CN112626215A - Aml预后相关基因表达检测试剂盒 - Google Patents

Aml预后相关基因表达检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种AML预后相关基因表达检测试剂盒。所述试剂盒包括用于AML预后相关基因表达检测的分子探针，以及用于检测内参基因ABL1表达的分子探针。本发明针对与AML预后相关性最高的10个基因，设计了用于检测各基因转录本mRNA的探针，在同一孔中对这些标志基因的表达进行NanoString数字化表达检测，绘制数字基因表达谱，可用于AML预后判断和治疗效果的辅助评估。本发明提供的检测试剂盒具有通量高，耗时短，所用标本量少，可重复性好，准确性和敏感性高等优点，且检测结果与RT‑PCR定量技术相当。

Description

AML预后相关基因表达检测试剂盒
技术领域
本发明涉及核酸检测领域，具体地说，涉及一种AML预后相关基因表达检测试剂盒。
背景技术
急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是造血系统的髓系原始细胞克隆性恶性增殖性疾病。现有用于AML预后判断和治疗效果评估的方法主要是实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，RQ-PCR)，该方法敏感性高，准确性好，是目前最常用的检测方法；但其通量不足，在需要同时对多个基因定量的情况下，实验设计及操作步骤繁琐。
NanoString数字化基因检测技术是新一代的多重核酸定量技术，在基因表达谱的验证、研究和临床应用中扮演了越来越重要的角色。NanoString技术在一个体系中可进行逾八百个的颜色条码探针和特异性序列的杂交反应，最后直接以数字化输出的形式读取定量结果。该技术自动化程度高，反应中无需酶逆转录及扩增的过程，避免了相关偏差，其检测敏感性、准确性与实时荧光定量PCR技术相当。目前，NanoString数字基因检测技术在高通量研究结果验证、基因调控机理、疾病临床分子分型等方面发挥了重要作用。其研究涉及动植物发育、炎症、免疫、干细胞、肿瘤、药物耐药、信号转导等多个领域。
发明内容
本发明的目的是提供一种AML预后相关基因表达检测试剂盒。
本发明的另一目的是提供基于NanoString技术检测AML预后相关基因表达水平的方法。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种用于AML预后相关基因表达检测的分子探针，所述AML预后相关基因选自AF1q(GenBank：NM_006818.3)、BAALC(GenBank：NM_024812.2)、BRE(GenBank：NM_004899.3)、ERG(GenBank：NM_182918.3)、FLT3(GenBank：NM_004119.1)、MLL5(GenBank：NM_182931.2)、MN1(GenBank：NM_002430.2)、PRAME(GenBank：NM_006115.3)、EVI1(GenBank：NM_005241.2)和WT1(GenBank：NM_000378.3)中的至少一个。
所述分子探针由报告探针和捕获探针按5’-3’方向串联而成；所述报告探针为荧光分子条形码(DNA单链条形码)；
所述捕获探针为3’端带有生物素的DNA分子，且可与目标基因转录得到的mRNA特异性结合。每条捕获探针分别对应于不同的荧光分子条形码。
优选地，所述AML预后相关基因为AF1q、BAALC、BRE、ERG、FLT3、MLL5、MN1、PRAME、EVI1和WT1，它们对应的分子探针为P1～P10，P1～P10的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-10所示。
第二方面，本发明提供含有所述分子探针的检测试剂或试剂盒。
第三方面，本发明提供AML预后相关基因表达检测试剂盒，所述试剂盒包含所述分子探针以及用于检测内参基因ABL1表达的分子探针P11；P11的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。
第四方面，本发明提供一种用于AML预后相关基因表达检测的杂交反应体系，所述反应体系如下：
组分 体积
Reporter CodeSet+hybridization buffer混合液 8μL
RNA 5μL
Capture ProbeSet 2μL
注：Reporter CodeSet、Capture ProbeSet均为订制试剂，来自NanoStringTechnologies。
第五方面，本发明提供基于NanoString技术检测AML预后相关基因表达水平的方法，所述AML预后相关基因为AF1q、BAALC、BRE、ERG、FLT3、MLL5、MN1、PRAME、EVI1和WT1。所述方法包括：从骨髓或外周血样本中提取RNA，质控后，与分子探针P1～P11混合杂交，杂交完成后，经过纯化洗脱，将杂交产物固定于样品板，经电极极化等步骤，使所有杂交信号以同一方向位于同一成像平面上，进而可由数字成像分析系统对样本板上的报告荧光信号进行扫描，处理图片信息及数字计数。图片信息处理中，每一个特异颜色条形码标记的探针信号将对应一个特异的mRNA序列，即这一特异mRNA分子的一次计数，最终将产生一个对应于反应体系中多个颜色条码即多个特异目标mRNA分子计数信息的计数文件，从而实现对多种目标mRNA序列的绝对计数。
本发明筛选出与AML预后相关性最高的10个基因，设计了用于检测各基因转录本mRNA的探针，在同一孔中对这些标志基因的表达进行NanoString数字化表达检测，绘制数字基因表达谱，可用于AML预后判断和治疗效果的辅助评估。与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：
(一)检测通量高。
(二)手工操作耗时短(杂交体系配制约10分钟，样本制备站准备工作约5分钟)。
(三)所用标本量少。
(四)可重复性好，准确性和敏感性高，检测结果与RT-PCR定量技术相当。
附图说明
图1为NanoString数字基因表达谱技术探针设计原理。
图2为本发明较佳实施例中单分子成像结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例中使用的试剂Reporter CodeSet、Capture ProbeSet、hybridizationbuffer来自NanoString Technologies。
NanoString系统包含2个仪器Prep Station和Digital Analyzer。
实施例1用于AML预后相关基因表达检测的分子探针的设计与合成
本发明是基于NanoString技术，即核酸分子与探针杂交后，对探针上的颜色分子条形码标记直接探测、计数，从而实现多重定量的检测技术。其核心技术原理包括分子条形码技术和单分子成像数字计数技术。NanoString可检测各种类型的核酸，本发明针对AML预后相关基因AF1q、BAALC、BRE、ERG、FLT3、MLL5、MN1、PRAME、EVI1和WT1，以它们转录得到的mRNA为检测对象。
分子条形码技术的原理为：在NanoString杂交反应体系中，针对每一个目标mRNA分子设计一对分子探针，每对探针包括一个在5’端载有颜色条形码color barcode)标记的约35～50bp的报告探针和一个在3’端载有生物素的约35～50bp捕获探针。报告探针5’端标记的颜色条形码共有6个位置，每个位置可以是4种颜色的荧光团中的一种。探针的颜色条码标记使得每一种条码对应每一特异的目标mRNA序列。条码中6个序列位置的4种颜色排列组合理论上允许有46(4096)种方式，但需要排除易混淆的相近颜色条形码的探针和内置阳性对照、阴性对照所需的探针，在一个标本中可同时检测约八百个不同的条码即约八百种不同的目标mRNA序列。NanoString数字基因表达谱技术探针设计原理见图1。
单分子成像技术：单分子成像是指对反应体系中各个特异mRNA目标分子进行直接的绝对数字计数。样品探针混合物杂交完成后，经过纯化洗脱，将杂交产物固定于样品板，经电极极化等步骤，使所有杂交信号以同一方向位于同一成像平面上，进而可由数字成像分析系统对样本板上的报告荧光信号进行扫描、处理图片信息及数字计数。图片信息处理中，每一个特异颜色条形码标记的探针信号将对应一个特异的mRNA序列，即这一特异mRNA分子的一次计数，最终将产生一个对应于反应体系中多个颜色条码即多个特异目标mRNA分子计数信息的计数文件，从而实现对多种特异mRNA序列的绝对计数(图2)。
本发明根据AF1q、BAALC、BRE、ERG、FLT3、MLL5、MN1、PRAME、EVI1和WT1各基因的保守区域，分别设计了探针P1～P10，同时还针对内参基因ABL1设计了探针P11，用于对各基因转录得到的mRNA进行检测。
具体检测方法如下：
从骨髓或外周血样本中提取RNA，
1、质控
(1)RNA浓度：30ng/μL。
(2)RNA质量：A260/A280＝1.5～2.0；A260/A230＝1.5～2.0
2、杂交
(1)PCR仪预热杂交程序：热盖70℃，体积15μL，PCR程序：65℃，1h；65℃，18h；4℃，恒温。
(2)杂交体系配制：
a.将Reporter CodeSet和Capture ProbeSet提前从冰箱中取出静置，于室温溶解，颠倒混匀，低速瞬时离心。
b.配置工作液：用移液器吸取70μL hybridization buffer加入到ReporterCodeSet管中，颠倒混匀，低速瞬时离心。
c.标记杂交使用12联管，在每孔中加入8μL工作液。
d.在每孔中加入5μL RNA样本。颠倒混匀，低速瞬时离心。
e.在每孔中加入2μL Capture ProbeSet。颠倒混匀，低速瞬时离心。
(3)迅速将配制好的杂交体系置于已经预热的PCR仪中，并跳过第一步程序，进入第二步“65℃，18h”程序(尽量缩短加入2μL Capture ProbeSet与放入PCR仪操作之间的时间)。
3、纯化固定
(1)将reagent plates(试剂板)和cartridge(样本槽)从冰箱中取出，室温下静置，reagent plate以2000g离心2分钟。
(2)依次将reagent plates，cartridge，tips(移液枪头)，空白12联管，装有杂交产物的12联管放置在Prep Station(样本制备站)中，启动程序，进行纯化固定。
程序完成后，在cartridge上贴上封板贴纸，处理废弃物。
(3)扫描：将cartridge置于Digital Analyzer(数字分析仪)中进行扫描，扫描完成后拷贝数据，在电脑上分析结果。
4、分析检测结果
将下机的RCC数据导入到nSovler软件中，与数据库一起进行数据标准化分析后，排序计算该样本的百分位数。
实施例2 AML患者样本检测实例
1、标本提取
用Trizol方法从12例AML患者的骨髓样本中提取总RNA，分别标记为AML01，AML02，AML03，AML04，AML05，AML06，AML07，AML08，AML09，AML10，AML11，AML12。
2、质控
(1)浓度测定，浓度低于30ng/μL的样本重提，浓度高于30ng/μL的样本用无菌水稀释至30±3ng/μL，如表1所示；
表1
样本 浓度(ng/μL) A<sub>260</sub>/A<sub>280</sub> A<sub>260</sub>/A<sub>230</sub>
AML01 30.12 1.89 1.56
AML02 29.83 1.97 1.81
AML03 27.53 1.92 1.73
AML04 29.58 1.85 1.69
AML05 28.93 1.90 1.77
AML06 28.00 1.89 1.88
AML07 32.12 1.89 1.82
AML08 30.02 1.89 1.94
AML09 31.23 1.87 1.58
AML10 29.85 1.86 1.82
AML11 31.30 1.90 1.54
AML12 32.57 1.90 1.83
3、杂交
(1)PCR仪预热杂交程序：热盖70℃，体积15μL，PCR程序：65℃，1h；65℃，18h；4℃，恒温。
(2)杂交体系配制：
a.将Reporter CodeSet和Capture ProbeSet提前从冰箱中取出静置，于室温溶解，颠倒混匀，低速瞬时离心。
b.配置工作液：用移液器吸取70μL hybridization buffer加入到ReporterCodeSet管中，颠倒混匀，低速瞬时离心。
c.标记杂交使用12联管，在每孔中加入8μL工作液。
d.在每孔中加入5μL RNA样本。颠倒混匀，低速瞬时离心。
e.在每孔中加入2μL Capture ProbeSet。颠倒混匀，低速瞬时离心。
(3)迅速将配制好的杂交体系置于已经预热的PCR仪中，并跳过第一步程序，进入第二步“65℃，18h”程序(尽量缩短加入2μL Capture ProbeSet与放入PCR仪操作之间的时间)。
3、纯化固定
(1)将reagent plates和cartridge从冰箱中取出，室温下静置，reagent plate以2000g离心2分钟。
(2)依次将reagent plates，cartridge，tips，空白12联管，装有杂交产物的12联管放置在Prep Station中，启动程序，进行纯化固定。
程序完成后，在cartridge上贴上封板贴纸，处理废弃物。
(3)扫描：将cartridge置于Digital Analyzer(数字分析仪)中进行扫描，扫描完成后拷贝数据，在电脑上分析结果。
4、分析检测结果
将下机的RCC数据导入到nSovler软件中，与数据库一起进行数据标准化分析后，排序计算该样本的百分位数，以样本AML01为例。结果见表2。
表2
基因 原始拷贝数 标准化拷贝数 表达百分位数
BAALC 279 420.16 69.70％
BRE 706 1063.19 13.64％
EVI1 213 1.51 46.97％
FLT3 1 123.49 7.58％
MLL5 82 236.43 7.58％
MLLT11(AF1q) 157 22.59 51.52％
MN1 15 69.27 84.85％
ERG 46 320.76 24.24％
PRAME 5 7.53 60.61％
WT1 5 7.53 22.73％
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 武汉康圣达医学检验所有限公司
<120> AML预后相关基因表达检测试剂盒
<130> KHP201118350.1
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggaataggac taggtttatt tacccattgt gagggtagag aggcgagtct ggaggagcag 60
ggattgggag aaggggtgga aaaatactct gattcttaaa 100
<210> 2
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aagaatcaca aagaactgtg tcaactagca gagagtccaa gcagaagggc agatggactt 60
cttcagtgtc cttcacggca ctggatccca tcaaagaacc 100
<210> 3
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atctagcgtg gtccggaatg gaaaagtggg actggatgct acaaactgtt tgaggataac 60
tgacttaaaa tctggctgca catcattgac tcctgggccc 100
<210> 4
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctccactacc tcagagagac tcctcttcca catttgactt cagatgatgt tgataaagcc 60
ttacaaaact ctccacggtt aatgcatgct agaaacacag 100
<210> 5
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaatggaaaa ccaggacgcc ctggtctgca tatctgagag cgttccagag ccgatcgtgg 60
aatgggtgct ttgcgattca cagggggaaa gctgtaaaga 100
<210> 6
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gccttacacc acccacctca tcaaggacct ccactttttc cttcgagtgc tcatccaact 60
gtaccaccgt atccctcaca agctacacat cataccactt 100
<210> 7
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cacggagggt gacgaaccaa ggagccgtcg actcgctgga atacaattac ccgggcgagg 60
cgccctcggg acattttgac atgttttcgc cctctgactc 100
<210> 8
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aggacctggt ctttgatgag tgtgggatca cggatgatca gctccttgcc ctcctgcctt 60
ccctgagcca ctgctcccag cttacaacct taagcttcta 100
<210> 9
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctgcggcgga atccagtgct atccagtcca taagccacgt atgacgttat caaggttgac 60
cagagtggga ccaagtccaa cagtagcatg gctctttcat 100
<210> 10
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tcagagagca aggcatcggg ggtgaatctt gtctaacatt cccgaggtca gccaggctgc 60
taacctggaa agcaggatgt agttctgcca ggcaactttt 100
<210> 11
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctgcgtgagc tatgtggatt ccatccagca aatgaggaac aagtttgcct tccgagaggc 60
catcaacaaa ctggagaata atctccggga gcttcagatc 100

Claims (4)

1.用于AML预后相关基因表达检测的分子探针，其特征在于，所述AML预后相关基因选自AF1q、BAALC、BRE、ERG、FLT3、MLL5、MN1、PRAME、EVI1和WT1中的至少一个；
所述分子探针由报告探针和捕获探针按5’-3’方向串联而成；所述报告探针为荧光分子条形码；
所述捕获探针为3’端带有生物素的DNA分子，且可与目标基因转录得到的mRNA特异性结合。
2.根据权利要求1所述的分子探针，其特征在于，所述AML预后相关基因为AF1q、BAALC、BRE、ERG、FLT3、MLL5、MN1、PRAME、EVI1和WT1，它们对应的分子探针为P1～P10；P1～P10的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-10所示。
3.含有权利要求1或2所述分子探针的检测试剂或试剂盒。
4.AML预后相关基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1或2所述分子探针以及用于检测内参基因ABL1表达的分子探针P11；
P11的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。
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Denomination of invention: AML prognostic related gene expression detection kit

Granted publication date: 20230324

Pledgee: Pudong Shanghai Development Bank Limited by Share Ltd. Wuhan branch

Pledgor: WUHAN KINDSTAR MEDICAL TESTING INSTITUTE CO.,LTD.

Registration number: Y2024980003351

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