CN113230407A - 预防肺癌靶标mllt11及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域,具体涉及MLLT11作为预防和诊断由砷化物诱发的肺癌的新靶标及其应用。敲除MLLT11后可显著抑制砷化物诱发的肺正常支气管上皮细胞的恶转作用。MLLT11针对肺癌,至少是砷化物诱发的肺癌具有潜在的预防作用;因此,MLLT11有望在临床上进一步发挥其预防肺癌的作用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及MLLT11作为预防和诊断由砷化物诱发的肺癌的新靶标及其应用。
背景技术
据2020年世界卫生组织发布的最新全球癌症统计可知,全球仍有近220万肺癌新发病例及180万肺癌死亡病例,严重威胁着全体人类生命健康安全。其中2020年中国癌症发病率数据显示肺癌发病率为17.9%,死亡率更是高达23.8%。因此肺癌的预防和治疗对中国乃至全世界刻不容缓。砷是一种非金属元素,广泛存在于自然界,大量被应用到人们的生产和生活当中,包括农药、杀虫剂、除草剂和合金等。然而砷及其化合物就像一把双刃剑,在我们受益的同时,其带来的危害也不容小觑。砷化物在2017年被世界卫生组织国际癌症研究机构列为一类致癌物,流行病学调查结果显示,砷暴露可导致包括人类的头号杀手—肺癌在内的多种癌症的发生。砷化物既是重要的环境致肺癌化合物,又是重要的实验室诱导肺癌的模式化合物,故研究其致癌机制对于砷化物的生物学效应(即砷化物诱导肺癌)及肺癌发生的普遍机制可能有着同等重要的作用,然而砷化物诱发肺癌的具体作用机制尚不完全明确,这无疑为我们预防肺癌尤其是砷化物诱发的肺癌增加了莫大的阻力。机制研究的持续进展与突破,有可能为寻找肺癌的预防措施提供理论支持,因此深入研究砷诱发肺癌的相关分子机制迫在眉睫。
MLLT11,别名AF1Q(ALL1-fused gene from the chromosome 1q),基因大小10740bp,位于1号染色体长臂2区1带,为蛋白质编码基因。所编码的蛋白质含90个氨基酸,大小约为9KD,主要分布于细胞核及细胞质基质中,无明显功能结构域及与数据库中所有已知蛋白相似结构域。四级结构与HSPA8和LAMP2同型A相互作用,同样可与TCF7相互作用。已有研究表明,在白血病,卵巢癌,膀胱癌等恶性肿瘤中发现MLLT11的高表达。
2020105797538的发明《诊断和治疗膀胱癌的分子标志物MLLT11及其用途》已经告知了MLLT11在诊断和治疗膀胱癌中的应用。然而作为本行业常识:肿瘤具有组织特异性,用于诊断和治疗膀胱癌的分子标志物与预防和诊断肺癌的分子标志物之间无必然联系。例如,目前已知的可用于诊断和治疗膀胱癌的分子标志物有CK7,S-100P,GATA3,BTA,NMP22,FDP等,但其具有尿路上皮癌特异性,与肺癌无关。另例如Erdafitinib(FGFR抑制剂),Avelumab(靶向PD-L1药物),拓益等靶向膀胱癌的药物,无法对肺癌进行有效治疗。
因此,寻求新的靶点分子对于预防和治疗砷化物诱发的肺癌具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供MLLT11作为预防和诊断由砷化物诱发的肺癌的新靶标及其应用。
为了解决上述技术问题,本发明提供一种MLLT11表达抑制剂在制备预防肺癌药物中的应用。
作为本发明应用的改进:敲除MLLT11后可显著抑制砷化物诱发的肺正常支气管上皮细胞的恶性转化作用。
作为本发明应用的进一步改进:MLLT11表达抑制剂为敲除MLLT11质粒。
本发明还同时提供了一种预防肺癌的组合物:包括MLLT11表达抑制剂、药剂学上能够接受的载体;
所述MLLT11表达抑制剂为敲除MLLT11质粒。
本发明前期实验发现砷化物可上调肺正常支气管上皮细胞中MLLT11蛋白表达,且在临床肺癌组织中MLLT11的蛋白表达水平显著高于对应的正常组织。依据该现象,进行了相关探究。探究初步表明MLLT11在砷化物诱发肺支气管细胞恶性转化的过程中发挥了一定的作用,这为理解砷化物如何诱发肺癌提供了一定的思路。
本发明所采取的技术方案如下:
(1)通过细胞急性染毒实验,使用适当浓度梯度的砷化物处理肺正常支气管上皮细胞细胞,通过Western Blot实验,发现在一定浓度范围内,MLLT11蛋白表达量随砷化物浓度增加而表达上调。当使用同一砷化物浓度对正常支气管上皮细胞BEAS-2B进行时间梯度的急性染毒发现,在一定的时间范围内MLLT11蛋白表达量随时间增加而上调。
(2)进一步采用免疫组织化学染色技术检测到在临床配对肺癌组织中MLLT11高表达。这表明可通过检测MLLT11表达来诊断肺癌。
(3)通过细胞长期暴露实验和软琼脂克隆集落形成实验发现,敲除MLLT11后可显著抑制砷化物诱导的BEAS-2B恶性转化作用,这表明MLLT11表达抑制剂可以预防由砷化物诱发的肺癌。
(4)通过裸鼠皮下成瘤实验进一步在体内验证,敲除MLLT11后可显著抑制砷化物诱导的细胞恶性转化。这表明MLLT11表达抑制剂可以预防由砷化物诱发的肺癌。
本发明具有如下技术优势:
本发明以肺正常支气管上皮细胞BEAS-2B细胞为模型,敲除MLLT11后可显著抑制砷化物诱发的肺支气管上皮细胞恶转作用。这表明,可以通过敲除MLLT11来预防砷化物诱发的肺癌。
利用免疫组织化学染色技术等方法检测临床肺癌组织中MLLT11表达呈现高表状态。因此,通过检测MLLT11的表达有助于对肺癌的诊断。综上所述,MLLT11有望作为预防和诊断肺癌的新靶标。
即便现今已有部分关于MLLT11在白血病、膀胱癌、乳腺癌等癌症发展过程中的机制研究,但尚无其于肺癌以及砷化物致肺癌过程中的研究报道,本发明是敲除MLLT11后可显著抑制砷化物诱发的肺正常支气管上皮细胞的恶转作用。目前临床上尚无公认的药物靶点可以预防肺癌或者砷化物诱发的肺癌,本发明的MLLT11针对肺癌,至少是砷化物诱发的肺癌具有潜在的预防作用;因此,MLLT11有望在临床上进一步发挥其预防肺癌的作用。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明:
图1表明砷化物处理肺正常支气管上皮细胞后MLLT11表达的检测;
图1中:
A为利用蛋白质免疫印迹实验,检测MLLT11在不同浓度砷化物对BEAS-2B细胞急性处理后的蛋白表达量;
B为利用蛋白质免疫印迹实验,检测MLLT11在同一浓度砷化物对BEAS-2B细胞处理不同时间后的蛋白表达量;
C为利用蛋白质免疫印迹实验,检测MLLT11在砷化物对BEP2D细胞处理不同浓度的蛋白表达量;
D为利用蛋白质免疫印迹实验,检测MLLT11在砷化物对HBEC细胞处理不同浓度的蛋白表达量;
根据图1,可得知:砷化物急性染毒导致肺正常支气管上皮细胞中MLLT11蛋白表达的上调。
图2为临床肺癌组织中MLLT11表达的检测图;Normal是正常组织,Tumor是肿瘤组织;
图2中:
A为通过免疫组化技术,检测在临床肺癌组织样本中MLLT11的蛋白表达水平;
B为数据化免疫组化结果,(*)表示差异具有统计学意义(p<0.01);
根据图2,可得知:MLLT11在临床肺癌组织中的蛋白表达水平总体呈高表达。
图3为评估MLLT11在砷化物长期诱导的BEAS-2B细胞恶性转化(克隆集落的形成)过程中的作用;
图3中,
A为通过蛋白免疫印迹技术检测构建的稳定敲除MLLT11的BEAS-2B细胞系,对照组:Vector,敲除组:KO-MLLT11#1、KO-MLLT11#2、KO-MLLT11#3,其中#1,#2,#3均有效;
B,C为通过软琼脂克隆集落形成实验,检测经砷化物长期暴露5个月的BEAS-2B(KO-MLLT11)及对照BEAS-2B(Vector)稳转细胞系的恶变情况,(*)表示差异具有统计学意义(p<0.01);
根据图3,可得知:敲除MLLT11后可显著抑制砷化物诱发的肺正常支气管上皮细胞恶性转化作用。
图4为利用裸鼠皮下成瘤模型评估MLLT11在砷化物长期暴露致BEAS-2B恶性转化过程中的作用。
A为通过将25只裸鼠随机分成5组,分别注射砷化物长期暴露6个月的BEAS-2BVector(As),BEAS-2B KO-MLLT11#1(As),BEAS-2B KO-MLLT11#2(As),BEAS-2BKO-MLLT11#3(As)和正常培养的6个月BEAS-2B Vector(medium)细胞至裸鼠皮下;
B为裸鼠皮下肿瘤最大生长至10mm时,剖取肿瘤,通过拍照记录取下肿瘤大小;
C为通过作图展示肿瘤的质量。(*)表示差异具有统计学意义(p<0.01);
根据图4,可得知:敲除MLLT11显著抑制砷化物长期诱导的肺正常支气管上皮细胞的恶性转化。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此:
实施例1、砷化物处理肺正常支气管上皮细胞,以浓度和时间依赖性上调MLLT11的蛋白表达水平
1.细胞染毒处理
(1)细胞急性砷染毒处理:
a)对人正常支气管上皮细胞BEAS-2B进行细胞计数,计20万细胞铺于六孔板每孔中,共8孔,采用含10%FBS的DMEM培养基,于37℃恒温CO2培养箱中进行培养;12h后细胞密度达到80%左右。
b)种板12h后,将原含10%FBS的DMEM培养基更换为0.1%FBS的DMEM培养基,按照上述同样的培养条件进行细胞饥饿12h。
c)细胞饥饿12h后,分别进行两组实验,每组4孔细胞。一组实验为固定砷化物处理时间,于0.1%FBS的DMEM培养基中加工作浓度为对照(0)、0.625、1.25和2.5μM的砷化物进行染毒处理24h(图1A);另外一组实验为固定砷化物浓度为1.0μM,对贴壁细胞处理对照组(0)、12、24和36h(图1B)。结果如图1的A和B所述。
d)同理,对BEP2D、NHBEC细胞处理方式同a)b)过程。细胞饥饿12h之后进行砷化物浓度2.5μM,24h的急性暴露,得图1的C和D。
2.蛋白质免疫印迹技术
(1)蛋白处理:
a)弃去步骤1c)所得物的六孔板中的培养基,用预冷的PBS清洗并弃去,重复使用PBS清洗一次。
b)将六孔板放于冰盒上,根据细胞密度加入相应的细胞裂解液BB,使用细胞刮迅速刮动,以保证细胞能够快速且均匀地被裂解,将蛋白彻底刮取,并收集到1.5mL EP管中(做好标记)。
c)100℃恒温金属浴加热5min,中间开盖一次,点离暂存。
d)进行超声处理,振幅依细胞裂解液量而改变,在保证不超沸的前提下尽量提高振幅,1s/次,间隔1s,连续40次(全程在冰上操作),超声结束后细胞液澄清透明,流动性强。超声结束后高速离心样本,使用移液器量取上清蛋白液体积并转管,充分震荡混匀,使用NanoDrop 2000分光光度计进行测量蛋白样本的浓度。每个蛋白样本测两次后无明显误差时,取两者平均值,将同一组的蛋白样本调整到尽可能大的相同浓度,根据公式计算出所需的BB以及6×Sample Buffer。将蛋白样本充分混匀后,100℃加热5min,储存于-20℃冰箱。
(2)配胶:
a)根据目标蛋白的分子量大小选择不同浓度的分离胶进行配制,一般检测30KD以下的蛋白,就用12%的分离胶,80KD以上的蛋白,就用8%的分离胶,中等大小的蛋白就用10%的分离胶。MLLT11蛋白大小11KD,因此选取12%或者15%的分离胶进行Western Blot实验。
b)先检查胶板的密闭性,固定胶板并保证胶板水平后,开始配分离胶。配完分离胶后,用甲醇缓慢左右移动进行液封以保证胶面平直。
c)室温凝固1h后,将甲醇弃去,用滤纸吸去多余甲醇。按照配方配制5%的浓缩胶,插入梳子时应避免气泡产生。待室温凝固40min至1h后,可及时使用或可储存于4℃冰箱不超过1周时间。
(3)SDS-PAGE电泳(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳):
a)准备好电泳槽、盖子、电源、Running Buffer等,拔出梳子,开始上样。跑浓缩胶电压为150V,条带完全进入分离胶后将电压调整为125V。根据蛋白外marker估计目标蛋白所处位置,适时停止电泳。
b)转膜:转膜前新配好的转膜缓冲液需预冷至4℃。将转膜的电泳模块、海绵和滤纸等准备好,海绵、滤纸浸在转膜液中,使其充分浸润,且无气泡。将PVDF膜放在纯甲醇中活化45-60s,活化后在转膜缓冲液中清洗几次。从阴极至阳极的转膜顺序依次为:海绵-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵,注意不能有气泡,转膜电压为25V,时间4.5h。
c)封闭:转膜时间结束后,小心卸下膜并在非蛋白面做好标记,放入1×TBS中,并在摇床上晃动,更换TBS 3次,每次5min。然后甩尽TBS,加入脱脂牛奶(5%)在摇床上,室温封闭1h。封闭结束后倒掉牛奶,更换3次1×TBS,在摇床上洗膜,每次5min。
d)孵育一抗:甩干TBS后,加入1:800稀释比的MLLT11或1:2000稀释比的β-Actin抗体,4℃孵育12-16h。
e)二抗孵育:回收一抗,换3次1×TBST在摇床上洗膜5min。甩干TBST后,加入稀释的对应牛奶二抗(比例为1:1000-1:2000),4℃孵育2.5-3h。孵育结束后,再回收二抗,换3次1×TBST在摇床上洗膜15min。再换3次1×TBST在摇床上洗膜,每次15min。最后使用1×TBS摇床上清洗10min。
f)显影:稀释ECF显影液(500μLECF+6mL 1×TBS),根据不同蛋白检测的灵敏度差异,将PVDF膜完全浸入显影液中,顺蛋白泳道摇晃5s至1min不等,放置于塑料薄膜中,排空气泡。用Typhoon 7000(GE)扫膜仪,进行显影。扫膜结果保存于命名好的文件夹中,并用软件进行分析保存于PPT中。结果如图1的A、B、C、D所述。
根据图1,可得知:砷化物急性染毒导致肺正常支气管上皮细胞中MLLT11蛋白表达的上调。
实施例2、MLLT11在临床肺癌组织中的表达水平总体呈高表趋势。
1、临床组织免疫组化
(1)石蜡包埋切片:
a)组织收集:收取肺癌组织以及其相应癌旁组织。此操作严格遵守温州医科大学医学伦理委员会相关规定。
b)组织固定:4%PFA固定肺癌组织,4℃固定24-48h。
c)组织脱水:将固定好的肺癌组织流水冲洗,将PFA清洗干净。然后将标本依次放入30%乙醇30min,50%乙醇30min,70%乙醇1h,80%乙醇1h,85%乙醇1h,95%乙醇1h,95%乙醇1h,100%乙醇Ⅰ1h,100%乙醇Ⅱ1h中进行梯度脱水。
d)组织透明:组织脱水后,将组织放入1/2无水乙醇1/2二甲苯混合的溶液中5-10min左右,然后将组织依次放入100%二甲苯Ⅰ液中10-15min,100%二甲苯Ⅱ液中10-15min。
e)组织浸蜡:组织经过脱水透明之后,将组织转移进预先融化的软蜡中,软蜡Ⅰ1h,软蜡Ⅱ1h,使软蜡充分浸入组织当中,并能充分取代透明剂。
f)组织包埋:组织经过脱水透明浸蜡之后,将包埋盒和组织一起放入已融化的硬蜡中,浸泡待石蜡浸入组织内达到饱和程度时,充分冷却,凝固成为蜡块。
g)组织切片:组织周围保留2-3mm的石蜡,石蜡的切面需平整且对称。将蜡块与切片刀安装到石蜡切片机上。将组织切成厚度均匀为5μm的切片。将切片用镊子平整地放入冷水中,将其展开。使用防脱载玻片平稳的捞出薄片,放入42℃的热水中,薄片平整铺开后即可捞起。将切片放于4℃冰箱保存或进行烤片。
(2)免疫组织化学染色:
a)组织包埋:组织经过脱水透明浸蜡之后,将包埋盒和组织一起放入已融化的硬蜡中,浸泡待石蜡浸入组织内达到饱和程度时,充分冷却,凝固为蜡块。
b)组织脱蜡:将从65℃烘箱中取出的切片,放入二甲苯Ⅰ液10min,二甲苯Ⅱ液10min,1/2乙醇+1/2二甲苯2min,进行脱蜡。
c)组织复水:将切片放入不同梯度浓度的乙醇中进行复水,依次为:100%乙醇Ⅱ,100%乙醇Ⅰ,95%乙醇,90%乙醇,80%乙醇,70%乙醇,50%乙醇,去离子水,时间均为1-2min。
d)抗原修复:将玻片插入10mM的抗原修复液中,微波炉加热7min/次,共4次。后放置于室温冷却30-45min。
e)圈画组织:将抗原修复液甩去,使用1×TBS清洗3次,每次5min。甩去水渍后使用组化笔圈出组织。
f)H2O2封闭:将3%H2O2滴加于组织上,室温避光孵育30min,后将3%H2O2甩去,使用1×TBS清洗3次,每次5min。
g)5%BSA封闭:将5%BSA滴加于组织上,室温孵育30min。
h)孵育一抗:将5%BSA甩去,不用清洗,将免疫组化的MLLT11抗体滴加覆盖于组织上,4℃孵育过夜。
i)回收一抗:将湿盒室温复温30min后,回收MLLT11抗体,并使用1×TBS清洗3次,每次5min。
j)孵育二抗:一抗清洗完后,将对应免疫组化的二抗滴加于组织上,37℃孵育30min。
k)孵育SABC:使用1×TBS清洗组织3次,每次5min。然后将SABC滴加于组织上,37℃孵育30min。
l)DAB显色:使用1×TBS清洗组织3次,每次5min。然后将DAB同时滴加于Normal和Tumor组织上,镜下观察,待组织变黄时,ddH2O终止显色。
m)苏木素染色:将苏木素滴加于组织上,染色1-2min。
n)返蓝:自来水冲洗5-10min,期间换水3次。
o)脱色:50%乙醇,70%乙醇,80%乙醇,90%乙醇,95%乙醇,100%乙醇Ⅰ,100%乙醇Ⅱ,时间均为90s。
p)透明:1/2乙醇+1/2二甲苯,二甲苯Ⅰ,二甲苯Ⅱ,各2-5min。
q)封片:通风橱晾干30min后,使用适量的中性树胶进行封片,需防止气泡。
r)封片后晾干,镜下拍照并进行分析。结果如图2的A和B所述。
根据图2,可得知:MLLT11在临床肺癌组织中的蛋白表达水平总体呈高表达。
实施例3、MLLT11显著促进砷化物长期诱导的BEAS-2B细胞克隆集落形成。
1.细胞转染相关步骤(1)脂质体转染法:
a)BEAS-2B细胞种板24h,待细胞长到80%,提前1h更换培养基,为新鲜10%FBSDMEM+++培养基。
b)将2μg MLLT11 KO质粒(Vector,KO#1,KO#2,KO#3)分别加入50μL无血清含高葡萄糖的DMEM中充分混匀。
c)取6μL PolyJetTMreagent加入50μL无血清含高葡萄糖的DMEM,用枪轻轻混匀3-4下。
d)立即将稀释的PolyJetTM试剂加入稀释的DNA溶液中,轻轻吹打上下混匀3-4次。(顺序只能PolyJetTM加DNA)
e)室温下孵育15min,不能超过20min。
f)将100μL PolyJetTM和DNA混合物逐滴加入6孔板的培养基中,边加边轻轻旋转混匀。
g)培养12-18h换新的2mL全培,若细胞比较敏感6h后可以换新的全培。转染24-48h,检测转染效率,如带GFP标签可以在荧光显微镜下观察荧光。
当转染效率满足大于30%时,则进行后续的细胞药物筛选;反之,则重新转染。
2.筛选细胞株相关步骤(1)单克隆挑选细胞株:
a)细胞转染获得质粒性状后,待其增殖至传代标准后,进行消化计数。
b)利用有限稀释法,将细胞数稀释至5个/mL,铺至96孔板中,每孔200μL培养基,尽可能保证每孔只有1个细胞。
c)细胞于96孔板中生长至传代标准时,将孔中细胞消化,铺至48孔板中,再次进行传代;之后依次将细胞扩至24孔板,12孔板,6孔板中。
d)当细胞生长至可收取蛋白时,收取部分细胞蛋白进行Western Blot验证敲除效率,选取Western Blot结果中MLLT11条带完全不显影的细胞株,即完全敲除的细胞编号再次进行数次传代,收取蛋白,最终确定构建完成的MLLT11稳定敲除细胞株(经多次细胞传代后,WB结果中,敲除实验组仍未显现MLLT11条带,可认为稳定细胞株构建完成)。结果如图3A所述,成功构建敲除MLLT11细胞株。其中KO-MLLT11#1,KO-MLLT11#2,KO-MLLT11#3分别代表所转染的三组带有不同目的序列的敲除质粒,构建完成的稳定敲除细胞株,敲除质粒同2020105797538的发明《诊断和治疗膀胱癌的分子标志物MLLT11及其用途》中所使用质粒。
3.细胞砷染毒相关步骤(1)细胞长期砷暴露处理:
a)上述筛选后鉴定成功的BEAS-2B(Vector,KO-MLLT11#1,KO-MLLT11#2,KO-MLLT11#3)每孔10万个细胞进行种板,分别设置砷化物0或0.5μM的砷化物暴露组。
b)细胞长满后传代,每孔10万个细胞,多余细胞丢弃,维持对应孔的砷化物浓度不变。
c)上述细胞系维持砷处理并持续数月传代(传代培养的条件为含5%的CO2的37℃恒温培养箱),期间将细胞冻存几次留种。结果如图3B、C所述,长期砷化物(0或0.5μM)暴露的BEAS-2B(Vector,KO-MLLT11#1,KO-MLLT11#2,KO-MLLT11#3)细胞恶性转化模型构建成功。
4软琼脂克隆集落形成实验
(1)铺下层胶:
a)将4mL的1.25%琼脂糖溶液与6mL的medium加入15mL离心管中,将其轻轻吹打混匀后加入6孔板中,铺板时注意不能有气泡且防止胶出现凝固状态。
b)铺好后室温凝固2h。
(2)铺上层胶:
a)制备细胞悬液:将上述长期砷化物(0或0.5μM)染毒的处于对数生长期的BEAS-2B(Vector,KO-MLLT11#1,KO-MLLT11#2,KO-MLLT11#3)细胞使用胰酶消化后,收集至EP管中离心1200rpm,5min。
b)离心结束后,弃掉上清,用1mL PBS清洗细胞沉淀,重悬并混匀。再次离心1200rpm,5min。弃掉PBS。
c)使用新鲜的DMEM培养基重悬细胞沉淀。充分混合均匀。牛鲍计数板进行计数。取10μL细胞悬液滴加至牛鲍计数板上,镜下计数。
d)将计算所得的含1×104的细胞悬液与736μL medium充分混匀,后加入264μL1.25%琼脂糖凝胶,充分混匀后取1mL加入6孔板中,铺板时注意不能有气泡且防止胶出现凝固状态。
e)铺好后室温凝固1-2h,封口膜将六孔板密封并放入37℃5%CO2培养箱中继续进行培养。
f)观察细胞增殖的情况以及实验组与对照组的差异,后采用显微镜5倍镜拍照并计数含32个细胞以上的克隆,计算细胞集落数形成率并分析结果。结果如图3B、C所述。据此,可获得以下结论:MLLT11敲除显著抑制砷化物长期诱导的BEAS-2B细胞克隆集落形成。
实施例4、裸鼠皮下成瘤实验进一步体内评估敲除MLLT11能否显著抑制砷化物长期暴露下导致的肺正常支气管上皮细胞的恶性转化。
裸鼠皮下成瘤实验
a)实验动物通过江苏集萃药康公司购买,均为3-4周龄的BALB/C-nu雌性裸鼠,所有动物实验方案均提前通过温州医科大学实验动物伦理委员会的批准,并严格按照方案实行。
b)将25只裸鼠随机分成5组,每组5只,分别注射砷化物(0.5μM)长期诱导6个月的BEAS-2B(Vector)、BEAS-2B(KO-MLLT11#1)、BEAS-2B(KO-MLLT11#2)、BEAS-2B(KO-MLLT11#3)和砷未处理的6个月BEAS-2B(Vector)细胞,上述细胞来自于上述实施例3的细胞砷染毒相关步骤中的细胞长期砷染毒处理。每只裸鼠皮下注射800万相应细胞,构建裸鼠皮下成瘤模型。
c)观察裸鼠背部肿瘤大小,对取下的肿瘤进行拍照并称重记录。
结果如图4A-C所述,据此,可获得以下总结性结论:敲除MLLT11能显著抑制砷化物长期诱导的肺正常支气管上皮细胞的恶性转化。
最后,还需要注意的是,以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然,本发明不限于以上实施例,还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形,均应认为是本发明的保护范围。
Claims (6)
1.MLLT11表达抑制剂在制备预防肺癌药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征是:作为预防和诊断由砷化物诱发的肺癌的靶标。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征是:敲除MLLT11后可抑制砷化物诱发的肺正常支气管上皮细胞的恶性转化作用。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征是:所述MLLT11表达抑制剂为敲除MLLT11质粒。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征是:所述MLLT11表达抑制剂为敲除MLLT11的CRISPR-Cas9质粒。
6.一种预防肺癌的组合物,其特征是:包括MLLT11表达抑制剂、药剂学上能够接受的载体;所述MLLT11表达抑制剂为敲除MLLT11质粒。
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