervan et al., Science, 251:1360 (1991)), 전사 및 종양 세포 항원의 생산을 예방하게 된다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오타이드는 생체 내에서 mRNA와 혼성화되고, mRNA 분자가 종양 세포 항원으로 번역되는 것을 차단하게 된다(antisense-Okano, Neurochem., 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FIa., 1988). 전술한 올리고뉴클레오타이드를 세포로 전달하여 안티센스 RNA- 또는 DNA가 생체 내에서 발현되고 이로써 종양 세포 항원의 생산을 억제하도록 한다. 안티센스 DNA가 사용되는 경우, 번역-개시 부위에서 유도된 올리고데옥시리보뉴클레오타이드, 예컨대, 약 -10 및 +10 포지션 사이의 표적 유전자 뉴클레오타이드 서열이 바람직하다.
종양 세포 항원 길항작용의 다른 방법은 siRNA 기술의 사용이며, 여기서 단일 가닥 소 간섭(small inteferring) RNA(siRNAs: 19-29 뉴클레오타이드의 길이)가 침묵 유전자에 사용되었으며, 여기서, siRNA는 표적 항원의 mRNA의 분해를 조절하기 위하여 사용되었다(Martinez et al, Cell (2002) 110(5): 563-74).
잠재적인 길항제는 활성 부위, 수용체 결합 부위, 또는 성장 인자 또는 종양 세포 항원의 다른 관련 결합 부위에 결합하는 소분자를 포함하여, 종양 세포 항원의 정상적인 생물학적 활성을 차단하게 된다. 소분자의 예는 작은 펩타이드 또는 펩타이드-유사 분자, 바람직하게는 가용성 펩타이드, 및 합성 비-펩티딜 유기 또는 무기 화합물을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
리보자임은 RNA의 특이적 분열을 촉매하는 효소적 RNA 분자이다. 리보자임은 상보적 표적 RNA에 서열-특이적 혼성화와 그 다음의 뉴클레오타이드 내부 분열에 의하여 작용한다. 잠재적인 RNA 표적내의 특이적 리보자임 분열 부위는 공지의 기법에 의하여 확인될 수 있다. 상세한 설명을 위하여, 예컨대, 문헌 Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994), 및 PCT publication No. WO 97133551 (published Sep. 18, 1997)를 참조한다.
전사를 억제하는 3중 나선 구조 내의 핵산 분자는 단일-가닥이어야 하며, 데옥시뉴클레오타이드로 구성되어 있다. 이러한 올리고뉴클레오타이드의 염기 조성물은 후그스텐(Hoogsteen) 염기쌍 규칙을 통한 3중 나선 구조를 증진시키도록 설계되었으며, 이는 일반적으로 두가닥 중 하나에서의 퓨린 또는 피리미딘의 큰 길이를 필요로한다. 상세한 설명을 위하여, 예컨대, PCT publication No. WO 97/33551, 전게서를 참조한다.
이러한 소분자는 전술한 하나 이상의 선별 분석법 및/또는 당해 기술 분야의 숙련자에게 공지된 다른 선별 기법에 의하여 확인되었다.
III. 항-종양 세포 항원 항체의 생산
다음의 설명은 본 발명에 따라 사용되는 항체의 생산을 위한 예시적 기법이다. 항체 생산에 사용되는 종양 세포 항원은 예컨대, 소망하는 에피토프를 포함하는 종양 세포 항원 또는 이들의 부분의 가용성 형태의 세포외 도메인이 된다. 대안적으로, 이들의 세포 표면상에서 종양 세포 항원을 발현하는 세포는 항체를 생성하기 위하여 사용될 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시상태에서, 종양 세포 항원을 암호화하는 유전자를 사용한 DNA-기초 면역화는 항체를 생산하기 위하여 사용되었다(Ramos J.D.A. et al Allergy, Volume 59, Number 5, May 2004, pp. 539-547(9)). 항체 생성에 유용한 다른 형태의 종양 세포 항원은 당해 기술 분야의 숙련자에게 자명하다.
(i) 다클론 항체
항-종양 세포 항원 항체는 다클론 항체를 포함할 수 있다. 다클론 항체를 생산하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 다클론 항체는 포유류 내에서 생성되며, 예를 들면, 면역화 약제 및, 소망하는 경우, 보조제의 하나 이상의 주입에 의하여 생성된다. 일반적으로는, 면역화 약제 및/또는 보조제는 다중 피하 또는 복막내 주사에 의하여 포유류 내에 주입될 수 있다. 면역화 약제는 종양 세포 항원 또는 이들의 융합 단백질을 포함할 수 있다. 이는 접종된 포유류 내에서 면역화 약제와 면역원성으로 알려진 단백질의 접합에 유용한 것이다. 이러한 면역원성 단백질의 예는 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 갑상선글로블린, 및 대두 트립신 억제제를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 사용되는 보조제의 예는 프로인트 완전 보조제 및 MPL-TDM 보조제(모노포스포릴 지질 A, 합성 트레할로스 디코리노마이콜레이트)를 포함한다. 면역화 프로토콜은 실험을 하지 않고도 당해 기술 분야의 숙련자에 의하여 선택될 수 있다.
(ii) 단클론 항체
단클론 항체는 실질적으로 균일한 항체의 집락으로부터 획득할 수 있으며, 즉, 집락을 포함하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생적 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 변형인 "단클론"은 분리된 항체의 혼합물이 아닌 항체의 특성을 나타낸다.
단클론 항체는 하이브리도마법을 사용하여 생산될 수 있으며, 예컨대 문헌 Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)에 설명되어 있다. 하이브리도마법에 있어서, 마우스, 햄스터, 또는 다른 적합한 숙주 동물은 일반적으로는 면역화 약제로 접종되어 면역화 약제에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 또는 생산할 수 있는 림프구를 유발한다. 대안적으로, 림프구는 시험관 내에서 접종되었다.
면역화 약제는 일반적으로는 종양 세포 항원 폴리펩타이드 또는 이들의 융합 단백질을 포함한다. 일반적으로, 인간 기원의 세포를 소망하는 경우에는 말초 혈액 림프구("PBLs")를 사용하기도 하거나, 또는 비-인간 포유류 공급원을 소망하는 경우라면 지라 세포 또는 림프절 세포를 사용하기도 한다. 림프구는 적합한 융합 약제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 무한증식 세포주와 용합되어 하이브리도마 세포를 형성한다 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]. 무한증식 세포주는 일반적으로 전환된 포유류 세포, 특히 설치류, 소 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 일반적으로, 레트 또는 마우스 골수종 세포주를 사용한다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 무한증식 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지 내에서 배양된다. 예를 들면, 모세포에 효소 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 전이효소(HGPRT 또는 HPR™)가 결핍된 경우, 하이브리도마용 배양 배지는 일반적으로는 하이포잔틴, 아미노프테린, 및 티미딘("HAT 배지")를 포함하게되며, 이 물질이 HGPRT-결핍 세포의 성장을 예방한다.
양호한 무한증식 세포주는 효율적으로 융합하며, 선택된 항체-생산 세포에 의하여 항체를 높은 수준으로 안정적으로 발현하는 것을 지원하며 배지, 예컨대 HAT 배지에 민감한 것이다. 더욱 양호한 무한증식 세포주는 예를 들면, Salk Institute Cell Distribution Center(San Diego, Calif) 및 American Type Culture Collection(Manassas, Va)에서 획득한 뮤린 골수종 주이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주는 인간 단클론 항체의 생산용으로 설명되었다 [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antidodies Production Technique and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63].
하이브리도마 세포가 배양되는 배양 배지에서 그 다음 종양 세포 항원에 대한 단클론 항체의 존재를 분석할 수 있다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에서 생산된 단클론 항체의 결합 특이성은 면역침전 또는 시험관 내 결합 분석, 예컨대 방사성면역분석(RIA) 또는 효소-링크 면역흡수 분석(ELISA)에 의하여 결정되었다. 이러한 기법 및 분석은 기술분야에 공지되어 있다. 단클론 항체의 결합 친화도는 예를 들면, 문헌 Munson and Pollard, anal. Biochem., 107:220 (1980)의 스케차드 분석으로 결정할 수 있다.
서브클론으로부터 분비된 단클론 항체는 종래의 면역글로블린 정제 절차 예컨대, 예를 들면, 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파티테 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화도 크로마토그래피에 의하여 배양 배지 또는 복수 유체로부터 분리 또는 정제될 수 있다.
단클론 항체는 재조합 DNA 방법, 예컨대 U.S. Pat. No. 4,816,567에서 설명한 것으로 제조될 수 있다. 본 발명의 단클론 항체를 암호화하는 DNA는 종래의 절차를 사용하여 쉽게 분리되거나 또는 서열화될 수 있다(예컨대, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자를 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하여). 본 발명의 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 양호한 공급원으로 제공된다. 일단 분리된 경우, DNA를 발현 벡터 내로 위치시킬 수 있으며, 그 다음 면역글로블린 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포 예컨대 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 골수종 세포로 전달감염되어, 재조합 숙주 세포 내에서 단클론 항체의 합성을 얻게된다. DNA는 또한, 예를 들면, 상동성 뮤린 서열의 위치에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인의 암호화 서열을 치환하므로써, 또는 면역글로블린 암호화 서열 전부 또는 비-면역글로블린 폴리펩타이드의 암호화 서열의 일부에 공유결합하므로써 변형된다 [U.S. Pat. No. 4,816,567; Morrison et al., supra]. 이러한 비-면역글로블린 폴리펩타이드는 키메라 2가 항체를 생산하기 위하여 본 발명의 항체의 불변 도메인에 치환될 수 있거나, 또는 본 발명의 항체의 항원-결합 부위 중의 하나의 가변 도메인으로 치환될 수 있다.
항체는 1가 항체일 수 있다. 1가 항체의 생산 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 하나의 방법은 면역글로블린 경쇄 및 변형된 중쇄의 재조합 발현에 관련된 것이다. 중쇄는 일반적으로 Fc 영역의 어떠한 지잠에서 절단되어 중쇄 가교결합을 예방하게된다. 대안적으로, 유관 시스테인 잔기는 가교결합을 예방하기 위하여 또다른 아미노산 잔기로 치환되거나 또는 결실된다.
소망하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 클론을 희석 절차를 제한함으로써 서브클론하고, 표준 방법으로 성장시켰다[Goding, supra]. 이러한 목적을 위한 적합한 배양 배지는 예를 들면, 둘베코 변형 이글 배지 및 RPMI-1640 배지를 포함한 다. 대안적으로, 하이브리도마 세포는 포유류 내의 복수에서 생체 내 성장을 할 수 있다. 하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 항원에 대한 단클론 항체의 생산을 위하여 분석되었다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에서 생성된 단클론 항체의 결합 특이성은 면역침전 또는 시험관 내 결합 분석, 예컨대 방사성면역분석(RIA) 또는 효소-링크 면역흡수 분석(ELISA)에 의하여 결정된다. 소망하는 특이성, 친화도, 및/또는 활성을 지닌 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 확인한 후에, 클론을 희석 절차를 제한함으로써 서브클론하고, 표준 방법으로 성장시켰다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). 이 목적에 적합한 배양 배지는 예를 들면, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 이와 함께, 하이브리도마 세포는 동물 내의 복수 종양에서 생체 내 성장시켰다.
단클론 항체의 결합 친화도는 예를 들면, 문헌 Munson and Pollard, anal. Biochem., 107:220 (1980)의 스케차드 분석으로 결정할 수 있다.
서브클론으로부터 분비된 단클론 항체는 종래의 항체 정제 절차, 예를 들면, 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파티테 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화도 크로마토그래피에 의하여 배양 배지, 복수 유체, 또는 혈청으로부터 적절하게 분리된다.
단클론 항체를 암호화한 DNA는 종래의 절차를 사용하여 쉽게 분리 및 서열화되었다(예컨대, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하여). 하이브리도마 세포는 이러 한 DNA의 양호한 공급원으로서 제공된다. 일단 분리된 경우, DNA는 발현 벡터로 위치시키고, 그 다음 이를 항체 단백질을 생산하지 못하는 숙주 세포 예컨대 이. 콜리(E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 골수종 세포로 전달감염시켜, 재조합 숙주 세포 내에서 단클론 항체의 합성을 얻게된다.
항체를 암호화하는 DNA 내의 재조합 발현에 관한 연구 문헌은 Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) 및 Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)을 포함한다.
본 발명의 다른 실시상태에서, 단클론 항체 또는 항체 절편은 문헌 McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)에 설명된 기법에 의하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 문헌 Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. MoI. Biol., 222:581-597 (1991)는 파지 라이브러리를 사용한 각각 뮤린 및 인간 항체의 분리를 설명하고 있다. 후속 논문들은 사슬 셔플링에 의하여 고 친화도(nM 범위) 인간 항체를 생산하는 것(Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)) 및, 대형 파지 라이브러리를 구축하기 위한 전략으로서 조합 감염 및 생체 내 재조합(Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993))을 설명한다. 따라서, 이러한 기법은 단클론 항체의 분리를 위한 전통적인 단클론 항체 하이브리도마 기법에 비하여 실용적이다.
DNA는 예를 들면, 상동성 뮤린 서열의 위치에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인의 암호화 서열을 치환하므로써(U.S. Pat. No. 4,816,567; 및 Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sd. USA, 81:6851 (1984)), 또는 면역글로블린 암호화 서열 전부 또는 비-면역글로블린 폴리펩타이드의 암호화 서열의 일부에 공유결합하므로써 변형된다.
일반적으로는 이러한 비-면역글로블린 폴리펩타이드는, 항원에 특이성을 지닌 일 항원-결합 부위 및 다른 항원에 특이성을 지닌 다른 항원-결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 생산하기 위하여 본 발명의 항체의 불변 도메인에 치환되거나, 또는 본 발명의 항체의 항원-결합 부위 중의 하나의 가변 도메인으로 치환될 수 있다.
(iii) 인체 적응형 항체
본 발명의 항-종양 세포 항원 항체는 인체 적응형 항체 또는 인간 항체를 추가로 포함하게된다. 인체 적응형 비-인간(예컨대, 뮤린) 항체는 키메라 면역글로블린, 면역글로블린 사슬 또는 비-인간 면역글로블린으로부터 유도된 최소 서열을 함유하는 그것의 절편(예컨대 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)이다. 인체 적응형 항체는 수용자 상보적 결정 영역(CDR)의 잔기가 소망하는 특이성, 친화도 및 용량을 지닌 비-인간 종(공여자 항체) 예컨대 마우스, 레트 또는 레빗의 CDR의 잔기로 치환된 인간 면역글로블린(수용자 항체)을 포함한다. 일 예로써, 인간 면역글로블린의 Fv 프레임워크 잔기는 대응하는 비-인간 잔기에 의하여 치환된다. 인체 적응형 항체는 수용자 항체나 도입된 CDR 또는 프레임워크 서열 내에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인체 적응형 항체는 실질적으로 최소한 하나, 일반적으로는 두개의 가변 도메인 모두를 포함하게 되며, 비-인간 면역글로블린의 것에 대응하는 CDR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부 및 FR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로블린 공통 서열의 것이다. 인체 적응형 항체는 선택적으로 최소한 면역글로블린 불변 영역(Fc)의 부분, 일반적으로는 인간 면역글로블린의 부분을 포함하게된다 [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)].
인체적응형 비-인간 항체의 방법은 기술 분야에서 설명되어 왔다. 일반적으로, 인체 적응형 항체는 비-인간 공급원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 보유한다. 이러한 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "도입" 잔기로 언급되며, 일반적으로는 "도입" 가변 도메인으로부터 얻게된다. 인체적응은 Winter 및 공동연구자의 방법에 따라 인간 항체의 서열에 대응하는 고가변 영역 서열을 치환하므로써 필수적으로 수행할 수 있다(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al, Science, 239:1534-1536 (1988)). 따라서, 이러한 "인체 적응형" 항체는 키메라 항체이며 (U.S. Pat. No. 4,816,567) 여기서, 실질적으로 무손상 인간 가변 도메인이 비-인간 종의 대응 서열에 의하여 치환되었다. 실제로, 인체 적응형 항체는 일반적으로는 인간 항체이며, 이는 일부 고가변 영역 잔기 및 가능한 일부 FR 잔기는 설치류 항체 내의 유사 부위의 잔기에 의하여 치환된다.
인체 적응형 항체 생산에 사용하기 위한 인간 가변 도메인, 경쇄 및 중쇄의 선택은 항원성의 감소에 매우 중요하다. 소위 "베스트-핏(best-fit)" 방법에 따라 서, 설치류 항체의 가변 도메인 서열은 공지의 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대하여 선별하게된다. 설치류의 것에 가장 밀접한 인간 서열은 그 다음 인체 적응형 항체의 인간 프레임워크 영역(FR)으로서 수용된다(Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. MoI. Biol., 196:901 (1987)). 또다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 서브그룹의 인간 항체에서 유도된 특정 프레임워크 영역을 사용한다. 동일한 프레임워크는 수종의 다른 인체 적응형 항체에 사용될 수 있다(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., 3. Immunol., 151:2623 (1993)).
더 중요한 것은 항체가 항원 친화도 및 다른 유리한 생물학적 특성을 보유한 인체 적응형이라는 것이다. 이러한 목표를 달성하기 위하여, 양호한 방법에 따르면, 인체 적응형 항체는 모계 및 인체 적응형 서열의 3차원 모델을 사용하여 모계 서열 및 다양한 컨셉의 인체 적응형 제품의 분석 프로세스에 의하여 제조된다. 3차원 면역글로블린 모델을 일반적으로 사용하며 당해 기술 분야의 숙련자에게 친숙하다. 컴퓨터 프로그램을 사용할 수 있으며, 이는 선택된 후보 면역글로블린 서열의 개연성있는 3차원 배치 구조를 나타내고 현시한다. 이러한 현시의 조사는 후보 면역글로블린 서열의 기능에 있어서 잔기의 적절한 역할의 분석, 즉 후보 면역글로블린이 이들의 항원에 결합하는 능력에 영향을 주는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 이러한 방식으로, FR 잔기가 수용자 및 도입 서열로부터 선별되고 결합되어, 소망하는 항체 특성, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도를 달성하게 된다. 일반적으로, 고가변 영역 잔기는 항원 결합에 영향을 미치는데 직접적으로, 가장 실 질적으로 관여한다.
항체 인체적응화의 다른 방법은 항원의 도메인의 천연 친화도를 감소시키지 않으면서도 반면에 이종 종에 대한 항체의 면역원성을 감소시키도록 변형된 항체 가변 도메인 내의 이러한 아미노산의 확인에 의존한다. 변형된 아미노산은 항원 결합에 결정적이지 않은 것이나, 면역원성-자극 인자에 노출될 수 있다(예를 들면 WO931179).
항체는 공지의 선택법 및/또는 전술한 전이 방법을 사용하여 친화도 성숙이 될 수 있다. 양호한 친화도 성숙 항체는 성숙 항체가 준비되는 개시 항체(일반적으로 뮤린, 인체 적응형 또는 인간)보다 친화도가 5배, 더 바람직하게는 10배, 더욱 더 바람직하게는 20 내지 30배 크다.
다양한 형태의 인체 적응형 항체 또는 친화도 성숙 항체가 고려된다. 예를 들면, 인체 적응형 항체 또는 친화도 성숙 항체는 항체 절편, 예컨대 Fab가 될 수 있으며, 이들은 면역접합체를 생성하기 위하여 하나 이상의 세포독성 약제(들)과 선택적으로 접합된다. 대안적으로, 인체 적응형 항체 또는 친화도 성숙 항체는 무손상 항체, 예컨대 무손상 IgG1 항체가 될 수 있다.
(iv) 인간 항체
인체적응화의 대안으로써, 인간 항체를 생성할 수 있다. 예를 들면, 현재 면역화에 있어서 내인성 면역글로블린 생산의 부재하에 인간 항체의 전체 레퍼토리의 생산이 가능한 유전자삽입 동물(예컨대, 마우스)를 생산하는 것이 가능하다. 예를 들면, 키메라 및 세균-주 돌연변이 마우스 내의 항체 중쇄 합체 영역(JH) 유전자의 동종접합 결실에 의하여 내인성 항체 생산의 완전한 억제가 된다는 것을 설명하였다. 이러한 세균-주 돌연변이 마우스 내의 인간 세균-주 면역글로블린 유전자 배열의 전이는 항원 시험에 있어서 인간 항체의 생산을 가능하게 한다. 예컨대, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sd. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immune, 7:33 (1993); 및 U.S. Pat. Nos. 5,591,669, 5,589,369 및 5,545,807를 참조한다.
대안적으로, 파지 디스플레이 기술 (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990))을 미접종된 공여자의 면역글로블린 가변(V) 도메인 유전자 레퍼토리에서 시험관 내 인간 항체 및 항체 절편을 생산하기 위하여 사용될 수 있다. 이 기법에 따라서, 항체 V 도메인 유전자를 필라멘트형 박테리오파지, 예컨대 M13 또는 fd의 주요 또는 부수 피복 단백질 유전자 내로 프레임-내 클론하였으며 파지 입자의 표면상에서 기능성 항체 절편으로서 현시되었다. 필라멘트형 입자가 파지 게놈의 단일-가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능성 특성에 기초한 선택은 그러한 특성을 나타내는 항체를 암호화하는 유전자의 선택을 하게 한다. 따라서, 파지는 B-세포의 일부 특성을 모사한다. 파지 디스플레이는 다양한 포멧 내에서 수행될 수 있다; 이들의 연구를 위하여, 예컨대, Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)를 참조한다. V-유전자 부분의 몇종의 공급원은 파지 디스플레이를 위하여 사용될 수 있다. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)에서는 접종된 마우스의 지라에서 유도된 V 유전자의 무작위 조합의 작은 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 배열을 분리하였다. 미접종된 인간 공여자로부터 V 유전자의 레퍼토리를 구축하였으며, 항원(자가-항원을 포함)의 다양한 배열을 위한 항체가 필수적으로 Marks et al., J. MoI. Biol. 222:581-597 (1991), 또는 Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993), 또한, U.S. Pat. Nos. 5,565,332 및 5,573,905에 설명된 기법에 의하여 분리될 수 있다.
전술한 바와 같이, 인간 항체는 또한 시험관 내 활성화 B 세포에 의하여 생성될 수도 있다(U.S. Pat. Nos. 5,567,610 및 5,229,275).
(v) 항체 절편
항체 절편의 생산을 위한 다양한 기법이 개발되었다. 전통적으로, 이러한 절편은 무손상 항체의 단백질 분해 소화를 통하여 유도되었다(예컨대, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); 및 Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). 그러나, 이러한 절편은 현재 재조합 숙주 세포에 의하여 직접적으로 생산될 수 있다. 예를 들면, 항체 절편은 전술한 항체 파지 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 절편은 이. 콜리(E. coli)로부터 직접 회수될 수 있으며, F(ab')2 절편을 형성하기 위하여 화학적으로 커플링될 수 있다(Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). 다른 방법에 따르면, F(ab')2 절편은 재조합 숙주 세포 배양으로부터 직접적으로 분리될 수 있다. 항체 절편의 생산을 위한 다른 기법은 기술 숙련자에게 자명하게 될 것이다. 다른 실시상태에서, 선택된 항체는 단일 사슬 Fv 절편(scFv)이다. WO 93/16185; U.S. Pat. No. 5,571,894; 및 U.S. Pat. No. 5,587,458를 참조한다. 항체 절편은 "선형 항체"일 수 있으며, 예컨대, U.S. Pat. No. 5,641,870에서 설명된 바와 같다. 이러한 선형 항체 절편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
결합 도메인-면역글로블린 융합 단백질도 고려될 수 있다. 이러한 구조체에 있어서, 융합 단백질은 이황화-링크 다량체를 형성하는 손상된 능력에 기인하여 단량체로서 우세하게 존재하는 반면 ADCC 및/또는 CDC가 가능한 면역글로블린 CH2 및 CH3 도메인 및 항체 힌지 영역에 융합하는 대상 항원을 위한 결합 도메인을 포함하도록 구축된다(US20030118592 참조). 이러한 융합 단백질은 재조합적으로 높은 수준으로 생산될 수 있다.
(vi) 이중특이적 항체
이중특이적 항체는 최소한 두개의 서로다른 에피토프에 대한 결합특이성을 보유한 항체이다. 예시적인 이중특이적 항체는 종양 항원 단백질의 두 개의 다른 에피토프와 결합할 수 있다. 대안적으로,종양 항원-발현 세포에 대한 세포성 방어 기작에 초점을 맞추기 위하여, 항-종양 세포 항원 팔(arm)은 백혈구 예컨대 T-세포 수용체 분자(예컨대 CD2 또는 CD3), 또는 IgG(FcγR), 예컨대 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD16)를 위한 Fc 수용체 상에서 촉발 분자와 결합하는 팔과 결합된다. 이중특이적 항체는 종양 항원을 발현하는 세포에 대한 세포독성 약제를 국소화하기 위하여 사용할 수 있다. 이러한 항체는 종양 항원-결합 팔 및 세포독성 약제(예컨대 사포린, 항-인터페론-알파, 빈카 알칼로이드, 리신 A 사슬, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 헵탄)에 결합하는 팔을 보유한다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 절편(예컨대 F(ab')2 이중특이적 항체)로서 제조될 수 있다.
이중특이적 항체의 제조법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 전장 이중특이적 항체의 전통적인 생산은 두 면역글로블린 중쇄-경쇄 짝의 공동발현에 기초하며, 여기서 두 사슬은 다른 특이성을 갖는다(Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). 면역글로블린 중쇄 및 경쇄의 무작위 조합에 의하여, 이러한 하이브리도마 (쿼드로마)가 10 개의 다른 항체 분자의 잠재적인 혼합물을 생산하며, 여기서 오직 하나만이 정확한 이중특이적 구조를 갖게된다. 일반적으로 친화도 크로마토그래피 스텝으로 수행되는 정확한 분자의 정제는 다소 성가시며, 및 생산 수율도 낮다. 유사한 절차를 WO 93/08829, 및 Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)에서 개시하였다.
소망하는 결합 특이성을 지닌 항체 가변 도메인(항체-항원 결합 부위)은 면역글로블린 불변 도메인 서열에 융합되었다. 바람직하게는 융합은 최소한 힌지, CH2, 및 CH3 영역의 부분을 포함하는 면역글로블린 중쇄 불변 도메인을 보유한다. 최소한 하나의 융합에 존재하는 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (Cm)을 보유하는 것이 바람직하다. 면역글로블린 중쇄 융합체 및, 소망하는 경우, 면역글로블린 경쇄를 암호화하는 DNA는 분리 발현 벡터로 삽입되고 적합한 숙주 유기체 내로 동시-전달감염된다. 이중특이적 항체의 생성의 상세한 설명을 위 하여, 예를 들면, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)를 참조한다.
WO 96/27011에 설명된 다른 방법에 따르면, 항체 분자의 짝 사이의 경계면은 재조합 세포 배양물에서 회수되는 이종이량체의 백분율이 최대화되도록 조작될 수 있다. 바람직한 경계면은 최소한 항체 불변 도메인의 CH3 영역의 일부를 포함한다. 이 방법에서, 1차 항체 분자의 경계면의 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄는 대형 측쇄(예컨대 티로신 또는 트립토판)으로 대체되었다. 대형 측쇄(들)과 동일 또는 유사한 크기의 보상 "캐비티"가 대형 아미노산 측쇄를 소형(예컨대 알라닌 또는 트레오닌)으로 치환하므로써 제2 항체 분자의 경계면상에 생성되었다. 이는 다른 원치않는 최종산물 예컨대 동종이량체에 대한 이종이량체의 수율을 증가시키는 기작을 제공한다.
이중특이적 항체는 크로스-링크 또는 "이종접합" 항체를 포함한다. 이종접합 항체는 두개의 공유결합된 항체로 구성된다. 이러한 항체는, 예를 들면,표적 면역계 세포가 원치않는 세포를 표적화하도록 제안되었으며(U.S. Pat. No. 4,676,980), 및 HIV 감염의 치료를 위하여 제안되었다(WO 91/00360, WO 92/200373, 및 EP 03089). 가교결합 약제에 관한 것들을 포함하는 합성 단백질 화학 내의 공지의 방법을 사용하여 시험관 내에서 제조될 수 있다. 예를 들면, 면역독소는 이황화 교환 반응을 사용하거나 또는 티오에테르 결합을 형성하여 구축될 수 있다. 이러한 목적에 적합한 약제의 예에는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티르이미데이트를 포함하며, 예를 들면, U.S. Pat. No. 4,676,980에서 이를 개시하였다.
이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 절편(예컨대 F(ab')2 이중특이적 항체)로서 제조될 수 있다. 항체 절편에서 이중특이적 항체를 생성하는 기법은 문헌에서 설명되었다. 예를 들면, 이중특이적 항체는 화학적 링크를 사용하여 제조될 수 있다. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)에서는 절차를 설명하였으며, 여기서 무손상 항체는 단백질 분해적으로 분열되어 F(ab')2 절편을 생성하게된다. 이러한 절편은 디티올 복합 약제 아비산염 나트륨의 존재하에 환원되어 빈시날 디티올을 안정화시키고, 분자간 이황화 결합 형성을 예방한다. 생성된 Fab' 절편은 그 다음 티오니트로벤조에이트(TNB) 유도체로 전환되었다. Fab'-TNB 유도체의 하나는 그 다음 머캅토에틸아민으로 환원시켜 Fab'-티올로 재전환하며, 동몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성하게 된다. 생산된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정을 위한 약제로서 사용될 수 있다.
Fab'-SH 절편은 이. 콜리(E. coli)로 부터 직접적으로 회수될 수 있으며, 화학적으로 커플링되어 이중특이적 항체를 형성하게된다. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)는 전체적으로 인체 적응형 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 생산을 설명한다. 각 Fab' 절편은 이. 콜리(E. coli)로부터 개별적으로 분비되었으며, 시험관 내 화학적 커플링을 하여 이중특이적 항체를 형성하게된다. 형성된 이중특이적 항체는 따라서 ErbB2 수용체를 과다발현하는 세포 및 정상 인간 T 세포에 결합할 수 있으며, 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 촉발한다.
재조합 세포 배양물로부터 직접 이중특이적 항체 절편을 제조 및 분리하는 다양한 기법이 설명되었다. 예를 들면, 이중특이적 항체는 류신 지퍼를 사용하여 생산되었다. 문헌 Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992). Fos 및 Jun 단백질의 류신 지퍼 펩타이드는 유전자 융합에 의하여 두개의 다른 항체의 Fab' 부분에 결합한다. 항체 동종이량체는 힌지 영역에서 환원되어 단량체를 형성하며, 그 다음 재산화되어 항체 이종이량체를 형성하게된다. 이 방법은 항체 동종이량체의 생산에 활용될 수 있다. "이합체" 기술은 문헌 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)에 설명되어 있으며, 이중특이적 항체 절편을 생성하는 대체 기작을 제공한다. 절편은 동일한 사슬상의 두 도메인사이의 짝을 가능하기에는 너무 짧은 링커에 의하여 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 따라서, 하나의 절편의 VH 및 VL 도메인이 또다른 절편의 상보적 VL 및 VH 도메인과 짝을 이루도록 하여, 두개의 항원-결합 부위를 형성하게된다. 단일-사슬 Fv(sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 절편을 생산하는 또다른 전략이 보고되었다. 문헌 Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)를 참조한다.
원자가 2가 이상의 항체를 고려하였다. 예를 들면, 3중특이적 항체를 생산할 수 있다. 문헌 Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)를 참조.
예시적인 이중특이적 항체는 본원의 주어진 종양 세포 항원 폴리펩타이드 상의 두개의 다른 에피토프에 결합할 수 있다. 대안적으로, 특정 종양 세포 항원을 발현하는 세포에 대한 세포성 방어 기작에 초점을 맞추기 위하여, 항-종양 세포 항원 팔은 백혈구 예컨대 T-세포 수용체 분자(예컨대 CD2, CD3, CD28, 또는 B7), 또는 IgG(FcγR), 예컨대 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD16)의 Fc 수용체 상의 촉발 분자에 결합하는 팔과 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 특정 종양 세포 항원을 발현하는 세포에 대한 세포독성 약제를 국소화하기 위하여 사용할 수 있다. 이러한 항체는 종양 세포 항원-결합 팔 및 세포독성 약제 또는 방사선핵종 킬레이터, 예컨대 EOTUBE, DPTA, DOTA, 또는 TETA에 결합하는 팔을 보유한다. 또다른 대상 이중특이적 항체는 종양 세포 항원에 결합하고 추가적으로 조직 인자(TF)에 결합한다.
(vii) 다른 아미노산 서열 변형
본원의 항-종양 세포 항원 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 예를 들면, 이는 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 향상시키기에 바람직하다. 항종양 세포 항원 항체의 아미노산 서열 변이체는 적합한 뉴클레오타이드 변화를 항-종양 세포 항원 항체 핵산에 도입하거나, 또는 펩타이드 합성에 의하여 제조될 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들면, 항-종양 세포 항원 항체의 아미노산 서열 내의 잔기의 결실, 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 결실, 삽입, 및 치환의 모든 조합은 최종 구조체가 소망하는 특성을 보유하도록 최종 구조체에 도달하도록 만들어졌다. 아미노산 변화는 예컨대 글리코실화 부위의 수와 위치의 변화 등의 항-종양 세포 항원 항체의 번역-후 과정을 변화시킬 수 있다.
전이를 위한 바람직한 위치의 항-종양 세포 항원 항체의 특정 잔기 또는 영 역의 확인을 위한 유용한 방법은 "알라닌 스케닝 전이"라고 한다(Cunningham and Wells Science, 244:1081-1085 (1989)). 여기서, 잔기 또는 표적 잔기의 군이 확인되었으며(예컨대, 대전된 잔기 예컨대 arg, asp, his, lys, 및 glu) 및 중성 또는 음성 대전 아미노산(가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 치환되어 아미노산과 종양 세포 항원의 상호작용에 영향을 미친다. 치환에 기능적 민감성을 확인하는 그러한 아미노산 위치는 치환 부위에서 또는 치환 부위를 위한 추가의 또는 다른 변이체를 도입하여 정제되었다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위가 예정된 경우, 돌연변이 특성 그 자체가 예정될 필요가 없다. 예를 들면, 주어진 부위의 돌연변이의 성능을 분석하기 위하여, 알라닌 스케닝 또는 무작위 전이를 표적 코돈 또는 영역에서 수행하였으며, 발현된 항-종양 세포 항체 변이체는 소망하는 활성으로 선별되었다.
아미노산 서열 삽입은 하나의 잔기 내지 수백개 이상의 잔기 및 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열 내 삽입을 함유하는 폴리펩타이드의 길이의 범위의 아미노-및/또는 카르복실-말단 융합을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 지닌 항-종양 세포 항원 항체 또는 세포독성 폴리펩타이드에 융합된 항체를 포함한다. 항-종양 세포 항원 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소(예컨대 ADEPT에 대한) 또는 항체의 형청 반감기를 증가시키는 폴리펩타이드에 대한 항-종양 세포 항원 항체의 N-또는 C-말단의 융합체를 포함한다.
변이체의 또 다른 타입은 아미노산 치환 변이체이다. 이러한 변이체는 다른 잔기에 의하여 치환된 항-종양 세포 항원 항체 분자 내의 최소한 하나의 아미노산 잔기를 보유한다. 치환 전이의 가장 큰 대상 부위는 고가변 영역을 포함하나, FR 변형은 또한 고려되지 않았다. 보존적 치환은 "바람직한 치환"이라는 표제하에 표 1에 나타내었다. 이러한 치환에 의하여 생물학적 활성이 변화된 경우, 그 다음의 더욱 실질적인 변화로서, 표 1의 "예시적 치환"으로 명명되거나, 또는 아미노산 클래스의 참고자료로 다음에 추가로 설명된 것이 도입될 수 있으며, 산물이 선별되었다.
원 잔기 예시적 치환 바람직한 치환
Ala (A) val; leu; ile val Arg (R) lys; gin; asn lys Asn ((N)) gin; his; asp, lys; arg gin Asp (D) glu; asn glu Cys (C) ser; ala ser GIn (Q) asn, glu asn GIu (E) asp; gln asp His (H) asn; gin; lys; arg arg Ile (I) leu; val; met; ala; phe; norleucine leu Leu (L) norleucine; ile; val; met; ala; phe ile Lys (K) arg; gin; asn arg Met (M) leu; phe; ile leu Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr tyr Pro (P) ala ala Ser (S) thr thr Thr (T) ser ser Trp (W) tyr; phe tyr Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe VaI (V) ile; leu; met; phe; ala; norleucine leu
항체의 생물학적 특성의 치환의 실질적인 변형은 (a) 치환 영역 내의 폴리펩타이드 골격의 구조, 예를 들면, 시트 또는 나선 배치, (b) 표적 부위 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 용적을 유지하는 것에 대한 이들의 영향이 상당히 다른 치환을 선택함으로써 달성된다. 자연발생적 잔기는 일반 측쇄 특성에 기초한 군으로 나뉜다:
1) 소수성: norleucine, met, ala, val, leu, ile;
2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
3) 산성: asp, glu;
4) 염기성: asn, gin, his, lys, arg;
5) 사슬 방향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및
6) 방향족: trp, tyr, phe.
비-보존적 치환은 또다른 클래스를 위한 이러한 클래스 중의 하나의 구성원의 교환을 수반하게될 것이다.
이러한 치환된 잔기는 또한 보존적 치환 부위 또는, 더 바람직하게는, 잔존(비-보존적) 부위로 도입될 수 있다.
항-종양 세포 항원 항체의 적당한 입체구조의 유지에 관여하지 않는 모든 시스테인 잔기는 일반적으로 세린으로 치환되어 분자의 산화 안정성을 향상시키고 변종 가교결합을 예방하게된다. 이와 반대로, 시스테인 결합(들)이 항체에 첨가되어 이들의 안정성을 향상시키게된다(특히, 항체가 항체 절편 예컨대 Fv 절편인 경우).
특히 바람직한 타입의 치환 변이체는 모 항체(예컨대 인체 적응형 또는 인간 항체)의 하나 이상의 고가변 영역 잔기를 치환하는 것을 수반한다. 일반적으로, 추가의 개발을 위하여 선택된 결과 변이체(들)은 이들이 생성될 모 항체에 관련된 생물학적 특성을 향상시키게된다. 이러한 치환 변이체를 생성하기 위한 편리한 방법은 파지 디스플레이를 사용하는 친화도 성숙을 수반한다. 간단히 말하면, 수개의 고가변 영역 부위(예컨대 6-7 부위)가 각 부위에서 모든 가능한 아미노 치환을 생성하도록 돌연변이된다. 생성된 항체 변이체는 따라서 각 입자에 함입된 M13의 유전자 III 산물의 융합체로서, 필라멘트형 파지 입자로부터 1가 방식으로 현시된다. 파지-현시 변이체는 본원에서 개시한 바와 같이 이들의 생물학적 활성(예컨대 결합 친화도)을 위하여 선별된다. 변형을 위한 후보 고가변 영역 부위를 확인하기 위하여, 알라닌 스캐닝 전이를 수행하여 항원 결합에 현저하게 기여하는 고가변 영역 잔기를 확인하게 된다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 이는 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하여 항체 및 인간 종양 세포 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위하여 유용하다. 이러한 접촉 잔기 및 인근 잔기는 본원에서 설명한 기법에 따라 치환하기 위한 후보이다. 일단 이러한 변이체가 생성되는 경우, 변이체의 패널에 본원에서 설명한 바와 같이 선별을 가하게 되며, 하나 이상의 유관 분석법에서 우월한 특성을 지닌 항체가 추가의 개발을 위하여 선택될 수 있다.
또다른 타입의 항체의 아미노산 변이체는 항체의 원래의 글리코실화 패턴을 변화시킨다. 변화한다는 것은 항체에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 모이어티의 결실, 및/또는 항체 내에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 첨가를 의미한다.
항체의 글리코실화는 일반적으로는 N-링크이거나 또는 O-링크이다. N-링크는 탄수화물 모이어티를 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착하는 것을 의미한다. 트리펩타이드 서열인 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌, 여기서 X는 프롤린을 제외한 모든 아미노산이며, 이는 탄수화물 모이어티가 아스파라긴 측쇄에 효소적으로 부착하기 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩타이드 내의 이러한 트리펩타이드 서열이 각각 존재한다는 것은 잠재적인 글리코실화 부위를 생성하게된다. O-링크 글리코실화는 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시라이신이 사용되더라도 당 N-아실갈락토사민, 갈락토오스, 또는 자일로스 중의 하나가 히드록시아미노산, 가장 일반적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착하는 것을 의미한다.
항체에 글리코실화 부위를 첨가하는 것은 아미노산 서열을 변경함으로써 손쉽게 달성되며, 이로써 (N-링크 글리코실화 부위를 위한) 하나 이상의 전술한 트리펩타이드 서열을 함유한다. 변경은 (O-링크 글리코실화 부위를 위한) 원항체의 서열에 대한 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 첨가 또는 이에 의한 치환에 의하여 생성될 수 있다.
항-종양 세포 항원 항체의 아미노산 서열 변이체를 암호화하는 핵산 분자를 당해 기술 분야에 공지된 다양한 방법에 의하여 제조되었다. 이러한 방법은 천연 공급원으로부터의 분리(자연발생적 아미노산 서열 변이체의 경우) 또는 올리고뉴클레오타이드-매개(또는 부위-지향) 전이, PCR 전이, 및 항-종양 세포 항원 항체의 초기 제조된 변이체 또는 비-변이체 버전의 카세트 전이에 의한 제조를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위하여, U.S. Pat. No. 5,739,277에 기재된 바와 같이, 예를 들면 구제(salvage) 수용체 결합 에피토프를 항체(특히 항체 절편)내로 혼입시킬 수 있다. 본원에서 사용한 바와 같이, 용어 "구제 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체 내 혈청 반감기를 증가시키는 IgG 분자(예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 의미한다.
(viii) 친화도 성숙
이는 본 발명 항체의 친화도를 증가시키는데 필수적이며, 이러한 목적을 수행하기 위한 많은 공지의 방법이 존재한다. 예를 들면, 주목하는 병렬(step-by-step) 전이는 파지-발현 항체 라이브러리를 사용하여 수행할 수 있으며, 여기서 단일 돌연변이를 함유한 모든 6개의 중쇄 및 경쇄 CDR이 발현되며, 증가된 항원 친화도에 대하여 선별된다(Wu et al., (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(ll):6037-42). 또다른 주목하는 방법은 "핫-스팟 전이"이며, 여기서 무작위적 도입 돌연변이는 향상된 친화도를 생성할 가장 가능성있는 부위에 도입된다(Ho et al., (2005) J. Biol. Chem. 280:607-17). 주목하는 방법은 예컨대 이러한 것들은 오직 작은 라이브러리만이 선별을 위하여 필요하다는 점이 장점이며, 후에, 모든 변이체 조합의 확장 선별이 최상의 클론을 얻기 위하여 필요하다는 점이 단점이다.
두번째로 일반적인 항체 친화도 성숙을 수행하는 방법은 수개의 다른 타입의 현시 기술 중의 하나를 사용하는 것에 의존한다. 이러한 기술에 있어서, 수백만의 항체 변이체가 현시되고 향상된 친화도를 지닌 그러한 변이체에 유리한 조건하에서 선택된다. 현시 시스템은 무작위 돌연변이 도입을 위한 방법과 종종 짝을 이룬다 예컨대 에러-빈발 PCR 전이 등이다. 사용할 수 있는 현시 기술은 리보솜-, 효모-, 파지-, 마이크로비드-, 단백질-DNA 링크-, 박테리아- 및 레트로바이러스-디스플레이를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이러한 기법을 사용함으로써, 항체 친화도의 1000X 향상이 보고되었으며, 48 fM로 낮은 친화도를 지닌 항체를 생성하였다. 연구를 위하여, Hoogenboom (2005) Nature Biotechnology 23:1105-16를 참조한다.
대안적 방법으로서, "룩-스루(look-through) 전이"는 CDR 도메인 내의 화학의 기여도를 조사하므로써 및 아미노산 측쇄 화학의 시너지적 기여를 부여하므로써 동시에 조합적 돌연변이를 평가 및 최적화하는 다차원 전이 방법이다(Rajpal et al (2005) Proc Natl Acad Sci USA 102(24): 8466-71).
(ix) 효과기 기능 조작
이는, 예컨대 항체의 항원-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)을 증진시키기 위하여 본 발명의 항체를 효과기 기능에 관하여 변경하기에 바람직하다. 이는 항체의 Fc 영역 내에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입하므로써 달성하게된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 시스테인 잔기(들)이 Fc 영역 내에 도입되어, 이 영역 내에서 사슬 내 이황화 결합 형성이 가능하게 한다(연구를 위하여 참조: Weiner and Carter (2005) Nature Biotechnology 23(5): 556-557). 생성된 동종이량체 항체는 향상된 내재화 가능성 및/또는 증가된 보체-매개 세포 사멸 및 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC)을 보유하게된다. 문헌 Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) 및 Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)를 참조한다. 증진된 항-종양 활성을 지닌 동종이량체 항체는 Wolff et al. Cancer Research 53:2560-2565 (1993)에서 설시한 바와 같이 이종이중기능성 크로스-링커를 사용하여 제조될 수 있다. 대안적으로, 항체는 이중 Fc 영역을 보유하고 이에 따라 증진된 보체 용해 및 ADCC 가능성을 보유하도록 조작될 수 있다. 문헌 Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)를 참조한다. 항체는 Fc 영역 내의 변형된 글리코실화로 제조될 수 있다. 예를 들면, 탄수화물 사슬 내의 푸코스 함량을 낮추는 것은 항체의 내재적 ADCC 활성을 향상시킬 수 있다(예를 들면 BioWa's Potillegent™ ADCC 증진 기술, WO0061739). 대안적으로, 항체는 분기된 비-푸코실화 올리고사카라이드 사슬을 첨가한 세포주 내에서 생산될 수 있다(US 6,602,684). 이러한 두 기술은 증가된 ADCC 효능을 나타내는 효과기 세포 상의 FcγIIIa 수용체에 대한 증가된 친화도를 지닌 항체를 생산한다. Fc 영역은 본 발명의 항체의 혈청 반감기를 변화기키도록 조작될 수 있다. 애브덱스(Abdegs)는 FcRn 구제 수용체에대한 증가된 친화도를 지니고, 따라서 종래의 IgG보다 더 짧은 반감기를 지니는 조작된 IgG이다(Vaccaro et al, (2005) Nature Biotechnology 23(10): 1283-1288). 혈청 반감기를 증가시키기 위하여, 특이적 돌연변이를 FcRn에 대한 친화도를 감소시키는 것으로 보이는 Fc 영역 내로 도입할 수 있다(Hinton et al, (2004) J Biol Chem 297(8): 6213-6216). 본 발명의 항체는 다른 기작을 사용하도록 변형되어 혈청 반감기를 변화시킬 수 있으며, 예컨대 혈청 알부민 결합 도메인(dAb)을 포함한다(WO05035572, 예를 들면). 조작된 Fc 도메인(예를 들면 XmAB™, WO05077981)은 본 발명의 항체 내로 편입되어 향상된 ADCC 활성, 변경된 혈청 반감기 또는 증가된 항체 단백질 안정성을 나타내게 된다.
(x) 면역접합체
본 발명은 세포독성 약제 예컨대 화학치료제, 독소(예컨대 효소적 활성 독소 또는 박테리아, 진균류, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소로서, 절편 및/또는 이들의 변이체를 포함), 전구약물 또는 또다른 약제 예컨대 면역조절제, 호르몬 또는 호르몬 길항제, 및 효소 또는 효소 억제제, 광활성 치료제 예컨대 크로마겐 또는 염료, 혈관형성 억제제, 대체 항체 또는 그것의 절편, 또는 방사성 동위원소(즉, 방사성접합)와 접합된 항체를 포함하는 면역접합체에 관한 것이다(Schrama et al, (2006) Nature Reviews 5: 147-159).
이러한 면역접합체의 생성에 유용한 화학치료제를 전술하였다. 항체 및 하나 이상의 소분자 독소, 예컨대 칼리케아미신, 메이탄신 (U.S. Pat. No. 5,208,020), 트리코텐, 듀오카마이신(또한 '초 잠재성 독소'; 일반적으로 Lillo et al, (2004) Chemistry and Biology 11;p.897-906) 및 CC-1065의 접합체가 본원에서 고려되었다.
본 발명의 바람직한 일 실시상태에서, 항체는 하나 이상의 메이탄신 분자와 접합된다(예컨대 약 1 내지 약 10 메이탄신 분자/항체 분자). 메이탄신은, 예를 들면, May-SS-Me로 전환되며, 이는 May-SH3로 환원될 수 있으며 변형된 항체와 반응하여(Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)) 메이탄시노이드-항체 면역접합체를 생성한다. 대안적으로, 선택된 약물은 고도로 잠재적인 메이탄신 유도체 DM1(N2'-데아세틸-N2'-(3-머캅토-1-옥소프로필)-메이탄신)이 될 수 있으며(예를 들면 WO02/098883, Dec. 12, 2002), 이는 IC50값이 대략 10-11 M이고 (Payne (2003) Cancer Cell 3:207-212) 또는 DM4 (N2'-데아세틸-N2'(4-메틸-4-머캅토-1-옥소펜틸)-메이탄신)이 될 수 있다(예를 들면 WO2004/103272, Dec. 2, 2004).
또다른 면역접합체는 하나 이상의 칼리키마이신 분자와 접합된 항-종양 세포 항원 항체를 포함할 수 있다. 항생제의 칼리키마이신 족은 피코몰 이하의 농도에서 이중-가닥 DNA 브레이크를 생성할 수 있다. 사용되는 칼리키마이신의 구조적 유사체는, 감마.sub.1.sup.I, 알파.sub.2.sup.I, 알파.sub.3.sup.I, N-아세틸-감마.sub.1.sup.I, PSAG 및 .세타..sup.I.sub.1를 포함하나 이에 한정되지 않는다(Hinman et al. Cancer Research 53: 3336-3342 (1993) 및 Lode et al. Cancer Research 58: 2925-2928 (1998)). 또한, U.S. Pat. Nos. 5,714,586; 5,712,374; 5,264,586; 및 5,773,001는 참고자료로서 본원에 포함되어 있다.
또다른 방법은 많은 암 내에서 과다생산되는 효소에 의하여 이들의 활성 형태 내에서 방출될 수 있는 전구약물에 종양 세포 항원 항체를 접합하는 것을 수반한다. 예를 들면, 항체 접합체는 전구약물 형태의 독소루비신으로 제조될 수 있으며, 여기서 활성 성분은 플라스민에 의하여 접합체로부터 방출된다. 플라스민은 다수의 암성 조직 내에서 과다 생산되는 것으로 알려져 있다(Decy et al, (2004) FASEB Journal 18(3): 565-567).
사용될 수 있는 효소적 활성 독소 및 그것의 절편은 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 절편, 외독소 A 사슬(슈도모나스 아에루기노사), 슈도모나스 내독소, 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 메덱신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아르네리카나(Phytolaca arnericana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 리보뉴클레아제(RNA분해효소), 데옥시리보뉴클레아제(Dnase), 억새풀 항바이러스 단백질, 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 큐르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트리토신, 페노마이신, 네오마이신 및 트리코테칸을 포함한다. 예를 들면, WO 93/21232, Oct. 28, 1993를 참조한다. 특히 바람직한 것은 낮은 내인성 면역원성 및 암성 세포가 독소에 저항하는 기회를 감소시켜주는 활성 기작(예컨대 세포독성 기작 대 세포증식억제 기작)을 보유하는 독소이다.
본 발명의 항체 및 면역조절제 간의 접합체가 고려된다. 예를 들면, 면역 자극 올리고뉴클레오타이드를 사용할 수 있다. 이러한 분자가 항원-특이적 항체 반응을 유발시키는 잠재적 면역원이다(Datta et al, (2003) Ann N.Y. Acad. Sd 1002: 105-111). 추가적인 면역조절제 화합물은 줄기 세포 성장 인자 예컨대 "S1 인자", 림프독소 예컨대 종양 괴사 인자(TNF), 조혈 인자 예컨대 인터류킨, 집락 자극 인자(CSF) 예컨대 과립구-집락 자극 인자(G-CSF) 또는 과립구 대식세포-자극 인자(GM-CSF), 인터페론(IFN) 예컨대 인터페론 알파, 베타 또는 감마, 에리스로포이에틴, 및 트롬보포이에틴을 포함할 수 있다.
다양한 방사성 동위원소는 방사성접합된 항종양 세포 항원 항체의 생산에 활용된다. 치료적 방사성접합체는 P-32, P-33, Sc-47, Fe-59, Cu-64, Cu-67, Se-75, As-77, Sr-89, Y-90, Mo-99, Rh-105, Pd-109, Ag-111, I-125, I-131, Pr-142, Pr-143, Pm-149, Sm-153, Th-161, Ho-166, Er-169, Lu-177, Re-186, Re-188, Re-189, Ir-194, Au-198, Au-199, Pb-211, Pb-212, 및 Bi-213, Co-58, Ga-67, Br-80m, Tc-99m, Rh-103m, Pt-109, In-111, Sb-l19, I-125, Ho-161, Os-189m, Ir-192, Dy-152, At-211, Bi-212, Ra-223, Rn-219, Po-215, Bi-211, Ac-225, Fr-221, At-217, Bi-213, Fm-255 및 이들의 조합을 사용하여 제조될 수 있다. 추가적으로, 붕소, 가돌리늄 또는 우라늄 원자를 사용할 수 있으며, 여기서 붕소 원자는 바람직하게는 B-10, 가돌리늄 원자는 Gd-157 및 우라늄 원자는 U-235이다.
바람직하게는, 치료적 방사선핵종 접합체는 20 내지 10,000 keV 사이의 에너지를 지닌 방사선핵종을 보유한다. 방사선핵종은 1000 keV 이하의 에너지의 오제 에미터(Auger emitter)가 될 수 있으며, 20 내지 5000 keV 사이의 에너지를 보유한 P 에미터, 또는 2000 내지 10,000 keV 사이의 에너지를 보유한 알파 또는 'a' 에미터가 될 수 있다.
진단적 방사성접합체는 감마-베타-또는 양전자-방출 동위원소인 방사선핵종을 함유할 수 있으며, 방사선핵종은 20 내지 10,000 keV 사이의 에너지를 보유할 수 있다. 방사선핵종은 18F, 51Mn, 52mMn, 52Fe, 55Co, 62Cu, 64Cu, 68Ga, 72As, 75Br, 76Br, 82mRb, 83Sr, 86y, 89Zr, 94mTc, IIn, 12Oi, 124i, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 67CU, 67Ga, 75Se, 97Ru, 99mTc, 111In, 114mIn, 123i, 125i, 131i, 169, 197Hg, 및 21Ti의 군으로부터 선택될 수 있다.
추가의 타입의 진단용 면역접합체가 고려된다. 본 발명의 항체 또는 절편은 광활성제 또는 조영제인 진단용 약제에 링크될 수 있다. 광활성 화합물은 화합물 예컨대 크로마겐 또는 염료를 포함할 수 있다. 조영제는 예를 들면 상자성 이온이 될 수 있으며, 여기서 이온은 크롬(III), 망간(II), 철(III), 철(II), 코발트(II), 니켈(II), 구리(II), 네오디뮴(III), 사마리움(III), 이테르븀(III), 가돌리늄(III), 바나듐(II), 테르븀(III), 디스프로슘(III), 홀뮴(III) 및 에르븀(III)의 군으로부터 선택된 금속을 포함한다. 조영제는 X-레이 기술 또는 컴퓨터 단층촬영에 사용되는 방사능-비투과성 화합물, 예컨대 요오드, 이리듐, 바륨, 갈륨 및 탈륨 화합물이 될 수 있다. 방사성-비투과성 화합물은 바륨, 디아트리조에이트, 이티오다이즈드 오일, 시트르산염 갈륨, 이오캄산, 이오세탐산, 이오다미드, 이오디파미드, 이오독삼산, 이오규라미드, 이오헥솔, 이오파미돌, 이오파노산, 이오프로세믹산, 이오세파믹산, 이오세르산, 이오설파미드 메글루민, 이오세메트산, 이오타술, 이오테트르산, 이오탈람산, 이오트록산, 이오자글산, 이옥소트리조산, 이포데이트, 메글루민, 메트리자미드, 메트리조에이트, 프로필리돈, 및 염화 탈륨의 군으로부터 선택될 수 있다. 대안적으로, 진단용 면역접합체는 초음파-증진 약제 예컨대 본 발명의 항체에 접합된 기체 충진 리포좀을 함유할 수 있다. 진단적 면역접합체는 종양 또는 암 진단 및 검출의 수술중, 내시경 또는 혈관내 방법을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 절차에 사용될 수 있다.
항체와 세포독성 약제의 접합체는 다양한 이중기능성 단백질 커플링제 예컨대 N-석시니미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트(SPDP), 석시니미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트, 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이중기능성 유도체(예컨대 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르(예컨대 디석시니미딜 수베레이트), 알데히드(예컨대 글루타렐데하이드), 비스-아지도 화합물(예컨대 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예컨대 톨리엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오린 화합물(예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 리신 면역독소는 문헌 Vitetta et al. Science 238: 1098 (1987)에서 설명된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세테이트산(MX-DTPA)는 방사성뉴클레오타이드와 항체의 접합을 위한 킬레이트제의 예이다. WO94/11026를 참조한다. 링커는 세포 내에서 세포독성 약물의 방출을 촉진하는 "분열가능 링커"일 수 있다. 예를 들면, 산-불안정 링커, 펩티다아제-민감성 링커, 디메틸 링커 또는 이황화-함유 링커 (Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992))가 사용될 수 있다. 약제는 추가적으로 탄수화물 모이어티를 통하여 본 발명의 항체에 링크될 수 있다.
대안적으로, 항-종양 세포 항원 항체 및 세포독성 약제를 포함하는 융합 단백질은 예컨대 재조합 기법 또는 펩타이드 합성에 의하여 제조될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시상태에서, 항체는 종양 사전표적화에 사용가능한 "수용체"(예컨대 스트렙타비딘)에 접합될 수 있다. 여기서 항체-수용체 접합체가 환자에 투여되고, 그 다음 촉진제(clearing agent)를 사용하여 순환으로부터 미결합 접합체를 제거한다. 그리고 세포독성 약제(예컨대 방사성뉴클레오타이드)에 접합된 "리간드"(예컨대 아비딘)를 투여한다.
항-종양 세포 항원 항체는 추가적으로 표적 세포 라이소좀 내부에서만 방출되는 세포독성 분자에 접합된다. 예를 들면, 약물 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE)는 항체 접합체의 내부화에 따르는 단백질 분해 라이소좀 효소 카뎁신 B에 의하여 분열될 발린-시트룰린 링크에 의하여 접합될 수 있다(예를 들면 WO03/026577, April 3, 2003). 대안적으로, MMAE는 분열가능 모이어티로서의 히드라존 기능성을 포함하는 산-불안정 링커를 사용하여 항체에 부착될 수 있다(예를 들면 WO02/088172, Nov. 11, 2002).
(xi) 항체 의존성 효소 매개 전구약물 치료(ADEPT)
본 발명의 항체는 전구약물(예컨대 펩티딜 화학치료제, WO81/01145)을 활성 항암 약물로 전환하는 전구약물-활성화 효소에 항체를 접합하므로써 ADEPT에 사용될 수 있다. 예를 들면, WO 88/07378 및 U.S. Pat. No. 4,975,278이다.
ADEPT에 유용한 면역접합체의 효소 성분은 이들을 이들의 더욱 활성이며, 세포독성인 형태로 전환하도록하는 전구약물을 활성화할 수 있는 모든 효소를 포함한다.
본 발명의 방법에 유용한 효소는 포스페이트-함유 전구약물을 유리 약물로 전환하는 것에 유용한 알칼리성 인산분해효소; 설페이트-함유 전구약물을 유리 약물로 전환하는 것에 유용한 아릴설파타아제; 무독성 5-플루오로사이토신을 항암 약물, 5-플루오로우라실로 전환하는 것에 유용한 사이토신 디아미나아제; 펩타이드-함유 전구약물을 유리 약물로 전환하는 것에 유용한 프로테아제, 예컨대 세라티아 프로테아제, 더모라이신, 서브틸리신, 카르복시펩티다아제 및 카뎁신(예컨대 캅뎁신 B 및 L); D-아미노산 치환체를 함유한 전구약물로 전환하는 것에 유용한 D-알라닐카르복시펩티다아제; 글리코실화 전구약물을 유리 약물로 전환하는 것에 유용한 탄수화물-분해 효소 예컨대 베타-갈락토시다아제 및 뉴라미니다아제; 베타-락탐로 유도된 약물을 유리 약물로 전환하는 것에 유용한 베타-락타마아제; 및, 이들의 아민 질소를 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸기로 유도한 약물을 각각 유리 약물로 전환하는 것에 유용한 페니실린 아미다아제, 예컨대 페니실린 V 아미다아제 또는 페니실린 G 아미다아제를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 대안적으로, "애브자임"으로 당해 기술분야에 알려진 효소 활성을 지닌 항체는 본 발명의 전구약물을 유리 활성 약물로 전환하기 위하여 사용될 수 있다(예컨대, Massey, Nature 328: 457-458 (1987)). 항체-애브자임 접합체는 애브자임을 종양 세포 집락에 전달하기 위하여 본원에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 효소는 당해 기술 분야에 공지된 기법 예컨대 전술한 이종이중기능성 가교결합제를 사용하여 항-종양 세포 항원 항체에 공유 결합될 수 있다. 대안적으로, 최소한 본 발명의 효소의 기능적 활성 부분에 링크된 최소한 본 발명의 항체의 항원 결합 영역을 포함하는 융합 단백질은 당해 기술 분야에 공지된 재조합 DNA 기법을 사용하여 구축되었다(예컨대, Neuberger et al, Nature, 312: 604-608 (1984).
(xii) 기타 항체 변형
본원에서 항체의 다른 변형이 고려된다. 예를 들면, 항체는 다양한 비단백질성 폴리머, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜와 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체 중의 하나에 링크될 수 있다. 항체는 또한, 예를 들면, 콜로이드 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐), 또는 마크로에멀젼 내에서 코아세르베이트화 기법 또는 계면 중합(예를 들면, 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐, 각각)에 의하여 제조된 마이크로캡슐 내로 포획될 수 있다. 이러한 기법은 문헌 Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980)에 개시되어 있다.
본원에서 개시한 항-종양 세포 항원 항체는 면역리포좀으로서 제형화될 수 있다. 항체를 함유한 리포좀은 당해 기술 분야에 공비된 방법으로 제조될 수 있으며, 예컨대 문헌 Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al.; Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); U.S. Pat. Nos. 4,485,045 및 4,544,545; 및 WO97/38731(Oct. 23, 1997)에 기재되어 있다. 순환 시간이 증진된 리포좀은 U.S. Pat. No. 5,013,556에 개시되어 있다.
특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)를 포함하는 지질 조성물로 역상 증발법에 의하여 생성될 수 있다. 리포좀은 정의된 공극 크기의 필터를 통하여 압츨되어 소망하는 직경을 지닌 리포좀을 산출한다. 본 발명 항체의 Fab' 절편은 이황화 교환 반응을 통하여 리포좀에 접합될 수 있으며, 이는 문헌 Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)에 나타나 있다. 화학치료제는 선택적으로 리포좀 내에 포함될 수 있다. 문헌 Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81(19)1484 (1989)를 참조.
진단용 또는 치료용 융합 단백질은 본 발명의 항체를 포함하도록 구축될 수 있다. 이러한 융합 단백질은 본 발명의 항체로부터 유도된 최소한 두개의 항-종양 세포 항원 결합 도메인을 포함할 수 있으며, 또는 대체적 대상 에피토프에 결합하는 결합 도메인에 융합하는 하나의 항-종양 세포 항원 결합 도메인을 함유할 수 있다. 이 대체 에피토프는 암종-유관 에피토프일 수 있다. 이러한 융합은 면역접합체일 수 있으며, 및 전장 항체 또는 그것의 절편으로 구성될 수 있다.
(IV) 소망하는 특성을 지닌 항체의 선별
항체 생성 기법은 전술한 바 있다. 소망하는 특정 생물학적 특성을 지닌 항체를 추가적으로 선택할 수 있다.
세포 사멸을 촉진하는 항체를 확인하기 위하여, 시험관 내 분석은 종양 세포 항원을 발현하는 암 세포 및 본 발명의 항체를 사용하여 수행할 수 있다. 당해 기술 분야에 공지된 분석법은 세포역가 96 수성 비-방사능활성 세포 증식 분석 (Promega cat# G5421). 이 분석에서, 신규의 테트라졸륨 화합물 [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨, 내부염; MTS(a)]의 용액 및 전자 커플링제(페나진 메토설페이트) PMS이 사용되었다. MTS는 조직 배양 배지 내에서 가용성인 포마잔 산물 내로 세포에 의하여 생체환원되었다. 포마잔 산물의 490nm에서의 흡광은 추가의 프로세스없이 96-웰 분석 플레이트에서 직접 측정될 수 있다. 수성 가용성 포마잔 산물 내로 MTS의 전환은 대사적 활성 세포 내에서 발견되는 디하이드로지나아제 효소에 의하여 달성된다. 490nm 흡광량에 의하여 측정된 포마잔 산물의 양은 배양액 내의 생존 세포의 수와 정비례한다. 또다른 양호한 분석법은 CytoTox 96 분석(Promega cat# G1780)로서 테트라졸륨 염(INT)이 레드 포마잔 산물로 전환되는 커플링된 효소 분석과 함께 배양액 상청 내의 방출된 락테이트 디하이드로지나아제(LDH)의 양을 측정한다. 유색형의 양은 용해된 세포의 수와 비례한다. 가시 파장 흡광 데이터는 표준 96-웰 플레이트 리더를 사용하여 수집되었다.
세포독성 방식이 아닌 세포증식억제 방식에 활성인 항체의 확인은 미-처리된 대조구 배양액과 비교하여 처리된 표적 세포 배양액의 생육성을 측정하여 달성할 수 있다. 생육성은 공지의 방법, 예컨대 Ceimter-Blue® 세포 생육성 분석 또는 CellTiter-Glo®-Luminescent 세포 생육성 분석(Promega, catalog numbers G8080 및 G5750 respectively)을 사용하여 검출할 수 있다. 치료가 전술한 수단에 의하여 측정한 세포 사멸의 어떠한 증거도 없이 대조구 배양액과 비교하여 세포수의 감소를 유발하는 경우 항체는 잠재적인 세포증식억제로 간주될 것이다.
ADCC를 증진하는 항체를 확인하기 위하여, 시험관 내 선별 분석은 공지된 분석법의 하나를 따라 수행할 수 있다. 하나의 바랍직한 분석은 시험관 내 ADCC 분석이다: 크롬 51-라벨화 표적 세포를 제조하기 위하여, 종양 세포주를 조직 배양 플레이트 내에서 성장시키고, 무균 10 mM EDTA의 PBS 용액을 사용하여 수확하였다. 검출된 세포를 세포 배양 배지로 2회 세척하였다. 세포 (5 x 1O6)는 37℃에서 200 μCi의 크롬 51로 라벨화되었다(New England Nuclear/DuPont). 1시간 동안 수시 혼합하였다. 표지된 세포를 세포 배양물 배지로 3회 세척하였으며, 그 다음 1 x 105 세포/mL의 농도로 재현탁시켰다. 세포는 옵소닌화 없이, 또는 100 ng/mL 및 1.25 ng/mL의 PBMC 분석 또는 20 ng/mL 및 1 ng/mL의 NK 분석에서의 시험 항체를 배양함으로써 분석 전 옵소닌화하여 사용되었다. 말초 혈액 단핵 세포는 정상 건강한 공여자의 헤파린상의 혈액을 수집함으로써 제조되었으며 포스페이트 완충 식염수(PBS)의 동부피로 희석하였다. 그 다음 혈액은 LYMPHOCYTE SEPARATION MEDIUM® (LSM: Organon Teknika)으로 계층화하고 제조자 지시서에 따라 원심분리하였다. 단핵 세포를 LSM-혈장 경계면에서 수집하였고, PBS로 3회 세척하였다. 효과기 세포를 세포 배양물 배지에서 현탁하여 최종 농도가 1 x 107 세포/mL가 되었다. LSM을 통한 정제 후, 자연사(NK) 세포는 제조자의 설명서에 따라 NK 세포 분리 키트 및 자기 컬럼 (Miltenyi Biotech)을 사용하여 음성 선택을 하여 PBMC로부터 분리되었다. 분리된 NK 세포를 세포 배양물 배지 내에서 수집, 세척 및 재현탁하여 농도가 2 x 106 세포/mL되도록 하였다. NK 세포의 확인은 흐름 세포 분석으로 확인하였다. 다양한 효과기:표적 비율은 세포 배양물 배지 내에서 마이크로티터 플레이트(100μL 최종 부피)의 열을 따라 효과기(혹은 PBMC 또는 NK) 세포를 2배로 연속 희석하므로써 제조된다. 효과기 세포의 농도는 PBMC에 대하여 1.0 x 107/mL 내지 2.0 x 104/mL의 범위 및 NK에 대하여 2.0 x 105/mL 내지 3.9 x 103/mL의 범위이다. 효과기 세포의 적정 후, 1 x 105세포/mL에서 100μL의 크롬 51-라벨화 표적 세포(옵소닌화 또는 비옵소닌화)가 각 웰 플레이트에 첨가되었다. 이로서 초기 효과기:표적 비율은 PBMC에 대하여 100:1 및 NK 세포에 대하여 20:1이 된다. 모든 분석은 두벌로 실시하였으며, 및 각 플레이트는 자발적 용해 (효과기 세포 없음) 및 전체 용해 (표적 세포 + 100μL 1% 나트륨 도데실 설페이트, 1 N 나트륨 히드록사이드) 모두를 위한 대조구를 포함한다. 플레이트를 37℃로 배양하였다. 18 시간 후, 세포 배양물 상청을 상청 수거 시스템 (Skatron Instrument, Inc.)을 사용하여 수확한 후, Minaxi auto-gamma 5000 시리즈 감마 계수기(Packard)로 1분간 계수하였다. 결과는 공식: % 세포독성=(시료 cpm-자발적 용해)/(전체 용해-자발적 용해)x 100 을 사용하여 % 세포 독성으로 나타내었다.
고도 처리 포멧 내의 프로모팅 ADCC를 가능하게 하는 항체를 확인하기 위하여, (출원 60/756,301, 본원에 참고자료로 포함) ACEA Biosciences RT-CES® (실시간 세포 전자 센서) 시스템을 사용하여 다음과 같이 실시간 ADCC 분석을 수행할 수 있다: 세포를 E-플레이트 마이크로-티터 플레이트(ACEA Biosciences) 내에 도입한다. 여기서, 세포와 미소전극 표면간의 상호작용은 세포-전극 임피던스 반응의 생성을 유발하고, 이는 형태, 흡착의 질 및 수의 관점에서 세포의 상태를 적시한다. 인간 PBMC는 (건강한 자발적 공여자의) 인간 혈액으로부터 즉시 제조하고, 실험적으로 측정한 최적의 비율로 표적 세포를 첨가하며, 예를 들면 효과기:표적은 25:1이다. 시험 항체를 첨가하고, 세포 플레이트를 ACEA 시스템으로 되돌려 놓아 48 시간 동안 세포 지수를 계속적으로 모니터링하였다. PBMC 및 시험 항체의 추가 후 기록된 세포 지수의 감소는 시험 항체에 의하여 매개된 ADCC에 의한 표적 세포의 사멸을 반영한다. 수행한 대조구에는 효과기 PBMC 세포의 부재하에 또는 무관한 아이소타입 대조구 항체를 사용하는 분석법의 시행을 포함한다.
CDC를 증진하는 항체를 확인하기 위하여, 당해 기술 분야의 숙련자는 공지의 분석법을 수행할 수 있다. 하나의 바람직한 분석법은 시험관 내 CDC 분석이다: 시험관 내, CDC 활성은 시험 항체의 다른 농도의 부재 또는 존재하에 인간 (또는 대체 공급원) 보체-함유 혈청을 보유한 종양 세포 항원 발현 세포를 배양하므로써 측정할 수 있다. 세포독성은 그 다음 ALAMAR BLUE®을 사용하여 살아있는 세포를 정성하므로써 측정한다(Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202 163-171 (1997)). 대조구 분석은 항체 없이, 및 항체와 함께 열 불활성화 혈청 및/또는 문제의 종양 세포 항원을 발현하지 않는 세포를 사용하여 수행하였다. 대안적으로, 적혈구 세포는 종양 항원으로부터 유도된 종양 항원 또는 펩타이드로 피복될 수 있으며, CDC는 적혈구 용해를 관찰함으로써 분석할 수 있다(예를 들면 Karjalainen and Mantyjarvi, Acta Pathol Microbiol Scand [C]. 1981 Oct;89(5):315-9).
성장 억제 항-종양 세포 항원 항체를 확인하기 위하여, 종양 세포 항원을 과다발현하는 암 세포의 성장을 억제하는 항체를 선별할 수 있다. 일 실시 상태에서, 선택된 성장 억제 항체는 세포 배양물 내의 종양 세포 항원 발현 세포의 성장을 0.5 내지 30 μg/mL의 항체 농도에서 약 20-100% 및 바람직하게는 약 50-100%로 억제할 수 있다.
세포 사멸을 유발하는 항체의 선택을 위하여, 예컨대, PI, 트리판 블루 또는 7AAD 흡수에 의하여 나타난 막 통합성의 손실은 대조구와 비교하여 평가되었다. 바람직한 분석법은 종양 항원 발현 세포를 사용한 PI 흡수 분석이다. 이 분석에 따라, 종양 세포 항원 발현 세포는 10% 열-불활성화 FBS(Hyclone)로 보충된 둘베코 변형 이글 배지(D-MEM):햄 F-12 (50:50) 및 2mM L-글루타민 내에서 배양되었다. (따라서, 분석은 보체 및 면역 효과기 세포의 부재하에서 수행되었다). 종양 세포를 100 x 20 mm 디쉬에 3 x 106 /디쉬의 밀도로 도입하고, 밤새(overnight) 부착시켰다. 그 뒤 배지를 제거하고 신선한 배지 단독으로 또는 10μg/mL의 적합한 단클론 항체를 함유한 배지로 대체하였다. 세포를 3 일의 시간 동안 배양하였다. 각각의 처리 후, 단일층을 PBS로 세척하고 트립신처리로 검출하였다. 세포를 1200 rpm으로 5분간 4℃에서 원심분리하였으며, 펠렛은 3 mL의 얼음 냉각된 Ca2+ 결합 완충액(10 mM Hepes, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2)에 재현탁되었으며, 세포 응괴의 제거를 위하여 35 mm 여과-캡 12 x 75 튜브(1 mL/튜브, 3 튜브/처리군)로 분취하였다. 그 다음 튜브에 PI (10μg/mL)를 넣었다. 시료는 FACSCAN™ 흐름 세포분석기 및 FACSCONVERT™, CellQuest 소프트웨어(Becton Dickinson)를 사용하여 분석하였다. PI 흡수에 의하여 측정한 바와 같이 통계적으로 현저한 수분의 세포 사멸을 유도하는 그러한 항체는 세포 사멸-유도 항체로서 선택될 수 있다.
세포자멸사를 유도하는 항체를 선택하기 위하여, BT474 세포를 사용하는 아넥신 결합 분석을 사용할 수 있다. 세포 표면 포스파티딜세린(PS)은 모든 구득가능한 아넥신 V 염색제를 사용하여 검출할 수 있으며, 이는 PS에 대한 아넥신 V의 고친화도를 기초로 한다. BT474 세포를 배양하고, 전 문단에서 언급한 디쉬에 도입한다. 배지를 제거하고 신선한 배지 단독으로 또는 10μg/mL의 단클론 항체를 함유한 배지로 대체하였다. 3일 간의 배양 후, 단일층을 PBS로 세척하고 트립신처리에 의하여 검출하였다. 세포를 원심분리하고, Ca2+ 결합 완충액에 재현탁하였으며, 세포 사멸 분석을 위하여 전술한 튜브에 분취하였다. 튜브에 표지된 아넥신(예컨대 아넥신 V-FTIC)(1 μg/mL)를 넣었다. 시료를 FACSCAN™ 흐름 세포분석기 및 FACSCONVERT™, CellQuest 소프트웨어 (Becton Dickinson)를 사용하여 분석하였다. 대조구에 비하여 통계적으로 상당한 수준의 아넥신 결합을 유도하는 그러한 항체를 세포자멸사-유도 항체로서 선택하였다. 대안적으로, 예를 들면, 아넥신 V 염색제는 Roche Applied Science에서 구득가능하다. FTTC와 아넥신 V의 접합에 의하여, 흐름 세포분석에 의한 단일-세포 기초의 세포자멸성 세포의 확인 및 정량화가 가능하다. FTTC-아넥신 V (녹색 형광) 및 비-바이탈 염료 프로피디움 요오드(적색 형광)로 동시에 세포 염색함으로서 무손상 세포 (FITC-PI-), 초기 세포자멸 (FITC+PI-), 및 후기 세포자멸 또는 괴사성 세포 (FTTC+PI+)의 구별이 가능하게 된다.
아넥신 결합 분석과 함께, BT474 세포를 사용하는 DNA 염색 분석을 사용가능하다. 이 분석을 수행하기 위하여, 이전의 두 문단에서 설명한 대상 항체로 처리된 BT474 세포를 9μg/ml HOECHST 33342™로 2 시간 동안 37℃로 배양하였으며, 그 다음 MODFTT™ 소프트웨어(Verity Softwere House)를 사용하는 EPICS ELITE.TM. 흐름 세포분석기(Coulter Corporation)로 분석하였다. 미처리 세포(100% 까지의 세포자멸 세포)보다 2 배 또는 그 이상(바람직하게는 3 배 또는 그 이상)으로 세포자멸 세포의 백분율의 변화를 유도하는 항체를 이 분석을 사용하여 사후-세포자멸 항체로서 선택하였다.
추가적으로, 생물학적 시료 내의 증가된 세포자멸사는 세포자멸사의 특성을 지닌 DNA 절편화를 검출하는 핵산-기초 방법으로 확인될 수 있다. 아가로스 겔 상에서 전기영동을 사용하여 해결하는 경우, 세포자멸 DNA는 초기에 특징적인 "래더(ladder)" 패턴을 보유하며, 이는 예를 들면, 괴사 또는 다른 비-특이적 DNA 분해에서 관찰되는 핵산의 도말(smear)에 반한다. DNA 절편화를 검출하는 일반적인 조직화학적 기법은 말단-표지된 DNA를 사용한다. 이러한 키트는 구득가능하며, 예컨대 APOLERT DNA 절편화 키트(Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, California)이다. 이 분석은 말단 데옥시뉴클레오티딜전이효소(Tdt)-매개 dUTP 닉(nick)-말단 라벨화(TUNEL)에 기초하며, 여기서 Tdt는 세포자멸사하는 세포 내에서 절편화 DNA의 유리 3'-히드록실 말단에서의 플루오르세인(플루오레세인)-dUTP 통합을 촉매한다.
캐스페이즈(caspases)의 생물학적마커에 대한 다수의 분석 키트가 구득가능하다. 예를 들면, 균일한 캐스페이즈 분석(Roche Applied Sciences, Indianapolis, Indiana)은 마이크로플레이트 내에서의 시험관 내 캐스페이즈 활성의 정량적 결정을 위한 형광측정 분석이다. 이 분석은 고도-처리 선별에 특히 유용하며, 예를 들면, 100개의 시험을 96-웰 플레이트, 및 400개의 시험을 384-웰 플레이트에서 하게된다(Cat.No. 3 005 372). 이 분석은 예를 들면, 혈청 또는 혈장을 포함하는 생물학적 시료 내에서, 캐스페이즈-2, 캐스페이즈-3, 캐스페이즈-7, 및 더 적은 범위로는, 캐스페이즈-6, 캐스페이즈-8, 캐스페이즈-9, 및 캐스페이즈-10를 포함하는 수종의 캐스페이즈의 검출을 가능하게 한다. 세포 사멸 검출 ELISAPLUS 분석(Cat. No. 1 774 425; Roche Applied Sciences, Indianapolis, Indiana)은 DNA 및 히스톤, 각각에 대한 마우스 단클론 항체를 사용한 정량적 샌드위치-효소-면역분석 원리에 기초한다. 이 분석은 세포자멸사에 의하여 사멸한 세포의 세포질 내로 방출되는 모노- 및 올리고뉴클레오좀의 특이적 검출 및 정량화를 가능하게 한다. 세포 용해질, 혈청, 배양 상청액, 등을 포함하는 다양한 시료에 사용될 수 있다.
본 발명의 항체는 PET 영상화제로서 18F-아넥신을 사용하는 세포자멸 활성을 위하여 생체 내 선별이 될 수있다. 이 절차에 있어서, 아넥신 V는 18F로 방사성라벨화되며, 조사하에 항체를 함유한 다음의 투약량을 시험 동물에 투여한다. 세포막의 내측면에서 외부 세포 표면까지의 포스파티딜세린 외번(eversion)에 있어서의 세포자멸 과정에서 발생하는 초기 사건 중의 하나는, 이들이 아넥신에 접근이 가능하다는 것이다. 그 다음 동물을 PET 영상화한다(Yagle et al, J Nucl Med. 2005 Apr;46(4):658-66). 동물을 희생시키고 개별 기관 또는 종양을 제거하여 표준 프로토콜을 따라 세포자멸 마커를 분석하였다.
대상 항체에 의하여 결합되는 종양 세포 항원상의 에피토프에 결합하는 항체의 선별을 위하여, 통상의 교차-차단 분석 예컨대 문헌 Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)에서 설명한 방법에 의하여 수행될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 에피토프 맵핑은 당해 기술분야에 공지된 방법으로 수행될 수 있다.
본 발명의 항체는 문제의 종양-세포 항원과의 결합상의 급속한 내제화 능력이나, 또는 결합 후 세포 표면 상의 잔존 능력으로 선별될 수 있다. 일 실시 상태에서, 예를 들면 면역접합체의 일부유형의 구축에 있어서, 항체의 내재화 능력은, 내재화가 독소 모이어티의 방출에 필수적인 경우, 바람직하게된다. 대안적으로, 항체가 ADCC 또는 CDC를 증진시키기 위하여 사용되는 경우, 항체가 세포 표면상에 잔존하는 것이 바람직하다. 선별 방법은 이러한 유형의 행위를 차별화하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 종양 세포 항원 함유 세포가 사용되었으며, 여기서 세포는 인간 IgG1(대조구 항체) 또는 본 발명의 항체 중의 하나와 함께 대략 1μg/mL의 농도로 얼음(0.1% 나트륨 아지드, 내재화의 차단용)에서, 또는 37℃(나트륨 아지드 없이)에서 3 시간 동안 배양하였다. 세포를 냉각 염색 완충액 (PBS+1% BSA+0.1% 나트륨 아지드)으로 수세하고, 염소 항-인간 IgG-FTTC로 30 분간 얼음상에서 염색하였다. 기하 평균 형광 강도(MFI)를 FACS 캘리버로 기록하였다. 나트륨 아지드의 존재하에 본 발명의 항체와 동결하여 배양된 세포와 나트륨 아지드의 부재하에 37℃에서 관찰된 세포 사이에서는 MFI의 차이가 없는 경우, 항체는 내재화된 것이 아닌 세포 표면에 결합되어 잔존한 것으로 간주될 것이다. 그러나, 표면 염색가능한 항체의 감소가 나타난다면, 세포가 나트륨 아지드의 부재하에 37℃에서 배양되는 경우, 항체는 내재화가 가능한 것으로 간주될 것이다.
V. 벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법
본 발명은 또한 인체 적응형 항-종양 세포 항원 항체를 암호화하는 분리된 핵산, 이 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 및 항체 생산을 위한 재조합 기법을 제공한다.
항체의 재조합 생산을 위하여, 이를 암호화한 핵산이 분리되어 추가의 클로닝(DNA의 증폭) 또는 발현을 위한 복제가능한 벡터로 삽입된다. 단클론 항체를 암호화한 DNA는 간단히 분리되며, 종래의 절차(예컨대, 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하므로서)를 사용하여 서열화된다. 다수의 벡터가 사용될 수 있다. 벡터 성분은 일반적으로 하나 이상의 다음의 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 신호 서열, 복제 원점, 하나 이상의 마커 유전자, 인헨서 성분, 프로모터, 및 전사 종결 서열.
(i) 신호 서열 성분
본 발명의 항-종양 세포 항원 항체는 직접적으로만이 아니라 이종 폴리펩타이드와의 융합 폴리펩타이드로서 재조합적으로 생산될 수 있으며, 이종 폴리펩타이드는 바람직하게는 성숙 단백질 또는 폴리펩타이드의 N-말단의 특이적 분열 부위를 지닌 신호 서열 또는 다른 폴리펩타이드이다. 선택된 이종 신호 서열은 바람직하게는 숙주 세포에 의하여 인식되고 가공된(즉, 신호 펩티다아제에 의하여 분열된) 것이다. 자연 항-종양 세포 항원 항체 신호 서열을 인식하고 가공할 수 없는 원핵 숙주 세포에 있어서, 신호 서열은 예를 들면, 알칼리성 인산분해효소, 페니실라나제, Ipp, 또는 열-안정성 엔테로톡신 II 리더의 군으로부터 선택된 원핵 신호 서열에의하여 치환된다. 효모 분비에 있어서, 자연 신호 서열은, 예컨대, 효모 인버타아제 리더, 알파 인자 리더(사카로마이세스 및 클루베로마이세스 알파-인자 리더를 포함), 또는 산 포스파타아제 리더, 씨. 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀라아제 리더, 또는 WO 90/13646에 설명된 신호에 의하여 치환될 수 있다. 포유류 세포 발현에 있어서, 포유류 신호 서열 및 바이러스 분비 리더, 예를 들면, 헤르페스 심플렉스 gD 신호를 사용할 수있다. 이러한 전구체 영역을 위한 DNA는 리딩 프레임 내에서 항종양 세포 항원 항체를 암호화하는 DNA에 결찰된다.
(ii) 복제 원점 성분
발현 및 클로닝 벡터 모두는 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포 내에서 복제가능하게 하는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터 내에서 이 서열은 숙주 염색체 DNA의 독립적인 복제를 가능하게 하는 것이며, 복제의 원점 또는 자가 복제 서열을 포함한다. 이러한 서열은 다양한 박테리아, 효모, 및 바이러스에 대하여 잘 알려진 것이다. 플라스미드 pBR322의 복제 원점은 대부분의 그람-음성 박테리아에 적합하며, 2뮤 플라스미드 원점은 효모에 적합하고, 및 다양한 바이러스 원점은(SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유류 세포 내의 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 원점 성분은 포유류 발현 벡터에 필요하지 않다(초기 프로모터를 함유하기 때문에 SV40 원점이 일반적으로는 사용된다).
(iii) 선택 유전자 성분
발현 및 클로닝 벡터는 선택 유전자, 또는 다른 이름으로는선택가능한 마커를 함유할 수 있다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예컨대, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하고, (b) 보체 영양요구 결핍이거나, 또는 (c) 복합 배지에서 사용불가능한 결정적인 영양분을 공급하는 단백질을 암호화하며, 예컨대, 바실리(Bacilli)에 대한 D-알라닌 라세미화효소를 암호화하는 유전자이다.
선택 스킴의 일 예는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 사용하는 것이다. 이종 유전자로 상공적으로 전환된 그러한 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생산하며, 따라서 선택 요법에서 생존한다. 이러한 우세 선택의 예는 약물 네오마이신, 미코페놀산 및 하이그로마이신을 사용한다.
포유류 세포에 대한 적합한 선택가능한 마커의 또다른 예는 항-종양 세포 항원 항체 핵산, 예컨대 DHFR, 티미딘 키나아제, 메탈로티오닌-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오닌 유전자, 아데노신 디아미나아제, 오르니틴 디카르복실라아제, 등을 흡인하는 세포 성분을 확인할 수 있는 것이다.
예를 들면, DHFR 선택 유전자로 전환된 세포는 메토트렉세이트(Mtx), DHFR의 경쟁적 길항제를 함유하는 배양 배지 내에서 모든 형질전환주를 배양함으로써 1차적으로 확인할 수 있다. 야생형 DHFR이 사용되는 경우 적합한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결핍된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주이다.
대안적으로, 항-종양 세포 항원 항체, 야생형 DHFR 단백질, 및 또다른 선택가능한 마커 예컨대 아미노글리코사이드 3'-포스포전이효소(APH)를 암호화하는 DNA 서열로 전환되거나 또는 공동전환되는 숙주 세포 (특히 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는 선택가능한 마커 예컨대 아미노글리코사이드 항생제, 예컨대, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418에 대한 선택 약제를 함유한 배지 내에서 세포 성장시키므로써 선택될 수 있다. U.S. Pat. No. 4,965,199를 참조한다.
효모에 사용하기에 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다(Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)). trp1 유전자는 트립토판 내에서의 성장능력이 결핍된 효모의 돌연변이 균주에 대한 선택 마커를 제공하며, 예를 들면, ATCC No. 44076 또는 PEP4-1이다(Jones, Genetics, 85:12 (1977)). 효모 숙주 세포 게놈 내의 trp1 부위의 존재는 트립토판 부재하의 성장에 의한 형질전환을 검출하기위한 효과적인 환경을 제공하게 된다. 이와 유사하게, Leu2-결핍 효모 균주(ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 함유한 공지의 플라스미드와 상보적이다.
이와 함께, 1.6μm의 원형 플라스미드 pKD1에서 유도된 벡터는 클루베로마이세스 효모의 형질전환에 사용될 수 있다. 대안적으로, 재조합 송아지 키모신(chymosin)의 대규모 생산용 발현 시스템은 문헌 K. tactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)에서 보고되었다. 클루베로마이세스의 산업용 균주에 의하여 성숙 재조합 인간 혈청 알부민의 분비를 위한 안정적인 다중-카피 발현 벡터가 개시된 바 있다(Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)).
(iv) 프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터 일반적으로 숙주 유기체에 의하여 인식되고, 항-종양 세포 항원 항체 핵산에 작동가능하게 링크된 프로모터를 함유한다. 원핵 숙주와 함께 사용하기 적합한 프로모터는 phoA 프로모터, 베타-락타마아제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리성 인산분해효소, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 및 혼성 프로모터 예컨대 tac 프로모터를 포함한다. 그러나, 다른 공지의 박테리아 프로모터도 적합하다.박테리아 시스템 내에 사용되는 프로모터는 항-종양 세포 항원 항체를 암호화하는 DNA에 작동가능하게 링크된 샤인-달가노(S.D.) 서열을 함유하게될 것이다.
프로모터 서열은 진핵세포용으로 알려져있다. 사실상 모든 진핵 생물 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 상위방향으로 대략 25 내지 30 염기에 위치한 AT-풍부 영역을 보유한다. 다수의 유전자의 전사 시점으로부터 상위방향으로 70 내지 80 염기에서 발견되는 또다른 서열은 CNCAAT 영역이며, 여기서 N은 어떠한 뉴클레오타이드가 될 수도 있다. 대부분 진핵 생물 유전자의 3' 말단은 암호화 서열의 3' 말단에 폴리 A 테일을 첨가하는 신호가될 수 있는 AATAAA 서열이다. 모든 이러한 서열은 진핵 생물 발현 벡터 내로 적절하게 삽입된다.
효모 숙주에 사용하는 적합한 프로모팅 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나아제 또는 다른 해당 효소, 예컨대 엔올라아제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로지나아제, 헥소키나아제, 피루베이트 디카르복실라아제, 포스포프룩토키나아제, 글루코스-6-포스페이트 아이소머라아제, 3-포스포글리세레이트 뮤타아제, 피루베이트 키나아제, 트리오세포스페이트 아이소머라아제, 포스포글루코스 아이소머라아제, 및 글루코키나아제의 프로모터가 포함된다.
다른 효모 프로모터는, 성장 조건에 의하여 조절받는 추가적인 전사의 이점을 지닌 유발성 프로모터이며, 이는 알콜 디하이드로지나아제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타아제, 질소 대사와 관련된 분해 효소, 메탈로티오닌, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로지나아제, 및 말토오스 및 갈락토오스 활용을 위한 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 사용되는 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 73,657에 설명되어 있다. 효모 인헨서도 효모 프로모터와 사용되는 것이 유리하다.
포유류 숙주 세포 내의 벡터에 의한 항-종양 세포 항원 항체 전사는 바이러스 예컨대 폴리오마 바이러스, 포울폭스 바이러스, 아데노바이러스(예컨대 아데노바이러스 2), 소 파필로마 바이러스, 조류 육종 바이러스, 거대세포바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 가장 바람직하게는 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터 얻거나, 이종 포유류 프로모터, 예컨대, 액틴 프로모터 또는 면역글로블린 프로모터, 열-충격 프로모터로부터 얻은 프로모터에의하여 조절되며, 제공된 이러한 프로모터는 숙주 세포 시스템에 생체적합성이 있다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 원점을 함유하는 SV40 제한 절편에 의하여 간편하게 획득할 수 있다. 인간 거대세포바이러스의 가장 초기 프로모터는 HindIII E 제한 절편으로 간편하게 얻을 수 있다. 벡터로서 소 파필로마 바이러스를 사용하는 포유류 숙주 내의 DNA 발현 시스템은 U.S. Pat. No. 4,419,446에 개시되어 있다. 이 시스템의 변형은 U.S. Pat. No. 4,601,978에 설명되어 있다. 헤르페스 심플렉스 바이러스의 티미딘 키나아제 프로모터의 조절하에 마우스 세포 내의 인간 베타-인터페론 cDNA의 발현에 관한 문헌 Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982)를 참조한다. 대안적으로, 라우스 육종 바이러스 긴 말단 반복체를 프로모터로 사용할 수 있다.
(v) 인헨서 성분 성분
고등 진핵세포에 의한 본 발명의 항-종양 세포 항원 항체를 암호화하는 DNA의 전사는 인헨서 서열을 벡터에 첨가하므로써 증가된다. 현재 다수의 인헨서 서열이 포유류 유전자로부터 알려져 있다(글로빈, 엘라스타제, 알부민, 알파-페토단백질, 및 인슐린). 일반적으로는, 그러나, 진핵 세포 바이러스의 인헨서를 사용하게 된다. 예에는 복제 원점의 후기 측면에서 SV40 인헨서(bp 100-270), 거대세포바이러스 초기 프로모터 인헨서, 복제 원점의 후기 측면에서 폴리오마 인헨서, 및 아데노바이러스 인헨서가 포함된다. 진핵 생물 프로모터의 활성화를 위한 성분의 증진에 관한 문헌 Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)를 참조한다. 인헨서는 항-종양 세포 항원 항체-암호화 서열에 대한 5' 또는 3'의 위치, 바람직하게는 프로모터의 5' 부위에서 벡터로 스플라이싱될 수 있다.
(vi) 전사 종결 성분
진핵 생물 숙주 세포(효모, 곰팡이, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 다른 다세포 유기체의 유핵 세포)에 사용되는 발현 벡터는 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 포함하게 된다. 이러한 서열은 일반적으로 5' 및 때때로 3', 진핵 생물 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 미번역 영역에서 사용이 가능하다. 이러한 영역은 항-종양 세포 항원 항체를 암호화하는 mRNA의 미번역 부분 내의 폴리아데닐화 절편으로서 전사되는 뉴클레오타이드 부분을 함유한다. 하나의 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. WO94/11026를 참조하며 발현 벡터는 그 안에 설명되어 있다.
(vii) 숙주 세포의 선택 및 형질전환
숙주 세포는 항체 생산을 위하여 설명한 발현 또는 클로닝 벡터로 전달감염되거나 또는 전환되며, 프로모터를 유도하고, 형질전환주를 선택하거나, 또는 소망하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭하기에 적합하도록 변형된 종래의 영양 배지에서 배양된다. 배양 조건, 예컨대 배지, 온도, pH 등은 부적절한 실험없이도 당해 기술 분야의 숙련자가 선택할 수 있다. 일반적으로, 세포 배양물의 생산성을 최대화하기위한 원리, 프로토콜, 및 실무적 기법은 문헌 Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) 및 Sambrook et al., supra 내에서 찾을 수 있다.
진핵 생물 세포 전달감염 및 원핵 세포 형질전환 방법은 일반적으로 기술 분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 예를 들면, CaCl2, CaPO4, 리포좀-매개 및 전기천공이다. 사용된 숙주 세포에 따라, 형질전환은 이러한 세포에 적합한 표준 기법을 사용하여 수행된다. 염화 칼슘을 사용하는 칼슘 처리(Sambrook et al., supra), 또는 전기천공은 일반적으로 원핵생물에 사용된다. 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)에 의한 감염은 특정 식물 세포의 형질전환에 사용된다(Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) 및 WO 89/05859, 29 Jun. 1989). 이러한 세포벽이 부재한 포유류 세포에 대하여, 칼슘 포스페이트 침전법(Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978))의 방법이 사용될 수 있다. 포유류 세포 숙주 시스템 전달감염의 일반적인 특징은 U.S. Pat. No. 4,399,216에 설명되어 있다. 효모로의 형질전환은 일반적으로는 Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) 및 Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979)의 방법에 따라 수행된다. 그러나, 예컨대 핵 마이크로주입, 전기천공, 무손상 세포에 의한 박테리아 원형질체 융합, 또는 다중화, 예컨대, 폴리브렌, 폴리오르니틴 등에의한 DNA를 세포에 도입하는 다른 방법이 사용될 수 있다. 포유류 세포를 형질전환하는 다양한 기법에 대해서는, 문헌 Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) 및 Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988)를 참조한다.
본원의 벡터에서 DNA 클로닝 또는 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 원핵 생물, 효모, 또는 전술한 고등 진핵세포 세포이다. 이러한 목적에 적합한 원핵 생물은 유박테리아, 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들면, 엔테로박테리아세아 예컨대 에셔리시아, 예컨대, 이. 콜리(E. coli), 엔테로박터, 에위니아, 클레브시엘라, 프로테우스, 살모넬라, 예컨대, 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 세라티아, 예컨대, 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans), 및 쉬겔라, 및 바실리 예컨대 비. 서브틸리스(B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스(B. licheniformis)(예컨대, B. lichenfformis 41P, DD 266,710, 12 Apr. 1989), 슈도모나스 예컨대 피. 아에루기노사(P. aeruginosa), 및 스트렙토마이세스를 포함한다.
양호한 이. 콜리 클로닝 숙주는 이. 콜리 294 (ATCC 31,446)이며, 다른 균주 예컨대 이. 콜리B, 이. 콜리X1776 (ATCC 31,537), 및 이. 콜리W3110 (ATCC 27,325)가 적합하다. 이러한 예는 제한을 위한 것이 아닌 설명을 위한 것이다.
원핵 생물과 함께, 진핵 생물 마이크로브 예컨대 필라멘트형 곰팡이 또는 효모는 항체-암호화 벡터를 위한 클로닝 또는 발현 숙주에 적합하다. 사카로마이세스 세레비시아에(Sacchanomyces cerevisiae)는 일반적으로 하등 진핵 생물 숙주 마이크로유기체에 사용된다. 다른 것들은 스키조사카로마이세스 폼베(SchizoSacchanomyces pombe) (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; EP 139,383, 2 May 1985); 클루이베로마이세스 숙주 (U.S. Pat. No. 4,943,529; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) 예컨대, 예컨대, 케이. 락티스(K. lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol, 154(2):737-742 [1983]), 케이. 프라질리스(K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위커라미(K. wickeramii)(ATCC 24,178), 케이. 왈티(K. waltii)(ATCC 56,500), 케이. 드로소필라럼(K. drosophilarum) (ATCC 36,906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8: 135(1990)), 케이. 더모톨러란스(K. thermotolerans), 및 케이. 마르시아누스(K. marxianus); 여로위아(yarrowia) (EP 402,226); 피치아파스토리스(Pichiapastoris) (EP 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1988]); 칸디다(Candida); 트리코데르마 레에시아(Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라싸(Neurospora crassa) (Case et al., Proc. Natl. Acad. SCi. USA, 76:5259-5263 [1979]); 슈완니오마이세스(Schwanniomyces) 예컨대 슈완니오마이세스 오씨덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis) (P 394,538, 31 Oct. 1990); 및 필라멘트형 곰팡이 예컨대, 뉴로스포라, 페니실룸, 톨리포클라디움 (WO 91/00357, 10 Jan. 1991), 및 아스퍼길루스 숙주 예컨대 에이. 니둘란스(A. nidulans) (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA, 81: 1470-1474 [1984]) 및 에이. 니게르(A. niger) (Kelly and Hynes, EMBOJ., 4:475-479 [1985]). 메틸영양 효모가 본원에 적합하며, 한세뉼라, 칸디다, 클로엑테라, 피치아, 사카로마이세스, 토루롭시스, 및 로도토룰라로 구성된 속으로부터 선택된 메탄올 상에서 성장이 가능한 효모를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이 클래스의 효모의 예시인 특이적 종의 리스트는 문헌 C. Anthony, The Biochemistry of Methyfotrophs, 269 (1982)에서 찾을 수 있다.
글리코실화 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체에서 유도된다. 무척추동물 세포의 예는 곤충 세포 예컨대 드로소필라(Drosophila) S2 및 스포돕테라(Spodoptera) Sf9, 및 식물 세포를 포함한다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 및 COS 세포를 포함한다. 더욱 특이적인 예에는 SV40에 의하여 전환된 원숭이 신장 CVI 주(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장주 (현탁 배양액 내에서의 성장을 위한 293 또는 293 세포 서브클론, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR(CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216(1980)); 마우스 써토리 세포 (IM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251(1980)); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 및 마우스 유선 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51)을 포함한다. 적합한 숙주 세포의 선택은 당해 기술 분야의 숙련자의 범위 내에 존재한다고 간주된다.
면화, 옥수수, 감자, 대두, 페츄니아, 토마토, 및 담배의 식물 세포 배양물을 숙주로서 사용할 수 있다.
그러나, 척추동물 세포 내에서 가장 관심대상이며, 및 배양액(조직 배양) 내의 척추동물 세포의 증식은 통상의 절차를 따른다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예는 SV40에 의하여 전환된 원숭이 신장 CVI주(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장주 (현탁 배양액 내에서의 성장을 위한 293 또는 293 세포 서브클론 , Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 마우스 써토리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980));. 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 그린 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 레트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유선 종양 (MMT060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N-Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암주(Hep G2)이다.
숙주 세포는 항종양 세포 항원 항체 생산용 전술한 발현 또는 클로닝 벡터로 전환되며, 프로모터를 유도하고, 형질전환주를 선택하거나, 또는 소망하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭하기에 적합하도록 변형된 종래의 영양 배지에서 배양된다.
(viii) 숙주 세포의 배양
본 발명의 항-종양 세포 항원 항체의 생산을 위하여 사용하는 숙주 세포는 다양한 배지 내에서 배양될 수 있다. 구득가능한 배지 예컨대 햄 F10(Sigma), 최소 필수 배지((MEM) (Sigma), RPMI-1640(Sigma), 및 둘베코 변형 이글 배지((DMEM), Sigma)가 숙주 세포 배양에 적합하다. 이와 함께, 문헌 Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., anal. Biochem. 102:255 (1980), U.S. Pat. Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 U.S. Pat. No. Re. 30,985에 설명된 모든 배지를 숙주 세포용 배양 배지로 사용할 수 있다. 모든 이러한 배지는 필요한 경우 호르몬 및/또는 다른 성장 인자(예컨대 인슐린, 트렌스페린, 또는 표피 성장 인자), 염(예컨대 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트), 완충액(예컨대 HEPES), 뉴클레오타이드(예컨대 아데노신 및 티미딘), 항생제(예컨대 GENTAMYCIN.TM. 약물), 극소량의 성분(무기 화합물로 정의, 일반적으로 최종 농도에 마이크로 범위로 포함), 및 글루코스 또는 동량의 에너지 공급원으로 보충된다. 모든 다른 필요한 보충물은 당해 기술 분야의 숙련자에 알려진 적합한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH, 등은 발현을 위하여 선택된 숙주 세포와 함게 이전에 사용된 것이며, 및 일반적으로 당해 기술 분야의 숙련자에게 자명한 것이다.
(ix) 유전자 증폭/발현의 검출
유전자 증폭 및/또는 발현은 시료 내에서 직접 측정할 수 있으며, 예를 들면, mRNA의 전사를 정량화 하기 위한 종래의 서던블롯팅, 노던 블로팅[Thomas, Proc. Nad. Acad. Sci. USA. 77:5201-5205 (1980)], 도트 블로팅(DNA 분석), 또는 본원에 제공된 서열에 기초하여, 적합하게 표지된 프로브를 사용하는, 그 자체의 혼성화에 의한다. 대안적으로, 항체는 DNA 이합체, RNA 이합체, 및 DNA-RNA 혼성 이합체 또는 DNA-단백질 이합체를 포함하는 특이적 이합체를 인식할 수 있는 항체를 사용한다. 차례로 항체가 라벨화되며, 분석을 수행할 수 있고, 여기서 이합체는 표면에 결합되어, 표면상 이합체의 형성에 의하여, 이합체에 결합한 항체의 존재가 검출될 수 있다.
유전자 발현은, 대안적으로, 면역학적 방법, 예컨대 세포 또는 조직 절편의 면역조직화학 염색 및 세포 배양물 또는 체액의 분석에 의하여 측정될 수 있으며, 유전자 산물의 발현을 직접 정량화하기 위하여, 면역조직화학적 염색 및/또는 시료 유체의 분석에 유용한 항체는 단클론이거나 또는 다클론이 될 수 있고, 이는 모든 포유류에서 제조될 수 있다. 간단하게, 항체는 천연 서열 종양 세포 항원 폴리펩타이드에 대하여 또는 본원에서 제공된 DNA 서열에 기초한 합성 펩타이드에 대하여 또는 종양 세포 항원 DNA에 융합되거나 특이적 항체 에피토프를 암호화하는 외래 서열에 대하여 제조될 수 있다.
(X) 항-종양 세포 항원 항체의 정제
재조합 기법을 사용하는 경우, 항체는 원형질막 주위 공간 내인 세포 내에서 생산되거나, 또는 배지로 직접 분비된다. 항체가 세포 내에서 생산되는 경우, 첫 단계로서, 입자화된 파편, 숙주 세포 또는 용해된 절편은 예를 들면, 원심분리 또는 초원심분리에 의하여 제거된다. 문헌 Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)는 이. 콜리의 원형질막 주위 공간에 분비되는 항체를 분리하는 절차를 설명한다. 요약하면, 세포 페이스트는 나트륨 아세테이트(pH 3.5), EDTA, 및 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF)의 존재하에 약 30분 이상 해동된다. 세포 파편은 원심분리로 제거될 수 있다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템의 상청액은 일반적으로 우선 구득가능한 단백질 농축 필터, 예를 들면, Amicon 또는 Millipore Peilicon 초원심분리 유닛를 사용하여 농축된다. 프로테아제 억제제 예컨대 PMSF는 단백질분해를 억제하는 모든 전단계에 포함할 수 있으며, 항생제는 외래 오염물의 성장을 예방하기 위하여 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들면, 양호한 정제 기법인 친화도 크로마토그래피와 함께 히드록시레파티테 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있다. 친화도 리간드로서의 단백질 A의 적합성은 항체 내에 존재하는 모든 면역글로블린 Fc 도메인의 종 및 이소타입에 의존한다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2, 또는 γ4 중쇄에 기초한 항체를 정제하기 위하여 사용될 수 있다(Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 이소타입 및 인간 γ3에 추천된다(Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). 친화도 리간드가 부착하는 매트릭스는 가장 일반적으로 아가로스이나, 다른 매트릭스도 사용가능하다. 기계적으로 인정성인 매트릭스 예컨대 다공성 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스보다 빠른 유속 및 짧은 처리시간을 가능하게한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABX™ 수지(J. T. Baker, Phillipsburg, NJ.)가 정제에 유용하다. 단백질 정제를 위항 다른 기법, 예컨대 이온-교환 컬럼상의 분획, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카상의 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSE™ 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지(예컨대 폴리아스파르트 산 컬럼) 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 암모늄 설페이트 침전이 수거되는 항체에 따라 사용가능하다.
모든 예비 정제 단계(들) 후에, 대상 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물에 pH 약 2.5-4.5에서, 바람직하게는 저염 농도(예컨대,약 0-0.25M 염)에서 용출 완충액을 사용하여 저 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피를 가하였다.
VI. 약학적 제형
본 발명에 따라 사용된 작용제/길항제 또는 항체 분자의 치료적 제형은 동결건조 제형 또는 수성 용액의 형태 내에서 소망하는 순도를 지닌 분자와 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제를 혼합하여 저장을 위하여 제조된다(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용된 투약량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며, 여기에는 완충액 예컨대 포스페이트, 구연산, 및 다른 유기 산; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제(예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤스 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10 잔기 이하) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로블린; 친수성 폴리머 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이트제 예컨대 EDTA; 당 예컨대 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 짝-이온 예컨대 나트륨; 금속 복합체(예컨대 Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예컨대 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 양호한 동결건조 항-종양 세포 항원 항체 제형은 WO 97/04801에 설명되어 있으며, 본원에 참고자료로서 포함되어 있다.
본원의 제형은 처리된 특정 표지에 필요한 하나 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 역효과를 내지 않는 상보적 활성을 지닌 것을 포함할 수도 있다. 예를 들면, 이들은 일 제형 내에서 대체 족 구성원 단백질, 또는 선택된 종양 세포 항원 상의 다른 에피토프에 결합하는 항체를 추가로 제공하기에 바람직하다. 적합한 제2 항체는 CEA, EGP-1, EGP-2(예컨대, 17-IA), MUC-1, MUC-2, MUC-3, MUC-4, PAM-4, KC4, TAG-72, EGFR, HER2/neu, BrE3, Le-Y, A3, Ep-CAM, Tn, 및 톰슨-프라이덴레이크 항원, 종양 괴사 항원, 페리틴, 산성 이소페리틴, 테나신, 발암유전자, 발암유전자 산물, IL-6, IGF-1, IGFR-1, 종양 혈관형성 항원, 예컨대 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 태반 성장 인자(PIGF), ED-B 피브로넥틴, 및 다른 혈관 성장 인자, Ga 733, 또는 이들의 조합에 대한 항체를 포함할 수 있다. 대안적으로, 제2 항체는 동일한 종양 세포 항원에 결합하나, 대체 에피토프를 사용하는 것일 수 있다. 본 발명의 다른 실시상태에서, 제2 항체는 대체 종양 세포 항원에 결합할 수 있으며, 여기서 종양 세포 항원은 KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, 및 SLC1A5의 군으로부터 선택된다. 모든 제2 항체가 면역접합체 또는 순수 항체일 수 있으며, 다가 항체가 될 수 있다. 이러한 항체 조합은 본 발명의 항체의 투여 전, 동시 또는 후에 투여될 수 있다.
대안적으로, 또는 추가적으로, 조성물은 화학치료제, 세포독성 약제, 사이토카인, 성장 억제제, 항-호르몬 약제, 항-혈관형성 약제, 및/또는 심장보호제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도한 목적에 효과적인 양의 조합으로 적절하게 제공된다. 이러한 약제는 본 발명의 항체의 투여 전 동시 또는 후에 투여될 수 있다.
생체 내 투여에 사용되는 제형은 무균성이어야 한다. 이는 동결건조 및 재구성 전 또는 후에 무균 여과막을 통하여 여과함으로써 손쉽게 달성할 수 있다.
본원의 치료적 조성물은 일반적으로 무균 접근 포트를 구비한 용기, 예를 들면, 피하 주사 바늘에 의하여 관통되는 마개를 구비한 정맥 용액 백 또는 바이알에 보관된다.
투여 경로는 공지의 방법, 예컨대 정맥내, 복막내, 뇌내, 근육내, 안내, 동맥내 또는 병변내 경로, 국소 투여에 의한 주사 또는 주입, 또는 지속 방출 시스템에 의한 방법을 따른다.
활성 성분은 콜로이드 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 내에서 예를 들면, 각각, 코아세르베이트화 기법 또는 계면 중합, 예를 들면, 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 의하여 제조된 마이크로캡슐 내로 함입된다. 이러한 기법은 문헌 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에 개시되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투약량 및 소망하는 약물 농도는 계획된 특정 용도에 따라 달라질 수 있다. 적합한 투약량 또는 투여 경로의 결정은 일반 임상의의 능력범위 내에 있다. 동물 실험은 인간 치료에 효과적인 투약량을 결정하기 위한 신뢰할 만한 기준을 제시한다. 효과적인 투약량의 종간 비례는 문헌 Mordenti, J. and Chapped, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds., Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96에 설명된 원리에 따라 수행될 수 있다.
항-종양 세포 항원 항체의 생체 내 투여가 사용되는 경우, 정상 투약량은 투여 경로에 따라 일일 약 10ng/kg의 포유류 체중 내지 100mg/kg의 포유류 체중 또는 그 이상, 바람직하게는 약 1μg/kg/day 내지 10mg/kg/day로 달라질 수 있다. 특정 복용 및 전달 방법의 기준은 다음의 문헌에서 제공한다; 예를 들면, U.S. Pat. No. 4,657,760; 5,206,344; 또는 5,225,212. 다른 제형은 투여가 일 기관 또는 조직을 표적화된 다른 치료 화합물 및 다른 질환에 효과적일 수 있다고 기대되며, 예를 들면, 또다른 기관 또는 조직과는 다른 방식으로 전달을 필요로 할 수 있다.
항체의 투여를 필요로하는 모든 질병 또는 질환의 치료에 적합한 특성을 방출하는 제형내에서 항-종양 세포 항원 항체의 지속-방출 투여가 필요한 경우, 항체의 마이크로캡슐화가 고려된다. 지속 방출을 위한 재조합 단백질의 마이크로캡슐화는 인간 성장 호르몬(rhGH), 인터페론-(rhIFN-), 인터류킨-2, 및 MN rgpl2O에 의하여 성공적으로 수행되었다(Johnson et al., Nat Med., 2:795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27:1221-1223 (1993); Horaet al., Bio/Technology. 8:755-758 (1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems," in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds, (Plenum Press: New York, 1995), pp. 439462; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; 및 U.S. Pat. No. 5,654,010).
이러한 단백질의 지속-방출 제형은 이들의 생체적합성 및 광범위한 생분해성 특성에 기인하여 폴리-락틱-코글리콜 산(PLGA) 폴리머를 사용하여 개발되었다. PLGA의 분해 산물, 락트산과 글리콜산은 인체 내에서 신속하게 제거될 수 있다. 더욱이, 이 고분자의 분해성은 이들의 분자량 및 조성물에 따라 수개월 내지 수년으로 조정될 수 있다(Lewis, "controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer," in: M. Chasin and R. Langer (Eds.), Biogradable Polymer as Drug Delivery System (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1-41).
VII. 항-종양 세포 항원 항체에 의한 치료
본 발명에 따라, 항-종양 세포 항원 작용제/길항제 또는 항체 분자가 다양한 질병 또는 질환을 치료하기 위하여 사용될 수 있다는 것을 고려하였다. 예시적인 상태 또는 질환은 양성 또는 악성 종양; 백혈병 및 림프 악성종양; 다른 질환 예컨대 신경, 아교, 성상교, 시상하부, 림프절, 대식세포, 상피, 기질, 포배강, 염증성, 혈관형성 및 면역학적 질환을 포함한다.
일반적으로, 치료되는 질병 또는 질환은 암이다. 본원에서 치료되는 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병 또는 림프 악성종양을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이러한 암의 특정 예는 편평 세포 암(예컨대 상피 편평 세포 암), 폐암 예컨대 소세포 폐 암, 비-소세포 폐 암, 폐의 선암종 및 폐의 편평 암종, 복막암, 간세포암, 위샘 또는 위암 예컨대 위장관암, 췌장암, 아교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간암, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁암종, 타액선암종, 신장 또는 신장암, 전립선암, 외음부암, 흉선암, 간암종, 항문암종, 음경암종, 및 두부 및 경부암을 포함한다.
암은 일반적으로 종양 항원-발현 세포를 포함하며, 본원의 항-종양 항원 항체가 암에 결합할 수 있게된다. 시험 및 생물학적 대조구 시료 내에서 본 발명의 생물학적마커, 및 선택적으로 사이토카인 마커의 발현을 검출하는 방법은 핵산 또는 단백질 수준에서 이러한 마커의 존재 또는 양을 결정하는 모든 방법을 포함한다. 이러한 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 웨스턴 블롯, 노던 블롯, ELJSA, 면역침전, 면역형광, 흐름 세포분석/면역조직화학, 핵산 혼성화 기법, 핵산 역전사법, 및 핵산 증폭법을 포함하나 이에 한정되지 않고, 일 예로써, 생물학적마커의 발현은, 예를 들면, 특이적 생물학적마커 단백질을 지향하는 항체를 사용하여 단백질 수준으로 검출된다. 이러한 항체는 다양한 방법,예컨대 웨스턴 블롯, ELISA, 멀티플렉싱 기술, 면역침전, 또는 면역조직화학 기법에 사용될 수 있다. 일 실시 상태에서, 사이토카인 마커의 검출은 전기화학적 발광(ECL)에 의하여 달성된다. 생물학적마커 및 선택적으로 사이토카인 마커의 모든 검출 방법은 임상 정보의 평가, 종래의 예후법, 다른 종양 세포 항원-유관 인자의 발현, 특히 세포-표면 종양 세포 항원의 발현 및 잠재적인 가용성 종양 세포 항원의 순환 수준, 및 암 환자에 대하여 본원에서 적시한 것을 포함하나 이에 한정되지 않는 당해 기술 분야에 공지된 임상적으로 유용한 및 특성 예후 마커의 존재 또는 발현과 결부될 수 있다. 이러한 방법에서, 개시된 방법에 의하여 암 또는 전-악성 상태가 본원의 항-종양 세포 항원 치료제에 의한 치료적 개입에 의하여 호전되는 후보 대상체를 더 정확하게 결정할 수 있다.
따라서, 일 실시 상태에서, 종양 세포 항원-발현 신생물 세포와 관련된 고증식성, 암성 또는 전-악성 질환 또는 상태를 보유한 후보 대상체를 본원의 생체 외 예후 분석을 사용하여 대상 항-종양 세포 항원 치료제에 대한 응답성에 대하여 시험하였으며, 여기서 하나 이상의 종양 세포 항원-매개 활성에 대한 치료제 효과를 평가하였다. 생체 외 예후 분석의 추가의 정제가 바람직한 경우, 후보 대상체는 본원에서 전에 확인된 하나 이상의 종양 세포 항원-유관 인자, 하나 이상의 임상적 유용한 예후 마커의 발현 수준, 또는 발현 부재를 검사할 수 있다. 이러한 방식으로, 종양 세포 항원-발현 신생물 세포를 포함하는 생물학적 시료는 후보 대상체로부터 수집될 수 있으며, 종양 세포 항원-유관 인자(들) 및/또는 대상인 임상적 유용한 예후 마커(들)의 발현 수준 또는 발현 부재에 대하여 평가된다. 본원에서 전에 적시한 종양 세포 항원-발현 신생물 세포를 포함하는 모든 생물학적 시료는 이러한 예후 분석을 위하여 수집되었다. 추가적으로, 당해 기술 분야의 숙련자에 공지된 모든 검출 방법은 본원의 종양 세포 항원-유관 인자(들) 및/또는 대상인 임상적 유용한 예후 마커(들)의 발현 수준 또는 발현 부재를 검출하기 위하여 사용된다.
하나 이상의 종양 세포 항원-유관 인자의 발현 수준이 항-종양 세포 항원 치료제의 치료에 응답하는 암 또는 전-악성 상태를 보유한 대상체를 확인하기 위하여 평가되는 경우, 생물학적 시료를 대상체로부터 수집하고, 시료 내의 발현 수준을 대조구 또는 참조 표준 내의 인자(또는 인자들)의 발현 수준과 비교한다. 세포-표면 종양 세포 항원의 발현 수준에 대하여, 종양 세포 항원-발현 신생물 세포를 포함하는 모든 생물학적 시료를 전술한 바와 같이 사용할 수 있다. 가용성 종양 세포 항원의 순환 수준에 대하여, 혈액 성분 예컨대 혈장 또는 혈청을 포함하는 혈액 시료 또는 시료는 후보 대상체로부터 획득할 수 있다. "대조구" 또는 "참조 표준"은 질병을 보유하지 않은 건강한 대상체로부터 암 또는 전-악성 상태를 보유한 대상체를 구별하는 동일한 생물학적 공급원(즉, 조직 또는 체액)의 표준을 의미한다. 당해 기술 분야의 숙련자는 연령, 성별, 인종, 등을 조절하고 건강한 대상체 내에서 기대되는 발현의 표준 수준을 결정하기 위하여 발현 수준을 비교하여, 질병을 보유하지 않은 건강한 대상체와 암 또는 전-악성 상태를 보유한 대상체 내에서 이러한 종양 세포 항원-유관 인자 (즉, 세포-표면 종양 세포 항원 또는 가용성 종양 세포 항원)의 발현 수준의 측정을 위한 참조 표준을 제공할 수 있다. 일 실시 상태에서, 암 또는 전-악성 상태를 지닌 후보 대상체 내의 발현 수준은 참조 표준 내에서의 발현 수준 보다 최소한 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300% 이상이다. 항-종양 세포 항원 치료제에 의한 치료 적용성은 하나 이상의 이러한 종양 세포 항원-유관 인자의 발현 수준을 검출함으로써 평가될 수 있으며, 여기서 참조 표준에 비하여 생물학적 시료 내에서의 증가된 발현 수준은 대상체가 종양 세포 항원-매개 활성 예컨대 세포 생존 및 증식, 및/또는 ADCC 활성에 대한 항-종양 세포 항원 치료제의 생체 외 효과를 위하여 추가의 선별을 하지 않고, 대상 항-종양 세포 항원 치료제의 지료에 반응하는 암 또는 전-악성 상태를 확인하기 충분하다.
후보 대상체에서 획득한 생물학적 시료 내의 본원의 대상 종양 세포 항원의 존재는 핵산 수준에서 측정될 수 있다. 발현 평가를 위한 핵산-기초 기법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들면, 생물학적 시료 내의 생물학적마커 mRNA의 수준을 결정하는 것을 포함한다. 다수의 발현 검출 방법은 분리된 RNA를 사용한다. mRNA의 분리에 대하여 선택되지 않는 모든 RNA 분리 기법은 RNA의 정제를 위하여 활용될 수 있다(예컨대, Ausubel et al., ed. (1987-1999) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York). 추가적으로, 다수의 조직 시료를 당해 기술 분야의 숙련자에게 공지된 기법을 사용하여 손쉽게 처리할 수 있으며, 예컨대, 예를 들면, 단일-단계 RNA 분리 절차는 U.S. Patent No. 4,843,155에 설명되어 있다.
따라서, 일 실시 상태에서, 대상 생물학적마커 또는 다른 단백질의 검출은 핵산 프로브를 사용하여 핵산 수준에서 분석되었다. 용어 "핵산 프로브"는 특히 의도한 표적 핵산 분자, 예를 들면, 뉴클레오타이드 전사체에 선택적으로 결합할 수 있는 모든 분자를 의미한다. 프로브는 당해 기술 분야의 숙련자에 의하여 합성되거나, 또는 적합한 생물학적 제조법으로 유도될 수 있다. 프로브는 예를 들면, 방사성활성 라벨, 형광 라벨, 효소, 화학적형광 태그, 비색 태그, 또는 전술하였거나 또는 기술 분야에 공지된 다른 라벨 또는 태그로 라벨화되도록 특이적으로 설계될 수 있다. 프로브로 활용할 수 있는 분자의 예는 RNA 및 DNA를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
예를 들면, 분리된 mRNA는 서던 또는 노던 분석, 폴리머라아제 사슬 반응 분석 및 프로브 분석을 포함하나 이에 한정되지 않는 혼성화 또는 증폭 분석에 사용될 수 있다. mRNA 수준을 검출하기 위한 일 방법은 분리된 mRNA와 검출될 유전자에 의하여 암호화되는 mRNA와 혼성화할 수 있는 핵산 분자(프로브)가 접촉하는 단계를 포함한다. 핵산 프로브는, 예를 들면, 전장 cDNA, 또는 이들의 부분, 예컨대 최소한 7, 15, 30, 50, 100, 250 또는 500 뉴클레오타이드 길이의 올리고뉴클레오타이드로서 엄격 조건하에서 전술한 생물학적마커, CD40-유관 인자, 또는 임상적 유용한 예후 마커를 암호화하는 mRNA 또는 게놈 DNA와 특이적으로 혼성화하기 충분한 길이이다. mRNA와 프로브의 혼성화는 생물학적마커 또는 다른 대상 표적 단백질이 발현된다는 것을 나타낸다.
일 실시 상태에서, mRNA는 고체 표면상에 고정되며, 예를 들면 아가로스 겔상에서 분리된 mRNA를 주행시키고, mRNA를 겔에서 막, 예컨대 니트로셀룰로오스로 이동시키므로써 프로브와 접촉된다. 본 발명의 다른 실시상태에서, 프로브(들)은 고체 표면상에 고정되며, mRNA가 예를 들면, 유전자 칩 분석 내에서 프로브(들)에 접촉한다. 당해 기술 분야의 숙련자는 생물학적마커 또는 다른 대상 단백질을 암호화하는 mRNA의 수준을 검출하는데 사용되는 공지의 mRNA 검출 방법에 쉽게 적용할 수 있다. 시료 내에서 대상 mRNA 수준을 결정하기 위한 대체적 방법은 핵산 증폭, 예컨대, RT-PCR(예를 들면, U.S. Patent No. 4,683,202), 리가아제 사슬 반응(Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193), 자가-지속 서열 복제(Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), 전사 증폭 시스템(Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-베타 복제효소(Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6:1197), 롤링 써클 복제(U.S. Patent No. 5,854,033) 또는 모든 다른 핵산 증폭법에 의한 절차와 당해 기술 분야의 숙련자에 공지된 기법을 사용한 증폭된 분자의 검출에 관한 것이다. 이러한 검출 방법은 이러한 분자가 극소량으로 존재하는 경우 핵산 분자의 검출에 특히 유용하다. 본 발명의 특징으로서, 종양 세포 항원-유관 인자 또는 다른 임상적 유용한 예후 마커의 생물학적마커 발현, 또는 발현은 정량적 형광원 RT-PCR(즉, TaqMan® 시스템)으로 평가되었다.
대상 RNA의 발현 수준은 막 블롯(예컨대, 혼성화 분석 예컨대 노던, 도트, 등에 사용), 또는 마이크로웰, 시료 튜브, 겔, 비드 또는 섬유(또는 결합된 핵산을 포함하는 모든 고체 지지체)등을 사용하여 모니터링할 수 있다. 문헌 U.S. Patent Nos. 5,770,722, 5,874,219, 5,744,305, 5,677,195 및 5,445,934를 참고하며, 이들은 참고자료로서 본원에 포함되어 있다. 발현의 검출은 용액내 핵산 프로브를 사용하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시 상태에서, 마이크로어레이가 하나 이상의 생물학적마커, 종양 세포 항원-유관 인자, 및/또는 임상적 유용한 예후 마커의 발현을 거출하기 위하여 사용된다. 마이크로어레이는 다른 실험간의 재생산성의 의하여 이러한 목적에 특히 적합하다. DNA 마이크로어레이는 다수의 유전자의 발현 수준의 동시 측정을 위한 일 방법을 제공한다. 각 어레이는 고체 지지체에 부착된 캡춰 프로브의 재생 패턴으로 구성된다. 표지된 RNA 또는 DNA는 어레이 상에서 상보적 프로브와 혼성화되며, 그 다음 레이저 스캐닝으로 검출된다. 어레이 상의 각 프로브에 대한 혼성화 강도를 결정하였으며, 상대적 유전자 발현 수준을 나타내는 정량적 값으로 전환된다. 문헌 U.S. Patent Nos. 6,040,138, 5,800,992 및 6,020,135, 6,033,860, 및 6,344,316를 참고하며, 이들은 참고자료로서 본원에 포함되어 있다. 고-밀도 올리고뉴클레오타이드 어레이는 시료 내의 다수의 RNA에 대한 유전자 발현 트성을 결정하기 위하여 특히 유용하다.
기계적인 합성법을 이용하는 이러한 어레이의 합성 기법은, 예컨대, U.S. Patent No. 5,384,261에 설명되어 있으며, 이들은 참고자료로서 일체성을 지니고 본원에 포함되어 있다. 평면 어레이 표면이 바람직하나, 어레이는 사실상 모든 모양의 표면 또는 심지어 다중 표면상에 제조된다. 어레이는 비드, 겔, 폴리머 표면, 섬유 예컨대 광섬유, 유리 또는 모든 다른 적합한 기질 상의 펩타이드 또는 핵산이 될 수 있다. 문헌 U.S. Patent Nos. 5,770,358, 5,789,162, 5,708,153, 6,040,193 및 5,800,992를 참조하며, 이들은 참고자료로서 일체성을 지니고 본원에 포함되어 있다. 어레이는 진단 또는 모든-포괄적인 기구의 다른 조작을 가능하게하는 방식으로 함입될 수 있다. 예를 들면, 문헌 U.S. Patent Nos. 5,856,174 및 5,922,591를 참조하며, 이들은 참고자료로서 본원에 포함되어 있다.
하나의 접근방법으로서, 시료에서 분리된 모든 mRNA는 표지된 cRNA로 전환되며, 그다음 올리고뉴클레오타이드 어레이로 혼성화된다. 각 시료는 별도의 어레이로 혼성화된다. 상대적인 전사 수준은 어레이 상에 및 시료 내에 존재하는 적합한 대조구를 참조하여 계산할 수 있다.
암이 종양 항원의 과다발현에 의하여 특성화된 경우, 본 출원은 종양 항원-과다발현 암으로 간주되지 않는 암을 치료하는 방법을 추가적으로 제공한다. 암의 종양 항원 발현을 측정하기 위하여, 다양한 진단적/예후 분석이 가능하다. 일 실시 상태에서, 종양 항원 과다발현은 IHC로 분석이 가능하다. 종양 생검의 파라핀 삽입 조직 절편에 IHC 분석을 가하고, 다음과 같이종양 항원 단백질 염색 강도 기준과 일치시켰다:
스코어 0
염색이 관찰되지 않음 또는 막 염색이 종양 세포의 10% 이하로 관찰됨.
스코어 1+
흐리고/희미하게 인지할 수 있는 막 염색은 종양 세포의 10% 이상에서 검출된다. 세포는 이들의 막의 일부에만 염색된다.
스코어 2+
약하거나 중간정도의 완전 막 염색이 종양 세포의 10% 이상에서 관찰된다.
스코어 3+
중간 내지 강한 완전 막 염색이 종양 세포의 10% 이상에서 관찰된다.
종양 항원 과다발현 평가에서 0 또는 1+ 스코어를 받은 그러한 종양은 종양 항원을 과다발현하지 않는 것으로 특성화되나, 반면에 2+ 또는 3+ 스코어를 받은 그러한 종양은 종양 항원을 과다발현하는 것으로 특성화될 수 있다.
대안적으로, 또는 추가적으로, FISH 분석 예컨대 INFORM™ (Ventana, Ariz.) 또는 PATHVISION™ (Vysis, Ill.)는 포르말린-고정, 파라핀-삽입 종양 조직 상에서 수행되어 종양 내의 종양 항원 과다발현 정도(존재 한다면)를 결정하게된다.
더욱이, 종양 항원 과다발현 또는 증폭은 예컨대 검출할 분자에 결합하며 및 검출가능한 라벨(예컨대 방사성활성 동위원소)로 태그되는 분자(예컨대 항체)를 투여하고 라벨의 국부화를 위한 환자의 외부 스캐닝을 하는 생체 내 진단적 분석을 사용하여 평가될 수 있다.
본 발명의 선호하는 실시상태에서, 종양 항원은 인접한 건강한 조직 또는 풀을 형성한 정상 조직과 비교하여 항원의 발현 수준을 비교함으로써 표적화를 위하여 선택될 수 있다. 양호한 후보 종양 항원은 주변 정상 조직에 비하여 최소한 3 배(300%) 증가된 발현을 지닌 것을 포함하며, 여기서 3 배 증가는 풀을 형성한, 구득가능한 정상 조직 시료의 대부분의 비교에서 나타난다. 양호한 종양 항원의 선별은 레이저 캡춰 현미경을 사용하여 수행하여 정상 인접 조직으로부터 암성 조직을 구분하는 것이 가능하며, 그 다음 구득가능한 표준 칩 예컨대 표준 Affymetrix 칩 U133 (cat# 900370)를 사용하는 발현 마이크로어레이 분석을 수행한다(예를 들면, Yang et al, (2005) Oncogene, 10-31). 대안적으로, 암 유형에 따라 분류한 환자 조직 시료의 풀에서 유도된 핵산 시료를 함유하는 맞춤 칩을 생산할 수 있으며 발현 특성을 분석하는 것으로 입증되었다(예를 들면 Makino et al, Dis Esophagus. 2005;18(l):37-40.).
치료되는 암이 호르몬 독립성 암인 경우, 종양 내 호르몬(예컨대 안드로겐) 및/또는 이들의 인지 수용체의 발현은 예컨대 전술한 바와 같은, 사용가능한 모든 다양한 분석을 사용하여 평가될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 환자는 호르몬 독립성 암을 보유함으로써 이들이 항-안드로겐 요법에 더이상 반응하지 않는다는 것으로 진단될 수 있다.
특정 실시 상태에서, 세포독성 약제와 접합된 항-종양 항원 항체를 포함하는 면역접합체를 환자에 투여한다. 바람직하게는, 결합되는 면역접합체 및/또는 종양 세포 항원 단백질은(is/are) 세포에 의하여 내재화되어, 결합된 암세포를 사멸시키는 면역접합체의 치료적 효능을 증가시키게 된다. 본 발명의 선호하는 실시상태에서, 세포독성 약제는 암세포 내의 핵산을 표적화하거나 또는 방해한다. 이러한 세포독성 약제의 예는 메이탄시노이드, 칼리키마이신, 리보뉴클레아제 및 DNA 엔도뉴클레아제를 포함한다.
항-종양 세포 항원 항체 또는 면역접합체는 공지의 방법, 예컨대 정맥 투여, 예컨대, 덩어리로 또는 일정 시간 지속 주입, 근육내, 복막내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활액막내, 수막강내, 경구, 국소, 또는 흡입 경로에 따라 인간 환자에 투여할 수 있다. 항체의 정맥 또는 피하 투여가 양호하다.
다른 치료적 요법은 항-종양 세포 항원 항체의 투여와 결부될 수 있다. 이 결합 투여는 별도 제형 또는 단일 약학적 제형, 및 어떠한 순서로든 연속 투여를 사용하는 동시투여를 포함하며, 여기서 바람직하게는 두 개의 (또는 모든) 활성 약제가 이들의 생물학적 활성을 동시에 발휘하는 시간 간격이 있다(Lin et al, (2005) Clinical Cancer Research 11:129-138).
일 실시 상태에서, 본 발명의 치료는 다른 화학치료제의 칵테일의 동시투여를 포함하는 항-종양 세포 항원 항체(또는 항체) 및 하나 이상의 화학치료제 또는 성장 억제제의 결합 투여에 관한 것이다. 바람직한 화학치료제는 탁산(예컨대 파크리탁셀 및 데코탁셀) 및/또는 안트라사이클린 항생제을 포함한다. 이러한 화학치료제의 조제 및 복용 계획은 제조사의 설명서에 따라 또는 실무자에 의하여 경험적으로 결정될 수 있다. 이러한 화학요법의 조제 및 복용 계획은 또한 문헌 Chemotherapy Service Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md. (1992)에 설명되어 있다.
항체가 항-호르몬 화합물; 예컨대, 항-에스트로겐 화합물 예컨대 타목시펜; 항-프로게스테론 예컨대 오나프리스톤(EP 616 812); 또는 항-안드로겐 예컨대 플루타미드에, 이러한 분자에 공지된 투약량으로 결합될 수 있다. 치료되는 암이 호르몬 독립성 암인 경우, 환자는 사전에 항-호르몬 요법을 받을 수 있으며, 암이 호르몬 독립성이 된 후, 항-종양 세포 항원 항체 (및 선택적으로 전술한 다른 약제)를 환자에 투여할 수 있다.
본 발명의 다른 실시 상태에서, 면역접합 항체가 순수 항체와 조합하여 사용될 수 있다. 여기서 비접합 항체는 면역접합체 내에 사용된 것과 동일한 항체, 또는 항체의 변이체이다. 순수 항체는 저친화도 또는 비-특이적 결합 부위에 결합하거나 차단하기 위하여 우선 투여될 수 있다. 대안적으로, 순수 항체가 ADCC 또는 CDC 활성을 보유한 경우, 이러한 활성의 하나에 의하여 가능한한 많은 표적 종양 세포를 제거하기 위하여 투여될 수 있다. 그 다음, 면역접합 항체는 모든 잔존 종양 세포를 사멸하기 위하여 투여할 수 있다. 이러한 방식으로, 면역접합체는 적은 투약량으로 제공될 수 있으며, 접합체의 독소 부분과 결부될 수 있는 부작용을 감소시킬 수 있다.
전술한 동시투여된 모든 약제의 적합한 투약량은 현재 사용하고 있는 것이며, 약제와 항-종양 세포 항원 항체의 결합 활성(시너지)에 기인하여 낮출 수 있다.
질병을 예방 또는 치료하기 위하여, 적합한 항체 투약량은 전술한 치료되는 질병의 유형, 심각성 및 질병의 단계, 항체가 예방적 또는 치료적 목적으로 투여되는지, 항체가 약물 또는 방사성동위원소에 접합되는지, 이전의 요법, 환자의 임상 병력과 항체 반응, 및 담당의사의 재량에 따라 달라진다. 항체는 일회 또는 연속적인 치료로 환자에 적절하게 투여될 수 있다. 질병의 유형 및 정도에 따라, 예를 들면, 하나 이상의 별도 투여에 의하든, 또는 계속적 주입에 의하든, 약 1μg/kg 내지 15mg/kg(예컨대 0.1-20mg/kg)의 항체가 환자 투여를 위한 초기 후보 투약량이다. 전형적인 일일 투약량은 전술한 인자에 따라 약 1μg/kg 내지 100mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 수일간 또는 그 이상의 반복 투여를 위하여, 조건에 따라, 치료는 소망하는 질병 증상의 억제가 나타날때까지 지속된다. 양호한 항체 투약량은 약 0.05mg/kg 내지 약 10mg/kg의 범위 내에 있다. 따라서, 하나 이상의 투약량인 약 0.5mg/kg, 2.0mg/kg, 4.0mg/kg 또는 10mg/kg(또는 이들의 모든 조합)을 환자에 투여할 수 있다. 이러한 투약량을 간헐적으로, 예컨대 매주 또는 매 3주(예컨대, 환자에 2 내지 20, 예컨대 약 6회분의 항-종양 세포 항원 항체를 투여)로 투여할 수 있다. 투약량 범위는 약 0.01mg/kg 내지 약 40mg/kg, 약 0.01mg/kg 내지 약 30mg/kg, 약 0.1mg/kg 내지 약 30mg/kg, 약 1mg/kg 내지 약 30mg/kg, 약 3mg/kg 내지 약 30mg/kg, 약 3mg/kg 내지 약 25mg/kg, 약 3mg/kg 내지 약 20mg/kg, 약 5mg/kg 내지 약 15mg/kg, 또는 약 7mg/kg 내지 약 12mg/kg의 범위가 될 수 있다. 치료 방법은 치료적으로 효과적인 투약량의 단일 투여 또는 치료적으로 효과적인 투약량의 다중 투여를 포함할 수 있다고 이해한다. 추가적으로, 초기 높은 부하 투약량과 이후 하나 이상의 낮은 투약량이 투여될 수 있다. 예시적인 투여 요법은 항-종양 세포 항원 항체 약 4mg/kg의 초기 부하 투약량과 그 이후의 약 2mg/kg의 주간 유지 투약량을 투여할 수 있다. 그러나, 다른 복용 요법도 유용하다. 이 요법의 진행은 종래의 기법 및 분석법에 의하여 쉽게 모니터링된다.
본원은 표적 세포에 대한 진단/검출용 약제 또는 치료제를 전달하는 방법을 고려한다. 진단/검출용 약제는 전술한 약제, 예컨대 광활성 약제, 방사선핵종 또는 조영제가 될 수 있다. 치료제는 전술한 약제, 예컨대 방사선핵종, 면역조절제, 호르몬 또는 호르몬 길항제, 효소 또는 효소 억제제, 광활성 치료제, 세포독성 약제 및 이들의 조합이 될 수 있다. 이 방법은 본 발명의 조성물을 제공하는 단계 및 이들이 필요한 환자에 이들을 투여하는 단계를 고려한다. 본 발명의 항체 또는 면역접합체가 우선 제공되며, 혈류로부터 제거되고, 담체 분자는 진단/검출용 약제 또는 치료제 또는 이들의 조합을 포함하여 투여될 수 있으며, 여기서, 담체 분자는 본 발명의 항체에 결합될 것이다. 담체 분자는 본 발명의 항체 또는 면역접합체상의 하나 이상의 부위에 결합될 수 있다.
항체 단백질을 환자에 투여하는 것과 달리, 본원은 유전자 요법에 의한 항체의 투여를 고려한다. 이러한 항체를 암호화하는 핵산의 투여는 "항체의 치료적 유효량을 투여"한다는 표현으로 포괄된다. 예를 들면, 세포내 항체를 생성하는 유전자 요법의 용도에 관한 WO96/07321, Mar. 14, 1996를 참조한다.
핵산(선택적으로 벡터 내에 함유된)을 환자 세포 내로; 생체 내 및 생체 외에서 얻는 2개의 주된 방법이 있다. 생체 내 전달에 대하여, 핵산은 일반적으로 환자의항체가 필요한 부위에 직접 투여된다. 생체 외 치료에 대하여, 환자 세포는 제거되고, 핵산이 이러한 분리된 세포 내로 도입되며 변형된 세포는 직접적으로나 또는, 예를 들면, 환자 내에 식재된 다공성 막 내에 캡슐화되어 환자에 투여된다(예컨대 U.S. Pat. Nos. 4,892,538 및 5,283,187). 핵산을 생활성인 세포로 도입하기 위한 다양한 기법이 있다. 기법은 의도된 숙주 내의 세포 내의 시험관 내, 또는 생체 내 배양된 세포로 전이되는지 여부에 따라 달라진다.
시험관 내에서 핵산을 포유류 세포로 전이시키기 위한 적합한 기법은 리포좀, 전기천공, 마이크로주사, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 칼슘 포스페이트 침전법, 등의 사용을 포함한다. 유전자의 생체 외 전달을 위한 벡터에 일반적으로 사용되는 벡터는 레트로바이러스이다.
현재 양호한 생체 내 핵산 전이 기법은 바이러스 벡터(예컨대, 아데노바이러스, 헤르페스 심플렉스 I 바이러스, 또는 아데노-유관 바이러스) 및 지질-기초 시스템(유전자의 지질-매개 전이에 유용한 지질은 DOTMA, DOPE 및 DC-Choi, 예를 들면)에 의한 전달감염을 포함한다. 이러한 상황하에서, 핵산 공급원에 표적 세포, 예컨대 세포 표면 막 단백질 또는 표적 세포, 표적 세포상의 수용체용 리간드 등에 특이적인 항체를 표적화하는 약제를 제공하는 것이 바람직하다. 리포좀이 사용되는 경우, 세포내 이입에 관련된 세포 표면 막 단백질에 결합하는 단백질은 표적화 및/또는, 예컨대 캡시드 단백질 또는 특정 세포 타입에 대한 그것의 절편, 사이클링에서 내재화를 하는 단백질 및 세포내 국소화를 표적화하며 세포 내 반감기를 증진하는 단백질에 대한 항체의 흡수를 촉진하기 위하여 사용될 수 있다. 수용체-매개 세포내 이입의 기법은, 예를 들면, Wu et al., J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987); 및 Wagner et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3410-3414 (1990)에 설명되어 있다. 현재 공지된 유전자 마킹 및 유전자 요법 프로토콜의 연구를 위하여 문헌 Anderson et al., Science 256:808-813 (1992)를 참조한다. WO 93/25673 및 그 안의 참고자료를 참고한다.
VIII. 안전성 연구
본 발명의 항체는 안전성 및 독극물성 특성에 대하여 연구될 것이다. 이러한 유형의 연구를 위한 지침은 USDA CBER division에서 발행한 문헌 "Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use" (http://www.fda.gov/cber/gdlns/ptc_mab.pdf)에서 찾을 수 있으며 본원에 참고자료로서 포함되어 있다. 일반적으로, 후보 항체는 비-표적화 조직 결합 및 교차 반응성을 평가하기 위하여 다수의 인간 조직 시료 및/또는 분리된 인간 세포 유형을 사용하는 임상전 연구에서 선별되어야 한다. 이러한 인간 조직 연구의 만족하는 결과에 따라, 조직 시료의 패널 또는 다양한 동물 종에서 분리된 세포는 일반적으로 독극물학적 연구에 사용되기에 적합한 종을 확인하기 위하여 선별될 수 있다. 교차 반응성 동물 종이 확인되지 않은 경우, 다른 타입의 모델이 적합하다. 이러한 다른 모델은 예컨대 이종이식 모델의 연구를 포함할 수 있으며, 여기서 인간 종양 세포는 설치류 숙주 내로 식재된다. 또는 동물 종 내에서 대응하는 종양-세포 항원을 인식하는 대리 단클론 항체의 용도는 독극물학적 연구를 위하여 선택되었다. 대체 모델의 이러한 타입의 데이터는 우선 근사값이 될 것이며, 고등한 종으로의 진행은 신중하게 수행되어야 한다는 사실을 이해하여야한다.
후보 순수 항체에 있어서, 단순한 인내도를 관찰하는 연구가 수행되었다. 이러한 연구에 있어서, 후보 분자의 치료적 지수를 특성화하기 위하여 시도하는 치료적 항체 후보는 모든 투약량-의존성 약역학 효과를 관찰함으로써 제조된다. 넓은 범위의 투약량이 사용되어야 한다(예를 들면 0.1mg/kg 내지 100mg/kg). 종양 세포 항원 수, 교차 반응성 동물 표적에 대한 후보 항체의 친화도의 차이 및 항체 결합에 따른 세포성 반응의 차이는 치료적 지수를 평가하는데 고려되어야 한다. 약역학 및 약물동태학 연구는 적합한 동물 모델에서 수행하여 후보 항체가 인간에게 시험되는 경우 고려할 초기 투약량을 계산하는 것을 돕게된다.
후보 면역접합체에 있어서, 접합체의 안정성 연구는 생체 내에서 수행하여야 한다. 최적화하기 위하여, 약역학 및 약물동태학 연구는 후보 면역접합체의 모든 파괴 산물의 결과를 결정하기 위하여 면역접합체의 개개의 성분 상에서 수행되어야한다. 약역학 및 약물동태학 연구는 초기 투약량 고려를 계산하기 위하여 전술한 적합한 동물 모델 내에서 수행하여야한다. 약물이 순수 항체에 의한 선치료와 조합하여 주어지는 경우 안전성 연구 설계에 추가의 고려사항이 주어져야한다. 안전성 연구는 순수 항체 단독으로 수행하여야만 하며, 연구는 면역접합체의 궁극적 투약량은 이 유형의 치료 요법에서 낮게 될 것이라는 점을 명심하고 면역접합체로 설계하여야한다.
방사성-면역접합체에 있어서, 동물 조직 분포 연구는 생체 분포 데이터를 결정하기 위하여 수행하여야 한다. 이와 함께, 투여된 방사성활성체의 총량의 대사적 분해를 계수하는 것은 주어진 초기 및 후기 시점에서 모두 수행하여야 한다. 방사성-면역접합체는 혈청 또는 혈장을 사용하여 시험관 내에서 안정성을 시험할 수 있으며, 방법은 유리 방사선핵종, 방사성-면역접합 및 표지된, 비-항체 화합물의 백분율을 측정하기 위하여 개발되어야 한다.
IX. 제조용 물품
본 발명의 또 다른 실시상태에서, 전술한 질환의 치료에 유용한 물질을 함유한 제조용 물품을 제공한다. 제조용 물품은 용기 및 라벨 또는 용기와 함께 또는 용기 상의 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들면, 병, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질 예컨대 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 용기는 증상 치료에 효과적인 조성물을 함유하며, 무균 접근 포트를 구비할 수 있다(예를 들면 용기는 피하 주사 바늘로 관통할 수 있는 마개를 구비한 정맥 용액 백 또는 바이알이 될 수 있다). 조성물 내의 최소한 하나의 활성 약제는 항-종양 세포 항원 항체이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택된 증상, 예컨대 암의 치료에 사용된다는 것을 적시한다. 일 실시 상태에서, 라벨 또는 포장 삽입물이 종양 세포 항원에 결합하는 항체를 포함하는 조성물이 종양 세포 항원을 발현하는 암을 치료하기 위하여 사용할 수 있다는 것을 적시한다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물은 암 치료용으로 사용된다는 것을 나타낼 수 있으며, 여기서 암은 종양 세포 항원의 과다발현에 의하여 특성화되지 않는다. 예를 들면, 반면에 HERCEPTIN.RTM.의 포장 삽입물은 항체를 전이성 유방암 환자의 치료에 사용될 수 있다는 것을 나타내며, 이들의 종양은 ErbB2 단백질을 과다발현하고, 본원의 포장 삽입물은 항체 또는 조성물이 종양 세포 항원 과다발현의 정도와 무관하게 암을 치료하기 위하여 사용된다는 것을 나타낸다. 다른 실시상태에서, 포장 삽입물은 항체 또는 조성물이 유방암(예컨대 전이성 유방암); 호르몬 독립성 암; 전립선암(예컨대 안드로겐 독립성 전립선암); 폐 암(예컨대 비-소세포 폐 암); 결장, 직장 또는 결장직장 암; 또는 본원에서 개시한 모든 다른 질병 또는 질환을 치료하기 위하여 사용될 수 있다는 사실을 나타낸다. 더욱이, 제조용 물품이 (a) 조성물이 그 안에 함유된 제1 용기, 여기서 조성물은 종양 세포 항원에 결합하고, 종양 세포 항원을 과다발현하는 암 세포의 성장을 억제하는 제1 항체를 포함하며; 및 (b) 조성물이 그 안에 함유된 제2 용기, 여기서 조성물은 종양 세포 항원에 결합하는 제2 항체를 포함한다. 본 발명의 실시상태에서의 제조용 물품은 제1 및 제2 항체 조성물이 암 치료용으로 사용할 수 있다는 사실을 적시하는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 더욱이, 포장 삽입물은 (종양 세포 항원에 결합하는 항체를 포함하는) 조성물의 사용자가 항체를 보유한 치료제와 전장의 모든 부가 치료제(예컨대, 화학치료제, 항-혈관형성 약제, 항-호르몬 화합물, 및/또는 사이토카인)를 결합하여 사용하도록 지시할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 제조용 물품은 약학적으로-허용가능한 완충액, 예컨대 주사용 정균수(BWFI), 포스페이트-완충 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 및 주사기를 포함하는 상업적 및 소비자 기준에서 바람직한 다른 물질이 추가로 포함될 수 있다.
X. 항-종양 세포 항원 항체의 비-치료적 용도
본 발명의 항체(예컨대 항-종양 세포 항원 항체)는 비-치료적 용도를 추가로 보유할 수 있다.
예를 들면, 항체는 친화도 정제 약제로서 사용할 수 있다. 이 프로세스에서, 항체는 당해 기술 분야에 공지된 방법을 사용하여 고체 상 예컨대 세파덱스 수지 또는 여과지 상에 고정된다. 고정된 항체는 종양 세포 항원 단백질 (또는 그것의 절편)을 포함하는 시료와 접촉하여 정제하게되고, 이후 지지체는 고정된 항체에 결합하는 종양 세포 항원 단백질을 제외한 시료 내의 실질적으로 모든 물질을 제거하는 적합한 용매로 세척된다. 마침내, 지지체는 또다른 적합한 용매, 예컨대 글리신 완충액, pH 5.0로 세척하고, 이는 항체에서 종양 세포 항원 단백질을 방출하게 된다.
항-종양 세포 항원 항체는 또한 예컨대, 특이적 세포, 조직, 또는 혈청 내에서의 이들의 발현을 검출하는 종양 세포 항원 단백질의 진단적 분석에 유용하다.
진단적 응용에 있어서, 항체 일반적으로는 검출가능한 모이어티로 표지된다. 일반적으로 다음의 카테고리로 분류된 다양한 라벨을 사용할 수 있다:
(a) 전술한 방사선핵종. 항체는 Current Protocols in Immunology,Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubs. (1991)에 설명된 기법을 사용하여 방사성동위원소로 라벨화될 수 있으며, 예를 들면 및 방사성활성은 섬광 계수법을 사용하여 측정할 수 있다.
(b) 형광 라벨 예컨대 희토류 킬레이트(유로피움 킬레이트) 또는 플루오레세인 및 이들의 유도체, 로다민 및 이들의 유도체, 단실, 리사아민, 피코에리스린 및 텍사스 레드를 사용할 수 있다. 형광 라벨은 문헌 Current Protocols in Immunology, supra에 개시된 기법을 사용하여 항체에 접합될 수 있으며, 예를 들면. 형광은 형광계를 사용하여 정량할 수 있다.
(c) 다양한 효소-기질 라벨을 활용할 수 있으며, U.S. Pat. No. 4,275,149는 이러한 것에 대한 연구를 제공한다. 효소는 일반적으로 다양한 기법을 사용하여 측정할 수 있는 유색 기질의 화학적 변화를 촉매한다. 예를 들면, 효소는 분광측광학적으로 측정한 기질 내의 색변화를 촉매한다. 대안적으로, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변화시킬 수 있다. 형광의 변화를 정량화하는 기법은 전술하였다. 화학발광 기질은 화학적 반응에 의하여 전자적으로 여기되며, 측정할 수 있는 빛을 발광하게 된다(화학발광계를 사용, 예를 들면) 또는 형광 수용체에 에너지를 공여한다. 효소적 라벨의 예는 루시페라아제(예컨대, 반딧불 루시페라아제 및 박테리아 루시페라아제; U.S. Pat. No. 4,737,456), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 말레이트 디하이드로지나아제, 우레아제, 페록시다아제 예컨대 홍당무 페록시다아제(HRPO), 알칼리성 인산분해효소, 베타-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 라이소자임, 당 산화효소(예컨대, 글루코스 산화효소, 갈락토오스 산화효소, 및 글루코스-6-포스페이트 디하이드로지나아제), 이종시클릭 산화효소(예컨대 우리카제 및 잔틴 산화효소), 락토페록시다아제, 마이크로페록시다아제 등을 포함한다. 항체와 효소를 접합하는 기법은 문헌 O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981)에 설명되어 있다.
효소-기질 조합의 예는, 예를 들면:
(i) 기질로서 하이드로겐 페록시다아제를 지닌 홍당무 페록시다아제(HRPO), 여기서 하이드로겐 페록시다아제는 염료 전구체(예컨대, 오르도페닐렌 디아민(OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 하이드로클로라이드 (TMB))을 산화한다;
(H) 유색 기질로서 파라-니트로페닐 포스페이트를 지닌 알칼리성 인산분해효소 (AP); 및
(iii) 유색 기질(예컨대, p-니트로페닐-베타-D-갈락토시다아제) 또는 형광원 기질 4-메틸움벨리페릴-베타-D-갈락토시다아제를 지닌 베타-D-갈락토시다아제 (베타-D-Gal).
다양한 다른 효소-기질 조합을 당해 기술 분야의 숙련자가 사용할 수 있다. 일반적인 연구를 위하여, U.S. Pat. Nos. 4,275,149 및 4,318,980를 참조한다.
종종, 라벨이 항체와 간접적으로 접합된다. 당해 기술 분야의 숙련자에게 이를 달성하는 다양한 기법이 알려져 있다. 예를 들면, 항체는 바이오틴과 접합될 수 있으며, 전술한 라벨의 3종의 넓은 카테고리가 아비딘과 접합되거나, 또는 그 반대이다. 바이오틴은 선택적으로 아비딘과 결합하며 따라서, 라벨은 간접적인 방법으로 항체와 접합된다. 대안적으로, 라벨과 항체의 간접 접합을 달성하기 위하여, 항체는 소 헵탄(예컨대, 디곡신)과 접합되며, 전술한 다른 타입의 라벨의 하나가 항-헵탄 항체(예컨대, 항-디곡신 항체)와 접합된다. 따라서, 라벨과 항체의 접합이 달성될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시상태에서, 항-종양 세포 항원 항체가 라벨화될 필요가 없으며, 이들의 존재는 종양 세포 항원 항체에 결합된 표지된 항체를 사용하여 검출될 수 있다.
본 발명의 항체는 공지의 모든 분석 방법을 사용할 수 있으며, 예컨대 경쟁적 결합 분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석, 및 면역침전 분석이다. (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987)).
면역조직화학을 위하여, 종양 시료는 신선한 것이거나 또는 동결될 수 있으며 또는 파라핀에 삽입되고, 보존제 예컨대 포르말린으로 고정할 수 있다.
항체는 생체 내 진단적 분석을 위하여 사용할 수 있다. 일반적으로, 항체는 방사선핵종으로 라벨화되어 종양을 면역섬광조영술을 사용하여 국소화할 수 있다. 편리함의 문제로써, 본 발명의 항체는 키트 내에서 제공될 수 있으며, 즉, 진단적 분석을 수행하는 지시서와 함께 우세한 양의 약제와 조합 포장될 수 있다. 항체가 효소로 표지된 경우, 키트는 효소에 의하여 필요한 기질 및 보조인자를 포함하게 된다(예컨대, 검출가능한 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체). 이와 함께, 다른 첨가제 예컨대 안정화제, 완충액(예컨대, 차단 완충액 또는 용해 완충액) 등이 포함될 수 있다. 다양한 약제의 상대량은 분석의 민감성을 실질적으로 최적화된 약제의 용액 농도를 제공하기 위하여 다양하게 변화된다. 특히, 약제는 건조 분말, 일반적으로 동결건조형으로 제공될 수 있으며, 용해된 부형제를 포함하여 적합한 농도를 지닌 약제 농도를 제공한다.
본 발명의 추가의 상세는 다음의 비제한적 실시예에 의하여 설명된다. 본 명세서에서 인용된 문헌은 모두 본원에 참고자료로서 포함되어 있다.
XI. 실시예
실시예 1
표적화를 위한 종양 유관 항원의 선택
A. 종양성 세포 및 인접 정상 세포의 레이저 절개, 및 절개된 세포의 RNA의 생산.
정상 및 암성 조직이 레이저 캡춰 마이크로절개(LCM)를 사용하여 환자로부터 수집되었으며, 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 기법을 사용하여 이러한 조직에서 RNA를 제조하였다(예컨대, Ohyama et al. (2000) Biotech'iques 29:530-6; Curran et al. (2000) MoI. Pathol. 53:64-8; Suarez-Quian et al. (1999) Biotech'iques 26:328-35; Simone et al. (1998) Trends Gerzet 14:272-6; Conia et al. (1997) 3. Clin. Lab. anal. 11:28-38; Emmert-Buck et al. (1996) Science 274:998-1001). LCM이 실질적으로 균일한 세포 시료를 제공하기 위하여 특이적 세포 유형의 분리를 제공하기 때문에, 이는 유사하게 순수한 RNA 시료를 제공하게된다.
B. 마이크로어레이 분석
cDNA의 생산: 절제된 세포에서 생산된 총 RNA는 그 다음 Affymetrix 2주기 cDNA 합성 키트 (cat# 900432)를 사용하여 cDNA 생산에 사용될 수 있다. 70℃로 12분간 가열한 11μL 반응물 내에서 8μL의 총 RNA가 1μL T7-(dT) 24 프라이머(50 pmol/μL)와 함께 사용된다. 혼합물을 그 다음 실온으로 5분간 냉각한다. 9μL 마스터 믹스(4μL 5x 제1 가닥 cDNA 완충액, 2μL 0.1M DTT, 1μL 10mM dNTP 믹스, 2μL 수퍼스크립트 II(600U/μL))를 첨가하고, 혼합물을 2.5시간 동안 42℃로 배양하였다(혼합물의 총 부피는 20μL). 그 다음 얼음상에서 냉각하고, 제2 가닥 합성을 다음과 같이 수행하였다: 위의 20μL 혼합물을 130μL의 제2 가닥 마스터 믹스 (91μL의 물, 30μL 5x 제2 가닥 반응 완충액, 3μL 10 mM dNTP 믹스, 1μL 10 U/μL 이. 콜리 DNA 리가아제, 4μL 10U/μL 이. 콜리 DNA 폴리머라아제 I, 1μL 2U/μL 이. 콜리 RNA분해효소 H)와 혼합하고, 16℃로 10분으로 2시간 동안 배양하였다. 얼음으로 냉각하고 난 뒤, dsDNA를 반응 혼합물에서 정제하였다. 요약하면, QiaQuick PCT 정제 키트를 사용하였다(Qiagen, cat# 28104), 5 부피의 완충액 PB를 1 부피의 cDNA 혼합물에 첨가하였다. 그 다음 cDNA를 제조자의 설명에 따라 QIAquick 스핀 컬럼으로 정제하고 60μL의 최종 부피를 산출하였다.
바이오틴-표지된 cRNA의 생산. 생산하고 전제된 상기 cDNA를 다음과 같이 바이오틴 표지된 RNA로 만드는데 사용하였다: QIAQuick 컬럼에서 회수한 60μL의 cDNA를 가속 진공으로 가열한 배지 내에서 22μL 부피로 감소시켰다. 이를 ENZO 바이오어레이 고수율 RNA 전사 키트(cat# 4265520)에 사용하였다. 요약하면, 4μL 10x HY 반응 완충액, 4μL 1Ox 바이오틴-표지된 리보뉴클레오타이드, 4μL DTT, 4μL RNA분해효소 억제제 믹스, 및 2μLT7 RNA 폴리머라아제를 함유한 마스터 믹스를 22μL의 정제 cDNA에 첨가하고, 37℃에서 4 내지 6시간동안 리프트 업 배양하였다. 그 다음 반응물은 제조자의 지시에 따라 Qiagen RNeasy 키트(cat# 74104)를 사용하여 정제하였다.
cRNA의 절편화. 앞의 15 내지 20μg의 cRNA를 8μL의 5x 절편화 완충액 (20OmM Tris-아세테이트, pH 8.1, 50OmM 칼륨 아세테이트, 15OmM 마그네슘 아세테이트) 및 물과 혼합하여 40μL의 최종 농도가 되게 하였다. 혼합물을 94℃에서 35분간 배양하였다. 일반적으로는, 이 절편화 프로토콜은 35 내지 200 염기 크기의 범위인 RNA 절편의 분포를 산출한다. 절편화는 TAE 아가로스 전기영동을 사용하여 확인할 수 있다.
어레이 혼성화. 전에 절편화된 cRNA를 혼성화 칵테일을 제조하기 위하여 사용한다. 요약하면, 전술한 40μL를 1mg/mL의 인간 Cot DNA 및 적합한 대조구 올리고뉴클레오타이드와 혼합하였다. 추가적으로, 3mg의 청어 정자 DNA(10mg/mL)를 150μL 2x 혼성화 완충액(100mM MES, 1 M NaCl, 20mM EDTA, 0.01% Tween-20) 및 물과 함께 첨가하여 최종 농도가 300μL가 되도록 하였다. 200μL의 이 용액을 U133 어 레이(Affymetrix cat # 900370)에 탑재하고, 45rpm의 정속으로 밤샘(overnight) 45℃에서 배양하였다. 그 다음 혼성화 완충액을 제거하고, 어레이를 세척하고, 제조자의 프로토콜을 따라 Gene Chip Fluidics Station 450 (Affymetrix, cat# 00-0079)를 사용하여 200μL의 미-엄격 세척 완충액(6X SSPE, 0.01% Tween-20)로 염색하였다.
스캐닝 어레이. 상기 어레이를 제조자의 프로토콜에 따라 Gene Chip Scanner 3000 (Affymetrix cat# 00-0217)를 사용하여 스캔하였다.
잠재적인 종양 세포 항원 표적의 선택. 종양 항원은 종양 세포(원발 종양 또는 전이)내의 항원의 발현 수준 대 인접한 건강한 조직 또는 풀을 형성한 정상 조직을 비교하여 표적화를 위하여 선택된다. 선택된 종양 항원은 주변 정상 조직에 비하여 최소한 3 배 (300%) 증가된 발현을 나타내며, 여기서 이 3 배 증가란 풀을 형성한, 구득가능한 정상 조직 시료 비교의 대부분에서 나타난다(참조 표준 믹스 또는 RSM, 풀은 각 조직 타입에서 제조됨). 하기하는 표 2는 KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, 및 SLC1A5의 어레이 분석의 배율 증가 데이터를 나타내며, 여기서 숫자는 정상 조직과 비교한 발현의 2-, 3-또는 5-배 증가를 나타내는 분석된 환자 시료의 백분률을 나타낸다.
표 2-KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, 및 SLC1A5의 마이크로어레이 결과:
표 2a-FLJ23390
환자 유형 환자의 수 2배 증가 3배 증가 5배 증가
결장 원발 vrs 정상 RSM 25 20 4 0
결장 전이 vrs 정상 RSM 33 0 0 0
유방 원발 vrs 정상 RSM 20 100 75 25
전립선 원발 vrs 정상 RSM 22 0 0 0
전립선 원발 vrs 정상 17 6 6 0
표 2b-LOC157378
환자 유형 환자의 수 2배 증가 3배 증가 5배 증가
결장 원발 vrs 정상 RSM 26 50 23 9
결장 전이 vrs 정상 RSM 32 50 44 22
유방 원발 vrs 정상 RSM 49 24 6 2
전립선 원발 vrs 정상 RSM 21 14 0 0
전립선 원발 vrs 정상 15 40 7 0
표 2c-FLJ20421
환자 유형 환자의 수 2배 증가 3배 증가 5배 증가
결장 원발 vrs 정상 RSM 26 35 15 0
결장 전이 vrs 정상 RSM 33 24 3 0
유방 원발 vrs 정상 RSM 50 70 40 14
전립선 원발 vrs 정상 RSM 22 14 5 0
전립선 원발 vrs 정상 17 24 0 0
표 2d-DSCD75
환자 유형 환자의 수 2배 증가 3배 증가 5배 증가
결장 원발 vrs 정상 RSM 27 52 37 7
결장 전이 vrs 정상 RSM 33 76 36 9
유방 원발 vrs 정상 RSM 49 22 2 0
전립선 원발 vrs 정상 RSM 22 5 0 0
전립선 원발 vrs 정상 16 12 0 0
표 2e-GPR160
환자 유형 환자의 수 2배 증가 3배 증가 5배 증가
결장 원발 vrs 정상 RSM 26 23 8 0
결장 전이 vrs 정상 RSM 33 12 0 0
유방 원발 vrs 정상 RSM 46 24 9 0
전립선 원발 vrs 정상 RSM 22 36 9 5
전립선 원발 vrs 정상 17 59 24 6
표 2f-GPCR41
환자 유형 환자의 수 2배 증가 3배 증가 5배 증가
결장 원발 vrs 정상 RSM 23 48 17 4
결장 전이 vrs 정상 RSM 30 77 50 13
유방 원발 vrs 정상 RSM 43 63 40 23
전립선 원발 vrs 정상 RSM 0 0 0 0
전립선 원발 vrs 정상 3 33 33 33
표 2g-SLC1A5
환자 유형 환자의 수 2배 증가 3배 증가 5배 증가
결장 원발 vrs 정상 RSM 26 15 4 0
결장 전이 vrs 정상 RSM 31 13 0 0
유방 원발 vrs 정상 RSM 39 18 3 0
전립선 원발 vrs 정상 RSM 1 100 0 0
전립선 원발 vrs 정상 6 67 50 33
실시예 2-암성 조직 대 정상 조직의 발현 분석
실시예 1에 사용된 마이크로어레이 절차가 다수의 암성 종양 타입 및 정상 시료의 다수의 조직 내에 발현을 광범위하게 관찰하기 위하여 다시 사용된다. cDNA, RNA 및 혼성화 조건의 생성은 U133 Plus 2.0 어레이(Affymetrix cat# 900470)를 사용하는 것을 제외하고 실시예 1에서 사용된 것이다. DecisionSite 소프트웨어 (Spotfire, Somerville, MA) 및 in-house developed Pipeline Pilot (SciTegic, San Diego, CA, in-house developer Josef Ringgenberg) 프로토콜을 사용하여 도 1-6에 나타난 그래프를 생성하였다. 그래프에서, 정상 및 암성 조직 타입은 수평축에 나타내었다. 암성 조직은 'C'로 표시된다, 예를 들면, 유방암 조직 시료는 "c_breast_duct"로 나타내며, 정상 조직은 이와 유사하게'n'으로 나타낸다. 조직 타입은 알려진 경우 조직 타입 및 서브타입을 추가로 표시한다. 예를 들면 "c_breast_duct"는 유선에 국부화된 유방암의 암성 조직이다. 서브타입이 외과적 제거과정에서 분명하지 않거나 또는 미지인 경우, 라벨은 "불특정"을 의미하는 'ns'로 나타낸다. 수직 축의 각점은 단일 환자의 조직 시료를 나타내며, 수직축 상의 각 최고점(log 2 기초)은 프로브셋의 상대적 발현 수준을 나타낸다. 채워진 원형은 선형 검출 범위 내의 발현 수준을 지닌 시료를 나타낸다. 개방 원형은 시료 내의 유전자 발현상의 최고 한계를 나타내며, 여기서 유전자는 프로브셋 검출 한계이하이다. 개방 사각형은 시료 내의 유전자 발현상의 최저 한계를 나타내며, 여기서 프로브셋은 포화되었다. 요약하면, 분석을 수행하기 전에, 각 프로브세트는 시료의 크고 다양한 세트를 통하여 이들의 구성 프로브의 행위를 분석함으로써 조정된다. 이 조정은 프로브셋 반응이 프로브 사이에서 선형인 한도에서 각 프로브의 상대적 민감성, 및 강도의 범위를 결정한다. 이 범위 이하의 강도는 "미검출" 이라하고, 그 이상을"포화됨"이라고 한다. 시료간의 혼성화 및 표지화 효능에 있어서의 변이에 의하여, 각 칩은 조정 후 정상화되었다.
실시예 3-종양 세포 항원의 세포외 도메인의 분석
상기 종양 세포 항원을 확인한 후, 이론적 세포외 도메인을 확인하기 위하여 단백질의 토폴로지를 분석하였다. 두 분석 알고리즘이 막관통 도메인을 예측하기위하여 사용되었으며, 그 결과를 비교하였다. 첫번째는 TMpred 이었다(K. Hofmann & W. StofTel (1993) TMbase-A database of membrane spanning proteins segments Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374,166). 사용된 제2 분석 프로그램은 TMHMM 이었다(A. Krogh, B. Larsson, G. von Heijne, and E. L. L Sonnhammer. Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: Application to complete genoms. Journal of Molecular Biology, 305(3):567-580, January 2001). 각 종양 세포 항원의 결과를 표 3에 열거하였다. 일 예로써 알고리즘 다른 것에 대한 토폴로지 방향의 확실성을 예측할 수 없음에도, 일반적으로, 두 세트의 분석의 결과는 상당하게 일치하였다. 그러한 경우에 있어서, 두 방향이 열거되었다. 하기의 표 3은 잠정적 막관통 나선(TM helix)의 위치 및 혈장 막의 내부 또는 외부에 위치한 단백질의 이론적 부분을 나타낸다. 이와 함께, SignalP 3.0(Bednsten et al, (2004) J MoI Biol. 2004 JuI 16;340(4):783-95)을 사용하여 신호 펩타이드의 존재 및 전장 단백질로부터 그러한 단백질이 분해되는 위치가 어디인지를 예측한다. 세포 외부의 단백질의 부분은 항체 상호작용에 대한 표적으로 제공될 수 있다.
표 3a-KIAA1815: 인증 번호 NP_079172, 902 aas.
TMHMM IMpred
자리 위치 자리 위치
외부 1-408 외부 1-74
TM 나선 409-431 TM 나선 75-92
내부 432-450 내부 93-398
TM 나선 451-473 TM 나선 399-422
외부 474-487 외부 422
TM 나선 488-510 TM 나선 418-436
내부 511-521 내부 437-462
TM 나선 522-544 TM 나선 463-487
외부 545-548 외부 488-489
TM 나선 549-568 TM 나선 490-512
내부 569-579 내부 513-537
TM 나선 580-602 TM 나선 538-564
외부 603-621 외부 565-581
TM 나선 622-644 TM 나선 582-602
내부 645-650 내부 603-623
TM 나선 651-673 TM 나선 624-641
외부 674-904 외부 642-653
TM 나선 654-674
내부 675-904
SignalP 3.0 예측 신호 펩타이드 없음
표 3b-BC017881: 인증 번호 NP_919267, 240 aas.
TMHMM IMpred #1 IMpred #2
자리 위치 자리 위치 자리 위치
내부 1-116 내부 1-117 외부 1-117
TM 나선 117-139 TM 나선 118-142 TM 나선 118-143
외부 140-142 외부 143-148 내부 144
TM 나선 143-165 TM 나선 149-167 TM 나선 145-164
내부 166-206 내부 168-211 외브 165-211
TM 나선 207-229 TM 나선 212-230 TM 나선 212-232
외부 230-240 외부 231-240 내부 233-240
SignalP 3.0 예측 aa 1-48의 신호 펩타이드.
표 3c-FLJ20421: 인증 번호 AAH67814, 359 aas.
TMHMM IMpred #1 IMpred #2
자리 위치 자리 위치 자리 위치
내부 1-6 내부 1-9 외부 1-7
TM 나선 7-29 TM 나선 10-28 TM 나선 8-28
외부 30-359 외부 29-359 내부 29-359
SignalP 3.0 예측 aa 1-50의 신호 펩타이드.
표 3d-DSCD75: 인증 번호 AAF65450, 208 aas
TMHMM IMpred #1 IMpred #2
자리 위치 자리 위치 자리 위치
내부 1 내부 0 외부 0
TM 나선 2-24 TM 나선 1-19 TM 나선 1-19
외부 25-208 외부 20-208 내부 20-208
SignalP 3.0 예측 aa 1-30의 신호 펩타이드.
표 3e-GPR160: 인증 번호 NP_055188, 338 aas
TMHMM IMpred
자리 위치 자리 위치
외부 1-21 외부 1-25
TM 나선 22-44 TM 나선 26-43
내부 45-56 내부 44-56
TM 나선 57-79 TM 나선 57-79
외부 80-93 외부 80-93
TM 나선 94-116 TM 나선 94-121
내부 117-136 내부 122-136
TM 나선 137-156 TM 나선 137-156
외부 157-175 외부 157-182
TM 나선 176-198 TM 나선 183-199
내부 199-239 내부 200-243
TM 나선 240-262 TM 나선 244-265
외부 263-276 외부 266-276
TM 나선 277-294 TM 나선 277-294
내부 295-338
SignalP 3.0 예측 aa 1-38의 신호 펩타이드
표 3f-GPCR41: 인증 번호 AAH02917, 445 aas
TMHMM IMpred
자리 위치 자리 위치
내부 1-8 내부 1-8
TM 나선 9-31 TM 나선 9-30
외부 32-45 외부 31-49
TM 나선 46-68 TM 나선 50-68
내부 69-80 내부 69-111
TM 나선 81-103 TM 나선 112-133
외부 104-112 외부 134-145
TM 나선 113-135 TM 나선 146-167
내부 136-146 내부 168-194
TM 나선 147-169 TM 나선 195-211
외부 170-195 외부 212-270
TM 나선 196-218 TM 나선 271-297
내부 219-275 내부 298-311
TM 나선 276-298 TM 나선 312-339
외부 299-307 외부 339
TM 나선 308-330 TM 나선 335-359
내부 331-336 내부 360-370
TM 나선 337-359 TM 나선 371-389
외부 360-368 외부 390-403
TM 나선 369-391 TM 나선 404-424
내부 392-403 내부 425-445
TM 나선 404-426
외부 427-445
SignalP 3.0 예측 aa 1-25의 신호 펩타이드
표 3g-SLC1A5: 인증 번호 AAH00062, 541 aas
TMHMM IMpred
자리 위치 자리 위치
내부 1-52 내부 1-50
TM 나선 53-75 TM 나선 51-72
외부 76-94 외부 73-98
TM 나선 95-117 TM 나선 99-119
내부 118-129 내부 120-126
TM 나선 130-152 TM 나선 127-145
외부 153-227 외부 146-227
TM 나선 228-245 TM 나선 228-246
내부 246-264 내부 247-264
TM 나선 265-287 TM 나선 265-284
외부 288-301 외부 285-304
TM 나선 302-324 TM 나선 305-329
내부 325-336 내부 330-335
TM 나선 337-359 TM 나선 336-361
외부 360-378 외부 362-376
TM 나선 379-401 TM 나선 377-404
내부 402-413 내부 405-413
TM 나선 414-436 TM 나선 414-432
외부 437-541 외부 433-541
SignalP 3.0 예측 aa 1-35의 신호 펩타이드
실시예 4-KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, 및 SLC1A5에 대한 단클론 항체의 생산.
A. KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, 및 SLC1A5의 PCR 클로닝.
RNA는 암세포 항원을 필수적으로 발현하는 인간 암 세포의 집단으로부터 분리된다(Chirgwin et al., Biochemistry (1979) 17:5294). 요약하자면, 세포는 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 3회 세척되며, 0.7M 2-머캅토에탄올의 존재하에 5 M 구아니디늄 티오시아네이트 내에서 용해된다. 세포 용해질은 불연속적 CsCl 구배상에서 층을 이루고(Chirgwin et al.) 및 Beckman SW28 로터에서 16시간동안 26,000rpm의 속도로 원심분리된다. RNA는 DEPC-처리된 H2O 내에서 펠렛을 용해시켜 회수한다. RNA는 에탄올로 1회 침전되며, DEPC-처리된 H2O에 재현탁되고, -70℃로 저장된다.
총 RNA(10μg/반응물)은 500 유닛 MLV-RT (Bethesda Research Laboratories, Bethesda, Md.), 5μM 무작위 육합체 (Pharmacia, Piscataway, NJ.), 1mM DTT, dNTP 믹스(각 0.5mM), 10 mM Tris-HCL pH 8.3, 50mM KCI, 2.5mM MgCl2 및 0.1mg/ml BSA (소 혈청 알부민)을 함유하는 50μl의 반응 완충액 내에서 무작위 육합체 프라이밍을 사용하여 cDNA로 전환된다. 37℃에서의 1시간 배양 후, 시료를 3분간 비등시키고, -70℃에서 저장하였다. KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, 및 SLC1A5 분자를 암호화하는 DNA는 공지의 KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, 및 SLC1A5 서열과 상동인 서열을 함유하는 프라이머를 사용하는 PCR에 의하여 생성될 수 있으며, 여기서, 프라이머는 또한 클로닝에 유용한 제한부위를 암호화한다. 이러한 프라이머는 KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, 및 SLC1A5에 대한 공지의 cDNA 암호화 서열에 기초하게된다. 모든 프라이머는 클로닝용 제한부위에 따르는 5' 말단에서의 C-G 집게로 개시된다.
PCR 증폭에 있어서, 1μl의 cDNA를 1μl (10 picomoles)의 전방 프라이머, 1μL(10 picomoles)의 후방 프라이머, 및 47μl의 PCR 믹스와 혼합하였다. PCR 믹스는 1.25 유닛의 Taq 폴리머라아제 (Perkin-Elmer/Cetus, Norwalk, Conn.), dNTP 믹스(각 0.2mM), 10 mMTris-HCL pH 8.3, 50mM KCl, 2.5mM MgCl2 및 0.1mg/ml BSA로 구성된다. 50μl의 PCR 혼합물은 70μl의 광유로 피복되고, Perkin-Elmer/Cetus thermocycler 내에서 25 주기로 증폭된다(95℃에서 30초간 변성. 30초간 55℃로 프라이머 서냉상동결합 및 72℃에서 1.5분간 확장). PCR 산물은 25 증폭 주기 후 얻을 수 있다.
증폭 산물은 크기-분획에 의하여 분리된다. 바큘로바이러스 내에서의 발현 전에, 각 절편의 DNA 서열은 PCR-유도 돌연변이의 도입을 예방하기 위하여 시퀀싱 분석에 의하여 확인된다.
증폭된 절편은 적합한 발현 벡터에 결찰된다(예를 들면, 바큘로바이러스 발현 시스템용 pAcC8 벡터). 결찰 산물은 박테리아 균주 DH5α(Gibco/BRL, Gaithersburg Md.)로 전환되며, 재조합 pAcC8 벡터는 암피실린 내성에 기초하여 선택된다. 재조합 플라스미드는 박테리아 클론에서 분리될 것이며(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratories), 1982; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Media, Pa.: John Wiley and Sons)), 대상 삽입체의 존재는 폴리머라아제 사슬 반응(전술)을 사용하여 입증될 것이다. 대규모 플라스미드 제조는 표준 절차로 수행될 것이다(Ausubel et al.; Maniatis et al.; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratories), 1989).
B. 인간 KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, 및 SLC1A5의 바큘로바이러스 발현.
인간 KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, 및 SLC1A5를 암호화하는 서열은 대상 전장 DNA 분자를 포함하는 전이 벡터를 사용하여 아우토그라파 칼리포니카(Autographa califbrnica) 바큘로바이러스(AcNPV)를 사용하여 개별적으로 재조합된다. 플라스미드는 야생형 바큘로바이러스 DNA(2-10 pfu) (AcNPV; Summers et al., A Manual of Methods for Baculovirus Vector and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555 (1987))와 106 세포/mL의 농도로 Sf9 (Spodoptera frugiperda)세포 내로 동시전달감염된다(Summers et al.). 재조합 바큘로바이러스-감염 Sf9 세포가 확인되고, 클론적으로 정제된다(Summers et al.). 재조합 단백질의 세포 표면 발현에 대하여, 세포는 48 시간의 배양 후 수확되었다.
C. 숙주 동물 면역화
암컷 BALB/c 마우스에 대상 유전자를 함유한 바이러스 또는 삽입체가 결핍된 대조구 바이러스로 감염된 5 x 106 Sf9 세포를 실험 0일 및 14일에 복막내 주사하였다. 실험 제21일에, 100μl의 혈청을 특이적 항체의 존재하에 시험물에서 획득하였다. 최소한 두 주의 잔존 기간 후, 마우스는 재조합 또는 대조구로 감염된 Sf9 5 x 106 세포의 최종 주사를 맞았다. 마지막 주사 3일 후, 지라 세포를 세포 융합에 사용하였다.
D. 하이브리도마 클론의 생성
접종된 BALB/c 마우스의 비장림프구는 문헌 de Boer et al., J. Immunol. Meth. (1988) 113:143에서 전술한 바와 같이 50% 폴리에틸렌 글리콜과 같이 10:1의 비율로 SP2/0 뮤린 골수종 세포과 융합된다. 융합된 세포는 하이포잔틴(0.1 raM), 아미노프테린(0.01 mM), 티미딘(0.016 mM) 및 0.5ng/ml hIL-6 (G효소, Cambridge, Mass.)로 보충된 완전 IMDM 배지 내로 재현탁된다. 융합된 세포는 96-웰 조직 배양 플레이트의 웰에 분배되어, 각 웰이 평균적으로 단일 성장 하이브리도마를 함유하게된다.
10-14일 후, 하이브리도마 집단의 상청액이 특이적 항체 생산을 위하여 선별될 것이다. 양성 하이브리도마 세포는 0.5ng/mL hIL-6를 함유한 IMDM/FBS 내에서 희석을 제한함으로써 3회 클론하게 된다.
E. 파지 디스플레이 또는 유전자삽입 동물 기술의 사용
하이브리도마 기술을 통한 항체 생성의 대안적 방법으로서, 본 발명의 항체는 현시 기술 또는 유전자삽입 동물의 사용을 통하여 생성될 수 있다.
현재 인간 항체의 정제에 사용되는 현시 기술은 몇가지 종류가 있다(Hoogenboom (2005) Nature Biotechnology 23(9): 1105-1116). 파지 디스플레이는 본 발명의 인간 항체를 생성하기 위하여 사용할 수 있는 특이적 타입의 현시 기술 중의 하나이다. 제1 패닝 라운드는 1-20μg의 정제된 종양 세포 항원을 사용하여 ELISA 플레이트의 웰을 피복하여 수행된다. 파지 라이브러리는(파지 라이브러리 구축에 관한 방법론 및 상세한 프로토콜 정보, 예를 들면 P.M. O'Brien and R. Aitken, Antibody phage Display Humana Press, 2001) 일반적으로 1 x 1010 내지 1 x 1011 pfu/웰의 농도로 첨가된다. 배양 후, 웰을 세척하고, 결합 파지를 염 또는 저 pH 글리신 용액을 사용하여 용출시켰다. 그 다음 용출 파지를 박테리아로 감염시켜 증폭시키고, 및 증폭되고 및 정제된 파지 입자는 후속 패닝 라운드에 사용된다. 소망하는 경우, 다른 패닝 기법은 예컨대 종양 세포 항원을 발현하는 세포에 대한 세포-기초 패닝을 수행할 수 있다. 대안적으로, 액체-기초 패닝 프로토콜을 수행하였다. 종종 낮은 농도의 정제 항원은 이후의 패닝 라운드에 사용되어 고도의 친화도 항체의 선택을 하게된다. 수행된 운드의 수는 표적 및 라이브러리에 따라 달라진다. 패닝 기법 예컨대 고체상에서의 패닝 및 전세포 상에서의 패닝은 다른 라운드에서 사용될 수 있다. 일단 항체 클론이 소망하는 양의 항체를 생산한다고 확인된 경우, 항체를 암호화하는 유전자는 파지로부터 분리될 수 있으며, 발현 시스템에 기초한 다양한 박테리아, 진균 또는 포유류 세포에서 발현될 수 있다.
유전자삽입 마우스를 사용하는 인간 항체의 생성에 있어서, 동물에 정제된 종양 세포 항원 또는 항원을 발현하는 전 세포를 주사할 수 있다. 예를 들면, 마우스에 다음의 방식으로 전부 8회 주사를 할 수 있다: 실험 0일에, 대상 종양 세포 항원을 발현하는 107 세포를 유전자삽입 마우스의 발바닥에 주사하였다. 실험 제3, 7, 10, 및 14일에, 마우스에 증진 주사를 할 수 있으며, 각 주사는 대상 종양 세포 항원을 발현하는 107개의 세포와 10μg의 CpG 폴리뉴클레오타이드를 함유한다. 실험 제17, 21, 및 27일에, 마우스에 정제된 종양 세포 항원 단백질을 함유한 추가의 증진 주사를 할 수 있다. 접종된 유전자삽입 마우스의 전혈을 제31일에 수확하고, 표준 기법으로 하이브리도마를 생산하였다. 결과 하이브리도마 상청액을 상기 'D'절에서 설명한 바와 같이 선별하였다.
F. 인체적응화/다른 변형
본 발명의 항체에서 강건한 ADCC 또는 CDC 활성을 소망하는 경우, 항체는 인간 또는 인체 적응형 불변 영역을 함유하여야 한다. 항체가 비-인간 종에서 유도되는 경우, 본 발명의 항체 가변 도메인은 인간 불변 도메인에 융합될 수 있다. 인간 불변 도메인에 융합된 후, 가변 도메인은 잠재적인 면역원성을 감소시키기 위하여 추가적으로 인체 적응형이 될 수 있다. 추가적으로, 다른 유전자 또는 재조합 변형은 이점에서 수행될 수 있으며, 예컨대 융합 단백질의 구축, 친화도 성숙, 또는 소수의 실시예로 명명된 부가의 효과기 기능 조작이 있다.
G. 단클론 항체의 정제
대상 항체는 표준 단백질 A 크로마토그래피 및 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 기법을 사용하여 하이브리도마 배양액으로부터 정제된다. 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 방법에 따르면, 하이브리도마 상청액이 수확되고, 종결 후 여과에 의하여 모든 세포가 제거된다. 여과물을 단백질 A 컬럼상에 탑재한다(필요하다면 다중 통과). 컬럼을 세척하고, 그 다음 발현되고, 분비된 면역글로블린 폴리펩타이드가 컬럼으로부터 용출된다. 항체 산물의 생산을 위하여, 단백질 A 풀은 바이러스 불활성화 단계로서 저 pH (pH 3로 최소 30 분 및 최대 1시간)로 유지된다. 흡착 양이온 교환 단계는 다음에 산물을 추가로 정제하기 위하여 사용된다. 흡착 분리 컬럼의 용출물을 바이러스 보유 필터에 통과시켜 잠재적인 바이러스 입자의 제거를 제공하게 된다. 여과물은 산물을 결합하지 않는 음이온 교환 컬럼을 통과시켜 추가 정제하게된다. 마지막으로, 정제 프로세스는 산물을 정용여과를 통하여 제형 완충액으로 전이시켜 완결된다. 보전물은 단백질 농도를 최소한 1mg/mL로 조절하게 되며, 안정화제가 첨가된다.
H. 결합 친화도의 특성화
본 발명의 항체는 BIACore 마이크로칩 분석을 사용하여 대상 표적에 대한 이들의 친화도에 대하여 분석할 수 있다. 예를 들면, BIACore 2000 분석기는 CM5 센서칩(BIACore; Piscataway, NJ)와 함께 사용될 수 있다. 정제된 항원 단백질은 제조자의 지시에 따라, HBS-EP 완충액(1OmM HEPES, 0.15M NaQ, 3.4mM EDTA, 0.005% P-20, pH 7.4)의 연속 흐름을 사용하여 센서 칩 표면에 고정된다. 센서 칩 표면상의 카르복실기는 0.2M N-에틸-N'-(디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) 및 0.05M N-히드록시석신이미드(NHS)를 함유한 혼합물의 60uL의 주사에 의하여 활성화된다. 특이적 표면은 2,000 공명유닛(RU)의 적절한 표면 밀도를 얻기 위하여 10ug/mL의 농도에서 1OmM 아세테이트, pH 4.5 (BIACore, Inc.; Piscataway, NJ)로 희석된 재조합 종양 세포 항원을 주입하여 얻게된다. 특정 실시 상태에서, 다른 농도의 종양 세포 항원, 예컨대 25 g/mL가 사용될 수 있다. 칩 표면상의 과다 반응기는 60 uL의 1 M 에탄올아민 주사로 불활성화될 것이다. 블랭크, 모크(mock)-커플 참조 표면이 각 센서 칩상에서 제조되었다. 모크-커플링, 활성화 및 불활성화 단계는 단백질 없이 수행된다.
단클론 항체 후보는 시료 완충액(1X PBS + 0.005% P-20 + O.1mg/mL BSA(분획 V, 무 IgG; Sigma, Inc.) 여과되고 탈기됨)으로 희석되어 25nM의 농도가 되고, 80pUmin의 흐름 속도로 2분 동안 종양 세포 항원 표면에 주사되었다. 모든 분석에 대하여, 기기 유동 완충액은 1X PBS (무 염화 칼슘, 무 염화 마그네슘; Gibco Inc.) + 0.005% P-20 (여과되고 탈기됨)가 될 것이며, 온도는 25℃로 설정된다. 항체 결합 곡선은 결합 신호 강도, 및 분해 속도와 정량적으로 비교되었다.
I. 접합체
본 발명의 항체가 면역접합체 내의 파트너로서 사용되는 경우, 정제된 항체는 이제 또다른 모이어티와 접합될 수 있다. 예를 들면, 항체는 방사선핵종, 독소 또는 다른 면역조절제에 ADEPT 기술을 사용하여 전구약물-활성화 효소에 접합될 수 있다.
실시예 5-항-종양 세포 항원 항체의 시험관 내 선별
A. ADCC 활성에 대한 선별.
시험관 내 ADCC 분석: 크롬 51-표지된 표적 세포를 제조하기 위하여, 종양 세포주는 조직 배양 플레이트 내에서 성장되며, 무균 10 mM EDTA의 PBS 용액을 사용하여 수확하였다. 분리된 세포는 세포 배양물 배지 내로 2회 세척된다. 세포(5 x 106)는 1 시간동안의 수시 혼합하면서 37℃에서 200μC의 크롬 51(New England Nudear/DuPont)으로 표지된다. 표지된 세포는 세포 배양물 배지로 3회 세척되며, 1 x 105 세포/mL의 농도로 재현탁된다. 세포는 옵소닌화없이 사용되거나, 또는 PBMC 분석에서 100ng/mL 및 1.25ng/mL으로 또는 NK 분석에서 20ng/mL 및 1ng/mL로 시험 항체를 배양함으로써 분석전 옵소닌화된다. 말초 혈액 단핵 세포는 정상 건강한 공여자의 헤파린상에서 혈액 수집에 의하여 준비되며, 포스페이트 완충 식염수(PBS)의 동부피로 희석된다. 혈액은 림프구 SEPARATION MEDIUM® (LSM: Organon Teknika)에 대하여 층을 이루게되고, 제조자의 설명서에 따라 원심분리된다. 단핵 세포는 LSM-혈장 경계에서 수거되며, PBS로 3회 세척된다. 효과기 세포는 세포 배양물 배지에 현탁되어 최종 농도가 1 x 107 세포/mL가 된다. LSM을 통한 정제 후, 자연사(NK) 세포는 제조자의 설명서에 따라 NK 세포 분리 키트 및 자기 컬럼(Miltenyi Biotech)을 사용하여 음성 선택함으로써 PBMC로부터 분리된다. 분리된 NK 세포를 수거하고, 세척하여 세포 배양물 배지 내로 재현탁하여 2 x 106 세포/mL의 최종 농도가 되게 한다. NK 세포의 확인은 흐름 세포 분석으로 확인될 수 있다. 다양한 효과기:표적 비율은 세포 배양물 배지 내의 마이크로티터 플레이트(100μL 최종 부피)의 열을 따라 효과기(PBMC 또는 NK) 세포를 두배로 연속 희석하여 제조된다. 효과기 세포 범위의 농도는 PBMC에 대하여 1.0 x 107 /mL 내지 2.0 x 104 /mL이고 NK에 대하여 2.0 x 106/mL 내지 3.9 x 103/mL이다. 효과기 세포의 적정 후, 1 x 105 세포/mL의, 100μL 크롬 51-표지된 표적 세포(옵소닌화 또는 비옵소닌화)를 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 이는 초기 효과기표적 비율이 100:1(PBMC) 및 20:1(NK 세포)로 나타났다. 모든 분석은 2벌로 진행하였으며, 각 플레이트는 자발적 용해(무 효과기 세포) 및 총 용해 (표적 세포 + 100μL 1% 나트륨 도데실 설페이트, 1N 나트륨 하이드록사이드) 모두에 대한 대조구를 포함한다. 플레이트는 37℃로 18시간 동안 배양되며, 그 다음 세포 배양물 상청액을 상청액 수거 시스템(Skatron Instrument, Inc.)을 사용하여 수확되고, Minaxi auto-gamma 5000 시리즈 감마 계수기(Packard)로 1분간 계수하였다. 결과는 다음의 공식을 사용하여 백분율 세포독성으로 나타내었다: % 세포독성=(시료 cpm-자발적 용해)/(전체 용해-자발적 용해) x 100.
B. 세포자멸 활성에 대한 선별.
이 분석은 아넥신 V는 포스포스티딜세린(PS)에 대한 고친화도를 지닌다는 사실에 의존한며, 세포의 외부 노출이 세포자멸 프로세스의 초기 확증이다. 종양 세포 항원 발현 세포는 10% 열-불활성화 FBS(Hyclone) 및 2mM L-글루타르닌으로 보충된 둘베코 변형 이글 배지(D-MEM):햄 F-12(50:50) 내에서 배양된다. 종양 항원 발현 종양 세포는 100 x 20 mm 디쉬 내에 3 x 106 /디쉬의 밀도로 제공되며, 밤샘(overnight) 부착되도록 한다. 세포 표면 PS는 구득가능한 아넥신 V 염색제 중의 하나를 사용하여 검출되며, 이는 아넥신 V의 PS에 대한 고 친화도에 기초할 수 있다. 세포 배지가 제거되고, 신선한 배지 단독 또는 10 μg/mL의 단클론 항체를 함유한 배지로 대체된다. 3일 간의 배양 기간 후, 단일층을 PBS로 세척하고, 트립신처리로 부착하였다. 그 다음 세포를 원심분리하고, Ca2+ 결합 완충액으로 재현탁한 뒤, 튜브로 분취하였다. 그 다음 튜브에 표지된 아넥신(예컨대 아넥신 V-FTIC) (1μg/mL)를 담았다. 시료를 FACSCAN™ 흐름 세포분석기 및 FACSCONVERT™, CellQuest 소프트웨어 (Becton Dickinson)를 사용하여 분석하였다. 대조구에 비하여 통계학적으로 의미있는 수준의 아넥신 결합을 유도하는 항체를 세포자멸사-유도 항체로서 선택된다.
실시예 6-대상 항체의 생체 내 특성화.
항체는 종양 형성 및/또는 성장의 예방, 성장의 억제 또는 생성된 종양 크기의 감소, 전이의 억제, 또는 생성된 전이성 병변의 치료 능력에 대하여 생체 내 시험되었다. 각 종양 항원의 유관 종양 모델은 RNA 또는 단백질 발현에 의하여 평가된 종양 세포주 내의 종양 항원 발현에 기초하여 선택되었다. 본원의 종양 세포 항원의 대표적 종양 세포주는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다:
KIAA1815:
T47D 인간 유방
COLO205 인간 결장
HT29 인간 결장
HCT116 인간 결장
LOC157378:
A549 인간 nsclc
FLJ20421:
MDA-MB-435
DSCD74:
KM12 인간 결장
COLO205
GPR16O:
T47D 인간 유방
MCF7 인간 유방
GPCR41:
COLO205 인간 결장
PC3-M-luc 인간 전립선
MDA-MB-435 인간 유방
SLC1A5
COLO205 인간 결장
SW620 인간 결장
A. 종양 형성 또는 성장
평균 체중 20g인 4-7 주령의 면역약화 마우스가 이러한 연구에 사용되었다.
i) 항-종양 세포 항원 항체에 의한 결장직장 암의 치료
인간 결장직장 암 세포주 예컨대 COLO205, KM-12 또는 SW620가 흉선 제거 마우스에 피하 이식되었다(Sheng et al. J. Clin. Invest. 99:2254-2259 (1997)). 이 마우스를 무작위로 군을 형성하고, 종양 이식일에 치료를 개시하였으며, 주당 2회 0.1-50mg/kg의 단클론 대상 항체를 정맥 또는 복강내 주사하여 투여하였다. 종양 넓이 및 길이의 켈리퍼스 측정으로 종양 부피를 계산하였다. 종양 형성 또는 성장이 전술한 실험의 결과로 억제될 것이라고 기대된다.
ii) 항-종양 세포 항원 항체에 의한 유방암의 치료.
인간 유방암 세포주 예컨대 T47D, MCF-7 pr MDA-MB-435가 흉선 제거 마우스에 피하 이식되었다(Sheng et al. J. Clin. Invest. 99:2254-2259 (1997)). 대안적으로 세포는 직접 주사 또는 외과적 이식에 의하여 유선 지방 패드 내에 동소이식되었다. 이러한 종양 모델은 성장에 대한 에스트로겐 의존성이며, 에스트로겐이 보충된 암컷 마우스가 사용된다. 이 마우스를 무작위로 군을 형성하고, 종양 이식일에 치료를 개시하였으며, 주당 2회 0.1-50mg/kg의 단클론 대상 항체를 정맥 또는 복강내 주사하여 투여하였다. 종양 넓이 및 길이의 켈리퍼스 측정으로 종양 부피를 계산하였다. 종양 형성 또는 성장이 전술한 실험의 결과로 억제될 것이라고 기대된다.
iii) 항-종양 세포 항원 항체에 의한 폐암의 치료.
인간 비소세포 폐암주 예컨대 A549가 흉선 제거 마우스에 피하 이식되었다(Sheng et al. J. Clin. Invest. 99:2254-2259 (1997)). 이 마우스를 무작위로 군을 형성하고, 종양 이식일에 치료를 개시하였으며, 주당 2회 0.1-50mg/kg의 단클론 대상 항체를 정맥 또는 복강내 주사하여 투여하였다. 종양 넓이 및 길이의 켈리퍼스 측정으로 종양 부피를 계산하였다. 종양 형성 또는 성장이 전술한 실험의 결과로 억제될 것이라고 기대된다.
iv) 항-종양 세포 항원 항체에의한 전립선암의 치료.
인간 전립선암 세포에 대한 본 발명의 항체의 효과를 인간 전립선 PC-3 또는 PC-M-luc 종양 모델에 대하여 평가하였다. 세포는 수컷 마우스 내로 피하 주사하였다. 마우스를 무작위로 군(각 군내의 n=10)으로 나누고 실험 0일에 본 발명의 항체 또는 아이소타입 MAb 대조구로 정맥 또는 복막내(i.p.) 치료를 개시하였다. 동물은 주 2회 치료되었다. 종양 성장은 주 2회 종양 길이 및 넓이를 캘리퍼스 측정하여 모니터링하였다. 대안적으로, PC-3M luc 세포에 대하여, 주 1 또는 2회 종양내 루시페라아제 신호를 측정하는 Xenogen IVIS 시스템으로 생체발광 영상화를 사용하여 종양 성장이 모니터링되었다.
B. 전이 억제
인간 전립선암세포 전이에 대한 본 발명의 항체의 효과 및 뼈 및 연약 조직 내의 전이 병변의 성장을 인간 전립선 PC-M-luc 종양 모델을 사용하여 평가하였다. 세포는 수컷 마우스 내로 심장내 경로를 통하여 주입되었다. 마우스를 무작위로 군으로 나누고 실험 0일에 본 발명의 항체 또는 아이소타입 MAb 대조구로 정맥 또는 복막내(i.p.) 치료를 개시하였다. 동물은 주 2회 치료되었다. 주 1회 종양내 루시페라아제 신호를 측정하는 Xenogen IVIS 시스템으로 생체발광 영상화를 사용하여 뼈 및 연약 조직 내의 종양 성장이 모니터링되었다. 대안적으로, 동물을 이식 후 1-3주간 Xenogen IVIS (Xenogen 100 시리즈 및 Living Image 2.5 소프트웨어) 시스템을 사용하여 영상화하였으며 및 항체 치료 개시 전의 루시페라아제 신호에 기초하여 무작위 군으로 나누었다. 종양 성장 반응을 주 1회 Xenogen IVIS 영상화로 평가하였다.

Claims (43)

  1. 종양 세포 항원에 결합하는 항체 또는 그것의 절편의 치료적 유효량을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는, 포유류 내의 암을 진단, 검출 또는 치료하는 방법으로서, 암은 정상 인접 조직 시료 또는 풀(pool)을 형성한 정상 조직 시료에 비하여 최소한 3배 증가된 종양 세포 항원을 발현하며, 종양 세포 항원은 KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, 및 SLC1A5의 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체는 인간, 인체 적응형, 키메라 또는 그것의 절편인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그것의 절편.
  3. 제1항에 있어서, 상기 절편은 Fv, F(ab')2, Fab' 및 Fab로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그것의 절편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그것의 절편은 종양 세포 항원의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하며, 상기 종양 세포 항원은 KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, 및 SLC1A5의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그것의 절편.
  5. 제4항에 있어서, 항체는 KIAA1815의 세포외 도메인에 결합하며, 세포외 도메인은 약 1-408 위치, 약 474-489 위치, 약 545-581 위치, 약 603-621 위치, 약 642-653, 및 약 674-904 위치의 아미노산의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그것의 절편.
  6. 제4항에 있어서, 항체는 BC017881의 세포외 도메인에 결합하며, 세포외 도메인은 약 1-117 위치, 약 140-148 위치, 약 165-211 위치, 및 약 230-240 위치의 아미노산의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그것의 절편.
  7. 제4항에 있어서, 항체는 FLJ20421의 세포외 도메인에 결합하며, 세포외 도메인은 약 30-359 위치의 아미노산인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그것의 절편.
  8. 제4항에 있어서, 항체는 DSCD75의 세포외 도메인에 결합하며, 세포외 도메인은 약 20-208 위치의 아미노산인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그것의 절편.
  9. 제4항에 있어서, 항체는 GPR160의 세포외 도메인에 결합하며, 세포외 도메인은 약 1-15 위치, 약 80-93 위치, 약 157-182 위치, 약 263-276 위치의 아미노산의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그것의 절편.
  10. 제4항에 있어서, 항체는 GPCR41의 세포외 도메인에 결합하며, 세포외 도메인 은 약 31-49 위치, 약 104-112 위치, 약 134-145 위치, 약 170-195 위치, 약 212-270 위치, 약 299-307 위치, 약 360-368 위치, 약 390-403 위치 및 약 427-445 위치의 아미노산의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그것의 절편.
  11. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그것의 절편은 면역접합체인 것을 특징으로 하는 포유류 내의 암의 진단, 검출 또는 치료 방법.
  12. 제11항에 있어서, 항-종양 세포 항원 항체 또는 그것의 절편 또는 항종양 세포 항원 항체 융합 단백질 또는 그것의 절편을 포함하는 항체를 포함하며, 상기 항체 성분은 최소한 하나의 진단/검출용 약제 또는 최소한 하나의 치료제에 결합하는 것을 특징으로 하는 진단, 검출 또는 치료용 면역접합체.
  13. 제12항에 있어서, 상기 진단/검출용 약제는 최소한 하나의 광활성 진단/검출용 약제를 포함하며, 상기 광활성 진단용 약제는 크로마겐 또는 염료를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단/검출용 면역접합체.
  14. 제12항에 있어서, 상기 면역접합체는 수술중, 내시경, 또는 혈관내 종양 검출/진단에 사용되는 것을 특징으로 하는 진단/검출용 면역접합체.
  15. 제12항에 있어서, 상기 치료제는 방사선핵종, 붕소, 가돌리늄 또는 우라늄 원자, 면역조절제, 사이토카인, 호르몬, 호르몬 길항제, 효소, 효소 억제제, 광활성 치료제, 세포독성 약물, 독소, 혈관형성 억제제, 다른 항체 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 치료용 면역접합체.
  16. 제15항에 있어서, 상기 세포독성 약물은 약물, 전구약물, 효소 또는 독소인 것을 특징으로 하는 치료용 면역접합체.
  17. 제15항에 있어서, 상기 세포독성 약물은 칼리키마이신 또는 칼리키마이신 유사체, 메이탄신 또는 메이탄신 유도체 또는 아우리스타틴 E 또는 아우리스타틴 E 유도체인 것을 특징으로 하는 치료용 면역접합체.
  18. 제15항에 있어서, 상기 세포독성 약물은 독소 또는 그것의 절편이며, 상기 독소는 식물, 미생물, 및 동물 독소, 및 이들의 합성 변이체로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 치료용 면역접합체.
  19. 제15항에 있어서, 상기 면역조절제는 사이토카인, 줄기 세포 성장 인자, 림프독소, 조혈 인자, 집락 자극 인자(CSF), 인터페론(IFN), 줄기 세포 성장 인자, 에리스로포이에틴, 트롬보포이에틴, 항체 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 치료용 면역접합체.
  20. 제15항에 있어서, 효소는 전구약물-활성화 효소인 것을 특징으로 하는 치료용 면역접합체.
  21. 제20항에 있어서, 전구약물-활성화 효소는 알칼리성 인산분해효소, 아릴설파타아제, 사이토신 디아미나아제, 프로테아제, D-알라닐카르복시펩티다아제, 탄수화물-분해 효소 예컨대 베타-갈락토시다아제 및 뉴라미니다아제, 베타-락타마아제, 페니실린 아미다아제; 및 효소 활성을 지닌 항체의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 치료용 면역접합체.
  22. 종양 세포 항원에 대한 친화도를 보유한 하나 이상의 항원 결합 부위 및 에피토프에 대한 친화도를 보유한 하나 이상의 에피토프 결합 부위를 포함하며, 상기 종양 세포 항원은 KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41 및 SLC1A5의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 다가, 다특이적 항체 또는 그것의 절편.
  23. 제22항에 있어서, 상기 다가, 다특이적 항체 또는 그것의 절편은 인간, 인체 적응형 또는 키메라인 것을 특징으로 하는 다가, 다특이적 항체 또는 그것의 절편.
  24. 제22항에 있어서, 진단/검출용 약제 또는 치료제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 다가, 다특이적 항체 또는 그것의 절편.
  25. 최소한 두개의 항-종양 세포 항원 항체 또는 그것의 절편을 포함하며, 상기 항체 또는 그것의 절편은 제1항에 따른 상기 항-종양 세포 항원 항체 또는 그것의 절편으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 융합 단백질 또는 그것의 절편.
  26. 전술한 항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그것의 절편의 치료적 유효량으로 치료하는 단계를 포함하는 포유류 내의 암을 치료하는 방법으로서, 항체는 치료적으로 허용가능한 제형으로 제형화된 것인 방법.
  27. 약학적으로 허용가능한 운반체 중에 제형화된, 전술한 항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그것의 절편의 진단적 유효량을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 포유류 내의 암을 진단/검출하는 방법.
  28. (i) 전술한 항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그것의 절편을 이들이 필요한 포유류에 투여하는 단계; (ii) 비-결합 단백질의 양이 포유류의 혈류에서 제거되기에 충분한 시간동안 대기하는 단계; 및 (iii) 상기 항체의 결합 부위에 결합하는 진단용 약제, 치료제, 또는 이들의 조합을 포함하는 담체 분자를 상기 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 포유류 내의 암을 진단/검출 또는 치료하는 방법.
  29. 전술한 항 중 어느 한 항에 따른 항-종양 세포 항원 항체 또는 그것의 절편 또는 면역접합체를 암호화하는 핵산을 포함하는 DNA 서열.
  30. 제29항의 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터.
  31. 제30항의 발현벡터를 포함하는 숙주 세포.
  32. (i) 전술한 항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그것의 절편을 포함하는 면역접합체를 포함하는 조성물을 제공하는 단계 및 (ii) 상기 조성물을 이들이 필요한 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 진단/검출용 약제 또는 치료제, 또는 이들의 조합을 표적에 전달하는 방법.
  33. 약학적으로 적합한 부형제 중에 제형화된, 전술한 항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는, 최소한 두 종의 항체 또는 그것의 절편을 포함하는 항체 또는 그것의 절편의 치료적 유효량을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 포유류 내의 암을 치료하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 제1항의 것이 아닌 제2 항체 또는 그것의 절편을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 포유류 내의 암을 치료하는 방법.
  35. 제33항에 있어서, 제1항의 것인 제2 항체 또는 그것의 절편을 추가로 포함하 는 것을 특징으로 하는 포유류 내의 암을 치료하는 방법.
  36. 제33항에 있어서, 상기 제2 항체는 치료제 또는 진단/검출용 약제에 접합되는 것을 특징으로 하는 포유류 내의 암을 치료하는 방법.
  37. 제34항에 있어서, 상기 항-종양 세포 항원 항체 또는 그것의 절편을, 상기 악성종양에 의하여 발현되는 제2 종양 세포 항원에 반응하는 제2 접합된 항체를 상기 포유류에 투여하기 전, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여하는 것을 특징으로 하는 포유류 내의 암을 치료하는 방법.
  38. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-종양 세포 항원 항체는 1회 투약 당 10ng/kg의 포유류 체중 내지 100mg/kg의 포유류 체중의 투약량으로 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 투약량은 반복적으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 전술한 항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 면역접합체의 사용을 포함하는, 포유류 내의 유방암, 전립선암 또는 결장암을 검출 또는 진단하는 방법.
  41. 전술한 항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 면역접합체의 사용을 포함하는, 포유류 내의 유방암, 전립선암 또는 결장암을 치료하는 방법.
  42. 전술한 항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 면역접합체의 사용을 포함하는, 포유류 내의 유방암, 전립선암 또는 결장암을 치료하는 방법으로서, 종양 세포 항원은 KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, 및 SLC1A5의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. d) 전술한 항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그것의 절편, 또는 면역접합체 또는 그것의 절편으로서, 상기 항체 또는 절편은 종양 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있으며, 상기 종양 세포 항원은 KIAA1815, LOC157378, FL320421, DSCD75, GPR160, GPCR41, 및 SLC1A5의 군으로부터 선택되는 항체 또는 그것의 절편, 또는 면역접합체 또는 그것의 절편;
    e) 상기 포유류 내의 상기 암의 진단 또는 검출을 가능하게 하는 검출 방법; 및
    이 키트 사용을 위한 설명서
    를 포함하는 포유류 내의 암 검출 또는 진단용 키트.
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