CN102912018A - 一种检测WT1基因mRNA表达量的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测WT1基因mRNA表达量的试剂盒，属于生物技术领域。所述试剂盒包括检测用引物、荧光探针、cDNA第一链合成试剂、荧光定量PCR混合液、阴性对照和阳性对照，所述检测用引物、荧光探针包括WT1基因引物、内参基因ABL引物及Taqman荧光探针。WTl基因与造血系统肿瘤发病有关，约在80％的初诊急性髓细胞性白血病和急性淋巴细胞白血病患者中有过度表达，是公认的泛白血病标记基因，可以作为一个独立的微小残留病监测及预后提示指标。采用敏感性及特异性均较高的荧光定量PCR技术检测WT1mRNA水平，其检测结果的特异性和敏感度均显著提高。该试剂盒为预测急性髓系白血病和急性淋巴细胞白血病的预后以及化疗方案的确定提供了一种全新的快速简便的基因诊断技术。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域的荧光定量PCR技术，具体涉及一种检测WT1基因mRNA表达量的试剂盒。
背景技术
急性髓细胞性白血病（Acute myeloid leukemia，AML）是一种临床分子异质性恶性克隆性疾病，是急性白血病最常见的类型，在美国每年有超过11,900新发病例，AML患者大多是中老年人。大约一半的成年AML患者缺乏染色体畸变，虽然这些患者有一个较长的预后期，但是只有40%能长期存活。微小残留病（Minimal Residual Desease，MRD）是ALL患者经过治疗，并按同前所确定的疗效标准达到临床完全缓解状态后，体内残留微量白血病细胞的状态。MRD是ALL的重要的独立预后指标。已经证实患儿体内的MRD在ALL的疗效评价、预后判断和复发监测以及造血干细胞移植时净化移植物等方面均有十分重要的意义。
WTl（Wilms’tumour gene 1）基因是从Wilm’s tumour细胞的染色体中分离出来的Wilm’s瘤基因，定位于染色体11p13断臂上，由10个外显子组成，是一种能编码锌指结构转录因子的抑癌基因。近年来许多学者发现WT1基因作为致癌基因在各种白血病（除慢性粒细胞白血病慢性期）及其他肿瘤中被高表达，特别是AML。WTl基因与造血系统肿瘤发病有关，几乎所有的白血病原始细胞都持续表达WT1基因，WT1基因的主要功能是参与调控细胞周期和细胞凋亡。研究表明，WT1基因表达水平上调或WT1基因突变与AML患者的临床预后和治疗效果密切相关。WTl基因约在80％的初诊AML和ALL患者中有过度表达，在发生WTl基因突变的一些急性白血病者中，WTl基因的表达量会更高，现已被公认为泛白血病标记。WT1蛋白能激活转录激活因子或是抑制因子，大约一半的成人AML患者在诊断上缺乏同源性染色体畸变，虽然这些患者预后中等，但仅仅只有40%是长期存活的。因而需要一种特异的分子标志物来提高诊断、预测预后以及指导治疗。对于接受常规化疗的患者，WTl基因可以作为一个独立的MRD监测及预后提示指标。
目前可用于WT1基因定量表达的方法有探针杂交法、基因芯片法、质谱法、基因测序法等。探针杂交法假阳性率较高；基因芯片法成本高、制备方法繁琐；质谱法难以在普通医疗机构开展；基因测序法虽敏感性和特异性高，但价格比较昂贵，而且操作较繁琐，耗时较长。荧光PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）检测WT1基因定量表达可高通量完成临床样品检测，且特异性和敏感性都很高。实时荧光定量PCR技术实现了PCR从定性到真正意义的定量的飞跃，为人类疾病基因的定量检测提供了一个行之有效的检测工具，与普通PCR相比具有特异性增强、灵敏度提高和检测快速、降低了污染等特点，但目前尚未有荧光定量PCR方法检测急性髓细胞性白血病中WT1基因的相关报道。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种检测WT1基因mRNA表达量的试剂盒。所述技术方案如下：
本发明实施例提供了一种检测WT1基因mRNA表达量的试剂盒，包括检测用引物、荧光探针、cDNA第一链合成试剂、荧光定量PCR混合液、阴性对照和阳性对照，所述检测用引物、荧光探针包括WT1基因引物、内参基因ABL引物及Taqman荧光探针，其中：
WT1基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；
WT1基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；
WT1基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:3所示；
ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:4所示；
ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:5所示；
ABL基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:6所示；
所述cDNA第一链合成试剂含有MgC12、逆转录酶缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂、Oligo(dT)15、AMV逆转录酶和无RNase去离子水；所述荧光定量PCR混合液含有PCR预混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq酶、UNG酶和无RNase去离子水。
进一步地，所述试剂盒还包括内部阳性控制序列、内部阳性控制序列的引物和Taqman荧光探针，其中：内部阳性控制序列如序列表中SEQ ID NO:7所示；内部阳性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID NO:8所示；内部阳性控制序列的下游引物如序列表中SEQ IDNO:9所示；内部阳性控制序列的Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:10所示。
进一步地，所述WT1基因的Taqman荧光探针和ABL基因的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团FAM，3’端均连接有荧光淬灭基团TAMRA；所述内部阳性控制序列的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团TET，3’端连接有荧光淬灭基团TAMRA。
具体地，所述内参基因ABL的核酸序列如序列表中SEQ ID NO:11所示。
具体地，所述阴性对照为去离子水；所述阳性对照为含有WT1基因的总RNA样品。
具体地，所述cDNA第一链合成试剂为：25mmol/L MgC124μL，10×逆转录酶缓冲液2μL，10mmol/L dNTP 2μL，RNA酶抑制剂0.5μL，Oligo(dT)150.5ug，AMV逆转录酶1.5U和无RNase去离子水，总体积11μL。
具体地，所述荧光定量PCR的混合液（以反应体系终浓度表示）为：1×的PCR预混合液（原液为2×PCR Premix）、2.5-4.0mM的Mg2+、0.2-0.4mM的dNTPs、0.3-0.6mM的dUTP、0.2U/μL的Taq酶和0.01-0.05U/μL的UNG酶以及无RNase去离子水。
本发明试剂盒的优点和效果如下：
（1）敏感性高：可重复敏感度为0.01%，即10000个细胞中有一个含WT1基因就可以被检测出。
（2）特异性强：使用特异性探针对定量分子进行识别，准确性高。同时，靶序列由引物和探针双重控制，特异性好、假阳性低。
（3）简便安全：操作简单、安全、自动化程度高而且防止污染。扩增和检测可以在同一管内检测，不需要开盖，不易被污染；同时扩增和检测一步完成，不需要后期处理，无需要担心放射性污染。
（4）全程监控：本发明实施例提供的试剂盒引入了内部阳性控制质量控制体系，对检测过程进行全程质量监控，有效避免假阳性或者假阴性。
（5）快速：速度快、高通量，可在3-4小时完成。
本发明的试剂盒能快速、准确、定量检测WT1基因mRNA水平，有效杜绝了假阳性和假阴性的发生，用于急性髓细胞性白血病的治疗及预后评价，为急性髓细胞性白血病的诊断、鉴别诊断、制定治疗方案及预后提供了重要的检测手段。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1A是本发明实施例2提供的试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增1.0x106-1.0x103拷贝的内部阳性控制序列标准品的荧光曲线图；
图1B是由本发明实施例2提供的试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增1.0x106-1.0x103拷贝的内部阳性控制序列标准品的荧光曲线图得到的标准曲线图；
图2A是本发明实施例2提供的试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增1.0x106-1.0x103拷贝的ABL标准品的荧光曲线图；
图2B是由本发明实施例2提供的试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增1.0x106-1.0x103拷贝的ABL标准品荧光曲线图得到的标准曲线图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
实施例1.试剂盒的制备
1、特异性的引物和荧光探针的设计
根据基因序列（ABL基因序列、和WT1基因序列来源于美国国家生物技术信息中心核酸数据库，其中ABL基因ID分别为25，参考序列号为NM 005157.4；WT1基因ID分别为7490，参考序列号为NG 009272.1）分别设计对上述各基因序列特异的引物和荧光探针。
2、按照下列试剂盒的组成配制试剂盒的各组分
本发明试剂盒组成如下：
①RNA提取试剂：Trizol试剂（Invitrogen公司，产品货号：15596-026/100ml），每1ml骨髓组织加入1mlTrizol快速提取急性淋巴（或髓系）细胞白血病患者骨髓组织RNA。
②cDNA第一链合成试剂盒（RT-PCR）（Fermentas公司，产品货号：K1622）：25mmol/LMgCl24μL，10×逆转录酶缓冲液2μL，10mmol/L dNTP 2μL，RNA酶抑制剂（RNasin，一种酸性糖蛋白）0.5μL，Oligo(dT)150.5ug，AMV逆转录酶1.5U和无RNase去离子水，总体积11μL。
③引物、探针和标准品：包括WT1基因引物、内参基因ABL引物、内部阳性控制序列引物及与引物对应的Taqman荧光探针，具体如下：
WT1基因上游引物序列为：5’-TTTCCTAACGCGCCCTACCT-3’（序列表中序列1）；
WT1基因下游引物序列为：5’-GGGATCCTCATGCTTGAATGA-3’（序列表中序列2）；
WT1基因Taqman荧光探针序列为：FAM 5’-AGCTGCCTCGAGAGC-3’TAMRA（序列表中序列3）；
内部阳性控制序列为：5’-UUUCCUAACGCGCCCUUCCAGCCCAGCUCGCUCGAGAGCCAGCCCGCUAUUCGCAAUCAGGGUUACAGCACGGUCACCUUCGACGGGACGCCCAGCUACGGUCACACGCCCUCGCACCAUGCGGCGCAGUUCCCCAACCACACAUACAAGCAUGAGGAUCCC-3’（序列表中序列7）；
内部阳性控制序列上游引物序列为：5’-TTTCCTAACGCGCCCTTCCA-3’（序列表中序列8）；
内部阳性控制序列下游引物序列为：5’-GGGATCCTCATGCTTGTATGT-3’（序列表中序列9）；
内部阳性控制序列Taqman荧光探针：TET 5’-AGCTCGCTCGAGAGC-3’TAMRA（序列表中序列10）。
ABL基因序列为：5’-CAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAAGGCTGGGTCCCAAGCAACTACATCACGCCAGTCAACAGTCTGGAGAAACACTCCTGGTACCATGGGCCTGTGTCCCGCAATGCCGCTGAGTATCTGCTGAGCAGCGGGATCAATGGCAGCTTCTTGGTGCGTGAGAGTGAGAGCAGTCCTGGC-3’（序列表中序列11）；
ABL基因上游引物序列为：5’-CCGGGTCTTAGGCTATAATCACA-3’（序列表中序列4）；
ABL基因下游引物序列为：5’-GCCTTGGCCATTTTTGGTT-3’（序列表中序列5）；
ABL基因Taqman荧光探针序列为：FAM 5’-TGGTGTGAAGCCC-3’TAMRA（序列表中序列6）。
其中，内部阳性控制序列为人工合成序列，包含一部分已知的WT1融合基因序列和一部分人工合成序列；内部阳性控制序列和ABL基因序列分别用作标准品。
上述引物序列、控制序列、基因序列、基因序列、探针序列均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
④阴性对照和阳性对照：以去离子水为阴性对照，以含有WT1基因的总RNA样品为阳性对照，采用上述实施例1中提供的本发明试剂盒组成①RNA提取试剂：Trizol试剂（Invitrogen公司，产品货号：15596-026/100ml），按每1ml骨髓组织加入1ml Trizol试剂的比例，快速提取已经确诊的含有WT1融合基因的急性髓或淋巴细胞性白血病患者的骨髓组织RNA，作为阳性对照。
⑤WT1基因荧光定量PCR的反应液：由荧光定量PCR混合液和检测WT1融合基因的引物、探针组成：1×的PCR预混合液（Qiagen公司，产品货号：210212，2×PCR Premix）、2.5-4.0mM的Mg2+、0.2-0.4mM的dNTPs和0.3-0.6mM的dUTP、0.2U/μL的Taq酶和0.01-0.05U/μL的UNG酶、0.25pmol/μL的WT1基因上游引物（序列表中序列1）、0.25pmol/μL的WT1基因下游引物（序列表中序列2）、0.3pmol/μL的WT1基因Taqman荧光探针（序列表中序列3）、0.25pmol/μL的内部阳性控制序列上游引物（序列表中序列8）、0.25pmol/μL的内部阳性控制序列下游引物（序列表中序列9）、0.3pmol/μL的内部阳性控制序列Taqman荧光探针（序列表中序列10）（以上所有的浓度都是指PCR反应体系的终浓度）。通常取1-2μL的模板（包括被测样品RNA反转录合成的cDNA和内部阳性控制序列RNA反转录合成的cDNA），其余为无RNase去离子水，反应总体积通常为20μL。
⑥ABL内参基因荧光定量PCR反应液：由荧光定量PCR混合液和检测ABL内参基因的引物、探针组成：1×的PCR预混合液（Qiagen公司，产品货号：210212，2×PCR Premix）、2.5-4.0mM的Mg2+、0.2-0.4mM的dNTPs、0.3-0.6mM的dUTP、0.2U/μL的Taq酶和0.01-0.05U/μL的UNG酶、0.25pmol/μL的ABL内参基因上游引物（序列表中序列4）、0.25pmol/μL的ABL内参基因下游引物（序列表中序列5）、0.3pmol/μL的ABL基因Taqman荧光探针（序列表中序列6）（以上所有的浓度都是指PCR反应体系的终浓度）。检测时，加入ABL基因标准品模板2μL，反应总体积通常为20μL。
⑦内部阳性控制序列荧光定量PCR反应液：由荧光定量PCR混合液和检测内部阳性控制序列的引物、探针组成：1×的PCR预混合液（Qiagen公司，产品货号：210212，2×PCRPremix）、2.5-4.0mM的Mg2+、0.2-0.4mM的dNTPs和0.3-0.6mM的dUTP、0.2U/μL的Taq酶和0.01-0.05U/μL的UNG酶、0.25pmol/μL的内部阳性控制序列上游引物（序列表中序列8）、0.25pmol/μL的内部阳性控制序列下游引物（序列表中序列9）、0.3pmol/μL的内部阳性控制序列Taqman荧光探针（序列表中序列10）（以上所有的浓度都是指PCR反应体系的终浓度）。检测时，通常取1-2μL的模板（内部阳性控制序列RNA反转录合成的cDNA），其余为无RNase去离子水，反应总体积通常为20μL。
3、PCR扩增程序的设定：在lightcycler仪器上先经过50℃10s，95℃10min，然后再经过95℃15s，60℃1min，共40个循环。
实施例2.用实施例1制备的试剂盒检测WT1基因mRNA的表达量
以检测30例急性髓或淋巴细胞性白血病患者骨髓组织标本结果为例。
用本发明的试剂盒检测WT1基因mRNA表达量的检测流程为：首先根据基因序列设计特异性的引物和荧光探针。其次获取临床急性髓或淋巴细胞性白血病患者骨髓组织样本，快速提取组织RNA，进行逆转录PCR合成cDNA第一链；先配制ABL内参基因和内部阳性控制序列的荧光定量PCR反应液，将内部阳性控制序列标准品和ABL标准品分别稀释至拷贝数/mL为1.0x103、1.0x104、1.0x105和1.0x106，分别制作内部阳性控制序列标准品标准曲线（如图1A和图1B所示）和ABL标准品标准曲线（如图2A和图2B所示），然后再配制WT1基因荧光定量PCR反应液，进行荧光定量PCR检测样品，在荧光定量PCR仪数据分析系统中读出CT值结果。PCR扩增结束后，首先分析内部阳性控制序列扩增结果，如果其Ct值小于33，提示整个检测过程有效，如果其Ct值大于35，提示检测失败，则需要重新进行检测，如果其Ct值位于33~35之间，需要重复检测。当内部阳性控制序列Ct值小于33时，将实时荧光定量PCR所得数据进行计算，分别计算WT1基因及ABL基因的Ct值，两者之差即为ΔCt值。最后，荧光定量PCR结果采用软件分析，并标化计算样本数据。
具体步骤如下：
①急性髓或淋巴细胞性白血病患者骨髓组织总RNA的抽提：按RNA抽提纯化的方法抽提急性髓或淋巴细胞性白血病患者骨髓组织总RNA。提取的RNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，通过紫外分光光度计测定260nm与280nm光密度值计算RNA的纯度与浓度，用0．1％DEPC处理的水调节抽提的RNA至相同浓度。
②反转录合成cDNA：取2μL上述RNA提取液，在70℃保温10min，随后加入实施例1提供的本发明试剂盒组成②cDNA第一链合成试剂盒，即：25mmol/L MgC124μL，10×逆转录酶缓冲液2μL，10mmol/L dNTPs 2μL，RNA酶抑制剂0.5μL，Oligo(dT)150.5μg和AMV逆转录酶1.5U，补加无RNase去离子水至总体积20μL，于42℃保温15min，进行逆转录反应，合成cDNA第一链。反应结束后，加热至99℃，5min以灭活逆转录酶，加20μL无菌水混匀置冰箱-20℃保存。
取1μL浓度为2μg/ml内部阳性控制序列RNA(序列表中序列7)，在70℃保温10min，随后加入实施例1提供的本发明试剂盒组成②cDNA第一链合成试剂盒，即：25mmol/L MgC124μL，10×逆转录酶缓冲液2μL，10mmol/L dNTPs 2μL，RNA酶抑制剂0.5μL，Oligo(dT)150.5μg和AMV逆转录酶1.5U，补加无RNase去离子水至总体积20μL，于42℃保温15min，进行逆转录反应，合成cDNA。反应结束后，加热至99℃，5min以灭活逆转录酶，加20μL无菌水混匀置冰箱-20℃保存。
取1μL浓度为2μg/ml的阳性对照RNA，在70℃保温10min，随后加入实施例1提供的本发明试剂盒组成②cDNA第一链合成试剂盒，即：25mmol/L MgC124μL，10×逆转录酶缓冲液2μL，10mmol/L dNTPs 2μL，RNA酶抑制剂0.5μL，Oligo(dT)150.5μg和AMV逆转录酶1.5U，补加无RNase去离子水至总体积20μL，于42℃保温15min，进行逆转录反应，合成cDNA。反应结束后，加热至99℃，5min以灭活逆转录酶，加20μL无菌水混匀置冰箱-20℃保存。
③将内部阳性控制基因序列标准品和ABL标准品分别稀释至拷贝数/mL为1.0x103、1.0x104、1.0x105和1.0x106，用实施例1提供的内部阳性控制序列和ABL内参基因的荧光定量PCR反应液，分别制作内部阳性控制序列标准品标准曲线（如图1A和图1B所示）和ABL标准品标准曲线（如图2A和图2B所示）。
④WT1基因荧光定量PCR扩增：PCR反应体系为20μL：含1×PCR预混合液（Qiagen公司，产品货号：210212，2×PCR Premix）10.0μL，2.5-4.0mM的Mg2+、0.2-0.4mM的dNTPs和0.3-0.6mM的dUTP、0.2U/μL的Taq酶和0.01-0.05U/μL的UNG酶，WT1基因上游引物终浓度0.2mol/L，WT1基因下游引物终浓度0.2μmol/L，WT1基因Taqman荧光探针终浓度0.3μmol/L，被测样品RNA反转录合成的cDNA1.0μL，同时加入内部阳性控制序列上、下游引物终浓度为均0.2μmol/L，内部阳性控制序列Taqman荧光探针终浓度0.3μmol/L，终浓度为0.2μmol/L的内部阳性控制序列RNA反转录合成的cDNA（②中反转录合成的cDNA），加入超纯水至总体积20μL。在lightcycler荧光定量PCR仪上反应：扩增条件为95℃10min预变性，然后95℃15s，60℃1min扩增40个循环，扩增过程中仪器自动收集荧光信号。
⑤ABL内参基因荧光定量PCR扩增：PCR反应体系为20μL：含2×PCR混合液（Qiagen公司，产品货号：210212，2×PCR Premix）10.0μL，2.5-4.0mM的Mg2+、0.2-0.4mM的dNTPs和0.3-0.6mM的dUTP、0.2U/μL的Taq酶和0.01-0.05U/μL的UNG酶，ABL基因上、下游引物终浓度均为0.2μmol/L，ABL基因的Taqman荧光探针终浓度0.2μmol/L，ABL基因cDNA1.0μL，加入无RNase去离子水补至总体积20μL。在lightcycler荧光定量PCR仪上反应：扩增条件为95℃10min预变性，然后95℃15s，60℃1min扩增40个循环，扩增过程中仪器自动收集荧光信号。
⑥阳性对照、阴性对照荧光定量PCR扩增：PCR反应体系为20μL：含2×PCR混合液（Qiagen公司，产品货号：210212，2×PCR Premix）10.0μL，2.5-4.0mM的Mg2+、0.2-0.4mM的dNTPs和0.3-0.6mM的dUTP、0.2U/μL的Taq酶和0.01-0.05U/μL的UNG酶，WT1基因上、下游引物终浓度均为0.2μmol/L，WT1基因Taqman荧光探针终浓度0.3μmol/L，阳性对照RNA反转录合成的cDNA 1.0μL或者阴性对照去离子水1.0μL，加入无RNase去离子水补至总体积20μL。在lightcycler荧光定量PCR仪上反应：扩增条件为95℃10min预变性，然后95℃15s，60℃1min扩增40个循环，扩增过程中仪器自动收集荧光信号。
⑦数据收集处理和分析：PCR扩增结束后，首先分析内部阳性控制序列扩增结果，如果其Ct值小于33，提示整个检测过程有效，如果其Ct值大于35，则需要重新进行检测。当内部阳性控制序列Ct值小于33时，将实时荧光定量PCR所得数据进行计算，得出WT1基因相对于ABL内参基因的相对表达量后再进行统计分析，以比值大于或等于1.5为阳性表达，小于1.5为阴性表达（具体参见表1）：
表1为荧光定量PCR分析基因WT1在急性淋巴（或髓系）细胞白血病中的表达
| 样品 | WT1模板 | ABL模板 | WT1/ABL |
| 急性淋巴（或髓系）细胞白血病 | 437239644 | 197543321 | 2.213 |
| 急性淋巴（或髓系）细胞白血病 | 310023451 | 298871334 | 1.037 |
| 急性淋巴（或髓系）细胞白血病 | 301128954 | 311127655 | 0.968 |
| 急性淋巴（或髓系）细胞白血病 | 212900766 | 300128349 | 0.709 |
| 急性淋巴（或髓系）细胞白血病 | 90087642 | 301992774 | 0.298 |
| 急性淋巴（或髓系）细胞白血病 | 478988231 | 278854112 | 1.718 |
| 急性淋巴（或髓系）细胞白血病 | 432997541 | 275540085 | 1.571 |
| 急性淋巴（或髓系）细胞白血病 | 439971103 | 265186573 | 1.659 |
| 急性淋巴（或髓系）细胞白血病 | 441010476 | 178765561 | 2.467 |
| 急性淋巴（或髓系）细胞白血病 | 436607711 | 212104099 | 2.058 |
| 急性淋巴（或髓系）细胞白血病 | 332775112 | 275693441 | 1.207 |
| 急性淋巴（或髓系）细胞白血病 | 172836661 | 359765112 | 0.480 |
| 急性淋巴（或髓系）细胞白血病 | 359865102 | 349772100 | 1.029 |
| 急性淋巴（或髓系）细胞白血病 | 229865771 | 338976102 | 0.678 |
| 急性淋巴（或髓系）细胞白血病 | 499970012 | 239017285 | 2.092 |
| 急性淋巴（或髓系）细胞白血病 | 407738353 | 321223004 | 1.269 |
| 急性淋巴（或髓系）细胞白血病 | 90778245 | 289176485 | 0.314 |
| 急性淋巴（或髓系）细胞白血病 | 437708192 | 338192121 | 1.294 |
| 急性淋巴（或髓系）细胞白血病 | 471110033 | 165233222 | 2.851 |
| 急性淋巴（或髓系）细胞白血病 | 353591231 | 320019337 | 1.105 |
| 急性淋巴（或髓系）细胞白血病 | 329987001 | 278007008 | 1.187 |
| 急性淋巴（或髓系）细胞白血病 | 310088999 | 321200140 | 0.965 |
| 急性淋巴（或髓系）细胞白血病 | 464712834 | 178949223 | 2.597 |
| 急性淋巴（或髓系）细胞白血病 | 441728384 | 192377484 | 2.296 |
| 急性淋巴（或髓系）细胞白血病 | 89174959 | 318826495 | 0.280 |
| 急性淋巴（或髓系）细胞白血病 | 379127738 | 238816957 | 1.588 |
| 急性淋巴（或髓系）细胞白血病 | 449102749 | 217834659 | 2.062 |
| 急性淋巴（或髓系）细胞白血病 | 478926210 | 202018891 | 2.371 |
| 急性淋巴（或髓系）细胞白血病 | 88017738 | 276617765 | 0.318 |
| 急性淋巴（或髓系）细胞白血病 | 497172835 | 261884122 | 1.898 |
上述表中WT1模板和ABL模板中的数值均表示荧光累计值。
试剂盒检测能力评价：
以探针杂交法作为比较的检测方法，同时对上述30例急性髓或淋巴细胞性白血病患者骨髓组织标本进行检测，比较结果显示，采用本发明本试剂盒进行检测其敏感性、特异性及灵敏度较免疫组化法更为精确，完全符合目前临床诊疗实用要求（具体参见表2）：
表2为两种不同方法检测急性髓细胞性白血病中WT1基因表达的比较
由上表可知，通过探针杂交法检验荧光定量法，探针杂交法作为参照，荧光定量法和探针杂交法同时检测到21例高表达，而探针杂交法检测到了2例低表达，由此得出，荧光定量法的阳性预测值为95.5%；荧光定量法和探针杂交法同时检测到7例低表达，均未检测检测出低表达，由此得出，荧光定量法的阴性预测值为100%。
其中：
①特异性：87.5%；
②灵敏度：100%；
③阳性预测值：阳性预测值达到95.5%；
④阴性预测值：阴性预测值达到100%；
⑤重复性：多次重复实验结果一致；
⑥耗时：一份临床标本的检测时间约为4h，耗时短，而免疫组化法耗时约72h。
上述实验可以说明，采用敏感性及特异性均较高的荧光定量PCR检测WT1基因mRNA水平，其检测结果的特异性和敏感度均显著提高，采用内部阳性控制序列监控整个检测过程，有效地保证了每次检测的质量。
本发明实施例提供了一种能够监测整个检测过程的急性髓或淋巴细胞白血病基因WT1实时荧光定量PCR检测试剂盒，采用人工设计与合成的内部阳性控制序列，监测急性髓或淋巴细胞性白血病WT1基因实时荧光定量PCR检测的整个过程，能有效地解决目前急性髓或淋巴细胞性白血病WT1基因实时荧光定量PCR检测过程中的假阳性和假阴性问题，使得检测结果更可靠，该试剂盒为临床评估急性髓或淋巴细胞性白血病的诊断、预后以及复发周期提供了一种全新的快速简便的基因诊断技术。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种检测WT1基因mRNA表达量的试剂盒，包括检测用引物、荧光探针、cDNA第一链合成试剂、荧光定量PCR混合液、阴性对照和阳性对照，其特征在于，所述检测用引物、荧光探针包括WT1基因引物、内参基因ABL引物及Taqman荧光探针，其中：
WT1基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；
WT1基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；
WT1基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:3所示；
ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:4所示；
ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:5所示；
ABL基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:6所示；
所述cDNA第一链合成试剂含有MgCl2、逆转录酶缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂、Oligo(dT)15、AMV逆转录酶和无RNase去离子水；所述荧光定量PCR混合液含有PCR预混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq酶、UNG酶和无RNase去离子水。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内部阳性控制序列、内部阳性控制序列的引物和Taqman荧光探针，其中：内部阳性控制序列如序列表中SEQ IDNO:7所示；内部阳性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID NO:8所示；内部阳性控制序列的下游引物如序列表中SEQ ID NO:9所示；内部阳性控制序列的Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:10所示。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述WT1基因的Taqman荧光探针和ABL基因的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团FAM，3’端均连接有荧光淬灭基团TAMRA；所述内部阳性控制序列的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团TET，3’端连接有荧光淬灭基团TAMRA。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述内参基因ABL的核酸序列如序列表中SEQ ID NO:11所示。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为去离子水；所述阳性对照为含有WT1基因的总RNA样品。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述cDNA第一链合成试剂为：25mmol/LMgCl2 4μL，10×逆转录酶缓冲液2μL，10mmol/L dNTP 2μL，RNA酶抑制剂0.5μL，Oligo(dT)15 0.5μg，AMV逆转录酶1.5U和无RNase去离子水，总体积11μL。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR的混合液为：1×的PCR预混合液、2.5-4.0mM的Mg2+、0.2-0.4mM的dNTPs、0.3-0.6mM的dUTP、0.2U/μL的Taq酶、0.01-0.05U/μL的UNG酶和无RNase去离子水。
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