KR101899426B1

KR101899426B1 - 종양 진단을 위한 퓨린 대사체 하이포잔틴 및 잔틴 농도 분석용 효소 조성물

Info

Publication number: KR101899426B1
Application number: KR1020170064733A
Authority: KR
Inventors: 신동진; 김창현
Original assignee: (주)큐브바이오
Priority date: 2017-05-25
Filing date: 2017-05-25
Publication date: 2018-09-17
Also published as: CN108929895A; WO2018216864A1

Abstract

본 발명은 종양 진단을 위한 퓨린 대사체 농도 검출용 효소 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 소변 내에 존재하는 퓨린 대사체(Purine metabolite) 하이포잔틴(Hypoxanthine) 및 잔틴(Xanthine)의 농도를 검출하기 위한, 잔틴 산화효소(Xanthine Oxidase), 1-메톡시 PMS(1-Methoxy-5-methylphenazinium methylsulfate, MePMS), EZ-cytox (WST-8) 및 포타슘포스페이트 완충용액을 포함하는 효소 조성물에 관한 것이다.

Description

종양 진단을 위한 퓨린 대사체 하이포잔틴 및 잔틴 농도 분석용 효소 조성물{Enzyme Composition for analysing purine metabolite concentration such as hypoxanthine and xanthine for tumor diagnosis}

본 발명은 종양 진단을 위하여 퓨린 대사체인 하이포잔틴 및 잔틴 (이하 퓨린 대사체) 농도 검출용 효소 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 소변 내에 존재하는 퓨린 대사체의 농도를 검출하기 위한, 잔틴 산화효소 (Xanthine Oxidase), 1-메톡시 PMS (1-Methoxy-5-methylphenazinium methylsulfate, MePMS), EZ-cytox (WST-8) 및 포타슘포스페이트 완충용액을 포함하는 효소 조성물에 관한 것이다.

2014년 통계청 발표에 의하면, 국내 모든 암의 발생자는 217,057 명으로 조사 되었으며 암으로 인한 사망자는 76,855 명으로 주요 사망 원인별 사망률 1위라고 발표하였다.

기존의 종양 진단은 침습적이고 고통을 수반하여 기피 및 진단 검사의 어려움이 존재하였다. 이러한 이유로 최소 침습적이고 종양의 조기 및 예후를 예측하는 진단법이 차세대 진단 기법으로 부각되었다.

최근 연구에 의하면, 암 세포의 에너지 대사 및 핵산 합성에 있어 퓨린 대사체의 관련성이 밝혀지고 있다. 암 세포는 정상 세포와 다르게 빠르게 DNA를 합성하고 세포 복제를 한다고 알려져 있으며, 이를 위해서 핵산, 단백질, 아미노산, 포도당 등의 물질이 다량으로 소비를 한다.

퓨린 염기는 핵산의 구성 물질로 육각형 고리를 가지는 방향족성 유기 화합물이다. 퓨린 염기의 생합성은 다양한 경로를 거치게 되며 신생경로(De novo pathway)와 회수 경로(Salvage pathway)로 나뉜다. 신생 경로의 경우 PRPP, 아미노산, ATP, 이산화탄소 등과의 반응을 거쳐서 일어나고, 회수경로는 PRPP와 hypoxanthine의 결합으로 이루어진다.

최근 발표된 논문에 의하면, 암에서는 글루타민의 사용량이 늘어나며 이는 미토콘드리아의 ATP합성에 신생 경로가 발생되어 암세포의 ATP합성을 증가시킨다 보고되었다. 암세포의 특징인 무한 분열을 위해서는 다량의 핵산을 필요로 하고, 신생 경로와 회수 경로의 활발한 반응이 일어나지만, 암세포에서는 글루타민의 사용량이 많아져 신생경로의 생합성 보다 회수 경로의 재사용율이 늘어남에 따라 소변 내 퓨린 대사체의 농도가 감소하는 것으로 사료된다.

한국 공개특허 제2017-0021349호

본 발명의 종양 진단을 위한 퓨린 대사체 검출용 효소 조성물에 있어서 예의 연구 검토한 결과,

일반인과 비교해볼 때 종양 발생 환자의 경우 소변 내에 존재하는 퓨린 대사체의 농도가 낮아져, 상기 퓨린 대사체를 종양 발생 진단용 바이오마커로서 사용할 수 있음을 알아내었다.

따라서, 본 발명의 목적은 피검체의 소변 내에 존재하는 퓨린 대사체를 본 발명에 따른 효소 조성물과 반응시키고, 상기 반응 과정에서 나타나는 색 변화를 흡광도 측정을 통해 소변 내 퓨린 대사체의 농도를 산출하여 종양 발생 여부를 진단할 수 있는 효소 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 효소 조성물을 이용하여 종양 진단을 위한 퓨린 대사체의 농도를 측정하는 방법을 제공하는 것이다.

한편으로, 본 발명은 소변 내에 존재하는 퓨린 대사체의 농도를 검출하기 위한, 잔틴 산화효소 (Xanthine Oxidase), 1-메톡시 PMS(1-Methoxy-5-methylphenazinium methylsulfate, MePMS), EZ-cytox (WST-8) 및 포타슘 포스페이트 완충용액을 포함하는 종양 진단을 위한 퓨린 대사체 검출용 효소 조성물을 제공한다.

다른 한편으로, 본 발명은 피검체의 소변 내에 존재하는 퓨린 대사체 의 농도를 측정하는 방법으로서, 상기 효소 조성물을 이용하여 잔틴 산화효소가 하이포잔틴을 잔틴으로, 잔틴을 요산 (Uric acid)으로 산화시키는 과정에서 발생되는 수소 이온이 상기 EZ-cytox의 구조를 포르마잔 (Formazan) 형태로 변형시키며, 상기 변형 과정에서 색상이 변화하고, 변화된 색상을 흡광도 측정함으로써 소변 내 퓨린 대사체의 농도를 산출하여 종양 발생 여부를 진단하는 것을 특징으로 하는 종양 진단을 위한 퓨린 대사체의 농도 측정방법을 제공한다.

본 발명에 따른 효소 조성물은 소변 내에 존재하는 퓨린 대사체의 농도를 비침습적인 방법으로 검출하여 체내 종양 (악성 또는 양성) 발생 여부를 조기에 진단할 수 있다. 따라서, 치료의 방향과 정도를 예측할 수 있으므로 효과적인 치료는 물론 막대하게 지출될 수 있는 종양의 치료비를 감소할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 효소 조성물은 종래 사용되는 장비 (핵자기공명(NMR), 크로마토그래피, 질량분석기 등)을 이용하지 않으므로, 실험자의 편차나 소변 샘플의 전처리 등 일련의 과정 없이 보다 용이하게 종양 발생 여부를 진단할 수 있다.

도 1은 분석적 성능을 확인한 그래프이다.
도 2은 검출한계, 정량한계 및 직진성을 확인한 그래프이다.
도 3는 임상적 성능(췌장암)을 확인한 그래프이다.
도 4은 임상적 성능(대장암)을 확인한 그래프이다.
도 5는 키트의 형태에 관한 사진이다.
도 6는 xanthine oxidase expression vector map 이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 소변 내에 존재하는 퓨린 대사체의 농도를 검출하기 위한, 잔틴 산화효소(Xanthine Oxidase), 1-메톡시 PMS(1-Methoxy-5-methylphenazinium methylsulfate, MePMS), EZ-cytox(WST-8) 및 포타슘포스페이트 완충용액을 포함하는 종양 진단을 위한 퓨린 대사체 검출용 효소 조성물에 관한 것이다.

상기 포타슘포스페이트 완충용액은 NP-40을 추가로 포함할 수 있다.

상기 EZ-cytox는 수용성의 tetrazolium salt를 이용한 세포증식 / 독성 측정 키트이다.

상기 효소 조성물은 췌장암, 대장암 등의 진단에 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 대해 구체적으로 설명하면, 퓨린 대사체인 하이포잔틴과 잔틴은 잔틴 산화효소로 인해 각각 잔틴, 요산으로 산화된다 (그림 1 참조). 이 과정에서 아래 반응식 1과 같이 2개의 산소와 2개의 수소가 발생한다.

[그림 1]

[반응식 1]

R-H + H₂O + 2O₂ -> ROH + 2O² ^- + 2H⁺

상기 반응 과정에서 생성된 수소 이온은 EZ-cytox (WST-8, water soluble tetrazolium salt)의 구조를 포르마잔(Formazan) 형태로 변형시킨다(그림 2 참조).

[그림 2]

상기 과정에서 원래 EZ-cytox (WST-8)의 색은 옅은 주황색을 나타내나, 포르마잔 형태로 변형되면서 진한 주황색을 나타내게 된다. 또한, 상기 수소 이온이 EZ-cytox와 반응할 수 있도록 하는 것이 1-메톡시 PMS (1-Methoxy-5-methylphenazinium methylsulfate, MePMS)인데, 상기 1-메톡시 PMS가 색상을 유도하는 역할을 한다(그림 3 참조).

[그림 3]

상기 하이포잔틴 및 잔틴이 요산으로 산화되는 과정에서 발생되는 수소 이온의 수는 구조가 변형된 EZ-cytox Formazan의 수와 동일하고, 즉 하이포잔틴 및 잔틴의 농도와 동일하다.

따라서, 나타나는 색상이 진한 주황색을 나타낼수록 변형된 포르마잔 구조가 많음을 의미하고, 산화 과정에서 수소 이온이 많이 생성되었음을 의미하며, 이는 체내 퓨린 대사체의 농도가 높음을 의미하므로, 이러한 결과는 주로 종양이 발생하지 않은 일반인에게서 나타날 수 있다.

반면, 나타나는 색상이 옅은 주황색을 나타낼수록 변형된 포르마잔 구조가 많지 않음을 의미하고, 이는 산화 과정에서 수소 이온이 적게 생성되었기 때문이며, 즉 체내 하이포잔틴 및 잔틴의 농도가 낮음을 의미하므로, 이러한 결과는 주로 종양이 발생한 환자에게서 나타날 수 있다.

따라서, 상기 반응은 수소 이온에 의해서 변형된 포르마잔의 농도를 측정함으로써 간접적으로 퓨린 대사체의 농도를 측정하는 방법이며, 소변에는 다양한 물질과 pH로 인해 반응의 정확도는 떨어지나, 본 발명에서는 반응 조성물의 최적화를 통하여 이를 극복하였다.

본 발명에 따른 종양 진단을 위한 퓨린 대사체 농도 측정방법은

피검체의 소변 내에 존재하는 퓨린 대사체의 농도를 측정하는 방법으로서,

상기 효소 조성물을 이용하여 잔틴 산화효소가 하이포잔틴을 잔틴으로, 잔틴을 요산(Uric acid)으로 산화시키는 과정에서 발생되는 수소 이온이 상기 EZ-cytox의 구조를 포르마잔(Formazan) 형태로 변형시키며, 상기 변형 과정에서 색상이 변화하고, 변화된 색상을 흡광도 측정함으로써 소변 내 하이포잔틴 및 잔틴의 농도를 산출하여 종양 발생 여부를 진단하는 것을 특징으로 한다.

상기 색상이 옅은 주황색을 나타내는 경우 흡광도는 450 nm에서 0.654 ± 0.0616 (Mean ± SEM) 로, 상기 색상이 진한 주황색을 나타내는 경우 흡광도는 450 nm에서 2.02 ± 0.175 (Mean ± SEM)로 수치화할 수 있다.

본 발명의 일 실시형태에서, 상기 측정방법은 피검체의 임상정보, 예를 들면 임상병리학적 검사, 영상의학적 검사와 같은 방법에 의해 수득된 결과가 추가로 사용될 수 있다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오직 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업자에게 있어서 자명하다.

제조예 1: 잔틴 산화효소의 제조

xanthine oxidase는 Bos taurus xanthine dehydrogenase (XDH), Accession No. NM_173972.2에서 oxidase 부분의 유전자를 확보하고 대장균에서 단백질 발현 및 발현하여 사용하였다 (도 6 참조).

(1) Xanthine oxidase 유전자 확보 단계

NCBI gene bank의 Accession No. NM_173972.2인 Bos taurus xanthine dehydrogenase을 기반으로 IDT (Integrated Device Technoligy, INC.,USA)에서 발현 균주인 E.coli (Escherichia coli)에서 최적화 된 코던으로 합성하였다. 합성된 유전자는 5‘ Not I, 3’ NdeI으로 하여 pUCIDT-kan vector에 삽입하였다.

Xanthine oxidase 효소는 상기 방법으로 확보된 유전자를 pET24a 벡터에 삽입하여 6x His 가 C-말단에 부착된 융합단백질 형태로 제작하였고, BL21 (DE3) 대장균에 형질전환시켜 단백질을 제조하였다(도 6 참조). 그 과정은 아래와 같다.

상기 반응에 사용된 프라이머쌍의 정보는 하기 표 1과 같다.

구분		염기서열
Xanthine oxidase	순방향 프라이머	GGGAATTCCATATGGATACGGTCGGGAGACCG (서열목록 1)
Xanthine oxidase	역방향 프라이머	CCGCTCGAGctaCGTGGTAAACTTATCCACGCAAG (서열목록 2)

(2) 형질전환 대장균 배양단계

a. pET24a 벡터의 NdeI, XhoI 제한효소 site에 xanthine oxidase 유전자를 삽입함으로써 6x His 융합 단백질을 생산하는 재조합DNA를 완성하였다.

b. 생산된 재조합 DNA를 BL21(DE3) 대장균에 형질전환 하였다.

c. 해당 대장균주를 3 L LB(Luria broth) 배양액에서 16 ℃, 200 rpm 하에서 OD600 ~ 0.7까지 배양 후 0.1M IPTG 를 처리하여 단백질생산을 유도하였다.

(3) 대장균 파쇄 단계

a. 배양된 대장균을 원심분리기로 침전 후, 상등액은 버리고 침전된 대장균을 200 ml PBS로 재부유 시켰다가 원심분리기로 침전시킴으로써 세척과정을 수행하였다.

b. 침전된 대장균에 40 ml- 0.5 M NaCl, 5mM imidazole, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9;를 넣고 재부유 시켰다.

c. 초음파 세포파쇄기에서 대장균을 Energy 38% max, total cell breaking time 10 분(2초 sonic treatment/4초 pause) 조건 하에서 파쇄하였다. 대장균 샘플을 담은 병은 세포파쇄과정동안 얼음에 담긴 상태를 유지하였다.

d. 파쇄된 대장균은 13000 rpm, 30분, 4 ℃ 조건에서 원심분리 하였다.

e. 원심분리 후 상등액만 conical tube에 모아두었다.

(4) Ni-NTA Agarose resin을 이용한 his tag-융합단백질 정제

a. 위의 단계에서 얻어진 수용성 단백질이 포함된 상등액을 Ni-NTA Agarose resin 과 혼합하고 30분간 4 ℃ 조건하에서 흔들어 주면서 his tag-융합단백질과 Ni-NTA Agarose resin이 서로 결합하도록 유도하였다.

b. 수용성 단백질이 포함된 상등액과 resin 혼합액을 컬럼에 투입하고 컬럼 코크를 열어 중력방식으로 액체를 분리하였다.

c. Washing buffer (0.5 M NaCl, 60mM imidazole, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9) 400 ml을 통과시켜 불순물과 융합단백질 이외의 단백질을 제거하였다.

d. Elution buffer (0.25 M NaCl, 500mM imidazole, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9) 3 ml을 투입하고 10분간 방치한 후 단백질을 회수하였다.

e. d 과정을 2회 반복하였다.

(5) FPLC-size exclusion법을 이용한 단백질 정제

a. 회수된 단백질을 superdex S200 (GE healthcare) 컬럼이 장착된 FPLC에 투입하고 단백질을 크기에 따라 분리하였다.

b. 얻어진 fraction샘플들 가운데 his tag 융합단백질에 해당하는 fraction을 polyacrylamide gel electrophoresis 법으로 확인하고 최종적으로 원하는 his tag 융합단백질을 확보하였다.

c. Abs 280값을 측정하고 얻어진 값으로부터 단백질 농도를 환산하여 하기 표 2에 기재하였다.

구분	단백질 농도(OD₂₈₀nm)	효소 활성
1 mg xanthine oxidase/ml	2.42	2.7 μU

Xanthine oxidase DNA sequence 및 Xanthine oxidase protein sequence는 각각 서열목록 3 및 4로 첨부하였다.

또한, 본 발명에서 사용되는 1-메톡시 PMS(1-Methoxy-5-methylphenazinium methylsulfate, MePMS), EZ-cytox (WST-8), 포타슘포스페이트 완충용액 및 NP-40의 구입처는 아래 표 3에 기재하였다.

품명	회사	카탈로그 넘버
EZ-cytox	㈜대일랩서비스	EZ-3000
1-Methoxy PMS	Dojindo Molecular Technologies, Inc.	M003
Potossium phosphate monobasic	덕산약품	432
NP-40, 70% in H2O	Sigma Aldrich	NP-40S

실시예 1: 효소 조성물의 제조

하기 표 4에 작성한 바와 같이, 효소 활성(enzyme activity)이 7.5 μunit/μl인 잔틴 산화 효소(xanthine oxidase) 1 ㎕에 각각 전체 반응 볼륨(100 ㎕)의 10% EZ-Cytox와 0.5% MePMS Mix solution 10.5 ㎕, 0.1% NP-40이 함유된 50 mM potassium Phosphate buffer pH 7.5 Mix solution을 38.5 ㎕ 넣어 효소 반응 조성물 (Reaction mixture) 총 50 ㎕을 제조하였다.

Reaction mixture	Volume (50 ㎕)
50 mM potassium Phosphate buffer pH7.5	38.5 ㎕
0.1% NP-40	38.5 ㎕
Xanthine oxidase (7.5 μunit/ml)	1 ㎕
10% EZ-Cytox	10.5 ㎕
0.5% 1-Methoxy PMS	10.5 ㎕

실시예 2: 소변 시료 채취

정상인과 종양 환자의 소변 채취는 동일하며 다음과 같이 수행하였다.

아침 기상 후 첫 소변을 채취함에 있어 요도로부터 흘러나오는 처음 소변은 채취하지 않으며, 중간 소변에서 샘플을 채취하였다.

실험예 1: 퓨린 대사체의 농도 측정

소변 내에 존재하는 퓨린 대사체의 농도를 측정하기 위해 채취된 정상인과 종양 환자의 소변 각각 50 ㎕를 상기 실시예 1의 효소 반응 조성물과 반응시켰다 (각각 총 100 ㎕). 반응물은 실온(25 ℃)에서 차광하여 5분간 반응시키고 ELISA reader를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 소변 내 농도를 산출하였다. 그 결과를 아래 표 5에 기재하였다.

구분	Optical Density(Mean ± SEM)	평균의 차이(Mean ± SEM)	95% CI
정상인소변	2.02 ± 0.175	1.37 ± 0.161	1.05 to 1.69
종양환자소변	0.654 ± 0.0616	1.37 ± 0.161	1.05 to 1.69

상기 표 5에서 보듯이, 효소 반응 조성물과 반응하여 산출된 퓨린 대사체의 농도를 정상인의 소변과 종양 환자의 소변과 비교했을 때, 정상인의 소변은 진한 주황색을 나타내는 반면, 종양 환자의 소변은 옅은 주황색을 띄고 있는 것을 확인하였다.

이를 통해, 종양 환자의 소변에서 퓨린 대사체의 농도는 감소됨을 알 수 있었다.

실험예 2: 분석적 성능 확인

본 발명의 효소 조성물의 분석적 성능을 확인하기 위하여 직선성(linearity), 검출한계 (Limit Of Detect, LOD), 정량한계(Limit Of Quantitation, LOQ), 변동계수(Coefficient of Variation, CV) 등의 항목으로 분석법 검증(validation)을 실시하였다. 본 과정은 효소 조성물이 퓨린 대사체의 농도 의존적으로 반응이 잘 되는지를 검증하는 과정으로, 간략히 설명하면 다음과 같다.

직진성은 퓨린 대사체 농도 의존적으로 효소 반응이 되고 선형회귀 분석을 통해 검증하는 방법이다. 검출 한계와 정량 한계는 본 발명의 효소 조성물의 퓨린 대사체의 검출 능력을 검증하는 방법이다. 변동 계수는 직진성 실험을 3회 반복 후 편차를 보는 과정이다.

분석적 성능을 검증하기 위하여, 퓨린 대사체의 검량선을 그리기 위한 농도로 0, 2, 4, 8, 16, 32 μM 농도의 범위를 설정하였다. 퓨린 대사체의 회귀직선은 y = 0.0013x - 0.0001 , 상관계수 R²(coefficient of correlation)가 0.9987로써 좋은 직선성 (Linearity)을 나타냈고(도 1), LOD (32 μM), LOQ (0, 2, 4, 8, 16, 32 μM), CV(2.8%)를 나타내었다(도 2).

실험예 3: 임상적 성능 확인

본 발명의 효소 조성물을 이용하여 정상인 33명, 췌장암 환자 48명, 대장암 환자 32명의 실험을 진행 하였으며, 임상 시험에 참여한 사람들은 나이, 성별, 암의 종류, 암의 기수, 병리학적 소견, 영상 의학적 소견, 주치의 소견 등으로 분류하여, 본 발명의 효소 조성물을 통한 진단과 비교 하였다(서울 아산병원 연구임상, IRB-20160815).

그 결과 도 3, 4에 나타낸 바와 같이, 퓨린 대사체 농도는 췌장암, 대장암 환자에서 정상인에 비해 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 도 3, 4 에 나타낸 각각의 ROC 곡선에 대한 내용을 아래 표 6에 기재하였다.

암종	Pvalue	AUC	특이도	민감도	우도비
췌장암	< 0.0001	0.9272	90.32%	78.72%	8.13
대장암	< 0.0001	0.9366	90.32%	82.76%	8.55

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 본 발명이 속한 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아님은 명백하다. 본 발명이 속한 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주 내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.

따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 특허청구범위와 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> CUBEBIO <120> The diagnosis method for tumor by purine metabolite concentration analysis such as hypoxanthine and xanthine <130> DP18800 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 32 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Xanthine Oxidase primer <400> 1 gggaattcca tatggatacg gtcgggagac cg 32 <210> 2 <211> 35 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Xanthine Oxidase primer <400> 2 ccgctcgagc tacgtggtaa acttatccac gcaag 35 <210> 3 <211> 2235 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Xanthine Oxidase DNA Sequence <400> 3 gatacggtcg ggagaccgct gcctcacttg gctgcagcga tgcaggccag tggagaggct 60 gtatattgtg acgacatacc gcggtatgag aatgaattat ttttacgctt ggttacgtcc 120 acacgcgccc acgctaaaat taaaagcata gatgtctccg aagctcaaaa ggtacctggt 180 tttgtgtgtt ttttatcggc ggatgacata ccaggcagta atgaaacagg tcttttcaat 240 gacgagacag tcttcgcgaa agacactgtc acgtgtgtag ggcacataat tggtgccgtt 300 gtcgctgaca caccggagca tgctgagcgc gcggctcatg tagtgaaagt aacttatgag 360 gaccttccag caataatcac 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aagtcggagg tagacaagtt taataaggag 1260 aattgttgga aaaagagagg actgtgcatt attccaacaa aatttggtat atcgtttacc 1320 gtaccctttt taaatcaagc aggagccttg atccatgtgt atacagatgg ttccgttctg 1380 gtaagtcacg gcggaacaga gatggggcaa ggtttacaca ctaagatggt acaagttgct 1440 agtaaagctc tgaagattcc tatatccaag atttatataa gcgaaacatc taccaacacg 1500 gttcctaaca gttcgccgac agcggcgtcg gtgagtacag atatctacgg acaggcggtc 1560 tatgaggctt gtcaaacgat acttaagcgc ttggagccct ttaagaaaaa aaatccggac 1620 ggaagttggg aggattgggt catggcggca taccaagata gagtaagtct ttccacgacg 1680 ggattctatc gtaccccaaa cctgggatat tcctttgaaa ccaactcagg taatgctttt 1740 cattatttta catacggtgt ggcatgcagc gaggtggaaa ttgattgttt aaccggagac 1800 cacaagaacc tgcgcaccga cattgttatg gatgtgggtt cctccttaaa tcccgccata 1860 gatatcggcc aggtagaagg tgcatttgtc caaggtttag gtctgttcac actggaggag 1920 cttcattact ctccagaagg ctcccttcac acgcggggac cctcaacata taaaattccg 1980 gcattcggtt ctattccgac ggagtttaga gtttctttgt tgcgcgactg cccgaacaag 2040 aaggccatct atgcttctaa agcggtcggg gagcccccgt tgttcctggg tgcgagcgtg 2100 ttttttgcaa tcaaggacgc tatacgcgcg gctagagcgc agcatactaa taacaatacg 2160 aaggaactgt tccgcctgga tagcccggcc acgcccgaaa aaatccggaa tgcttgcgtg 2220 gataagttta ccacg 2235 <210> 4 <211> 645 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Xanthine Oxidase Protein Sequence <400> 4 Val Ala Asp Thr Pro Glu His Ala Glu Arg Ala Ala His Val Val Lys 1 5 10 15 Val Thr Tyr Glu Asp Leu Pro Ala Ile Ile Thr Ile Glu Asp Ala Ile 20 25 30 Lys Asn Asn Ser Phe Tyr Gly Ser Glu Leu Lys Ile Glu Lys Gly Asp 35 40 45 Leu Lys Lys Gly Phe Ser Glu Ala Asp Asn Val Val Ser Gly Glu Leu 50 55 60 Tyr Ile Gly Gly Gln Asp His Phe Tyr Leu Glu Thr His Cys Thr Ile 65 70 75 80 Ala Ile Pro Lys Gly Glu Glu Gly Glu Met Glu Leu Phe Val Ser Thr 85 90 95 Gln Asn Ala Met Lys Thr Gln Ser Phe Val Ala Lys Met Leu Gly Val 100 105 110 Pro Val Asn Arg Ile Leu Val Arg Val Lys Arg Met Gly Gly Gly Phe 115 120 125 Gly Gly Lys Glu Thr Arg Ser Thr Leu Val Ser Val Ala Val Ala Leu 130 135 140 Ala Ala Tyr Lys Thr Gly His Pro Val Arg Cys Met Leu Asp Arg Asn 145 150 155 160 Glu Asp Met Leu Ile Thr Gly Gly Arg His Pro Phe Leu Ala Arg Tyr 165 170 175 Lys Val Gly Phe Met Lys Thr Gly Thr Ile Val Ala Leu Glu Val Asp 180 185 190 His Tyr Ser Asn Ala Gly Asn Ser Arg Asp Leu Ser His Ser Ile Met 195 200 205 Glu Arg Ala Leu Phe His Met Asp Asn Cys Tyr Lys Ile Pro Asn Ile 210 215 220 Arg Gly Thr Gly Arg Leu Cys Lys Thr Asn Leu Ser Ser Asn Thr Ala 225 230 235 240 Phe Arg Gly Phe Gly Gly Pro Gln Ala Leu Phe Ile Ala Glu Asn Trp 245 250 255 Met Ser Glu Val Ala Val Thr Cys Gly Leu Pro Ala Glu Glu Val Arg 260 265 270 Trp Lys Asn Met Tyr Lys Glu Gly Asp Leu Thr His Phe Asn Gln Arg 275 280 285 Leu Glu Gly Phe Ser Val Pro Arg Cys Trp Asp Glu Cys Leu Lys Ser 290 295 300 Ser Gln Tyr Tyr Ala Arg Lys Ser Glu Val Asp Lys Phe Asn Lys Glu 305 310 315 320 Asn Cys Trp Lys Lys Arg Gly Leu Cys Ile Ile Pro Thr Lys Phe Gly 325 330 335 Ile Ser Phe Thr Val Pro Phe Leu Asn Gln Ala Gly Ala Leu Ile His 340 345 350 Val Tyr Thr Asp Gly Ser Val Leu Val Ser His Gly Gly Thr Glu Met 355 360 365 Gly Gln Gly Leu His Thr Lys Met Val Gln Val Ala Ser Lys Ala Leu 370 375 380 Lys Ile Pro Ile Ser Lys Ile Tyr Ile Ser Glu Thr Ser Thr Asn Thr 385 390 395 400 Val Pro Asn Ser Ser Pro Thr Ala Ala Ser Val Ser Thr Asp Ile Tyr 405 410 415 Gly Gln Ala Val Tyr Glu Ala Cys Gln Thr Ile Leu Lys Arg Leu Glu 420 425 430 Pro Phe Lys Lys Lys Asn Pro Asp Gly Ser Trp Glu Asp Trp Val Met 435 440 445 Ala Ala Tyr Gln Asp Arg Val Ser Leu Ser Thr Thr Gly Phe Tyr Arg 450 455 460 Thr Pro Asn Leu Gly Tyr Ser Phe Glu Thr Asn Ser Gly Asn Ala Phe 465 470 475 480 His Tyr Phe Thr Tyr Gly Val Ala Cys Ser Glu Val Glu Ile Asp Cys 485 490 495 Leu Thr Gly Asp His Lys Asn Leu Arg Thr Asp Ile Val Met Asp Val 500 505 510 Gly Ser Ser Leu Asn Pro Ala Ile Asp Ile Gly Gln Val Glu Gly Ala 515 520 525 Phe Val Gln Gly Leu Gly Leu Phe Thr Leu Glu Glu Leu His Tyr Ser 530 535 540 Pro Glu Gly Ser Leu His Thr Arg Gly Pro Ser Thr Tyr Lys Ile Pro 545 550 555 560 Ala Phe Gly Ser Ile Pro Thr Glu Phe Arg Val Ser Leu Leu Arg Asp 565 570 575 Cys Pro Asn Lys Lys Ala Ile Tyr Ala Ser Lys Ala Val Gly Glu Pro 580 585 590 Pro Leu Phe Leu Gly Ala Ser Val Phe Phe Ala Ile Lys Asp Ala Ile 595 600 605 Arg Ala Ala Arg Ala Gln His Thr Asn Asn Asn Thr Lys Glu Leu Phe 610 615 620 Arg Leu Asp Ser Pro Ala Thr Pro Glu Lys Ile Arg Asn Ala Cys Val 625 630 635 640 Asp Lys Phe Thr Thr 645

Claims

소변 내에 존재하는 퓨린 대사체(Purine metabolite) 하이포잔틴 (Hypoxanthine) 및 잔틴(Xanthine)의 농도를 검출하기 위한, 잔틴 산화효소 (Xanthine Oxidase), 1-메톡시 PMS (1-Methoxy-5-methylphenazinium methylsulfate, MePMS), WST-8 (2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium-monosodium salt) 및 포타슘포스페이트 완충용액을 포함하되,
상기 포타슘포스페이트 완충용액은 노닐 페녹시폴리에톡시에탄올-40(nonyl phenoxypolyethoxylethanol-40, NP-40)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 진단을 위한 퓨린 대사체 농도 검출용 효소 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 조성물이 소변과 반응시 나타나는 색상을 흡광도 측정함으로써 소변 내 퓨린 대사체의 농도를 산출하여 종양 발생 여부를 진단하는 것을 특징으로 하는 종양 진단을 위한 퓨린 대사체 농도 검출용 효소 조성물.
종양 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 피검체의 소변 내에 존재하는 퓨린 대사체의 농도를 측정하는 방법으로서,
제1항에 따른 효소 조성물을 이용하여 잔틴 산화효소가 하이포잔틴을 잔틴으로, 잔틴을 요산으로 산화시키는 과정에서 발생되는 수소 이온이 상기 WST-8의 구조를 포르마잔 형태로 변형시키며, 상기 변형 과정에서 색상이 변화하고, 변화된 색상을 흡광도 측정함으로써 소변 내 퓨린 대사체의 농도를 산출하여 종양 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 피검체의 소변 내 퓨린 대사체의 농도를 측정하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 변화된 색상이 옅은 주황색을 나타낼수록 발생된 수소 이온 수가 적어 포르마잔 형태로 변형되지 못했다는 것을 의미하고, 이는 피검체의 체내 하이포잔틴 및 잔틴의 농도가 낮으므로 종양이 발생함을 진단하는 것을 특징으로 하는 종양 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 피검체의 소변 내 퓨린 대사체의 농도를 측정하는 방법.