CN111856014A - 诊断和治疗膀胱癌的分子标志物mllt11及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种MLLT11作为特异性标志物在制备诊断和治疗膀胱癌的药物中的应用。本发明还同时提供了一种用于检测膀胱癌的试剂盒,膀胱癌诊断试剂盒包括与MLLT11蛋白特异性结合的抗体。本发明还公开了MLLT11基因表达的抑制剂用于制备治疗膀胱癌的药物。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及膀胱癌进展研究的新靶标及其应用,更具体涉及MLLT11作为膀胱癌增殖和转移研究的靶标及其应用。MLLT11作为膀胱癌诊断和预后的标志物,及MLLT11作为膀胱癌标志物在制备分子靶向药物中的应用。
背景技术
据2017年世界肿瘤学权威杂志《cancer statistics》统计,膀胱癌位于美国恶性肿瘤的第四位,每年大约有16,870例患者死亡。我国国家中央癌症登记中心(NCCR)分析评估膀胱癌的发病率和死亡率均占泌尿系统肿瘤的首位,而且近几年具有上升的趋势。临床上膀胱癌主要分为尿路上皮癌、鳞状细胞癌和腺癌三大类,其中尿路上皮癌占膀胱癌90%以上,虽然目前关于尿路上皮癌临床治疗技术的改善和相应的生物分子标记物的发现已取得大的进步,但是据统计仍有大部分膀胱尿路上皮癌患者病情易复发,5年生存率低下,最终进展为侵袭型膀胱癌。因此,寻找新的诊断或治疗膀胱癌的分子标记物具有十分重要的意义。
Mixed-Lineage Leukemia,Translocated to 11(MLLT11,又名AF1Q),定位于人类1号染色体长臂2区1带(1q21),该基因最初发现于携带有t(1;11)(q21;q23)染色体易位的急性骨髓性白血病(AML)患者体内。已有研究表明MLLT11在人类血液系统肿瘤中发挥着促进肿瘤形成的作用,在儿童急性骨髓性白血病(AML)、成人正常细胞遗传学的急性髓性白血病和成年骨髓增生异常综合征(MDS)中是一个预后不良生物标志物。而MLLT11在非血液系统肿瘤中的表达情况及相关功能和机制的研究较少,目前MLLT11在乳腺癌、卵巢癌中报道提示MLLT11与之不良预后相关,高表达MLLT11与神经元发育成负相关。
目前现有的诊断和治疗膀胱癌的分子标志物包括ImmunoCyt,核基质蛋白22(NMP22),膀胱肿瘤抗原(BTA),荧光原位杂交检测技术(FISH)。ImmunoCyt是一种新开发的结合了尿细胞学和荧光免疫细胞化学的独创技术,对低级别和非肌层浸润性的有较高的敏感性,但该项检查需要在荧光显微镜下观察结果,对器械和场所要求高,且成本高,操作繁琐,对检验医生水平要求高;NMP22含量与膀胱肿瘤大小、分期、分级呈正相关,但由于泌尿系统感染、结石、前列腺增生、放疗、BCG治疗、泌尿系统腔内器械操作等均会增加NMP22的假阳性率;膀胱肿瘤抗原(BTA)其灵敏度在低级别膀胱癌中较低,而在高级别膀胱癌中较高,其主要缺点是易随尿液状态的改变而出现假阳性,如浓缩尿、血尿、行侵入性检查及经BCG治疗后;荧光原位杂交检测技术(FISH)在膀胱癌的诊断及复发监控中具有较高的灵敏度和特异性,并对膀胱癌的术前分级有较高的临床价值,但其对操作过程和结果分析的要求都比较高,一些实验因素常会影响检测结果的真实性。
上述现有的诊断和治疗膀胱癌的分子标志物与乳腺癌、卵巢癌等无关联性。
迄今为止,MLLT11在膀胱癌中的作用尚未公布。
目前对于膀胱癌的诊断以及早期发现转移的预测指标仍然欠缺,且目前的临床治疗手段并未提高膀胱癌患者的生存率,尤其是晚期转移病人,因此,我们亟需寻找新的更特异和敏感的生物学靶标来预测膀胱癌的发展,以及治疗膀胱癌患者的新靶标。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供MLLT11作为膀胱癌增殖和转移的靶标及其应用。
为了解决上述技术问题,本发明提供MLLT11作为特异性标志物(与膀胱癌发展密切相关的特异性标志物)在制备诊断和治疗膀胱癌的药物中的应用。
作为本发明应用的改进:特异性标志物为MLLT11蛋白;MLLT11蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
作为本发明应用的进一步改进:制备用于检测膀胱癌的试剂盒。
作为本发明应用的进一步改进:所述膀胱癌诊断试剂盒包括与MLLT11蛋白特异性结合的抗体。
作为本发明应用的进一步改进:MLLT11基因表达的抑制剂用于制备治疗膀胱癌的药物。
作为本发明应用的进一步改进:药物包含抑制MLLT11基因表达的抑制剂和药物学可接受的载体。
作为本发明应用的进一步改进:所述抑制剂为敲除MLLT11基因表达的CRISPR-Cas9质粒。
作为本发明应用的进一步改进:所述敲除MLLT11基因表达的CRISPR-Cas9质粒选自KO MLLT11#1,KO MLLT11#2、KO MLLT11#3中的至少一种;所述KO MLLT11#1序列如SEQ IDNO:1所示;所述KO MLLT11#2的序列如SEQ ID NO:2所示;所述KO MLLT11#3的序列如SEQ IDNO:3所示。
本发明所采取的技术方案如下:通过生物信息学分析TCGA数据库(Cancer GenomeAtlas)中膀胱癌的数据,筛查到MLLT11在膀胱癌中表达上调,进一步采用免疫组织化学染色(IHC)技术检测MLLT11在人膀胱癌组织与癌旁组织中的表达情况及通过蛋白免疫印迹检测膀胱上皮正常细胞及膀胱癌细胞系中MLLT11的表达水平。
体外软琼脂集落形成实验(soft agar assay)检测MLLT11对膀胱癌细胞生长增殖能力的影响,同时体外Transwell实验证明MLLT11可在体外促进膀胱癌细胞迁移和浸润。
进一步敲除MLLT11可在体外显著抑制膀胱癌细胞增殖,迁移和浸润,在体内显著抑制膀胱癌细胞移植瘤和肺转移灶的形成。
本发明具有如下有益效果:
1.生物信息学分析TCGA数据库及临床膀胱癌组织中MLLT11表达均呈显著上调趋势,且MLLT11表达与膀胱癌患者的5年无病生存期(DFS)和总体生存期(OS)呈负相关。可见,MLLT11可以辅助诊断膀胱癌并作为膀胱癌的预后指标。
2.本发明在T24T,UMUC3细胞构建了敲除MLLT11表达的稳转细胞株,功能实验表明抑制MLLT11表达可以在体内抑制膀胱癌细胞的增殖和转移及体内异位移植瘤及肺转移灶。可见,用MLLT11表达抑制剂可以敲除MLLT11从而为膀胱癌的治疗提供一个潜在的治疗靶点。
虽然,目前MLLT11在乳腺癌、卵巢癌中的报道表明MLLT11可能发挥着促癌因子作用,但是本发明的研究不仅通过大量临床样本验证MLLT11在膀胱癌中表达升高,而且发现高表达的MLLT11与膀胱癌患者的无病生存期及总体生存期呈现显著的负相关关系,提示MLLT11可能成为肿瘤膀胱癌诊断和治疗的新的分子靶点。
MLLT11在膀胱癌中表达显著高于癌旁正常组织,且其可以促进膀胱癌细胞的增殖和转移,并在体内裸鼠实验中再次证明了其可以促进异位移植瘤的形成及增加肺转移灶的数量。通过对TCGA膀胱癌MLLT11表达数据显示,MLLT11在膀胱癌中表达明显升高,且其升高与膀胱癌的无病生存期及总体生存期呈现显著的负相关关系,同时在收集的临床膀胱癌标本中发现MLLT11的显著高表达与TCGA数据库结果一致,由此可说明MLLT11在膀胱癌中的广泛适用性和生物学功能显著,且其检测简单方便。
另,MLLT11在乳腺癌、卵巢癌的研究仅通过小样本量证明MLLT11在这些癌症中表达水平升高,且未显示MLLT11与患者预后的关系,并且在一些亚型中检测不到MLLT11的表达,表现出MLLT11在这些癌症中的局限性,而本发现首次表明MLLT11在膀胱癌中表达上调,不仅通过大样本验证了MLLT11在膀胱癌中表达显著上调,且与患者的不良预后直接相关,表明了MLLT11在膀胱癌中的特异作用及普遍适用性。
综上所述,本发明公开了一种诊断和治疗膀胱癌的分子标志物,所述分子标志物为MLLT11。本发明首次发现MLLT11蛋白在人类膀胱癌组织,高侵袭性膀胱癌细胞系中均呈高表达。这一发现与利用TCGA数据库分析得出的MLLT11高表达水平的结果一致,并且MLLT11表达与膀胱癌患者的5年无病生存期(DFS)和总体生存期(OS)呈负相关。本发明还揭示了敲除MLLT11抑制膀胱癌细胞增殖和迁移和侵袭能力。体内动物实验表明敲除MLLT11在体内抑制肿瘤的生长和转移,这与体外细胞水平结果一致。因此,本发明首次证实MLLT11在人膀胱癌中高表达,其在膀胱癌细胞的异常生长和侵袭中起重要作用,这为进一步阐述MLLT11作为膀胱癌预后的生物标记物或作为膀胱癌预防和治疗的靶标提供了重要信息。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1-1为免疫组织化学染色(IHC)技术分析MLLT11在人膀胱癌组织与癌旁组织中的表达情况。
图1-1中,A从上至下分别为:人膀胱癌癌旁组织10倍镜下H&E染色结果,显示该组织为正常尿路上皮组织及正常尿路上皮组织中MLLT11蛋白的免疫组化染色结果;人膀胱癌癌旁组织10倍镜局部放大40倍后正常尿路上皮组织H&E染色结果及MLLT11蛋白在该组织中的免疫组化染色结果;人膀胱癌组织10倍镜下H&E染色结果(用于膀胱癌病理分析)及MLLT11蛋白在该组织中的免疫组化染色结果;人膀胱癌组织10倍镜局部放大40倍后H&E染色结果(用于膀胱癌病理分析)及MLLT11蛋白的免疫组化染色结果。
B从上至下分别为:免疫组织化学染色检测分析了17对临床膀胱癌组织及其对应癌旁组织中MLLT11蛋白表达水平相对定量结果;免疫组织化学染色检测分析了33例膀胱癌组织及17例癌旁组织中MLLT11蛋白表达水平相对定量结果。
HE代表临床收集的膀胱癌样本与正常尿路上的病理情况。IHC-MLLT11代表临床膀胱癌病人癌组织和相对应的癌旁组织中MLLT11蛋白的表达,显微镜下结果显示MLLT11主要定位于膀胱癌细胞质中,阳性表达呈黄褐色。通过Image-Pro Plus软件对MLLT11蛋白表达定量统计分析比较发现MLLT11在膀胱癌组织中呈高表达,而在癌旁组织中低表达或不表达,两者比较有显著性差异。
Normal代表人膀胱癌癌旁组织,Tumor代表人膀胱癌组织。
图1-2为western blot技术检测MLLT11蛋白在人膀胱癌细胞系和正常膀胱尿路上皮细胞中的表达情况。
图2为生物信息学分析TCGA数据库中MLLT11与膀胱癌病无病生存期(DFS,A)、总体生存期(OS,B)的关系。
图3-1为采用CRISPR-Cas9技术构建敲除MLLT11表达细胞株,MLLT11敲除效果鉴定结果。
图3-2为软琼脂集落形成实验(soft agar assay)检测MLLT11对膀胱癌细胞生长增殖能力的影响;
其中,A为T24T(Vector),T24T(MLLT11 KO#1),T24T(MLLT11 KO#2),T24T(MLLT11KO#3)细胞和UMUC3(Vector),UMUC3(MLLT11 KO#1),UMUC3(MLLT11 KO#2),UMUC3(MLLT11 KO#3)细胞进行软琼脂集落形成实验,拍摄细胞集落的代表性图像。
B为软琼脂集落形成实验细胞集落数统计:超过32个细胞计为一个集落,结果以每104个细胞的集落表示,统计每个图像中的细胞集落数目并比较分析。
图4为体内裸鼠皮下成瘤实验检测MLLT1在体内促进肿瘤的生长和形成情况。
其中,A为将指定细胞(2×106)以皮下接种方式注射到已随机分组的裸鼠背部右侧,正常饲养4-5周,待最大肿瘤达到1.5cm时,按照动物伦理学的要求麻醉处死裸鼠,并且拍照对比肿瘤大小,拍照对比显示敲除MLLT11显著抑制肿瘤的生长和形成。
B为将裸鼠麻醉之后,外科手段取出皮下肿瘤,拍照,结果显示实验组肿瘤比对照组小。
C为称量取出的肿瘤组织,并统计对照组与实验组的重量进行比较发现,实验组肿瘤的重量也显著降低。
图5为Transwell实验检测MLLT11对膀胱癌细胞迁移和侵袭能力的影响。
其中,A为使用不含Matrigel的空白插入薄膜检测敲除MLLT11对T24T细胞的迁移能力的影响,使用添加了Matrigel的相同系统检测其MLLT11对T24T细胞的侵袭能力的影响。细胞铺板,固定和染色后拍摄迁移和侵袭细胞图像。
B为计数每个图像中的细胞数并且将细胞侵袭能力(按照厂商说明)以不含Matrigel的迁移细胞做标准化,结果显示敲除MLLT11可以显著抑制T24T细胞的迁移和侵袭能力(p<0.05)。
C为使用不含Matrigel的空白插入薄膜检测敲除MLLT11对UMUC3细胞的迁移能力的影响,使用添加了Matrigel的相同系统检测其MLLT11对UMUC3细胞的侵袭能力的影响。细胞铺板,固定和染色后拍摄迁移和侵袭细胞图像。
D为计数每个图像中的细胞数并且将细胞侵袭能力(按照厂商说明)以不含Matrigel的迁移细胞做标准化,结果显示敲除MLLT11可以显著抑制UMUC3细胞的迁移和侵袭能力(p<0.05)。
图6为体内裸鼠肺转移模型检测MLLT11对体内肺转移灶形成的影响。
其中,A为通过裸鼠尾静脉注射T24T(vector)细胞和T24T(MLLT11 KO#2)及T24T(MLLT11 KO#3)细胞至随机分组的裸鼠体内,饲养7-8周左右,处死裸鼠并取出肺组织进行苦味酸固定,体视显微镜拍照裸鼠肺图像。HE染色观察裸鼠肺转移灶情况,发现与对照组相比,MLLT11 KO组镜下肺组织转移灶小而少,敲除MLLT11显著抑制裸鼠肺转移灶的形成。
B为每组随机统计5只裸鼠肺组织上的转移灶数目,结果显示与对照组相比,MLLT11KO组裸鼠肺转移灶数量显著降低。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此:
实施例1、MLLT11在膀胱癌病人及膀胱癌细胞系中表达上调
1、组织样本
由温州医科大学第一附属医院泌尿外科提供,于2014年3月至2015年12月期间收集的在行膀胱癌手术的33例患者的组织标本。收集患者姓名、性别、年龄、病理号码、病理等资料。入选患者大部分为男性且均经膀胱全切术,术前活检和术后病理检查证实为膀胱尿路上皮癌。每例标本均采集肿瘤组织,同时距肿瘤周围约3cm处切取正常组织作为对照。每份样本在组织离体后冻存于液氮灌中且实验操作经伦理审查批准。
2、免疫组化
参照免疫组织化学法进行,具体如下:
2.1、烤片:取出已切好的石蜡切片排放在专用组化玻片架子上,置于65℃烘箱,烤片2-3小时,天冷时可延长时间;
2.2、脱蜡复水:从65℃烘箱中取出切片,立即放入二甲苯I,5-8min→二甲苯Ⅱ,5-8min→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液,2min,充分脱蜡。脱蜡时间与石蜡能否彻底溶解及当时气温相关。如气温较高,则可缩短脱蜡时间,反之亦然。然后经不同梯度乙醇进行复水:100%乙醇I→100%乙醇II→95%乙醇→90%乙醇→80%乙醇→70%乙醇→50%乙醇,各1-2min,最后放于盛有去离子水烧杯中洗涤5min,这期间更换2-3次去离子水;
2.3、抗原修复:抗原修复液是PH=6.0的10mM柠檬酸钠修复液,抗原修复方式采用微波炉加热,调至高火,保证修复液温度达到99度以上,总共煮4次,每次7min。修复结束之后将装有玻片的湿盒放置室温自然冷却,冷却时间根据当时气温延长或者缩短;
2.4、去除内源性过氧化物酶:抗原修复平衡至室温之后,先用TBS洗涤样本3次,每次10min,再用3%过氧化氢室温孵育15分钟,以阻断内源性过氧化物酶,用TBS缓冲液洗涤3次,每次5min;
2.5、封闭:将5%BSA用移液枪仔细滴加在组织上,室温放置30min进行封闭;
2.6、一抗孵育:提前按照比例用5%BSA配置好一抗(可与MLLT11抗原特异性结合的蛋白)稀释液(稀释比例为1:50,Abcom公司,货号为:ab109016),放置4℃冰箱备用。用移液枪吸取一抗滴加于组织上,使抗体能够充分覆盖组织即可,4℃过夜孵育。
2.7、二抗孵育:回收一抗,TBS洗涤三次,每次10min,滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体于组织上,37℃孵育30min-1h,TBS冲洗3次,每次10分钟;
2.8、SABC孵育:组织上滴加SABC试剂覆盖组织,37℃孵育30min-1h,TBS冲洗3次,每次5分钟;
2.9、DAB显色:取DAB试剂盒中的A、B、C液各一滴于1mL的ddH2O,震荡混匀,避光备用。将配置的DAB显色液滴加于组织表面,室温静置5-10min,当镜下观察组织标本出现黄褐色时即可用ddH2O终止显色。ddH2O浸洗5min,期间更换3-5次ddH2O;
2.10、苏木素复染:用已经过滤的碧云天生产的苏木素滴加于组织上复染约1-3min;
2.11、脱水透明:经复染后石蜡切片再次经过梯度乙醇进行脱水:50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇→90%乙醇→95%乙醇→100%乙醇I→100%乙醇II,各1-2min,然后放入1/2二甲苯+1/2乙醇混合液,1min→二甲苯Ⅰ,5min→二甲苯Ⅱ,5min;
2.12、封片、镜检、分析:透明结束之后,将玻片放置的通风橱风干一会,滴上适量中性树胶于玻片上,然后取出干净的盖玻片,慢慢盖到中性树胶上封片,切记不能有气泡。封片完成后,放在通风橱吹干,显微镜下拍照并分析发现MLLT11在膀胱癌组织中呈高表达,而在癌旁组织中低表达或不表达,两者比较有显著性差异(图1-1的A、B)(P<0.05)。
3、蛋白免疫印迹
参照蛋白免疫印记法进行,具体如下:
3.1、取所需厚度的胶板。
3.2、按照配方配制8%,10%或12%的分离胶10mL,混匀加入制胶板之间至所需高度。
3.3、用甲醇缓慢液封,室温下静置约30min待其凝固。
3.4、弃掉甲醇,流水冲洗胶板,然后用滤纸将残余自来水吸干。接下来配制5%的浓缩胶3mL,充分震荡混匀后用加样器缓慢加入胶板之中,待胶板灌满后,迅速插入相应孔数的样品梳。
3.5、室温下静置约30min后,待其凝固放4℃保存。
3.6、蛋白样本处理:使用Boiling buffer裂解液(约60μL,根据细胞数量可进行相应调整)进行蛋白质抽提后,放置冰上。
3.7、金属浴100℃煮沸5min后,超声碎裂(1s/次,间隔1s,连续30-50次,强度可以30-40%)(冰上操作,注意深度,防止液体飞溅)。
3.8、用Bio drop来定量,每个样本测两次取平均值,如有一次变异较大,需再测一次,取两个接近的值(也可用BCA法测定蛋白浓度),并调整各个样本蛋白到统一浓度。
3.9、100℃加热5min,点离,上样前振荡混匀,(加热时注意开盖放气,防止EP管盖炸开,损失体系)。
3.10、SDS-PAGE电泳:拔掉梳子,将制胶板底端对齐放置于电泳槽中,制胶板内外槽中均倒入1×电泳缓冲液。将蛋白marker和处理好的蛋白样品按照实验安排顺序加入到上样孔中。打开电源,设置电泳程序,S1为150V,30min;S2为125V,1.5h,待溴酚蓝指示剂到达胶板底部时停止电泳。
3.11、转膜:剪裁长8cm,宽6cm的PVDF膜并用100%甲醇浸泡活化30s后,放入转膜缓冲液中清洗30s。转膜缓冲液需事先4℃预冷,装配从阴极到阳极依次是:棉垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-棉垫,不能有气泡,插上电极,设置25V,4.5h。
3.12、封闭:转膜结束后,PVDF膜用1×TBS室温洗膜5min,弃TBS并用5%脱脂牛奶于室温水平缓慢摇动封闭1h,封闭结束后用1×TBS室温洗膜5min×3次。
3.13、一抗孵育:封闭后加入一抗MLLT11抗体(可与MLLT11抗原特异性结合的蛋白)稀释液(稀释比例为1:800,Abcom公司,货号为:ab109016),或GAPDH抗体(可与GAPDH抗原特异性结合的蛋白)稀释液(1:4000,Abways公司,货号为:Ab0037)4℃孵育过夜,孵育结束后用1×TBST洗膜5min×3次。
3.14、二抗孵育:加入合适稀释度的碱性磷酸酶(AP)标记的羊抗兔IgG抗体(CellSinagling Technology公司,货号为:7054),4℃孵育3h,缓慢摇动,用1×TBST洗5min×3次→15min×3→1×TBS 10min。
3.15、显色:加入合适稀释度的ECF试剂,与PVDF膜的蛋白面反应数秒;曝光显影。
3.16、结果处理:分析目标条带,正常尿路上皮细胞SV-HUC-1和正常膀胱上皮细胞UROtsa以及膀胱癌(膀胱尿路上皮癌)细胞T24T,UMUC3细胞蛋白免疫印迹发现:MLLT11在人膀胱癌细胞系中表达上调(图1-2)。
根据图1-2,可得知:MLLT11在膀胱癌组织中呈高表达,且在人膀胱癌细胞系中表达上调,表明MLLT11在膀胱癌中具有重要意义。
实施例2、TCGA数据库示分析显示MLLT11表达上调与膀胱癌病人5年的年DFS和OS呈负相关
为了明确MLLT11在膀胱癌中可能存在的作用以及与膀胱癌病人之间的关系,本发明分析了TCGA数据库中膀胱癌病人的5年无病生存期(DFS)和总体生存期(OS)与MLLT11表达量之间的关系(图2A-2B),采用MLLT11在膀胱癌组织中的表达量的中位数将其分成高低表达两个组,结果显示MLLT11低表达的病人5年DFS和5年OS时间长,生存率高;相反,MLLT11高表达的病人5年DFS和5年OS时间短,生存率低下,两组比较有显著性差异(P<0.05)。以上TCGA数据分析显示MLLT11在膀胱癌中具有重要作用,且与病人的5年DFS和5年OS呈负相关,MLLT11可以作为膀胱癌一个关键预后分子。
即,本发明通过分析TCGA公共数据库中MLLT11表达后发现,MLLT11在膀胱癌组织中的表达显著上调,同时发现MLLT11的高表达与膀胱癌病人的无病生存期及总体生存期显著负相关。
实施例3、敲除MLLT11表达可以显著抑制膀胱癌细胞体外增殖能力
1)、首先选择两种常用的膀胱癌细胞株T24T和UMUC3来构建敲除MLLT11稳定细胞株,将Cas9 vector、MLLT11 KO#1、MLLT11 KO#2、MLLT11 KO#3质粒分别转染T24T、UMUC3细胞,单克隆筛选得到的稳定细胞株,western blot检测MLLT11蛋白水平以确认敲除效率。结果显示,T24T和UMUC3细胞均成功敲除MLLT11蛋白表达,GAPDH用作内参(图3-1)。
MLLT11 KO#1的序列如SEQ ID NO.1所示;MLLT11 KO#2序列如SEQ ID NO:2所示;MLLT11 KO#3的序列如SEQ ID NO:3所示。
2)、软琼脂集落形成实验
开展了软琼脂集落形成实验,将细胞铺于软琼脂中,37℃、5%CO2培养箱培养3-4周拍摄特征性图像并分析(图3-2的A和B);
通过细胞克隆计数发现,T24T(Vector)集落形成数为56.8 1.724,T24T(MLLT11KO#1)集落形成数是24.4 0.2309,T24T(MLLT11 KO#2)集落形成数是23.47 0.4807,T24T(MLLT11KO#3)集落形成数是20.4 0.9238,统计学分析具有差异显著性(p<0.05)。UMUC3(Vector)中集落形成数为64.33 1.525,而UMUC3(MLLT11 KO#1)集落形成数是24.670.1333,UMUC3(MLLT11 KO#2)集落形成数是24.00 0.6110,UMUC3(MLLT11 KO#3)集落形成数是22.730.5333,统计学分析具有差异显著性(p<0.05)。
以上结果表明:敲除MLLT11后显著抑制膀胱癌细胞集落形成,即显著抑制了膀胱癌细胞锚定非依赖性生长能力,表明MLLT11能够促进膀胱癌细胞恶性生长。
实施例4、敲除MLLT11显著抑制裸鼠体内异位移植瘤的形成
在随机分成的3组5周龄的BALA/c裸鼠的右侧背部分别注射2×106T24T(vector),T24T(MLLT11 KO#2)和T24T(MLLT11 KO#3)细胞,经过4-5周皮下肿瘤的形成之后,按照温州医科大学动物实验管理办法麻醉裸鼠并解剖出肿瘤之后进行拍照称重,结果直观显示敲除MLLT11表达显著抑制裸鼠皮下肿瘤的大小和重量(图4的A-C),这与体外细胞水平实验结果一致,表明MLLT11在体内外具有促进膀胱癌细胞增殖的作用,充分表明MLLT11在膀胱癌细胞生长增殖方面具有重要作用。
实施例5、敲除MLLT11抑制膀胱癌细胞体外迁移和侵袭能力
采用Trasnwell/Invasion实验方法探究了敲除MLLT11对膀胱癌细胞迁移和侵袭的影响。采用了UMUC3/T24T(MLLT11 KO#1,KO#2,KO#3)及其对照细胞进行实验。
如图5所示,敲除MLLT11表达能显著抑制膀胱癌细胞T24T和UMUC3迁移和侵袭(图5的A-D),统计迁移和侵袭细胞数,与对照组进行比较分析发现,敲除MLLT11表达显著抑制膀胱癌细胞T24T和UMUC3迁移和侵袭的能力,结果具有显著性差异。
实施例6、敲除MLLT11显著抑制裸鼠肺转移的形成
裸鼠肺转移实验
1.动物饲养
购买45只4周龄的BALB/c裸鼠,正常饲养于SPF级动物实验室中,所有动物实验都符合温州医科大学动物委员会要求;
2.扩增目的细胞T24T(vector)、T24T(MLLT11 KO#2)、T24T(MLLLT11 KO#3);
3.消化收集对数生长期的目的细胞,离心后,弃掉培养基,PBS洗涤一遍,弃掉PBS;
4.用1mL PBS重悬细胞沉淀,并取出1μL细胞悬液于1mL PBS中进行稀释计数;
5.计算并分装每管200μL含有2.5×106个细胞的细胞悬液置于冰上;
6.动物房操作,先每只裸鼠都打耳标,便于标记,随机将45裸鼠平均分为3组,每组15只;
7.于裸鼠尾静脉处注射100μL准备好的对应的细胞悬液,并且分笼饲养;
8.正常饲养裸鼠6-8周,每组随机处死5只裸鼠,取出肺组织,苦味酸固定并拍照计数肺转移灶数目;
9.拍照计数转移灶数目之后,肺组织用于固定包埋做HE染色分析转移灶的情况。如图6A-6B所示,敲除MLLT11抑制膀胱癌细胞体内肺转移。
所得结果如图6的A-B所示;根据该图,可得知:敲除MLLT11确实能抑制膀胱癌细胞迁移和侵袭以及裸鼠肺组织转移灶的形成。
最后,还需要注意的是,以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然,本发明不限于以上实施例,还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形,均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 温州医科大学
<120> 诊断和治疗膀胱癌的分子标志物MLLT11及其用途
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caagcaactg cagcagacca ggagaaaaac cctgaaggtg atggcctcct tgagtacagc 60
accttcaact tctggagagc tcccattgcc agcatccact ccttcgaact ggacttgctc 120
taa 123
<210> 2
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgagtacagc accttcaact tctggagagc tcccattgcc agcatccact ccttcgaact 60
ggacttgctc taa 73
<210> 3
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcccatccca gaactggatc tgtcggagct ggaaggcctg ggtctgtcag atacagccac 60
ctacaaggtc aaagacagca gcgttggcaa aatgatcggg 100
<210> 4
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Arg Asp Pro Val Ser Ser Gln Tyr Ser Ser Phe Leu Phe Trp Arg
1 5 10 15
Met Pro Ile Pro Glu Leu Asp Leu Ser Glu Leu Glu Gly Leu Gly Leu
20 25 30
Ser Asp Thr Ala Thr Tyr Lys Val Lys Asp Ser Ser Val Gly Lys Met
35 40 45
Ile Gly Gln Ala Thr Ala Ala Asp Gln Glu Lys Asn Pro Glu Gly Asp
50 55 60
Gly Leu Leu Glu Tyr Ser Thr Phe Asn Phe Trp Arg Ala Pro Ile Ala
65 70 75 80
Ser Ile His Ser Phe Glu Leu Asp Leu Leu
85 90
Claims (8)
1.MLLT11作为特异性标志物在制备诊断和治疗膀胱癌的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征是:特异性标志物为MLLT11蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征是:制备用于检测膀胱癌的试剂盒。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征是:所述膀胱癌诊断试剂盒包括与MLLT11蛋白特异性结合的抗体。
5.根据权利要求1或2所述的应用,其特征是:MLLT11基因表达的抑制剂用于制备治疗膀胱癌的药物。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征是:药物包含抑制MLLT11基因表达的抑制剂和药物学可接受的载体。
7.根据权利要求5或6所述的应用,其特征是:所述抑制剂为敲除MLLT11基因表达的CRISPR-Cas9质粒。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征是:所述敲除MLLT11基因表达的CRISPR-Cas9质粒选自KO MLLT11#1,KO MLLT11#2、KO MLLT11#3中的至少一种;所述KO MLLT11#1序列如SEQ ID NO:1所示;所述KO MLLT11#2的序列如SEQ ID NO:2所示;所述KO MLLT11#3的序列如SEQ ID NO:3所示。
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