CN109439747B - 一组用于肺癌诊断的circRNA标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肿瘤基因检测技术领域，具体涉及一组用于肺癌诊断的circRNA标志物及其应用。本发明提供的标志物包括hsa_circRNA_104600和hsa_circRNA_105013，本发明还提供上述标志物的引物组合。本发明为肺癌的诊断提供参考数据，所提供的circRNA生物标志物对肺癌具有很高的灵敏性和特异性，可以作为新型的生物标志物用于肺癌的检测。

Description

一组用于肺癌诊断的circRNA标志物及其应用

技术领域

本发明涉及肺癌基因检测技术领域，具体涉及一组用于肺癌诊断的circRNA标志物及其应用。

背景技术

根据世界卫生组织(worldhealthorganization，WHO)发布的《全球癌症报告2014》可知，肺癌是世界上高发的恶性肿瘤之一，亚洲尤盛。2017美国癌症报告显示,在2017年美国癌症预估发病率方面，男、女新发病例中，肺癌均高居第二位，并且，肺癌仍是美国癌症致死的首要原因，超过1/4的癌症死亡患者的死因为肺癌。在中国，数据统计显示2015年有73.3万的肺癌新发病例，同时有61万人死于肺癌，肺癌的发病率在男性癌症病人中居于首位，而在女性癌症病人中居第二位，无论是在男性或女性中，肺癌也是造成癌症致死的主要原因。近年来，尽管对于肺癌的治疗手段已取得了进展，但肺癌的5年生存率仍低于15％。

环状RNA(circularRNA，circRNA)是一种新发现的环形结构RNA，其在真核细胞中广泛表达，具有跨物种保守性，并具有时间和组织表达特异性。大多数circRNAs是由蛋白编码基因首尾共价连接而成的闭合环状结构，这样的环状结构使得circRNAs可以抵抗RNA酶的水解作用，这使得circRNAs比线性RNA更为稳定，同时，circRNAs不可依赖于5端的帽子结构来翻译蛋白。

CircRNA因具有稳定性、时间、空间表达特异性等特性，使得circRNA更有潜力成为疾病诊断的潜在分子标志物。已有研究表明，circRNAs的表达异常与包括肿瘤在内的多种疾病有关。例如，一项研究证实hsa_circRNA_0047905，hsa_circRNA_0138960和has_circRNA_7690-15在胃癌组织中显著上调，体外抑制这些circRNAs能抑制胃癌细胞增殖、侵袭能力，这些均提示hsa_circRNA_0047905，hsa_circRNA_0138960和has_circRNA_7690-15可能在胃癌的形成过程中发挥作用。已有研究证明hsa_circRNA_0001785可能对乳腺癌的诊断具有一定的价值。其他报道也显示circRNAs在肺腺癌、结直肠癌、肝癌等肿瘤的发展中具有重要的作用。然而，circRNAs是否在肺癌发病过程中发挥作用尚不清楚。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一组用于肺癌诊断的circRNA标志物及其应用，为肺癌的诊断提供参考数据，本发明提供的circRNA生物标志物对肺癌具有很高的灵敏性和特异性，可以作为新型的生物标志物用于肺癌的检测。

为了达到上述目的，本发明的技术方案是：

本发明提供一组用于肺癌诊断的circRNA标志物，包括SEQ ID No.1所示的hsa_circRNA_104600和SEQ ID No.2所示的hsa_circRNA_105013两种circRNAs。

上述标志物在制备诊断肺癌患者的试剂盒或试剂中的应用。

上述标志物在诊断肺癌的circRNA芯片中的应用。

上述标志物在制备或筛选肺癌靶向药物中的应用。

本发明还提供一组用于肺癌诊断的circRNA标志物的引物组合，所述引物组合包括针对hsa_circRNA_104600的特异性引物和针对hsa_circRNA_105013的特异性引物；

进一步，上述针对hsa_circRNA_104600的特异性引物包括如SEQ ID No.3所示的上游引物，如SEQ ID No.4所示的下游引物；上述针对hsa_circRNA_105013的特异性引物包括如SEQ ID No.5所示的上游引物，如SEQ ID No.6所示的下游引物。

上述circRNA标志物的引物组合在制备诊断肺癌的试剂盒或试剂中的应用。

上述circRNA标志物的引物组合在制备或筛选肺癌靶向药物的应用。

本发明还提供一种诊断肺癌的试剂盒，其中包括上述的circRNA标志物的引物的任意一种或两种。

有益效果：

(1)本发明通过基因芯片技术和RT-qPCR技术，筛选出用于检测肺癌的生物标志物，通过上述两种方法联合筛选的生物标记物，在肺癌发生时表达量变化差异性大，利于应用于临床检测；

(2)针对两种筛选出的生物标记物的特异性引物，其具有特异性强和敏感性高等优点，通过RT-qPCR技术，可以准确地检测出所筛选的生物标志物的含量；

(3)两种筛选出的生物标志circRNAs在肺癌发生时表达量发生显著的变化，在制备或筛选肺癌靶向药物中具有应用价值。

(4)两种筛选出的生物标志circRNAs在制备诊断肺癌患者的试剂盒或试剂方面具有应用价值。

附图说明

图1是RNA变性琼脂糖凝胶电泳图(泳道内为部分提取的RNA)；

图2是样本芯片扫描后的箱图(图中：Ⅰ-A、Ⅱ-A、ⅢA/Ⅰ-P、Ⅱ-P、Ⅲ-P分别表示I期、II期、III期癌组织/癌旁组织)；

图3是样本芯片扫描后的火山图(垂直线相当于肺癌组织相较于癌旁组织的2倍上调或下调，水平线代表P值)；

图4是I、II、III期肺癌标本共有的显著差异表达的circRNAs的数量统计图；

图5是候选circRNAs的RT-qPCR产物琼脂糖凝胶电泳图(每个样本重复两次电泳，每图最左边是marker)；

图6是肺癌和癌旁的候选circRNA的相对表达量统计图(LCXW：肺癌组织；Normal：癌旁组织)；

图7是候选circRNA的表达量芯片检测结果与RT-qPCR结果比较图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一：

肺癌circRNAs标志物的初步筛选

1实验对象

收集2011年9月到2015年12月昆明医科大学第一附属医院并且胸外科病理学诊断为肺癌的癌组织及癌旁组织，患者术前未接受过化疗和放疗。收集患者年龄、性别、吸烟史、肿瘤大小、肿瘤分期、是否发生淋巴结转移及肿瘤类型等临床资料。本实验经昆明医科大学伦理委员会审查批准。

2实验方法

2.1样品RNA抽提及质量检测

样品RNA用TRIZOL法提取，溶解后保存于-80℃；利用紫外吸收法和凝胶电泳法检测所提取的RNA质量；线性转录本去除效率评估：将totalRNA分为等量2份，1份采用RNaseR处理，另一份不作处理。经过纯化和反转录后，用荧光定量PCR检测GAPDH和circRNA-7表达。RNaseR处理组GAPDH基因PCR的Ct值远大于未处理组，circRNA-7Ct值变化明显小于GAPDH基因。

2.2 cDNA/aRNA样品合成和标记

采用ArraystarSuperRNALabelingKit试剂盒(美国Arraystar公司)，将RNaseR处理后的RNA用随机引物反转录为带有T7promoter的cDNA序列，再将cDNA转录为荧光标记的cRNA序列。

2.3芯片杂交

将26对LCXW样本分别提取RNA后，按照分期(Ⅰ期：10/26；Ⅱ期：9/26；Ⅲ期：7/26)及组织来源(癌和癌旁)分为6组，每组内各样本混合后利用ArraystarHumancircRNAArrayV2分析circRNAs表达情况。在标准条件下将标记好的探针和高密度基因组芯片进行杂交。

2.4图像采集

使用GenePix4000B芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度，并将实验结果转换成数字型数据保存，使用配套软件对原始数据进行分析运算。

2.5数据分析及靶miRNA预测

2.8.1表达谱数据

使用R软件中的limma包对原始数据进行标准化和后续数据处理。在对原数据进行标准化处理后，进行了低强度滤波，并保留了6个样本中至少有3个样本的标志为“P”或“M”(所有目标值)，以做进一步分析。

2.8.2差异表达数据

每一个circRNA在每组的差异倍数(foldchange)用于比较两组表达谱差异，t检验用于评估显著性差异。circRNAs的差异倍数(FC)≥2.0且P≤0.05被认为是显著差异表达。我们可以通过差异倍数和P值等来筛选显著差异表达的circRNAs。

2.8.3 circRNA/miRNA相互作用的注释

最近的研究表明环状RNAs可通过吸附miRNA，从而微调miRNA介导调控的基因表达，circRNAs与疾病相关miRNA的相互作用表明circRNAs在疾病调控中具有重要作用。比如，环状RNAciRS-7具有多样的miRNA-7结合位点，因此可作为内源性miRNA海绵吸附miRNA-7，由此阻断正常miRNA-7的正常功能。为进行显著差异表达的circRNAs的靶miRNA预测，以便进行后续研究，我们用以TargetScan和miRanda为基础的Arraystar'shome-mademiRNAtarget预测软件来预测circRNA/miRNA之间的作用，并对所有显著差异表达的circRNAs的预测靶miRNA进行了详细注释。

2.8.4筛选候选circRNAs

根据差异倍数(FC)≥2，RawIntensity≥200，及circRNAs长度在200～2000bp之间，P值越小越好，再结合circRNAs的预测靶miRNAs或宿主基因已有报道证实与癌症的发生的相关，来筛选有价值的circRNAs进行后续研究。

3实验结果

3.1芯片标本统计信息如表1所示：

表1芯片样本信息

3.2总RNA质量检测

3.2.1所提取的RNA都符合实验在纯度和浓度等方面的要求，都为质检合格的RNA样本。

3.2.2所提取的RNA样本的琼脂糖凝胶电泳图如图1所示，RNA电泳后，可见明显的28s、18s和5s条带，表明所提取的RNA较为完整，可以认为样本RNA没有降解，样本合格，可用于后续实验。

3.3芯片结果分析

3.3.16组样本芯片扫描后的分析

箱图(图2)表明6组样本检测结果有良好的均一性；火山图(图3)，由差异倍数和P值所得，垂直线相当于宣威地区肺癌癌组织相较于癌旁组织的2倍上调或下调，水平线代表P值，显示A与P存在显著差异表达的circRNAs。

3.3.26组样本circRNAs表达谱

芯片针对13617个人类circRNA设计探针，3组样本共检测到10819个circRNA，包括9106个外显子类型circRNA、744个内含子类型circRNA、699个正义链重叠类型circRNA、193个反义链类型circRNA、77个基因间类型circRNA。

3.3.3circRNAs的靶miRNA预测

采用Arraystar'shome-mademiRNAtarget预测软件来预测circRNAs的5个靶miRNAs。

3.3.4显著差异表达的circRNAs

各期样本检测到的差异表达的circRNAs的总数量下调的比上调的多，且I到III期所检测到的circRNAs数量呈逐步减少的趋势(表2)。

表2各期检测到的差异表达的circRNA数量

(1)共有的显著差异表达的circRNAs：

检测到537个各期均出现一致差异表达的circRNAs(图4)，包括143个上调，394个下调，在此基础上将FC值由大到小排列，再结合circRNAs的RawIntensity≥200的有276个，包括101个上调，175个下调，结合P值越小越好的原则，且预测的miRNA或宿主基因与肿瘤相关，拟选出hsa_circRNA_104600、hsa_circRNA_069397、hsa_circRNA_105013、hsa_circRNA_005255、hsa_circRNA_406010进行验证。

(2)各特有的显著差异表达的circRNAs：

a.从I到III期上调和下调的circRNAs均呈逐步减少的趋势。

b.I期检测到680个特有的circRNAs，包括372个上调，308个下调。在此基础上将680个circRNAs的FC值由大到小排列，再结合circRNAs的RawIntensity≥200的有238个，分别选出差异倍数(FC)值较大的且上调或下调的前20个circRNAs。拟选出hsa_circRNA_0000937和hsa_circRNA_102151进行验证。

c.II期检测到350个特有的circRNAs，包括263个上调，87个下调。在此基础上将263个circRNAs的FC值由大到小排列，再结合circRNAs的RawIntensity≥200的有227个。考虑到本研究侧重于寻找可作为宣威肺癌早期或晚期诊断的circRNAs生物标志物，因此在该期未选择circRNAs作后续验证。

d.III期检测到45个特有的circRNAs，包括20个上调，25个下调。仅筛出1个差异倍数(FC)≥2、RawIntensity≥200的circRNAs。拟选出hsa_circRNA_102471验证。

实施例一筛选出的8个候选circRNA及5个预测的miRNAs。

实施例一通过RNA提取和芯片检测技术从肺癌患者体内筛选出明显高表达或者是低表达的circRNA，上调或下调表达的circRNA较多，筛选出表达差异倍数较大的进行继续研究。共筛选出8个circRNA的差异倍数(FC)≥2并且Raw Intensity≥200的候选引物。筛选出的circRNA仅通过芯片高通量筛选得到，但是芯片技术会有假阳性现象发生，故需要进一步实验验证所选circRNA是否符合作为肺癌生物标志物的条件。

实施例二

肺癌组织及癌旁组织候选circRNAs表达验证

1实验对象

实验对象的纳入标准与实施例一一致。

2 RNA提取及质量检测

RNA提取和质量检测步骤按照实施例一进行。

3 RNA逆转录为cDNA

使用日本TaKaRa公司的PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser(PerfectRealTime)逆转录试剂盒。按照说明书步骤进行DNA的去除和RNA的反转录。

4测序

从各熔解曲线唯一的circRNAs的扩增产物中选取2～3个样本分别做测序，由于hsa_circRNA_105013的扩增产物大小为60bp，片段较短，因此针对此circRNA的测序选用克隆载体测序，其余circRNAs的产物，采用普通一代测序。

5实时荧光定量PCR(RT-qPCR)

5.1引物设计

首先根据circRNA的ID号在circBase上找到全长序列。circRNA的验证与普通mRNA相比，还需增加一条验证——确定是否成环。因此，circRNA验证引物需设计在接头位点两侧，确保PCR扩增片段包含接头位点。将circRNA序列的5’端到3’端序列从中间剪断，把全长序列的3’端序列移至5’端序列上游，得到circRNA首尾序列对调的新序列，针对新序列用Prism3.0设计对应的PCR引物，设计方法同常规引物设计，但是产物必须包含接头位点。查阅文献发现内含子来源的circRNA可直接调控宿主基因mRNA的表达，我们也针对候选RNA中内含子来源的circRNA—hsa_circRNA_406010的宿主基因编码的mRNA进行了表达验证。

5.2实时荧光定量PCR(RT-qPCR)及收集结果

(1)实时荧光定量PCR(RT-qPCR)配置PCR反应液

按照2×All-in-One^TMqPCRMix(美国GeneCopoeia公司)说明书配制PCR反应液，然后分装到各PCR管中，最后依次加入cDNA模板，配置成20μl体系的反应液，用无RNase水代替cDNA模板设置阴性对照组。将八联管置于SLAN-96P实时荧光定量PCR仪中进行实时荧光定量PCR反应。

(2)收集结果采用相对定量的方法检测肺癌组织和癌旁组织hsa_circRNA_104600、hsa_circRNA_069397、hsa_circRNA_105013、hsa_circRNA_406010、mRNAHECW2的表达量。通过分析熔解曲线是否为单峰、琼脂糖凝胶电泳来确定产物的唯一性，再用测序的方法确定产物为目的产物。使用Excel表计算各样本的ΔCt(Ct目的基因-Ct内参基因)、ΔΔCt(ΔCt癌-ΔCt癌旁)、2–ΔCt及2–ΔΔCt的值。以2–ΔCt代表目的circRNA在组织中的相对表达量，2–ΔΔCt代表目的circRNA的差异表达倍数。

5.3统计学分析

用GraphPadPrism5.0统计作图软件对肺癌组织和癌旁组织目的circRNA的相对表达量进行分析，采用K-S检验数据是否满足正态分布，若符合正态分布，则选用配对t检验，若不符合正态分布，则用非参数检验中的Wilcoxon秩和检验，对circRNA的表达与临床资料的相关性分析，采用卡方检验的方法。采用Kaplan-Meier生存分析法评估circRNA的表达与宣威肺癌预后的关系。P＜0.05表示差异具有统计学意义

6结果分析

6.1标本信息

6.2引物设计成功情况

根据circRNA引物设计规则设计引物后，8个circRNA中，仅有4个circRNA引物设计成功，针对候选RNA中内含子来源的circRNA—hsa_circRNA_406010的宿主基因编码的mRNA进行了表达验证(表3)。

表3 RT-qPCR引物序列

6.3琼脂糖电泳和测序结果

各circRNAs的产物琼脂糖凝胶电泳后产物均唯一，测序结果与将各circRNAs原始序列首尾相接后所拼接序列可比对上，且各circRNAs产物均跨各自的剪接位点，而mRNAHECW2产物的测序结果与mRNAHECW2在genebank中的序列可比对上，琼脂糖凝胶电泳结果如图5所示，测序结果正确。

6.4实时荧光定量PCR(RT-qPCR)

6.4.1应用RT-qPCR检测宣威肺癌组织和癌旁组织表达hsa_circRNA_104600、hsa_circRNA_069397、hsa_circRNA_105013、hsa_circRNA_406010及mRNAHECW2的相对表达量，数据的收集是在退火延伸阶段，45～95℃收集反应的熔解曲线，得到相应circRNA的特异的熔解曲线，经过测序比对发现产物与目的产物一致。

6.4.2统计学分析结果将RT-qPCR的结果进行正态性检验，数据均不符合正态分布用非参数检验中的Wilcoxon秩和检验，通过统计分析比较癌和癌旁的目的circRNA的相对表达量，发现hsa_circRNA_104600、hsa_circRNA_105013、hsa_circRNA_406010在癌和癌旁中的表达差异有意义，而hsa_circRNA_069397(图6)则无差异，但hsa_circRNA_105013的RT-qPCR结果与芯片结果相反，图7展示了候选circRNA芯片结果与RT-qPCR结果比较。

表4肺癌组织和癌旁组织circRNAs相对表达量的描述

6.4.3差异表达的circRNAs与临床资料的相关分析

采用卡方检验的统计方式对hsa_circRNA_104600、hsa_circRNA_105013、hsa_circRNA_406010的相对表达与临床资料进行相关性分析，发现hsa_circRNA_104600、hsa_circRNA_105013的表达上调与肿瘤大小具有相关性(表5)。

表5肺癌组织和癌旁组织标志物临床资料的相关性分析

6.4.4差异表达的circRNAs的预测靶miRNA功能查阅

采用Arraystar'shome-mademiRNAtarget预测软件来预测hsa_circRNA_104600、hsa_circRNA_105013、hsa_circRNA_406010的5个靶miRNAs，并对hsa_circRNA_104600、hsa_circRNA_105013、hsa_circRNA_406010的预测靶miRNAs进行了详细注释。在hsa_circRNA_104600的预测靶miRNA中，miRNA-592与包括非小细胞肺癌、胶质瘤等一些人类肿瘤的起始和进展有关，并与结肠癌的转移有关，而在hsa_circRNA_105013的预测靶miRNA中，一些证据表明miR-608在一些恶性肿瘤中广泛下调，如肝癌、结肠癌、肺癌等，并作为肿瘤抑制剂，通过促进细胞凋亡来抑制细胞增殖、迁移和侵袭。hsa_circRNA_406010的预测靶基因中，miR-619-5p在前列腺癌中上调。其余大多数预测的miRNAs在肺癌中的潜在功能仍然不清楚。

表6标志物的5个预测miRNAs

本研究揭示了宣威肺癌的circRNAs表达谱。hsa_circRNA_104600、hsa_circRNA_105013和hsa_circRNA_406010在宣威肺癌中差异表达，且hsa_circRNA_104600和hsa_circRNA_105013的预测miRNA参与多种肿瘤的进展调控，这些circRNAs的表达异常与一些临床病理参数具有显著相关，因此，我们认为hsa_circRNA_104600和hsa_circRNA_105013可能作为宣威肺癌的潜在标志物。

应理解，在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明进行各种修改和润色，然而均是以检测本发明所述的circRNA相关，或者是该组circRNA的各种形式的应用，这些修改或润色均属于本发明的范围。

序列表

<110> 昆明医科大学第一附属医院

<120> 一组用于肺癌诊断的circRNA标志物及其应用

<141> 2018-09-17

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1674

<212> DNA

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 1

aaagaagagt gggaaattga aggcctccta taaacgggat tgttttagtg ttggcagtaa 60

tgttgatata gatttttctg gaccaaccat ctatggctgg gctgtgttgg ccttcgaagg 120

gtggcttgct ggctatcaga tgagttttga cacagccaaa tccaaactgt cacagaataa 180

tttcgccctg ggttacaagg ctgcggactt ccagctgcac acacatgtgt gagtgtttat 240

aatttattcc ttagtatcag tgcagttgcc caaaatattg tagccattag catgctgaga 300

agtgatggta ctcagattta gcatgccttg gtgaatatcc atccttgcgg tgctatcctc 360

atagcaaaac cttgccagga ggctggtgca cgtggtgtgc aggctgtgct gctggtggtc 420

actggcccct cagcctgcac cccaaacttg aggaagctcc agcctctgta gaagaaccac 480

tgggatagag ggagcccaga gcatggctta cctcatggta agatgaccct ttggagatgt 540

tactgcttcc tctgctgccc tctcatcttg acagtatctg gaagcaggtc tgttttggtc 600

accaacaacc accaccaaat tgatctgagc atcctgggac atcccggtaa ttctgtggag 660

gtttcaggta ctggtattct cggttggaac ccaggtaccg ctaatgcatt cagaagtaac 720

aggtgctctg aaagagtcct gggattcagt tatgtaggct gcaccatgtt ggtgggatga 780

atcagaactt ttacgtagta ttttatgttg agcctactgg acactgctac tataccagga 840

agaaaaagca aagggcaaac tatgtgtttt taaactgttg cagattcctc tctgctagat 900

gctctaattt acttatgatg gctaaaacaa aggcaagcag tggtatagac agttactgaa 960

attgatgaaa cagtattatc aggaaaacca tgtgaaaacc caaggactca cctctggcat 1020

gcttggaagc aataactaag gtggttttct ggagcagtgc accctaggta tcgtaggagg 1080

gtgctttcta actgtaggat tgtgttttaa aggaaatcca gaattggttt tattcctata 1140

cctctacctt tttatttttt tgcagaatct ttattgaact ctactttgaa gtttctaagt 1200

tctatgaact tctcagagac ctatagatta tacttacccg aggtgtctgc ctttgtgctt 1260

aattgaattg tcttaagaaa ctcacatcat gtggaggagc caagtaaatg gatcaagtgt 1320

taacgtttta attaagcagt cattactggc atagctggat ttagttctgt gttttgttta 1380

gtagtcattt atgctagaaa tttgctgaaa tctatagtta caaaatggga tccttgttta 1440

gatagtctta gaatttgttt tcataccata ataacaatgg tacaaactag atatttatga 1500

cgttttctta tctatgaaaa caggaacgat ggcactgaat ttggaggttc tatctaccag 1560

aaggtgaatg agaagattga aacatccata aaccttgctt ggacagctgg gagtaacaac 1620

acccgttttg gcattgctgc taagtacatg ctggattgta gaacttctct ctct 1674

<210> 2

<211> 12180

<212> DNA

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 2

ctggaagaac tttcactttg ccattcaaca acaggatcct ctaccgaagc gtcacttgtg 60

ccaacagttt catcttccta caacaaagag ccagcaatta agatatatgg atattaccag 120

ctaatgtatt tctaattaaa aaaccactac ctgttttata gcattttttt gaattctgcc 180

ctcaaaaaat gttcttctta aaacgcacat aattattgtt ctaagtatat ctgtaactca 240

caactaagtc tactaggtat ttctaaattt ctagcatcat tatcttattg atataaaaca 300

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cacccactgc cttatactct agcattagtt tgatgcacaa tatgaccaaa aaaaccattt 600

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cagaggttgc agtgagccaa gtacgtgtca ctgcactcca gcctggggac agagtgagac 1380

tccatctcaa aaaaaaaaaa aaagaattgg gaatggcaca agaatgagag taccatatat 1440

tgtcaatgca tgattaaacc ttcattatgc atttaacaat gaaagctgtt aagagaacaa 1500

aaagactgga gaacagaaga acaagatgaa aagaagctat gctctttatt cattaccatg 1560

aaaaaggtag gtctgagaaa aatcaacatt caatgatctc tatgaggggt gaagtcaata 1620

ataacaaaac atgtgtacat tatgttgatt agatagccaa ccagttctga aactgtgtaa 1680

cttattaatg ctctttatat ttcgctcctt tccatttata ggctgatttc ctcttactct 1740

ttttttcact gtctcaacgt caaactcttg ctggcatatt tgataccctc accaagacag 1800

catctgaggt acaaatccaa gacatctaaa tgaattaaat atgcccaaat atacctacta 1860

aatgtattat taatgaacaa atctcttata agaatataat taaaataatt ttctattaaa 1920

gaagtgaccc ttaaacccaa atggatgata caaactggga aacaaaaaac tacatcaaat 1980

aaataatagt atatatataa cctctgaaga actgtctgag tcttcctgta cacctgaatt 2040

ttgacatgat gcctgtgaat tatgctctat gttggaccgt gtttggtaag tatgctgacg 2100

tttgcgctgt gtcctgcgta aagaacgccc acagctaggc tcataatcat tctgtaaaag 2160

agaagaataa taaattttaa aaaaggaaaa gctcagtaaa cacacaagga acatatataa 2220

agcaaattag gtggggggta ggggtgagta ggagatgaga ataaattccc caaaataaag 2280

tcaacataga actatattta tacatattta atccactttc cactaatatt gatcactctc 2340

ctattttgta aaccttgtga tcaaattaaa gacagtgctg aaaagtctgg gttgcaaagt 2400

cccacagact tctctgtaca acgcagagta atagtttagg cagcaacttc ttgatcctca 2460

gttttgccag aggctgcaac cagacctgtg ctggaaccac atttagaaac cagtatgaca 2520

atgatatcat tgtctggagc aggattcatc aaactgaata tgcaatggaa gctgttaaac 2580

aaggttcagc cacagttggt ctgaaatcaa aaacccatgc agtattggtt gcattgaaaa 2640

gggcaccatc ggagcttgca gctcatcaga aaaaaattct ccatattgac aaacatattg 2700

gtatctcaat tgcagggctt actgatgatg gtaaactgtt acgtaatttt atgtgccagg 2760

agtgtttcga ttccagattt gtatctgata gaccacttcc tgtgtcttct cttgtatctc 2820

taattggaag caagacccaa atatcaacac aacaatatgg ctggagacca tatggtgtta 2880

ggctacttac tgctggttat aatgatatgg gcctcacatt ttccaaacct ggtcatctgc 2940

tgactatttt gactacagag ctacgtccac tggggcccat tctcagtcag ctcgtactta 3000

cttggagaga catatgtcta aatttatgga atacaattta aatgaactgg ttaaacatgg 3060

tctgcatgcc tgaagagaga caattcctgc agaacaggac ataactacaa aaatgtttcc 3120

attggaattg ctggtaataa tttggagttt acaatctatc atgatgatga tgatgtgtct 3180

ccaatcctgg aaggtcttga agaaaggcca cagagaaagg caaagcctgc tcaacctgct 3240

gattaaccag cagaaaaggc tgatgaacca atggaacatt aagtgataag ccagcctatg 3300

tatgtattat caaatatgta ataatgctgg aagacatact gatgatacta atcatcagta 3360

gaatggtggt ggaatggtat gttttaggaa tcagtccaga tgtgagtttt ttctaagcaa 3420

cctcactaaa accatataat ggggtacatt tttctttgag atgtctatat aatcactttc 3480

tagaaagtac aggtatctgt actaatgttt ttatatgaaa aaagtaagtg tctttgtgat 3540

tttaaagcca actgtaaaat aaaattgttt cacctcctga aaaaaaaaag aaatgtctgg 3600

gttgcaagaa tttgcccatt cataatttac gtatgccaca ttattcagaa ttattatagg 3660

atgaagcaag acatttcagt catatgtgta tatataatgt gtgtttattt agttctgctc 3720

aaaaatctag aaaacttttt taaagtgcta agatatataa gtggatttaa taatctatac 3780

ttttgttcat tctagattaa cattgagggc taaactctga tcttttattt ctcttgccca 3840

aatttctatc taagaggcct tctgcagagg tgggcatggg aggggaggtt ccatgcctca 3900

caaacgacaa agtctcatca gaggggtttt acttaaccct atataacgtg ttttaacttt 3960

ccaatatgac tctggcataa catcatacaa cagagaaaga aggaaatcaa aatattttaa 4020

ccgcaaatat gtttctgtca tatcttgaaa tagccctgta aagctgtctt aaaatcaaca 4080

ttctgtagag aatccctttc tctttccagg cctttttcct gatccaggag agaatcaacc 4140

aaaagtctgg cacttttatt taagtctgaa aagaaacatt tgcaacctac tctctgtgaa 4200

aaaagctacc tagaggcttc ttctgcgtaa tgagaatctc ggtctctaaa attccttatc 4260

taaacccaga catttccttc cattgattct aggtctttag acaataactc tttcaactaa 4320

ttgctaatta gaaaattttt gaatccacct atgacctgga acctcctccg tcacaccccc 4380

atgagttgtc ctgcctttct gtactaaacc aatgtactgt cttacatgta ctgattgatg 4440

tcttgtctct ctaaattgta taaatccaac cagtagcctg gccatcttag gcatatgttc 4500

tcgggactac ttcttgagac tgtgcatcca gtcactggtc actcatgtat ggctcagaat 4560

aaatctcttc aaatatttta tagagtttga ctctttcatc aacagcattc ttaagattct 4620

taagaggtaa aaagtatctt tagaataaat ttagtccaat ctccaacccc ccacctctga 4680

aatacaaaac taggtccagg agagagttgt ttaaaataaa aatgaaatgc tctcccctct 4740

cccctctccc cacggtatcc ctctgatgcc gagccgaagc tggactgtac tgctgccatc 4800

tcggctcact gcaacctccc tgcctgattc tcctgcctca gcctgccgag tgcctgtgat 4860

tgcaggcacg cgccgccaca cctgactggt tttcgtattt ttttggtgga gacggggttt 4920

cgctgtgttg gccgggctgg tctccagctc ctaatcgcga gtgatccgca agcctcggcc 4980

tcccgaggtg ccgggattgc agacggagtc tcgttcactc agtgctcaat ggtgcccagg 5040

ctggagtgca gtggcgtgat ctcggctcgc tacaacctcc acctcccagc cgcctgcctt 5100

ggcctcccaa agtgccgaga ttgcagcctc tgcccggccg ccaccctgtc tgggaagtga 5160

ggagcgtctc tgcctggctg cccatcgtct gggatgtgag gagcccctct gcctggctgc 5220

ccagtctgga aagtgaggag cgtctctgcc cagccgccat cccatctagg aagtgaggag 5280

cgcctcttcc cggccgccca tcgtctgaga tgtggggagc gcctctgccc tgccgccccg 5340

tctgggatgt gaggagcatc tctgcccggc cgcgaccccg tctgggaggt gaggagcgtc 5400

tctgcccagc cgccccgtct gagaagtgag gagaccctcc gcctggcaac tgccccgtct 5460

gagaagtgag gagcccctcc gcccggcagc cgccccgtct gagaagtgag gagctcctcc 5520

gcccggcacc caccccgtct gggaagtgag gagcgtctcc gcccggcagc caccccgtcc 5580

gggagggagg tgggggggcc agccccccgc ccggccagct gccccgtctg ggagggagtt 5640

gggggggtca gccccctgcc cggccagccg ccccgtccgg gaggtgaggg gcacctctgc 5700

ccggccgccc ctactgggaa gtgaggagcc cctctgcccg gccaccaccc cgtctgggag 5760

gtgtacccaa cagctcattg agaacgggcc atgatgacaa tggcggtttt gtggaataga 5820

aaagggggaa aggtggggaa aagattgaga aatcggatgg ttgctgtgtc tgtgtagaaa 5880

gaagtagaca tgggagactt ttcgttttgt tctgtactaa gaaaaattct tctgccttgg 5940

gatcctgttg atctatgacc ttaaccccaa ccctgtgctc tctgaaacat gtgctgtgtc 6000

cactcagagt taaatggatt aagggcggtg caagatgtgc tttgttaaac agatgcttga 6060

aggcagcatg ctccttaaga gtcatcacca ctccctaatc tcaagtaccc agggacacaa 6120

acactgcgga aggccgcagg gtcctctgcc taggaaaacc agagaccttt gttcacttgt 6180

ttatctgctg accttccctc cactattgtc ctatgaccct gccaaatccc cctctgcgag 6240

agacacccaa gaatgatcaa taaaaaaata aaaaataaaa aaaacaaata ataaatctta 6300

gattacttct aacaacagaa gggaaaggac tcaaaacaat ctacatacaa aaagtaacaa 6360

tttaattttt ggaactgaaa tctaaactct gctcttttgt tattctcttg ctcaaattcc 6420

tatctcaagg gtctggagag tcatgcctta caaaccatag agtcccatca gagcggtttt 6480

atttaactct atgtaacatg gctttacttt tccaacctga ctttggcata gcatcacatg 6540

acagataaag aggggaatca gaatatttta aacccaaatg tttctttgcc atatcttgaa 6600

atagccctgc aaagttgtct cttgtggggg aaaacctaca ttgtgcagag gacccccttc 6660

aagggagaat caactaagag tctggcatct ttttaagtcc gataacaaac atttacaacc 6720

tattttctct gaagtttgct acctggaggc ttcatctgca taataagaat cttggtcttc 6780

acaaaccttc atcttttttt tttttttttt ttttttttga gacggagttt cactctagtt 6840

gcgcaggcta gaatgcaatg gcgtgatatg ggctcactgc aaccttggcc tccaaggttc 6900

aagtgattct cctgcctgcc tcagcctccc gagtagctgg gattacagac atgcaccacc 6960

acacctggct acccaaaccc ttatcttaat ccagacattc ctttctcttc attccaggtc 7020

tttagataaa aactctttca accaatttcc agtcagaaaa tcttggattg gaaactgacc 7080

tggaagccca ccacccacct tccagttgtc ctgcttttct gcaccaaacc agtgtacatt 7140

ttacatctat tgattgatgt cttatgtatc cctaaaatgt ataaaaccaa gttgtagccc 7200

gaccatctca ggcacagagt ctcaggatct cctgagggct gtgccacgga ccattggtca 7260

ctcatttttg gctcagaata aatctcttca aatattttaa aatttgattc ttcgtcaaag 7320

gcacatagac gcacacaaat tcatgccatg tttaatccct tatatcccat tgaggattat 7380

ttctactatt tgcggacaat atagaagaag agaaattgag taactatgga taacttacct 7440

gtagttgtaa caagaattgg cagtatgttc atttagtaaa caggtcaaaa tagagattta 7500

atttttaatg attaaaattt gaagtgaaaa ctattttatt ctaaccttta caaatataaa 7560

acattactat tgatattcca tttagctaag ctgcaatcct agaatgtaat caggagccaa 7620

caagtttaaa agtgtatgta aatgtttcac attttcaacc taagtaaaaa tatctacaga 7680

cctaagtacc ctgtccatta gtctcagcca agtctgatgt ttgataaaat cagcttagta 7740

agaaacatga ataaaaatca gtgttctgag tcattcaaaa tctcttaaaa aaaaaaaaac 7800

ttaccagaga acagcaaata aactaacaaa acaataaagt taatttctta acaataaaag 7860

ttaagaaagc aaacatcaaa atgatctaat atttgcagat atccatttga tatttaccta 7920

aatttctgtt tatcaattat ggaaaaaaat gcaaattcag ggtccattac ctagatttgt 7980

ttaacaacat caaaatcatc ctagactctt caaattacca cactctacag aaattatggt 8040

taaatttggg aacaaaacta tacatttggt gtacctgaga gtattctgct tagcagtttc 8100

tttctatagt acatcacaat atacagatca tattttgctc ctaaatgatt tggtaagcca 8160

ggaatgggtc tagggtaggg atcagcaaac tttttctgca aaggaccaaa gtgtaaacat 8220

tttttggctt tgcaagtcat acaatctctg ttacaactat tcaattctgt cttacagcct 8280

gaaagcaacc acatacaaga cataaataag tgaacgtggc tgtgttccaa taaagattaa 8340

cagaaatagg tagcagaact gatttggccc atgggctata gtttgccaat ctctggccta 8400

ggatatctgg atcatttgtt ttacattcta attagtgatc tggtaatata gttaaggttc 8460

tactttgatc atataaaaat ggttatttta atacaaatat cttacaccta caatgaccac 8520

atgtcctaga tttgggggga cactcgactt gtgactttgt tcttattaat aataatcata 8580

tatctcaatt tgtggctcaa aaagtaggtt ccctatatgc agatacctat taaaatagtc 8640

tcttaacaca caactgctgc ctctcaaaag cctattatct acaaatatct gcaaatagtg 8700

tatcccaaag tattgtaaaa ctatacttac cctttgagta gtgtaagatg gctttttctt 8760

cttttcaact gtataaagac tgatttctat gtcacctttt gcagttcgac attcttcctg 8820

taccctaata acaagtcaaa ggtcaaagta acagaaaatc aagaagaaaa ccaatcattt 8880

aagaatcaga taataaaaat acttttaaac atataatttg ccacttgaac tatttttaag 8940

catataattc agtggcatca attacattca gaaagttgtg caaccattac cagcatttcc 9000

aaaacttttt catcacttca aagataaact ctgtgaccat taagcaataa ctccccattt 9060

tctccttctt cctagcccct gaaaacctct aatctattgt atgtctctat gaatttgcct 9120

agtccagata tttcatataa gtggaatcat ataatatttg tccttttgtc tctggcttct 9180

tttgcttagc atgtttatcc acgttgtagc aggtatcaga acatcattct tttctgtagc 9240

tgaatgatat gccattttgt acatatacca caatttgttt atctattcat ctgttggtgg 9300

acaattgagt tgtttccacc atttggttat tgtgaataat gccacattta acagtggtat 9360

acaaatatct ttgagtccct gctttcaatt ctgctttcta tgttttgagt aaataatcat 9420

ttactccaaa gacattaatt atgtcttttt ttttttctta tcactgctgc cttcttatag 9480

cagaaagcag aagaaaagga gaaaccaaat taattttgct atttgttggt tgatctggta 9540

aaaggcttgg ttaggaagat acttgattaa aatgaattgt acatattctc tgtaaatgtc 9600

ctttctcttt tctaaatcta tttccagttg ctgtggagta tctgaaagtt attattacag 9660

caaatgtcag ggtttacaaa tatgaatagg gattataagt ttgaaattaa tcctaatgaa 9720

attctttcac ccaatgaagc ctacctaaat gacatttcta aagatactct aagcactagc 9780

atctaacaaa taattgtact cccaggctgc tccaatgtta gggtccatat atcactcaca 9840

tatttaatta tgtaagacct catgagttct taatactact tgtattcttt tcttctaatc 9900

taggctataa actcagaaca gagataatgt tttgcatttt caatattccc caaagcattc 9960

agcacaaagc tgaagatgat cattatttgt tacgaagtga actcactgga ataatatgga 10020

aaaactaatg catgactaaa ctatatttta aaattcctca tttactaggc taacatagta 10080

catttcaatt cacttcctaa gaataaagct ttaaattttt ttctaaatgt taccttattg 10140

actcacctac taaccccatt atttagttca ttgaccacca ctcttctgct ccacgccatg 10200

agatctcttt cagtggccat ctggctccga ggagcattgt tatgcatttg tctaacacct 10260

tcaatttgac tactatgtct tcgaagcctg atgtttgggg aagaagatat gtccatgttt 10320

ggacttctca gagctaaaac aaaaacaagg aaaattatca ctttgtgagc aaaggcacca 10380

tagttttcca gaacagagct ctaaataaaa cagtagattc aaatatagta ctgctgtaag 10440

aattgctatc cctttgttct atattttctg taccctcctt tgtgtttttc atattgttat 10500

aaataaagca ggcactctta ttgagaaatg tttaaaattt ctataattat tttaattttt 10560

ttcaaagtag tttcacatct gacatctact aaatgctcaa tgaatataaa aaaatgtatt 10620

caacatgatt tggagattta caaatgttta tctccattac agtgtttcta gataaaacat 10680

caataaaact ttcaaaaatg ttaagattca aagtgtaaat aaatattttt ttaaatcaaa 10740

atttcatttt caagattgat gagcaacgaa agaaagaaaa caaagtaaca gaagttttac 10800

tttttaatac tccagaaagg ttcatgttat ttttcttata tttacaaata aaacacaaat 10860

ggaaactgaa acatccaact gttaaatgtc agaaaaattt caaaacaaat caatattaca 10920

aatagaagtc agtggggtct cttgactaat gccatttcta atctgtccac agaaacctag 10980

tattgacggt acaacagaat acagatttca ttaatggata tttaaatcag ggttctgaga 11040

aagttttatg tctcaggaat aaagggcctg gatagatagg attatcagcc cacttgtcat 11100

cttgttctag gttcagaaaa gcttatctga gttaggtgtt caagtaacct aaatgaacta 11160

ttttaatttt atgagatatt gaagacatca ggaaatgagt aaaataccct gtgaatcacc 11220

acaaatttaa atcaccttat tcatttccat ggaatctaaa atgcaatgtt acacagataa 11280

atgactctag ttacaaatat atgaaaagaa ataaatctga aaaatctcat aagatgacta 11340

catttgaaaa taaaactgat agctcttgat acaagctaaa acttatataa aactcagatg 11400

ccctggcacg tttaatgtaa aagataggat agaatatcat tttaatatca tttaaggata 11460

gaatattcat tttaagataa ttaattatac aataacttct actggtatta agatcaaact 11520

attataaaag ttaattcaga agctgtatct gtattcccta agagtgcttc ttgtcttcag 11580

tgtatttttt ttttttattc aagagaagag catggtattc tgctttcctc tccacaaaag 11640

aggaattggt agtaatttct aaacttaagg tagttttaat tttgaaaact atataggttg 11700

tttcctctac aaaagggcta gacttaccgt agcacttcac ttcttaaaac aaatgtaaag 11760

attacagata aattactgag taaaaagaag acagtgtatt aaaatgcatc acctgtattt 11820

ctcaggagac cttaagtcat tttatccaca aatgatgaga ttatgagact tcaatatatc 11880

tgatatcaaa attgtaaatt aataaaaaag tttttattta taaacgtaaa atattttcca 11940

tgtaattatt tggtaaaagt aaaataatta cagtacataa actacaccct ttacaagtat 12000

aaaaatactt accaccatta acagagtatg ctctattaac tggtaaatgt ggaacatctc 12060

cttcattaat tagtctcagg tcttgttctc tctgcagctc cctgattatt ccatcaagaa 12120

tgctctcatc ttggtcattg gtttgctgcc caattacctg ttctactacc tcaccatcac 12180

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgaatttgga ggttctatct accag 25

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccttcaattt cccactcttc ttt 23

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttcttccagg tgatggtgag gt 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cttggtcatt ggtttgctgc 20

Claims (7)

1.一组用于肺癌诊断的circRNA标志物，其特征在于：包括SEQ ID No.1所示的hsa_circRNA_104600和SEQ ID No.2所示的hsa_circRNA_105013。

2.权利要求1所述的用于肺癌诊断的circRNA标志物在制备诊断肺癌患者的试剂盒或试剂中的应用。

3.权利要求1所述的用于肺癌诊断的circRNA标志物在制备诊断肺癌的circRNA芯片中的应用。

4.一组用于肺癌诊断的circRNA标志物的引物组合，其特征在于：所述引物组合包括针对hsa_circRNA_104600的特异性引物和针对hsa_circRNA_105013的特异性引物。

5.根据权利要求4所述的用于肺癌诊断的circRNA标志物的引物组合，其特征在于：针对hsa_circRNA_104600 的特异性引物包括如SEQ ID No.3所示的上游引物，如SEQ IDNo.4所示的下游引物；上述针对hsa_circRNA_105013的特异性引物包括如SEQ ID No.5所示的上游引物，如SEQ ID No.6所示的下游引物。

6.权利要求4所述的用于肺癌诊断的circRNA标志物的引物组合在制备诊断肺癌的试剂盒或试剂中的应用。

7.一种诊断肺癌的试剂盒，其特征在于：包括权利要求4所述的用于肺癌诊断的circRNA标志物的引物组合。

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